WO1999011816A1

WO1999011816A1 - Reactifs pour controler la proprete et procede de controle de la proprete

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Publication number: WO1999011816A1
Application number: PCT/JP1998/003761
Authority: WO
Inventors: Tatsuya Sakakibara; Seiji Murakami
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1998-08-25
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2000-02-28
Also published as: JPH1169997A; AU8750398A

Description

明細書清浄度検査試薬および清浄度検査法技術分野

本発明はルシフヱリン ·ルシフヱラ一ゼ発光試薬を用いて、 A TPを汚染 ί旨標とした清浄度検査法（以下 AT Ρ法による清浄度検査法という）の改良に関する。更に詳述すると、汚れの指標成分である AT Pに加え、従来のルシフヱリン 'ルシフヱラーゼ発光試薬では測定が困難であつた ADP、 AMPおよび RNAも同時に測定して、少ぃ汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査試薬および、この試薬を用、る清浄度検査法に関する。

従来の技術

従来、 AT P法による清浄度検査法が知られている。

この方法は概略以下の手順により実施される。

(1) 無菌水で湿らせた綿棒で検査箇所（1 0 cm² ) を拭き取り

( 2 ) 綿棒を無菌水を入れた試験管の中で濯ぐ

(3) すすぎ液の所定量を測定用試験管に取る

(4) AT P抽出試薬を所定量加える

(5) 発光試薬（ルシフェリン ·ルシフェラ一ゼ発光試薬）を所定量加える (6) 発光量測定器（ルミノメーター）で発光量を測定する。

一方、 ATPは生物の死後、速やかに AT P分解酵素によって分解され、 AD Pもしくは AMPになる。飲食品、その半製品、およびそれらの原料には、 AD Pおよび AMPを著量含有するが、これらは、ルシフヱリン ·ノレシフヱラ一ゼ発光試薬と反応しない。

したがって、従来の A TP法による清浄度検査法では、 AT P以外の AMP、 ADP、 RNAを検出することができないので、精度の高い清浄度検査を行なうことはできない。

技術的課題

本発明は、汚れの指標成分である AT Pに加え、従来のルシフヱリン 'ルシフヱラーゼ発光試薬では測定が困難であつた ADP、 AMPおよび RNAも同時に測定できる精度のよし、清浄度検査試薬および、この試薬を用、る清浄度検査法を提供することを目的とする。

解決手段

本発明者らは、このような課題を解決するために、ピルべ一トオルトホスフエートジキナーゼ（以下、 P PDKということがある）、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフヱリン、ルシフヱラ一ゼおよび金属塩を含む発光試薬

(以下「PPDK含有発光試薬」ということがある）を使用することにより、汚れの指標成分である AT Pに加え、 AMPも同時に測定することができ、少ぃ汚れを、感度よく検出して、精度の高い清浄度検査を行なうことができることを見出した。また上記 PPDK含有発光試薬にさらに、「八0?から八丁？を生成する反応を触媒する酵素」および Zまたは「RNA分解酵素」を併用すると、 AT Pおよび AMPに加え、さらに AD Pおよび RNAも同時に測定して、さらに少ない汚れを検出でき、より精度の高い清浄度検査を行なうことができることを見出した。すなわち、 ADP、 AMPおよび RNAからなる群より選ばれる少なくとも 1種と、 ATPとを指標として測定することにより、より精度の高い清浄度検査を行なうことができることを見出した。

そしてこれらの知見に基づ、て本発明を完成した。

即ち（1) 本発明はピルべ一トオルトホスフヱ一卜ジキナ一ゼ、ホスホエノ一ノレピノレビン酸、ピロリン酸、ルシフヱリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含むことを特徴とする清浄度検査試薬であり、

(2) また本発明は、 ADPから A TPを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および RN A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも

1種と、ピルべ一トオルトホスフエ一トジキナーゼ、ホスホェノールピルビン酸、ピ口リン酸、ルシフヱリン、ルンフヱラ一ゼおよび金属塩とを含むことを特徴とする清浄度検査試薬であり、

(3) また本発明は、 ADP、 AMPおよび RNAからなる群より選ばれる少なくとも一種と、 AT Pとを指標として測定することを特徴とする清浄度検査法であり、 ( 4 ) また本発明は、検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水を接触させ、得られる接触液と、ピルペートオル卜ホスフェートジキナ一ゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフニラ一ゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法であり、

( 5 ) また本発明は、検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触させ、得られる接触液と、 A D Pから A T Pを生成する反応を触媒する酵素および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべ一トオル卜ホスフヱ一トジキナーゼ、ホスホェノールピルビン酸、ピロリン酸、ノレシフェリン、ルンフェラーゼぉよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法であり、

( 6 ) また本発明は、検査対象物または、その処理物に、ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラ一ゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法であり、

( 7 ) また本発明は、検査対象物または、その処理物に、 A D Pから A T Pを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべ一トオル卜ホスフエ一トジキナーゼ、ホスホェノールピルビン酸、ピロリン酸、ノレシフェリン、ノレシフェラ一ゼおよび金属塩とを含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法である。

発明の実施の形態

以下本発明の清浄度検査試薬につ、て詳細に説明し、ついでこの清浄度検査試薬を用いた清浄度検査法について詳細に説明する。

先ず、本発明に用いるピルべ一トオルトホスフェートジキナ一ゼは、マグネシゥムイオン存在下で、 A M P、ホスホエノ一ルビルビン酸およびピロリン酸に作用して、 A T P、ピルビン酸およびリン酸を生じる反応を触媒する酵素で、その理化学的性質および製法について既に知られており、容易に入手可能である。該酵素は、微生物および植物由来のものが知られている。

微生物由来のものとしては、例えば以下の属または種に属する微生物が挙げられる。

( 1 ) プロピオニバクテリゥム · シェルマ二

(P r o p i on i b a c t e r i um s he rman i i)

[B i o c h em i s t r y 1 0 , 72 1 - 729 ( 1 97 1 ) ] ,

(2) ァセトバクタ一 'キシリナム（Ac e t ob a c t e r x y 1 i n urn) [J ou r n a l o f Ba c t e r i o l o gy (1 970) ] .

(3) バクテロイデス · シンピオサス（B a c t e r o i d e s

s ymb i o s u s) LMe t o o d s i n En z ymo 1 o gy 42、 1 99 - 2 1 2 ( 1 975 ) ] および

(4) ミクロビスポーラ属（例えばミクロビスポーラ ·サ一モロ一ザ（

Mi c r ob i s p o r a t h e rmo s e a I FO 1 4047 。

また植物由来のものとしては、例えば以下に属する植物が挙げられる。

( 1 ) トウモロコシ葉由来 [B i o c h em i s t r y 1 2、 2862 - 28 67 ( 1 973 ) ] o

(2) サトウキビ葉由来 [Th e B i o c hemi c a l J ou rn a l 1 1 4、 1 1 7 - 1 25 ( 1 9 69 ) ] o

微生物の生産するピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼのー製造例を以下に示す。

酵母エキス 0. 2%、カザミノ酸 0. 2%、硫酸第一鉄 0. 00 1 %、塩化力リウム 0. 05%、リン酸二カリウム 0. 1 %、硫酸マグネシウム 0. 05%、乳酸 0. 3 %からなる培地（pH 7. 0) 50m 1を坂口フラスコ（500 m 1 容量）に入れて、 1 2 1°Cで 1 5分間殺菌した。

この培地に、ミクロビスポーラ ·サ一モロ一ザ（M i c r 0 b i s p 0 r a t h e rmo r o s e a) I FO 1 4047を接種し、これを 45 °Cでー晚振盪培養して培養物を得た。

この培養物 50 m 1を、前記と同一組成の培地 1 リットルを入れた 5リットル容坂ロフラスコ中に接種し一晩培養して培養物を得た。この培養物を、前記と同一組成の培地 2 0 リットルを入れた 3 0リットルのジャ一フアーメンタ一 2基に 5 0 Om 1づっ接種し、通気量 2 0リットル/分、撹拌速度 3 0 0 r . p. mの条件で 4 5 °Cで 2 4時間通気撹拌培養を行なつた。培養終了後、この培養物 4 0 リットルからマイクロ一ザ（旭化成工業社製）を用いて菌体を集めた。この菌体の一部（2 0 0 g) に、 5mM EDTA, l m l MgS04 、 1 mM DTTを含有する 2 0mM HEPES緩衝液 (pH 7. 5) (以下緩衝液 Aという）を加え、菌体を十分に懸濁して 7 0 0 m 1とした。

ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナ一ゼの精製

上記菌体懸濁液 7 0 0 m lを以下に示す操作により精製した。

ステップ 1

(粗酵素液の調製）

前記の菌体懸濁液 7 0 0 m 1に、リゾチーム（ナガセ生化学工業社製） 8. 7 5 gを加え、室温でゆっくり撹拌しながら 2時間放置した後、リン酸二アンモニゥム 2 3. 1 gを加え、さらに 2時間室温で撹拌して菌体を破砕した。

この破砕液を 7 0 0 0 r. p. m、 1 5分間、遠心分離して上清部分を集め、 6 20 m lの液を得た。

ステップ 2

(第一回目 Q A E—セフアデックス · クロマトグラフィ一）

前記 6 2 0 m lの液に、 2 g/ 1 0 0 m 1の割合で硫安を溶解させ、これをあらかじめ 0. 1 5 Mの硫安を含有した前記緩衝液 A (pH 7. 5) で平衡化した QAE—セフアデックス樹脂約 7 0 0 m 1に酵素を吸着させた。これを 0. 1 5 M硫安を含んだ前記緩衝液 A (pH7. 5) で洗浄して不要な蛋白を除いた後、 0. 6 M硫安を含んだ前記緩衝液 A (pH 7. 5 ) で溶出した。

ステップ 3

(第二回目 QAE—セフアデックス · クロマトグラフィ一）

前記溶出液をホロファイバ一限外濾過装置（PAN 1 3— DX、旭メディカル社製）によって濃縮した後、あらかじめ前記緩衝液 A (pH7. 5) で平衡化した QAE—セフアデックスを充塡したカラム（直径 6 cmx 1 5 cm) にかけて酵素を吸着させた。次に 0. 1 5 M硫安を含んだ前記緩衝液 A (pH 7. 5 ) で洗浄して不要な蛋白を除いた後、 0. 1 5 M硫安を含んだ前記緩衝液 A (pH7. 5 ) と 0. 8 M硫安を含んだ緩衝液（ p H 7. 5 ) とからなる濃度勾配緩衝液 3 リットルで溶出し一定量づっ分画した。

ステップ 4

(プチルトヨパール . クロマトグラフィー）

前記の溶出液のうちピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼの活性画分を回収し、硫安を加え硫安濃度を 1 Mに調整した後、あらかじめ 1 M硫安を含む前記緩衝液 A (pH 7. 5) で平衡化したブチルトヨパール（東ソ一社製）を充塡したカラム（直径 4. 5 cmx 1 5 c m) にかけて酵素を吸着させた。

これを、前記緩衝液 A (pH 7. 5) 中の硫安濃度勾配（ 1. 0 M~ 0 M) をもった緩衝液（pH 7. 5) 1. 2 リットルによって溶出した。

ステップ 5

(ゲル濾過クロマ卜グラフィ一）

前記の活性部をァミコン社製限外濾過膜装置（分画 1 0， 0 0 0 ) で 2 m 1にまで濃縮し、このうち 1 0 0〃 1をあらかじめ 0. 3 M硫安を含んだ 2 0 mM HE PES緩衝液（pH7. 5) で平衡化した T S Kゲル G 3 0 0 0 SWXLカラム（直径 0. 7 6 cmX 3 0 cmx 2本）にかけてゲル濾過を行なつた。

すべての酵素をゲル濾過し、活性部を濃縮した。活性部を再び前記と同様の力ラムにかけてゲル濾過を行なった。全ての酵素をゲル濾過して溶出された活性画分 5. 4m lを採取した。

該画分は、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一と判断された本酵素の標品であり、全タンパク量が 6. 6 5mg、全活性が 6 6. 0 U、比活性が 9. 9 2 UZmgのものであった。

ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼのカ価の測定法

(生成する A T Pを発光法で定量する方法）

3 mM 硫酸マグネシウム、 2 5mM 硫酸アンモニゥム、 2 mM 2メルカブトエタノール、 2mM ピロリン酸、 2 mM ホスホエノ一ルビルビン酸および 0. i mM AMPを含む5 0mM B I S—TR I S PRO PANE緩衝液（pH6. 8) 1 80〃 1をマイクロチューブにとり、温度平衡を 37°Cに至 ij 達させたのち、適当な活性を有する酵素溶液 20 1を加え、 1 5分間反応させ、沸騰水中で 3分間煮沸し、反応を止める。

この反応液を適当に希釈したもの 50 1を試験管にとり、そこに「ルシフエ —ル LU」（キッコ一マン社製）溶液を 50 1滴下し、発光量を測定する。別に予め既知濃度の AT P標準溶液を用いて、その発光量との関係を調べたグラフを用意する。

このグラフを用いて 37°Cで 1分間当たりに 1〃mo 1の ATPを生成する酵素量を 1単位とする。

次に、本発明に用いるルシフェリンとしては、ルシフヱリン、ノレシフヱリン誘導体およびルンフエリン前駆体などが挙げられる。

ルシフヱリン誘導体としては、例えば以下のものが挙げられる。

( 1 ) D—ルシフェリン— 0—硫酸塩（D— l u c i f e r i n— 0— s u l ph a t e) 、

(2) D—ルシフェリンメチルエステル（D_ 1 u c i ί e r i n

me t hy l e s t e r 、

(3) D—ルシフェリン一 0—リン酸塩（D— l u c i f e r i n— 0— p ho s p ha t e) 、

( 4 ) D—ルシフェリン一 L—フエ二ルァラニン（D— l u c i f e r i n— L — h e ny l a l an i n e)

(5) D—ルシフェリン一 L— Να—アルギニン（D— l u c i f e r i n— L — Να— a r g i n i n e) ₀

ルシフヱリン前駆体としては、 2—シァノー 6—メトキシベンゾチアゾール (2 -Cy ano— 6— me t ho xyb e n z o t h i a z o lリ、および D 一システィン等が挙げられる。

次に、ルシフヱラーゼとしては、例えば以下の甲虫類（コレオプテラ

Co l e o p t e r a) 由来のルシフヱラーゼ、それらの変異ルシフヱラーゼぉよび非甲虫類由来のルシフェラ一ゼ等が挙げられる。

[甲虫類由来のルンフェラ一ゼ] (1) ノレシオラ * クノレシァタ (Lu c i o l a c r u c i a t a) 、

(2) ノレシオラ * ラテラリス (Lu c i o l a l a t e r a l i s) 、

(3) ノレシオラ ' ミングレリカ（Lu c i o l a mi n g r e l i c a) 、

(4) ランピリス *ナクティノレ力（Lampy r i s n a c t i 1 u c a) 、 (5) フォティナス ' ピラリス（Pho t i nu s py r a l i s) 、

(6) フォチユリス ·ペンシルバニ力（Pho t u r i s

p e nn s y l v an i c a) 、

(7 ) ホ夕リア ·パルブ一ラ（Ho t a r i a p a r vu l a) 、

(8) ピロコエリア ' ミヤコ（Py r o c o e 1 i a mi y a k o) 、 (9) ピロホラス 'プラギオフタラムス（Py r o pho r u s

1 a g i o p h t h a 1 a m u s ) ₀

(1 0) 上記ルシフラ一ゼおよび変異ルシフェラーゼを遺伝子組換法で製造したノレシフェラ一ゼ。

次に、金属塩としては、 2価の金属塩、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシゥム等のマグネシウム塩、硫酸マンガン、塩化マンガン等のマンガン塩などが挙げられる。

また ADPから ATPを生成する反応を触媒する酵素としては、以下のものが挙げられる。

( 1 ) ピルビン酸キナーゼ（Py r uv a t e k i n a s e)

(E. C. 2. 7. 1. 40)

基質：ホスホエノ一ル · ピノレビン酸（Pho s p ho e n o 1 py r uv a t e)

( 2 ) 酢酸キナ一ゼ (Ac e t a t e k i n a s e)

(E. C. 2. 7. 2. 1 ) 、

基質：ァセチル ' リン酸（A c e t y 1 pho s p h a t e)

(3) クレアチンキナーゼ（C r e a t i n e k i n a s e)

(E. C. 2. 7. 3. 2)

基質：クレアチン · リン酸（C r e a t i n e p ho s p ha t e) ( 4 ) ケ卜へキソキナーゼ（Ke t o h e xo k i n a s e) (E. C. 2. 7. 1. 3 )

基質： D—フルクト一ス 1—リン酸（D— f r u c t o s e 1 - pho s pha t e)

(5) ホスホリブ口キナーゼ (Pho s pho r i bu 1 o k i n a s e) 基質： D—リブロース · 1， 5—ジリン酸（D— r i b u 10 s e 1，

5— d i pho s ph a t e)

(6) 力ノレノくメ一トキナ一ゼ (Ca r b ama t e k i n a s e)

基質：力ルバモイノレリン酸 (C a r b amoy l e p ho s ph a t e) (7 ) ホスホグリセレートキナ一ゼ（Pho s pho g l y c e r a t e

k i n a s e

基質： 3—ホスホ— D—グリセリン酸（3— Pho s pho— D— g l y c e r a t e)

( 8 ) ァスバルテ一トキナーゼ（As p a r t a t e k i n a s e)

基質： Lーァスパラギン酸 4一リン酸（L一 A s p a r t a t e 4— p h o s p h a t e ) など。

また、微生物細胞内成分抽出試薬としては、界面活性剤（塩化べンゼトニゥム、塩化ベンザルコニゥム、トリトン X I 00など）、メタノール、エタノール、ェタノ一ルとァンモニァの混合液、トリクロル酢酸水溶液、過塩素酸水溶液などが挙げられる。

また RNA分解酵素としては、 RNAから 5' —モノヌクレオチド（AM P, GMP, CMP, UMP) を生成する反応を触媒する酵素を意味し、例えば以下の記載のものが挙げられる。

( 1 ) エンドヌクレアーゼ ·エス ' ワン（Endonu c l e a s e S i ) (E C 3. 1. 30. 1 ) 、

( 2 ) べノム 'ェキソヌクレアーゼ（V e n o m e xonu c 1 e a s e) (EC 3. 1. 1 5. 1 ) 、

( 3 ) ホスホ · ジエステラーゼ ' ワン（Pho s pho

d i e s t e r a s e l) (E C 3. 1. 4. 1 ) など。

なお、上記ェンドヌクレアーゼ 'エス · ヮンには、ヌクレアーゼ ' ピィ ' ワン (Nu c l e a s e P , ) 、マング · ビーン · ヌクレア一ゼ（Mu n g b e a n s n u c 1 e a s e) 、ニューロスホラ * クラッサ ' ヌクレアーセ ( e u r o s p o r a c r a s s a nu c l e a s e) など力く含まれる。また、本発明では上記の成分以外に、酵素の賦活剤、酵素の安定剤、緩衝剤および清浄度検査試薬に固有的に含まれる構成成分で、バックグラウンド発光の原因となる AT Pの消去剤、などの一種または二種以上を添加することが好ましい。酵素の賦活剤としては、例えば硫酸アンモニゥム（ピルべ一トオルトホスフエ ―トジキナーゼの賦活剤）などが挙げられる。

酵素の安定剤としては、ジチオスレィトールおよび EDTA (ルシフェラーゼの安定剤）などが挙げられる。

そのほか、単糖類（例えばグルコースなど）、二糖類（例えばシュクロースなど）、多糖類および糖アルコール（例えばグリセロールなど）などが挙げられる。また緩衝剤としては、発光反応溶液をルシフラ一ゼの至適 p Hの範囲に保持するものが好適であり、グリシン一 N a OH緩衝剤、 HE PES緩衝剤およびトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンなどの T r i s緩衝剤などが挙げられる。また、清浄度検査試薬の A TPの消去剤としては、 ATP分解酵素、例えばァデノシンリン酸デァミナ一ゼ（酵素活性の測定法：特開平 9一 1 8 26 0 0参照）などが挙げられる。

次に、本発明の清浄度検査試薬の構成成分の好適な濃度範囲を以下に示す。 ( 1 ) ピルべ一トオルトホスフエ一トジキナーゼ（P PDK) ：

0. 00 1 U/m 1以上（終濃度）、特に 0. 0 0 2 ~ 1 0 0 U/m 1 (終濃度）となる濃度。

(2) ホスホェノールピルビン酸：

0. 1 mM (終濃度）以上、特に 0 5〜8. 0 mM (終濃度）となる濃度 _c (3) ピロリン酸：

1. 0 uM (終濃度）以上、特に 5 0〜1 0 0 0 M (終濃度）となる濃度 c

( 4 ) ノレシフヱリン： 5. 0 U (終濃度）以上、特に 5 0. 0〜 1 0 0 0 0 M (終濃度）となる濃度 _c

( 5 ) ルシフヱラーゼ： ' 0. 1 mg/m 1 (終濃度）以上、特に 0. 5〜2 0mg/m l (終濃度）となる濃度。

(6) マグネシウムイオン：

1. OmM (終濃度）以上、特に 5. 0〜1 0 OmM (終濃度）となる濃度。 (7) 硫酸アンモニゥム：

0. 1 mM (終濃度）以上、特に 0. 5〜1 0 OmM (終濃度）となる濃度。 (8 ) ジチオスレィトール：

0. 1 mM (終濃度）以上、特に 0. 5〜1 OmM (終濃度）となる濃度。

(9) EDTA：

0. I mM (終濃度）以上、特に 0. 5〜1 OmM (終濃度）となる濃度。

( 1 0) HE P E S緩衝液（pH 7. 0) ：

1 OmM (終濃度）以上、特に 2 0〜2 0 OmMとなる濃度。

( 1 1 ) アデノシンリン酸デァミナ一ゼ： 0. 0 0 1 UZm 1以上、特に 0. 0 1 U/m 1 ~ 1 0 U/m 1となる濃度。

次に本発明の清浄度検査法について説明する。

本発明の清浄度検査法は、検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水を接触させ、得られる接触液に、ピルべ —トオルトホスフヱートジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルンフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定することにより行なわれる。

あるいは検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触させ、得られる接触液を、 AD Pから A T Pを生成する反応を触媒する酵素および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフヱリン、ルシフヱラーゼおよび金属塩とを含む清浄度検査試薬と反応させ、生成する発光量を測定することにより行なわれる。

あるいは、検査対象物または、その処理物と、ピルべ一トオル卜ホスフェートジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ノレシフヱリン、ルシフエラ一ゼぉよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを反応させ、生成する発光量を測定することにより行なう。

検査箇所としては、まな板、包丁、シャモジなどの調理器具、医薬品製造用機械、食品製造機械などが挙げられる。

これらの検査箇所に、綿棒、ガーゼなどの布、不織布およびスポンジなどのよごれ採取用担体を接触させて、よごれの付着した担体を得る。

この際、検査対象物が、固体あるいはペースト状などを呈しており、担体による接触では採取できない汚れは、搔取り具（ヘラ、スプーン、ナイフなど）で採取したのち、無菌水に溶解して水溶液（処理物）としたのち、あるいは無菌水に混ぜ磨砕または濾過などして懸濁液、抽出液（処理物）としたのち、検査用試料

(サンプル）として利用する。

また溜り水や水滴状を呈している汚れ水の場合は、スポィトなどで採取して、そのまま、あるいは無菌水で希釈したのち検査用試料として利用する。

次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触させて得られる接触液を調製する。

これらの微生物細胞内成分抽出試薬の濃度は、 0. 0 0 1 %〜 1 %が好ましい c こうして微生物細胞内成分、例えば ATP、 ADP、 AMP, RNAなどが抽出された接触液が調製される。

次にこの接触液と前述した清浄度検査試薬とを反応させると、該試薬が A T P、 ADP、 AMP, RNAに作用して、発光反応が行なわれるので、その生成する発光量を測定する。

上記微生物細胞内成分と清浄度検査試薬の発光反応を、以下に説明する。

先ず、 AMPと清浄度検査試薬の発光反応について説明する。

本反応は、一般式

に示したように、破線枠（ィ）で示すように、 AMP、ピロリン酸、ホスホエノ —ルビルビン酸およびマグネシウムイオンに、ピルべ一トオルトホスフヱイトジキナーゼを作用させ、 ATP、ピルビン酸およびリン酸とに変換せしめる反応と、一点鎖線（口）で示すように、 ATP、ルシフヱリン、溶存酸素およびマグネシゥムイオンに、ルシフヱラ一ゼを作用させ、 AMP、ピロリン酸、ォキシルシフェリン、炭酸ガスおよび光を生じせしめる反応を組合せたことを特徴としているこの反応式により、まず（口）の反応により AT Pが消費されて、発光し、 A MPとピロリン酸が生成する力く、この AMPとピロリン酸は（ィ）の反応によりに ATPに再生される。そして、この ATPは再び（口）の反応に供され、 AT Pが消費されて発光する。

以下この 2つの反応が同時に行なわれ、発光が減衰することなく高水準のまま、短くとも 1 0分間一定の値に維持される。

次に、 AD Pと清浄度検査試薬の発光反応について説明する。発光反応は、一般式

に示したように、反応（ィ）（前述した通り）と反応（口）（前述した通り）に、新たに二点鎖線枠（ハ）で示したホスホエノ一ルビルビン酸とマグネシウムィォンの存在下で、 ADPから ATPを生成する反応を触媒する酵素であるピルビン酸キナーゼにより AT Pおよびピルビン酸に変換せしめる反応を組合わせたことを特徴としている。

なお、ここで用いられる ADPから ATPを生成する反応を触媒する酵素として、ピルビン酸キナーゼに代えて、酢酸キナーゼまたはクレアチンキナーゼなどの他の酵素を用いてもよい。

酢酸キナーゼの反応式、クレアチンキナーゼの反応式をそれぞれ以下に示す。酢酸キナーゼの反応式

Λ

(反応 3 ) アセテートキナーゼ

クレアチンキナーゼの反応式

上記反応 2の反応において、まず二点鎖線枠で示すように、マグネシウムィォンおよびホスホエノールビルビン酸の存在下で、 A D Pにピルビン酸キナーゼを反応させて AT Pおよびピルビン酸に変換せしめる反応（ハ）を行ない、これにより ADPが ATPに変換され、次いで反応（口）によりこの AT Pが消費されて、発光し、 AMPが生成し、次いで反応（ィ）によりこの AMPが AT Pに再び変換される。

この AT Pは再び反応（口）に供され、 AT Pが消費されて発光し、 AMPに変換される。以下、この 2つの反応が同時に、連続的に繰返し行なわれる。

この一連の A T P変換反応系にお、て生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも 1 0分間にわたって安定である。

反応 3および反応 4の反応においては、以上と同様な態様を示し、重複するので、割愛する。

次に、 R N Aと清浄度検査試薬の発光反応について説明する。

本反応は、一般式

RNA分解薛柰

R NA * AMP+GMP+CMP+UMP

に示したように反応（ィ）（前述した通り）と反応（口）（前述した通り）に、新たに三点鎖線枠で示した R N Aを R N A分解酵素と反応させて、 AM P、 G M P、 CMPおよび UMPに変換せしめる反応（二）を組合わせたことを特徴としている。

上記反応において、まず三点鎖線枠で示すように、 RNAを RNA分解酵素と反応させて、 AMP、 GMP、 CMPおよび UMPに変換せしめる反応（二）を行ない、これにより RN A力く、 AMPに変換され、次いで反応（ィ）によりこの AMPが AT Pに変換され、次いで反応（口）によりこの AT Pが消費されて、発光し、 AMPが生成する。

この AMPは再び反応（ィ）に供され、 ATPに変換され、この ATPは次いで反応（口）により消費されて発光し、 AMPに変換される。

以下、これらの反応が同時に、連続的に繰返し行なわれる。

この一連の A TP変換反応系において生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも 1 0分間にわたって安定である。

次に汚れ採取用担体収納容器を用いた清浄度検査法について説明する。

図 1において、無菌水で湿らせた綿棒で検査箇所（例えば 1 0 cm² ) を拭き取り、汚れ採取部 5 aに汚れの付着した綿棒 5を得、この綿棒のついたピストン 2を、シリンダ一 1の下方に向けて圧入し、綿棒 5の汚れ採取部 5 aを微生物細胞内成分抽出試薬収納槽 7の一方の壁面 7 aを貫通して一時停止し、該抽出試薬 6の収納槽の中で濯ぎを行い、汚れ（微生物、その他の汚れ成分）の抽出液、特に微生物細胞内成分抽出を得る。

一方、シリンダー 1の下方から発光試薬収納槽 4を押し上げ、該収納槽の薄膜部材 4 aを突起 8の尖鋭部分に押しつけることにより開裂する。

次いで、ピストン 2を前記停止位置からさらに押し下げ、拭取部 5 aを抽出試薬収納槽 7の他方の壁面 7 bを貫通（開裂）し、汚れの抽出液を滴下させ、清浄度検査試薬収納槽 4の発光試薬と混和し、発光反応を行い、その生成する発光量をルミノメーターで測定し、その結果から清浄度を測定する。

以下実施例を示して本発明をより具体的に説明する。

実施例

実施例 1

A T Pと AM Pの測定が可能な清浄度検査試薬の調製以下の成分を含有する（1) 発光試薬を均一に混和し、清浄度検査試薬を調製した。

1 ) 発光試薬

ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼ（PPDK) 1. 8 U/m 1 ホスホェノールピルビン酸 4. 2 mM ピロリン酸ナトリウム 200 /iM ルシフヱリン 1. 5 mM ルシフヱラ一ゼ（キッコ一マン社製） 4. 5 m g/m 1 硫酸マグネシウム（金属塩） 1 5 mM

※HEPES (緩衝剤） 50 mM (p H 7. 0 )

※シュ一クロース（酵素安定剤） 0. 37重量％ ※EDTA · 2 N a (酵素の金属による阻害防止剤） 0 mM ※ジチオスレイト一ル（酵素安定剤） 0 mM ※硫酸アンモニゥム（酵素活性化剤） 5 mM ※アデノシンリン酸デァミナ一ゼ 1 U/m 1 なお上記成分のうち、記号卩※」のついた HE PES緩衝剤は反応系の pH安定化のため、シユークロースはルシフヱラ一ゼの安定化のため、 EDTAは酵素の金属による阻害防止のため、ジチオスレイト一ルは酵素安定化のため、硫酸ァンモニゥムはピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼの活性化を強めるため、そしてまた、アデノシンリン酸デァミナーゼは清浄度検査試薬の持込み AT P消去剤のため、それぞれ使用するもので、必須の成分ではない。

実施例 2

微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である、 AT Pと AMP測定が可能な清浄度検査試薬の調製

以下の（1) 発光試薬および（2) 微生物細胞内成分抽出試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。

1 ) 発光試薬

上記実施例 1に同じ。

2) 微生物細胞内成分抽出試薬塩化ベンザルコニゥム 0. 02重量％

HEPE S緩衝液（pH 7. 0) 1 0mM

実施例 3

ATP、 AMPおよび R N Aの測定が可能な清浄度検査試薬の調製

以下の（1) 発光試薬および（3) RN A分解酵素試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。

1 ) 発光試薬

上記実施例 1に同じ。

3) RN A分解酵素試薬。

ヌクレア一ゼ ' ピィ · ワン（シグマ社製 RN A分解酵素） 1. 2U/ml HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM 実施例 4

微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である、 ATP、 AMPおよび R N Aの測定が可能な清浄度検査試薬の調製

以下の（1) 発光試薬、（2) 微生物細胞内成分抽出試薬および（3) RNA 分解酵素試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。

1 ) 発光試薬。

実施例 1に同じ。

2) 微生物細胞内成分抽出試薬

塩化ベンザルコニゥム 0. 02重量％

HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM

3) RNA分解酵素試薬。

ヌクレアーゼ ' ピィ ·ワン（シグマ社製 RN A分解酵素） 1. 2U/ml HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM 実施例 5

微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である ATP、 ADPおよび A M Pの測定が可能な清浄度検査試薬の調製

以下の（1) 発光試薬、（2) 微生物細胞内成分抽出試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 1 ) 発光試薬。

実施例 1の発光試薬にピルビン酸キナーゼ（シグマ社製） 5 0 0 U/m 1を加えた以外は、実施例 1に同じ。

2) 微生物細胞内成分抽出試薬

塩化ベンザルコニゥム 0. 0 2重量％

HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM

実施例 6

微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である AT P、 ADP、 AMP および R N Aを測定することが可能な清浄度検査試薬の調製

1 ) 発光試薬。

2) 微生物細胞内成分抽出試薬

塩化ベンザルコニゥム 0. 0 2重量％

HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM

3) RNA分解酵素試薬。

ヌクレア一ゼ · ピィ ' ワン（シグマ社製） 1. 2U/ml HEPES緩衝液（pH7. 0) 1 0 mM

実施例 7

(清浄度検査法）

表 1に記載されたサンプルを、滅菌済み超純水に溶解または懸濁して、表 1に記載された濃度（％) に希釈して用いた。

なお、サンプルが薄すぎて測定できない場合は、より濃い濃度のサンプルを測定し、比例計算で各濃度における発光量に換算した。

( 1 ) この希釈水（濯ぎ液） 1 0 0 1を測定用試験管に採る。

( 2 ) これに超純水 1 0 0 1および上記実施例 1で調製した清浄度検査試薬 (PPDK含有発光試薬） 1 0 0 z lを加える。 ( 3 ) 生成する発光量をベル卜一ルド社製発光量測定器 L B 9 5 0 1 (ルミノメ —ター）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

なお、実施例 1で調製した清浄度検査試薬は、 A T Pおよび AM Pの測定が可能である。

比較例 1

(比較のための清浄度検査試薬の調製）

上記実施例 1の清浄度検査試薬において、ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナ―ゼを含まない以外は全く同様にして比較のための清浄度検査試薬を調製した。なお、比較例 1で調製した清浄度検査試薬は、 A T Pの測定は可能であるが、 A M Pの測定はできない。

比較例 2

(比較例 1の清浄度検査試薬を用いた清浄度検査法）

上記実施例 7の清浄度検査法において、実施例 1で調製した「清浄度検査試薬」に代えて、比較例 1で調製した「清浄度検査試薬」を用いる以外は、全く同様にして発光量を測定した。

そして、上記実施例 7および比較例 2で得られたそれぞれの発光量および後者の発光量に対する前者の発光量の比をまとめて表 1に示す。

表 1

本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの発光量の比較

表 1の結果から、従来のルシフヱリン ·ルシフヱラ一ゼ発光試薬（比較例の清浄度検査試薬）を用いる清浄度検査法では、 A M Pを検出することができず、本発明の清浄度検査試薬（発光試薬）と比べると、低い値の発光量を示し、感度および精度の高い清浄度検査を行なうことはできない。

これに対し、本発明の清浄度検査試薬を用いた場合は、比較例に比べて、 1 4 倍〜 6千万倍も高い値の発光量が得られ、このことから少ない汚れでも、感度よく清浄度検査を行えることがが判る。

そしてまた、特に牛肉エキスを検査対象とする場合、比較例の清浄度検査試薬を用いる場合は、殆ど汚れを検出することができないが、本発明のそれを用いた場合は、非常に高感度によごれを検出できることが判る。

実施例 8 ' (清浄度検査法）

表 2に記載されたサンプルを、滅菌済み超純水に溶解または懸濁して、 0. 0 0 1重量％に希釈して用いた。

なお、サンプルの ATP濃度が薄すぎて（1 X 1 0—¹³ M以下）測定できない場合は（表 2において、 ※のついたサンプルが該当する）、 1重量％の濃度のサンプルを測定し、比例計算で 0. 0 0 1重量％濃度に換算した。

( 1 ) この希釈水（サンプル） 1 0 0 Z 1を測定用試験管に採る。

( 2 ) これに超純水 \ 00 および上記実施例 1で調製した清浄度検査試薬 (PPDK含有発光試薬） 1 0 0 /z lを加える。

( 3 ) ベルト一ルド社製発光量測定器 L B 9 5 0 1にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

そしてサンプル中の A T Pおよび A M Pの合計された濃度を測定した。

この合計された濃度は、以下の理由により濃度既知の A T P標準液とその発光量との関係から求めた直線性を示す検量線を使用して求めた。

理由： AT P濃度とその発光量から求めた検量線は、 AMP濃度とその発光量から求めた検量線と、ほぼ同一となるので、 AT Pと AMPの合計濃度は、 AT P濃度とその発光量から求めた検量線を用、て測定することができる。

その結果を表 2の「実施例（ィ） ATP + AMP」欄に示した。

比較例 3

また、比較のため、本実施例の清浄度検査方法において、「実施例 1で調製した清浄度検査試薬」を用いる代わりに「比較例 1で調製した清浄度検査試薬」を用いる以外は、全く同様に清浄度検査法を実施し、検体中の A TP濃度を求めた c その結果を「比較例（口）」の欄に示した。

比較例 3の AT P濃度に対する本実施例のそれの値（A TP濃度の比）を求め、その結果を「実施例（ィ） /比較例（口）」欄に示した。表 2

本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの検出 A TP濃度の比較実施例（ィ）比較例（口） AT P濃度の比 ATP+AMP ATP 実施例（ィ）

/比較例（口）酵母エキス 4. 7 1 X 1 0 2. 1 4 X 1 0 2 2 0 ※牛肉エキス 3. 6 9 X 1 0 1. 6 9 X 1 0 2 1 8 0 0 0 0 0 ※麦芽エキス 1. 3 7 X 1 0 6. 9 7 X 1 0 1 9 7 ※ビール 1. 8 6 X 1 0 4. 1 9 X 1 0 44 4 牛乳 4. 7 6 X 1 0 9. 2 9 X 1 0 ※ご飯 1. 5 9 X 1 0 2. 3 6 X 1 0 6 7 4 豚肉 4. 0 2 X 1 0 5. 6 1 X 1 0 7 表 2の結果から、牛肉エキス、麦芽エキス、ビールおよびご飯をサンプルとする場合、それらの AT P濃度が薄すぎて（1 X 1 (T¹³ M以下）、従来のルシフェリン ·ルシフェラ一ゼ発光試薬（比較例 1の清浄度検査試薬）では、測定できないことが判る。

そして、また従来の ATP法による清浄度検査法では、汚染指標として AMP を検出することができず、本発明の PPDK含有発光試薬と比べると、低い値の発光量を示し、精度の高い清浄度検査を行なうことはできない。

これに対し、本発明の発光試薬を用いた場合は、比較例に比べて、 5倍（測定対象：牛乳）〜約 2千万倍（同：牛肉エキス）も高い値の発光量を得ることが可能で、汚れを感度よく検査できることがが判る。すなわち、同一のルミノメータ —で測定すれば、 5分の 1〜2千万分の 1という非常に少ない汚れを検出することができる。

そして、特に牛肉エキスを検査対象とする場合は、 ATPが殆ど分解されており、 ATPを指標として清浄度検査を行なう従来法では、汚れを検査することが難しいことが判る。これに対し本発明によれば、 ATPおよび AMPを指標とするため AT Pを指標にした場合に比べ、 2千万倍も高感度検査をすることができることが判る。

実施例 9

表 3に記載されたサンプルを、滅菌済み超純水に溶解または懸濁して、 0. 0 0 1重量％に希釈して用いた。

なお、サンプルが薄すぎて（表 2において、 ※のついたサンプルが該当する）測定できない場合（1 X 1 0 ¹³ M以下）は、より濃い濃度のサンプルを測定し、比例計算で 0. 0 0 1重量％濃度に換算した。

(1) この希釈水（サンプル） 1 0 0 1を測定用試験管に採る。

(2) これに実施例 3で調製した RN A分解酵素試薬 1 0 0 u 1を加え、室温で 1 5分間放置する。サンプルに含まれる RNAを分解し、 AMPに変換する。 ( 3 ) 上記実施例 3で調製した清浄度検査試薬（ P P D K含有発光試薬） 1 0 0 1を加える。

(4) ベルトールド社製発光量測定器 L B 9 5 0 1 (ノレミノメータ一）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

そしてサンプル中の AT P、 AMPおよび RNA由来の AMPの成分の合計された濃度を測定した。

この合計された濃度は、以下の理由により A T P濃度と発光量を示す検量線を用いて測定した。

理由 AT P濃度と発光量を示す検量線は、 AMP濃度と発光量を示す検量線と、ほぼ同一となるので、 AT Pと AMPの合計濃度は、 AT P濃度と発光量を示す検量線を用 L、て測定することができる。

その結果を表 3にATP + AMP + RNA欄に示した。

また、比較例 1の清浄度検査試薬を用いて得られる ATP濃度に対する本実施例のそれの比較値を求め、その結果を「実施例（ィ） Z比較例（口）」欄に示した。

表 3

本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの検出 AT P濃度の比較サンプル実施例（ィ）比較例（口） AT P濃度の比

ATP+AMP ATP 実施例（ィ）

+ RNA /比較例（口）酵母エキス 9 . 5 8 X 1 0 -⁹ 2 . 1 4 X 1 0 ¹ ' 4 4 8

※牛肉エキス 5 . 4 5 X 1 0 -" 1 . 6 9 X 1 0 — ' ⁵ 3 2 2 0 0 0 0 0

※麦芽エキス 1 . 9 3 X 1 0 "" 6 . 9 7 X 1 0 ¹⁴ 2 7 7

※ビール 2 . 5 8 X 1 0 ¹² 4 . 1 9 X 1 0 - ' ⁵ 6 1 6 牛乳 1 . 1 5 X 1 0 " 9 . 2 9 X 1 0— ^{1 3} 1 2

※ご飯 3 . 7 0 X 1 0 —' ' 2 . 3 6 X 1 0 - ¹⁴ 1 5 6 8 豚肉 1 . 7 1 X 1 0 -'。 5 . 6 1 X 1 0 ¹² 3 0 表 2および表 3の結果から、発光試薬と R N A分解酵素試薬との組合せからなる実施例 3で調製した清浄度検査試薬（ATP、 AM Pおよび RN Aの測定が可能）は、 RNA分解酵素試薬を用いない実施例 1で調製した清浄度検査試薬（A TPおよび AMPの測定が可能）に比べて、酵母エキス：約 2倍（4 4 8 Z22 0 ) 、牛肉エキス：約 1. 5倍（約 3千万/約 2千万）、麦芽エキス： 1. 4倍 ( 2 7 7 / 1 9 7 ) 、ビール： 1. 3倍（ 6 1 6 / 4 4 4 ) 、牛乳： 2. 4倍 ( 1 2 Z 5 ) 、ご飯： 2. 3倍（ 1 5 6 8 / 6 7 4 ) 、豚肉： 4. 5倍（ 3 0 Z 7) もそれぞれ感度が良好になることが判った。

実施例 1 0

( 1 ) 無菌水で湿らせた綿棒で、しゃもじの表面を拭き取る（ 1 0 cm」）。なお、このしゃもじは、炊飯米をわけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯いだものである。

(2) 綿棒を無菌水（超純水）を入れた試験管の中で濯いだ。

そして濯ぎ液 5 m 1を得る。 ( 3 ) 測定用試験管 A， Bに、濯ぎ液を 1 0 0 ^ 1づっ入れる。

(4) 一方の試験管 Aには超純水 1 0 0 p. 1を加える。他方の試験管 Bには、実施例 3で調製した RN A分解酵素試薬 1 0 0 1を加え、室温で 1 5分放置する (サンプルに含まれる RNAを分解し、 AMPに変換する）。

(5) 試験管 Aおよび試験管 Bに、それぞれ実施例 1および実施例 3で調製した清浄度検査試薬（発光試薬） 1 0 0 1を加える。

(6) ベルト一ルド社製発光量測定器 LB 9 5 0 1 (ノレミノメータ一）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

そして、濯ぎ液の ATP、 AMPおよび RNA由来の AMPの濃度の合計量を測定した。

AMPの濃度は、 AT Pに換算して求めた。

それらの結果をまとめて表 4に示す。

表 4 (しゃもじの濯ぎ廃液の清浄度検査結果）

実施例 1 1

(1) 超純水で湿らせた綿棒で、しゃもじ（検査箇所）（1 0 cm² ) を拭き取つた。このしゃもじは、炊飯米をわけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯いで、これに、古くなつた炊飯米から分離した雑菌の懸濁液を噴霧したものである。

( 2 ) この綿棒を、実施例 2で調製した細胞内成分抽出試薬液 5 m 1を入れた試験管の中で濯いだ。

雑菌以外の汚れと雑菌の細胞内成分である AT Pがそれぞれ抽出された濯ぎ液 5m lを得た。

(3) 4本の測定用試験管 A， B, Cおよび Dにそれぞれ濯ぎ液（サンプル） 1 0 Q fi lを取った。

(4) ついで、試験管 Aおよび試験管 Bにはそれぞれ超純水 1 0 0 1を、また試験管 Cおよび試験管 Dには、それぞれ実施例 4および実施例 6で調製した R N A分解酵素試薬 1 0 0 1を加え、室温で 1 5分放置する（サンプルに含まれる RNAを分解し、 AMPに変換する）。

(5) ついで、試験官 A， B, Cおよび Dにそれぞれ実施例 2、実施例 5、実施例 4および実施例 6で調製した発光試薬 1 0 0 1を添加し、ベルトールド社製発光量測定器 LB 9 5 0 1 (ノレミノメーター）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

そしてサンプル中の ATP、 ADP、 AMPおよび RNA由来の AMPの成分の合計された濃度を測定した。

なお、 AMPの濃度は、 AT Pに換算して求めた。

それらの結果をまとめて表 5に示す。

表 5 (雑菌に汚染された、しゃもじの濯ぎ廃液の清浄度検査結果）

実施例 1 2

(1 ) 超純水で湿らせた綿棒で、使用直後の挽肉製造機の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、その表面を拭き取った（1 0 cm² ) 。

(2) 綿棒を超純水を入れた試験管の中で濯いだ。

そして濯ぎ液 5 m 1を得た。

(3) 測定用試験管 Aおよび Bにそれぞれ濯ぎ液 1 0 0 / 1を取った。

(4) ついで試験管 Aには超純水 1 0 0〃 1を、そして試験管 Bには、実施例 3 で調製した RN A分解酵素試薬 1 0 0 1を加え、室温で 1 5分放置した（サンプルに含まれる RNAを分解し、 AMPに変換する）。

( 5 ) ついで、試験管 Aおよび Bに、それぞれ実施例 1および実施例 3で調製した発光試薬 1 00 1を添加し、ベルトールド社製発光量測定器 L B 950 1

(ルミノメータ一）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

そして、濯ぎ液の AT P、 AMPおよび RNA由来の AMPの濃度の合計量を測定した。

AMPの濃度は、 AT Pに換算して求めた。

それらの結果をまとめて表 6に示す。

表 6 (挽肉製造機の濯ぎ廃液の清浄度検査結果）

実施例 1 3

(1) 超純水で湿らせた綿棒で、使用直後の挽肉製造機の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、この表面に古くなったブタ肉から分離した雑菌の懸濁液を噴霧した箇所

(検査箇所）（1 0 cm² ) を拭き取った。

(2) この綿棒を、実施例 2で調製した細胞内成分抽出試薬液 5 mlを入れた試験管の中で濯いだ。

雑菌以外の汚れと雑菌の細胞内成分である ATP、 AMPおよび RNAがそれぞれ抽出された濯ぎ液 5 m 1を得た。 (3) 4本の測定用試験管 A， B， Cおよび Dにそれぞれ濯ぎ液（サンプル） 1 00〃 1を取った。

(4) ついで、試験管 Aおよび試験管 Bにはそれぞれ超純水 1 0 0 / 1を、また試験管 Cおよび試験管 Dには、それぞれ実施例 4および実施例 6で調製した R N A分解酵素試薬 1 0 0 1を加え、室温で 1 5分放置する（サンプルに含まれる RNAを分解し、 AMPに変換する）。

(5) ついで、試験管 A， B， Cおよび Dにそれぞれ実施例 2、実施例 5、実施例 4および実施例 6で調製した発光試薬 1 0 0 1を添加し、ベルトールド社製発光量測定器 LB 9 5 0 1 (ノレミノメータ一）にて、 1 0秒後の発光量を測定した。

なお、 AMPの濃度は、 AT Pに換算して求めた。

それらの結果をまとめて表 7に示す。

表 7 (雑菌に汚染された、挽肉製造機の濯ぎ廃液の清浄度検査結果）

発明の効果

本発明は、 P PDK含有発光試薬を用いるものであるから、汚れの指標成分である AT Pに加え、従来のルシフヱリン · ルンフヱラ一ゼ発光試薬では測定が困難であった ADP、 AMPおよび RNAも同時に測定して、少ぃ汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評価できる。また上記 PPDK含有発光試薬にさらに、「ADPから AT Pを生成する反応を触媒する酵素」および Zまたは「RNA分解酵素」を添加利用するものであるから、汚れの指標成分である AT Pおよび AMPに加え、さらに A DPおよび RN Aも同時に測定して、さらに少ない汚れを、感度よく検出して、より精度の高い清浄度検査を行なうことができる。

図面の簡単な説明

図 1は本発明の清浄度検査法を実施するため器具の 1具体例を示す概略図である。

1 シリンダー

2 ピストン

3 清浄度検査試薬

4 清浄度検査試薬収納槽

4 a 薄膜部材

5 汚れ採取用担体（綿棒）

5 a 汚れ採取部

6 微生物細胞内成分抽出試薬

7 微生物細胞内成分抽出試薬収納槽

丁 a tffl

7 b ia

8 突起

Claims

請求の範囲

1 . ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフヱリン、ルシフヱラーゼおよび金属塩を含むことを特徴とする清浄度検査試薬。

2 . A D Pから A T Pを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ノレシフェリン、ルシフェラ一ゼおよび金属塩とを含むことを特徴とする清浄度検査試薬。

3 . A D P、 AM Pおよび R N Aからなる群より選ばれる少なくとも一種と、 A T Pとを指標として測定することを特徴とする清浄度検査法。

4 . 検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水を接触させ、得られる接触液と、ピルペートオルトホスフエートジキナーゼ、ホスホェノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ノレシフエラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。

5 . 検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこれに微生物細胞内成分抽出試薬を接触させ、得られる接触液と、 A D P から A T Pを生成する反応を触媒する酵素および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべ一トオルトホスフェートジキナ一ゼ、ホスホエノ一ルピルビン酸、ピ口リン酸、ルシフヱリン、ノレシフヱラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。

6 . 検査対象物または、その処理物に、ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナ一ゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフヱラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。

7 . 検査対象物または、その処理物に、 A D Pから A T Pを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および R N A分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも 1種と、ピルべ一トオルトホスフヱ一トジキナーゼ、ホスホェノールピルビン酸、ピ口リン酸、ルシフヱリン、ノレシフェラ一ゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを添加し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。