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WO1999036528A2 - Transgener nicht-menschlicher säuger sowie verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung - Google Patents

Transgener nicht-menschlicher säuger sowie verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung Download PDF

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WO1999036528A2
WO1999036528A2 PCT/DE1999/000116 DE9900116W WO9936528A2 WO 1999036528 A2 WO1999036528 A2 WO 1999036528A2 DE 9900116 W DE9900116 W DE 9900116W WO 9936528 A2 WO9936528 A2 WO 9936528A2
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mammal
human
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homologous
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Qin Yang
Zhao-Qi Wang
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Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Definitions

  • the invention relates to a method for producing a transgenic non-human p53 mammal and its use for testing chemicals, drugs and therapeutic approaches.
  • the invention relates to the generation of a p53 human knock-in mouse.
  • the invention further relates to a transgenic non-human mammal in which all or part of the p53 gene is functionally replaced by a homologous p53 gene or a homologous p53 gene segment from another mammal, the respectively introduced sequence being present as a genomic sequence .
  • Acquired somatic mutations in the tumor suppressor gene p53 very often correlate with the spontaneous onset of cancer in humans and animals, for example colon, lung, liver, breast, bladder, esophageal cancer as well as lymphomas, osteosarcomas, neurofibrosarcomas. Between 30 and 70% of all malignant tumors of almost every organ or tissue type show a point mutation in one of the two p53 gene copies and / or the loss of the other alien.
  • the "normal" p53 protein (wild type) encoded by this gene has a cancer-inhibiting function in that it can stop the cell cycle and induce apoptosis (programmed cell death).
  • the p53 protein acts as a negative regulator of cell growth, in which it is induced after DNA damage. Functional loss of p53 can result from point mutation, allele loss, intragenic rearrangement and intragenic deletion. Germline p53 mutations are associated with cancer in early life. The oncogenic potential of various mutations in the p53 gene has been investigated in numerous studies (cf. Harris et al., New Engl. Journ. of Med., 329, 1 31 8-1 327 (1 993)). Certain mutations, so-called hot spol mutations, are more common in some types of tumor. Common mutation sites in the coding sequence of p53 are, for example, codons 273, 248, 1 75, 249 or 245.
  • Mutated p53 proteins are very often associated with a poor prognosis for the respective cancer and can even inhibit wild-type p53 dominant-negative and perform other additional functions, e.g. stimulate the cell cycle, thus favoring a neoplastic process.
  • An overview of the functional and clinical significance of mutations in the p53 gene can be found in Sidransky et al., Annu. Rev. Med. 47: 285-301, 1 996.
  • mice including transgenic and other rodents have been exposed to the respective substances and the genes from the tumors formed have been analyzed (cf. Goodrow et al., Molecular Carcinogenesis, 5, 9-1 5, 1 992) .
  • Human cell lines were also exposed in vitro and the mutations in certain genes examined. Such cells were then injected into nude mice and the educated ⁇ th tumors were analyzed for mutations in oncogenes and tumor suppressor genes.
  • transgenic mice More recently, transgenic mice have been used to study carcinogenesis. Transgenic animals are well suited as a model for targeted testing for the effects of a mutation in a tumor suppressor gene such as the p53 gene.
  • a p53 defect mouse was paired with a p53 null allele with a transgenic mouse that contained multiple copies of a mutated mouse p53 gene (Val 135) outside the normal chhromatin context.
  • Animals which are related to the endogenous wild-type p53 gene with the mutated transgenes were hemizygous, developed a tumor more quickly and showed an altered tumor spectrum compared to the non-transgenic control group (Kemp et al., Nature Genetics, 9, 305-31 1 1 995).
  • the p53 gene was not in its natural form: in one case the mouse transgene was mutated (not functional) and not in its natural chromosomal location; in the other case the gene sequence was not integrated as a pattern of intron and exon sequences, but rather as cDNA and moreover not under the control of the naturally present regulatory elements and was not expressed in all tissues. These models therefore do not correspond to natural conditions and allow no or only limited information about a possible mutagenesis or carcinogenesis in humans. In a third model, the p53 alleles (mouse) were switched off by "knock-out" and are therefore no longer available for the mutation analysis.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a model on which carcinogenicity tests with significance for mammals, in particular humans, can be carried out. These carcinogenicity tests are designed to relate to the oncogenic potential of changes in the p53 gene.
  • the invention is also intended to provide a model on which mutation spectra in the human p53 transgene, which are typical for certain classes of human carcinogens or carcinogen exposure, can be represented.
  • the use of carcinogenic substances is said to be able to identify mutation hot spots in the p53 gene which are also important in the natural environment of human p53, ie in humans.
  • a model is to be created on which chemical and pharmaceutical products can be tested with regard to their mutagenic and carcinogenic potential in the human p53 gene in various organs. Furthermore, a model is to be provided with which pharmaceutical products of a new generation can be tested for their effectiveness against human tumors.
  • the model is intended to allow the development of agents which are suitable for diagnostic and / or therapeutic measures in various tumors which carry a mutated p53 gene, and in particular for generating a mutation pattern in the p53 gene which is typical for humans. The interaction of different mutations in the development of tumors should also be investigated.
  • the present invention therefore relates to a method for producing a transgenic non-human mammal, wherein an embryonic stem cell line of a non-human mammal is transfected with a suitable recombination vector, stably transfected cell clones are isolated and implanted in suitably prepared female animals of a non-human mammal and their progeny are selected for the presence of the gene exchange, the method being characterized in that, in the event of the recombination, all or part of the p53 gene by a homologous p53 gene or a homologous p53 gene segment of another mammal is functionally replaced, the respectively introduced sequence being present as a genomic sequence.
  • the invention further relates to a transgenic non-human mammal in which part or all of the p53 gene of the mammal is functionally replaced by a homologous p53 gene or a homologous p53 gene segment from another mammal, the respectively introduced sequence being genomic Sequence is present.
  • the respective p53 gene is present in its natural genetic environment and preferably codes for an expressed, non-mutated protein.
  • the invention further relates to a method in the form of a mammal model for testing new drugs for their effectiveness against human tumors, which is characterized in that the above-mentioned transgenic non-human mammals are treated with the new drug and the tumor regression or remission after method known per se.
  • the invention relates to a method for testing chemicals for their mutation and cancer-inducing potential, which is characterized in that the above-mentioned transgenic non-human mammal is treated with the chemical and the mutation spectra or tumor induction are determined by methods known per se.
  • the p53 gene of one mammal can be integrated in the form of genomic sequences into the genome of another mammal instead of the p53 gene present there and is then under the control of the regulatory elements naturally present in this genome.
  • the p53 sequence to be introduced comes from the genome of a mammal other than the transgenic mammal to be generated (eg mouse, rat, rabbit, horse, cow, sheep, goat, monkey, pig, dog, cat).
  • the comes preferably Sequence to be introduced from the human genome. However, it can also come from the genome of another mammal, such as a pet (eg dog, cat etc.) or a farm animal (eg horse, cattle, pig etc.).
  • the p53 sequence can be introduced as a whole or in parts. It can exist as a wild-type sequence or as a mutated sequence, depending on whether a model for testing for carcinogens or drugs is to be obtained. It can also contain one or more mutation (s) that are typical of a specific cancer. The mutation is preferably typical for a type of cancer, for example for colon, lung, liver, breast, bladder, esophageal, as well as lymphomas, osteosarcomas and neurofibrosarcomas.
  • the exons / introns of the p53 gene of another mammal are preferably introduced, which usually have the greatest number of mutations in tumors. These are preferably human exons 5-9.
  • those gene parts are preferred which have one or more mutations typical of a specific cancer, e.g. To be able to specifically investigate oncogenesis and therapeutic options for the specific tumor disease.
  • UTR Untranslated Region
  • the invention relates in particular to the production of the p53 human knock-in mouse (Phuki mouse).
  • This genetically modified mammal carries the exons and Introns of the human p53 gene as a transgene.
  • the part of the human p53 gene that is most important for tumor development preferably wild-type p53 or parts thereof
  • This created a natural situation for the human p53 gene which is that the p53 gene is present in the form of genomic sequences, ie as intron and exon sequences, but not as cDNA in multiple copies in unknown locations in the genome.
  • the p53 gene is under the control of regulatory elements that are naturally present in the mouse.
  • the present invention makes it possible, by using carcinogenic substances, to identify mutation hot spots in the p53 gene or p53 protein which are also important in the natural environment of human p53, ie in humans. This enables targeted development of agents that are suitable for diagnostic and / or therapeutic measures for mutant p53 in precancerous diseases and various cancers.
  • a gene substitution vector or recombination vector is generated in which the p53 gene of a mammal is completely or partially replaced by the corresponding counterpart of another mammal.
  • This construction is preferably transfected into embryonic stem cells (eg mouse 1 29 / SV) via the mechanism of homologous recombination (cf. RM Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1 997).
  • the homologous recombination between the DNA sequences present in a chromosome and new, added cloned DNA sequences enables the insertion of a cloned gene into the Genome of a living cell instead of the original gene.
  • embryonic germ cells can be used to obtain via chimeras animals that are homozygous for the desired gene or the desired gene part or the desired mutation.
  • mice with the Phuki constructs can of course be crossed with common mouse strains which are used for carcinogenesis tests and are therefore responsible for the mutagenic / carcinogenic activity of various substances: e.g. SENCAR mice (especially used for skin tumorigenesis studies), B6C3F1 (used for various cancer tests).
  • SENCAR mice especially used for skin tumorigenesis studies
  • B6C3F1 used for various cancer tests.
  • Other strains of mice that are interesting for crossing with the Phuki mouse are e.g. Strains with genetic defects in DNA repair (e.g. lack of enzyme activity from O6-alkylguanine transferase). These mouse strains are all commercially available and are well known to those skilled in the art.
  • transgenic mammal by crossing the transgenic mammal according to the invention with already established transgenic mammals (e.g. models for general or organ-specific inflammation), double-transgenic mammalian models can be produced, which allow a more realistic simulation of human carcinogenesis than before.
  • transgenic mammals e.g. models for general or organ-specific inflammation
  • HBsAg hepatitis B surface antigen
  • TGF-beta 1 transgenic mouse which has a transforming growth factor cDNA under the control of regulatory elements from the mouse albumin gene
  • hu-HLA-B27 a human MHC class I allele associated with human inflammatory diseases
  • the ge ⁇ be desired exons, including exons 5-9, the endogenous mouse p53 gene by the corresponding exons of the human, including the intron sequences replaced by homologous recombination.
  • Gensubstitutionsvektor used for example, the plasmid described below 14-1 -3
  • an embryonic stem cell line eg ES 129 / SV.
  • the recombinant clones of the mouse embryonic stem cells obtained are implanted in suitably prepared female animals for the production of chimeras.
  • “Appropriately prepared female animals” means that the animals have been prepared for their "carrying out” task by various measures, for example by hormone treatment.
  • the heterozygous strains (p53 + phuk 7 +) thus obtained can then be mated with another animal of the same strain or with a different (heterozygous) mouse strain.
  • this can be a p53 knock-out mouse (p53 + / -) [Donehower et al., Nature 356, 21 5-221, 1 992], in which one of the functional endogenous p53 alleles by interrupting the coding sequences had been rendered inoperative by a foreign DNA.
  • the offspring of this mating house a non- functional mouse p53 allele and a functional hybrid mouse / human p53 allele, which differs from the normal functional mouse allele only with regard to the DNA sequence in the corresponding exons (5 -9) and the cutscenes. These are identical to the sequence of the normal human p53 gene.
  • the recombinant gene is still controlled by the mouse normal p53 promoter.
  • the chromatic structure, the biological parameters and the gene environment are also unchanged.
  • the plasmids 14-1 -3 and 29-38 which can be used for gene substitution were obtained on December 1, 1,997 at the DSMZ Braunsschweig (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig) under the accession numbers DSM 1 1 904 (14-1 -3) and DSM 1 1 905 (29-38).
  • Figure 1 Construction of a p53 mouse-human hybrid gene.
  • FIG. 2 steps for the construction of a gene transfer vector (“gene targeting”) simple lines: p53 intron sequences black rectangles: p53 exon sequences ⁇ : LoxP sites for excision by means of CRE recombinase
  • Mouse p53 genomic DNA fragment contains exons 2, 3 and 4 with the intron sequences between them cloned from the mouse 1 29 / SV genome
  • Drug resistance selection cassette contains the coding genetic information for neomycin resistance and gangcylovir sensitivity. The cassette has its own promoters.
  • Fragment C Human p53 genomic DNA fragment contains exons 5, 6, 7, 8, 9 with the intron sequences in between
  • Fragment D Mouse p53 genomic fragment contains exon 10 with flanking intronse- quence
  • the model according to the invention can be used for mutagenicity or carcinogenicity studies in order to test chemicals of all kinds for their carcinogenic potential. All products or their metabolites that contribute directly (e.g. through direct DNA adduct formation in this gene) or indirectly (e.g. through favoring endogenous mutagenic adducts in this gene) to mutations in p53 are to be classified as potentially carcinogenic for humans, especially if they cause mutations that are already stored in the p53 database.
  • Known methods are available for the investigation of DNA mutation spectra in the new PHUKI mouse, which already have a few mutations in tumors (Lehman et al., Cancer Res. 51, pp.
  • tumors with chemical or other carcinogens with human-typical mutations in the p53 gene are generated in the transgenic animal. These are then treated with the respective test pharmaceuticals.
  • An active ingredient that converts mutated, conformationally modified p53 proteins in tumors to wild-type function makes the tumor cells sensitive to apoptosis and thus triggers the suicide program in the tumor. This should result in remission or regression of the tumor.
  • the following examples illustrate the invention.
  • a gene bank from DNA of the mouse strain 1 29 / SV in the Lambda Fix II phage was screened with a cDNA sample which corresponds to the mouse p53 gene transcript.
  • a phage was isolated with a 14 kb insert of the mouse functional p53 gene (called Strat # 1).
  • Strat # 1 A 3.8 kb Kpnl / Xbal fragment and a 2.3 kb BamHI / Xbal fragment were cut out of Strat # 1 by restriction digestion and separately cloned into plasmid pGEM 3Z / A (commercially available from Promega), which the Clones 2QG and 4A results.
  • a Kpnl / Xbal fragment (fragment A, see FIG. 2) was cut out of clone 2QG and then cloned into the pBluescript II KS vector (commercially available from Stratagene).
  • the neomycin resistance / thymidine kinase genes contained in the plasmid pHR1 (obtained from Dr. KITAner, DKFZ Heidelberg) flanked by loxP recognition sites (for the subsequent cre recombinase-controlled excision) were identified as Xbal / HindIII fragment (fragment B; see FIG. 2) cloned to fragment A in the Bluescript II KS vector. Clone 25-34 was obtained.
  • the human fragment C (see FIG.
  • Fragment C contains the human p53 gene from exon 5 to 9 (and intervening introns). Fragment C and a Kpn / Notl fragment (fragment D, see FIG. 2) from clone 4A were cloned into pBluescript KS II, which results in clone 21 -6.
  • the clones obtained were sequenced using fluorescence-labeled dideoxynucleotides with an ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) for verification.
  • a Spel / Notl fragment from clone 21-6 (contains fragments C + D) has now been cloned into plasmid 25-35.
  • the finished construct now carries A + B + C + D. This construct corresponds to the above-mentioned deposited plasmid 29-3B (Phuki test construct).
  • the other deposited clone 14-1 -3 is identical to 29-38, except that clone 29-38 in fragment C contains a missense mutation which triggers amino acid substitution on codon 1 92 in exon 6, while fragment C in 14-1 -3 corresponds to the wild type and thus represents the "prototype".
  • Construct 29-38 can serve as a test mutant in the experiments, which is particularly interesting since 4% of the point mutations in human tumors take place in the modified codon.
  • the plasmids 14-1-3 and 29-38 obtained in Example 1 were each electroplated with a single pulse of 260 V / 500 ⁇ F into pluripotent embryonic stem cell lines of the mouse 1 29 / Sv ( 20 ⁇ g / 10 7 cells; E14.1 or MB-1 obtained from Dr. Wang, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France) inserted. Suitable neomycin resistant clones bearing the homologous recombination event were selected. The genomic DNA from these clones was tested by Southern blot to confirm the integration of the plasmid by homologous recombination. The recombination scheme is shown in FIG. 3.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, wobei eine embryonale Stammzellinie eines nicht-menschlichen Säugers mit einem geeigneten Rekombinationsvektor transfiziert wird, stabil transfizierte Zellclone isoliert werden und in geeignet vorbereitete weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugers implantiert werden und deren Nachkommen auf das Vorhandensein des Genaustausches selektioniert werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei dem Rekombinationsereignis die Gesamtheit oder einen Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt wird, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt. Ausserdem betrifft die Erfindung den erhaltenen transgenen, nicht-menschlichen Säuger und seine Verwendung zum Austesten von Medikamenten, Chemikalien und Therapieansätzen.

Description

Transgener nicht-menschlicher Säuger sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen p53-Säugers sowie dessen Verwendung zum Austesten von Chemikalien, Medikamenten und Therapieansätzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Erzeugung einer p53 Human Knock-in Maus.
Die Erfindung betrifft ferner einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, bei dem die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.
Erworbene somatische Mutationen in dem Tumor-Suppressorgen p53 korrelieren sehr häufig mit dem spontanen Aufteten von Krebs bei Mensch und Tier, z.B. Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs sowie Lymphomen, Osteosarkomen, Neurofibrosarkomen. So weisen zwischen 30 und 70% aller malignen Tumore fast jedes Organ- oder Gewebstyps eine Punktmutation in einer der zwei p53-Genkopien und/oder den Verlust des anderen Alieis auf. Das von diesem Gen codierte "normale" p53-Protein (Wildtyp) besitzt eine krebshemmende Funktion, indem es den Zellzyklus stoppen und Apoptose (programmierter Zelltod) induzieren kann. Mit Hilfe p53-abhängiger Mechanismen wird die geschädigte Zelle entweder wieder repariert oder komplett vernichtet, wodurch in beiden Fällen der neoplastische Prozeß unterbrochen wird. Das p53-Protein wirkt dabei als negativer Regulator des Zellwachstums, in dem es nach DNA- Schädigung induziert wird. Zu einem Funktionsverlust von p53 kann es durch Punktmutation, Allelverlust, intragenische Umordnung und intragenische Deletion kommen. p53-Mutationen in der Keimbahn stehen im Zusammenhang mit Krebs in frühen Lebensjahren. In zahlreichen Studien wurde das onkogene Potential verschiedener Mutationen im p53-Gen untersucht (vgl. Harris et al., New Engl. Journ. of Med., 329, 1 31 8-1 327 ( 1 993)). Bestimmte Mutationen, sogenannte Hot-Spol-Mutationen, kommen bei manchen Tumorarten häufiger vor. Häufige Mutationsstellen in der codierenden Sequenz von p53 sind beispielsweise die Codons 273, 248, 1 75, 249 oder 245.
Mutierte p53-Proteine sind sehr häufig mit einer schlechten Prognose für die jeweilige Krebserkrankung verbunden und können sogar Wild-Typ p53 dominantnegativ hemmen und noch weitere Zusatzfunktionen ausüben, wie z.B. die Stimulierung des Zellzyklus, also einen neoplastischen Prozeß begünstigen. Ein Überblick über die funktioneile und klinische Bedeutung von Mutationen im p53- Gen findet sich in Sidransky et al., Annu. Rev. Med. 47:285-301 , 1 996.
Alle bisher erforschten Mutationen und ihre Korrelation mit den jeweiligen Krebserkrankungen sind in einer Datenbank zusammengestellt, die von der International Agency for Research on Cancer (IARC) in Lyon, Frankreich, betreut wird und auf CD-ROM erhältlich ist (vgl. Hollstein et al., Nucleic Acids Res., 24, 1 , 141 -146, 1 996).
Zur Identifizierung von möglichen menschlichen Karzinogenen wurden bisher Mäuse (auch transgene) und andere Nager gegenüber den jeweiligen Stoffen exponiert und die Gene aus den entstandenen Tumoren analysiert (vgl. Goodrow et al., Molecular Carcinogenesis, 5, 9-1 5, 1 992) . Ferner wurden auch menschliche Zelllinien in vitro exponiert und die Mutationen in bestimmten Genen untersucht. Solche Zellen wurden dann auch in Nacktmäuse injiziert und die gebilde¬ ten Tumoren wurden auf Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen untersucht. In jüngerer Zeit werden verstärkt transgene Mäuse zum Studium der Karzinogenese verwendet. Transgene Tiere eignen sich gut als Modell zum gezielten Test auf die Auswirkungen einer Mutation in einem Tumorsuppressor- gen wie dem p53-Gen. Dazu wurde beispielsweise eine p53-Defektmaus mit einem p53-Nullallel mit einer transgenen Maus, die mehrere Kopien eines mutierten Maus p53-Gens (Val 135) außerhalb des normalen Chhromatin-Kontextes in sich trug, verpaart. Tiere, die bzgl. des endogenen Wild-Typ p53-Gens mit dem mutierten Transgen hemizygot waren, entwickelten rascher einen Tumor und zeigten ein verändertes Tumorspektrum gegenüber der nicht-transgenen Kontrollgruppe (Kemp et al., Nature Genetics, 9, 305-31 1 1 995).
Jedoch erlauben derartige Karzinogenesemodelle bei Tieren nur wenige Rückschlüsse auf Mutationsmuster beim Menschen. Zum einen entsprechen die Expositionen meist nicht den beim Menschen üblichen komplexen Expositionen wie z.B. Tabakrauch, Umweltfaktoren, Lebensstil, Ernährungsgewohnheiten etc.. Wegen der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet sich nach heutiger Kenntnis außerdem ein Mutationsspektrum des Tieres immer von dem des Menschen (vgl. Duflot et al., Carcinogenesis, 1 5, 7, 1 353-1 357, 1 994 und Dumaz et al., Carcinogenesis 1 8, 897-904, 1 997). Obwohl beispielsweise die Aminosäuresequenz der stark konservierten DNA-Bindungsregion des p53- Protein bei Mensch, Maus und Ratte fast identisch ist, unterscheiden sich die DNA-Sequenzen in vielen Nukleotiden. Es konnte gezeigt werden, daß die Induktion einer Mutation in hohem Maße von der genauen DNA-Sequenz abhängt, die bei der Maus anders als beim Menschen ist.
Ferner lag bei den bisher beschriebenen transgenen Tieren das p53-Gen nicht in seiner natürlichen Form vor: in einem Fall war das Maus-Transgen mutiert (nicht funktionell) und nicht an seiner natürlichen chromosomalen Stelle; im anderen Fall war die Gensequenz nicht als Muster von Intron- und Exonsequenzen, sondern als cDNA integriert und überdies nicht unter der Kontrolle der natürlicherweise vorhandenen Regulatorelemente und wurde nicht in allen Geweben exprimiert. Diese Modelle entsprechen also nicht den natürlichen Verhältnissen und erlauben keine bzw. nur eine beschränkte Aussage über eine mögliche Mutagenese bzw. Karzinogenese beim Menschen. In einem dritten Modell sind die p53 Allele (Maus) durch "Knock-out" ausgeschaltet worden, stehen also für die Mutationsanalyse nicht mehr zur Verfügung. Es besteht daher ein Bedarf nach Modellen, an denen im Hinblick auf die Entwicklung von Krebsmedikamenten aussagefähige Erkenntnisse über die Entstehung und Progression von Krebs, insbesondere beim Menschen, gewonnen werden können. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Modell bereitzustellen, an dem Karzinogenitätstests mit Aussagekraft für Säuger, insbesondere den Menschen, durchgeführt werden können. Diese Karzinogenitätstests sollen sich auf das onkogene Potential von Veränderungen im p53-Gen beziehen. Die Erfindung soll ferner ein Modell bereitstellen, an dem Mutationsspektren im menschlichen p53-Transgen, die für bestimmte Klassen von menschlichen Karzinogenen bzw. Karzinogenexposition typisch sind, dargestellt werden können. Durch den Einsatz von kanzerogenen Stoffen sollen Mutations-Hot- Spots im p53-Gen identifiziert werden können, die auch in der natürlichen Umgebung von humanem p53, d.h. im Menschen, Bedeutung haben. Dadurch sollen sich z.B. berufsbedingte, ernährungsbedingte, durch spezielle Lebensgewohnheiten bedingte Expositionsmuster herausfinden lassen. Es soll ein Modell geschaffen werden, an dem chemische und pharmazeutische Produkte im Hinblick auf ihr mutagenes und karzinogenes Potential im menschlichen p53-Gen in verschiedenen Organen getestet werden können. Ferner soll ein Modell bereitgestellt werden, mit dem pharmazeutische Produkte einer neuen Generation auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore getestet werden können. Das Modell soll die Entwicklung von Mitteln erlauben, die sich für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen bei verschiedenen Tumoren, die ein mutier- tes p53-Gen tragen, eignen und insbesondere zur Erzeugung eines für den Menschen typischen Mutationsmusters im p53-Gen. Auch das Zusammenwirken verschiedener Mutationen bei der Tumorentstehung soll untersucht werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, wobei eine embryonale Stammzellinie eines nicht-menschlichen Säugers mit einem geeigneten Rekombinationsvektor transfiziert wird, stabil transfizierte Zellclone isoliert werden und in geeignet vorbereitete weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugers implantiert werden und deren Nachkommen auf das Vorhandensein des Genaustausches selektioniert werden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß bei dem Rekombinationsereignis die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt wird, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genömische Sequenz vorliegt.
Ferner betrifft die Erfindung einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, bei dem ein Teil oder die Gesamtheit des p53-Gens des Säugers durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt. Dabei liegt das jeweilige p53-Gen in seiner natürlichen genetischen Umgebung vor und kodiert bevorzugt für ein exprimiertes, nicht mutiertes Protein.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren in Form eines Säugermodells zum Test von neuen Arzneistoffen auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den vorstehend genannten transgenen nicht-menschlichen Säuger mit dem neuen Arzneistoff behandelt und die Tumorregression bzw. - remission nach an sich bekannten Verfahren bestimmt. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Test von Chemikalien auf ihr mutations- und krebsinduzierendes Potential, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den vorstehend genannten transgenen nicht-menschlichen Säuger mit der Chemikalie behandelt und die Mutationsspektren bzw. Tumorinduktion nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.
Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, daß sich das p53-Gen eines Säugers in Form von genomischen Sequenzen in das Genom eines anderen Säugers anstelle des dort vorliegenden p53-Gens integrieren läßt und dann unter der Steuerung der natürlicherweise in diesem Genom vorhandenen Regulatorelemente steht.
Die einzuschleusende p53-Sequenz stammt aus dem Genom eines anderen Säugers als der zu erzeugende transgene Säuger (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Kuh, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund, Katze) . Bevorzugt stammt die einzuschleusende Sequenz aus dem menschlichen Genom. Sie kann aber auch aus dem Genom eines anderen Säugers, wie z.B. eines Haustieres (z.B. Hund, Katze etc.) oder eines Nutztieres (z.B. Pferd, Rind, Schwein etc.) stammen. Die p53-Sequenz kann als Ganzes oder in Teilen eingeschleust werden. Sie kann als Wildtypsequenz oder als mutierte Sequenz vorliegen, je nachdem ob ein Modell zum Test auf Karzinogene oder Arzneimittel erhalten werden soll. Sie kann auch ein oder mehrere Mutation(en), die für eine spezielle Krebsart typisch ist/sind, enthalten. Bevorzugt ist die Mutation für eine Krebsart, beispielsweise für Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymphomen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typisch.
Zur Erzeugung von Modellen für Karzinogenitätstests werden bevorzugt die Exons/Introns des p53-Gens eines anderen Säugers eingeschleust, die in Tumoren üblicherweise die größte Anzahl an Mutationen aufweisen. Bevorzugt sind dies die menschlichen Exons 5-9. Bei Modellen zum Test auf neue Arzneimittel werden bevorzugt diejenigen Genteile eingeschleust, die eine oder mehrere für eine bestimmte Krebserkrankung typische Mutationen aufweisen, um z.B. Onkogenese und Therapiemöglichkeiten der speziellen Tumorerkrankung gezielt untersuchen zu können.
Zusätzliche Gentransfer-Kontrukte zum "Gene Targeting" wurden hergestellt, in welchen z.B. durch homologe Rekombination (z.B. mit den nachfolgend erwähnten Konstrukten 14-1 -3 und 29-38) zusätzliche Maus-p53-Exons durch menschliche p53-Exons (z.B. Exon 4, Exon 10) ersetzt wurden. Schließlich wurden Konstrukte hergestellt, in denen nicht-kodierende Maus-Sequenzen, die die p53- Gentranskription steuern, durch menschliche Kontrollsequenzen ersetzt wurden. Diese Kontrollelemente beinhalten z.B. die 3'-UTR (UTR = Untranslated Region) Sequenzen, die 5'-Promotorsequenzen und Intron 4, welches gewebespezifische Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthält.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung der p53 Human Knock-in Maus (Phuki-Maus) . Diese genetisch veränderte Säugetierart trägt die Exons und Introns des menschlichen p53-Gens als Transgen. Dabei wird der für die Tumorentstehung wichtigste Teil des menschlichen p53-Gens (bevorzugt Wildtyp-p53 oder Teile davon) anstelle der entsprechenden Sequenz des Mausgens durch homologe Rekombination eingebracht. Dabei wurde eine für das humane p53- Gen natürliche Situation geschaffen, die darin liegt, daß das p53-Gen in Form genomischer Sequenzen, d.h. als Intron- und Exon-Sequenzen, nicht aber als cDNA in multiplen Kopien in unbekannten Orten im Genom vorliegt. Ferner liegt das p53-Gen unter der Kontrolle von natürlicherweise in der Maus vorhandenen Regulatorelementen vor. Dadurch werden Kopienzahl, Ort des Gens und sein Kontext nicht verändert, so daß für den Wirtsorganismus die säugerzelltypische Regulation unverändert beibehalten wird. Mit weiteren Plasmiden können Regulationselemente eingeführt werden, die eine für den Menschen typische Genregulation bewirken sollen. Eine solche Situation wurde bisher bei den bekannten transgenen p53-Tieren nicht beschrieben. Dadurch ermöglicht die vorliegende Erfindung, durch Einsatz von kanzerogenen Stoffen, Mutations-Hot-Spots im p53-Gen bzw. p53-Protein zu identifizieren, die auch in der natürlichen Umgebung von humanem p53, d.h. im Menschen, Bedeutung haben. Dadurch lassen sich gezielt Mittel entwickeln, die sich für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen bei mutiertem p53 in Präkanzerosen und verschiedenen Krebserkrankungen eignen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gensubstitutionsvektor bzw. Rekombinationsvektor erzeugt, bei dem das p53-Gen eines Säugers ganz oder in Teilen durch das entsprechende Gegenstück eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist.
Diese Konstruktion wird bevorzugt über den Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R.M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1 997) in embryonale Stammzellen (z.B. Maus 1 29/SV) transfiziert. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwendung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.
Mäuse mit den Phuki-Konstrukten können natürlich mit üblichen Mäusestämmen gekreuzt werden, die für Karzinogenese-Tests verwendet werden und deshalb für die mutagene/karzinogene Aktivität verschiedener Substanzen verantwortlich sind: z.B. SENCAR-Mäuse (insbesondere verwendet für Haut-Tumorgenese- Studien), B6C3F1 (verwendet für verschiedene Krebstests). Andere Mäusestämme, die zur Kreuzung mit der Phuki-Maus interessant sind, sind z.B. Stämme mit genetischen Defekten der DNA-Reparatur (z.B. mit einem Fehlen der Enzymaktivität von O6-Alkylguanintransferase). Diese Mäusestämme sind alle käuflich erhältlich und dem Fachmann hinreichend bekannt.
Ferner lassen sich durch Kreuzung des erfindungsgemäßen transgenen Säugers mit bereits etablierten transgenen Säugern (z.B. Modelle für generelle oder organspezifische Entzündung) doppelt-transgene Säugetiermodelle herstellen, die eine realistischere Nachbildung der menschlichen Karzinogenese als bisher erlauben. Für die Kreuzung können dabei beispielsweise die Hepatitis B-Ober- flächen-Antigen (HBsAg)-transgene Maus; die TGF-beta 1 transgene Maus, welche als Transgen "transforming growth factor" cDNA unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen aus dem Mausalbumingen hat; oder die hu-HLA-B27 (ein menschliches MHC Klasse I Allel assoziiert mit menschlichen Entzündungserkrankungen) transgene Maus, welche spontane Entzündungsreaktionen aufgrund eines geänderten Immunsystems-Repertoire entwickelt, verwendet werden.
Zur Erzeugung einer bevorzugten erfindungsgemäßen Maus werden die ge¬ wünschten Exons, z.B. die Exons 5-9, des endogenen Mausgens p53 durch die entsprechenden Exons des Menschen unter Einschluß der Intron-Sequenzen durch homologe Rekombination ersetzt. Dazu wird ein in geeigneter Weise hergestellter Gensubstitutionsvektor (z.B. das nachstehend beschriebene Plasmid 14-1 -3)~und eine embryonale Stammzellinie (z.B. ES 129/SV) verwendet. Die erhaltenen rekombinanten Klone der embryonalen Stammzellen der Maus werden dabei in geeignet vorbereitete weibliche Tiere zur Erzeugung von Chimären implantiert. "Geeignet vorbereitete weibliche Tiere" heißt dabei, daß die Tiere durch verschiedene Maßnahmen, z.B. durch eine Hormonbehandlung, auf ihre "austragende" Aufgabe vorbereitet worden sind. In diesem Zusammenhang sei auch auf "R.M. Torres, R. Kühn, s.o. " verwiesen. Da es vorteilhaft ist, reinerbige Tiere vorliegen zu haben, können die so erhaltenen heterozygoten Stämme (p53 + phuk7 + ) dann mit einem anderen Tier des gleichen Stamms oder einem anderen (heterozygoten) Mausstamm verpaart werden. Beispielsweise kann dies eine p53-Knock-out-Maus sein (p53 + /-) [Donehower et al., Nature 356, 21 5- 221 , 1 992], bei dem eines der funktioneilen endogenen p53-Allele durch Unterbrechen der codierenden Sequenzen durch eine Fremd-DNA funktionslos gemacht worden war. Die Nachkommen dieser Verpaarung (p53 + phuki/-) beherbergen ein funktionsloses Maus-p53-Allel und ein funktionelles hybrides Maus/- Mensch p53-Allel, das sich von dem normalen funktionellen Mausallel nur bezüglich der DNA-Sequenz in den entsprechenden Exons (5-9) und den Zwischensequenzen unterscheidet. Diese sind mit der Sequenz des normalen menschlichen p53-Gens identisch. So wird das rekombinante Gen immer noch von dem normalen p53-Promotor der Maus kontrolliert. Ebenso sind die Chromatinstruk- tur, die biologischen Parameter und die Genumgebung unverändert.
Die zur Gensubstitution verwendbaren Plasmide 14-1 -3 und 29-38 wurden am 1 6. Dezember 1 997 bei der DSMZ Braunsschweig (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) unter den Hinterlegungsnummern DSM 1 1 904 (14-1 -3) und DSM 1 1 905 (29-38) hinterlegt.
Um verschiedene Krebsrisikofaktoren mittels des erfindungsgemäßen transgenen Säugers auszutesten, wird von in diesem Gebiet bekannten Arbeitsweisen Gebrauch gemacht. Diese sind beispielsweise beschrieben in: Hussain et al., Carcinogenesis 1 8, S. 1 21 -1 25 ( 1 997) Mace et al., Carcinogenesis 1 8, S. 1 291 -1 297 ( 1 997) Dümaz et al., Carcinogenesis 1 8, S. 897-904 (1 997) [Behandlung mit UV-Licht]
Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 90, S. 101 3-101 7 ( 1 993) [Behandlung mit Benzopyrenen)
Seil et al., Cancer Res. 51 , S. 1 278-1 285 ( 1 991 ) [Behandlung mit Aflato- xin B1 ]
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, die zeigen:
Figur 1 Konstruktion eines p53-Maus-Mensch-Hybridgens.
Figur 2 Schritte zur Konstruktion eines Gentransfer-Vektors ("Gene Targeting") einfache Linien: p53-lntron-Sequenzen schwarze Rechtecke: p53-Exon-Sequenzen < < : LoxP-Stellen zur Exzision mittels CRE-Rekombinase
Fragment A: Maus-p53 genomisches DNA-Fragment enthält die Exons 2, 3 und 4 mit den dazwischen liegenden Intronsequenzen kloniert aus dem Maus 1 29/SV-Genom
Fragment B: Arzneimittelresistenz-Selektionskassette enthält die kodierende genetische Information für Neomycin-Resistenz und Gangcylovir-Sensi- tivität. Die Kassette hat ihre eigenen Promotoren.
Fragment C: menschliches p53 genomisches DNA-Fragment enthält die Exons 5, 6, 7, 8, 9 mit den dazwischen liegenden Intronsequenzen
Fragment D: Maus-p53 genomisches Fragment enthält Exon 10 mit flankierenden Intronse- quenzen
Fig. 3 Rekombinationsschema
Das erfindungsgemäße Modell kann zu Mutagenitäts- bzw. Karzinogenitäts- studien verwendet werden, um Chemikalien aller Art auf ihr krebserzeugendes Potential zu testen. Alle Produkte oder deren Metaboliten, die unmittelbar (z.B. durch direkte DNA-Adduktbildung in diesem Gen) oder mittelbar (z.B. durch Begünstigung von endogenen mutagenen Addukten in diesem Gen) zu Mutationen in p53 beitragen, sind als potentiell krebserzeugend für den Menschen einzustufen, besonders wenn sie Mutationen hervorrufen, die bereits in der p53- Datenbank gespeichert sind. Für die Untersuchung von DNA-Mutationsspektren in der neuen PHUKI-Maus stehen bekannte Methoden zur Verfügung, die bereits wenige Mutationen in Tumoren (Lehman et al., Cancer Res. 51 , S. 4090-4096, 1 991 ) oder Addukte bzw. wenige Mutationen in p53-mutierten Zellen von nicht maligen Geweben erkennen können (vgl. Science, 274, S. 430-432, 1 996 und Science 264, S. 1 31 7-1 31 9, 1 994). Das Modell kann auch dazu dienen, Diagno- stika zur Früherkennung von Mutationsmustern beim Menschen zu testen. Mit einem derartigen Modell können sowohl die Kosten als auch der Zeitbedarf für Tierversuche erheblich gesenkt werden, da die Zeit bis zur Erzeugung eines Mutationsspektrums in p53 in nicht-maligen Geweben wesentlich kürzer ist als die zur Erzeugung von Mutationsspektren in Tumoren (mit p53-Mutationen) notwendige Zeitspanne.
Um neue Arzneistoffe auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore zu testen, werden in dem transgenen Tier mit chemischen oder anderen Karzinogenen Tumore mit humantypischen Mutationen im p53-Gen erzeugt. Diese werden dann mit den jeweiligen Testpharmaka behandelt. Ein Wirkstoff, der mutierte, konformationsveränderte p53-Proteine in Tumoren zur Wildtyp-Funktion überführt, macht die Tumorzellen apoptosesensibel und löst damit das Selbstmordprogramm im Tumor aus. Dadurch sollte es zu einer Remission bzw. Regression des Tumors kommen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel 1
Konstruktion eines Rekombinationsvektors
Zur Konstruktion eines Gensubstitutionsvektors wurde eine Genbank aus DNA des Mausstamms 1 29/SV im Lambda Fix Il-Phagen (Fa. Stratagene Inc. La Jolla, CA) mit einer cDNA-Probe gescreent, die dem Maus p53 Gentranskript entspricht. Es wurde ein Phage mit einem 14 kb Insert des funktionellen p53-Gens der Maus isoliert (genannt Strat #1 ). Ein 3,8 kb Kpnl/Xbal-Fragment und ein 2,3 kb BamHI/Xbal-Fragment wurden aus Strat #1 mittels Restriktionsverdau herausgeschnitten und getrennt jeweils in Plasmid pGEM 3Z/A (käuflich erhältlich von Fa. Promega) einkloniert, was die Klone 2QG und 4A ergibt. Aus Klon 2QG wurde ein Kpnl/Xbal-Fragment (Fragment A, s. Figur 2) wieder herausgeschnitten und dann in den pBluescript II KS Vektor (käuflich erhältlich von Fa. Stratagene) kloniert. Die Neomycin-Resistenz/Thymidin-Kinase-Gene, die im Plasmid pHR1 (erhalten von Dr. Kästner, DKFZ Heidelberg) flankiert von loxP-Erken- nungsstellen (für die anschließende cre-Rekombinase-gesteuerte Exzision) enthalten sind, wurden als Xbal/Hindlll-Fragment (Fragment B; s. Fig. 2) an Fragment A im Bluescript II KS-Vektor kloniert. Es wurde Klon 25-34 erhalten. Das menschliche Fragment C (s. Fig. 2) wurde durch PCR-Amplifikation von menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer (MO9: 5'-TGCAG- G TA C C C G G C ATTTT G AG T G TTA G AC- 3 ' u n d M O 5 A : 5 ' - C G AT A C - TAGTGTTTCTTTGCTGCCGTGTTC-3') erhalten. Fragment C enthält das menschliche p53-Gen von Exon 5 bis 9 (und dazwischenliegende Introns) . Fragment C sowie ein Kpn/Notl-Fragment (Fragment D, s. Fig. 2) aus Klon 4A wurden in pBluescript KS II einkloniert, was Klon 21 -6 ergibt. Die erhaltenen Klone wurden unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Didesoxynukleotide mit einem ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) zur Überprüfung sequenziert. Eine Spel/Notl-Fragment aus Klon 21 -6 (enthält die Fragmente C + D) wurde nun in Plasmid 25-35 kloniert. Das fertige Konstrukt trägt nun A + B + C + D. Dieses Konstrukt entspricht dem oben erwähnten hinterlegten Plasmid 29-3B (Phuki-Test-Konstrukt). Der weitere hinterlegte Klon 14-1 -3 ist mit 29-38 identisch, außer daß Klon 29-38 in Fragment C eine Missense-Mutation enthält, die an Codon 1 92 in Exon 6 eine Aminosäurensubstitution auslöst, während Fragment C in 14-1 -3 dem Wildtyp entspricht und somit den "Prototyp" darstellt. Konstrukt 29-38 kann dagegen als Test-Mutante in den Experimenten dienen, was besonders interessant ist, da 4% der Punktmutationen in menschlichen Tumoren in dem veränderten Codon stattfinden.
Beispiel 2
Erzeugung der PHUKI-Maus
Die in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide 14-1 -3 und 29-38 wurden nach Linearisierung durch Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym "Notl" jeweils mittels Elektroporation mit einem einzigen Puls von 260 V/500 μF in pluripotente embryonale Stammzellinien der Maus 1 29/Sv ( 20 μg/107 Zellen; E14.1 bzw. MB-1 erhalten von Dr. Wang, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, Frankreich) insertiert. Geeignete neomycinresistente, das homologe Rekombinationsereignis tragende Klone wurden selektioniert. Die genomische DNA aus diesen Klonen wurde mittels Southern-Blot getestet, um die Integration des Plasmids durch homologe Rekombination zu bestätigen. Das Rekombinationsschema ist in Fig. 3 gezeigt.
Zellklone, die nach PCR-Analyse die korrekt einrekombinierte Sequenz enthielten, wurden isoliert und durch Southern-Analyse weiter analysiert.
Stabil transfizierte Zellklone wurden isoliert und die Selektionskassette (Fragment B) mit CRE-Rekombinase herausgeschnitten. Dies hat den Vorteil, daß die Maus p53 Intron 4-Sequenzen nicht länger von den 3 Kb des eingefügten Arzneimittelresistenz-Gens unterbrochen werden, was die korrekte p53-Gen- transkription oder mRNA-Reifung stören könnte, falls man Fragment B nicht entfernen würde. Die nun erhaltenen Klone werden dann in Blastocyten injektiert und in geeignet vorbereitete weibliche Mäuse (pseudo-schwanger) implantiert. Die Nachkommen dieser Maus enthalten dann das ausgetauschte Genteil. Sie werden nach Rückkreuzungsverpaarung als PHUKI-Mäuse (p53 Human Knock-in Maus) bezeichnet und können für die gewünschten Experimente eingesetzt werden oder event. nochmals mit anderen Mäusestämmen verpaart werden.

Claims

Patentansprüche
1 ) Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, wobei eine embryonale Stammzellinie eines nicht-menschlichen Säugers mit einem geeigneten Rekombinationsvektor transfiziert wird, stabil transfizierte Zellclone isoliert werden, in geeignet vorbereitete weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugers implantiert werden und die erhaltenen Nachkommen auf das Vorhandensein des Genaustausches selektioniert werden, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Rekombinationsereignis die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt wird, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.
2) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die p53-Wildtyp-Sequenz eines anderen Säugers ist.
3) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz eine oder mehrere für eine Krebsart, ausgewählt aus Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymp¬ homen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typische Mutation(en) in p53 enthält.
4) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die Exons 5 bis 9 des p53-Gens eines anderen Säugers in unveränderter oder mutierter Form umfaßt.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz aus dem menschlichen p53-Gen stammt. 6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.
7) Transgener nicht-menschlicher Säuger, bei dem die Gesamtheit oder einen Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.
8) Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die p53-Wildtyp-Sequenz eines anderen Säugers ist.
9) Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz eine oder mehrere für eine Krebsart, ausgewählt aus Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymphomen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typische Mutation(en) in p53 enthält.
10) Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die Exons 5 bis 9 des p53-Gens eines anderen Säugers umfaßt.
1 1 ) Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz vom menschlichen p53-Gen stammt.
1 2) Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nager, insbesondere eine Maus, ist.
1 3) Selektierbar markierter Rekombinationsvektor zur homologen Rekom¬ bination in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
14) Rekombinationsvektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er das Plasmid 14-1 -3 bzw. 29-38, hinterlegt am 1 6. Dezember 1 997 bei der DSMZ Braunschweig (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) unter den Hinterlegungsnummern DSM 1 1 904 bzw. DSM 1 1 905 ist.
1 5) Stabil transfizierter Zellclon, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens eines nicht-menschlichen Säugers durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.
1 6) Verfahren zum Test von neuen Arzneistoffen auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore, dadurch gekennzeichnet, daß man einen transgenen nicht-menschlichen Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 1 2 mit dem neuen Arzneistoff behandelt und die Tumorregression bzw. - remission nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.
17) Verfahren zum Test von Chemikalien auf ihr p53-mutagenes bzw. krebsin¬ duzierendes Potential, dadurch gekennzeichnet, daß man einen trans¬ genen nicht-menschlichen Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 1 2 mit der Chemikalie behandelt und die Mutationsspektren bzw. die Tumorin¬ duktion nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.
18) Verwendung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugers nach einem der Ansprüche 7 bis 1 2 zum Austesten von Medikamenten, Chemikalien und Therapieansätzen.
PCT/DE1999/000116 1998-01-19 1999-01-19 Transgener nicht-menschlicher säuger sowie verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung Ceased WO1999036528A2 (de)

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