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WO1999009180A2 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von guanosindiphosphat-6-desoxyhexosen und deren verwendung zur herstellung von oligosacchariden - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen herstellung von guanosindiphosphat-6-desoxyhexosen und deren verwendung zur herstellung von oligosacchariden Download PDF

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WO1999009180A2
WO1999009180A2 PCT/EP1998/005242 EP9805242W WO9909180A2 WO 1999009180 A2 WO1999009180 A2 WO 1999009180A2 EP 9805242 W EP9805242 W EP 9805242W WO 9909180 A2 WO9909180 A2 WO 9909180A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gdp
mannose
keto
deoxy
enzymes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1998/005242
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English (en)
French (fr)
Other versions
WO1999009180A3 (de
Inventor
Wolfgang Piepersberg
Jürgen Distler
Christoph Albermann
Wilhelm Tischer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
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Priority to JP2000509844A priority patent/JP2001514896A/ja
Publication of WO1999009180A2 publication Critical patent/WO1999009180A2/de
Publication of WO1999009180A3 publication Critical patent/WO1999009180A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins

Definitions

  • the present invention relates to a process for the enzymatic synthesis of guanosine diphosphate (GDP) -6-deoxyhexoses, for example GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose, GDP-L-fucose and GDP-L-perosamine, starting from simple nutrients or GDP-D-Mannose.
  • the method further relates to the use of GDP-6-deoxy-hexoses formed in microorganisms or in vitro for the synthesis of oligo- or polysaccharides by means of glycosyltransferases.
  • NDP nucleoside triphosphates
  • NDP-6-deoxyhexoses (mostly dTDP-, GDP- or CDP-activated hexose derivatives), is characterized by the loss of the 6-hydroxyl group and is incorporated in many modifications into many biological molecules with a characteristic function.
  • Typical representatives of this group of substances are L-fucose (from GDP-D-mannose), L-rhamnose (from dTDP-D-glucose) and 3,6-dideoxyhexoses of enterobacteria (e.g. D-colitose; from CDP-D- Glucose).
  • Sugar derivatives made from GDP-D-mannose are produced using numerous enzymes (approx. 30), many of which are end product-inhibited.
  • An advantage for the overproduction in a host organism are those enzymes which show only a weak or almost no end product inhibition, such as the ManB (phosphomannomutase), ManC (mannose-1-phosphate guanylyl transferase [GDP-mannose pyrophosphorylase or synthase] ) and Enzymes from the gram-negative bacterium Escherichia coli (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178 (16), 4885-4893, 1996).
  • GDP-L-fucose is produced from GDP-D-mannose in two to three successive enzymatic steps, as described by Chang et al. using the example of porcine salivary glands (J. Biol. Chem., 263, 1693-1697, 1988) and in analogy to the biosynthesis of L-rhamnose and L- (dihydro-) streptose in bacteria (Marumo, K. et al., Eur. J. Biochem. 204, 539-545, 1992; Verseck, S., Dissertation, Wuppertal, 1997). Reeves et al. (J. Bacteriol.
  • GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose, other deoxyhexoses are also likely to be derived, such as the transamination product GDP-D-perosamine. which is attributed to the presence of the rfbE gene in the enterobacterium Vibrio cholerae (Manning, PA et al., Gene 158, 1-7, 1995).
  • the direct production of L-fucose, D-perosamine and other derivatives of the GDP-6-deoxyhexose biosynthetic pathway from D-mannose is not possible in economically interesting amounts in the absence of the specific nucleotide group.
  • L-fucose and D-perosamine are important building blocks of extracellular polysaccharides, glycoproteins and other cell surface glycoconjugates, for example of tetrasaccharides. like Sialyl LewisX.
  • L-fucose and D-perosamine are important components of other natural products, such as the macrolide antibiotic perimycin. The transfer of the sugars from the GDP-activated precursors into such (pseudo) saccharidic end products usually takes place via specific glycosyltransferases.
  • Futl Flegel WA, Dissertation (2015) Ulm, 1998
  • Fut2 Korean, RJ et al., J. Biol. Chem. 270 (9), 4640-4649, 1995
  • Fut3 Fut3
  • various bacteria e.g. from Escherichia coli (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178 (16 ), 4885-4893 (1996)), from Yersinia enterocolitica (Zhang, L. et al., Mol. Microbiol.
  • the object of the invention was therefore to provide a simple process for the production of guanosine diphosphate (GDP) -6-deoxyhexose compounds consisting of as few steps as possible.
  • GDP guanosine diphosphate
  • the object is achieved by a process for the enzymatic production of a GDP-D-hexose, the starting compound being GDP-D-mannose or a compound which can be converted into GDP-D-mannose in the presence of one or more enzymes, the GDP-D-mannose.
  • 4,6-dehydratase (Gmd, RfbD) - and optionally GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4 reductase (WcaG) - or GDP-4-keto-6- have deoxy-D-mannose-4-aminotransferase (RfbE) activity, incubated and the desired product is isolated.
  • the enzymes required for the enzymatic synthesis are preferably obtained by cloning the genes or coding DNA fragments coding for these enzymes, insertion into one or more vector (s) and transformation into a bacterial or fungal host cell.
  • the method is particularly suitable for the preparative in vitro extraction and purification of GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose or GDP-L-fucose by overproduction of the corresponding biosynthetic enzymes in suitable host organisms, such as, for example, in E. coli.
  • the biosynthetic enzymes are phosphomannomutase (ManB), GDP-D-mannose synthesis (ManC or pyrophosphorylase.
  • Mannose-1-phosphate-guanyltransferase GDP-D-mannose-4,6-dehydratase (Gmd. RfbD) and / or GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-keto reductase (WcaG. or GDP-L-fucose synthase), which are preferably derived from E. coli (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178, 4885-4893. 1996).
  • the method according to the invention is suitable for the preparative production of GDP-D-perosamine, an overproduction of the GDP-D-perosamine synthase (RfbE, GDP-4-Kto-6-deoxy-D-mannose-4-aminotransferase) from Vibrio cholerase 01 occurs.
  • genes or DNA fragments coding for corresponding enzymes are preferred according to the invention: manB, manC, gmd, rfbD, rfbE and wcaG.
  • the genes or corresponding DNA regions are specifically amplified, for example using suitable primers in a PCR reaction, before they are used for expression.
  • suitable bacterial or fungal host organisms are, for example, E. coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium sp., Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Saccharromyces cerevisiae, Schizosaccharamyces pombe, Hansenula polymorpha and Pichia stipidis.
  • a preferred embodiment of the method is that first mannose-6-phosphate and GTP are incubated in the presence of phosphormannomutase (ManB) and GDP-D-mannose synthase (ManC), GDP-D-mannose is separated if necessary and used for further synthase and that desired subsequent product, for example GDP-L-fucose, is isolated.
  • ManB phosphormannomutase
  • ManC GDP-D-mannose synthase
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is when a buffer solution containing all the starting materials or substrates is continuously percolated over a solid carrier material on which the (synthesis) enzymes are immobilized.
  • Another object of the invention is a method for coupling the GDP-6 deoxyhexose produced according to the invention to glycosides. Oligosaccharides or polysaccharides in the presence of a protein having glycosyltransferase activity.
  • the invention relates to a process for L-fucosylation or D-perosaminylation by glycosyl transfer to suitable substrates and by providing sufficient amounts of GDP-activated hexose, such as GDP-L-fucose.
  • the glycosyl transfer is preferably carried out enzymatically, specifically by proteins which have fucosyl transferase and / or perosamine transferase activity.
  • the GDP-L-fucose can be used, for example, for the enzymatic synthesis of oligosaccharides, e.g. B of 2-fucosyl-beta-galactosides or 3-fucosyl-beta-N-acetylgalactosamines can be used by means of suitable fucosyltransferases; the GDP-D-perosamine can also be used for glycosylating suitable receptor molecules such as oligosaccharides or secondary metabolites (e.g. macrolides such as perimycin) using suitable glycosyltransferases, e.g.
  • the perosaminyltransferase from Vibrio cholerae 01 or other gram-negative or gram-positive bacteria be used.
  • the present invention relates. a process for the enzymatic production of guanosine diphosphate-D-mannose, guanosine-diphosphate-6-deoxy-D-hexose (e.g. GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose), guanosine diphosphate-6-deoxy-L-hexose ( e.g.
  • the invention is associated in particular with the advantage that GDP-activated sugars which have not previously been able to be produced in large quantities are now accessible on a preparative scale and that the building blocks obtained are further used for the in vitro or in vivo synthesis of valuable active ingredients can.
  • the method is characterized by the isolation of suitable genes from bacteria and their genetic incorporation into new recipient organisms, preferably under the control of suitable control elements (for example promoters) for stronger or controllable expression of the gene products, or in new metabolic relationships with other genes, in particular for the purposes mentioned and possible uses to be usable.
  • Figure 1 Enzymatic synthesis of GDP-ß-L-fucose and GDP-D-perosamine
  • Figure 2 Recombinant plasmid pCAW20.1
  • Figure 3 Recombinant plasmid pCAW19.1
  • Figure 4 Recombinant plasmid pCAW21.1
  • Figure 5 Recombinant plasmid pCAW22.1
  • Figure 6 Recombinant plasmid pCAW13.1
  • Figure 7 Recombinant plasmid pCAW14.1
  • Figure 8 Recombinant plasmid pCAW21.2
  • Figure 9 Recombinant plasmid pCAW22.2
  • E. coli DH5 ⁇ and E. coli BL21 were preferably incubated in LB medium (trypton 10 g / 1, yeast extract 5 g / 1, sodium chloride 5 g / 1) at 37 ° C. Plasmid-bearing bacteria were kept under selection pressure of antibiotics (ampicillin 100 ⁇ l / ml; chloramphenicol 30 ⁇ l / ml). The cultivation was carried out on a rotary shaker at 270 rpm. Approaches which were incubated for at least 12 h were referred to as overnight culture.
  • restriction endonucleases according to the manufacturer's instructions (Gibco BRL, Eggenstein) were used for the hydrolysis of vector DNA.
  • 5 U (Uni) of the respective restriction endonuclease were used and incubated at 37 ° C. for 2 h.
  • the same amount of restriction endonuclease was added a second time and incubated again for at least 1 h.
  • the digested DNA was electrophoresed using a 1% horizontal agarose gel. For elution, the gel pieces containing the DNA fragments were cut out with a sterile scalpel. The DNA fragments from the agarose were eluted according to the instructions using the JETsorb kit (Genomed, Bad Oeynhausen).
  • E. coli DH5 ⁇ cells For E. coli DH5 ⁇ cells, a 1.5 ml UN culture was grown at 37 ° C. in LB medium and harvested by centrifugation (5 min, 7000 rpm). The cell sediment was resuspended in 567 ul TE buffer and together with 30 ul SDS (10%), 20 ul lysozyme solution (20 mg / ml) and 3 ul Proteinase K (20 mg / ml) incubated for 1 h at 37 ° C. Then 100 ⁇ l of 5 M sodium chloride solution and 80 ⁇ l of CTAB solution (hexadecyltrimethylammonium bromide) were added and inverted several times and incubated at 65 ° C. for 10 min.
  • CTAB solution hexadecyltrimethylammonium bromide
  • the PCR is used for the specific in vitro multiplication of selected DNA areas.
  • Vent DNA polymerase was used for the reactions according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs, Schwalbach). The reaction was carried out in a thermal cycler (Biometra, Göttingen).
  • the vector pETl ⁇ b Due to its leader sequence (his), the vector pETl ⁇ b enables 12 histidine residues to be fused to the ⁇ -terminus of the overexpressed protein, which were a prerequisite for purification of the protein via an ⁇ i-agarose column.
  • His-Gmd or His-WcaG The recombinant proteins produced in this way are referred to below as His-Gmd or His-WcaG and the genes coding for them as his-gmd or as his-wcaG.
  • the fragments and vectors to be ligated were purified from the agarose gels by elution (Example 1). For ligations of D ⁇ A fragments with protruding ends ("sticky end"), the fragment to be ligated was used in a fourfold excess to the cut vector and incubated at RT with 1 U T4-D ⁇ A ligase for 4 h.
  • Transformation in E. coli cells The competent cells (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580, 1983) were thawed on ice and mixed with 2-20 ⁇ l DNA solution. After an incubation period of at least 30 min on ice, the cells were placed at 42 ° C. (heat shock) for 90 s and then on ice for at least 2 min. For regeneration, 800 ⁇ l SOC medium (2.0% tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 0.5% yeast extract, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM D-glucose) was added to the cells. Pipetted in and incubated at 37 ° C. for 45 min. From this cell suspension, 100-1000 ⁇ l were plated on selection agar plates and stored at 37 ° C.
  • the DNA sequencing was carried out with recombinant pETlla plasmids according to the method of Sanger et al. (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977).
  • Sanger et al. Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977.
  • A.L.F. Express Sequencer Pharmacia, Freiburg
  • the sequence reaction with fluorescein labeled "termi” and "promo'x primers and the Thermo Sequenase fluorescent labeled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP was carried out according to the manufacturer's instructions (Amersham, Braunschweig).
  • the gene products can preferably be overexpressed in E. coli BL21 (DE3) using a T7 RNA polymerase / promoter system (Studier et al. 1990).
  • the corresponding gene was cloned into the MCS of the vectors pETl ⁇ b and pETlla behind the ⁇ 10 promoter (see Example 4), which have a suitable SD sequence at an optimal distance from the start codon of the target gene.
  • the resulting recombinant plasmids were introduced into competent cells of the E. coli strain BL21 (DE3) by transformation.
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS LB medium (with ampicillin, chloramphenicol) was inoculated from a culture of the strain of the strain with the corresponding plasmid to an OD 540 nm of 0.05 and in a shaker at 37 ° C. up to one OD 540nm , incubated from 0.6-0.8.
  • the T7 RNA polymerase was induced by adding 1.0 mM isopropylthiogalactoside (IPTG). The cells are harvested 90 min after the addition of IPTG.
  • the cells were " harvested by centrifugation and washed twice with cell disruption buffer. 1.5 ml Cell disruption buffer added to 1.0 g cells. Two methods were used alternatively to disrupt the cells, the choice being based on how much buffer was required for resuspending. At a volume of less than 5 ml, the cells were disrupted using ultrasound, the cells being sonicated for 5 min (50 cycles, 15 s pulses and 15 s pause) and simultaneously cooled with an ice / water mixture. To check the completeness of the digestion, the extract was checked under a microscope.
  • the suspensions with the disrupted cells were centrifuged in the SS-34 rotor (Sorvall, DuPont. Bad Nauheim) between 30-45 min at 16000 rpm. whereby cell fragments sediment.
  • the enzyme proteins were prepared using conventional methods of enzyme preparation or alternatively as His-Tag fusion proteins (see Example 7) in a highly enriched form and preserved in a stable form.
  • the accumulation of recombinant proteins can preferably be made possible by a C- or N-terminal fusion with histidine-containing oligopeptides (Example 4).
  • the enrichment was carried out using the Ni-NTA agarose from Qiagen (Haan) and in accordance with the QIAexpress protocol. This affinity chromatography is based on the binding of the nickel ions of the Ni-NTA agarose with the His tag of the specially constructed, recombinant protein (His-Gmd, His-WcaG).
  • an FPLC system consisting of a Liquid Chromatography Controller (LCC-500 Plus, Pharmacia), two piston pumps (P500, Pharmacia), a flow UV monitor (UV-1, l 28 o nm> Pharmacia) ), a 2-channel recorder (Rec 482, Pharmacia) and a fraction collector (Frac 100, Pharmacia) were used.
  • LCC-500 Plus Liquid Chromatography Controller
  • P500, Pharmacia two piston pumps
  • a flow UV monitor UV-1, l 28 o nm> Pharmacia
  • Rec 482, Pharmacia 2-channel recorder
  • the electrophoresis was carried out using the SERVA Blue-Vertical 100 / C apparatus (BioRad. Kunststoff) (gel form, 80 x 100 x 0.75 mm).
  • the protein concentration of the samples to be analyzed was determined using the protein assay (BioRad, Kunststoff), a calibration line being established using BSA.
  • the "VIIL Dalton marker” (14.2 kDa - 66 kDa) from Sigma (Deisenhofen) served as the standard for the molecular weights of the separated proteins.
  • the phosphomannomutase activity was determined according to (Verseck. S. et al., Glycobiology ⁇ , 591-597, 1996).
  • the reaction was started by adding mannose-1-phosphate.
  • the course of the reaction was monitored spectroscopically at 30 ° C. by the extinction at ⁇ 340 nm .
  • the reaction was started by adding mannose-1-phosphate.
  • the decrease, at 37 ° C, of NADH was monitored spectroscopically at ⁇ 340nm .
  • the GDP-D-mannose-4.6-dehydratase activity was determined according to (Kornfeld et al ..
  • the reactions were started by adding the raw extract to be tested.
  • the amino acid L-glutamate was used as the amino donor.
  • the enzyme batch was incubated at 37 ° C. and the reaction was stopped by heating to 100 ° C. in a water bath for 1 min. After centrifuging the protein, the solution was subjected to HPLC analysis.
  • the respective overexpression clones are designated with RfbD, RfbE, ManB, ManC, WcaG and Gmd (see Example 6).
  • NADP 1 " oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • the GDP-4-keto-6-deoxymannose comes from the approach described in Example 11. Crude extracts from E. coli BL21 (DE3) / pLysS pCAW22.1 (WcaG) were used for the reactions. These batches were incubated at 37 ° C for 1 h. The reaction mixture was then cooled on ice and 150 ⁇ l of 0.3 M perchloric acid were added. The proteins thus precipitated were centrifuged at 30,000 g for h. The supernatant was then neutralized with 1 M potassium hydroxide.
  • the reaction is also achieved with immobilized enzymes, which are from the substrate and buffer solution, preferably at a temperature of 30-37 ° C. is washed around.
  • immobilized enzymes are e.g. achieved by binding the His-Taq fusion proteins (HisGmd, His-WcaG) to a Ni-NTA agarose column (Qiagen, Hilden) or by using a membrane reactor.
  • a Sephadex G-10 column (SR 25/100 column; Pharmacia. Freiburg) was used to desalt the fraction obtained after ion exchange chromatography.
  • the gel bed height was 81 cm and the total volume was 398 ml.
  • the GDP-activated hexose was detected using a UV monitor (Uvicord SII. I 254 nm , Pharmacia. Freiburg) and a 2-channel recorder (Rec 482, Pharmacia. Freiburg ).
  • the samples were collected with a fraction collector (Frac 100, Pharmacia, Freiburg).
  • the concentrated fraction of the anion exchange chromatography was applied to the column using a peristaltic pump (Pump Pl; Pharmacia, Freiburg) and a foot rate of 0.5 ml / min.
  • the fraction of the gel filtration was pumped at 10 ml / min onto the membrane anion exchange module Q15 (Sartorius, Göttingen) (Pump Pl; Pharmacia, Freiburg). Then the anion exchange module was rinsed with 20-50 ml of H 2 O and then the activated hexose was eluted from the membrane with 150 mM NaCl. The flow rate was 10 ml / min. This solution was then concentrated to 10-20 ml in a high vacuum (rotary vane vacuum pump RD4, Vakuubrand GmbH + Co, Wertheim) with stirring at approx. 25 ° C. After each run, the membrane was regenerated with 20-30 ml of 0.2 M NaOH and rinsed with H 2 0 until a neutral pH was measured.
  • High-pressure liquid chromatography was used to control the reaction and to analyze the nucleotide-activated sugars.
  • the HPLC separations were carried out using a device from Beckmann (Beckmann Instruments, Kunststoff), consisting of UV detector 166, pump module 125 and autosampler 502.
  • the following separation system Payne, SM and Arnes, BN, Anal. Biochem. 123, 151 -161, 1982) were used:
  • the GDP-activated sugars were identified by NMR spectroscopy.
  • the ⁇ , I3 C and 3I P spectra were recorded on a 400 MHz device (Bruker AC 400, Bruker-Franzen Analytik, Bremen).
  • the samples to be measured were dissolved in D 2 0.
  • the measurements were made at room temperature.
  • the ⁇ -NMR data of bis (triethylammonium) -ß-L-fucopyranosyl-guanosine-5'-pyrophosphate from chemical synthesis were available as a reference for GDP-ß-L-fucose (Schmidt, R. et al., Liebigs Ann. Chem., 121-124, 1991).
  • Cloned genes are cloned in vectors under the control of consumable or inducible promoters in a common transcription unit and in microorganisms, preferably E. coli, Slreptomyces sp. or Saccharomyces cerevisiae transformed.
  • the genes are preferred under the control of promoters with lower expression performance, e.g. lacP is cloned to ensure a consistently optimal synthesis of the enzymes in a fermenter culture or a reactor with immobilized cells.
  • the natural genes with their own promoters are used.
  • the activated sugars are applied intracellularly with the aid of suitable glycosyltransferases e.g.
  • WcbH galactoside-2-L-fucosyltransferase
  • Yersinia enterocolitica or from Escherichia coli (RffT) on suitable substrates e.g. Transfer ⁇ -galactosides that are either produced biosynthetically in the host cell or added from outside.

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Abstract

Vefahren zur enzymatischen präparativen Herstellung von GDP-6-Desoxyhexosen aus GDP-D-Mannose, Mannose-1-phosphat oder Mannose-6-phosphat in Gegenwart geeigneter Enzyme wie einer GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase und gegebenenfalls einer GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase oder einer GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-4-reduktase und Verfahren zur Kopplung der erhaltenen GDP-aktivierten Hexosen mittels Glycosyltransferasen, z.B. Fucsyltransferasen an Oligo- oder Polysacchariden.

Description

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Guanosindiphosphat-6-desoxyhexosen und deren Verwendung zur Herstellung von Oligosacchariden
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Guanosin- diphosphat (GDP)-6-desoxyhexosen, beispielsweise GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose, GDP-L- Fucose und GDP-L-Perosamin, ausgehend von einfachen Nährstoffen bzw. von GDP-D-Man- nose. Das Verfahren betrifft weiterhin die Verwendung von in Mikroorganismen bzw. in vitro gebildeten GDP-6-Desoxy-hexosen zur Synthese von Oligo- oder Polysacchariden mittels Gly- cosyltransferasen.
In der Natur in großer Menge auftretende einfache Hexosen, beispielsweise D-Glucose, D-Glu- cosamin, D-Mannose und D-Galactose, werden in Oligo- oder Polysaccharide eingebaut, indem sie zunächst mittels Nucleosidtriphosphaten (NTP) zu NDP-Hexosen (UDP-, dTDP-, GDP-, CDP-Hexosen) aktiviert werden und anschließend durch spezifische Glycosyltransferasen auf entsprechende Vorläufermoleküle übertragen werden. Vielfach werden aber diese einfachen Zucker zunächst noch biosynthetisch zu sekundär veränderten NDP-aktivierten Hexosederivaten umgesetzt. Eine große Gruppe dieser Zuckermoleküle, NDP-6-Desoxyhexosen (meist dTDP-, GDP- oder CDP-aktivierte Hexosederivate), ist durch den Verlust der 6-Hydroxylgruppe gekennzeichnet und wird in vielerlei Abwandlungen in viele biologische Moleküle mit charakteristischer Funktion eingebaut. Typische Vertreter dieser Stoffgruppe sind die L-Fucose (aus GDP-D-Mannose), die L-Rhamnose (aus dTDP-D-Glucose) und die 3,6-Didesoxyhexosen der Enterobakterien (z.B. D-Colitose; aus CDP-D-Glucose). Aus GDP-D-Mannose hergestellte Zuckerderivate, wie z.B. L-Fucose und D-Perosamin, werden über zahlreiche Enzyme (ca. 30) hergestellt, die vielfach Endprodukt-gehemmt sind. Einen Vorteil für die Überproduktion in einem Wirtsorganismus stellen dabei solche Enzyme dar, die nur eine schwache oder so gut wie keine Endprodukthemmung zeigen, wie z.B. die ManB (Phospomannomutase), ManC (Mannose- 1-phosphat Guanylyltransferase [GDP-Mannose Pyrophosphorylase oder Synthase]) und Enzyme aus dem gram-negativen Bakterium Escherichia coli (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178(16),4885-4893,1996).
Der Biosyntheseweg der 6-Desoxyhexosen startet typischerweise mit einer Dehydratisierungs- reaktion katalysiert durch eine NAD(+)-abhängige NDP-Hexose-4,6-Dehydratase, wodurch eine NDP-6-Desoxy-D-4-hexulose entsteht (Abbildung 1 ; Piepersberg. W., Crit. Rev. Biotechnol. 14, 251-285, 1994; Liu, H.-W. und Thorson, J.S., Ann. Rev. Microbiol. 48, 223-256, 1994; Piepersberg, W. und Distler, J. In: Biotechnology (2nd Ed.), Vol. 7, Products of Secondary Metabolism (Rehm, H.-J., Reed, G., Pühler, A., Stadler, P., Eds.), S. 397-488. 1997). Weitere Modifikationsreaktionen können sich auf der Stufe der D-Konfiguration abspielen und verwenden beispielsweise die 4-Ketoverbindung entweder zur Transaminierung, Dehydroxylierung der benachbarten 3 -Hy droxygruppe über eine Dehydrasereaktion oder zur enantioselektiven Reduktion zur 4-Hy- droxygruppe. Andere Biosynthesewege wandeln die NDP-6-Desoxy-D-4-hexulose zunächst über eine Epimerasereaktion in eine NDP-6-Desoxy-L-4-hexulose um. wobei meist neben der Position 5 gleichzeitig die Position 3 der Hexose in ihrer Stereospezifität umgekehrt wird (Abbildung 1).
Die direkte Herstellung von Fucose ausgehend von Mannose kann im Stoffwechsel nur in der Nukleotid-aktivierten Form erfolgen. Die biosynthetischen Enzyme sind daher auf eine Aktivierung, d. h. den Nukleotidteil, angewiesen. Die Biosynthese anderer sekundärer, d. h. stark modifizierter Zucker erfolgt ebenfalls in der Nukleotid-aktivierten Form, wie am Beispiel der dTDP-L-Rhamnose gezeigt wurde (DE 195 37 217.4; Verseck, S.. Dissertation, Universität Wuppertal. 1997). Dabei stellt dTDP-6-Desoxy-D-xylo-4-hexulose ein Zwischenprodukt des Biosyntheseweges dar. Die enzymatische Synthese und Isolierung dieser Substanz wurde ebenfalls beschrieben (Marumo, K. et al, Eur. J. Biochem. 204, 539 - 545, 1992).
Aus GDP-D-Mannose wird beispielsweise GDP-L-Fucose in zwei bis drei aufeinanderfolgenden enzymatischen Schritten hergestellt, wie von Chang et al. am Beispiel der Schweine-Speicheldrüsen gezeigt wurde (J. Biol. Chem., 263, 1693-1697, 1988) und in Analogie zur Biosynthese der L-Rhamnose und der L-(Dihydro-)Streptose in Bakterien (Marumo, K. et al., Eur. J. Biochem. 204, 539 - 545, 1992; Verseck, S., Dissertation, Wuppertal, 1997) angenommen wurde. Reeves et al. (J. Bacteriol. 178, 4885-4893, 1996) nehmen aufgrund der genetischen Hin- weise in Escherichia coli an, daß die beiden Gene gmd (GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase) und wcaG (GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose 3,5-EpimeraseII-4-Ketoreduktase) im Gencluster für die Synthese der Colansäure ausreichen, um die Umsetzung zur GDP-L-Fucose zu bewerkstelligen. Folglich wären im Gegensatz zur Synthese von dTDP-L-Rhamnose aus dTDP-D-Glucose für die GDP-L-Fucose-Synthese aus GDP-D-Mannose zwei anstatt drei Enzyme ausreichend (Marumo, K. et al., Eur. J. Biochem. 5 204, 539 - 545, 1992; Verseck, S., Dissertation, Wuppertal, 1997). Darüber hinaus beschreiben Chang et al. (J. Biol. Chem.. 263, 1693-1697. 1988) bereits die Umwandlung von GDP-D-Mannose mittels einer spezifischen Dehydratase in zunächst GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose, die anschließend mittels eines Epimerase- und Keto- reduktase-Aktivität aufweisenden Enzyms zu GDP-L-Fucose umgesetzt wird. Von dem gemeinsamen Zwischenprodukt. GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose, leiten sich darüber hinaus wahrscheinlich andere Desoxyhexosen ab, wie z.B. das Transaminierungsprodukt GDP-D-Perosamin. das auf die Gegenwart des Gens rfbE in dem Enterobakterium Vibrio cholerae zurückgeführt wird (Manning, P.A. et al., Gene 158, 1-7, 1995). Die direkte Herstellung von L-Fucose, D-Pero- samin und anderen Abkömmlingen des GDP-6-Desoxyhexose-Biosyntheseweges ausgehend von D-Mannose ist dagegen in Abwesenheit der spezifischen Nukleotidgruppe nicht in wirtschaftlich interessanten Mengen möglich.
L-Fucose und D-Perosamin sind wichtige Bausteine von extrazellulären Polysacchariden, Gly- coproteinen und anderen Zelloberflächen-Glycokonjugate, beispielsweise von Tetrasacchariden. wie Sialyl LewisX. Darüber hinaus sind L-Fucose und D-Perosamin wichtige Bestandteile von anderen Naturstoffen, wie beispielsweise des Macrolid- Antibiotikums Perimycin. Die Übertragung der Zucker aus den GDP-aktivierten Vorstufen in solche (pseudo-)saccharidischen Endprodukte erfolgt in der Regel über spezifische Glycosyltransferasen. Es sind vielerlei Quellen für Fucosyltransferasen, einschließlich humaner Proben bekannt: Futl (Flegel W. A., Dissertation Universität Ulm, 1998, Fut2 (Kelly, R.J. et al., J. Biol. Chem. 270 (9), 4640-4649, 1995) oder Fut3 (Cameron, H.S. et al., J. Biol. Chem. 270 (34), 20112-20122. 1995) und verschiedene Bakterien, z.B. aus Escherichia coli (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178 (16), 4885-4893 (1996)), aus Yersinia enterocolitica (Zhang, L. et al., Mol. Microbiol. 23, 63-76, 1997) oder aus Helicobacter pylori (Martin, S.L., Glycobiology (im Druck)). Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, aus möglichst wenigen Schritten bestehendes Verfahren zur Herstellung von Guanosindiphosphat (GDP)-6-Desoxyhexose-Ver- bindungen zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung einer GDP-D- hexose, wobei als Ausgangsverbindung GDP-D-Mannose oder eine in GDP-D-Mannose überführbare Verbindung in Gegenwart eines Enzyms oder mehrerer Enzyme, die GDP-D-Mannose- 4,6-dehydratase (Gmd, RfbD)- und gegebenenfalls GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epi- merase-4 Reduktase (WcaG)- oder GDP-4-Keto-6-desoxy-D-Mannose-4-Aminotransferase (RfbE) -Aktivität aufweisen, inkubiert und das gewünschte Produkt isoliert wird. Die für die enzymatische Synthese erforderlichen Enzyme werden erfindungsgemäß bevorzugt durch Klo- nierung der für diese Enzyme kodierenden Gene bzw. kodierende DNA-Fragmente, Insertion in einen oder mehrere Vektor(en) und Transformation in eine bakterielle oder pilzliche Wirtszelle gewonnen. Insbesondere ist das Verfahren zur präparativen in vitro-Gewinnung und Aufreinigung von GDP-4-Keto-6-desoxy-D-Mannose bzw. GDP-L-Fucose durch Überproduktion der entsprechenden Biosyntheseenzyme in geeignete Wirtsorganismen, wie beispielsweise in E. coli geeignet. Bei den Biosyntheseenzymen handelt es sich um Phosphomannomutase (ManB), GDP- D-Mannose-Synthese (ManC oder Pyrophosphory läse. Mannose-1 -Phosphat-Guanyltransferase), GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase (Gmd. RfbD) und/oder GDP-4-Keto-6-desoxy-D-Mannose- 3, 5 -epimerase-4-keto reduktase (WcaG. oder GDP-L-Fucose-Synthase), die vorzugsweise aus E. coli stammen (Stevenson, G. et al., J. Bacteriol. 178. 4885-4893. 1996).
Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren zur präparativen Herstellung von GDP-D-Perosamin geeignet, wobei eine Überproduktion er GDP-D-Perosamin-Synthase (RfbE, GDP-4-Kto-6- desoxy-D-Mannose-4-Aminotransferase) aus Vibrio cholerase 01 erfolgt.
Demzufolge sind erfindungsgemäß die folgenden Gene bzw. für entsprechende Enzyme kodierende DNA-Fragmente bevorzugt: manB, manC, gmd, rfbD, rfbE und wcaG. Falls erforderlich werden die Gene bzw. entsprechende DNA-Bereiche spezifisch amplifiziert, z.B. durch geeignete Primer in einer PCR-Reaktion, bevor sie zur Expression eingesetzt werden. Geeignete bakterielle bzw. pilzliche Wirtsorganismen sind beispielsweise E. coli, Bacillus sub- tilis, Corynebacterium sp., Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Saccharromyces cerevisiae, Schizosaccharamyces pombe, Hansenula polymorpha und Pichia stipidis.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist, daß zunächst Mannose-6-phosphat und GTP in Gegenwart von Phosphormannomutase (ManB) und GDP-D-Mannose-Synthase (ManC) inkubiert, GDP-D-Mannose gegebenenfalls separiert sowie zur weiteren Synthase eingesetzt und das gewünschte Folgeprodukt, beispielsweise GDP-L-Fucose, isoliert wird.
Ferner stellt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, wenn eine sämtliche Ausgangsstoffe bzw. Substrate enthaltene Pufferlösung über ein festes Trägermaterial, an welchem die (Synthese-)Enzyme immobilisiert sind, kontinuierlich perkoliert wird.
Darüber hinaus hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn das Verfahren im Batch- Prozeß bzw. in einem Enzym-Membran-Reaktor kontinuierlich durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kopplung der erfindungsgemäß hergestellten GDP-6-Desoxyhexose an Glykoside. Oligo- oder Polysaccharide in Gegenwart eines Glycosyltransferase-Aktivität aufweisenden Proteins. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur L-Fucosylierung bzw. D-Perosaminylierung durch Glycosyltransfer auf geeignete Substrate und durch Bereitstellung ausreichender Mengen an GDP-aktivierter Hexose, wie beispielsweise GDP-L-Fucose. Der Glycosyltransfer erfolgt bevorzugt enzymatisch und zwar durch Proteine, die Fucosyltransferase- und/oder Perosamintransferase-Aktivität aufweisen.
Die GDP-L-Fucose kann beispielsweise zur enzymatischen Synthese von Oligosacchariden, z. B von 2-Fucosyl-beta-Galactosiden oder 3-Fucosyl-beta-N-Acetylgalactosaminen, mittels geeigneter Fucosyltransferasen eingesetzt werden; das GDP-D-Perosamin kann ebenfalls zur Glyco- sylierung geeigneter Rezeptormoleküle wie Oligosaccharide oder Sekundärmetabolite (z.B. Makrolide wie z.B. Perimycin) mittels geeigneter Glycosyltransferasen, z.B. die Perosaminyl- transferase aus Vibrio cholerae 01 bzw. anderer gram-negativen oder gram-positiven Bakterien, verwendet werden. Somit betrifft die vorliegende Erfindung neben einem Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Enzymen zur Biosynthese und Übertragung (Glycosyltransferasen) von GDP-Hexosen. ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Guanosindiphosphat-D-Mannose, Guanosindi- phosphat-6-desoxy-D-hexulosen (z.B. GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose), Guanosindiphosphat- 6-desoxy-L-hexosen (z.B. GDP-L-Fucose) und Guanosindiphosphat-4,6-didesoxy-D-hexosamine (z.B. GDP-D-Perosamin). Die Erfindung ist insbesondere mit dem Vorteil verbunden, daß durch bisher nicht in größeren Mengen herstellbare GDP-aktivierte Zucker nunmehr in präparativem Maßstab zugänglich sind und daß darüber hinaus die gewonnenen Bausteine zur in- vitro- oder in-vivo-Synthese von wertvollen Wirkstoffen weiterverwendet werden können. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch Isolierung von geeigneten Genen aus Bakterien und deren genteclmischen Einbau in neue Empfängerorganismen, bevorzugt unter Kontrolle geeigneter Kontrollelemente (z.B. Promotoren) zur stärkeren oder steuerbaren Expression der Genprodukte, oder in neue Stoffwechselbeziehungen mit anderen Genen, um so für die genannten Zwecke und Nutzungsmöglichkeiten verwertbar zu werden.
Legenden zu den Abbildungen
Abbildung 1 Enzymatische Synthese von GDP-ß-L-Fucose und GDP-D-Perosamin Abbildung 2 Rekombinantes Plasmid pCAW20.1 Abbildung 3 Rekombinantes Plasmid pCAW19.1 Abbildung 4 Rekombinantes Plasmid pCAW21.1 Abbildung 5 Rekombinantes Plasmid pCAW22.1 Abbildung 6 Rekombinantes Plasmid pCAW13.1 Abbildung 7 Rekombinantes Plasmid pCAW14.1 Abbildung 8 Rekombinantes Plasmid pCAW21.2 Abbildung 9 Rekombinantes Plasmid pCAW22.2
Im folgenden wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben. Beispiel 1
Anzucht von E- coli-Stümmen, Präparation der Plasmid-DNA und Isolierung von DNA-Fragmenten
E. coli DH5α und E .coli BL21(DE3) wurden vorzugsweise in LB-Medium (Trypton 10 g/1, Hefeextrakt 5 g/1, Natriumchlorid 5 g/1) bei 37 °C bebrütet. Plasmid-tragende Bakterien wurden unter Selektionsdruck von Antibiotika gehalten (Ampicillin 100 μl/ml; Chloramphenicol 30 μl/ml). Die Kultivierung erfolgte auf einem Rundschüttler bei 270 rpm. Als Übernachtkultur wurden Ansätze bezeichnet, die mindestens 12 h bebrütet wurden.
Für die Präparation von Plasmid-DNA wurden die Zellen aus einer 1 ,5 ml Übernachtkultur, unter Selektionsdruck bebrütet, eingesetzt. Die Isolierung der Plasmide erfolgte nach der Methode der alkalischen SDS-Lyse (Birnboim, H.C., Doly, J., Nucleic Acid Res. 7, 1513, 1979).
Zur Hydrolyse von Vektor-DNA wurden ausschließlich Restriktionsendonukleasen nach Vorschrift des Herstellers (Gibco BRL, Eggenstein) eingesetzt. Zur Restriktion von 10 μg Plasmid- DNA wurden 5 U (Unis) der jeweiligen Restriktionsendonuklease eingesetzt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten wurde die gleiche Menge Restriktionsendonuklease ein zweites Mal zugegeben und wiederum wenigstens für 1 h inkubiert.
Die gespaltete DNA wurde mit Hilfe eines l%igen horizontalen Agarosegel elektrophoretisch getrennt. Zur Elution wurden die Gelstücke, welche die DNA-Fragmente enthielten, mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Die Elution der DNA-Fragmente aus der Agarose erfolgte nach Vorschrift mit dem JETsorb-Kit (Genomed, Bad Oeynhausen).
Beispiel 2
Isolierung von chromosomaler DNA (modifiziert, Pospiech, A., Neumann, B., TIG 1 1, 217-218, 1995)
Für E. coli DH5α-Zellen wurde eine 1,5 ml UN-Kultur bei 37 °C in LB-Medium angezogen und durch Zentrifugation (5 min, 7000 rpm) geerntet. Das Zellsediment wurde in 567 μl TE-Puffer resuspendiert und zusammen mit 30 μl SDS (10%), 20 μl Lysozym-Lösung (20 mg/ml) und 3 μl Proteinase K (20 mg/ml) für 1 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurden 100 μl 5 M Natriumchlorid-Lösung und 80 μl CTAB-Lösung (Hexadecyltrimethylammonium-bromid) zugegeben und mehrfach invertiert und bei 65°C für 10 min inkubiert. Nach der Zugabe von 800 μl Chloroform /Isoamylalkohol wurde 5 min zentrifugiert (3000 rpm) und die wässrige Phase in einem neuen Gefäß mit dem selben Volumen Phenol/Chloroform vermischt. Durch Zentrifugation wurden die Phasen erneut getrennt und die wässrige Phase mit 0,6 Volumenteilen 2-Propanol zusammengegeben und die gefällte DNA abzentrifugiert. Die DNA wurde einmal mit 1 ml Ethanol (70%) gewaschen und nach dem Trocknen bei RT in 100 μl TE-Puffer (Tris/HCl pH8 10 mM, EDTA 1 mM) resuspendiert.
Beispiel 3
Polymerase-Ketten-Reaktion
Die PCR dient der spezifischen in-vitro-Vermehrung ausgesuchter DNA-Bereiche.
Für die Reaktionen wurde Vent-DNA-Polymerase nach Angaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach) eingesetzt. Durchgeführt wurde die Reaktion in einem Thermocycler (Biometra, Göttingen).
Die Amplifikation eines DNA-Abschnittes mittels der PCR-Technik (Polymerase Chain Reac- tion, Saiki et al.. 1985) wurde in einem 100 μl Standardansatz durchgeführt (Tab. l .
Tabelle 1
Zusammensetzung der PCR-Ansätze
Figure imgf000011_0001
*Die Primer wurden, bevor sie in die PCR eingesetzt wurden. 1 : 10 verdünnt. Die Konzentration entsprach im PCR- Ansatz - 50 pmol/100 μl. OD260 = 1 ,0/100 μl = 100 pmol. Das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes betrug jeweils 100 μl und wurde mit 60 μl sterilem Mineralöl überschichtet.
Die PCR-Ansätze zur Amplifikation bestimmter DNA-Bereiche wurden den tabellarisch aufgeführten Temperaturprogrammen (Tab. 2) unterzogen.
Tabelle 2
Zusammenfassung der PCR-Programm-Daten
Figure imgf000011_0002
* Die Temperaturänderung (ramping rate) zwischen den einzelnen Schritten betrug 2 °C/s. ** Die Zugabe der Polymerase erfolgte nach einem "hot start" während des ersten 95°C-
Schrittes.
Der PCR-Programmverlauf wurde so gewählt das die Schritte 2 - 4 in einem Durchlauf 6 mal, und die Schritte 5 - 7 30 mal wiederholt wurden.
Tabelle 3: Verwendete PCR-Primer
Figure imgf000012_0001
* Neu gebildete Schnittstellen sind in der Tabelle angegeben und in der Nucleotidsequenz unterstrichen.
Beispiel 4
Klonierung der Leserahmen von manB, manC, gmd, rfl>D, rfbE und wcaG in Expressionsvektoren
Für die Überexpression von ManB, ManC, Gmd, RfbD, RfbE μnd WcaG in E. coli wurden die durch PCR isolierten Leserahmen in Expressionsvektoren kloniert. In diesem Fall wurden hierfür vorzugsweise die Expressionsvektoren pETlla und pET16b der Firma Novagen (Studier. F. W., et al., Methods Enzymol. 189, 113-130, 1990) ausgewählt. Bei diesen Vektorn handelt es sich um starke Klonierungs- und Expressionssysteme für rekombinante Proteine in E. coli.
Für die Klonierung in die Vektoren wurde diese mit Hilfe der Hydrolyse durch die Restriktions- endonucleasen Ndel bzw. Ncol und BamHl linearisiert. Die mit Ndel bzw. Ncol und Bg/II bzw. BamHl hydrolysierten Fragmente der PCR-Produkte von manB, manC, gmd und wcaG wurden in die zuvor Ndel bzw. Νcol und BamHl hydrolysierten Expressionsvektoren liniert (pCAW13.1 ( O); pCAW14.1 (rfbE); pCAW19.1 (manB); pCAW20.1 (manC); pCAW21.1 (gmd); pCAW22.1 (wcaG); pCAW21.2 (his-gmd); pCAW22.2 (his-wcaG), siehe Fig. 2-9) und in E. coli transformiert. Durch die Klonierung in die Ndel bzw. die Ncol-Schnittstelle der pET- Vektoren wurde sichergestellt, daß das Startcodon erhalten bleibt und im optimalen Abstand zur Shine-Dalgarno Sequenz auf dem Vektor liegt.
Der Vektor pETlόb ermöglicht durch seine leader Sequenz (his) eine Fusion von 12 Histidin- resten an den Ν-Terminus des überexprimierten Proteins, welche eine Voraussetzung für eine Aufreinigung des Proteins über eine Νi-Agarose-Säule waren. Die auf diese Weise entstandenen rekombinanten Proteine werden im Folgenden als His-Gmd bzw. als His-WcaG und die für diese codierenden Gene als his-gmd bzw. als his-wcaG bezeichnet.
Ligation: Die zu ligierenden Fragmente und Vektoren wurden durch Elutionen (Beispiel 1) aus den Agarosegelen aufgereinigt. Bei Ligationen von DΝA-Fragmenten mit überstehenden Enden ("sticky end") wurde das zu ligierende Fragment im vierfachen Überschuß zum geschnittenen Vektor eingesetzt und bei RT mit 1 U T4-DΝA-Ligase für 4 h inkubiert.
Transformation bei E. coli Zellen: Die kompetenten Zellen (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166. 557- 580, 1983) wurden auf Eis aufgetaut und mit 2-20 μl DNA-Lösung versetzt. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 30 min auf Eis wurden die Zellen für 90 s auf 42 °C (Hitzeschock) und danach mindestens 2 min auf Eis gestellt. Zur Regenerierung wurde zu den Zellen 800 μl SOC- Medium (2,0% Trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM D-Glucose) zupipettiert und 45 min bei 37 °C inkubiert. Von dieser Zellsuspension wurden 100-1000 μl auf Selektionsagarplatten ausplattiert und ÜN bei 37 °C gelagert. Beispiel 5
DNA-Sequenzierung
Die DNA- Sequenzierung, der isolierten Leserahmen, erfolgte mit rekombinanten pETlla-Plas- miden nach der Methode von Sanger et al. (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467, 1977). Für die automatisierte Sequenzanalyse mit dem A.L.F. Express Sequenzierer (Pharmacia, Freiburg) wurde die Sequenzreaktion mit Fluorescein markierten "termi"- und "promo'xPrimern und dem Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit mit 7-deaza-dGTP entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Amersham, Braunschweig) durchgeführt.
termi-Primer 5' GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG 3' promo-Primer 5'GAAATAAATACGACTCACTATAGGG 3'
Beispiel 6
Überexpression von ManB, ManC, Gmd, RfbD, RfbE. WcaG. His-Gmd und His-WcaG
Die Genprodukte lassen sich vorzugsweise mit Hilfe eines T7-RNA-Polymerase/Promotor- Systems in E. coli BL21 (DE3) überexprimieren (Studier et al.. 1990). Dazu wurde hinter dem φlO Promotor das entsprechende Gen in die MCS der Vektoren pETl όb bzw. pETlla kloniert (s. Beispiel 4), die eine geeignete SD-Sequenz im optimalen Abstand zum Startcodon des Zielgens besitzen. Die entstandenen rekombinanten Plasmide wurden durch Transformation in kompetente Zellen des E. coli Stamms BL21 (DE3) eingebracht.
Überexpression in E. coli BL21 (DE3) pLysS: Von einer ÜN-Kultur des Stammes mit entsprechendem Plasmid wurde LB-Medium (mit Ampicillin, Chloramphenicol) auf eine OD540nm von 0,05 angeimpft und im Schüttler bei 37 °C bis zu einer OD540nm, von 0,6-0,8 inkubiert. Durch Zugabe von 1,0 mM Isopropylthiogalaktosid (IPTG) wurde die T7-RNA-Polymerase induziert. 90 min nach Zugabe von IPTG w irden die Zellen geerntet.
Für Proteinextrakte aus E. coli Uberexpressionsklonen wurden" die Zellen durch Abzentrifugieren geerntet und zweimal mit Zellaufschlußpuffer gewaschen. Zum Resuspendieren wurden 1 ,5 ml Zellaufschlußpuffer auf 1 ,0 g Zellen gegeben. Zum Aufschließen der Zellen wurden zwei Methoden alternativ verwendet, wobei sich die Wahl danach richtete, wieviel Puffer zum Resuspendieren nötig war. Bei einem Volumen von weniger als 5 ml wurden die Zellen mit Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen, wobei die Zellen 5 min mit Ultraschall (50 Zyklen, 15 s Pulsen und 15 s Pause) beschallt und gleichzeitig mit einer Eis/Wasser-Mischung gekühlt wurden. Zur Kontrolle der Vollständigkeit des Aufschlusses wurde der Extrakt unter dem Mikroskop überprüft.
Wenn die Zellen in einem Volumen von mehr als 5 ml Aufschlußpuffer resuspendiert wurden. konnten sie zweimal mit 1300 psi durch eine French-Press (American Instrument Company, Maryland, USA) aufgeschlossen werden.
Die Suspensionen mit den aufgeschlossenen Zellen wurden im SS-34 Rotor (Sorvall, DuPont. Bad Nauheim) zwischen 30 - 45 min bei 16000 rpm zentrifugiert. wobei Zellbruchstücke sedi- mentieren. Die Enzymproteine wurden mit klassischen Methoden der Enzympräparation oder alternativ als His-Tag-Fusionsproteine (s. Beispiel 7) in hochangereicherter Form präpariert und in stabiler Form konserviert.
Tabelle 4
Daten der Gene und der erwarteten Genprodukte
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Beispiel 7
Aufreinigung von rekombinanten Proteinen
Die Anreicherung von rekombinanten Proteinen läßt sich vorzugsweise durch eine C- oder N-ter- minal Fusion, mit Histidin-haltigen Oligopeptiden ermöglichen (Beispiel 4). Mit Hilfe der Ni- NTA-Agarose der Firma Qiagen (Haan) und in Anlehnung an das QIAexpress-Protokoll wurde die Anreicherung durchgeführt. Diese Affinitätschromatographie beruht auf der Bindung der Nickel-Ionen der Ni-NTA-Agarose mit dem His-Tag des speziell konstruierten, rekombinanten Proteins (His-Gmd, His-WcaG). Für die Aufreinigung wurde eine FPLC-Anlage, die aus Liquid Chromatography Controller (LCC-500 Plus, Firma Pharmacia), zwei Kolbenpumpen (P500, Firma Pharmacia), einem Durchfluß UV-Monitor (UV-1, l28onm> Firma Pharmacia), einem 2- Kanal-Schreiber (Rec 482, Firma Pharmacia) und einem Fraktionssammler (Frac 100, Firma Pharmacia) bestand benutzt.
Beispiel 8
Gelelektrophoretische Darstellung von Proteinen
Denaturierende Trennung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen und deren Färbung mit dem Coomassie-Farbstoff
Tabelle 5
Zusammensetzung eines Acrylamid/Bisacrylamid-Proteingels
Figure imgf000016_0001
Die Elektrophorese erfolgte mit der SERVA Blue-Vertical 100/C Apparatur (BioRad. München) (Gelform, 80 x 100 x 0,75 mm ). Die Bestimmung der Proteinkonzentration der zu analysierenden Proben erfolgte mit dem Protein- Assay (BioRad, München), wobei mit BSA eine Eichgerade erstellt wurde. Als Standard für die Molekulargewichte der getrennten Proteine diente der "VIIL Dalton-Marker" (14,2 kDa - 66 kDa) von Sigma (Deisenhofen).
Beispiel 9
Bestimmung von Enzym-Aktivitäten
Bestimmung der Phosphomannomutase- Aktivität
Die Bestimmung der Phosphomannomutase-Aktivität erfolgte nach (Verseck. S. et al., Glyco- biology ό, 591-597, 1996).
Enzymansatz:
Tris/CHl, pH 8,0 50 mM
MgCl2 10 mM
NADP+ 1 mM
Glucose- 1 ,6-bisphosphat 0,25 mM
Mannose- 1 -phosphat I mM
Rohextr. ManB variabel
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 0,5 U/ml
Phosphomannose-Isomerase 0,5 U/ml
Phosphoglucose-Isomerase 0,5 U/ml
Endvolumen 500 μl
Die Reaktion w irde durch Zugabe von Mannose-1-phosphat gestartet. Der Reaktionsverlauf wurde, bei 30 °C, durch die Extinktion bei λ340nm spektroskopisch verfolgt.
Bestimmung der-GDP-D-Mannosepyrophosphorylase-Aktivität
Die Bestimmung der GDP-D-Mannosepyrophosphorylase-Aktivität erfolgte mit dem PP,-Rea- genz von Sigma (Deisenhofen). Enzymansatz:
PPrReagenz 170 μl
Tris/HCl, pH 8,0 50 mM
MgCl2 lO mM
GTP 2 mM
Mannose-1-phosphat 10 mM
Rohextr. ManC variabel
Endvolumen 500 μl
Die Reaktion wurde durch Zugabe von Mannose-1-phosphat gestartet. Die Abnahme, bei 37 °C, von NADH wurde spektroskopisch bei λ340nm verfolgt. Der molare Extinktionskoeffizient für NADH2 betrug ε340 = 6.22 x 10" l/(mol x cm).
Bestimmung der GDP-D-Mannose-4.6-Dehydratase-Aktivität
Die Bestimmung der GDP-D-Mannose-4.6-Dehydratase-Aktivität erfolgte nach (Kornfeld et al..
1965).
Enzymansatz:
Tris/HCl, pH 7,5 50 mM
GDP-D-Mannose 4 mM
Rohextr. Gmd bzw. RfbD variabel
Endvolumen 300 ml
Es wurden zu definierten Zeiten 50 μl Probe entnommen, zu 950 μl 1 N NaOH gegeben und weitere 20 min bei 37 °C inkubiert. Die Messung der Extinktion erfolgte bei λ320πι_. (ε320 = 4600 l/(mol x cm)). In der negativ-Kontrolle wurde GDP-D-Mannose durch Wasser ersetzt.
Bestimmungen der GDP-4-Keto-6-desoxymannose-3.5-Epimerase-4-Reduktase Aktivität
Enzymansatz:
Tris/CHl, pH 7,5 50 mM
GDP-4-Keto-6-desoxymannose 2 mM NADPH2 1 mM
Rohextr. WcaG variabel
Endvolumen 0,5 ml
Die Reaktionen wurden durch die Zugabe des zu testenden Rohextraktes gestartet. Gemessen wurde die Abnahme von NADPH2 bei λ340mn (ε340 = 6.22 x 106 1/mol x cm), bei einer Temperatur von 37 °C.
Bestimmungen der GDP-D-Perosamin-Synthase Aktivität
Enzymansatz
Tris/HCl. pH 7,5 50 mM
GDP-4-Keto-6-desoxymannose 2 mM
L-Glutamat 2,5 mM
Pyridoxalphosphat 8 mM
Magnesiumchlorid 1 inM
Rohextr.RfbE variabel
Endvolumen 0,5 ml
Als Aminodonor wurde die Aminosäure L-Glutamat verwendet.
Der Enzymansatz wurde bei 37 °C inkubiert, und die Reaktion durch Erhitzen auf 100 °C im Wasserbad für 1 min gestoppt. Nach dem Abzentrifugieren des Proteins wurde die Lösung einer HPLC-Analyse unterzogen.
Mit RfbD, RfbE, ManB, ManC, WcaG und Gmd sind die jeweiligen Uberexpressionsklone bezeichnet (s. Beispiel 6).
Beispiel 10
Ansatz zur präparativen Umsetzung von D-Mannose-6-phosphat zu GDP-D-Mannose
Ansatz zur präparativen Umsetzung mit ManB und ManC Tris/HCl, pH 8,0 50 mM Mannose-6-phosphat 150 μmol
MgCl2 10 MM
Rohextr. ManB 120 nat
Rohextr. ManC 120 nat
GTP 150 μmol
Endvolumen 6 ml
Es wurde Rohextrakt von E. coli BL21(DE3) pLysS pCAW19.1 oder pCAW20.1 für die Umsetzung zu GDP-D-Mannose eingesetzt. Der Ansatz wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Kochen von 1 min abgestoppt. Die Proteine wurden durch Ultrafiltration in Mikrosep-Röhrchen (Ausschlußgröße 3 kDa; Amicon. Heidelberg) bei 8000 rpm (SS-34 Rotor; Sorvall DuPont, Bad Nauheim) über Nacht abgetrennt.
Beispiel 1 1
Präparative Umsetzung von GDP-D-Mannose zu GDP-4-Keto-6-desoxymannose
Ansatz zur präparativen Umsetzung mit Gmd bzw. RfbD Tris/HCl, pH 7,5 300 μmol
GDP-D-Mannose 165 μmol ( 100 mg)
Rohextr.Gmd bzw. RfbD 120 nkat
Endvolumen 6 ml
Es wurde Rohextrakt von E. coli BL21(DE3) /pLysS pCAW21.1 bzw. 2 oder pCAW13.1 für die Umsetzung von GDP-D-Mannose eingesetzt. Der Ansatz wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Kochen von 1 min abgestoppt. Die Proteine wurden durch Ultrafiltration in Mikrosep-Röhrchen (Ausschlußgröße 3 kDa; Amicon, Heidelberg) bei 8000 rpm (SS-34 Rotor; Sorvall DuPont, Bad Nauheim) über Nacht abgetrennt. Der Überstand wurde für die präparative Synthese von weiteren GDP-Hexosen wie GDP-L-Fucose oder GDP-D-Perosamin weiterverwendet. Beispiel 12
Präparative Umsetzung von GDP-4-Keto-6-desoxymannose zu GDP-L-Fucose
Ansatz zur Präparative Umsetzung mit WcaG:
Tris/HCl, pH 7,5 400 μmol
GDP-4-Keto-6-desoxymannose 82 μmol (50 mg)
NADPH2 123 μmol
Rohextrakt WcaG 3,5 U
Endvolumen 8 ml
Zur Regenerierung von oxidiertem Nicotinamid-adenindinukleotid-phosphat (NADP1") bzw. Nicotinamid-adenindinukleotid (NAD+) wird dieses z.B. durch die enzymatische Reaktion mit Isocitrat unter Katalyse von Isocitrat-Dehydrogenase reduziert.
Die GDP-4-Keto-6-desoxymannose stammt aus dem in Beispiel 1 1 beschriebenen Ansatz. Es wurde für die Umsetzungen Rohextrakte von E. coli BL21(DE3) /pLysS pCAW22.1 (WcaG). Diese Ansätze wurden 1 h bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde dann auf Eis gekühlt und 150 μl 0,3 M Perchlorsäure dazugegeben. Die so gefällten Proteine wurden bei 30000 g für h abzentrifugiert. Der Überstand wurde dann mit 1 M Kaliumhydroxid neutralisiert.
Beispiel 13
Präparative Umsetzung von GDP-4-Keto-6-desoxymannose zu GDP-D-Perosamin
Ansatz zur präparativen Umsetzung mit RfbE:
Tris/HCl, pH 7,5 400 μrnol
GDP4-Keto-6-desoxymannose 82 μmol (50 mg)
L-Glutamat 123 μmol
Rohextrakt RfbE 3,5 U
Pyridoxal-phosphat 100 μmol
Endvolumen 8 ml Die GDP-4-Keto-6-desoxymannose stammt aus dem in Beispiel 1 1 beschriebenen Ansatz. Es wurden für die Umsetzungen Rohextrakte von E. coli BL21(DE3) /pLysS pCAW14.1 (RfbE) verwendet. Diese Ansätze wurden 1 h bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde dann auf Eis gekühlt und 150 μl 0,3 M Perchlorsäure dazugegeben. Die so gefällten Proteine wurden bei 30000 g für 1 h abzentrifugiert. Der Überstand wurde dann mit 1 M Kaliumhydroxid neutralisiert.
Beispiel 14
Neben den in den Beispielen 10-13 beschriebenen Enzymreaktionen im Batch-Verfahren wird die Reaktion des weiteren mit immobilisierten Enzymen erreicht, welche von der Substrat- und Pufferlösung, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30-37 °C. umspült wird. Eine Immobilisierung der Enzyme wird z.B. durch die Bindung der His-Taq-Fusionsproteine (HisGmd, His- WcaG) an eine Ni-NTA-Agarose Säule (Qiagen, Hilden) oder durch die Verwendung eines Membranreaktors erreicht.
Beispiel 15
Aufreinigung von GDP-Hexosen
DOWEX-Ionen- Austauschchromatographie
Um das Nebenprodukt NADP+ bzw. NAD" und das Restsubstrat XADPH-, bzw. NADH2 bei der Synthese von GDP-L-Fucose bzw. um Pyridoxal-phosphat. L-Glutamat und α-Ketogutarat bei der Synthese von GDP-D-Perosamin abzutrennen, wurde eine Anionen-Austauschchromatogra- phie mittels eines 1 x 8 DOWEX-Harzes ("mesh" = 200-400; Serva. Heidelberg) mit Formiat als Gegenion gewählt. Das Harz w irde in eine SR 25/50-Säule (Pharmacia, Freiburg) gefüllt. Die Gelbetthöhe betrug 12,5 cm und das Gesamtvolumen 61 ml. Für die Trennung wurde eine FPLC- Anlage (Pharmacia, Freiburg) mit einem UV-Monitor Filter für λ;5 ι _ benutzt. Die Elution erfolgte wie folgt:
Elutionsvolumen (ml): Dowex-Puffer A (%):
1200 50
1400 100 1 Das Gesamtvolumen betrug 1400 ml und die Flußrate 6 ml/min. Es wurden Fraktionen zu 5 ml aufgefangen. Die Elution erfolgte bei 5 °C. Es folgte eine HPLC-Analyse der Fraktionen, wonach die Fraktionen vereinigt wurden, die die GDP-aktivierte Hexose enthielten. Anschließend wurde diese Lösung im Hochvakuum (Drehschieber- Vakuumpumpe RD4, Vakuubrand GmbH+Co, Wertheim) unter Rühren bei ca. 25 °C auf 10-20 ml eingeengt. Nach jedem Lauf wurde die Säule mit 185 ml 4 M Ameisensäure regeneriert und solange mit H20 gespült, bis ein neutraler pH gemessen wurde.
Gelfiltration
Zum Entsalzen der nach der Ionenaustauscherchromatographie erhaltenen Fraktion wurde eine Sephadex G-10-Säule (SR 25/100-Säule; Pharmacia. Freiburg) benutzt. Die Gelbetthöhe betrug 81 cm und das Gesamtvolumen 398 ml. Die Detektion der GDP-aktivierten Hexose erfolgte über einen UV-Monitor (Uvicord SII. I254 nm, Pharmacia. Freiburg) und einem 2-Kanal-Schreiber (Rec 482, Pharmacia. Freiburg). Die Proben wurden mit einem Fraktionssammler (Frac 100, Pharmacia, Freiburg) aufgefangen. Die eingeengte Fraktion der Anionen-Austauschchromatographie wurde mit einer Peristaltikpumpe (Pump P-l ; Pharmacia, Freiburg) und einer Fußrate von 0.5 ml/min auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte mit H20 zuerst mit einer Flußrate von 0,5 ml/min für 20-30 ml, danach mit 1 ml/min. Es folgte eine HPLC-Analyse der Fraktionen, wonach die Fraktionen vereinigt wurden, die die GDP-aktivierte Hexose enthielten.
Umsalzung mit einem Anionenaustauschmembran
Um die Reste des Ammoniumformiats gegen NaCl auszutauschen wurde die Fraktion der Gelfiltration mit 10 ml/min auf das Membran- Anionenaustauschmodul Q15 (Sartorius, Göttingen) gepumpt (Pump P-l ; Pharmacia, Freiburg). Danach wαrrde das Anionenaustauschmodul mit 20- 50 ml H20 gespült und anschließend die aktivierte Hexose mit 150 mM NaCl von der Membran eluiert. Die Flußrate betrug 10 ml/min. Anschließend wurde diese Lösung im Hochvakuum (Drehschieber-Vakuumpumpe RD4, VakuubrandGmbH+Co, Wertheim) unter Rühren bei ca. 25 °C auf 10-20 ml eingeengt. Nach jedem Lauf wurde die Membran mit 20 - 30 ml 0,2 M NaOH regeneriert und solange mit H20 gespült, bis ein neutraler pH gemessen wurde.
Gelfiltration und Gefriertrocknung Das Entsalzen der nach Umsalzen erhaltenen Lösung wurde mit einer Sephadex G-10-Säule wie oben beschrieben durchgeführt.
Nach dem Entsalzen wurde der Pool der GDP-aktivierten Hexose in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei RT gefriergetrocknet (Cryograph LCD-1, Christ GmbH, Osterode am Harz und Drehschieber-Vakuumpumpe RD4, Vakuubrand GmbH+Co, Wertheim).
Beispiel 16
Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
Zur Reaktionskontrolle und zur Analyse der Nukleotid-aktivierter Zucker wurde die Hochdruckflüssigchromatographie eingesetzt. Die HPLC-Trennungen wurden durchgeführt mit einem Gerät der Firma Beckmann (Beckmann Instruments, München), bestehend aus UV-Detektor 166, Pumpmodul 125 und Autosampier 502. Folgendes Trennsystem (Payne, S.M. und Arnes, B.N., Anal. Biochem. 123, 151-161, 1982) wurden verwendet:
"reversed" phase-Chromatographie:
Säule: Eurospher 100 C 18; Korngröße 5 mm; 250 x 4,6 mm (Knauer, Berlin)
Laufmittel A: Kaliumphosphatpuffer, pH 6 30 rnM
Tetrabutylarnmoniumbydrogensulfat 5 mM
Acetonitril 2%
Laufmittel B: Acetonitril 100%
Elutionsprogramm:
Flußrate: 1 ,5 ml/min von 0% bis 40% Laufmiael B: 60 min
100% Laufmittel A: 15 min
Sämtliche Laufmittel wurden vor der Benutzung in einer Sterilfilter-Einheit mit einer MF12- Membran (Durchmesser 0,2 μm; Schleicher & Schüll, Dassel) filtriert und entgast. In allen Chromatographien besaß die Probenschleife ein Volumen von 20 μl. Die Detektion fand bei 260 nm statt. Die Auswertung der Elutionsprofile erfolgte mit dem Computerprogramm Gold Version 7.11U (Beckmann Instruments, München). Die Identifizierung der Nukleotid-aktivierten Zucker erfolgte durch Cochromatographie, sowie durch den Vergleich der Retentionszeiten mit Stan- dardsubstanzen. Für die Quantifizierung der Zucker wurde mit Standardsubstanzen eine Dreipunkteichung der Peakflächen in Abhängigkeit von der Konzentration vorgenommen.
Tabelle 6
Retentionszeiten der UV-aktiven Substanzen. .
Figure imgf000025_0001
Beispiel 17
NMR- Spektroskopie
Die Identifizierung der GDP-aktivierten Zucker erfolgte durch NMR-Spektroskopie. Die Aufnahmen der Η-, I3C- und 3IP-Spektren erfolgte an einem 400 MHz-Gerät (Bruker AC 400, Fa. Bruker-Franzen Analytik, Bremen). Die zu messenden Proben wurden in D20 gelöst. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Als Referenz standen für GDP-ß-L-Fucose die Η-NMR Daten von Bis(triethylammonium)-ß-L-Fucopyranosyl-Guanosin-5'-Pyrophosphat aus der chemischen Synthese zur Verfügung (Schmidt, R. et al., Liebigs Ann. Chem., 121-124, 1991). Beispiel 18
In-vivo-Produktion von GDP-Hexosen bzw. von fucosylierten oder perosaminylierten Oligo- sacchariden
Klonierte Gene (siehe Beispiel 4) werden in Vektoren unter Kontrolle konsumtiver oder induzierbarer Promotoren in einer gemeinsamen Transkriptionseinheit kloniert und in Mikroorganismen, bevorzugt E. coli, Slreptomyces sp. oder Saccharomyces cerevisiae transformiert. Bevorzugt werden die Gene unter Kontrolle von Promotoren mit geringerer Expressionsleistung, wie z.B. lacP kloniert, um eine gleichbleibend optimale Synthese der Enzyme in einer Fermen- terkultur oder einem Reaktor mit immobilisierten Zellen zu gewährleisten. Alternativ werden dazu auch die natürlichen Gene mit ihren eigenen Promotoren verwendet. Die aktivierten Zucker werden intrazellulär mit Hilfe geeigneter Glycosyltransferasen z B. WcbH (Galactosid-2-L-Fuco- syltransferase) aus Yersinia enterocolitica oder aus Escherichia coli (RffT) auf geeignete Substrate z.B. ß-Galactoside übertragen, die entweder biosynthetisch in der Wirtszelle hergestellt oder von außen zugesetzt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung einer Guanosindiphosphat (GDP)-6-Desoxy- hexose, dadurch gekennzeichnet, daß GDP-D-Mannose oder eine diesbezügliche Vorstufe in Gegenwart eines oder mehrere Enzyme(s), welche(s) GDP-D-Mannose-4.6-dehydratase (Gmd, RfbD)- Aktivität und gegebenenfalls GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epime- rase-4-Reduktase- (WcaG) oder GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-4-Aminotransferase (RfbE) -Aktivität aufweisen, inkubiert und das gewünschte Produkt isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß GDP-4-Keto-6-desoxy-D-man- nose, GDP-L-Fucose oder GDP-L-Perosamin aus GDP-D-Mannose hergestellt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für die enzymatische Synthese erforderlichen Enzyme durch Klonierung der für diese Enzyme kodierenden Gene bzw. kodierenden DNA-Fragmente, Insertion in einen oder mehrere Vektor(en) und Transformation in eine bakterielle oder ein pilzliche Wirtszelle erhältlich sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß die Gene bzw. entsprechende DNA-Bereiche zunächst amplifiziert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeiclmet. daß es sich bei den Genen bzw. DNA-Fragmenten um manB, manC, gmd, rfbD, rfbE und/oder wcaG handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirtszelle um E.coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium sp.. Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccaramyces pombe, Hansenula polymorpha, Pichia stipidis handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mannose-6-phosphat und GTP in Gegenwart von Phosphomannomutase (ManB) und GDP-D-Mannose-Synthase (ManC) inkubiert und GDP-D-Mannose bzw. ein diesbezügliches Folgeprodukt isoliert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Batch-Verfahren durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem Enzym-Membran-Reaktor kontinuierlich durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Substrate bzw. sonstige Ausgangsstoffe enthaltene Pufferlösung über ein festes Trägermaterial, an welchem die Enzyme immobilisiert sind, kontinuierlich perkoliert wird.
11. Verwendung einer nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellten GDP-6-Desxoyhexose zur Kopplung an Glykoside, Oligo- oder Polysaccharide.
12. Verwendung nach Anspruch 1 1, wobei die Kopplung in Gegenwart eines Glycosyltrans- ferase-Aktivität aufweisenden Proteins erfolgt.
13. Verfahren zur Herstellung von Fucose bzw. Perosamin haltigen Oligo- oder Polysaccha- riden, dadurch gekennzeichnet, daß eine GDP-aktivierte Hexose mittels eines Proteins, welches Fucosyltransferase- oder Perosamintransferase-Aktivität aufweist, auf ein Oligo- bzw. Polysaccharid übertragen wird.
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