DE29823795U1

DE29823795U1 - Oligonukleotid zur Verwendung der Synthese eines modifizierten Genes für GEP

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Description

Oligonukleotid zur Verwendung der Synthese eines modifizierten Genes für GEP

Die Erfindung betrifft ein Oligonukleotid zur Verwendung bei der Synthese eines modifzierten Genes für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea, sowie ein algenadaptiertes Gen, das für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea kodiert.

Der zunehmende Einsatz rekombinanter Gene in der Gen- und Biotechnologie sowie der medizinischen Analytik hat einen großen Bedarf an Verfahren zur "de novo"-Synthese von langen Nukleinsäureketten ausgelöst. Die synthetische Herstellung beliebig gewählter Nukleinsäuresequenzen kann in vielen Fällen eine zeitsparende Alternative für aufwendige Klonierungs- und Modifizierungsverfahren sein. Eine routinemäßige Synthese langer Nukleinsäureketten kann ebenfalls entscheidende Vorteile beim "drug-design" bieten, z. B. bei der Herstellung von "maßgeschneiderten" Antikörpern, Inhibitor/Aktivatormolekülen, Ribozymen oder in der DNA-Chip-Technologie. Desweiteren könnten auf diese Weise gezielt modifizierte Nukleotide, z. B. markiert durch (Fluoreszenz)Farbstoffe oder Enzyme, in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden. Neben den hier aufgeführten Beispielen ergeben sich noch eine Vielzahl weiterer Anwendungsmöglichkeiten für gezielt hergestellte Nukleinsäurepolymere.

Bei der einfachsten Variante der herkömmlichen Gensynthese, der direkten Klonierung, werden zwei lange, einander vollständig komplementäre Oligonukleotide miteinander hybridisiert. Auf Grund der derzeitigen technischen Limitierung bei der Herstellung der Oligonukleotide auf eine Länge von 150 - 200 Basen ist auch die Größe der resultierenden Hybridisierungsprodukte auf diesen Längenbereich beschränkt.

Lange Nukleinsäurepolymere können weiterhin durch die sogenannte Fill-in-Methode hergestellt werden, bei der zwei einzelsträngige Nukleinsäureketten miteinander hybridisiert werden, wobei überhängende Enden mit Hilfe von DNA-Polymerasen aufgefüllt werden, so daß das doppelsträngige Produkt länger als die eingesetzten Oligonukleotide ist. Aber auch mit der Fill-in-Methode kann kein Produkt erzeugt werden, das länger als die Summe der beiden eingesetzten Nukleinsäureketten ist.

Bei der "Shot Gun-Gensynthese" werden komplementäre, einzelsträngige Oligonukleotide zusammen mit einem durch Restriktionsenzyme geöffneten Expressionsvektor direkt in Zellen transfiziert, wobei ein zirkularisiertes Produkt nur entstehen kann, wenn alle Teilsequenzen durch die Enzymmaschinerie des Wirtsorganismus in geeigneter Weise ligiert werden. Die Effizienz der erfolgreichen Ligationen bei dieser Methode ist i.a. sehr gering, insbesondere wenn viele Oligonukleotide für die Gensynthese eingesetzt werden.

1972 entwickelte Khorana ein nach ihm benanntes Verfahren, bei dem mehrere chemisch synthetisierte Oligonukleotide von durchschnittlich 15 Nukleotiden Länge, die sich in geeigneter Anordnung lückenlos überlappen, enzymatisch durch Polynukleotidligase zu einem Doppelstrang verbunden wurden (Khorana, H.G.et al., J. Mol. Biol. 27, 209-17, 1972, und Folgeveröffentlichungen; Khorana, H.G et al., J. Biol. Chem. 25J., 3 (10), 565-70, 1976 und Folgeveröffentlichungen). Durch sequenzielles Ligieren von wenigen (4 - 8) Oligonukleotiden zu längeren Zwischenprodukten, Aufreinigen der Zwischenprodukte und anschließendes Ligieren der Zwischenprodukte miteinander wurden doppelsträngige Nukleinsäureketten mit einer Länge von 514 Basenpaaren (Edge, M.D. et al., Nature 292, 756-62,1981), später bis ca. 1000 bp synthetisiert, die anschließend in bakterielle Expressionsvektoren kloniert werden konnten.

Mit diesen Verfahren sind mehrere entscheidende Nachteile verbunden:

1.) Nach jedem Ligationsschritt mußten die Produkte bzw. Zwischenprodukte durch Auftrennung auf einem Polyacrylamid-Gel (PAA-GeI) von unerwünschten Nebenprodukten der Ligationsreaktion gereinigt werden. Dieser zeitintensive Arbeitsschritt ist mit einem hohen personellen und finanziellen Aufwand verbunden.

2.) Bei der Elution der Zwischen- und Endprodukt aus dem PAA-GeI mußten beträchtliche Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden.

3.) Das bisher längste Produkt, das mit Hilfe dieser Technik hergestellt werden konnte, hatte eine Länge von ca. 1000 Basenpaaren. Da die meisten eu- und

prokaryotischen Gene eine kodierende Sequenz von durchschnittlich 300 - 3000 Basenpaaren haben, ist diese Länge für die meisten Anwendungen ungenügend.

4.) Für die benötigte Aufreinigung über PAA-GeIe wurden die Nukleotide bei dem von Khorana beschriebenen Verfahren üblicherweise radioaktiv markiert, um die Bande des gewünschten Produktes im Gel identifizieren zu können. Die Verwendung hoch radioaktiver ³²P-Marker stellt ein Gefährdungspotential dar, das bei diesem Verfahren nicht vermieden werden konnte.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Oligonukleotide für ein Verfahren zur Synthese eines modifizierten Gens für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea bereitzustellen, bei dem die oben aufgeführten Nachteile überwunden werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Oligonukleotid zur Verwendung bei der Sythese eines modifizierten Genes für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

FG1 (46) ATGGCCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGTGTGGTCCCCATCCTGG

FG2(46) TGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCTCCGTCTCCGG

FG3(46) CGAGGGTGAGGGTGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTC

FG4(45) ATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTC

FG5(46) ACCACCCTGACCTACGGTGTGCAGTGCTTCTCCCGCTACCCCGACC

FG6(47) ACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTAC

FG7(47) GTGCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC

FG8(45) CCGCGCCGAGGTCAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAT

FG9(45) CGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGG

FG10(47) CCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTGTACATCATGG

FG11 (47) CCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCAC

• ·

FG 12(45) AACATCGAGGACGGCTCCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAG

FG13(46) AACACCCCCATCGGCGATGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACT

FG14(46) ACCTGTCCACCCAGTCCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCG

FG15(46) CGACCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTCACCGCTGCCGGCATCACC

FG14rev(46) ACTCCAGCAGGACCATGTGGTCGCGCTTCTCGTTGGGGTCCTTGGA FG13rev(46) CAGGGCGGACTGGGTGGACAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACG FG12rev(46) GGGCCATCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCCAGCT FG11rev(46) GCACGGAGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTT FG10rev(46) GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATGTACACGTTGTGGGAG FG9rev(46) TTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGGCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCT FG8rev(46) TGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCC FG7rev(46) CTCGAACTTGACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTG FG6rev(46) AAGAAGATGGTGCGCTCCTGCACGTAGCCCTCGGGCATGGCGGACT FG5rev(46) TGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGGAGMGCA FG4rev(46) CTGCACACCGTAGGTCAGGGTGGTGACCAGGGTGGGCCAGGGCACG FG3rev(46) GGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGT FG2rev(46) AGGTGGCGTCACCCTCACCCTCGCCGGAGACGGAGAACTTGTGGCC FG1 rev(46) GTTCACGTCGCCGTCCAGCTCCACCAGGATGGGGACCACACCGGTG

FG15rev(50)

TACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTGGGTGATGCCGGCAGCGGTGACGA

Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea kodierenden Genes, das an die Expression in Algen ad-

aptiert ist. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein algenadaptiertes Gen mit der folgenden Squenz:

atgtccaagggcgaggagctgttcaccggtgtggtccccatcctggtggagctgg acggcgacgtgaacggccacaagttctccgtctccggcgagggtgagggtgacgc cacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgc cctggcccaccctggtcaccaccttcacctacggtgtgcagtgcttctcccgctac cccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgagggctacgt gcaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgag gtcaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgactt caaggaggacggcaacatcctgggccacaagctggagtacaactacaactcccaca acgtgtacatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatc cgccacaacatcgaggacggctccgtgcagctggccgaccactaccagcagaaca cccccatcggcgatggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgtccaccca gtccgccctgtccaaggaccccaacgagaagcgcgaccacatggtcctgctggag ttcgtcaccgctgccggcatcacccacggcatggacgagctgtacaagtaa

Das Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide ist in den Abb. 1 und 2 schematisch dargestellt. Ein solches Verfahren bietet bei Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide im Unterschied zum Khorana-Verfahren den entscheidenden Vorteil, daß die Synthese eines einzelsträngigen Nukleinsäurepolymers in einem einzigen Reaktionsansatz durchgeführt werden kann. Dabei werden alle zur Synthese des Primärstrangs benötigten verknüpfbaren und nicht verknüpfbaren Oligonukleotide gleichzeitig eingesetzt; durch Zugeben eines Verknüpfungsmittels entsteht ein Primärstrang kovalent verknüpfter Oligonukleotide, der eine Länge von mehr als 1000, z.B. 1500 Basen erreichen kann.

In bevorzugten Ausführungsformen werden die Schritte (b) und (c) mehrfach wiederholt, wobei vor jeder Wiederholung dieser beiden Schritte die zuvor miteinander hybridisierten Oligonukleotide voneinander getrennt werden, d.h. der durch die Hybridisierung zuvor gebildete Doppelstrang denaturiert wird. Die Denaturierung kann durch Temperaturerhöhung oder Erhöhung des pH-Wertes auf dem Fachmann bekannte Weise durchgeführt werden. Das mehrfache Denaturieren und Renaturieren mit anschließendem Verknüpfen führt zu einer erheblichen Verbesserung der Ausbeute an Primärstrang, die sonst z.B. durch Kettenabbrüche, die eine Folge des Einbaus unvollständig phosphorylierter Primärstrangoligonukleotide sind, beeinträchtigt wird. Der Einfluß solcher Kettenabbrüche auf die Gesamtausbeute wird durch die Wiederholung der Schritte (b) und (c) minimiert.

Die Schritte (b) und (c) werden nicht nur 1 mal, sondern mehrfach durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie 1 bis 8 mal, besonders bevorzugt 3 bis 5 Mal wiederholt.

Die Anzahl der eingesetzten Oligonukleotide kann zwischen 2 verknüpfbaren Oligonukleotiden und 150 verknüpfbaren Oligonukleotiden schwanken. Die Anzahl der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide ist jeweils gleich der Anzahl der verknüpfbaren Oligonukleotide, um eines höher oder um eines niedriger, mindestens also eins. Bevorzugt werden zwischen 5 und 100, besonders bevorzugt 10 und 50 verknüpfbare Oligonukleotide eingesetzt.

Das Verknüpfen der verknüpfbaren Oligonukleotide des Primärstranges kann verschiedene Reaktionen umfassen. Unter Verknüpfen wird hierz.B.eine Reaktion enzymatischem chemischer oder auch photochemischer Natur verstanden. So wird im Fall der enzymatischen Verknüpfung (Ligation) als Verknüpfungsmittel z.B. T4-DNA-Ligase verwendet. In der bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile Ligase, z.B. Pfu-Ligase (Stratagene), eingesetzt, die den Vorteil bietet, daß bei wiederholten Zyklen des Denaturierens durch Temperaturerhöhung , des Hybridisierens und Ligierens der Oligonukleotide kein neues Enzym zugesetzt werden muß, während dies bei Verwendung thermolabiler DNA-Ligasen, wie z.B. T4-DNA-Ligase, der Fall ist.

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Desweiteren gestattet die Verwendung dieser thermostabilen Ligase, die Schritte des Hybridisierens und des Ligierens der Oligonukleotide bei hohen Temperaturen von 45° bis 80⁰C, bevorzugt 7O⁰C, durchzuführen. Diese stringenten Temperaturbedingungen bedeuten, daß der Schritt des Hybridisierens der Oligonukleotide in komplementärer Anordnung mit hoher Spezifität erfolgt und im Vergleich zum Khorana-Verfahren erheblich weniger Nebenprodukte anfallen. Ligationen mit herkömmlicher Ligase werden üblicherweise in einem Temperaturbereich von 4O⁰C bis 4°C durchgeführt und können daher zu einem höheren Anteil unspezifischer Hybridisierungen durch Fehlpaarung oder Sekundärstrukturen führen.

Eine chemische Verknüpfung der Oligonukleotide, die von Goeddel und Kollegen beschrieben worden ist (Goeddel, D.V. et al., PNAS 76, 1979), ist ebenfalls möglich.

Eine weitere Möglichkeit, Oligonukleotide miteinander verknüpfen, bietet die photochemische Verknüpfung. Dabei müssen die zu verknüpfenden Oligonukleotide an den endständigen Nukleotiden mit photosensitiven Molekülen markiert sein, die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten und einer (2+2) Photocyclodimerisation unterliegen können, wie z.B. Stilben-, Allen-, Mono-, Di- und Triendicarbonsäurederivate oder Styrolderivate.

Die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide dienen lediglich als Matrize zur Bildung des Nukleinsäurepolymers. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende nicht phosphoryliert. Dadurch ist eine enzymatische Verknüpfung dieser Oligonukleotide, die nur für die Anlagerung der verknüpfbaren Oligonukleotide in der gewünschten Anordnung verantwortlich sind, nicht möglich..

Es können ebenfalls nicht verknüpfbare Oligonukleotide eingesetzt werden, bei denen z.B. das 3'-Ende ein Didesoxynukleotid oder ein Thionukleotid ist. Entsprechende Modifizierungen sind auch am 5'-Ende möglich. Weiterhin kann das Verfahren mit nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden, die am 3'-Ende phosphoryliert sind, durchgeführt werden. Diese Modifikation verhindert ebenfalls die enzymatische Verknüpfung der Oligonukleo-

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tide. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren nicht mittels enzymatischer Ligation, sondern chemischer oder photochemischer Verknüpfung durchgeführt wird, müssen die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide dementsprechend so konzipiert sein, daß sie unter den zur Verknüpfung der den Primärstrang bildenden Oligonukleotide gewählten Bedingungen keine kovalente Bindung zum jeweils benachbarten nicht verknüpfbaren Oligonukleotid bilden können.

Die in dem Verfahren eingesetzten Oligonukleotide können eine Länge von 30 bis 1500 Nukleotiden haben. Die Länge des jeweils gewählten Nukleotides ist von mehreren Faktoren einschließlich der Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von Sekundärstrukturen und der Reinheit der gewählten Ausgangsmaterialien abhängig. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Oligonukleotide des Primärstranges eine Länge von 30 bis 200, besonders bevorzugt von 30 bis 100 oder 30 bis 60 Nukleotiden haben.

Bei der Synthese bereits erzeugte einzelsträngige Nukleinsäurepolymere können in einem weiteren Schritt wiederum mit dem Verfahren in einzelsträngige Nukleinsäurepolymere von mehreren Kilobasen Länge zusammengeführt werden (Abb. 3). Dazu wird das Verfahren so, wie oben ausgeführt, durchgeführt, wobei als verknüpfbare Oligonukleotide für den Primärstrang Nukleinsäurepolymere von beispielsweise 1500 Basen eingesetzt werden können.

Die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide, die die korrekte Anordnung der Oligonukleotide des Primärstranges nebeneinander gewährleisten sollen, sind gegebenenfalls nur 30 bis 50 Nukleotide lang. Diese Größenordnung erlaubt die Hybridisierung mit zwei benachbart anzuordnenden Oligonukleotiden des Primärstranges. Es besteht keine Notwendigkeit, den ganzen Primärstrang abdeckende nicht verknüpfbare Oligonukleotide zur Verfügung zu stellen. Selbstverständlich ist jedoch die Verwendung von nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden mit bis zu 300 Nukleotiden oder mehr ebenfalls möglich und kann, wo z.B. im Primärstrang ansonsten starke Sekundärstrukturen ausgebildet werden würden, durchaus sinnvoll sein.

*·· § » « alii

Jedes der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide enthält zwei aneinandergrenzende Bereiche, die Komplementarität mit dem 3'- bzw. 5'-Ende zweier benachbarter Oligonukleotide für den Primärstrang aufweisen. Die Bereiche der Komplementarität zwischen den verknüpfbaren Oligonukleotiden für den Primärstrang und den nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden des Gegenstranges sind jeweils ca. 15 bis 30 Basenpaare lang, bevorzugt 20 bis 25 bp (s. Abb. 2).

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, in einer vorgeschalteten Reaktion die endständigen Oligonukleotide für den Primärstrang und/oder zu den endständigen Oligonukleotiden des Primärstranges ganz oder teilweise komplementäre Oligonukleotide an die Enden eines linearisierten Vektors anzulagern, sie mit dem Vektor zu verknüpfen und nachfolgend das eben beschriebene Verfahren durchzuführen. Die Vektorenden sind dabei bevorzugt kohäsiv. Dieses Verfahren führt zu einem zirkularisierten Produkt, das direkt in einen geeigneten Wirtsorganismus, z.B. Bakterien, Sauger- oder Insektenzellen, transfiziert werden kann. Unter "Transfektion" sind in diesem Fall verschiedene Techniken, wie z.B. Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion, Transfektion unterstützt durch z.B. "Ca-PO₄", DEAE, hydrophobe Moleküle etc., zu verstehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist entweder das 5"-endständige Oligonukleotid des Primärstrangs an seinem 5'-Ende oder das 3'-endständige Oligonukleotid des Primärstrangs an seinem 3'-Ende mit einem Hapten oder beide endständigen Oligonukleotide mit verschiedenen Haptenen versehen. Dies ermöglicht die Fixierung des mit dem Hapten gekoppelten Oligonukleotids vor oder nach seiner Verknüpfung mit weiteren Oligonukleotiden des Primärstranges an einen festen Träger. Damit wird eine Abtrennung des Hapten-gekoppelten Stranges von allen Vorstufen und Nebenprodukten ohne Hapten z. B. unter denaturierenden Bedingungen (z.B. pH 13) möglich. Die jeweils gewählte Hapten-Träger-Kombination muß unter den vorgesehenen Bedingungen stabil sein. Ein bevorzugtes Hapten ist z.B. Biotin, das durch an einen Träger gekoppeltes Streptavidin gebunden wird. Weiter können die Oligonukleotide mit Antigenen gekoppelt werden, die von an einen Träger fixierten Antikörpern erkannt und gebunden werden. Die weitere Synthese des Primärstranges oder einer der im folgenden beschriebenen weiteren Schritte kann dann an diesem Träger durchgeführt werden. Das zweite Hapten könnte

beispielsweise für später mit dem Nukleinsäurepolymer durchzuführende Detektionsverfahren nützlich sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird dem Reaktionsansatz einer nach dem beschriebenen Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym zugesetzt, um aus dem Primärstrang, der ein Nukleinsäure-Einzelstrang ist, einen Nukleinsäure-Doppelstrang zu bilden oder gezielt den komplementären Strang (d.h. den Gegenstrang zum Primärstrang) zu amplifizieren (asymmetrische PCR). Als spezifischer Primer dient ein zum 3'-Ende des vollständigen Primärstranges komplementäres Oligonnukleotid (Rückwärtsprimer).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden dem Reaktionsansatz einer nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym und zusätzlich endständige Vorwärts- und Rückwärtsprimer im großen Überschuß zum eingesetzten Syntheseprodukt zugesetzt. Auf diese Weise werden nach dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al., Science 239, 487-491, 1988) aus den einzelsträngigen Nukleinsäurepolymeren doppelsträngige Nukleinsäurepolymere gebildet.

Das Polymeraseenzym wird dabei aus der Gruppe der DNA-Polymerasen, z.B. E. coli Polymerase I, Klenow-Polymerase, T4 DNA-Polymerase und Reverse Transkriptase, ausgewählt. Die dabei gebildeten Nukleinsäure-Doppelstränge können entweder DNA-DNA-Doppelstränge oder DNA-RNA-Doppelstränge sein (Kleppe et al., Proc, Natl. Acad. Sei. 67, 68-79, 1970).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zugesetzte Polymerase eine temperaturstabile Polymerase, z.B. Taq-Polymerase. Das temperaturstabile Enzym verliert auch nach mehreren Temperaturzyklen nur wenig von seiner Aktivität und kann deshalb die Polymerasereaktionen mehrerer aufeinander folgender Zyklen katalysieren.

Die Polymerasereaktion wird bevorzugt mehrfach wiederholt durchgeführt, um den Nukleinsäure-Doppelstrang exponentiell zu amplifizieren. Nach dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion umfaßt dabei jeder Zyklus eine Denaturierung bereits bestehender

Nukleinsäure-Doppelstränge durch übliche Maßnahmen, z.B. durch Erhöhen der Temperatur oder des pH, das Anlagern endständiger Primer unter geeigneten Bedingungen und eine Polymerase-katalysierte Nukleinsäuresynthese. Im Fall einer temperaturstabilen Polymerase erübrigt sich die Zugabe weiterer Polymerase; wo jedoch eine der nicht temperaturstabilen Polymerasen für die Polymerisationsreaktion verwendet worden ist, wird diese durch die thermische Denaturierung inaktiviert; in diesem Fall muß in jedem Zyklus frisches Polymeraseenzym zugefügt werden. Üblicherweise wird die Polymerasereaktion 5 bis 15 Mal durchgeführt, bevorzugt etwa 8 bis 12 Mal. Der wesentliche Vorteil der Wiederholung der Polymerasereaktion liegt darin, daß aufgrund der Position der Primer (endständig) gezielt vollständiges Syntheseprodukt exponentiell amplifiziert werden kann.

Die Denaturierung der Doppelstränge wird üblicherweise bei Temperaturen von mehr als 9O⁰C durchgeführt. Der Reaktionsansatz wird sodann langsam abgekühlt, so daß sich die endständigen Primer in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung bei Temperaturen zwischen 80⁰C und 45°C mit den dann vorliegenden Einzelsträngen hybridisieren können. Die Polymerase-katalysierte DNA-Synthese kann bei Verwendung eines temperaturstabilen Enzymes im Bereich von 45 bis 7O⁰C durchgeführt werden, wodurch die Bildung unspezifischer Hybride minimiert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein algenadaptiertes Gen, kodierend für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea, das durch die oben angegebene Sequenz gekennzeichnet ist. Ein solches algenadaptiertes Gen kann mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Durch geschickte Kopplung des Verfahrens, mit dem zunächst einzelsträngige Primärstränge hergestellt werden, mit der FiIMn-Methode lassen sich ohne weiteres doppelsträngige Nukleinsäurepolymere von mehreren 1000 Basen erzeugen (Abb. 4). Dazu müssen z.B. Primärstränge so konzipiert sein, daß sie an ihrem 3'-Ende in einem Bereich von wenigen Basenpaaren, z.B. 20 bis 60, bevorzugt 30 bis 40 Basenpaaren, einander komplementär sind, so daß bei einer nachfolgend in vitro oder in vivo ablaufenden Polymerasereaktion das 3'-Ende jedes Primärstranges als Primer für eine matrizenabhängige Polymerase dienen kann.

Die folgenden Abbildungen und das Beispiel erläutern die Erfindung.

Abbildung 1 beschreibt eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens unter Verwendung der Oligonukleotide gemäß Anspruch 1.

Es werden zunächst phosphorylierte Oligonukleotide für den Primärstrang und nicht verknüpfbare Oligonukleotide für den Gegenstrang, die zu den Oligonukleotiden des Primärstrangs komplementär sind und mit jeweils zwei der phosphorylierten Oligonukleotide überlappen, bereitgestellt (a). Anschließendes Ligieren führt zu einem einzelsträngigen Nukleinsäurepolymer (b), dem Primärstrang.

Abbildung 2 zeigt eine Detailaufnahme des Überlappungsbereiches zwischen zwei benachbarten verknüpfbaren Oligonukleotiden und einem nicht verknüpfbaren Oligonukleotid, das zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren einer dem 3'-Ende eines ersten verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist, und deren zweiter dem 5¹-Ende eines zweiten verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist. Der Überlappungsbereich zwischen einem Bereich des nicht verknüpfbaren Oligonukleotids mit dem komplementären Bereich eines der verknüpfbaren Oligonukleotide sollte mindestens 15 bp betragen.

Abbildung 3 veranschaulicht die Durchführung des Verfahrens mit sehr langen verknüpfbaren Oligonukleotiden, die jeweils durch Hybridisierung mit weitaus kürzeren nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden korrekt nebeneinander angeordnet werden. Für diesen Zweck ist es ausreichend, wenn die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide eine stabile Hybridisierung mit den beiden benachbart anzuordnenden verknüpfbaren Oligonukleotiden gewährleisten, ohne daß eine Komplementarität zum gesamten späteren Primärstrang gegeben sein muß.

Abbildung 4 zeigt das Prinzip der Fill-in-Methode am Beispiel zweier nur in ihrem 3'-Bereich komplementärer langer Oligonukleotide. Durch Hybridisierung der komplementä-

ren 3'-Bereiche dient das 3'-Ende jedes der Oligonukleotide als Primer für eine Polymerasereaktion entlang der Matrize des jeweils anderen Oligonukleotides.

Abbildung 5:

a) Oligonukleotide zur Synthese des Primärstranges der algenadaptierten GFP-Mutante S65T/F64L (FG1 bis (FG15)

b) Oligonukleotide des Gegenstranges (nicht verknüpfbar) (FG14rev bis FGIrev)

c) Oligonnukleotid FG15rev, Primer für die Polymerase-katalysierte Synthese des Gegenstranges

Abbildung 6: Modifiziertes Gen (S65T/F64L) für das Grüne Fluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein - GFP) aus Aquorea victorea. Das Gen wurde gegenüber dem natürlichen GFP-Gen so modifiziert, daß es nur Kodons enthält, die von Grünalgen, beispielsweise Chlamvdomonas, bevorzugt werden. Die unterstrichenen Nukleotide wurden erst durch die Polymerasereaktion aufgefüllt (Matrize: FG15rev).

Beispiel: Synthese eines alqenadaptierten Genes, das für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea kodiert

Im folgenden wird die Synthese eines modifizierten Genes für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea gezeigt. Der Kodongebrauch wird im synthetischen Gen dahingehend modifiziert, daß die Kodons von Grünalgen, wie beispielsweise Chlamvdomonas, bevorzugt werden. Für die Synthese wurden 30 Oligonukleotide mit einer Länge von 45 bis 50 Basen eingesetzt. Die Oligonukleotide des Primärstranges werden dabei als FG1 bis FG15 bezeichnet und sind 45 bis 47 Basen lang. Die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide des komplementären Stranges werden als FG14rev bis FGIrev bezeichnet und sind 46 Basen (FG14rev bis FGIrev) lang. Die Sequenzen der Oligonukleotide sind in Abb. 5a, b gezeigt.

Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt. Die Oligonukleotide, die den verknüpfbaren Strang bilden, wurden vor der Synthesereaktion am 5'-Ende phosphoryliert.

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Schritt 1: Oligonukleotid-Phosphorylierung am 5'-Ende (100 &mgr;&Igr;-Ansatz)

10 &mgr;&Igr; Oligonukleotide FG1 bis FG15 (500 pMol total, gleiche molare Konzentration jedes Oligonukleotides)

10 &mgr;&Igr; Kinasepuffer (10-fach konzentriert, Biolabs)

10 &mgr;&Igr; ATP 2 mM

69 &mgr;&Igr; H₂O

1 &mgr;&Igr; T4 Polynukleotidkinase (10 Einheiten Biolabs)

Die Reaktion wird für 4 h bei 37°C durchgeführt und anschließend durch 5-minütige Inkubation bei 95°C beendet.

Schritt 2: Trägerfreie Nukleotidpolymersynthese (Primärstrang)

Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt. Es wurde rekombinante Pfu-DNA-Ligase der Firma Stratagene verwendet. Die Pufferbedingungen wurden mit KCI, NP-40, MgCI₂ auf die Ligasebedingungen umgestellt, wobei die Ionen im Kinaseansatz berücksichtigt wurden.

10 &mgr;&Igr; 5'-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) aus Schritt 1 (FG1-FG15)

1 &mgr;&Igr; nicht-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) (FGIrev - FG14rev)

6&mgr;&Igr; KCI(IOOmM)

3 &mgr;&Igr; NP-40 (0,5%)

4&mgr;&Igr; MgCI₂(50mM)

3 &mgr;&Igr; ATP(IOmM)

Der Reaktionsansatz wird 3 Min. bei 95⁰C und 3 Min. bei 80⁰C inkubiert. Während der Inkubation bei 80°C werden 3 &mgr;&Igr; Pfu-DNA-Ligase (12 Einheiten thermostabile Ligase der Firma Stratagene) zugesetzt und anschließend 3mal der folgende Temperaturzyklus durchgeführt:

&Ggr;:::·/ OC: X *

a) 1 Min. 95°C

b) in 1 Min. von 95⁰C auf 7O⁰C abkühlen

c) über den Zeitraum von 1 Std. linear von 70⁰C auf 55°C abkühlen

d) 2 Std. bei 55⁰C inkubieren

Variante 1: Das Produkt wird zur Abtrennung der Pfu-Ligase ausgefällt, gegebenenfalls über PCR und Taq-Polymerase amplifiziert und kloniert.

Variante 2: Um die Abtrennung zu erleichtern, wird der Primer FG1 biotinyliert eingesetzt. Nach Beendigung der Synthese wird der Reaktionsansatz mit NaOH auf pH 13 gebracht. Es werden Streptavidin-Magnetkugeln (Dynal) zugesetzt und das Syntheseprodukt mit einem Magneten an der Wand des Reaktionsgefäßes festgehalten, während alle Rückwärtsprimer, unverbrauchte Vorwärtsprimer sowie Ligase mit dem Überstand abgenommen werden. Das saubere, nun an Streptavidin gekoppelte Syntheseprodukt wird in 30 &mgr;&Igr; neutralem Puffer aufgenommen und kann z.B. wie im Schritt 3 (s. unten) amplifiziert werden.

Schritt 3: Amplifizierung des Syntheseproduktes mit Hilfe der Poiymerasekettenreaktion (PCR)

Variante 1:1 &mgr;&Igr; des Syntheseproduktes werden mit 1 E thermostabiler Pfu-Polymerase (Stratagene) in 12 Zyklen im Standardpuffer (It. Hersteller) in einem 50 &mgr;&Igr;-Ansatz amplifiziert. Als Vorwärtsprimer dient das Oligonukleotid FG1, als Rückwärtsprimer dient das Oligonukleotid FG15rev (50 Basen; Abb. 5c). Endkonzentration: 25 pMol pro 50 &mgr;&Igr;.

Variante 2: Zur Amplifizierung mittels PCR werden zwei endständige Primer zugegeben, die zwar eine Gesamtlänge von 30 bzw. 33 Basen aufweisen, wovon aber nur 21 bzw. 24 bp mit dem Syntheseprodukt hybridisieren. Die "Überhänge" enthalten jeweils eine Schnittstelle der "Multiplen Klonierungsregion" des Vektors pBenescript Il KS' (Stratagene). Das amplifizierte Produkt wird mit den Enzymen Xhol und Knpl geschnitten, über Quiaex Il (Quiagen) gereinigt und standardmäßig kloniert.

Vorwärtsprimer mit Xhol-Schnittstelle:

5¹ CCG CTC GAG ATG GCC AAG GGC GAG GAG CTG

Rückwärtsprimer mit Kpnl-Schnittstelle:

5¹ CGC GGA TCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Prof. Dr. Peter Hegemann

(B) STRASSE: Hauptstr.40

(C) ORT: Friesheim.

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 98092

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zum Herstellen von Nukleinsaeurepolymeren

™ (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRDGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

ATGGCCAAGG GCGAGGAGCT GTTCACCGGT GTGGTCCCCA TCCTGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

TGGAGCTGGA CGGCGACGTG AACGGCCACA AGTTCTCCGT CTCCGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

CGAGGGTGAG GGTGACGCCA CCTACGGCAA GCTGACCCTG AAGTTC

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 45 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: ATCTGCACCA CCGGCAAGCT GCCCGTGCCC TGGCCCACCC TGGTC

Ox T": "---Fi I !

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: &bgr; ACCACCCTGA CCTACGGTGT GCAGTGCTTC TCCCGCTACC CCGACC

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 47 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA GGGCTAC 47

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 47 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

•&Ggr;

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ED NO: 7:

GTGCAGGAGC GCACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGCAACT ACAAGAC

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LGNGE: 45 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

CCGCGCCGAG GTCAAGTTCG AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCAT

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 45 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ DDNO: 9:

CGAGCTGAAG GGCATCGACT TCAAGGAGGA CGGCAACATC CTGGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 47 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

CCACAAGCTG GAGTACAACT ACAACTCCCA CAACGTGTAC ATCATGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 47 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREroUNG: SEQ ID NO: 11:

CCGACAAGCA GAAGAACGGC ATCAAGGTGA ACTTCAAGAT CCGCCAC

(2) ANGABEN ZU SEQ ED NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 45 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

••-_T-· · · · · T I &Lgr; &Lgr; ·

AACATCGAGG ACGGCTCCGT GCAGCTGGCC GACCACTACC AGCAG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ED NO: 13:

AACACCCCCA TCGGCGATGG CCCCGTGCTG CTGCCCGACA ACCACT

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

ACCTGTCCAC CCAGTCCGCC CTGTCCAAGG ACCCCAACGA GAAGCG

(2) ANGABEN ZU SEQ ED NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins,,ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

CGACCACATG GTCCTGCTGG AGTTCGTCAC CGCTGCCGGC ATCACC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

ACTCCAGCAG GACCATGTGG TCGCGCTTCT CGTTGGGGTC CTTGGA

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LGNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

CAGGGCGGAC TGGGTGGACA GGTAGTGGTT GTCGGGCAGC AGCACG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

r=·::· &ogr;&ogr;&khgr; &Ogr;": 7Ch ill

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

GGGCCATCGC CGATGGGGGT GTTCTGCTGG TAGTGGTCGG CCAGCT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

GCACGGAGCC GTCCTCGATG TTGTGGCGGA TCTTGAAGTT CACCTT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20: GATGCCGTTC TTCTGCTTGT CGGCCATGAT GTACACGTTG TGGGAG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

TTGTAGTTGT ACTCCAGCTT GTGGCCCAGG ATGTTGCCGT CCTCCT

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

TGAAGTCGAT GCCCTTCAGC TCGATGCGGT TCACCAGGGT GTCGCC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

JL

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ TD NO: 23:

CTCGAACTTG ACCTCGGCGC GGGTCTTGTA GTTGCCGTCG TCCTTG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGEE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

AAGAAGATGG TGCGCTCCTG CACGTAGCCC TCGGGCATGG CGGACT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LGNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO: 25:

TGAAGAAGTC GTGCTGCTTC ATGTGGTCGG GGTAGCGGGA GAAGCA 46

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

U C

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

CTGCACACCG TAGGTCAGGG TGGTGACCAG GGTGGGCCAG GGCACG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

GGCAGCTTGC CGGTGGTGCA GATGAACTTC AGGGTCAGCT TGCCGT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

AGGTGGCGTC ACCCTCACCC TCGCCGGAGA CGGAGAACTT GTGGCC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 46 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

GTTCACGTCG CCGTCCAGCT CCACCAGGAT GGGGACCACA CCGGTG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 50 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

TTACTTGTAC AGCTCGTCCA TGCCGTGGGT GATGCCGGCA GCGGTGACGA

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 717 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

Ui:

ATGTCCAAGG GCGAGGAGCT GTTCACCGGT GTGGTCCCCA TCCTGGTGGA GCTGGACGGC 60

GACGTGAACG GCCACAAGTT CTCCGTCTCC GGCGAGGGTG AGGGTGACGC CACCTACGGC ,120

AAGCTGACCC TGAAGTTCAT CTGCACCACC GGCAAGCTGC CCGTGCCCTG GCCCACCCTG 180

GTCACCACCT TCACCTACGG TGTGCAGTGC TTCTCCCGCT ACCCCGACCA CATGAAGCAG 240

CACGACTTCT TCAAGTCCGC CATGCCCGAG GGCTACGTGC AGGAGCGCAC CATCTTCTTC 300

AAGGACGACG GCAACTACAA GACCCGCGCC GAGGTCAAGT TCGAGGGCGA CACCCTGGTG 360

AACCGCATCG AGCTGAAGGG CATCGACTTC AAGGAGGACG GCAACATCCT GGGCCACAAG 420

CTGGAGTACA ACTACAACTC CCACAACGTG TACATCATGG CCGACAAGCA GAAGAACGGC 480

ATCAAGGTGA ACTTCAAGAT CCGCCACAAC ATCGAGGACG GCTCCGTGCA GCTGGCCGAC 540

CACTACCAGC AGAACACCCC CATCGGCGAT GGCCCCGTGC TGCTGCCCGA CAACCACTAC 600

CTGTCCACCC AGTCCGCCCT GTCCAAGGAC CCCAACGAGA AGCGCGACCA CATGGTCCTG 660

CTGGAGTTCG TCACCGCTGC CGGCATCACC CACGGCATGG ACGAGCTGTA CAAGTAA 717

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 30 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

·&ngr;·&khgr;

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

CCGCTCGAGA TGGCCAAGGG CGAGGAGCTG 3

(2) ANGABEN ZU SEQ ED NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LDNGE: 33 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKsLS: Sonstige Nucleins&ldquor;ure

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33: CGCGGATCCT TACTTGTACA GCTCGTCCAT GCC

Claims

1. Oligonukleotid zur Verwendung bei der Synthese eines modifizierten Genes für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea vicforea, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:

2. Algenadaptiertes Gen, kodierend für grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victorea, gekennzeichnet durch die folgende Sequenz: