WO1999011665A1

WO1999011665A1 - Human thrombopoietin produced by established human cell lines, process for producing the same, and medicinal compositions containing the same

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Publication number: WO1999011665A1
Application number: PCT/JP1998/003884
Authority: WO
Inventors: Haruhiko Morita; Atsushi Matsumoto; Takashi Kato; Hideya Ohashi
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2000-03-01
Also published as: AU8888198A; JP4236376B2; KR20010023238A; TWI235158B; KR100562929B1; CN1278267A

Description

明細書ヒト株化細胞が産生するヒトトロンボポェチン、その製造方法およびそれを含む医薬組成物発明の背景

発明の分野

本発明は、ヒト株化細胞が産生する新規なヒトトロンボポェチン糖タンパク質に関し、特に抗原性の低下や体内動態の改善等が認められる新規のヒトト口ンボポェチン糖タンパク質、その製造方法、およびそれを含む医薬組成物に関する。関連技術の開示

ヒトトロンボポェチン（ thrombopo ietin; 「 T P 〇」と称する）は、サイト力インのレセブタ一ス一ノ一ファミリーの一つである Μ Ρ 1 のリガンドとしてクロ一ニングされた糖タンノク質である（ de Sauvage ら、 N a t u r e ( L ondo n ) 369 巻、 53 3-565 頁、 ( 1994) ； Bart 1 ey, T. D. ら、 C e l l 77 巻、 1117-1 124 頁、（ 1994)) 。これらの M p 1 リガンドはいずれも血小板減少症の動物（例えばヒト、マウス、ィヌなど）の血清や血漿中に検出され、巨核球形成や血小板形成への関与が確認されている。

血小板減少症の治療剤の開発を念頭において、本発明者らも、ラット骨髄より高度に純化した巨核球前駆細胞からの巨核球生成を促進する活性を指標にして、血小板減少症のラット血漿よリラット T P O を精製し、その部分アミノ酸配列に基づいて、ラット T P O c D N A、さらにはヒト T P O c D N A をクロ一ニングし、遺伝子組換え技術によって大量に均一なヒト T P O を取得することに成功した（H. Miyazaki ら、 E xp. Hemato 1. 22 巻、 838 頁、（ 1994)) 。本発明者らが取得に成功したこのヒト T P 0 は、前述のヒト M p 1 リガンドとして取得された因子と同一のアミノ酸配列であることが判明している（後記の配列表：配列番号 1 参照）。

本発明者らは、該ヒト T P 0 を制ガン剤や免疫抑制剤の投与、あるいは放射線照射や B M T によって骨髄抑制の起きた血小板減少症のマウスに投与したところ、血小板減少阻止効果、血小板増加促進効果、さらには、造血機能の亢進が認められ、該ヒト T P 0 がこれらの血小板減少症に有効であることを見いだしている。ヒト T P 〇についてはこれまでに、ヒト血漿中の T P 〇について報告力 'なされている（ Matsumoto, A. ら、 38th Annual M eet ing of the ASH ( 1996) )が、いまだ単離 · 精製されたものはないため、その構造、機能等については知られていなまた、各種細胞で T P O を産生するものも m R N A および ELISA レベルでは検出されている。ヒト肝臓由来細胞（ HepG2) では ( H i no , M. ら、 Biochem B i ophys Res Commun 217 巻、 4 75-481 頁、（ 1995))、構成的な m R N Aの発現が検出されている。また、ヒト胎児腎臓細胞（ HEK)では m p 1 発現細胞（ M0- 7e, BaF3/mp l)を増殖させる活性と T P O m R N A を検出している。しかしながらこれも単離 . 精製されてはおらず、 in vi vo の活性も含めてその構造、機能等については知られていな

—方、遺伝子組換え技術を用いた組換えヒト T P O としては、アフリカミドリザル腎臓細胞（ C 0 S - 1 )において発現させたもの（ Kato, T. ら、 J. B iochem 118 巻 229-236 頁、 ( 199 5) ) 、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ CH0)において発現させたもの（ Mori ta, H. ら、 FEBS Lett. 395 巻 228-334 頁、 ( 1995 ) ； Kato, T. ら、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . U. S. A. 94 巻

4669-4697 頁、（ 1997 ) ) 、大腸菌にて発現させたもの（ Ann, M. F. ら、 Blood 86 巻 54-59 頁、（ 1995)) 、 Baby Hamster 腎臓細胞（ BHK)で発現させたもの ( Ross, H. ら、 B iochemist ry 35 巻 14849- 14861 頁（ 1996 ) )、ヒト胎児腎臓細胞（ HEK29 3) で発現させたもの ( de Sauvage ら、 Nature 369 巻、 533- 538 頁 ( 1994) ； Bart ley, T. D. ら、 Cel l 77 巻、 1117-1124 頁、（ 1994) ) 等が知られている。

しかし、これまでに T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞で発現させた T P 0 についての報告はない。

また、上記の種々の非ヒト株化細胞が産生する T P O と、ヒト株化細胞が産生するヒト T P O ゃヒト血中で認められる T P 0 との構造の異同等については何等知られていない。ましてや、その構造の異同と T P O の機能との関係については何等報告されていないのが現状である。

一般に、 T P O のような生理活性糖タンパク質の場合、主要 T P O 産生臓器以外にも該タンパク質を産生している臓器があり、その臓器 /臓器由来細胞の種類によって、産生されている該糖タンパク質の構造が異なる場合がある。同様に、遺伝子組換え技術を用いた組換え糖タンパク質の場合、用いる宿主細胞によって産生される糖鎖構造が異なることが知られている。特に動物細胞を用いる場合はその種類 (動物種、あるいは由来する臓器の種類、細胞株等）によつて付加される糖鎖構造は様々であリ、その差異がタンパク質の機能、主に、抗原性、体内動態等に影響を与えることも少なくない。事実、これまでに多くの遺伝子組み換え蛋白医薬品に対する抗体産生の報告（Steis ら、 N. Eng. J. Med. 318 巻、 1409- 1413 頁（ 1988) など）があるが、これは体内をめぐる天然体蛋白と構造的、機能的な差があるからに他ならな抗原性、体内動態に関してより優れた性質を有するヒト T

P O耱タンパク質であれば、医薬品としての価値を一層高めることが期待できる。

発明の要約

本発明は、ヒト株化細胞が産生するヒトトロンボポェチン

( T P O ) を提供する

本発明の実施態様において、 T P 0 は、内在性又は外来性のヒト T P O 遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であつて、単離 ' 精製されたものである。また、ヒト株化細胞としては、 T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞、例えば J H H 7 ( F ERM BP - 6049)、 H u H 7 ( FERM BP - 6048)等のヒ卜肝臓由来細胞ゃヒト骨髄ストロ一マ細胞を挙げることができる。

本発明の T P O は、 SSA -レクチンカラムに親和性を有する糖鎖構造をもつものか、あるいは、少なくとも α 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつものであることができる。そのアミノ酸配列は、例えば配列表の配列番号 1 に示す 1 位〜 332 位のアミノ酸を有するものである。

本発明はまた、上記定義のヒト Τ Ρ Ο を有効成分とする医薬組成物を提供する。具体的には、該 Τ Ρ 0 は血小板増加剤、血小板障害治療剤、血小板減少症治療剤として用いることができる。本発明の Τ Ρ Ο は、薬剤として使用されるとき、抗原性の低下や体内動態の改善などの利点を付与することができる。

本発明はさらに、 Τ Ρ Ο 産生臓器由来ヒト株化細胞において外来性のヒト Τ Ρ Ο 遺伝子を発現させることを含む、ヒト Τ Ρ Ο の製造方法を提供する。ヒト株化細胞として、上記のヒト肝臓由来細胞（例えば J H H 7 ( FERM BP- 6049) 等）やヒト骨髄ストロ一マ細胞を用いること力 'できる。このような方法によって得ることができるヒト T P O も本発明に包含される。

本発明はさらにまた、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Ο を提供する。ここで、ヒト T P 0 は外来性のヒト T P 0遺伝子の株化細胞における発現産物であって、単離 · 精製されたものとすることができ、また株化細胞としては、 a , 6 — シァリルトランスフェラーゼ遺伝子が導入された C H 0細胞であることができる。

本発明はまた、 C H 0細胞に α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入し、該 C H O細胞においてヒト T P O遺伝子を発現させることを含む、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Ο の製造方法、あるいは、 C H O細胞においてヒト Τ Ρ Ο遺伝子を発現させ、該 C H O細胞に ci 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入することを含む、少なくとも α 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Οの製造方法を提供する。

図面の簡単な説明

図 1 は、 recChoTPO 、 nat i veHepTPO ( JHH7) および nat iveH epTPO ( HuH7) の電気泳動による分子量の比較を示す写真である。検出は、エレクトロブロッティッグ後、抗 T P 〇ャギ I g G x R A G — H R P との反応により行った。レーンあたり 2 50pg の T P 〇が用いられた。

図 2 は、 recHepTPO ( JHH7/7/c83) 、 nat i veHepTPO ( JHH7) および recChoTPO の電気泳動による分子量の比較を示す写真である。検出は図 1 と同様に行った。

図 3 は、レクチン一 ELISA 法による図中に表示の各 T P O と S S A レクチン又は M A M レクチンとの反応性の比較を示す。

図 4 は、 FDCP-hMpl 635 アツセィ法による図中に表示の T P 0 の in vi tro 活性を示す。

図 5 は、クローン CH0+ 2 , 6 ST/19/ C4 及び CH0+ 2 , 6 ST /2 c3 によって産生された T P O と、クローン CH029C14 によつて産生された recChoTPO との分子量を、電気泳動 /ウェスタンブロッテイング（抗 hTP 0 ャギポリクロ一ナル抗体及び西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合抗ャギ I g G 家兎ポリクロ一ナル抗体使用）により比較した写真である。

図 6 は、レクチン一 EL ISA 法による、クローン CH0+ 2 , 6 ST/ 19/c4 及び CHO+ 2 , 6 ST/21/c3 によって産生された TP0 のシアル酸分析の結果を示す。

図 7 は、 FDCP-hMpl635 アツセィ法による、 cr 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c DNA を遺伝子導入した C H O 細胞 (図中、 19c4 及び 21c3 と表示）及び C H O D -細胞（図中、 H TCF と表示）で発現させて得られた T P O の in vitro 活性の比較を示す。

発明の詳細な説明

本発明者らは、ヒト T P O の主要産生臓器が肝臓であること力； m R N A レべノレで確認されている（ Sh i mada, Y. ら、 Exp.

Hemato 1 23 巻、 1388- 1396 頁、 ( 1995) ； Nomura, S. ら、 Ex p. Hemato 1 25 巻、 565-572 頁、（ 1995) )こと力、ら、ヒト肝臓由来株化細胞に注目した。そこで、ヒト血漿から部分精製した T P O ( nat i veP 1 asmaTPO) , ヒト T P O 産生肝臓由来株ィ匕細胞力、ら精製した T P O ( nat i veHepTPO) 、並びに該ヒト T P O 産生肝臓由来株化細胞で発現させた組換えヒト T P O

( recHepTPO)等を調製し、その糖鎖構造について、 C H O で発現させた組換えヒト T P O ( recChoTPO)との比較を行った。その結果、ヒト T P O 産生肝臓由来株化細胞から精製した T P 0 ( nat i veHepTPO) と該ヒト T P O 産生肝臓由来株化細胞で発現させた組換えヒト T P O ( recHepTPO)は、その N 結合型糖鎖の結合パターンが C H O で発現させた組換えヒト T P 0 と異なっており、むしろ、ヒト血漿から精製した T P O ( n at ivePl asmaTPO)と共通していること力'判明した。

即ち、後述の実施例にあるように抗 T P O モノクローナル抗体とレクチンを用いたレクチン一 EL ISA 分析法によると na tivePlasmaTPO 、 nat i veHepTPO および recHepTPO は糖鎖末端のシアル酸付加様式が α 2 , 6 結合であることを特徴付けする S S A レクチン（ Shibuya, N. ら、 J. B i oc em, 106 巻、

1098- 1103 頁、（ 1989) ) に反応性を見せるが、 recChoTPO は反応しない、一方、シアル酸付加様式が α 2 ， 3 結合であることを特徴付けする M A Μ レクチン（ We i-Chun, W. ら、 J. B i ol . Chem. 263 巻、 4576-4585 頁、（ 1988)) にはこれらすベてが反応する。つまり、 recChoTPO は、 N 結合型糖鎖において α 2 , 6 結合型シアル酸付加構造を有するヒト血漿由来の Τ Ρ Ο と大きく異なり、一方、 nativeHepTPO および recHepTPO はヒト血漿由来の T P O と類似していると言える。

そこで、本発明によれば、ヒト株化細胞が産生する新規な T P O が提供される。好ましくは、 Τ Ρ Ο 産生臓器由来ヒト株化細胞が産生する新規なヒト Τ Ρ Ο が提供される。更に好ましくは、上記特定の糖鎖構造を有する新規なヒト Τ Ρ 0 力提供される。

本発明の新規ヒト Τ Ρ Ο は、抗原性の低下、体内動態の改善、連投時の血小板増多効果の低下の改善をもたらすものである，

本発明のヒト Τ Ρ Ο としては、遺伝子組換え技術を用いて、ヒト Τ Ρ Ο 遺伝子をヒト株化細胞に導入し、発現させ、単離 ' 精製することによって得られる、外来性（ exogenous)のヒト T P O 遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であるヒト T P 0 が挙げられる。あるいは、ヒト T P 0遺伝子が発現されているヒト株化細胞から、単離 · 精製することによって得られる、内在性（ endogenous) のヒト T P O遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であるヒト T P 0であってもよい。あるいは、内在性（ endogenous) のヒト T P O遺伝子の発現産物であるヒト T P O には、ヒト T P O遺伝子をもつヒト株化細胞に、プロモーター等を外から導入し、該内在性（ eridog enous) のヒト T P O遺伝子を活性化し発現させる方法（国際公開第 W096/29411 号参照）によって得られるようなヒト T P 0 も含まれる。

ヒト株化細胞としては、例として、 HL60 (ATCC 寄託番号 CC い 240 )、 Jurkat (ATCC 寄託番号 TIB- 152)、 K562 (ATCC 寄託番号 TIB - 152)、 HeLa (理研寄託番号 RCB0027 ), HepG2 (ATCC 寄託番号 CKL 10741 ) 等が挙げられる。好ましくは、 T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞であり、例えばヒト肝臓由来細胞、ヒト骨髄ストローマ細胞などが挙げられる。更に好ましくは、ヒト由来肝臓細胞株である、 J H H 7 、 H u H 7 、 H e p G 2 等が挙げられる。 J H H 7 は、 1997 年 8 月 11 日付で、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM BP-6049 としてブタぺスト条約下で国際寄託されている。 H u H 7 は、 1997 年 8 月 I I 日付で、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP- 6048 として同様に寄託されている。

本発明のヒト T P O として、好ましくは、 α 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつもの、もしくは、少なくとも SSA-L ec t i η [正式名称： S ambucus s i e b o 1 d i n a aggu 1 u t i n i n lect i n 又は Elderberry Bark l ect in ( S i buya, ら、 J. Biol. Che m 262 : 1596- 1616 ( 1987 ) 参照 ] に親和性を有する糖鎖構造をもつものが挙げられる。更に好ましくは、 N 結合型糖鎖において ci 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつもの、もしくは SSA- Lect in に親和性を有する糖鎖構造をもつものが挙げられる。

本発明のヒト T P O は、そのタンパク質部分の一次構造、即ちアミノ酸配列としては、配列番号 1 に示されたアミノ酸配列か、または配列番号 1 に示されたアミノ酸配列のうち、ヒト T P 0 活性を保持する限りにおいてその一都が改変（置換、欠失、揷入、およびまたは付加）されているようなァミノ酸配列であるものも含まれる。具体的には、国際公開第 W 095/21919 号（ 1995 年 8 月 17 日）に記載されている T P O 誘導体や同第 W096/25498 号（ 1996 年 8 月 22 日）に記載された T P O誘導体、同第 W095/18858 号（ 1995 年 7 月 13 日）に記載された T P O 誘導体等に見られるようなアミノ酸残基の改変を挙げることができる。

本明細書中、「 T P O 活性」とは、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、および又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、または増強する活性をいう。また、本発明によれば、上記新規なヒト T P 0 を製造する方法も提供される。

ヒト株化細胞から直接精製および単離する方法としては、一般にタンパク質の精製に用いられる手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、レクチンァフィ二ティ一クロマトグラフィ一、色素吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク口マトグラフィ一、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ一、へノリンァフィニティーク口マトグラフィ ―、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ノヽイドロキシルァノタイトクロマトグラフィー、金属キレ一ティングクロマトダラフィ一、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法などの一つ以上を組み合わせた方法がある。また、ヒト T P O の物理化学的な性質を利用して組み合わせることのできる方法も本発明に含まれる。さらには、 τ

P O を認識することのできる抗体を用いた抗体カラムをも用いることができる。また、 T P 0 は M p 1 のリガンドであることが判明したことから（ de Sauvage ら、 Nature 369 巻 533 -538 頁（ 1994) ； Bart ley ら、 Cel l 77 巻 1117- 1124 頁（ 19 94) ； Kaushansky ら、 Nature 369 巻 565 - 568 頁（ 1994) )、 M P 1 を活性ィ匕ゲルにカップリングさせることでァフィ二ティ一ゲルカラムを調製し、これを利用することによつても T P 0 を精製することができる。より具体的には、 M p 1 の細胞外領域（ M p 1 — X ) を C H O細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産 ' 調製し、調製された M p l — X カラムが挙げられる（前述の BarUey ら（ 1994))。

また、本発明には、遺伝子組換え技術を用いた、本発明のヒト T P O の製造方法も含まれる。例えば、ヒト T P O をコ — ドする D N A をべクタ一の適切な部位に組み込んだ組換えベクターでヒト株化細胞を形質転換又はトランスフエクトし、産生されたヒト T P O タンパク質を分離 · 精製することを特徴とする本発明のヒト T P O の製造方法が挙げられる。本発明の実施態様において、本発明は、 T P 0産生臓器由来ヒト株化細胞、好ましくはヒト肝臓由来細胞（例えば J H H 7 細胞）又はヒト骨髄ストロ一マ細胞にヒト T P O 遺伝子を導入し、発現させることによるヒト T P O の製造方法を提供する。これらの方法におけるヒト株化細胞としては、上述のとおりである。

これらの宿主細胞を形質転換又はトランスフエク卜させるために用いられるベクタ一としては、 pSV2- neo (Southern と Berg ； J . Mo 1. App 1. Genet. , 丄， 327-341 , 1982 ) 、 pCAGG S (N iwa ら； Gene, 108, 193-200, 1991 ) 、あるい（ま cDL-SR α 296 (Takebe ら； Mo l . Ce l l . Bi o l . , 8， 466-472, 1988) 等がある。

これらのベクタ一は必要に応じて複製起点、選択マーカ一、プロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクタ一には、必要に応じて R N A スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。

複製起点としては、 SV40、アデノウイルス、ゥシノピロ一マウィルス由来のもの等を用いることができる。

遺伝子発現用プロモーターとしては、ウィルス由来であるレトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、 SV4 0 由来のもの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、 EF 1 - ) 等を用いることができる。

選択マーカ一としては、ネオマイシン（ neo )耐性遺伝子、ピューロマイシン（ pur)耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ TK) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ DHFR) 遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ —ゼ（ E c 0 g p t ) 遺伝子などを用いることができる。

好ましくは、後述の実施例 1 の（ 4 ) にあるように、ヒトェロンゲ一シヨンファクター 1 — アルファプロモータ一下流にヒト T P O c D N A を配置し、さらに SV40 初期ポリァゲニル化シグルナル、 DHFR 遺伝子、 SV40 複製開始点などを付力 [] したベクターによって、トランスフエクタム法（プロメガ社製）を用いて J H H 7 細胞を形質転換することによって行われる。形質転換された J H H 7 細胞は恐らく内在性のヒト T P O遺伝子の発現産物であるヒト T P 0 に加えて導入された外来性（ exogenous)のヒト T P 0遺伝子に基づいた T P 0 を産生することになる。

また、本発明によれば、本発明のヒト T P O を含有する医薬組成物も提供される。本発明の医薬組成物は、その製剤化の目的に応じて安定化剤、希釈剤、可溶化剤、防腐剤、酸化防止剤、賦形剤及び等張化剤等を含有することができる。

本発明のヒト T P O を含有する医薬組成物は注射等の非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々の投与経路に応じた剤形として、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、凍結乾燥製剤などが例示される。本発明のヒト T P O を含有する医薬組成物は、活性成分として通常 0.05 μ g/ kg 体重〜 1 mg/ kg 体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日一回〜数回程度投与することがでさる。

本発明によれば、本発明のヒト T P O を有効成分とし、血小板の増加を必要とする多数の疾患患者に対する血小板増加剤が提供される。

更には、制ガン剤や免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるいは骨髄移植（ B M T ) や P B S C T 、 C B S C T施行患者における血小板減少症の治療剤が提供される。

更に、血小板障害、例えば、血小板産生障害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とする多数の疾患への治療剤が提供される。

例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進するために用いることができる。また、 Τ Ρ 0 産生異常による血小板減少症にも有用である血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、特発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（ A I D

S ) 、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症などがあのような患者の血小板回復促進にも有用である

更に、外科手術前に T P 0 を投与して自分の血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用血小板として用いる、いわゆる自己血小板輸血への用途としても有用である

更に本発明のヒト T P 0 は、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた血小板障害の治療にも有用である本発明のヒト T P O は、そのような患者で新しい "無傷の血小板の放出を促進するのに用いることができる。更に T P

0 の主たる産生臓器の一つが肝臓であることが明らかにされていることから、血小板減少をきたす各種の肝臓病、例えば胆道閉鎖症、肝臓移植、肝硬変、肝炎などにも T P O 投与の臨床応用が期待される。更に、保存血小板の止血血栓形成能を回復させる用途としても有用である

このように、本発明の医薬組成物又は治療剤を用いることによって、抗原性がより低下すると共に、薬剤の体内動態がより改善され、より優れた血小板増加効果、血小板障害治療効果又は血小板減少症治療効果を得ることができる

本発明はさらに、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト T P 〇を提供する。ここで、ヒト T P 〇は外来性のヒト T P 0 遺伝子の株化細胞における発現産物であつて単離 · 精製されたものであってよく、また、株化細胞は

C H O 細胞や、卵巣細胞同様に α 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ活性が低いとされる腎臓由来の Η Ε Κ 2 9 3 や Β

Η Κ などの細胞に、 α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ遺伝子を導入したものであることができる

本発明者らは、 C H O細胞にラット α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入することによって、，

3 結合型及び ct 2 , 6 結合型の両シアル酸が付加された形の

T P O を発現させることを試みた。この場合、ヒト T P O遺伝子を導入した C H O 細胞に後から α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入することによって形質転換を行ってもよいし、その順序は逆であっても、また同時であつてもよい。また、後述の実施例において、 C Η 0 細胞に遺伝子導入したのはラット肝臓；3 — ガラクトシド α 2 , 6 — シァリノレトランスフェラ —ゼ ( E n t r e z a c c e s s i o n

N o . M 1 8 7 6 9 ) であるが、たとえば成熟ラット脳由来のもの ( E n t r e z a c c e s s i o n N o . L 2 9 5 5 4 ) やマウス <3 — ガラクトシド cc 2 , 6 — シァリルトランスフエラ一セ E n t r e z a c c e s s i o n N o . D 1 6 1 0 6 ) を用いることも可能である。

本来 C H O 細胞はな 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ活性を有していないが（Paulson, J. C. ら， J. Biol. Chem.264 巻， 1 0931~ 10934 頁、（ 1989))、これに Lee， E · J . ら（ J . B i o 1. C h em . 264 , 13848 - 13855 頁、（1989))の方法にあるように強力なプロモータ一下に配した α 2 , 6 — シァリルトランスフェラーゼ c D N A を導入することによって、本来細胞の有する α 2 , 3 — シァリルトランスフェラーゼ活性と競合することによってその量的優位性によって α 2 , 6 結合型シアル酸が α 2 , 3 結合型シアル酸と同一分子上に、あるいは優位に付加された Τ Ρ Ο が産生されることになる。ここで言う「 α 2 ,

6 結合型のシアル酸が優位に付加された」とは、実施例 3 で述べられている L e c t i n — E L I S A で測定したときに S S A — L e c t i n E L I S A に反応し、 M A M — L e c i n E L I S A に対する反応が測定限界以下であることを指す。 C H O D —株で産生された T P O は α 2 ， 3 型の結合様式で付加されたシアル酸をもち、 α 2 , 6 型の結合様式で付加されたシアル酸をもたないことが確認されているが、事実、 M A M — L e c t i n E L I S Aに十分な反応性をもつていて、力つ S S A — L e c t i n E L I S Aに全く反応しない。 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼの遺伝子導入によりこの反応性が逆転し、本来有しない 2 , 6 — 型の結合様式で付加されたシアル酸に特異的に結合する S S A — L e c i n が反応するようになったということは、 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼが遺伝子導入によって高発現するようになつた結果、その活性力 2 , 3 — シァリルトランスフエラ一ゼのシアル酸付加活性を圧倒的に上回り、本来 α 2 ， 3 型の結合様式でシアル酸が付加される位置を α 2 ， 6 型の結合様式のシアル酸が占めたことを意味する

ヒト Τ Ρ Ο遺伝子を導入した C H O細胞としては、例えばヒト T P 〇をコードする D N A を担持する適切な発現べクタによって形質転換された C H 0細胞を用いることができる。例えば、 1995 年 1 月 31 日付で日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP- 4988 として寄託されている、ヒト全長 T P O をコードする c D N A を担持するプラスミド PDEF202- hTPO-Pl によって形質転換された C H O 細胞株（CHO- DUKXBl 1 )が挙げられる。

このように、本発明はまた、 C H O 細胞に α 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入し、該 C H O 細胞においてヒト Τ Ρ Ο 遺伝子を発現させることを含む、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト T P O の製造方法を提供する。さらに本発明は、 C H O 細胞においてヒト T P O 遺伝子を発現させ、該 C H O 細胞に、 a 、 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入することを含む、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Ο の製造方法を提供する。

実施例

以下の実施例によリ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるべきでない。

ぐ実施例 1 >

( 1 ) ヒト血漿からの Τ Ρ Ο の（部分）精製… nat i veP 1 asmaT PQ

— 80°C保存のヒト血漿、約 460ml を流水中にて融解後、 135 OX g で遠心、不溶性沈殿を除去し、その上清 457ml を等量の lniM EDTA、 0. \% Tween 20 、 0. \% NaN₃ を含む Du 1 becco のリン酸緩衝塩水（ PBS) (DPBS ：日水製薬（株）社製 Cat. No.05 913) で希釈した。この 2 倍希釈ヒト血漿 914ml に対し、プロテア一ゼによる蛋白分解を阻害する目的でプロテア一ゼ · ィンヒビタ一、 Pef ab 1 ocSC (MERK 社製 Cat. No.124839 、最終濃度 0. 1mM)、 trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guaniai no) -butane (SIGMA 社製 Cat. No. E3132, 最終濃度 0.0 ImM) を添力□ した。これを SARTOBRAN 300 (Sartorius 社製 Cat. No. 5231307H5--00-— B)をもちいて 0· 22μ ろ過し、抗 Τ Ρ Ο抗体結合 NHS- activated Sepharose 4FF カラム（カラムサイズ： Φ 0. 5 cm X 5 cm、 NHS— activated Sepharose FF ゲノレ： Pharmacia 社製 Cat. No. 17-0906— 01)へ流速 0.5ral /min でアプライした。その際、抗 T P O 抗体カラムへの非特異的吸着を避けるため、

Sepharose 4FF (カラムサイズ： 0 O. 5 cmx O, 5 cm、 Sepharo se 4FF ゲル： Pharma i a 社製 Cat. No. 17-0149-01 ) < おび normal Rabbi t I gG 結合 NHS-ac t i vated Sepharose 4FF カラム ( カラムサイズ： 0. 5 cra x 5 cm, NHS— act ivated Sepharos e 4FF ゲル： Pharmac i a 社製 Cat. No. 17— 0906— 01 )をブレカラムとして、抗 T P O 抗体カラムに接続した。アプリケーシヨン終了後、 1 mM EDTA 、 0. 1% Tween 20 、 0. 1¾ NaN₃ を含む DPBS ファーでカラムを洗浄し、 280nm の吸光度（ A₂₈。

) 力 0. 2 程度まで下がったところでプレカラムを取り外した。さらにゲルへの非特異的吸着物除去のため、 0. 5Μ NaC 1 を含む 10mM Sod ium Phosphate pH 7.3 ファーでカラムを洗净した。カラム内を 150mM NaCl で置換した後、 150mM NaCl、 5 mM CHAPS を含む 0. 1M Glyc ine-HC l pH 2.5 ファーで T P O の溶出を行った。溶出後、ただちに各分画を 1 M Na₂C0₃ により中和し、高感度 TP0-ELISA へ供した。 EL ISA の結果をもとに T P 0 溶出画分をブールし、限外ろ過法により濃縮、ッファ一交換を行った。限外ろ過濃縮には ULTRAFREE-MC 10K cut (MI LLI P0RE 社製 Cat. No. UFC3LGC00) を用い、 4, 000 X g で遠心、濃縮し、その後、数回 DPBS を添加、濃縮を繰り返した。最終的に 500 1 の I mM EDTA 、 0. 1 ¾ Tween 20 、 0. 1%

NaN₃ を含む DPBS ファーに懸濁、部分精製ヒト血漿 T P 0 とした。この部分精製 T P O の一部を以下の通り S D S 存在下、ゲルろ過に供した。部分精製 T P 〇に対し、 5 分の 1 容量の 250 raM Tr i s-HC 1 , pH 6.8, 50% Glycerol , 5¾ SDS, lOmM EDTA を添加し、 95°C、 5 分処理した。これを 0. 1% SDS、 ImM EDTA を含む DPBS で平衡化した Superose 6 HR ゲルろ過カラム（ ø 1 cm X 30cm ： Pharmac ia 社製 Cat . No. 17- 0537-01)へァブラィし、得られた分画を TPO- ELISA に供し T P O の溶出位置の同定をおこなった。その結果、ヒト血漿由来 T P O は、 C H O 発現型 T P 〇 ( 1- 332a. a. )とほぼ同位置にメインに溶出され、分子量約 80kD と考えられた。また僅かではあるが、約 20kD 付近にも部分長型 T P O の溶出を認めた。

( 2 ) J H H 7 細胞からの T P 0 の（部分）精製… nat i veHep TPO ( JHH7)

J H H 7 細胞を培養面積 225cm2 の培養フラスコに入れ、 1 0 % F C S を含む 1 ： 1 ダルベッコ変法イーグル培地ノハム F 12 ( D F ) 培地（ G i bco 社製）で 5 %炭酸ガス培養器中にて 3 7 °C でコンフルェントになるまで培養した。その後、これを無血清の D F 培地に置換して、 4 日間培養した後、上清を回収した。上記培養で得られた体積 4 L の上清（ T P 0 濃度 55pg/nil ) を約 1 L づつに分割してあら力じめ 5 mM potas i urn phosphate pH 6.8 で平衡化した WGA- agarose (生化学工業社製）を 5 m 1 充填したカラムにアプライした。約 250ml の 5 mM potas ium p hosphate pH 6.8 で洗浄した後、 0. 4 M N-ァセチルガラクトサミン、 5 mM po tas i um phosphate p H 6.8、 15ml で溶出した。溶出液を UF15- lOkcut ( ミリポア社製）で濃縮し T P O サンプノレとした（ 1.0ml， 159ng/ml)。

( 3 ) H u H 7 細胞からの T P O の（部分）精製… nat iveHep TPO ( HuH7)

H u H 7 細胞を培養面積 225cm2 の培養フラスコにいれ、 1 0 % F C S を含む D F 培地で 5 %炭酸ガス培養器中にて 37'Cでコンフルェントになるまで培養した。その後、これを無血清の D F 培地に置換して、 4 日間培養した後、上清を回収した。体積 1. 9 L の上清（ 147pg/ml ) を約 1 L づつに分割してあら力、じめ 5 mM po tas i um phosphate pH 6.8 で平衡ィ匕した WGA— a garose (生化学工業社製）を 5 ml 充填したカラムにアブライした。約 250ml の 5 mM po t as i um phosphate pH 6.8 で洗浄した後、 0. 4 M N -ァセチルガラクトサミン、 5 mM potas i um pho sphate pH 6. 8 各 15ml で溶出した。溶出液を UF 15-10kcut (ミリポア社製）で濃縮して T P 0 サンプルとした（ 1. 5 mし 77ng/m 1 )。

( 4 ) J H H 7 細胞における T P 0 の発現、及び精製… recHe PTP0 ( JHH7 / 7 / C83 )

J H H 7 細胞を 6 cm 径のプレート（ファルコン社製）中、 1 0% F C S を含む D M E M培地で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法（プロメガ社製）を用いて PDEF202- h-TPO-P l (特閲平 8 -228781 号公報）によって形質転換した。

なお、プラスミド pDEF202-h- TP0-P 1 によって形質転換された C H 0 細胞（ CH0- DUKB I I ) は 1995 年 1 月 31 日付で日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FER M- BP- 4988 として寄託されている。

S3ち、 _PDEF202-hTP0-Pl ブラスミド 10 g 、 pEFneo プラスミド 1 μ g を 500 l の D M E M培地に添加した Solut ion A、及び 500 μ ΐ の D Μ Ε Μ培地にトランスフエクタム（ 1 mg/40 0 1 EtOH) 5 1 を添力 Q した So lut i on Β を混合し、 500 1 の無血清 D Μ Ε Μ培地に置換した 6 c m 径ブレートに 1 m 1 加え、 6 時間、 37で、 5 % 炭酸ガスインキュベーター内に置いた。次に、 D M E M培地 3. 5 ml を添加し、血清を最終濃度 1 0 % になるように加え、再び、 37 t：、 5 %炭酸ガスインキュべ — ター内に 48 時間置いた。なお、 pEFneo ブラスミドの作製は次のようにして行った。すなわち、ブラスミド pRc/CMV ( Invi trogen 社）を制限酵素 EcoRl- BamHl で処理し、ァガ口一スゲル電気泳動で neomycin 耐性遺伝子を含む小さい方の断片を回収し、 T 4 ポリメラ一ゼ（宝酒造製）にて末端を平滑化した後、このフラグメントとプラスミド pEF18S (特開平 8-228781 号公報）を制限酵素 Smal で処理したベクター D N A を T 4 D N A リガ一ゼ（宝酒造製）で結合する。こうしてできた 2 種類のプラスミドのうち、ェロンゲ一シヨンファクタ一プロモータ一と同方向で neomycin 耐性遺伝子が揷入されたものを選択して pEFneo とした。

ついでこれを 0.05 % トリブシン、 53mM E D T A溶液で剥離分散し、 24 穴プレート 10 枚に分割したのちに 4 mg/mgG418 を含む D M E M + 10% F C S 培地で選択を行った。このうちコロニーを形成したものを FDCPhMpl 635/MTS アツセィ（ Mor i ta H. ら、 FEBS Lett. 395 巻 228-334 頁、 ( 1995 )) を行い高発現コロニーを選択した。選択されたコロニーについて限 8/03884 界希釈法によるクロ一ニングを行い単一クローンとした。

ヒト T P O c D N A を含む PDEF202- hTPO- P 1 によって形質転換された J H H 7 細胞株（ JHH7/7/C83) は、 1997 年 8 月 11 日付で、曰本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP- 6050 としてブタぺスト条約下で国際寄託されている。

この組み換え型 J H H 7 細胞株（ JHH7/7/C83) を培養面積 225cm2 の培養フラスコに入れ、 10 % F C S を含む D F 培地で 5 %炭酸ガス培養器中にて 37 °Cでコンフルェントになるまで培養した。その後、これを無血清の D F 培地に置換して、 4 日間培養した後、上清を回収した。

体積 8.97L の上清（ TP0 濃度 0.55^ §/!111 ) を pel l icon-2c assette lOkcut ( ミリポア社製、カタログ番号 P2B0 10A 05) にて 899ml (TP0 濃度 5. 7 β g/ml ) まで濃縮した。プロテア一ゼによる蛋白分解を阻害する目的でプロテア一ゼ · インヒビタ一、 Leupep t i n (最終濃度 0.0 ImM) 、 t rans-epoxysucc i ny 1 -L-leucylamido (4-guan id ino)-butane (最終濃度 0.0 ImM) を加えた。

225ml つ'つに分解してあら力、じめ 5 mM p o t as i urn phosphate pH 6.8 で平衡化した WGA- agarose (生化学工業社製）を 5 ml 充填したカラム 4 本にアプライした。約 250m 1 の 5 mM potas i um phosphate pH 6.8 でそれぞれ洗浄した後、 0. 4 M N-ァセチノレ力'ラクトサミン、 5 mM p 01 as i um phosphate p H 6.8 各 15ml で溶出した（ TPO 濃度 73 μ _g/ml ) 。

溶出液を UF15- lOkcut (ミリポア社製）で濃縮、 5mM potasiu m phosphate pH6.8 に換した ( 5. 0 ml, TPO 濃度 1084 g / m 1 ) .

これを Hydroxyl Apat ite type 1 (BioRad 社製直径 1 cm、ベッド高 10cm) カラムに注入し、流速 Ι πΠ/min で添加した。添加終了後、弓 I き続き 5 mM potas ium phosphate pH 6.8 を力ラムに注入し未吸着画分 50ml ( TP0 濃度 54/i g/ml) を集めた。これに 1 M Tris- base 溶液をカ卩えて pH を 8. 5 に調整した。

次に、この画分を Q— Sepharose HP ( Pharmac i a Biotech 社、カタログ番号直径 5 mm、ベッド高 10cm) カラムで展開した。即ち、展開溶媒 A に 20mM Tris-HCl pH 7. 5 、展開溶媒 B に 1 M NaC 1 を含む 20mM Tris-HCl pH 7.5 を用い、 20mM Tris-HCl 緩衝液 P H 7.5 で予め平衡化したカラムに流速 0. 3 ra 1 / m i n でサンプルを添加した。添加終了後、流速を 0. 3 ra m i n から 0. 5 ml /min に上げて、 0 % B から 22 % B まで直線濃度勾配で展開し、 1. 0 ml ( 2 m i π )ずつポリプロピレン製チューブに集めた。

それぞれの各フラクションを ELISA 法により測定し、 T P 0 画分を特定した。この結果チューブ番号 34〜 55 ( NaCl 濃度で 0. 116~ 0. 2 M の範囲）に T P O の分布を見出したので、これを回収し、 T P O 画分 F A ( 22ml ) とした。これを、 UF1 5- 1 Okcu t (ミリポア社製）で濃縮し、途中液量が 4. 1 ml となつた時点で T P 0 濃度を EL ISA 法で測定した（ 1143 t g/ml) 。さらにこれを濃縮を進め、 200 1 とした。

最終的なステップとして Supe rdex 200HR (Pharmacia B i ot ech 社製、直径 1 cm、ベッド高 30cm) を用いて分離を行った。即ち、リン酸緩衝塩水（PBS)にてカラムを置換した後、 F A濃縮サンプル 200 μ 1 を流速 0. 3 ml/min で注入した。注入後引き続き P B S をカラムに添加し、サンプル添加開始から 15 分経過後から 600 μ 1 ( 3 πιίη)ずつのフラクションとした。これを銀染色、抗ヒト T P O ポリクローナル抗体、 EUSA 法によリフラクシヨンを測定し、この結果チューブ番号 13， 14， 15 (添加開始からの総量で 7. 2 〜 9. 0 m 1 ) に T P ◦ の分布を見出した。この 3 フラクションをブ一ノレし、 AccQTag 法により組成分析を行ったところ 1. Π 733mg/m 1 ( 1.8ml ) であることが分かった（表 1 ) 。このとき、 EL ISA 法で測定した T P 0 量は I. 1 mg/ml を与え、組成分析値とほぼ同等であった。すなわちここで用いた E LISA が、 recHepTPO に対しても標準 T P 0 と同等の反応性を示すといえる。

表 1 recHe_PTPO(JHH7/7/c83)

CBB法 ELISA

AccQ"TAG法 [rag/ral]

く実施例 2 〉分子量の測定

実施例 1 で得られた各種 T P O の分子量を測定する目的で S DS-PAGE · ウェスタンブロッテイングを行った。常法にしたがつて、マイクロスラブゲル（第一化学薬品製、 4. 0 % 〜 20 % 濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）を用いて、 S D S ゲル電気泳動を室温下で 10mA、ついで 20mA の一定電流にて約 2 時間かけて実施した。分子量マ一カーにはブレステインド · プロ — ドレンジマ一力一（ニューイングランドノィオラブズ社製）を用いた。

セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転写装置モデル KS-8640)を用いて、泳動終了後直ちに 150mA の一定電流で 1 時間かけて P V D F 膜（ミリポア社製）に電気的に転写した。陽極に 0. 3 M Tris、 20% メタノール、 pH10.4、転写膜液に 25mM Tris 、 20% メタノール、 pH10.4、陰極液に 25mM Tris 、 40mM ァミノカブロン酸、 20 % メタノールを用いた。

転写された膜を T T B S 溶液にて 5 分間洗浄した後、プロックエース（雪印社製）にてブロッキング 1 時間を行った。これを再び T T B S にて 5 分間洗浄した後に、 90 % T T B S 、 10% ブロックエース、 0.05% B S A 溶液に抗ヒト T P O ャギ抗体を添加して 1 時間振とうした。ついで、この膜を再び T T B S にて 5 分間 2 回洗浄した後に、 T T B S 溶液に抗ャギ、バーオキシダ一ゼ結合抗体を添加し 1 時間振とうした。この後この膜を T T B S 溶液にて 10 分間 4 回洗浄し、 E C L 発色システム（アマシャム社製）にて発色を行い、フィルム（ァマシャム社製）に感光させた。

電気泳動における見かけの分子量は recChoTPO (CH0) 、 nat i veHepTPO (JHH7、 HuH7 ) 、 recHepTPO ( J HH 7 / 7 / c83 )ともに（まぼ同じで 80KDa 付近に存在する（図 1 および図 2 ) 。これはアミノ酸配列から予想される分子量 35KDa とは大きく異なり、それが糖鎖付加による分子量の増加であることが容易に推定される。

く実施例 3 > Lect in- EU SA によるシアル酸分析

レクチン一 EL I SA は今までに報告されている方法（ Raf fert y， B. ら、 J. Endoer i . 145 巻、 527— 533 頁）のように、固相に目的タンパクに対する特異抗体を用いることによって目的タンパクを吸着させ、ピオチン化レクチンを反応させて、続く標識アビジンの反応によって発色させ吸光度を測定することによる。

すなわち、 10 ^ g/m l の濃度で抗ヒトマウスモノクローナル抗体、 TN- 1 (Tahara, T. ら、 Br. J . Hemato 1 57 巻、 783-788 頁、（ 1995) ) を 96 穴プレートに各穴 100 1 ずつ分注し攪拌した後、約 10 時間、 4 °C にて放置する。これを各穴当たり 35 0 μ 1 の Τ Τ Β S 溶液にて 4 回洗浄したのち、予め後に検出に用いるものと同じレクチンを結合させたァガロース（ SSA- A garose または MAM- Agarose 、何れも生化学工業社製）と 4 時間転倒混和させて、レクチン反応物を除去した 1 % B S A / T T B S 溶液を各穴分注し、 1 時間室温で攪拌した。続いてこれを捨て、 30 分間乾燥させた後、サンプルを前述の 1 % B S A / T T B S 溶液に各種濃度で添加したものを各濃度 3 穴ずつに ΙΟΟ μ Ι ずつ分注し 4 時間攪拌した。プレートを再び各穴当たり 350 μ 1 の T T B S 溶液にて 5 回洗浄したのち、レクチン一ピオチン（生化学工業社製）を S S A — ビォチンの場合最終濃度 0. 2 /z g/ml、 M A M — ピオチンの場合最終濃度 1. 0 g/ml になるように 0. 5 % B S A Z T T B S 溶液に添加し、各穴 ΙΟΟ μ Ι 分注し 2 時間攪拌した。再度ブレ — トを各穴当たり 350 1 の T T B S 溶液にて 5 回洗浄したのち、 30 分前にアビジン一アルカリフォスファタ一ゼ /アビジン — ピオチン液を（ DAK0 社製）を各 1 μ 10m 1 の濃度で加え攪拌した 0.25 % B S A T T B S 溶液を各穴当たり 100 μ 1 分注し、 1 時間攪拌した。最後にプレートを各穴当たり 350 β 1 の T T B S 溶液にて 6 回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色キット（ DAK0 社製）基質液を ΙΟΟμ 1 加え 10 分間、続いて増感発色液を ΙΟΟ μ Ι 加えて 5 分間攪拌し、プレートリーダ一（生化学工業社製）にて吸光度 492nm 、対照として 630 nm を測定し、その値と濃度で吸光度の温度依存曲線、すなわち各種 T P O のレクチンに対する反応性をブロットした。

図 3 力ら、 SSA— LectinELISA に対する反応性は、 nat ivef a smaTPO 、 nativeHepTPO ( JHH7) および nat iveHepTPO ( HuH7) は何れも似たような傾向を示す。特に nati veP 1 asmaTPO 、 nat iveHepTPO ( JHH7) 及び nat iveHepTPO ( HuH7) は高い反応性を示す，一方、 recChoTPO は検出限界以下である。 MAM- LectinE LISA に対する反応性は nat ivePl asmaTPO 、 nat iveHepTPO ( JH H7) 、及び nat iveHepTPO ( HuH7) は似たような傾向を示すが、 recChoTPO 及び recHepTPO ( J HH 7 / 7 / c 83 )は少し反応性力、'低力つた。

く実施例 4 〉 in vivo 活性

in vivo 活性は原理的には各種検体をマウスに投与した際の血小板数を基に算出する。

すなわち、ォス 8 週齢 BALB/c マウスに P B S に懸濁した各種濃度の各種検体を 4 日連投する。連投終了日から数えて 3 日目に血液サンプルを採取し血小板数を測定する。このとき 1 OOmU を血中血小板数が 3 X 106 血小板 / _μ 1 を与える濃度と定義した。

各種 Τ Ρ Ο を上記アツセィ法にて比較したところ recHepTPO は 4. 5 X 10⁴ U/mg となリ、 recChoTPO の 9. 0 X 10⁴ U/mg に比べて低い値となった。

く実施例 5 > in vi tro 活性（ FDCP-hMpl 635 アツセィ）

T P 0 存在下に継代培養している FDC/P2 細胞に全長ヒ M P 1 を強制発現させた FDCP-hMpl 635 細胞（ Mori ta, H. ら、 FE BS Lett. 395 巻 228— 334 頁、（1995)) を回収し、十分に洗净後、 I 0 % F C S を含む I M D M培養液に再浮遊させた。組織培養用 96 穴平底プレート 1 穴あたりの細胞数が 2. 5 X 103 個になるように FDCP- hMpl 635 細胞を入れ、さらに標準品、及び被検検体を加えて、最終液量を 200 μ 1 /穴にした。プレートを 5 % 炭酸ガスに入れ、 37 °C で、 3 日間培養した。 3 日目の培養 4 時間前に M T S Z P M S 溶液（ Promega 社製） 25 1 を各穴に添加し、培養終了後に 492nm の吸光度をプレートリ — ダー（生化学工業社製）にて測定した。

各種細胞由来の T P O を組換え型 T P O については組成分析値、血漿あるいは非組換え型の肝臓細胞由来 T P O は EL I SA (Tahar a, T ら、 Br. J. Hemato 1 57 巻、 783 -788 頁、 (199 5) ) における値をもとにアツセィしたところ何れも同等の活性を示すことが分かった（図 4 ) 。

く実施例 6 〉 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ発現べクタ一（ p E F n e o — a 2 , 6 S T ) の作製

実施例 1 の（ 4 ) に記載の p E F n e o プラスミドを X b a I で十分に切断した後に、引き続いて短時間、 X h o I を作用させることによって X b a I - X h o I の部分切断断片が得られた。この場合、 X h o l 部位は 3 個所存在するために、 S V 4 0 の複製開始点（ 0 r i ) を含む断片は 3 種類できることになる。このうち目的とする断片は 2 番目に長いものであるが、取リ敢えずこの 3 種類の混合物と目的断片の連結を行い、後に p E F n e o の E F — 1 α ブロモータ一の 3 ' 末端に近い位置をコードするブライマー 5 ' — C C T C A G A C A G T G G T T C A A A G - 3 ' ( 配列番号 2 ) を用いて行うシーケンスによって他の 2 つの可能性を排除することが可能であり、実際その通りであった。ここでいう目的断片とは、ラット肝臓由来の ^ 一ガラクトシド α — 2 ， 6 — シァリノレトランスフェラ一ゼ c D N A ( Genbank M 18769 /We i n ste i n, J . ら， J . B i o l . Chem. 262, 17735 - 17743 ) の全長を含み 5 ' 末端に X h o I 部位を有し、 3 ' 末端に X b a l 部位を有する D N A断片である。

このべクタ一は S V 4 0 の複製開始領域、ヒトェロンゲ

— シヨンファクタ 1 — α プロモータ一、 S V 4 0 初期ポリアデニル化部位、さらに S V 4 0 プロモータ一領域、ネオマイシン耐性遺伝子、 S V 4 0 初期ポリアデニル化部位、 β ーラクタマーゼ遺伝子（ A m p ^r ) を含み、、ヒトェロンゲ一シヨンファクタ 1 一 α プロモータ一下流に；9 一ガラクトシド cr 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A が接続されている。

く実施例 7 〉 a 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ発現べクタ一の C H O 細胞への導入

既にヒト全長 T P O を発現している C H 0 2 9 / 1 4 株 ( 2 0 0 n M メソトレキセ一ト耐性）を 3 X 1 0 ⁵細胞を 6 c m径のプレート（ F a 1 c 0 n 社製）中 1 0 % ゥシ胎児血清を含む α 最小必須培地（ α — Μ Ε Μ ( — ）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをトランスフエクタム法（プロメガ社製）によって形質転換し、 α 2 ， 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ発現べクタ一を導入した。

すなわち、実施例 6 で調製した p E F n e o — α 2 ， 6 S T プラスミド 1 5 S に a — M E M ( — ） 5 0 0 μ 1 を加え混合したものと、 l m g トランスフエクタムを 4 0 0 μ 1 のエタノールに溶解したものを 5 i l に α — M E M ( — ） 5 Ό 0 β 1 を加え混合したものを混合した後に室温で 1 0 分間放置した。この間に 6 c m 径のプレート上で培養した上記細胞をゥシ胎児血清を含まない α — M E M ( — ）に置換しておく。この D N A溶液をプレートに滴下した後、 C 0 ₂ インキュベータ一中で約 6 時間培養した。プレートに 2 . 5 m l の α — M E M ( — ）と 5 0 0 1 のゥシ胎児血清を力 B え、引き続き 1 日間培養した後、 1 0 % 透析ゥシ胎児血清含有選択培地

( - M E M ( ― ) 、チミジン、ヒポキサンチン無添加、ジエネティシン（ G i b o c o 社製）添加）での選択を行った。選択は、細胞をトリブシン処理した後、 6 c m径のプレート

1 枚あたリを 2 4 穴プレート 1 0 枚に分割した後、 2 ~ 3 日後とに選択培地交換を行いながら培養を続行することによリ実施した。このとき最初の 2 日間は最終濃度 0 . 5 m g / m 1 のジエネティシンを含む選択培地で、続く 3 日間は最終濃

1 m g m 1 のジエネティシンを含む選択培地で、その後は、培地交換のつど約半分の最終濃度のジエネティシンを含む選択培地に交換していき、最終的には 0 . 2 m g Z m l までジエネティシン濃度を下げていった。メソトレキセ一トの濃度はこの間 2 0 0 n Mのまま維持した。細胞が増殖してきた穴については、 T P O — E L I S A にてその培養上清中のヒト T P O量、および S S A— レクチン E L I S Aにて α 2 ,

6 — 型の結合様式で付加されたシアル酸の相対的付加量を測定した。培養上清中にヒト Τ Ρ Ο活性及び _α 2 , 6 結合型シアル酸の付加が認められたものについては、新しいゥエルに

2 0 0 η Μのメソトレキセ一ト 2 m g / m 1 のシエネティシンを含む選択培地で 1 ： 1 5 に細胞を分割し、培養を続行させることによリジエネティシンに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行った結果、最終的に 2 0 0 n Mのメソトレキセート 2 m g / m 1 のジエネティシンに耐性なクローン C H O + 2 , 6 3 丁 1 9 ノじ 4 及び〇 1"1 0 + 2 ,

6 S T / 2 1 / c 3 を得た

<実施例 8 > 発現の確認実施例 7 で得られた各種 T P O の分子量を測定する目的で、実施例 2 に記載の方法で S D S — P A G E · ウェスタンブロッテイングを行った。 T a h a r a , T . らの方法（ Br

J. Hematol.5/ 783 ~ 788 ( 1995) )に基づいて測定された発現量をもとに得られた、クローン C H O + 2 , 6 S T / 1

9 c 4 及び C H O + 2 , 6 S T / 2 1 / c 3 の産生する T

P O の電気泳動における見かけの分子量は r e c C h o T P

O C H O 2 9 c 1 4 ) とほぼ同じで 8 O KDa 付近に存在する

( 図 5 参照）これはアミノ酸配列から予想される分子量 3

5 KDa とは異なり、それが糖鎖付加による分子量の増加であることが容易に推定される

く実施例 9 〉レクチン一 E L I S Aによるシアル ¾J>析— 実施例 3 に記載の方法で、実施例 8 で得られた T P 0 についてシアル酸分析を行った（図 6 )

この結果により、 2 株の細胞のうち C H O + 2 , 6 S T

/ 1 9 Z c 4 は特徴として α 2 , 6 — 結合様式のシアル酸が優位に付加された Τ Ρ Ο を産生する細胞であリ、 C H O + 2 ,

6 S T Z 2 1 / c 3 は α 2 , 3 — 及び α 2 ， 6 — 結合様式のシアル酸の両方が同一分子上に付加された Τ Ρ 0 を産生する細胞であることが判った。

く実施例 1 0 〉 i n V i t r 0 における活性確認

実施例 7 で得られた T P 0 について、実施例 5 に記載の F D C P — h M p l 6 3 5 アツセィ法で i n v i t r o 活性の確認を行った。

9 6 穴ブレート中、 2 . 5 X 1 0 ³個の F D C P h M p l 6 3 5 細胞を種々の濃度の T P O と共に 3 7 °C 、 3 日間培養した後、各ゥエルに 2 0 μ 1 の M T S 溶液をカ卩えた。さらに 4 時間インキュベートした後、サンブルの活性を 4 9 2 n m での吸光度として検出した。結果を図 7 に示す。

この結果から、 C H O D — 細胞で発現させた T P O も a 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ遺伝子を導入した C H O 細胞で発現させた T P O も F D C P h M p 1 6 3 5 の増殖活性はほぼ同等であった。つまり、シアル酸の結合様式が本来 C H O 細胞で見られる α 2 , 3 型から α 2 ， 6 型に変化してもその割合によらず細胞の増殖活性は同じであるといえる。

Claims

請求の範囲

1 . ヒト株化細胞が産生するヒトトロンボポェチン（ T P 0 ) 。

2 . ヒト T P O が外来性のヒト T P O遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であって、単離 · 精製されたものであることを特徴とする請求項 1 に記載のヒト T P O。

3 . ヒト株化細胞が T P O産生臓器由来ヒト株化細胞であることを特徴とする請求項 2 に記載のヒト T P O。

4 . T P O産生臓器由来ヒト株化細胞がヒト肝臓由来細胞であることを特徴とする請求項 3 に記載のヒト T P O。

5 . ヒト肝臓由来細胞が J Η Η 7 ( FERM BP-6049 ) であることを特徴とする請求項 4 に記載のヒト T P O。

6 . ヒト肝臓由来細胞が H u H 7 ( FERM BP-6048 ) であることを特徴とする請求項 4 に記載のヒト T P O。

7 . T P O産生臓器由来ヒト株化細胞がヒト骨髄ストローマ細胞であることを特徴とする請求項 3 に記載のヒト T P 〇。

8 . ヒト T P O が、ヒト株化細胞における内在性のヒト T P 0遺伝子の発現産物であって、単離 · 精製されたものであることを特徴とする請求項 1 に記載のヒト T P O。

9 . ヒト株化細胞が T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞であることを特徴とする請求項 8 に記載のヒト Τ Ρ Ο 。

1 0 . T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞がヒト肝臓由来細胞であることを特徴とする請求項 9 に記載のヒト T P O 。

1 1 . ヒト肝臓由来細胞力 J Η Η 7 ( FERM BP-6049) であることを特徴とする請求項 10 に記載のヒト T P O 。

1 2 . ヒト肝臓由来細胞が H u H 7 ( FERM BP- 6048) であることを特徴とする請求項 10 に記載のヒト T P 〇。

1 3 . T P O 産生臓器由来ヒト株化細胞がヒト骨髄スト口一マ細胞であることを特徴とする請求項 9 に記載のヒト T P O 。

1 4 . SSA-レクチンカラムに親和性を有する糖鎖構造をもつものであることを特徴とする、請求項 1 〜 13 のいずれかに記載のヒト Τ Ρ 〇。

1 5 . ヒト Τ Ρ Ο のアミノ酸配列が配列番号 1 の 1 〜 332 であることを特徴とする請求項 14 に記載のヒト Τ Ρ Ο 。

1 6 . 少なくとも ct 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつものであることを特徴とする、請求項 1 〜 13 のいずれかに記載のヒト T P 〇。

1 7 . ヒト T P 0 のアミノ酸配列力配列番号 1 の 1 〜 332 であることを特徴とする請求項 16 に記載のヒ卜 T P 〇。

1 8 . 請求項 1 ~ 17 のいずれかに記載のヒト T P 〇を有効成分とする医薬組成物。

1 9 . 請求項 1 〜 17 のいずれかに記載のヒト T P O を有効成分とする血小板増加剤。

2 0 . 請求項 1 〜 17 のいずれかに記載のヒト T P O を有効成分とする血小板障害治療剤。

2 1 . 請求項 1 〜 17 のいずれかに記載のヒト T P O を有効成分とする血小板減少症治療剤。

2 2 . 抗原性が低下した請求項 19 に記載の血小板増加剤。

2 3 . 抗原性が低下した請求項 20 に記載の血小板障害治療剤。

2 4 . 抗原性が低下した請求項 21 に記載の血小板減少症治療剤。

2 5 . 体内動態が改善された請求項 19 に記載の血小板増加剤。

2 6 . 体内動態が改善された請求項 20 に記載の血小板障害治療剤。

2 7 . 体内動態が改善された請求項 21 に記載の血小板減少症治療剤。

2 8 . T P O産生臓器由来ヒト株化細胞において外来性のヒト T P O遺伝子を発現させることを含む、ヒト T P O の製造方法。

2 9 . ヒト肝臓由来細胞において外来性のヒト T P 〇遺伝子を発現させることを含む、ヒト T P O の製造方法。

3 0 . ヒト骨髄ストローマ細胞において外来性のヒト T P O 遺伝子を発現させることを含む、ヒト T P O の製造方法。

3 1 . J H H 7 ( FERM BP— 6049) において外来性のヒト T P 0遺伝子を発現させることを含む、ヒト T P Oの製造方法。

3 2 . 請求項 28〜 31 のいずれかに記載の方法によって得ることができるヒト T P 0。

3 3 . 少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒ卜 Τ Ρ 0。

3 4 . t ト Τ Ρ Ο が、外来性のヒト T P O遺伝子の株化細胞における発現産物であって、単離 · 精製されたものであることを特徴とする請求項 3 3 に記載のヒト T P O。

3 5 . 前記株化細胞が、 α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ —ゼ遺伝子が導入された C H O 細胞であることを特徴とする請求項 3 4 に記載のヒト丁 0。

3 6 . C H O細胞に α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入し、該 C H O 細胞においてヒト T P O遺伝子を発現させることを含む、少なくとも α 2 ， 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Οの製造方法。

3 7 . C H O細胞においてヒト Τ Ρ Ο遺伝子を発現させ、該 C H O 細胞に α 2 , 6 — シァリルトランスフェラ一ゼ c D N A を導入することを含む、少なくとも α 2 , 6 結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒト Τ Ρ Οの製造方法。