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WO2007116800A1 - Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物 - Google Patents

Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物 Download PDF

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WO2007116800A1
WO2007116800A1 PCT/JP2007/056818 JP2007056818W WO2007116800A1 WO 2007116800 A1 WO2007116800 A1 WO 2007116800A1 JP 2007056818 W JP2007056818 W JP 2007056818W WO 2007116800 A1 WO2007116800 A1 WO 2007116800A1
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WO
WIPO (PCT)
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mda5
type
interferon
human
animal
Prior art date
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PCT/JP2007/056818
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shizuo Akira
Hiroki Kato
Osamu Takeuchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
University of Osaka NUC
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency, Osaka University NUC filed Critical Japan Science and Technology Agency
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a non-human animal in which the function of expressing MDA5 (Melanoma differentiation associated gene-5) has been lost, in which type I interferon response to infection with a virus belonging to the picornavirus family is deleted.
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene-5
  • Identification of anti-picornavirus agents using non-human model animals that are non-human model animals that do not respond to type I interferons and non-human models that do not respond to type I interferons It relates to methods.
  • PRR host pattern recognition receptors
  • TLR Toll-like receptor
  • PAMP pathogen-associated molecular patterns
  • TLR3 located in the endosomal membrane is known to recognize viral dsRNA in addition to the synthetic dsRNA analog polyinosine polycytidylic acid (poly I: C).
  • poly I polyinosine polycytidylic acid
  • RIG-1 Retinoic acid-inducible protein-1
  • MDA-5 Mellanoma differentiation associated gene-5
  • RIG-I is a DExDZHbox type RNA helicase with two domain (CARD) -like modules that recruit caspases.
  • the helicase domain is thought to be involved in dsRNA recognition, and CARD has been reported to be essential for the initiation of downstream signaling leading to the activity of IRF3, IRF7 and NF- ⁇ B (For example, refer nonpatent literature 3).
  • RIG-I-deficient mice consistently produce type I interferon (IFN) against vesicular stomatitis virus (VSV), Newcastle disease virus (NDV) and Sendai virus (SeV) infection. Can be reported (See, for example, Non-Patent Document 4).
  • IFN type I interferon
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • NDV Newcastle disease virus
  • SeV Sendai virus
  • MDA-5 has a structure similar to RIG I and has been reported to be involved in mediating antiviral responses (see, for example, Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6).
  • RIG-I and MDA5 are suggested to be involved in the recognition of viral dsRNA, in addition to the functional relationship between these dsRNA detectors in vivo, we are well aware of the functional role of MDA5. Be cunning. Thus, since the clear function of the dsRNA detector has not been elucidated, interferon responses based on these actions could not be suppressed in mammals.
  • Non-Patent Document 1 Annu Rev Immunol. 20, 197-216, 2002
  • Non-Patent Document 2 Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
  • Non-Patent Document 3 See Nat Immunol. 5, 730-737, 2004
  • Non-Patent Document 4 Immunity Vol.23 19-28 July 2005
  • Non-Patent Document 5 Curr Biol. 12, 838-843, 2002
  • Non-Patent Document 6 Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
  • An object of the present invention is to provide a picornavirus-specific type I interferon-refractory non-human model animal lacking the response of type I interferon to infection with a virus belonging to the picornavirus family, It is to provide a method for identifying an anti-picornavirus agent using a non-human model animal that does not respond to type I interferon.
  • MDA5 _ / -mice The inventors first established MDA5 _ / -mice in order to investigate the functional role of MDA5 in vivo.
  • MDA5 _ / _ mouse-derived fibroblasts and rod cells lack a type I interferon response to infection with encephalomyocarditis virus (EMCV) and Tyler virus (Thei ler's virus) belonging to the picornavirus family. Forces that were used Responsiveness to other RNA viruses was normal.
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • Tyler virus Thei ler's virus
  • the present invention is (1) inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of non-human animal that codes for MDA5 (Melanoma differentiation associated gene-5).
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene-5
  • non-human model animal force model mouse characterized in that it is a model mouse, and (3) an endogenous gene encoded by MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene— 5
  • the present invention provides (5) MDA5 (Melanoma differentiation associated gene—inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of a non-human animal that co-operates with 3).
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene—inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of a non-human animal that co-operates with 3.
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene—inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of a non-human animal that co-operates with 3
  • RANTES or IL-6 production is measured, and if the production of type I interferon, RANTES or IL 6 is observed, the test substance is evaluated as an anti
  • the present invention provides (8) MDA5 (Melanoma differentiation associated gene—inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of a non-human animal that co-operates with 3).
  • MDA5 Melnoma differentiation associated gene—inactive by gene mutation such as disruption, deletion, substitution, etc. of all or part of the endogenous gene of a non-human animal that co-operates with 3.
  • EMCV myocarditis virus
  • Type I interferon, RANTES or IL-6 in cells derived from wild-type animals of the same species as non-human animals characterized by evaluating the test substance as an anti-picornavirus.
  • the identification method according to (11) above characterized in that it is compared with the production amount of 6, and (13) the non-human animal is a mouse as described in (11) or (12) above And (14) the identification method according to any one of (11) to (13) above, wherein the cell is an embryonic fibroblast or a rod-shaped cell.
  • FIG. 1 a is a diagram showing the structures of a mouse MDA5 gene, a targeting vector, and a predicted disrupted gene. The country indicates coding exon. B; indicates BamHI.
  • Fig. 1b shows the results of Southern blot analysis of offspring from heterozygous intercross. Genomic DNA was extracted from the tail of the mouse, digested with BamHI, separated by electrophoresis, and hybridized with the radiolabeled probe shown in a. Southern blot showed that wild type (+ Z +) mice had a 9.4 kb single band, homozygous (one Z) mice had a 4.6 kb band, and heterozygous (+ Z) mice had both bands. Obtained.
  • FIG. 1c shows the results of Northern plot analysis of peritoneal exudate cells (PEC). Extract wild-type (WT) and MDA5_, PEC total RNA treated with 1000 U / ml IFN— ⁇ for 8 hours Northern blot analysis was performed for the expression of MDA5 mRNA. The same membrane was rehybridized with the j8 lactin probe.
  • Fig. 1d shows the results of Western blot analysis of MDA5 expression. WT and MDA5 _ / _ MEF were treated with lOOOUZml of IFN- ⁇ for 8 hours, and whole cell lysates were immunoblotted with MDA5 antibody.
  • FIG. 2 is intravenously display of the mouse, the 200 8 Poly 1: Ji Leave injected the indicated time, generation of IFN-a, IL 6 and IL 12p40 in serum
  • FIG. 3 is a view showing the results of measuring the ELISA with ELISA. Data are mean SD of serum samples.
  • FIG. 2c shows the results of analyzing the surface expression of CD86 by flow cytometry on spleen CDllc + B220_cDC of mice injected with PBS or poly I: C.
  • FIG. 2d shows the results of stimulation of WT, RIG—I—, and MDA5 _ / _ GMCSF—DC with poly I: C with increasing concentrations for 24 hours.
  • FIG. 1 The production of IFN- «, IL-6 and IL-12p40 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • Figure 2e shows the results of treating WT, RIG-1 _ / _ , and MDA5 _ / _ MEF with in vitro transcribed ds RNA of the indicated length that forms a complex with ribofactamine 2000 for 24 hours.
  • FIG. The production of IFN- ⁇ in the culture supernatant was measured by ELI SA. The error bars for d and e indicate 3 times S. D.
  • FIG. 3a is a diagram showing the results of infecting WT, RIG—I __ / _ , and MDA5 __ / _ MEF with the indicated minus-strand ss RNA virus.
  • the production of IFN- ⁇ in the culture supernatant was measured by E LISA.
  • B and c in FIG. 3 are diagrams showing the results of infecting WT, RIG—I—, and MDA5 MEF with the indicated positive strand ssRNA viruses, JEV (b) and EMCV (c).
  • 8 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • FIG. 3 d and e are diagrams showing the results of infecting WT, RIG-1 _ / _ , and MDA5 _ / _ GMCSF-DC with EMCV with gradually increasing moi.
  • the production of IFN-a (d) and IL-6 (e) in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • F and g in FIG. 3 temporarily transfect WT and RIG—I—, MDA5 ” ⁇ MEF with a reporter construct that includes the IFN—
  • the cells are then infected with EMCV or Se VCm and subjected to luciferase assembly
  • the error bars a, b, c, d, and e indicate the three SDs.
  • FIG. 4 shows 2 X 10 7 pfu JEV, RIG-1 + / _ , RIG- I, MDA5 + / _ and M
  • FIG. 4 shows the results of measuring the production level of IF N- ⁇ by ELISA, after injecting intravenously into DA5 _ / _ mice, and collecting serum of mouse force 24 hours after the injection. Bars show average values.
  • FIG. 4b is a graph showing the results of monitoring the survival of display mice (6 weeks old) infected with 2 ⁇ 10 7 pfu JEV via vein over 15 days.
  • FIG. 4c shows the results of monitoring the survival of mice (3 weeks old) infected intranasally with 4 ⁇ 10 6 pfu VS V over 9 days.
  • Fig. 5b shows the results of monitoring the survival of display mice (6 weeks old) intraperitoneally infected with 10 fu EMCV every 6 hours for 6 days.
  • Figure 5c shows the result of MDA5 and MDA5 __ / _ mice being infected intraperitoneally with 10 fu EMCV.
  • FIG. Fig. 5d shows the results of histological changes evaluated by hematoxylin and eosin staining on the heart of MDA5 + / _ and MDA5 __ / _ mice 2 days after infection. . Arrows indicate focal necrosis of cardiomyocytes.
  • Figures 5e and f show the results of an echocardiographic assessment of cardiac function 48 hours after EMCV infectivity.
  • E in Fig. 5 is a translucent view of transthoracic echocardiography in M mode of MDA5 + / _ and MDA5 ___ / _ mice 48 hours after EMCV infectivity.
  • F in Fig. 5 shows the shortening rate (FS) after infection confirmed by echocardiography.
  • FIG. 6 shows the results of Northern blot analysis of MEFs.
  • WT wild type
  • IFN— ⁇ The expression of IP 10 mRN ⁇ was examined.
  • the 28S and 18S ribosomal RNA bands on the gel stained with ethidium bromide were used as RNA loading controls.
  • FIG. 7 shows that WT (wild type) and MDA5 GMCSF—DCs are infected with the moi-increased Tyler virus (Theiler's virus) or Mengovirus (Mengovirus) for 24 hours, and in the culture supernatant. It is a figure which shows the result of having measured the production amount of IFN-a of ELISA by ELISA.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the amount of IFN- ⁇ produced in the culture supernatant by ELISA.
  • the non-human model animal of the present invention all or part of the endogenous gene of MDA5-encoding non-human animal is inactivated by gene mutation such as destruction / deletion / substitution, and MDA5 is expressed. If the non-human animal has lost its function to prevent infection with type I interferon against infection with a virus belonging to the picornavirus family, it is not particularly limited.
  • the method of the present invention includes a non-human animal in which all or part of the endogenous gene encoding MDA5 is inactivated by a gene mutation such as disruption / deletion / replacement and the function of expressing MDA5 is lost.
  • type I interferon unresponsiveness refers to the reactivity of the living body or the cells, tissues or organs of type I interferon to infection (stimulation) with a virus belonging to the picornavirus family. It means that it has been reduced, lost power, or almost lost. Therefore, in the present invention, the type I interferon-nonresponsive human model animal is a type I interferon-producing reactivity of a living body or a cell, tissue or organ constituting the living body against infection with a virus belonging to the picornavirus family. This refers to non-human animals such as mice, rats, and rabbits that have lost or are almost lost.
  • a type I interferon non-responsive model mouse can be preferably exemplified.
  • the type I interferon-nonresponsive human animal of the present invention is preferably non-responsive to RANTES and IL 6 in addition to type I interferon non-responsiveness.
  • the virus belonging to the Picornaviridae family is a single positive chain RN.
  • An RNA virus with the genome of A, which has no envelope, has an icosahedral force psid, and has a small RNA (pico-rna).
  • Viruses belonging to the genus Enterovirus such as viruses, Coxsackie virus, Echovirus
  • viruses belonging to the genus Rhinovirus such as human rhinovirus, Mengo virus
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • Parechoviruses such as viruses belonging to the genus Cardiovirus, viruses belonging to the genus Aphthovirus such as foot-and-mouth disease virus, hepatouinoleus genus such as hepatitis A virus, and human parechovirus Mention may be made of viruses belonging to the genus.
  • Examples of non-human animals that have lost the function of expressing MDA5 of the present invention include MDA5 _ / _ mice and rodents such as MDA5 _ / _ rats that lack MDA5 gene function. be able to.
  • MDA5 As the non-human animal whose function deficient genes that may be obtained with wild-type littermates capable of birth to come MDA5 _ / _ non-human animal force accurate comparative experiment following the law of Mendel Is preferable. A method for producing such an animal deficient in the function of the MDA5 gene will be described below using MDA5 __ mice as an example.
  • the MDA5 gene can be screened using a probe derived from the mouse MDA5 gene after a mouse gene library is amplified by PCR or the like.
  • the screened MDA5 gene can be subcloned using a plasmid vector or the like, and can be identified by restriction enzyme mapping and DNA sequencing.
  • all or part of the gene encoding MDA5 is replaced with pMCl neo gene cassette, etc., and diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or simple herpesvirus thymidine kinase (
  • a target vector is prepared by introducing a gene such as the HSV-tk) gene.
  • the produced targeting vector is linearly introduced and introduced into ES cells by the electro-poration method (electroporation) method, and homologous recombination is performed.
  • GANC ganciclovir
  • the confirmed ES cell clone Is microinjected into the blastocyst of the mouse, and the earning blastocyst is returned to the temporary parent mouse to produce a chimeric mouse.
  • hetero contact coalescing mouse F1 mouse; MDA5 + / _
  • MDA5 _ of the present invention / _Mice can be made.
  • RNA is isolated from the mouse obtained by the above method and examined by Northern blotting or the like. There are methods to examine the expression of MDA5 in Western blotting.
  • the produced MDA5 __ / _ mouse force-type interferon non-responsiveness means that, for example, viruses belonging to the picornavirus family can be used for macrophages, mononuclear cells, rod cells, etc. of MDA5 mice. This can be confirmed by infecting immune cells or embryonic fibroblasts in vitro or in vivo, and measuring the amount of type I interferon, IL-6, RANTES, etc. produced in vigorous cells.
  • all or part of the endogenous gene of the non-human animal encoding MDA5 is inactivated by gene mutation such as disruption 'deletion' substitution
  • a non-human animal that has lost the function of expressing MDA5 is infected with a virus belonging to the Picornavirus family, and a test substance is administered before, after, or simultaneously with the virus infection, and the non-human animal type I interferon, RANTES or
  • a method for evaluating the test substance as an anti-picornavirus agent, or for non-human animals encoding MDA5 All or part of the endogenous gene is inactivated by gene mutations such as deletion or replacement, and cells derived from non-human animals that have lost the function of expressing MDA5 are treated with picornavirus family.
  • the method is not particularly limited as long as the test substance is evaluated as an anti-picornavirus agent.
  • the method for identifying an anti-picornavirus agent of the present invention Can be used to screen for anti-picornavirus agents. A powerful form of implementation of the identification method of the present invention The state will be described below with an example.
  • the type I interferon-unresponsive non-human model animal power of the present invention is obtained by combining immune cells such as rod-shaped cells and embryonic fibroblasts, a test substance, and a virus belonging to the picornavirus family. After culturing and measuring and evaluating the degree of type I interferon production in the cells, or after administering the test substance to the type I interferon non-responsive non-human animal model of the present invention, An identification method for infecting immune cells capable of obtaining human animal power with a virus belonging to the Picornavirus family and measuring the degree of type I interferon production in the immune cells, or the type I interferon non-responsiveness of the present invention After infecting a human model animal with a virus belonging to the picornavirus family in advance, the immune cells capable of obtaining the non-human animal power can be obtained in the presence of the test substance.
  • the level of RANTES or IL-6 production can also be measured.
  • the anti-EMCV agent of the present invention can be identified by destroying or deleting all or part of the endogenous gene of non-human animal encoding MDA5 (Melanoma differentiation asso dated gene-5). Infect non-human animals that have lost their ability to express MDA5 by infecting with myocarditis virus (EMCV) belonging to the Picornavirus family, and administer the test substance before, after, or simultaneously with EMCV infection.
  • MDA5 myocarditis virus
  • the histological analysis of the heart of the non-human animal is performed and suppression of focal necrosis of cardiomyocytes is observed, it is not particularly limited as long as it is an identification method for evaluating the test substance as an anti-EMCV agent,
  • the anti-EMCV agent of the present invention Anti-EMCV agents can be screened using standard methods. In the evaluation, it is preferable to compare and evaluate the degree of suppression of focal necrosis of cardiomyocytes in wild-type animals of the same species as non-human animals, particularly litter pups.
  • the MDA5 gene was isolated from genomic DNA from which ES cell (GSI-I) force was also extracted by PCR.
  • a simple perpes virus driven by the PGK promoter by constructing a targeting vector by substituting the neomycin-resistant gene cassette (neo) for the MDA50RF (including DEXH box) 4.3-kb fragment.
  • Thymidine kinase (HSV-TK) was inserted into the genomic fragment for negative selection.
  • HSV-TK Thymidine kinase
  • MyD88 mice, TLR3 _ / _ mice, and TRIF mice were prepared by the method described in the literature Sceience 301, 640-3 (2003).
  • IFN ⁇ / ⁇ R _ / _ mice were prepared by the method described in Int Immunol 14 1225-31 (2002).
  • RIG-adult mice were produced by crossing with ICR mice.
  • RIG—I heterozygote (RIG—I + / _ ) mouse and an MDA5 heterozygote (MDA5 + / _ ) mouse are crossed, their children become RIG—I + / + MDA5 + / + , RIG— I + / _ MDA5 + / + , RI G— I + / + MDA5 + / _ , RIG— I + / _ MDA5 + / _
  • genomic DNA extracted from the mouse tail should be used, and PCR or Southern blotting should be used. It can be identified more.
  • RIG- by mating the mouse between each other I + / _ MDA5 + / _ genotype, RIG- I + / + MDA5 + / +, RIG- I + / _ MDA5 + / +, RI G — I + / + MDA5 + / _ , RIG— I + / _ MDA5 + / _ , RIG— l _MDA5 + / + , RIG— I— / _ MDA5 + / _ , RIG— I + / + MDA5 _ / _ , RIG— I + / + MDA5 _ / _ , RIG— I + / _ MDA5 __ / _ , RIG— I + / _ MDA5 __ / _ , RIG— I __ / _ MD A5 __ / _ _ _ _ mice were identified by PCR or Southern plotting.
  • RIG—I—, MEF, and bone marrow-derived GMCSF or Flt3L—DC were prepared as described in literature Immunity 23, 19-28 (2005).
  • PDC and cDC were isolated from Flt3L-DC as described above by MACS using anti-B220 and CD1 lc microbeads manufactured by Miltenyi Biotech. Poly (I: C) was purchased from Amersham Biosciences.
  • An anti-MDA5 polyclonal antibody was produced corresponding to amino acids 1005-1019 of mouse MDA5.
  • NCV, VSV, INFNORE ENZYNORES, ANS1, JEV, EMCV, Tyler virus, and Mengovirus were prepared by methods described in the literature.
  • SeV (V—) and (Cm) mutants those provided by Dr. A. Kato were used.
  • MEF was treated with lOOOUZml of IFN—j8 for 8 hours.
  • the cells were then lysed in lysis buffer containing 1.0% Nonidet-P40, 150 mM NaCl, 20 mM Tris—Cl (pH 7.5), ImM EDTA and a protease inhibitor cocktail (Roche). Dissolved.
  • the cell lysate was lysed with SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. Plotting the membrane with the specific antibody of MDA5 protein and visualizing with enhanced fluorescence system (Perkinermer) [0028] (7) Histological analysis
  • EMCV infected mouse hearts were homogenized in PBS. Virus titration in PBS containing virus was confirmed with standard plaque assay as described above. The prepared HeLa cells were infected with serial dilutions. DMEM containing 1% low melting point agarose was overlaid on the cells and incubated for 48 hours. Thereafter, plaques were counted.
  • Embryo 11 MEF obtained from wild-type or RIG-I _ / _ MDA5 _ / -embryo in 5 days with empty beta (control), RIG-I or MDA5 expression vector and reporter containing IFN- ⁇ promoter Transfected temporarily with the construct.
  • Renilla luciferase construct was tranfected.
  • the culture supernatant was collected and analyzed for IFN-a, IL 6 or IL-12p40 production by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • An ELISA kit for mouse IFN- ⁇ was purchased from PBL Biomedical Laboratories, and an ELISA kit for IL-6, IL-12p40, and Rantes was obtained from R & D Systems.
  • mice were injected intravenously with 200 ⁇ g of poly I: C, and the mice were discarded 24 hours after the injection.
  • mouse spleen cells were also prepared using collagenase and DNasel. Spleen cells were stained with CD86-FITC (BD Biosciences Pharmingen), B220-PE, and CDlc-A PC, and analyzed with FACS Calibur (BD Bioscience). [0033] (12) Preparation of in vitro transcribed dsRNA
  • the mouse Lamin A / C cDNA sequence was amplified by PCR, cloned with the pT7 Blue T vector (Novagen) and sequenced. In another PCR reaction using primers tagged with the following T7 sequences, the ends of the 200 and 400 bp DNA sequences corresponding to mouse Lamin A / C were tagged with a T7 RNA polymerase promoter;
  • the PCT product was gel purified and used for in vitro transcription and production of dsRNA using the T7 RiboMAX TM Express RNAi System (Promega) as per manufacturer's instructions.
  • mice anesthetized with 5% avertin (8 ⁇ 1 / g) using an ultrasonography (SONOS-5500, equipped with a 15-MHz linear transducer, Philips Medical Systems). Echo examination was performed. The heart was projected as a two-dimensional parasternal short-axis image, and an M-mode echocardiogram of the mid ventricle was recorded at the papillary muscle level. LV heart rate, anterior and posterior wall thickness, and end-diastolic and end-systolic inner diameters were obtained from M-mode images.
  • MDA5 _ / _ mice were established and the contribution of MDA5 to virus recognition was analyzed (see Figures la and lb). MDA5 mRNA expression was not detected in MDA5 _ / _ cells, as was the case with MDA5 protein (see Figures lc and Id). In contrast to RIG—mice, many of whom die at the embryonic stage, MDA5 _ / _ mice are born and grow healthy according to Mendelian ratio, and no macroscopic developmental abnormalities are observed until age 24 weeks. I got it.
  • TLR3, RIG-I and MDA5 are believed to be involved in the recognition of poly I: C and the subsequent induction of antiviral responses. However, the in vivo contribution of these molecules in response to dsRNA stimulation has not yet been clarified. Therefore, the inventors next examined the in vivo response to poly I: C in mice deficient in RIG-I, MDA-5, TRIF, or both MDA-5 and TRIF.
  • MDA5 _ / _ TRIF _ / _ mice did not induce IFN-a, IL-6, and IL-12 ⁇ 40 in response to poly I: C (see FIG. 2b). These results indicate that MDA5 is essential for poly I: C-induced IFN- ⁇ production and TLR3 signaling is important for IL-12 production, while both MDA5 and TLR3 regulate IL 6 production. It shows that In addition to the induction of site force-in, poly-I: C treatment of wild-type mice also enhanced the surface expression of costimulatory molecules such as CD86 in conventional spleen DC!] (See Figure 2c). Absence of either MDA5 or TRIF did not affect CD86 expression.
  • inosinic acid is not used in the virus replication process in the natural state! Therefore, the present inventors synthesized long dsRNA by in vitro transcription and lacked MDA5 or RIG-I.
  • wild-type and MDA5 _ / _ MEF produced equivalent amounts of IFN- ⁇ (see Figure 2e).
  • RIG — I __ / _ MEF did not produce any detectable amount of IFN — ⁇ .
  • RNA viruses are classified into negative strand ssRNA virus, plus strand ssRNA virus, and dsRNA virus based on the genome structure.
  • RNA viruses are classified into negative strand ssRNA virus, plus strand ssRNA virus, and dsRNA virus based on the genome structure.
  • RIG-I a series of negative strand RNA viruses are recognized by RIG-I.
  • Vigorous viruses include V protein deficient (V-) or mutated C protein (Cm) SeV, M protein mutant deficient VSV (NCP), and influenza virus deficient in NS 1 protein (A NS I) is included.
  • V- V protein deficient
  • Cm mutated C protein
  • NCP M protein mutant deficient VSV
  • a NS I influenza virus deficient in NS 1 protein
  • RIG-I _ / _ MEF significantly impaired IFN- ⁇ production compared to wild-type cells, but MDA5 was responsible for the production of IFN- ⁇ in response to these viruses.
  • Paramyxovirus V proteins such as Sev have been shown to cooperate with MDA5 to suppress dsRNA-induced IFN production! /.
  • Both wild type and SeVV (-) induced expression of IP-10 gene and type I IFN in control and MDA5 MEF Fig. 2a and Fig. 6).
  • RIG-I- and MEF did not respond to both wild type and SeVV (-). This is related to the presence of virus inhibitory proteins This shows that Magna5 does not contribute to SeV recognition.
  • JEV Japanese encephalitis virus
  • a plus-strand ssRNA virus belonging to the flavivirus also did not require the force MDA5 that required RIG-I to produce IFN- ⁇ (Fig. 3b).
  • MDA5 GMCSF-DC which means that MDA5, which is not RIG-I, is an EMCV in MEF and conventional DC. It is indispensable for the recognition ( Figures 3d and 3e).
  • other viruses belonging to the Picornavirus family, Tyler virus and Mengo virus also induced IFN- ⁇ via MDA5 (Fig. 7).
  • pDC primarily uses the TLR system instead of RIG-I for the recognition of several RNA viruses.
  • MyD88 is an adapter protein involved in signaling of various TLRs except TLR3.
  • pDC highly expresses TLR7 and TLR9, and generates type I IFN in a MyD88-dependent manner upon exposure to the virus.
  • MDA5 is involved in virus detection in pDC
  • the present inventors exposed B220 + pDC purified from Flt3L-constructed BM-derived (Flt3L-DC) DC to EMCV, and IFN— ⁇ Production was measured.
  • PDC from MyD88 mice but not from MDA5 __ / _ mice showed a severe defect in IFN- ⁇ production.
  • mice infected with EMCV as a virus model recognized by MDA5 were examined.
  • serum of MDA5 mice induction of IFN-a, RANTES and IL-6 was severely reduced.
  • MDA5 is essential for the induction of humoral responses in vivo during EMCV infection ( Figure 5a). Therefore, the susceptibility of MDA5 _ / _ mice to EMCV infection was further investigated and compared with that of IFN-a, BR- ', MDA5 " ⁇ , RIG _ / _ , and TLR3 _ / _ mice.
  • the MDA5 __ / _ and IFN— mice were compared to the control littermate mice.
  • MDA5 specifically recognizes a virus of the picornavirus family.
  • MDA5 is a helicase, and by regulating this function, it is possible to control infection of viruses belonging to this group, such as poliovirus, Coxsaki virus, rhinovirus that is the cause of cold symptoms. There is sex.
  • MDA5 _ / _ mice are expected to be used as model mice for human viral infections by mating with gene mutant mice expressing human virus receptors.
  • drugs that control the activity of MDA5 can be screened using MDA5-deficient (MDA5 __ / _ ) mice and control (wild-type) mice, for example, mated with mice expressing the poliovirus receptor, It can be a model animal susceptible to poliovirus infection. This mouse can be used to screen for new drugs.

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Abstract

ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失した、ピコルナウィルス特異的Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物や、このＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用した抗ピコルナウィルス剤の同定方法などを提供するものである。ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する。

Description

I型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物
技術分野
[0001] 本発明は、 MDA5 (Melanoma differentiation associated gene- 5)を発現する機能を 喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物 として使用する方法や、 I型インターフ ロン不応答性非ヒトモデル動物や、この I型ィ ンターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用した抗ピコルナウィルス剤の同定方 法などに関する。
背景技術
[0002] ウィルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、 Toll様受容体（ TLR)及びへリカーゼファミリーメンバーのような宿主パターン認識受容体 (PRR)が 、病原体関連分子パターン (PAMP)と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識する ことによって惹起される (例えば、非特許文献 1及び非特許文献 2参照)。宿主パター ン認識受容体 (PRR)は、 DNA、一本鎖（ss) RNA、二本鎖（ds) RNA及び糖タンパ ク質を含むウィルスに特異的な分子パターンの認識に不可欠の役割を果たしている 。エンドソーム膜に局在する TLR3は、合成 dsRNAアナログであるポリイノシン ポリ シチジル酸（ポリ I : C)に加えてウィルスの dsRNAも認識することが知られている。ま た、細胞質タンパク質である RIG— I (Retinoic acid- inducible protein- 1)及びへリカー ドとしても知られる MDA— 5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)は、 dsRN Aディテクタ一として同定されている。 RIG— Iは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ CARD)様モジュールを 2個有する DExDZHbox型 RNAヘリカーゼである。ヘリ力 ーゼドメインは、 dsRNAの認識に関与していると考えられ、 CARDは、 IRF3、 IRF7 及び NF— κ Bの活性ィ匕を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須であること が報告されている (例えば、非特許文献 3参照)。また、 RIG -I欠損マウスは、水疱 性口内炎ウィルス (VSV)、ニューカッスル病ウィルス (NDV)及びセンダイウィルス (S eV)の感染に対して、一貫して I型インターフェロン (IFN)を産生しな 、ことが報告さ れている（例えば、非特許文献 4参照)。さらに、ウィルス感染に応答した IRF3及び N F - κ Bの活性ィ匕は、 RIG— I欠損細胞で障害されていた。また、 MDA— 5は、 RIG Iに類似した構造を有し、抗ウィルス応答の媒介に関与していることが報告されてい る (例えば、非特許文献 5及び非特許文献 6参照)。
[0003] RIG— I及び MDA5は、ウィルス dsRNAの認識に関与することが示唆されるものの 、インビボでのこれら dsRNAディテクタ一間の機能的関係に加え、 MDA5の機能的 役割にっ ヽては知られて ヽな 、。このように dsRNAディテクターの明確な機能が解 明されていないため、哺乳動物において、これらの作用に基づくインターフェロン応 答を抑えることはできな力つた。
[0004] 非特許文献 1： Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
非特許文献 2 :Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
非特許文献 3 : Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照
非特許文献 4: Immunity Vol.23 19-28 July 2005
非特許文献 5 : Curr Biol. 12, 838-843, 2002
非特許文献 6 : Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対する I型ィ ンターフェロンの応答が欠失した、ピコルナウィルス特異的 I型インターフェロン不応 答性非ヒトモデル動物や、この I型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用 した抗ピコルナウィルス剤の同定方法などを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、まず、インビボでの MDA5の機能的役割を調べるため、 MDA5_/ —マウスを確立した。この MDA5_/_マウス由来の線維芽細胞、及び榭状細胞はピコ ルナウィルスファミリーに属する脳心筋炎ウィルス (EMCV)や、タイラーウィルス (Thei ler' s virus)の感染に対する I型インターフェロン応答が欠如していた力 他の RNAゥ ィルスに対する応答性は正常であった。このように、 MDA5がピコルナウィルス属のゥ ィルスを特異的に認識し、 I型インターフェロン産生を誘導する受容体であることを見 い出し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち本発明は、（1) MDA5 (Melanoma differentiation associated gene- 5)をコ ードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊 ·欠損 ·置換等の遺伝子 変異により不活性ィ匕し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピ コルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対する I型インターフェロンの応答 が欠失した I型インターフ ロン不応答性非ヒトモデル動物や、（2)非ヒトモデル動物 力 モデルマウスであることを特徴とする上記（1)記載の非ヒトモデル動物や、（3) M DA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5) コードする内在'性遺云子の全 部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 MDA5を発現す る機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染 に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型インターフェロン不応答性非ヒトモ デル動物として使用する方法や、（4)非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを 特徴とする上記（3)記載の方法に関する。
[0008」 また本発明は、（5) MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 3ノをコ' 卜 する非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊 ·欠損 ·置換等の遺伝子変異 により不活性ィ匕し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウイ ルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物 質を投与し、前記非ヒト動物における I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の 産生量を測定し、 I型インターフェロン、 RANTES又は IL 6の産生が認められた場 合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウイ ルス剤の同定方法や、（6)非ヒト動物と同種の野生型動物における I型インターフ 口 ン、 RANTES又は IL 6の産生量と比較 ·評価することを特徴とする上記（5)記載の 同定方法や、（7)非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載 の同定方法に関する。
[0009」 さらに本発明は、（8) MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 3ノをコ' 卜 する非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊 ·欠損 ·置換等の遺伝子変異 により不活性ィ匕し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウイ ルスファミリーに属する心筋炎ウィルス (EMCV)を感染させ、 EMCV感染の前後又 は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的分析を行い、心筋細 胞の病巣壊死の抑制が認められた場合、前記被検物質を抗 EMCV剤と評価するこ とを特徴とする抗 EMCV剤の同定方法や、（9)非ヒト動物と同種の野生型動物にお ける心筋細胞の病巣壊死の抑制の程度と比較'評価することを特徴とする上記 (8) 記載の同定方法や、（10)非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（8)又は（ 9)記載の同定方法や、 (11) MD A5 (Melanoma differentiation associated gene- 5) をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊 ·欠損 ·置換等の遺 伝子変異により不活性化し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の 細胞に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後 又は同時に被検物質を前記細胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞における I 型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生量を測定し、 I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィル ス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法や、 (12)非ヒト動 物と同種の野生型動物由来の細胞における I型インターフェロン、 RANTES又は IL 6の産生量と比較'評価することを特徴とする上記（11)記載の同定方法や、（13) 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（11)又は（12)記載の同定方法や、 (14)細胞が、胚線維芽細胞又は榭状細胞であることを特徴とする上記（11)〜（13) のいずれか記載の同定方法に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1の aは、マウス MDA5遺伝子、ターゲテイングベクター及び予測された破壊 遺伝子の構造を示す図である。國はコーディングェクソンを示す。 B;BamHIを示す 。図 1の bは、ヘテロ接合体のインタークロスによる子孫のサザンブロット分析結果を 示す図である。ゲノム DNAをマウスの尾から抽出し、 BamHIで分解し、電気泳動で 分離して、 aに示した放射性標識プローブとハイブリダィズした。サザンブロットにより 、野生型（+Z+)マウスには 9. 4kbのシングルバンド、ホモ接合体（一 Z ）マウスに は 4. 6kbのバンド、ヘテロ接合体 (+Z ）マウスには両方のバンドが得られた。図 1 の cは、腹腔滲出細胞 (PEC)のノーザンプロット分析結果を示す図ある。 1000U/ mlの IFN— βで 8時間処理した野生型（WT)及び MDA5_, PECの全 RNAを抽 出し、 MDA5の mRNAの発現について、ノーザンブロット分析を行った。同じ膜を j8 ァクチンプローブと再度ハイブリダィズした。図 1の dは、 MDA5発現のウェスタンブロ ット分析結果を示す図ある。 WT及び MDA5_/_MEFを lOOOUZmlの IFN— βで 8時間処理し、全細胞溶解液を MDA5の抗体でィムノブロットした。
[図 2]図 2の a及び bは、表示のマウスの静脈内に、 200 8のポリ1 :じを表示した時間 注入しておき、血清中の IFN— a、 IL 6及び IL 12p40の生成を ELISAで測定 した結果を示す図である。データは、血清試料の平均値士 S. D.である。図 2の cは 、 PBS又はポリ I : Cを注入されたマウスの脾臓 CDl lc+B220_cDCについて、 CD8 6の表面発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。図 2の dは、 WT 、 RIG— I—, 、及び MDA5_/_GMCSF— DCを、濃度を次第に増大させたポリ I : C で 24時間刺激した結果を示す図である。培養上清中の IFN— «、 IL— 6及び IL— 1 2p40の生成を ELISAで測定した。図 2の eは、 WT、 RIG— 1_/_、及び MDA5_/_ MEFを、リボフヱクトァミン 2000と錯体を形成する、表示した長さのインビトロ転写 ds RNAで 24時間処理した結果を示す図である。培養上清中の IFN— βの生成を ELI S Aで測定した。 d及び eのエラーバーは、 3回の士 S . D.を示す。
[図 3]図 3の aは、 WT、 RIG— I_/_、及び MDA5_/_MEFを、表示したマイナス鎖 ss RNAウィルスに感染させた結果を示す図である。培養上清中の IFN— αの生成を E LISAで測定した。図 3の b及び cは、 WT、 RIG— I—, 、及び MDA5 MEFを、 表示したプラス鎖 ssRNAウィルス、 JEV (b)及び EMCV (c)に感染させた結果を示 す図である。培養上清中の IFN— |8の生成を ELISAで測定した。図 3の d及び eは、 WT、 RIG— 1_/_、及び MDA5_/_GMCSF— DCを、 moiを次第に増大させた EM CVに感染させた結果を示す図である。培養上清中の IFN— a (d)及び IL— 6 (e)の 生成を ELISAで測定した。図 3の f及び gは、 WT及び RIG— I—, MDA5"^ MEF を、 IFN— |8プロモーターを含み、さらに表示した発現ベクターを含む又は含まない レポーターコンストラクトで一時的にトランスフエタトし、その後、細胞を EMCV又は Se VCmに感染させ、ルシフェラーゼアツセィにかけた結果を示す図である。 a、 b、 c、 d 、及び eのエラーバーは、 3回の間の士 S. D.を示す。
[図 4]図 4の aは、 2 X 107pfuの JEVを、 RIG— 1+/_、 RIG— I 、 MDA5+/_及び M DA5_/_マウスの静脈内に注入し、注入の 24時間後、マウス力も血清を採取し、 IF N— αの生成レベルを ELISAで測定結果を示す図である。バーは、平均値を示す。 図 4の bは、静脈経由で 2 X 107pfuの JEVに感染させた表示マウス（6週齢）の生存を 15日間にわたってモニターした結果を示す図である。図 4の cは、 4 X 106pfuの VS Vに鼻内感染させたマウス（3週齢)の生存を 9日間にわたってモニターした結果を示 す図である。
[図 5]図 5の aは、 107pfuの EMCVを、 MDA5+ 及び MDA5_/_マウス（n= 5)に 静脈接種し、注入の 4時間後に血清を採取し、 IFN— α、 Rantes及び IL— 6の生成 レベルを ELISAで確認した結果を示す図である。図 5の bは、 10 fuの EMCVに腹 腔内感染させた表示マウス (6週齢)の生存を、 12時間ごとに 6日間にわたってモニタ 一した結果を示す図である。図 5の cは、 MDA5 マウス及び MDA5_/_マウスを 、 10 fuの EMCVに腹腔内感染させた、 48時間後、マウスを処分し、心臓内のウイ ルス価をプラークアツセィで確認した結果を示す図である。図 5の dは、感染から 2日 後の MDA5+/_及び MDA5_/_マウスの心臓につ!、て、へマトキシリン及びェオシ ン染色によって組織学的変化を評価した結果を示す図である。矢印は、心筋細胞の 病巣壊死を示す。図 5の e及び fは、 EMCV感染力も 48時間後の心機能を心エコー 検査により評価した結果を示す図である。図 5の eは、 EMCV感染力も 48時間後の MDA5+/_及び MDA5_/_マウスの Mモードによる経胸壁心エコー検査の透写図 である。図 5の fは、心エコー検査により確認した感染後の短縮率 (FS)を示す図であ る。
[図 6]図 6は、 MEFsのノーザンブロット分析結果を示す図である。 WT (野生型）、 RI G— 1_/_、及び MDA5_/_MEFsを moi= 10の SeV V (―)で感染させ、抽出した 全 RN Aをノーザンブロット分析に供し、 IFN— βと IP 10の mRN Αの発現を調べた。 ェチジゥムブロマイドで染色されたゲル上の 28S及び 18Sリボソーム RNAのバンドを RNA loadingコントロールとして使用した。
[図 7]図 7は、 WT (野生型）及び MDA5 GMCSF— DCsを moiの増加したタイラ 一ウィルス (Theiler' s virus)又はメンゴウィルス (Mengovirus)に 24時間感染させ、培 養物の上澄み中の IFN— aの産生量を ELISAで測定した結果を示す図である。 [図 8]図 8は、 MACSによって MyD88_/_、 MDA5_/_、及び MDA5_/_Flt3L— DCsから分離された B220+及び B220—CD1 lc+細胞を moi= 1の EMCVで 24時 間感染させ、培養物の上澄み中の IFN— αの産生量を ELISAで測定した結果を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明の非ヒトモデル動物としては、 MDA5をコードする非ヒト動物の内在性遺伝 子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 MDA5を 発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピコルナウィルスファミリーに属する ウィルスの感染に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型インターフェロン不 応答性の非ヒト動物であれば特に制限されず、また、本発明の方法としては、 MDA5 をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異によ り不活性化し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスフ アミリーに属するウィルスの感染に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型ィ ンターフ ロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する方法であれば特に制限され ず、上記 I型インターフェロンとしては、 IFN— αや IFN— βを具体的に例示すること ができる。
[0012] 本発明において I型インターフェロン不応答性とは、ピコルナウィルスファミリーに属 するウィルスによる感染 (刺激）に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しく は器官の I型インターフェロン産生反応性が低下して 、る力、あるいはほぼ失われて いることを意味する。したがって、本発明において I型インターフェロン不応答性非ヒト モデル動物とは、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスによる感染に対して、生 体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の I型インターフェロン産生反応性が 低下している力、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ゥサギ等のヒト以外の動物 をいう。これらの中でも、 I型インターフェロン不応答性モデルマウスを好適に例示す ることができる。本発明の I型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物は、 I型イン ターフェロン不応答性に加えて、 RANTESや IL 6に対しても不応答性であること が好ましい。
[0013] ピコルナウィルスファミリー（Picornaviridae)に属するウィルスは、一本のプラス鎖 RN Aをゲノムとしてもつ RNAウィルスで、エンベロープを持たず、正 20面体の力プシド を有し、小さな RNA(pico-rna)を持つという意味で名付けられたこのピコルナウィル スフアミリーに属するウィルスとしては、ポリオウイルス、コクサツキ一ウィルス、エコーゥ ィルスなどのェンテロウィルス属（Enterovirus)に属するウィルスや、ヒトライノウィルス、 メンゴウィルスなどのライノウィルス属（Rhinovirus)に属するウィルスや、脳心筋炎ウイ ルス (EMCV)などのカーディォウィルス属（Cardiovirus)に属するウィルスや、 口蹄疫 ウィルスなどのァフトウィルス属（Aphthovirus)に属するウィルスや、 A型肝炎ウィルス などのへパトウイノレス属（Hepatovirus)に属するウイノレスゃ、 Human parechovirusなど の Parechovirus属に属するウィルスを挙げることができる。
[0014] 本発明の MDA5を発現する機能を喪失した非ヒト動物として、 MDA5_/_マウスの 他、例えば MDA5遺伝子の機能が欠損した MDA5_/_ラット等の齧歯目動物を例 示することができる。これら MDA5遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メン デルの法則に従い出生してくる MDA5_/_非ヒト動物力 正確な比較実験をすること ができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかる MDA5遺伝子の 機能が欠損した動物の作製方法を、 MDA5_/_マウスを例にとって以下説明する。
[0015] MDA5遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーを PCR法等により増幅し、得られた遺 伝子断片をマウス MDA5遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることがで きる。スクリーニングされた MDA5遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクロ ーンし、制限酵素マッピング及び DNAシーケンシングにより特定することができる。 次に、この MDA5をコードする遺伝子の全部又は一部を pMClネオ遺伝子カセット 等に置換し、 3'末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント（DT— A)遺伝子や単純へ ルぺスウィルスのチミジンキナーゼ (HSV—tk)遺伝子等の遺伝子を導入すること〖こ よって、ターゲットベクターを作製する。
[0016] この作製されたターゲテイングベクターを線状ィ匕し、エレクト口ポレーシヨン (電気穿 孔)法等によって ES細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中 から、 G418やガンシクロビア（GANC)等の抗生物質により相同的組換えを起こした ES細胞を選択する。また、この選択された ES細胞が目的とする組換え体力どうかを サザンプロット法等により確認することが好まし 、。その確認された ES細胞のクローン をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、カゝかる胚盤胞を仮親のマウスに戻 し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接 合体マウス（F1マウス； MDA5+/_)を得ることができ、また、このへテロ接合体マウス を交雑させることによって、本発明の MDA5_/_マウスを作製することができる。また 、 MDA5_/_マウスにおいて、 MDA5が生起しているかどうかを確認する方法として は、例えば、上記の方法により得られたマウスから RNAを単離してノーザンブロット法 等により調べたり、またこのマウスにおける MDA5の発現をウェスタンブロット法等に より調べる方法がある。
[0017] また、作出された MDA5_/_マウス力 型インターフェロン不応答性であることは、 例えば、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを MDA5 マウスのマクロファ ージ、単核細胞、榭状細胞などの免疫細胞や胚線維芽細胞にインビトロ又はインビ ボで感染せしめ、力かる細胞における I型インターフェロン、 IL— 6、 RANTES等の 産生量を測定することにより確認することができる。
[0018] 本発明の抗ピコルナウィルス剤の同定方法としては、 MDA5をコードする非ヒト動 物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊 '欠損'置換等の遺伝子変異により不活 性化し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリ 一に属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を投与し、 前記非ヒト動物における I型インターフェロン、 RANTES又は IL 6の産生量を測定 し、 I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生が認められた場合、前記被検 物質を抗ピコルナウィルス剤と評価する方法や、 MDA5をコードする非ヒト動物の内 在性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の細胞に、ピコルナウィルスファ ミリ一に属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を前記 細胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞における I型インターフ ロン、 RANTE S又は IL— 6の産生量を測定し、 I型インターフェロン、 RANTES又は IL 6の産生 が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価する方法であれば 特に制限されず、本発明の抗ピコルナウィルス剤の同定方法を利用すると、抗ピコル ナウィルス剤をスクリーニングすることもできる。力かる本発明の同定方法の実施の形 態を以下に例を挙げて説明する。
[0019] 本発明の I型インターフ ロン不応答性非ヒトモデル動物力 得られる榭状細胞等 の免疫細胞や胚線維芽細胞と、被検物質と、ピコルナウィルスファミリーに属するウイ ルスとを共に培養し、前記細胞における I型インターフェロン産生の程度を測定'評価 する同定方法や、本発明の I型インターフ ロン不応答性非ヒトモデル動物に被検物 質をあら力じめ投与した後、該非ヒト動物力も得られる免疫細胞にピコルナウィルスフ アミリーに属するウィルスを感染させ、該免疫細胞における I型インターフェロン産生の 程度を測定'評価する同定方法や、本発明の I型インターフ ロン不応答性非ヒトモ デル動物にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスをあらかじめ感染した後、該 非ヒト動物力も得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけ る I型インターフェロン産生の程度を測定'評価する同定方法や、本発明の I型インタ 一フエロン不応答性非ヒトモデル動物にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを 感染させ、感染と同時又は前後して被検物質を投与し、該非ヒトモデル動物力 得ら れる免疫細胞における I型インターフ ロン産生の程度を測定'評価する同定方法や 、本発明の I型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物にピコルナウィルスファミリ 一に属するウィルスを感染させ、感染と同時又は前後して被検物質を投与し、該非ヒ トモデル動物から得られる血清中の I型インターフェロン産生の程度を測定.評価する 同定方法を挙げることができる。上記 I型インターフェロン産生の程度を測定する代わ りに、 RANTES又は IL— 6の産生の程度を測定することもでき、また、評価に際して は、非ヒト動物と同種の野生型動物、中でも同腹の仔における I型インターフ ロン、 RANTES又は IL 6の産生量と比較 ·評価することが好まし!/、。
[0020] 本発明の抗 EMCV剤の同定方法としては、 MDA5 (Melanoma differentiation asso dated gene-5)をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 •置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 MDA5を発現する機能を喪失させた非ヒト 動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する心筋炎ウィルス (EMCV)を感染させ、 E MCV感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的 分析を行い、心筋細胞の病巣壊死の抑制が認められた場合、前記被検物質を抗 E MCV剤と評価する同定方法であれば特に制限されず、本発明の抗 EMCV剤の同 定方法を利用すると、抗 EMCV剤をスクリーニングすることもできる。また、評価に際 しては、非ヒト動物と同種の野生型動物、中でも同腹の仔における心筋細胞の病巣 壊死の抑制の程度を比較'評価することが好ましい。
[0021] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例
[0022] [材料と方法]
( 1) MDA5 マウスの作製
PCRにより、 ES細胞（GSI— I)力も抽出したゲノム DNAから MDA5遺伝子を単離 した。 MDA50RF (DExH boxを含む）をコードする 4. 3— kbの断片をネオマイシ ン耐性遺伝子カセット (neo)で置換することによりターゲテイングベクターを構築し、 P GKプロモーターにより動力された単純ペルぺスウィルスチミジンキナーゼ（HSV—T K)を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に挿入した。ターゲテイングベクターを ES 細胞にトランスフエタトした後、 G418とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、 PCRによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌 の C57BL/6マウスにマイクロインジェクションし、 MDA5_/_マウスを得るために、 ヘテロ接合体の F1子孫をインタークロスした。
[0023] (2) MyD88_/—マウス、 TRIF_/_マウス、 TLR3_/_、TRIF マウス及び RIG— I — マウスの作製
MyD88 マウス、 TLR3_/_マウス、 TRIF マウスについては、文献 Sceience 301 , 640-3 (2003)に記載の方法により作製した。また、 IFN α / β R_/_マウスは、 Int Immunol 14 1225-31 (2002)に記載の方法により作製した。さらに、 ICRマウスとの 交配により、 RIG— 成体マウスを作製した。
[0024] (3) RIG— I_/_MDA5_/_マウスの作製
RIG— Iへテロ接合体(RIG— I+/_)マゥスとMDA5へテロ接合体（MDA5+/_)マ ウスとを交配すると、その子は RIG— I+/+MDA5+/+、 RIG— I+/_MDA5+/+、 RI G— I+/+MDA5+/_、 RIG— I+/_MDA5+/_のどれ力となる。この遺伝子型はマウ ス尾より抽出したゲノム DN Aを用 ヽ、 PCR法もしくはサザンブロット法を用いることに より同定することが出来る。このうち、 RIG— I+/_MDA5+/_の遺伝子型のマウス間 同士で交配させることにより、 RIG— I+/+MDA5+/+、 RIG— I+/_MDA5+/+、 RI G— I+/+MDA5+/_、 RIG— I+/_MDA5+/_、 RIG— l _MDA5+/+、 RIG— I— /_MDA5+/_、 RIG— I+/+MDA5_/_、 RIG— I+/_MDA5_/_、 RIG— I_/_MD A5_/_、のどれ力となる。このうち、 RIG— I_/_MDA5_/_マウスを PCR法もしくは サザンプロット法により同定した。
[0025] (4)細胞、試薬及びウィルス
RIG— I—, MEF及び骨髄由来 GMCSF又は Flt3L— DCの作製については、文 献 Immunity 23, 19-28 (2005)記載のとおり作製した。 Miltenyi Biotech社製の抗 B 22 0及び CD1 lcマイクロビーズを用 、た MACSにより、 Flt3L - DCから pDC及び cD Cを前述のとおり単離した。ポリ（I : C)は、 Amersham Biosciences社から購入した。抗 MDA5ポリクローナル抗体は、マウス MDA5のアミノ酸 1005— 1019に対応して作 製された。 NCV、 VSV、インフノレエンザゥイノレス、 A NS1、 JEV、 EMCV、タイラーゥ ィルス、及びメンゴウィルスは、それぞれ文献に記載されている方法で作製した。 SeV (V—）及び (Cm)変異体は、 Dr. A. Katoから供与されたものを使用した。
[0026] (5)ノーザンブロット
lOOOUZmlの IFN— βを用いて又は用いずに、 PECを 8時間処理し、 TRIzol試 薬（Invitrogen社製）を用いて全 RN Aを抽出した。 RNAを電気泳動にかけ、ナイロン 膜に転写した後、表示の cDNAプローブとハイブリダィズさせた。 MDA5 mRNAの 発現を検出するため、 308bpの断片（777— 1084)をプローブとして使用した。同じ 膜を βァクチンプローブと再度ハイブリダィズさせた。
[0027] (6)ウェスタンブロット
lOOOUZmlの IFN— j8で MEFを 8時間処理した。その後、 1. 0%の Nonidet- P40 、 150mMの NaCl、 20mMの Tris— Cl (pH7. 5)、 ImMの EDTA及びプロテア一 ゼ阻害剤カクテル (Roche社製)を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。 SDS -PA GEで細胞溶解物を溶解し、 PVDF膜に転写した。カゝかる膜を MDA5タンパク質の 特異抗体でプロットし、増強したィ匕学発光システム (Perkinermer社製）により視覚化し [0028] (7)組織学的分析
EMCV感染マウス力 心臓を採取し、 3. 7%のホルムアルデヒドで固定した。心臓 全体にわたって横断面の切片（5 μ m)を切り出し、へマトキシリンとェォシンで染色し た。
[0029] (8)プラークアツセィ
EMCV感染マウスの心臓を PBS中でホモジナイズした。 PBS含有ウィルスにおけ るウィルス滴定を、前述のとおりに標準プラークアツセィで確認した。調製した HeLa 細胞を連続希釈物に感染させた。 1 %の低融点ァガロースを含む DMEMを細胞に 重ね、 48時間インキュベーションした。その後、プラークを計数した。
[0030] (9)ルシフェラーゼアツセィ
胎生 11. 5日で野生型又は RIG— I_/_MDA5_/—胚から得た MEFを、空のベタ ター（コントロール）、 RIG— I又はMDA5発現べクターと共にIFN— βプロモーター を含むレポーターコンストラクトで一時的にトランスフエタトした。内部コントロールとし て、ゥミシィタケ（Renilla)ルシフェラーゼコンストラクトをトランスフエタトした。トランスフ ェタトした細胞には模擬処理 (Mock)を行うか、又は moiを次第に増大させた EMCV に、若しくは SVc— (moi= 20)に 24時間感染させた。細胞を溶解させて、二重ルシ フェラーゼレポーターアツセィシステム（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアツセ ィにかけた。
[0031] ( lO) lFN - a、 IL 12p40、 IL 6及び Rantes生成の測定
培養上清液を回収し、酵素免疫吸着測定法 (ELISA)で IFN— a、 IL 6又は IL — 12p40の生成を分析した。マウス IFN— α用の ELISAキットは PBL Biomedical La boratories社から購入し、 IL— 6、 IL— 12p40、及び Rantes用の ELISAキットは、 R & D Systems社から入手した。
[0032] (11)フローサイトメトリー
マウスの静脈内に 200 μ gのポリ I : Cを注入し、注入から 24時間後にマウスを処分 した。前述のとおり、コラゲナーゼ及び DNaselを用いてマウスカも脾細胞を調製した 。 CD86— FITC (BD Biosciences Pharmingen社製）、 B220— PE、及び CDl lc— A PCで脾細胞を染色し、 FACS Calibur (BD Bioscience社製）で分析した。 [0033] (12)インビトロ転写 dsRNAの調製
マウス Lamin A/Cの cDNA配列を PCRで増幅し、 pT7ブルー Tベクター（Novagen 社製）にてクローン化し、配列決定した。以下の T7配列でタグしたプライマーを用い た別の PCR反応により、マウス Lamin A/Cに対応する 200及び 400bpの DNA配列 の末端に、 T7RNAポリメラーゼプロモーターをタグした；
T7 Lamin.フォワード、 TAATACGACTCACTATAGGacttgttggctgcgcaggc T7 Lamin. 200リバース、 TAATACGACTCACTATAGGccactcgcctcagcatct cat
T7 Lamin. 400リノ ース、 TAATACGACTCACTATAGGctgttccacctggtcctca tg
PCT産物をゲル精製し、 T7 RiboMAX™Express RNAi System (Promega社製）を製造 者の説明書どおりに用いての dsRNAのインビトロ転写及び作製に使用した。
[0034] (13)心エコー検査
2. 5%のアベルチン（8 μ 1/g)で麻酔をかけたマウスに対し、超音波検査（SONOS -5500、 15— MHzの線形変換器を装備、 Philips Medical Systems社製）を用いて心 エコー検査を行った。心臓は、二次元胸骨傍短軸像で映し出され、心室中央部 (mid ventricle)の Mモードによる心エコー図を乳頭筋のレベルで記録した。 LVの心拍数、 前壁及び後壁の厚さ、並びに拡張終期及び収縮末期の内径を Mモードによる画像 から得た。
[0035] [結果]
インビボでの MDA5の機能的役割を調べるため、 MDA5_/_マウスを確立し、ウイ ルス認識に対する MDA5の寄与を分析した（図 la及び lb参照）。 MDA5の mRNA の発現は、 MDA5タンパク質の場合と同様に、 MDA5_/_細胞では検出されなかつ た（図 lc及び Id参照)。その多くが胚期に死亡する RIG— マウスとは対照的に、 MDA5_/_マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、 24週齢まで巨 視的な発達異常は認められなカゝつた。脾臓及びリンパ節における CD3、 B220、 CD 11cのフローサイトメトリー分析により、野生型と MDA5_/_マウスとの間には、リンパ 球及び榭状細胞の数にぉ ヽて変化がな!ヽことを確認した。 [0036] TLR3、 RIG—I及びMDA5は、ポリ I : Cの認識及びその後の抗ウィルス応答の誘 導に関与しているとされている。しかし、 dsRNA刺激に対する応答におけるこれらの 分子のインビボでの寄与については、まだ明らかにされていない。したがって、本発 明者らは次に、 RIG— I、 MDA— 5、 TRIF、又は MDA— 5と TRIFの両方を欠損し たマウスにおけるポリ I : Cへのインビボでの応答について調べた。意外にも、ポリ I : C を投与すると野生型及び RIG— I—, マウスのいずれの血清中でも、 IFN- a、 IL 6及び IL— 12が急速に誘導され、 RIG— Iがインビボにおけるポリ I : Cを介した応答 に不可欠ではないことが示された（図 2a参照)。これとは際立って対照的に、 MDA5 ―' マウスがポリ I : Cに応答して IFN— αを生成することはなぐ IL— 6及び IL— 12ρ 40の生成も、かなり減少していた。また、 TRIF マウスは通常量の IFN— aを生 成していた力 IL— 12p40の生成は著しく減少しており、 IL— 6の生成もかなり減少 していた。さらに、 MDA5_/_TRIF_/_マウスがポリ I : Cに応答して IFN— a、 IL— 6及び IL— 12ρ40を誘導することはなかった（図 2b参照）。これらの結果は、 MDA5 はポリ I : C誘導性の IFN— α生成に不可欠であり、 TLR3シグナリングは IL— 12の 生成に重要である一方で、 MDA5及び TLR3の両方が IL 6の生成を調節すること を示している。サイト力インの誘導に加え、野生型マウスのポリ I : C処理によっても、従 来の脾臓 DCにおける CD86などの共刺激分子の表面発現が増力!]した（図 2c参照） 。 MDA5又は TRIFの一方が欠損していても CD86発現に影響はなかった力 二重 欠損では結果的に CD86のアップレギュレーションが阻害された。このことは、 MDA 5シグナリング及び TLR3シグナリングの両方力 インビボにおけるポリ I： C応答性の c DC活性ィ匕に関与していることを示している。 GM— CSFを用いて作製した骨髄由来 DC (GMCSF-DC)をポリ I： Cで刺激すると、野生型又は RIG— 1_/—マウスの!/、ず れかの細胞は、ポリ I : Cに応答して投与量依存的に IFN— a、 IL— 6及び IL— 12p4 0を生成する。これとは対照的に、 MDA5 GMCSF—DCでは、これらのサイト力 インの生成がひどく減少していた（図 2d参照)。したがって、細胞質中では、 RIG— I ではなく MDA5がポリ I： Cを主に認識して!/、ることを確認した。
[0037] しかし、イノシン酸は自然状態でのウィルス複製過程では利用されな!、ため、本発 明者らはインビトロ転写により長鎖 dsRNAを合成し、 MDA5又は RIG— Iを欠損して いるマウスの胚線維芽細胞（MEF)における IFN応答を調べてみた。リポフエクシヨン 試薬との錯体を形成するマウスラミン (Lamin) AZCの配列に対応する、長さの異なる 2つの dsRNA (200bp及び 400bp)で、 MEFを刺激した。ポリ I : Cの場合とは異なり 、野生型及び MDA5_/_MEFは同等量の IFN— βを生成した（図 2e参照）。 RIG — I_/_MEFは、検出可能量の IFN— βをまったく生成しなかった。これは、 RIG— I 力 Sインビトロ転写 dsRNAの検出に不可欠であることを示している。また、他のいくつ かの配列に対応するインビトロ転写 dsRNAは、 MDA5ではなく RIG— Iを介して I型 I FNを誘導していた。総合的に考えて、これは MDA5と RIG— Iがポリ I : C及びインビ トロ転写 dsRNAの検出にそれぞれ差別的に関与している証拠となる。
これらの知見から、本発明者らは、 RIG—I及びMDA5が異なるRNAゥィルスの検 出に関与しているとの仮説を立てた。 RNAウィルスは、ゲノム構造に基づいて、マイ ナス鎖 ssRNAウィルス、プラス鎖 ssRNAウィルス、及び dsRNAウィルスに分類される 。本発明者らは以前に一連のマイナス鎖 RNAウィルスが RIG— Iに認識されることを 示している。本発明者らはまず、 NDV、 Sev、 VSV、及びインフルエンザウイルスを 含む一連のマイナス鎖 ssRNAウィルスに応答した、 MDA5 MEFにおける IFN αの生成について調べた。 NDV以外の大半の野生型ウィルスの感染は、ウィルス 性タンパク質により IFN応答が抑制されるために MEF中で IFN— aを誘導しないこ とから (データは図示せず)、本発明者らはウィルス阻害タンパク質を欠損した変異ゥ ィルスも使用した。力かるウィルスには、 Vタンパク質を欠損した (V- )又は変異した C タンパク質を有する（Cm) SeV、 Mタンパク質の変異体を欠損した VSV (NCP)、及 び NS 1タンパク質を欠損したインフルエンザウイルス（ A NS I)が含まれる。図 3aに 示されるように、野生型細胞に比べて RIG— I_/_MEFでは IFN— αの生成がひど く損なわれているが、 MDA5はこれらのウィルスに応答した IFN— αの生成には不 可欠ではなかった。 Sevなどのパラミクソウィルスの Vタンパク質は、 MDA5と協同し て dsRNA誘導性の IFN生成を抑制することが示されて!/、る。野生型及び SeVV ( - )は共に、コントロール及び MDA5 MEFにおいて IP— 10遺伝子及び I型 IFNの 発現を誘導した（図 2a及び図 6)。また、 RIG— I—, MEFは、野生型及び SeVV (— )のいずれにも応答しな力つた。このことは、ウィルス阻害タンパク質の存在とは関係 なぐ MDA5が SeV認識に寄与していないことを示している。フラビウィルスに属する プラス鎖 ssRNAウィルスである日本脳炎ウィルス (JEV)も、 IFN— βの生成に RIG— Iを必要とした力 MDA5を必要とすることはなかった（図 3b)。
[0039] 次いで、ピコルナウィルスファミリーに属するプラス鎖 ssRNAウィルスである脳心筋 炎ウィルス（EMCV)に対する MEFの IFN応答を調べた。意外にも、 EMCV誘導性 の IFN— βの生成は、 MDA5_/_MEFにおいては阻害されていた（図 3c)。これに 対し、野生型及び RIG— I_/_MEFでは同等量の IFN— βが生成されており、これ は、 EMCVが MDA5に特異的に認識されていることを示している（図 3c)。また、 E MCVに応答した IFN— α及び IL— 6の生成は、 MDA5 GMCSF— DCでは阻 害されており、このことは、 RIG— Iではなぐ MDA5が、 MEF及び従来の DCにおけ る EMCVの認識に不可欠であることを示している（図 3d及び 3e)。さらに、ピコルナゥ ィルスファミリーに属するその他のウィルスであるタイラーウィルス及びメンゴウィルスも 、 MDA5を介して IFN— αを誘導していた（図 7)。
[0040] 次に、 SeVCm又は EMCVへの暴露に応答した IFN— βの誘導が完全に阻害さ れた、 RIG— I—, MDA5 二重欠損 MEFに RIG— I又は MDA5発現ベクターを トランスフエタトすることにより、再構成実験を行った（図 3f)。 MDA5ではなくヒト RIG —Iの局所的発現によって、 SeVCm応答性の IFN— |8プロモーター活性ィ匕が生じ た。逆に、 RIG— Iではなくヒト MDA5を発現する細胞は、投与量依存的に EMCVに 応答して IFN— |8プロモーターを活性ィ匕させた（図 3f)。これらの結果はヒト RIG— I 及び MDA5が異なる RNAウィルスを認識して!/、ることを示して!/、る。
[0041] これまでの研究で、 pDCが、数種の RNAウィルスの認識において、 RIG— Iの代わ りに TLRシステムを主に利用していることが示されている。 MyD88は、 TLR3を除く 各種 TLRのシグナリングに関与するアダプタータンパク質である。 pDCは TLR7及び TLR9を高発現し、ウィルスへの暴露により I型 IFNを MyD88依存的に生成する。 p DCにおけるウィルス検出に MDA5が関与しているのかどうかに取り組むため、本発 明者らは Flt3L構築 BM由来（Flt3L - DC) DCから精製した B220+pDCを EMCV に暴露し、 IFN— αの生成を測定した。 MDA5_/_マウス由来ではなく MyD88 マウス由来の pDCは、 IFN— αの生成に深刻な欠陥を示した。これは、 RIG— I及び MDA5の!、ずれもが pDC中で重要な役割を果たして!/ヽな 、ことを示して!/、る（図 8) 。逆に、 Flt3L— DCから精製された B220—の従来の DCにおける IFN— αの生成 には、 MyD88ではなく MDA5が必要である（図 8)。これらの結果は、 MDA5と RIG —Iはいずれも、 pDC中の IFN— αのウィルス性誘導には不可欠ではないことを示し ている。
[0042] また、ウィルス感染に対する宿主の防御における MDA5又は RIG— Iのインビボで の役割について調べた。 RIG— マウスは、ほとんどが胚期に死亡する力 ICR マウスと交配させることにより、本発明者らは生存成体マウスを効率的に得ることがで きた。成体 RIG— マウスは巨視的な発達異常を全く示さず、 20週齢を過ぎても 生存していた。マウスを JEVに感染させると、 RIG— マウスでは同腹子のコント口 ールマウスと比較して、血清中の IFN— αレベルが顕著に低下した。これに対し、 Μ マウスは、 JEV誘導性の全身性 IFN— α生成については大きな欠陥を示さ なかった（図 4a)。コントロールマウスと比較してより JEVに感染しやすかつたのは MD A5 マウスではなく RIG— I—, マウスであった力 これは、上記知見に一致してい る（図 4b)。また、 VSV感染により死亡したのは MDA5_/_マウスではなく RIG— 1_/ —マウスであつたが、これは IFN応答が阻害されたことと一致する（図 4c)。このように 、 RIG— Iを介した一連のウィルスの認識は、インビボでの抗ウィルス宿主防御におい て重要な役割を果たして 、る。
[0043] さらに、 MDA5に認識されるウィルスモデルとしての EMCVに感染したマウスを検 証した。 MDA5 マウスの血清では、 IFN— a、 RANTES及び IL— 6の誘導が ひどく減少していた。これは、 EMCV感染時のインビボでの体液性応答の誘導には MDA5が不可欠であることを示している（図 5a)。そのため、さらに EMCV感染に対 する MDA5_/_マウスの感受性を調べ、それを IFN— a , B R—' 、 MDA5"^ 、 R IG_/_、及び TLR3_/_マウスの場合と比較した。図 5bに示すように、 MDA5_/_及 び IFN— マウスは、コントロールである同腹子のマウスと比較して、 EM
CV感染に対する感受性が高力つた。これに対し、 1¾0— 1又は11^3の欠損はぃず れも、 EMCV感染マウスの生存には影響しな力つた。 EMCVは心筋細胞に選択的 に感染し、心筋炎を引き起こすことが知られている。コントロールマウスと比較して M DA5_/_マウスでは心臓内のウィルス価が際立って高ぐこれは、 EMCVへの感受 性が増大していることと一致していた（図 5c)。 EMCV感染 2日後の心臓の組織学的 分析により、心筋細胞の病巣壊死が MDA5_/_マウスで発達していたことが明らか になったが、野生型マウスの心臓は、その時点では組織学的な異常を全く示してい なかった（図 5d)。注目すべきは、この時点で免疫細胞の浸潤が野生型又は MDA5 _/一のいずれの心臓切片にも認められな力つたことである。 EMCV感染に応答した 心臓機能の変化を評価するため、感染の 2日後に心エコー検査で心仕事量を分析し た（図 5e)。短縮率 (FS)で判断した心臓収縮能は、 MDA5_/_マウスではひどく低 下していた（野生型 48. 2±4. 9%対 MDA5 21. 2± 5. 8%)。このことは、 MD A5_/_マウスがウィルス誘導性心筋症による重篤な心不全を起こしたことを示唆して いる（図 5f)。このように、 MDA5を介した EMCVの認識は、心筋機能障害を予防す るためだけではなく抗ウィルス応答を引き起こすための前提条件である。総合的に考 えて、これらの結果は、異なるグループの RNAウィルスの認識、及びその後の I型 IF N及び炎症性サイト力インの生成において、 RIG— I及び MDA5が不可欠な役割を 果たして!/ヽることを明白に示して!/、る。
産業上の利用可能性
本発明において、 MDA5がピコルナウィルスファミリーのウィルスを特異的に認識し ていることを明らかにした。 MDA5はへリカーゼであり、この機能を調節することで、こ のグループに属するウィルス群、例えばポリオウイルス、コクサツキ一ウィルス、風邪症 候群の原因であるライノウィルスなどの感染制御が可能になる可能性がある。また、 MDA5_/_マウスはヒトウィルス受容体を発現する遺伝子変異マウスと交配させること によりヒトウィルス感染症のモデルマウスとして利用されることが期待される。さらに、 M DA5の活性を制御する薬剤を MDA5欠損（MDA5_/_)マウス、及びコントロール（ 野生型)マウスを用いてスクリーニングすることができ、例えばポリオウイルス受容体を 発現するマウスと交配させ、ポリオウイルス感染感受性のモデル動物となりうる。この マウスを用いて新しい薬剤のスクリーニングに利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)をコードする ヒト動物の内在 性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 M DA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピコルナウィルスファミリーに 属するウィルスの感染に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型インターフエ ロン不応答性非ヒトモデル動物。
[2] 非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項 1記載の非ヒトモデ ル動物。
[3] MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)をコードする内在'性遺伝子の 全部又は一部を破壊 ·欠損'置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 MDA5を発現 する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感 染に対する I型インターフェロンの応答が欠失した I型インターフェロン不応答性非ヒト モデル動物として使用する方法。
[4] 非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項 3記載の方法。
[5] MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)をコードする ヒト動物の内土 性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 M DA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する ウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト 動物における I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生量を測定し、 I型イン ターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピ コルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法。
[6] 非ヒト動物と同種の野生型動物における I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6 の産生量と比較'評価することを特徴とする請求項 5記載の同定方法。
[7] 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の同定方法。
[8] MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)をコードする ヒト動物の内在 性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 M DA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する 心筋炎ウィルス (EMCV)を感染させ、 EMCV感染の前後又は同時に被検物質を投 与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的分析を行い、心筋細胞の病巣壊死の抑制が 認められた場合、前記被検物質を抗 EMCV剤と評価することを特徴とする抗 EMCV 剤の同定方法。
[9] 非ヒト動物と同種の野生型動物における心筋細胞の病巣壊死の抑制の程度と比較 · 評価することを特徴とする請求項 8記載の同定方法。
[10] 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 8又は 9記載の同定方法。
[11] MDA5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)をコードする ヒト動物の内土 性遺伝子の全部又は一部を破壊'欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性ィ匕し、 M DA5を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の細胞に、ピコルナウィルスファミリ 一に属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を前記細 胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞における I型インターフェロン、 RANTES 又は IL— 6の産生量を測定し、 I型インターフェロン、 RANTES又は IL— 6の産生が 認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする 抗ピコルナウィルス剤の同定方法。
[12] 非ヒト動物と同種の野生型動物由来の細胞における I型インターフ ロン、 RANTES 又は IL 6の産生量と比較'評価することを特徴とする請求項 11記載の同定方法。
[13] 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 11又は 12記載の同定方法。
[14] 細胞が、胚線維芽細胞又は榭状細胞であることを特徴とする請求項 11〜13の 、ず れか記載の同定方法。
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