CN1278267A - 人细胞株产生的人血小板生成素、其制备方法及包含该物质的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由人血小板生成素(TPO)产生脏器来源的细胞株(例如,人肝脏来源的细胞和人骨髓基质瘤细胞)产生的与天然型糖链结构类似的TPO;TPO的制备方法,包括在人细胞株中表达外源性人TPO基因;和包含TPO的药物组合物,如用作血小板减少症的治疗剂;至少具有α2,6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO。本发明的TPO可望降低抗原性和改善体内的动力学。

Description

人细胞株产生的人血小板生成素、 其制备方法及包含该物质的药物组合物

发明背景

发明领域

本发明涉及人细胞株产生的新型人血小板生成素糖蛋白，特别是涉及能降低抗原性和改善体内动力学的新型人血小板生成素蛋白、其制备方法及包含该物质的药物组合物。

人血小板生成素(thrombopoietin，简称TPO)是作为Mpl的配体而克隆出的糖蛋白，而Mpl是细胞因子受体家庭成员之一(de Sauvage等，Nature(London)，369卷，533-565页，(1994)；Bartley，T.D.等，Cell，77卷，1117-1124页，(1994))。这些Mpl配体均可在血小板减少症动物(例如，人、小鼠、狗等)的血清和血浆中检测出来，因此确定它们与巨核细胞和血小板的形成相关。

以开发血小板减少症的治疗剂为目标，本发明人以促进由大鼠骨髓高度纯化的巨核前体细胞生成巨核细胞的活性为指标，从血小板减少症的大鼠血浆中纯化了大鼠的TPO，在其部分氨基酸序列的基础上，克隆了大鼠的TPO cDNA，进一步克隆了人的TPO cDNA，通过基因重组技术成功地获得了大量均一的人TPO(H.Miyazaki等，实验血液学，22卷，838页，(1994))。经证明，本发明人成功取得的人TPO与前面作为人Mpl配体而取得的因子具有相同的氨基酸序列(参照后面的序列表：序列号1)。

本发明人将该人TPO给予因方便用抑癌剂和免疫抑制剂或由(放射线照射)及BMT而引起骨髓抑制的血小板减少症的小鼠时发现，它能阻止血小板减少、促进血小板增加，而且看到造血功能的亢进，该人TPO对这些血小板减少症有效。

目前关于人TPO，已有人血浆中TPO的报道(Matsumoto，A，等，第38届ASH年会(1996))，但由于未得到分离、纯化的物质，所以其结构功能未知。

另外，由各种细胞所产生的TPO可在mRNA及ELISA水平检测出来。用来源于人的肝细胞(HepG2)(Hino，M.等，生物化学和生物物理研究通讯，217卷，475-481页，(1995))，可检测出组成型mRNA。另外，用人胎儿肾脏细胞(HEK)可检测出TPO mRNA，它具有使mpl表达细胞(mo7e，BaF3/mpl)增殖的活性。但是仍未能对其进行分离、纯化，包括体内活性在内，其结构、功能尚不知道。

另一方面，应用基因重组技术生产的重组人TPO，可在非洲绿猴肾脏细胞(COS-1)中表达(Kato，T.等，生化学杂志，118卷，229-236页，(1995))，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达(Morita，H.等，FEBS Lett 395卷，228-334页，(1995)，Kato.T.等，美国国家科学院院刊，94卷，4669-4697页，(1997))，在大肠杆菌(Ann.M.F.等，血液，86卷，54-59页，(1995))，小仓鼠肾脏细胞(BHK)(Ross，C.H.等，生物化学，35卷，14849-14861页(1996))、人胎儿肾脏细胞(HEK 293)(de Sauvage等，自然，369卷，533-538页(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，1117-1124页，(1994))中表达。

但是，到目前为止还没有关于用来源于TPO产生器官的人细胞株来表达TPO的报道。

另外，由上述各种非人细胞株所产生的TPO，与人细胞株产生的人TPO以及人血中的TPO在结构上有何异同尚未明了。因此，目前其结构的差异与TPO功能间的关系如何尚未见报道。

一般而言，具有TPO样生理活性的糖蛋白，除主要的TPO产生脏器以外，还有其它产生该蛋白质的脏器，由于来源于这种、那种脏器或脏器细胞的种类不同，有时所产生的该糖蛋白质的结构不同。

同样，用基因重组技术生产的重组糖蛋白质，由于所用宿主细胞不同，其所产生的糖链结构不同。尤其是用动物细胞作宿主细胞时，由于其种类的不同(动物种类或来源器官的种类、细胞株等)所添加的糖链结构多种多样，这种差异给蛋白质的功能，主要是抗原性、体内动力学等带来不少影响。事实上，目前有对很多基因重组蛋白药品产生抗体的报道(Steis等，N.Eng.J.Med.318卷，1409-1413页(1988)等)，这只是因为它们与体内的天然蛋白在构造、功能上存在差异造成的。

若有在抗原性、体内动态方面具有更优良性质的人TPO糖蛋白，预计其作为药品的价值更高一畴。

发明概要

本发明提供人细胞株产生的人血小板生成素(TPO)。

本发明的实施方案中，TPO是由内源性或外源性的人TPO基因在人细胞株中的表达产物，产物被分离、纯化。另外，作为人细胞株推荐TPO产生脏器来源的细胞株，例如JHH7(FERM BP-6049)、HuH7(FERM BP-6048)等来源于人肝脏的细胞，和人骨髓基质瘤细胞。

本发明的TPO含有与SSA凝集素柱具有亲合性的糖链结构，或者，至少含有α2，6连接型唾液酸化糖链结构。其氨基酸序列具有如序列表的序列号1中所示1-332位的氨基酸。

本发明还提供以上述定义的人TPO为有效成分的药物组合物。具体而言，该TPO可用作血小板增加剂，血小板障碍治疗剂、血小板减少症治疗剂。本发明的TPO作为药剂使用的时候，可具有降低抗原性和改善体内药代动力学等优点。

本发明还提供人TPO的制备方法，它包括在来源于TPO产生脏器的人细胞株内表达外源性的人TPO基因。作为人细胞株可应用上述来源于人肝脏的细胞(例如JHH7(FERM BP-6049)等)和人骨髓基质瘤细胞。用该方法所获得的人TPO也包含于本发明中。

本发明还提供至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO。这里的人TPO可以是外源性的人TPO基因在细胞株内的表达产物、产物被分离、纯化。而作为细胞株可以是导入了α2，6唾液酸基转移酶基因的CHO细胞。

另外，本发明还提供至少具有α2，6连接型唾液酸基糖链结构的人TPO的制备方法，它包括将α2，6唾液酸基转移酶cDNA导入CHO细胞中，然后在该CHO细胞中表达人TPO基因，或者在CHO细胞中表达人TPO基因，然后将α2，6唾液酸基转移酶cDNA导入该CHO细胞的制备方法。

附图简述

图1是通过电泳比较重组ChoTPO、天然HepTPO(JHH7)和天然HepTPO(HuH7)分子量的照片。检测是在电泳后，进行与抗TPO羊IgGXRAG-HRP的反应。每一泳道用250pg的TPO。

图2是通过电泳比较重组HepTPO(JHH7/7/c83)、天然HepTPO(JHH7)和重组ChoTPO的分子量的照片。检测与图1同样进行。

图3是应用凝集素ELISA法比较图中所示的各TPO与SSA凝集素或MAM凝集素的反应性。

图4是应用FDCP-hMp1635分析法显示图中所示的TPO的体外活性。

图5是通过电泳/Western印迹(使用抗hTPO羊多克隆抗体和辣根过氧化酶结合的抗羊IgG兔多克隆抗体)比较克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3产生的TPO，与克隆CHO29c14产生的重组ChoTPO分子量的照片。

图6表示用凝集素-ELISA法分析克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3产生的TPO的唾液酸的结果。

图7表示应用FDCP-hMp1635测定法比较导入了α2，6唾液酸转移酶cDNA的CHO细胞(图中以19c4和21c3表示)和CHO D-细胞(图中以HTCF表示)表达的TPO在体外的活性。

发明详述

由于在mRNA水平验证了人TPO的主要产生脏器为肝脏(Shimada，Y.等，实验血液学，23卷，1388-1396页，(1995)；Nomura，S.等，实验血液学，25卷，565-572页，(1995))，所以本发明人将注意力集中于来源人肝脏的细胞株。于是制备从人血浆部分纯化的TPO(天然血浆TPO)、从产生人TPO来源于肝脏细胞株纯化的TPO(天然HepTPO)、以及由产生该人TPO来源于肝脏的细胞株表达的重组人TPO(重组HepTPO)，与CHO中表达的重组人TPO(重组ChoTPO)比较它们的糖链结构。结果表明，从人TPO产生来源于肝脏的细胞株纯化出的TPO(天然HepTPO)与该人TPO产生来源于肝脏的细胞株表达的重组人TPO(重组HepTPO)，其N连接糖链的结合方式与CHO细胞表达的重组人TPO不同，但与从人血浆中纯化出的TPO(天然血浆TPO)相同。

也就是说，如后述的实施例中所示，应用抗TPO单克隆抗体和凝集素进行凝集素ELISA法分析时可发现，天然血浆TPO、天然HepTPO和重组HepTPO与判断糖链末端唾液酸的连接方式为α2，6连接的SSA凝集素(Shibuya，N.等，生物化学杂志，106卷，1098-1103页，(1989))具有反应性，但重组ChoTPO不具有反应性；另一方面，对于判断唾液酸连接方式为α2，3连接的MAM凝集素(Wei-Chun，W.等，生物化学杂志，263卷，4576-4585页，(1988))，它们均具有反应性。总之，可以这么说重组ChoTPO与N连接型糖链中具有α2，6连接唾液酸结构的来源于人血浆的TPO有很大差异，而天然HepTPO和重组HepTPO与来源于人血浆的TPO相类似。

于是，参照本发明，可提供由人细胞株产生的新型TPO。优选提供由TPO产生脏器来源的人细胞株所产生的新型人TPO。更优选提供具有上述特定糖链结构的新型TPO。

本发明的新型人TPO能降低抗原性，改善体内的药代动力学，改善因连续施用所造成的血小板增多效果的降低。

本发明的人TPO推荐使用外源性(exogenous)的人TPO基因在人细胞株中表达的产物，而外源性的人TPO基因是应用基因重组技术，将人TPO基因导入细胞株，使之表达、分离、纯化而获得的。或者使用内源性(endogenous)的TPO基因在人细胞株中的表达产物作为人TPO，而该内源性的TPO基因是从表达人TPO基因的人细胞株中分离、纯化得到的。作为内源性的人TPO基因的表达产物，还包括参照下一方法而得到的人TPO，即将启动子等导入含有TPO基因的人细胞株中，使该内源性的TPO基因活化、表达(国际公开第WO96/29411号)。

作为人细胞株，可推荐如HL60(ATCC保藏号CCL-240)、Jurkat(ATCC保藏号TIB-152)、K562(ATCC保藏号TIB-152)、HeLa(理研保藏号RCB0027)、HepG2(ATCC保藏号CRL10741)等。优选应用来源于TPO产生脏器的人细胞株，例如来源于人肝脏的细胞、人骨髓基质瘤细胞等。更优选来源于人肝脏的细胞株JHH7、HuH7、HepG2等。JHH7按照布达佩斯条约，于1997年8月11日保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-6049。同样HuH7于1997年8月11日保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-6048。

优选的本发明人TPO，具有2，6连接的唾液酸化的糖链结构，或者至少包括与SSA凝集素(正规名称参照：蓝筛朴(Sambucussieboldina)aggulutinin凝集素或EIderberry Bark凝集素(Sibuya，N.等，生物化学杂志，262：1596-1616(1987))具有亲和性的糖链结构。更优选在N连接型糖链中含有α2，6连接的唾液酸化的糖链结构，或与SSA凝集素具有亲和性的糖链结构。

本发明的人TPO，其蛋白质部分的一级结构，即其氨基酸序列包括序列号1中所示的氨基酸序列，或者保持人TPO活性而氨基酸序列中一部分发生改变(置换、缺失、插入和/或添加)了的序列。具体而言，可推荐象国际公开第WO95/21919号(1995年8月17日)记载的TPO衍生物和第WO96/25498号(1996年8月22日)记载的TPO衍生物，WO95/18858号(1995年7月13日)记载的TPO衍生物那样进行氨基酸残基的改变。

本说明书中，“TPO活性”是指能促进巨核前体细胞的增殖和分化，和/或在生物体内特异性刺激或增强血小板产生的活性。

另外，本发明还提供上述新型人TPO的制备方法。

作为从人细胞株直接纯化和分离的方法，可应用蛋白质纯化中所应用的常规手段，例如离子交换层析法、凝集素亲和层析、色素吸附层析、疏水性相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、肝素亲和层析、硫酸化凝胶层析、羟基磷灰石层析、金属螯合物层析、等电点层析、分离电泳及等电点电泳等，可多种方法组合应用。另外，应用人TPO理化性质可进行组合的方法也包括在本发明中。也可应用可识别TPO的抗体制备的抗体柱。另外，因为已证明TPO是Mpl的配体(de Sauvage等，Nature，369卷，533-565页，(1994)：Bartley，T.D.等，Cell，77卷，1117-1124页，(1994)；Kaushanaky等，Nature，369卷，565-568页，(1994))，通过偶联使Mpl活化的胶可制备亲和性凝胶柱，利用这一点可纯化TPO。更具体而言，可推荐以CHO细胞作宿主，通过基因重组法生产、制备Mpl的细胞胞外区(Mpl-X)而制备的Mpl-X柱(前述的Bartley等(1994))。

另外，本发明中也包括应用基因重组技术制备本发明的人TPO的方法。例如本发明的人TPO制备方法的特征在于：将编码人TPO的DNA插入到载体的合适部位，作该重组载体转化或转染人细胞株，分离、纯化其产生的人TPO蛋白质。本发明的实施方案中所提供的人TPO的制备方法是将人TPO基因导入TPO产生脏器来源的人细胞株中，优选导入来源于人肝脏的细胞(例如JHH7细胞)或人骨髓基质瘤细胞，使之表达。这些方法中使用的人细胞株如上所述。

转化或转染这些宿主细胞所用的载体有pSV2-neo(Southern和Berg；J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341，1982)，pCAGGS(Niwa等，基因，108，193-200，1991)，或pCDL-SRα296(Takebe等，分子细胞生物学，8，466-472，1988)等。

这些载体要含有必要的复制起点、选择性标记，启动子，用于真核细胞的载体要附加必要的RNA剪接部位、聚腺苷酸化信号。

作为复制起点可应用来源于SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒的复制起点。

作为基因表达用的启动子可应用来源于逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、SV40等病毒的启动子或应用来源于染色体的启动子(例如，EF1-α)等。

作为选择标记可应用新霉素(neo)抗性基因、嘌呤霉素(pur)抗性基因、胸苷激酶(TK)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因等。

优选如后面实施例1(4)那样转化JHH7细胞，即将人TPO cDNA配置在人延长因子-1-α启动子下游，再加上SV40初期腺苷酸加尾信号，DHFK基因SV40复制起始点，用这样的载体，通过转染法(Promega公司)转染JHH7细胞。或许转染的JHH7细胞除产生内源性人TPO基因的表达产物人TPO外，还产生基于导入的外源性人TPO基因的TPO。

另外，本发明还提供含有本发明的人TPO的药物组合物。本发明的药物组合物可包括与制剂目的相适应的稳定剂、稀释剂、崩解剂、防腐剂、防酸剂、赋形剂和等张剂等。

本发明的包含人TPO的药物可以是适于注射等非经口途径、经肺、经鼻和经口等多种途径的剂型，例如溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、冷冻干燥剂等。

本发明的包含人TPO的药物组合物，其活性成分含量通常是0.05μg/kg-1mg/kg体重，根据病情，特别及施用途径可一日一次-数次施用。

本发明为必须增加血小板的多数疾病患者提供以本发明的人TPO为有效成分的血小板增加剂。

再者，为因施用抗癌剂和免疫抑制剂而造成的血小板减少症、施行化疗和放疗、或是骨髓移植(BMT)和PBSCT、CBSCT的患者提供血小板减少症的治疗剂。

再者，对以因血小板障碍，例如血小板生成障碍和血小板寿命缩短(血小板破坏亢进，或血小板消耗亢进)而造成血小板减少为特征的多种疾病提供治疗剂。

例如，先天性范康尼贫血，伴随化疗和放疗法的再生不良性贫血，骨髓异常形成症，急性骨髓性白血病，或者象骨髓移植那样因骨髓形成不全而引起的血小板减少症等，该治疗剂可由于促进这些患者血小板的恢复。

另外，对因TPO产生异常而引起的血小板减少症也有用。作为因血小板和巨核细胞寿命缩短而引起的血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，播散性血管内凝血综合征，血栓性血小板减少症等，该治疗剂可用于促进这些患者的血小板恢复。

再者，外科手术前施予TPO可增加自身的血小板，该血小板可用作自身手术时输血用血小板，也就是说可用于自身血小板输血。

再者，本发明的人TPO对于因其它化学药品或药物或活疗措施而引起的一过性血小板缺损或损伤所造成的血小板障碍也具有治疗作用。本发明的人TPO可用于促进这些患者的新的“无伤”血小板的释放。再者，由于已明确TPO的主要产生脏器之一为肝脏，所以期待临床上将TPO施于引起血小板减少的各种肝脏病，例如，胆道闭锁症、肝脏移植、肝硬变、肝炎等。再者可用于保存血小板的止血血栓形成的能力。

由此，应用本发明的药物组合物或治疗剂，不仅可更好地降低其抗原性，而且可更好地改善其药剂的药代动力学，可得到更好的血小板增加效果，血小板障碍治疗效果或血小板减少症治疗效果。

本发明还提供至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO。这里，人TPO是外源性的人TPO基因在细胞株内表达、分离纯化的产物。另外，与CHO细胞和卵巢细胞同样，可将α2，6-唾液酸基转移酶基因导入α2，6-唾液酸转移酶活性低下的来源于肾脏的HEK293和BHK等细胞株中。

本发明人通过将大鼠α2，6-唾液酸基转移酶cDNA导入CHO细胞中，尝试表达添加α2，3连接型和α2，6连接型二种唾液酸形式的TPO。此时，可将人TPO基因导入CHO细胞后再将α2，6-唾液酸转移酶cDNA导入，也可相反顺序进行。或同时进行。另外，在后来的实施例中导入到CHO细胞的基因可以是大鼠肝脏β-半乳糖苷α2，6-唾液酸基转移酶(Entrez登记号M18769)，例如来源于或大鼠脑的酶(Entrez登记号L29554)和小鼠β-半乳糖苷α2，6-唾液酸转移酶(Entrez登记号D16106)。

本来CHO细胞不具有α2，6-唾液酸基转移酶活性(Paulson，J.C.等，生物化学杂志，264卷，10931-10934页，(1989))，但根据Lee，E.J.等(生物化学杂志，264卷，13848-13855页，(1989))的方法，通过在强启动子下游导入α2，6-唾液酸基转移酶cDNA，与细胞本有的α2，3-唾液酸基转移酶活性产生竞争，根据其量的优势，α2，6结合型唾液酸和α2，3连接型唾液酸在同一分子上，或者产生优势位置添加的TPO。这里所讲的“α2，6结合型唾液酸添加到优势位置”是指在实施例3中叙述的用凝集素ELISA测定时，它与SSA-凝集素ELISA反应与MAM凝集素ELISA的反应在测定界限以下。不用认CHO D-珠产生的TPO具有α2，3型结合的唾液酸，而不具有α2，6型结合的唾液酸，事实上，它与MAM凝集素ELISA有很强的反应性，而对SSA凝集素ELISA没有一点反应。通过导入α2，6-唾液酸转移酶基因可逆转这一反应性。达到与本来没有的α2，6-型结合的唾液酸产生特异性结合的SSA凝集素反应是指，导入α2，6-唾液酸转移酶基因使之多表达。结果其活性与α2，3-唾液酸转移酶的唾液的添加活性相比，占压倒性多数，结果本来α2，3型结合方式的唾液酸添加位置被α2，6型结合方式的唾液酸占据。

作为导入人TPO基因的CHO细胞，可用由包含编码人TPO DNA的适宜表达载体所转化的CHO细胞。例如可推荐由保持编码人全长TPO cDNA的质粒pDEF202-hTPO-P1所转化的CHO细胞株(CHO-DUKXB11)，该质粒于1993年1月31日保藏于日本国通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏为FERM BP-4988。

如此，本发明提供至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO的制备方法，它包含将α2，6-唾液酸转移酶cDNA导入CHO细胞，在该CHO细胞中使人TPO基因表达的方法。另外本发明提供至少具有α2，6结合型唾液酸化糖链结构的人TPO的制备方法，它包含在CHO细胞中使人TPO基因表达，再在将α2，6-唾液酸基转移酶cDNA导入该CHO细胞中的方法。

实施例

通过以下实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些实施例。<实施例1>(1)从人血浆(部分)纯化TPO……天然血浆TPO

在流水中溶解约460ml的-80℃保存的人血浆，之后1350×g离心，除去不溶性沉淀，用等量的含1mM EDTA，0.1％Tween 20，0.1％ NaN₃的Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(PBS)(DPBS：日水制药(株)公司产品目录号05913)稀释其上清457ml。为了抑制蛋白酶造成的蛋白水解，向2倍稀释的人血浆914ml中加入蛋白酶抑制剂PefablocSC(MERK公司产品目录号124839，终浓度0.1mM)。添加反式-环氧琥珀酸-L-亮氨酰氨基(4-胍基)-丁烷(SIGMA，产品目录号E3132，终浓度0.01mM)。应用0.22μ的SARTOBRAN 300(Sartorius公司产品目录号5231307H5--00--B)将之过滤，以0.5ml/min的流速上样到结合了抗TPO抗体的NHS-activated Sepharose 4FF柱(柱大小：φ0.5cm×5cm，NHS-activated Sepharose FF凝胶：Pharmacia，产品目录号17-0906-01)。此时为了避免抗TPO抗体柱的非转异性吸附，用Sepharose 4FF柱(柱大小：φ0.5cm×0.5cm，Sepharose 4FF胶：Pharmacia，产品目录号17-0149-01)和正常兔IgG结合的NHS-activated Sepharose 4FF柱(柱大小：φ0.5cm×5cm，NHS activated Sepharose 4FF胶：Pharmacia，产品目录号17-0906-01)作为前柱。然后连接抗TPO抗体柱。上柱之后，用含有1mM EDTA、0.1％Tween 20、0.1％NaN₃的DPBS缓冲液洗柱，当280nm的吸光度(A280)达到0.2时移去前柱。为了除去与胶结合的非转异性吸附物，用含有0.5M NaCl的10mM磷酸钠pH 7.3缓冲液洗柱。柱内用150mM NaCl置换后，用含有150mM NaCl、5mM CHAPS的0.1M甘氨酸-HCl pH 2.3缓冲液洗脱TPO。洗脱后，立即用1M Na₂CO₃中和各部分，供给高敏感度的TPO-ELISA。根据ELISA结果选出TPO洗脱部分，通过超滤进行浓缩，交换缓冲液。用ULTRAFREE-MC 10kcut(MILLIPORE，产品目录号UFC3LGCOO)进行超滤，4000×g离心，浓缩后，添加数次DPBS，反复进行浓缩。最后悬浮到500L含1mM EDTA 0.1％Tween 20，0.1％NaN₃的DPBS缓冲液中，得到部分纯化的人血浆TPO。

将部分纯化的该TPO的一部分如下进行SDS凝胶过滤。向部分纯化TPO中加入5份1体积的250mM Tris-HCl、pH6.8，50％甘油，5％SDS，10mM EDTA，95℃处理5分钟。将之上样到用含有0.1％SDS、1mM EDTA的DPBS平衡过的Superose 6HR凝胶过滤柱(φ1cm×30cm，Pharmacia，产品目录号17-0537-01)，将所得级份供给TPO-ELISA，鉴定出TPO的洗脱位置。结果来源于人血浆和TPO与CHO表达型TPO(1-332氨基酸)几乎去同一位置洗脱出，考虑分子量约80KD。另外，虽然量少但在大约20KD附近可看到部分长型TPO洗脱出来。

(2)从JHH7细胞(部分)纯化TPO……天然HepTPO(JHH7)

将JHH7细胞放入到培养子面积为225cm²的培养瓶中，用含有10％FCS的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基/HamF12(DF)培养基(Gibco)，在5％CO₂的培养箱中，37℃培养到汇合。其后，置换成无血清的DF培养基，培养4天后，回收上清。

将上述培养中得到的体积4L的上清(TPO浓度55pg/ml)合成每份1L，然后上到用5mM磷酸钾pH6.8平衡过的WGA-agarose(生化学工业社制)5ml充填的柱中。用大约250ml的5mM磷酸钾pH6.8洗净后，用0.4M N-乙酰半乳糖胺、5mM磷酸钾pH6.8 15ml洗脱。用UF15-10kcut(Millipore公司)浓缩洗脱液，得到TPO样品(1.0ml，159ng/ml)。(3)从HuH7细胞(部分)纯化TPO……天然HepTPO(HuH7)

将HuH7细胞放置到培养子面积225cm²的培养瓶中，用含有10％FCS的DF培养基，在5％CO₂培养箱中、37℃培养至汇合。其后，换成无血清的DF培养基，培养4天后，回收上清。将1.9L的上清(147pg/ml)分为每份L后。上到用5mM磷酸钾pH6.9平衡过的WGA-agarose(生化学工业公司)5ml充填的柱上。用约250ml的5mM磷酸钾pH6.8洗净后，用0.4M N-乙酰半乳糖胺5mM磷酸钾pH6.8各15ml进行洗脱。用UF15-10kcut(Millipore)浓缩洗脱液，得到TPO样品(1.5ml，77ng/ml)。(4)JHH7细胞中TPO的表达和纯化……重组HepTPO(JHH7/7/c83)

在直径6cm的平皿(Pharmacia公司)中，用含有10％FCS的DMEM培养基培养JHH7细胞，使之增殖，应用トランスフエクタム法(Promega)，用pDEF202-h-TPO-P1(特开平8-228781号公报)进行转化。

质粒pDEF202-h-TPO-P1所转化的CHO细胞(CHO-DUKBII)于1995年1月31日保藏于日本国通商产业省工业技术院生命化学工业技术研究所，登记号为FERM-BP-4988。

即，将10μg pDEF202-hTPO-P1质粒、1μg pEFneo质粒加入到500μl的DMEM培养基中构成SolutionA，向500μl DMEM培养基中加入5μl(1mg/400μl EtOH)构成Solution B，将二者混合，向置换成500μl大血清DMEM培养基的直径6cm的平皿中加入1ml、37℃、5％的培养箱中放置6小时。然后，添加DMEM培养基3.5ml，加入终浓度达10％的血清，再在37℃、5％CO₂培养箱中放置48小时。pEFneo质粒的制作如下进行。即，用限制性酶EcoRI-BamHI处理质粒pRc/CMV(Invitrogen)，通过琼脂糖凝胶电泳回收含有新霉素抗性基因的小片段，用T4聚合酶(宝酒造)将末端平端化处理后，用T4DNA聚合酶(宝酒造)将该片段与用限制性酶SmaI处理的质粒pEF18S(特开平8-228781号公报)而得到的载体DNA进行连接。在如此所得的2种质粒中，选择新霉素抗性基因与延长因子启动子同一方向插入的质粒，即为pEFneo。

然后用0.05％胰蛋白酶、53mM EDTA溶液将之剥离分散，分散于10个24孔板中后，用含4mg/mg G418的DMEM+10％FCS培养基进行筛选。其中形成集落后，用FDCPhMp1635/MST鉴定法(Morita H.等，FEBS Lett.395卷，228-334页，(1993))筛选高表达的集落。用有限稀释法对筛选的集落进行克隆化，作为单一克隆。

包含人TPO cDNA的pDEF202-hTPO-P1转化的JHH7细胞株(JHH7/7/c83)于1997年8月11日根据布达佩斯条约保藏于日本国通商业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-6050。

将该重组JHH7细胞株(JHH7/7/c83)放入到培养面积为225cm²的培养瓶中，用含10％FCS的DF培养基，在5％CO₂培养箱中37℃培养至汇合。其后，将之置换到无血清的DF培养基上，培养4日后，回收上清。

用Pellicon-2cassette 10kcut(Millipore公司，批号P2B010A05)将8.97L的上清浓缩为899ml(TPO浓度为5.7μg/ml)。为了抑制蛋白酶的蛋白水剂，加入蛋白酶抑制剂亮抑蛋白肽(Leupeptin)(终浓度0.01mm)、反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)-丁烷(终浓度0.01mm)。

分成每份225ml，上到4个预先用5mM磷酸钾pH6.8平衡过的WGA0-agavose(生化学工业公司)5ml充填的柱上。分别用大约250ml的5mM磷酸钾洗涤后，用0.4M N-乙酰基半乳糖胺、5mM磷酸钾pH6.8各15ml进行洗脱(790浓度为73μg/ml)。

用UF15-10kcut(Millipore)浓缩洗脱液，置换成5mM磷酸钾pH6.8(5.0ml，TPO浓度1084μg/ml)。

将之注入Hydroxyl Apatite typel(Biorad，直径1cm，基床高10cm)柱，以1ml/min的流速进行添加之后，连续将5nm磷酸钾pH6.8注入柱内，收集未吸附的部分50ml(TPO浓度54μg/ml)。向其中加入1M Tris碱溶液，调pH值为8.5。

接着，用Q-Sepharose HP(Pharmacia Biotech，批号直径5mm，基床高10cm)柱展开该部分，即展开溶剂A用20mMTris-HCl pH7.5，展开溶剂B用含1M NaCl的20mM Tris-HClpH 7.5，以0.3ml/min的流速将样品添加剂预先用20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5平衡过的柱子上。添加终了后，流速从0.3ml/min调至0.5ml/min，用0％B-22％B的直线浓度梯度进行展开，每1.0μl(2min)收集到聚丙烯制的管中。

用ELISA法测定各级份，鉴定出TPO级份。结果发现试管编号为34-55(NaCl浓度为0.116-0.2M)的有TPO分布，因此回收该部分，作为TPO级份FA(22ml)。用UF15-10kcut(Millipore)浓缩这一部分，当液量达到4.1ml的时候，用ELISA法测定TPO的浓度(1143μg/ml)。再进一步浓缩，使之达200μl。

最后一步是用Superdex 200HR(Pharmacia Biotech，直径1cm，床高30cm)进行分离。即，将柱置换成磷酸缓冲盐水(PBS)后，将FA浓缩样品200μl以0.3ml/min的流速注入。注入后连续用PBS添加柱子，从样品添加开始15分钟后开始每100μl(3min)作为一级份。通过银染色、抗人TPO的克隆抗体、ELISA法测定各级份，结果发现试管编号13，14，15(从添加开始的总量为7.2-9.0μl)中有TPO分布。合并这3个级份，用AccQTag法分析其组成，结果为人1.733mg/ml(1.8ml)级分。

此时，与用ELISA法测定的TPO量为1.1mg/ml时的组成分析值几乎相同。也就是说，这里所应用的ELISA即便对重组HepTPO也显示与标准TPO同等的反应性。

表1重组HepTPO(JHH7/7/c83)

CBB法    ELISA

样品	级分	体积(ml)	蛋白浓度(mg/ml)	总量(mg)	流速	TPO浓度(μg/ml)	总量(μg)	回收(％)
									Cond.Med		8971	0.09408	843.99168	100.0	0.55	4934.05	-
Conc.Med		899	0.9298	835.8902	99.0	5.7	5124.3	100.0
									WGA	FT	903	0.8693	784.9779	93.0	0.45	406.35	7.9
	Ads	60	0.3448	20.688	2.5	72.95	4377	85.4
										Conc	5		0	0.0	1084.15	5420.75	105.8
HA	FT	50		0	0.0	54.4	2720	53.1
									Q	pool	4.1		0	0.0	1143	4686.3	91.5
Superdex	pool	1.8		0	0.0	1127.85	2030.13	39.6

AccQ-TAG法(mg/ml)

1.11733<实施例2>分子量的测定

为了测定实施例1中得到的各种TPO的分子量，进行SDS-PAGEWestern印迹。按照常规方法，应用微孔凝胶(第一化学药品公司，4.0％-20％浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶)室温下进行SDS凝胶电泳，以先10mA，然后20mA的电流，进行约2小时。应用预染色宽范围标记作为分子量标记。

应用半干转移装置(マリソル公司，ウエツトフオ转移装置KS-8640型)，电泳终止后直接用150mA的电流经7小时电转移到PVPF膜(Millipore)上。阳极用0.3M Tris，20％甲醇，pH10.4，转膜液用25mM Tris、20％甲醇、pH10.4，阴极液25mM Tris、40mM氨基正己酸、20％甲醇。

将转移的膜在TTBS溶液中洗5分钟后，在封闭液(雪印社)中封闭1小时。由在TTBS中洗5分钟后，向90％TTBS、10％封闭液、0.03％BSA溶液中加入抗人TPO羊抗体，振荡1小时。接着，由在TTBS中将该膜洗2次，每次3分钟，然后向TTBS溶液中加入抗羊过氧化酶结合抗体，振荡1小时。其后，将该膜在TTBS溶液中洗4次，每次10分钟，在ELC显色系统(Amersham)中使胶片(Amersham)感光。

电泳中所看到的分子量，重组ChoTPO(CHO)、天然HepTPO(JHH7、HuH7)、重组HepTPO(JHH7/7/c83)几乎均在80KDa附近存在(图1和图2)。这与从氨基酸序列推算的分子量为(35KDa有很大差异，可很容易地推出这是由于它附加了糖使分子量增加。<实施例3>应用凝集素-ELISA进行唾液酸分析

与目前所报道的方法(Rafferty，B.等，J.Endoeri，145卷，527-533页)相似，凝集素ELISA通过用与目的蛋白质相对的特异抗体作为固相，以吸附目的蛋白质，使之与生物素化的凝集素进行反应，接着与标记的亲和素反应，显色，通过测定吸光度进行。

即，在10μg/ml的浓度下，将抗人的小鼠单克隆抗体、TN-1(Tahara，J.等，英国血液学杂志，57卷，783-788页(1995))以每孔100μl分别加到96孔板的各孔中，搅拌后放置约10小时。各孔以350μl的TTBS溶液将之洗涤4回，然后向各孔中加入200μl预先与用于检测的相同凝集素结合的琼脂糖(SSA-Agarose或MAM-Agarose，均为生化学工业公司)颠倒混合4小时、除去了凝集素反应物的1％BSA/TTBS溶液，室温搅拌1小时。然后弃之，干燥30分钟后，向前述的1％BSA/TTBS溶液中加入各种浓度的样品，每浓度3孔，各孔100μl，搅拌4小时。由入各孔350μl的TTBS溶液中洗板，洗5次后，将凝集素-生物素(生化学工业公司)加入到0.5％BSA/TTBS溶液中，SSA-生物素时终浓度为0.2μg/ml，MAM-生物素时终浓度为1.0μg/ml，各孔加入100μl，搅拌2小时。再次在各孔350μl的TTBS溶液中洗板，洗5次后，将30分钟前以各1μl/100ml的浓度加入了亲和素-碱性磷酸酶/亲和素-生物素溶液(DAKO)。搅拌了的0.25％BSA/TTBS溶液以100μl每孔分加到各孔，搅拌1小时。最后，再在每孔350μl的TTBS溶液中洗板，洗6次，加入碱性磷酸酶显色试剂盒(DAKO)的底物溶液100μl，作用10分钟，接着加入100μl增敏显色液，搅拌5分钟，用平板检测仪(生化学工业公司)测定492nm的吸光度，于630nm处测定对照值，用该值和浓度绘制吸光度的温度依赖曲线，也就是说描绘出TPO各种对凝集素的反应性。

从图3可以看出天然血浆TPO、天然HepTPO(JHH7)和天然HepTPO(HuH7)对SSA凝集素ELISA的反应性均有相似趋势。尤其是天然血浆TPO、天然HepTPO(JHH7)和天然HepTPO(HuH7)显示高反应性。另一方面，重组ChoTPO在检测界限以下。天然血浆TPO、天然HepTPO(JHH7)和天然HepTPO(HuH7)对MAM-凝集素ELISA的反应性具有相似的趋势，而重组HepTPO和HepTPO(JHH7/7/c83)的反应性稍低。<实施例4>体内活性

体内活性计算原理是将各种检测施用给小鼠，通过计算血小板数而算出。

即，将悬浮于PBS中的各种浓度的各种检测物连续4日施用于雄性8周龄的BALB/c小鼠。连续施用结束后第3天采血样测定血小板数。此时将100mn定义为血中血小板数为3×10⁶血小板1μl的浓度。

用上述测定方法比较TPO各种时发现重组HepTPO为4.5×10⁴U/mg，比重组ChoTPO的9.0×10⁴U/mg的值较低。<实施例5>体外活性(FDCP-hMp1635测定)

回收TPO存在下传代培养的FDC/P2细胞中强制表达全长人Mpl的FDCP-hMp1635细胞(Morita，H.等，FEBS Lett.395卷，228-334页，(1995))，充分洗涤后，再悬浮到含10％FCS的IMDM培养液中。将FDCP-hMp1635细胞以每孔2.5×10³个的细胞数加到组织培养用96孔平底培养板中，再加入标准品和待检样品，使终液量达200μl/孔。将培养孔于5％CO₂、37℃培养3天。在第3天培养4小时前向各孔加入25μl MTS/PMS溶液(Promega)，培养终了后用平板读数(生化学工业公司)测定492nm的吸光度。

再次分析来源于各种细胞的TPO的重组型TPO的组成分析值、(Tahara，T等，英国血液学杂志，57卷，783-788页，(1995))来源于血浆或难重组型肝脏细胞的TPO的ELISA值，发现它们具有同等活性(图4)。<实施例6>α2，6-唾液酸基转移酶表达载体(pEFneo-α2，6ST)的制备

用XbaI充分切断实施例1(4)中的pEFneo质粒后，连续短时间以XhoI作用，得到XbaI-XhoI的部分酶切片段。此时，由于XhoI部位存在3个，所以含有SV40复制起点的片段可有3种。其中目的片段长度第2，首先将3种的混合物与目的片段连结，然后用编码pEFneo的EF-1α启动子3′末端附近位置的引物5′-CCTCAGACAGTGGTTCAAAG-3′(序列号2)进行测序，以排除其它2种的可能性，实际上亦如此。这里所讲的目的片段是含有来源于大鼠肝脏的β-半乳糖苷α2，6-唾液酸转移酶cDNA(GenbankM18769/Weinstein，J.等，生物化学杂志，262，17733-17743)全长的5′端有XhoI部位、3′末端有XbaI部位的DNA片段。

该载体含有SV40的复制起始区域，人延长因子-1-2启动子，SV40起始聚腺苷酸化部位，及SV40启动子区域，新霉素抗性基因，SV40起始聚腺苷酸化部位，β-乳胺酶基因(Ampr)，β-半乳糖苷-α2，6-唾液转移酶cDNA连接到人延长因子-1-α启动子下游。<实施例7>α2，6-唾液酸转移酶表达载体向CHO细胞的导入

将已表达人全长TPO的CHO29/14株(200nM氨甲喋呤抗性)，以3×10⁵细胞，置于6cm口径的平皿(Falcon)中，用含有10％胎牛血清的最小必须培养基(α-MEM(-)，添加腺胸苷、次黄嘌呤进行培养，使之增殖，应用トランスフエクタム法(Promega)对之进行转化，导入α2，6-唾液酸转移酶表达载体。

即，向实施例6制备的pEFneo-α2，6 ST质粒15μg中加入500μl α-MEM(-)制备为混合物，然后从溶解了1mg トランスフエクタム的400μl乙醇中取5ul，将500μl α-MEM(-)加入到其中，制备为混合物。将上面的两种混合物再混合，室温放置10分钟。其间，将在6cm直径平皿上培养的上述细胞置换到不含胎牛血清的α-MEM(-)中。将该DNA溶液滴到平皿中后在CO₂培养箱中培养大约6小时。向平皿中加入2.5ml的α-MEM(-)和500μl的胎牛血清，继续培养1天后，用含有10％透析胎牛血清选择培养基(α-MEM(-)，未添加胸苷，次黄嘌呤，添加遗传霉素(Giboco))进行筛选。筛选的实施是，用胰蛋白酶处理细胞后，将每个6cm直径的平皿分割10个24孔板中，2-3天后，边换选择培养基，边继续培养。此时，最初2天用含有终浓度为0.5mg/ml遗传霉素的选择培养基，接着3天用含有终浓度为1mg/ml的遗传霉素的选择培养基，其后，每换培养液时，换成遗传霉素浓度减半的选择培养液，最终将遗传霉素的浓度得到0.2mg/ml。其间氨甲喋呤的浓度维持在200mM不变。对于细胞增殖了的孔，用TPO-ELISA检测其培养上清中人TPO的量，通过SSA-凝集素ELISA测定以α2，6型结合方式所添加的唾液酸的相对增加量。对培养上清中看到人TPO活性和α2，6结合型唾液酸增加的各孔，再用含有200mM氨甲喋呤、0.2mg/ml遗传霉素的选择培养基以1∶15将细胞分开剥离到孔中，通过继续培养，使遗传霉素抗性细胞增殖，克隆化，结果最终得到对200mM氨甲喋呤0.2mg/ml遗传霉素抗性的克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3。<实施例8>表达的确认

为了测定实施例7中所得的各种TPO的分子量，用实施例2中的方法进行SDS-PAGE Western印迹。以参照Tahara.T等的方法(英国血液学杂志，57卷，783-788页，(1995))测定得到的表达量为基础，所得克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3产生的TPO在电泳中看到的分子量与重组ChoTPO(CHO29c14)几乎同在80 KDa附近(参照图5)。这与根据氨基酸序列推升的分子量量35KDa有所差异，可很容易地推断出这是因为添加糖链而分子量增加。<实施例9>用凝集素-ELISA分析唾液酸

用实施例3中的方法，对实施例8中得到的TPO进行唾液酸分析(图6)。

结果表明，2株细胞中CHO+2，6ST19/c4以产生在优势位置添加α2，6-结合方式的唾液酸TPO为特征的细胞，CHO+2，6ST/21/c3产生α2，3-和α2，6结合方式的唾液酸同时添加在同一分子上的TPO。<实施例10>体外活性的确认

用实施例5中的FDCP-hMp1635测定法确认实施中得到的TPO的体外活性。

2.5×10³个的FDCP hMp1635细胞与各种浓度的TPO一起在96孔板中37℃培养3天后，向各孔中加入20μl MTS溶液。再培养4小时后，在492mm处测定吸光度来检测样品的活性。结果如图7所示。

结果表明，CHO D-细胞表达的TPO和导入了α2，6-唾液酸转移酶基因的CHO细胞表达的TPO对FDCP hMp1635的增殖活性几乎相等。总之，可以这样说：尽管唾液酸的连接方式由原来CHO细胞中见到的α2，3型变化成α2，6型，不管比例如何，细胞的增殖活性相同。

                   序列表<110>Kirin Brewery Company.Limited<120>用细胞株生产的人血小板生成素，其制备方法，及包含该血小板的药物组合物。<130>PH-570-PCT<150>JP97/236109<151>1997-09-01<160>2<210>1<211>332<212>蛋白质<213>人<400>1Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1               5                  10                  15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

         20                  25                  30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

     35                  40                  45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

 50                  55                  60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65                  70                  75                  80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

             85                  90                  95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145                 150                 155                 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

            165                 170                 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

        180                 185                 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile

    195                 200                 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln lle Pro Gly

210                 215                 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly

            245                 250                 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser

        260                 265                 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

    275                 280                 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro

290                 295                 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            325                 330<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cctcagacag tggttcaaag                              20

Claims (37)

1.人细胞株产生的人血小板生成素(TPO)。

2.权利要求1的人TPO，其特征在于，人TPO是外源性的人TPO基因在人细胞株中的表达产物，产物经过分离、纯化。

3.权利要求2的人TPO，其特征在于，人细胞株为来源于TPO产生脏器的人细胞株。

4.权利要求3的人TPO，其特征在于，来源于TPO产生脏器的人细胞株为人肝脏来源的细胞。

5.权利要求4的人TPO，其特征在于，来源于人肝脏的细胞为JHH7(FERM BP-1049)。

6.权利要求4的人TPO，其特征在于，来源于人肝脏的细胞为HuH7(FERM BP-6048)。

7.权利要求3的人TPO，其特征在于，来源于TPO产生脏器的人细胞株为人骨髓基质瘤细胞。

8.权利要求1的人TPO，其特征在于，人TPO是内源性的人TPO基因在人细胞株中的表达产物，产物经过分离、纯化。

9.权利要求8的人TPO，其特征在于，人细胞株为来源于TPO产生脏器的人细胞株。

10.权利要求9的人TPO，其特征在于，来源于TPO产生脏器的人细胞株是来源于人肝脏的细胞。

11.权利要求10的人TPO，其特征在于，来源于人肝脏的细胞为JHH7(FERM BP-6049)。

12.权利要求10的人TPO，其特征在于，来源于人肝脏的细胞为HuH7(FERM BP-6048)。

13.权利要求9的人TPO，其特征在于，来源于TPO产生脏器的人细胞株为人骨髓基质瘤细胞。

14.权利要求1-13任一权项中的人TPO，共特征在于，它具有与SSA凝集素柱有亲和性的糖链结构。

15.权利要求14的人TPO，其特征在于，人TPO的氨基酸序列为序列号1的1-332。

16.权利要求1-13任一权项中的人TPO，其特征在于，它至少具有α2，6连接型唾液酸化的糖链结构。

17.权利要求16中的人TPO，其特征在于，人TPO的氨基酸序列为序列号1中的1-332。

18.一种药物组合物，它以权利要求1-17任一权项中的人TPO作有效成分。

19.一种血小板增加剂，它以权利要求1-17任一权项中的人TPO作为有效成分。

20.一种血小板障碍治疗剂，它以权利要求1-17任一权项中的人TPO作有效成分。

21.一种血小板减少症治疗剂，它以权利要求1-17任一权项中的人TPO作有效成分。

22.权利要求19中的血小板增加剂，其抗原性被降低。

23.权利要求20的血小板障碍治疗剂，其抗原性被降低。

24.权利要求21的血小板减少症治疗剂，其抗原性被降低。

25.权利要求19的血小板增加剂，它改善了体内的药代动力学。

26.权利要求20的血小板障碍治疗剂，它改善了体内的药代动力学。

27.权利要求21的的血小板减少症治疗剂，它改善了体内的药代动力学。

28.一种人TPO的制备方法，它包括在来源于TPO产生脏器的人细胞株中表达外源性人TPO基因。

29.一种人TPO的制备方法，它包括在来源于人肝脏的细胞中表达外源性人TPO基因。

30.一种人TPO的制备方法，它包括在人骨髓基质瘤细胞中表达外源性人TPO基因。

31.一种人TPO的制备方法，它包括在JHHT(FERM BP-6049)中表达外源性人TPO基因。

32.通过权利要求28-31任一权项中的方法而得到的人TPO。

33.至少含有α2，6结合型唾液酸化糖结构的人TPO。

34.权利要求33的人TPO，其特征在于，它是外源性的人TPO基因在细胞株中的表达产物，产物被分离、纯化。

35.权利要求34的人TPO，其特征在于，上述的细胞株是导入了α2，6-唾液酸基转移酶基因的CHO细胞。

36.至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO的制备方法，它包括将α2，6-唾液酸基转移酶基团导入CHO细胞，在该细胞中表达人TPO基因。

37.至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO的制备方法，它包括在CHO细胞中表达人TPO基因，然后将α2，6-唾液酸基转移酶cDNA导入该CHO细胞中。

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