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WO1999009172A1 - Identification et localisation de polypeptides epil exprimes, codes par le gene insl4 et leurs applications - Google Patents

Identification et localisation de polypeptides epil exprimes, codes par le gene insl4 et leurs applications Download PDF

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Publication number
WO1999009172A1
WO1999009172A1 PCT/FR1998/001799 FR9801799W WO9909172A1 WO 1999009172 A1 WO1999009172 A1 WO 1999009172A1 FR 9801799 W FR9801799 W FR 9801799W WO 9909172 A1 WO9909172 A1 WO 9909172A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
cells
acid sequence
epil
cell
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001799
Other languages
English (en)
Inventor
Dominique Bellet
Frédéric TROALEN
Jean-Michel Bidart
Pascal Mock
Original Assignee
Institut Gustave-Roussy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9710387A external-priority patent/FR2767325B1/fr
Application filed by Institut Gustave-Roussy filed Critical Institut Gustave-Roussy
Priority to CA002301154A priority Critical patent/CA2301154A1/fr
Priority to AU90757/98A priority patent/AU9075798A/en
Priority to EP98942734A priority patent/EP1003866A1/fr
Publication of WO1999009172A1 publication Critical patent/WO1999009172A1/fr

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins

Definitions

  • the present invention relates to the identification and tissue localization of new polypeptides expressed by the insulin-like 4 gene (INSL4), their amino acid and nucleic acid sequence, methods of detection and diagnosis, methods of labeling. , selection and detection of cells expressing said polypeptides or their corresponding nucleic sequence and methods of selecting compounds capable of modulating the activity of said polypeptides.
  • the invention also relates to medicaments intended for the treatment of tumors, in particular angioproliferative tumors such as Kaposi's sarcoma, for vascularization of specific tissues and / or for regeneration of tissues.
  • Insulin is well known as a pancreatic endocrine hormone that regulates energy metabolism.
  • Insulin-IGF-1 growth factors are growth promoter peptides involved in the endocrine, paracrine and autocrine regulation of cell growth and which are expressed in many tissues.
  • IGF-2 has similar properties but is expressed in greater amounts during the prenatal period and is considered to be a factor in fetal growth.
  • Relaxin induces a remodeling of the connective tissues in the reproductive tract and inhibits uterine contractions.
  • the relaxin gene is expressed in the corpus luteum, the decidua, the trophoblast and the prostate (Bogie, LV et al., 1995). Its functional role in the brain, where a very important expression has been observed, remains to be elucidated.
  • Ley ILs which are currently cloned in the form of cDNA and whose biological activity is yet to be defined.
  • Ley IL transcripts are present in Leydig cells and in other tissues such as the corpus luteu, the trophoblast, the fetal membranes and the breast tissue (Adham, IM et al., 1993; Tashima, LS et al. , 1995).
  • This peptide family has in common structural characteristics defined by the position of different cysteines essential for the formation of a tertiary structure. It has been shown that all members of this family bind to cell surface receptors. These receptors were identified by molecular cloning and characterized in detail for insulin and IGFs.
  • RTK tyrosine kinase receptors
  • EGF receptor growth factor receptor
  • c-met hepatocyte growth factor receptor
  • fms CSF-1 receptor
  • NGF receptor trk
  • IRS-1 insulin and IGFs
  • P13K secretory protein
  • Shc secretory protein
  • GBR2 protein activating mitogenesis
  • Ras Ras
  • Raf protein activating mitogenesis
  • kinase culminating when the cascade of phosphorylation affects different cellular processes such as transcription.
  • the member polypeptides of this family are all characterized by the presence of a signal peptide, a B chain, a C junction peptide or C chain and an A chain.
  • pre-prohormone, prohormone or hormone mature are defined from the presence or absence of certain elements and their arrangement in a tertiary structure.
  • Pre-prohormone is distinguished from prohormone by the presence of the signal peptide element. The distinction between prohormone and active mature hormone is more complex and depends on the hormone considered.
  • the B and A chains are located respectively at the N- and C-terminal ends and are separated by a long C junction peptide which is cleaved during the maturation phase which results in the form active hormone.
  • the C peptide of IGFs is not cleaved during the maturation phase.
  • the mature forms of the IGFs peptides contain, in addition to the domains A, B and C, two terminal carboxyl peptides (domains D and E) which are cleaved after expression.
  • INSL4 insulin-like (related insulins) was characterized (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). This gene was cloned from an early placenta cDNA library and located on chromosome 9p24.
  • the INSL4 gene codes for a polypeptide of 139 amino acids called "EPIL” (insulin-like peptide of early placenta).
  • EPIL polypeptide means the putative polypeptide of 139 amino acids deduced from the coding nucleic acid sequence and as defined in FIG. 1.
  • the deduced amino acid sequence showed, in agreement with the general organization of this family of hormones, certain structural homologies such as the presence of a signal peptide, a B and A chain and a C peptide of junction or C chain, as well as the presence of 6 cysteine residues, which must probably be involved in the formation of 3 disulfide bridges.
  • EPIL polypeptide has a structure closer to insulin, relaxin and LEY-IL than to IGF 1 and 2
  • the inventors were thus able to demonstrate, surprisingly, two expressed forms of the EPIL polypeptide.
  • a form provided with the C chain and a form devoid of the C chain.
  • the inventors have also and just as surprisingly demonstrated that these two expressed forms were localized at different tissue levels.
  • the present invention therefore relates to an EPIL 1 polypeptide encoded by the INSL4 gene, characterized in that it is expressed in human or animal cells, in particular in the human placenta triphoblasts, and in that it consists of a single chain comprising the regions A, B and C of overall amino acid sequence chosen from the amino acid sequences comprised between positions 18 and 139, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said overall sequence comprising at least the amino acid sequence between positions 24 and 139, ends included, said EPIL 1 polypeptide possibly further comprising a signal peptide such that the amino acid sequence of EPIL 1 polypeptide comprising signal peptide is the sequence between positions 1 and 139, ends included, of the amino acid sequence defined in Figure 1.
  • polypeptide also denotes a protein or a peptide. It should be understood that the invention does not relate to polypeptides in natural form, that is to say that they are not taken in their natural environment but that they could have been obtained by purification from natural sources , or else obtained by genetic recombination, or even by chemical synthesis and which can then include non-natural or modified amino acids.
  • the invention also relates to an EPIL 2 polypeptide coded by the INSL4 gene, characterized in that it is expressed in human or animal cells, in particular in human placenta trophoblasts and in that it consists of: a) of a chain A whose amino acid sequence is the sequence between positions 115 and 139, inclusive ends of the amino acid sequence defined in FIG. 1; b) a chain B whose amino acid sequence is chosen from a sequence between positions 18 and 58, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said sequence comprising at least the sequence between positions 24 and 53, ends included; said EPIL 2 polypeptide possibly further comprising an amino acid sequence signal peptide chosen from a sequence between positions 1 and 23, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said signal peptide sequence comprising at least the sequence between positions 1 and 17, ends included.
  • the invention also relates to an EPIL 3 polypeptide encoded by the INSL4 gene, characterized in that it is expressed in human or animal cells, in particular in human placenta trophoblasts and in that it is consisting of a chain C, the amino acid sequence of which is chosen from a sequence between positions 54 and 114, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said sequence comprising at least the sequence included between positions 59 and 114, ends included.
  • the invention also relates to an EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide according to the invention, characterized in that it is preferentially expressed in the cytotrophoblasts of human placenta.
  • the invention further relates to an EPIL 1 or
  • EPIL 3 according to the invention, characterized in that it is present in endothelial cells, preferably vascular endothelial cells, in particular fetal vascular endothelial cells.
  • the EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide according to the invention is characterized in that it is secreted in the amniotic fluid and / or in the fetal circulation.
  • the invention also relates to an EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide according to the invention, characterized in that it is present in smooth muscle cells, in particular vascular smooth muscle cells constituting the wall of vessels such as embryonic vessels or umbilical cord.
  • the invention also includes an EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide according to the invention, characterized in that it is present in the stromal cells, in particular the amnion and / or the embryonic vestige cells, preferably the yolk sac and the 'allantoid located at the level of the umbilical cord.
  • the invention further comprises an EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide according to the invention, characterized in that it is present in tumor cells, preferably in tumor cells of angioproliferative tumor such as for example tumor cells associated with Kaposi's sarcoma. Also preferred according to the invention are intra-tumor vessel tumor cells and Malpighi epithelial cells.
  • the invention also relates to an EPIL 2 polypeptide according to the invention, characterized in that it is preferentially expressed in syncytiotrophoblasts of human placenta.
  • the invention also comprises an EPIL 2 polypeptide according to the invention, characterized in that it is secreted in the maternal circulation.
  • polypeptides according to the invention characterized in that they are involved in the process of differentiation, proliferation and / or regeneration of human and / or animal cells, in particular endothelial cells , smooth muscle cells, preferably of the vascular type, epithelial cells or stromal cells, in particular of the decidue, or cells of the glandular epithelium.
  • the polypeptides according to the invention are also characterized in that they are involved in the process of vascularization of embryonic cells and / or in the process of vascularization of tumors, preferably angioproliferative tumors such as for example Kaposi's sarcoma.
  • polypeptides according to the invention are also characterized in that they are involved in the process of decidualization and / or implantation of the embryo, in a process of the insulin-like type, in particular paracrine and / or autocrine, preferably a process of response to hypoxic stress and / or hypoglycemic stress, in particular a process promoting the use of glucose as a source of energy.
  • polypeptide fragments according to the invention characterized in that they are biologically active, also form part of the invention.
  • biologically active fragment is intended to denote in particular a fragment of the amino acid sequence of a polypeptide according to the invention having at least one of the activities of a polypeptide according to the invention, in particular: - the capacity to modulate the differentiation, the regeneration and / or the proliferation of cells, such as in particular endothelial or smooth muscle cells, in particular vascular cells; the ability to be recognized by an antibody specific for a polypeptide according to the invention; and / or the capacity to modulate the activity of a polypeptide according to the invention, by neutralizing for example the binding of a polypeptide according to the invention on its specific cellular receptor.
  • polypeptide fragment is intended to denote a polypeptide of amino acid sequence comprising at least 5 amino acids, preferably 10 amino acids and 15 amino acids.
  • the invention also includes the homologous polypeptides and variants of the polypeptides according to the invention.
  • the term “homologous polypeptides” is intended to denote the polypeptides having, with respect to the polypeptides according to the invention, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a mutation, in particular a point mutation.
  • homologous polypeptides those whose amino acid sequence has at least 80%, preferably 90%, of similarity with the amino acid sequences of the polypeptides according to the invention are preferred.
  • polypeptide varying means all of the mutated polypeptides which may exist, in particular in humans, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of at least one amino acid residue.
  • the invention further comprises the nucleic acid sequences characterized in that they code for a polypeptide or one of its fragments according to the invention.
  • the complementary sequences or the RNA sequences corresponding to said nucleic acid sequences according to the invention also form part of the invention.
  • the invention also includes the cloning and / or expression vectors containing a nucleic acid sequence according to the invention as well as the host cells transformed by said vectors.
  • vectors according to the invention characterized in that they comprise the elements allowing the expression and / or the secretion of said sequences in said host cells, also form part of the invention.
  • the invention also relates to a method for producing a recombinant polypeptide characterized in that it implements a cell according to the invention.
  • the method for obtaining a polypeptide according to the invention in recombinant form is preferably characterized in that the transformed cells are cultivated under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide, and that said recovery is obtained.
  • recombinant polypeptide The recombinant polypeptides capable of being obtained by said methods also form part of the invention.
  • the invention also includes the polypeptides or one of their fragments according to the invention, characterized in that they are obtained by chemical synthesis.
  • polypeptides corresponding to the polypeptides according to the invention obtained by chemical synthesis and which may contain unnatural amino acids, are also included in the invention.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art. In this case, the sequence of nucleic acid used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
  • the cellular host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotic systems, such as, for example, yeasts, insect or mammalian cells such as CHO cells (Chinese hamster ovary cells) or murine cells or any other system advantageously available.
  • prokaryotic systems such as bacteria
  • eukaryotic systems such as, for example, yeasts
  • insect or mammalian cells such as CHO cells (Chinese hamster ovary cells) or murine cells or any other system advantageously available.
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention is constituted by Chinese hamster ovary CHO cells, and by 3AsubE cells of human placental origin.
  • the vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as appropriate regions for transcription regulation. It must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have particular signals specifying the secretion of the translated protein.
  • control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host.
  • Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example lipofection, electroporation, thermal shock.
  • the invention further relates to the host cells transformed by the preceding vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector. as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence. These cells can be used in a method for producing a recombinant polypeptide according to the invention.
  • bacterial cells Olins and Lee, 1993
  • yeast cells Buckholz, 1993
  • animal cells in particular cell cultures.
  • mammals Edwards and Aruffo, 1993
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells human cells such as 3AsubE cells of placental origin, but also insect cells in which methods can be used using baculoviruses for example (Luckow, 1993).
  • the methods of purification of recombinant or synthetic polypeptide used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant or synthetic polypeptide can be purified using methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono or polyclonal antibodies, etc.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant polypeptide fused to a “carrier” protein (conjugated protein).
  • carrier protein conjuggated protein
  • Specific polyclonal antibodies can be obtained from a serum of an animal immunized against, for example: a polypeptide according to the invention, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures, from a nucleic acid sequence according to the invention or an amino acid sequence of a polypeptide according to the invention.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein, 1975.
  • the antibodies according to the invention are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments. According to the invention, they can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the invention relates to the use of one or more antibodies for the detection, identification, localization, in particular tissue or cell, and / or the assay of a polypeptide according to the invention, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of polypeptide according to the invention. Said use is included in the invention.
  • the expression “several " antibodies” in the present description means at least two antibodies according to the invention of different specificity, that is to say capable of recognizing and binding to two epitopes or different domains of polypeptide according to the invention It is moreover preferred according to the invention to use at least two antibodies of the invention of different specificity for the methods, methods and kits or kits of the invention which include said antibodies, in which case, for example, two different antibody labels or two different development systems may be used. They thus constitute a means of immuno-cytochemical or immunohistochemical analysis of the expression of polypeptide according to the invention on sections of specific tissues, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates.
  • polypeptide according to the invention make it possible in particular to demonstrate and quantify the normal or abnormal specific presence of a polypeptide according to the invention in tissues or biological samples, which makes them useful for the identification and localization of the expression of polypeptide according to the invention, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of the polypeptide according to the invention.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention must be observed qualitatively and / or quantitatively.
  • the invention also relates to oligonucleotide probes or primers, characterized in that they consist of a nucleic acid sequence according to the invention or a fragment thereof, or of a nucleic acid sequence capable of specifically hybridize to said sequence according to the invention, preferably the probes may be labeled.
  • Specific hybridization means that the hybridization is carried out under stringency conditions, in particular under temperature and ionic strength conditions such that they allow hybridization to be maintained between two globally complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the nucleotide sequences described above are advantageously as follows:
  • the hybridization is carried out at a preferential temperature of 65 ° C., in the presence of buffer 6 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05M of sodium citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% of polyvinylpyrrolidone and 0.02% of bovine serum albumin.
  • the washing steps can, for example, be carried out for 5 to 30 min. at 65 ° C, in 2 x SSC or 1 x SSC buffer and 0.1% SDS.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size will be adapted by those skilled in the art for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al., 1989.
  • the invention also relates to the use of probe or primer, for the detection, identification, localization, in particular tissue or cell, amplification, and / or assay of nucleic acid sequence according to the invention, as well as for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of nucleic acid sequence according to the invention.
  • oligonucleotide probes or primers and in general the nucleic acid sequences according to the invention, will have a minimum size of 10 bases and fragments of 20 bases will be preferred, and preferably
  • nucleic acid fragments of interest there may be mentioned in particular the antisense oligonucleotides, that is to say the structure of which ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product .
  • sense oligonucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of the expression of the polypeptides according to the invention, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
  • sense oligonucleotides or antisense are also part of the probes according to the invention.
  • the invention also relates to a method for the detection, identification, localization and / or specific assay of a polypeptide or one of its fragments according to the invention in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of polypeptide according to the invention, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing the biological sample into contact with one or more antibodies according to the invention; b) detection, identification, location and / or determination of the antigen-antibody complex formed.
  • the biological sample consists of a fluid, for example a human or animal serum, blood, amniotic fluid or biopsies.
  • the antibody used in step a) is fixed on a solid support and the demonstration, identification, localization and / or assay of the antigen-antibody complex formed from step b) is carried out using an immunoconjugate or labeled antibody according to the invention.
  • solid supports which can be used such as polystyrene beads, microtiter plates, are well known in the field of immunoassays and will not be developed in the present description.
  • the invention also relates to a kit, or necessary, for the detection, identification, localization and / or specific assay of a polypeptide or one of its fragments according to the invention in a biological sample, in particular in the amniotic fluid. , or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of polypeptide according to the invention, characterized in that it comprises the following elements: a) one or more antibodies according to the invention, in particular being able to be fixed on a solid support; b) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for the immunological reaction; c) where appropriate, the reagents for the detection, identification and / or determination of the antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction, in particular an immunoconjugated or labeled antibody according to the invention.
  • Any conventional procedure can be implemented to carry out such detection, identification, localization and / or assay of the antigen-antibody complex possibly formed.
  • the specific techniques and reagents enabling the detection, identification, localization and / or assay of the antigen-antibody complexes which can be used in the methods of the invention are well known to those skilled in the art. and are, for example, ELISA, RIA or immunofluorescence techniques which can be combined, in the case where the antibodies of the invention are not already immunoconjugated or labeled, with the appropriate reagents such as immunoconjugated antibodies, labeled with fluoroscein or radiolabelled capable of specifically recognizing the antibodies of the invention or the forms of EPIL polypeptide or their fragments, as well as the chromogenic substrates specific for the conjugated enzymes and the control reagents of positive, negative and quantitative control.
  • the invention further relates to a method for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence according to the invention in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of sequence of nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following stages: a) isolation of the DNA from the biological sample to be analyzed, or production of a cDNA from the RNA of the biological sample; b) specific amplification of the nucleic acid sequences according to the invention using primers according to the invention; c) qualitative and / or quantitative analysis of the amplification products.
  • the invention also relates to a method for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence according to the invention in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of acid sequence nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing an oligonucleotide probe according to the invention into contact with a biological sample, the DNA contained in the biological sample having, where appropriate , previously made accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the DNA contained in the biological sample; b) detection, identification and / or assay of the hybrid formed between the oligonucleotide probe and the DNA of the biological sample.
  • the invention also includes a method for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence according to the invention in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of acid sequence nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps: a) contacting an oligonucleotide probe according to the invention immobilized on a support with a biological sample, the DNA of the sample, having, where appropriate, has been previously amplified using primers according to the invention and / or made accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the DNA of said biological sample; b) bringing the hybrid formed into contact between said oligonucleotide probe immobilized on a support and the DNA contained in the biological sample, if appropriate after elimination of the DNA from the biological sample which has not hybridized with the probe, with an oligonucleotide probe, in particular labeled, according to the invention.
  • the invention also relates to a kit or kit for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence according to the invention in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of sequence nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe according to the invention; b) the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction; c) where appropriate, a pair of primers according to the invention as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
  • the invention further comprises a kit or kit for the detection, identification and / or specific determination of nucleic acid sequence in a biological sample, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of acid sequence nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe, called capture probe, according to the invention which can be supplied pre-immobilized on a support; b) an oligonucleotide probe, known as a revelation probe, in particular labeled, according to the invention; c) where appropriate, a pair of primers according to the invention as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
  • a kit or kit for the detection, identification and / or specific determination of nucleic acid sequence in a biological sample or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of acid sequence nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe, called capture probe, according to the
  • the methods or kits according to the invention for the diagnosis of pathologies linked to the presence of tumor cells advantageously form part of the invention.
  • the term “diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of polypeptide or nucleic sequence according to the invention” is also understood to mean “diagnosis of pathologies linked to the presence of tumor cells”, not only the actual diagnosis of the pathology, but also the diagnosis or prognosis of the evolution of said pathology, following for example a therapeutic treatment.
  • said methods or kits can be used to evaluate the effectiveness of a therapeutic treatment of said pathology.
  • the invention therefore also relates to cell labeling methods, characterized in that they use one or more antibodies according to the invention or a probe, in particular labeled, and / or a primer according to the invention.
  • the marking methods according to the invention are preferred, characterized in that they implement a method according to the invention.
  • Techniques for labeling cells with antibodies specific for the compound of said cell, such as that described in Example 4, are well known to immumocytochemists or immunohistochemists and will not be developed in the present description.
  • the amplified products may be treated with the aid of an appropriate restriction enzyme before detecting or assaying the targeted product, in particular by a method according to the invention.
  • PCR-like will be understood to mean all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified. These techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, reverse transcription should be carried out beforehand. There are currently many methods for this amplification, for example the so-called NASBA “Nucleic Acid Sequence Based Amplification” (Compton 1991), TAS “Transcription based Amplification System” (Guatelli et al.
  • nucleic acid quantification techniques in which, for example, the nucleic acid to be quantified is amplified by a PCR type method and in the presence of a standard nucleic acid of the same size and quantity. known and capable of hybridizing to the same primers as the target nucleic acid.
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography.
  • the specificity of the amplification can be checked for example by molecular hybridization using as probes the probes of the invention, in particular labeled.
  • the invention relates in particular to cell labeling methods, characterized in that the cell is an endothelial cell, in particular a vascular cell, a smooth muscle cell, a stromal cell, in particular of the decidue, a cell of the glandular epithelium, in particular the endometrial epithelium of the uterus, or a tumor cell, in particular angioproliferative and those of Sarcoma from Kaposi in particular.
  • the cell is an endothelial cell, in particular a vascular cell, a smooth muscle cell, a stromal cell, in particular of the decidue, a cell of the glandular epithelium, in particular the endometrial epithelium of the uterus, or a tumor cell, in particular angioproliferative and those of Sarcoma from Kaposi in particular.
  • the subject of the invention is also a method for obtaining a cell containing a polypeptide according to the invention and / or a nucleic acid sequence according to the invention, characterized in that it implements a labeling method according to the invention, and in that said labeled cell is isolated.
  • the invention also relates to a cell in that it is capable of being selected by a method of production according to the invention.
  • the subject of the invention is also a method for detecting tumor cells, in particular tumor cells from kaposi sarcoma, characterized in that it implements a labeling method according to the invention.
  • Another aspect of the invention relates to methods of selecting a chemical or biochemical compound capable of modulating the activity of a polypeptide according to the invention, characterized in that they use a polypeptide or one of its fragments according to the invention.
  • invention a nucleic acid sequence according to the invention or a cell according to the invention.
  • Said cell can be a transformed or selected cell according to the invention.
  • Said compounds may, for example, be selected on their capacity to bind to one of the polypeptides according to the invention and may thus inhibit or promote the activity of said polypeptides as, for example, agonist or antagonist ligands of a receptor specific for said polypeptides .
  • Said compounds can also be selected on their ability to bind to a nucleic acid according to the invention and can thus inhibit or promote expression of the gene encoding said polypeptides as an inducer or repressor.
  • Said compounds can also be selected on their ability to modulate on said cells according to the invention in vitro or in vivo, the biological activity of said polypeptides expressed by said cells, such as in particular the differentiation, proliferation or regeneration of cells.
  • the invention further relates to selection methods according to the invention, characterized in that said selected compound is capable of modulating the differentiation, proliferation and / or regeneration of human and / or animal cells, in particular of promoting or to inhibit the differentiation, regeneration and / or proliferation of said cells, in particular endothelial cells, preferably vascular endothelial cells, smooth muscle cells, in particular vascular cells, epithelial cells, stromal cells, in particular of the deciduous tissue, and / or the cells of the glandular epithelium.
  • endothelial cells preferably vascular endothelial cells, smooth muscle cells, in particular vascular cells, epithelial cells, stromal cells, in particular of the deciduous tissue, and / or the cells of the glandular epithelium.
  • the invention also has the aspect of selection methods according to the invention, characterized in that said selected compound is capable of modulating the process of decidualization and / or implantation of the embryo, in particular of promoting or inhibiting the decidualization and / or implantation process.
  • Another aspect of the invention also relates to selection methods according to the invention, characterized in that said selected compound is capable of modulating insulin-like activity, preferably of modulating the response of the cell to hypoxic and / or hypoglycemic stress. , including promoting the use of glucose as an energy source.
  • the invention comprises a method for selecting compounds capable of binding to a polypeptide or one of its fragments according to the invention or capable of binding to a nucleotide sequence or one of its fragments according to the invention, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing said compound into contact with said polypeptide or said nucleotide sequence; b) determining the capacity of said compound to bind with said polypeptide or said nucleotide sequence.
  • the cells transformed or selected according to the invention and expressing said polypeptide or said nucleotide sequence can also be used in said selection methods.
  • Methods for selecting compounds based on the affinity of a compound for another compound (search for specific ligands) with agonist or antagonist effect on a specific desired activity (such as cell-type biochemical activity) are well known and will not be described.
  • the invention also includes chemical or biochemical compounds, which can be selected by a method according to the invention.
  • the compounds capable of being selected may be organic compounds such as polypeptides or hydrates of carbon or other compounds already known, or new organic compounds produced from molecular modeling techniques and obtained by chemical synthesis or biochemical, these techniques being known to one skilled in the art.
  • the invention further relates to compounds according to the invention as a medicament, preferably chosen from: a) a polypeptide or one of its fragments according to the invention; b) an antibody according to the invention; c) a chemical or biochemical compound, characterized in that it is a ligand of a polypeptide or one of its fragments according to the invention; d) a vector according to the invention; e) a vector according to the invention, having on its surface a specific marker of the target cell which one seeks to modulate the activity of a polypeptide according to the invention; f) a probe according to the invention, such as for example the sense or antisense nucleic acid sequences as defined above.
  • the invention relates to compounds according to the invention, intended for the treatment of tumors, in particular angioproliferative tumors such as for example Kaposi's sarcoma.
  • tumors in particular angioproliferative tumors such as for example Kaposi's sarcoma.
  • tumors of the pancreas, liver, uterus, breast, angiosarco e, glioblastoma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma or very particularly leiomyosarcoma are also preferred.
  • EPIL endothelial growth factor
  • the invention also includes compounds according to the invention, intended to promote the vascularization of specific tissues.
  • the invention also includes compounds according to the invention, intended for the treatment of retinopathy, degeneration of the macula, psoriasis, endometriosis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis or hyperthyroidism. Treatments for lesions due to atherosclerosis as well as restenosis after angioplasty are among the preferred treatments.
  • the invention further comprises compounds according to the invention, intended for regenerating and / or differentiating tissue, in particular endothelial, smooth or epithelial muscle, following a degenerative disease or a disease of the endocrine glands, in particular the thyroid or the pancreas, or as a result of damage to said tissue caused by trauma.
  • the invention also includes compounds according to the invention, intended to promote or inhibit embryonic implantation.
  • the invention comprises compounds according to the invention, intended for preventing and / or treating pathologies directly or indirectly linked to an activity of the insulin-like type, preferably linked to a dysfunction of the carbohydrate metabolism, such as hypoglycemia or hyperglycemia.
  • pathologies directly or indirectly linked to an activity of the insulin-like type, preferably linked to a dysfunction of the carbohydrate metabolism, such as hypoglycemia or hyperglycemia.
  • diabetes such as gestational diabetes, and complications linked to diabetes, in particular cardiovascular complications, are particularly preferred.
  • the compounds of the invention as active principles of medicament will preferably be in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.
  • the replacement therapy may be carried out by gene therapy, that is to say by introducing the nucleic acid sequences according to the invention and / or the corresponding genes with the elements which allow their expression in vivo, in the case where one of the genes is insufficiently expressed, for example, or when it is expressed in an abnormal form.
  • Viral vectors can be used, for example on the basis of adenoviruses (Perricaudet et al., 1992), AAVs, Adenovirus Associated Viruses (Carter, 1993), retroviruses (Temin, 1986), poxviruses or herpes viruses ( Epstein et al., 1992). Most of the time, these viruses are used in defective form and, in general, with or without integration into the cell genome. It is also possible to provide non-viral vectors, that is to say synthetic vectors, which mimic viral sequences or which are constituted by naked DNA or RNA according to the technique developed in particular by the company VICAL. .
  • targeting elements ensuring specific expression will have to be provided so as to be able to limit the areas of expression of the polypeptides. he it is even advantageous, in certain cases, to have vectors of transient expression or at least of controlled expression which can be blocked when necessary.
  • the compounds according to the invention which can be used as medicaments offer a new approach for the treatment of diseases linked to the differentiation or unregulated proliferation of specific cells or tissues, or to the absence or insufficiency of certain cells or tissue, for example from trauma.
  • Kaposi's sarcoma can be defined as an angioproliferative disease characterized by a proliferation of spindle-shaped cells probably of heterogeneous origin predominantly endothelial, but also smooth, dendritic and / or monocytic muscle, a neoangiogenesis process, inflammatory cell infiltration as well as edema.
  • SK affects the skin and / or mucous membranes. It can spread to the soft tissues, bones, and lymph nodes and affect visceral organs such as the lungs, the gastrointestinal tract (intestine, liver and spleen), the genitals (prostate, seminal vesicle, testes, bladder, penis, cervix and vulva), brain, kidneys and adrenal glands.
  • the etiology of SK remains an enigma today. However, four different clinical entities are recognized on the epidemiological level (Tappero et al., 1993): 1. Classic, affecting men (male / female ratio 10: 1) between 50 and 80 years of Mediterranean origin or Eastern European Jews, skin localization, chronic course, with secondary cancer developing in 35% of cases.
  • SK associated with AIDS seems to be a disease strictly linked to cytokines where the inflammatory and angiogenic cytokines and the tat protein HIV-1 have an influence on the induction and progression of SK.
  • inflammatory cytokines have the capacity to increase the expression of integrin fixing the RGD (Arg-Gly-Asp) sequence in SK cells and normal endothelial cells.
  • This sequence corresponds to the regions of the proteins of the extracellular matrix (collagen, fibronectin, laminin, tenascin and thrombospondin) which bind to the membrane integrins of cells, thus modulating cell attachment, therefore, participating in the growth and differentiation process and therefore to tumorigenesis.
  • the tat protein of the HIV virus contains RGD sequences, it has been demonstrated that the inflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF, IFN gamma) can moreover increase the binding of the tat protein to the SK cell.
  • the progression of the disease is characterized by the proliferation of spindle cells in both classical SK and in SK associated with AIDS.
  • AIDS is indistinguishable (Tappero et al., 1993).
  • the origin of SK lesion cells remains unclear. The cells are probably mesenchymal cells of
  • Patch clinically, macular lesion, histologically, proliferation of small, irregular spaces carpeted by an endothelium surrounding normal dermal vessels. Whether or not associated with variable inflammatory lymphocyte infiltration.
  • Plaque clinically, small palpable lesion (papule), histologically, expansion of spindle cells in the dermis dispersed among the collagen of the dermis with the formation of irregular vascular channels.
  • Nodule clinically, large palpable nodule, histologically, range of spindle cells with discrete to moderate cytological atypia, erythrocytes in an extensive network of slit-like vascular spaces.
  • SK associated with AIDS seems to respond to antiprotease treatment, in particular by triple therapy (4 international conference on retroviruses and opportunistic infections in February 1997 in Washington).
  • chemotherapy can be started (Bleomycin, Vincristine).
  • the treatment of SK in general can be local (mainly cryotherapy and radiotherapy) or systemic (interferon, chemotherapy). The first is usually the one you start with because having fewer side effects provided it is a mild form.
  • the cutaneous and mucosal localizations are the major indications for their accessibility. Cryotherapy with liquid nitrogen and the laser offer an acceptable cosmetic result.
  • SK remains in the deep dermis and the incidence of recurrence after 6 months increases.
  • Intralesional cytotoxic chemotherapy with vinblastine or vincristine allows a partial or complete response in 60 to 88% of cases with a 40% recurrence rate for patients with SK associated with AIDS in 4 to 6 months.
  • there is the frequent problem of cutaneous sequelae such as post-inflammatory hyperpigmentation.
  • the intralesional injection of interferon alpha as well as TNF alpha is still at the experimental stage.
  • Figure 1 Nucleic acid sequence of the cDNA of the INSL4 gene and amino acid sequence of the EPIL polypeptide encoded by this sequence.
  • Figure 2 Nucleic acid sequence of the cDNA of the INSL4 gene and amino acid sequence of the EPIL polypeptide encoded by this sequence.
  • A Schematic representation of the structure of the EPIL polypeptide and localization of the binding sites of the domains of the EPIL polypeptide recognized by the antibodies 1661 and 7381.
  • Figure 4 Competitive inhibition curve of the binding of polyclonal antibody 7383. The results were obtained by ELISA method on microplate support with the peptide EPIL 23-52 adsorbed. The percentage inhibition of the binding of the antibody 7383 diluted to 1/500 is calculated as a function of the increasing quantity of inhibitor peptide chain B (23-52), having served as immunogen, the molar concentration of which is expressed in notation scientific: 1.0 E-10 equivalent to 1.0 x 10 "10 .
  • Figure 5 Competitive inhibition curve for the binding of the EPIL 02 monoclonal antibody.
  • FIG. 5 represents the competitive inhibition analysis of the EPIL 02 antibody for two different dilutions: 1/2500 dilution (D) and 1/5000 dilution
  • Figure 7 Immunohistochemical detection of the EPIL 1 and EPIL 2 polypeptides.
  • Slices of villous chorionic tissue from placenta less than 3 months (6 to 8 weeks) (photographs A, B, E and F) or term placenta (photographs C and D) have been marked:
  • Figure 8 Quantitative analysis of the levels of mRNA transcripts of the INSL4 gene in cytotrophoblasts (CT) compared to syncytiotrophoblasts (ST).
  • the quantification is carried out by competitive RT-PCR using a standard quantitative DNA in internal control (IQS). Electrophoresis is performed on the ABI DNA sequencer from Perking Elmer and the peak areas obtained are measured. The results are expressed as a percentage of peak area obtained with the target cDNA and the corresponding IQS.
  • IQS quantitative DNA in internal control
  • Figure 9 Analysis by immunoblotting (Western blot) - Figure 9A: Revealing monoclonal antibody EPIL 02 (antichain A)
  • Line 1 Supernatant obtained after solubilization of proteins from infected Sf9 cell cultures. The bands corresponding to the recombinant EPIL polypeptides are very little marked and hardly visible taking into account the factor of dilution of the polypeptides in the crude culture supernatant.
  • Line 2 Effluent after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • Line 3 Eluate after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • Line 2 Supernatant obtained after solubilization of proteins from infected Sf9 cell cultures.
  • Line 3 Effluent after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • Line 4 Eluate after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • Line 5 Fraction 7 after reverse phase chromatography.
  • Line 1 Supernatant obtained after solubilization of proteins from infected Sf9 cell cultures.
  • Line 2 Effluent after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • Line 3 Eluate after affinity chromatography (Sepharose-CNBr-EPIL 02).
  • FIG. 10 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Labeling of tumor cells ("Spindle cells") with the 7381 immuniser (1/500 dilution). Magnification: X 100.
  • Figure 11 Classic Kaposi's sarcoma (N ° 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Absence of labeling of tumor cells (“Spindle cells”) after inhibition of immunserum 7381 (Dilution 1/500) by peptide 59-108Y (18 hours of incubation). Magnification: X 100.
  • Figure 12 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB 2). Marking of tumor cells ("Spindle cells”) by immunserum 7381 (Dilution 1/500). Magnification: X 200.
  • Figure 13 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Absence of labeling of tumor cells ("Spindle cells") after inhibition of immunserum 7381 (1/500 dilution) by peptide 59-108Y (18 hours of incubation). Magnification: X 200.
  • Figure 14 Classic Kaposi's sarcoma (N ° 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Labeling of tumor cells (“Spindle cells”) by immunserum 7381 (Dilution 1/500). Magnification: X 1000.
  • Figure 15 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Absence of labeling of tumor cells ("Spindle cells”) after inhibition of immunserum 7381 (Dilution 1/500) by peptide 59-108Y (18 hours of incubation). Magnification: X 1000.
  • Figure 16 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Marking of tumor cells ("Spindle cells”) by immunserum 7381 (Dilution 1/500). Magnification: X 400.
  • Figure 17 Classic Kaposi's sarcoma (No. 320818) Immunohistochemistry (alkaline phosphatase, Dako LSAB2). Absence of labeling of tumor cells ("Spindle cells") after inhibition of immunserum 7381 (Dilution 1/500) by peptide 59-108Y (18 hours of incubation). Magnification: X 1000.
  • Fig ure 18 Inhibition curves obtained with the monoclonal antibody EPIL 08 for different peptides of the 59-108 portion of the chain C EPIL putative polypeptide.
  • Fig ure 19 Calibration curve obtained with the synthetic peptide corresponding to the 76-139 portion of EPIL putative polypeptide by the method of radioimmunoassay in two sites and using the monoclonal antibody EPIL 08 as capture antibody and antibody monoclonal EPIL 02 marked with 125 I as a tracer.
  • Figure 20 Comparative assay curves of EPIL and 1 hCG in amniotic fluid for a panel of pregnant women obtained with the radioimmunoassay method at 2 sites for the assay of EPIL; other curves were obtained on other panels showing higher concentrations.
  • Figure 21 Marking of the vessels inside the trophoblastic villi by the antibody 7381 directed against the C region of EPIL on trophoblasts aged
  • Figure 22 Marking of smooth muscle cells of cord vessels by the antibody 7381 directed against the C region of EPIL (X 200).
  • Figure 23 Labeling of cells of the endometrial epithelium " of the uterus by the antibody EPIL 08 directed against the C region of EPIL on trophoblasts aged
  • the strategy for detecting the expressed form or forms of the EPIL polypeptide is based on the production and use of monoclonal and polyclonal antibodies directed against synthetic peptides, coupled to carrier proteins, mimicking different regions of putative protein.
  • Synthesis of the peptides and preparation of the immunogens Synthetic peptides are constructed according to the conventional solid phase method on an Applied Biosystems model 431A automaton. The peptides synthesized are presented during the description of the antibodies (see 3). These peptides are purified by exclusion chromatography followed by HPLC and then they are analyzed (amino acid composition and peptide sequencing). They are then conjugated to carrier proteins to prepare immunogens.
  • polyclonal antibodies The production of polyclonal antibodies is carried out by injection of immunogens (peptide-carrier protein conjugates) in female rabbits "Grand Fauve de
  • the immunogen 150 ⁇ g is injected by intradermal multipoint into the back in the presence of complete Freund's adjuvant in physiological saline.
  • the following two booster shots are given on D + 21 and D + 42 respectively by injection of 25 ⁇ g of immunogen in incomplete Freund's adjuvant by subcutaneous route.
  • a third reminder can be made on D + 70.
  • One week after the recall a blood sample is taken from the ear to test for the presence of antibodies.
  • the rabbits "good responders" are bled white by intracardiac puncture.
  • mice of BALB / c strain are immunized by the injection of
  • peptide-carrier protein conjugate as a complete Freund's adjuvant subcutaneously.
  • Reminders by intraperitoneal route 25 ⁇ g of immunogen in incomplete Freund's adjuvant are carried out three months apart until obtaining an immune response, evidenced by the presence of detectable antibodies in the animal's serum.
  • Cell fusion is carried out 3 days after iv (intravenous) injection of the immunogen. It consists of removing and dissociating the spleen from the mouse and, in a second step, fusing with polyethylene glycol.
  • the hybridomas are selected in a selective medium containing 1 aminopterin.
  • the production of monoclonal antibodies by hybridomas is analyzed by an immuno-enzymatic solid phase method (binding to the immunogenic peptide).
  • the producing hybridomas are cloned twice by limiting dilution and the mass production of antibodies is carried out by injection of the hybridomas intraperitoneally into the Nude mouse.
  • the monoclonal antibodies are then purified from the ascites liquids by an affinity chromatography method on
  • Sepharose-protein A (Pharmacia) after precipitation of ammonium sulfate proteins.
  • Antibody binding characteristics are established by solid phase immunoenzymatic (ELISA) and radioimmunological (RIA) methods. Briefly, the ELISA method is carried out by adsorbing one or more peptides mimicking a sequence of a domain of the putative polypeptide EPIL, diluted in a 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, on a solid support (polystyrene plate COSTAR / EIA). After an incubation of 18 hours at + 4 ° C, the supports are saturated with an albumin solution and the antibodies to be tested are added for an incubation of 1 hour at 37 ° C.
  • ELISA solid phase immunoenzymatic
  • RIA radioimmunological
  • the binding of the antibodies is detected by the addition of a secondary antibody labeled with peroxidase (RAM / IgG (H + L) Po, TEBU).
  • the chromogen solution o-phenylene diamine
  • An inhibition method competitive can be performed to specify the location of sites recognized by antibodies. For this, the antibodies are previously incubated with synthetic peptides at different concentrations, for example representative of shorter sequences than that of the peptide adsorbed on the support. The mixture is then deposited on the support and the residual antibody activity is measured. The results are expressed as a percentage of binding inhibition.
  • the RIA method is developed in a similar way, except for the fact that the peptide is radiolabelled with a 125 ⁇ isotope according to the so-called Iodogen process.
  • the immune complexes potentially formed with the antibody are precipitated by polyethylene glycol (PEG 6000) and, after washing, the radioactivity is measured. It is also possible to carry out a competitive inhibition experiment as described above. 3.
  • Antibody characteristics are also possible to carry out a competitive inhibition experiment as described above. 3.
  • a polyclonal antibody numbered 7381, is obtained by immunization of rabbits with an immunogen comprising a synthetic peptide mimicking the putative C chain 59-108 Tyrosine (Y) sequence ( Figure 2) coupled by benzidine to the keyhole limpet hemocyanin (KLH), carrier protein.
  • This antibody binds to the sequence 59-108 of domain C of the EPIL polypeptide ( Figure 3A). It does not recognize the analogous sequence in relaxin H2 (RLX-H2), a protein which has the greatest structural similarity (67%) in the C domain.
  • This antibody is capable of detecting the recombinant polypeptide comprising the C domain, for example in an immunoblot method, and to demonstrate the physiological EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide, by example at the level of the placenta (see example 4, relating to immunohistochemistry).
  • a polyclonal antibody numbered 1661, is obtained by immunization of rabbits with an immunogen comprising a mixture of synthetic peptides mimicking the sequences 23-52 of the putative B chain and 115-139 of the putative A chain
  • Figure 2 coupled by benzidine to tetanus toxoid, carrier protein.
  • This polyclonal antibody contains antibodies mainly directed against the region 115-139 of chain A and to a lesser extent against the sequence 23-59 of chain B (FIG. 3B). It makes it possible to detect a recombinant polypeptide comprising the A and / or B domains, for example in an immunoblotting method, as well as the native EPIL polypeptide and its molecular forms comprising the A and / or B domains, such as for example the polypeptides.
  • EPIL 1 and EPIL 2 are antibodies mainly directed against the region 115-139 of chain A and to a lesser extent against the sequence 23-59 of chain B (FIG. 3B). It makes it possible to detect a recombinant polypeptide comprising the A and / or B domains, for example in an immunoblotting method, as well as the native EPIL polypeptide and its molecular forms comprising the A and / or B domains,
  • a polyclonal antibody numbered 7383, and obtained by immunization of rabbits with an immunogen comprising a mixture of synthetic peptides mimicking the sequences (31-49) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) of the putative B chain coupled by MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succimimide) to keyhole limpet hemocyanin (KLH), carrier protein (Figure 4).
  • EPIL 02 IgG2a
  • An immunogen comprising a synthetic peptide mimicking the 125- 137-Y sequence of the putative A chain coupled by benzidine to tetanus toxoid, carrier protein (figure 5).
  • This antibody can be used for the preparation of an affinity chromatography column making it possible to separate and purify the polypeptide of recombinant origin (see example 2).
  • EPIL 08 IgG2a
  • IgG2a A monoclonal antibody, called EPIL 08 (IgG2a) is selected after immunization of mice with an immunogen comprising a synthetic peptide mimicking the sequence 59- 108 -Y of the putative C chain coupled to the carrier protein.
  • This antibody recognizes a long sequence of 13 amino acid residues comprising the 88-100 portion of the C chain as shown by the results obtained by competitive inhibition (see FIG. 18).
  • the extra short form INSL4 (coding sequence) is inserted into the lower eukaryotic (baculovirus) expression vector pFastBac TM (GIBCOBRL) at the Kpnl site. Subsequently, coinfection of the SF9 insect cells with DNA of wild baculovirus (AcMNPV, GIBCOBRL) and of the transfer vector containing the gene of interest is carried out, in order to constitute a homologous recombination. 2. Sequencing
  • the analysis of the restriction profile of the recombinant DNA is carried out using different endonucleases (Kpnl, EcoRl) and by automatic sequencing (specific primers of DNA
  • a Sepharose-CNBr-EPIL 02 column is prepared as follows. Three grams of gel are swelled in 20 ml of HCl for 4 hours. The gel is then introduced into a column (20 x 1.5 cm) and then rinsed with a coupling solution (0.1 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.5). After elimination thereof, 1.5 to 4 mg of purified monoclonal antibody EPIL 02, diluted in the coupling solution, are added. After 18 hours at + 4 ° C. with stirring, the free sites are blocked with 1 M ethanolamine then the column is washed with 0.1 M CH 3 COONa solution, 0.1 M CH 3 COOH, NaCl 0 , 5 M, pH 4. Finally, the column is rinsed with 0.05 M Na 2 HP0 4 , pH 8.5.
  • a coupling solution 0.1 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.5
  • the supernatant recovered after solubilization is diluted 1/10 in 0.05 M Na 2 HP0 4 buffer, pH 8.5. After dilution, the solution is brought into contact for 18 h at + 4 ° C with the Sepharose-CNBr-EPIL 02 support with slow stirring. Washings are carried out with a 0.05 M Na 2 HP0 4 buffer, pH 8.5 in the presence of 0.01% NP40. The procedure is automated on FPLC equipment (Pharmacia). The washing time is conditioned by the return of the optical density to the basic level. The collected fractions constitute the effluent. The elution of the antigen linked to the antibody is carried out with a 2.5% acetic acid buffer. The fractions collected constitute the eluate. The effluent and the eluent are analyzed by an immunoblotting technique with EPIL 02, 7381 and 7383 as revealing antibodies.
  • phase A TFA 0.1% - 99.9% H 2 0
  • phase B TFA 0.08 - 4.92% H 2 0 -
  • the presence as well as the relative molecular weights (M r ) of the molecular forms of the recombinant EPIL polypeptide are determined by electrophoresis followed by immunoblotting. Briefly, the method consists in migrating the protein preparations to be tested in a polyacrylamide gel (30% w / v acrylamide, 0.8% w / v bis acrylamide; Tris-Hcl 1.5 m, pH 8.8) for 30 minutes at 200 volts. After migration, the proteins are transferred to a support of the PVDF filter paper type under the influence of an electric field. The support is then saturated in " blocking buffer and then incubated with the antibodies.
  • (1-139) corresponds to a mass of 15,445.05 Da.
  • the mass difference of 43 Da with respect to the experimental molecular mass M2 could be attributed to an acetyl group (CH3-CO-).
  • the coding sequence corresponding to the extra short form INSL4 is cloned into the eukaryotic expression vector pSec Tag C TM (INVITROGEN) at the BamHI-Xbal site (diagram in FIG. 6).
  • pSec Tag C MOCK digested with the same restriction endonucleases
  • a recombinant clone is selected 1 / by PCR analysis, 2 / by a study of the restriction profile of the recombinant DNA with respect to different endonucleases (BamHI, Xbal, ECOR1) and 3 / by automatic sequencing (primers specific for INSL4 DNA and the multiple cloning site of the plas ide pSec
  • the expression vector having integrated the INSL4 gene is transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO line). Two transfection methods can be used: the Calcium Phosphate method and electroporation.
  • the use of 10 to 20 ⁇ g of plasmid DNA allows genomic integration of the INSL4 recombinant DNA. Thanks to the presence of an antibiotic resistance marker present in the vector, cell clones stable recombinants, having integrated pSec Tag C INSL4, are selected by culture in a medium containing 600 ⁇ g / ml of ZEOCIN TM (INVITROGEN).
  • Northern blot The selected clones are established in culture. The study of the expression of the pSec TagC INSL4 transcripts is carried out by Northern blot after extraction of the mRNAs. Twenty four hours after hybridization of the INSL4 probe (BamHI-Xbal insert), the expression of the pSec Tag C INSL4 recombinant transcript is demonstrated in all the transfected cells. The size of the mRNA, 900 bp, corresponds to that expected for the putative transcript (907 bp).
  • the expression of the recombinant INSL4 transcript in CHO cells is also confirmed by an RT-PCR analysis.
  • the purification of the various recombinant placental hormonal forms produced from the culture media and the transfected cells shows, by the immunoblotting method, the presence of protein forms of 16.5 and 20 kDa in the transfected cells, as well as protein species of 6.5, 10 and 16.5 kDa in the medium of pSec Tag C INSL4 transfected CHO cells.
  • Placental villi obtained from early (7 weeks) and long-term placenta were provided by the Hospital's Obstetrics and Gynecology Department
  • the tissues are fixed in a neutral pH buffer containing 10% formalin and then included in paraffin.
  • villous cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts previously purified from placenta at term.
  • the isolation of cytotrophoblast cells from the villous placenta is carried out as described by Guillaudeux T. et al. (1995) by enzymatic digestion and centrifugation in Percoll gradient as for the primary cultures.
  • the villous cytotrophoblasts and differentiated villous syncytiotrophoblasts, formed in vitro from cytotrophoblasts (4-5 days in culture), are highly purified (less than 1% of contaminating cells).
  • cytotrophoblasts the cells purified from villous cytotrophoblasts and the cells in vitro differentiated from syncytiotrophoblasts are referred to herein as cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts respectively.
  • the immunohistochemical analysis of the embryonic vessels was carried out both on trophoblastic villus sections of 10 SA (Antoine Béclère hospital) and of an umbilical cord of a human embryo of 11 SA (Robert Debré hospital, France) 2 samples obtained as part of the voluntary termination of pregnancy.
  • Tissue sections of 3 ⁇ m are produced, mounted on SuperFrost / Plus plates and degreased on xylene. The rehydrated sections are passed over a microwave for 15 minutes in the presence of 10 mM citrate buffer, pH 6.0. After several washes in phosphate buffered saline (PBS), the sections are incubated for 20 min in the presence of the antibody given.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the sections are then washed and then labeled with a biotinylated antibody followed by an alkaline phosphatase coupled to streptavidin.
  • the labeling is then revealed by incubation in the presence of the chromogenic substrate solution (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate System, Carpinteria, CA).
  • the negative control control tissue sections are made with sections incubated in the presence of non-specific antibodies (pre-immune serum) or in the presence of antibodies pre-absorbed on an excess of corresponding peptide (FIG. 7).
  • the polyclonal antibody 7381 immunoglobulin diluted with
  • the negative controls used are the preimmune serum (Jo) and the 7381 immunserum inhibited by the corresponding peptide (59-108Y) with an incubation of 18 hours.
  • the other primary antibodies (Ab) were chosen as positive controls making it possible to confirm the diagnosis of SK: Antifactor VIII Ab (endothelial phenotype) and alpha vascular smooth muscle antiactin Ab (smooth muscle phenotype).
  • INSL4 mRNAs are quantified by the RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) method as described in Bellet, D. et al. (1997). Briefly, the TFIID transcripts are quantified and used as endogenous control mRNA. The PCR is carried out over 30 amplification cycles.
  • the nucleic acid sequences of the primers used for the PCR amplification are as follows: INSL4-F: F 5 '-AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3' INSL4 -R: 5 '-TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT- 3' TFIID-F: F 5 '-ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3 'TFIID-R: 5' -CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3 '(F: fluorescein dye).
  • Two antibodies, designated 7381 and 1661, directed respectively against the polypeptides EPIL 1 and / or EPIL 3, and EPIL 2 were selected.
  • the antibody 7381 directed against the 59-108-Y domain of the C chain conjugated with a carrier protein has been found to be completely specific for the EPIL 1 and / or EPIL 3 polypeptide. Indeed, the competitive inhibition experiments carried out with peptides or sub-peptides analogous to the C chain portion of the putative EPIL polypeptide or the corresponding portion of human relaxin, demonstrate that antibody 7381 binds only to the C domain of the putative EPIL polypeptide at its 59-88 portion and does not recognize the C chain of human relaxin (Figure 3A).
  • the hormone relaxin is the only member of the insulin-like superfamily with a significant percentage (37%) of similarity with the putative EPIL polypeptide in the portion of domain C corresponding to region 59-88 of the EPIL polypeptide.
  • the 1661 antibody was obtained by immunization carried out with a mixture of two peptides analogous to domain 115-139 of chain A and to domain 23-52 of chain B. These two regions of the putative polypeptide EPIL do not have a significant percentage similarity with corresponding regions of other members of the superfamily ( ⁇ 16%).
  • Competitive inhibition experiments demonstrate that this polyclonal antibody is mainly directed against domain 115-139 of chain A and also contains a subpopulation of antibodies directed against domain 23-52 of chain B (Figure 3B).
  • the munohistochemical methods based on the antibodies 7381 and 1661 were used to detect the presence of the polypeptides EPIL 1 and / or EPIL 3, and EPIL 2 respectively in the tissues of early placenta (less than 3 months) and of placenta at term.
  • Figure 7 represents the results obtained from experiments carried out on tissues of at least two pregnant women.
  • the immunolabeling carried out with the antibody 7381 directed against the polypeptide EPIL 1 and / or EPIL 3 is very important in cytotrophoblasts of early placenta whereas it is light or even absent in syncytiotrophoblasts (FIG. 7B).
  • results obtained with the anti-EPIL 2 polypeptide 1661 antibody show that both the cytotrophoblasts and the syncytiotrophoblasts of the early placenta are stained (FIG. 7F). In contrast, this antibody does not mark the placental trophoblasts at term (results not shown).
  • Analysis of mRNA transcripts The results obtained by the RT-PCR method and the quantitative analysis method by PCR show that the levels of INSL4 mRNA transcripts in the differentiated villous syncytiotrophoblasts in vi tro obtained from term placenta, are ten times higher (one log unit) higher than those observed in cytotrophoblasts ( Figure 8). In contrast, the levels of TFIID transcripts are similar in the two cell types.
  • Detection of mRNA does not imply that proteins are synthesized, as for example for HLA class I expression in the placenta.
  • the villous cytotrophoblasts express the HLA class I mRNAs, but do not synthesize the corresponding proteins, whereas the extravillous trophoblasts transcribe and translate the HLA class I genes (Hunt, JS et al., 1990).
  • the placenta which transcribes a large number of genes, is also a source of many polypeptides, including insulin-like growth factors, which are known to be essential at the early stage of embryonic development and, after birth, and to participate in the growth and functional activity of almost all the organs of the human body (Le Roith, D. 1997).
  • insulin-like growth factors which are known to be essential at the early stage of embryonic development and, after birth, and to participate in the growth and functional activity of almost all the organs of the human body (Le Roith, D. 1997).
  • the C junction peptides or C chain are mediators for the formation of the tertiary structure of proteins and in particular for the correct assembly of the three disulfide bridges of the mature hormone.
  • This capacity for selective excretion of different peptides in various biological compartments has already been illustrated by other polypeptide hormones such as for HCG and its free subunits.
  • the EPIL 1 and / or EPIL 3 polypeptide is (are) also present in vascular endothelial fetal cells. Recent results (Zhou, Y.
  • the objective of the immunohistochemistry experiment series is to study more precisely the intravillository embryonic vessels as well as the umbilical cord of the 1st, 2nd and 3rd trimesters.
  • the immunohistochemistry experiments confirm the presence of immunostaining at the level of the embryonic vessels of the floating villi, in particular at the level of the endothelial cells in a case of 12 SA trophoblastic sampling. .
  • the embryonic vessels of primary villi exhibit immunolabelling of the cells constituting the vessel wall, the smooth muscle cells, while the endothelial cells are almost no longer marked.
  • Umbilical cord (11 SA) Media + NT * Endoth + Media + Vx (3 vx) (3 vx) (3 vx)
  • Reading the slides corresponding to the umbilical cord also highlights the endodermal embryonic vestiges, in particular the yolk sac (yolk sac) and the allantois. These structures are visible alongside the three vessels and are marked by the immune serum 7381 antichaine C. It is interesting to note that the allantois, as well as the yolk sac (yolk sac) are embryonic structures (of endodermal origin) very important in terms of vasculogenesis. Indeed, these structures are the seat of the process of differentiation of hemangioblastic cells (derived from the mesoderm) into angioblastic and hematopoietic cells. Moreover, it is interesting to recall that this differentiation process corresponding to the first stages of vasculogenesis (from the 3rd week of gestation) and appears to be induced VEGF not synthesized by the endoderm (Risau, W., 1997).
  • the decidualization process of the endometrium is essential for implantation of the embryo to be possible. This process is dependent on the ovarian steroid hormones, especially progesterone.
  • One of the modifications during decidualization concerns the stromal cells of the endometrium. Indeed, the stromal cells undergo in the vicinity of the implantation site morphological (polygonal, cytoplasm of enlarged size, appearance of epitheloid cells) and functional modifications (rich in glycogen and lipid, autocrine secretion and / or paracrine of prolactin, relaxin, renin, IGF and IGFBP) (Speroff, L.
  • TGF-alpha transforming growth factor-alpha
  • stromal cells a study has demonstrated the localization of transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) in the endometrium, the decidue and the trophoblast (Horowitz, GM et al., 1993).
  • decidualization of stromal cells is accompanied by changes in cell motility which involves a change in the extracellular matrix (secretion of laminin by stromal cells, for example). It appears in rats that the expression of basic bFGF or fibroblast growth factor at the level of uterine stromal cells, is dependent on progesterone and could be a growth factor co-regulating stromal cells and therefore be involved in the differentiation process. (decidualization).
  • EPIL 1 or 3 we have demonstrated by immunohistochemistry with the immune antichain C serum a marking of the decidualized stromal cells, as well as of the endometrial glandular epithelium of the deciduous or deciduous parietal and basal 1 st trimester pregnancies (see Figure 23). It is interesting to note that in a similar way to the growth factors of the family of EGF, in particular TGF-alpha, the localization of EPIL 1 or 3 is found both at the level of the trophoblast and at the level of the deciduous
  • the EPIL polypeptide should be involved in the implantation process at the time of attachment, like TGF-alpha.
  • the EPIL polypeptide should also be involved in the differentiation of internal stromal cells which constitute one of the cellular changes in decidualization. Indeed, like relaxin, the EPIL polypeptide should have a stimulating role on the synthesis of PRL by stromal cells and thus participate in the decidualization process.
  • a sandwich assay by 2-site immuno-radiometry is used for the detection and assay of the forms of EPIL polypeptide obtained by recombinant route, in different fractions in the chromatography procedures or in the biological samples where these forms are likely to be present.
  • This assay can be carried out for example by using a solid phase, such as polystyrene beads (Precision Plastic Bail, Chicago, MN), coated with monoclonal antibody EPIL 08 as capture antibody, and by using the monoclonal antibody EPIL 02 marked with 125 I as a radiolabelled indicator.
  • the beads coated with EPIL 08 monoclonal antibody are for example incubated for 2 hours in the presence of the test sample diluted in calf serum.
  • the sensitivity of the assay obtained approximately 50 ng / ml with a 2 hour incubation of the sample to be analyzed, can be improved for example by proceeding with the 2-stage incubation of 6 and 18 hour incubations, approximately 10 ng / mL (see Figure 19).
  • the dosage of EPIL in the amniotic fluid of pregnant women is carried out by immunoradiometric assay according to the method described above. Concentrations of EPIL polypeptides ranging from 10 to several hundred ng / mL are detected in pregnant women. Figure 20 shows the results obtained on a panel of women, other results have shown that the concentrations can reach several hundred ng / mL.
  • c) Application to the assay of EPIL in the serum The assay of EPIL in the serum is carried out by immunoradiometric assay according to the method described above. Concentrations of EPIL polypeptides ranging from 10 to 100 ng / mL are detected. 4) Kaposi's sarcoma
  • the objective of the immunohistochemistry experiment series is to study the expression of the EPIL 1 or EPIL 3 polypeptide at the level of SK biopsies.
  • the various immunohistochemistry performed with the polyclonal antichain C antiserum directed against EPIL 1 and / or EPIL 3 (ac 7381 immunserum diluted 1: 500) made it possible to detect the polypeptides EPIL 1 and / or EPIL 3 at the level of '' about 50% of the 28 cases of SK.
  • the immunostaining is localized at the level of the fusiform tumor cells or spindle cells as well as at the level of intratumoral vessels and / or vessels of the "slit-like" type (without endothelium) and most often in late lesions of the nodular type.
  • the intensity of the immunostaining is moderate (+ to ++) in the majority of cases, with however in 8 cases the observation of an intense immunostaining (+++).
  • Out of the 4 cases of SK associated with AIDS only one case has weak to moderate labeling in tumor cells, the others being all negative.
  • Table 3 (cf. Table 3 below), has confirmed an intense immunostaining, noted (3) on the table, at the level of 4 classic skin nodular stage SKs.
  • Immunolabelling is relatively heterogeneous localized in the cytoplasm of fusiform tumor cells (SC).
  • SC fusiform tumor cells
  • all cases of SK show immunostaining by 1' 7381 immune serum of the squamous epithelium (skin) and the sebaceous glands.
  • skin marking rather concerns the basal cells of the squamous epithelium with cytoplasmic and nuclear labeling. It should be noted that normal (healthy) skin did not exhibit immunostaining with the immune serum 7381 during experiments carried out in parallel.
  • Figures 10, 12, 14 and 16 correspond to the results obtained for a case of classic cutaneous Kaposi's sarcoma after immunohistochemistry (PA, Dako LSAB2) with 1 ' immune serum
  • FIGS. 11, 13, 15 and 17 correspond to the negative control after inhibition of the immune serum 7381 by the peptide 59-108 Y (18 hours of incubation) using the same immunohistochemistry technique. There is an absence of complete labeling.
  • Polyclonal rabbit antibodies recognizing the C chain (7381 immune serum) and the A and B chain (1661 immune serum) made it possible to demonstrate the polypeptide EPIL 1 and / or EPIL 3, and EPIL 2 respectively at the placenta with expression of the EPIL 1 and / or EPIL 3 polypeptide at the level of cytotrophoblastic cells.
  • Zhou et al. (1997) showed how important the differentiation of extravillous cytotrophoblasts into cells with endothelial phenotype was important in the physiology of placental development.
  • EPIL polypeptide Insulin-like activity of the EPIL polypeptide (EPIL 1, 2 and / or 3)
  • HC Carbohydrates
  • carbohydrates are the main source of energy in the body. Regulatory systems ensure a constant adjustment between HC requirements and glucose formation.
  • the organs involved in this regulation are the pancreas and the liver.
  • the beta cells of the islets of Langerhans of the pancreas are the place of synthesis and secretion of insulin, but also of glucagon and somatostatin.
  • the liver has a function of storing glucose by glycogenesis (like adipocytes) and of synthesis of glucose by neoglucogenesis. Its vital function is to make glucose available by glycogenolysis if necessary (hypoglycemia).
  • Proinsulin is made up of two chains A and B with a chain C called the connecting peptide. Insulin is biologically active after having undergone a cleavage of its C peptide. It acts on a transmembrane receptor of the tyrosine kinase family which via a phosphorylation cascade intervenes on the regulation of enzymes of the different metabolic pathways ( carbohydrate, fat and protein). The main role of insulin is to allow the use of glucose by the cell as well as the synthesis of lipids and proteins (anabolism).
  • glucose is facilitated, for example, in the muscle / adipocyte by a stimulating action of glucose and insulin on its transporter (GLUT-4).
  • Insulin stimulates or inhibits the expression of a series of enzymes involved in the metabolic glucose pathway of E den-Meyerhof such as glucokinase (GK), PFK2 and LPK (insulin stimulating action), PEPCK and F-1,6-P2ase (insulin inhibiting action).
  • GK glucokinase
  • PFK2 and LPK insulin stimulating action
  • PEPCK PEPCK
  • F-1,6-P2ase insulin inhibiting action.
  • glucose is then metabolized to pyruvate and actate, then to C0 2 , H 2 0 and ATP after passage through the Krebs cycle or citric acid cycle (at the level of mitochodria by oxidative phosphorylation).
  • G6P glucose 6 phosphate
  • pentose phosphate the pathway of pentose phosphate, also stimulated by insulin and responsible for the formation NADPH +, coenzyme essential for the biosynthesis of lipids.
  • the pentose pathway is the source of essential ribose for nucleic acid synthesis.
  • type I diabetes There are two types of diabetes: type I or juvenile diabetes. It is an autoimmune disease characterized by destruction of the islets of Langerhans, therefore not an insulin deficiency; type II or adult diabetes, on the other hand, is characterized by insulin resistance.
  • Gestational diabetes its diagnosis is made during pregnancy (fasting hyperglycemia) and generally disappears after childbirth. During the second trimester, the insulin level increases considerably in part by the increase in hormonal anti-insulin activity. Indeed, the placenta produces diabetogenic hormones such as human lactogenic placental hormone (hPL), estrogen and progesterone. In addition, pituitary prolactin and cortisol are antagonists of
  • pancreatic hypersecretion regulator is then set in motion. If the pancreas has a dysfunction, it will not be able to respond to this new physiological state of pregnancy and glucose intolerance or even gestational diabetes may result (Becker,
  • the major complication is cardiovascular.
  • the mechanisms underlying this diabetic complication are those of atherosclerosis and constitute diabetic macro-angiopathy. Briefly, in diabetes, endothelial cells of the vessels undergoes various aggressions "Physical and chemical such as hypertension, hyperglycemia, and 1 hypercholesterolemia. These repeated lesions 1 vascular endothelium lead through macrophages, platelets and growth factors to the progressive accumulation of smooth muscle cells, extracellular matrix and lipids in the intima and the media. These are the lesions that contribute to the narrowing of the vascular lumen. of the EPIL polypeptide
  • EPIL is an ORP (oxygen-related protein) or GRP (glucose-related protein) type like VEGF. From the third trimester, the placenta becomes the organ through which fetal-maternal exchanges take place, in particular via a considerably developed embryonic vascular network. It is interesting to recall that recently certain studies have demonstrated the role of VEGF in embryonic vasculogenesis with an increased expression from the 3 rd week of gestation in the endoderm, responsible for the differentiation of the overlying mesenchyme into hemangioblasts (Risau, W . , 1997) . In addition, VEGF has been shown to be an oxygen-regulated protein (ORP) and glucose (GRP). Indeed, Stein et al.
  • ORP oxygen-regulated protein
  • GRP glucose
  • hypoxia and hypoglycemia seem to increase the expression of VEGF, in particular by a mechanism for stabilizing its messenger RNA (Stein, I. et al., 1995).
  • glucose transporter GLUT-1 is stimulated by hypoglycemia and allows the cell in a hostile environment to use the maximum amount of glucose as an energy source (Stein, I. et al., 1995).
  • the EPIL polypeptide should be involved in these stress response processes, either hypoxic or hypoglycemic through an insulin-like effect.
  • VEGF tissue under stress
  • Insulin-like effect of EPIL and the placenta is until the end of the first trimester in an environment of relative hypoxia.
  • nutrients in particular glucose
  • it is most certainly in a hypoglycemic state.
  • it is a highly mitogenic tissue of pseudotumoral type, therefore in increased energy need.
  • producing an insulin-like molecule with improved glucose use would allow the placenta to continue its development and growth.
  • the placenta is responsible for the breakdown of insulin and that it is the source of diabetogenic proteins such as hPL, estrogens and progesterone.
  • the EPIL polypeptide should thus play the role of insulin by an insulin-like auto / paracrine effect.

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Abstract

La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, telles que le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques, à la différentiation et/ou à la régénération de tissus, à moduler l'implantation embryonnaire et au traitement de pathologies liées à l'activité insulin-like, telles que le diabète et ses complications.

Description

IDENTIFICATION ET LOCALISATION DE POLYPEPTIDES EPIL EXPRIMES, CODES PAR LE GENE INSL4 ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 ( INSL4 ) , leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, notamment angioprolifératives comme le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques et/ou à la régénération de tissus.
L'insuline, l'IGF-1, l'IGF-2 (« Insulin-like growth factors 1 and 2 » ou facteurs de croissance de type insuline 1 et 2) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire.
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-1 sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale .
La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogie, L.V. et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau où une expression très importante a été observée, reste à être élucidé.
On a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L qui sont actuellement clones sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteu , le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995). Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire . On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs . Ils appartiennent à la super- famille des récepteurs tyrosine- kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c- erbB2/neu (récepteur EGF) , c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes) , fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF) . La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine- kinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à des phosphorylations . Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2 , Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP) , kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription. Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives . Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chaîne C et une chaîne A. Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré- prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée .
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit à la forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression.
Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4 , de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été caractérisé ' (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été clone à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisé sur le chromosome 9p24.
Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé « EPIL » (peptide insulin-like de placenta précoce) .
Pour plus de clarté dans la présente description, on désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique codante et tel que défini dans la figure 1. La séquence d'acides aminés déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans la formation de 3 ponts disulfures.
Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARN du gène INSL4 sont présents en particulier au niveau du tissu placentaire et utérin.
L'analyse par analogie de la séquence peptidique et nucléotidique de l'EPIL, comparée aux autres séquences des membres de la famille, ainsi que l'étude de la distribution des transcrits laisse supposer aux auteurs de ces documents que le polypeptide EPIL a une structure plus proche de l'insuline, de la relaxine et de LEY- IL que de 1 ' IGF 1 et 2
(Chassin, D. et al., 1995). L'analyse par homologie de l'EPIL comparée aux autres membres de la famille ne permet pas de déduire les caractéristiques essentielles comme par exemple l'identification et la localisation de la forme exprimée du polypeptide EPIL codé par le gène INSL4 .
La connaissance de ces caractéristiques essentielles permettrait en effet d'élaborer par exemple, des peptides synthétiques" correspondant à des formes prédéterminées (pré-prohormone, prohormone ou hormone mature) exprimées ou à des domaines particuliers de ces formes prédéterminées (chaînes A, B ou peptide C) . Ces peptides synthétiques peuvent être utilisés comme agonistes ou antagonistes de l'activité correspondante. Ils peuvent également être utilisés comme peptide antigénique et permettre l'obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre des formes ou domaines particuliers de cette hormone. La localisation tissulaire de la ou des formes exprimées par le gène INSL4 permettrait de préétablir le ou les types d'activité biologique dans lesquels cette nouvelle hormone est impliquée. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Compte tenu de ce qui précède, en particulier de l'analogie de structure entre l'insuline, la relaxine et le polypeptide EPIL, laissant supposer ainsi que la forme exprimée et mature du polypeptide EPIL est unique et sous une forme dépourvue de chaîne C, et compte tenu des pratiques habituelles d'identification et de localisation de la forme exprimée d'une hormone à partir de la connaissance de sa séquence codante, les inventeurs ont néanmoins utilisé des anticorps antichaîne C, à partir de constructions de peptide mimant le domaine C du polypeptide
EPIL putatif, en plus des anticorps antichaîne A et B dans leur recherche d'identification et de localisation des formes exprimées.
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante deux formes exprimées du polypeptide EPIL. Une forme pourvue de la chaîne C et une forme dépourvue de la chaîne C. Les inventeurs ont également et de manière tout aussi surprenante mis en évidence que ces deux formes exprimées étaient localisées à des niveaux tissulaires différents.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trôphoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
Dans la présente description, le terme de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide. II doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention a également pour objet un polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué : a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
L'invention est relative aussi à un polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
L'invention concerne en outre un polypeptide EPIL 1 ou
EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, notamment les cellules endothéliales vasculaires foetales.
De préférence, le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
L'invention est également relative à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses, en particulier les cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseaux tels que les vaisseaux embryonnaires ou de cordon ombilical. L'invention comprend aussi un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules stromales, notamment 1 ' amnion et/ou les cellules de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du cordon ombilical.
L'invention comprend en outre à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales, de préférence dans des cellules tumorales de tumeur angioproliférative telles que par exemple les cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi . Sont également préférées selon l'invention, les cellules tumorales de vaisseau intra-tumoral et les cellules épithéliales de Malpighi .
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain.
L'invention comprend également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de differentiation, de prolifération et/ou de régénération des cellules humaines et/ou animales, notamment les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, de préférence de type vasculaire, les cellules épithéliales ou les cellules stromales, notamment de la décidue, ou les cellules de l'épithélium glandulaire. Les polypeptides selon l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires et/ou dans le processus de vascularisation des tumeurs, de préférence les tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
Les polypeptides selon l'invention sont aussi caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine, de préférence un processus de réponse à un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique, notamment un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
Les fragments de polypeptide selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs, font également partie de l'invention. Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des activités d'un polypeptide selon l'invention notamment : - la capacité de moduler la differentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules, comme en particulier les cellules endothéliales ou musculaires lisses, notamment les cellules vasculaires ; la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ; et/ou la capacité de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, en neutralisant par exemple la fixation d'un polypeptide selon l'invention sur son récepteur cellulaire spécifique. Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés.
L'invention comprend également les polypeptides homologues et variants des polypeptides selon l'invention. On entendra désigner comme polypeptides homologues, les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides selon l'invention, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé. L'invention comprend en outre les séquences d'acide nucléique caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention. Les séquences complémentaires ou les séquences des ARN correspondant auxdites séquences d'acide nucléique selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans lesdites cellules hôtes, font également partie de l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon l'invention. La méthode d'obtention d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante se caractérise de préférence en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par lesdites méthodes, font aussi partie de 1 ' invention.
L'invention comprend également les polypeptides ou un de leurs fragments selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par synthèse chimique.
Les polypeptides correspondant aux polypeptides selon l'invention obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention. Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci- dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible .
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules murines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les cellules 3AsubE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite .
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi .
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, 1 ' électroporation, le choc thermique.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée . Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993) , de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) , des cellules humaines telles que les cellules 3AsubE d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993) .
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d' immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse » (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vi tro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple : un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, 1975.
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d' immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable .
Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention. Ladite utilisation est comprise dans l'invention. II est bien entendu qu'on entend par l'expression « plusieurs " anticorps » dans la présente description, au moins deux anticorps selon l'invention de spécificité différente, c'est-à-dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents de polypeptide selon l'invention. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de l'invention de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits ou nécessaires de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différents. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immuno- cytochimique ou immunohistochimique de l'expression de polypeptide selon l'invention sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques .
Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale d'un polypeptide selon l'invention dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
L'invention concerne également des sondes ou amorces oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s ' hybrider spécifiquement à ladite séquence selon l'invention, de préférence les sondes pourront être marquées . Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt , 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo- nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989. L'invention concerne en outre l'utilisation de sonde ou d'amorce, pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon l'invention, ainsi que pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon 1 ' invention.
Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence
30 bases.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants selon l'invention, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des polypeptides selon l'invention, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Ces oligonucléotides sens ou antisens font également partie des sondes selon 1 ' invention .
L'invention concerne également un procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention ; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum humain ou animal, du sang, le liquide amniotique ou des biopsies.
De préférence, dans le procédé précédent selon l'invention, l'anticorps utilisé à l'étape a) est fixé sur un support solide et la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage du complexe antigène- anticorps formé de l'étape b) est réalisé en utilisant un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Les supports solides pouvant être utilisés, tels que des billes de polystyrène, les plaques de microtitration, sont bien connus dans le domaine des immunodosages et ne seront pas développés dans la présente description.
L'invention concerne également un kit, ou nécessaire, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, notamment dans le liquide amniotique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un ou plusieurs anticorps selon l'invention, notamment pouvant être fixé sur un support solide ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène- anticorps produits par la réaction immunologique, notamment un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d ' immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas où les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués à la fluoroscéïne ou radiomarqués capables de reconnaître spécifiquement les anticorps de l'invention ou les formes de polypeptide EPIL ou leurs fragments, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif.
L'invention concerne en outre un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de 1 'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon l'invention à l'aide d'amorces selon 1 ' invention ; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
L'invention concerne aussi un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon l'invention et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique ; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon l'invention. L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique selon l'invention ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend en outre un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'invention ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
Les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, notamment angioprolifératives et en particulier pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, font avantageusement partie de l'invention. Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide ou de séquence nucléique selon l'invention, ou encore par diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie .
Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, celles qui seront décrites ci-après.
L'invention est donc relative également à des méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon l'invention ou une sonde, notamment marquée, et/ou une amorce selon l'invention.
On préfère les méthodes de marquage selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un procédé selon 1 ' invention . Les techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, telles que celle décrite à l'exemple 4, sont bien connues des immumocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne seront pas développées dans la présente description. Parmi les méthodes de marquage de cellule selon l'invention mettant en oeuvre une sonde de l'invention, on préfère également les méthodes comprenant l'utilisation d'une sonde marquée selon l'invention et/ou les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible d'être présente à l'aide de couple d'amorces de séquence nucléique selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA « Nucleic Acid Séquence Based Amplification » (Compton 1991) , TAS « Transcription based Amplification System » (Guatelli et al. 1990), LCR « Ligase Chain Reaction » (Landegren et al. 1988), « Endo Run Amplification » (ERA) , « Cycling Probe Reaction » (CPR) , et SDA « Strand Displacement Amplification » (Walker et al. 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s ' hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par exemple par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes de l'invention, notamment marquées .
L'invention concerne en particulier les méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce que la cellule est une cellule endothéliale, notamment vasculaire, une cellule musculaire lisse, une cellule stromale, notamment de la décidue, une cellule de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithéliu endométrial de l'utérus, ou une cellule tumorale, notamment angioproliférative et celles du Sarcome de Kaposi en particulier.
L'invention a aussi pour objet une méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
L'invention a également pour objet une cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode d'obtention selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellules tumorales, notamment les cellules tumorales du Sarcome de kaposi, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention. Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou une cellule selon l'invention. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée ou sélectionnée selon l'invention.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un des polypeptides selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'activité desdits polypeptides en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à se lier à un acide nucléique selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'expression du gène codant pour lesdits polypeptides en tant qu'inducteur ou répresseur.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules selon l'invention in vi tro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la differentiation, la prolifération ou la régénération de cellules.
L'invention a en outre pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la differentiation, la prolifération et/ou la régénération de cellules humaines et/ou animales, en particulier de favoriser ou d'inhiber la differentiation, la régénération et/ou la prolifération desdites cellules, notamment les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses, notamment vasculaires, les cellules épithéliales, les cellules stromales, notamment de la décidue, et/ou les cellules de l'épithélium glandulaire.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, notamment de favoriser ou d'inhiber le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable moduler l'activité insulin-like, de préférence de moduler la réponse de la cellule à un stress hypoxique et/ou hypoglycémique, notamment de favoriser l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
On entendra désigner par activité insulin-like dans la présente description, les activités bien connues de l'insuline, notamment celles qui seront décrites dans les exemples ci-après. Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capable de se lier à un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention ou capable de se lier à une séquence nucléotidique ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique ; b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique .
Les cellules transformées ou sélectionnées selon l'invention et exprimant ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique peuvent également être utilisées dans lesdites méthodes de sélection. Les méthodes de sélection de composés basées sur l'affinité d'un composé pour un autre composé (recherche de ligands spécifiques) à effet agoniste ou antagoniste sur une activité spécifique désirée (telle qu'une activité biochimique de type cellulaire) sont bien connues et ne seront pas décrites.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de 'carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de 1 ' homme de 1 ' art .
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi : a) un polypeptide ou un de ses fragments selon 1 ' invention ; b) un anticorps selon l'invention ; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon 1 ' invention ; d) un vecteur selon l'invention ; e) un vecteur selon l'invention, présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention ; f) une sonde selon l'invention, comme par exemple les séquences d'acide nucléique sens ou antisens telles que définies précédemment.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi. Parmi lesdites tumeurs, les tumeurs du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarco e, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome ou tout particulièrement un léiomyosarcome, sont également préférés.
On pourra, par exemple, se référer aux publications de Clark, R. (1997) ; Ferrara, N., et al. (1997), ou de la revue Scrip N° 2209, pp.21, et Scrip N° 2202 concernant l'article sur la société Genentech, pour les activités biologiques dans lesquelles sont impliqués l'IGF-1 et 1 ' EGF
(facteur de croissance endothéliale) , hormones apparentées au polypeptide EPIL.
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques.
L'invention comprend aussi des composés selon l'invention, destinés au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de 1 ' endométriose, de l'arthrite rhumatoïde, de l'athérosclérose ou de 1 ' hyperthyroïdie . Les traitements de lésions dues à l'athérosclérose ainsi qu'à la resténose après angioplastie étant parmi les traitements préférés.
En effet (Owens et al., 1996 et Murry et al., 1997), les facteurs de régulation de la croissance des cellules musculaires lisses, notamment ceux favorisant cette croissance, jouent un rôle essentiel dans la formation des plaques d'athérosclérose qui sont constituées d'une population monoclonale de cellules musculaires lisses. Ainsi, parmi les composés de l'invention, ceux permettant de moduler, en particulier d'inhiber, la croissance ou la prolifération des cellules musculaires lisses, pourront être utilisés pour le traitement des lésions induites par la formation de ces plaques, notamment pour le traitement de la resténose après angioplastie, dans le cadre du traitement de maladies cardiovasculaires .
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, destinés à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithélial, suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroïde ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme .
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser ou à inhiber 1 ' implantation embryonnaire .
Enfin, l'invention comprend des composés selon l'invention, destinés à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à une activité de type insulin-like, de préférence liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, tel que l'hypoglycémie ou l'hyperglycémie. Parmi lesdites pathologies, le diabète, comme le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires, sont notamment préférées .
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite « de remplacement » permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas où l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus . On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986) , des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de l 'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL. Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. Il est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contrôlée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire . Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la differentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines cellules ou tissus, suite par exemple à un traumatisme .
Parmi les maladies liées à la differentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, comme en particulier les maladies liées à la présence de tumeurs, les inventeurs ont mis par exemple en évidence la présence anormale de quantité de polypeptides selon l'invention dans des tissus spécifiques chez des patients atteints du Sarcome de Kaposi, et ce en comparaison avec les tissus sains correspondants. Le Sarcome de Kaposi (SK) peut être défini comme une maladie angioproliférative caractérisée par une prolifération de cellules fusiformes ( "spindle-shaped cells") probablement d'origine hétérogène en majorité endothéliale, mais aussi musculaire lisse, dendritique et/ou monocytaire, un processus de néoangiogenèse, une infiltration cellulaire inflammatoire ainsi que d'un oedème .
Le SK affecte la peau et/ou les muqueuses. Il peut s'étendre aux tissus mous, os, et ganglions lymphatiques et affecter les organes viscéraux tels que les poumons, le tractus gastro-intestinal (intestin, foie et rate) , les organes génitaux (prostate, vésicule séminale, testicules, vessie, pénis, col et vulve) , le cerveau, les reins et les glandes surrénales. L'étiologie du SK reste au jour d'aujourd'hui une énigme. Cependant, on reconnaît sur le plan épidémiologique 4 entités cliniques différentes (Tappero et al., 1993) : 1. Classique, affectant les hommes (ratio hommes/femmes 10:1) entre 50 et 80 ans d'origine méditerranéenne ou juifs de l'Europe de l'Est, de localisation cutanée, d'évolution chronique, avec un cancer secondaire se développant dans 35 % des cas.
2. Endémique, affectant l'homme noir africain d'environ 35 ans (ratio hommes/femmes 13:1), d'évolution bénigne ou fatale en 5-8 ans, affectant le jeune enfant d'environ 3 ans, d'évolution fatale en 2-3 ans. Le SK représente entre 9 % et 12,8 % de toutes les néoplasies au Zaïre.
3. Iatrogène, affectant les receveurs d'un organe transplanté immunosupprimé, avec habituellement une rémission en cas d'arrêt du traitement immunosuppresseur .
4. Epidémique, associé au SIDA, avec environ 30 % des patients atteints du SIDA développant un SK. Il s'agit de la tumeur la plus fréquente associée à l'infection HIV-1. Le risque de développer un SK est différent selon le mode de transmission du virus HIV avec un risque plus grand chez les hommes homosexuels et les femmes s 'infectant par contact hétérosexuel avec un homme bisexuel par rapport aux hémophiles et aux utilisateurs de drogues intraveineuses. Il est de localisation multicentrique et symétrique, avec une évolution peu prévisible, la progression du SK étant le plus souvent corrélée à l'état général du patient. Ainsi, les critères de stades élaborés par le AIDS Clinical Trials Group (ACTG)" tiennent compte du statut immunologique (CD4) et des infections opportunistes.
La plupart des études traitant de la physiopathologie du SK sont basées sur des cultures primaires de cellules de SK associées au SIDA. La survie in vitro des cellules de SK en culture semble dépendre de facteurs de croissance tels que OSM, VEGF, FGF-b, PDGF, IL-6 notamment. De plus, la protéine Tat du virus HIV-1 semble jouer un rôle inducteur synergique avec le FGF-b dans la formation du SK ce qui pourrait expliquer en partie l'évolution clinique plus agressive du SK associé au SIDA (Ensoli et al., 1994). En effet, dans les stades précoces de la maladie, le SK associé au SIDA semble être une maladie strictement liée aux cytokines où les cytokines inflammatoires et angiogéniques et la protéine tat HIV-1 ont une influence sur l'induction et la progression du SK. De plus, il est intéressant de noter que Barillari et al. en 1993 ont démontré que les cytokines inflammatoires auraient la capacité d'augmenter l'expression d'intégrine fixant la séquence RGD (Arg-Gly-Asp) au niveau de cellules du SK et de cellules normales endothéliales. Cette séquence correspond aux régions des protéines de la matrice extracellulaire (collagène, fibronectine, laminine, tenascin et thrombospondin) qui se lient aux intégrines membranaires des cellules, modulant ainsi l'attachement cellulaire, donc, participant au processus de croissance et différenciation et par conséquent à la tumorigenèse . Alors que la protéine tat du virus HIV contient des séquences RGD, on a démontré que les cytokines inflammatoires (IL-1 béta, TNF, IFN gamma) pouvaient par ailleurs augmenter la fixation de la protéine tat à la cellule SK. La progression de la maladie est caractérisée par la prolifération des cellules fusiformes du SK (spindle cells) tant dans le SK classique que dans le SK associé au SIDA. Récemment, on a démontré que le proto-oncogène Bcl-2, gène anti-apoptose, semblerait surexprimé dans les cellules fusiformes de phénotype endothélial (facteur VIII RA) des lésions de SK classique et associé au SIDA avec un taux de cellules marquées plus élevé au stade nodulaire de la maladie (Bohan Morris et al., 1996). Ainsi, l'apparition de ce processus anti-apoptotique semble être un mécanisme important dans la pathogénèse du SK et pourrait être un marqueur de progression de la maladie.
Histologiquement, le SK classique et le SK associé au
SIDA est indistinguable (Tappero et al., 1993). L'origine des cellules des lésions de SK reste peu claire. Les cellules sont probablement des cellules mésenchymateuses de
1 ' endothélium lymphatique ou vasculaire, de dendrocytes du derme exprimant le facteur XlIIa ou de cellules du muscle lisse vasculaire.
Les 3 stades histologiques patch, plaque et nodule sont corrélés à la clinique et à la progression de la lésion. 1. Patch : cliniquement , lésion maculaire, histolo- giquement, prolifération de petits, irréguliers espaces tapissés par un endothélium entourant des vaisseaux du dermes normaux. Associés ou non à une infiltration lymphocytaire inflammatoire variable. 2. Plaque : cliniquement, petite lésion palpable (papule), histologiquement , expansion de cellules fusiformes (spindle cells) dans le derme dispersées parmi le collagène du derme avec formation de canaux vasculaires irréguliers. 3. Nodule : cliniquement, large nodule palpable, histolo- giquement, plage de cellules fusiformes avec atypie cytologique discrète à modérée, érythrocytes dans un réseau étendu d'espaces vasculaires en forme de fente (slit-like) . Récemment, le SK associé au SIDA semble répondre au traitement antiprotéase notamment par la trithérapie (4 conférence internationale sur les rétrovirus et les infections opportunistes en Février 1997 à Washington) . Lorsque la tumeur échappe au traitement, un traitement par chimiothérapie peut être instauré (Bléomycine, Vincristine) . Sommairement, le traitement du SK en général peut être local (principalement la cryothérapie et radiothérapie) ou systémique (interféron, chimiothérapie) . Le premier est généralement celui par lequel on débute parce que ayant moins d'effets secondaires à condition qu'il s'agisse d'une forme légère. Les localisations cutanées et de la muqueuse en sont les indications majeures de par leur accessibilité. La cryothérapie à l'azote liquide, le laser offrent un résultat acceptable sur le plan cosmétique. Cependant, il y a persistance du SK dans le derme profond et 1 ' incidence d'une récidive après un délai de 6 mois augmente. La chimiothérapie cytotoxique intralésionnelle par vinblastine ou vincristine permet une réponse partielle ou complète dans 60 à 88 % des cas avec pour les patients présentant un SK associé au SIDA un taux de récidive de 40 % en 4 à 6 mois. En outre, se pose le problème fréquent de séquelle cutanée comme 1 ' hyperpigmentation post inflammatoire. L'injection intralésionnelle d'interféron alpha ainsi que de TNF alpha reste encore au stade expérimental.
Les patients n'ayant pas ou mal répondu au traitement local ou présentant une forme plus sévère par exemple avec ulcère ou forme extensive, peuvent bénéficier d'un traitement systémique avec en général une réponse clinique supérieure. Les agents chimiothérapeutiques le plus souvent associés sont la Bléomycine et la Vincristine. Cependant, il reste que ces traitements sont potentiellement immunosuppresseurs car relativement aplasiant. Le développement d'une thérapeutique basée sur des agents anti-angiogéniques comme l'IFN-alpha inhibant la production de FGF-b et d'IL-8 dans les cellules de SK, le human platelet factor-4 ou le développement d'inhibiteurs de facteur de croissance (cytokines) et/ou de récepteur spécifique aux cellules du SK reste d'actualité. Récemment, Masood et al. (1997) ont démontré l'action d'oligo- nucléotide antisens de VEGF sur la croissance tumorale sur un modèle in vivo (souris nude) . En cours de développement, on cite généralement les analogues de TNP-450, l'acide cis- trans-rétinoïque et plus récemment l'HAF ou hCG associated factor dont" le mécanisme d'action semble être lié au processus de l'apoptose (Lunardi Iskandar 1997). En outre, depuis que Huang et al. (1996) ont pu récemment mettre en évidence par PCR la présence d'ADN d'un nouveau virus de la famille Herpès, le HHV-8 au niveau de lésion de SK des 3 types, SK associé au SIDA, SK classique et SK endémique africain, une thérapeutique anti-virale est en cours de développement .
Pour le Sarcome de Kaposi et en général pour la plupart des maladies liées à la présence de tumeurs, il existe aujourd'hui d'une part un grand besoin de nouveaux outils moléculaires pour mieux comprendre le mécanisme physiologique de ces maladies, mais également de nouveaux traitements thérapeutiques pour les combattre.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après .
Légende des Figures
Figure 1 : Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé par cette séquence. Figure 2 :
A. Représentation schématique de la structure du polypeptide EPIL et localisation des sites de liaisons des domaines du polypeptide EPIL reconnus par les anticorps 1661 et 7381.
B. Structures primaires de la partie amino- terminale de la chaîne C de l'EPIL et de RLX-H2 (relaxine H2) . Les résidus d' amino-acides identiques sont notés par *. Figure 3 : Courbes d'inhibition compétitive, obtenues par méthode ELISA, de la fixation des anticorps 7381 et 1661, par différents peptides compétiteurs.
A. Inhibition de la fixation de l'anticorps 7381 (dilué au 1/500) dirigé contre le peptide EPIL 59-108-Y adsorbé sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 59-108-
Y ( ), EPIL" 88-108-Y (D) , RLX-H2 63-92 (Δ) et RLX-H2 74-92 (O) .
B. Inhibition de la fixation de l'anticorps 1661 (dilué au 1/300) dirigé contre les peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 adsorbés sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 23-52 (*), EPIL 115-139 (D) , et par un mélange de peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 (0) .
Figure 4 : Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps polyclonal 7383. Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque avec le peptide EPIL 23-52 adsorbé. Le pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps 7383 dilué au 1/500 est calculé en fonction de quantité croissante de peptide inhibiteur chaîne B (23-52) , ayant servi d' immunogène, dont la concentration molaire est exprimée en notation scientifique : 1,0 E-10 équivalent à 1, 0 x 10"10.
Figure 5 : Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps monoclonal EPIL 02.
La figure 5 représente l'analyse d'inhibition compétitive de l'anticorps EPIL 02 pour deux dilutions différentes : dilution au 1/2500 (D) et dilution au 1/5000
(*) . Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque sur laquelle est adsorbée le peptide EPIL (125-137-Y) . Figure 6 : Schéma représentant les caractéristiques de la construction du vecteur INSL4-pSec TAG C™ contenant 1' insert INSL4 de 418 pb.
Figure 7 : Détection immunohistochimique des polypeptides EPIL 1 et EPIL 2. Des coupes de tissus chorioniques villeux de placenta âgé de moins de 3 mois (6 à 8 semaines) (photographies A, B, E et F) ou de placenta à terme (photographies C et D) ont été marquées :
- avec des anticorps anti-EPIL 1 préabsorbés (photo- graphies A et C) et des anticorps 7381 anti-EPIL 1, dilués tous les deux au 1/500 (photographies B et D) ;
- avec des anticorps anti-EPIL 2 préabsorbés (photographie E) et des anticorps 1161 anti-EPIL 2 (photographie F), tous les deux dilués au 1/300. Les cytotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie B) et de placenta à terme (photographie D) montrent un marquage prédominant avec les anticorps anti-EPIL 1 alors que les anticorps anti-EPIL 2 marquent à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie F) . Agrandissement : photographies A et B : x 400, photographies C à F : x 1 000.
Figure 8 : Analyse quantitative des niveaux de transcrits ARNm du gène INSL4 dans les cytotrophoblastes (CT) comparée aux syncytiotrophoblastes (ST) .
La quantification est réalisée par RT-PCR compétitive en utilisant un ADN standard quantitatif en témoin interne (IQS) . L' électrophorèse est réalisé sur le séquenceur d'ADN ABI de Perking Elmer et on mesure les surfaces de pic obtenu. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surface de pic obtenu avec l'ADNc cible et 1 ' IQS correspondant .
Les expériences ont été réalisées deux fois de manière indépendante, les barres représentant l'écart entre les deux résultats obtenus.
Figure 9 : Analyse par immunoempreinte (Western blot) - Figure 9A : Anticorps monoclonal révélateur EPIL 02 (antichaîne A)
Ligne 1 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Les bandes correspondant aux polypeptides EPIL recombinants sont très peu marquées et peu visibles compte tenu du facteur de dilution des polypeptides dans le surnageant brut de culture. Ligne 2 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) .
Ligne 3 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) .
Ligne 4 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne 5 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse .
Ligne 6 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse . Ligne 7 : Fraction 16 après chromatographie phase inverse . - Figure 9B : Anticorps polyclonal révélateur 7381 (antichaîne C)
Ligne 1 : Etalon de masse moléculaire.
Ligne 2 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Ligne 3 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) .
Ligne 4 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) . Ligne 5 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse .
Ligne 6 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse .
Ligne 7 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
- Figure 9C : Anticorps polyclonal révélateur 7383 (antichaîne B)
Ligne 1 : Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées. Ligne 2 : Effluent après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) .
Ligne 3 : Eluat après chromatographie d'affinité (Sépharose-CNBr-EPIL 02) .
Ligne 4 : Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne ' 5 : Fraction 8 après chromatographie phase inverse.
Ligne 6 : Fraction 9 après chromatographie phase inverse . Ligne 7 : Fraction 16 après chromatographie phase inverse.
Figure 10 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500). Agrandissement : X 100. Figure 11 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de 1 ' immunserum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation). Agrandissement :X 100.
Figure 12 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB 2) . Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par 1 ' immunserum 7381 (Dilution 1/500). Agrandissement : X 200.
Figure 13 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Absence de marquage des cellulles tumorales ("Spindle cells") après inhibition de 1 ' immunserum 7381 (dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d ' incubatiton) . Agrandissement : X 200.
Figure 14 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Marquage des cellules tumorales (« Spindle cells ») par 1' immunserum 7381 (Dilution 1/500). Agrandissement : X 1000.
Figure 15 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Absence de marquage des celules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de 1 ' immunserum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation). Agrandissement : X 1000.
Figure 16 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par 1 ' immunserum 7381 (Dilution 1/500). Agrandissement : X 400.
Figure 17 : Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2) . Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de 1 ' immunserum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation). Agrandissement : X 1000.
Figure 18 : Courbes d'inhibition obtenues avec l'anticorps monoclonal EPIL 08 pour différents peptides de la portion 59-108 de la chaîne C du polypeptide EPIL putatif.
Figure 19 : Courbe de calibration obtenue avec le peptide synthétique correspondant à la portion 76-139 du polypeptide EPIL putatif selon la méthode de radio- immunodosage à 2 sites et utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture et l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué à l'125I comme traceur.
Figure 20 : Courbes de dosages comparatifs de l'EPIL et de 1 ' hCG dans le liquide amniotique pour un panel de femmes enceintes obtenues avec la méthode de radio- immunodosage à 2 sites pour le dosage de l'EPIL; d'autres courbes ont été obtenues sur d'autres panels montrant des concentrations supérieures .
Figure 21 : Marquage des vaisseaux à l'intérieur des villosités trophoblastiques par l'anticorps 7381 dirigé contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes âgés de
8 semaines (X 200) .
Figure 22 : Marquage de cellules musculaires lisses des vaisseaux du cordon par l'anticorps 7381 dirigé contre la région C de l'EPIL (X 200). Figure 23 : Marquage des cellules de l'épithélium endométrial " de l'utérus par l'anticorps EPIL 08 dirigé contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes âgés de
9 semaines (X 200) .
EXEMPLE 1
Caractérisation de la ou des formes de polypeptide EPIL exprimées dans les tissus
Production d'anticorps anti-EPIL, spécifique de domaines particuliers du polypeptide EPIL. La stratégie de détection de la ou des formes exprimées du polypeptide EPIL, repose sur la production et l'utilisation d'anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre des peptides synthétiques, couplés à des protéines porteuses, mimant différentes régions de protéine putative .
1. Synthèse des peptides et préparation des immunogènes Des peptides synthétiques sont construits selon la méthode conventionnelle en phase solide sur un automate Applied Biosystems model 431A. Les peptides synthétisés sont présentés lors de la description des anticorps (voir 3). Ces peptides sont purifiés par une chromatographie d'exclusion suivie d'une HPLC puis ils sont analysés (composition en acides aminés et séquençage peptidique) . Ils sont ensuite conjugués à des protéines porteuses afin de préparer des immunogènes .
2. Production et caractérisation des anticorps polyclonaux et monoclonaux
La production des anticorps polyclonaux est réalisée par injection des immunogènes (conjugués peptide-protéine porteuse) chez des lapins femelles « Grand Fauve de
Bourgogne » âgés de 70 jours environ. L'immunogène (150 μg) est injecté par voie intradermique multipoints au niveau du dos en présence d'adjuvant complet de Freund dans du sérum physiologique. Deux rappels suivants sont effectués à respectivement J+21 et J+42 par injection de 25 μg d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund par voie sous- cutanée. Un troisième rappel peut être effectué à J+70. Une semaine après le rappel, un prélèvement de sang est réalisé au niveau de l'oreille pour tester la présence d'anticorps. Les lapins « bons répondeurs » sont saignés à blanc par ponction intracardiaque .
La production des anticorps monoclonaux est réalisée par la technique d'hybridation cellulaire. Brièvement, des souris de souche BALB/c sont immunisées par l'injection de
50-100 μg de conjugué peptide-protéine porteuse en adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Des rappels par voie intra-péritonéale (25 μg d ' immunogène en adjuvant incomplet de Freund) sont réalisés à trois mois d'intervalle jusqu'à obtenir une réponse immune, attestée par la présence d'anticorps détectables dans le sérum de l'animal. La fusion cellulaire est effectuée 3 jours après injection i.v. (intra veineuse) de 1 ' immunogène . Elle consiste à prélever puis dissocier la rate de la souris et, dans un second temps, fusionner par le polyéthylèneglycol
(PEG 1000) les lymphocytes ainsi libérés avec des cellules myélomateuses, entretenues en culture continue. Les hybridomes sont sélectionnés en milieu sélectif contenant de 1 ' aminoptérine . La production d'anticorps monoclonaux par les hybridomes est analysée par une méthode immuno- enzymatique en phase solide (liaison au peptide immunogène) . Les hybridomes producteurs sont clones deux fois par dilution limite et la production en masse d'anticorps est réalisée par injection des hybridomes en intrapéritonéal chez la souris Nude . Les anticorps monoclonaux sont ensuite purifiés à partir des liquides d'ascite par une méthode de chromatographie d'affinité sur
Sépharose-protéine A (Pharmacia) après précipitation des protéines au sulfate d'ammonium.
Les caractéristiques de liaison des anticorps sont établies par des méthodes immunoenzymatiques en phase solide (ELISA) et radioimmunologiques (RIA) . Brièvement, la méthode ELISA est réalisée en adsorbant un ou plusieurs peptides mimant une séquence d'un domaine du polypeptide putatif EPIL, dilué dans un tampon Phosphate 0,1 M, pH 7,4, sur un support solide (plaque de polystyrène COSTAR/EIA) . Après une incubation de 18 heures à + 4° C, les supports sont saturés par une solution d'albumine et les anticorps à tester sont ajoutés pour une incubation de 1 heure à 37°C. Après lavage, la liaison des anticorps est détectée par l'addition d'un anticorps secondaire marqué à la peroxydase (RAM/IgG (H+L) Po, TEBU) . La solution de chromogène (o- phénylène diamine) en présence d'H202 permet de révéler la réaction enzymatique. Une méthode par inhibition compétitive peut être réalisée pour préciser la localisation des sites reconnus par les anticorps. Pour cela, les anticorps sont préalablement incubés avec des peptides synthétiques à différentes concentrations, par exemple représentatifs de séquences plus courtes que celle du peptide adsorbé sur le support. Le mélange est ensuite déposé sur le support et l'activité anticorps résiduelle est mesurée. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison. La méthode RIA est développée de façon semblable, excepté le fait que le peptide est radiomarqué par un isotope 125ι selon le procédé dit du Iodogène. Les complexes immuns potentiellement formés avec l'anticorps sont précipités par le polyéthylène glycol (PEG 6000) et, après lavage, la radioactivité est mesurée. Il est aussi possible de réaliser une expérience d'inhibition compétitive comme décrit ci-dessus. 3. Caractéristiques des anticorps
Les nombres associés aux séquences ci -dessous correspondent aux positions des acides aminés définies dans la séquence d'acides aminés de la figure 1.
Trois anticorps polyclonaux et deux anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides synthétiques sont décrits ci-dessous :
• Un anticorps polyclonal, numéroté 7381, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108 Tyrosine (Y) de la chaîne C putative (figure 2) couplé par la benzidine à 1 ' Hémocyanine de Patelle (KLH) , protéine porteuse. Cet anticorps se lie à la séquence 59-108 du domaine C du polypeptide EPIL (figure 3A) . Il ne reconnaît pas la séquence analogue dans la relaxine H2 (RLX-H2) , protéine qui présente la plus forte similitude structurale (67 %) dans le domaine C. Cet anticorps est capable de détecter le polypeptide recombinant comportant le domaine C, par exemple dans une méthode d' immunoempreinte, et de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 physiologique, par exemple au niveau du placenta (voir exemple 4 , concernant 1 ' immunohistochimie) .
• Un anticorps polyclonal, numéroté 1661, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences 23-52 de la chaîne B putative et 115-139 de la chaîne A putative
(figure 2) couplés par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse. Cet anticorps polyclonal comporte des anticorps majoritairement dirigés contre la région 115-139 de la chaîne A et dans une moindre mesure contre la séquence 23-59 de la chaîne B (figure 3B) . Il permet de détecter un polypeptide recombinant comportant les domaines A et/ou B, par exemple dans une méthode d' immunoempreinte, ainsi que le polypeptide EPIL natif et ses formes moléculaires comportant les domaines A et/ou B, tels que par exemple les polypeptides EPIL 1 et EPIL 2
(voir exemple 4) .
• Un anticorps polyclonal, numéroté 7383, et obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences (31- 49) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) de la chaîne B putative couplés par le MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy- succimimide) à 1 ' Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse (figure 4) . • Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 02 (IgG2a) , est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 125- 137-Y de la chaîne A putative couplé par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse (figure 5). Cet anticorps est utilisable pour la préparation de colonne de chromatographie d'affinité permettant de séparer et de purifier le polypeptide d'origine recombinante (voir exemple 2) .
• Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 08 (IgG2a), est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59- 108 -Y de la chaîne C putative couplé à la protéine porteuse. Cet anticorps reconnaît une séquence longue de 13 résidus d'acide aminé comprenant la portion 88-100 de la chaîne C comme le montre les résultats obtenus par inhibition compétitive (Cf figure 18) .
EXEMPLE 2
Production de la forme extra courte en cellule SF9
Les étapes suivantes sont réalisées :
1. Construction dans le vecteur d'expression pFastBac™
La forme extra courte INSL4 (séquence codante) est insérée dans le vecteur d'expression d'eucaryote inférieur (baculovirus) pFastBac™ (GIBCOBRL) au site Kpnl . Par la suite, une coinfection des cellules d'insecte SF9 par de l'ADN du baculovirus sauvage (AcMNPV, GIBCOBRL) et du vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt est réalisée, afin de constituer une recombinaison homologue. 2. Séquençage
Afin de vérifier la présence et l'orientation de la séquence codante INSL4 dans la construction recombinante, l'analyse du profil de restriction de l'ADN recombinant est réalisée grâce à différentes endonucléases (Kpnl, EcoRl) et par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN
INSL4 et du site multiple de clonage du bacmide pFastBac™.
3. Analyse de l'expression du polypeptide EPIL
Après infection des cellules ovariennes d'insecte
(Spodoptera frugiperda 9) et amplification du titre viral, l'expression du polypeptide recombinant EPIL, codé par le gène INSL4 , est analysée par SDS-PAGE suivi d'immuno- empreintes .
4. Purification et caractérisation du polypeptide recombinant EPIL • Solubilisation des protéines. Environ 200 x 106 cellules Sf9 infectées sont centrifugées. Le culot de centrifugation est repris dans 1 ml de tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 contenant 0,1 % NP 40 et 5 μg/ml de leupeptin. Après agitation par basculement pendant 4 h à 4°C, le mélange est centrifugé 10 mn à 14 000 t/mn à + 4°C. Le surnageant est récupéré pour les étapes suivantes.
• Chromatographie d'affinité.
Dans un premier temps, une colonne de Sépharose-CNBr- EPIL 02 est préparée de la façon suivante. Trois grammes de gel sont mis à gonfler dans 20 ml d'HCl pendant 4 heures. Le gel est ensuite introduit dans une colonne (20 x 1,5 cm) puis rincé avec une solution de couplage (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Après élimination de celle-ci, 1,5 à 4 mg d'anticorps monoclonal purifié EPIL 02, dilué dans la solution de couplage, sont ajoutés. Après 18 heures à + 4°C sous agitation, les sites libres sont bloqués avec de 1 ' éthanolamine 1 M puis la colonne est lavée avec une solution de CH3COONa 0,1 M, CH3COOH 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4. Enfin, la colonne est rincée par Na2HP04 0,05 M, pH 8,5.
Le surnageant récupéré après solubilisation est dilué au 1/10 dans du tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5. Après dilution, la solution est mise en contact pendant 18 h à + 4°C avec le support Sépharose-CNBr-EPIL 02 en agitation lente. Des lavages sont effectués avec un tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 en présence de 0,01 % NP40. La procédure est automatisée sur un équipement FPLC (Pharmacia) . Le temps de lavage est conditionné par le retour de la densité optique au niveau de base. Les fractions recueillies constituent l' effluent. L'élution de l'antigène lié à l'anticorps s'effectue avec un tampon d'acide acétique 2,5 %. Les fractions recueillies constituent l'éluat. L' effluent et 1 ' éluant sont analysés par une technique d' immunoempreinte avec comme anticorps révélateurs EPIL 02, 7381 et 7383.
• Chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse . Deux chromatographies successives sont ensuite réalisées sur les fractions recueillies après élution avec l'acide acétique 2,5 %. Ces fractions sont rassemblées puis déposées tout d'abord sur une colonne Lichrosorb RPB C8 7 μm (250 mm x 4 mm) montée sur un système HPLC Beckman
GOLD. Le chargement s'effectue en continu par une vanne externe avec un débit de 2 ml/mn et les fractions sont recueillies par collection automatique toutes les 30 secondes. Deux phases mobiles sont utilisées : phase A : TFA 0,1 % - 99,9 % H20 et phase B : TFA 0,08 - 4,92 % H20 -
95 % CH3CN. Une analyse des fractions recueillies après chromatographie phase inverse C8 est réalisée par électrophorèse et SDS-PAGE/immunoempreinte utilisant les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383. 5. Analyse par immunoempreinte.
La présence ainsi que les masses moléculaires relatives (Mr) des formes moléculaires du polypeptide recombinant EPIL sont déterminées par électrophorèse suivie d'immuno- empreintes. Brièvement, la méthode consiste à faire migrer les préparations protéiques à tester dans un gel de polyacrylamide (30 % w/v acrylamide, 0,8 % w/v bis acrylamide ; Tris-Hcl 1,5 m, pH 8,8) pendant 30 minutes sous 200 volts. Après migration, les protéines sont transférées sur un support de type papier filtre PVDF sous l'influence d'un champ électrique. Le support est ensuite saturé dans" un tampon de blocage puis incubé avec les anticorps. Après lavage, la liaison éventuelle des anticorps est révélée soit par un anticorps secondaire marqué à la peroxydase soit par la méthode au luminol (kit ECL, Amersham, NW) . Les masses moléculaires relatives sont calculées à partir des standards de référence. Dans ces conditions, les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383 révèlent plusieurs fractions positives après chromatographie phase inverse et correspondent à des temps d' élution différents. Ces fractions référencées 7, 8, 9 et 16 contiennent différentes populations de protéines variant par leur masse moléculaire relative (figure 9) . Ces masses relatives sont comprises entre 13 kDa et 32 kDa .
6. Analyse par spectrométrie de masse par ionisation à électro-spray en mode positif Cette étude est réalisée sur un analyseur PlatformII (Micromas Ltd) utilisant comme étalon le myoglobine de cheval (Masse moléculaire : 16 951,50 ± 0,17 Da) . La fraction 7 obtenue après chromatographie phase inverse et positive après une analyse d' immunoempreinte avec les 3 anticorps EPIL 02, 7381 et 7383, est lyophilisée puis reprise dans une solution de CH3CN/H20 (V/V) et acide formique 0,1 %. L'analyse de cet échantillon révèle un mélange de deux produits présentant des masses moléculaires expérimentales moyennes : Ml : 13 346,62 ± 2, 14 Da et M2 : 15 491,86 ± 3,46 Da .
La masse moléculaire théorique du polypeptide EPIL 1
(1-139) correspond à une masse de 15.445,05 Da . La différence de masse de 43 Da par rapport à la masse moléculaire expérimentale M2 pourrait être attribuée à un groupement acétyl (CH3-CO-) .
Ces résultats suggèrent la présence dans l'échantillon de la molécule EPIL 1 acétylée en position N-terminale.
Une masse moléculaire théorique égale à 13.347,46 Da est calculée lorsque les 18 premiers acides aminés du polypeptide EPIL 1 sont délétés et que 3 ponts disulfures sont réalisés entre les 6 cystéines. La masse expérimentale trouvée (13.346,62 ± 2 Da) est proche de cette masse théorique calculée. Cette observation pourrait suggérer que la deuxième molécule présente majoritairement dans l'échantillon correspond à la molécule EPIL 1 sans le peptide signal 1-18 et avec une structure tertiaire présentant 3 ponts disulfures. EXEMPLE 3
Production de la forme extra courte en cellules CHO
Les étapes suivantes sont réalisées : 1. Construction
La séquence codante correspondant à la forme extra courte INSL4 est clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pSec Tag C™ (INVITROGEN) au site BamHl-Xbal (schéma figure 6) . En parallèle, un vecteur de référence pSec Tag C, digéré par les mêmes endonucléases de restriction (pSec Tag C MOCK) , est construit. Après transformation de bactéries TOP10 (INVITROGEN) , un clone recombinant est sélectionné 1/ par analyse par PCR, 2/ par une étude du profil de restriction de l'ADN recombinant vis-à-vis de différentes endonucléases (BamHl, Xbal, ECOR1) et 3/ par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du plas ide pSec
Tag C™) . La fonctionnalité du cadre ouvert de lecture est confirmée par une étude de transcription/traduction in vi tro (TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation
System, PROMEGA) . Cette expérience met en évidence l'expression de deux espèces protéiques néosynthétisées .
Ces deux espèces, identifiées par l'anticorps 7381, spécifique du peptide C, et l'anticorps 7383 dirigé contre la chaîne* B, présentent des masses moléculaires respectivement égales à 15 et 20 kDa.
Afin d'obtenir une lignée produisant le polypeptide recombinant EPIL de façon stable, le vecteur d'expression ayant intégré le gène INSL4 est transfecté dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (lignée CHO). Deux méthodes de transfection peuvent être utilisées : la méthode au Phosphate de Calcium et 1 ' électroporation. L'utilisation de 10 à 20 μg d'ADN plasmidique permet l'intégration génomique de l'ADN recombinant INSL4. Grâce à la présence d'un marqueur de résistance aux antibiotiques présent dans le vecteur, les clones cellulaires recombinants stables, ayant intégré pSec Tag C INSL4 , sont sélectionnés par culture dans un milieu contenant 600 μg/ml de ZEOCIN™ (INVITROGEN).
2. Northern blot Les clones sélectionnés sont établis en culture. L'étude de l'expression des transcrits pSec TagC INSL4 est réalisée par Northern blot après extraction des ARNm. Vingt quatre heures après hybridation de la sonde INSL4 (insert BamHl-Xbal), l'expression du transcrit recombinant pSec Tag C INSL4 est mise en évidence dans toutes les cellules transfectees. La taille de l'ARNm, 900 pb, correspond à celle attendue pour le transcrit putatif (907 pb) .
3. RT-PCR
L'expression du transcrit recombinant INSL4 dans les cellules CHO est aussi confirmée par une analyse en RT-PCR.
L'analyse par RT-PCR des ARNm extraits des cellules CHO transfectees par la construction CHO-pSec Tag C MOCK
(vecteur vide contrôle) ainsi que de ceux extraits des cellules parentales CHO montre l'absence d'expression du transcrit recombinant INSL4 après 30 cycles d' amplification.
4. Détection du polypeptide recombinant
La purification des diverses formes hormonales placentaires recombinantes produites à partir des milieux de culture et des cellules transfectees montre, par la méthode des immunoempreintes, la présence de formes protéiques de 16,5 et 20 kDa dans les cellules transfectees, ainsi que des espèces protéiques de 6,5, 10 et 16,5 kDa dans le milieu des cellules CHO transfectees pSec Tag C INSL4. EXEMPLE 4
Détection des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL
L'existence des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL dans les tissus humains normaux est recherchée par une méthode immunohistochimique grâce aux anticorps décrits ci-dessus. Cette technique est réalisée sur du placenta dans la mesure où le gène INSL4 a été clone à partir de ce tissu, sur du tissu vasculaire de cordon ombilical et sur un tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi. A) Echantillons de tissu 1) Echantillons de tissu placentaire
Des villosités placentaires obtenues à partir de placenta précoce (7 semaines) et à terme ont été fournies par le Service de Gynécologie obstétrique de l'Hôpital
Antoine Béclère, France, selon les procédures appropriées par le comité éthique.
Les tissus sont fixés en tampon à pH neutre contenant 10 % de formol puis inclus en paraffine.
On utilise également des cellules de cytotrophoblastes villeux et de syncytiotrophoblastes préalablement purifiées de placenta à terme. L'isolement des cellules de cytotrophoblastes à partir de placenta villeux est effectué comme décrit par Guillaudeux T. et al. (1995) par digestion enzymatique et centrifugation en gradient de Percoll comme pour les cultures primaires. Les cytotrophoblastes villeux et les syncytiotrophoblastes villeux différenciés, formés in vi tro à partir de cytotrophoblastes (à 4-5 jours de culture) , sont hautement purifiés (moins de 1 % de cellules contaminantes) . Pour plus de clarté, les cellules purifiées de cytotrophoblastes villeux et les cellules différenciées in vi tro de syncytiotrophoblastes sont dénommées ici cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes respectivement. 2) Tissu de vaisseaux embryonnaires
L'analyse immunohistochimique des vaisseaux embryonnaires a été réalisée à la fois sur des coupes de villosités trophoblastiques de 10 SA (hôpital Antoine Béclère) et d'un cordon ombilical d'un embryon humain de 11 SA (hôpital Robert Debré, France) , ces 2 prélèvements ayant été obtenus dans le cadre d'interruption volontaire de grossesse .
3) Tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi
28 biopsies cutanées de SK classique et associé au SIDA ont été recherchées aux archives de l'Institut Gustave- Roussy et utilisées pour immunohistochimie.
Il s'agit de tissus fixés dans une solution de Bouin, inclus en paraffine. Les coupes de tissus (3 μm) ont été montées sur des lames SuperFrost/Plus et déparaffinées au Xylène. Les coupes, une fois réhydratées, ont été chauffées par microondes (3 x 5min.) dans une solution de tampon citrate (10 mM, pH 6) . B) Immunohistochimie
1) Echantillons de tissu placentaire
On utilise des tissus placentaires âgés de 6 à 12 semaines (n = 6) et des tissus de placenta à terme (n = 2) . On réalise des coupes de tissus de 3 μm, montées sur des plaques SuperFrost/Plus et dégraissées sur xylène. Les coupes réhydratées sont passées sur micro-ondes pendant 15 minutes en présence de tampon citrate 10 mM, pH 6,0. Après plusieurs lavages en tampon phosphate salin (PBS) , les coupes sont incubées pendant 20 mn en présence de l'anticorps donné.
Les coupes sont ensuite lavées puis marquées par un anticorps biotinylé suivi par une phosphatase alkaline couplée à la streptavidine . La révélation du marquage est ensuite obtenue par incubation en présence de la solution de substrat chromogène (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate System, Carpinteria, CA) . Les coupes de tissus témoins contrôle négatif sont réalisées avec des coupes incubées en présence d'anticorps non spécifiques (sérum preimmun) ou en présence d'anticorps préabsorbés sur un excès de peptide correspondant (figure 7) .
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires et tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi
Après lavage par un tampon TBS (Dako) , les coupes ont été incubées avec l' antisérum donné pendant 20 min., puis lavées et révélées en utilisant un complexe anticorps biotinylé suivi d'une phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (PA-streptavidine) . Le marquage est complété après incubation avec une solution chromogène du substrat (DAKO New Fuchsin substrate System, Carpinteria, CA) .
L'anticorps polyclonal 7381 (immun sérum dilué au
1:500) a été utilisé comme anticorps primaire. Il s'agit d'un anticorps reconnaissant l'EPIL 1 ou l'EPIL 3 puisque reconnaissant la région 59-108 de la chaîne du polypeptide
EPIL.
Les contrôles négatifs utilisés sont le sérum preimmun (Jo) et le 7381 immunserum inhibé par le peptide correspondant (59-108Y) avec une incubation de 18 heures. Les autres anticorps (Ac) primaires ont été choisis comme témoins positifs permettant de confirmer le diagnostic de SK : Ac antifacteur VIII (phénotype endothélial) et Ac antiactine du muscle lisse alpha vasculaire (phénotype muscle lisse) .
Les conditions d'inhibition des Ac 7381 sont réalisées par incubation pendant 18 heures en présence de :
150 μl Ac 7381 dilué au 1/250 et 150 μl de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis) à 2 10"4 M équivalent à 300 μl Ac 7381 dilué au 1/500 pour 10~4 M de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis) .
Pour 1 ' immunomarquage des échantillons suivants : - villosité trophoblastique n° X991 formol (12SA) , 8785 (cordon ombilical) 320818 (2) (SK) , 293905-7 (SK) , 240444 (SK) , 293626-1 (SK) (coupes de 3 μm-microtome) , les anticorps (Ac) suivants ont été utilisés :
- 7381 imun sérum anti chaîne C (59-108Y) dilué au 1/500 ;
- 7381 JO (preimmun) dilué au 1/500 ; - Ac anti-facteur VIII dilué au 1/30 ;
- Ac monoclonal de souris anti-actine de muscle lisse alpha humain prédilué (Dako, code N 1584) (1A4) .
EXEMPLE 5
Analyse des transcrits ARNm des cytotrophoblastes et des syncytiotrophoblastes
Les ARNm d'INSL4 sont quantifiés par la méthode RT-PCR (reverse transcriptase-polymérase chaîne réaction) comme décrit dans Bellet, D. et al. (1997). Brièvement, les transcrits TFIID sont quantifiés et utilisés comme ARNm endogène de contrôle. La PCR est réalisée sur 30 cycles d'amplification. Les séquences nucléiques des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont les suivantes : INSL4-F : F 5 ' -AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3 ' INSL4 -R : 5 ' -TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT- 3 ' TFIID-F : F 5 ' -ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3 ' TFIID-R : 5 ' -CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3 ' (F : colorant fluorescéine) . RESULTATS
1) Tissu placentaire
Deux anticorps, désignés 7381 et 1661, dirigés respectivement contre les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 ont été sélectionnés.
L'anticorps 7381 dirigé contre le domaine 59-108-Y de la chaîne C conjugué avec une protéine porteuse s'est révélé totalement spécifique du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3. En effet, les expériences d'inhibition compétitive réalisées avec des peptides ou des sous-peptides analogues de la portion de la chaîne C du polypeptide putatif EPIL ou de la portion correspondante de la relaxine humaine, démontrent que l'anticorps 7381 se lie seulement au domaine C du polypeptide putatif EPIL au niveau de sa portion 59-88 et ne reconnaît pas la chaîne C de la relaxine humaine (Figure 3A) . L'hormone relaxine est le seul membre de la superfamille des insulin-like présentant un pourcentage significatif (37 %) de similitude avec le polypeptide putatif EPIL dans la portion du domaine C correspondant à la région 59-88 du polypeptide EPIL.
L'anticorps 1661 a été obtenu par immunisation réalisée avec un mélange de deux peptides analogues au domaine 115- 139 de la chaîne A et au domaine 23-52 de la chaîne B. Ces deux régions du polypeptide putatif EPIL ne présentent pas de pourcentage significatif de similitude avec des régions correspondantes d'autres membres de la superfamille (< 16 %) . Les expériences d'inhibition compétitive démontrent que cet anticorps polyclonal est principalement dirigé contre le domaine 115-139 de la chaîne A et contient également une sous-population d'anticorps dirigée contre le domaine 23-52 de la chaîne B (Figure 3B) . Le parallélisme des courbes de compétition d'antigènes observées avec les peptides chaîne A et chaîne B reflète plus vraisemblablement des affinités similaires de ces deux sous-populations d'anticorps pour leurs épitopes chaîne A et chaîne B, puisque la structure primaire de ces deux régions distinctes ne présente pas de similitude significative .
Les méthodes i munohistochimiques basées sur les anticorps 7381 et 1661 ont été utilisées pour détecter la présence des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement dans les tissus de placenta précoce (moins de 3 mois) et de placenta à terme. La Figure 7 représente les résultats obtenus à partir d'expériences réalisées sur des tissus d'au moins deux femmes enceintes. L'immuno- marquage réalisé avec l'anticorps 7381 dirigé contre le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est très important dans les cytotrophoblastes de placenta précoce alors qu'il est léger voire absent dans les syncytiotrophoblastes (Figure 7B) . Dans le placenta à terme, de rares cytotrophoblastes présentent une coloration intense alors que les syncytiotrophoblastes ne présentent pas de coloration appréciable (Figure 7D) . De plus, cet anticorps anti- polypeptide EPIL 1 marque les cellules foetales endothéliales vasculaires, particulièrement dans le placenta précoce (figure 7B) .
Les résultats obtenus avec l'anticorps 1661 anti- polypeptide EPIL 2 montrent qu'à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce sont colorés (Figure 7F) . Par opposition, cet anticorps ne marque pas les trophoblastes de placenta à terme (résultats non présentés) . Analyse des transcrits ARNm Les résultats obtenus par la méthode RT-PCR et la méthode d'analyse quantitative par PCR montrent que les niveaux de transcrits d'ARNm d'INSL4 dans les syncytiotrophoblastes villeux différenciés in vi tro obtenus à partir de placenta à terme, sont dix fois plus (une unité log) élevés que ceux observés dans les cytotrophoblastes (Figure 8) . Par opposition, les niveaux de transcrits TFIID sont similaires dans les deux types de cellules.
La détection d'ARNm n'implique pas que les protéines sont synthétisées, comme par exemple pour l'expression HLA classe I dans le placenta. En effet, les cytotrophoblastes villeux expriment les ARNm d'HLA classe I, mais ne synthétisent pas les protéines correspondantes, alors que les trophoblastes extravilleux transcrivent et traduisent les gènes HLA de la classe I (Hunt, J. S. et al., 1990). Cependant, le placenta, qui transcrit un nombre important de gènes, est aussi une source de nombreux polypeptides, incluant les facteurs de croissance de type insulin-like, qui sont connus pour être essentiels au stade précoce du développement embryonnaire et, après la naissance, et pour participer à la croissance et à l'activité fonctionnelle de presque tous les organes du corps humain (Le Roith, D. 1997) . Ces résultats montrent pour la première fois que les trophoblastes non seulement expriment l'ARNm de l ' INSL4 , mais contiennent des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 immunoréactifs . D'autre part, il est d'un grand intérêt d'observer que 1 ' immunomarquage important des tissus trophoblastiques de placenta précoce obtenu l'EPIL 2, est similaire à ceux décrits pour plusieurs facteurs de croissance, incluant le TGFα et 1 ' EGF (Horowitz, G. M. et al. , 1993) . Un autre résultat surprenant est l'expression importante de polypeptides EPIL 1 et /ou EPIL 3 dans les cytotrophoblastes comparée aux syncytiotrophoblastes, alors que, à la fois les études d'hybridation in si tu réalisées sur des placenta précoces (résultats non représentés) et l'analyse quantitative par PCR compétitive réalisée sur des placenta à terme indiquant que les transcrits d ' INSL4 sont plus abondants dans les syncytiotrophoblastes. De plus, les polypeptides EPIL 2 sont détectés à la fois dans les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce avec des intensités du marquage similaires dans les deux types de cellules.
Prises ensemble, ces observations montrent que, in vivo, la maturation de l'EPIL diffère dans les cytotrophoblastes en comparaison avec les syncytio- trophoblastes.
Dans la superfamille des insulin-like, les peptides C de jonction ou chaîne C sont les médiateurs de la formation de la structure tertiaire des protéines et en particulier de l'assemblage correct des trois ponts disulfures de 1 ' hormone mature .
Ces résultats montrent que dans les cytotrophoblastes, le peptide C du polypeptide putatif EPIL est maintenu alors que l'EPIL 2 présent dans les syncytiotrophoblastes ne présente pas de peptide C de jonction. Ainsi, nous pouvons déduire de ces résultats et de ces observations que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 contenant le peptide C peut être sécrété à partir des cytotrophoblastes dans le liquide amniotique et que l'EPIL 2 ne contenant pas le peptide C peut être sécrété à partir des syncytiotrophoblastes dans la circulation maternelle. L'EPIL 3, correspondant au peptide C est par définition également reconnu par les anticorps antichaîne C, tels que l'anticorps 7381. Cette forme du polypeptide putatif EPIL et qui correspond au sous-produit de clivage aboutissant à l'EPIL 2, peut également avoir une activité biologique autre que celle de participer à la formation de la structure tertiaire de l'EPIL (Ido, Y. et al., 1997, Steiner, D. F. et al., 1997). Cette capacité d'excrétion sélective de peptides différents dans des compartiments biologiques variés a déjà été illustrée par d'autres hormones polypeptidiques comme pour l'HCG et ses sous-unités libres. D'autre part, il est remarquable de voir que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est (sont) présent (s) également dans les cellules foetales endothéliales vasculaires. Des résultats récents (Zhou, Y. et al., 1997), ont montré que les cytotrophoblastes extravilleux sont plastiques et ont la capacité d'acquérir des caractéristiques de cellules endothéliales. Ainsi, ces résultats établissent en fait que les cytotrophoblastes villeux et les cellules foetales endothéliales doivent très certainement partager des caractéristiques phénotypiques communes. Ces résultats montrent également que le polypeptide "EPIL, en particulier l'EPIL 1, est impliqué dans le processus de differentiation des cellules trophoblastiques, et de manière générale le polypeptide EPIL est très certainement impliqué dans le processus de differentiation, de prolifération et de régénération des cellules, en particulier endothéliales comme les cellules vasculaires.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires
L'objectif de la série d'expérience par immuno- histochimie est d'étudier plus précisément les vaisseaux embryonnaires intravillositaires ainsi que du cordon ombilical du 1er, Ilème et Illème trimestre. En utilisant 1 'antisérum 7381 à une dilution de 1:500, les expériences d ' immunohistochimie confirment la présence d'un immunomarquage au niveau des vaisseaux embryonnaires des villosités flottantes, notamment au niveau des cellules endothéliales sur un cas de prélèvement trophoblastique de 12 SA. Cependant, on note pour la première fois que les vaisseaux embryonnaires de villosités primaires présentent un immunomarquage des cellules constituant la paroi du vaisseau, les cellules musculaires lisses, alors que les cellules endothéliales ne sont quasiment plus marquées.
De même, ce phénomène paraît s'amplifier au niveau des vaisseaux du cordon ombilical (cf Figure 22) avec, au niveau de la veine et des 2 artères un marquage des cellules de la média donc des cellules musculaires lisses, avec une disparition complète du marquage des cellules endothéliales (cf . Tableaux 1 et 2 ci-après).
Tableau 1
Cellules Cellules Musculaires Endothéliales Lisses
Vx embryonnaires
1. villosité + ++ flottante
2. tronc primaire + ++ ou secondaire
(villosité)
3. cordon ombilical - ++
Légende du tableau 1 : Détection immunohistochimique (PA, Dako, LSAB2) du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 par 1 ' immun sérum 7381 (dilution 1/500) au niveau des vaisseaux embryonnaires de villosités trophoblastiques (12 SA) et d'un cordon ombilical (AA SA) du 1er trimestre de grossesse
(coupe 3μ) . On observe tant au niveau des villosités trophoblastiques des troncs primaires (cf figure 21) qu'au niveau du cordon ombilical un immunomarquage plus important des cellules musculaires lisses (média) (cf figure 22) par rapport aux cellules endothéliales. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante : (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité.
Tableau 2
Figure imgf000060_0001
Cytotrophoblaste
Syncytio- trop oblaste
Vx embryonnaires ( tronc primaire) endothélium + + Média ++ ++
Cordon ombilical (11 SA) Média+ NT* Endoth+ Média+ Vx (3 vx) (3 vx) (3 vx)
Amnion + NT NT
Vestiges embry. Sac vitellin ++ Allantoide ++ non testé.
Légende du tableau 2 : Analyse immunohistochimique (PA,
Dako, LSAB2) avec 1 ' immun sérum 7381 anti-peptide C
(dilution 1/500), l'anticorps polyconal anti-facteur VIII
(Dako, Réf. A0082) et monoclonal anti-actine α muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 μ) de villosités trophoblastiques (tronc primaire) et d'un cordon ombilical du 1er trimestre de grossesse. On observe une similitude de marquage entre 1 ' immun sérum 7381. Par ailleurs, on relève une absence de marquage par l'anticorps polyclonal 7381 pré immun et 1 ' immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante : (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité. Vestiges embry. : vestiges embryonnaires ; Endoth. : endothélium ; Vx : vaisseaux ; NT : non testé ; Im.sér. : immun sérum ; JO : sérum preimmun.
La lecture des lames correspondant au cordon ombilical (cf. tableau 2 et figure 22)) met également en évidence les vestiges embryonnaires endodermiques dont notamment la vésicule (ou sac) vitelline (yolk sac) et 1 ' allantoïde . Ces structures sont visibles aux côtés des trois vaisseaux et sont marquées par 1 ' immun sérum 7381 antichaîne C. Il est intéressant de souligner que 1 ' allantoïde, ainsi que le yolk sac (sac vitellin) sont des structures embryonnaires (d'origine endodermique) très importantes sur le plan de la vasculogénèse . En effet, ces structures sont le siège de processus de différenciation des cellules hémangioblastiques (dérivées du mésoderme) en cellules angioblastiques et hématopoïétiques . En outre, il est intéressant de rappeler que ce processus de différenciation correspondant aux premières étapes de la vasculogénèse (dès la 3 e semaine de gestation) et semble être induit pas le VEGF synthétisé par l'endoderme (Risau, W., 1997).
Rôle du polypeptide EPIL dans le processus de décidualisation et d'implantation embryonnaire Le processus de décidualisation de 1 ' endomètre est essentiel pour que l'implantation de l'embryon puisse se faire. Ce processus est dépendant des hormones stéroïdes ovariennes, notamment de la progestérone. Une des modifications durant la décidualisation concerne les cellules stromales de l' endomètre. En effet, les cellules stromales subissent au voisinage du site d'implantation des modifications morphologiques (polygonale, cytoplasme de taille agrandie, aspect de cellules épithéloïdes) et fonctionnelles (riche en glycogène et lipide, sécrétion autocrine et/ou paracrine de prolactine, relaxine, renin, IGF et IGFBP) (Speroff, L. et al., 1995 ; Edwards, R.G., 1995) . Plus récemment, il a été démontré que les facteurs de croissance de la famille EGF (EGF, TGF-alpha, HB-EGF, amphiregulin, heregulin, betacellulin, epiregulin) pourraient jouer un rôle important dans les mécanismes d'initiation de l'implantation, notamment de l'attachement. En effet, dans les modèles murins, l'expression du récepteur à 1 ' EGF (EGF-R) régulée par la progestérone et l'E2 a été démontrée tant au niveau du blastocyste que des cellules stromales utérines, ce qui fait des molécules de cette grande famille de 1 ' EGF des ligands potentiels à activité modulatrice de l'implantation (SK Das, International Symposium on Embryo Implantation, Octobre 1997). Il est intéressant de noter que dans l'espèce humaine, une étude a démontré la localisation du transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) dans l' endomètre, la décidue et le trophoblaste (Horowitz, G. M. et al., 1993). En outre, la décidualisation de cellules stromales est accompagnée de changements dans la motilité cellulaire qui implique une modification de la matrice extracellulaire (sécrétion de laminine par les cellules stromales, par exemple) . Il apparaît chez le rat que l'expression de bFGF ou fibroblast growth factor basique au niveau des cellules utérines stromales, est dépendante de la progestérone et pourrait être un facteur de croissance co-régulant les cellules stromales et être donc impliqué dans le processus de différenciation (décidualisation) . Les cellules stromales décidualisées synthétisent et sécrètent de la prolactine (PRL) . Une étude in vi tro de cellules endométriales stromales a montré que la production de PRL est probalement régulée par l'effet combiné des hormones stéroïdiennes (oestrogène et projestérone) et d'un peptide, la relaxine (Huang, J.R. et al., 1987). Plus récemment, alors que la source de relaxine endogène est le corps jaune, la présence de relaxine au niveau de l'épithélium glandulaire et des cellules stromales de l' endomètre a été démontrée ainsi que son rôle autocrine/paracrine sur la sécrétion de PRL par 1 'endomètre in vi tro (Bryant-Greewood et al., 1993 ; Zhu, H.H. et al., 1990 ; Rosenberg, M. et al. , 1991) .
Lorsque l'on considère l'expression d'EPIL 1 ou 3 , nous avons démontré par immunohistochimie avec 1 ' immun sérum antichaîne C un marquage des cellules stromales décidualisées, ainsi que de l'épithélium glandulaire endométrial de la caduque ou décidue pariétale et basale de grossesses du 1er trimestre (cf Figure 23) . Il est intéressant de noter que de façon similaire aux facteurs de croissance de la famille de l'EGF, notamment le TGF-alpha, la localisation d'EPIL 1 ou 3 est retrouvée à la fois au niveau du trophoblaste et au niveau de la décidue
(notamment au niveau des glandes endométriales et des cellules stromales) . Ainsi, le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans le processus d'implantation au moment de l'attachement, à l'instar de TGF-alpha. De plus, le polypeptide EPIL devrait également être impliqué dans la différenciation des cellules stromales internes qui constituent un des changements cellulaires de la décidualisation. En effet, à l'instar de la relaxine, le polypeptide EPIL devrait avoir un rôle stimulateur sur la synthèse de PRL par les cellules stromales et participer ainsi au processus de décidualisation. Par ailleurs, en raison d'un marquage des cellules trophoblastiques de phénotype non invasif (cytotrophoblaste intravilleux) , il est raisonnable de penser que le polypeptide EPIL sécrété par les cellules stromales et par les cellules de l'épithélium glandulaire de 1 ' endomètre devrait jouer un rôle dans le contrôle de l'invasion des cytotrophoblastes extravilleux au même titre que le TGF- béta (Giudice, L., 1994).
3) Dosage des différentes formes du polypeptide EPIL, application au dosage de l'EPIL dans le liquide ammiotique a) Méthode de dosage
On utilise par exemple un dosage « sandwich » par immuno-radiométrie à 2 sites (IRMA) pour la détection et le dosage des formes de polypeptide EPIL obtenues obtenues par voie recombinante, dans différentes fractions dans les procédures de chromatographie ou dans les échantillons biologiques où ces formes sont susceptibles d'être présentes. Ce dosage peut être réalisé par exemple en utilisant une phase solide, telle que des billes de polystyrène (Précision Plastic Bail, Chicago, MN) , revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture, et en utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué à l'125I comme indicateur radiomarqué. Les billes revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 sont par exemple incubées 2 heures en présence de l'échantillon à contrôler dilué dans du sérum de veau. On peut par exemple utiliser comme témoins des peptides synthétiques tels que le peptide correspondant à la portion 76-139 de l'EPIL, dans une gamme de concentrations telle qu'une gamme allant de 5 ng/mL à 2000 ng/mL. La sensibilité du dosage obtenue, environ 50 ng/mL avec une incubation de 2 heures de l'échantillon à analyser, peut être améliorée par exemple en procédant pour l'incubation à 2 étapes d'incubations de 6 et 18 heures, environ 10 ng/mL (Cf figure 19) . b) Application au dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique
Le dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique de femme enceinte est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment . Des concentrations de polypeptides EPIL allant de 10 à plusieurs centaines de ng/mL sont détectées chez les femmes enceintes. La figure 20 présente les résultats obtenus sur un panel de femmes, d'autres résultats ont montré que les concentrations peuvent atteindre plusieurs centaines de ng/mL. c) Application au dosage de l'EPIL dans le sérum Le dosage de l'EPIL dans le sérum est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment. Des concentrations de polypeptides EPIL allant de 10 à 100 ng/mL sont détectées. 4) Sarcome de Kaposi
L'objectif de la série d'expérience par immunohistochimie est d'étudier l'expression du polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 au niveau de biopsies de SK. Les différentes immunohistochimies effectuées avec 1' antisérum polyclonal antichaîne C dirigée contre l'EPIL 1 et/ou l'EPIL 3 (ac 7381 immunserum dilué au 1:500) ont permis de détecter les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau d'environ 50 % des 28 cas de SK. L ' immunomarquage est localisé au niveau des cellules tumorales fusiformes ou spindle cells ainsi qu'au niveau de vaisseaux intratumoraux et/ou vaisseaux de type "slit-like" (sans endothélium) et le plus souvent dans des lésions tardives de type nodulaire. L'intensité de 1 ' immunomarquage est modéré (+ à ++) dans la majorité des cas, avec cependant sur 8 cas l'observation d'un immunomarquage intense (+++). Sur les 4 cas de SK associés au SIDA, seul un cas présente un marquage faible à modéré au niveau des cellules tumorales, les autres étant tous négatifs. L'expérience dont les résultats sont représentés sur le tableau 3 (cf. tableau 3 ci-après) a permis de confirmer un immunomarquage intense, noté (3) sur le tableau, au niveau de 4 SK cutanés classiques de stade nodulaire. L' immunomarquage est relativement hétérogène localisé au niveau du cytoplasme des cellules tumorales fusiformes (SC) . En 'outre, tous les cas de SK montrent un immunomarquage par 1 ' immun sérum 7381 de l'épithélium malpighien (peau) ainsi que des glandes sébacées. On peut sur 1 cas noter un effet de gradient de marquage avec une intensité de marquage de la peau plus importante dans la région susjacente à la tumeur. Le marquage cutané concerne plutôt les cellules basales de l'épithélium malpighien avec un marquage cytoplasmique et nucléaire. A relever que la peau normale (saine) n'a pas présenté d ' immunomarquage par 1 ' immun sérum 7381 lors d'expériences effectuées parallèlement . Les contrôles négatifs tant le sérum preimmun (7381 JO) que 1 ' immun sérum 7381 préabsorbé par le peptide 59- 108Y ne montrent aucun marquage.
Les figures 10, 12, 14 et 16 (X 100, X 200, X 1000, X 400, respectivement) correspondent aux résultats obtenus pour un cas de Sarcome de Kaposi cutané de type classique après immunohistochimie (PA, Dako LSAB2) avec 1 ' immun sérum
7381 antichaîne C (dilution 1:500).
On observe un marquage relativement homogène des cellules tumorales (SC) d'intensité marquée (++) . En revanche, les cloisons fibreuses ne sont pas marquées (figures 10 et 14) .
Les figures 11, 13, 15 et 17 (X 100, X 200, X 1000 et X 1000, respectivement) correspondent au contrôle négatif après inhibition de 1 ' immun sérum 7381 par le peptide 59- 108 Y (18 heures d'incubation) en utilisant la même technique d' immunohistochimie . On observe une absence de marquage complète.
Tableau 3
7381 im. 7381 7381 Anti nti actine
Marquage sér. JO im. sér, A facteur alpha- /Tissu 1/500 1/500 inhibé
1/500 VIII muscle lisse
Sarcome de
Figure imgf000067_0001
E.M. + + (noy>cyt) nb + +
Vx qq + + (média et (Endoth. ) cloison fibreuse)
Sarcome de
Kaposi N°2
S.C. + + qq ++ (<5 %)
E.M. ++ (nooy>cyt)
Vx qq ++ + (Endoth. ) (média)
Sarcome de
Kaposi N°3
S.C. + +
E.M. + +
(noy≈cy .
Couche basale ++)
Vx ++ (média) (10%)
Sarcome de
Kaposi N°4
S.C. ++ ++ (30 %)
E.M.
(noy-cyt .
Couche basale ++)
Vx ++ (média)
SC : Spindle cells (cellules tumorales) ; Vx : Vaisseaux EM : Epithélium malpighien ; Noy : Noyau ; nb : nombreux qq : quelques ; Cyt : Cytoplasme Légende du tableau 3 : Analyse immunohistochimique (Pa, Dako, LSAB2) avec 1 ' immun sérum 7381 antichaîne C (dilution (1/500), l'anticorps polyclonal antifacteur VIII (Dako,
Réf. A0082) et monoclonal anti-actine α muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 μ) de biopsie cutanée de Sarcome de Kaposi (type classique) au stade histologique nodulaire. On observe que 1 ' immun sérum 7381 marque les cellules tumorales "spindle cells" du SK de façon plus marquée et plus étendue que l'anticorps polyclonal antifacteur VIII et monoclonal anti-actine α muscle lisse. En outre, on note un marquage de l'épithélium malpighien de la peau par 1 ' immun sérum 7381 tant nucléaire que cytoplasmique avec une prédominance au niveau de la couche basale. On note une absence de marquage au niveau des quatre cas de SK lorsque l'anticorps polyclonal 7381 pré immun et 1 ' immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y sont utilisés. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante : (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité. Mises en évidence par immunohistochimie sur des biopsies et par dosage sérique, les cellules de SK semblent sécréter des cytokines dont certaines sont des facteurs angiogéniques (VEGF, FGF-b, PDGF) . Récemment, par IH et HIS, les kératinocytes épidermiques bordant une région ulcérée ou dans une région hyperplasique semblent être une des sources de VEGF. En outre, l'expression de l'ARNm des récepteurs KDR et flt-1, deux récepteurs tyrosine kinase de la cellule endothéliale, semble être augmentée dans les cellules de SK elles-mêmes, ce qui serait en faveur d'une double action paracrine (Kératinocytes et macrophages) et autocrine directe de VEGF sur la cellule de SK (Brown et al., 1996). Plus récemment, Masood et al. (1997) ont démontré que le VEGF est un facteur de croissance autocrine pour le SK associé au SIDA faisant de lui le facteur angiogénique probablement le plus important dans ce type de tumeur . Ces résultats montrent que l'expression du gène INSL4 appartenant à la famille de l'insuline, est localisée notamment au niveau du placenta, du cordon ombilical et au niveau de cellules tumorales telles que celles du sarcome de Kaposi. Des anticorps monoclonaux et polyclonaux ont été produits contre différents peptides synthétiques correspondant aux différentes chaînes A, C et B de polypeptide putatif natif.
Les anticorps polyclonaux de lapin reconnaissant la chaîne C (7381 immun sérum) et la chaîne A et B (1661 immun sérum) ont permis de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement au niveau du placenta avec une expression du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau des cellules cytotrophoblastiques . En outre, nous avions observé un surprenant marquage des cellules endothéliales embryonnaires intravillositaires par l'Ac polyclonal 7381. Récemment, Zhou et al. (1997) a montré combien la différenciation des cytotrophoblastes extravilleux en cellules à phénotype endothélial était importante dans la physiologie du développement placentaire. Notre observation, en revanche, objectivant 1 ' immunomarquage du polypeptide EPIL 1 et /EPIL 3 au niveau cytotrophoblastique et des vaisseaux embryonnaires intravillositaires nous permet d'en déduire que le polypeptide EPIL jouerait un rôle essentiel dans la vasculogénèse embryonnaire" comme cela a été récemment démontré pour le VEGF, une cytokine angiogénique induisant la prolifération de cellules endothéliales et une augmentation de perméabilité vasculaire (Risau et al., 1997). En effet, il est intéressant de noter que Clark et al. en 1996 a démontré par immunohistochimie la présence de la protéine VEGF ainsi que de son récepteur Flt-1 au niveau du cytotrophoblaste intravilleux et de 1 ' endothélium des vaisseaux embryonnaires intravillositaires. Ces homologies d' immunomarquage avec le VEGF et d'autres cytokines que nous avons mis en évidence par la présence du polypeptide EPIL au niveau d'une tumeur angioproliférative, le Sarcome de Kaposi, montrent également que le polypeptide EPIL serait impliqué en tant que facteur de croissance des cellules tumorales comme le VEGF et d'autres cytokines dont leur rôle est bien connu. En outre, il apparaît que l'IGF-I, un membre de la famille de l'insuline, induit l'expression de VEGF dans le cancer colorectal ainsi que sur un modèle in vitro d'ostéoblastes (Goad et al., 1996).
Ainsi ces résultats montrent que le polypeptide EPIL est très certainement lié au processus de vasculogénèse embryonnaire et d' angiogenèse tumorale.
Activité insulin-like du polypeptide EPIL (EPIL 1, 2 et/ou 3)
Rappel du rôle physiologique de l'insuline Les hydrates de carbone (HC) ou glucides constituent la source principale d'énergie de l'organisme. Des systèmes régulateurs assurent un ajustement constant entre les besoins en HC et la formation de glucose. Les organes intervenant dans cette régulation sont le pancréas et le foie. Les cellules béta des îlots de Langerhans du pancréas sont le lieu de synthèse et de sécrétion de l'insuline, mais aussi du glucagon et de la somatostatine. Le foie a une fonction de stockage du glucose par glycogenèse (comme les adipocytes) et de synthèse du glucose par néoglucogenèse. Il a comme fonction vitale de mettre du glucose à disposition par glycogénolyse en cas de besoin (hypoglycémie) .
La proinsuline est formée de deux chaînes A et B avec une chaîne C appelée peptide de connexion. L'insuline est biologiquement active après avoir subi un clivage de son peptide C. Elle agit sur un récepteur transmembranaire de la famille des tyrosine kinase qui par l'intermédiaire d'une cascade de phosphorylation intervient sur la régulation des enzymes des différentes voies métaboliques (glucide, lipide et protide) . L'insuline a pour principal rôle de permettre l'utilisation du glucose par la cellule ainsi que la synthèse des lipides et des protéines (anabolisme) .
• L'utilisation du glucose est facilitée, par exemple, dans le muscle/adipocyte par une action stimulatrice du glucose et de l'insuline sur son transporteur (GLUT-4). L'insuline stimule ou inhibe l'expression d'une série d'enzymes intervenant dans la voie métabolique du glucose d'E den-Meyerhof comme la glucokinase (GK) , PFK2 et LPK (action stimulante de l'insuline), PEPCK et F-1,6-P2ase (action inhibitrice de l'insuline). Par l'action de l'insuline, le glucose est alors métabolisé en pyruvate et l'actate, puis en C02, H20 et ATP après passage dans le cycle de Krebs ou cycle de l'acide citrique (au niveau des mitochodries par phosphorylation oxydative) . Il faut noter qu'une autre voie de dégradation du G6P (glucose 6- phosphate) est possible, la voie des pentoses phosphate, également stimulée par l'insuline et responsable de la formation NADPH+, coenzyme essentiel à la biosynthèse des lipides. En outre, la voie des pentoses est la source de ribose essentiel pour la synthèse d'acide nucléique.
• La synthèse des lipides est également facilitée par l'insuline et se fait à partir de 1 ' acétyl (CoA) . Il y a aussi stimulation de la synthèse des protéines par l'insuline.
Physiopathologie du diabète
Il existe deux types de diabète : le type I ou diabète juvénile. Il s'agit d'une maladie auto-immune caractérisée par une destruction des îlots de Langerhans, donc pas une carence en insuline ; le type II ou diabète de l'adulte est en revanche caractérisé par une résistance à l'insuline.
Le diabète gestationnel : son diagnostic se fait pendant la grossesse (hyperglycémie à jeun) et généralement disparaît après l'accouchement. Durant le second trimestre, le taux d'insuline augmente considérablement en partie par l'augmentation d'activité hormonale anti-insuline . En effet, le placenta produit des hormones diabétogéniques comme l'hormone placentaire lactogène humaine (hPL) , les oestrogènes et la progestérone. En outre, la prolactine pituitaire ainsi que le cortisol sont des antagonistes de
1 ' insuline . Les mécanismes physiopathologiques sont probablement multiples. On a mis en évidence, par exemple, une augmentation de la dégradation de l'insuline pendant la grossesse. Cette dégradation esst causée par des enzymes placentaires comparables aux insulinases hépathiques (Freinkel, N. et al., 1991). Par un phénomène combinant d'une part la résistance à l'insuline d'origine hormonale
(hPL, PRL) et l'augmentation de la dégradation de l'insuline, le taux d'insuline à disposition diminue et un mécanisme d'hypersécrétion pancréatique régulateur est alors mis en route. Si le pancréas présente un dysfonctionnement, il ne pourra répondre à ce nouvel état physiologique de la grossesse et une intolérance au glucose voire un diabète gestationnel peut en résulter (Becker,
K.L. et al. , 1990) . Les complications du diabète
La complication majeure est d'ordre cardiovasculaire . Les mécanismes sous-jacents à cette complication diabétique sont ceux de l'athérosclérose et constitue la macro- angiopathie diabétique. Brièvement, dans le diabète, la cellule endothéliale des vaisseaux subit différentes agressions "physiques et chimiques comme l'hypertension artérielle, l'hyperglycémie, et 1 'hypercholestérolémie. Ces lésions répétées de 1 ' endothélium vasculaire mènent par l'intermédiaire des macrophages, des plaquettes et des facteurs de croissance à l'accumulation progressive de cellules musculaires lisses, de matrice extracellulaire et de lipides au niveau de l'intima et de la média. Ce sont ces lésions qui contribuent au rétrécissement de la lumière vasculaire. Fonctions insulin-like du polypeptide EPIL
• EPIL est une protéine de type ORP (oxygen-related protein) ou GRP (glucose-related protein) comme le VEGF. A partir du troisième trimestre, le placenta devient l'organe par lequel les échanges foeto-maternels se font notamment par l'intermédiaire d'un réseau vasculaire embryonnaire considérablement développé. Il est intéressant de rappeler que récemment certains travaux ont démontré le rôle du VEGF dans la vasculogénèse embryonnaire avec une expression augmentée dès la 3 e semaine de gestation dans l'endoderme, responsable de la différenciation du mésenchyme sus-jacent en hémangioblastes (Risau, W. , 1997) . En outre, il a été démontré que le VEGF est une protéine régulée par l'oxygène (ORP) et le glucose (GRP) . En effet, Stein et al. en 1995 démontre que l'hypoxie et l'hypoglycémie semblent augmenter l'expression du VEGF notamment par un mécanisme de stabilisation de son ARN messager (Stein, I. et al., 1995). De façon similaire, le transporteur du glucose GLUT-1 est stimulé par hypoglycémie et permet à la cellule dans un environnement hostile d'utiliser le maximum de glucose comme source d'énergie (Stein, I. et al . , 1995) . Le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans ces processus de réponse à un stress soit hypoxique soit hypoglycémique par un effet insulin-like. En effet, en addition de 1 ' homologie de structure du polypeptide EPIL et de l'insuline comme décrit précédemment, nous avons clairement démontré par immunohistochimie une localisation cellulaire similaire entre EPIL et VEGF avec un marquage du cytotrophoblaste, des cellules musculaires lisses des vaisseaux embryonnaires ainsi que des vestiges embryonnaires au niveau du cordon ombilical. La coexpression du polypeptide EPIL et VEGF au niveau de cellules et tissus identiques permet d'établir plusieurs mécanismes possibles. Comme nous l'avons dit plus haut, l'insuline permet une utilisation du glucose intracellulaire et permet par conséquent à la cellule de produire de l'ATP, du ribose (voie des pentoses). L'insuline est une hormone anabolique permettant de plus la biosynthèse des lipides et protéines. Tant au niveau placentaire qu'au niveau d'un tissu néoplasique, le taux de division cellulaire est important et le besoin énergétique plus important. Si le processus de néovascularisation est important pour la survie d'un tissu en situation de stress (VEGF) , il est vraisemblable que le polypeptide EPIL par un effet insulin-like para/autocrine intervienne dans ce processus en favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
• Effet insulin-like d'EPIL et le placenta. Le placenta est jusqu'à la fin du premier trimestre dans un environnement d'hypoxie relative. De même, on peut penser qu'en terme de nutriments notamment de glucose il se trouve très certainement dans un état hypoglycémique. Pourtant, il s'agit d'un tissu hautement mitogénique de type pseudotumoral, donc en besoin énergétique augmenté. Aussi, le fait de produire une molécule à effet insulin- like avec amélioration de l'utilisation du glucose permettrait au placenta de poursuivre son développement et sa croissance. En outre, il faut rappeler que le placenta est à l'origine de la dégradation de l'insuline et qu'il est à l'origine de protéines diabétogènes comme l'hPL, les oestrogènes et la progestérone. Le polypeptide EPIL devrait ainsi jouer le rôle de l'insuline par un effet insulin-like auto/paracrine .
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
2. Polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué : a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
3. Polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4 , caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les cellules trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales .
6. Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules endothéliales sont des cellules endothéliales vasculaires.
7. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules endothéliales vasculaires sont des cellules endothéliales vasculaires foetales.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 1, et 3 à 7, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3 , caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses sont des cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseau.
11. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses vasculaires sont des cellules constituant la paroi de vaisseau embryonnaire ou de cordon ombilical.
12. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans les cellules stromales .
13. Polypeptide selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules stromales sont des cellules de
1 ' amnion et/ou de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l' allantoïde situés au niveau du cordon ombilical.
14. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3 , caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales .
15. Polypeptide selon la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules tumorales de tumeur angioproliférative.
16. Polypeptide selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
17. Polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules de vaisseau intra-tumoral .
18. Polypeptide selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules épithéliales de Malpighi.
19. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain.
20. Polypeptide selon l'une des revendications 2 et 19, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle.
21. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de differentiation de cellules humaines et/ou animales.
22. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de prolifération de cellules humaines et/ou animales.
23. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de régénération de cellules humaines et/ou animales.
24. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules endothéliales.
25. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules musculaires lisses, notamment vasculaires .
26. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules épithéliales.
27. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules stromales, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire.
28. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires.
29. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des tumeurs.
30. Polypeptide selon la revendication 29, caractérisé en ce que les tumeurs sont des tumeurs angioprolifératives .
31. Polypeptide selon l'une des revendication 29 et 30, caractérisé en ce que les tumeurs sont des tumeurs associées au Sarcome de Kaposi.
32. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
33. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine .
34. Polypeptide selon la revendication 33, caractérisé en ce que le processus de type insulin-like est un processus de réponse à un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique.
35. Polypeptide selon l'une des revendications 33 et 34, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
36. Fragment de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisé en ce qu'il est biologiquement actif .
37. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, sa séquence complémentaire ou la séquence de son ARN correspondant .
38. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
39. Vecteur selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte.
40. Cellule hôte transformée par un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39.
41. Méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon la revendication 40.
42. Méthode de production d'un polypeptide recombinant selon la revendication 41, caractérisée en ce que l'on cultive les cellules transformées selon la revendication 40 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
43. Polypeptide recombinant' susceptible d'être obtenu par une méthode selon l'une des revendications 41 et 42.
44. Polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse chimique.
45. Anticorps monoclonal et polyclonal ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications l à 36, 43 et 44.
46. Anticorps selon la revendication 45, caractérisé en ce qu'il est immunoconjugué ou marqué.
47. Sonde ou amorce oligonucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement à une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
48. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 47, caractérisée en ce qu'elle est marquée.
49. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide ou d'un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, ou pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36.
50. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une des revendications 47 et 48, pour la détection, l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
51. Procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46 ; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène -anticorps formé.
52. Procédé selon la revendication 51, caractérisé en ce l'anticorps utilisé à l'étape a) est fixé sur un support solide et en ce que la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage du complexe antigène-anticorps formé de l'étape b) est réalisé en utilisant un anticorps selon la revendication 46.
53. Procédé selon la revendication 51 ou 52, pour le dosage d'une des formes du polypeptide EPIL dans le liquide amniotique et/ou le sérum.
54. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46 ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) le cas échéant les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique .
55. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon la revendication 37 à l'aide d'amorces selon la revendication 47 ; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d' amplification.
56. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
57. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon la revendication 47 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon la revendication 47 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l 'hybriclation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique ; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48.
58. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
59. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 47 pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48 ; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
60. Procédé ou kit selon l'une des revendications 51 à 59, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales.
61. Procédé ou kit selon la revendication 60, pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, notamment angioprolifératives .
62. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46.
63. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une amorce et/ou une sonde, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48.
64. Méthode de marquage selon l'une des revendications 62 et 63, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 51 et 56.
65. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule endothéliale .
66. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 65, caractérisée en ce que la cellule endothéliale est une cellule vasculaire.
67. Méthode " de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule musculaire lisse.
68. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule stromale, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithélium endométrial de l'utérus.
69. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule tumorale, notamment angio- proliférative .
70. Méthode de marquage de cellule selon la revendication
69, caractérisée en ce que la cellule est une cellule tumorale du Sarcome de Kaposi.
71. Méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44 et/ou une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 62 à
70, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
72. Cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode selon la revendication 71.
73. Procédé de détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 62 à 70.
74. Procédé selon la revendication 73, pour la détection de cellules' tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
75. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, une séquence d'acide nucléique selon la revendication 47 ou une cellule selon l'une des revendications 40 et 72.
76. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la differentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales .
77. Méthode de sélection selon la revendication 76, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la differentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
78. Méthode de sélection selon la revendication 76, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la differentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales .
79. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules endothéliales.
80. Méthode de sélection selon la revendication 79, caractérisée en ce que les cellules endothéliales sont des cellules vasculaires.
81. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules musculaires lisses.
82. Méthode de sélection selon la revendication 81, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules musculaires lisses vasculaires.
83. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules épithéliales.
84. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules stromales, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithélium endométrial de l'utérus.
85. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
86. Méthode de sélection selon la revendication 85, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
87. Méthode de sélection selon la revendication 85, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
88. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler l'activité insulin-like.
89. Méthode de sélection selon la revendication 88, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la réponse de la cellule à un stress hypoxique et/ou hypoglycémique.
90. Méthode de sélection selon la revendication 89, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
91. Composé chimique ou biochimique, en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode selon l'une des revendications 75 à 90.
92. Composé selon la revendication 91, à titre de médicament .
93. Composé selon l'une des revendications 91 et 92, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44 ; b)un anticorps selon la revendication 45 ; un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36 ; c)un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 ; d)un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36 ;et e)une sonde selon la revendication 47.
94. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné au traitement des tumeurs.
95. Composé selon la revendication 94, destiné au traitement des tumeurs angioprolifératives.
96. Composé selon la revendication 95, destiné au traitement du Sarcome de Kaposi.
97. Composé selon l'une des revendications 94 et 95, caractérisé en ce que la tumeur est une tumeur du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome , ou un léiomyosarcome .
98. Composé selon la revendication 97, caractérisé en ce que la tumeur est un léiomyosarcome .
99. Composé selon selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques .
100. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de
1 ' endométriose, de l'arthrite rhumatoïde, de l'athérosclérose ou de 1 ' hyperthyroïdie .
101. Composé selon la revendication 100, destiné au traitement de l'athérosclérose, notamment des lésions dues à la resténose après angioplastie .
102. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithéliale, suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroïde ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.
103. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à favoriser ou à inhiber l'implantation embryonnaire .
104. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à une activité de type insulin-like.
105. Composé selon l'une des revendication 104 destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, notamment à une hypoglycémie ou à une hyperglycémie.
106. Composé selon l'une des revendication 104 et 105, caractérisé en ce que la pathologie est choisi parmi le diabète, notamment le diabète gestationnel , et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires.
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