WO1999005284A1

WO1999005284A1 - GENE HUMAIN RecQ4 CODANT HELICASE

Info

Publication number: WO1999005284A1
Application number: PCT/JP1998/003114
Authority: WO
Inventors: Akira Shimamoto; Saori Kitao; Yasuhiro Furuichi
Original assignee: Agene Research Institute Co Ltd
Current assignee: Agene Research Institute Co Ltd
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 1999-02-04
Anticipated expiration: 2000-01-25
Also published as: EP0999273B1; EP0999273A1; EP0999273A4; US6335435B1; DE69836482T2; JP4113920B2; DE69836482D1; US6472513B1

Description

明細書

ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子， R e c Q4 技術分野

本発明は、ヘリ力一ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途に関する。背景技術

DNAヘリカーゼは、生体内又は微生物細胞中に於いて DNAが関与する各種の生物反応に作用する重要な酵素であり、その種類も多い。

DNA ヘリカーゼが多種類にわたって存在することは、 DNA が関与する反応が細胞の複製及び増殖、個体の発生及び成長、さらに生命維持など多岐にわたることから明らかである。これまでに判っている細胞レベルでの生化学反応としては、 DNA の複製（replication) 、修復 (repairing) 、転写 (transcription) 、 DNA の分離（segregation) 及び解合（recombination) の少なくとも 5種類が想定されている。一般的に、 DNAヘリカーゼの作用は二本鎖 DNAを一本鎖 DNA に分別することが知られており、この作用に必要なェネルギ一は ATPの加水分解により得られていると考えられている。

数ある DNAヘリカーゼの中でも、最近、 RecQ タイプの DNAヘリ力一ゼ（大腸菌 recQ遺伝子のヘリ力一ゼドメインとアミノ酸レベルで約 40%以上の相同性を示すヘリ力一ゼドメインを有するヘリカーゼ）が見出され、ヒトの病気及び老化現象と関連するという観点から注目が集まっている。例えば、ブルーム症候群は若年で種々の癌を多発する疾患であり、ウェルナー症候群は早老と異常癌を誘発する遺伝性疾患である。最近これらの疾患の原因が、それぞれ異なるヒト RecQ タイプの MAヘリ力一ゼをコードする遺伝子の変異によることが明らかにされた (Cell,83,pp655-666(1995) 及び Science, 272, pp258- 262(1996) ) 。

RecQ タイプへリカーゼは、元来、中山等（Mol.Gen.Genet., 195，pp474 - 480(1984)) により大腸菌中に於いて発見されたものであるが、このへリカーゼに高い相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、酵母とヒ卜癌細胞中 Ίこ発見され、それぞれ sgsl(Gangloff et al..Mol.Cel l.Biol.14,pp8391- 8398(1994))及び RecQKSeki et al.， Nuc. Acids Res.22, pp4566- 4573(1994)) と命名された。

.大腸菌や酵母のような単一細胞生命体に於いては、このフアミリーに属するヘリ力一ゼとしては、最初に見出された大腸菌 RecQヘリカーゼ及び sgslの各一種類であるが、多細胞からなるヒトに於いては、前述した疾患に関連するブル一ム DNA ヘリ力一ゼ（Ellis et al.， Cel 1， 83， pp655- 666(1995)) 及びウェルナー DNA ヘリカーゼ (Yu et al. , Science, 272， pp258- 262(1996))の二種類、並びにいまだ疾患との関連が見出されていない RecQlヘリ力一ゼの合計 3種類がこれまでに知られている。発明の開示

本発明は、ヒト RecQ4型 DNAヘリ力一ゼ遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途を提供することを目的とする。

本発明者らは、 RecQ ファミリ一に属する DNA ヘリカーゼが、ヒトに於いては前記 3種類のほかにも多数存在するのではないかと考えた。そして、それらの遺伝子が変異を受けた時、ブルーム症候群やウェルナー症候群の例に於いて見られたように、各種疾患を誘発し、いまだ原因不明となっている難病の原因遺伝子となっているのではないかと考察した。そして、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、いわゆる RACE 法により、新たにヒト RecQ4 型 DNAヘリ力一ゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、以下の（a)又は（b)のタンパク質をコードする遺伝子である。

(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質

(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質

さらに、本発明は、以下の（c)又は（d)の DNAを含む遺伝子である。

(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA

(d) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘリ力一ゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA

さらに、本発明は、前記遺伝子の少なくとも一部とハイブリダィズするオリゴヌクレオチドプロ一ブである。

さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。

さらに、本発明は、前記組換えべクタ一を含む形質転換体である。

さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からへリカ一ゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする前記タンパク質の製造方法である。

さらに、本発明は、以下の（a)又は（b)の組換えタンパク質である。

(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質

さらに、本発明は、前記タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %のホモロジ一を有するアミノ酸配列を含む、マウス又はラット由来のヘリカーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするマウス又はラット由来の遺伝子である。

さらに、本発明は、前記タンパク質と特異的に反応するモノクロナール抗体又はポリクロナ一ル抗体である。

さらに、本発明は、前記タンパク質で免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。

さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む、ヘリ力一ゼをコ ―ドする遺伝子の検出用試薬である。

さらに、本発明は、前記タンパク質、並びに前記モノクローナル抗体及び又はポリクローナル抗体を含む、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子異常により引き起こされる疾患の診断用キットである。

さらに、本発明は、前記遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジエニック動物、及び前記遺伝子の機能が失われるように処理されたノックァゥトマウスである。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明により明らかになつた遺伝子は、新規ヒト RecQ4型 DNAヘリ力一ゼをコ —ドするものであり、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列において少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換、付加したァミノ酸配列を含み、かつへリカ一ゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。

本発明のタンパク質は、図 2に示すように、これまで知られている RecQ 型 DNA ヘリ力一ゼにおいて、アミノ酸レベルでは、大腸菌、酵母及びヒトとの間で良く保存された 7つのへリカ一ゼ，モチーフを含む。また、図 3に示すラジェ一シヨンハイブッリドマッピングの結果から明白なように、本発明のヒト RecQ 型 DNAヘリカーゼ遺伝子は、図 4に示すヒト第 8染色体の長腕、 8q24. 3に存在することが確認された。なお、本発明のヒト由来の遺伝子に相当する他種生物由来の遺伝子は、公知技術によりクロ一ニングすることが可能である。

本発明の遺伝子が各種臓器に於てどのように発現しているかを調べる多組織 (Mul t i -Ti ssue) ノーザンプロットによる解析結果（図 5 ) から、当該遺伝子は、全ての組織において発現し、特に、胸腺及び精巣において著しく強く発現してることが認められた。

以上の結果を総合すると、本発明の遺伝子は、生体の基本的な恒常性の維持に関わる遺伝子の一つであることが強く示唆される。従って、本発明の遺伝子は、発育及び老化との関連を解明するための研究に有用であると共に、この遺伝チの発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するうえでも有用であり、また、生命の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用である。本発明の遺伝子は、例えば以下のようにして同定し取得することができる。

1. ヒト RecQ型 DNAヘリカーゼ遺伝子のクローニング。

本発明の遺伝子（ヒト RecQ4型遺伝子、又はヒト RecQ型 DNAへリ力一ゼ遺伝子ともいう）は、 Long-distance (LD) PCR 法及び Suppression PCR 法の 2つの原理に基づいて RACE [Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman, M. A. et al., Methods Enzymol. Vol.218, pp340-358 (1993)]を行うことにより得ることができる。

すなわち、本発明のヒト RecQ型 DNAヘリ力一ゼ遺伝子は、既知の部分配列を有する DNA断片と、 5' 及び 3' 末端を有するが配列が未知の DNA 断片とを増幅し、さらに、これらの DNA 断片の融合により、完全長の cDNA として得ることができる。本発明では、完全長の cDNA のクローニングは、例えば市販のキット（Marathon^TM cDNA Amplification Kit; CLONETECH 社）を用いて行うことができる。

まず、ヒト由来の既知配列を有する DNA 断片を増幅する。既知配列は、ヒ卜組織又は器官由来の poly(A)+ RNA 、例えばヒト精巣又は脾臓由来の poly(A) + RNA から得ることができる。すなわち、該 RNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成し、 RT-PCR により部分 cDNA 断片を調製する（図 1 (1) ) 。次に、得られた部分 cDNA 断片の配列を決定した後、該部分 cDNA の配列を基に 4種類の遺伝子特異的プライマ一（_GSp)を設計する（5'GSP1 及び 5'GSP2 並びに 3'GSP1 及び 3'GSP2 という）。 GSP は、当該部分 cDNA 配列より 5' 側及び 3'側の領域に存在する DNA 断片であって配列が未知の DNA 断片を増幅するために必要とされるプライマーである。 GSP の配列は、当該部分 cDNA 配列から任意に選択することができ、その配列は化学合成により得ることができる。本発明では、当該部分 cDNA よりも 5' 側の未知配列を増幅する際に使用する GSP を 5'GSP1 及び 5' GSP2 、また 3'側の未知配列を増幅する際に使用する GSP を 3' GSP 1 及—び 3' GSP2 とする（図 1 ( 1 ) の枠囲み部分）。

次に、部分 cDNA よりも 5'側及び 3'側の DNA断片を増幅する（図 1 (2) ) 。錡型としては、市販のヒト精巣、脾臓等の由来の cDNA [例えば、 CLONETECH 社の cDNA Ready¹" ^M ]を用いることができる。この錡型となる DNA断片の配列は未知であるが、各 DNA断片の末端にはアダプタ一配列が付加されている。そこで、アダプタ一配列にハイブリダィズするプライマ一 [アダプタープライマー（AP) という] 及び前記 GSP をプライマ一として用いて、アダプタ一が連結された、配列が未知の cDNA 断片の増幅反応（LD PCR) を 2回行う（図 1 (2) ) 。例えば、 5'側の未知配列を増幅するために、まず API及び 5' GSP1 を用いて PCRを行い、得られた断片を铸型として、次は前記 API 及び 5' GSP1 の位置よりも内側の領域にハイブリダィズすることができるプライマ一（AP2 及び 5' GSP2)を用いて PCR を行う（nested PCR)。 3'側の未知配列も、 3' GSP1 及び 3' GSP2 を用いて 5' 側の未知配列を増幅したと同様に増幅することができる。

本発明では、前記既知の部分配列の断片の位置を基準として、その既知配列よリも上流に位置する DNA断片を 5' - RACE 産物、下流に位置する DNA断片を 3' - RACE 産物とする。なお、 AP はアダプタ一の突出末端と同じ配列を持っため、ァダブターにはアニーリングせず、一回目の増幅では、遺伝子特異的プライマ一 (GSP)からのみ伸長する（これを Suppress i on PCRという）。

得られた cDNA の塩基配列の決定は、 Hattor i ら [ El ectrophores i s 13, PP560-565 ( 1992) ] により記載された PCR をベースにした方法により行う。すなわち、 Perkin Elmer 社製の蛍光ダイデォキシタ一ミネーターを含有する PRISM シ一クェンシングキットを使って反応を行い、 Appl i ed Biosystem 社製のォ一トシ一クェンサ一（モデル AB I 373) で塩基配列を読み取り、附属のコンピュータ一（例えば Mac i ntoshコンピュ一ター）によリデータの解析を行う。

上記のようにして得られた既知の部分配列、 5' - RACE 産物及び 3' -RACE 産物の塩基配列からァセンブリにより全長 cDNA の塩基配列を得ることができる。すなわち、各塩基配列間でオーバ一ラップしている部分を繋げて 5'及び 3'部分を含む塩基配列を得ることができる（図 1 ) 。配列番号 1に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号 2に該遺伝子によ "コ一ドされるアミノ酸配列を示すが、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質がヘリ力一ゼ活性を有する限り、当該タンパク質に含まれるアミノ酸配列、又は当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列の少なくとも 1個、好ましくは 1 〜10 個、さらに好ましくは 1 〜 5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列に少なくとも 1個、好ましくは 1〜10 個、さらに好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号 2で表わされるアミノ酸配列の少なくとも 1個、好ましくは 1〜10 個、さらに好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。従って、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の第 1番目のメチォニン（Met)が欠失しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のタンパク質をコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。

さらに、本発明は、配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA を含む遺伝子のほか、該 DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつへリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAを含む遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が 15〜60mM、好ましくは 15〜30mMであり、温度が 55〜70°C、好ましくは 60〜70°C での条件をいう。なお、上記変異の導入は、公知のいずれかの手法により行うことができ、例えば点突然変異導入キット（例えば宝酒造社製の TAKARA LA PCR in vi tro Mutagenes i s K i t) 等を用いることにより行うことができる。

また、前記タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %のホモロジ一を有するアミノ酸配列を含むタンパク質も、本発明のタンパク質に含まれ、そのタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。このタンパク質及び遺伝子としては、例えばマウス又はラット由来のものが挙げられる。塩基配列が一旦決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定され—た当該塩基配列から合成したプライマー（例えば配列番号 35 及び 36) を用いた PCRによって、あるいは該塩基配列を有する DNA断片をプローブとしてハイプリダイズさせることによって、所望の遺伝子を得ることができる。

2 . 組換えベクター及び形質転換体の作製

本発明の組換えべクタ一は、適当なベクタ一に遺伝子を組み込むことにより作製することができる。また、本発明の形質転換体は、本発明の組み換え体 DNA を、該組換えべクタ一を作製する際に用いたベクターに適合する宿主中に導入することにより得ることができる。

精製された遺伝子を、適当なベクタ一 DNA の制限酵素部位又はマルチクロ一ニングサイトに挿入して組換えベクターを作製し、当該組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転換する。

DNA 断片を揷入するためのベクター DNA は、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド DNA としては、例えばプラスミド pUC1 18 (宝酒造社製）、 PUC119 (宝酒造社製）、 pB luescript SK+ (Stratagene 社製）、 pGEM-T (Promega 社製）等が挙げられ、ファージ DNA としては、例えば M13mpl8、 M13mpl9 等が挙げられる。

宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができる。例えば、大腸菌 (Escheri chi a co l i ) 、バチルス . ズブチリス（Bac i l l us subt i 1 i s)等の細菌、サッカロミセス ·セレビシェ（Saccharomyces cerev i s i ae) 等の酵母、 COS 細胞、 CH0 細胞等の動物細胞などが挙げられる。

大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモータ一、本発明の DNA、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大腸菌としては XU-B lue (St ratagene 社製）、 JM109 (宝酒造社製）等が挙げられ、発現ベクターとしては、例えば pBTrp2 等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、 trp プロモータ一、 rac プロモータ一、 PL プロモータ一、 PR プロモータ一などの大腸菌やファージ等に由来するプロモータ一が用いられる。

本発明では、形質転換は、例えば Hanahan の方法 [Techniques for Transformat ion of E. co l i In DNA Cloning, vol . 1, Glover, D. M. (ed. ) , ppl09- 136， IRL Press ( 1985) ]により行うことができる。

酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば YEpl3、 YC_P50 等が挙げられる。プロモータ一としては、例えば gal 1 プロモータ一、 gal 10 プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロボレ一シヨン法 [Methods. Enzymo l . , 194, ppl82-187 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Nat l . Acad. Sci . USA, 84， ppl929-1933 ( 1978) ]、酢酸リチウム法 [J. Bacterio l . , 153, 163-168 ( 1983) ] 等が挙げられる。

動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば pcDNAI、 pcDNAI /Amp (インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換えべクタ —の導入方法としては、例えば、エレクトロボレ一シヨン法、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。

ベクタ一 DNA としてプラスミド DNA を用いる場合、例えば EcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミド DNA を制限酵素 EcoRI (NEB 社製）を用いて消化しておく。次いで、 DNA 断片と切断されたべクタ一 DNA とを混合し、これに、例えば T4 DNA リガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換えベクターを得る。

上記形質転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含む MA 断片をプローブとしたコロニーハイブリダィゼ一シヨン、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた 5，プライマー（FP ; forward primer) を合成し、次いで、相補鎖 DNAの塩基配列に基づいた 3' プライマ一（RP ; reverse primer) を合成し、これらのプライマーを用いた PCR 法により、目的とする遺伝子を含むコロニーを選択することができる。

3 . ヒト RecQ4型遺伝子がコードするタンパク質（ポリペプチド）の生産

前記のようにして得られた組換えべクタ一を保有する形質転換体を培養すれば、本発明のタンパク質を生産することができる。培養方法は、通常の固体培養'; e もよいが、液体培養法を採用することが好ましい。

形質転換体を培養する培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる 1種以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等の無機塩類の 1種以上を添加し、更に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。また、必要により培地に

IPTG 等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養開始時の培地の PH は 7. 2〜7. 4 に調節し、培養は通常 36〜38で、好ましくは 37°C前後で 14〜20時間、通気撹拌培養、振盪培養等により行う。

培養終了後、培養物より本発明のタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段を用いることができる。

すなわち、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨碎処理等により菌体を破壊し、本発明の遺伝子がコードするタンパク質を菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。

上記粗タンパク質溶液から、該タンパク質をさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ一、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることによリ行う。

4 . モノクローナル抗体の作製

本発明のヒト RecQ4型遺伝子がコードするタンパク質に特異的なモノクロ一ナル抗体は、以下のようにして得ることができる。

( 1 ) 抗原の調製

前記 3の方法により得られたタンパク質を緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバントとしては、市販のフロイント完全アジュバント、フロイン卜の不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。 ( 2) 免疫及び抗体産生細胞の採取

上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばラット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は 1回に動物 1匹当たり、 10〜500 ^ § 用いる。免疫部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは 1〜 3週間間隔で、 2〜 5回、好ましくは 3〜4回免疫する。最終の免疫日から 2〜 7日後、好ましくは 4〜 5日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。

(3) 細胞融合

抗体産生細胞と融合させるミエ口一マ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（HAT 培地：ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、 P3U- 1 (大日本製薬社製）、 P3x63Ag8. 653 などのマウスミエ口一マ細胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まない DMEM、 RPMI - 1640 培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエ口一マ細胞 1に対して抗体産生細胞 100〜500 の割合、例えば 10⁸ 細胞/ ml の抗体産生細胞と 2 X 10⁵細胞/ ml のミエローマ細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合を促進させるためには、平均分子量 1，500 ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーシヨン）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエ口一マ細胞とを融合させることもできる。

(4) ハイプリドーマの選択及びクロ一ニング

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばゥシ胎児血清含有 RPMI -1640 培地などで適当に希釈後、マイクロタイタ一プレート上に 5〜10 細胞/ゥエル程度まき、各ゥエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約 14 日前後から生育してくる細胞をハイプリドーマとして得ることができる。増殖してきたハイブリド一マの培養上清中に、目的とする抗 ^が存在するか否かをスクリーニングする。ハイプリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイプリドーマとして生育したゥエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（EIA; enzyme immuno assay)、 RIA (rad i o iramuno assayリ等によってスクリ一ニンクを ί了つことができる。

融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクロ一ナル抗体産生細胞であるハイプリドーマを樹立する。

(5) モノクローナル抗体の採取

樹立したハイプリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が採用できる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640 培地、 MEM 培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば 37°C， 5 %C0₂濃度）で 10〜 14 日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。腹水形成法の場合は、ミエ口一マ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイプリドーマを約 5 X 10⁶個投与し、ハイプリドーマを大量に増殖させる。そして、 1〜2週間後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィ一などの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。

5 . ポリクローナル抗体の作製

( 1) 抗原の調製

前記 3の方法により得られたタンパク質を緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバントとしては市販のフロイント完全アジュバント、フロィント不完全アジュバントを用いる。

(2) 免疫

動物としては、通常、ゥサギ、モルモット、ャギ、ヒッジなどを用いる。ゥサギを例にとると、ゥサギの足踱に、通常 100 g から 500 z g のタンパク質をフ口イント完全アジュバントとともに皮下注射する。二週間後に同量の抗原をァロィント不完全アジュバントと混合して筋肉内注射をする。さらに二週間後に筋肉内注射を繰り返し、最終免疫の一週間後に耳より部分採血して E IA 法等により抗体価を測定する。抗体価が目的の値に達していれば全採血し、抗体価が低ければ筋肉内注射を繰り返し、抗体価が目的の値に達するまで免疫を繰り返す。血清から硫安分画による抗体の精製は、モノクローナル抗体の項で述べた方法を採用できる。

6 . ヒト RecQ4型遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の検出用試薬ヒト RecQ4型遺伝子は、染色体の不安定性を生じ、高頻度発ガンや早老症を引き起こすブルーム症候群やウェルナー症候群の原因遺伝子と高い相同性を有し (図 2 ) 、かつ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められたことから (図 5 ) 、生体の基本的な恒常性の維持に関わる DNA ヘリ力一ゼをコードしている遺伝子の一つであるといえる。従って、この遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するうえで有用であり、また、生体の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用であると共に、老化との関連を解明するための研究にも有用である。そして、本発明の試薬は、ヘリ力一ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の異常により引き起こされる疾患、例えばブル一ム症候群やウェルナー症候群（これらに限定されるものではない）の検出、診断に有用である。

本発明の遺伝子を検出用試薬として使用する場合は、クローニングされたヒト RecQ4 遺伝子の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイセーシヨンを行い、サザン又はノーザンプロット法により検出が行われる。なお、オリゴヌクレオチドプローブとしては、 DNA プローブ、 RNA プロ一ブ等が挙げられる。

また、本発明の遺伝子をコードするタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を検出用試薬として使用する場合は、 E I A、 R IA 又はゥェスタンブロット解析により検出が行われる。 7 . 遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入ざれたトランスジエニック動物

本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位 (ェンハンサ一、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、付加、揷入等の変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に上昇又は下降するように修飾することができる。

上記変異の導入は、公知のいずれかの手法により行うことができ、例えば、点突然変異導入キット（例えば宝酒造社の TAKARA LA PCR in vi tro Mutagenes i s ki t)等を用いることができる。トランスジエニック動物としては、例えばトランスジエニックマウス、トランスジエニックラット等が挙げられる。前記変異を導入した遺伝子を保有するべクタ一としては、各動物種 RecQ4 型遺伝子を過剰発現させるようなベクタ一、逆にその発現を抑制するようなアンチセンスのベクタ一の二つが考えられる。いずれの場合にも、遺伝子の選択のためのポジティブ選別用の薬剤（例えば、ネオマイシンなど）耐性遺伝子を連結させておく。

細胞への遺伝子の導入は、受精卵に直接 DNAを注入する方法も使用し得るが、 ES 細胞は、培養が可能でしかもこの細胞からマウス等を発生させることができるという利点を有しているため、各種 ES 細胞を用いる方法がより効率的で好ましい。 ES 細胞としては、例えば TT2 細胞が挙げられる（相沢慎一，ジーンターゲッティング， 1995 年，羊土社）。そして、例えばマウス RecQ4 型遺伝子を含む上記べクタ一 DNA をエレクトロボレ一シヨンにより ES 細胞へ導入し、ネオマイシンでポジティブ選別し、目的の変異 ES 細胞を得る。上記 ES 細胞を、胚胎盤胞又は 8細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。その後、胚胎盤胞又は 8細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。生殖系列のキメラ動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得られ、接合体同士の交配によりホモ接合体動物を得ることができる。 8 . ノックアウトマウス

本発明のノックアウトマウスは、マウス RecQ4遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。その処理方法について説明する。

マウス RecQ4遺伝子を含むゲノム DNAを、マウス ES細胞から調製したゲノム DNAから PCRにより、又はゲノムライブラリ一から得、そのいずれかのェクソンの中に neo 耐性遺伝子を揷入したベクターを構築する。この操作により、このェクソンの機能は破壊される。これと同時に、このべクタ一の中にネガティブ選別用のチミジンキナーゼ（tk) 遺伝子又はジフテリア（DT) 毒素遺伝子を繋げておく。エレクト口ポレーシヨンにより該ベクタ一 DNA を ES 細胞に導入する。次に、この細胞をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別用の核酸類似体 FIAU (f luoro i odoadenosylurac i l ) , 又はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作により非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細胞、及び組換えを全く起こさない G418 感受性細胞が除去され、相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞では、破壊されたェクソンを含む遺伝子がノックアウトされる。得られた細胞をマウスの胚胎盤胞又は 8細胞期胚に注入する。その後は、トランスジエニック動物の作製と同様の手法によリ、ノックアウトマウスを作製することができる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の遺伝子のクロ一ニング手法を示す図である。

図 2は、ヒト RecQ4型遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列について、他の遺伝子由来のものと相同性の比較をした図である。

図 3は、ヒト RecQ4型遺伝子のヒト第 8番染色体上の位置を示すラジェーションマッピング分析を示す図である。

図 4は、ヒト第 8番染色体を示す図である。

図 5は、ヒト RecQ4型遺伝子のノーザンブロットによる解析結果を示す電気泳動写真である。

図 6は、 EST- DNA ACC. H16879 によリコ一ドされるアミノ酸配列について、大腸菌由来のものと相同性の比較をした図である。図 7は、本発明の遺伝子のアセンブリを示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。

〔実施例 1〕全長ヒト RecQ4cDNA のクロ一ニング

( 1) 大腸菌 RecQ4 DNAヘリ力一ゼに相同性を有する cDNA断片の同定。

まず、本発明の DNAをクローニングするにあたり、大腸菌 RecQヘリカーゼに相同性を有する cDNA配列を dbest データ一ベースで探索した。この結果、 EST - DNA ACC. H16879 (図 6， H16879のアミノ酸配列をコードする DNA) を含む十数種の EST(Expessed Sequence Tag) DNA 配列が得られた。但し、これらの EST と、ヒト以外の例えば大腸菌、酵母、線虫等の生物種由来の EST-DNA とのヌクレオチド配列に於ける相同性、あるいは前記 EST と、ヒト由来のすでに知られているブルーム病ヘリ力一ゼ、ウェルナー病ヘリカーゼ及び RecQlヘリ力一ゼの各遺伝子とのヌクレオチド配列に於ける相同性を考慮し、これらの遺伝子と相同性の高い EST- DNAについては除外した。

(2) EST-DNA ACC. H16879がヒト組織で発現している遺伝子であることの確認次に、 EST-DNA ACC. H16879 の配列が真にヒト組織において発現している遺伝子であることを確認する一連の予備実験を行った。即ち、 EST- DNA 断片に含まれる塩基配列から PCR(Po lymerase Chain React i on)用のプライマ一としてセンスプライマー（配列番号 3 ) 及びアンチセンスプライマー（配列番号 4 ) を用意した。一方ではヒト精巣由来の mRNAから逆転写反応により cDNAを作製し、先に調製したプライマ一を用いて PCRを行い、ヒト精巣 cDNA中に EST-DNAが存在するか否かを確認した。

すなわち、（3- i ) に後述された方法で RT- PCR を行い、 EST- DNA ACC. H16879の配列から予想される約 320 塩基対の PCR 産物を検出することができた。

PCR による当該 EST- DNA 配列の有無は、 PCR によって増幅された DNA 断片を大腸菌のプラスミド DNA 中に組み込みクローン化し、得られたプラスミドク口 ―ン DNA の塩基配列を分析することによつても確認された。このようにし " EST-DNA ACC.H16879 が新規へリカーゼ遺伝子の一部であることを確認した（方法は、後述の（3- Π)及び（3- iii) を参照）。

(3) RT-PCRによるヒ卜 RecQ4型遺伝子の部分 cDNA 断片のクロ一ニング

(3-i)逆転写による cDNA の調製及び増幅

ヒト精巣由来の Poly(A)+ RNA (CLONETECH社）約 1 g、ジチオスレィトール、 dNTP (dATP, dCTP, dGTP 及び dTTP；)、逆転写酵素用バッファ一及び逆転写酵素 Super Sucript II を含む反応液を、 42°Cで 30 分反応させ、その後 RNase 処理をして cDNA を調製した。この cDNA をテンプレートとして PCR を行った。

PCR には宝酒造社製の TAKARA Taq 及びこれに添付のバッファ一を用いた。後述される Taq DNA ポリメラ一ゼ及び PCR バッファ一は、特別の指定がない限り TAKARA Taq 及びこれに添付のバッファ一をそれぞれ指すものとする。 PCR は、 1 XPCR バッファー、 0.2mM dNTP, 0.4 zM RecQ4 プライマ一（配列番号 3及び 4) 及び 0.625unit Taq DNA ポリメラ一ゼを含む溶液に、適当量の上記ヒト精巣 cDNAを加えた 25μ 1 の混合反応液中で行った。

まず、上記反応液を 94°Cで 5分反応させ、次に、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒及び 72°Cで 1分の反応を 1サイクルとしてこれを 35サイクル行った。得られた反応液をさらに 72°Cで 5分反応させた。

(3-ii) 塩基配列決定のための RT- PCR 産物のサブクロ一ニング

上記（3-i) で得られた RT- PCR産物、 T4 DNA リガ一ゼ（宝酒造社製）、バッファ一（宝酒造社製）及び PGEM-T ベクタ一（Promega 社製）を含む溶液を 15°C で 3時間反応させて、 RT-PCR 産物の断片を pGEM-T ベクターに組み込んだ。このベクターで大腸菌 JM109 をトランスフォームさせ、この大腸菌を、 X-gal、 IPTG 及びアンピシリン（最終濃度 50^g/ml) を含む LB パクトァガ一プレートに播き、 37°Cで 12 時間インキュベートした。出現した白色の大腸菌コロニーについて、アンピシリン（最終濃度 50 g/ml) を含む LB 培地で、 37°Cで 16 時間以上振盪培養し、 Kurabo 社製のロボット（Ρί- 100Σ) を用いてプラスミド DNAを調製した。 10^g/ml RNase を含む dH₂0 ΙΟΟ 1 にプラスミド DNA を溶解し、 DNA シ^ "クエンス用の試料とした。

(3-iii)塩基配列の決定

上記（3-ii)で調製したプラスミド DNA を铸型 DNAとして、非標識プライマ一、 4種類の蛍光標識ヌクレオチド- 5'-トリフォスフェイト及び Taq ポリメラ一ゼを加えた反応系で PCR を行った。反応混合液は以下の通りである。

Thermal Ready 反応混合物 8.0 1

铸型 DNA 3.0 1

プライマ一（3.2pmol/ zl ) 1.0 β \

dH₂0 8.0

20 1 なお、塩基配列決定用プライマ一として、配列番号 5〜19 に示すものを用いた。

PCR は、 96°Cで 30秒（変性）、 55°Cで 15秒（ァ二一リング）及び 60°Cで 4 分（伸長）の反応を 1サイクルとしてこれを 25サイクル行った。この反応では、無作為に蛍光色素の入った DNA 断片が合成され、それをシークェンサ一で解析することで、最終的には連続した塩基配列を決定することができる。 PCR 反応物の解析は、 Applied Biosystera 社製の自動 DNA シークェンサ一（model ABI 373)により行った。得られたヒト RecQ4 部分 cDNAの塩基配列を配列番号 31 に示す。

(4) Marathon cDNA Amplification kit を用いたヒト RecQ4 遺伝子の 5 ' 及び 3' 領域のクロ一ニング

前記（3)により得られた RecQ4部分 cDNA断片の塩基配列を基にして、 5' 及び 3，領域のクロ一ニングを、 Marathon cDNA Amplification kit (CL0NTECH 社）を用いて行った。まず 5， RACE産物を増幅するため、 Marathon Ready精巣 cDNA を铸型として、アダプター配列特異的なプライマー API (配列番号 20) と、 RecQ4部分 cDNA断片に特異的なプライマ一 5'GSP1 (配列番号 22) とを用いて 1 回目の PCRを行った。 PCR の反応混合液は以下の通りである。テンプレー卜 5

プライマー（10 raM) 1 β ΐ X 2

lOXKlen Taq反応バッファ一 5 ΐ

2.5mM dNTPs ミックス 4 ΐ

Klen Taq (Klontech社製) 1 ( \

dH₂0 33 1

50

PCR は、 94°Cで 1分で変性し、 94°Cで 30 秒（変性）、 72°Cで 4分（ァ二一リング及び伸長）の反応を 1サイクルとしてこれを 5サイクル、次に 94°Cで 30秒

(変性）、 70°Cで 4分（アニーリング及び伸長）の反応を 1サイクルとしてこれを 5サイクル、さらに 94°Cで 30秒（変性）、 68°Cで 4分（アニーリング及び伸長）の反応を 1サイクルとしてこれを 25サイクル行った。

この反応液を希釈したものを铸型として、更に内側のプライマ一、即ち、 AP2

(配列番号 21) と 5'GSP2 (配列番号 23) を用いた 2回目の PCRを行った。これにより、約 2キロ塩基対の 5 ' RACE 産物を得た。同様の方法により、 3'GSP1

(配列番号 24) 及び 3'GSP2 (配列番号 25) プライマ一を用いて約 1· 5キロ塩基対の 3， RACE 産物を得た。これらを pGEM- T ベクターにサブクローニングし、 5，及び 3， RACE 産物の全長の配列を決定した [方法は（3- ii)及び（3- iii)に記載] 。

得られたヒト RecQ4 遺伝子の 5 ' 及び 3' RACE 産物の塩基配列をそれぞれ配列番号 32及び 33に示す。

(5) RecQ4 遺伝子の転写開始点の決定

5' - RACE 産物の塩基配列を解析した結果、 RecQ4 遺伝子がコードすると予想されるタンパク質の第一メチォニンはこの 5，- RACE 産物中には見られず、さらに上流に存在すると予想されたので、この遺伝子の転写開始点を調べた。

RecQ4 遺伝子の転写開始点を含む 5' 領域はオリゴキヤッビング法により決定した。ヒト精巣由来 mRNA を宝酒造製の子牛小腸由来アルカリホスファタ一ゼ (CIAP)で処理し脱リン酸化を行った。反応混合液は以下の通りである。ヒト精巣由来 mRNA 10 βも

10x CIAPバッファー（宝酒造） 10 (J 1

RNasin (Promega) 4 β 1

CIAP (宝酒造) 1 1

dH₂0 100 β ΐ にする

反応は 37°Cで 30分行った。次に脱リン酸化した mRNAに含まれる 5' CAP構造を除く為、二ツボンジーン製タバコ酸性ピロホスファターゼ（TAP)で処理した。反応混合液は以下の通リである。脱リン酸化 mRNA 10 a

10x TAP バッファ一（二ツボンジーン） 10 1

RNasin (Promega) 4 ΐ

TAP (二ッポンジ一ン 300 U/μ Ι ) Ι Ι

dH₂0 100 1 にする

反応は 37°Cで 60分行った。次に CAP構造が除かれた mRNA(TAP- RNA)の 5 ' 端にアダプタ一として 30 塩基からなるオリゴ RNA (配列番号 26) を宝酒造製 T4RNAリガ一ゼを用いて繋げた。反応混合液は以下の通りである。

TAP-RNA 10 f g

オリゴ RNA (2 /β \ ) 5 μ.1

10χ リガ一ゼバッファー（宝酒造） 10 μ 1

100 mM ATP 0.5

RNasin (Promega) 4 β \

RNA リガーゼ（宝酒造） 5 1

60% PEG6000 (二ッポンジーン） 42 1

dH₂0 100 1 にする

反応は 18°Cで 16時間行った。この反応物をフエノール処理にて除タンパクしエタノール沈殿にてオリゴキヤッビング RNAを回収した後 50^ 1 の dH₂0に溶解した。次にこのオリゴキヤッビング RNA を錄型にして一本鎖 cDNA を合成した。反応混合液は以下の通りである,

オリゴキヤッビング RNA 50

ランダムへキサマ一（20 Μ) 5

55 1

70 °Cで 10分間熱した後氷中にて冷却しさらに以下の試薬を加えた ₍

5x第一鎖バッファー（Gibco) 20 n 1

0.1 M DTT (Gibco) 10 1

20 dNTP 5 1

RNasin (Promega) 5 β 1

95 1

37°Cで 2分間保温し、さらに Superscript II (Gibco) 5μ 1 を加えて 37°Cで 30分間反応させた。反応の後 95°Cで 10分間加熱して dH₂0を加えて全量 500 1 としたものをオリゴキヤッビング cDNA とした。次にォリゴキヤッビング cDNA を铸型として PCRを行った。 PCRは 2回行い、 1回目の PCR産物を铸型として 2 回目の PCR に用いる nested PCR法を行った。 1回目の反応混合液は以下の通りである。オリゴキヤッピング cDNA 1

マー（配列番号 27)(20μΜ) 0.5 1

マー（配列番号 29)(20μΜ) 0.5

10x PCR バッファ一 2.5 1

2.5 mM dNTP 2.0 \

50% グリセロール 2.5 1

Taq DNA ポリメラ一ゼ 0.5 1

dH₂0 15.5 l

25 1

PCRは 95°Cで 5分（変性）を一回行った後、 94°Cで 30秒（変性）、 60°Cで 30 秒（アニーリング）、 72°Cで 1分（伸長）を 1サイクルとしてこれを 35 サイクル行った。そして最後に 72°Cで 5分反応させた。次にこの PCR 産物を铸型にしてさらに 2回目の PCRを行った。反応混合液は以下の通りである。 PCR 産物 1

マ一（配列番号 28) (20 μΜ) Q. 5 n\

マー（配列番号 30) (20 ζΜ) 0.5 1

10x PCR バッファ一 2.5

2.5 mM dNTP 2.0 1

50% グリセロール 2.5 1

Taq DNA ポリメラ一ゼ 0.5 ΐ

dH₂0 15.5 1

σ 5Τ 25 1

2回目の PCRのサイクルは 1回目と同様に行った。 2 ァガロースゲル電気泳動にて約 400塩基対の大きさの PCR産物が認められたので、この産物を pGEM- Τベクタ一にサブクローニングし、塩基配列を決定した [方法は（3- ii)及び（3-iii) に記載] 。塩基配列決定には配列番号 5及び 6に記載のプライマ一を用いた。得られたヒト RecQ4遺伝子の 5' 転写開始点領域の塩基配列を配列番号 34に示す。

(6) 塩基配列アセンブリによる全長 RecQ4 cDNAの構築

前記（3)、（4)及び（5)の結果得られたヒト RecQ4 cDNAの 4つの塩基配列を配列番号 31〜34 に示す。これらの配列は部分的に重複し、その相対的位置関係は図 7のように示すことができる。図 7において、転写開始領域は配列番号 34、 5' RACE産物は配列番号 32、部分 cDNAは配列番号 31、 3' RACE産物は配列番号 33 で表されるものである。

この領域を DNASYS ソフトを用いてコンピュータで解析し、上記 4つの塩基配列を繋げて RecQ4 cDNA 全長の配列を得ることができた。このようにして得られた cDMは、 3' 端の polyA配列を除く全長 3850 ヌクレオチドにより示された (配列番号 1 ) 。そのうちオープンリーディングフレーム（0RF)は 3624ヌクレオチドであり、これがコードするタンパク質は 1208 アミノ酸から成り、分子量 133070 ダルトンであることがわかった。また、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。〔実施例 2〕ヒト RecQ4型遺伝子のノーザンプロットによる解析

(1) ヒト RecQ4 型遺伝子のノーザンブロット解析

(1-i) ヒト多組織ノーザン（Multiple Tissue Northern; MTN-1 and - Π)プロッ卜

本実施例においては、市販のプリメイドフィルタ一（Clontech 社製）を使用して MTN プロットを行った。なお、プリメイドフィルタ一は、 16 種類のヒトの組織 ·臓器よリ抽出した poly(A)+ RNA 各 2 g をァガロース電気泳動にかけ、ナイロン膜にブロットすることによリ作製されたものである。

(1-ii) ヒト RecQ4 cDNAプローブ

ヒト RecQ4 cDNA の一部であるオープンリ一ディングフレーム（配列番号 1で表される塩基配列の第 2097-2417 番目の残基， 321bp)を後述の方法に従い放射性ラベルし、これをヒト RECQ4 遺伝子の検出プローブとして用いた。

(2) ハイプリダイゼ一シヨン

(2-i) プレハイブリダィゼーシヨン

フィルタ一を弁当箱型ポリ容器の中で、 100 ml のプレハイブリダィゼーションバッファ一に浸し、 42°Cで 4時間インキュベーションした。プレハイブリダィゼ一シヨンバッファーには、 50%ホルムアミド、 5 XSSPE、 lOxDenhardt's 溶液、 2% SDS及び lOOyUg/m 変性サケ精子 DNA断片を含むものを用いた。

(2-ii) ヒト RecQ4 cDNAプローブの放射性ラベリング

テンプレートとして前述のヒト RecQ4 cDNA 断片 50 ng、プライマーとしてランダムへキサマ一 50 pmol を用い、ランダムプライマ一 DNA ラベリングキット Ver.2 (宝酒造社製）により [a- ³²P]-dCTP (NEN 社製、第一化学薬品社製）で放射性ラベルした。

(2-iii) ハイブリダィゼ一シヨン

プレハイブリダィゼーシヨンバッファ一を棄て、新たに 50ml のプレハイプリダイゼ一ションバッファ一を加え、気泡がフィルタ一の下に入りこまないように穏やかに振盪した。これに [³²P]- dCTP で放射性ラベルしたプローブを比活性が約 1 Xl0^scpm/ml となるように加え、 42°Cで 16時間ハイプリダイズした。ハイブリダィゼ一シヨンの後、フィルタ一に対し、 100 ml の 2 X SSC、 0. 1 "% SDS溶液を用いて室温で 15分のリンスを 2回繰り返し、次に 100 mlの 0. 2 x SSC、 0. 1 % SDS溶液を用いて室温で 15分のリンスを 2回行った。

フィルターがやや湿った状態になるまで水分を除き、サランラップ（旭化成社製）にはさんで BAS 1500 システム（富士フィルム社製）によるオートラジオグラフィー解析を行った。

(3) Fuj i BAS 1500 システムによる解析

輝尽性蛍光体を用いた放射線エネルギーメモリ型 2次元センサ一（イメージングプレート； IP) に、 X線フィルム同様にサンプルを密着露光させ、この IP を He-Ne レーザー光で励起させ、露光量に応じて放出される蛍光を PSL (Photo St imul ated Lumi nescence) というデジタル量に変換して定量した。定量は BAS 1500 システムを用いた。このシステムによる定量値の直線性は良好であり、バックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強度の計測、比較が行える。

(4) ヒト RecQ4 mRNAの組織特異的発現結果

ヒト各組織 ·臓器由来の 2 poly(A) + RNA を含む MTN ブロット（CLONTECH 社製）に [ ^{3 2}P] 標識したヒト RecQ4 cDNAの一部である 0RF (配列番号 1で表される塩基配列の第 2097-2417番目； 321bp)をプローブにハイブリダィズさせた。ヒト RecQ4mRNA の発現は、各種の臓器で幅広く認められ、図 5のようなパターンを示した。すなわち、ヒト RecQ4 遺伝子は、全ての組織において発現し、特に、胸腺及び精巣において著しく強く発現してることが認められた。図 5において、 Po ly (A) + RNA の起源は以下の通りである。

a, i臓 b, 脳； c，胎盤； d，肺； e, 肝臓； f，骨格筋； g, 腎臓 h, 膝臓 i，脾臓； j，胸腺； k, 前立腺； 1 , 精巣； m，卵巣

n, 小腸 o，大腸； p，末梢血リンパ球産業上の利用可能性

本発明により、ヒト RecQ4 型遺伝子が提供される, 本発明のヒト RecQ4型遺伝子は、ヒ卜の恒常性維持及び細胞老化との関連を"^ 明するための研究に有用であると共に、発育及び老化に伴って発症する疾患の病因解明、症状の改善。緩和を目指す治療薬として、また、老化に伴う他の疾病との関連性のある病気の検査 '予防のための診断プローブとして、あるいは、ヒト個体の発生に関する医科学的、細胞生物学的、免疫学的、生化学的及び分子生物学的研究のための試薬として有用である。

Claims

請求の範囲以下の（a)又は（b)のタンパク質をコードする遺伝子。

(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質

(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において少なくとも 1個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリ力一ゼ活性を有するタンパク質

. 以下の（c)又は（d)の DNAを含む遺伝子。

(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA

(d) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジユントな条件下でハイブリダイズし、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA

. 請求項 1又は 2記載の遺伝子の少なくとも一部とハイブリダィズするオリゴヌクレオチドプローブ。

. 請求項 1又は 2記載の遺伝子を含有する組換えべクタ一。

. 請求項 4記載の組換えベクターを含む形質転換体。

. 請求項 5記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からへリカーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする前記タンパク質の製造方法。. 以下の（a)又は（b)の組換えタンパク質。

(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質

(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリ力一ゼ活性を有するタンパク質

. 請求項 7記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %のホモロジ一を有するアミノ酸配列を含む、マウス又はラット由来のへリカーゼ活性を有するタンパク質。

. 請求項 7又は 8記載のタンパク質と特異的に反応するモノクロナール抗体。 0 . 請求項 7又は 8記載のタンパク質と特異的に反応するポリクロナール抗体 1 . 請求項 7又は 8記載のタンパク質で免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、請求項 9記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。

2 . 請求項 3記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、ヘリ力一ゼをコードする遺伝子の検出用試薬。

3 . 請求項 7又は 8記載のタンパク質、並びに請求項 9記載のモノクロ一ナル抗体及び又は請求項 1 0記載のポリクローナル抗体を含む、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子異常により引き起こされる疾患の診断用キット。

4 . 請求項 8記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする、マウス又はラット由来の遺伝子。

5 . 請求項 1若しくは 2記載の遺伝子又は請求項 1 4記載の遺伝子の発現レべルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物。

6 . 請求項 1若しくは 2又は請求項 1 4記載の遺伝子の機能が失われるように処理されたノックアウトマウス。