MX2008012641A - Detector de lipoproteinas. - Google Patents

Abstract

De acuerdo con la presente invención se proporciona un biodetector que comprende un sustrato que contiene un analito bioquímico, un sistema enzimático, un glicoléter de bajo peso molecular y un medio de detección. El analito bioquímico es una lipoproteína de baja densidad. El sistema enzimático contiene una enzima de colesterol tal como, colesterol esterasa, colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa.

Description

DETECTOR DE LIPOPROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de un glicoléter en un detector. En particular, la presente invención, se relaciona con el uso de un glicoléter en un biodetector que solubiliza selectivamente lipoproteinas de baja densidad en colesterol (LDL, por sus siglas en inglés) con interacción mínima con lipoproteinas de alta densidad en colesterol permitiendo así la detección de LDL.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El colesterol desempeña una parte importante en la función corporal normal. Desempeña una parte en el desarrollo del tejido celular, la reproducción de membranas celulares, hormonas, y sirve para otras funciones. Sin embargo, un alto nivel de colesterol en la sangre, aumenta el riesgo de enfermedad cardiaca coronaría lo cual puede conducir a ataque cardiaco. Además, se sabe que está asociado con riesgo aumentado de apoplejía. Un paciente que sufre de altos niveles de colesterol sanguíneo se considera que está padeciendo de hipercolesterolemia . Existen dos fuentes principales de colesterol en el cuerpo. La primera fuente principal proviene del cuerpo mismo. La otra fuente principal proviene de alimentos tales como: carne, aves de corral, pescado y productos lácteos. Los alimentos que tienen alto contenido de grasa saturada, estimulan al cuerpo a aumentar la producción de colesterol . El colesterol se transfiere hacia y desde las células mediante portadores especiales tales como lipoproteinas . Esto es debido a que es insoluble en la sangre. Existen dos tipos principales de lipoproteinas. Existen lipoproteinas de baja densidad (LDL) , y lipoproteinas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) . Se sabe que las LDL tendrán una forma "mala" del portador de colesterol mientras que las HDL se sabe que serán la forma "buena" del portador de colesterol. El colesterol de la LDL tiende a acumularse en la pared interna de las arterias dando por resultado en depósitos de placa que obstruyen las arterias, conduciendo a un riesgo aumentado de ya sea un ataque cardiaco o una apoplejía. El nivel deseado de colesterol en las LDL en la sangre es de aproximadamente 100 mg/dl. Un mayor nivel (mayor a 160 mg/dl) presenta un riesgo aumentado de enfermedad cardiaca. El colesterol de HDL se cree que protege al cuerpo contra este riesgo aumentado de una enfermedad cardiaca. Se cree que las HDL portan el colesterol lejos de las arterias y regresa al hígado. Además, las HDL, también eliminan el exceso de colesterol de los depósitos plaquetarios ya presente en las arterias. Por lo tanto se ha invertido mucho esfuerzo en desarrollar detectores que pueden diferenciar entre las cantidades del colesterol de las LDL y el colesterol de las HDL en la sangre. Tradicionalmente , la cantidad de colesterol en lipoproteinas de baja densidad se ha determinado utilizando ultracentrifugación diferencial. Sin embargo, esto requiere equipo especial y puede llevar mucho tiempo hasta obtener las mediciones requeridas. Más recientemente, se han desarrollado detectores que son más fáciles de utilizar y proporcionar resultados más confiables. Estos detectores en general se conocen como biodetectores . Los biodetectores son herramientas analíticas que combinan un componente para reconocimiento bioquímico o un elemento detector con un transductor físico. Tiene amplia aplicación en estos diversos campos como supervisión persona de la salud, selección y supervisión ambiental, supervisión de bioprocesos, y dentro de la industria de alimentos y bebidas. El elemento detector biológico puede ser una enzima, anticuerpo, secuencia de ADN, o incluso un microorganismo. El componente bioquímico sirve para catalizar selectivamente una reacción o facilitar un evento de unión. La selectividad del evento de reconocimiento bioquímico permite la operación de biodetectores en una matriz de muestra compleja, es decir, un fluido corporal. El transductor convierte el evento bioquímico en una señal medible, proporcionando así los medios para detectarlo. Los eventos mensurables varían de cambios espectrales que son debido a la producción o consumo de un producto/sustrato de la reacción enzimática, al cambio másico con la complejación bioquímica. En general, los transductores toman muchas formas y así determinan el parámetro físico-químico que se medirá. De esta forma, el transductor puede basarse ópticamente, midiendo cambios tales como absorción óptica, fluorescencia, o índice de refracción. Puede ser de base másica, midiendo el cambio en la masa que acompaña a una reacción de unión derivada biológicamente. Adicionalmente , puede ser de base térmica (midiendo el cambio de entalpia (calor) o con base de impedancia (midiendo el cambio en las propiedades eléctricas) que acompañan a la interacción en capa de analito/bio-reconocimiento o con base en electroquímica. Los biodetectores ofrecen la conveniencia y facilidad de una medición distribuida, es decir, la capacidad potencial de tomar el análisis hasta el punto de relación o cuidado. Los dispositivos biodetectores diseñados y fabricados adecuadamente, se pueden producir convenientemente en masas. Sin embargo, existen diversas limitaciones para el uso de los biodetectores . Estas incluyen una vulnerabilidad del transductor para contaminación e interferencias. Los biodetectores con base enzimática se utilizan ampliamente en la detección de analitos en aplicaciones clínicas, ambientales, agrícolas y biotecnológicas . Los analitos que se pueden medir en análisis clínicos de fluidos del cuerpo humano incluyen, por ejemplo, glucosa, lactato, colesterol, bilirrubina y aminoácidos. Los niveles de estos analitos en fluidos biológicos, tales como sangre, son importantes para el diagnóstico y supervisión de enfermedades. Los detectores que se utilizan en general en los sistemas con base enzimática se proporcionan ya sea como el punto de cuidado o sobre los dispositivos contadores. Los mismos se pueden utilizar para probar muestras sanguíneas con pinchazo en el dedo enteras, sin modificar, recién preparadas, para determinar las concentraciones de colesterol total, triglicéridos , HDL y LDL, dentro, por ejemplo, 1 hasta 2 minutos de agregar la muestra a un dispositivo (obsérvese que este tiempo no es fijo y podría ser sujeto a variaciones significativas) . Estos cuatro parámetros, en combinación, se han probado clínicamente para proporcionan una indicación muy buena del riesgo de enfermedad cardiaca en adultos. Es bien sabido que el alto colesterol es asintomático . De esta forma, se recomienda que cada adulto deba tener una prueba para valorar su riesgo. Si se encuentra que su riesgo es alto, éste se puede reducir significativamente mediante la manipulación correcta de ya sea sólo la dieta, o en combinación con fármacos terapéuticos. En un ejemplo de este biodetector con base enzimática, se utiliza un análisis electroquímico para detectar el analito en cuestión. El uso se hace de un cambio en el estado de oxidación de un mediador que interactúa con una enzima que se ha hecho reaccionar con el analito que será determinado. El estado de oxidación del mediador se selecciona de tal forma que únicamente en el estado en el cual interactuará con la enzima o además del sustrato. El analito reacciona con el mediador vía la enzima. Esto provoca que el mediador ser oxide o reduzca (dependiendo de la reacción enzimática) y este cambio en el nivel de mediador se pueda medir al determinar la señal electroquímica por la corriente de ejemplo generada a un potencial determinado. Se pueden utilizar microelectrodos convencionales, típicamente con un microelectrodo de trabajo y un electrodo de referencia. El electrodo de trabajo por lo general está hecho de paladio, platino, oro o carbono. El contra-electrodo es típicamente carbón, Ag/AgCl, Ag/Ag2SO,j, paladio, oro, platino, Cu/CuS04, Hg/HgO, Hg/HgCl2, Hg/HgS04 o Zn/ZnS04. El electrodo de trabajo puede ser una pared de un receptáculo que forma el microelectrodo . Los ejemplos de microelectrodos que se pueden utilizar son aquellos expuestos en la WO03/097860 que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. La técnica anterior muestra varios métodos para detectar el colesterol de las LDL, en una muestra tal como sangre, suero o plasma. Muchos de estos métodos de la técnica anterior para determinar la concentración de colesterol se basan en la valoración de diversas propiedades, tales como, un cambio de color. EP 1 434 054, WO 03/102596 y JP 2004-354284 exponen un biodetector que utiliza un éter de polietilenglicol . La patente de los Estados Unidos No. 6 762 062 expone un método para determinar el colesterol en lipoproteínas de baja densidad. El método se basa en la medición del nivel total de colesterol en una muestra y los niveles de colesterol en las fracciones sin LDL (HDL, VLDL y quilomicras ) . La cantidad de colesterol en LDL entonces se puede determinar al restar simplemente una cantidad de la otra. La patente de los Estados Unidos No. 6 342 364 y la JP 2001-343348 también exponen sistemas para detección en LDL con base en el uso de células electroquímicas. Por lo tanto, podría ser ventajoso tener un sistema de detección que sea simple de utilizar, pero que produzca resultados consistentes y confiables y no requiera un cambio en el color como parte de la metodología de detección . De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un biodetector que comprende un sustrato que contiene un analito bioquímico, un sistema enzimático, un glicoléter de bajo peso molecular y un medio para detección. Típicamente, el sustrato es un fluido biológico tal como, sangre o plasma. El analito bioquímico determinado del fluido biológico puede ser una lipoproteína , por lo general una lipoproteína de baja densidad . El sistema enzimático puede contener una enzima de colesterol tal como, colesterol esterasa, colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa . El glicoléter de bajo peso molecular se puede seleccionar del grupo que tenga grupo de alquilenglicol recto o ramificado con 1-4 repeticiones, por lo general los grupos de alquileno son: etileno, propileno e isómeros de los mismos, butileno e isómeros del mismo, pentileno e isómeros del mismo, o combinaciones de los mismos. Los glicoléteres se pueden sustituir por cualquier grupo alquilo, tal como, Ci-C5alquilo . El glicoléter de bajo peso molecular se puede seleccionar de 2-metoxietanol , metiléter de tripropilenglicol , propiléter de dietilenglicol , butiléter de diet ilenglicol , pentiléter de dietilenglicol, l-metoxi-2-propanol , butiléter de dipropilenglicol , butiléter de tripropilenglicol, glicerol etoxilato-co-propoxilato triol, etoxilato de neopentilglicol , propoxietanol , metiléter de triet ilenglicol , propiléter de propilenglicol , 1-ter-butoxi-2-propanol , propiléter de dipropilenglicol, propiléter de tripropilenglicol o ter-butiléter de dipropilenglicol . El biodetector puede incluir además, una solución tampón acuosa. La solución tampón típicamente tiene un pH de 5 hasta 10. De mayor preferencia, la variación de pH puede ser 7-10. La resistencia iónica o resistencia salina de la solución del biodetector se puede aumentar de tal forma que se mejore la selectividad para lipoproteínas de baja densidad. La resistencia iónica se puede aumentar al agregar una sal seleccionada del grupo que consiste de cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de rutenio hexamina, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de lantano, sulfato de sodio o sulfato de magnesio . El medio de detección puede estar en la forma de una célula electroquímica. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema para detección para medir la cantidad del analito bioquímico en una muestra que comprende los pasos de: a) proporcionar una mezcla de una solución de un glicoléter de bajo peso molecular con una mezcla enzimática ; b) agregar una solución de la muestra que será probada ; c) incubar la mezcla resultante bajo condiciones que den por resultado en un cambio a una señal mensurable ; d) medir el cambio resultante; y e) cerciorarse de la cantidad del analito o determinar la diferenciación entre HDL y LDL en la muestra original utilizando una curva de calibración. El analito puede ser una lipoproteína de baja densidad . Típicamente, la señal mensurable es una señal electroquímica, colorimétrica , térmica, piezo-eléctrica o espectroscópica . El analito biológico y el reactivo, se pueden secar antes de utilizarse. El analito y el reactivo se pueden liofilizar. De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un glicoléter de bajo peso molecular para solubilizar un analito bioquímico. El glicoléter de bajo peso molecular, se puede seleccionar del grupo que contiene grupos de alquilenglicol recto o ramificado con 1-4 repeticiones, por lo general los grupos alquílenos son, etileno, propileno e isómeros, de los mismos, butileno e isómeros del mismo, pentileno e isómeros del mismo, o combinaciones de los mismos. Los glicoléteres se pueden sustituir mediante un grupo alquilo, tal como, d-C5alquilo . El glicoléter de bajo peso molecular se puede seleccionar de 2-metoxietanol , metiléter de tripropilenglicol , propiléter de dietilenglicol , butiléter de dietilenglicol, pentiléter de dietilenglicol, l-metoxi-2-propanol , butiléter de dipropilenglicol , butiléter de tripropilenglicol, glicerol etoxilato-co-propoxilato triol, etoxilato de neopentilglicol , propoxietanol, metiléter de trietilenglicol , propiléter de propilenglicol , l-ter-butoxi-2-propanol , propiléter de dipropilenglicol, propiléter de tripropilenglicol o ter-butiléter de dipropilenglicol. El glicoléter se puede utilizar para solubilizar una lipoproteína tal como, colesterol en lipoproteínas de baja densidad. En un cuarto aspecto de la invención, la resistencia iónica de la solución ayuda en la diferenciación obtenida entre los colesteroles de HDL y LDL. Se ha encontrado que un cambio en la resistencia iónica o concentración salina del liquido influye el grado relativo de reacción con los dos colesteroles. Por consiguiente, se proporciona el uso de una sal para aumentar la resistencia iónica o concentración salina de una solución que contenga una lipoproteina de baja densidad, una lipoproteina de alta densidad y un glicoléter en donde el aumento de resistencia iónica de la solución modula las solubilidades relativas de la lipoproteina de baja densidad y la lipoproteina de alta densidad. El uso de la sal para aumentar la resistencia iónica o concentración salina, típicamente aumenta la solubilidad de la lipoproteina de baja densidad con relación a la lipoproteina de alta densidad. La resistencia iónica o la concentración salina de la solución se pueden controlar mediante las sales agregadas y en los ejemplos, cloruro de potasio, sulfato de magnesio o cloruro de rutenio hexamina, se utilizó para modificar la resistencia iónica o concentración salina de la solución. Sin embargo, se pueden utilizar otras sales por ejemplo, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de rutenio hexamina, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro del lantano, sulfato de sodio o sulfato de magnesio.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Cuando se utilizan en la presente, las siguientes definiciones, definen el término establecido: El término "glicol", se refiere a alcoholes del dihidricos. El término "glicoléter", se refiere a monoalquiléteres de alcoholes dihidricos o trihidricos. El término "alquilo", incluye hidrocarburos alifáticos lineales o ramificados, saturados. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen; metilo, etilo, n-propilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, ter-butilo y lo semejante. A menos que se observe de otra manera el término, "alquilo", incluye grupos tanto alquilo como cicloalquilo . Un "fluido biológico", es cualquier fluido corporal o derivado de fluido corporal en el cual el analito se pueda medir, por ejemplo, sangre, orina, fluido intersticial, plasma, fluido dérmico, sudor y lágrimas. Un "detector electroquímico", es un dispositivo configurado para detectar la presencia o la medición de la concentración o cantidad de un analito en una muestra vía oxidación electroquímica o reacciones de reducción. Un "mediador redox" es un agente para transferencia electrónica para portar electrones entre un analito o una enzima analito reducida o analito oxidada, un cofactor u otra especie activa redox y un electrodo, ya sea directamente o via uno o más agentes para transferencia electrónica adicional. El término "electrodo de referencia", incluye tanto, a) un electrodo de referencia, como b) un electrodo de referencia, que también puede funcionar como un contraelectrodo (es decir, contra/electrodos de referencia), a menos que se indique de otra manera. El término "contra-electrodo", incluye tanto a) un contra-electrodo como b) un contra-electrodo que también puede pueda funcionar como un electrodo de referencia (es decir, un contra-electrodo de referencia) , a menos que se indique de otra manera. El término "señal mensurable", significa una señal que se puede medir fácilmente tal como una corriente eléctrica, potencial de electrodo, fluorescencia, espectroscopia de absorción, luminiscencia, dispersión de luz, NMR, IR, espectroscopia másica, cambio de calor, o un cambio piezo-eléctrico . El término "analito bioquímico", incluye cualquier químico o sustancia bioquímica mensurable que puede estar presente en un fluido biológico y también incluir cualquiera de una enzima, un anticuerpo, una secuencia de ADN, o un microorganismo. Los biodetectores conocidos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención pueden consistir de, por ejemplo, una cinta con cuatro cavidades de reactivo y una referencia común; con cada cavidad que tenga su propio electrodo de trabajo micro-banda, tal como un electrodo micro-banda tubular. El componente detector de esta cinta se proporciona al secar diferentes reactivos formulados específicamente que comprenden al menos una enzima y un mediador que interactuará con los analitos específicos en la muestra de prueba en cada cavidad. Ya que se pueden agregar potencialmente diferentes bioactivos, y secar a cada cavidad, resulta claro que es posible completar una prueba de múltiples analitos utilizando una muestra de prueba individual. El número de cavidades es variable, de esta forma el número de pruebas únicas es variable, por ejemplo se pueden utilizar detectores que utilizan entre 1 y 6 cavidades. Se pueden utilizar microelectrodos convencionales, típicamente con un microelectrodo de trabajo y un electrodo de referencia. El electrodo de trabajo para generar está hecho de paladio, platino, oro o carbono. El contra-electrodo típicamente es carbono, Ag/AgCl, Ag/Ag2S04, paladio, oro, platino, Cu/CuS04, Hg/HgO, Hg/HgCl2, Hg/HgS04 o Zn/ZnS04.

En un microelectrodo preferido, el electrodo de trabajo está en una cavidad de un receptáculo que forma el microelectrodo. Los ejemplos de microelectrodos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención se exponen en la O2003097860.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las modalidades de la presente invención se describirán ahora a manera de ejemplo únicamente con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales: La Figura 1, ilustra gráficamente los resultados obtenidos de solubilizar selectivamente LDL con respecto a HDL cuando se utiliza monopentiléter de dietilenglicol (Ej emplo 1 ) . La Figura 2, ilustra gráficamente los resultados obtenidos para solubilizar selectivamente LDL con respecto a HDL cuando se utiliza monobutiléter de dietilenglicol (Ejemplo 1) . La Figura 3, muestra la diferenciación de plasma LDL (circuios rellenos) y HDL (circuios vacíos) utilizando E2C4 (Ejemplo 9) . La Figura 4, muestra la diferenciación de plasma LDL (círculos rellenos) y HDL (círculos vacíos) utilizando P2C4 (Ejemplo 9) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1 Tampón #1 de LDL (tampón Tris-glicina al 5%, pH 9.0) Se disolvieron cristales pre-fraguados Trizma, pH 9.0 (Sigma, T-1444 ) en 950 mis de dH20 (dH20 = agua desionizada) y se registró el pH . Después de esto se agregaron 50 g de glicina (Sigma, G-7403) a la solución tris y se registró el pH. El pH se ajustó a aproximadamente 8.8-9.2 utilizando hidróxido de potasio 10M (Sigma, P-5958) y la solución se constituyó a 1000 mis con dH20 y se registró el pH final (pH 9.1). La solución se almacenó a 4°C.

Soluciones de glicoléter Se preparó una solución de glicoléter de doble cadena utilizando tampón #1 de LDL. Monopentiléter de dietilenglicol ( Sigma-Aldrich, 32285) . Aproximadamente 2.5% (0.0218 g en 872 µ? de tampón #1 de LDL) . Monobutiléter de dietilenglicol (Sigma-Aldrich, 537640) . Aproximadamente 10% (0.0640 g en 640 µ? de tampón #1 de LDL) .

Muestras de LDL y HDL Scipac Las muestras de LDL (Scipac, P232-8) y HDL (Scipac, P233-8) se prepararon a lOx la concentración requerida (debido a una dilución 1:10 en la mezcla de prueba final) utilizando suero sin lipidos (Scipac, S139) . Las muestras luego se analizaron utilizando un analizador clínico Space (Schiappanelli Biosystems Inc) .

Mezcla de enzimas La mezcla de enzimas se preparó a doble resistencia, utilizando tampón #1 de LDL. Cloruro de rutenio de hexamina (III) 160 mm (Alfa Aesar, 10511) . Dinucleótido de tionicotinamida adenina 17.7 mm (Oriental Yeast Co) . 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa (Biocatalysts) . 6.7 mg/ml de colesterol esterasa (Sorachim/Toyobo, COE-311) 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina (Amano, CHDH-6) .

Protocolo de prueba 9 µ? de una solución de glicol de resistencia se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas A T=-30 segundos, se mezclaron 2 µ? de la muestra (ya sea lOx concentrada LDL o HDL, o suero sin lipidos) con la mezcla de glicoléter : enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante colocada sobre un electrodo. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometria . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 5 puntos de tiempo (10, 32, 63, 90 y 110 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado.

Análisis Los datos se analizaron junto con la concentración de LDL, HDL y suero sin lipido proveniente del analizador Space. Los gradientes de respuesta a HDL y LDL para cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido de la medición de LDL y HDL. La Figura 1 y Tabla 1, ilustran gráficamente los resultados obtenidos para solubilizar selectivamente LDL sobre HDL utilizando monopentiléter de dietilenglicol. La Figura 2 y Tabla 2, ilustran gráficamente los resultados obtenidos para solubilizar selectivamente LDL sobre HDL utilizando monobutiléter de dietilenglicol.

Conclusiones El monobutiléter de dietilenglicol (5%) mostró diferenciación preferencial para LDL de >35%. El monopentiléter de dietilenglicol (1.25%) también mostró diferenciación preferencial para LDL aunque a un grado menor de >20%.

E emplo 2 : Colesterol estearasa Genzyme contra lipasa Genzyme Soluciones RuAcAc = [Ru111 (acac) 2 (py-3-C00H) (py-3-C00) ] . Se preparó una solución Ruacac 30 ram utilizando un tampón que contuvo kCl O.lM, Tris pH 9.0, glicina al 5%. Solución de butiléter de dietilenglicol: Se preparó una solución de glicoléter al 10% utilizando la solución RuAcac. Se preparó una mezcla de enzimas utilizando la solución Ruacac: Dinucleótido de tionicotinamida 17.7 mM. 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa . 6.7 mg/ml de colesterol esterasa o 6.7 mg/ml de lipasa . 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina, Las muestras de LDL (Scipac, P232-8) y HDL (Scipac, P233-8) se prepararon utilizando suero sin lipidos (Scipac, S139). Las muestras luego se analizaron utilizando un analizador clínico Space ( Schiappanelli Biosystems Inc) .

Protocolo de prueba 9 µ? de una solución de glicoléter de doble resistencia (o solución Ruacac sin glicoléter) se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, se mezclaron 2 µ? de la muestra (LDL o HDL, o suero sin lípido) con la mezcla de glicoléter : enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante y se colocó sobre un electrodo. El electrodo es como se describe en la WO200356319. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometría . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 7 puntos de tiempo (0, 28, 56, 84, 112, 140 y 168 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV, al punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado.

Resultados Cuando E2C4 es butiléter de dietilenglicol . Los gradientes para cada punto de tiempo utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido partir de la medición de LDL y HDL y se muestran en la Tabla 3.

Conclusiones En presencia de butiléter de dietilenglicol al %, utilizando ya sea colesterol esterasa o lipasa confiere una diferenciación LDL sobre la mezcla de enzimas, aunque la diferenciación para LDL es superior con colesterol esterasa . Estos datos indican que la diferenciación con lipasa cambia de la diferenciación de HDL a la diferenciación de LDL mediante la adición de butiléter de dietilenglicol . Esto muestra que el butiléter de dietilenglicol tiene un efecto más fuerte sobre la diferenciación de LDL que el tipo de la enzima para hidrolizar colesterol éster.

Ejemplo 3: Identi icación de la concentración óptima de butiléter de dietilenglicol para solubilizar selectivamente LDL. El propósito del experimento fue valorar el monobutiléter de dietilenglicol para identificar la concentración óptima para solubilizar selectivamente LDL con interacción mínima de HDL con el fin de detectar LDL.

Soluciones : Solución de RuAcAc : RuAcac 30 mM se preparó utilizando tampón que contuvo Tris pH 9.0, sacarosa al 10% y KC1 0.1 . Las soluciones de glicoléter se prepararon a 12%, %, 8%, 6%, 4% y 2% de butiléter de dietilenglicol en la solución Ruacac anterior. La mezcla de enzimas (que contenia colesterol esterasa) y las muestras de LDL y HDL se prepararon con las mismas fórmulas que en el Ejemplo 2.

Método : El experimento y análisis se llevaron a cabo de acuerdo con el método descrito en el experimento 2. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Conclusiones El gradiente de respuesta para LDL, aumentó con la concentración cada vez mayor de butiléter de dietilenglicol. Esto dio por resultado en la diferenciación para LDL que es la mayor al 6% de butiléter de dietilenglicol.

Ejemplo 4: Identificación de la concentración óptima de butiléter de dipropilenglicol para solubilizar selectivamente LDL El propósito del experimento fue variar la concentración de monobutiléter de dipropilenglicol para identificar la concentración óptima para solubilizar selectivamente LDL con interacción mínima de HDL para el propósito de detectar LDL.

Soluciones Las muestras de tampón Ruacac 30 mM, solución de enzimas (conteniendo colesterol esterasa) y HDL o LDL Scipac, se prepararon como se describió en el Ejemplo 2. Las soluciones de glicoléter se prepararon utilizando 3.5%, 3%, 2.5%. 2%. 1.5% y 1% de butiléter de dipropilenglicol en la solución de Ruacac descrita anteriormente .

Métodos El experimento se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Conclusiones A medida que se aumentó la concentración de butiléter de dipropilenglicol, se obtuvo un gradiente aumentado de respuesta a LDL. Esto dio por resultado en una diferenciación aumentada para LDL. La mayor diferenciación se obtuvo a 1.5 y 1.75% de butiléter de dipropilenglicol .

Ejemplo 5: Identificación de agentes que muestran selectividad aumentada para LDL El propósito de experimento fue identificar agentes que muestran selectividad para LDL con interacción mínima de HDL para el propósito de detectar LDL.

Soluciones Soluciones de glicoléter: cada solución de glicoléter se preparó utilizando tampón Tris, pH 9.0, glicina al 5%. Las siguientes cantidades proporcionaron una solución de glicoléter de doble resistencia. Favor de observar que debido a pequeñas variaciones en el peso, los porcentajes son sólo aproximaciones: 2-metoxietanol (Aldrich 185469) 10% (0.0477g en 477 µ? de tampón) Metiléter de trietilenglicol (Fluka 90450) 10% (100 µ? + 900 µ? de tampón) Propiléter de dietilenglicol (Aldrich 537667) 10% (0.0947 g en 947 µ? de tampón) Butiléter de dietilenglicol (Aldrich 537640) % (0.0640 g en 640 µ? de tampón) Pentiléter de dietilenglicol (Fluka 32285) 2.5% (0.0218 g en 872 µ? de tampón) l-metoxi-2-propanol (Aldrich 65280) 10% (0.0459 g en 459 µ? de tampón) Butiléter de dipropilenglicol (Aldrich 388130) 2.5% (0.0121g en 484 µ? de tampón) Metiléter de tripropilenglicol (Aldrich 30,286-4) 10% (0.0463 g en 463 µ? de tampón) Butiléter de tripropilenglicol (Aldrich 48,422-9) 2.5% (0.0176 g en 704 µ? de tampón) Glicerol etoxilati-co-propoxilato triol (Aldrich 40,918-9) 5% (0.0534 g en 1.068 mi de tampón) Etoxilato de neopentilglicol (Aldrich 410276) 10% (0.0619 g en 619 µ? de tampón) Propiléter de propilenglicol (Sigma-Aldrich 424927) 10% (0.0444 g en 444 µ? de tampón) l-ter-butoxi-2-propanol (Sigma-Aldrich 433845) 10% (0.0470 g en 470 µ? de tampón) Propiléter de dipropilenglicol (Sigma-Aldrich 484210) 10% (0.0458 g en 458 µ? de tampón) Propiléter de tripropilenglicol (Sigma-Aldrich 469904) 10% (0.0435 g en 435 µ? de tampón) Ter-butiléter de dipropilenglicol (Sigma-Aldrich 593346) 10% (0.0417 g en 417 µ? de tampón) 2-propoxietanol (Sigma-Aldrich 82400) 10% (0.0444 g en 444 µ? de tampón) Muestras LDL y HDL Scipac: Las muestras de LDL y HDL se prepararon utilizando suero sin lipidos.

Mezcla de enzimas La mezcla de enzima se preparó utilizando tampón Tris, pH 9.0, glicina al 5% descrita anteriormente para contener : Cloruro de rutenio hexamina (III) 160 mM Dinucleótido de tionicotinamida adenina 17.7 mM 8.4mg/ml de putidaredoxinreductasa 6.7 mg/ml de colesterol esterasa 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina Protocolo de prueba 9 µ? de solución de glicol se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, 2 µ? de la muestra (ya sea LDL, HDL, o suero sin lipidos) se mezcló con la mezcla de glicoléter : enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo. El electrodo es como se describe en la WO200356319. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometria . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 5 puntos de tiempo (10, 32, 63, 90 y 110 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado.

Resultados Los datos se analizaron y el gradiente en el primera punto de tiempo se utilizó para calcular % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL. Estos resultados se muestran en la Tabla 6.

Ejemplo 6: Valoración de KC1 500 a 1500 mM El efecto del experimento fue investigar el efecto de la resistencia iónica aumentada sobre la respuesta de LDL y HDL en presencia de monobutiléter de dietilenglicol .

Soluciones Solución Ruacac 30 mM: RuAcac 30 mM, Tris pH 9.0, glicina al 5%, butiléter de dietilenglicol al 5%. Las soluciones de KC1 a KC1 3M, 2M, 1.5M y 1M, se prepararon en la solución de Ruacac descrita anteriormente. La mezcla de enzimas se preparó en la solución de Ruacac descrita anteriormente: Dinucleótido de tionicotinamida adenina 17.7 mM 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa 6.7 mg/ml de colesterol esterasa 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa Las muestras de LDL y HDL Scipac se prepararon en sueros sin lipidos.

Protocolo de prueba 9 µ? de la solución de KC1 se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, 2 µ? de la muestra se mezcló con la mezcla de KC1: enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometria . La corriente de oxidación se midió 0.15mV a 7 puntos de tiempo (0, 32, 64, 96, 128, 160 y 192 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado. Los datos se analizaron. Los gradientes para cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Conclusiones El aumento de la concentración de KC1 a muy alta concentración (1.5 ) redujo la diferenciación para LDL al aumentar el gradiente de respuesta a HDL. Se obtuvo una alta diferenciación a LDL a 500, 750 y KC1 1 M.

Ejemplo 7: Valoración de KC1 0 hasta 500 mM El propósito del experimento fue investigar el efecto de la resistencia iónica sobre la respuesta de LDL y HDL en presencia de butiléter de dietilenglicol .

Soluciones Se preparó una solución RuAcac 30 mM en tampón que contuvo Tris pH 9.0, glicina al 5%, solución de butiléter de dietilenglicol al 5%. Las soluciones de KC1 se prepararon a concentraciones de 1M, 500mM, lOOmM en tampón Ruacac descrito anteriormente. La mezcla de enzimas se preparó a doble resistencia utilizando solución Ruacac: Dinucleótido de tionicotinamida de adenina 17.7mM (Oriental Yeast Co) 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa ( Biocatalysts ) 6.7 mg/ml de colesterol esterasa (Genzyme) 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina (Amano, CHDH-6) Las muestras de LDL y HDL Scipac se prepararon en suero sin lipido proveniente de Scipac.

Protocolo de prueba 9 µ? de ya sea la solución de KC1 o la solución Ruacac (modelo) se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, 2 µ? de la muestra (ya sea LDL o HDL concentrada lOx, o suero sin lipidos) se mezcló con la mezcla de KC1: enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo. El electrodo es como se describe en la O200356319. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometria . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 7 puntos de tiempo (0, 32, 64, 96, 128, 160 y 192 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó en el duplicado.

Resultados Los datos se analizaron. Los gradientes para cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Conclusiones El aumento de la concentración de KC1 en la variación de 0-500 mm dio por resultado en mayor diferenciación para LDL con una concentración cada vez mayor de KC1, debido al gradiente aumentado de respuesta a LDL.

Ejemplo 8: Investigación de la resistencia iónica sobre la solubilización selectiva de LDL El propósito del experimento fue investigar el efecto de la resistencia iónica sobre solubilización selectiva de LDL con una interacción mínima de HDL con el fin de detectar LDL, al variar la concentración del mediador de cloruro de Ru hexamina .

Soluciones Una solución de glicoléter que contuvo monobutiléter de dietilenglicol al 12% se preparó en tampón Tris (pH 9.0, glicina al 5%). Las muestras de LDL & HDL Scipac se prepararon a diversas concentraciones utilizando suero sin lípido Scipac . Las mezclas de enzima se prepararon a doble resistencia utilizando tampón Tris pH 9.0, glicina al 5%. Se prepararon cuatro mezclas de enzimas por separado, conteniendo cloruro de rutenio hexamina ya sea 80, 160, 240 ó 480 mm: Cloruro de rutenio hexamina (III) 80, 160, 240 ó 480 mm 17.7 mM de dinucleótido de tionicotinamida adenina 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa 6.7 mg/ml de colesterol esterasa 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina .

Protocolo de prueba 9 µ? de una solución de glicoléter de doble resistencia se mezcló con 9 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, 2 µ? de la muestra (ya sea LDL o HDL concentrado lOx, o suero sin lipidos) se mezcló con la mezcla de glicoléter : enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo (el electrodo es como se describe en la WO200356319) . A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometria . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 5 puntos de tiempo (0, 28, 56, 84 y 112 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado.

Análisis Los datos se analizaron y los gradientes para cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre LDL y HDL. Los resultados del primer punto de tiempo 0 segundos, se muestran en las Tablas 9A-D.

Conclusiones Se obtuvo la mayor diferenciación para LDL con cloruro de Ru hexamina 80 mm. Mientras que no se desee estar vinculados por ninguna teoría particular se puede suponer que el cambio en los niveles iones presentes altera el poder de solvatación relativo del co-solvente para los colesteroles hasta que la resistencia iónica o la concentración iónica alcanza un nivel en el cual se limita la solubilidad.

Ejemplo 9: Calibraciones de plasma con butiléter de dietilenglicol o butiléter de dipropilenglicol El propósito del experimento fue investigar la respuesta al LDL y HDL de plasma en presencia de monobutiléter de dietilenglicol (E2C4, por sus siglas en inglés) o monobutiléter de dipropilenglicol (P2C4).

Soluciones Tampón KC1 : tampón Tris pH 9.0, glicina al 5%, KC1 0.2M. Se preparó Ruacac 40 mM utilizando solución tampón con KC1 descrita anteriormente. La solución de KC1 3 M se preparó en la solución Ruacac descrita anteriormente. Mezclas de enzimas: mezcla de enzimas (sin co- solvente) se preparó utilizando solución Ruacac: Dinucleótido de tionicotinamida adenina 17.7 mM 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa 6.7 mg/ml de colesterol esterasa 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenasa, libre de gelatina. La mezcla de enzimas que contuvo E2C4 al 12%: 0.0304 g de E2C4 ( Sigma-Aldrich) se disolvió en 253 µ? de mezcla de enzimas. La mezcla de enzimas que contuvo P2C4 al 3.5%: 0.0075 g de P2C4 (Sigma-Aldrich) se disolvió en 250 µ? de la mezcla de enzimas. Muestras de plasmas: muestras de plasma congelado se descongelaron durante al menos 30 minutos, antes de centrifugación durante 5 minutos. Las muestras luego se analizaron utilizando un analizador clínicos Space ( Schiappanelli Biosystems Inc) .

Protocolo de prueba Para la mezcla de enzimas que contuvo E2C4, 1.5 µ? de la solución de KC1 3 se mezcló con 7.5 µ? de la mezcla de enzimas. A T=-30 segundos, 9 µ? de la muestra (ya sea plasma o suero sin lípidos) se mezcló con la mezcla de KC1: enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo. A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometría . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 7 puntos de tiempo (0, 32, 64, 96, 128, 160 y 192 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó por duplicado. Para la mezcla de enzimas que contiene P2C4, a T=-30 segundos, 9 µ? de la mezcla de enzimas se colocó con 9 µ? de la muestra (ya plasma o suero sin lipidos) . 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo y a T=0 segundos inició la prueba de cronoamperometria como anteriormente para E2C .

Análisis Los datos se analizaron. Los gradientes cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL.

Resultados Utilizando E2C4, la diferenciación para LDL plasmático fue del 103% en el tiempo T=0 segundos (Figura 3-HDL mostrado por circuios vacíos, LDL mostrado por círculos rellenos). Utilizando P2C4, la diferenciación para LDL plasmático fue del 91% a T=96 segundos (Figura 4-HDL mostrado por círculos vacíos, LDL mostrado por círculos rellenos ) .

Conclusiones La mayor diferenciación para LDL plasmático se obtuvo con ya sea E2C4 o P2C4.

Ejemplo 10: Experimento para identificar agentes que solubilizarán selectivamente LDL con mínima interacción de HDL para el propósito de detectar LDL Soluciones Tampón de KCl 0.1M = tampon Tris, pH 9.0, glicina KCl 0.1 .

Soluciones de glicoléter : Se preparó una solución de glicoléter de doble resistencia utilizando tampón de KCl 0.1M. Butiléter de dietilenglicol (Aldrich 537640) 10% (0.0958 en 958 µ? de tampón KCl) Mezcla de enzimas: La mezcla de enzimas se preparó utilizando tampón de KCl 0.1M y contuvo: RuAcac 40mM Dinucleotido de tionicotinamida adenina 17.7 m 8.4 mg/ml de putidaredoxinreductasa 6.7 mg/ml de colesterol esterasa 44.4 mg/ml de colesterol deshidrogenase, libre de gelatina Muestras de LDL y HDL Scipac: Las muestras de LDL (Scipac, P232-8) y HDL (Scipac, P233-8) se prepararon a lOx la concentración requerida utilizando suero sin lipidos (Scipac, S139) . Las muestras luego se analizaron utilizando un analizador clínicos Space ( Schiappanelli Biosystems Inc) .

Protocolos de prueba 9 µ? de solución de glicoléter se mezcló con 9 µ? de la mezcla de la enzima. A T=-30 segundos, 2 µ? de la muestra (LDL o HDL, o suero sin lipidos) se mezcló con la mezcla de glicoléter : enzima resultante y 9 µ? de la solución resultante se colocó sobre un electrodo (el electrodo como se describe en la O200356319) . A T=0 segundos se inició la prueba de cronoamperometría . La corriente de oxidación se midió a 0.15mV a 5 puntos de tiempo (0, 35, 63, 90, 118, 145 y 172 segundos), con una corriente de reducción medida a -0.45mV en el punto de tiempo final. Cada muestra se probó "por duplicado.

Análisis Estos datos se analizaron junto con la concentración de LDL, HDL y suero sin lipidos proveniente del analizador Space . Los gradientes para cada punto de tiempo se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Conclusiones Se obtuvo una mayor diferenciación para LDL con butiléter de dietiienglicol.

La Tabla 1, ilustra gráficamente los resultados obtenidos de solubilizar selectivamente LDL con respecto a HDL cuando se utiliza monopentiléter de dietiienglicol (Ejemplo 1) .

TABLA 1 La Tabla 2, ilustra gráficamente los resultados obtenidos para solubilizar selectivamente LDL con respecto a HDL cuando se utiliza monobutiléter de dietiienglicol (Ejemplo 1) .

TABLA 2 TIEMPO en segundos Monobutiléter de dietilenglicol (5%) 0 35 63 90 118 Gradiente 604.33 556.68 481 .10 391 .90 302 .75 LDL (0.564) Intercepción 47.31 43.33 41. 99 40. 53 38. 97 Gradiente 381.16 320.52 255 .73 193 .62 140 .93 HDL (0.652) Intercepción 52.14 47.79 45. 84 43. 67 41. 40 % de diferencia 36.93 42.42 46. 85 50. 59 53. 45 La Tabla 3, muestra los resultados del Ejemplo 2. (Donde E2C4 es butiléter de dietilenglicol). Los gradientes para cada punto temporal se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido de la medición de LDL y HDL.

TABLA 3 La Tabla 4, muestra los resultados del Ejemplo 3. Los gradientes para cada punto temporal se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido a partir de la medición de LDL y HDL.

TABLA 4 La Tabla 5, muestra los resultados de Ejemplo 4. Los gradientes para cada punto temporal se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido de la medición de LDL y HDL.

TABLA 5 La Tabla 6, muestra los datos del Ejemplo 5. El gradiente en el primer punto temporal se utilizó para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL.

TABLA 6 La Tabla 7, muestra los resultados del Ejemplo 6. Los gradientes para cada punto temporal se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL.

TABLA 7 KC1 a 500 m KC1 a 750 mM KC1 a 1M C1 a 1.5M Gradientes a 0 LDL 183.64 183 .64 207 .96 228 .53 segundos HDL 46.44 62. 84 52. 86 114 .67 % de 74.71 65. 78 74. 58 49. 82 diferenciación La Tabla 8, muestras los datos del Ejemplo 7. Los gradientes para cada punto temporal se utilizaron para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL.

TABLA 8 Modelo KC1 a 500 mM KC1 a 250mM KC1 a 500mM Gradientes a LDL 41.45 60 .73 93 .36 117 .61 0 segundos HDL 18.98 21 .65 22 .91 23. 15 % de 54.20 64 .35 75 .46 80. 32 diferencición Las Tablas 9A-D, muestran los resultados para el primer punto temporal de 0 segundos del Ejemplo 8. El gradiente para cada punto temporal se utilizó para calcular el % de diferenciación obtenido entre la medición de LDL y HDL.

TABLA 9A Ruhex a 40 nM Tiempo/segundo 0 LDL Gradiente /nA/nM 316.78 HDL Gradiente /nA/nM 120.40 % de diferenciación 61.99 TABLA 9B TABLA 9D La Tabla 10, muestra el gradiente para cada punto temporal utilizado para calcular el % de diferenciación entre la medición de LDL y HDL (del Ejemplo 10) .

TABLA 10 E2C4 al 5% (RC0027) ; NM002 a 20 mM; C1 a 0.1M 0 35 63 90 118 145 172 LDL Gradiente 43 54 72 93 117 137 152 HDL Gradiente 17 15 16 19 29 44 60 % de diferencia 60 72 78 80 75 68 60

Claims (30)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un biodetector caracterizado porque comprende un sustrato que contiene un analito bioquímico, un sistema de enzimas, un glicoléter de bajo peso molecular y un medio para detección.
2. 2. El biodetector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato es un fluido biológico tal como, sangre, suero o plasma.
3. 3. El biodetector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el analito bioquímico determinado a partir del fluido biológico es una lipoproteína .
4. 4. El biodetector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la lipoproteína es una lipoproteína de baja densidad.
5. 5. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema de enzimas contiene una enzima de colesterol tal como, colesterol esterasa, colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa .
6. 6. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el glicoléter de bajo peso molecular se selecciona del grupo que tiene 1-4 grupos alquileno recto o ramificado de repetición .
7. 7. El biodetector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el grupo alquileno es etileno, propileno e isómeros de los mismos, butileno e isómeros del mismo, o pentileno e isómeros del mismo, o combinaciones de los mismos.
8. 8. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el glicoléter se sustituye por un grupo alquilo sustituido opcionalmente por uno o más grupos alcoxi.
9. 9. El biodetector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el grupo alquilo es C1-C5 alquilo.
10. 10. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el grupo alquileno o alquilo se sustituye con 1-4 grupos alcoxi.
11. 11. El biodetector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los 1-4 grupos alcoxi son 1-4 grupos etoxi.
12. 12. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el glicoléter de bajo peso molecular es 2-metoxietanol , metiléter de tripropilenglicol , propiléter de dietilenglicol , butiléter de dietilenglicol , pentiléter de dietilenglicol, l-metoxi-2-propanol, butiléter de dipropilenglicol, butiléter de tripropilenglicol, glicerol etoxilato-co-propoxilato triol, etoxilato de neopentilglicol , propxietanol , metiléter de trietilenglicol, propiléter de propilenglicol , 1-ter-butoxi-2-propanol, propiléter de dipropilenglicol, propiléter de tripropilenglicol o ter-butiléter de dipropilenglicol.
13. 13. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el biodetector incluye además una solución tampón acuosa.
14. 14. El biodetector de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la solución tampón típicamente tiene un pH alcalino.
15. 15. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque la resistencia iónica de la solución se aumenta de tal forma que se mejore selectivamente la lipoproteína de baja densidad .
16. 16. El biodetector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la resistencia iónica de la solución se aumenta al agregar una sal seleccionada del grupo que consiste de cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de rutenio hexamina, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de lantano, sulfato de sodio o sulfato de magnesio.
17. 17. El biodetector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de detección está en la forma de una célula electroquímica .
18. 18. Un sistema de detección para medir la cantidad de un analito bioquímico en una muestra, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar una mezcla de una solución de un glicoléter de bajo peso molecular con una mezcla de enzimas ; b) agregar una solución de la muestra que será probada; c) incubar la mezcla resultante bajo condiciones que den por resultado en un cambio para una señal mensurable; d) medir el cambio resultante; y e) cerciorarse de la cantidad de analito o determinar la diferenciación entre HDL y LDL en la muestra original utilizando una curva de calibración.
19. 19. El sistema para detección de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el analito es una lipoproteína de baja densidad
20. 20. El sistema para detección de conformidad con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, caracterizado porque la señal mensurable es una señal electroquímica, colourimétrica , térmica, piezo-eléctrica o espectroscópica .
21. 21. El sistema para detección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque el glicoléter de bajo peso molecular es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-12.
22. 22. Un sistema para detección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque el analito biológico y los reactivos se secan antes de utilizarse.
23. 23. El uso de un glicoléter de bajo peso molecular para solubilizar un analito bioquímico.
24. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el glicoléter de bajo peso molecular es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6-12.
25. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque el glicoléter se utiliza para solubilizar una lipoproteína tal como, una lipoproteína colesterol de baja densidad.
26. 26. El uso de una sal para aumentar la resistencia iónica de una solución que contiene una lipoproteína de baja densidad, una lipoproteina de alta densidad y un glicoléter, en donde el aumento de la resistencia iónica de la solución modula las solubilidades relativas de la lipoproteina de baja densidad y la lipoproteina de alta densidad.
27. 27. El uso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el aumento de resistencia iónica aumenta la solubilidad de la lipoproteina de baja densidad con relación a la lipoproteina de alta densidad.
28. 28. El uso de conformidad con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, caracterizado porque la sal se selecciona de grupos que consiste de cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de rutenio hexamina, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de lantano, sulfato de sodio o sulfato de magnesio.
29. 29. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizado porque la concentración de la sal está en la variación de 0.1M-1M.
30. 30. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizado porque la resistencia iónica de la solución está en la variación de 0.5M-1.5M.