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WO1999033952A1 - Nouvelle souche de champignon coriolus versicolor utile pour le traitement des materiels pollues - Google Patents

Nouvelle souche de champignon coriolus versicolor utile pour le traitement des materiels pollues Download PDF

Info

Publication number
WO1999033952A1
WO1999033952A1 PCT/FR1998/002880 FR9802880W WO9933952A1 WO 1999033952 A1 WO1999033952 A1 WO 1999033952A1 FR 9802880 W FR9802880 W FR 9802880W WO 9933952 A1 WO9933952 A1 WO 9933952A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pahs
strain
cycles
recalcitrant
coriolus versicolor
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/002880
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric BAUD-GRASSET
Timothy Vogel
Original Assignee
Rhodia Chimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhodia Chimie filed Critical Rhodia Chimie
Priority to AU18838/99A priority Critical patent/AU1883899A/en
Publication of WO1999033952A1 publication Critical patent/WO1999033952A1/fr

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H15/00—Fungi; Lichens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/20—Organic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
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    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/20—Organic substances
    • A62D2101/22—Organic substances containing halogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
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    • A62D2101/26—Organic substances containing nitrogen or phosphorus
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    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/20—Organic substances
    • A62D2101/28—Organic substances containing oxygen, sulfur, selenium or tellurium, i.e. chalcogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a new strain of fungus Coriolus versicolor as well as its use for the treatment of materials contaminated with recalcitrant polluting compounds.
  • Pollution control can be done mechanically, by burning the land, chemically or biologically.
  • Bioremediation or bioremediation can be more particularly used.
  • This technique uses microorganisms, such as bacteria or fungi, to degrade recalcitrant polluting compounds, that is to say compounds which resist degradation in the environment.
  • microorganisms such as bacteria or fungi
  • halobenzoates such as chlorobenzoate and bromobenzoate
  • nitro compounds such as 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)
  • other explosives such as PETN (penta-erythritol tetranitrate) and EGDN (ethylene glycol dinitrate).
  • PAH mutagenic and carcinogenic compounds
  • PAHs Polycyclic aromatic hydrocarbons
  • They are the systematic pollutants of the soil of old gas factories and coke ovens (steel, carbochemistry). They are also found scattered in other places in relation to the use that has been made of these tars: agglomeration of coal dust into balls, manufacture of wood treatment products called creosotes and wood treatment plants using these products . They have even been used in some cases to manufacture road surfaces, or as sealants (coatings, plugging breaches, building dams).
  • PAHs are hydrophobic products that strongly adhere to solids. They all have very low solubility, but this solubility is sufficient to displace them and dilute them notably in the soil over time. These are very low volatile products, with the exception of naphthalene, but they nevertheless emit a strong, unpleasant characteristic odor.
  • rot fungi when grown under nutrient-limiting conditions (nitrogen deficiency for example) are capable of degrading lignin as well as many other organic compounds, including in particular PAHs, thanks to a non-enzymatic system specific with strong oxidizing power (ligninases). Certain rot fungi are also capable, when grown under non-limiting conditions, of transforming certain PAHs, such as phenanthrene, into trans-dihydrodiols using monooxygenases according to a mechanism close to that existing in other families. mushrooms.
  • Some fungi are also capable of degrading PAHs into trans-dihydrodiols or phenols.
  • the strain Phanerochaete chrysosporium is useful for degrading in particular TNT (WO 94/21394) and PAHs of 2 to 5 cycles such as anthracene, pyrene, benzo (a) pyrene (Hammel et al. ,
  • the present invention therefore relates to a strain of fungus Coriolus versicolor, characterized in that it is the strain deposited on January 19, 1996 at the CNCM (National Collection of Cultures of
  • Microorganisms at the Institut Pasteur under the reference 1-1657, or one of its derivatives, capable of degrading not only polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) comprising from two to four cycles but also polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) comprising at least five cycles, including all PAHs comprising five or six cycles, in particular all PAHs five or six cycles from Table 1.
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • “derivative” is meant a strain derived from Coriolus versicolor 1-1657 by mutation, spontaneous or induced, and capable of degrading not only polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) comprising two to four cycles, but also polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH ) comprising at least five cycles, including all the PAHs comprising five or six cycles, in particular all the PAHs with five or six cycles in Table 1, as well as, in general, the PAHs comprising more than six cycles.
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbons
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbons
  • the Coriolus versicolor 1-1657 strain will be designated as well as its derivatives as defined above by the expression “Coriolus versicolor strain according to the invention” or “strain according to the invention”.
  • the present invention also relates to the use of said strain Coriolus versicolor according to the invention for degrading recalcitrant polluting compounds contained in contaminated materials.
  • the subject of the present invention is the use of the strain Coriolus versicolor according to the invention for degrading polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) which can be chosen in particular from the 16 PAHs from the list of EPA cited above (Table 1 ).
  • the Coriolus versicolor strain according to the invention has proved to be particularly useful for degrading PAHs with at least 6 aromatic cycles such as in particular benzo (g, h, i) perylene and indenol (1, 2,3-cd) pyrene.
  • the present invention also relates to a method of treating material contaminated with recalcitrant pollutants, in which the fungus of strain Coriolus versicolor according to the invention is brought into contact with the contaminated material under conditions suitable for stimulate the growth of said fungus in the material and guarantee the degrading activity of recalcitrant pollutants.
  • Said contaminated material can be soil, aquatic sediments, gravel, and other solid materials, as well as water.
  • said contaminated material is soil.
  • - on-site treatment the soil is excavated and treated on site
  • - ex situ treatment the soil is excavated and treated off site.
  • condition suitable for stimulating the growth of said fungus in the material and guaranteeing the degrading activity of recalcitrant pollutants we mean conditions of aeration, temperature and humidity, of the contaminated material, known to those skilled in the art .
  • the contaminated material is a soil
  • its humidity can be, preferably, between 50 and 80% of the useful water content depending on the type of soil.
  • the temperature can be between 10 and 40 ° C, a growth of the fungus being however always possible even at a lower temperature.
  • the nitrogen content in the soil can be such that the carbon / nitrogen / phosphorus ratio is equal to about 100/10/1.
  • Contaminated material may also advantageously contain nutrients and trace elements.
  • Aeration can be ensured by forced air circulation, by natural diffusion of air, or by mechanical mixing of the soil.
  • the contaminated material is soil
  • an air flow of about 0.1 to 5 m 3 / h / tonne of soil is advantageous for example.
  • the aeration can be made more homogeneous in the soil by ensuring a stripping or a preliminary screening of the soil.
  • the addition of an organic support with an inoculum also improves the structure of the soil, and therefore its aeration. More generally, the homogenization of the soil by stripping / screening / mixing and mixing with the organic support of the inoculum makes it possible to improve the transfers of mass (water, temperature, nutrients, air, enzymes) and therefore the biochemical activity responsible for the degradation of the polluting components.
  • the strain according to the invention can be brought into contact with the contaminated material either alone or in the presence of an organic support.
  • the strain according to the invention can be brought into contact with such an organic support either at the time of inoculation in the contaminated material, or prior to this inoculation. The latter case is preferred and allows the pre-development of the strain on the organic support before contacting the contaminated material.
  • the inoculum can then be introduced into the contaminated material at a rate of between 1 and 50% by weight, preferably between 5 and 20% by weight relative to the weight of contaminated material.
  • the contacting can be carried out in particular on excavated soil or on unstructured soil.
  • the material contaminated with recalcitrant pollutants is treated with an inoculum of fungi of the Coriolus versicolor strain according to the invention, said inoculum being prepared by: - treatment of a lignified organic support which can be chosen from wood chips, tree bark, or corn cobs, so as to eliminate microbiological contaminants;
  • said strain of fungus possibly being in particular in the form of a) a solution of spores and / or fragments of mycelium suspended in a liquid medium, b) of predeveloped mycelium in a liquid medium, or c) of mycelium pre-developed on a solid support, in particular (i) on a solid gelled medium such as for example agar, or (ii) on cereal grains (preculture on cereal grains);
  • condition suitable for the growth of fungi on said lignified organic support is meant humidity, temperature and aeration conditions known to those skilled in the art.
  • the lignified organic support inoculated with the fungus strain can be advantageously placed in a culture chamber saturated with humidity, at a temperature between 15 and 35 ° C, more particularly between 20 and 30 ° C.
  • corn lump or wood chips are chosen as the lignified organic support.
  • the wood chips can be calibrated or of the "general purpose" type, that is to say uncalibrated.
  • Wood shavings with a particle size greater than 4.5 mm are preferred, chips with a smaller particle size generally hamper the growth of the fungus due to poor ventilation due to compaction of the chips.
  • the lignified organic support is treated before inoculation with the fungus strain so as to eliminate microbiological contaminants.
  • This treatment can be carried out by drying between 450 and
  • 550 ° C for example at 500 ° C for a few seconds or by pasteurization for 1 or 2 cycles each of 8 to 30 hours, preferably
  • the lignified organic support can be moistened preferably to saturation, before the treatment intended to remove microbiological contaminants.
  • said treatment is carried out by pasteurization.
  • the lignified organic support can then be inoculated with the Coriolus versicolor strain according to the invention, which can be: a) in the form of a solution of spores, fragments of mycelium or a mixture of spores and fragments of mycelium, suspended in a liquid medium, which can be prepared, for example, from cultures of fungi on a support solid, in particular on solid gelled medium (in particular agar) in a tube, or on cereal grains; the suspension can thus be obtained in particular by introducing a determined volume of CH culture medium as described in Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol.
  • the pre-developed mycelium can be obtained by culturing in CH medium (Kirk et al., 1978) a solution of spores in suspension; in this case, the culture is generally stirred for about a week at 30 ° C; at the end of incubation, the balls of mycelium formed are recovered and then used as an inoculum; c) or in the form of mycelium predeveloped on a solid support (mycelium covering fragments of solid support), in particular (i) on a solid gelled medium, such as for example agar, which can be contained in a petri dish , or (ii) on cereal grains (preculture on cereal grains).
  • a solid support mycelium covering fragments of solid support
  • the lignified organic support is inoculated with fungi of the Coriolus versicolor strain according to the invention precultured on cereal grains, such as grains of wheat, rye or millet in particular.
  • Said lignified organic support can be inoculated with cereal grains colonized by the fungus, preferably at a rate of about 1% to about 20%, more preferably from 2 to 10% (grain weight / weight of lignified organic support ).
  • the cereal grains used are then preferably untreated grains which are sterilized according to the following protocol: soaking in water then cooking at around 100 ° C. for 30 to 60 minutes, preferably 45 minutes and finally autoclaving from 1 10 to 130 ° C, preferably at about 120 ° C for 20 to 240 minutes, preferably 100 to 200 minutes.
  • An abrasive agent facilitating the separation of the grains from one another as well as a source of nutrient can be advantageously added.
  • plaster, calcium carbonate, chalk or talc can act as both a nutrient (source of calcium) and an abrasive agent. Plaster can thus be added to the cereal grains immediately before autoclaving at a concentration of, for example, between approximately 0.5 and approximately 10% (mass / mass).
  • the grains are then inoculated, for example using a) a solution of spores and / or fragments of mycelium suspended in a liquid medium, b) mycelium pre-developed in liquid medium, or c) mycelium pre-developed on a solid support, in particular (i) on a solid gelled medium such as, for example agar, which can be contained in a petri dish or (ii) on cereal grains, then generally placed in sterile jars or in bags sterile with microporous membranes.
  • a solution of spores and / or fragments of mycelium suspended in a liquid medium b) mycelium pre-developed in liquid medium, or c) mycelium pre-developed on a solid support, in particular (i) on a solid gelled medium such as, for example agar, which can be contained in a petri dish or (ii) on cereal grains, then generally placed in sterile jars or in bags sterile with microporous membranes.
  • the inoculated supports can then be placed in culture bags allowing gas exchange.
  • High capacity solid phase fermenters can also be used in place of bags.
  • organic support corn cobs or wood shavings are chosen, which prior to bagging are intimately mixed with the cereal grains colonized by the fungus at a rate of approximately 1 % to 20%, preferably 2 to 10% (weight of grains / weight of chips or stalks).
  • the mixture is then incubated at an optimum temperature for the growth of the fungus strain used (generally 25-30 ° C). This technique makes it possible to obtain a homogeneous and very well developed culture.
  • Successive generations of inoculum can be produced by rediluting either the inoculated grains in a volume of sterile grains, or the mature inoculum in a volume of sterile lignified supports.
  • shavings can be moistened with a mineral solution (including nutritive supplements for the fungus) comprising for one liter of solution:
  • FIG. 1 represents a comparative test of the capacity of four different strains of Coriolus versicolor to degrade four PAHs: BAN (benzo (a) anthracene), BPY (benzo (a) pyrene), BKF
  • FIG. 2 represents the percentages of biodegradation into total PAHs and as a function of the number of cycles after four weeks.
  • the pilot with Coriolus versicolor 1-1657, 20% is compared to the native microflora control.
  • FIG. 3 represents the percentages of biodegradation into total PAHs and as a function of the number of cycles.
  • the pilot with Coriolus versicolus 1-1657, 10% (after 5 weeks) is compared with the control (native microflora, 8 weeks).
  • FIG. 4 represents the percentages of biodegradation into total PAHs and as a function of the number of cycles after eight weeks.
  • the pilot with Coriolus versicolor 1-1657, 10% is compared to the native microflora control.
  • FIG. 5 represents the percentages of biodegradation of some PAHs at five and six cycles in a soil initially containing 7602 mg PAH / kg of soil and after eight weeks of incubation.
  • naphthalene NA
  • acenaphthylene AY
  • acenaphthene ACE
  • fluorene FL
  • phenanthrene PH
  • anthracene AN
  • fluoranthene FLH
  • pyrene PY
  • benzo a) anthracene (BAN), chrysene (CH), benzo (b) fluoranthene (BBF), benzo (k) fluoranthene (BKF), benzo (a) pyrene (BAP), dibenzo (a, h) anthracene (DBA) ), benzo (g, h, i) perylene (BPE) and indenol (1,2,3, cd) ⁇ yrene (INP).
  • NA naphthalene
  • ACY acenaphthylene
  • ACE acenaphthene
  • fluorene FL
  • PH phenanthrene
  • the extraction is carried out on the entire test volume.
  • An organic solvent is added to each bottle at the rate of 40 ml of acetonitrile. Then the bottles are shaken for one hour at 200 rpm before passing through an ultrasonic tank for 5 minutes.
  • the extraction yields have been measured beforehand and are greater than 95%.
  • the PAHs are determined by GILSON high pressure liquid chromatography / JASCO UV detection, equipped with a Lichrospher 100 C18 column 250 mm long and 4 mm in diameter.
  • the eluent used is isocratic (800 ml acetonitrile + 200 ml water).
  • the wavelength of the detector is 254 nm. This assay method allows the separation and quantification of the peaks corresponding to the 16 PAHs studied.
  • Each test bottle contains 20 ml of culture medium allowing the proper development of the fungus.
  • the culture medium used is a medium enriched in nitrogen or nitrogen deficiency and causing stimulation of its extracellular enzymatic activity (secretion of ligninases) depending on the case.
  • Its composition (described by Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol. 1 17, 277-285) is as follows:
  • Basal medium III (sterilized by filtration), 100 ml
  • the fungi were brought into the test medium as a suspension spore solution, prepared from sloping culture tubes.
  • the tested substances were provided in the form solubilized in an organic solvent at a final concentration of PAHs in the test bottles between 6 and 50 mg / l.
  • the concentration tested was generally 6 mg / l in order to limit the toxicity of the substance and the quantities of solvent supplied.
  • the total amounts of solvent supplied to the test medium never exceeded 1% and the bottles were, if necessary, left open for the time necessary for the evaporation of the solvent.
  • Oxygen was introduced at the start of the test into the bottles, then, if necessary, regularly over time. The initial amount of pure oxygen added was 50 ml.
  • test was carried out in static phase and the flasks were incubated for one month in the dark and at 30 ° C. At the end of the test, an extraction with acetonitrile was carried out on the entire volume of test medium after 30 days of incubation. Specific assays were then carried out by HPLC.
  • the parameter measured was the disappearance of the " substance studied.
  • the Coriolus versicolor 1-1657 strain is capable of degrading all 16 PAHs.
  • the comparison of the Coriolus versicolor I-1657 strain and three other strains of Coriolus versicolor highlighted the significant advantage of the Coriolus versicolor 1-1657 strain according to the invention. compared to the other three Coriolus versicolor (see Figure 1) to degrade heavy PAHs.
  • EXAMPLE 2
  • the effectiveness of the Coriolus versicolor strain according to the invention was verified during pilot tests carried out on soils historically polluted by PAHs. Their inoculation in the soil made it possible to significantly improve the biodegradation of compounds known to be recalcitrant.
  • the mushrooms are introduced into the soil on their organic support (wood chips) at a rate of 20% (example 2a) and 10% (examples 2b and 2c).
  • the organic support was inoculated with pre-developed mycelium on cereal grains (the inoculation of the grains having been carried out initially by solid agar covered with fungi (mycelium pre-developed on solid agar)).
  • the mushrooms were inoculated at a rate of 20% and the environmental parameters (humidity, temperature and, optionally, supply of nutrients) were optimized in order to accelerate the growth of the fungi and their enzymatic activity.
  • Biodegradation percentages of 73% for three-cycle PAHs, 47% for four-cycle PAHs, 15% for five-cycle PAHs and 25% for six-cycle PAHs were obtained after only one month of pilot incubation in the presence of Coriolus versicolor 1-1657 (see Figure 2).
  • Biodegradation of total PAHs was approximately 50% after one month of treatment.
  • the native microflora is stimulated had only very slightly degraded the PAHs, the final concentration reached not being significantly different from the initial concentration in total PAHs. In this case, only the three- and four-cycle PAHs were degraded, but their percentages of disappearance were only 19 and 16% respectively.
  • Tests were carried out in 50 kg pilots on soils historically contaminated with PAHs from former gas factory sites. The effectiveness of fungal strains was evaluated and compared to the activity of the native soil microflora in the case of soil contaminated with PAHs at a concentration of 1092 mg / kg distributed as follows: 122 mg / kg for three-cycle PAHs, 652 mg / kg for four-cycle PAHs, 318 mg / kg for five and six-cycle PAHs. The fungus strain Coriolus versicolor 1-1657 was brought at a rate of 10% (w / w). The environmental parameters have been optimized in order to accelerate the growth of fungi and their enzymatic activity.
  • Biodegradation percentages equal to 75% for the three cycles, 50% for the four cycles, 38% for the five and six cycles including 46% for benzo (a) pyrene, were obtained after only five weeks of incubation in pilot in the presence of the Coriolus versicolor 1-1657 strain (see FIG. 3). Biodegradation in total PAHs reached 49% after only five weeks of incubation. At the same time, the native biostimulated microflora degraded PAHs only very slightly, the percentage of biodegradation reached at the end of the test being barely greater than 10%.
  • the analytical methods used for these tests were validated beforehand and consisted, for this example, of a solvent extraction under pressure using a DIONEX ASE 200 apparatus followed by an analysis by gas chromatography / mass spectrometry or liquid chromatography high pressure / UV detection.
  • the effectiveness of the fungus compared to native microorganisms is most marked for heavy PAHs with five and six cycles which are the most difficult to biodegrade.
  • the native biostimulated microflora only very slightly degraded the PAH, the percentage of biodegradation reached at the end of the test being equivalent to 25, 9, 0 and 16% for the two and three cycles, the four cycles, the five and six cycles and the total PAHs respectively (see Figure 4).

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Abstract

Cette invention concerne une souche de champignon Coriolus versicolor déposée à la CNCM sous la référence I-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, ainsi que son utilisation pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.

Description

Nouvelle souche de champignon Coriolus versicolor utile pour le traitement des matériels pollués
La présente invention concerne une nouvelle souche de champignon Coriolus versicolor ainsi que son utilisation pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.
La dépollution des sites pollués, c'est-à-dire des sites sur lesquels une pollution d'origine industrielle du sol ou du sous-sol est susceptible de générer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l'environnement, est un enjeu économique et scientifique actuel majeur.
La dépollution peut se faire par voie mécanique, par brûlage des terres, par voie chimique ou par voie biologique. La biorestauration ou bioréhabilitation peut être plus particulièrement utilisée. Cette technique met en œuvre des microorganismes, tels que des bactéries ou des champignons, pour dégrader les composés polluants récalcitrants, c'est-à-dire des composés qui résistent à la dégradation dans l'environnement. Parmi ces composés polluants récalcitrants, on peut citer notamment les halobenzoates tels que le chlorobenzoate et le bromobenzoate, et les composés nitrés tels que le 2,4,6-trinitrotoluène (TNT) et autres explosifs tels que le PETN (penta-érythritol tétranitrate) et l'EGDN (éthylèneglycol dinitrate). On peut citer également les halogénures organiques tels que notamment le DDT[1 ,1 -bis(4-chlorophényl)-2,2,2-trichloroéthane], la 2,3,7,8- tétrachlorodibenzo-p-dioxine, le lindane (1 ,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane), les composés biphényles polyhalogénés tels que notamment le 3,4,3', 4'- tétrachlorobiphényle et le 2,4,5,2',4',5'-hexachlorobiphényle. On peut enfin citer les hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAP) dont certains sont des composés mutagènes et cancérigènes.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) constituent une part importante des goudrons résultant de la distillation de la houille. On en trouve aussi dans les goudrons de distillation du pétrole. Les HAP sont les polluants systématiques du sol des anciennes usines à gaz et des cokeries (sidérurgie, carbochimie). On les trouve aussi dispersés dans d'autres lieux en relation avec l'usage qui a été fait de ces goudrons : agglomération des poussières de charbon en boulets, fabrication des produits de traitement du bois appelés créosotes et usines de traitement du bois utilisant ces produits. Ils ont même pu être utilisés dans certains cas pour fabriquer des revêtements de route, ou comme produits d'étanchéité (enduits, bouchage de brèches, constitution de barrages).
Les HAP sont des produits hydrophobes qui adhèrent fortement aux solides. Ils présentent tous une très faible solubilité, mais cette solubilité est suffisante pour les déplacer et les diluer notablement dans le sol au fil du temps. Ce sont des produits très peu volatiles, à l'exception du naphtalène, mais ils émettent cependant une forte odeur désagréable caractéristique.
Le nombre de HAP que l'on peut trouver sur un site gazier est considérable. L'agence américaine pour la protection de l'environnement (EPA pour environmental protection agency) a édité une liste de 16 HAP contaminant les sols, cette liste faisant référence dans de nombreux pays. Ces
16 HAP sont considérés comme prioritaires et doivent être surveillés.
Le tableau 1 suivant présente la formule de ces 16 HAP.
Tableau 1 : Formule des 16 HAP
Figure imgf000005_0001
Plusieurs champignons formant la pourriture blanche sur le bois sont connus pour leur action dégradatrice envers certains composés polluants récalcitrants.
Ces champignons de la pourriture, lorsqu'ils sont cultivés en conditions limitantes en nutriments (carence en azote par exemple) sont capables de dégrader la lignine ainsi que de nombreux autres composés organiques, y compris en particulier des HAP, grâce à un système enzymatique non spécifique à fort pouvoir oxydant (ligninases). Certains champignons de la pourriture sont également capables, lorsqu'ils sont cultivés en conditions non limitantes, de transformer certains HAP, tels que le phénanthrène, en trans-dihydrodiols à l'aide de monooxygénases selon un mécanisme proche de celui existant dans les autres familles de champignons.
Quelques champignons sont également capables de dégrader des HAP en trans-dihydrodiols ou en phénols. Ainsi, par exemple, la souche Phanerochaete chrysosporium est utile pour dégrader notamment le TNT (WO 94/21394) et des HAP de 2 à 5 cycles tels que l'anthracène, le pyrène, le benzo(a)pyrène (Hammel et al.,
1987, Les colloques de l'INRA n° 40, INRA Ed., pp 45-49).
Cependant, aucune donnée de l'état de la technique ne met en évidence la biodégradation de tous les HAP à cinq et six cycles ni la biodégradation des HAP à plus de six cycles.
Le besoin existait donc de trouver une souche de microorganisme capable de dégrader un large spectre de composés polluants récalcitrants, en particulier les HAP de haut poids moléculaire (à 5 cycles aromatiques ou plus).
Le Demandeur a à présent découvert une nouvelle souche de champignon qui répond à ce besoin.
La présente invention a donc pour objet une souche de champignon Coriolus versicolor , caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes à l'Institut Pasteur) sous la référence 1-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant de deux à quatre cycles mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1.
Par "dérivé", on entend une souche dérivée de Coriolus versicolor 1-1657 par mutation, spontanée ou induite, et capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant deux à quatre cycles, mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1 , ainsi que, en général, les HAP comprenant plus de six cycles. Ci-après, on désignera la souche Coriolus versicolor 1-1657 ainsi que ses dérivés tels que définis ci-dessus par l'expression "souche Coriolus versicolor selon l'invention" ou "souche selon l'invention".
La présente invention a également pour objet l'utilisation de ladite souche Coriolus versicolor selon l'invention pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans des matériels contaminés.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation de la souche Coriolus versicolor selon l'invention pour dégrader des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) pouvant être notamment choisis parmi les 16 HAP de la liste de l'EPA citée précédemment (tableau 1 ). La souche Coriolus versicolor selon l'invention s'est avérée particulièrement utile pour dégrader les HAP à au moins 6 cycles aromatiques tels que notamment le benzo(g,h,i)perylène et l'indénol(1 ,2,3-cd)pyrène.
La présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants, dans lequel le champignon de souche Coriolus versicolor selon l'invention est mis en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.
Ledit matériel contaminé peut être les sols, les sédiments aquatiques, les graviers, et autres matériels solides, ainsi que l'eau. De manière préférentielle, ledit matériel contaminé est un sol.
Les principales mises en œuvre de techniques de biorestauration d'un sol sont :
- le traitement in situ : le sol est traité sans être excavé ;
- le traitement sur site : le sol est excavé et traité sur place ; - le traitement ex situ : le sol est excavé et traité hors site.
Par "conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants", on entend des conditions d'aération, de température et d'humidité, du matériel contaminé, connues de l'homme du métier.
Lorsque le matériel contaminé est un sol, l'humidité de celui-ci peut être, de manière préférentielle, comprise entre 50 et 80 % de la teneur en eau utile suivant le type de sol. La température peut être comprise entre 10 et 40°C, une croissance du champignon étant cependant toujours possible même à une température plus basse. La teneur en azote dans le sol peut être telle que le rapport carbone/azote/phosphore soit égal à environ 100/10/1.
Le matériel contaminé peut également contenir de manière avantageuse des nutriments et des oligo-éléments.
L'aération peut être assurée par une circulation d'air forcée, par une diffusion naturelle d'air, ou par brassage mécanique du sol. Lorsque le matériel contaminé est un sol, un débit d'air d'environ 0,1 à 5 m3/h/tonne de sol est avantageux par exemple. L'aération peut être rendue plus homogène dans le sol en assurant un démottage ou un criblage préliminaire du sol. L'apport d'un support organique avec un inoculum permet également d'améliorer la structure du sol, et par conséquent son aération. Plus généralement, l'homogénéisation du sol par démottage/criblage/brassage et le mélange avec le support organique de l'inoculum permettent d'améliorer les transferts de masse (eau, température, nutriments, air, enzymes) et par conséquent l'activité biochimique responsable de la dégradation des composants polluants.
La souche selon l'invention peut être mise en contact avec le matériel contaminé soit seule, soit en présence d'un support organique. La souche selon l'invention peut être mise en contact avec un tel support organique soit au moment de l'inoculation dans le matériel contaminé, soit préalablement à cette inoculation. Ce dernier cas est préféré et permet le prédéveloppement de la souche sur le support organique avant mise en contact avec le matériel contaminé. L'inoculum peut alors être introduit dans le matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 % en poids, de préférence entre 5 et 20 % en poids par rapport au poids de matériel contaminé. La mise en contact peut être réalisée notamment sur sol excavé ou sur sol déstructuré.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel contaminé par des polluants récalcitrants est traité avec un inoculum de champignons de la souche Coriolus versicolor selon l'invention, ledit inoculum étant préparé par : - traitement d'un support organique lignifié pouvant être choisi parmi des copeaux de bois, des écorces d'arbres, ou des rafles de maïs, de manière à éliminer les contaminants microbiologiques ;
- inoculation dudit support organique lignifié ainsi traité, avec ladite souche de champignon, ladite souche pouvant être notamment sous la forme a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que par exemple de la gélose, ou (ii) sur des grains de céréales (préculture sur grains de céréales) ;
- puis incubation dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support organique lignifié. Par "conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support organique lignifié", on entend des conditions d'humidité, de température et d'aération connues de l'homme du métier.
Le support organique lignifié inoculé avec la souche de champignons peut être placé de manière avantageuse dans une chambre de culture saturée en humidité, à une température comprise entre 15 et 35°C, plus particulièrement entre 20 et 30°C.
De manière préférentielle, on choisit comme support organique lignifié des rafles de maïs ou des copeaux de bois.
Les copeaux de bois peuvent être calibrés ou du type "tout- venant", c'est-à-dire non calibrés.
Des copeaux de bois d'une granulométrie supérieure à 4,5 mm sont préférés, les copeaux de plus faible granulométrie freinant généralement la croissance du champignon du fait d'une mauvaise aération due au tassement des copeaux.
Les champignons étant sensibles aux contaminations microbiologiques, il est important de minimiser les risques de contamination.
A cet effet, le support organique lignifié est traité avant inoculation par la souche de champignon de façon à éliminer les contaminants microbiologiques. Ce traitement peut s'effectuer par séchage entre 450 et
550°C, par exemple à 500°C pendant quelques secondes ou par pasteurisation pendant 1 ou 2 cycles chacun de 8 à 30 heures, de préférence
16 heures, chacun à une température comprise entre 50 et 100°C, de préférence entre environ 65 et environ 85°C, ou par stérilisation (autoclavage) entre 110 et 130°C, de préférence à environ 120°C, pendant 20 à 240 minutes, de préférence pendant 20 à 60 minutes. Le support organique lignifié peut être humidifié de préférence à saturation, avant le traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques. De manière préférentielle, ledit traitement est réalisé par pasteurisation.
Le support organique lignifié peut être ensuite inoculé avec la souche Coriolus versicolor selon l'invention, qui peut se présenter : a) sous la forme d'une solution de spores, de fragments de mycélium ou d'un mélange de spores et de fragments de mycélium, en suspension dans un milieu liquide, pouvant être préparée par exemple à partir de cultures de champignons sur un support solide, en particulier sur milieu gélifié solide, (notamment gélose) en tube, ou sur grains de céréales ; la suspension peut ainsi être obtenue notamment en introduisant un volume déterminé de milieu de culture CH tel que décrit dans Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol. 117, 277-285, puis en agitant vigoureusement le tube de façon à libérer les spores ; b) sous la forme de mycélium prédéveloppé en milieu liquide : le mycélium prédéveloppé peut être obtenu en mettant en culture dans du milieu CH (Kirk et al., 1978) une solution de spores en suspension ; dans ce cas, la culture est placée sous agitation en général pendant environ une semaine à 30°C ; en fin d'incubation, les pelotes de mycélium formées sont récupérées puis utilisées comme inoculum ; c) ou sous la forme de mycélium prédéveloppé sur un support solide (mycélium recouvrant des fragments de support solide), notamment (i) sur un milieu gélifié solide, tel que par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri, ou (ii) sur des grains de céréales (préculture sur grains de céréales).
De manière préférentielle, le support organique lignifié est inoculé avec des champignons de la souche Coriolus versicolor selon l'invention précultivés sur des grains de céréales, tels que des grains de blé, de seigle ou de millet notamment.
Ledit support organique lignifié peut être inoculé avec des grains de céréales colonisés par le champignon, préférentiel lement à un taux d'environ 1% à environ 20 %, de préférence encore de 2 à 10 % (poids de grains/poids du support organique lignifié).
Les grains de céréales utilisés sont alors de préférence des grains non traités qui sont stérilisés selon le protocole suivant : trempage dans l'eau puis cuisson aux environs de 100°C pendant 30 à 60 minutes, de préférence 45 minutes et finalement autoclavage de 1 10 à 130°C, de préférence à environ 120°C pendant 20 à 240 minutes, de préférence 100 à 200 minutes. Un agent abrasif facilitant la séparation des grains entre eux ainsi qu'une source de nutriment peuvent être ajoutés de manière avantageuse. Le plâtre, le carbonate de calcium, la craie ou le talc peuvent par exemple jouer à la fois le rôle de nutriment (source de calcium) et d'agent abrasif. Du plâtre peut ainsi être ajouté aux grains de céréales immédiatement avant autoclavage à une concentration comprise par exemple entre environ 0,5 et environ 10 % (masse/masse). Les grains sont ensuite inoculés par exemple à l'aide a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que, par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri ou (ii) sur des grains de céréales, puis généralement placés en bocaux stériles ou dans des sacs stériles équipés de membranes microporeuses.
Les supports inoculés peuvent ensuite être placés en sacs de culture permettant les échanges gazeux. Des fermenteurs en phase solide de capacité élevée peuvent également être utilisés à la place des sacs. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on choisit comme support organique des rafles de maïs ou des copeaux de bois, qui préalablement à l'ensachage sont mélangés intimement aux grains de céréales colonisés par le champignon à un taux d'environ 1 % à 20 %, de préférence de 2 à 10 % (poids de grains/poids de copeaux ou de rafles). Le mélange est ensuite incubé à une température optimale pour la croissance de la souche de champignon utilisée (en général 25-30°C). Cette technique permet d'obtenir une culture homogène et très bien développée. Des générations successives d'inoculum peuvent être produites en rediluant soit les grains inoculés dans un volume de grains stériles, soit l'inoculum arrivé à maturité dans un volume de supports lignifiés stériles. A titre d'exemple, des copeaux pourront être humidifiés à l'aide d'une solution minérale (comprenant des suppléments nutritifs pour le champignon) comprenant pour un litre de solution :
KH2PO4 : 2 g
MgSO4 : 0,5 g
CaCI2 : 0,1 g
Tartrate d'ammonium : 0,2 g
Eau : en quantité suffisante pour 1 I de solution.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans la limiter d'une quelconque façon.
LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 représente un essai comparatif de la capacité de quatre souches différentes de Coriolus versicolor à dégrader quatre HAP : BAN (benzo(a)anthracène), BPY (benzo(a)pyrène), BKF
(benzo(k)fluoranthène) et DBA (dibenzo(a,h)anthracène). Les niveaux de biodégradation sont donnés semi-quantitativement : 0=0-9 %, 1=10-24 %, 2=25-49 %, 3=50-74 %, 4=75-100 %.
La figure 2 représente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après quatre semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 20 % est comparé au témoin microflore indigène.
La figure 3 représente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycles. Le pilote avec Coriolus versicolus 1-1657, 10 % (après 5 semaines) est comparé au témoin (microflore indigène, 8 semaines).
La figure 4 représente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après huit semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 10 % est comparé au témoin microflore indigène.
La figure 5 représente les pourcentages de biodégradation de quelques HAP à cinq et six cycles dans un sol contenant initialement 7602 mg HAP/kg de sol et après huit semaines d'incubation.
EXEMPLE 1 :
Activité dégradatrice de la souche Coriolus versicolor 1-1657 envers les HAP.
Les abréviations suivantes ont été utilisées pour chaque HAP : naphtalène (NA), acénaphtylène (ACY), acénaphtène (ACE), fluorène (FL), phénanthrène (PH), anthracène (AN), fluoranthène (FLH), pyrène (PY), benzo(a)anthracène (BAN), chrysène (CH), benzo(b)fluoranthène (BBF), benzo(k)fluoranthène (BKF), benzo(a)pyrène (BAP), dibenzo(a,h)anthracène (DBA), benzo(g,h,i)perylène (BPE) et indénol(1 ,2,3,cd)ρyrène (INP).
a) Méthodes analytiques
Extraction :
L'extraction est effectuée sur la totalité du volume d'essai. Un solvant organique est ajouté dans chaque flacon à raison de 40 ml d'acétonitrile. Puis les flacons sont agités pendant une heure à 200 tpm avant leur passage dans une cuve à ultrasons pendant 5 minutes. Les rendements d'extraction ont été mesurés au préalable et sont supérieurs à 95 %.
Dosages :
Les HAP sont dosés par chromatographie liquide haute pression GILSON/détection UV JASCO, équipée d'une colonne Lichrospher 100 C18 de longueur 250 mm et de diamètre 4 mm. L'éluant utilisé est isocratique (800 ml acetonitrile + 200 ml eau). La longueur d'onde du détecteur est de 254 nm. Cette méthode de dosage permet la séparation et la quantification des pics correspondants aux 16 HAP étudiés.
b) Méthode d'étude de la biodégradation : Les études de dégradation ont été réalisées dans des flacons sérum de 100 ml, fermés de façon étanche.
Chaque flacon d'essai contient 20 ml de milieu de culture permettant le bon développement du champignon. Le milieu de culture utilisé est un milieu enrichi en azote ou carence en azote et provoquant la stimulation de son activité enzymatique extra-cellulaire (sécrétion des ligninases) suivant les cas. Sa composition (décrite par Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol. 1 17, 277-285) est la suivante :
• Milieu de culture : milieu basai III médium :
KH2PO4 : 20 g/1
MgSO4 : 5 g/1
CaCI2 : 1 g/l
• Composition de la culture :
Les produits suivants sont ajoutés par litre de cultures:
Milieu basai III (stérilisé par filtration), 100 ml
10 % glucose (passé à l'autoclave), 100 ml
0,1 M 2,2-méthylsuccinate, pH 4,2 (passé à l'autoclave), 100 ml Thiamine (100 mg/litre de solution mère stérilisé par filtration) 10 ml
Tartrate d'ammonium (8 g/litre de solution mère, passé à l'autoclave), 25 ml
Spores (absorbance à 650 nm = 0,5), 100 ml.
Les champignons ont été apportés dans le milieu d'essai sous forme d'une solution de spores en suspension, préparée à partir de tubes de cultures en pente. Les substances testées ont été apportées sous forme solubilisée dans un solvant organique à une concentration finale en HAP dans les flacons d'essai comprise entre 6 et 50 mg/l. Cependant, la concentration testée a été en général de 6 mg/l afin de limiter la toxicité de la substance et les quantités de solvant apportées. Dans tous les cas, les quantités totales de solvant apportées dans le milieu d'essai n'ont jamais excédé 1 % et les flacons ont été, le cas échéant, laissés ouverts le temps nécessaire pour l'évaporation du solvant. De l'oxygène a été introduit en début d'essai dans les flacons, puis, si nécessaire, régulièrement au cours du temps. La quantité initiale d'oxygène pur ajouté a été de 50 ml. L'essai a été conduit en phase statique et les flacons ont été incubés pendant un mois à l'obscurité et à 30°C. En fin d'essai, une extraction à l'acétonitrile a été effectuée sur la totalité du volume de milieu d'essai après 30 jours d'incubation. Des dosages spécifiques ont ensuite été effectués par HPLC.
c) Résultats
Le paramètre mesuré a été la disparition de la "substance étudiée.
Les résultats obtenus pour chacun des 16 HAP sont présentés dans le tableau 2. Ces résultats sont présentés semi-quantitativement : 0=0-9 % ; 1 = 10-24 % ; 2=25-49 % ; 3=50-74 % ; 4=75-100 % (%=pourcentages de biodégradation après un mois d'incubation).
Tableau 2 :
Figure imgf000017_0001
Conclusion :
La souche Coriolus versicolor 1-1657 est capable de dégrader l'ensemble des 16 HAP. La comparaison de la souche Coriolus versicolor I- 1657 et de trois autres souches de Coriolus versicolor (Coriolus versicolor ATCC 34578, ATCC 34671 , ATCC 32745) a mis en évidence l'avantage significatif de la souche Coriolus versicolor 1-1657 selon l'invention par rapport aux trois autres Coriolus versicolor (voir figure 1) pour dégrader les HAP lourds. EXEMPLE 2 :
Procédé de traitement biologique de sols contaminés par des substances organiques récalcitrantes
L'efficacité de la souche Coriolus versicolor selon l'invention a été vérifiée lors d'essais pilote conduits sur des sols pollués historiquement par des HAP. Leur inoculation dans le sol a permis d'améliorer significativement la biodégradation de composés réputés récalcitrants. Les champignons sont introduits dans les sols sur leur support organique (copeaux de bois) à un taux de 20 % (exemple 2a) et 10 % (exemples 2b et 2c).
Le support organique a été inoculé avec du mycélium prédéveloppé sur des grains de céréales (l'inoculation des grains ayant été effectuée initialement par de la gélose solide recouverte de champignons (mycélium prédéveloppé sur de la gélose solide)).
a) Des expérimentations ont été conduites en pilotes de 50 litres sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usine à gaz. L'efficacité de la souche de champignons selon l'invention a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 1596 mg/kg répartis de la façon suivante : 431 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 774 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 274 mg/kg pour les HAP à cinq cycles et 117 mg/kg pour les HAP à six cycles. Les champignons ont été inoculés à un taux de 20 % et les paramètres environnementaux (humidité, température et, éventuellement, apport de nutriments) ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Des pourcentages de biodégradation égaux à 73 % pour les HAP à trois cycles, 47 % pour les HAP à quatre cycles, 15 % pour les HAP à cinq cycles et 25 % pour les HAP à six cycles ont été obtenus après seulement un mois d'incubation en pilote en présence de Coriolus versicolor 1-1657 (voir figure 2). La biodégradation des HAP totaux a représenté environ 50 % après un mois de traitement. Dans le même temps, la microflore indigène en étant pourtant stimulée n'avait dégradé que très faiblement les HAP, la concentration finale atteinte n'étant pas significativement différente de la concentration initiale en HAP totaux. Dans ce cas, seuls les HAP à trois et quatre cycles ont été dégradés, mais leurs pourcentages de disparition n'ont été que de 19 et 16 % respectivement.
Les méthodes analytiques utilisées pour tous nos essais ont été validées préalablement et ont classiquement consisté pour cet exemple en une extraction au CO2 supercritique suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse.
b) Des essais ont été conduits en pilotes de 50 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration de 1092 mg/kg répartis de la façon suivante : 122 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 652 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 318 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignon Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30°C et l'humidité du sol à 70 % de la teneur en eau utile du sol. Des pourcentages de biodégradation égaux à 75 % pour les trois cycles, 50 % pour les quatre cycles, 38 % pour les cinq et six cycles dont 46 % pour le benzo(a)pyrène, ont été obtenus après seulement cinq semaines d'incubation en pilote en présence de la souche Coriolus versicolor 1-1657 (voir figure 3). La biodégradation en HAP totaux a atteint 49 % après seulement cinq semaines d'incubation. Dans le même temps, la microflore indigène biostimulée n'a dégradé que très faiblement les HAP, le pourcentage de biodégradation atteint en fin d'essai étant à peine supérieur à 10 %. Après huit semaines d'incubation, les résultats obtenus avec la microflore indigène biostimulée n'avaient guère évolué, avec des pourcentages de biodégradation de 18, 21 , 6 et 17 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux. Il est important de noter que le pilote témoin microflore indigène avait également été inoculé avec des copeaux stériles identiques à ceux utilisés pour la préparation de l'inoculum de champignon et cela à un taux de 10 % (poids/poids).
Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEX ASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux microorganismes indigènes (bactéries et champignons) est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodégrader.
c) Des essais ont été conduits en pilotes de laboratoire de 2 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 7602 mg/kg répartis de la façon suivante : 3903 mg/kg pour les HAP à deux et trois cycles, 3233 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 466 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignons Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30°C et l'humidité du sol à 70 % de la teneur en eau utile du sol. Des pourcentages de biodégradation égaux à 49 % pour les trois cycles, 26 % pour les quatre cycles, 34 % pour les cinq et six cycles dont 44 % pour le benzo(a)pyrène, ont été obtenus après seulement huit semaines d'incubation en présence de la souche Coriolus versicolor 1-1657. La biodégradation en HAP totaux a atteint 38 % après huit semaines d'incubation. Dans le même temps, la microflore indigène biostimulée n'a dégradé que très faiblement les HAP, le pourcentage de biodégradation atteint en fin d'essai étant équivalent à 25, 9, 0 et 16 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux (voir figure 4).
Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEXASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux autres microorganismes est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodegrader (voir figure 5).

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche de champignon Coriolus versicolor , caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM sous la référence 1-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles.
2. Souche de champignon Coriolus versicolor, déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM sous la référence 1-1657.
3. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans un matériel contaminé. ,ro
4. Utilisation selon la revendication 3 dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).
5. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques choisis parmi le naphtalène, l'acénaphtylène, l'acénaphtène, le fluorene, le phenanthrene, l'anthracene, le fluoranthene, le pyrène, le benzo(a)anthracène, le chrysène, le benzo(b)fluoranthène, le benzo(k)fluoranthène, le benzo(a)pyrène, le dibenzo(a,h)anthracène, le benzo(g,h,i)perylène et l'indénol(1 ,2,3,cd)pyrène.
6. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques à au moins cinq cycles.
7. Procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants dans lequel la souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 est mise en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel contaminé et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.
8. Procédé selon la revendication 7 comprenant les étapes consistant à : a) préparer un inoculum de champignon selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 sur un support organique lignifié, ledit support étant préalablement traité de manière à éliminer les contaminants microbiologiques, inoculé avec ladite souche de champignon, puis incubé dans des conditions appropriées à la croissance du champignon ; b) introduire l'inoculum dans le matériel contaminé.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'inoculum est introduit dans le matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 %, de préférence entre 5 et 20 %, en poids.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ledit matériel contaminé est un sol.
PCT/FR1998/002880 1997-12-24 1998-12-24 Nouvelle souche de champignon coriolus versicolor utile pour le traitement des materiels pollues WO1999033952A1 (fr)

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