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WO1999018123A1 - Utilisation des bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires dans le traitement des maladies neurologiques d'origine immunitaire - Google Patents

Utilisation des bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires dans le traitement des maladies neurologiques d'origine immunitaire Download PDF

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Publication number
WO1999018123A1
WO1999018123A1 PCT/FR1998/002136 FR9802136W WO9918123A1 WO 1999018123 A1 WO1999018123 A1 WO 1999018123A1 FR 9802136 W FR9802136 W FR 9802136W WO 9918123 A1 WO9918123 A1 WO 9918123A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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cys
lys
ktx
seq
represent
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1998/002136
Other languages
English (en)
Inventor
Marcel Crest
Maurice Gola
Evelyne Beraud
Jurphaas Van Rietschoten
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to EP98949027A priority Critical patent/EP1021461A1/fr
Priority to CA002305786A priority patent/CA2305786A1/fr
Priority to AU95442/98A priority patent/AU9544298A/en
Priority to JP2000514930A priority patent/JP2001519356A/ja
Publication of WO1999018123A1 publication Critical patent/WO1999018123A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae

Definitions

  • the present invention relates to the use of inhibitors (or blockers) of potassium channels as therapeutic agents for neurological diseases with an immune component in which a blockage of nerve conduction occurs, and in particular multiple sclerosis (MS).
  • MS multiple sclerosis
  • MS is the most common human demyelinating disease of the nervous system with an average prevalence of 5 to 300 / 100,000 inhabitants. It affects young adults and 1.5 to 2 times more often women.
  • the geographic distribution of MS is not uniform since its prevalence increases with latitude, according to three areas of low, medium and high risk. The peak of prevalence is located in regions between 45 ° and 60 ° north latitude, therefore in particular in Northern Europe.
  • the clinical and pathological data for MS are as follows.
  • MS is due to a progressive destruction of the myelin sheaths of the axons of the central nervous system, without axonal degeneration, accompanied by a glial scar.
  • the injured myelin is not or little reconstituted by glial cells (oligodendrocytes), which accentuates the progression of the disease.
  • Histopalhological examination reveals the existence of inflammatory infiltrates in the white matter and the dissemination of lesions gives an account of the polymorphism of the symptoms. These inflammations are accompanied by disorders of nerve conduction, the conduction blocks, which are at the origin. of the loss of (nei vuscs anointings
  • the lesions are formed by infiltration of monocytes, B and T lymphocytes (majority) and by demyelination plates.
  • T lymphocytes predominantly express receptors for interleukin 2 and HLA molecules, witnesses of cell proliferation.
  • Resident cells, astrocytes, microglial cells and capillary endothelial cells also express HLA class II molecules, which indicates an inflammatory reaction in the brain. Inflammation is particularly harmful in the central nervous system, generating compressions, demyelination lesions, disturbances of the nerve impulse.
  • demyelination is the appearance of conduction blocks due to the disruption of the activity of the ion channels responsible for nerve impulses in the axons.
  • aminopy ⁇ dines are not very selective and touch a large number of potassium channels dependent on the potential and inter alia, those present in the synaptic terminations (Sherrat, Bostock and Sears, 1980) These are Kv channels of Kvl type. l, Kvl .2, Kvl 3, Kvl 4, Kvl 5 but also channels of another genetic family, channels Kv3 1 and v3 4 Blocking these channels facilitates the release of excitatory neuromediators and induces numerous peripheral side effects and central (Bever, 1994)
  • Aminopy ⁇ dines-based therapies aim to treat neurological symptoms At the concentrations used and because of the duration of the treatments, they induce side effects due to their lack of specificity
  • margatoxin a molecule derived from scorpion venom
  • no effect of blocking of the neural Kv channels is described or suggested in this US patent
  • the present invention aims to provide compounds acting on a limited number of neural Kv channels, while ensuring high efficiency in neurological pathologies in which the immune system is involved and a blockage of nerve conduction occurs, without for as much engendered the side effects observed within the framework of thei apeutic tests of the compounds of aerial art
  • the present invention also aims to provide new pharmaceutical compositions which can be used in the context of ti alternate pathologies immunological components associated with a blockage of neon conduction, in particular of MS
  • the subject of the present invention is the use of compounds which inhibit the neural potassium channels Kvl. l, Kv l 2, and lymphocyte potassium channels Kv l. 3, for the preparation of medicaments intended for the treatment of neurological diseases with an immune component in humans or animals, in which blockage of nerve conduction occurs.
  • the compounds used in the context of the present invention are further characterized in that they have an inhibitory effect on the neuronal potassium channels Kvl. l and Kvl .2 potential dependent, located in Ranvier nodes (said neural channels being described in particular in the following articles: McNamara et al., 1996; Wang et al., 1994), and an inhibitory effect on potassium dependent channels of the Kvl .3 potential that is found in lymphocytes (said lymphocyte channels being described in particular in Chandy and Gutman, 1994; Grissmer et al., 1994).
  • potassium channels dependent on the potential in what precedes and what follows, one understands membrane proteins selectively permeable to potassium ions and whose permeability to this ion depends on the potential of the cell.
  • the flow of potassium ions through the channel constitutes a potassium current.
  • the characteristics of the relationship between potassium current and cell potential have been described by St ⁇ hmer et al. (1989) for the currents Kv l. l, Kv l .2 and Kvl .3.
  • the sequence of the main protein subunit ( ⁇ subunit) constituting the Kvl potassium channels. l, Kvl .2 and Kvl .3 is also described in this article.
  • the classification of potential-dependent potassium channels is also explained in the review by Chandy and Gutman (1994).
  • inhibitors (or blockers) of potassium channels dependent on the potential in what precedes and what follows, one understands any molecule able to limit the potassium current through a potassium channel by a direct action on the channel.
  • the blocking is carried out by obturation of the external part of the channel.
  • the measurement of blockage of potassium channels by the compounds of the invention can be carried out by the method of the imposed potential such as that described in the article Crest et al. 1992, mentioned above
  • the central neurological pathologies with inflammatory inflammation of the brain and spinal cord in particular multiple sclerosis and diseases related (Balo, Devic. acute disseminated encephalitis and hemorrhagic, isolated optic neuropathies);
  • peripheral inflammatory or related pathologies in particular: acute and chronic polyradiculoneuritis, neuropathies linked to infectious diseases and coliagenoses, degenerative neurological pathologies, in particular amyotrophic lateral sclerosis, neuropathies with conduction block, tumor pathologies, primary or secondary, associated with a dysregulation of the immune system.
  • the invention also relates to the aforementioned use of the compounds described above in the context of the treatment of other central cerebral and spinal cord injuries, in particular pathologies of metabolic origin, ischemic arterial, venous and hemorrhagic vascular pathologies, traumatic pathologies, as well as central complications of systemic diseases, especially circulatory, such as Beheet, Sarcoidosis, and other vasculitides.
  • the invention more particularly relates to the use of peptide compounds as described above, inhibiting the neuronal potassium channels, Kvl. l, Kvl .2, and the lymphocyte channels Kvl .3, said compounds being derived from scorpion venoms or sea anemones, for the preparation of medicaments intended for the treatment of neurological diseases with component mentioned above, with exclusion of the use of margatoxin in the treatment of neurological diseases with an immune component, such as MS.
  • an immune component such as MS.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of peptide compounds derived from scorpion venoms, or of compounds derived from the latter, these compounds or derivatives comprising the amino acid sequence corresponding to the following general formula (I) below:
  • - ni, and n2. independently of each other, represent zero or 1.
  • AA25, AA28, AA31, AA39, and AA40 independently of each other, represent any natural or unnatural amino acid.
  • the invention relates more particularly to the use, as compound of formula (II), noxiustoxin (such as derived from the scorpion venom called
  • AAg AA7, AA9, AAJO, AA12, AA1, AA15, AA 16, ⁇ A 17, ⁇ A22- AA24, AA31, AA33, AA35, AA38 and AA39, independently of each other, represent any natural amino acid or not,
  • the invention more particularly relates to the abovementioned use, as compounds comprising the sequence represented by the mule law (111) defined above, of kaliotoxin (KTX), or of peptide or pseudopeptide derivatives of KTX
  • Kaliotoxin is a 38-amino acid peptide with the following amino acid sequence GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK (still corresponding to the sequence SEQ ID NO 2 shown below) This sequence was for the first time published in 1992 in the article, Crest et al, 1992, J of Biological Chemistry, vol. 267, pl640- 1647
  • peptide or pseudopeptide derivatives of KTX we mean compounds deriving from KTX by addition or deletion of one or more amino acids, or by replacement of one or more amino acids with natural amino acids or no, said derivatives of kaliotoxin possessing the property of the latter of inhibiting the neuronal potassium channels Kvl. l and Kvl.2, as well as the above-mentioned potassium channels Kvl .3.
  • - na, nb, and ni independently of each other, represent 0 or 1, - AA3, AA5, AA7, AA9, AA10 " AA12, AA13, AA15, AA16, AA17,
  • AA2 represents a glycine
  • AA5 represents a proline
  • AA7 represents a seine
  • AA9 i represents a lysine
  • AA J Q represents a histidine.
  • the invention also relates to the aforementioned use of KTX drugs comprising the aforementioned (ormule (III) and more particularly corresponding to formula (IV) defined above, in which ni represents 0 or 1, and
  • a 17 represents aminobuty ⁇ que acid (Abu), - and / or, at least one of AA24 or AA31 represents a norleucine residue
  • AA17 represents ammobuty ⁇ que acid (Abu) or valine, and / or
  • AA24 and AA31 represent, independently of one another, methiomne or norleucine.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of derivatives of the KTX of formula (IV) defined above, in which ni represents 0 or 1, and
  • AA j has AA7 AA9, AA J Q ⁇ A 15 AA33 AA3 and ⁇ A38 ⁇ A40 independently of each other, they represent any natural or unnatural amino acid
  • KTX derivative with a modified ⁇ helix represents by the sequence SEQ ID NO 9, in which, unlike KTX.
  • AA ⁇ 2 represents a lysine
  • AA 13 represents a glutamic acid
  • AA15 represents a tryptophan
  • AA j g represents a serine
  • AA17 represents a valine
  • AA22 represents a tyrosine
  • KTX derivative designated (P12 / K, P17 / V, F22) KTX corresponding to the amino acid sequence SEQ ID NO 10, in which, unlike KTX, AA 2 represents a lysine, AA JJ represents a valme , and AA22 represents a phenylalamne
  • the invention also relates to the aforementioned use of peptide compounds derived from sea anemones, or peptide or pseudopeptide derivatives of these compounds (namely compounds derived from the latter by addition or removal of one or more amine acids, or by replacing one or more amino acids with natural or unnatural amino acids), said derivatives having the property of compounds derived from sea anemones of inhibiting the neuronal potassium channels Kvl 1 and Kvl 2, as well as the lymphocyte potassium channels Kvl 3 above, these compounds or derivatives comprising the amino acid sequence corresponding to the following general formula (VI) below
  • a more particular subject of the invention is the above-mentioned use of the peptide compounds of formula (VI) following BgK co ⁇ espondant to the amino acid sequence SLQ ID NO 1 1 (such as derived from the sea anemone designated Bunodosoma gian lifeia) the SK corresponding to the amino acid sequence SCQ ID NO 12 (as derived from the met anemone designated Sluh ⁇ chu txla eliantlms) kaliseptin corresponding to the amino acid sequence SEQ ID NO 13 (such as from the sea anemone designated Anemonia sulcata)
  • the subject of the invention is also any pharmaceutical composition, characterized in that it comprises one or more peptide compounds as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions of the invention are in a form which can be administered by intravenous, intramuscular, anal or subcutaneous routes, in particular at a rate of approximately 0.05 to approximately 1 mg / kg, or approximately 0.5 mg / kg to about 1 mg / kg, 1 to 3 times a day.
  • Preferred pharmaceutical compositions are those containing kaliotoxin or its derivatives, in particular kaliotoxin 3, in the context of the treatment of MS.
  • Other preferred pharmaceutical compositions are those containing the compound (P12 / Abu, P17 / Abu) KTX, in the context of the treatment of MS.
  • the invention also relates to the KTX derivatives, as defined above, and corresponding to the following formula (IV):
  • na, nb, and ni independently of each other, represent 0 or 1.
  • AA - or AA2 represents a glycine
  • AA5 represents a proline
  • AA7 represents a sequence
  • AA9 represents a lysine
  • AA IQ represents an histidine
  • AA d? represents a glycine
  • AA j represents an isoleucine.
  • AA24 or AA31 i represents a norleucine residue
  • AA2 represents a glycine
  • AA5 represents a proline
  • AA7 represents a serine
  • AA9 represents a lysine.
  • AAI Q represents a histidine.
  • AA ⁇ 2 represents a glycine
  • AA J ⁇ represents an isoleucine, in particular kaliotoxin 3 corresponding to the amino acid sequence SEQ ID NO 4, or
  • KTX 6-37 represented by SEQ ID NO 6.
  • Cys-AA36-Cys-AA3g-AA39-AA40 (V) in which AA1 to AA7, AA9, AAI Q, AA15, AA33, AA3.5, and AA3 to AA40, independently of each other, represent any natural amino acid or not.
  • AA j 2 represents a lysine
  • AA 13 represents a glutamic acid
  • AA15 represents a tryptophan
  • AA [6 represents a serine
  • AA17 represents a valine.
  • AA22 represents a tvrosine.
  • the derivative of KTX designated (P12 / K, P17 / V, F22) KTX corresponding to the amino acid sequence SEQ ID NO 10, in which, unlike KTX, AA12 represents a lysine, AA17 represents a valine, and AA22 represents a phenylalamne.
  • the invention also relates to any peptide derived from those described above, in particular by substitution, deletion or addition of one or more amino acids, or any fragment of the peptides described above, said derivative peptides or fragments being capable of blocking the neural potassium channels Kvl. l and Kvl.2, as well as the above-mentioned Kvl.3 lymphocyte potassium channels.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the peptides, or derived peptides, or fragments thereof, described above, as well as their use in the context of the preparation of said peptides, derived peptides, or fragments, by transformation of host cells with vectors containing said nucleotide sequences, culturing the host cells thus transformed, and recovery of the peptides, derived peptides produced
  • Kaliotoxin and its various analogues were synthesized by the solid phase synthesis method using, for the protection of amino acids, either Boc chemistry according to the protocol explained in the article Romi et al., 1993, J of Biological Chemistry , vol 268, p 26302-26309. either chemistry
  • the assembly of the amino acids was constructed as of HOBt-ester or by coupling with the HBTU reagent
  • the cleavage and deprotection of the side chains of the amino acids were carried out either in HF medium or in the presence of TFA ditteients traps a p-cresol, ethanedithiol, thioanisole or phenol radicals
  • the peptides were placed in reoxidation in the presence of a T ⁇ s-HCl buffer in contact with air.
  • the constitution of the disulfide bridges and the restructuring of the molecules were monitored by HPLC.
  • the oxidized peptides were purified by preparative HPLC and characterized by: analytical HPLC, analysis of amino acids, mass spectrometry, and by various biological tests: electrophysiology, toxicity in mice, fixation on their receptors.
  • the physico-chemical characteristics are as follows. amorphous white lyophilized powder, of great solubility in water (> 10 mg / ml), storage at 4 ° C in the lyophilized state and at -20 ° C in solution in water.
  • T lymphocytes are maintained in culture by alternating cycles of antigen activation and amplification cycles in growth medium containing 10% of "T cell growth factoi s "(TCGF)
  • the antigenic activation is carried out by cultivating 3x10 4 LcT with 2x10 ⁇ cells presenting the antigen, the basic protein of myelin (PBM) (10 mg / ml) / 200 ml stimulation medium / microplate well After 48 hrs, a radioactive DNA precursor (H3-Tdr.
  • EAE is induced by adoptive transfer of T lymphocytes (LcT) specific for the basic myelin protein (PBM).
  • LcT T lymphocytes
  • PBM basic myelin protein
  • T lymphocytes come from a CD4 + T cell line, Thl, "PAS”, derived from Lewis rats; they are activated by PBM 48 hours before being injected into normal syngeneic recipients.
  • Five groups (A to E) of 5 Lewis rats aged 10 weeks, 200 g (Charles River) receive this 2 to 5 million LcT (T PAS line) specific for the basic myelin protein PBM intraperitoneally on day 0 (D0).
  • KTX 0.8 and 8 ⁇ g / 0.1 ml PBS / rat
  • a control group (group A) receives instead of KTX, 1 ml of PBS.
  • Group D rats receive 8 ⁇ g of KTX after the appearance of clinical signs of EAE.
  • the rats of group E receive on day 0 LcT pretreated with KTX in vitro (100 ng / ml) and daily 8 ⁇ g of KTX until D6.
  • the rats of the sixth group (F) receive only KTX (8 ⁇ g) from D0 to D6.
  • Another experiment was carried out by testing KTX at different doses: 0.8, 8, 16 and 32 ⁇ g / rat / day.
  • the highest dose (32 ⁇ g) was injected once or twice in 0.1 or 1 ml of PBS.
  • the route of administration was subcutaneous; it was compared to the intravenous route in one experiment.
  • the clinical observation of the animals was carried out 1, 2 or 4 times a day.
  • the rats are observed and weighed daily.
  • the clinical signs of EAE (identical to those obtained by active induction) are noted from 0 to 4. as follows (after Bourdoulous et al., 1995) -
  • the average clinical EAE is obtained by adding together the clinical signs of maximum intensity of each rat; rats showing no signs are included and scored 0 Weight loss takes into account the minimum and maximum weight of each rat during the 6 days of treatment
  • the optic nerve is removed from Lewis rats and placed in a perfused, oxygenated and thermostated chamber at 36 ° C.
  • the recording of the overall activity of the axons is carried out using a suction electrode serving to contain a end of the nerve
  • a second identical electrode, placed at the other end, is used to stimulate the nerve (stimulation giving a maximum response 0 1 ms, 10 to 30 V)
  • the controls carried out, the preparation is put in the presence of lymphocytes reactive against myelin basic protein (2 10 ⁇ cells / ml) maintained in a DMEM culture medium.
  • the detection in the CNS of the evoked potentials by stimulation applied to a hind paw of a rat makes it possible to evaluate the functional state of the ascending fibers of the brainstem.
  • the detection is done at the thalamic level.
  • the metal electrodes are implanted permanently under stereotaxic control. , two in the ventro-postero-lateial thalamic nucleus and two others on the scalp.
  • the animal being anesthetized with chloral (0.1 g / rat), the stimulation of the right hind paw is carried out using a bracelet encircling the leg and containing two conductors
  • the threshold stimulation (2 ms. 25 to 60 V) is detected visually by a reflex contraction
  • the evoked potentials are obtained by means of around fifty stimulations repeated every 5s
  • the Kv3.1 channel is insensitive (IC50> 1 ⁇ ).
  • other authors have shown that the neural channels Kvl .5 and Kv 3.1 are insensitive to KTX (Grissmer et al, 1994).
  • This activity profile ideally corresponds to the load plan set in the context of the present invention: high affinity for the Kvl .3 lymphocyte channel; high and selective affinity for Kvl axonal Kvl channels. l and Kvl.2, compared to other neural channels.
  • This activity profile is ideal for combining an effective immunosuppressive effect and a neurological effect oriented on axonal conduction which may make it possible to avoid the epileptogenic effects of aminopyridines.
  • Results Analysis shows that. From a clinical point of view, the treatment of rats systemically with KTX (8 and 0.8 ⁇ g) from day 0 to day 6 considerably reduces the severity of the disease and abolishes mortality. The remission is complete in less than 10 days. Even more significant are the results of group D treated after the appearance of clinical signs with 8 ⁇ g of KTX and only for 2 days. The clinical signs do not exceed an average severity of 1.1 and regress rapidly. Conclusion: Treatment of Lewis rats with KTX from the day of the adoptive transfer reduced the severity of EAE and weight loss. Treatment with KTX as soon as clinical signs appear, for only one to three days, constitutes an effective treatment for EAE (see Table 1).
  • EAE is induced in Lewis rats by intraperitoneal injection of 2 to 5 million “PAS” T lymphocytes activated by PBM on day 0.
  • KTX is injected subcutaneously in PBS as soon as clinical signs appear, for 1 to 3 days.
  • the average clinical EAE is obtained by adding together the clinical signs of maximum intensity of each rat evaluated according to the scale of Sommer et al. (Nature Med. 1995, 1: 247).
  • n represents the number of rats per group. Statistical analysis is performed by the Mann and Whitney test.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires pour la préparation de médicaments destinés au traitement de maladies neurologiques à composante immunitaire chez l'homme ou l'animal dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse. L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques, ainsi que de nouveaux bloqueurs des canaux potassium, et leurs utilisations dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées.

Description

UTILISATION DES BLOQUEURS DES CANAUX POTASSIUM NEURONAUX ET LYMPHOCYT AIRES DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES NEUROLOGIQUES D'ORIGINE IMMUNITAIRE
La présente invention concerne l'utilisation d' inhibiteurs (ou bloqueurs) des canaux potassium comme agents thérapeutiques des maladies neurologiques à composante immunitaire dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, et en particulier la sclérose en plaque (SEP). La sclérose en plaque (SEP) est la plus fréquente des maladies humaines démyélinisantes du système nerveux avec une prévalence moyenne de 5 à 300/100 000 habitants. Elle atteint l'adulte jeune et 1 ,5 à 2 fois plus souvent les femmes. La répartition géographique de la SEP n'est pas uniforme puisque sa prévalence augmente avec la latitude, selon trois zones de risque faible, moyen et fort. Le pic de prévalence se situe dans les régions comprises entre 45° et 60° de latitude nord, donc en particulier en Europe du Nord.
L'évolution de la maladie se fait en poussées, avec apparition de lésions neuronales pouvant altérer des fonctions motrices et sensitives, la vision, l'équilibre et le contrôle des sphincters. Dans 50 à 60% des cas, une phase progressive de plus en plus invalidante s'installe au bout d'une dizaine d'années mais ces formes progressives apparaissent aussi d'emblée dans 15% des cas.
La prévalence relativement élevée de cette maladie, associée à son caractère progressif pénible et invalidant, expliquent les efforts de la communauté scientifique pour améliorer la vie des patients. Ainsi entre 1993 et 1996, 2400 références relatives à la SEP ont été publiées par des journaux spécialisés.
Les données cliniques et anatomo-pathologiques de la SEP sont les suivantes.
La SEP est due à une destruction progressive des gaines de myéline des axones du système nerveux central, sans dégénérescence axonale, accompagnée d'une cicatrice gliale. l'ensemble formant la plaque de sclérose La myéline lésée n'est pas ou peu reconstituée par les cellules gliales (oligodendrocytes), ce qui accentue l'évolution de la maladie. L'examen histopalhologique icvèle l'existence d' infiltrats inflammatoires dans la substance blanche et la dissémination des lésions rend compte du polymorphisme des symptômes Ces inflammations s'accompagnent de troubles de la conduction nerveuse, les blocs de conduction, qui sont à l'origine de la perte des (onctions nei veuscs
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGI-E 26) Lors des phases actives de la maladie, on observe dans le liquide céphalo- rachidien la présence d'un nombre anormal de lymphocytes T et à un degré moindre, de lymphocytes B, une élévation de la concentration des immunoglobulines (IgG) dirigées contre différents antigènes viraux, et surtout dans certains cas des anticorps dirigés contre les oligodendrocytes et contre la protéine basique myélinique. Aucun agent infectieux n'a pu être, à ce jour, formellement et systématiquement impliqué.
Les lésions sont formées par des infiltrations de monocytes, de lymphocytes B et T (majoritaires) et par des plaques de demyélinisation. Les lymphocytes T expriment majoritairement des récepteurs pour l'interleukine 2 et des molécules HLA, témoins d'une prolifération cellulaire. Les cellules résidentes, astrocytes, cellules microgliales et les cellules endothéliales des capillaires, expriment aussi les molécules HLA de classe II, ce qui témoigne d'une réaction inflammatoire dans le cerveau. L'inflammation est particulièrement nocive dans le système nerveux central, en générant des compressions, des lésions de demyélinisation, des perturbations de l'influx nerveux. L'une des conséquences aggravantes de la demyélinisation est l'apparition de blocs de conduction dus au dérèglement de l'activité des canaux ioniques responsables de l'influx nerveux dans les axones. Les thérapies actuelles de la SEP dérivent de traitements appliqués à diverses formes d'encéphalomyélites allergiques expérimentales (EAE) qui sont devenues le modèle essentiel de la SEP, et de médicaments anti-inflammatoires, immunosuppresseurs ou immunomodulateurs utilisés dans les cancers, les transplantations d'organes et d'autres processus inflammatoires Elles sont basées sur l'hypothèse que la SEP est une maladie autoimmune dirigée contre la myéline du SNC. De ce fait, ces thérapies impliquent des traitements, avec l'interféron ou des corticostéroides par exemple, qui interfèrent en priorité avec le système immunitaire pour limiter ou prévenir les processus inflammatoires dans le SNC (Revue par Jacobs et coll , 1994) Les traitements symptomatiques visant à rétablir ou améliorer les fonctions neurologiques déficientes sont peu développés et peu efficaces A l'exception des aminopyπdines. ces traitements ne prennent pas en considération le rôle des canaux potassium dans les blocs de conduction des nerfs démyéhnisés. causes ma|eures des insuffisances sensorielles et motrices Des effets cliniques bénéf iques de bloqueurs des canaux potassium et en particulier des aminopyπdines (4-AP et 3,4-DAP) dans la sclérose en plaque ont été décrits dès 1983 (vou pour i cvues Noseworthy 1993. Polman et Hartung. 1995) L'utilisation des πdιnes est justifiée p<u leui capacité a bloquci les canaux potassium neuronaux et ainsi à faciliter la conduction axonale De tait, les essais cliniques ont montré que la 4-AP et surtout la 3.4-DAP améliorent significativement les symptômes chez certains patients
Cependant, les aminopyπdines sont peu sélectives et touchent un grand nombre de canaux potassium dépendants du potentiel et entre autres, ceux présents dans les terminaisons synaptiques (Sherrat, Bostock et Sears, 1980) Il s'agit des canaux Kv de type Kvl. l, Kvl .2, Kvl 3, Kvl 4, Kvl 5 mais aussi des canaux d'une autre famille génétique, les canaux Kv3 1 et v3 4 Le blocage de ces canaux facilite la libération de neuromédiateurs excitateurs et induit de nombreux effets annexes périphériques et centraux (Bever, 1994)
L'administration soutenue de 4-AP à des patients atteints de SEP a des effets bénéfiques, mais également des effets neurologiques sérieux avec induction de décharges épileptiformes locales ou généralisées (Polman et coll. , 1994) Par ailleurs, l'efficacité des aminopyπdines sur les canaux Kv des lymphocytes T est relativement faible (Ic50 = 200 μM). Ceci explique que la 4-AP (ainsi que la qumidine) se soient révélées incapables d'induire des changements notables dans l'évolution de l'EAE chez le rat Lewis (Uitdehaag et coll , 1994)
Les thérapies a base d'aminopyπdines ont pour but de traiter les symptômes neurologiques Aux concentrations utilisées et du fait de la durée des traitements, elles induisent des effets secondaires dus a leur manque de spécificité
Par ailleurs, la margatoxine, molécule issue du venin de scorpion, est décrite en tant qu' immunosuppresseur susceptible de pouvoir être utilisée dans le cadre du traitement de maladies autoimmunes, ou de la prévention du rejet de greffes (Brevet US 5,494,895) Cet effet immunosuppresseur de la margatoxine tesulteiait de son action de blocage des canaux Kvl 3 des lymphocytes Cependant, aucun effet de blocage des canaux Kv neuronaux n'est décrit ni suggère dans ce brevet US
La présente invention a pour but de fournir des composés agissant sur un nombie limité de canaux Kv neuronaux, tout en assurant une grande eff icacité sui les pathologies neurologiques dans lesquelles le système îmmunitan e est implique et se produit un blocage de la conduction nerveuse, sans poui autant engendi ei les effets secondaires observes dans le cadre des essais thei apeutiques des composes de l'art anteneur La pi esente invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques susceptibles d'être utilisées dans le cadi e du ti alternent des pathologies neui ologiques a composante immunitane associées a un bloctue de la conduction nei veuse, notamment de la SEP La présente invention a pour objet l'utilisation de composés inhibiteurs des canaux potassium neuronaux Kvl . l , Kv l 2, et des canaux potassium lymphocytaires Kv l .3, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de maladies neurologiques à composante immunitaire chez l'homme ou l 'animal, dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse.
Les composés utilisés dans le cadre de la présente invention, sont davantage caractérisés en ce qu'ils possèdent un effet inhibiteur des canaux potassium neuronaux Kvl . l et Kvl .2 dépendants du potentiel, situés dans les noeuds de Ranvier (lesdits canaux neuronaux étant notamment décrits dans les articles suivants : McNamara et coll., 1996 ; Wang et coll. , 1994), et un effet inhibiteur des canaux potassium dépendants du potentiel Kvl .3 que l'on trouve dans les lymphocytes (lesdits canaux lymphocytaires étant notamment décrits dans Chandy et Gutman, 1994; Grissmer et coll. , 1994).
Par canaux potassium dépendants du potentiel, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend des protéines membranaires sélectivement perméables aux ions potassium et dont la perméabilité à cet ion dépend du potentiel de la cellule. Le flux d' ions potassium à travers le canal constitue un courant potassium. Les caractéristiques de la relation entre le courant potassium et le potentiel de la cellule ont été décrites par Stϋhmer et coll. (1989) pour les courants Kv l . l , Kv l .2 et Kvl .3. La séquence de la sous-unité protéique principale (sous-unité α) constitutive des canaux potassium Kvl . l , Kvl .2 et Kvl .3 est également décrite dans cet article. La classification des canaux potassium dépendants du potentiel est par ailleurs explicitée dans la revue de synthèse de Chandy et Gutman (1994). Par inhibiteurs (ou bloqueurs) des canaux potassium dépendants du potentiel, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute molécule capable de limiter le courant potassium à travers un canal potassium par une action directe sur le canal. Dans le cas particulier de la kaliotoxine, et des autres composés peptidiques (ou pseudopeptidiques) décrits ci-après, le blocage s'effectue par obturation de la partie externe du canal. La mesure du blocage des canaux potassium par les composés de l' invention peut être effectuée par la méthode du potentiel imposé telle que celle décrite dans l 'article Crest et al . 1992, susmentionné
Parmi les pathologies neurologiques, notamment a composante immunitaire, susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer les pathologies neurologiques centrales mflammatoues a localisation cei ebrale et médullaire, notamment la sclérose en plaque cl maladies apparentées (Balo, Devic. encéphalite aiguë disséminée et hémorragiques, neuropathies optiques isolées);
- les pathologies périphériques inflammatoires ou apparentées, notamment: les polyradiculonévrites aiguës et chroniques, les neuropathies liées à des atteintes infectieuses et à des coliagénoses, les pathologies neurologiques dégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies avec bloc de conduction, les pathologies tumorales, primitives ou secondaires, associées à un dérèglement du système immunitaire.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée des composés décrits ci-dessus dans le cadre du traitement des autres atteintes centrales cérébrales et médullaires, notamment les pathologies d'origine métabolique, les pathologies vasculaires ischémiques artérielles, veineuses et hémorragiques, les pathologies traumatiques, ainsi que les complications centrales des maladies de système, notamment circulatoire, tells que Beheet, Sarcoïdose, et autres vascularites.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés peptidiques tels que décrits ci-dessus, inhibant les canaux potassium neuronaux, Kvl . l , Kvl .2, et les canaux lymphocytaires Kvl .3, lesdits composés étant issus de venins de scorpion ou d'anémones de mer, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies neurologiques à composante mentionnées ci-dessus, à l'exclusion de l'utilisation de la margatoxine dans le cadre du traitement de maladies neurologiques à composante immunitaire, telle que la SEP.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques issus de venins de scorpion, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (I) suivante :
Cys- AA9- A A i Q-A A ι \ - AA \ 2- AA [ 3-Cys- A A 15-A A \ - A A \ 7-Cys- A A 19- A A20,- A A21 -( A22)n AA23"AA24"AA25"AA26"A A 7"( AA28)n2"Lys-Cys- A31 - AA32-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys (I)
dans laquelle :
- ni , et n2. indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou 1. - AA9 a ΛA 13, AA15 à AA 17, AA 19 à AA284 AA3 1 <> AA33, e AA3 , indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque, naturel ou non.
L' invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de composés comprenant la séquence en acides aminés de formule (I) dans laquelle ni = n2 = 1 , et représentés par la formule (II) suivante
AA2-AA3-Ile-Asn-Val-Lys-Cys-Thr-Ser-Pro-AAi2-Gln-Cys-AAi5-AAi6-Pro- Cys-Lys-AA20"AA21 -AA22-Gly-AA24-AA25-Ala-Gly-AA28"Lys-Cy S-AA3 - Asn-Gly-Lys-Cys-Lys-Cys-Tyr-AA39-AA4o (II)
dans laquelle AA2, AA3, AA12, AA15, AA^, AA20 à AA22. AA24,
AA25, AA28, AA31 , AA39, et AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation, à titre de composé de formule (II), la noxiustoxine (telle qu'issue du venin de scorpion dénommé
Centrudoides noxius) correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO
1 .
L' invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de composés, comprenant la séquence en acides aminés de formule (I), dans laquelle n2 = 0, lesdits composés comprenant la séquence représentée par la formule (III) suivante:
AA6-AA7-Cys-AA9-AA 10-Ser-AA 12-AA 13-Cys-AA 15-AA 15- A A 17-Cys-Lys- Asp-Ala-(AA22)nrGlv-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-AA3 i-Asn-AΛ33-Lys-
Cys-AA36-Cys-AA38-AA39 (III)
dans laquelle
- AAg, AA7, AA9, AAJO, AA12, AA1 , AA15, AA 16, ΛA 17, ΛA22- AA24, AA31 , AA33 , AA35, AA38 et AA39, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- ni représente zéro ou 1
L' invention a plus particulièrement pour objet l 'utilisation susmentionnée, a titre de composés comprenant la séquence l epresentee par la loi mule (111) définie ci-dessus, de la kaliotoxine (KTX), ou des denvcs peptidiques ou pseudopeptidiques de la KTX
La kaliotoxine est un peptide de 38 acides a inés dont la séquence en acides aminés est la suivante GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK (correspondant encore à la séquence SEQ ID NO 2 représentée ci-après) Cette séquence a été pour la première fois publiée en 1992 dans l 'article, Crest et al, 1992, J of Biological Chemistry, vol. 267, pl640- 1647 Par dérivés peptidiques ou pseudopeptidiques de la KTX, on entend les composés dérivant de la KTX par addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés, ou par remplacement d'un ou plusieurs acides aminés par des acides aminés naturels ou non, lesdits dérivés de la kaliotoxine possédant la propriété de cette dernière d'inhiber les canaux potassium neuronaux Kvl . l et Kvl.2, ainsi que les canaux potassium lymphocytaires Kvl .3 susmentionnés.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de dérivés de la KTX définis ci-dessus, et répondant à la formule (IV) suivante:
[(G1y)na-val-AA3-Ile-AA5]nb-Val-AA7-Cys-AA9-AA1o-Ser-AA12-AA13-Cys- AAi5-AAi6-AAi7-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n G1y-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys-
Cys-AA3 1-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle :
- na, nb, et ni , indépendamment les uns des autres, représentent 0 ou 1 , - AA3, AA5, AA7, AA9, AA10» AA12, AA13, AA15, AA16, AA17,
AA22> AA24, AA31 , AA33, et AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de composés de formule (IV) définie ci-dessus dans laquelle ni = 0, et - nb = l , notamment les composés peptidiques suivants
. la kaliotoxine 2 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, et pour laquelle na = 0, nb = 1 , la kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 4, dans laquelle, à la différence de KTX, AA2 représente une glycine, AA5 représente une proline, AA7 représente une senne, AA9 i eprésente une lysine, AA J Q représente une histidine. AA [2 lepiesente une glycine, et AAjg représente une isoleucine, et pour laquelle na = 0 nb = 1 l'agitoxine 2 correspondant a la séquence en acides aminés SEQ ID NO 5, et pour laquelle na = nb = 1 , - ou nb = 0, notamment la KTX(6-37) lepiesentee pai SEQ ID NO 6 ci pour laquelle na = nb = 0
L' invention a également poui objet l'utilisation susmentionnée de denves de la KTX comprenant la (ormule (III) susmentionnée et plus pai ticuliei ement lepondant a la formule (IV) définie ci dessus, dans lesquelles n i représente 0 ou 1 , et
- l 'un au moins de AA12 ou ^e A 17 représente l'acide aminobutyπque (Abu), - et/ou, l'un au moins de AA24 ou de AA31 lepresente un résidu norleucine
A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée des dérivés de la KTX de formule (IV) définie ci-dessus, dans laquelle ni = 0 ou 1 , et - AA12 représente l'acide aminobutyπque (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide ammobutyπque (Abu) ou la valine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthiomne ou la norleucine.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de dérives de la KTX de formule (IV) définie ci-dessus, dans laquelle ni représente 0 ou 1 , et
- l'un au moins de AA12 ou de AA - représente l'acide aminobutyπque (Abu), notamment les composes de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb = 1 , et AA12 et AA17 représentent Abu, tel que le dérive de KTX désigne (P12/Abu, P17/Abu)KTX représente par SEQ ID NO 7,
- et/ou l'un au moins de AA24 ou de AA31 représente un résidu norleucine, notamment les composes de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb — 0, AA12 et AA17 représentent Abu, et AA24 et AA31 représentent un résidu norleucine, tel que le dérive de KTX désigne Kaline ledit dérive étant représente par SEQ ID NO 8 , ou les dérives de la KTX de formule (IV) dans laquelle ni = 1 . na = nb = 1 , et repondant à la formule (V) suivante
AAι -AA2-AA3-AA4-AA5-AA(3-AA7-Cys-AA9-AA ιo-Seι -Abu-Gln-Cys-AA i5-
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe Gly-Lys-Cys-Nle Asn AA33-LVS Cys-AA3(3-Cys-AA3g-AA39-AA40 (V)
dans laquelle AA j a AA7 AA9, AA J Q ΛA 15 AA33 AA3 et ΛA38 <ι A40 indépendamment les uns des auties l epresentent un acide amme quelconque naturel ou non
L' invention a également plus particulièrement pour objet 1 utilisation susmentionnée de dei n es de l<ι KTX compi enant la toi mule (III) susmentionnée et plus paiticulierement repondant a la formule (IV) définie ci-dessus, dans lesquelles ni = 1 , notamment ceux pour lesquels na = nb = 1 , tels que
- le dérive de KTX a hélice α modifiée représente par la séquence SEQ ID NO 9, dans laquelle, a la différence de KTX. AA ^2 représente une lysine, AA 13 représente un acide glutamique, AA15 représente un tryptophane, AAjg îepresente une serine, AA17 représente une valine, et AA22 représente une tyrosine,
- le dérivé de KTX désigné (P12/K, P17/V, F22)KTX correspondant a la séquence en acides aminés SEQ ID NO 10, dans laquelle, à la différence de KTX, AA 2 représente une lysine, AA JJ représente une valme, et AA22 représente une phénylalamne
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques issus d'anémones de mer, ou de dérivés peptidiques ou pseudopeptidiques de ces composes (à savoir de composes dérivant de ces derniers par addition ou suppression d'un ou plusieurs acides ammes, ou par remplacement d'un ou plusieurs acides aminés par des acides aminés naturels ou non), lesdits dérivés possédant la propriété des composés issus d'anémones de mer d' inhiber les canaux potassium neuronaux Kvl 1 et Kvl 2, ainsi que les canaux potassium lymphocytaires Kvl 3 susmentionnés, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés repondant a la formule générale suivante (VI) suivante
( AA 1 )nι -( AA2)n2-Cys-AA4-Asp-AA6-AA7-AAg-AA9-AA \ o-AA γ \ -Cys- (AA 13)n3-AA14-(AA15)n4-AA16-(AA17)n5-AA18-(AAI9)n6-AA20-Cys- AA22-(AA23)n7-Ser-AA25-Lys-Tyr-AA28-(AA29)n8-AA30-cys-AA32-Lys
Thr-Cys-AA36-AA37-Cys (VI)
dans laquelle
- ni à n8, indépendamment les uns des autres, représentent zéro ou 1 - AA2, AA2, AA4, AA<3 a AAn , AA22 AA23> AA25* AA28
AA30. AA32, AA36 et AA37, indépendamment les uns des autres î epi esentent un acide aminé quelconque naturel ou non
L' invention a plus particulièrement pour objet I utilisation susmentionnée des composes peptidiques de formule (VI) suivants la BgK coπ espondant a la séquence en acides aminés SLQ ID NO 1 1 (telle qu issue de l'anémone de mer désignée Bunodosoma gian lifeia) la S K correspondant a la séquence en acides aminés SCQ ID NO 12 (telle qu issue de I anémone de met désignée Sluhυchu txla eliantlms ) la kaliseptine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 13 (telle qu' issue de l 'anémone de mer désignée Anemonia sulcata)
L' invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs composés peptidiques tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques de l' invention se présentent sous une forme administrable par voies intraveineuse, intramusculaire, anale ou sous-cutanée, notamment à raison d'environ 0.05 à environ 1 mg/kg, ou d'environ 0.5 mg/kg à environ 1 mg/kg, à raison de 1 à 3 prises par jour.
Des compositions pharmaceutiques préférées sont celles contenant la kaliotoxine ou ses dérivés, notamment la kaliotoxine 3, dans le cadre du traitement de la SEP. D'autres compositions pharmaceutiques préférées sont celles contenant le composé (P12/Abu, P17/Abu) KTX, dans le cadre du traitement de la SEP.
L' invention concerne également les dérivés de la KTX, tels que définis ci- dessus, et répondant à la formule (IV) suivante:
[(Gly)na-Val-AA3-Ile-AA5]nb-Val-AA7-Cys-AA9-AA1o-Ser-AA12-AA13-Cys-
AA 15- AA 16-AA \ 7-Cys-Lys- Asp-Ala-( AA22)n 1 -Gly-AA24- Arg-Phe-Gly-Lys- Cys-AA3 i-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle . - na, nb, et ni , indépendamment les uns des autres, représentent 0 ou 1 .
- AA3, AA5, AA7, AA9, AAio- AA12' AA13' A 15, AA ι0. AA 17, AA22, AA24, AA31 , AA33, et AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non, sous réserve que lorsque ni = 0, alors • - nb = 0,
- ou AA2 représente une glycine, AA5 représente une proline. AA7 l epresente une séπne, AA9 représente une lysine, AA I Q l epi esente une histidine. AA j ? représente une glycine, et AA j représente une isoleucine.
- et/ou l'un au moins de AA 12 ou de AA 17 l epresente l ' acide .immobutyπque (Abu).
- et/ou, l'un au moins de AA24 ou de AA31 i cprésente un résidu norleucine L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la KTX de formule (IV), tels que définis ci-dessus, dans laquelle ni = 0, et :
- na = 0, nb = 1 , AA2 représente une glycine, AA5 représente une proline, AA7 représente une serine, AA9 représente une lysine. AAI Q représente une histidine. AA^2 représente une glycine, et AA JÔ représente une isoleucine, notamment la kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 4, ou
- nb = 0, notamment la KTX(6-37) représentée par SEQ ID NO 6. L'invention concerne plus particulièrement les dérivés de la KTX de formule (IV), tels que définis ci-dessus, dans laquelle ni = 0 ou 1, et :
- l'un au moins de AA12 ou de AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu), notamment les composés de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb = 1 , et AA12 et AAi7 représentent l'acide aminobutyrique (Abu), tel que le dérivé (P12/Abu, P17/Abu)KTX représenté par SEQ ID NO 7, - et/ou, l'un au moins de AA24 ou de AA31 représente un résidu norleucine, notamment :
. les composés de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb = 0, AA12 et AA17 représentent l'acide aminobutyrique (Abu), AA24 et AA31 représentent un résidu norleucine, tel que la Kaline représentée par SEQ ID NO 8, ou
. les dérivés de la KTX de formule (IV) dans laquelle ni = 1 , na = nb = 1 , et répondant à la formule (V) suivante :
AA 1 -AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA 1 g-Ser- Abu-Gln-Cys-AA 15- Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys-
Cys-AA36-Cys-AA3g-AA39-AA40 (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AAI Q, AA15, AA33, AA3.5, et AA3 à AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés de la KTX de formule (IV), tels que définis ci-dessus, dans laquelle ni = 1. notamment les composés suivants pour lesquels na = nb = 1 , tels que :
- le dérivé de KTX à hélice α modifiée représenté par la séquence SEQ ID
NO 9, dans laquelle, à la différence de KTX, AAj2 représente une lysine, AA 13 représente un acide glutamique, AA15 représente un tryptophane, AA [6 représente une serine. AA17 représente une valine. et AA22 représente une tvrosine. - le dérive de KTX désigné (P12/K, P17/V, F22)KTX correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 10, dans laquelle, à la différence de KTX, AA12 représente une lysine, AA17 représente une valine, et AA22 représente une phénylalamne. L'invention concerne également tout peptide dérivé de ceux décrits ci- dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides ammés, ou tout fragment des peptides décrits ci-dessus, lesdits peptides dérivés ou fragments étant capables de bloquer les canaux potassium neuronaux Kvl. l et Kvl.2, ainsi que les canaux potassium lymphocytaires Kvl.3 susmentionnés.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les peptides, ou peptides dérivés, ou fragments de ces derniers, décrits ci- dessus, ainsi que leur utilisation dans le cadre de la préparation desdits peptides, peptides dérivés, ou fragments, par transformation de cellules hôtes avec des vecteurs contenant lesdites séquences nucléotidiques, mise en culture des cellules hôtes ainsi transformées, et récupération des peptides, peptides dérivés produits
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples de synthèse des composés de l'invention, et de leurs effets sur un modèle expérimental animal de la SEP
I - Techniques de synthèse
La kaliotoxine et ses différents analogues ont ete synthétises par la méthode de synthèse en phase solide en utilisant, pour la protection des acides aminés, soit la chimie Boc selon le protocole explicité dans l'article Romi et coll., 1993, J of Biological Chemistry, vol 268, p 26302-26309. soit la chimie
Fmoc selon le protocole explicité pour des peptides comparables dans l'article
Kharrat et coll., 1996, Eur J of Biochemistry 42, p 491-498 Les résines utilisées sont à base de polystyrène 1 % divinyl-benzene denvatise en PAM- îésine, paraméthyl-BHA résine, résine HMB, ou résine RINK Les chaînes protectrices des acides aminés sont cyclohéxyl ou t-butyl pour Asp et Glu, benzyl ou t-butyl pour Ser et Thr, carbobenzoxy. tosyl ou tutyl pour His, p- méthylbenzyl, Acm, ou tπtyl pour Cys, xantyl ou tπtyl poui Asn et Gin, tosyl ou Pmc pour Arg et 2Cl-CbZ ou Boc pour Lys L'assemblage des amino-acides a été réalisé sous forme de HOBt-ester ou par couplage avec le reactif HBTU
Le clivage et la déprotection des chaînes latérales des amino-acides ont ete tealises soit en milieu HF, soit en présence de TFA
Figure imgf000014_0001
ditteients pièges a radicaux p-crésol, éthanedithiol, thioanisole ou phénol Les peptides ont été placés en réoxydation en présence d'un tampon Tπs-HCl au contact de l'air. La constitution des ponts disulfures et la restructuration des molécules ont été suivies par HPLC. Les peptides oxydés ont été purifiés par HPLC préparative et caractérisés par : HPLC analytique, analyse d'acides aminés, spectrométπe de masse, et par différents tests biologiques : électrophysiologie, toxicité chez la souris, fixation sur leurs récepteurs.
Les caractéristiques physico-chimiques sont les suivantes . poudre lyophilisée blanche amorphe, de grande solubilité dans l'eau ( > 10 mg/ml), conservation à 4°C à l'état lyophilisé et à -20°C en solution dans l'eau.
Dégradation rapide en milieux oxydant et réducteur, dégradation rapide en milieu basique et acide extrême (< 1).
II - Etude de l'effet des composés de l'invention sur un modèle animal de SEP
A) Méthodologie
1) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux potassium de type Kv L'affinité de la kaliotoxine (KTX) pour les canaux potassium de type Kv a été déterminée par électrophysiologie (potentiel imposé) après expression d'ARN dans l'ovocyte de xénope (Kushner er coll., 1989).
2) Blocage des canaux Kv lymphocytaires par la KTX L'activité des canaux potassium est détermine en enregistrant le courant global d'un lymphocyte à l'aide de la technique de patch-clamp dans la configuration cellule entière.
3) Effets in vitro de la kaliotoxine sur la prolifération d'une lignée lymphocytaire T Des lymphocytes T sont maintenus en culture en alternant des cycles d'activation antigénique et des cycles d'amplification dans du milieu de croissance contenant 10% de "T cell growth factoi s" (TCGF) L'activation antigénique est réalisée en cultivant 3xl04 LcT avec 2x10^ cellules présentatrices de l'antigène, la protéine basique de la myéline (PBM) ( 10 mg/ml) /200 ml milieu de stimulation/puits de microplaque Au bout de 48 hrs, un précurseur radioactif du DNA (H3-Tdr. lmCi/puits) est ajouté , 18 hrs plus tard, les cellules sont récoltées, lysées et le matériel ladioactif incorporé dans l' ADN est compté. Les bloqueurs sont ajoutés au début de l'activation antigénique, pour la durée totale de la culture. Chaque concentration de bloqueur est testée en quadreplicat. Les résultats sont exprimés en moyenne de cpm des 4 échantillons ± écart-type.
4) Effets de la kaliotoxine sur un modèle animal de SEP, l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) induite chez le rat
L'EAE est induite par transfert adoptif de lymphocytes T (LcT) spécifiques de la protéine basique myélinique (PBM). Ces lymphocytes proviennent d'une lignée lymphocytaire T CD4+ , Thl, "PAS", issue de rats Lewis ; ils sont activés par la PBM 48h avant d'être injectés aux receveurs syngéniques normaux. Cinq groupes (A à E) de 5 rates Lewis âgées de 10 semaines, 200 gr (Charles River) reçoivent ce 2 à 5 millions de LcT (lignée T PAS) spécifiques de la protéine basique myélinique PBM par voie intra-péritonéale au jour 0 (J0). Dans les groupes B et C, la KTX (0,8 et 8 μg /0, 1 ml PBS/rat)
(PBS, tampon phosphate) est injectée par voie sous cutanée le même jour et quotidiennement jusqu'au 6° jour (J6). Un groupe contrôle (groupe A) reçoit en lieu et place de KTX, 1ml de PBS. Les rats du groupe D reçoivent 8 μg de KTX après l'apparition des signes cliniques d'EAE. Les rats du groupe E reçoivent au jour 0 des LcT prétraités par KTX in vitro (100 ng/ml) et quotidiennement 8 μg de KTX jusqu'à J6. Les rats du sixième groupe (F) reçoivent uniquement KTX (8 μg) de J0 à J6.
Une autre expérience a été effectuée en testant KTX à différentes doses : 0.8, 8, 16 et 32 μg/rat/jour. La dose la plus élevée (32 μg) a été injectée en 1 ou 2 fois dans 0.1 ou 1 ml de PBS. La voie d'administration a été en sous cutanée ; elle a été comparée à la voie intraveineuse au cours d'une seule expérience. L'observation clinique des animaux a été effectuée 1 , 2 ou 4 fois par jour.
Les rats sont observés et pesés quotidiennement. Les signes cliniques de l'EAE (identiques à ceux obtenus par induction active) sont notés de 0 à 4. comme suit (d'après Bourdoulous et coll. , 1995)-
0 = absence de signes neurologiques.
1 = queue flaccide,
2 = parésie des membres postérieurs pouvant s'accompagner de tremblements,
3 = paralysie flasque des membres postérieurs pouvant s'accompagner d' incontinence, d'hémorragies oculaires et nasales. 4 = état moribond (paralysie des membres supérieurs, troubles îespiratoires)
L'EAE clinique moyenne est obtenue en totalisant les signes cliniques d'intensité maximale de chaque rat; les rats ne présentant pas de signes sont inclus et notés 0 La perte pondérale tient compte du poids minimal et maximal de chaque rat au cours des 6 jours de traitement
5) Levée des blocs de conduction par la kaliotoxine Deux tests ont été retenus Nerf optique de rat in vitro
C'est un nerf du système nerveux central, myéhnisé par des oligodendrocytes couplés à des astrocytes. Le nerf optique est prélevé chez des rats Lewis et placé dans une chambre perfusée, oxygénée et thermostatee a 36°C L'enregistrement de l'activité globale des axones est réalisé à l'aide d'une électrode de succion servant de contention à une extrémité du nerf Une seconde électrode identique, placée à l'autre extrémité, sert à stimuler le nerf (stimulation donnant une réponse maximale 0 1 ms, 10 à 30 V) Les contrôles effectués, la préparation est mise en présence de lymphocytes reactifs contre la protéine basique de la myéline (2 10^ cellules/ ml) maintenus dans un milieu de culture DMEM.
Potentiels évoqués
La détection dans le SNC des potentiels évoques par une stimulation appliquée a une patte arrière d'un rat permet d'évaluer I état fonctionnel des fibres ascendantes du tronc cérébral La détection se fait au niveau thalamique Les électrodes métalliques sont implantées a demeure sous contrôle stéréotaxique, deux dans le noyau thalamique ventro-postero-lateial et deux autres sur le scalp. L'animal étant anesthésié au chloral (0.1 g/rat), la stimulation de la patte arrière droite est réalisée a l'aide d un bracelet ceintuiant la jambe et contenant deux conducteurs La stimulation seuil (2ms. 25 a 60V) est détectée visuellement par une contraction réflexe Les potentiels évoques sont obtenus en moyennant une cinquantaine de stimulations répétées toutes les 5s
B) Résultats
1) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux Kv
Les courbes doses-reponses montrent une sensibilité élevée des canaux Kv l 1 (IC50 = 1 5 nM), Kvl 2 (IC50 = 24 nM) et Kv l (IC50 = 0 1 nM) à la KTX. Le canal Kv3.1 est insensible (IC50 > 1 μ ). Par ailleurs, d'autres auteurs ont montré que les canaux neuronaux Kvl .5 et Kv 3.1 sont insensibles à la KTX (Grissmer et coll, 1994).
Conclusion : Ce profil d'activité correspond idéalement au plan de charge fixé dans le cadre de la présente invention : affinité élevée pour le canal Kvl .3 lymphocytaire; affinité élevée et sélective pour les canaux Kv axonaux Kvl . l et Kvl.2, par rapport aux autres canaux neuronaux.
Ce profil d'activité est idéal pour combiner un effet immunosuppresseur efficace et un effet neurologique orienté sur la conduction axonale susceptible de permettre d'éviter les effets épileptogènes des aminopyridines.
2) Blocage des canaux Kv lymphocytaires par la kaliotoxine Résultats : Sur les diverses lignées lymphocytaires testées, la sensibilité des canaux Kv endogènes s'exprimant constitutivement ou après activation antigénique est caractérisée par un coefficient de dissociation Kd de 1 à 2 nM.
Conclusion : Bien que plus faible, cette sensibilité est en accord avec les données obtenues sur les canaux Kvl .3 exogènes exprimés dans l'ovocyte de xénope.
3) Effets in vitro de la kaliotoxine sur la prolifération d'une lignée lymphocytaire T encéphalitogène.
Résultats : Ceux d'une expérience type sont présentés dans l'annexe 1. Quatre séries d'expériences indiquent que 10 à 50 nM de KTX inhibe à 60% l'incorporation du précurseur radioactif de l'ADN et donc, la prolifération cellulaire.
Conclusion : Ces données confirment le rôle majeur des canaux Kvl .3 dans les phases proliferatives des lymphocytes T et l'efficacité de l'effet immuno-suppresseur de la KTX.
4) Effets de la KTX sur l'EAE induite chez le rat
Résultats : L'analyse montre que. du point de vue clinique, le traitement des rats par voie systémique avec la KTX (8 et 0.8 μg) du jour 0 au jour 6 réduit considérablement la sévérité de la maladie et abolit la mortalité. La rémission est totale en moins de 10 jours. Plus significatifs encore sont les résultats du groupe D traité après l'apparition des signes cliniques avec 8 μg de KTX et seulement pendant 2 jours. Les signes cliniques ne dépassent pas une sévérité moyenne de 1.1 et régressent rapidement. Conclusion : Le traitement de rats Lewis par KTX dès le jour du transfert adoptif réduit la sévérité de l'EAE et la perte pondérale. Le traitement par KTX dès l'apparition des signes cliniques, pendant un à trois jours seulement, constitue un traitement efficace de l'EAE (voir Tableau 1).
Les conditions optimales à retenir dans le cadre de ces expériences sont :
- 32 μg de KTX/rat/jour : dose à laquelle les résultats sont le plus reproductibles,
- injection de KTX dans 1 ml PBS, 1 fois par jour, par voie sous cutanée,
- pesée et examen clinique des animaux une seule fois/jour.
Tableau 1. Traitement de l'EAE adoptive par KTX
1
Score Clinique EAE 1
Contrôle PBS KTX (32 μg) , expérience 1 3 ± 1.8 1.2 ± 0.7 1 n = 5 n = 5 expérience 2 2.5 ± 1.0 1.1 ± 0.35 1
1 n = 7 n = 8 expérience 3 3.6 ± 0.4 2.51 ± 1.5 n = 7 n = 8 expérience 4 2.3 ± 1 1 6 ± 1.3 n = 5 n = 5
L'EAE est induite chez des rats Lewis par injection intrapéritonéale de 2 à 5 millions de lymphocytes T "PAS" activés par la PBM au jour 0.
La KTX est injectée par voie sous cutanée dans du PBS dès l'apparition des signes cliniques, durant 1 à 3 jours. L'EAE clinique moyenne est obtenue en totalisant les signes cliniques d'intensité maximale de chaque rat évalués selon l'échelle de Sommer et al. (Nature Med.. 1995, 1: 247).
"n" représente le nombre de rats par groupe. L'analyse statistique est réalisée par le test de Mann et Whitney.
Ces données sont une confirmation, sur un modèle animal reconnu représentatif de la sclérose en plaques, de l'action anti-inflammatoire et immunosuppressive de la kaliotoxine. De plus, la guéπson des animaux du groupe D susmentionné traité tardivement est un argument indirect en faveur d'une action symptomatique de la KTX sur les canaux Kv du SNC. Cette conclusion est confirmée par les deux tests suivants.
5) Levée des blocs de conduction par la kaliotoxine
Nerf optique de rat in vitro
Résultats : En accord avec les données de Yarom et coll. (1983), l' incubation d'un nerf optique de rat avec des lymphocytes T pré-activés contre la protéine basique de la myéline entraîne, en lh30-2h, un bloc quasi-total du potentiel global dérivé par une électrode de succion. Une restauration partielle de l'activité contrôle peut alors être obtenue 2 à 3 heures après avoir enlevé les lymphocytes. Par contre, l'addition de KTX (100 nM) restaure rapidement (15- 20 min) la capacité de conduction du nerf même en présence des lymphocytes.
Conclusion : Ces expériences valident l'hypothèse que les blocs de conduction dans les fibres centrales démyélinisées peuvent être levés en agissant sur les canaux potassium neuronaux. Elles montrent également que la kaliotoxine, par sa spécificité, exerce cet effet à des concentrations nanomolaires.
Potentiels évoqués Résultats : Sur un animal dont les signes cliniques d'EAE atteignent le niveau 2 (paralysie du train postérieur), les potentiels évoqués par une stimulation électrique de la patte arrière sont retardés et déprimés de 80 à 90% par rapport aux enregistrements contrôle effectués avant l'induction de l'EAE. Une injection sous-cutanée de KTX (10 μg) est suivie d'une récupération progressive de l'amplitude et de la latence des potentiels évoqués. La récupération devient totale en 90 minutes.
Conclusion : Cette expérience menée in vivo montre que les blocs de conduction consécutifs au processus inflammatoire des fibres situées dans la partie lombaire du tronc cérébral sont levés par une injection aiguë de KTX. Les résultats confirment notre hypothèse d'un effet neurologique positif de la KTX. Ils montrent directement que le bloqueur peut passer lentement la barrière hémato-méningée, probablement au niveau des sites d'inflammation. Cette dernière conclusion est d'importance quant à la possibilité de restaurer une conduction axonique satisfaisante apte à rétablir une fonction motrice altérée. Références Bibliographiques
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Bourdoulous et coll., (1995), Eur. J. Immunol.. 25, p 1176.
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Receptors and Channels, A. North, éd., CRC Press, Boca Raton, FL, p 1.71.
Grissmer S, Nguyen AN, Aiyar J, Hanson DC, Mather RJ, Gutman GA, Karmilo icz MJ, Auperin DD and Chandy KG, (1994) Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels, types Kvl . l , 1.2,
1.3, 1.5 and 3.1, stably expressed in mammalian cell Unes. Molec. Pharmacol. 45; p. 1227.
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Kushner L, Lerma J, Bennet MVL and Zukin RS, (1989) Using the xenopus oocyte System for expression and cloning of neuroreceptors and channels. In, Methods in Neurosciences . Vol. 1; p. 3. Académie Press Inc.
McNamara N.M.C., Averill S., Wilkin G.P., Dolly J.O., Priestley J.V., (1996), Ultrastructural localization of a voltage-gated K channel subunit (Kvl .2) in the rat cerabellum, Eur. J. of Neurosciences, 8 p. 688-699
Noseworthy JH (1993) Clinical trials in multiple sclerosis Cu r. Opin.
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Sherratt RM, Bostock H and Sears TA, (1980) Effects of 4-aminopyridine on normal and demyelinated mammalian nerve fibres. Nature. 283; p. 570.
Stϋhmer W., Ruppesberg J.P., Schroter K.H., Sakmann B., Stocker M., Giese K.P., Perschke A., Baumann A., Pongs O., (1989), Molecular basis of functional diversity of voltage-gated potassium channel in mammalian brain, The EMBO Journal, 8 : p. 3235-3244.
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Wang H., Kunkel D.D., Sch artzkroin P.A., Tempel B.L., (1994), Localization of Kvl.l and Kvl.2, two K channel protein, to synaptic terminais, somata, and dendrites in the mouse brain, The J. of Neuroscience, 14 : p. 4588-
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Yarom Y, Naparstek Y, Lev-Ram V, Holoshitz J, Ben-Nun A and Cohen
IR, (1983) Immunospecific inhibition of nerve conduction by T lymphocytes réactive to basic protein of myelin. Nature. 303; p 246.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation de composés inhibiteurs des canaux potassium neuronaux Kvl. l , Kvl.2, et des canaux potassium lymphocytaires Kvl .3, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de maladies neurologiques à composante immunitaire chez l'homme ou l'animal, dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse..
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies neurologiques à composante immunitaire suivantes : les pathologies neurologiques centrales inflammatoires à localisation cérébrale et médullaire, notamment la sclérose en plaque et maladies apparentées (Balo, Devic, encéphalite aiguë disséminée et hémorragiques, neuropathies optiques isolées); les pathologies périphériques inflammatoires ou apparentées, notamment :
. les polyradiculonévrites aiguës et chroniques, . les neuropathies liées à des atteintes infectieuses et à des collagénoses, les pathologies neurologiques dégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies avec bloc de conduction, les pathologies tumorales à dérèglement du système immunitaire.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2. de composés peptidiques issus de venins de scorpion, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (I) suivante :
Cys-AA9-AAιo-AAn-AAi2-AAi3-Cys-AAi5-AAi6-AAi7-Cys-AAi9-AA2θ-
AA2i-(AA22)nl-AA23-AA24-AA25-AA26-AA27-(AA28)n2-Lys-cys-AA3 i- AA32-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys (I)
dans laquelle : - ni , et n2. indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou 1 ,
- AA9 à AA13, AA15 à AA17, AA19 à AA28. AA31 à AA33, et AA3.5, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque, naturel ou non.
4. Utilisation selon la revendication 3, de composés peptidiques de formule (II) suivante:
AA2-AA3-Ile-Asn-Val-Lys-Cys-Thr-Ser-Pro-AAi2-Gln-Cys-AAi5-AAi6-Pro-
Cys-Lys-AA20-AA2i-AA22-Gly-AA24-AA25-Ala-Gly-AA28-Lys-Cys-AA3i-
Asn-Gly-Lys-Cys-Lys-Cys-Tyr-AA39-AA4o (II)
dans laquelle AA2, AA3, AA12, AA15, AAiβ, AA20 à AA22, AA24, AA25, AA28, AA31, AA39, et AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non, tel que la noxiustoxine représentée par SEQ ID NO 1.
5. Utilisation selon la revendication 3, de composés peptidiques comprenant la séquence de formule (III) suivante:
AA6-AA7-Cy S-AA9-AA iQ-Ser-AA 12- AA \ 3-Cys-A A 15- AA γ £-AA 17-Cys-Ly s- Asp-Ala-(AA22)nl-G1y-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-AA3 i -Asn-AA33-Lys- Cys-AA36-Cys-AA38-AA39 (III)
dans laquelle :
- AAg, AA7, AA9, AA10, AA12, AA13, AA15, AA16, AA17, AA22> AA24, AA31 , AA33, AA36, AA38 et AA39, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non. - ni représente zéro ou 1.
6. Utilisation selon la revendication 5, de la kaliotoxine représentée par SEQ ID NO 2, ou de dérivés de la KTX répondant à la formule (IV) suivante:
[(Gly)na-Val-AA3-Ile-AA5]nb-Val-AA7-Cys-AA9-AA1o-Ser-AA l2-AA13-Cys-
AAi5-AAi6-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n G1y-AA24-ArS-phe-G1y"Lys" Cys-AA31 -Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle : - na, nb, et ni, indépendamment les uns des autres, représentent 0 ou 1 ,
- AA3, AA5, AA7, AA9, AAJQ, AA124 A13, AA 15. AA[6, AA17. AA22- AA24, AA31 , AA33, et AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
7. Utilisation selon la revendication 6, de composés de formule (IV) dans laquelle ni = 0, et :
- nb = 1 , tels que les composés peptidiques suivants :
. la kaliotoxine 2 représentée par SEQ ID NO 3, . la kaliotoxine 3 représentée par SEQ ID NO 4,
. l'agitoxine 2 représentée par SEQ ID NO 5,
- ou nb = 0, tel que la KTX(6-37) représentée par SEQ ID NO 6.
8. Utilisation selon la revendication 6, de dérivés de la KTX de formule (IV), dans laquelle ni représente 0 ou 1, et :
- l'un au moins de AAχ2 ou de AA1 représente l'acide aminobutyrique (Abu), tel que le dérivé (P12/Abu, P17/Abu)KTX représenté par SEQ ID NO 7, et/ou
- l'un au moins de AA24 ou de AA31 représente un résidu norleucine tel que la Kaline représentée par SEQ ID NO 8, ou les dérivés de la KTX de formule (V) suivante :
AAι-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AAi()-Ser-Abu-Gln-Cys-AAi5- Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys- Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (V)
dans laquelle AAj à AA7, AA9, AAIQ, AA15, AA33, AA3.5, et AA3 à AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
9. Utilisation selon la revendication 6, de dérivés de la KTX de formule (IV) dans laquelle ni = 1, notamment ceux pour lesquels na = nb = 1 , tels que:
- le dérivé de la KTX à hélice α modifiée représenté par la séquence SEQ ID NO 9,
- le dérivé (P12/K. P17/V, F22)KTX représenté par SEQ ID NO 10.
10. Utilisation selon la revendication 1 ou 2. de composés peptidiques issus d'anémones de mer, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (VI) suivante : ( AA ι )nι -(AA2)n2~ y S-AA4-ASP-AA6- AA7-A A8- AA9-AA 10-AA \ \ -Cy s- (AAi3)n3-AA14-(AA15)n4-AA16-(AA17)n5-AA18-(AA19)n6-AA20-Cys- AA22-(AA23)n7-Ser-AA25-Lys-Tyr-AA28-(AA29)n8-AA30-Cys-AA32-Lys- Thr-Cys-AA36-AA37-Cys (VI)
dans laquelle :
- ni à n8, indépendamment les uns des autres, représentent zéro ou 1,
- AA2, AA2, AA4, AAg à AAn, AA22- AA23, AA25, AA28 à AA30, AA32, AA36 et AA37, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
11. Utilisation selon la revendication 10, des composés peptidiques suivants :
- la BgK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 11 , - la ShK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 12,
- la kaliseptine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 13.
12. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs composés peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 13, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Dérivés de la KTX, répondant à la formule (IV) suivante:
[(G1y)na-Val-AA3-Ile-AA5]nb-Val-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-AA13-Cys- AAi5-AAi6-AAi7-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)nrG'y"AA24-Arg-Phe-Gly-Lys-
Cy S-AA31 -Asn-AA33-Lys-Cys-A A36-Cys-Thr-Pro-Ly s (IV)
dans laquelle :
- na, nb, et ni, indépendamment les uns des autres, représentent 0 ou 1 , - AA3, AA5, AA7, AA9, AAI Q, AAi2- A13, AA15, AA^ AA17,
AA22* AA24, AA31 , AA33, et AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non. sous réserve que lorsque ni = 0, alors :
- nb = 0, - ou AA2 représente une glycine, AA5 représente une proline. AA7 représente une serine, AA9 représente une lysine. AA JQ représente une histidine. AAj2 représente une glycine, et AAjg représente une isoleucine. - et/ou l'un au moins de AAj2 ou de AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu),
- et/ou, l'un au moins de AA24 ou de AA31 représente un résidu norleucine.
14. Dérivés de la KTX selon la revendication 13, de formule (IV) dans laquelle ni = 0, et :
- na = 0, nb = 1, AA2 représente une glycine, AA5 représente une proline, AA7 représente une serine, AA9 représente une lysine, AAI Q représente une histidine, AA12 représente une glycine, et AA16 représente une isoleucine, notamment la kaliotoxine 3 représentée par SEQ ID NO 4,
- ou nb = 0, notamment la KTX(6-37) représentée par SEQ ID NO 6.
15. Dérivés de la KTX selon la revendication 13, de formule (IV) dans laquelle ni = 0 ou 1 , et :
- l'un au moins de AA12 ou de AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu), notamment les composés de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb = 1, AA12 et AA17 représentent l'acide aminobutyrique (Abu), tel que le dérivé (P12/Abu, P17/Abu)KTX représenté par SEQ ID NO 7, - et/ou, l'un au moins de AA24 ou de AA31 représente un résidu norleucine, notamment les composés de formule (IV) dans laquelle ni = 0, na = nb = 0, AA12 et AA17 représentent l'acide aminobutyrique (Abu), AA24 et AA31 représentent un résidu norleucine, tel que la Kaline représentée par SEQ ID NO 8, ou les dérivés de la KTX de formule (V) suivante :
AAι-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AAιo-Ser-Abu-Gln-Cys-AAi 5- Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys- Cys-AA36-Cys-AA3g-AA39-AA40 (V) dans laquelle AAj à AA7, AA9, AA^ AA15, AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
16. dérivés de la KTX selon la revendication 13. de formule (IV) dans laquelle ni = 1 , notamment les composés suivants pour lesquels na = nb = 1. tels que :
- le dérivé de KTX à hélice modifiée représenté par la séquence SEQ ID NO 9,
- le dérivé (P12/K. P17/V, F22)KTX représenté par SEQ ID NO 10.
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