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WO1999002698A1 - Arn polymerase - Google Patents

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Publication number
WO1999002698A1
WO1999002698A1 PCT/JP1998/003037 JP9803037W WO9902698A1 WO 1999002698 A1 WO1999002698 A1 WO 1999002698A1 JP 9803037 W JP9803037 W JP 9803037W WO 9902698 A1 WO9902698 A1 WO 9902698A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna polymerase
amino acid
wild
type
phage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/003037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihide Hayashizaki
Masanori Watahiki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Gene KK
RIKEN
Original Assignee
Nippon Gene KK
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Gene KK, RIKEN filed Critical Nippon Gene KK
Priority to DE69833112T priority Critical patent/DE69833112D1/de
Priority to EP98929851A priority patent/EP0939130B1/en
Priority to US09/254,344 priority patent/US6867027B1/en
Priority to CA2265884A priority patent/CA2265884C/en
Publication of WO1999002698A1 publication Critical patent/WO1999002698A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a mutant RNA polymerase useful for a method for determining a nucleotide sequence of DNA and the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR raw There are various methods for purifying the product, for example, an electrophoresis purification method, an ethanol precipitation method, a gel filtration method, and an HPLC purification method (eg, ⁇ Dorit R. et al. (1991)). urrent Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11 ". However, both methods are complicated.
  • the second problem is the rapid renaturation of PCR products. If the PCR product regenerates into double-stranded DNA, it will no longer be a single-stranded template (type II), preventing annealing between the primer and the single-stranded template. Methods for minimizing regeneration include quenching after denaturation, biotilation of one primer and adsorption of PCR products to streptavidin-coated, exonucleolytic The use and the use of asymmetric PCR were reported. For example, Barbara Bachmann et al., 1990, Nucleic Acid
  • the present inventor has proposed that the unreacted primer remaining in the PCR reaction system and the 2 'deoxyribonucleoside 5' triphosphate (2, dNTPs)
  • 2, dNTPs 2 'deoxyribonucleoside 5' triphosphate
  • This method is used to determine the RNA polymerase, such as T7 RNA polymerase, and the terminator of the RNA transcription reaction (eg, 3 'dexribonucleoside 5' triphosphat, 3 'd
  • This is a direct transcription sequence method using NTP s).
  • the nucleotide sequence of the DNA product amplified by the polymerase chain reaction can be used without removing the primer and the 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate (2'-dNTPs). It can be used for the sequence as it is. Furthermore, since the denaturation itself is not performed at all, the problem of rapid regeneration of the PCR product can be avoided, which is an extremely excellent method.
  • RNA polymerase such as T7 RNA polymerase comprises ribonucleoside 5 ′ triphosphophosphates composed of ATP, GTP, CTP and UTP or their derivatives and 3
  • the reaction is performed in a mixture of at least one 3'-deoxyribonucleotide consisting of 'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP or a derivative thereof.
  • polyribonucleotides are synthesized by sequentially incorporating ribonucleotides and deoxyribonucleotides having bases corresponding to the type I sequence into the ribonucleotide sequence. .
  • an object of the present invention is to provide an RNA polymerase that has little or no bias depending on the type of nucleotide with respect to this incorporation ability.
  • amino acid residues are represented by the one-letter notation conventionally used. Only amino acids appearing in the text are described for understanding, such as fenirarayun (F), tyrosine (Y), proline ( ⁇ ), leucine (shi), and histidine ( ⁇ ). Also, the number from the ⁇ end of the polymerase protein is indicated, for example, F667. This indicates that the amino acid residue at position 667 of this polymerase is F, and the description of F 667Y means that the amino acid residue F at position 667 has been substituted with ⁇ .
  • F fenirarayun
  • Y tyrosine
  • ⁇ proline
  • shi leucine
  • ⁇ histidine
  • the homogeneity of nucleotide incorporation in the sequence reaction using T7 DNA polymerase is the amino acid at position 526 in this polymerase. Is produced. Furthermore, it is described that changing the amino acid at the homologous site of another DNA polymerase based on the homology of the amino acid sequence of this enzyme and another DNA polymerase reduces the incorporation bias. That is, it is the cause of the small bias of the incorporation efficiency of 2'-dNTP and 2 ', 3'-ddNTP of Y7 (tyrosine) of T7 DNA polymerase.
  • F (phenylalanine) 762 of Escherichia coli DNA polymerase I and F (phenylalanine) 667 of Thermus aquaticus DNA polymerase (commonly referred to as Taq DNA polymerase)
  • T7 DNA polymerase Describes that the amino acid residue is a homologous amino acid residue of Y526, and that changing this amino acid residue to F762Y (tyrosine) and F667Y (tyrosine) reduces the incorporation bias.
  • RNA polymerase has never been used in the sequence method, and the difference in incorporation of ribonucleotides did not pose a problem in itself. Furthermore, under such circumstances, a mutant RNA polymerase that eliminated the difference in incorporation was not known.
  • the present inventor examined the modification of amino acids in a region corresponding to this region in T7 RNA polymerase, in which the position of F762 of Escherichia coli DNA polymerase I is in helix 0 of the finger one subdomain.
  • the helix Z in T7 RNA polymerase corresponding to helix 0 of E. coli DNA polymerase I based on the three-dimensional structure shown in the document of Sousa et al. (Nature, 364: 593-599, 1993), also has F (fue). Nilalanine) was not there.
  • the present inventor has provided an RNA polymerase having little or no bias due to the type of ribonucleotide and 3′-deoxyribonucleotide to this uptake ability. To do so, we independently searched for a new RNA polymerase. As a result, the present invention has been completed by finding an RNA polymerase having an increased ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotide or a derivative thereof by modifying a part of the amino acids of wild-type RNA polymerase.
  • RNA polymerase of the present invention particularly the amino acid modification position thereof, is not suggested or taught in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-205874. This is a new part, which was found completely new this time. Summary of the Invention
  • the present invention comprises a wild-type RNA polymerase having at least one amino acid modified to increase its ability to incorporate a 3 'deoxyribonucleotide or a derivative thereof as compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase. It relates to an RNA volimerase.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence (first half) of T7 RNA polymerase, which is encoded by the T7 RNA polymerase gene on the T7 phage genome.
  • the upper row shows the base sequence, and the lower row shows the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number at the right end indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in the DNA sequence database GeneBank in the case of the nucleotide sequence, and the amino acid number is the first number of the T7 RNA polymerase.
  • M methionine
  • Figure 2 shows the amino acid sequence of the T7 RNA polymerase, encoded by the T7 RNA polymerase gene on the T7 phage genome (second half).
  • the upper row shows the base sequence, and the lower row shows the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number on the right end indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in the DNA sequence database GeneBank, and the amino acid number is the first M of T7 RNA polymerase. (Methionine) is 1 to indicate that it consists of 883 amino acid residues in full length.
  • Figure 3 shows a comparison of the amino acid sequences of the phage-derived RNA polymerases currently reported (first half). Based on the top T7 RNA polymerase, The same amino acid as limerase, one is deleted, and * at the bottom indicates that it is an amino acid common to all polymerases.
  • Figure 4 compares the amino acid sequences of phage-derived RNA polymerases that are currently reported (second half). Based on the top T7 RNA polymerase, ⁇ indicates the same amino acid as T7 RNA polymerase, one indicates deletion, and the bottom * indicates an amino acid common to all polymerases.
  • FIG. 5 is a detailed view of a site where a mutation site is introduced into T7 RNA polymerase. Open characters indicate that the amino acid has been mutated.
  • Figure 6 compares the amino acid sequences of T7 RNA polymerase and T3 RNA polymerase (first half). Based on the T7 RNA polymerase at the top, ⁇ indicates the same amino acid, 1 indicates deletion, and * at the bottom indicates an amino acid common to the two polymerases.
  • FIG. 7 is a comparison (second half) of the amino acid sequences of T7 RNA polymerase and T3 RNA polymerase. Based on the T7 RNA polymerase at the top, 'indicates that the amino acid is the same, one indicates deletion, and * at the bottom indicates an amino acid common to the two polymerases.
  • Figure 8 shows the sequences before and after residues 641-667 of T7 RNA polymerase and the corresponding amino acid sequences of T3 RNA polymerase, K11 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase in the corresponding regions. .
  • T7 RNA polymerase all residues are shown, but for corresponding T3, Kll, SP6, the same residues as T7.
  • Figure 9 shows expression of wild-type T7 RNA polymerase It is a construction drawing of plasmid and pT7R.
  • FIG. 10 shows the construction of pT7RF644Y, a plasmid that expresses mutant T7 RNA polymerase F644Y.
  • FIG. 11 is a construction diagram of pT7R-Xho, an improved plasmid of pT7R, having a restriction enzyme XhoI site in the T7 RNA polymerase gene.
  • FIG. 12 is a construction diagram of a plasmid, PT7RL665P / F667Y, which expresses a mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y.
  • FIG. 13 shows the improvement of the uptake rate of the dye terminator by the mutant T7 RNA polymerase.
  • Wild-type T7 RNA polymerase WT
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y F644Y
  • mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y F667Y
  • FIG. 14 shows the improvement in the uptake rate of the director and the mutant by the mutant T7 RNA polymerase F644Y. Displayed as an electrogram. Wild-type T7 RNA polymerase (WT), mutant T7 RNA polymerase F644Y (F644Y).
  • FIG. 15 shows the improvement of the uptake rate of dye terminator 1 by mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y. Displayed as an electrogram. Wild-type T7 RNA polymerase (WT), mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y (F667Y) C Figure 16 shows an example of a sequence reaction.Wild-type T7 RNA polymerase (WT), mutant T7 RNA polymerase F644Y (F644Y), The mutant T7 RNA polymerase was reacted with 665P / F667Y (F667Y). Both have the same sequence pattern, but in wild-type T7 RNA polymerase (WT) (top row), base calls do not function properly, and the base spacing is narrowed (base indications overlap). If the sequence is not correctly made,
  • FIGS. 18 (1) to 18 (4) show the results of improvement in the uptake rate of dye-terminator by mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y as an electrogram.
  • wild-type RNA polymerase refers to all naturally occurring RNA polymerases.
  • wild-type RNA polymerase is a wild-type RNA polymerase that has the ability to take up 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase. It may further have amino acid substitutions, insertions or deletions other than the modification aimed at increasing. That is, an RNA polymerase obtained by artificially modifying a wild-type RNA polymerase for a purpose other than the above is also included in the above-mentioned "wild-type RNA polymerase". However, it is appropriate that such substitution, insertion or deletion of the amino acid is performed within a range that maintains the activity as an RNA polymerase.
  • wild-type RNA polymerase examples include RNA polymerases derived from T7 phage, T3 phage, SP6 phage, and K11 phage. However, it is not limited to these RNA polymerases.
  • the “wild-type RNA polymerase” is obtained by artificially modifying a naturally occurring heat-resistant RNA polymerase and a naturally occurring RNA polymerase so as to have heat resistance (namely, amino acids Substitutions, insertions or omissions). However, it is appropriate that the modification for imparting heat resistance has been performed within a range that maintains the activity as RNA polymerase.
  • RNA polymerase as "wild-type RNA polymerase" Mutant RNA polymerase also becomes thermostable.
  • T7 RNA polymerase is known as an extremely specific promoter monospecific RNA polymerase.
  • the nucleotide sequence and production method of T7 RNA polymerase are described in Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: 2035-2039 (1984). Further, mass production has already been described in Zawadzki et al., Nucl. Acids Res., 19: 1948 (1991).
  • This phage-derived RNA polymerase unlike RNA polymerase of Escherichia coli and higher organisms, can perform a transcription reaction using only a single polypeptide (Chamberl in et al., Nature, 228: 227-231, 1970) c Therefore, it has become a good source for analyzing the transcription mechanism, and many mutants have been isolated and reported. In addition, the crystal analysis results are described in Sousa et al., Nature, 364: 593-599, 1993.
  • T3 phage that infects Escherichia coli, SP6 phage that infects Salmonella, and K11 phage-derived RNA polymerase that infects Klebsiel la pneumoniae are commonly used as highly specific promoter-specific RNA polymerases.
  • RNA polymerases are very similar in primary amino acid structure, promoter sequence, and the like, as described later.
  • the RNA polymerase of the present invention has an increased ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotide or a derivative thereof as compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase.
  • wild-type RNA polymerase has a lower incorporation of 3'-deoxyribonucleotides than ribonucleotides, This hindered the use of the column determination method.
  • the RNA polymerases of the present invention have been modified to increase their incorporation capacity for 3 'deoxyribonucleotides or their derivatives, preferably at least twice as much as the wild type.
  • 3′-deoxyribonucleotide tends to decrease particularly when a 3′-deoxyribonucleotide derivative having a fluorescent label attached to 3′-deoxyribonucleotide is used. Can also improve the incorporation of such 3, deoxyribonucleotide derivatives.
  • ribonucleotide means ribonucleoside 5 ′ triphosphates composed of ATP, GTP, CTP and UTP or derivatives thereof
  • 3 ′ deoxyribonucleotide is 3 ′ dATP, 3 ′ dGTP, 3 ′ dCTP and 3 ′ dUTP, and derivatives thereof refer to compounds in which these 3 ′ deoxyribonucleotides are, for example, fluorescently labeled.
  • RNA polymerase of the present invention is obtained by modifying at least one amino acid of the corresponding wild-type RNA polymerase. This will be described in detail below.
  • RNA polymerase mutant that has little or no bias in incorporation efficiency depending on the type of ribonucleotide or the like in T7 RNA polymerase. We considered building. In particular, the ability to mutate which amino acid in the wild-type RNA polymerase and, in the case of performing substitution as a mutation, what kind of amino acid should be substituted were actually created and examined. Finding that modifying at least one amino acid of the wild-type RNA polymerase can improve its ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives, The mutant RNA polymerase of the present invention has been completed.
  • the present inventors first constructed an expression plasmid pT7R into which a T7 RNA polymerase gene was inserted, and then constructed a mutant of the T7 RNA polymerase based on the expression plasmid pT7R. That is, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, and F882Y, which are mutant T7 RNA polymerases in which the F (phenylalanine) residue of T7 RNA polymerase was changed to a Y (tyrosine) residue, were constructed. The uptake ability was compared for the body.
  • the amino acid sequence of the wild-type T7 RNA polymerase is determined by the base number of the T7 phage DNA sequence (39,937 base pairs) of accession No. V01148 J02518 X00411 from GeneBank, a gene sequence database. It is based on the sequence coded in 3171-5822 (see Figures 1 and 2). The upper part of the sequence shown in FIGS. 1 and 2 is the base sequence, and the lower part is the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number at the right end indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in GeneBank, and the amino acid number is the first M (methionine) of T7 RNA polymerase. 1 indicates that it is composed of 883 amino acid residues in total length.
  • This amino acid sequence is the same as the amino acid sequence reported in Moffatt et al., J. Mol. Biol., 173 (2): 265-269, 1984.
  • the amino acid sequence of the wild-type T7 RNA polymerase gene and the number given to each amino acid in this specification are the sequences and numbers shown in FIGS. You.
  • the wild-type T7 RNA polymerase may further have amino acid substitution, insertion, or deletion other than the modification targeted in the present invention. Therefore, when the wild-type RNA polymerase to be introduced with a mutation for the purpose of the present invention is obtained by introducing another mutation into wild-type T7 RNA polymerase, particularly, such a mutation is caused by amino acid insertion or amino acid insertion.
  • the above amino acid numbers fluctuate in response to such insertions or deletions, and maintain T7 RNA polymerase activity even if the amino acid numbers differ from those shown in FIGS. 1 and 2.
  • T7 RNA polymerase having such an insertion or deletion is included in the category of the wild-type T7 RNA polymerase which introduces the mutation of the present invention in the present invention.
  • the amino acid sequence numbers for RNA polymerases other than T7 RNA polymerase are determined based on the sequence listings shown in FIGS. Further, the present invention may further have amino acid substitution, insertion or deletion other than the modification targeted in the present invention. Therefore, these amino acid sequences and their numbers are the same as in the case of T7 RNA polymerase, and if there is a mutation due to insertion or deletion of amino acids, the amino acid number will be changed according to such insertion or deletion. Although fluctuating, such a wild-type RNA polymerase having a mutation in a part thereof is also included in the category of the wild-type T7 RNA polymerase into which the mutation of interest of the present invention is introduced in the present invention.
  • the T7 RNA polymerase gene is purified to a specific primer upstream of the N-terminal amino acid region of the T7 RNA polymerase gene (T7Rpol-N: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG-3 '), and a primer specific to the downstream of the C-terminal amino acid region (T7Rpol-C: ⁇ '-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G- 3 '), and use PCR to synthesize Amplification and expression vector PT7R can be constructed (see Example 1).
  • T7Rpol-N 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG-3 '
  • T7Rpol-C ⁇ '-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G
  • the wild-type RNA polymerase based on the mutant RNA polymerase of the present invention is obtained by substituting an amino acid other than the modification intended in the present invention with respect to the sequences shown in FIGS. , Insertion or deletion, and the amino acid sequence reported by Grachev et al., In which the 623th and 665th residues are H and P, respectively, is also a variant of the present invention. Included in the wild-type RNA polymerase that is the base for RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase purified from Escherichia coli having the expression vector PT7R had sufficient RNA synthesis activity in vitro in the presence of DNA containing the T7 promoter. Based on this expression plasmid pT7R, Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, and F882Y were constructed as mutant T7 RNA polymerases, and the uptake capacity of these mutants was compared.
  • pT7R Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, and F882Y were constructed as mutant T7 RNA polymerases, and the uptake capacity of these mutants was compared.
  • mutant T7 RNA polymerase having the F644Y mutation in addition to the mutation for F644, a mutation in which L665 near F644 was changed to P in accordance with the report of Grachev et al. Described above was also introduced. In other words, a mutation was introduced as F644Y / 665P, and the effect of Examined. Also, in the mutant T7 RNA polymerase having the F667Y mutation, in addition to the mutation for F667, a mutation in which L665 near F667 was changed to P in accordance with the report of Grachev et al. Described above was also introduced. That is, the mutation was introduced as 665P / F667Y.
  • F644Y, F644Y / L665P, L665P / F667Y and F644Y / L665P / F667Y sufficiently maintain RNA synthesis activity, and have 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP,
  • Table 1 shows only the results of the L665P / F667Y mutant, and the F667Y mutant had the same uptake ability of the L665P / F667Y mutant.
  • the F644Y / L665P / F667Y mutant had the highest uptake capacity.
  • the uptake ability of the F644Y / F667Y mutant was almost equivalent to that of the F644Y / L665P / F667Y mutant.
  • the F782Y mutant retains RNA synthesis activity and has 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP,
  • the Y739F mutant of T7 RNA polymerase which corresponds to Y526 of T7 DNA polymerase, had 3 'dA, 3' dGTP,
  • the RNA polymerase of the present invention is an RNA polymerase in which at least one amino acid present in the “nucleotide binding site” of the polymerase has been modified. It can increase the ability to incorporate 3 'deoxyribonucleotides or other ribonucleotide analogs for ribonucleotides.
  • nucleotide binding site is, for example, an amino acid in a loop between helix Y and helix Z of wild-type RNA vomerase and a loop between helix Z and helix AA. It can be an amino acid in it.
  • the F residues of 733, 782 and 882 are present in a region other than the region corresponding to the loop, and are thought to face the inside of the kraft in the polymerase molecule. These F residues were also actually substituted with Y residues.
  • the present invention relates to an RNA polymerase modified in the amino acid in a region selected from the region corresponding to amino acid residues 641-667 of the RNA polymerase from T7 phage.
  • the region corresponding to amino acid residues 641-667 of the RNA polymerase from T7 phage corresponds to the aforementioned “nucleotide binding site”.
  • FIGS. 3 and 4 show the amino acid sequences of RNA polymerases derived from the above four phages in comparison. This comparison shows that the RNA polymerases from T7, T3, and K11 are very similar.
  • the amino acid sequences of RNA bulimerase derived from T7 and T3 phages have extremely high similarity. Both T7 and T3 phage are phage that infect E. coli, which is very similar in nature.
  • the promoter sequences recognized by the two RNA polymerases are similar, their recognition specificity is known to be extremely high.
  • RNA polymerase derived from T7 phage in RNA polymerase other than RNA polymerase derived from T7 phage
  • the region corresponding to residues 641-667 is amino acid residues 642-668 for RNA polymerase from T3 phage and amino acid residues 664-668 for RNA polymerase from K11 phage. 690, which means that the amino acid residues are 633-670 for RNA polymerase derived from SP6 phage.
  • RNA polymerases from T7, T3, and K11 are very similar and adapting the results for T7 RNA polymerase to other derived RNA polymerases with similar amino acid sequences (See Figure 8).
  • RNA polymerase examples include an RNA polymerase derived from T7 phage and having a tyrosine at an amino acid residue of 644 or 667. Further, an RNA polymerase derived from T3 phage and having tyrosine at amino acid residue 645 or 668 can also be exemplified. Further, RNA polymerase derived from K11 phage, which has a tyrosine at amino acid residues 664 to 669 or at 690, may be exemplified. Still further, RNA polymerase from SP6 phage, which has tyrosine between amino acids 633-638 or 670, can be exemplified.
  • amino acid modifications can be insertions or deletions, as well as amino acid mutations.
  • amino acid mutation is, for example, replacing at least one of the naturally occurring amino acids with tyrosine.
  • the naturally occurring amino acid to be substituted can be, for example, phenylalanine. However, it is not limited to phenylalanine and has the ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotides or other ribonucleotide analogs for the corresponding ribonucleotide. As long as it is a substitution of an amino acid that can increase the power.
  • the mutant T7 RNA polymerases F644Y, L644P / F667Y and F644Y / L665P / F667Y sufficiently retain the RNA synthesis activity, and further greatly improve the ability to take up 3 ′ dNTPs, The strong bias observed in the wild type was significantly reduced.
  • the mutant T7 RNA polymerase F644Y, L 665P / F667Y or F644Y / L665P / F667Y having such excellent characteristics, the transcription product can be used at a practical level beyond the DNA sequencing using DNA polymerase. This enables the base sequencing method.
  • Escherichia coli pT7RF644Y / 665P / F667Y (DH5a) which produces mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y, was approved by Life Science Research Depositary No. 6364 (FERM-BP-6364) in May 1998. 20 deposits.
  • the present invention provides a method for producing the RNA polymerase of the present invention, which comprises providing a nucleic acid molecule encoding an RNA polymerase, wherein one or more sites at one or more sites in a nucleotide base sequence are provided.
  • a method comprising mutating the nucleic acid molecule to mutate a base and then recovering the modified RNA polymerase expressed by the mutated nucleic acid molecule.
  • Preparation of a nucleic acid molecule encoding an RNA polymerase, introduction of a mutation into the nucleic acid molecule, and recovery of the modified RNA polymerase can all be performed using known methods. It can be constructed by the method of Wear.
  • type II is used to mutate the region between the restriction enzyme Hpa I and Nco I sites corresponding to the C-terminal side of the T7 RNA polymerase gene using PCR. Construct an expression plasmid into which is introduced. Then, when this expression plasmid is used to transform Escherichia coli DH5 and isopropyl-iS-D-thiogalactobyranoside (IPTG) is added, a large amount of mutant T7 RNA polymerase protein can be expressed. it can.
  • IPTG isopropyl-iS-D-thiogalactobyranoside
  • the corresponding 3′-deoxyribonucleotide or a derivative thereof is less likely to be incorporated into the polyribonucleotide sequence than the ribonucleotide, and Among the medium and 3'-deoxyribonucleotides, there is little bias for the ability to take in ribonucleotides, such as differences in the way they are incorporated into the sequence depending on the type of base, respectively. Alternatively, no RNA polymerase can be provided.
  • RNA polymerase of the present invention it is possible to perform a base sequence determination more than a base sequence determination method using a DNA polymerase without complicated operations.
  • the heat-resistant RNA polymerase of the present invention can be used for the DNA base sequence determination method disclosed in W096 / 14434, for example, by using it in combination with the PCR method to more rapidly obtain the DNA base sequence. It will be possible to make decisions.
  • Escherichia coli C600 was inoculated into 200 ml of LB medium (a medium in which 10 g of Bacto tryptone, 5 g of Bacto yeast extract, and 5 g of NaCl were dissolved in one liter of water, adjusted to pH 7.5, and sterilized with an autoclave).
  • LB medium a medium in which 10 g of Bacto tryptone, 5 g of Bacto yeast extract, and 5 g of NaCl were dissolved in one liter of water, adjusted to pH 7.5, and sterilized with an autoclave.
  • OD (600 nm) 1.0
  • the cells are infected at a multiplicity of infection of about 2.After that, 0D is measured over time, and when 0D drops sharply, the remaining bacterial cells are centrifuged.
  • phage layer The white layer and band of this phage are carefully separated, and TE buffer (10 mM Tris-HC1, pH 7. Dialysis with ⁇ , ImM EDTA) to remove CsCl component. Further, this phage solution was subjected to phenol treatment to denature the phage protein, and genomic DNA of T7 phage was purified.
  • TE buffer 10 mM Tris-HC1, pH 7. Dialysis with ⁇ , ImM EDTA
  • the T7 RNA polymerase gene is encoded at positions 3171 to 5822 out of 39,937 base pairs in this genomic DNA. [The entire nucleotide sequence of the T7 genomic gene has already been reported by Dunn et al. (1983, . J. Mol Biol, 166 (4 ):. 477-535) 0 However, there some Genhinoto Shoriki s (GeneBank, see T7 file over di DNA sequence of accession No. V01148 J02518 X00411)]. Using this genomic DNA as type I, it was amplified using PCR and cloned into an expression vector as shown below (see Fig. 9).
  • a specific primer (T7Rpol-N5'-ATA TTT TAG CCA TGG) containing a restriction enzyme NcoI cleavage site at the 5 'end and upstream of the N-terminal amino acid region of the T7 RNA polymerase gene, respectively.
  • AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG-3 'and a primer specific to the C-terminal amino acid region downstream (T7Rpol-C5' -ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG-3 ' ) was used to amplify this enzyme gene by PCR.
  • This DNA fragment was digested with NcoI, subjected to 1% agarose electrophoresis, the target DNA fragment was excised from the agarose, and purified using Gene Pure Kit (Futtsubon Gene).
  • Plasmid pT7R which expresses wild-type T7 RNA polymerase, is transformed into Escherichia coli DH5, Escherichia coli resistant to the antibiotic ampicillin is cultured, IPTG is added to the culture solution, and the expression vector pT7R is added.
  • Trc promoter was activated. Two hours after the addition of IPTG, E. coli was recovered, and the total protein was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The protein was found to be present only when IPTG was added near the molecular weight of 99 kDa, which is the molecular weight of T7 RNA polymerase. Band detected.
  • This protein was further modified by partially modifying the method already described in Zawadzki, V et al., 1991, Nucl. Acids Res., 19: 1948 (detailed method was carried out by using the mutant type exemplified in Example 3). (This can be performed in almost the same way as the purification method of RNA polymerase.) As a result, RNA polymerase had the activity of RNA polymerase that acts specifically on the promoter.
  • PT7R into which wild-type T7 RNA polymerase gene is inserted Mutations were introduced into the region flanked by the restriction enzymes HpaI and NcoI sites corresponding to the C-terminal side of the polymerase gene using PCR. More specifically, for example, the base to which the mutation is to be introduced is divided into left and right sides, and the primer having the mutation introduced is F646Y (+) (5'-GTT GAC GG A AGC CGT ACT CTT TGG AC-3 ') F646Y (-) ( ⁇ '-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3 ') and primers with 5'-terminal restriction sites for each restriction enzyme T7RNAP-Hpal-N (5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTT Each DNA fragment was amplified by PCR using CCT AG-3 ') and pTrc99a-PstI-C (5'-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG-3').
  • DNA fragments into which the desired mutation was introduced were prepared.
  • This DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis by excising only the DNA fragment of the desired size, and this was re-amplified as type III using primers T7RNAP-Hpal-N and pTrc99a-Pstl-C.
  • This DNA was digested with restriction enzymes Hpa I and Pst I.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y from this plasmid can be induced by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, as in the production of wild-type T7 RNA polymerase.
  • the construction of the mutant T7 RNA polymerase 665P / F667Y was carried out in the following manner, based on the PCR method, as in the construction of F644Y.
  • a restriction enzyme Xhol was introduced into the T7 RNA polymerase gene region in pT7R, an expression vector having a wild-type T7 RNA polymerase gene, to facilitate the mutagenesis operation. More specifically, a combination of the primer ApaFl (5'-CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC-3 ') and the primer Xho-R ( ⁇ '-CCAGT GTT CTC GAG TGG AGA-3'), Xho-F ( ⁇ '-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3 ') and primer Afll-R (5'-CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3') PCR was performed using the expression vector pT7R.
  • CTCGAG restriction enzyme Xhol
  • the amplified DNA fragment was reacted with the restriction enzymes Apal and Xhol, and the amplified DNA fragment was reacted with the restriction enzymes ⁇ ⁇ and Xhol, respectively.
  • the expression vector pT7R was treated with Apal and ⁇ ⁇ beforehand. Was ligated using a T4 DNA ligase. The reaction was transformed into E.
  • This XhoI site can be cleaved by treatment with the restriction enzyme Xhol and the nucleotide sequence of DNA can be determined to confirm its presence.
  • primer Xho-R and primer 667R 5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3 '
  • primer 667F ⁇ '-GCT GAG TGT ACA TCG GAC PCR was performed using a combination of CCT-3 ′) and primer AflIIR.
  • PCR product directly as type I, determine the nucleotide sequence of DNA, confirm the sequences of primers 667R and 667F, Each was subjected to 2% agarose electrophoresis (agarose used was Agarose X made by Futatsu Gene), a DNA fragment of the desired size was cut out, and the DNA fragment was purified using the Gene Pure Kit. The two purified DNAs are mixed and subjected to PCR using primers XhoF and AflllR as type I.
  • the mutant T7 RNA polymerase protein introduced into E. coli was purified.
  • All mutant T7 RNA polymerases can be purified by essentially the same method. Mutation site The expression level and the behavior of column chromatography may be slightly different due to differences in the expression.
  • a method for purifying the mutant T7 RNA polymerase F644Y will be exemplified.
  • Escherichia coli cells are collected by centrifugation, and typically 10 g of wet weight Escherichia coli can be obtained from 2 liters of culture solution. If the E. coli cells are not used immediately, they can be stored in a freezer below -20 ° C. Unless otherwise specified, all steps of enzyme purification after this step are performed at temperatures below room temperature, preferably at 0-5 ° C. At this time, the E.
  • coli was washed with a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTANa 2 at 25 ° C) 10 times the cell weight, and centrifuged again (5, 000xg at 4 ° C for 10 minutes), and add 10 volumes of sonication buffer [50 mM Tris-HC1, pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTANa 2 , 5 mM dithiothreitol (DTT) , 0.1 mM benzamidine, 30 // g / ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 ⁇ g / mK bacitracin], and using Sonihuaia 450 (Branson) at 80 W for more than 15 minutes Sonicate the cells to disrupt the cells and reduce the viscosity.
  • a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaC
  • the mixture was centrifuged at 12,000 xg and 4 ° C for 10 minutes to remove cell debris. While stirring the obtained supernatant, 10% streptomycin sulfate was slowly added dropwise to a final concentration of 2.0%, and stirring was continued for another 30 minutes. 12,000xg. Centrifuge at 4 ° C for 10 minutes to remove the precipitate, stir while adding ammonium sulfate powder slowly, and form a precipitate. In this case, first collect the precipitate with 30% saturated ammonium sulfate (30% ammonium sulfate precipitation), and then add the supernatant to the mixture with ammonium sulfate with stirring so that the concentration becomes 60% saturated ammonium sulfate.
  • the eluate is collected by fractionating an appropriate amount into a test tube, immediately performing SDS-acrylamide gel electrophoresis, analyzing the protein, and finding a protein near the molecular weight that is considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. Inspect the fractions to be removed. A typical example should be found near 0.4M NaCl.
  • the fractions were collected containing the protein, the column buffer of about 1 Li Tsuta (20 mM KP0 4, pH7. 7, 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 ⁇ g / ml PMSF) and dialyzed 16 hours against, de A salt operation was performed.
  • the dialyzed and desalted fraction was added to a 5 ml column volume of Q-sepharose (Q-Sepharose, Pharmacia'Biotech) previously equilibrated with the same buffer, and a 280 nm ultraviolet absorbing substance was added to the same buffer. Wash until no detectable, and elute with a linear gradient of 0.1M to 0.64M NaCl in the same buffer, approximately 40 column volumes.
  • the eluate is collected by fractionating an appropriate amount into a test tube, immediately performing SDS-acrylamide gel electrophoresis, analyzing the protein, and determining whether the protein exists near the molecular weight that is considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. Inspect the picture.
  • RNA synthesis reaction was performed using the enzyme dilution method as a standard, and the approximate titer was estimated by agarose electrophoresis of the synthesized RNA. At this time, the degree of degradation of the synthesized RNA is also observed, and at the same time, a simple assay for contaminating ribonuclease is possible.
  • a purification method based on the above steps is used to purify 2,500,000 units of mutant T7 RNA polymerase F644Y protein from 1 liter of culture, and this sample contains almost no RNase No contamination is observed.
  • the incorporation efficiency of 3 ′ dNTP was compared with that of wild-type T7 RNA polymerase as follows.
  • the in vitro transcription reaction was carried out by partially modifying the method described by, for example, Melton, DA, [Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056 (1984)]. More specifically, the plasmid vector pBluescriptKS (+) (Stratagene) having the T7 promoter was reacted with the restriction enzyme PvuII or Seal, and the linearized version was used as type III to obtain 3 ′ dNTPs.
  • 5-carboxy-X-rhodamine-labeled 3'-dexoxycytidine-5'-triphosphate which is one of the dye terminators synthesized with reference to the method described in W096 / 14434, is 150 ⁇ and further 500 ⁇ 500.
  • the transcript is purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia's Biotech), and the purified product is centrifuged. It was evaporated to dryness using a formula evaporator.
  • the 5-carboxy-X-rhodamine-labeled 3′-dexoxytidine-5′-triphosphate is a compound represented by the following chemical formula.
  • the dried reaction product is dissolved in formamide / EDTA / Blue dextran loading buffer 6 ⁇ 1 according to the ABI PRISM 377 DNA Sequencing System Operation Manual Ver.1.0 of PerkinElmer Japan Co., Ltd.
  • a denaturing gel for sequence analysis containing 4% Ngranger TM Acrylamide Solution (FMC) was used for sequence analysis containing 4% Ngranger TM Acrylamide Solution (FMC).
  • FMC Ngranger TM Acrylamide Solution
  • the results are shown in Figure 13 as a gel image.
  • Mutant T7 RNA vomerase F644Y The sequence ladder was found to be about three times as large as the wild-type T7 RNA polymerase, and a transcript of about 700 bases was also confirmed.
  • the sequence reaction by the dye luminescent method was compared between the purified mutant T7 RNA polymerase F644Y and L665P / F667Y and the wild-type T7 RNA volimerase as follows.
  • the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia's Biotech). The purified product was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
  • the above 5-carboxy-X-mouth-damine-labeled 3′-dexoxytidine-5′-triphosphate is the same compound as used in Example 4.
  • 5-carboxyl rhodamine 6G-labeled 3'-deoxyadenone-5'-triphosphate, 5-carboxyrhodamine 110-labeled 3'-deoxyguanosine-5'-triphosphate, and 5-carboxytetramethylrhodamine labeled 3 '- Dokishiurijin - 5'DOO Rifosufue Ichito is a compound represented by the following formula c
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y or L665P / F667Y has a higher peak intensity and less variation than the wild type T7 RNA polymerase, and the sequence can be read. It turned out to be. Here, when using wild-type T7 RNA polymerase, almost no sequence was possible.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y is based on PCR, as in the construction of the expression plasmid that produces the mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y (see Example 2). I went like that.
  • the expression plasmid producing the mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y is designated as ⁇ , and the primer Xho-F and the primer T7-DOUBLE-R (21mer: 5'-CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3 ' PCR was performed using a combination of the primer 17-DOUBLE-F (29mer: 5'-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3 ') and the primer Aflll-R.
  • direct type I determine the nucleotide sequence of DNA, confirm the sequence of primers T7-D0UBLE-R and T7-DOUBLE-F, and perform 2% agarose electrophoresis on each.
  • the DNA fragment of the size was purified.
  • the two purified DNAs are mixed and subjected to PCR using primers Xho-F and Aflll-R as type III, and the amplified DNA fragment is subjected to restriction enzyme mapping and DNA base sequence analysis.
  • an enzymatic reaction was performed using the restriction enzymes Xhol and Afll, and the T4 DNA plasmid was ligated to the plasmid pT7RL665P / F667Y previously treated with the restriction enzymes Xhol and ⁇ ⁇ . And coupled. This reaction was transformed into Escherichia coli DH5 to obtain several colonies growing on agar plates containing the antibiotic ampicillin.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y Expression plasmids PT7RF644Y / and 665P / F667Y for producing / L665P / F667Y were constructed (see Fig. 17).
  • the production of mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y from this plasmid can be induced by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, similarly to the production of wild-type T7 RNA polymerase. there were.
  • Mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y could be purified by the same method as described in Example 3. As a typical example, 1,000,000 units of the mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y protein was purified from one liter of the culture solution. The obtained RNA polymerase was almost a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and RNase was not detected in this sample.
  • the incorporation rate of ribonucleotide (NTP) and 3′-deoxynucleotide (3 ′ dNTP) of the mutant T7 RNA polymerase purified in Example 7 was measured as follows.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y or L665P / F667Y obtained in Example 3, or constructed and purified in the same manner as in Examples 2 and 3. Inhibition results were obtained using mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P, F782Y, F733Y, F646Y or Y639F in the reaction. Table 1 shows the relative activities.
  • mutant enzyme is a mutation that facilitates incorporation of 3'-dATP.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y is an enzyme that is more likely to incorporate 3′-dATP 5.58 times than wild-type enzyme.
  • the F644Y / L665P / F667Y mutant is the most mutant mutant enzyme that incorporates 3'-dNTP among the mutant enzymes that were created. Mutation site 3 Relative activity of RN Holimefuse by dATP
  • Example 9 Example of Sequence Reaction Using Mutant T7 RNA Polymerase F644Y / L665P / F667Y Type ⁇ used as type ⁇ of the sequence reaction was prepared by PCR as follows. Human thyroid-stimulating hormone (hTSH-cDNA was subcloned into a plasmid derived from BS750 having a T7 promoter and used as a type II PCR. The plasmid with hTSH-] 3, lOOfg, was used to sandwich the cloying site.
  • Human thyroid-stimulating hormone hTSH-cDNA was subcloned into a plasmid derived from BS750 having a T7 promoter and used as a type II PCR.
  • the plasmid with hTSH-] 3, lOOfg was used to sandwich the cloying site.
  • PCR with L220 primer (5'-TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A-3 ') and 1211 primer (5, -ACG TTG TAA AAC GACGGC CAG T-3') [(94 ° C for 2 minutes) 1 time, (94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1.5 minutes) 30 times, 72 ° C for 5 minutes]
  • the T7 promoter is located downstream of the 1211 primer in the PCR product.
  • the sequence transcription reaction is performed using the method described in Melton, DA [Nucleic Acids Res., 12: 7035-7036 (1984)]. ⁇ (about 10ng) of the above PCR product was used for the sequence reaction.
  • the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech). It was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.

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Description

明細書
RNAポリメラーゼ
技術分野
本発明は、 DNA の塩基配列決定法等に有用な変異型 RNA ポリ メ ラ 一ゼに関する。
背景技術
ポリ メ ラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 法は優れた方法であり 、 年々その利 用範囲力、広力 ^つてレヽる [Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。 PCR 法では、 1 分子の DNA 断片を増幅する こ と も可能で ある。 PCR 法で増幅した生成物をク ロ一ニングする こ となく シーク エンスする方法 （ダイ レク ト · シークェンス法） も有用な方法であ る [Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330, 384-386] c この方法 はライブラ リ ー作製やそのライブラ リ ーのスク リーユングが不要で あり 、 多く のサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法であ
しかるに、 上記ダイ レク ト ' シークェンス法には 2つの大きな問 題点がある。
一つは、 取り込めなかったプライマー及び 2 ' デォキシリ ボヌク レオシ ド 5 ' ト リ フォ スフエ一 ト （ 2， d N T P s ) が反応系中に 残存し、 これらがシークェンス反応を妨げるこ とである。 従って、 従来法では、 これら残存するプライマーと 2 ' d N T P s は、 シー クエンスの前に P C R生成物から除去する必要があった。 P C R生 成物の精製方法には種々の方法があり 、 例えば、 電気泳動による精 製法、 エタ ノール沈殿法、 ゲル濾過法、 H P L C精製法がある [例 . λ Dorit R.し et al . (1991) し urrent Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2. 1-15.2. 11 参照」。 しかし、 何れの方法でも煩雑である。
2つ目の問題は、 PCR 生成物の迅速な再生 （renaturation) であ る。 P C R生成物が 2本鎖 D N Aに再生してしま う と、 1 本鎖のテ ンプレー ト （铸型） ではなく なり 、 プライマーと 1 本鎖テンプレー ト との間のァニーリ ングを妨げる。 再生を最小限にするための方法 と して、 例えば変性後の急冷、 1 つのプライマーのピオチレーショ ン （biotilation) と ス ト レプ トア ビジン被覆物への P C R生成物の 吸着、 ェク ソヌ ク レア一ゼの使用、 ァシンメ ト リ ッ ク P C R等が報 告されてレヽる。 例えば、 Barbara Bachmann ら、 1990， Nucleic Acid
Res.， 18, 1309- に開示されている。 しかし、 これらの方法の殆ど は、 長い時間を必要と し、 非常に面倒である。
そこでそれらを解決するための新しい方法と して、本発明者は、 PCR 反応系中に残存する未反応のプライマ一及び 2 ' デォキシリ ボヌク レオシ ド 5 ' ト リ フォスフェー ト （ 2， d N T P s ) を除去する こ となく 、 かつ P C R反応生成物が迅速に再生する問題を回避するた め、 変性自体を全く 行わないで良い、 全く新しい DNA の塩基配列決 定方法を提案した 〔W096 4434〕。 この方法は、 T7 RNAポリ メ ラ一 ゼ等の RNA ポリ メ ラーゼと R N A転写反応のタ一ミネ一ター （例え ば、 3 ' デォキシ リ ボヌ ク レオシ ド 5 ' ト リ フォスフヱ一 ト、 3 ' d N T P s ) を用いるダイ レク ト転写シークェンス法である。 この 方法によれば、 ポリ メ ラーゼ連鎖反応によ り増幅した D N A生成物 の塩基配列を、 プライマー及び 2 ' デォキシリ ボヌク レオシ ド 5 ' ト リ フォスフェー ト （ 2 ' d N T P s ) を除去する必要なしにその ままシークェンスに使用できる。 さ らに、 変性自体を全く行わない ため、 P C R生成物が迅速に再生する問題も回避でき、 極めて優れ た方法である。
と ころが、 上記方法について本発明者がさ らに研究を行ったと こ ろ、 よ り正確な塩基配列データを得るためには、 さ らに解決すべき 課題があるこ とを見出した。
上記塩基配列決定法において、 T 7 RNAポリ メ ラーゼ等の RNAポ リ メ ラーゼは、 ATP 、 GTP 、 CTP 及び UTP 又はそれらの誘導体か らなる リ ボヌク レオシ ド 5 ' ト リ フォスフエ一 ト類並びに 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP或いはそれらの誘導体からなる少な く と も 1 種の 3 ' デォキシリ ボヌク レオチ ドの混合物中で反応させ る。 この反応において、 铸型の配列に相応した塩基を有する リ ボヌ ク レオチ ド及びデォキシリ ボヌク レオチ ドが、 リ ボヌク レオチ ド配 列中に逐次取り込まれる こ とで、 ポリ リ ボヌク レオチ ドが合成され る。
と ころが、 リ ボヌク レオチ ドに比べて、 対応する 3 ' -デォキシリ ボヌク レオチ ドやその誘導体は、上記配列に取り込まれにく いこ と、 さ らに、 リ ボヌク レオチ ドの中及び 3 ' -デォキシリ ボヌク レオチ ド の中でもそれぞれ塩基の種類によ り 、 配列への取り込まれ方に差が あるこ とが判明した。 このよ う にリ ボヌク レオチ ドと 3 ' -デォキシ リ ボヌク レオチ ドとの間、 並びに異なる塩基を有する リ ボヌク レオ チ ド間及び異なる塩基を有するデォキシリ ボヌ ク レオチ ド間でのバ ィァスが存在するため、 転写生成物は得られるものの、 得られる転 写生成物は短鎖であったり 、 標識されたリ ボヌク レオチ ドからのシ グナルにバラツキがあったり して、 正確なシークェンスデータを得 る こ とは難しかった。
そこで、 本発明の目的は、 この取り込み能力に対してヌク レオチ ドの種類によるバイ アスが少ない力 、 或いは全く ない RNA ポリ メ ラ ーゼを提供するこ とにある。
尚、 本発明の説明中において、 アミノ酸残基は、 慣例により使用されている一 文字表記法を用いる。本文中に出てくるアミノ酸のみ、理解のために記述すると、 フエ二ルァラユン（F)、 チロシン（Y)、 プロ リン（ρ)、 ロイシン（し）、 ヒスチジン（Η) である。 また、 ポリメラーゼ蛋白質の Ν末端からの番号を記し、 例えば F667 と いうように表す。 これは、 このポリメラ一ゼの 667番目のアミノ酸残基が Fであ ることを示し、 F 667 Yの記述は、 667番目のアミノ酸残基 F を Υ に置換させた ことを意味する。
と ころで、 DNA ポリ メ ラ一ゼについても、 ヌク レオチ ドの種類に よ り取り込みに差異がある こ とが知られており 、 さ らにこのよ うな 取り込みの差異を解消した変異型の DNA ポリ メ ラーゼが知られてい る 〔特開平 8 — 2 0 5 8 7 4号、 Pro Natl. Acid. Sci. USA, 92 : 6339- 6345, 1995)〕。
そこには、 T7 DNAポリメラーゼを用いたシークェンス反応におけるヌクレ ォチドの取り込みに対する均一性は、 このポリメラーゼ中の 526番目のァミノ酸 が生み出しているということが記載されている。さらに、この酵素とその他の DNA ポリメラーゼのァミノ酸配列の相同性に基づいて、 他の DNAポリメラーゼの相同 部位のアミノ酸を変えることにより、 取り込みのバイアスが低下すると記載され ている。即ち、 T7 DNAポリメラーゼの Y (チロシン） 526力 2'-dNTPと 2', 3 ' -ddNTP の取り込み効率のバイアスが少ない原因である。 更に、 大腸菌 DNAポリメラ一ゼ Iの F (フエ二ルァラニン） 762、及び Thermus aquat i cus DNAポリメラーゼ（Taq DNA ポリメラーゼと一般には呼ばれている） の F (フエ二ルァラニン） 667力'、 T7 DNA ポリメラーゼの Y526の相同なァミノ酸残基であり、 このァミノ酸残基を各々、 F762Y (チロシン）および F667Y (チロシン）に変化させることで取り込みバイアス が低下すると記載している。
さらに、 このような DNAポリメラーゼに関するデータに基づいて、 T7 R N A ポリメラーゼについても、 DNAポリメラ一ゼで議論されている領域と相同な領域、 即ち残基 631-640に対する修飾は dNTPに対するその特異性を変化させるであろ うことを示唆している、 と記載している。
しかるに、 RNA ポリ メ ラーゼについては、 これまでシークェンス 法に使用されるこ とはなく 、 リ ボヌク レオチ ドの取り込みに差異が ある こ と 自体問題にならなかった。 さ らに、 このよ う な状況下、 当 然のこ とながら、 取り込みの差異を解消した変異型の RNA ポリ メ ラ ーゼは知られていなかった。 事実、 上記特開平 8 — 2 0 5 8 7 4号 公報には、 T7 R N Aポリメラーゼを修飾した実例は記載されていない c さらに、 T7 R N Aポリメラ一ゼのこの領域は、 Protein Engineering, 3 : 461- 467, 1990に示されているモチーフ B 中の、 DNAポリメラ一ゼの α型、 I型及び DNA依存性 RNAポリメラ一ゼ （T7RNAポリメラーゼはこの中に分類される） に特 に保存されたァミノ酸 Kと Y Gに挟まれた 9 ~ 1 0アミノ酸残基からなる領域に 相当すると考えられる。 先に DNAポリメラーゼで議論された大腸菌 DNAポリメラ 一ゼのァミノ酸残基 7 6 2あるいは T a q DNAポリメラーゼのァミノ酸残基 6 6 7の F (フエ二ルァラニン） は、 I型に分類されている DNAポリメラーゼの多く に観察される。 しかるに、 驚いたことに、 DNAポリメラーゼと極めて相同性が高 いにも係わらず、 T7RNAポリメラ一ゼでは、 上記領域に相当する残基 631-640に は F (フエ二ルァラニン）は存在せず、 上記公報の示唆をそのまま実行することは できないことが判明した。
加えて、 本発明者は、 大腸菌 DNAポリメラーゼ Iの F762の位置は、 フィンガ 一 ·サブドメインのヘリックス 0に存在し、 T7 RNA ポリメラーゼにおいて、 こ の領域に相当する領域におけるアミノ酸の修飾を検討した。ところが Sousa et al. の文献（Nature, 364: 593 - 599, 1993)で示された立体構造上からの、 大腸菌 DNA ポリメラーゼ Iのヘリックス 0に相当する T7 RNA ポリメラーゼ中のヘリックス Zにも F (フエ二ルァラニン）がなかった。
このような状況下、 本発明者は、 こ の取 り 込み能力に対して リ ボヌ ク レオチ ド及び 3 ' -デォキシリ ボヌク レオチ ドの種類によるバイアス が少ないか、 或いは全く ない RNA ポリ メ ラーゼを提供する こ とを目 的と して、 新たな R N Aポリ メ ラーゼを独自に探索した。 その結果、 野性型 R N Aポリメラーゼのアミノ酸の一部を修飾することで、 3 ' デォキシ リボヌクレオチドまたはその誘導体を取り込む能力を増加させた R N Aポリメラ ーゼを見いだして本発明を完成した。
尚、 後述の説明から明らかになるが、 本発明の R N Aポリメラーゼ、 特にその アミノ酸修飾位置は、 上記特開平 8-205874 号には全く示唆も教示もされていな い部位であり、 今回、 全く新らたに見いだされたものである。 発明の要約
本発明は、 対応する野性型 R N Aポリメラーゼの能力と比較して、 3 ' デォキ シリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、 少なくとも 1つのアミノ酸が修飾された野性型 R N Aポリメラーゼからなること を特徴とする R N Aボリメラーゼに関する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 T7 ファージゲノム上の T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子とコードされてい る T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列 （前半） である。 上段は、 塩基配列、 下 段はその配列に対応するァミノ酸配列を示した。右端の数字は、塩基配列の場合、 DNA配列データベース GeneBankに登録されている T7ファージゲノム（Locus T7CG, 39, 937 塩基対）の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ボリメラ一ゼき最初 の M (メチォニン）を 1 として、全長 883アミノ酸残基からなっていることを示す。 図 2は、 T7 ファージゲノム上の T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子とコードされてい る T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列 （後半） である。 上段は、 塩基配列、 下 段はその配列に対応するアミノ酸配列を示した。右端の数字は、塩基配列の場合、 DNA配列データベース GeneBankに登録されている T7ファージゲノム（Locus T7CG, 39, 937 塩基対）の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ポリメラーゼき最初 の M (メチォニン）を 1 として、全長 883ァミノ酸残基からなっていることを示す。 図 3は、 現在報告されているファージ由来 RNAポリメラーゼのァミノ酸配列の比 較 （前半） である。 最上段の T7 RNA ポリメラーゼを基準として、 ·は T7 RNA ポ リメラーゼと同一のアミノ酸、 一は欠損、 最下段の *はすべてのポリメラーゼに 共通しているアミノ酸であることを示す。
図 4は、 現在報告されているファージ由来 RNAポリメラーゼのァミノ酸配列の比 較 （後半） である。 最上段の T7 RNA ポリメラーゼを基準として、 ·は T7 RNA ポ リメラーゼと同一のアミノ酸、 一は欠損、 最下段の *はすべてのポリメラ一ゼに 共通しているアミノ酸であることを示す。
図 5は、 T7 RNA ポリメラーゼの変異部位導入部位の詳細図である。 白ぬき文字 は、 変異導入されたアミノ酸であることを示している。
図 6は、 T7 RNA ポリメラーゼと T3 RNA ポリメラ一ゼのァミノ酸配列の比較 （前 半） である。 最上段の T7 RNA ポリメラ一ゼを基準として、 ·は同一のァミノ 酸、 一は欠損、 最下段の *は 2 つのポリメラーゼに共通しているアミノ酸である ことを示す。
図 7は、 T7 RNA ポリメラーゼと T3 RNA ポリメラ一ゼのァミノ酸配列の比較 （後 半） である。 最上段の T7 RNA ポリメラ一ゼを基準として、 'は同一のァミノ 酸、 一は欠損、 最下段の *は 2 つのポリメラーゼに共通しているアミノ酸である ことを示す。
図 8は、 T7 RNA ポリメラーゼの残基 6 4 1— 6 6 7の前後の配列と、 それに対 応する領域の T 3 RNAポリメラーゼ、 K 1 1 RNAポリメラーゼ、 及び S P 6 RNAポ リメラーゼアミノ酸配列を示す。 T7RNA ポリメラ一ゼについては、 残基を全て示 したが、 対応する T3, Kl l , SP6については T7と同じ残基については . （ドット） 図 9は、 野生型 T7 RNAポリメラ一ゼを発現するプラスミ ド、 pT7Rの構築図であ る。 図 1 0は、 変異型 T7RNA ポリメラーゼ F644Yを発現するプラスミ ド、 pT7RF644Y の構築図である。
図 1 1は、 T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子中に制限酵素 Xho l 部位を持つ、 pT7R の 改良型プラスミ ド、 pT7R-Xhoの構築図である。
図 1 2は、 変異型 T7RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y を発現するプラスミ ド、 PT7RL665P/F667Yの構築図である。
図 1 3は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼによるダイ ·ターミネータ一の取り込み 率の改善を示す。 野生型 T7 RNA ボリメラーゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ポリメラー ゼ F644Y (F644Y)、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ L665P/F667Y (F667Y)。
図 1 4は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Yによるダイ · タ一ミネ一ターの取 り込み率の改善を示す。 エ レク トログラムとして表示した。 野生型 T7 RNA ポリ メラーゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y (F644Y)。
図 1 5は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Yによるダイ 'ターミネータ 一の取り込み率の改善を示す。 エレク トログラムとして表示した。 野生型 T7 RNA ポリメラーゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y (F667Y) C 図 1 6は、 シークェンス反応例 野生型 T7 RNAポリメラーゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y (F644Y)、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ し 665P/F667Y (F667Y) を用いて反応した。 何れも同じ領域のシークェンスパターンであるが、 野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼ（WT) (最上段）では、 ベースコールが正しく機能せず、 塩基の間 隔が狭まり（塩基の表示が重なってしまい）、 正しくシークェンスできていない事 力 S 力 る。
図 1 7は、 変異型 T7RNA ポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Y を発現するブラスミ ド、 pT7R F644Y/L665P/F667Yの構築図である 図 1 8 (1)〜（4)は、変異型 T7RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Yによるダイ - ターミネ一ターの取り込み率の改善結果をエレク トログラムとして表示した。 発明を実施するための態様
本発明において、 「野性型 RNAポリメラーゼ」 とは、 天然に存在する全 ての RN Aポリメラーゼを意味する。 さらに、 「野性型 RN Aポリメラ一ゼ」は、 野性型 RNAポリメラーゼであって、 対応する野性型 RNAポリメラーゼの能力 と比較して、 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能 力を増加させることを目的とする修飾以外のァミノ酸の置換、挿入または欠落を、 さらに有するものであることもできる。 即ち、 野性型 RNAポリメラーゼを人為 的に上記以外の目的で修飾した RN Aポリメラーゼも、 上記 「野性型 RNAポ リメラーゼ」 に含まれる。 但し、 そのようなァミノ酸の置換、 挿入または欠落は、 RNAポリメラーゼとしての活性を維持する範囲で、 行われたものであることが 適当である。
「野性型 RNAポリメラ一ゼ」 としては、 例えば、 T 7ファージ、 T 3ファー ジ、 S P 6ファージ、 K 1 1ファージに由来する RNAポリメラーゼを挙げるこ とができる。 但し、 これらの RNAポリメラーゼに限定されるものではない。 また、 本発明において 「野性型 RN Aポリメラ一ゼ」 は、 天然に存在する耐 熱性の RNAポリメラーゼ、 及び天然に存在する RN Aポリメラーゼを耐熱性を 有するように人為的に修飾した （即ち、 アミノ酸の置換、 挿入または欠落を行つ た） ものも包含する。 但し、 耐熱性を付与するための修飾は、 RNAポリメラー ゼとしての活性を維持する範囲で、 行われたものであることが適当である。 「野 性型 RNAポリメラ一ゼ」 として耐熱性の RN Aポリメラーゼを用いた本発明の 変異型 R N Aポリメラーゼも耐熱性となる。 その結果、 例えば、 PCR 法に併用し て、 PCR 産物を铸型としてその場で、 即ち、 PCR と並行して、 シークェンス用の R N Aフラグメントを合成することも可能である。
T7 RNA ポリメラーゼは、 極めて特異性の高いプロモータ一特異的 RNA ポリメ ラーゼとして知られている。 T7 RNA ポリメラーゼの塩基配列と生産法に関して は Davanloo et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 81 : 2035-2039 (1984)に記載さ れている。 さらに大量生産に関しては、 Zawadzki et al. , Nucl. Acids Res.， 19 : 1948 (1991)に既に記載されている。 このファージ由来の RNAポリメラーゼは、 大腸菌や高等な生物の RNAポリメラーゼと異なり、 単一のポリぺプチドのみで転 写反応を行うことが出来る（Chamberl in et al. , Nature, 228 : 227-231, 1970) c そのため、 転写メカニズムを解析する格好の材料となり、 沢山の突然変異体が分 離され、 報告されている。 さらに Sousa et al. , Nature, 364: 593 - 599， 1993 に 結晶解析結果が記載されている。
さらに、 その他極めて特異性の高いプロモータ一特異的 RNAポリメラーゼとし て大腸菌に感染する T3 ファージ、 サルモネラ菌に感染する S P 6ファージ及び Klebsiel la pneumoniae に感染する K11ファージ由来の RNAポリメラ一ゼの 3つ がよく知られている。
尚、 上記 4種の R N Aポリメラーゼは、 後述するように、 アミノ酸の一次構造、 プロモーターの配列等、 極めて類似している。
本発明の R N Aポリメラーゼは、 対応する野性型 R N Aポリメラーゼの能力と 比較して、 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力 を増加させたものである。 前述のように、 野性型 R N Aポリメラーゼでは、 リボ ヌクレオチドに比べて 3 ' デォキシリボヌクレオチドの取り込みが悪く、 塩基配 列決定法に用いる妨げとなっていた。 それに対して、 本発明の R N Aポリメラー ゼは、 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する取り込み能 力を、好ましくは野性型の少なくとも 2倍増加させるように修飾されている。 3 ' デォキシリボヌクレオチドの取り込みは、 3 ' デォキシリボヌクレオチドに蛍光 標識を付した 3 ' デォキシリボヌクレオチド誘導体を用いた場合に特に低下する 傾向があるが、 本発明の R N Aポリメラーゼは、 このような 3， デォキシリボヌ クレオチド誘導体の取り込みも改善できる。
尚、 ここで、 リボヌクレオチドとは、 ATP、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘 導体からなるリボヌクレオシド 5 ' トリフォスフェート類を意味し、 3 ' デォキ シリボヌクレオチドは、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP及び 3 ' dUTPを意味し、 その誘導体は、 これら 3 ' デォキシリボヌクレオチドに例えば、 蛍光標識を付し た化合物を意味する。
本発明の R N Aポリメラーゼは、 対応する野性型 R N Aボリメラーゼの少なく とも 1つのァミノ酸が修飾されたものである。 この点について以下に詳細に説明 する。
本発明者は、 前述のような T7 RNA ポリメラ一ゼに関する種々の報告を踏まえ た上で、 T7 RNA ポリメラーゼにおけるリボヌクレオチド等の種類により取り込 み効率にバイアスが少ない或いは全くない RNAポリメラーゼ変異体を構築するこ とを検討した。 特に、 野性型 RNAポリメラーゼ上のどのアミノ酸を変異させるの 力 、 さらに、 変異として置換を行う場合、 どのようなアミノ酸に置換させればよ いかについて実際に、 種々の変異体を作成して検討し、 野性型 R N Aポリメラー ゼの少なくとも 1つのァミノ酸を修飾することで 3 ' デォキシリボヌクレオチド またはそれらの誘導体を取り込む能力を改善することができることを見出して、 本発明の変異型 R N Aポリメラーゼを完成した。
本発明者は、 まず、 T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を挿入した発現プラスミ ド pT7R を構築し、 次に、 この発現プラスミ ド pT7R をべ一スにして T7 RNA ポリメラー ゼの変異体を構築した。 即ち、 T7 RNA ポリメラーゼの F (フエ二ルァラニン） 残基を Y (チロシン） 残基に変化させた変異型 T7 R N Aポリメラーゼである F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y を構築し、 これらの変異体につい て取り込み能力の比較を行った。 さらに、 文献（Sousa. , EMBO J. , 14 : 4609- 4621 ( 1995) )には、 Τ7 DNA ポリメラ一ゼの Υ526に相当する位置である Τ7 RNA ポ リメラーゼの Y639F変異体の性質を記述している。 特に、 特開平 8- 205874号に 記載された dNTP に対するその特異性を変化させるであろうことを示唆した残基 631 -640に含まれる Y639F変異体も構築した。
本明細書において、 野性型 T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列は、 遺伝子配 列データべ一スである GeneBank より、 accession No. V01 148 J02518 X0041 1 の T7 ファージ DNA配列（39, 937塩基対）の塩基番号 3171-5822にコ一ドされてい る配列 （図 1及び 2参照） を基礎としている。 図 1及び 2に示す配列の上段は、 塩基配列、 下段はその配列に対応するアミノ酸配列である。 右端の数字は、 塩基 配列の場合、 GeneBankに登録されている T7 ファージゲノム（Locus T7CG, 39, 937 塩基対）の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ポリメラーゼき最初の M (メ チォニン）を 1 として、 全長 883アミノ酸残基からなっていることを示す。
尚、 このアミノ配列は、 上記 Moffatt et al. , J. Mol . Biol. , 173 (2) : 265-269, 1984に報告されているアミノ酸配列と同一である。
従って、 本明細書における野性型 T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のアミノ酸配列 及び各アミノ酸に付された番号は、 この図 1及び 2に示される配列及び番号であ る。 さらに、 前述のように、 上記野性型 T7 RNA ポリメラーゼは、 本発明で目的 とする修飾以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落を、 さらに有するものである こともできる。 従って、 本発明の目的に基づいて変異を導入すべき野性型 R N A ポリメラーゼが、 野性型 T7 RNA ポリメラーゼに別の変異を導入したものである 場合、 特に、 そのような変異が、 アミノ酸の揷入または欠落である場合、 そのよ うな挿入または欠落に応じて、 上記アミノ酸番号は変動し、 アミノ酸番号が図 1 及び 2に示す番号とは異なったとしても、 T7 RNA ポリメラ一ゼ活性を維持して いる限り、 そのようなに挿入または欠落を有する T7 RNA ポリメラーゼも本発明 において本発明の目的とする変異を導入する野生型 T7 RNA ポリメラーゼの範疇 に含まれる。
T7 RNA ポリメラーゼ以外の RNA ポリメラ一ゼについてのアミノ酸配列の番号 は、 図 3及び 4に示す配列表に基づき決定される。 さらに、 本発明で目的とする 修飾以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落を、 さらに有するものであることも できる。 従って、 これらのアミノ酸配列及びその番号に付いても、 T7 RNA ポリ メラーゼの場合と同様であり、アミノ酸の挿入または欠落による変異がある場合、 そのような挿入または欠落に応じて、 上記アミノ酸番号は変動するが、 そのよう な一部に変異を有する野性型の R N Aポリメラーゼも本発明において本発明の目 的とする変異を導入する野生型 T7 RNAポリメラーゼの範疇に含まれる。
T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子は、 T7 ファージ DNA を精製後、 T7 RNA ポリメラ ーゼ 遺伝子の N 末端アミノ酸領域上流に特異的なプライマ一（T7Rpo l- N ： 5' - ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG - 3 ' ) , 及び C末端ァミノ酸領域下流に特異的なプライマー（ T7Rpo l - C： δ' -ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G - 3 ' )を合成し、 PCR を用いて 増幅、 発現べクタ一 PT7Rを構築することができる （実施例 1参照）。 この発現べ クタ一を用い、 大腸菌 DH5ひに形質転換し、 イソプロピル - i3 -D-チォガラク トビ ラノシド （IPTG) を添加すると、 T7 RNAポリメラ一ゼ蛋白質を大量に発現する。 この T7 RNAポリメラ一ゼ遺伝子の配列を、 図 1及び 2に示すァミノ酸配列と 比較したところ、 両者完全に一致した。 尚、 図 1及び 2に示すアミノ酸配列と Grachev et al. , Bioorg. Kim. , 10 : 824 - 843, 1984 に報告されているアミノ酸 配列とは、 図 1及び 2に示すァミノ酸配列における 623番目の Υ及び 665番目の Lが、 Grachev et al.の報告におけるアミノ酸配列では、 それぞれ H (623番目） 及び P (665 番目） である点で相違していた。 上述のように、 本発明の変異型 R N Aボリメラ一ゼのべ一スとなる野性型 R N Aポリメラーゼは、 図 1及び 2に示 す配列に対して、 本発明で目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠 落を、 さらに有するものであることもでき、 上記 Grachev et al.の報告してい る 623番目及び 665番目の残基がそれぞれ H及び Pであるアミノ酸配列も、 本 発明の変異型 R N Aポリメラーゼのベースとなる野性型 R N Aポリメラーゼに含 まれる。
発現ベクター PT7Rを持つ大腸菌から精製した T7 RNAポリメラーゼは、 ィン - ビトロで T7 プロモーターを含んだ DNA存在下で充分な RNA合成活性を有してい た。 この発現プラスミ ド pT7R をべ一スにして変異型 T7 RNA ポリメラーゼとし て、 前述の Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Yを構築し、 これ らの変異体について取り込み能力の比較を行った。
尚、 F644Y変異を持つ、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼについては、 F644に対す る変異以外に、 F644の近傍の L665を前述の Grachev et al.の報告に従って Pと する変異も導入した。 即ち、 F644Y /し 665P として変異を導入し、 し 665P の影響を 調べた。 また、 F667Y変異を持つ、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼも、 F667 に対す る変異以外に、 F667の近傍の L665を前述の Grachev et al .の報告に従って Pと する変異も導入した。 即ち、 し 665P/F667Yとして変異を導入した。
さらに、 F644Y/L665P/F667Y 変異を導入した変異型 T7 RNA ポリメラーゼも構 築した。 これらの変異体の取り込み能力の比較も行つた。
変異を導入した T7 RNAポリメラーゼを精製し、 プロモーター配列特異的な RNA 合成と ATP、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド 5 ' トリフォスフェート類並びに 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いは それらの誘導体の取り込み能力を野生型 T7 RNA ポリメラーゼと比較した。 結果 は後述の表 1に示す。
その結果、 表 1 に示すよ うに、 F644Y、 F644Y/L665P , L665P/F667Y 及び F644Y/L665P/F667Yは、 RNA合成活性を充分維持し、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、
3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込みの大幅な改善が見られた。 また、 F644Y/L665P 変異体の取り込み能力は、 F644Y 変異体と同等であった。 この結果 力 ら、 665 のロイシンのプロリンへの置換は、 3， dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、
3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込みに影響がないことが分かる。 なお、 表 1には、 L665P/F667Y変異体の結果のみを示すが、 F667Y変異体も、 L665P/F667Y 変異体の取り込み能力と同等であった。 さらに、 F644Y/L665P/F667Y 変異体の取 り込み能力が最も高かった。 また、 表 1には示していないが、 F644Y/F667Y 変異 体の取り込み能力は F644Y/L665P/F667Y変異体のそれとほぼ同等であった。
F782Y変異体は、 RNA合成活性を保持しており、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、
3 ' dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力も若干改善された。 F733Y変異体 は、 RNA 合成活性が若干低下したものの、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP或いはそれらの誘導体の取り込みの若干の改善が見られた。 F646Y変異体は、 RNA合成活性を保持していたものの 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP或 いはそれらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなかった。 F882Y は、 RNA 合 成活性が著しく低下していたので、 表 1には結果を示さなかった。
さらに、 T7 DNA ポリメラーゼの Y526に相当する位置である T7 RNA ポリメラ ーゼの Y639F変異体は、 RNA合成活性を保持していたものの 3 ' dA 、 3 ' dGTP、
3 ' dCTP、 3， dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなか つた。
以上の結果に基づいて、 本発明の R N Aポリメラ一ゼは、 特に、 ポリメラーゼ の 「ヌクレオチド結合部位」 中に存在する少なくとも 1つのアミノ酸が修飾され た R N Aポリメラーゼであり、 このような修飾により、 対応するリボヌクレオチ ドに対して 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたは他のリボヌクレオチド類似体を 取り込む能力を増加させることができる。
また、 上記 「ヌクレオチド結合部位」 に存在するアミノ酸は、 例えば、 野性型 R N Aボリメラーゼのヘリックス Yとへリックス Zとの間のループ中のァミノ酸及 び Z又はヘリックス Zとヘリックス A Aとの間のループ中のアミノ酸であること ができる。
Sousa et al.の文献（Nature, 364 : 593-599， 1993)に示されている立体構造から、 铸型 DNAを包み込むポリメラ一ゼ分子中のクラフトの内側に面する、 ヘリ ックス Y (T7 RNAポリメラーゼのアミノ酸残基 625から 634に相当） とへリックス Z (同 アミノ酸残基 649から 658に相当） に挟まれたループ （同アミノ酸残基 635から 647に相当）及びヘリックス Z とへリ ックス AA (同ァミノ酸残基 685から 699に 相当） に挟まれたループ （同アミノ酸残基 659から 684に相当） は、 極めてヌク レオチドに近いところに位置するリボヌクレオチド結合部位の一部であると考え られる。 本発明では、 実際に、 このループに相当する領域の 644、 646、 667に存 在する F残基を Y残基に置換した （図 5参照）。
また、 733、 782及び 882の F残基は、 ループに相当する領域以外の領域に存 在し、 ポリメラーゼ分子中のクラフトの内側に面すると考えられる。 これらの F 残基についても実際に Y残基に置換した。
さらに本発明は、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラーゼのアミノ酸残基 641-667 に対応する領域から選択される領域中のァミノ酸において修飾されてい る R N Aポリメラーゼに関する。 T 7ファージ由来の R N Aポリメラーゼのァミ ノ酸残基 641 -667に対応する領域は、 前述の 「ヌクレオチド結合部位」 に相当す る。
前記 4種の R N Aポリメラーゼは、 アミノ酸の一次構造、 プロモーターの配列 等、 極めて類似している。 図 3及び 4に、 上記 4つのファ一ジ由来の RNAポリメ ラーゼのアミノ酸配列を比較して示す。 この比較より、 T7、 T3、 K1 1 由来の RNA ポリメラーゼは、 極めて類似していることが分かる。 特に、 図 6及び 7に示すよ うに、 T7 と T3ファージ由来の RNAボリメラーゼのアミノ酸配列は、 極めて類似 性が高い。 T7 と T3 ファージは、 共に大腸菌に感染するファージであり、 その性 質も極めて類似していることと符合する。 更にこの 2つの RNAポリメラーゼの認 識するプロモータ一配列も類似しているが、 その認識特異性は極めて高いことが 知られている。 このように T7 RNA ポリメラーゼにおいて得られた結果を、 アミ ノ酸配列の類似する他の RNAポリメラーゼに適応することは比較的容易にできる。 このような高い相同性から、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラーゼ以外の R N Aポリメラ一ゼにおける、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼのァミノ酸 残基 641- 667に対応する領域は、 T 3ファージ由来の RNAポリメラ一ゼについ ては、 アミノ酸残基 642 - 668であり、 K 1 1ファージ由来の RNAポリメラー ゼについては、 アミノ酸残基 664- 690であり、 SP6 ファージ由来の RNAポリメ ラーゼについては、 アミノ酸残基 633-670である、 と言える。 前述のように、 T7、 T3、 K11由来の RNAポリメラ一ゼは、 極めて類似しており、 T7 RNAポリメラ一ゼ についての結果を、 ァミノ酸配列の類似する他の由来 RNAポリメラーゼに適応す ることができる（図 8参照）。
上記 RN Aポリメラーゼとしては、 例えば、 T 7ファージ由来の RNAポリメ ラ一ゼであって、 ァミノ酸残基 644または 66 7においてチロシンを有する R NAポリメラーゼを挙げることができる。 また、 T 3ファ一ジ由来の RNAポリ メラ一ゼであって、 ァミノ酸残基 645または 668においてチロシンを有する RNAポリメラ一ゼを例示することもできる。 さらに、 K 1 1ファージ由来の R NAポリメラ一ゼであってァミノ酸残基 664〜669の間または 690 においてチロ シンを有する RN Aポリメラ一ゼを例示することもできる。 さらにまた、 さらに、 S P 6ファージ由来の RN Aポリメラーゼであってァミノ酸残基 633〜638 の間 または 670においてチロシンを有する RN Aポリメラ一ゼを例示することもでき
。
このようなアミノ酸の修飾は、 アミノ酸の変異のみならず、 挿入または欠落で あることができる。 また、 アミノ酸の変異は、 例えば、 天然に存在するアミノ酸 の少なくとも 1つをチロシンに置換することである。 さらに、 置換されるべき天 然に存在するアミノ酸は、 例えば、 フエ二ルァラニンであることができる。 但し、 フエ二ルァラニンに限定されることはなく、 対応するリボヌクレオチドに対して 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたは他のリボヌクレオチド類似体を取り込む能 力を増加させることができるァミノ酸の置換であればよレ、。
本発明の変異型 R N Aポリメラーゼにおいて、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y、 L665P/F667Y及び F644Y/L665P/F667Yは、 RNA合成活性を充分保持し、 さ らに 3 ' dNTPs の取り込み能力が大幅に改善し、 野生型で観察された強いバイァ スが著しく低下していた。 このような優れた特性を有する、 変異型 T7 RNA ポリ メラーゼ F644Y、 L 665P/F667Y又は F644Y/L665P/F667Yを用いることにより、 DNA ポリメラーゼを用いる塩基配列決定法を超える実用レベルで、 転写生成物による 塩基配列決定法が可能になる。
変異型 T7 RNA ポリ メ ラーゼ F644Y、 L665P/F667Y を生産する大腸菌 pT7RF644Y (DH5 a )及び pT7RL665P/F667Y (DH5ひ）は、 生命研国際寄託番号がそれ ぞれ 5998号（FERM- BP- 5998)及び 5999号（FERM- BP- 5999)として 1997年 7月 2 日 に寄託済みである。 さらに、 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Y を 生産する大腸菌 pT7RF644Y /し 665P/F667Y (DH5 a )は、 生命研国際寄託番号が 6364 号（FERM- BP-6364)として 1998年 5月 20 ョに寄託済みである。
本発明は、 上記本発明の R N Aボリメラ一ゼを製造する方法であって、 R N Aポリメラーゼをコードする核酸分子を用意し、 ヌクレオチド塩基配列内の 1つまたはそれ以上の部位における 1つまたはそれ以上の塩基を変異させるよう に該核酸分子に突然変異を起こさせ、 次いで変異させた核酸分子により発現され る修飾された R N Aポリメラーゼを回収することを含む方法を包含する。 R N A ポリメラーゼをコードする核酸分子の用意、 核酸分子への突然変異の導入、 修飾 された R N Aポリメラーゼの回収はいずれも、 公知の手法を用いて行うことが出 変異型 T7 RNA ポリメラーゼは、 例えば、 以下の方法により構築することがで きる。 T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を挿入してある発現ベクターを铸型にして T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子の C末端側に相当する制限酵素 Hpa I, Nco I 部位には さまれる領域を PCR法を利用して変異を導入した発現プラスミ ドを構築する。 次 いで、 この発現プラスミ ドを用レ、、 大腸菌 DH5ひに形質転換し、 イソプロピル- iS -D -チォガラク トビラノシド （IPTG) を添加すると、 変異型 T7 RNA ポリメラ ーゼ蛋白質を大量に発現させることができる。
本発明によれば、 リ ボヌク レオチ ドに比べて、 対応する 3 ' -デォ キシリ ボヌ ク レオチ ドやその誘導体がポリ リ ボヌク レオチ ド配列に 取り込まれにく かったり 、 リ ボヌ ク レオチ ドの中及び 3 ' -デォキシ リ ボヌク レオチ ドの中でもそれぞれ塩基の種類によ り 、 配列への取 り込まれ方に差がある といった、 リ ボヌク レオチ ド等の取り込み能 力に対するバイ アスが少ない力 、 或いは全く ない RNA ポリ メ ラ一ゼ を提供するこ とができる。
さらに、 本発明の R N Aポリメラーゼを用いることで、 煩雑な操作もなく、 D N Aボリメラーゼを用いる塩基配列決定法以上の塩基配列決定を可能にする。 また、 耐熱性を有する本発明の R N Aポリメラ一ゼは、 例えば、 W096 / 1 4434 に開示された D NA の塩基配列決定方法において、 PCR 法に併用するこ とで、 より迅速に DNA の塩基配列の決定を行う こ とが可能になる。 実施例
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例 1
野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子のクローユングと発現プラスミ ドの構築 大腸菌を宿主とする T7 ファージは、 以下のように精製した。 大腸菌 C600 を L B培地 (Bacto tryptone 10g, Bacto yeast extract 5g, NaCl 5gを 1 リツタ 一の水に溶かし、 pH 7. 5に調整したのち、ォートクレーブにて滅菌した培地） 200ml に植菌し、 菌体濃度が OD (600nm) =1. 0に達した時点で、 多重感染度約 2で感染 させ、 その後 0Dを経時的に測定し、 0Dが急激に落ちた時点で遠心操作にて、 菌 体残査をのぞき、 NaCl及びポリエチレンダリコール 6000をそれぞれ最終濃度、 0. 5M、 及び 10%になるように加え、 よく撹拌後、 ー晚、 4°Cにて静置し、 沈殿を 形成させた。 この沈殿を遠心操作で集め、 SM緩衝液 （10 mM Tris-HCl， PH 7. 5， 10 mM MgS04 , 50 mM NaCl, 0. 01% gelatin) にて懸濁した。 この T7 ファージの濃 縮液を、 次に遠心管に丁寧に重層した密度の異なる CsCl溶液上 （下層から、 CsCl 濃度が、 1. 267g/ml, 0. 817g/ml, 0. 705g/ml である溶液） に重層し、 22, OOOrpm で 2時間、 遠心することにより、 ファージ層を形成させ、 このファージの白レ、バ ンドを丁寧に分取し、 TE緩衝液 （10mM Tris- HC1, pH 7. δ, ImM EDTA)で透析し、 CsCl 成分を除去した。 更にこのファージ溶液を、 フエノール処理により、 ファ ージ蛋白質を変性させ、 T7 ファージのゲノム DNAを精製した。
T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子はこのゲノム DNA、 39, 937塩基対の内、 3171 から 5822 番目にコードされている [T7 ゲノム遺伝子の全塩基配列については、 Dunn らによって既に報告されている（1983, J. Mol. Biol. , 166 (4)： 477-535) 0 但し、 若干の言丁正力 sある（GeneBank、 accession No. V01148 J02518 X00411 の T7 ファ ージ DNA配列参照）]。 このゲノム DNAを铸型として PCRを利用して増幅し、 以下 のように発現ベクターにクロ一ユングした （図 9参照）。 すなわち、 5' 末端に制 限酵素 Nco I 切断部位をそれぞれ含み、 T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子の N 末 端アミノ酸領域上流に特異的なプライマ一（T7Rpol- N 5' -ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG - 3 ' 及び C 末端ァミノ 酸領域下流に特異的なプライマー（ T7Rpol-C 5' -ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG - 3 ' )を用いて、 この酵素遺伝子を PCR 法により増幅し た。 この DNAフラグメントを Nco Iで消化し、 1%ァガロース電気泳動を行い、 目的の DNAフラグメントをァガロースから切り出し、 Gene Pure Ki t (二ツボンジ ーン） を用いて精製した。 これを Nco I で消化し脱リン酸化した発現べクタ 一 pTrc99a (フアルマシア .バイオテク） と連結することで T7 RNA ポリメラ一 ゼ を高発現する pT7R を構築した。 野生型 T7 RNA ボリメラ一ゼを発現するプ ラスミ ド pT7R は、 大腸菌 DH5ひに形質転換し、 抗生物質アンピシリン耐性を示 す大腸菌を、 培養し、 培養液中に IPTGを添加し、 発現ベクター pT7Rに含まれる Trc プロモータ一を稼働させた。 IPTG 添加 2 時間後、 大腸菌を回収し、 全蛋白 質を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により解析したところ、 T7 RNA ポリ メラ一ゼの分子量である 99kDa 付近に、 IPTG を添加した時のみ蛋白質のバンド が検出された。 この蛋白質を更に、 Zawadzki , V ら、 1991， Nuc l. Ac ids Res. , 19 : 1948 に既に記載されている方法を一部改良した方法 （詳しい方法は実施例 3 で例示されている変異型 Τ7 RNA ポリメラーゼの精製法とほとんど同じ方法で行 うことが出来る） で精製したところ、 Τ7 プロモータ一特異的に作用する RNA ポ リメラーゼの活性を有していた。
実施例 2
変異型 Τ7 RNAボリメラーゼを生産するための発現プラスミ ドの構築
( 1 )変異型 Τ7 RNAポリメラーゼ F644Yを生産するための発現プラスミ ドの構 築 （図 1 0参照）
野生型 T7 RNAポリメラーゼ 遺伝子の挿入してある pT7Rを鎵型にして、 T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子の C末端側に相当する制限酵素 Hpa I , Nco I 部位 に 挟まれる領域を PCR 法を利用して変異を導入した。 更に詳しく例示すると、 変 異を導入したい塩基を境界として、 左右に分け、 変異の導入してある ブライマ 一 F646Y (+) (5' -GTT GAC GG A AGC CGT ACT CTT TGG AC- 3 ' ) F646Y (-） (δ' -GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC- 3 ' ) とそれぞれの制限酵素切断部 位を 5'末端に持つ プライマー T7RNAP- Hpal- N (5' - CGC GCG GTT AAC TTG CTT CCT AG - 3 ' ) 、 pTrc99a-PstI-C (5' - GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG - 3 ' ) を用いて PCRによりそれぞれの DNAフラグメントを増幅した。 これらの DNAフ ラグメントには相補する部分があり、 これらを変性、 ァニール、 伸長反応を繰り 返すことで目的の変異の導入された DNA フラグメントを作製した。 この DNA フ ラグメントをァガロースゲル電気泳動により、 目的の大きさの DNA フラグメン トのみを切り出すことで精製し、 これを铸型としてプライマー T7RNAP - Hpal-Nと pTrc99a- Pstl-Cを用いて再増幅し、 制限酵素 Hpa I , Pst I で切断した： この DNA は 1 %ァガロース電気泳動を行い、 分離した後、 目的の DNA フラグメントを 切り出し、 精製した。 この DNA フラグメントを pT7R の Hpa I ， Pst I DNA フ ラグメントと置き換えることで変異を導入し， 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 変 異の導入されたプラスミ ドを選択し、 最終的には塩基配列を確認することで目的 の位置に変異が導入されているかどうかを確認した。 そして、 変異型 T7 RNA ポ リメラーゼ F644Yを生産するための発現プラスミ ド pT7RF644Yを得た。 このプラ スミ ドからの変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Yの生産は、 野生型 T7 RNAボリメ ラーゼの生産と同様、 本プラスミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTG を添加するこ とにより、 発現誘導可能であった。
(2)変異型 T7 RNAポリメラ一ゼし 665P/F677Yを生産するための発現プラスミ ド の構築 （図 1 1及び 1 2参照）
変異型 T7 RNA ポリメラーゼし 665P/F667Yの構築は、 先の F644Yの構築同様、 PCR法をベースにして以下のように行った。
先ず、 野生型 T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を持つ発現べクタ一 pT7R中の T7 RNA ボリメラ一ゼ遺伝子領域内に、 変異導入操作を容易にするため制限酵素 Xhol (CTCGAG)を導入した。 更に具体的に述べるとプライマー ApaFl (5' - CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC— 3 ' )とプライマ一 Xho - R (δ' -CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA— 3 ' )の組み合わせで、 また、 Xho - F (δ' -CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG - 3 ' )とプライマー Af l l l - R (5' -CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG- 3 ' )の組み合 わせで、 各々铸型として発現べクタ一 pT7R を用いて、 PCR を行った。 増幅した 前者の DNAフラグメントは制限酵素 Apal と Xho lで、 後者の増幅した DNAフラグ メントは制限酵素 ΑΠ Π と Xholでそれぞれ反応し、 さらに発現ベクター pT7Rを 予め Apal と ΑΠ Πで処理して、 全てを T4 DNAライゲ一スを用いて結合させた。 この反応物を大腸菌 DH5 aに形質転換し、 抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平 板上で生育するコロニ一を複数得た = このコロニーをいくつか選択し、 培養、 プ ラスミ ド DNAの抽出を行い、 T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子領域内に制限酵素 Xho l 部位が生まれたプラスミ ド pT7R- Xho を得た （図 1 0参照）。 この Xho l 部位は、 制限酵素 Xhol で処理することによって、 切断されること及び DNAの塩基配列決 定を行い、その存在を確認可能である。 このプラスミ ド pT7R - Xhoを踌型として、 プライマ一 Xho - R とプライマ一 667R (5' - GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT- 3 ' ) の組み合わせとプライマー 667F (δ' -GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT- 3 ' )とプ ライマ一 Afl l lRの組み合わせで各々 PCRを行った。 この PCR産物を直接鍚型と して、 DNAの塩基配列を決定し、 プライマー 667Rおよび 667Fの配列を確認し後、 それぞれを 2%ァガロース電気泳動 （ァガロースは二ツボンジーン製のァガロー ス Xを使用）を行い、 目的の大きさの DNAフラグメントを切り出し、 Gene Pure Kit を用いて、 この DNAフラグメントを精製した。 この精製した 2つの DNAを混合し、 铸型としてプライマー XhoF及び Afl llRを用いて PCRを行い、 増幅した DNAフラ グメントを制限酵素マツビング、 DNA塩基配列の解析により目的のフラグメント であることを確認後、 制限酵素 Xhol と Aflll を用いて酵素反応を行い、 これを 予め制限酵素 Xholおよび Afl l lで処理したプラスミ ド pT7R- Xhoに T4 DNA ライ ゲースを用いて結合させた。 この反応物を大腸菌 DH5 aに形質転換し、 抗生物質 アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。 このコロニー をいくつか選択し、 培養、 プラスミ ド DNAの抽出を行い、 目的の変異が導入され ているかを DNA 塩基配列の決定を行い、 確認し、 最終的に目的の変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Yを生産するための発現プラスミ ド pT7RL665P/F667Yを 構築した （図 1 2参照）。 このプラスミ ドからの変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y の生産は、 野生型 T7 RNA ポリメラーゼの生産と同様、 本プラスミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTGを添加することにより、 発現誘導可能であった。 実施例 3
変異型 T7 RNA ポリメラーゼ の精製
大腸菌に導入した変異型 T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を精製した。
尚、 本蛋白質の野生型については既に Chamberl in, M et al. Nature, 228 : 227—231 (1970)， Davanloo et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 81 : 2035- 2039 (1984)に記載されている。 さらに大量生産に関しては、 Zawadzki, V et al. , Nucl. Acids Res.， 19 : 1948 (1991)に報告されている。
変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼは基本的に全て同じ方法で精製できる。 変異部位 の違いにより、 その発現量、 カラムクロマトグラフィの挙動が若干異なることも ある。 以下、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y の精製法を例示する。 F644Y の 発現ベクター pT7RF644Yを大腸菌 DH5 aに導入、 抗生物質アンピシリンを含んだ LB培地にて、 先ず、 試験管培養にて OD (600nm) = 0. 4〜0. 6になったとき、 イソ プロピル - チォガラク トピラノシド（IPTG) を終濃度 0. 4mMになるように加え、 更に 8時間培養する。 このとき遠心分離により、 大腸菌菌体を集め、 典型的には 2 リツターの培養液より 10gの湿重量の大腸菌が得られる。 この大腸菌菌体を直 ぐに使用しない時は、 -20°C以下の冷凍庫で保存が可能である。 この段階以降の 酵素の精製の全ての行程は、 特記しない限り、 室温以下の温度、 好ましくは 0〜 5°Cにて実施する。 この大腸菌は、 このとき菌体重量の 10倍の洗净緩衝液 （20mM Tri s-HCl , pH 8. 1， 130 mM NaCl , 2mM EDTANa2 at 25°C)で洗い、 再び遠心分離 (5，000xg、4°Cにて 10分間）し、 10倍量のソニケーション緩衝液 [50 mM Tris- HC1, pH 8. 1, 100 mM NaCl , 0. 1 mM EDTANa2, 5 mM ジチォスレイ トール（DTT)、 0. 1 mM ベンザミジン， 30 // g/ml フエ二ルメチルスルホニルフルオリ ド（PMSF)、 10 μ g/mK バシトラシン] に懸濁し、 ソニフアイャ一 450 (ブランソン社） を用い、 80W、 15 分間超音波処理を行い菌体を破砕、 粘度を低下させる。 続いて、 12, 000xg、 4°C にて 10分間遠心分離し、 細胞残查を除いた。 得られた上清を撹拌しながら、 10% 硫酸ス トレプトマイシンをゆっく りと滴下し、 終濃度 2. 0%とした後、 更に 30 分間撹拌を続けた。 12，000xg。 4°Cにて 10分間遠心分離し、 沈殿を除去し、 粉末 硫安をゆつく り添加しながら撹拌し、 沈殿を形成させる。 この場合、 最初に 30% 飽和硫安で沈殿を集め （30%硫安沈殿）、 上清は更に 60%飽和硫安になるように 硫安を撹拌しながら添加し、 再び沈殿を形成させ （30-60%硫安沈殿）、 更に上清 を 90%飽和硫安になるように粉末硫安を加え、 4°Cにて 1時間撹拌し、 遠心し回 収した。 この 3つの硫安画分の一部を SDS-アクリルアミ ドゲル電気泳動を行い、 蛋白質を分析したところ、 目的の変異型 T7 RNA ポリメラーゼのほとんどは、 30 - 60%硫安画分に存在し、 以後この画分を用いて精製を進めた。 30-60%硫安画 分は少量のカラム緩衝液 （20 mM KP04, ρΗ7. 7, 100 m NaCl, ImM DTT, 30 μ g/ml PMSF)に懸濁し、 同じ緩衝液 500ml にて、 16時間透析し、 脱塩した。 この透析液 を、 カラム体積 5ml のへパリン-セファロ一ス （フアルマシア 'バイオテク） に 付加する。 次いで、 このカラムを同緩衝液で、 280nm の紫外線吸収物質が検出さ れなくなるまで洗浄し、 カラム体積の約 40 倍の体積の同一緩衝液中の 0. 1M〜 0. 64M NaCl の直線濃度勾配で溶出する。 溶出液は、 適当量を試験管に分画して 集め、 直ぐに SDS -アク リルアミ ドゲル電気泳動を行い、 蛋白質を分析し、 目的 の変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を 検査する。 典型的な例では 0. 4M の NaCl付近に見いだされるはずである。 この 蛋白質を含む分画を集め、 約 1 リ ツターのカラム緩衝液 （20 mM KP04， pH7. 7， 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 μ g/ml PMSF)に対して 16時間透析し、 脱塩操作を行った。 この透析脱塩した分画を、 同緩衝液で予め平衡化した 5ml のカラム体積の Q-セ ファロース（Q- sepharose, フアルマシア 'バイオテク）に付加し、 同緩衝液で、 280nm の紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗浄し、 カラム体積の約 40 倍 の体積の同一緩衝液中の 0. 1M〜0. 64M NaCl の直線濃度勾配で溶出する。 溶出 液は、 適当量を試験管に分画して集め、 直ぐに SDS -アク リルアミ ドゲル電気泳 動行い、 蛋白質を分析し、 目的の変異型 T7 RNA ポリメラーゼと思われる分子量 付近に蛋白質が存在する分画を検査する。 典型的な例では 0. 24M の NaCl 付近 に見いだされるはずである- この蛋白質を含む分画を集め、 500ml の保存用緩衝 液 （50% glycerol, 20 mM KP04, ρΗ7. 7, 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 μ g/ml PMSF) に対して 16時間透析し、 使用まで- 20°Cにて保存する。 この状態で、 イン . ビト 口の RNA合成活性、或いは混入しているリボヌクレアーゼ活性について試験する。 ここでこの方法を例示すると、 イン ' ビトロ RNA 合成活性については、 T7 プロ モ一ターを含むプラスミ ドを铸型として用い、 野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼの巿 販品 （BRL ·ギブコ社） を標準品として酵素希釈法を用いて、 RNA 合成反応を行 レ、、 合成した RNAをァガロース電気泳動する事により、 おおよその力価を推定し た。 このとき、 合成された RNAの分解の程度も観察されるため、 同時に混入リボ ヌクレアーゼに関しての、 簡単な検定も可能である。 典型的な例として、 以上の ような工程を踏まえた精製法で、 1 リッターの培養液から 2， 500， 000単位の変異 型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y蛋白質が精製され、 この標品にはほとんど RNase の混入は認められない。
実施例 4
3 ' dNTP誘導体の取り込み率の改善
精製された変異型 T7 NA ポリメラーゼ F644Y及びし 665P/F667Yを用いて 3 ' dNTPの取り込み効率を野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼと以下のように比較した。 イン . ビトロでの転写反応は、 例えば、 Melton, D. A, [Nucleic Acids Res. , 12: 7035-7056(1984)]によって示された方法を一部改良して行った。 さらに具体的に 述べると、 T7プロモータ一を有するプラスミ ドベクタ一 pBluescriptKS(+) (ス トラタジーン社） を、 制限酵素 PvuII あるいは Seal で反応し、 線状にしたもの を鍩型として用い、 3 ' dNTP の誘導体として、 W096/14434 に記載された方法 を参照して合成したダイ · ターミネータ一である 5-カルボキシ -X -ローダミン標 識 3 '-デォキシシチジン- 5'-トリフォスフェートを 150 μΜ, さらに 500 μ M GTP， UTP 及び 250 μΜ ATP, CTP、 8mM MgCl2、 2mM spermidine- (HC1) 3、 5m DTT、 40mM Tris/HCl H 8.0 (BRL, ギブコ社） の条件下に、 野生型 T7 RNAポリメラーゼ（BRL, ギブコ社あるいは二ツボンジーン製）、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y ある いは L665P/F667Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10// 1 として、 37°Cで 1時 間反応を行った。 次に反応産物中に残存している未反応のダイ · ターミネータ一 を除去するため、 セフアデックス G- 50 カラム （フアルマシア 'バイオテク） を 用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを 用いて蒸発乾固した。
上記 5-カルボキシ- X-ローダミン標識 3 ' -デォキシシチジン- 5' -トリフォス フェートは、 以下の化学式で示される化合物である。
0—
Figure imgf000032_0001
乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1.0に従い、 ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e x t r a n loading buffer 6μ 1 に溶解し、 そのうち 2μ 1 を、 6Μ尿素/ 4%口 ングレンジャー ™アク リルアミ ド溶液 （FMC) を含むシークェンス解析用変性ゲ ルを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer 及び解析プログラムにより解析した。 その結 果を図 1 3にゲル 'イメージとして示す。 変異型 T7 RNA ボリメラーゼ F644Yは 野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼに較べて、 約 3倍のシークェンスラダ一が得られる ことが判明し、 約 700塩基の転写産物も確認された。
更に図 1 4及び図 1 5に、 それぞれ F644Y及びし 665P/F667Yを用いて得られた シークェンスラダーのピーク強度を野生型 T7 RNA ポリメラーゼを用いて得られ たピーク強度と対比して示す。 この対比から、 変異型酵素のピークの高さは、 野 生型と較べてバラツキが少なく、 さらに強いシグナルをもつピークが得られた。 これは、 F644Yあるいは L665P/F667Yの変異によって、 この場合、 3 ' dCTP誘導 体の取り込み率が改善されたことを示し、 さらに、 この変異型 T7 RNA ポリメラ —ゼによる転写反応が、 既に存在する DNAポリメラーゼによる塩基配列決定法の デ一タ生産力に匹敵するラダー伸長反応特性を持っていることを示している。
実施例 5
変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼを用いたダイ · ターミネータ一法によるシークェ ンス反応例
ダイ ' タ一ミネ一ター法によるシークェンス反応を、 精製された変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y及び L665P/F667Y と野生型 T7 RNA ボリメラーゼについて以 下のように比較した。
イン 'ビトロでの転写反応は、実施例 4で例示した、 Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res.， 12 : 7035 - 7056)によって示された方法を用いた。 さらに具体的に述 ベると、 T7 プロモーターを有するプラスミ ドベクター PBluescriptKS (+)を、 制 限酵素 pvuI Iあるいは Sealで反応し、線状にしたものを铸型として用レ、、 3 ' dNTP の誘導体として、 W096 4434 に記載された方法を参照して合成したダイ -タ 一ミネ一タ一、 5-カルボキシローダミン 6G 標識 3 ' -デォキシアデノン- 5' -ト リフォスフェート， 5-カルボキシローダミン 110標識 3 ' -デォキシグアノシン - 5'-トリフォスフェート， 5-カルボキシ -X-ローダミン標識 3 ' -デォキシシチ ジン- 5' -トリフォスフェート， 5 -カルボキシテトラメチルローダミン標識 3 ' -デォキシゥリジン- 5'-トリフォスフェート， さらに 500 μ M GTP， UTP 及び 250 μΜ ATP, CTP、 8mM MgCl2、 2mM spermidine- (HCl) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社） の条件下に、 野生型 T7 RNA ポリメラーゼ（BRL, ギブコ社 あるいは二ツボンジーン製） あるいは変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y 25 単位を加えて、 合計反応体積 ΙΟμΙ として、 37°Cで 1時間反応を行った。 次に反 応産物中に残存している未反応のダイ ·ターミネータ一を除去するため、 セファ デックス G-50 カラム （フアルマシア 'バイオテク製） を用いたゲル濾過法によ り転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバボレーターを用いて蒸発乾固した。 上記 5-カルボキシ- X-口一ダミン標識 3 ' -デォキシシチジン- 5'-トリフォス フェートは、 実施例 4で使用したものと同一の化合物である。 また、 5-カルボキ シローダミン 6G標識 3 ' -デォキシアデノン- 5'-トリフォスフェート， 5-カル ボキシローダミン 110 標識 3 ' -デォキシグアノシン- 5'-トリフォスフエ一ト， 及び 5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3 ' -デォキシゥリジン- 5'-ト リフォスフエ一トは以下の化学式で示される化合物である c
C=0
O 0 0
II II II
O -" P一 0一 P― 0一 P一ひ
o— 0' 0" -カルボキシローダミン 6G標識 3 ' -デォキシアデノン- 5'-トリフォスフエ'
o ~
Figure imgf000035_0001
5-カルボキシローダミン 110 標識 3 ' -デォ -5' -トリフォスフ ェ1 ~ト
O—
Figure imgf000035_0002
5 -カルボキシテトラメチルローダミン標識 3 ' -デォキシゥリジン- 5'-トリフ ォスフ. 乾燥させた反応物を株式会社バーキンエルマ' ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1. 0に従い、 ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e x t r a n loading buffer 6 μ 1 に、溶角 ¥し、 そのうち 2 μ 1 を、 6Μ尿素 /4%口 ングレンジャー ΤΜアク リルアミ ド溶液 （FMC) を含むシークェンス解析用変性ゲ ルを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer 及び解析プログラムにより解析した。 その結 果、図 1 6に提示した力 、変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Yあるいは L665P/F667Y は野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼに比べて、 ピーク強度が高く、 更にバラツキが少 なく、 シークェンス読みとりが可能であることが判明した。 ここで野生型 T7 RNA ポリメラーゼを用いた場合、 ほとんどシークェンスは不可能であった。
実施例 6
変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Y を生産するための発現プラス ミ ドの構築 （図面 17参照）
変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Y の構築は、 先に構築した変異 型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y を生産する発現プラスミ ド構築方法 （実施 例 2参照） と同様に、 PCRをベースにして以下のように行った。
変異型 T7 RNAポリメラーゼ L665P/F667Y を生産する発現プラスミ ドを踌型と し て 、 プ ラ イ マ ー Xho - F と プ ラ イ マ ー T7 - DOUBLE- R (21mer : 5' - CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG- 3' )の組み合わせとプライマ一 17- DOUBLE-F (29mer： 5' - TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC- 3' )とプライマ一 Afl l l- R の組み合わせで各々 PCRを行った。 この PCR産物を直接铸型として、 DNA の塩基配列を決定し、 プラ イマ一 T7-D0UBLE- Rおよび T7- DOUBLE- F の配列を確認後、 それぞれを 2%ァガロ ース電気泳動を行い、 目的の大きさの DNAフラグメントを精製した。 この精製し た 2つの DNAを混合し、 踌型としてプライマー Xho - Fおよび Afl l l- R用いて PCR を行い、 増幅した DNA フラグメントを制限酵素マッピング、 DNA塩基配列の解析 により目的のフラグメントであることを確認後、 制限酵素 Xhol および Af l l l を 用いて酵素反応を行い、 これを予め制限酵素 Xhol および ΑΠ Π で処理したプラ スミ ド pT7RL665P/F667Y に T4 DNA ライゲ一スを用いて結合させた。 この反応物 を大腸菌 DH5ひに形質転換し、 抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育 するコロニーを複数得た。 このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミ ド DNA の抽出を行い、 目的の変異が導入されているかを DNA塩基配列の決定を行い、 確 認し、 最終的に目的の変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yを生産す るための発現プラスミ ド PT7RF644Y/し 665P/F667Yを構築した （図 17参照）。 この プラスミ ドからの変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yの生産は、 野 生型 T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTG を添加することにより発現誘導可能であった。
実施例 7
変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Yの精製
変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yは、 実施例 3に記載の方法と 同じ方法で精製可能であった。 典型的な例として、 1 リ ツターの培養液から 1 , 000, 000単位の変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Y蛋白質が精製 された。 得られた RNAポリメラーゼは、 SDS-ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動に て、 ほぼ単一バンドであり、 この標品から RNaseは検出されなかった。
実施例 8
3' dNTP誘導体の取り込み率の改善
実施例 7で精製した変異型 T7 RNAポリメラーゼのリボヌクレオチド (NTP)と 3' デォキシヌクレオチド（3' dNTP)の取り込み率を以下のように測定した。
転写反応の铸型は、 プラスミ ド pBlueScript (KS+) (ストラタジーン社） を制 限酵素、 PvuI Iで反応し、 線状としたものを用い、 ATP, CTP, GTP, UTPをそれぞ れ 250uM、 2mM spermidine- (HC1) 3、 5m DTT、 40m Tri s/HCl pH 8. 0、 0. 1D1 の [alpha-32P] UTP (3000 Ci/mmole)の条件下、 変異型 T7 RNA ポリ メラーゼ F644Y/L665P/F667Yを 25単位、 反応に用いた。 そして、 2種類の反応液 （3' dATP の無添加又は添加 （終濃度 ΙΟΟ μ Μ) ) を用意して、 37°C、 60分反応させた。 そし て、 この反応物全量を DE81 paper (ワッ トマン社） にスポットし、 リン酸緩衝 液で 3 回洗浄、 乾燥させ、 DE81 paper をシンチレーシヨンバイアルに入れて、 シンチレーシヨンカウンター （ベックマン） を用いて、 それぞれの放射活性を測 定した。 これにより得られた放射活性より、 3' - dATP の添加、 無添加時の値と比 較することによってどれだけ [alpha-32P] UTP の取り込みが阻害されるかを算出 した。 算出値を、 野性型 T7 RNA ポリメラ一ゼの阻害度 1 . 0 0 0と比較して得 られる相対活性を表 1に示す。
上記 F644Y/し 665P/F667Y変異体に代えて、 野性型 T7 RNAポリメラーゼ、 実施 例 3で得た変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y若しくは L665P/F667Y、 又は実施 例 2及び 3と同様の方法で構築精製した変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P、 F782Y、 F733Y、 F646Y若しくは Y639Fを反応に用いて、 阻害結果を得た。 相対活 性を表 1に示す。
表 1の結果は、 数値が大きいほど、 その変異型酵素が、 3' -dATPを取り込みや すくなつている変異であることを示している。 例えば、 この場合、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yは、 野性型酵素より、 5. 58倍、 3' -dATPを取り 込みやすい酵素であることを意味する。 F644Y/L665P/F667Y 変異体は、 今回、 作 製した変異型酵素の中で、 もっとも 3' -dNTPを取り込むバイアスの少ない変異型 酵素であることを示している。 変異部位 3 dATPによる RNホリメフーセの相対活性
F644Y 5. 1 30
F644YZし 665P 5. 1 30
し 665P/F667Y 4. 71 1
F644YZし 665PZF667Y 5. 580
F782Y 1 . 1 73
F733Y 1 . 075
F646Y 0. 459
Y639F 0. 930
野生型 1 . 000
実施例 9 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yを用いたシークェンス反応例 シークェンス反応の錄型として用いた铸型は以下のように PCRにより作製した。 PCRの铸型として human thyroid-stimulating hormone (hTSH- cDNA を T7 プロモーターを有する BS750由来のプラスミ ドにサブクローニングしたものを用 いた。 この hTSH- ]3をもつプラスミ ド、 lOOfg を用い、 クローユング部位を挟む 形で存在する L220プライマ一（5' -TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A - 3' )及び 1211 プライマー（5， - ACG TTG TAA AAC GACGGC CAG T- 3' )で反応液量 20 μ 1で PCR [ (94°C 2分） 1回、 （94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1. 5分） 30回、 72°C 5分] を行った。 この PCRで出来た PCR産物の 1211プライマーの下流に T7プロモーターが存在す る。 シーク ェンス転写反応は、 Mel ton, D. A [Nucleic Acids Res.， 12 : 7035— 7036 ( 1984) ]に示されている方法を用いて行った。 上記 PCR産物の内 Ι μ ΐ (約 10ng)をシークェンス反応に用いた。反応は、 3' dNTP の誘導体として、 実施例 5 で用いたと同様のダイ · ターミネータ一 4 MR6G- 3'dATP[5-カルボキシローダミン 6G標識 3'-デォキシアデノシン- 5-トリフォス フェート（η=4)]、 4μΜ R110-3' dGTP [5-カルボキシローダミン 110標識 3' -デォ キシグアノシン- 5-トリフォスフェート（n=4)]、 80 μΜ XR- 3' dCTP[5-カルボキシ- X -ローダミン標識 3'-デォキシシチジン- 5-トリフォスフエ一ト（n=4)]、 20 μΜ TMR-3' dUTP [5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3'-デォキシゥリジン- 5- トリフォスフェート（n=4)]を用いた。 さらに 500/iMUTP、 250 μ M ATP, 200/iMCTP、 500 //Μ GTP、 2mM スペルミジン-（HCI)3、 δπιΜ DTT、 40mM Tris/HCl pH8.0 (BRし、 ギブコ社）の条件下、 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Y 25単位を 加えて、 合計反応体積 10// 1 として、 37°Cで一時間反応を行った。
次に反応産物中に残存している未反応のダイ ·ターミネータ一を除去するため、 セフアデックス G- 50カラム（フアルマシア ·バイオテク製） を用いたゲル濾過法 により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固し た。
この乾燥させた反応物を株式会社パーケンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA sequencing System取り扱レヽ説明書 Ver.1.0に従レヽ、 ホルムァミ ド /EDTA/Blue dextran loading buffer 6 μ 1 に溶角？し、 そのうちの 2μ1 を、 6Μ尿素/ 4% ロン グレンジャー ΤΜアク リルアミ ド溶液 (FMC社）を含むシークエンス解析用変性ゲル を用レヽ、 ΑΒΙ 377 DNA sequencer 及び角？析ブログラム（Sequencing Analysis Ver.3.0)により解析し、 エレク トロフエログラムを得た。 図 18 にその結果を示 す。 このように良好なシークェンス解析が可能である。

Claims

請求の範囲
(1 ) 対応する野性型 RN Aポリメラーゼの能力と比較して、 3' デォキシリボ ヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、 少なく とも 1つのアミノ酸が修飾された野性型 R N Aポリメラ一ゼからなることを特徴 とする RNAポリメラーゼ。
(2) 野性型 RNAポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なく と も 1つのァミノ酸が修飾されている請求項 1記載の RNAポリメラ一ゼ。
(3) アミノ酸の修飾が、 アミノ酸の置換、 挿入または欠落である請求項 2に記 载の R N Aポリメラーゼ
(4) 野性型 RN Aポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なく と も 1つのアミノ酸がチロシンに置換されている請求項 1〜 3のいずれか 1項に記 載の RNAポリメラ一ゼ。
(5) 置換されるアミノ酸がフエ二ルァラニンである請求項 4に記載の RN Aポ リメラ一ゼ。
(6) ヌクレオチド結合部位に存在するアミノ酸が、 ヘリックス Y とへリックス Z との間のループ中のアミノ酸及び Z又はヘリックス Z とヘリックス A Aとの間 のループ中のアミノ酸である請求項 2〜5のいずれか 1項に記載の RN Aポリメ ラーセ。
(7) 3 ' デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する取り込み能 力を、 野性型の少なくとも 2倍増加させるように修飾されている請求項 1〜 6の いずれか 1項に記載の RN Aポリメラーゼ。
(8) T 7ファージ、 T 3ファージ、 S P 6ファージ、 K l 1ファージに由来す る請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の RNAポリメラ一ゼ。
(9) T 7ファ一ジ由来の RNAポリメラーゼのァミノ酸残基 641- 667に対応す る領域から選択される領域中の少なくとも 1つのアミノ酸が修飾されている野性 型 RNAポリメラーゼであることを特徴とする RN Aポリメラーゼ。
(1 0) 修飾されるべき野性型 RNAポリメラーゼが、 前記以外のアミノ酸の置 換、 挿入または欠落を、 さらに有する請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の RN Aポリメラ一ゼ。
(1 1) T 7ファージ由来の RNAポリメラーゼであって、 アミノ酸残基 644 または 667においてチロシンを有する RN Aポリメラーゼ。
(1 2) T 7ファージ由来の RN Aボリメラーゼがァミノ酸残基 644及び 66 7以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落をさらに有する請求項 1 1に記載の R N Aポリメラ一ゼ。
(1 3) 野性型 T 7 RNAポリメラーゼの 644番目のアミノ酸残基フユニルァ ラニンがチロシンに置換されたことを特徴とする R N Aポリメラーゼ。
(14) 野性型 T 7 RN Aポリメラーゼの 667番目のァミノ酸残基フエニルァ ラ二ンがチ口シンに置換されたことを特徴とする R N Aポリメラーゼ。
(1 5) 野性型 T 7 RNAポリメラーゼの 665番目のアミノ酸残基ロイシンが プロリンに置換されている請求項 1 3又は 14に記載の RN Aポリメラ一ゼ。
(1 6) 野性型 T 7 RNAポリメラーゼの 644番目のァミノ酸残基フエニルァ ラニンがチロシンに置換され、 かつ 667番目のアミノ酸残基フエ二ルァラニン がチロシンに置換されていることを特徴とする RN Aポリメラ一ゼ。
(1 7) 野性型 T 7 RNAボリメラーゼの 665番目のアミノ酸残基ロイシンが プロリンに置換されている請求項 1 6に記載の RN Aポリメラーゼ。
(1 8) T 3ファージ由来の RN Aポリメラ一ゼであって、 アミノ酸残基 64 5 または 668においてチロシンを有する RN Aポリメラーゼ。
(1 9) T 3ファージ由来の RN Aポリメラーゼがァミノ酸残基 645及び 66 8以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落をさらに有する請求項 1 8に記載の R NAポリメラーゼ。
(20) K 1 1ファージ由来の RNAポリメラーゼであって、 ァミノ酸残基 664 〜669の間または 690においてチロシンを有する RN Aポリメラ一ゼ-
(2 1) K 1 1ファージ由来の RNAポリメラーゼがァミノ酸残基 664〜669 の 間または 690以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落をさらに有する請求項 2 0に記載の R N Aポリメラーゼ。
(22) S P 6ファージ由来の RNAポリメラーゼであって、 アミノ酸残基 6 33〜638の間または 6 70においてチロシンを有する R N Aポリメラーゼ。
(23) S P 6ファージ由来の RNAポリメラ一ゼがアミノ酸残基 633〜6 38の間または 670以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落をさらに有する請 求項 22に記載の RN Aボリメラーゼ。
(24) 請求項 1〜1 8のいずれか 1項に記載の RNAポリメラ一ゼの少なく と も一部をコードするポリヌクレオチド。
(25) 請求項 1〜24のいずれか 1項に記載の RNAポリメラ一ゼを製造する 方法であって、
RNAポリメラーゼをコ一ドする核酸分子を用意し、
ヌクレオチド塩基配列内の 1つまたはそれ以上の部位における 1つまたはそれ以 上の塩基を変更させるように該核酸分子に突然変異を起こさせ、 次いで 変異させた核酸分子により発現される修飾された R N Aポリメラーゼを回収する ことを含む方法。
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