[go: up one dir, main page]

WO1999010358A2 - Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren - Google Patents

Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren Download PDF

Info

Publication number
WO1999010358A2
WO1999010358A2 PCT/EP1998/005219 EP9805219W WO9910358A2 WO 1999010358 A2 WO1999010358 A2 WO 1999010358A2 EP 9805219 W EP9805219 W EP 9805219W WO 9910358 A2 WO9910358 A2 WO 9910358A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotides
linkable
nucleic acid
polymerase
primary strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1998/005219
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1999010358A3 (de
Inventor
Peter Hegemann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP98947434A priority Critical patent/EP1005574A2/de
Priority to US09/486,241 priority patent/US6472184B1/en
Priority to DE29823795U priority patent/DE29823795U1/de
Publication of WO1999010358A2 publication Critical patent/WO1999010358A2/de
Publication of WO1999010358A3 publication Critical patent/WO1999010358A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae

Definitions

  • the invention relates to a method for producing nuclear acid polymers
  • Another method for producing long nucleic acid polymers is the so-called fill-in method, in which two single-stranded nucleic acid chains are hybridized with one another, overhanging ends being filled in with the aid of DNA polymerases, so that the double-stranded product is longer than the oligonucleotides used, but also the Fill-m method cannot produce a product that is longer than the sum of the two nuclear acid chains used
  • Khorana developed a process named after him, in which several chemically synthesized oligonucleotides with an average length of 15 nucleotides, which overlap in a suitable arrangement without gaps, were enzymatically linked to a double strand by polynucleotide ligase (Khorana, HG et al, J Mol Biol 27, 209 -17, 1972, and subsequent publications, Khorana, HG et al, J Biol Chem 251, 3 (10), 565-70, 1976 and subsequent publications) by sequentially ligating a few (4-8) oligonucleotides into longer intermediates, purifying the intermediates and subsequent ligation of the intermediates with one another, double-stranded nuclear acid chains with a length of 514 base pairs (Edge, MD et al, Nature 292, 756-62, 1981), were synthesized later up to approximately 1000 bp, which could then be cloned into bacterial expression vectors
  • Khorana The methods described by Khorana are usually radiolabelled in order to identify the band of the desired product in the gel highly radioactive 32 P marker represents a potential hazard that could not be avoided with this method
  • the present invention has for its object to provide an uncomplicated, reliable and inexpensive method for the synthesis of nucleic acid polymers with a length of more than 1000 bases in one step, in which the disadvantages listed above can be overcome
  • linkable oligonucleotides which, when arranged continuously and after linking, can form a primary strand
  • one or more non-linkable oligonucleotides each of the non-linkable oligonucleotides comprising two mutually bordering regions, the first of which is the 3 'end of a linkable Oligonucleotide is complementary and the second of which is complementary to the 5 'end of a further linkable oligonucleotide
  • FIGS. 1 and 2 The method according to the invention is shown schematically in FIGS. 1 and 2.
  • Khorana process it offers the decisive advantage that the synthesis of a single-stranded nucleic acid polymer can be carried out in a single reaction batch. All the linkable and non-linkable oligonucleotides required for the synthesis of the primary strand are used simultaneously; by adding a linking agent, a paris strand of covalently linked oligonucleotides is formed which can reach a length of more than 1000, for example 1500 bases.
  • steps (b) and (c) are repeated several times, the oligonucleotides previously hybridized with one another being separated from each other before each repetition of these two steps, i.e.
  • the double strand previously formed by the hybridization is denatured.
  • the denaturation can be carried out by increasing the temperature or increasing the pH value can be carried out in a manner known to the person skilled in the art.
  • the multiple denaturing and renaturing with subsequent linking leads to a considerable improvement in the yield of P ⁇ marstrang, which is otherwise impaired, for example, by chain breaks which are a consequence of the incorporation of incompletely phosphorylated P ⁇ marstrangoligonucleotide
  • the effect of such chain terminations on the overall yield is minimized by repeating steps (b) and (c)
  • steps (b) and (c) are carried out not only once, but several times. In a preferred embodiment, they are repeated 1 to 8 times, particularly preferably 3 to 5 times
  • the number of oligonucleotides used can vary between 2 linkable oligonucleotides and 150 linkable oligonucleotides.
  • the number of non-linkable oligonucleotides is in each case equal to the number of linkable oligonucleotides, one higher or one lower, at least one, preferably between 5 and 100, particularly preferred 10 and 50 linkable oligonucleotides used
  • the linking of the linkable oligonucleotides of the Pmarmar strand can comprise different reactions.
  • Linking here is understood to mean, for example, a reaction of an enzymatic, chemical or also photochemical nature.
  • T4-DNA ligases are used as linking agents
  • a thermostable ligase for example Pfu ligase (Stratagene)
  • Pfu ligase (Stratagene)
  • thermostable ligase for example Pfu ligase (Stratagene)
  • T4 DNA ligase thermolabile DNA ligases
  • the use of this thermostable ligase allows the steps of hybridizing and ligating the oligonucleotides to be carried out at high temperatures of 45 ° to 80 ° C., preferably 70 ° C.
  • oligonucleotides to be linked must be labeled on the terminal nucleotides with photosensitive molecules which contain carbon-carbon double bonds and which can be subjected to (2 + 2) photocyclodimensation, such as, for example Stilbene, allen, mono-, di- and triendicarboxylic acid derivatives or styrene derivatives
  • the non-linkable oligonucleotides only serve as a template for the formation of the nucleic acid polymer.
  • these oligonucleotides are not phosphorylated at their 5 'end. This means that these oligonucleotides are enzymatically linked, which are only responsible for the attachment of the linkable oligonucleotides in the desired arrangement , not possible
  • non-linkable oligonucleotides in which, for example, the 3 'end is a dideoxynucleotide or a thionucleond. Corresponding modifications are also possible at the 5' end.
  • the method can also be used with non-linkable oligonucleotides which are phosphorylated at the 3 'end This modification likewise prevents the enzymatic linkage of the oligonucleotides.
  • non-linkable oligonucleotides must be designed such that they cannot form a covalent bond to the respectively adjacent non-linkable oligonucleotide under the conditions chosen for linking the oligonucleotides forming the primary strand
  • the oligonucleotides used in the method according to the invention can have a length of 30 to 1500 nucleotides.
  • the length of the nucleotide selected in each case is dependent on several factors, including the probability of the formation of secondary structures and the purity of the selected starting materials. However, it is preferred that the oligonucleotides have a length of 30 to 200, particularly preferably 30 to 100 or 30 to 60 nucleotides
  • the single-stranded nucleic acid polymers already generated in the synthesis can in turn be combined with the method according to the invention into single-stranded nucleic acid polymers of several kilobases in length (FIG. 3).
  • the method is carried out as explained above, with linkable oligonucleotides for the P ⁇ marstrang nucleic acid polymers of, for example, 1500 bases can be used
  • the non-linkable oligonucleotides which are intended to ensure the correct arrangement of the oligonucleotides of the P ⁇ mar strand next to one another, are possibly only 30 to 50 nucleotides long.This order of magnitude allows hybridization with two oligonucleotides of the P ⁇ mar strand to be arranged adjacent to one another
  • the use of non-linkable oligonucleotides with up to 300 nucleotides or more is also possible and, where, for example, otherwise strong secondary structures have been formed in the primary strand, can be very useful
  • Each of the non-linkable oligonucleotides contains two adjoining regions, which have complementate with the 3 'or 5' end of two adjacent oligonucleotides for the primary strand.
  • the regions of complementary between the linkable oligonucleotides for the primary strand and the non-linkable oligonucleotide nucleotides of the opposite strand are each about 15 to 30 base pairs long, preferred
  • a preferred embodiment of the method then consists in an upstream reaction of attaching the terminal oligonucleotides for the P ⁇ mar strand and / or oligonucleotides complementary to the terminal oligonucleotides of the P ⁇ mar strand to the ends of a linearized vector, to link them to the vector and subsequently to carry out the method according to claim 1
  • the vector ends are preferably cohesive.
  • This method leads to a circulated product which can be transfected directly into a suitable host organism, for example bacteria, sucker or insect cells.
  • "transfection” includes various techniques, how to understand eg electroporation microinjection infection transfection supported by eg "Ca-P0 4 ", DEAE, hydrophobic molecules etc.
  • either the 5'-end oligonucleotide of the pmarmar strand at its 5'-end or the 3'-end oligonucleotide of the pmarmar strand at its 3'-end is provided with a hapten or both terminal oligonucleotides with different haptens. This is made possible the fixation of the oligonucleotide coupled to the hapten before or after its linkage with other oligonucleotides of the primary strand to a fixed support. This separates the hapten-coupled strand from all precursors and by-products without hapten z.
  • the chosen hapten-carrier combination must be stable under the intended conditions.
  • a preferred hapten is eg biotin, which is bound by streptavidm coupled to a carrier.
  • the oligonucleotides can be coupled with antigens which are recognized and bound by antibodies fixed to a carrier. The further synthesis of the primary strand or one of the further steps described below can then be carried out on this carrier.
  • the second hapten could be useful, for example, for detection methods to be carried out later with the nucleic acid polymer
  • a polymerase enzyme is added to the reaction mixture of a synthesis reaction carried out in accordance with the present process in order to convert the primary strand, which is a single nucleic acid strand, into a to form a klemsaure double strand or to specifically amplify the complementary strand (ie the opposite strand to the primary strand) (asymmetric PCR)
  • a specific primer is an oligonucleotide (backwinder) which is complementary to the 3 'end of the complete primary strand
  • the reaction mixture of a synthesis reaction carried out according to the present method a polymerase enzyme and additionally terminal forward and backward separators are added in large excess to the synthesis product used.
  • a polymerase enzyme and additionally terminal forward and backward separators are added in large excess to the synthesis product used.
  • the principle of the polymerase chain reaction (Saiki et al, Science 239, 487 -491, 1988) from the single-stranded nucleic acid polymers, double-stranded nucleic acid polymers
  • the polymerase enzyme is selected from the group of DNA polymerases, eg BE coli polymerase I, Klenow polymerase, T4 DNA polymerase and reverse transceptase.
  • the nucleic acid double strands formed in this way can be either DNA-DNA double strands or DNA-RNA double strands be (Kleppe et al, Proc NatI Acad
  • the added polymerase is a temperature-stable polymerase, for example Taq polymerase.
  • the temperature-stable enzyme loses only a little of its activity even after several temperature cycles and can therefore catalyze the polymerase reactions of several successive cycles
  • the polymerase reaction is preferably carried out repeatedly several times in order to amplify the nucleic acid double strand exponentially.
  • each cycle comprises denaturing already existing nuclear acid double strands by conventional measures, for example by increasing the temperature or the pH. the attachment of terminal polymers under suitable conditions and a polymerase-catalyzed nucleic acid synthesis.
  • a temperature-stable polymerase the addition of further polymerase is unnecessary, but where one of the non-temperature-stable polymerases has been used for the polymerization reaction, this is inactivated by the thermal denaturation, in this case, fresh polymerase enzyme must be added in each cycle.
  • the polymerase reaction is usually carried out 5 to 15 times, preferably about 8 to 12 times. The main advantage the repetition of the polymerase reaction is then that due to the position of the primers (final) targeted complete synthesis product can be exponentially amplified
  • the denaturation of the double strands is usually carried out at temperatures of more than 90 ° C.
  • the reaction mixture is then slowly cooled so that the final primers, depending on their composition, can hybridize with the single strands at temperatures between 80 ° C. and 45 ° C.
  • Polymerase-catalyzed DNA synthesis can be carried out using a temperature-stable enzyme in the range from 45 to 70 ° C, which minimizes the formation of u ⁇ specific hybrids
  • the present invention furthermore relates to a single-stranded nucleic acid polymer which has been obtained by the process according to the invention.
  • a single-stranded nucleic acid polymer which has been obtained by the process according to the invention.
  • primary strands must be designed so that they are complementary to one another at their 3 'end in a range of a few base pairs, for example 20 to 60, preferably 30 to 40 base pairs, so that in a subsequent in vitro or in vivo polymerase reaction, the 3 'end of each primary strand can serve as a polymer for a mattress-dependent polymerase
  • Figure 1 describes a preferred embodiment of the method according to the invention
  • Figure 2 shows a detailed view of the overlap area between two adjacent linkable oligonucleotides and a non-linkable oligonucleotide, which comprises two adjacent regions, one of which is complementary to the 3 'end of a first linkable oligonucleotide and the second of which the 5' end of a second linkable oligonucleotide is complementary
  • the overlap area between a region of the non-linkable oligonucleotide with the complementary region of one of the linkable oligonucleotides should be at least 15 bp
  • Figure 3 illustrates the implementation of the method with very long linkable oligonucleotides, which are correctly arranged next to one another by hybridization with much shorter non-linkable oligonucleotides.For this purpose, it is sufficient if the non-linkable oligonucleotides ensure stable hybridization with the two linkable oligonucleotides to be arranged adjacent without having to be complementary to the entire later primary strand
  • Figure 4 shows the principle of the Fill-m method using the example of two long oligonucleotides that are only complementary in their 3 'region. By hybridizing the complementary 3' regions, the 3 'end of each of the oligonucleotides serves as a polymer for a polymerase reaction along the template of the each other oligonucleotides
  • Figure 5 a) Oligonucleotides for the synthesis of the primary strand of the algal-adapted GFP mutant S65T / F64L (FG1 to FG15) b) Oligonucleotides of the opposite strand (not connectable) (FG14rev to FGIrev) c) Ohgon nucleotide FG15rev, polymer for the synthesis of the polymerase-catalyzed catalyst Figure 6 Modified gene (S65T / F64L) for the Green Fluorescent Protein (GFP) from Aquorea victorea.
  • S65T / F64L Green Fluorescent Protein
  • the gene was modified compared to the natural GFP gene in such a way that it only contains codons preferred by green algae, for example Chlamvdomonas
  • the underlined nucleotides were only filled in by the polymerase reaction (matrix FG15rev)
  • the following shows the synthesis of a modified gene for green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea victorea.
  • the codon usage is modified in the synthetic gene in such a way that the codons of green algae such as Chlamvdomonas are preferred.
  • 30 oligonucleotides with a length of 45 to 50 bases used
  • the oligonucleotides of the primary strand are designated as FG1 to FG15 and are 45 to 47 bases long.
  • the non-linkable oligonucleotides of the complementary strand are designated as FG rev to FGI rev and are 46 bases (FG14rev to FGI rev) long
  • Sequences of the oligonucleotides are shown in Fig. 5a, b
  • the reaction was carried out in a programmable thermal cycler.
  • the oligonucleotides which form the linkable strand were phosphorylated at the 5 'end before the synthesis reaction
  • Step 1 oligonucleotide phosphorylation at the 5 'end (100 ⁇ l mixture)
  • T4 polynucleotide kmase 10 units Biolabs
  • the reaction is carried out at 37 ° C. for 4 h and then terminated by incubation at 95 ° C. for 5 minutes.
  • Step 2 carrier-free nucleotide polymer synthesis (primary strand)
  • the reaction was carried out in a programmable thermal cycler. Recombinant Pfu DNA ligase from Stratagene was used. The buffer conditions were changed to the ligase conditions with KCI, NP-40, MgCI 2 , whereby the ions were taken into account in the kinase batch.
  • the reaction mixture is incubated for 3 minutes at 95 ° C. and for 3 minutes at 80 ° C. During the incubation at 80 ° C., 3 ⁇ l of Pfu DNA ligase (12 units of thermostable ligase from Stratagene) are added and the following temperature cycle is then carried out 3 times:
  • Variant 1 The product is precipitated to separate the Pfu ligase, if necessary amplified and cloned using PCR and Taq polymerase.
  • Variant 2 In order to facilitate the separation, the primer FG1 is used biotinylated. After completion of the synthesis, the reaction mixture is adjusted to pH 13 with NaOH Streptavidin magnetic balls (Dynal) are added and the synthesis product is held in place with a magnet on the wall of the reaction vessel, while all the backwashers, unused forward packers and ligase are removed with the supernatant. The clean synthesis product, now coupled to streptavidm, is placed in 30 ⁇ l of neutral buffer recorded and can, for example, be amplified as in step 3 (see below)
  • Variant 1 1 ⁇ l of the synthesis product are amplified in 1 cycle with 1 U of thermostable Pfu polymerase (Stratagene) in 12 cycles in a standard buffer (It manufacturer) in a 50 ⁇ l batch.
  • the oligonucleotide FG1 serves as the forward spanner, the oligonucleotide FG15rev (50 bases, Fig. 5c) final concentration 25 pmol per 50 ⁇ l.
  • Variant 2 For amplification by means of PCR, two terminal polymers are added which have a total length of 30 or 33 bases, of which only 21 or 24 bp hybridize with the synthesis product. The "overhangs" each contain an interface of the "multiple cloning region" of the vector pBenesc ⁇ pt II KS ' (Stratagene) The amplified product is cut with the enzymes Xhol and Knpl, purified using Quiaex II (Quiagen) and cloned by default

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die herkömmliche Synthese von Nukleinsäurepolymeren aus mehreren Oligonukleotiden umfaßt mehrere Zyklen der Zwischenproduktsynthese, Reinigung der Zwischenprodukte und Synthese eines Vollängenproduktes (bis zu einer Maximallänge von ca. 1000 Nukleotiden). Das neue Verfahren soll in einem Reaktionsschritt durchgeführt werden und zu Nukleinsäurepolymeren von mehr als 1000 Nukleotiden führen. Erfindungsgemäß werden zwei oder mehr verknüpfbare Oligonukleotide bereitgestellt, die bei kontinuierlicher Anordnung und nach Verknüpfen einen Primärstrang bilden können, und ein oder mehr nicht verknüpfbare Oligonukleotide, wobei jedes der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren erster dem 3'-Ende eines verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist und deren zweiter am 5'-Ende eines weiteren verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist. Die verknüpfbaren Oligonukleotide werden mit den komplementären Bereichen der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide hybridisiert und anschließend enzymatisch, chemisch oder photochemisch verknüpft. Das Verfahren eignet sich zur de novo-Synthese langer Nukleinsäureketten.

Description

Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurepolymeren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Nuklemsaurenpolymeren
Der zunehmende Einsatz rekombinanter Gene in der Gen- und Biotechnologie sowie der medizinischen Analytik hat einen großen Bedarf an Verfahren zur "de novo"-Synthese von langen Nuklemsaureketten ausgelost Die synthetische Herstellung beliebig gewählter Nukieinsauresequenzen kann in vielen Fallen eine zeitsparende Alternative für aufwendige Klonierungs- und Modifizierungsverfahren sein Eine routinemäßige Synthese langer Nuklemsaureketten kann ebenfalls entscheidende Vorteile beim "drug-design" bieten, z B bei der Herstellung von "maßgeschneiderten" Antikörpern, Inhibitor/Aktiva- tormolekulen, Ribozymen oder in der DNA-Chip-Technologie Desweiteren konnten auf diese Weise gezielt modifizierte Nukleotide, z B markiert durch (Fluoreszenz)Farbstoffe oder Enzyme, in eine Nukleinsaurekette eingebaut werden Neben den hier aufgeführten Beispielen ergeben sich noch eine Vielzahl weiterer Anwendungsmoglichkeiten für gezielt hergestellte Nukleinsaurepolymere
Bei der einfachsten Variante der herkömmlichen Gensynthese, der direkten Klonierung, werden zwei lange, einander vollständig komplementäre Oligonukleotide miteinander hybridisiert Auf Grund der derzeitigen technischen Limitierung bei der Herstellung der Oligonukleotide auf eine Lange von 150 - 200 Basen ist auch die Große der resultierenden Hybπdisierungsprodukte auf diesen Langenbereich beschrankt
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen langer Nukleinsaurepolymere ist die sogenannte Fill-in-Methode, bei der zwei einzelstrangige Nuklemsaureketten miteinander hybridisiert werden, wobei überhangende Enden mit Hilfe von DNA-Polymerasen aufgefüllt werden, so daß das doppelstrangige Produkt langer als die eingesetzten Oligonukleotide ist Aber auch mit der Fill-m-Methode kann kein Produkt erzeugt werden, das langer als die Summe der beiden eingesetzten Nuklemsaureketten ist
Bei der "Shot Gun-Gensynthese" werden komplementäre, einzelstrangige Oligonukleotide zusammen mit einem durch Restriktionsenzyme geöffneten Expressionsvektor direkt in Zellen traπsfiziert, wobei ein zirkularisiertes Produkt nur entstehen kann wenn alle Teilsequenzen durch die Enzymmaschineπe des Wirtsorganismus in geeigneter Weise ligiert werden Die Effizienz der erfolgreichen Ligationen bei dieser Methode ist i a sehr gering, insbesondere wenn viele Oligonukleotide für die Gensynthese eingesetzt werden
1972 entwickelte Khorana ein nach ihm benanntes Verfahren, bei dem mehrere chemisch synthetisierte Oligonukleotide von durchschnittlich 15 Nukleotiden Lange, die sich in geeigneter Anordnung lückenlos überlappen, enzymatisch durch Polynukleotidligase zu einem Doppelstrang verbunden wurden (Khorana, H G et al , J Mol Biol 27, 209-17, 1972, und Folgeveroffentlichungen, Khorana, H G et al , J Biol Chem 251, 3 (10), 565- 70, 1976 und Folgeveroffentlichungen) Durch sequenzielles Ligieren von wenigen (4 - 8) Oligonukleotiden zu längeren Zwischenprodukten, Aufreinigen der Zwischenprodukte und anschließendes Ligieren der Zwischenprodukte miteinander wurden doppelstrangige Nuklemsaureketten mit einer Lange von 514 Basenpaaren (Edge, M D et al , Nature 292, 756-62, 1981 ), spater bis ca 1000 bp synthetisiert, die anschließend in bakterielle Expressionsvektoren kloniert werden konnten
Mit diesen Verfahren sind mehrere entscheidende Nachteile verbunden
1 ) Nach jedem Ligationsschπtt mußten die Produkte bzw Zwischenprodukte durch
Auftrennung auf einem Polyacrylamid-Gel (PAA-Gel) von unerwünschten Nebenprodukten der Ligationsreaktion gereinigt werden Dieser zeitintensive Arbeitsschritt ist mit einem hohen personellen und finanziellen Aufwand verbunden
2 ) Bei der Elution der Zwischen- und Endprodukt aus dem PAA-Gel mußten beträchtliche Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden
3 ) Das bisher längste Produkt, das mit Hilfe dieser Technik hergestellt werden konnte, hatte eine Lange von ca 1000 Basenpaaren Da die meisten eu- und prokaryotischen Gene eine kodierende Sequenz von durchschnittlich 300 - 3000 Baseπpaaren haben, ist diese Lange für die meisten Anwendungen ungenügend
4 ) Für die benotigte Aufreinigung über PAA-Gele wurden die Nukleotide bei dem von
Khorana beschriebenen Verfahren üblicherweise radioaktiv markiert, um die Bande des gewünschten Produktes im Gel identifizieren zu können Die Verwendung hoch radioaktiver 32P-Marker stellt ein Gefahrdungspotential dar, das bei diesem Verfahren nicht vermieden werden konnte
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein unkompliziertes, zuverlässiges und preiswertes Verfahren für die Synthese von Nukleinsäurepolymeren mit einer Lange von mehr als 1000 Basen in einem Schritt bereitzustellen, bei dem die oben aufgeführten Nachteile überwunden werden können
Diese Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsaurepoly- mers, umfassend
a) das Bereitstellen von 2 oder mehr verknupfbaren Oligonukleotiden die bei kontinuierlicher Anordnung und nach Verknüpfen einen Pπmarstrang bilden können, und einem oder mehreren nicht verknupfbaren Oligonukleotiden, wobei jedes der nicht verknupfbaren Oliognukleotide zwei anemandergrenzende Bereiche umfaßt, deren erster dem 3'-Ende eines verknupfbaren Oligonukleotids komplementär ist und deren zweiter dem 5'-Ende eines weiteren verknupfbaren Oligonukleotids komplementär ist
b) das Hybridisieren von Oligonukleotiden für den Pπmarstrang mit den komplementären Bereichen der nicht verknupfbaren Oligonukleotide und
c) das Verknüpfen der Oligonukleotide des Pπmarstranges
Das erfindungsgemaße Verfahren ist in den Abb 1 und 2 schematisch dargestellt. Es bietet im Unterschied zum Khorana-Verfahren den entscheidenden Vorteil, daß die Synthese eines einzelstrangigen Nuklemsaurepolymers in einem einzigen Reaktionsansatz durchgeführt werden kann Dabei werden alle zur Synthese des Pπmarstrangs benotigten verknupfbaren und nicht verknupfbaren Oligonukleotide gleichzeitig eingesetzt; durch Zugeben eines Verknupfungsmittels entsteht ein Pπmarstrang kovalent verknüpfter Oligonukleotide, der eine Lange von mehr als 1000, z B 1500 Basen erreichen kann In bevorzugten Ausfuhrungsformen werden die Schritte (b) und (c) mehrfach wiederholt, wobei vor jeder Wiederholung dieser beiden Schritte die zuvor miteinander hybridisierten Oligonukleotide voneinander getrennt werden, d h der durch die Hybridisierung zuvor gebildete Doppelstrang denaturiert wird Die Denaturierung kann durch Temperaturerhöhung oder Erhöhung des pH-Wertes auf dem Fachmann bekannte Weise durchgeführt werden Das mehrfache Denaturieren und Renaturieren mit anschließendem Verknüpfen fuhrt zu einer erheblichen Verbesserung der Ausbeute an Pπmarstrang, die sonst z B durch Kettenabbruche, die eine Folge des Einbaus unvollständig phosphory- lierter Pπmarstrangoligonukleotide sind, beeinträchtigt wird Der Einfluß solcher Kettenabbruche auf die Gesamtausbeute wird durch die Wiederholung der Schritte (b) und (c) minimiert
Die Schritte (b) und (c) werden erfindungsgemaß nicht nur 1 Mal , sondern mehrfach durchgeführt In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden sie 1 bis 8 Mal besonders bevorzugt 3 bis 5 Mal wiederholt
Die Anzahl der eingesetzten Oligonukleotide kann zwischen 2 verknupfbaren Oligonukleotiden und 150 verknupfbaren Oligonukleotiden schwanken Die Anzahl der nicht verknupfbaren Oligonukleotide ist jeweils gleich der Anzahl der verknupfbaren Oligonukleotide, um eines hoher oder um eines niedriger, mindestens also eins Bevorzugt werden zwischen 5 und 100, besonders bevorzugt 10 und 50 verknupfbare Oligonukleotide eingesetzt
Das Verknüpfen der verknupfbaren Oligonukleotide des Pπmarstranges kann verschiedene Reaktionen umfassen Unter Verknüpfen wird hier z B eine Reaktion enzymati- scher, chemischer oder auch photochemischer Natur verstanden So wird im Fall der enzymatischen Verknüpfung (Ligation) als Verknupfungsmittel z B T4-DNA-Lιgase verwendet In der bevorzugten Ausfuhrungsform wird eine thermostabile Ligase, z B Pfu- Ligase (Stratagene), eingesetzt, die den Vorteil bietet, daß bei wiederholten Zyklen des Denatuπerens durch Temperaturerhöhung , des Hybπdisierens und Ligierens der Oligonukleotide kein neues Enzym zugesetzt werden muß wahrend dies bei Verwendung thermolabiler DNA-Ligasen, wie z B T4-DNA-Lιgase, der Fall ist Desweiteren gestattet die Verwendung dieser thermostabilen Ligase, die Schritte des Hybndisierens und des Ligierens der Oligonukleotide bei hohen Temperaturen von 45° bis 80°C, bevorzugt 70°C, durchzufuhren Diese stπngenten Temperaturbedingungen bedeuten, daß der Schritt des Hybndisierens der Oligonukleotide in komplementärer Anordnung mit hoher Spezifitat erfolgt und im Vergleich zum Khorana-Verfahren erheblich weniger Nebenprodukte anfallen Ligationen mit herkömmlicher Ligase werden üblicherweise in einem Temperaturbereich von 40°C bis 4°C durchgeführt und können daher zu einem höheren Anteil unspezifischer Hybridisierungen durch Fehlpaarung oder Sekunda rstrukturen fuhren
Eine chemische Verknüpfung der Oligonukleotide, die von Goeddel und Kollegen beschrieben worden ist (Goeddel D V et al PNAS 76 1979), ist ebenfalls möglich
Eine weitere Möglichkeit, Oligonukleotide miteinander verknüpfen, bietet die photochemische Verknüpfung Dabei müssen die zu verknüpfenden Oligonukleotide an den end- standigen Nukleotiden mit photosensitiven Molekülen markiert sein die Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbmdungen enthalten und einer (2+2) Photocyclodimensation unterliegen können, wie z B Stilben-, Allen-, Mono-, Di- und Triendicarbonsauredeπvate oder Styroldeπvate
Erfindungsgemaß dienen die nicht verknupfbaren Oligonukleotide lediglich als Matrize zur Bildung des Nuklemsaurepolymers In einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind diese Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende nicht phosphoryliert Dadurch ist eine enzymatische Verknüpfung dieser Oligonukleotide, die nur für die Anlagerung der verknupfbaren Oligonukleotide in der gewünschten Anordnung verantwortlich sind, nicht möglich
Es können ebenfalls nicht verknupfbare Oligonukleotide eingesetzt werden bei denen z B das 3'-Ende ein Didesoxynukleotid oder ein Thionukleond ist Entsprechende Modifizierungen sind auch am 5'-Ende möglich Weiterhin kann das Verfahren mit nicht verknupfbaren Oligonukleotiden, die am 3'-Ende phosphoryliert sind, durchgeführt werden Diese Modifikation verhindert ebenfalls die enzymatische Verknüpfung der Oligonukleotide Sofern das erfindungsgemaße Verfahren nicht mittels enzymatischer Ligation, sondern chemischer oder photochemischer Verknüpfung durchgeführt wird, müssen die nicht verknupfbaren Oligonukleotide dementsprechend so konzipiert sein, daß sie unter den zur Verknüpfung der den Pπmarstrang bildenden Oligonukleotide gewählten Bedingungen keine kovalente Bindung zum jeweils benachbarten nicht verknupfbaren Oligo- nukleotid bilden können
Die in dem erfindungsgemaßen Verfahren eingesetzten Oligonukleotide können eine Lange von 30 bis 1500 Nukleotiden haben Die Lange des jeweils gewählten Nukleotides ist von mehreren Faktoren einschließlich der Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von Se- kundarstrukturen und der Reinheit der gewählten Ausgangsmateπalien abhangig Es ist jedoch bevorzugt, daß die Oligonukleotide des Pπmarstranges eine Lange von 30 bis 200, besonders bevorzugt von 30 bis 100 oder 30 bis 60 Nukleotiden haben
Bei der Synthese bereits erzeugte einzelstrangige Nukleinsaurepolymere können in einem weiteren Schritt wiederum mit dem erfindungsgemaßen Verfahren in einzelstrangige Nukleinsaurepolymere von mehreren Kilobasen Lange zusammengeführt werden (Abb 3) Dazu wird das Verfahren so, wie oben ausgeführt, durchgeführt, wobei als ver- knupfbare Oligonukleotide für den Pπmarstrang Nukleinsaurepolymere von beispielsweise 1500 Basen eingesetzt werden können
Die nicht verknupfbaren Oligonukleotide, die die korrekte Anordnung der Oligonukleotide des Pπmarstranges nebeneinander gewährleisten sollen, sind gegebenenfalls nur 30 bis 50 Nukleotide lang Diese Größenordnung erlaubt die Hybridisierung mit zwei benachbart anzuordnenden Oligonukleotiden des Pπmarstranges Es besteht keine Notwendigkeit, den ganzen Pπmarstrang abdeckende nicht verknupfbare Oligonukleotide zur Verfugung zu stellen Selbstverständlich ist jedoch die Verwendung von nicht verknupfbaren Oligonukleotiden mit bis zu 300 Nukleotiden oder mehr ebenfalls möglich und kann, wo z B im Pπmarstrang ansonsten starke Sekundarstrukturen ausgebildet werden wurden, durchaus sinnvoll sein
Jedes der nicht verknupfbaren Oligonukleotide enthalt zwei aneinandergrenzende Bereiche, die Komplementaπtat mit dem 3'- bzw 5'-Ende zweier benachbarter Oligonukleotide für den Pπmarstrang aufweisen Die Bereiche der Komplementaπtat zwischen den verknupfbaren Oligonukleotiden für den Pπmarstrang und den nicht verknupfbaren Oligo- nukleotiden des Gegenstranges sind jeweils ca 15 bis 30 Basenpaare lang, bevorzugt
Figure imgf000009_0001
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform des Verfahrens besteht dann, in einer vorgeschalteten Reaktion die endstandigen Oligonukleotide für den Pπmarstrang und/oder zu den end- standigen Oligonukleotiden des Pπmarstranges ganz oder teilweise komplementäre Oligonukleotide an die Enden eines lineaπsierten Vektors anzulagern, sie mit dem Vektor zu verknüpfen und nachfolgend das Verfahren gemäß Anspruch 1 durchzufuhren Die Vektorenden sind dabei bevorzugt kohasiv Dieses Verfahren fuhrt zu einem zirkulaπsierten Produkt, das direkt in einen geeigneten Wirtsorganismus, z B Bakterien, Sauger- oder Insektenzellen, transfiziert werden kann Unter "Transfektion" sind in diesem Fall verschiedene Techniken, wie z B Elektroporation Mikroinjektion Infektion Transfektion unterstutzt durch z B "Ca-P04", DEAE, hydrophobe Moleküle etc , zu verstehen
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist entweder das 5'-endstandιge Oligonukleotid des Pπmarstrangs an seinem 5'-Ende oder das 3'-endstandιge Oligonukleotid des Pn- marstrangs an seinem 3'-Ende mit einem Hapten oder beide endstandigen Oligonukleotide mit verschiedenen Haptenen versehen Dies ermöglicht die Fixierung des mit dem Hapten gekoppelten Oligonukleotids vor oder nach seiner Verknüpfung mit weiteren Oligonukleotiden des Primarstranges an einen festen Trager Damit wird eine Abtrennung des Hapten-gekoppelten Stranges von allen Vorstufen und Nebenprodukten ohne Hapten z. B unter denaturierenden Bedingungen (z B pH 13) möglich Die jeweils gewählte Hapten-Trager-Kombination muß unter den vorgesehenen Bedingungen stabil sein Ein bevorzugtes Hapten ist z B Biotin, das durch an einen Trager gekoppeltes Streptavidm gebunden wird Weiter können die Oligonukleotide mit Antigenen gekoppelt werden, die von an einen Trager fixierten Antikörpern erkannt und gebunden werden Die weitere Synthese des Primarstranges oder einer der im folgenden beschriebenen weiteren Schritte kann dann an diesem Trager durchgeführt werden Das zweite Hapten konnte beispielsweise für spater mit dem Nukleinsaurepolymer durchzuführende Detektionsver- fahren nützlich sein
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird dem Reaktionsansatz einer nach dem vorliegenden Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym zugesetzt, um aus dem Pπmarstrang, der ein Nuklemsaure-Einzelstrang ist, einen Nu- klemsaure-Doppelstrang zu bilden oder gezielt den komplementären Strang (d h den Gegenstrang zum Primarstrang) zu amplifizieren (asymmetrische PCR) Als spezifischer Primer dient ein zum 3'-Ende des vollständigen Primarstranges komplementäres Oligo - nukleotid (Ruckwartspπmer)
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden dem Reaktionsansatz einer nach dem vorliegenden Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym und zusätzlich endstandige Vorwärts- und Rύckwartspπmer im großen Überschuß zum eingesetzten Syntheseprodukt zugesetzt Auf diese Weise werden nach dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al , Science 239, 487-491 , 1988) aus den einzel- straπgigen Nukleinsäurepolymeren doppelstrangige Nukleinsaurepolymere gebildet
Das Polymeraseenzym wird dabei aus der Gruppe der DNA-Polymerasen, z B E coli Polymerase I, Klenow-Polymerase, T4 DNA-Polymerase und Reverse Transkπptase, ausgewählt Die dabei gebildeten Nuklemsaure-Doppelstrange können entweder DNA- DNA-Doppelstrange oder DNA-RNA-Doppelstrange sein (Kleppe et al , Proc NatI Acad
Figure imgf000010_0001
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist die zugesetzte Polymerase eine temperaturstabile Polymerase, z B Taq-Polymerase Das temperaturstabile Enzym verliert auch nach mehreren Temperaturzyklen nur wenig von seiner Aktivität und kann deshalb die Polymerasereaktionen mehrerer aufeinander folgender Zyklen katalysieren
Die Polymerasereaktion wird bevorzugt mehrfach wiederholt durchgeführt, um den Nu- kleinsaure-Doppelstrang exponentiell zu amplifizieren Nach dem Prinzip der Polyme- rasekettenreaktion umfaßt dabei jeder Zyklus eine Denaturierung bereits bestehender Nuklemsaure-Doppelstrange durch übliche Maßnahmen, z B durch Erhohen der Temperatur oder des pH, das Anlagern endstandiger Pπmer unter geeigneten Bedingungen und eine Polymerase-katalysierte Nukle sauresynthese Im Fall einer temperaturstabi- len Polymerase erübrigt sich die Zugabe weiterer Polymerase, wo jedoch eine der nicht temperaturstabilen Polymerasen für die Polymerisationsreaktion verwendet worden ist, wird diese durch die thermische Denaturierung inaktiviert, in diesem Fall muß in jedem Zyklus frisches Polymeraseenzym zugefugt werden Üblicherweise wird die Polymerasereaktion 5 bis 15 Mal durchgeführt, bevorzugt etwa 8 bis 12 Mal Der wesentliche Vorteil der Wiederholung der Polymerasereaktion liegt dann, daß aufgrund der Position der Primer (endstandig) gezielt vollständiges Syntheseprodukt exponentiell ampiifiziert werden kann
Die Denaturierung der Doppelstrange wird üblicherweise bei Temperaturen von mehr als 90°C durchgeführt Der Reaktionsansatz wird sodann langsam abgekühlt, so daß die endstandigen Primer in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung bei Temperaturen zwischen 80°C und 45°C mit den dann vorliegenden Einzelstrangen hybridisieren können Die Polymerase-katalysierte DNA-Synthese kann bei Verwendung eines tempera- turstabilen Enzymes im Bereich von 45 bis 70°C durchgeführt werden, wodurch die Bildung uπspezifischer Hybride minimiert wird
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein einzelstrangiges Nukle saurepo- lymer, das mit dem erfindungsgemaßen Verfahren erhalten worden ist Durch geschickte Kopplung des erfindungsgemaßen Verfahrens, mit dem zunächst einzelstrangige Pn- marstrange hergestellt werden, mit der Fill-m-Methode lassen sich ohne weiteres doppelstrangige Nukleinsaurepolymere von mehreren 1000 Basen erzeugen (Abb 4) Dazu müssen z B Primarstrange so konzipiert sein, daß sie an ihrem 3'-Ende in einem Bereich von wenigen Basenpaaren, z B 20 bis 60, bevorzugt 30 bis 40 Basenpaaren, einander komplementär sind, so daß bei einer nachfolgend in vitro oder in vivo ablaufenden Polymerasereaktion das 3'-Ende jedes Primarstranges als Pπmer fur eine matπzenab- hangige Polymerase dienen kann
Die folgenden Abbildungen und das Beispiel erläutern die Erfindung
Abbildung 1 beschreibt eine bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens
Es werden zunächst phosphorylierte Oligonukleotide für den Primarstrang und nicht ver- knupfbare Oligonukleotide für den Gegenstrang, die zu den Oligonukleotiden des Pπ- marstrangs komplementär sind und mit jeweils zwei der phosphorylierten Oligonukleotide überlappen, bereitgestellt (a) Anschließendes Ligieren fuhrt zu einem emzelstrangigen Nuklemsaurepolymer (b), dem Pπmarstrang
Abbildung 2 zeigt eine Detailaufnahme des Uberlappungsbereiches zwischen zwei benachbarten verknupfbaren Oligonukleotiden und einem nicht verknupfbaren Oligonukleotid, das zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren einer dem 3'-Ende eines ersten verknupfbaren Oligonukleotides komplementär ist, und deren zweiter dem 5'- Ende eines zweiten verknupfbaren Oligonukleotides komplementär ist Der Uberlap- pungsbereich zwischen einem Bereich des nicht verknupfbaren Oligonukleotids mit dem komplementären Bereich eines der verknupfbaren Oligonukleotide sollte mindestens 15 bp betragen
Abbildung 3 veranschaulicht die Durchfuhrung des Verfahrens mit sehr langen verknupfbaren Oligonukleotiden, die jeweils durch Hybndisierung mit weitaus kürzeren nicht verknupfbaren Oligonukleotiden korrekt nebeneinander angeordnet werden Für diesen Zweck ist es ausreichend, wenn die nicht verknupfbaren Oligonukleotide eine stabile Hybndisierung mit den beiden benachbart anzuordnenden verknupfbaren Oligonukleotiden gewährleisten, ohne daß eine Komplementaπtat zum gesamten spateren Primarstrang gegeben sein muß
Abbildung 4 zeigt das Prinzip der Fill-m-Methode am Beispiel zweier nur in ihrem 3'- Bereich komplementärer langer Oligonukleotide Durch Hybndisierung der komplementären 3'-Bereιche dient das 3'-Ende jedes der Oligonukleotide als Pπmer fur eine Polymerasereaktion entlang der Matrize des jeweils anderen Oligonukleotides
Abbildung 5 a) Oligonukleotide zur Synthese des Primarstranges der algenadaptierten GFP-Mutante S65T/F64L (FG1 bis FG15) b) Oligonukleotide des Gegenstranges (nicht verknupfbar) (FG14rev bis FGIrev) c) Ohgonnukleotid FG15rev, Pπmer fur die Polymerase-katalysierte Synthese des Gegenstranges Abbildung 6 Modifiziertes Gen (S65T/F64L) für das Grüne Fluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein - GFP) aus Aquorea victorea Das Gen wurde gegenüber dem natürlichen GFP-Gen so modifiziert, daß es nur Kodons enthalt, die von Grünalgen, beispielsweise Chlamvdomonas, bevorzugt werden Die unterstrichenen Nukleotide wurden erst durch die Polymerasereaktion aufgefüllt (Matrize FG15rev)
Beispiel Synthese eines alqenadaptierten Genes, das für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea kodiert
Im folgenden wird die Synthese eines modifizierten Genes für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea gezeigt Der Kodongebrauch wird im synthetiscnen Gen dahingehend modifiziert daß die Kodons von Grünalgen wie beispielsweise Chlamvdomonas, bevorzugt werden Für die Synthese wurden 30 Oligonukleotide mit einer Lange von 45 bis 50 Basen eingesetzt Die Oligonukleotide des Primarstranges werden dabei als FG1 bis FG15 bezeichnet und sind 45 bis 47 Basen lang Die nicht verknupfbaren Oligonukleotide des komplementären Stranges werden als FG rev bis FGI rev bezeichnet und sind 46 Basen (FG14rev bis FGI rev) lang Die Sequenzen der Oligonukleotide sind in Abb 5a, b gezeigt
Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt Die Oligonukleotide die den verknupfbaren Strang bilden, wurden vor der Synthesereaktion am 5'-Ende phosphoryliert
Schritt 1 Oliqonukleotid-Phosphoryiierunq am 5'-Ende (100 μl-Ansatz)
10 μl Oligonukleotide FG1 bis FG15 (500 pMol total, gleiche molare Konzentration jedes Oligonukleotides)
10 μl Kmasepuffer (10-fach konzentriert, Biolabs)
10 μl ATP 2 mM
69 μl H20
1 μl T4 Polynukleotidkmase (10 Einheiten Biolabs) Die Reaktion wird für 4 h bei 37°C durchgeführt und anschließend durch 5-minütige Inkubation bei 95°C beendet.
Schritt 2: Trägerfreie Nukleotidpolymersynthese (Primärstrang)
Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt. Es wurde rekombinante Pfu-DNA-Ligase der Firma Stratagene verwendet. Die Pufferbedingungen wurden mit KCI, NP-40, MgCI2 auf die Ligasebedingungen umgestellt, wobei die Ionen im Kinaseansatz berücksichtigt wurden.
10 μl 5'-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) aus Schritt 1 (FG1-FG15)
1 μl nicht-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) (FGI rev - FG14rev)
6 μi KCI (100 mM)
3 μl NP-40 (0,5%)
4 μl MgCI2 (50 mM) 3 μl ATP (10 mM)
Der Reaktionsansatz wird 3 Min. bei 95°C und 3 Min. bei 80°C inkubiert. Während der Inkubation bei 80°C werden 3 μl Pfu-DNA-Ligase (12 Einheiten thermostabile Ligase der Firma Stratagene) zugesetzt und anschließend 3mal der folgende Temperaturzyklus durchgeführt:
a) 1 Min. 95°C b) in 1 Min. von 95°C auf 70°C abkühlen c) über den Zeitraum von 1 Std. linear von 70°C auf 55°C abkühlen d) 2 Std. bei 55°C inkubieren
Variante 1: Das Produkt wird zur Abtrennung der Pfu-Ligase ausgefällt, gegebenenfalls über PCR und Taq-Polymerase amplifiziert und kloniert.
Variante 2: Um die Abtrennung zu erleichtern, wird der Primer FG1 biotinyliert eingesetzt. Nach Beendigung der Synthese wird der Reaktionsansatz mit NaOH auf pH13 gebracht Es werden Streptavidin-Magnetkugeln (Dynal) zugesetzt und das Syntheseprodukt mit einem Magneten an der Wand des Reaktionsgefaßes festgehalten, wahrend alle Ruckwartspπmer, unverbrauchte Vorwartspπmer sowie Ligase mit dem Überstand abgenommen werden Das saubere, nun an Streptavidm gekoppelte Syntheseprodukt wird in 30 μl neutralem Puffer aufgenommen und kann z B wie im Schritt 3 (s unten) amplifiziert werden
Schntt 3 Amplifizierung des Syntheseproduktes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)
Variante 1 1 μl des Syntheseproduktes werden mit 1 E thermostabiler Pfu-Polymerase (Stratagene) in 12 Zyklen im Standardpuffer (It Hersteller) in einem 50 μl-Ansatz amplifiziert Als Vorwartspπmer dient das Oligonukleotid FG1 , als Ruckwartspπmer dient das Oligonukleotid FG15rev (50 Basen, Abb 5c) Endkonzentration 25 pMol pro 50 μl.
Variante 2: Zur Amplifizierung mittels PCR werden zwei endstandige Pπmer zugegeben, die zwar eine Gesamtlange von 30 bzw 33 Basen aufweisen, wovon aber nur 21 bzw 24 bp mit dem Syntheseprodukt hybridisieren Die "Überhange" enthalten jeweils eine Schnittstelle der "Multiplen Klonierungsregion" des Vektors pBenescπpt II KS' (Stratagene) Das amplifizierte Produkt wird mit den Enzymen Xhol und Knpl geschnitten, über Quiaex II (Quiagen) gereinigt und standardmäßig kloniert
Vorwartspπmer mit Xhol-Schnittstelle
5' CCG CTC GAG ATG GCC AAG GGC GAG GAG CTG
Rückwartspπmer mit Kpnl-Schnittstelle
5' CGC GGA TCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC

Claims

WO 99/10358 Λ A PCT/EP98/05219,14Patentansprüche
1 Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsaurepolymeres, umfassend
a) das Bereitstellen von 2 oder mehr verknupfbaren Oligonukleotiden, die bei kontinuierlicher Anordnung und nach Verknüpfen einen Primarstrang bilden können, und einem oder mehr nicht verknupfbaren Oligonukleotiden, wobei jedes der nicht verknupfbaren Oligonukleotide zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren erster dem 3'-Ende eines verknupfbaren Oligonukleotids komplementär ist und deren zweiter dem 5'-Ende eines weiteren verknupfbaren Oligonukleotids komplementär ist
b) das Hybridisieren von Oligonukleotiden für den Primarstrang mit den komplementäre Bereichen der nicht verknupfbaren Oligonukleotide und
c) das Verknüpfen der Oligonukleotide des Primarstranges
2 Verfahren nach Anspruch 1 , umfassend eine oder mehrere Wiederholungen der Schπtte (b) und (c), wobei vor jeder Wiederholung eine Denaturierung durchgeführt
3 Verfahren nach Anspruch 2 wobei die Schritte (b) und (c) 1 bis 8 Mal bevorzugt 3 bis 5 Mal wiederholt werden
4 Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 wobei die Oligonukleotide des Pπmarstranges enzymatisch verknüpft werden
5 Verfahren nach Anspruch 4 wobei zur enzymatischen Verknüpfung thermostabile Ligase zugesetzt wird
6 Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5 wobei das Hybridisieren und Verknüpfen zwischen 45βC und 80βC, bevorzugt bei 70°C durchgeführt wird
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 wobei die Oligonukleotide des Primarstranges chemisch verknüpft werden
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligonukleotide des Primarstranges photochemisch verknüpft werden
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die nicht verknupfbaren Oligonukleotide nicht phosphoryliert sind
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das 3'-Ende oder das 5'-Ende der nicht verknupfbaren Oligonukleotide modifiziert ist
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die verknupfbaren und nicht verknupfbaren Oligonukleotide jeweils 30 bis 1500 Nukleotide umfassen
Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die verknupfbaren Oligonukleotide jeweils 30 bis 200 Nukleotide, bevorzugt 30 bis 60 Nukleotide, umfassen
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nicht verknupfbaren Oligonukleotide 30 bis 50 Nukleotide umfassen
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Bereiche der Komplementaπtat zwischen verknupfbaren Oligonukleotiden des Primarstranges und nicht verknupfbaren Oligonukleotiden jeweils ca 15 bis 30 bp, bevorzugt 20 bis
Figure imgf000017_0001
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei vor den Schritten (a) bis (c) gemäß Anspruch 1 die endstandigen Oligonukleotide für den Primarstrang und/oder zu den endstandigen Oligonukleotiden für den Primarstrang ganz oder teilweise komplementäre Oligonukleotide an die Enden eines lineaπsierten Vektors angelagert und mit diesen verknüpft werden
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das 3'-endständige Oligonukleotid für den Primärstrang ein Hapten am 3'-Ende trägt und/oder das 5'- endständige Oligonukleotid für den Primärstrang ein Hapten am 5'-Ende trägt.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend weiter
d) das Zusetzen einer Polymerase, um ein Nukleinsäure-Doppelstrangpolymer zu bilden, und
e) das Durchführen einer Polymerasereaktion.
18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei vor oder nach dem Zusatz von Polymerase im Schritt d) zusätzlich endständige Rückwärtsprimer oder endständige Vorwärts- und Rückwärtsprimer zugesetzt werden.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die zugesetzte Polymerase eine temperaturstabile Polymerase ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend eine oder mehrere Wiederholungen des Schrittes (e), wobei vor jeder Wiederholung eine Denaturierung durchgeführt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Denaturierung bei Temperaturen von mehr als 90°C und die Anlagerung endständiger Primer sowie die Polymerase-katalysierte DNA-Synthese bei 45°C bis 70°C durchgeführt werden.
22. Einzelsträngiges Nukleinsäurepolymer, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.
23. Verwendung eines einzelsträngigen Nukleinsäurepolymers nach Anspruch 22 zum Erzeugen doppelsträngiger Nukleinsaurepolymere von mehr als 1000 bp, bevorzugt mehr als 1500 bp.
PCT/EP1998/005219 1997-08-22 1998-08-17 Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren Ceased WO1999010358A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98947434A EP1005574A2 (de) 1997-08-22 1998-08-17 Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren
US09/486,241 US6472184B1 (en) 1997-08-22 1998-08-17 Method for producing nucleic acid polymers
DE29823795U DE29823795U1 (de) 1997-08-22 1998-08-17 Oligonukleotid zur Verwendung der Synthese eines modifizierten Genes für GEP

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19736591.4 1997-08-22
DE19736591A DE19736591A1 (de) 1997-08-22 1997-08-22 Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurepolymeren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1999010358A2 true WO1999010358A2 (de) 1999-03-04
WO1999010358A3 WO1999010358A3 (de) 1999-08-05

Family

ID=7839861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/005219 Ceased WO1999010358A2 (de) 1997-08-22 1998-08-17 Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren

Country Status (4)

Country Link
US (1) US6472184B1 (de)
EP (1) EP1005574A2 (de)
DE (2) DE19736591A1 (de)
WO (1) WO1999010358A2 (de)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE296310T1 (de) * 1999-03-08 2005-06-15 Metrigen Inc Syntheseverfahren zum ökonomischen aufbau langer dna-sequenzen und zusammensetzungen hierfür
US8137906B2 (en) * 1999-06-07 2012-03-20 Sloning Biotechnology Gmbh Method for the synthesis of DNA fragments
US8568766B2 (en) 2000-08-24 2013-10-29 Gattadahalli M. Anantharamaiah Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease
TW580729B (en) * 2001-02-23 2004-03-21 Macronix Int Co Ltd Method of avoiding electron secondary injection caused by pocket implantation process
ATE414767T1 (de) * 2001-11-22 2008-12-15 Sloning Biotechnology Gmbh Nukleinsäure-linker und deren verwendung in der gensynthese
US7563600B2 (en) 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
DK1599173T3 (en) 2002-11-13 2017-06-06 Uab Res Found SYNTHETIC SINGLE DOMAIN POLYPEPTIDES SIMILARING APOLIPOPROTEIN E AND PROCEDURES FOR THEIR USE
US7262031B2 (en) * 2003-05-22 2007-08-28 The Regents Of The University Of California Method for producing a synthetic gene or other DNA sequence
US20050106590A1 (en) * 2003-05-22 2005-05-19 Lathrop Richard H. Method for producing a synthetic gene or other DNA sequence
EP1812598A1 (de) * 2004-10-18 2007-08-01 Codon Devices, Inc. Verfahren zum zusammenbau synthetischer polynukleotide mit hoher treue
US20070122817A1 (en) * 2005-02-28 2007-05-31 George Church Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US20060281113A1 (en) * 2005-05-18 2006-12-14 George Church Accessible polynucleotide libraries and methods of use thereof
US20070231805A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-04 Baynes Brian M Nucleic acid assembly optimization using clamped mismatch binding proteins
US20070298503A1 (en) * 2006-05-04 2007-12-27 Lathrop Richard H Analyzing traslational kinetics using graphical displays of translational kinetics values of codon pairs
US20090087840A1 (en) * 2006-05-19 2009-04-02 Codon Devices, Inc. Combined extension and ligation for nucleic acid assembly
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
WO2008115632A2 (en) * 2007-02-09 2008-09-25 The Regents Of The University Of California Method for recombining dna sequences and compositions related thereto
EP2195340A4 (de) 2007-08-28 2011-05-11 Uab Research Foundation Synthetische apolipoprotein e-imitierende polypeptide und verwendungsverfahren
CA2704729C (en) 2007-08-28 2020-06-23 Uab Research Foundation Synthetic apolipoprotein e mimicking polypeptides and methods of use
US9115352B2 (en) * 2008-03-31 2015-08-25 Sloning Biotechnology Gmbh Method for the preparation of a nucleic acid library
BRPI0922083A2 (pt) 2008-11-11 2017-05-30 Danisco Us Inc proteases compreendendo uma ou mais mutações combináveis
CN104293751B (zh) 2008-11-11 2018-11-27 丹尼斯科美国公司 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
WO2010115021A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties
MX338884B (es) 2009-12-09 2016-05-04 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasa.
HUE034524T2 (en) 2010-05-06 2018-02-28 Procter & Gamble Consumer products with protease variants
JP5657560B2 (ja) 2010-08-31 2015-01-21 株式会社エーピーアイ コーポレーション 新規加水分解酵素タンパク質
AU2011338841B2 (en) 2010-11-12 2017-02-16 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
EP2637780B1 (de) 2010-11-12 2022-02-09 Gen9, Inc. Proteinanordnungen und verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
CA2820956C (en) 2010-12-10 2016-05-03 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions comprising il-7 receptor ligands
JP6105560B2 (ja) 2011-05-05 2017-03-29 ダニスコ・ユーエス・インク セリンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法
EP2723872A1 (de) 2011-06-24 2014-04-30 Algenol Biofuels Inc. Genetisch erweiterte cyanobakterien ohne funktionelles gen zur verleihung von biozider resistenz für die herstellung von chemischen verbindungen
EP3954770A1 (de) 2011-08-26 2022-02-16 Gen9, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur hochqualitativen anordnung von nukleinsäuren
US20130109596A1 (en) 2011-09-26 2013-05-02 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
AU2012328562A1 (en) 2011-10-28 2014-03-13 Danisco Us Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
EP2607374A1 (de) 2011-12-21 2013-06-26 Sanofi Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Labyrinthopeptinen und funktionalen Derivaten davon
US20140342431A1 (en) 2011-12-22 2014-11-20 Danisco Us Inc. Variant Alpha-Amylases and Methods of Use, Thereof
AU2012360934A1 (en) 2011-12-30 2014-07-31 Algenol Biofuels Inc. Genetically enhanced cyanobacteria for the production of a first chemical compound harbouring Zn2+, Co2+ or Ni2+ -inducible promoters
EP2798068B1 (de) 2011-12-30 2015-09-16 Algenol Biofuels Inc. Metabolisch verbessertes cyanobakterium mit sequenziell induzierbaren produktionsgenen zur herstellung einer ersten chemischen verbindung
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
WO2013163263A2 (en) 2012-04-24 2013-10-31 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
ES3035568T3 (en) 2012-06-08 2025-09-04 Danisco Us Inc Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
LT2864531T (lt) 2012-06-25 2019-03-12 Gen9, Inc. Nukleorūgšties konstravimo ir aukšto produktyvumo sekvenavimo būdai
WO2014037050A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Algenol Biofuels Inc. Genetically enhanced cyanobacteria for the production of isoprene
CN110093330B (zh) 2012-10-12 2023-11-28 丹尼斯科美国公司 包含脂解酶变体的组合物和方法
US9157101B2 (en) 2012-12-21 2015-10-13 Algenol Biotech LLC Cyanobacterium sp. for production of compounds
US10563240B2 (en) 2013-03-14 2020-02-18 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2014198964A2 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Algenol Biofuels Inc. Metabolically enhanced cyanobacterial cell for the production of ethanol
WO2015090422A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Algenol Biofuels Inc. Chlorogloeopsis sp. host cell for producing ethanol and method for producing ethanol using the same
WO2016018665A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Uab Research Foundation Apoe mimetic peptides and higher potency to clear plasma cholesterol
CN115927293A (zh) 2014-12-09 2023-04-07 生命技术公司 高效小体积核酸合成
EP3763818A1 (de) 2015-10-06 2021-01-13 Pierce Biotechnology, Inc. Vorrichtungen und verfahren zur herstellung von proteinen
EP3814494B1 (de) 2018-06-29 2023-11-01 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Hochdurchsatzanordnung von nukleinsäuremolekülen
GB201905303D0 (en) 2019-04-15 2019-05-29 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Multiplex assembly of nucleic acid molecules
MX2022002712A (es) 2019-09-13 2022-08-10 Danisco Us Inc Variantes termoestables de glucosa isomerasa.
CA3169966A1 (en) * 2020-03-03 2021-09-10 John E. Gill Methods for assembling nucleic acids
DE102022105061B3 (de) 2022-03-03 2023-06-01 Norelle Wildburger Verfahren zum Nachweis von multimeren, bevorzugt dimeren Peptiden unter Verwendung von Einzeldomänen-Antikörpern
EP4638776A1 (de) 2022-12-19 2025-10-29 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Rückgewinnung von sequenzverifizierten nukleinsäuremolekülen
GB2628173A (en) 2023-03-17 2024-09-18 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Methods of producing modified nucleic acid sequences for eliminating adverse splicing events

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE143696T1 (de) * 1989-02-28 1996-10-15 Canon Kk Partiell doppelsträngiges oligonukleotid und verfahren zu seiner bildung
US5852188A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
WO1994012632A1 (en) * 1992-11-27 1994-06-09 University College London Improvements in nucleic acid synthesis by pcr
BE1007918A3 (fr) * 1993-02-19 1995-11-21 Wallone Region Sondes d'acides nucleiques chimiquement modifiees en 5'(oh) et/ou en 3'(oh) en vue de l'introduction en ces positions d'un ou plusieurs elements de marquage non radioactif et procede de preparation.
US5679773A (en) * 1995-01-17 1997-10-21 Affymax Technologies N.V Reagants and methods for immobilized polymer synthesis and display
US6110668A (en) * 1996-10-07 2000-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Gene synthesis method
IL120337A0 (en) * 1997-02-27 1997-06-10 Gesher Israel Advanced Biotecs Method for joining DNA fragments
IL120338A0 (en) * 1997-02-27 1997-06-10 Gesher Israel Advanced Biotecs Single step DNA fragments assembly
IL120339A0 (en) * 1997-02-27 1997-06-10 Gesher Israel Advanced Biotecs Improved DNA assembly method

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999010358A3 (de) 1999-08-05
US6472184B1 (en) 2002-10-29
DE29823795U1 (de) 2000-03-02
EP1005574A2 (de) 2000-06-07
DE19736591A1 (de) 1999-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1005574A2 (de) Verfahren zum herstellen von nukleinsäurepolymeren
DE3650762T2 (de) Kit zur Verwendung bei der Amplifizierung und beim Nachweis von Nukleinsäuresequenzen
DE69028725T2 (de) Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung
DE3687287T3 (de) Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen.
DE69119083T2 (de) Direkte klonierung von pcr amplifizierten nukleinsäuren
DE69233041T2 (de) Behandlung von amplifizierter DNS mit alkalischer Phosphatase
DE19953854C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften
EP1314783B1 (de) Nukleinsäure-Linker und deren Verwendung in der Gensynthese
DE68915202T2 (de) Verfahren zur Vermehrung und zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen.
DE69607830T2 (de) Verfahren zur isothermer amplifikation von nukleinsäure molekülen
EP2316965B1 (de) Einführung von Sequenzelementen in Nukleinsäuren
DE69011101T2 (de) Methoden zur in vitro-dna-amplifikation, zum genomischen klonieren und zur genkartierung.
DE69125702T2 (de) Enzymatische synthese von oligonukleotiden
DD204494A5 (de) Verfahren zum schneiden doppelstraengiger dns
DE19812103A1 (de) Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuremolekülen
DE69934088T2 (de) Verfahren zur in vitro amplifikation zirkulärer dna
EP1327682B1 (de) Verfahren zur Herstellung von DNA
DE69427876T2 (de) Methode zur detektion einer gezielten nukleinsäure
DE3930312A1 (de) Verfahren zur direkten sequenzierung von nukleinsaeureketten
DE4428651C1 (de) Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von Nukleinsäuren
DE69730558T2 (de) Methode zur Bildung makromolekularer Mikrogenpolymeren
DE60202196T2 (de) Orientationsgerichtete konstruktion von plasmiden
EP1511842A2 (de) Verfahren zur erzeugung von polynukleotidmolekülen
WO2001049880A2 (de) Primer, insbesondere für primer-abhängige nukleinsäure-syntheseprozesse und nukleinsäure-amplifikationsverfahren
DE102004001582B4 (de) Verfahren zur Herstellung von DNS-Sonden für DNS-Abschnitte mit repetitiven Sequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998947434

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09486241

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998947434

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998947434

Country of ref document: EP