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WO1999033585A1 - Procede de traitement d'un materiel contamine par des composes polluants recalcitrants - Google Patents

Procede de traitement d'un materiel contamine par des composes polluants recalcitrants Download PDF

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Publication number
WO1999033585A1
WO1999033585A1 PCT/FR1998/002882 FR9802882W WO9933585A1 WO 1999033585 A1 WO1999033585 A1 WO 1999033585A1 FR 9802882 W FR9802882 W FR 9802882W WO 9933585 A1 WO9933585 A1 WO 9933585A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fungi
support
contaminated
mycelium
strain
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/002882
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric BAUD-GRASSET
Dominique Petre
Original Assignee
Rhodia Chimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhodia Chimie filed Critical Rhodia Chimie
Priority to AU19712/99A priority Critical patent/AU1971299A/en
Publication of WO1999033585A1 publication Critical patent/WO1999033585A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
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    • A62D2101/20—Organic substances
    • A62D2101/22—Organic substances containing halogen

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating material contaminated with recalcitrant polluting compounds.
  • Pollution control can be done mechanically, by burning the land, chemically or biologically. Bioremediation or bioremediation can be more particularly used. This technique uses microorganisms, such as bacteria or fungi, to degrade recalcitrant polluting compounds, that is to say compounds which resist degradation in the environment.
  • halobenzoates such as chlorobenzoate and bromobenzoate
  • nitro compounds such as 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)
  • TNT 2,4,6-trinitrotoluene
  • other explosives such as PETN (penta-erythritol tetranitrate) and EGDN (ethylene glycol dinitrate).
  • organic halides such as in particular DDT [1, 1-bis (4-chlorophenyl) -2,2,2-trichloroethane], 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, lindane (1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane), polyhalogenated biphenyl compounds such as in particular 3,4,3 ', 4'-tetrachlorobiphenyl and 2,4,5,2', 4 ', 5 '-hexachlorobiphenyl.
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • rot fungi when grown under nutrient limiting conditions (nitrogen deficiency for example) are capable of degrading lignin as well as many other organic compounds, including PAHs in particular, thanks to a non-specific enzyme system with strong oxidizing power (ligninases). Certain rot fungi are also capable, when cultivated under non-limiting conditions, of transforming certain PAHs, such as phenanthrene, into trans-dihydrodiols using monooxygenases according to a mechanism close to that existing in other families of mushrooms. Some fungi are also capable of degrading PAHs into trans-dihydrodiols or phenols.
  • German patent DE 37 31 816 describes a process for degrading aromatic compounds which are difficult to degrade in contaminated soil, consisting in introducing into these soils certain white rot fungi associated with materials containing hemicellulose, such as straw. These materials containing hemicellulose are subjected beforehand to a treatment at a temperature of 100 to 140 ° C and a pressure of 1 to 3.6 bar, in the presence of water vapor, in order to cause partial autolysis and turgor. of these materials.
  • the Applicant has now developed a new method for treating materials contaminated with recalcitrant pollutants, by selecting the types of organic supports to be used, their method of treatment and their method of inoculation with the fungus.
  • the subject of the present invention is therefore a method of treating material contaminated with recalcitrant polluting compounds comprising the following steps:
  • a lignified organic support chosen from wood chips, tree bark or corn cobs undergoes a treatment intended to remove microbiological contaminants; 2) said support thus treated is inoculated with a strain of fungi of the polyporal family, said strain being in the form of a) a solution of spores and / or fragments of mycelium suspended in a liquid medium, b) mycelium pre-developed in liquid medium, or c) mycelium pre-developed on a solid support, in particular (i) on a solid gelled medium, or (ii) on cereal grains;
  • step 4) the inoculum of mushrooms on an organic support from step 3) is introduced into the contaminated material.
  • condition suitable for the growth of fungi on said lignified organic support is meant humidity, temperature and aeration conditions known to those skilled in the art.
  • the lignified organic support inoculated with the fungus strain can, for example, be advantageously placed in a culture chamber with controlled humidity, at a temperature between 15 and 35 ° C, more particularly between 20 and 30 ° C, for a period preferably between one and six weeks, for example three weeks.
  • the highly lignified organic support can be advantageously chosen from hardwood chips, such as poplar or beech or tree bark, such as pine, or even crushed corn cobs, which can be possibly mixed with sawdust.
  • hardwood chips such as poplar or beech or tree bark, such as pine, or even crushed corn cobs, which can be possibly mixed with sawdust.
  • corn lump or wood chips are chosen as the lignified organic support.
  • the wood chips can be calibrated or of the "general purpose" type, that is to say uncalibrated.
  • Wood shavings with a particle size greater than 4.5 mm are preferred, chips with a smaller particle size generally hamper the growth of the fungus due to poor ventilation due to compaction of the chips. Since fungi are sensitive to microbioiogical contamination, it is important to ensure that the risks of contamination are very low.
  • the lignified organic support is treated before inoculation with the fungus strain, so as to eliminate microbiological contaminants.
  • This treatment can be carried out by drying between 450 and 550 ° C, for example at 500 ° C for a few seconds, by pasteurization for 1 or 2 cycles each from 8 to 30 hours, preferably 8 to 24 hours, preferably 16 hours , each at a temperature between 50 and 100 ° C, preferably between approximately 65 and approximately 85 ° C, or by sterilization (autoclaving) between 110 and 130 ° C, preferably at approximately 120 ° C for 20 to 240 minutes, preferably 20 to 60 minutes.
  • the lignified organic support can be humidified, preferably to saturation, before the treatment intended to remove microbiological contaminants.
  • this treatment is carried out by pasteurization.
  • the lignified organic support is then inoculated with the fungus of the polyporal family which is present: a) in the form of a solution of spores, fragments of mycelium or a mixture of spores and fragments of mycelium, in suspension in a liquid medium, which can be prepared for example from mushroom cultures on a solid support, in particular on solid gelled medium (in particular agar) in a tube, or on cereal grains; the suspension can thus be obtained in particular by introducing a determined volume of CH culture medium as described in Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol.
  • the pre-developed mycelium can be obtained by culturing in CH medium (Kirk et al., 1978) a solution of spores in suspension; in this case, the culture is generally stirred for about a week at 30 ° C; at the end of incubation, the balls of mycelium formed are recovered and then used as an inoculum; c) or, preferably in the form of mycelium pre-developed on a solid support (mycelium covering fragments of solid support), in particular (i) on a solid gelled medium such as for example agar, which can be contained in a box of Petri, or (ii) on cereal grains (preculture on cereal grains).
  • a solid support mycelium covering fragments of solid support
  • the lignified organic support is inoculated with polyporal fungi precultivated on cereal grains, such as grains of wheat, rye or millet in particular.
  • Said lignified organic support can be inoculated with cereal grains colonized by the fungi, preferably at a rate of about 1% to about 20%, more preferably from 2 to 10% (weight of grains / weight of lignified organic support) .
  • the cereal grains used are then preferably grains not treated with chemical substances which could inhibit the growth of the fungus, grains which are sterilized according to the following protocol: soaking in water, cooking at around 100 ° C. for 30 to 60 minutes, preferably 45 minutes, then autoclaving from 110 to 130 ° C, preferably at about 120 ° C for 20 to 240 minutes, preferably from 100 to 200 minutes.
  • An abrasive agent facilitating the separation of the grains from one another as well as a source of nutrient can be advantageously added to the cereal grains.
  • a pH corrector can also be added advantageously. Plaster, calcium carbonate, chalk or talc can, for example, play the role of a nutrient (source of calcium), an abrasive agent and a pH corrector.
  • Plaster can thus be added to the cereal grains immediately before autoclaving at a concentration of, for example, between approximately 0.5 and approximately 10% (mass / mass).
  • the grains are then inoculated, for example using a) a solution of spores and / or fragments of mycelium suspended in a liquid medium, b) mycelium pre-developed in liquid medium, or c) mycelium pre-developed on a solid support, in particular (i) on a solid gelled medium such as, for example agar or (ii) on cereal grains, then generally placed in sterile jars or in sterile bags equipped with microporous membranes.
  • the incubation is then preferably carried out in a culture chamber with controlled humidity. at a temperature between 15 and 35 ° C, more particularly between 20 and 30 ° C, for a period between one and six weeks, preferably three weeks.
  • the inoculated supports can then be placed in culture bags allowing gas exchange.
  • High capacity solid phase fermenters can also be used in place of bags.
  • corn cobs or wood chips are chosen, which, prior to bagging, are intimately mixed with the cereal grains colonized by the fungus, at a rate of '' about 1% to 20%, preferably 2 to 10% (weight of grains / weight of chips or stalks).
  • the mixture is then incubated at an optimum temperature for the growth of the fungus strain used (generally 25-30 ° C).
  • This technique makes it possible to obtain a homogeneous and very well developed culture.
  • Successive generations of inoculum can be produced by rediluting either the inoculated grains in a volume of sterile grains, or the mature inoculum in a volume of sterile lignified supports.
  • shavings can be moistened with a mineral solution (including nutritive supplements for the fungus) comprising for one liter of solution:
  • the fungus used in the process of the invention can be any known polyporal.
  • the fungus used can be the strain Coriolus versicolor deposited on January 19, 1996 in the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms at the Institut Pasteur) under the reference 1-1657 or one of its derivatives, which is capable of degrading not only polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) comprising two to four cycles, but also aromatic hydrocarbons (PAHs) comprising at least five cycles including all the PAHs comprising five or six cycles, in particular all the PAHs with five or six cycles in Table 1.
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbons
  • PAHs aromatic hydrocarbons
  • derivative is meant a strain derived from Coriolus versicolor 1-1657 by spontaneous or induced mutation and capable of degrading not only polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) comprising two to four cycles, but also polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) comprising at least five cycles, including all the PAHs comprising five or six cycles, in particular all the PAHs with five or six cycles in Table 1 (namely in particular benzo (b) fluoranthene, benzo (k) floranthene, benzo (a) pyrene, dibenzo (a, h) anthracene, benzo (g, h, i) perylene and indenol (1, 2,3-cd) pyrene), as well as, in general, PAHs comprising more than six cycles .
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbons
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbons
  • the present invention also relates to the use of the inoculum prepared according to steps 1) to 3) as defined above for degrading recalcitrant polluting compounds contained in contaminated material.
  • the inoculum is brought into contact with the contaminated material under appropriate conditions to stimulate the growth of fungi in the material and guarantee the degrading activity of recalcitrant pollutants.
  • the inoculum can be brought into contact with the contaminated material at a rate of between 1 and 50% by weight, preferably between 5 and 20% relative to the weight of the contaminated material.
  • the contacting can be carried out in particular on excavated soil or on unstructured soil.
  • Said contaminated material can be soils, aquatic sediments, gravel, and other solid materials, and water.
  • said contaminated material is soil.
  • condition suitable for stimulating the growth of said fungus in the material and guaranteeing the degrading activity of recalcitrant pollutants we mean conditions of aeration, temperature and humidity, of the contaminated material, known to those skilled in the art .
  • the contaminated material When the contaminated material is a soil, its humidity can be, preferably, between 50 and 80% depending on the type of soil.
  • the temperature can be between 10 and 40 ° C, a growth of the fungus being however always possible even at a lower temperature.
  • the nitrogen content in the soil can be such that the carbon / nitrogen / phosphorus ratio is equal to about 100/10/1. Contaminated material may also advantageously contain nutrients and trace elements.
  • Aeration can be ensured by forced air circulation, by natural diffusion of air, or by mechanical mixing of the soil.
  • an air flow of about 0.1 to 5 m 3 / h / tonne of soil is advantageous for example.
  • the aeration can be made more homogeneous in the soil by ensuring a stripping or a preliminary screening of the soil.
  • the addition of an organic support with the inoculum according to the invention also makes it possible to improve the structure of the soil, and consequently its aeration. More generally, the homogenization of the soil by demottagc screening / mixing and mixing with the organic support of the inoculum make it possible to improve mass transfers (water, temperature, nutrients, air, enzymes) and consequently the responsible biochemical activity. degradation of polluting components.
  • Figure 1 shows the percentages of biodegradation in total PAH and as a function of the number of cycles after four weeks.
  • the pilot with Coriolus versicolor 1-1657, 20% is compared to the native microflora control.
  • FIG. 2 represents the percentages of biodegradation into total PAHs and as a function of the number of cycles.
  • the pilot with Coriolus versicolus 1-1657, 10% (after 5 weeks) is compared with the control (native microflora, 8 weeks).
  • FIG. 3 shows the percentages of biodegradation in total PAH and according to the number of cycles after eight weeks.
  • the pilot with Coriolus versicolor 1-1657, 10% is compared to the native microflora control.
  • FIG. 4 represents the percentages of biodegradation of a few PAHs at five and six cycles in a soil initially containing approximately 7602 mg PAH / kg of soil and after eight weeks of incubation.
  • strains used are:
  • the objective of this trial was to assess the influence of the size of wood chips on the growth of Coriolus versicolor 1-1657.
  • the wood chips used come from the company SPS (Institut Parisienne de Sciure, Voussieux). Three different particle sizes in chips were used to assess the influence of the size of the chips on the growth of the fungi: 9-4.5 mm, 4.5-2.5 mm and 2.5-1.8 mm.
  • the shavings originally contain 10% moisture. They were sterilized by autoclaving at 120 ° C for 20 minutes and humidified to 60% with distilled water. They were then inoculated with fragments of solid agar covered with fungus. The chips are then placed in culture chambers saturated with humidity and at a temperature of 30 ° C. The growth of the fungi was assessed regularly over time using a visual method.
  • the wood chips used come from the company SPS (Institut Parisienne, Voussieux). They originally contain 10% moisture. They were humidified to about 60% (weight / weight) using a specific mineral medium, comprising for one liter of solution:
  • the shavings were sterilized according to the following techniques: - by autoclaving at 120 ° C for 20 minutes;
  • the fungus used is the isolated strain Coriolus versicolor 1-1657. The growth of the fungi was assessed regularly over time using a visual method.
  • Pasteurization therefore represents an effective means of eliminating the risks of contamination of the inoculum. However, it may be necessary to carry out two successive pasteurization cycles or to increase the pasteurization temperature for better efficiency.
  • the effectiveness of the fungi used was verified during pilot tests conducted on soils historically polluted by PAHs. Their inoculation in the soil made it possible to significantly improve the biodegradation of compounds known to be recalcitrant.
  • the fungi are introduced into the soil on their organic support (wood chips) at a rate of 20% (example 4a) and 10% (examples 4b and 4c).
  • the organic support was inoculated with pre-developed mycelium on cereal grains (the inoculation of the grains having been carried out initially by solid agar covered with fungi (mycelium pre-developed on solid agar)).
  • the mushrooms were inoculated at a rate of 20% and the environmental parameters (humidity, temperature and, optionally nutrient supply) were optimized in order to accelerate the growth of the fungi and their enzymatic activity.
  • Biodegradation percentages equal to 73% for three-cycle PAHs, 47 % for four-cycle PAHs, 15% for five-cycle PAHs and 25% for six-cycle PAHs were obtained after only one month of pilot incubation in the presence of Coriolus versicolor 1-1657 (see Figure 1) . Biodegradation of total PAHs was approximately 50% after one month of treatment.
  • Tests were carried out in 50 kg pilots on soils historically contaminated with PAHs from former gas factory sites. The effectiveness of fungal strains was evaluated and compared to the activity of the native soil microflora in the case of soil contaminated with PAHs at a concentration of 1092 mg / kg distributed as follows: 122 mg / kg for three-cycle PAHs, 652 mg / kg for four-cycle PAHs, 318 mg / kg for five and six-cycle PAHs. The fungus strain Coriolus versicolor 1-1657 was brought at a rate of 10% (w / w). The environmental parameters have been optimized in order to accelerate the growth of fungi and their enzymatic activity.
  • Biodegradation percentages equal to 75% for the three cycles, 50% for the four cycles, 38% for the five and six cycles including 46% for benzo (a) pyrene, were obtained after only five weeks of incubation in pilot in the presence of the Coriolus versicolor 1-1657 strain (see FIG. 2). Biodegradation in total PAHs reached 49% after only five weeks of incubation. At the same time, the native biostimulated microflora degraded PAHs only very slightly, the percentage of biodegradation reached at the end of the test being barely greater than 10%.
  • the results obtained with the native biostimulated microflora had hardly changed, with biodegradation percentages of 18, 21, 6 and 17% for respectively the two and three cycles, the four cycles, the five and six cycles and total PAHs. It is important to note that the native microflora control pilot had also been inoculated with sterile shavings identical to those used for the preparation of the mushroom inoculum and this at a rate of 10% (weight / weight).
  • the analytical methods used for these tests were validated beforehand and consisted, for this example, of a solvent extraction under pressure using a DIONEX ASE 200 apparatus followed by an analysis by gas chromatography / mass spectrometry or liquid chromatography high pressure / UV detection.
  • the effectiveness of the fungus compared to native microorganisms is most marked for heavy PAHs with five and six cycles which are the most difficult to biodegrade.

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Abstract

Cette invention concerne un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des composés polluants récalcitrants comprenant les étapes suivantes: 1) un support organique lignifié choisi parmi des copeaux de bois, des écorces d'arbres ou des rafles de maïs subit un traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques; 2) ledit support ainsi traité est inoculé avec une souche de champignons de la famille des polyporales, ladite souche étant sous la forme a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide, ou (ii) sur des grains de céréales; 3) l'inoculum de champignons obtenu est incubé dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support; 4) l'inoculum de champignons sur support organique issu de l'étape 3) est introduit dans le matériel contaminé.

Description

Procédé de traitement d'un matériel contaminé par des composés polluants récalcitrants
La présente invention concerne un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des composés polluants récalcitrants.
La dépollution des sites pollués, c'est-à-dire des sites sur lesquels une pollution d'origine industrielle du sol ou du sous-sol est susceptible de générer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l'environnement, est un enjeu économique et scientifique actuel majeur.
La dépollution peut se faire par voie mécanique, par brûlage des terres, par voie chimique ou par voie biologique. La biorestauration ou bioréhabilitation peut être plus particulièrement utilisée. Cette technique met en œuvre des microorganismes, tels que des bactéries ou des champignons, pour dégrader les composés polluants récalcitrants, c'est-à-dire des composés qui résistent à la dégradation dans l'environnement.
Parmi ces composés polluants récalcitrants, on peut citer notamment les halobenzoates tels que le chlorobenzoate et le bromobenzoate, et les composés nitrés tels que le 2,4,6-trinitrotoluène (TNT) et autres explosifs tels que le PETN (penta-érythritol tétranitrate) et l'EGDN (éthylène glycol dinitrate).
On peut citer également les halogénures organiques tels que notamment le DDT[1 ,1 -bis(4-chlorophényl)-2,2,2-trichloroéthane], la 2,3,7,8- tétrachlorodibenzo-p-dioxine, le lindane (1 ,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane), les composés biphényles polyhalogénés tels que notamment le 3,4,3', 4'- tétrachlorobiphényle et le 2,4,5,2',4',5'-hexachlorobiphényle.
On peut enfin citer les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dont certains sont des composés mutagènes et cancérigènes.
L'agence américaine pour la protection de l'environnement (EPA pour environmental protection agency) a édité une liste de 16 HAP contaminant les sols, cette liste faisant référence dans de nombreux pays. Ces 16 HAP sont considérés comme prioritaires et doivent être surveillés. Le tableau 1 suivant présente la formule de ces 16 HAP. Tableau 1 : Fonnule des 16 HAP
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
Plusieurs champignons formant la pourriture blanche sur le bois sont connus pour leur action dégradatrice envers certains composés polluants récalcitrants.
Ces champignons de la pourriture lorsqu'ils sont cultivés en conditions limitantes en nutriments (carence en azote par exemple) sont capables de dégrader la lignine ainsi que de nombreux autres composés organiques, y compris en particulier des HAP, grâce à un système enzymatique non spécifique à fort pouvoir oxydant (ligninases). Certains champignons de la pourriture sont également capables lorsqu'ils sont cultivés en conditions non limitantes, de transformer certains HAP, tels que le phénanthrène, en trans-dihydrodiols à l'aide de monooxygénases selon un mécanisme proche de celui existant dans les autres familles de champignons. Quelques champignons sont également capables de dégrader des HAP en trans-dihydrodiols ou en phénols. Le brevet allemand DE 37 31 816 décrit un procédé de dégradation des composés aromatiques difficilement dégradables dans les sols contaminés consistant à introduire dans ces sols certains champignons de la pourriture blanche associés à des matériels contenant de l'hémicellulose, comme par exemple la paille. Ces matériels contenant de l'hémicellulose sont préalablement soumis à un traitement à une température de 100 à 140°C et une pression de 1 à 3,6 bar, en présence de vapeur d'eau, afin de provoquer une autolyse partielle et un turgescence de ces matériels.
Le Demandeur a à présent mis au point un nouveau procédé de traitement des matériels contaminés par des polluants récalcitrants, en sélectionnant les types de supports organiques à utiliser, leur mode de traitement et leur mode d'inoculation par le champignon.
La présente invention a donc pour objet un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des composés polluants récalcitrants comprenant les étapes suivantes :
1) un support organique lignifié choisi parmi des copeaux de bois, des écorces d'arbres ou des rafles de maïs subit un traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques ; 2) ledit support ainsi traité est inoculé avec une souche de champignons de la famille des polyporales, ladite souche étant sous la forme a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide, ou (ii) sur des grains de céréales ;
3) l'inoculum de champignons obtenu est incubé dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support ;
4) l'inoculum de champignons sur support organique issu de l'étape 3) est introduit dans le matériel contaminé.
Par "conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support organique lignifié", on entend des conditions d'humidité, de température et d'aération connues de l'homme du métier. Le support organique lignifié inoculé avec la souche de champignons peut être, par exemple, placé de manière avantageuse dans une chambre de culture à humidité contrôlée, à une température comprise entre 15 et 35°C, plus particulièrement entre 20 et 30°C, pendant une période comprise entre de préférence une et six semaines, par exemple de trois semaines.
Le support organique fortement lignifié peut être choisi, de manière avantageuse, parmi des copeaux de bois dur, tel que le peuplier ou le hêtre ou des écorces d'arbres, tels que le pin, ou bien encore des rafles de maïs broyées, pouvant être éventuellement mélangées à de la sciure de bois. De manière préférentielle, on choisit comme support organique lignifié des rafles de maïs ou des copeaux de bois.
Les copeaux de bois peuvent être calibrés ou du type "tout- venant", c'est-à-dire non calibrés.
Des copeaux de bois d'une granulométrie supérieure à 4,5 mm sont préférés, les copeaux de plus faible granulométrie freinant généralement la croissance du champignon du fait d'une mauvaise aération due au tassement des copeaux. Les champignons étant sensibles aux contaminations microbioiogiques, il est important de s'assurer que les risques de contamination sont très faibles.
A cet effet, le support organique lignifié est traité avant inoculation par la souche de champignon, de façon à éliminer les contaminants microbiologiques. Ce traitement peut s'effectuer par séchage entre 450 et 550°C, par exemple à 500°C pendant quelques secondes, par pasteurisation pendant 1 ou 2 cycles chacun de 8 à 30 heures, de préférence 8 à 24 heures, de préférence 16 heures, chacun à une température comprise entre 50 et 100°C, de préférence entre environ 65 et environ 85°C, ou par stérilisation (autoclavage) entre 110 et 130°C, de préférence à environ 120°C pendant 20 à 240 minutes, de préférence 20 à 60 minutes. Le support organique lignifié peut être humidifié, de préférence à saturation, avant le traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques. De manière préférentielle, ce traitement est réalisé par pasteurisation.
Le support organique lignifié est ensuite inoculé avec le champignon de la famille des polyporales qui se présente : a) sous la forme d'une solution de spores, de fragments de mycélium ou d'un mélange de spores et de fragments de mycélium, en suspension dans un milieu liquide, pouvant être préparée par exemple à partir de cultures de champignons sur un support solide, en particulier sur milieu gélifié solide, (notamment gélose) en tube, ou sur grains de céréales ; la suspension peut ainsi être obtenue notamment en introduisant un volume déterminé de milieu de culture CH tel que décrit dans Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch. Microbiol. 117, 277-285, puis en agitant vigoureusement le tube de façon à libérer les spores ; b) sous la forme de mycélium prédéveloppé en milieu liquide : le mycélium prédéveloppé peut être obtenu en mettant en culture dans du milieu CH (Kirk et al., 1978) une solution de spores en suspension ; dans ce cas, la culture est placée sous agitation en général pendant environ une semaine à 30°C ; en fin d'incubation, les pelotes de mycélium formées sont récupérées puis utilisées comme inoculum ; c) ou, de préférence sous la forme de mycélium prédéveloppé sur un support solide (mycélium recouvrant des fragments de support solide), notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri, ou (ii) sur des grains de céréales (préculture sur grains de céréales).
De manière préférentielle, le support organique lignifié est inoculé avec des champignons polyporales précultivés sur des grains de céréales, tels que des grains de blé, de seigle ou de millet notamment.
Ledit support organique lignifié peut être inoculé avec des grains de céréales colonisés par les champignons, préferentiellement à un taux d'environ 1 % à environ 20 %, de préférence encore de 2 à 10 % (poids de grains/poids de support organique lignifié).
Les grains de céréales utilisés sont alors de préférence des grains non traités par des substances chimiques qui pourraient inhiber la croissance du champignon, grains qui sont stérilisés selon le protocole suivant: trempage dans l'eau, cuisson aux environs de 100°C pendant 30 à 60 minutes, de préférence 45 minutes, puis autoclavage de 110 à 130°C, de préférence à environ 120°C pendant 20 à 240 minutes, de préférence de 100 à 200 minutes. Un agent abrasif facilitant la séparation des grains entre eux ainsi qu'une source de nutriment peuvent être ajoutés de manière avantageuse aux grains de céréales. Un correcteur de pH peut être également ajouté de manière avantageuse. Le plâtre, le carbonate de calcium, la craie ou le talc peuvent par exemple jouer à la fois le rôle de nutriment (source de calcium), d'agent abrasif et de correcteur de pH. Du plâtre peut ainsi être ajouté aux grains de céréales immédiatement avant autoclavage à une concentration comprise par exemple entre environ 0,5 et environ 10 % (masse/masse). Les grains sont ensuite inoculés par exemple à l'aide a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que, par exemple de la gélose ou (ii) sur des grains de céréales, puis généralement placés en bocaux stériles ou dans des sacs stériles équipés de membranes microporeuses. L'incubation est alors de préférence réalisée dans une chambre de culture à humidité contrôlée à une température comprise entre 15 et 35°C, plus particulièrement entre 20 et 30°C, pendant une période comprise entre une et six semaines, de préférence trois semaines.
Les supports inoculés peuvent ensuite être placés en sacs de culture permettant les échanges gazeux. Des fermenteurs en phase solide de capacité élevée peuvent également être utilisés à la place des sacs.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on choisit comme support organique des rafles de maïs ou des copeaux de bois, qui, préalablement à l'ensachage, sont mélangés intimement aux grains de céréales colonisés par le champignon, à un taux d'environ 1 % à 20 %, de préférence de 2 à 10 % (poids de grains/poids de copeaux ou de rafles). Le mélange est ensuite incubé à une température optimale pour la croissance de la souche de champignon utilisée (en général 25-30°C). Cette technique permet d'obtenir une culture homogène et très bien développée. Des générations successives d'inoculum peuvent être produites en rediluant soit les grains inoculés dans un volume de grains stériles, soit l'inoculum arrivé à maturité dans un volume de supports lignifiés stériles. A titre d'exemple, des copeaux pourront être humidifiés à l'aide d'une solution minérale (comprenant des suppléments nutritifs pour le champignon) comprenant pour un litre de solution :
KH2PO4 : 2 g
MgS04 : 0,5 g
CaCI2 : 0,1 g
Tartrate d'ammonium : 0,2 g
Eau en quantité suffisante pour 1 I de solution.
Le champignon utilisé dans le procédé de l'invention peut être n'importe quel polyporale connu. De manière avantageuse, le champignon mis en œuvre peut être la souche Coriolus versicolor déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur) sous la référence 1-1657 ou l'un de ses dérivés, qui est capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant deux à quatre cycles, mais aussi les hydrocarbures aromatiques (HAP) comprenant au moins cinq cycles dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1.
Par "dérivé", on entend une souche dérivée de Coriolus versicolor 1-1657 par mutation spontanée ou induite et capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant deux à quatre cycles, mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1 (à savoir notamment le benzo(b)fluoranthène, le benzo(k)floranthène, le benzo(a)pyrène, le dibenzo(a,h)anthracène, le benzo(g,h,i)perylène et l'indenol (1 ,2,3-cd)pyrène), ainsi que, en général, les HAP comprenant plus de six cycles.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'inoculum préparé selon les étapes 1) à 3) telles que définies précédemment pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans un matériel contaminé. L'inoculum est mis en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance des champignons dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.
De manière avantageuse, l'inoculum peut être mis en contact avec le matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 % en poids, de préférence entre 5 et 20 % par rapport au poids du matériel contaminé. La mise en contact peut être réalisée notamment sur sol excavé ou sur sol déstructuré.
Ledit matériel contaminé peut être les sols, les sédiments aquatiques, les graviers, et autres matériels solides, et l'eau.
De manière préférentielle, ledit matériel contaminé est un sol.
Les principales mises en œuvre de techniques connues de biorestauration d'un sol sont : - le traitement in situ : le sol est laissé en l'état ;
- le traitement sur site : le sol est excavé et traité sur place ;
- le traitement ex situ : le sol est excavé et traité hors site.
Par "conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants", on entend des conditions d'aération, de température et d'humidité, du matériel contaminé, connues de l'homme du métier.
Lorsque le matériel contaminé est un sol, l'humidité de celui-ci peut être, de manière préférentielle, comprise entre 50 et 80 % suivant le type de sol. La température peut être comprise entre 10 et 40°C, une croissance du champignon étant cependant toujours possible même à une température plus basse. La teneur en azote dans le sol peut être telle que le rapport carbone/azote/phosphore soit égal à environ 100/10/1. Le matériel contaminé peut également contenir de manière avantageuse des nutriments et des oligo-éléments.
L'aération peut être assurée par une circulation d'air forcée, par une diffusion naturelle d'air, ou par brassage mécanique du sol. Lorsque le matériel contaminé est un sol, un débit d'air d'environ 0,1 à 5 m3/h/tonne de sol est avantageux par exemple. L'aération peut être rendue plus homogène dans le sol en assurant un démottage ou un criblage préliminaire du sol. L'apport d'un support organique avec l'inoculum selon l'invention permet également d'améliorer la structure du sol, et par conséquent son aération. Plus généralement, l'homogénéisation du sol par démottagcVcriblage/brassage et le mélange avec le support organique de l'inoculum permettent d'améliorer les transferts de masse (eau, température, nutriments, air, enzymes) et par conséquent l'activité biochimique responsable de la dégradation des composants polluants.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter d'une quelconque façon. LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 représente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après quatre semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 20 % est comparé au témoin microflore indigène.
La figure 2 représente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycles. Le pilote avec Coriolus versicolus 1-1657, 10 % (après 5 semaines) est comparé au témoin (microflore indigène, 8 semaines).
La figure 3 repréf.ente les pourcentages de biodégradation en HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après huit semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 10 % est comparé au témoin microflore indigène. La figure 4 représente les pourcentages de biodégradation de quelques HAP à cinq et six cycles dans un sol contenant initialement environ 7602 mg HAP/kg de sol et après huit semaines d'incubation.
EXEMPLE 1 :
Choix du support organique
Les souches utilisées sont :
- Phanerochaete chrysosporium DSM 1547,
- Phanerochaete chrysosporium ATCC 24725,
- Coriolus versicolor CNCM 1-1657. e*.
Elles ont été cultivées sur un milieu malt agar en boîtes de Pétri jusqu'à obtention d'un recouvrement uniforme du champignon en surface de la boîte. Des morceaux de gélose inoculés par les champignons ont alors été utilisés pour coloniser les supports organiques. 9/33585
11
Tous les supports ont été préalablement autoclaves trois fois à 24 heures d'intervalle pendant 20 minutes à 120°C. Ils ont été humidifiés de façon à permettre un développement optimal du champignon.
Les supports inoculés par les différentes souches de champignons ont été placés en chambre d'incubation à une humidité de 100 % et à une température de 30°C jusqu'à obtention d'un développement satisfaisant des champignons. Leur développement a été évalué visuellement à l'aide d'une échelle qualitative (tableau 2) :
++ : développement moyen
+++ : fort développement (dense et uniforme)
Tableau 2 :
Figure imgf000013_0001
EXEMPLE 2 :
Influence de la granulométrie des copeaux sur la croissance des champignons
a) Objectif :
L'objectif de cet essai était d'évaluer l'influence de la taille des copeaux de bois sur la croissance de Coriolus versicolor 1-1657.
b) Méthodes
Les copeaux de bois utilisés proviennent de la société SPS (Société Parisienne de Sciure, Vénissieux). Trois granulométries différentes en copeaux ont été utilisées afin d'évaluer l'influence de la taille des copeaux sur la croissance des champignons : 9-4,5 mm, 4,5-2,5 mm et 2,5-1 ,8 mm. Les copeaux contiennent à l'origine 10 % d'humidité. Ils ont été stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes et humidifiés à 60% à l'aide d'eau distillée. Ils ont ensuite été inoculés par des fragments de gélose solide recouvert de champignon. Les copeaux sont alors placés dans des chambres de culture saturées en humidité et à une température de 30°C. La croissance des champignons a été évaluée régulièrement au cours du temps à l'aide d'une méthode visuelle.
c) Résultats
Une plus faible croissance du champignon a été observée sur les copeaux de plus faible granulométrie. Cela peut s'expliquer par la mauvaise aération due au tassement des copeaux. La croissance la plus rapide a été obtenue pour les deux granulométries les plus importantes, celles-ci correspondant à la meilleure aération. Dans ces deux derniers cas, la croissance du champignon a été très satisfaisante.
EXEMPLE 3 :
Essai comparatif pour l'inoculation des copeaux par les champignons suivant différentes techniques de stérilisation
a) Objectif : L'objectif de cet essai était d'évaluer l'efficacité de différentes techniques de stérilisation des copeaux permettant d'obtenir une qualité de copeaux microbiologiquement acceptable et réalisable industriellement. Des essais de pasteurisation ont ainsi été lancés afin de mettre au point une solution alternative à l'autoclavage.
b) Méthode :
Les copeaux de bois utilisés proviennent de la société SPS (Société Parisienne, Vénissieux). Ils contiennent à l'origine 10 % d'humidité. Ils ont été humidifiés à environ 60 % (poids/poids) à l'aide de milieu minéral spécifique, comprenant pour un litre de solution :
KH2P04 : 2 g
MgS04 : 0,5 g CaCI2 : 0,1 g
Tartrate d'ammonium : 0,2 g
Eau en quantité suffisante pour 1 I de solution.
Les copeaux ont été stérilisés selon les techniques suivantes : - par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes ;
- par pasteurisation à 65°C pendant 16 heures ou 24 heures ;
- par pasteurisation à 85°C pendant 16 heures ;
- par pasteurisation à 65°C pendant 2 x 16 heures ;
- par pasteurisation à 85°C pendant 2 x 16 heures ; dans le cas des doubles pasteurisations, les deux cycles successifs de 16 heures chacun ont été séparés d'une période de refroidissement de 8 heures afin de favoriser la germination de spores éventuellement encore vivantes.
Ils ont ensuite été inoculés par des fragments de gélose solide recouvert de champignon ou par du mycélium prédéveloppé en culture liquide, puis placés dans des chambres de culture saturées en humidité et à une température de 30°C. Le champignon utilisé est la souche isolée Coriolus versicolor 1-1657. La croissance des champignons a été évaluée régulièrement au cours du temps à l'aide d'une méthode visuelle.
c) Résultats :
Les résultats obtenus en comptant le nombre de points de contamination causée par des champignons indésirables confirment l'efficacité de la pasteurisation en particulier la pasteurisation obtenue à une température de 85°C ou pour deux cycles successifs de pasteurisation de 16 heures quelle que soit la température utilisée (65 ou 85°C). En effet, aucune contamination par un microorganisme étranger n'a été observée pour les cas cités précédemment. La pasteurisation représente donc un moyen efficace pour éliminer les risques de contamination de l'inoculum. Il peut cependant être nécessaire de conduire deux cycles de pasteurisation successifs ou d'augmenter la température de pasteurisation pour une meilleure efficacité.
EXEMPLE 4 :
Traitement biologique de sols contaminés par des substances organiques récalcitrantes
L'efficacité des champignons utilisés a été vérifiée lors d'essais pilote conduits sur des sols pollués historiquement par des HAP. Leur inoculation dans le sol a permis d'améliorer significativement la biodégradation de composés réputés récalcitrants. Les champignons sont introduits dans les sols sur leur support organique (copeaux de bois) à un taux de 20 % (exemple 4a) et 10 % (exemples 4b et 4c).
Le support organique a été inoculé avec du mycélium prédéveloppé sur des grains de céréales (l'inoculation des grains ayant été effectuée initialement par de la gélose solide recouverte de champignons (mycélium prédéveloppé sur de la gélose solide)).
a) Des expérimentations ont été conduites en pilotes de 50 litres sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usine à gaz. L'efficacité des souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 1596 mg/kg répartis de la façon suivante : 431 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 774 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 274 mg/kg pour les HAP à cinq cycles et 117 mg/kg pour les HAP à six cycles. Les champignons ont été inoculés à un taux de 20 % et les paramètres environnementaux (humidité, température et, éventuellement apport de nutriments) ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Des pourcentages de biodégradation égaux à 73 % pour les HAP à trois cycles, 47 % pour les HAP à quatre cycles, 15 % pour les HAP à cinq cycles et 25 % pour les HAP à six cycles ont été obtenus après seulement un mois d'incubation en pilote en présence de Coriolus versicolor 1-1657 (voir figure 1 ). La biodégradation des HAP totaux a représenté environ 50 % après un mois de traitement. Dans le même temps, la microflore indigène en étant pourtant stimulée n'avait dégradé que très faiblement les HAP, la concentration finale atteinte n'étant pas significativement différente de la concentration initiale en HAP totaux. Dans ce cas, seuls les HAP à trois et quatre cycles ont été dégradés, mais leurs pourcentages de disparition n'ont été que de 19 et 16 % respectivement. Les méthodes analytiques utilisées pour tous nos essais ont été validées préalablement et ont classiquement consisté pour cet exemple en une extraction au C02 supercritique suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse.
b) Des essais ont été conduits en pilotes de 50 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration de 1092 mg/kg répartis de la façon suivante : 122 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 652 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 318 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignon Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30°C et l'humidité du sol à 70 % de la teneur en eau utile du sol. Des pourcentages de biodégradation égaux à 75 % pour les trois cycles, 50 % pour les quatre cycles, 38 % pour les cinq et six cycles dont 46 % pour le benzo(a)pyrène, ont été obtenus après seulement cinq semaines d'incubation en pilote en présence de la souche Coriolus versicolor 1-1657 (voir figure 2). La biodégradation en HAP totaux a atteint 49 % après seulement cinq semaines d'incubation. Dans le même temps, la microflore indigène biostimulée n'a dégradé que très faiblement les HAP, le pourcentage de biodégradation atteint en fin d'essai étant à peine supérieur à 10 %. Après huit semaines d'incubation, les résultats obtenus avec la microflore indigène biostimulée n'avaient guère évolué, avec des pourcentages de biodégradation de 18, 21 , 6 et 17 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux. Il est important de noter que le pilote témoin microflore indigène avait également été inoculé avec des copeaux stériles identiques à ceux utilisés pour la préparation de l'inoculum de champignon et cela à un taux de 10 % (poids/poids).
Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEX ASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux microorganismes indigènes (bactéries et champignons) est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodégrader.
c) Des essais ont été conduits en pilotes de laboratoire de 2 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 7602 mg/kg répartis de la façon suivante : 3903 mg/kg pour les HAP à deux et trois cycles, 3233 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 466 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignons Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30°C et l'humidité du sol à 70 % de la teneur en eau utile du sol. Des pourcentages de biodégradation égaux à 49 % pour les trois cycles, 26 % pour les quatre cycles, 34 % pour les cinq et six cycles dont 44 % pour le benzo(a)pyrène, ont été obtenus après seulement huit semaines d'incubation en présence de la souche Coriolus versicolor 1-1657. La biodégradation en HAP totaux a atteint 38 % après huit semaines d'incubation. Dans le même temps, la microflore indigène biostimulée n'a dégradé que très faiblement les HAP, le pourcentage de biodégradation atteint en fin d'essai étant équivalent à 25, 9, 0 et 16 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux (voir figure 3).
Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEXASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux autres microorganismes est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodégrader (voir figure 4).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de traitement d'un matériel contaminé par des composés polluants récalcitrants comprenant les étapes suivantes :
1) un support organique lignifié choisi parmi des copeaux de bois, des écorces d'arbres ou des rafles de maïs subit un traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques ;
2) ledit support ainsi traité est inoculé avec une souche de champignons de la famille des polyporales, ladite souche étant sous la forme a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide, ou (ii) sur des grains de céréales ; 3) l'inoculum de champignons obtenu est incubé dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support ;
4) l'inoculum de champignons sur support organique issu de l'étape 3) est introduit dans le matériel contaminé.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel ledit support organique lignifié est formé de copeaux de bois, de préférence de granulométrie supérieure à 4,5 mm.
3. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel ledit support organique lignifié est formé de rafles de maïs.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques est réalisé par pasteurisation pendant un ou deux cycles de 8 à 30 heures, à une température comprise entre 50 et 100°C.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques est réalisé par pasteurisation à une température comprise entre environ 65 et environ 85°C, pendant un ou deux cycles de 16 heures.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champignon est pré-inoculé sur des grains de céréales stérilisés par trempage dans l'eau, cuisson aux environs de 100°C pendant 30 à 60 minutes, de préférence 45 minutes, puis autoclavage de 110 à 130°C, de préférence à environ 120°C pendant 20 à 240 minutes, de préférence de 100 à 200 minutes et est incubé dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur lesdits grains, préalablement à l'inoculation sur ledit support organique lignifié.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel un agent abrasif, une source de nutriment et/ou un correcteur de pH sont ajoutés aux grains de céréales.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel du plâtre ajouté immédiatement avant l'autoclavage à une concentration comprise entre environ
0,5 % et environ 10 % (masse/masse), joue le rôle d'agent abrasif, de source de nutriment et de correcteur de pH.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit support organique est inoculé avec une souche de champignons de la famille des polyporales, ladite souche étant sous la forme de mycélium prédéveloppé sur des grains de céréales, à un taux d'environ 1 % à environ 20 %, de préférence 2 à 10 % (poids de grains/poids du support organique).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champignon est la souche Coriolus versicolor déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM sous la référence 1-1657 ou l'un de ses dérivés.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'inoculum préparé selon les étapes 1) à 3) telles que définies dans l'une des revendications 1 à 10, est introduit dans ledit matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 %, de préférence entre 5 et 20 %, en poids.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit matériel contaminé est un sol.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).
14. Utilisation de l'inoculum préparé selon les étapes 1) à 3) telles que définies dans l'une des revendications 1 à 10 pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans un matériel contaminé.
15. Utilisation selon la revendication 14 dans laquelle l'inoculum préparé selon les étapes 1) à 3) telles que définies dans l'une des revendications 1 à 10, est introduit dans ledit matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 %, de préférence entre 5 et 20 %, en poids.
16. Utilisation selon l'une des revendications 14 ou 15 dans laquelle ledit matériel contaminé est un sol.
17. Utilisation selon l'une des revendications 14 à 16, dans laquelle lesdits composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).
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