JP2003061684A - Ｄｎａの塩基配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列決定法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
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Abstract
(57)【要約】
【課題】キャピラリーを用いたシークエンス解析におい
ても高いＳＮ比が得られ、かつ、一回の反応でより長
く、かつより正確な塩基配列データを取得し得る転写シ
ークエンス法を提供すること。 【解決手段】RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼのため
のプロモーター配列を有する鋳型DNA及びRNAポリメラー
ゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程を含むDNA
の塩基配列決定方法。RNAポリメラーゼの基質には、3'
−デオキシヌクレオチド誘導体が含まれる。RNAポリメ
ラーゼは、野生型RNAポリメラーゼの少なくとも１つの
アミノ酸を置換し、または少なくとも１つのアミノ酸を
欠失させた変異型RNAポリメラーゼである。アミノ酸の
置換及び／または欠失は、変異型RNAポリメラーゼが対
応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'−デオキ
シヌクレオチド誘導体を基質として取り込む能力が増加
するように行われる。
ても高いＳＮ比が得られ、かつ、一回の反応でより長
く、かつより正確な塩基配列データを取得し得る転写シ
ークエンス法を提供すること。 【解決手段】RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼのため
のプロモーター配列を有する鋳型DNA及びRNAポリメラー
ゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程を含むDNA
の塩基配列決定方法。RNAポリメラーゼの基質には、3'
−デオキシヌクレオチド誘導体が含まれる。RNAポリメ
ラーゼは、野生型RNAポリメラーゼの少なくとも１つの
アミノ酸を置換し、または少なくとも１つのアミノ酸を
欠失させた変異型RNAポリメラーゼである。アミノ酸の
置換及び／または欠失は、変異型RNAポリメラーゼが対
応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'−デオキ
シヌクレオチド誘導体を基質として取り込む能力が増加
するように行われる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変異型RNAポリメ
ラーゼによる転写反応を利用した塩基配列決定方法に関
する。
ラーゼによる転写反応を利用した塩基配列決定方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】DNAの塩基配列決定技術は、生物の持っ
ているゲノム上の配列情報を得るためになくてはならな
い技術である。歴史的に見ると塩基配列決定技術は、化
学分解法[Maxam,A.M., et al. Proc.Natl.Acad.Sci., 7
4:1258-1262(1977)]と酵素合成法[Sanger,F., et al. .
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463(1977)]の二つがあ
る。前者は、マキサム−ギルバート法、後者はジデオキ
シターミネーター法あるいは開発者に因んでサンガー法
と呼ばれている。
ているゲノム上の配列情報を得るためになくてはならな
い技術である。歴史的に見ると塩基配列決定技術は、化
学分解法[Maxam,A.M., et al. Proc.Natl.Acad.Sci., 7
4:1258-1262(1977)]と酵素合成法[Sanger,F., et al. .
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463(1977)]の二つがあ
る。前者は、マキサム−ギルバート法、後者はジデオキ
シターミネーター法あるいは開発者に因んでサンガー法
と呼ばれている。
【０００３】現在、サンガー法を基礎とする、DNAポリ
メラーゼ、特に耐熱性DNAポリメラーゼを用いたサイク
ルシークエンス法が塩基配列決定法の一般的な方法とし
て広く利用されている。サイクルシークエンス法を含む
塩基配列決定の一連の作業は、1)鋳型の調製、2) DNAポ
リメラーゼを利用した部分的停止反応によるラベルされ
たDNA断片の調製、3) DNA断片の電気泳動、4) 電気泳動
したDNA断片の読み取り、及び 5)読み取り結果の解析
からなる。上記2)〜5)については、異なる波長特性を持
つ4つの蛍光色素のいずれかでラベルされた4種類のジデ
オキシヌクレオチドを用い、さらに電気泳動しながら、
レーザー照射により使用している蛍光色素特異的な励起
波長を検出することにより、DNA断片の長さを順番に自
動的に取りこみ、配列データに変換する自動DNAシーケ
ンサーが開発されて、大量のDNA配列情報を簡単に得る
ことが可能になっている[Smith,L.M., et al. Nature,
321:674(1986)]。
メラーゼ、特に耐熱性DNAポリメラーゼを用いたサイク
ルシークエンス法が塩基配列決定法の一般的な方法とし
て広く利用されている。サイクルシークエンス法を含む
塩基配列決定の一連の作業は、1)鋳型の調製、2) DNAポ
リメラーゼを利用した部分的停止反応によるラベルされ
たDNA断片の調製、3) DNA断片の電気泳動、4) 電気泳動
したDNA断片の読み取り、及び 5)読み取り結果の解析
からなる。上記2)〜5)については、異なる波長特性を持
つ4つの蛍光色素のいずれかでラベルされた4種類のジデ
オキシヌクレオチドを用い、さらに電気泳動しながら、
レーザー照射により使用している蛍光色素特異的な励起
波長を検出することにより、DNA断片の長さを順番に自
動的に取りこみ、配列データに変換する自動DNAシーケ
ンサーが開発されて、大量のDNA配列情報を簡単に得る
ことが可能になっている[Smith,L.M., et al. Nature,
321:674(1986)]。
【０００４】しかし、1)については、2)のポリメラーゼ
反応に適した鋳型調製という点で重要であり、この調製
の如何により4)で取得されるデータ量と質に反映するた
め、様々な工夫が行なわれた。そして、作業の簡便性と
いう点から、耐熱性DNAポリメラーゼを用いた遺伝子増
幅法（PCR）を用いた増幅物を鋳型にする方法が利用さ
れるようになっている[Phear,G.A., et al. Methods Mo
l. Biol., 31:247(1994):高木茂他.蛋白質・核酸・酵
素、37(5):868(1992)]。しかし、この方法は、鋳型調製
は非常に容易であるが、先のPCR反応から持ちこんだ未
反応のプライマー及び取りこまれなかったデオキシヌク
レオチドが、DNAポリメラーゼを用いたシークエンス反
応を阻害し、配列解析が出来ないことがしばしばあっ
た。そこで、それを解決するため、PCR産物を精製した
り、酵素的にプライマーやフリーのヌクレオチドを不活
性化するといった方法が考案されている。しかし、いず
れの方法も、操作が煩雑であり、コストという点から、
大規模解析にはまた不向きであった。
反応に適した鋳型調製という点で重要であり、この調製
の如何により4)で取得されるデータ量と質に反映するた
め、様々な工夫が行なわれた。そして、作業の簡便性と
いう点から、耐熱性DNAポリメラーゼを用いた遺伝子増
幅法（PCR）を用いた増幅物を鋳型にする方法が利用さ
れるようになっている[Phear,G.A., et al. Methods Mo
l. Biol., 31:247(1994):高木茂他.蛋白質・核酸・酵
素、37(5):868(1992)]。しかし、この方法は、鋳型調製
は非常に容易であるが、先のPCR反応から持ちこんだ未
反応のプライマー及び取りこまれなかったデオキシヌク
レオチドが、DNAポリメラーゼを用いたシークエンス反
応を阻害し、配列解析が出来ないことがしばしばあっ
た。そこで、それを解決するため、PCR産物を精製した
り、酵素的にプライマーやフリーのヌクレオチドを不活
性化するといった方法が考案されている。しかし、いず
れの方法も、操作が煩雑であり、コストという点から、
大規模解析にはまた不向きであった。
【０００５】このようなPCR増幅物を鋳型にする方法に
おける問題を解決する方法として、PCR産物を何の精製
も必要なしに直接使用できる転写シークエンス法(trans
criptional sequencing)が開発された[Sasaki,N., et a
l. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95(7),:3455(1998)、特許
３１５５２７９号、特開平１１−７５８９８号公報]。
この方法は、PCR反応物の精製という面倒な操作ステッ
プを省略することが可能であり、全体のコスト削減に貢
献すると期待された。
おける問題を解決する方法として、PCR産物を何の精製
も必要なしに直接使用できる転写シークエンス法(trans
criptional sequencing)が開発された[Sasaki,N., et a
l. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95(7),:3455(1998)、特許
３１５５２７９号、特開平１１−７５８９８号公報]。
この方法は、PCR反応物の精製という面倒な操作ステッ
プを省略することが可能であり、全体のコスト削減に貢
献すると期待された。
【０００６】転写シークエンス法は、ファージRNAポリ
メラーゼを利用し、3'−デオキシヌクレオチド或いはそ
の誘導体の存在下で転写反応を行い、電気泳動にてRNA
断片を分離し、そのRNA断片のサイズに基づいて塩基配
列を読み取っていくことを原理とした方法である。更
に、使用するRNAポリメラーゼとして、例えばT7 RNAポ
リメラーゼの変異体のひとつであるT7 RNAポリメラーゼ
F644Y[特開平11-75867号公報]を用いると、3'−デオキ
シヌクレオチド或いはその誘導体のバイアスのない取り
込みが出来るためにより正確な塩基配列決定を行うこと
が出来る[特開平11-75898号公報]。
メラーゼを利用し、3'−デオキシヌクレオチド或いはそ
の誘導体の存在下で転写反応を行い、電気泳動にてRNA
断片を分離し、そのRNA断片のサイズに基づいて塩基配
列を読み取っていくことを原理とした方法である。更
に、使用するRNAポリメラーゼとして、例えばT7 RNAポ
リメラーゼの変異体のひとつであるT7 RNAポリメラーゼ
F644Y[特開平11-75867号公報]を用いると、3'−デオキ
シヌクレオチド或いはその誘導体のバイアスのない取り
込みが出来るためにより正確な塩基配列決定を行うこと
が出来る[特開平11-75898号公報]。
【０００７】しかし、転写シークエンス法においても、
ノイズが高く、正確な配列解析が出来ない場合があると
いう問題があった。このノイズ高の問題は、従来のスラ
ブ型シーケンサーを用いたときには問題にはならなかっ
た。これは、サンプルがポリアクリルアミドのマトリッ
クス中を移動する際、比較的その断面積が大きいためで
あると考えられる。しかし、キャピラリーを用いたシー
ケンサーでは、ノイズが高く、正確な配列解析が出来な
い場合があった。これは、キャピラリーの断面積が非常
に小さいため、負荷できるサンプル量が限られ、そのた
め、装置的に感度が高くなっており、ノイズに対して非
常に弱いためであると考えられる。キャピラリーを用い
たシーケンサーは、一度にたくさんのシークエンス解析
を行うことが可能であるため、大量のサンプル処理には
必須である。従って、転写シークエンス法がさらに普及
するためには、上記問題の解決が急務であった。
ノイズが高く、正確な配列解析が出来ない場合があると
いう問題があった。このノイズ高の問題は、従来のスラ
ブ型シーケンサーを用いたときには問題にはならなかっ
た。これは、サンプルがポリアクリルアミドのマトリッ
クス中を移動する際、比較的その断面積が大きいためで
あると考えられる。しかし、キャピラリーを用いたシー
ケンサーでは、ノイズが高く、正確な配列解析が出来な
い場合があった。これは、キャピラリーの断面積が非常
に小さいため、負荷できるサンプル量が限られ、そのた
め、装置的に感度が高くなっており、ノイズに対して非
常に弱いためであると考えられる。キャピラリーを用い
たシーケンサーは、一度にたくさんのシークエンス解析
を行うことが可能であるため、大量のサンプル処理には
必須である。従って、転写シークエンス法がさらに普及
するためには、上記問題の解決が急務であった。
【０００８】また、一回のポリメラーゼ反応でより長鎖
のDNAについて、より正確な塩基配列データを取得し得
る方法への改良要求もあった。
のDNAについて、より正確な塩基配列データを取得し得
る方法への改良要求もあった。
【０００９】ヒトゲノムの概要版が報告されている[Ven
ter,J.C., et al. Science, 291:1304-1351(2001); Int
ernational Human Genome Sequencing Consortium, Nat
ure,409:860-921(2001)]。ヒトゲノム配列は、30億塩基
対といわれているが、現在使用されている塩基配列決定
のための方法では、一回の反応で、せいぜい５００塩基
程度、より長く読むための様々な工夫を行っても解析可
能な塩基対はせいぜい１０００塩基対である。従って、
膨大な量のゲノムの塩基配列を決定するためには、非常
に多くの反応を行う必要がある。従って、一回のポリメ
ラーゼ反応でより長鎖のDNAを読める技術が必要であ
る。
ter,J.C., et al. Science, 291:1304-1351(2001); Int
ernational Human Genome Sequencing Consortium, Nat
ure,409:860-921(2001)]。ヒトゲノム配列は、30億塩基
対といわれているが、現在使用されている塩基配列決定
のための方法では、一回の反応で、せいぜい５００塩基
程度、より長く読むための様々な工夫を行っても解析可
能な塩基対はせいぜい１０００塩基対である。従って、
膨大な量のゲノムの塩基配列を決定するためには、非常
に多くの反応を行う必要がある。従って、一回のポリメ
ラーゼ反応でより長鎖のDNAを読める技術が必要であ
る。
【００１０】さらに、上記技術を用いて決定られた塩基
配列の断片情報は、繋ぎ合わされて、生物のもっている
ゲノムを連続した塩基配列情報が組み立てられる。さら
には、多くの生物種から得られた配列情報を比較し、さ
らに配列情報から機能解析を予想し、その情報を疾患遺
伝子同定、創薬、遺伝子型診断等へ繋げようというバイ
オインフォマティクスという分野が急速に発展している
[例えば、遺伝子医学、第4巻第３号(2000)]。特に、最
近は、一塩基多型(single nucleotide polymorphism; S
NP)が注目を集めており、これにより個人差や生命の多
様性を規定する現象を解き明かそうとしている。また、
この情報は、疾患のかかりやすさ、薬剤感受性、薬剤耐
性や副作用などの個人差を考えた医療に応用しようとい
う方向の研究が盛んである。そのためにはまだまだ塩基
配列を決定する作業は膨大なものであると予想される。
特に、SNPの解析においては、塩基配列データのより正
確な取得は必須である。
配列の断片情報は、繋ぎ合わされて、生物のもっている
ゲノムを連続した塩基配列情報が組み立てられる。さら
には、多くの生物種から得られた配列情報を比較し、さ
らに配列情報から機能解析を予想し、その情報を疾患遺
伝子同定、創薬、遺伝子型診断等へ繋げようというバイ
オインフォマティクスという分野が急速に発展している
[例えば、遺伝子医学、第4巻第３号(2000)]。特に、最
近は、一塩基多型(single nucleotide polymorphism; S
NP)が注目を集めており、これにより個人差や生命の多
様性を規定する現象を解き明かそうとしている。また、
この情報は、疾患のかかりやすさ、薬剤感受性、薬剤耐
性や副作用などの個人差を考えた医療に応用しようとい
う方向の研究が盛んである。そのためにはまだまだ塩基
配列を決定する作業は膨大なものであると予想される。
特に、SNPの解析においては、塩基配列データのより正
確な取得は必須である。
【００１１】塩基配列決定方法の進歩により、ヒトゲノ
ムサイズの解析が可能になり、まだまだ、今後、個人の
遺伝子情報の解析、遺伝子の機能解析のために行うヒト
以外の生物のゲノム解析と、益々、塩基配列決定技術の
需要は高まってくるものと思われる。上記のような利点
を有する転写シークエンス法をさらに改良した方法の提
供は、より大量の塩基配列決定をより容易にかつ正確に
行うことを可能にし、今後のバイオインフォマティクス
の進展にも大いに貢献すると考えられる。
ムサイズの解析が可能になり、まだまだ、今後、個人の
遺伝子情報の解析、遺伝子の機能解析のために行うヒト
以外の生物のゲノム解析と、益々、塩基配列決定技術の
需要は高まってくるものと思われる。上記のような利点
を有する転写シークエンス法をさらに改良した方法の提
供は、より大量の塩基配列決定をより容易にかつ正確に
行うことを可能にし、今後のバイオインフォマティクス
の進展にも大いに貢献すると考えられる。
【００１２】そこで本発明の目的は、キャピラリーを用
いたシークエンス解析においても高いＳＮ比が得られ、
かつ、一回の反応でより長く、かつより正確な塩基配列
データを取得し得る転写シークエンス法を提供すること
にある。
いたシークエンス解析においても高いＳＮ比が得られ、
かつ、一回の反応でより長く、かつより正確な塩基配列
データを取得し得る転写シークエンス法を提供すること
にある。
【００１３】ところで、転写シークエンス法の大きな特
徴は、大腸菌に感染するT3やT7と呼ばれるファージ、或
いはサルモネラ菌に感染するSP6ファージ由来あるいはK
lebsiella pneumoniaeに感染するK11ファージ由来の、
対応するプロモーター配列に関して、極めて特異性の高
いRNAポリメラーゼを用い、in vitro転写反応で、RNA断
片を合成することにより、塩基配列を決定することであ
る。
徴は、大腸菌に感染するT3やT7と呼ばれるファージ、或
いはサルモネラ菌に感染するSP6ファージ由来あるいはK
lebsiella pneumoniaeに感染するK11ファージ由来の、
対応するプロモーター配列に関して、極めて特異性の高
いRNAポリメラーゼを用い、in vitro転写反応で、RNA断
片を合成することにより、塩基配列を決定することであ
る。
【００１４】一般に、生体内において行われる一連の転
写反応では、転写終結後、新生されたRNA分子とRNAポリ
メラーゼは遊離し、遊離したRNAポリメラーゼは再び、
プロモーターを認識し、転写ステージに入っていくこと
が知られている。その中で、強い転写活性を持つT7 RNA
ポリメラーゼは、ひとつの鋳型から、最適条件下では、
数百コピーのRNA分子を転写し、RNA分子を新生する能力
を有する。このことは、T7RNAポリメラーゼも、他のRNA
ポリメラーゼと同様に転写終結機能を持つことを示す。
さらに、T7 RNAポリメラーゼを用いて、in vitroで転写
反応を行うと、使用する鋳型の構造に応じて、in vivo
の反応とは異なる転写終結現象が起こることが知られて
いる[Schenborn, E.T., et al. Nuc. Acids Res., 13(1
7):6223(1985)]。
写反応では、転写終結後、新生されたRNA分子とRNAポリ
メラーゼは遊離し、遊離したRNAポリメラーゼは再び、
プロモーターを認識し、転写ステージに入っていくこと
が知られている。その中で、強い転写活性を持つT7 RNA
ポリメラーゼは、ひとつの鋳型から、最適条件下では、
数百コピーのRNA分子を転写し、RNA分子を新生する能力
を有する。このことは、T7RNAポリメラーゼも、他のRNA
ポリメラーゼと同様に転写終結機能を持つことを示す。
さらに、T7 RNAポリメラーゼを用いて、in vitroで転写
反応を行うと、使用する鋳型の構造に応じて、in vivo
の反応とは異なる転写終結現象が起こることが知られて
いる[Schenborn, E.T., et al. Nuc. Acids Res., 13(1
7):6223(1985)]。
【００１５】まず、転写の伸長反応の様子（転写の伸長
反応複合体）を図１の模式図にもとついて説明する。RN
Aポリメラーゼのたんぱく質の構造体中に、鋳型であるD
NAの二重螺旋を取り囲む部分（DBSドメイン; Double st
rand DNA binding domain）とそれに続く鋳型DNAと合成
中のRNAのハイブリッドを認識する部分（HBSドメイン；
Hybird binding domain）、ハイブリットからRNAがはず
れたRNA鎖のみと結合する部分(RBSドメイン；RNA bindi
ng domain) があることが知られている。転写の伸長反
応複合体の形成時には、この３つの部分が転写終結を促
進する鋳型DNA中の配列に到達すると転写が終結する。
特にRBSドメインに結合する新生RNAがステムループ構造
を形成すると、その下流に存在する、HBSドメインに存
在するDNA−RNAハイブリッドに例えば、RNA鎖中にUが連
続する配列が存在すると、結果的に合成されたRNAは鋳
型から遊離する。この遊離したRNAが、必要な蛋白質を
コードするRNAになると考えられている[Jeng, S.-T., e
t al. J. Biol. Chem., 265(7):3823(1990)]。
反応複合体）を図１の模式図にもとついて説明する。RN
Aポリメラーゼのたんぱく質の構造体中に、鋳型であるD
NAの二重螺旋を取り囲む部分（DBSドメイン; Double st
rand DNA binding domain）とそれに続く鋳型DNAと合成
中のRNAのハイブリッドを認識する部分（HBSドメイン；
Hybird binding domain）、ハイブリットからRNAがはず
れたRNA鎖のみと結合する部分(RBSドメイン；RNA bindi
ng domain) があることが知られている。転写の伸長反
応複合体の形成時には、この３つの部分が転写終結を促
進する鋳型DNA中の配列に到達すると転写が終結する。
特にRBSドメインに結合する新生RNAがステムループ構造
を形成すると、その下流に存在する、HBSドメインに存
在するDNA−RNAハイブリッドに例えば、RNA鎖中にUが連
続する配列が存在すると、結果的に合成されたRNAは鋳
型から遊離する。この遊離したRNAが、必要な蛋白質を
コードするRNAになると考えられている[Jeng, S.-T., e
t al. J. Biol. Chem., 265(7):3823(1990)]。
【００１６】しかし、転写シークエンス法のように、基
質の一部に、3'−デオキシヌクレオチドのような次のヌ
クレオチドと結合する基を有さない基質を混在させる
と、3'−デオキシヌクレオチドが取り込まれた直後のヌ
クレオチドは、RNA鎖に取り込まれることがなくなり、
結果的に、強制的に転写が終結する。この場合、転写の
伸長反応は、上記のメカニズムとは異なり強制的に停止
させられるため、RNAポリメラーゼの多くは鋳型から遊
離することが出来ず、RNAポリメラーゼが鋳型中で立ち
止まった複合体を形成することが知られている[Tyagara
jan K, et al. Biochemistry. 30(45): 10920(1991)]。
しかし、転写シークエンス法では、3’-デオキシヌクレ
オチドによって転写が停止し、RNAポリメラーゼが結合
したままの複合体が形成されていても、シークエンス解
析は可能であった。これは、ゲルろ過、あるいはエタノ
ール沈殿操作による転写生成物の精製過程や、高濃度の
尿素を含む変性ゲルでの電気泳動において、ある程度の
RNAポリメラーゼはRNAから遊離し、上記複合体の形成は
転写シークエンス法に影響しないためであると考えられ
ていた[Sasaki,N., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 9
5(7),:3455(1998)]。
質の一部に、3'−デオキシヌクレオチドのような次のヌ
クレオチドと結合する基を有さない基質を混在させる
と、3'−デオキシヌクレオチドが取り込まれた直後のヌ
クレオチドは、RNA鎖に取り込まれることがなくなり、
結果的に、強制的に転写が終結する。この場合、転写の
伸長反応は、上記のメカニズムとは異なり強制的に停止
させられるため、RNAポリメラーゼの多くは鋳型から遊
離することが出来ず、RNAポリメラーゼが鋳型中で立ち
止まった複合体を形成することが知られている[Tyagara
jan K, et al. Biochemistry. 30(45): 10920(1991)]。
しかし、転写シークエンス法では、3’-デオキシヌクレ
オチドによって転写が停止し、RNAポリメラーゼが結合
したままの複合体が形成されていても、シークエンス解
析は可能であった。これは、ゲルろ過、あるいはエタノ
ール沈殿操作による転写生成物の精製過程や、高濃度の
尿素を含む変性ゲルでの電気泳動において、ある程度の
RNAポリメラーゼはRNAから遊離し、上記複合体の形成は
転写シークエンス法に影響しないためであると考えられ
ていた[Sasaki,N., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 9
5(7),:3455(1998)]。
【００１７】しかし、前述のように、転写シークエンス
法には、高感度検出を要求されるキャピラリーを用いた
シークエンス解析におけるノイズ高の問題が指摘されて
いた。このようなノイズ高の問題と上記複合体の形成に
何らかの関係があることや、上記複合体の形成が長鎖RN
Aの合成の可能性や塩基配列解析の正確性と何らかの関
係があることについては、今まで全く指摘されていなか
った。
法には、高感度検出を要求されるキャピラリーを用いた
シークエンス解析におけるノイズ高の問題が指摘されて
いた。このようなノイズ高の問題と上記複合体の形成に
何らかの関係があることや、上記複合体の形成が長鎖RN
Aの合成の可能性や塩基配列解析の正確性と何らかの関
係があることについては、今まで全く指摘されていなか
った。
【００１８】それに対して本発明者は、野性型T7 RNAポ
リメラーゼにおいて観察される転写終結異常が、ある種
の変異を有するT7 RNAポリメラーゼにおいて観察されな
いという報告をヒントとして、上記ノイズ高の問題が解
決できないかと考え、種々検討した結果、本発明に至っ
た。より具体的には、本発明者は、例えば、変異型T7RN
AポリメラーゼF644Yに、更にアミノ酸のLys-172及びArg
-173のような欠失を付加しして得られた変異型T7 RNAポ
リメラーゼF644Y/DEL172-173が、転写シーケンス法にお
いて、S/N比を改善する効果が高いこと、さらにこのア
ミノ酸のLys-172及びArg-173を欠失した変異体が、3'−
デオキシヌクレオチド或いはその誘導体の取り込みをさ
らに促進することも発見し、より正確な塩基配列解析が
可能であることを確認し、本発明を完成させた。
リメラーゼにおいて観察される転写終結異常が、ある種
の変異を有するT7 RNAポリメラーゼにおいて観察されな
いという報告をヒントとして、上記ノイズ高の問題が解
決できないかと考え、種々検討した結果、本発明に至っ
た。より具体的には、本発明者は、例えば、変異型T7RN
AポリメラーゼF644Yに、更にアミノ酸のLys-172及びArg
-173のような欠失を付加しして得られた変異型T7 RNAポ
リメラーゼF644Y/DEL172-173が、転写シーケンス法にお
いて、S/N比を改善する効果が高いこと、さらにこのア
ミノ酸のLys-172及びArg-173を欠失した変異体が、3'−
デオキシヌクレオチド或いはその誘導体の取り込みをさ
らに促進することも発見し、より正確な塩基配列解析が
可能であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１９】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、RNAポ
リメラーゼ、このRNAポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポリメラーゼの基質
を用いて核酸転写反応物を得る工程、得られた核酸転写
反応物を分離する工程、及び得られた分離分画から核酸
の配列を読み取る工程を含むDNAの塩基配列決定方法で
あって、前記RNAポリメラーゼの基質には、3'―デオキ
シヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオチ
ドが含まれ、かつ前記RNAポリメラーゼが、野生型RNAポ
リメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ
少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリ
メラーゼであり、前記アミノ酸の置換及び欠失は、変異
型RNAポリメラーゼが対応する野性型RNAポリメラーゼと
比較して、3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'
−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増
加するように行われることを特徴とする方法に関する。
リメラーゼ、このRNAポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポリメラーゼの基質
を用いて核酸転写反応物を得る工程、得られた核酸転写
反応物を分離する工程、及び得られた分離分画から核酸
の配列を読み取る工程を含むDNAの塩基配列決定方法で
あって、前記RNAポリメラーゼの基質には、3'―デオキ
シヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオチ
ドが含まれ、かつ前記RNAポリメラーゼが、野生型RNAポ
リメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ
少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリ
メラーゼであり、前記アミノ酸の置換及び欠失は、変異
型RNAポリメラーゼが対応する野性型RNAポリメラーゼと
比較して、3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'
−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増
加するように行われることを特徴とする方法に関する。
【００２０】さらに本発明は、RNAポリメラーゼ、このR
NAポリメラーゼのためのプロモーター配列を有する鋳型
DNA及び前記RNAポリメラーゼの基質を用いて核酸転写反
応物を得る工程、得られた核酸転写反応物を分離する工
程、及び得られた分離分画から核酸の配列を読み取る工
程を含むDNAの塩基配列決定方法であって、前記RNAポリ
メラーゼの基質には、3'−デオキシヌクレオチドまたは
蛍光標識3'−デオキシヌクレオチドが含まれ、かつ前記
RNAポリメラーゼが、野生型RNAポリメラーゼの少なくと
も１つのアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼ
であり、前記アミノ酸の欠失は、変異型RNAポリメラー
ゼが対応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'−
デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌク
レオチドを基質として取り込む能力が増加するように行
われることを特徴とする方法に関する。
NAポリメラーゼのためのプロモーター配列を有する鋳型
DNA及び前記RNAポリメラーゼの基質を用いて核酸転写反
応物を得る工程、得られた核酸転写反応物を分離する工
程、及び得られた分離分画から核酸の配列を読み取る工
程を含むDNAの塩基配列決定方法であって、前記RNAポリ
メラーゼの基質には、3'−デオキシヌクレオチドまたは
蛍光標識3'−デオキシヌクレオチドが含まれ、かつ前記
RNAポリメラーゼが、野生型RNAポリメラーゼの少なくと
も１つのアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼ
であり、前記アミノ酸の欠失は、変異型RNAポリメラー
ゼが対応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'−
デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌク
レオチドを基質として取り込む能力が増加するように行
われることを特徴とする方法に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明のDNAの塩基配列決定方法
は、（１）RNAポリメラーゼ、このRNAポリメラーゼのた
めのプロモーター配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポリ
メラーゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程、
（２）得られた核酸転写反応物を分離する工程、及び
（３）得られた分離分画から核酸の配列を読み取る工程
を含む。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列
を含むＤＮＡ断片を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを
用いて核酸転写生成物を酵素的に合成する方法、核酸転
写生成物の分離方法、さらには分離された分画から核酸
の配列を読み取る方法は、原理的には何れも公知の方法
である。従って、これらの点に関して、基本的には、い
ずれの公知の方法及び条件、装置等も適宜利用すること
ができる。
は、（１）RNAポリメラーゼ、このRNAポリメラーゼのた
めのプロモーター配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポリ
メラーゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程、
（２）得られた核酸転写反応物を分離する工程、及び
（３）得られた分離分画から核酸の配列を読み取る工程
を含む。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列
を含むＤＮＡ断片を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを
用いて核酸転写生成物を酵素的に合成する方法、核酸転
写生成物の分離方法、さらには分離された分画から核酸
の配列を読み取る方法は、原理的には何れも公知の方法
である。従って、これらの点に関して、基本的には、い
ずれの公知の方法及び条件、装置等も適宜利用すること
ができる。
【００２２】(1)核酸転写反応物を得る工程
鋳型となるＤＮＡ断片には、ＲＮＡポリメラーゼのため
のプロモーター配列を含むこと以外、特に制限はない。
例えば、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、ポリメ
ラーゼ連鎖反応により増幅したＤＮＡ生成物であること
ができる。さらに、増幅したＤＮＡ生成物から、ポリメ
ラーゼ連鎖反応に用いたプライマー及び/又は2'デオキ
シリボヌクレオシド5'トリフォスフェート及び/又はそ
の誘導体を除去することなしに、本発明の方法における
核酸転写生成反応を行うことができる。上記ＤＮＡ増幅
のためのポリメラーゼ連鎖反応は、ＰＣＲ法として広く
用いられている方法をそのまま用いることができる。ま
た、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、プロモータ
ー配列と増幅対象のＤＮＡ断片とをライゲーションした
後、適当な宿主を用いてクローニングされたＤＮＡ断片
であることもできる。即ち、本発明において、増幅の対
象であるＤＮＡ配列、プライマー、増幅のための条件等
には特に制限はない。
のプロモーター配列を含むこと以外、特に制限はない。
例えば、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、ポリメ
ラーゼ連鎖反応により増幅したＤＮＡ生成物であること
ができる。さらに、増幅したＤＮＡ生成物から、ポリメ
ラーゼ連鎖反応に用いたプライマー及び/又は2'デオキ
シリボヌクレオシド5'トリフォスフェート及び/又はそ
の誘導体を除去することなしに、本発明の方法における
核酸転写生成反応を行うことができる。上記ＤＮＡ増幅
のためのポリメラーゼ連鎖反応は、ＰＣＲ法として広く
用いられている方法をそのまま用いることができる。ま
た、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、プロモータ
ー配列と増幅対象のＤＮＡ断片とをライゲーションした
後、適当な宿主を用いてクローニングされたＤＮＡ断片
であることもできる。即ち、本発明において、増幅の対
象であるＤＮＡ配列、プライマー、増幅のための条件等
には特に制限はない。
【００２３】例えば、プロモーター配列を含むＤＮＡ断
片の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の反応系とし
て、１０〜５０ｎｇのゲノミックＤＮＡ又は１ｐｇのク
ローンされたＤＮＡ、１０μＭの各プライマー、２００
μＭの各２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォス
フェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）
を含む２０μｌ容量中でＤＮＡポリメラーゼとして、例
えばＴａｑポリメラーゼ等を用いて行うことができる。
片の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の反応系とし
て、１０〜５０ｎｇのゲノミックＤＮＡ又は１ｐｇのク
ローンされたＤＮＡ、１０μＭの各プライマー、２００
μＭの各２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォス
フェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）
を含む２０μｌ容量中でＤＮＡポリメラーゼとして、例
えばＴａｑポリメラーゼ等を用いて行うことができる。
【００２４】但し、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプラ
イマーのいずれか一方又は増幅された挿入(insert)ＤＮ
Ａが、後述するＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を含む必要がある。ダイレクト転写シーケンス法
では、ＰＣＲ法において、２種類のプライマーのいずれ
か一方にファージプロモーター配列を持っているプライ
マーを用いるか、又は増幅された挿入ＤＮＡ内にファー
ジプロモーター配列を持たせることで、得られるＰＣＲ
生成物はそのプロモーターにより働くＲＮＡポリメラー
ゼを用いるin vitro転写に付すことができる。
イマーのいずれか一方又は増幅された挿入(insert)ＤＮ
Ａが、後述するＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を含む必要がある。ダイレクト転写シーケンス法
では、ＰＣＲ法において、２種類のプライマーのいずれ
か一方にファージプロモーター配列を持っているプライ
マーを用いるか、又は増幅された挿入ＤＮＡ内にファー
ジプロモーター配列を持たせることで、得られるＰＣＲ
生成物はそのプロモーターにより働くＲＮＡポリメラー
ゼを用いるin vitro転写に付すことができる。
【００２５】ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター
配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼの種類に応じて適宜
選択することができる。但し、2つのファージ由来のプ
ロモーター、例えば、T7及びT3ファージがそれぞれ特異
的に認識する2つのプロモーターを鋳型の各鎖に導入す
ることで、転写シークエンス反応時にいずれかのＲＮＡ
ポリメラーゼを選択するだけで、このターゲットDNAの
両末端の配列データを解析することが可能である。
配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼの種類に応じて適宜
選択することができる。但し、2つのファージ由来のプ
ロモーター、例えば、T7及びT3ファージがそれぞれ特異
的に認識する2つのプロモーターを鋳型の各鎖に導入す
ることで、転写シークエンス反応時にいずれかのＲＮＡ
ポリメラーゼを選択するだけで、このターゲットDNAの
両末端の配列データを解析することが可能である。
【００２６】本発明の方法ではプロモーター配列を含む
DNA断片からＲＮＡ転写物等の核酸転写物を合成する。D
NA断片は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配
列を含むので、このプロモーター配列が変異型ＲＮＡポ
リメラーゼを起動させてＲＮＡ転写物等の核酸転写物を
合成する。
DNA断片からＲＮＡ転写物等の核酸転写物を合成する。D
NA断片は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配
列を含むので、このプロモーター配列が変異型ＲＮＡポ
リメラーゼを起動させてＲＮＡ転写物等の核酸転写物を
合成する。
【００２７】ＲＮＡ転写物等の核酸転写物の合成は、後
述する変異型RNAポリメラーゼの基質として、少なくと
も3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキ
シヌクレオチド(３’ｄＮＴＰ誘導体)が含まれる基質を
用いる。より具体的には、基質は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃ
ＴＰ及びＵＴＰ又はこれらの誘導体からなるリボヌクレ
オシド５’トリフォスフェート（ＮＴＰ）類、並びに１
種又は２種以上の３’ｄＮＴＰ誘導体を用いる。尚、
３’ｄＮＴＰ誘導体は、本明細書においては、３’ｄＡ
ＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ、３’ｄＵＴＰ及び
これらの誘導体の総称として用いる。リボヌクレオシド
５’トリフォスフェート（ＮＴＰ）類としては、その一
部がＡＴＰ等の誘導体である場合も含めて、塩基が異な
る少なくとも４種類の化合物が転写物の合成に必要であ
る。但し、同じ塩基を含む２種以上の化合物を用いるこ
とはできる。
述する変異型RNAポリメラーゼの基質として、少なくと
も3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキ
シヌクレオチド(３’ｄＮＴＰ誘導体)が含まれる基質を
用いる。より具体的には、基質は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃ
ＴＰ及びＵＴＰ又はこれらの誘導体からなるリボヌクレ
オシド５’トリフォスフェート（ＮＴＰ）類、並びに１
種又は２種以上の３’ｄＮＴＰ誘導体を用いる。尚、
３’ｄＮＴＰ誘導体は、本明細書においては、３’ｄＡ
ＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ、３’ｄＵＴＰ及び
これらの誘導体の総称として用いる。リボヌクレオシド
５’トリフォスフェート（ＮＴＰ）類としては、その一
部がＡＴＰ等の誘導体である場合も含めて、塩基が異な
る少なくとも４種類の化合物が転写物の合成に必要であ
る。但し、同じ塩基を含む２種以上の化合物を用いるこ
とはできる。
【００２８】転写生成物であるＲＮＡ又は核酸の３’末
端には、３’ｄＮＴＰ誘導体が取り込まれることによ
り、３’ヒドロキシ基が欠落し、ＲＮＡ又は核酸の合成
が阻害される。その結果、３’末端が３’ｄＮＴＰ誘導
体である種々の長さのＲＮＡ又は核酸断片が得られる。
塩基の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体について、そ
れぞれ、このようなリボヌクレオシド・アナログ体を得
る。このリボヌクレオシド・アナログ体を４通り用意す
ることで、ＲＮＡ又は核酸配列の決定に用いることがで
きる〔Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemist
ry Vol. 24, 5716-5723 〕。
端には、３’ｄＮＴＰ誘導体が取り込まれることによ
り、３’ヒドロキシ基が欠落し、ＲＮＡ又は核酸の合成
が阻害される。その結果、３’末端が３’ｄＮＴＰ誘導
体である種々の長さのＲＮＡ又は核酸断片が得られる。
塩基の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体について、そ
れぞれ、このようなリボヌクレオシド・アナログ体を得
る。このリボヌクレオシド・アナログ体を４通り用意す
ることで、ＲＮＡ又は核酸配列の決定に用いることがで
きる〔Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemist
ry Vol. 24, 5716-5723 〕。
【００２９】尚、３’ｄＮＴＰ誘導体は、１つの核酸転
写反応に１種類又は２種以上を用いることができる。１
種のみの３’ｄＮＴＰ誘導体を用いて１つの核酸転写反
応を行う場合、核酸転写反応を４回行うことで、３’末
端の３’ｄＮＴＰ誘導体の塩基の異なる４通りの転写生
成物を得る。１回の核酸転写反応で、３’末端の３’ｄ
ＮＴＰ誘導体は同一で、分子量の異なる種々のＲＮＡ又
は核酸断片の混合物である転写生成物が得られる。得ら
れた４通りの転写生成物について、独立に、後述する分
離及び配列の読み取りに供することができる。また、４
通りの転写生成物の２種以上を混合し、この混合物を分
離及び配列の読み取りに供することもできる。
写反応に１種類又は２種以上を用いることができる。１
種のみの３’ｄＮＴＰ誘導体を用いて１つの核酸転写反
応を行う場合、核酸転写反応を４回行うことで、３’末
端の３’ｄＮＴＰ誘導体の塩基の異なる４通りの転写生
成物を得る。１回の核酸転写反応で、３’末端の３’ｄ
ＮＴＰ誘導体は同一で、分子量の異なる種々のＲＮＡ又
は核酸断片の混合物である転写生成物が得られる。得ら
れた４通りの転写生成物について、独立に、後述する分
離及び配列の読み取りに供することができる。また、４
通りの転写生成物の２種以上を混合し、この混合物を分
離及び配列の読み取りに供することもできる。
【００３０】１回の核酸転写反応に２種以上の３’ｄＮ
ＴＰ誘導体を同時に用いると、１つの反応生成物中に、
３’末端の３’ｄＮＴＰ誘導体の塩基の異なる２通り以
上の転写生成物が含まれることになる。これを後述する
分離及び配列の読み取りに供することができる。核酸転
写反応に２種以上の３’ｄＮＴＰ誘導体を同時に用いる
と、核酸転写反応操作の回数を減らすことができるので
好ましい。
ＴＰ誘導体を同時に用いると、１つの反応生成物中に、
３’末端の３’ｄＮＴＰ誘導体の塩基の異なる２通り以
上の転写生成物が含まれることになる。これを後述する
分離及び配列の読み取りに供することができる。核酸転
写反応に２種以上の３’ｄＮＴＰ誘導体を同時に用いる
と、核酸転写反応操作の回数を減らすことができるので
好ましい。
【００３１】本発明では、特に、ＲＮＡ等の核酸転写
が、塩基の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体によりタ
ーミネートされ、これを分離して、４種類の塩基の配列
を一度に（同時に）読み取ることが好ましい。
が、塩基の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体によりタ
ーミネートされ、これを分離して、４種類の塩基の配列
を一度に（同時に）読み取ることが好ましい。
【００３２】(2)核酸転写反応物を分離する工程
本発明の方法では、ＲＮＡ又は核酸転写生成物を分離す
る。この分離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる
複数の生成物分子を、分子量に応じて分離することがで
きる方法で適宜行うことができる。このような分離方法
としては、例えば電気泳動法を挙げることができる。そ
の他にＨＰＬＣ等も用いることができる。
る。この分離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる
複数の生成物分子を、分子量に応じて分離することがで
きる方法で適宜行うことができる。このような分離方法
としては、例えば電気泳動法を挙げることができる。そ
の他にＨＰＬＣ等も用いることができる。
【００３３】電気泳動法の条件等には特に制限はなく、
常法により行うことができる。転写生成物を電気泳動法
に付することにより得られるバンド（ＲＮＡ又は核酸ラ
ダー）からＲＮＡ又は核酸の配列を読み取ることができ
る。
常法により行うことができる。転写生成物を電気泳動法
に付することにより得られるバンド（ＲＮＡ又は核酸ラ
ダー）からＲＮＡ又は核酸の配列を読み取ることができ
る。
【００３４】(3)核酸の配列を読み取る工程
ＲＮＡ又は核酸ラダーの読み取りは、３’ｄＮＴＰ誘導
体を標識することにより行うことができる。また、ＲＮ
Ａ又は核酸ラダーの読み取りは、リボヌクレオシド５’
トリフォスフェート（ＮＴＰ）類を標識することにより
行うこともできる。標識としては、例えば、放射性若し
くは安定同位元素又は蛍光標識等を挙げることができ
る。
体を標識することにより行うことができる。また、ＲＮ
Ａ又は核酸ラダーの読み取りは、リボヌクレオシド５’
トリフォスフェート（ＮＴＰ）類を標識することにより
行うこともできる。標識としては、例えば、放射性若し
くは安定同位元素又は蛍光標識等を挙げることができ
る。
【００３５】具体的には、例えば、標識された３’ｄＮ
ＴＰ誘導体、より具体的には、標識された３’ｄＡＴ
Ｐ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ及び３’ｄＵＴＰを用
い、転写生成物を電気泳動に付して得られるバンドの放
射性若しくは安定同位元素又は蛍光を検出することで、
転写生成物の配列を読み取ることができる。このように
３’ｄＮＴＰ誘導体を標識することで、いずれのバンド
間の放射性強度又は蛍光強度にばらつきがなく、測定が
容易になる。さらに放射性若しくは安定同位元素又は蛍
光を発生するラダーの検出は、例えば、ＤＮＡシーケン
シンクに用いている装置を適宜用いて行うことができ
る。
ＴＰ誘導体、より具体的には、標識された３’ｄＡＴ
Ｐ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ及び３’ｄＵＴＰを用
い、転写生成物を電気泳動に付して得られるバンドの放
射性若しくは安定同位元素又は蛍光を検出することで、
転写生成物の配列を読み取ることができる。このように
３’ｄＮＴＰ誘導体を標識することで、いずれのバンド
間の放射性強度又は蛍光強度にばらつきがなく、測定が
容易になる。さらに放射性若しくは安定同位元素又は蛍
光を発生するラダーの検出は、例えば、ＤＮＡシーケン
シンクに用いている装置を適宜用いて行うことができ
る。
【００３６】放射性若しくは安定同位元素又は蛍光標識
されたＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰを用い、電気
泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位
元素又は蛍光を検出することでも転写生成物の配列を読
み取ることができる。
されたＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰを用い、電気
泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位
元素又は蛍光を検出することでも転写生成物の配列を読
み取ることができる。
【００３７】さらに、異なる蛍光で標識された３’ｄＡ
ＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ及び３’ｄＵＴＰを
用い、末端が３’ｄＡＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴ
Ｐ又は３’ｄＵＴＰであり、異なる標識がなされた種々
の転写生成物断片の混合物を電気泳動に付して得られる
バンドの４種類の蛍光を検出することでＲＮＡ又は核酸
の配列を読み取ることもできる。
ＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴＰ及び３’ｄＵＴＰを
用い、末端が３’ｄＡＴＰ、３’ｄＧＴＰ、３’ｄＣＴ
Ｐ又は３’ｄＵＴＰであり、異なる標識がなされた種々
の転写生成物断片の混合物を電気泳動に付して得られる
バンドの４種類の蛍光を検出することでＲＮＡ又は核酸
の配列を読み取ることもできる。
【００３８】この方法では、４種類の３’ｄＮＴＰをそ
れぞれ異なる蛍光で標識する。このようにすることで、
３’末端の異なる４種類の転写生成物の混合物を電気泳
動に付することで、３’末端の４種類の異なる３’ｄＮ
ＴＰに応じた蛍光を発するバンドが得られ、この蛍光の
違いを識別しながら、１度に４種類のＲＮＡ又は核酸の
配列を読み取ることができる。蛍光標識した３’ｄＮＴ
Ｐとしては、例えば、特開平１１−８０１８９号公報及
びＷＯ９９／０２５４４に記載された3'デオキシリボヌ
クレオチド誘導体を用いることが好ましい。
れぞれ異なる蛍光で標識する。このようにすることで、
３’末端の異なる４種類の転写生成物の混合物を電気泳
動に付することで、３’末端の４種類の異なる３’ｄＮ
ＴＰに応じた蛍光を発するバンドが得られ、この蛍光の
違いを識別しながら、１度に４種類のＲＮＡ又は核酸の
配列を読み取ることができる。蛍光標識した３’ｄＮＴ
Ｐとしては、例えば、特開平１１−８０１８９号公報及
びＷＯ９９／０２５４４に記載された3'デオキシリボヌ
クレオチド誘導体を用いることが好ましい。
【００３９】[変異型RNAポリメラーゼ]本発明のDNAの塩
基配列決定方法は、RNAポリメラーゼとして、(1)野生型
RNAポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換
し、かつ少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型
RNAポリメラーゼであり、前記アミノ酸の置換及び欠失
は、変異型RNAポリメラーゼが対応する野性型RNAポリメ
ラーゼと比較して、3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍
光標識3'−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む
能力が増加するように行われた変異型RNAポリメラー
ゼ、または(2)野生型RNAポリメラーゼの少なくとも１つ
のアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼであ
り、前記アミノ酸の欠失は、変異型RNAポリメラーゼが
対応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'―デオ
キシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオ
チドを基質として取り込む能力が増加するように行われ
た変異型RNAポリメラーゼを用いることを特徴とする。
基配列決定方法は、RNAポリメラーゼとして、(1)野生型
RNAポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換
し、かつ少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型
RNAポリメラーゼであり、前記アミノ酸の置換及び欠失
は、変異型RNAポリメラーゼが対応する野性型RNAポリメ
ラーゼと比較して、3'―デオキシヌクレオチドまたは蛍
光標識3'−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む
能力が増加するように行われた変異型RNAポリメラー
ゼ、または(2)野生型RNAポリメラーゼの少なくとも１つ
のアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼであ
り、前記アミノ酸の欠失は、変異型RNAポリメラーゼが
対応する野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'―デオ
キシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオ
チドを基質として取り込む能力が増加するように行われ
た変異型RNAポリメラーゼを用いることを特徴とする。
【００４０】変異型RNAポリメラーゼの基礎となる野生
型RNAポリメラーゼは、例えば、T7ファージ、T3ファー
ジ、SP6ファージまたはK11ファージに由来するRNAポリ
メラーゼであることができる。
型RNAポリメラーゼは、例えば、T7ファージ、T3ファー
ジ、SP6ファージまたはK11ファージに由来するRNAポリ
メラーゼであることができる。
【００４１】特開平１１−７５８６７号公報（特許第３
１７２７１０号）には、対応する野性型ＲＮＡポリメラ
ーゼの能力と比較して、3'dNTP誘導体を取り込む能力を
増加させるように、野性型ＲＮＡポリメラーゼの少なく
とも１つのアミノ酸が置換された変異型ＲＮＡポリメラ
ーゼが記載されている。
１７２７１０号）には、対応する野性型ＲＮＡポリメラ
ーゼの能力と比較して、3'dNTP誘導体を取り込む能力を
増加させるように、野性型ＲＮＡポリメラーゼの少なく
とも１つのアミノ酸が置換された変異型ＲＮＡポリメラ
ーゼが記載されている。
【００４２】上記公報に記載された変異型ＲＮＡポリメ
ラーゼは、具体的には、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、
ＳＰ６ファージ、またはＫ１１ファージに由来し、Ｔ７
ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの場合、アミノ酸残
基644または667に対応するアミノ酸残基のチロシンへの
置換、Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの場合、
アミノ酸残基645または668に対応するアミノ酸残基のチ
ロシンへの置換、ＳＰ６ファージの場合、アミノ酸残基
670に対応するアミノ酸残基のチロシンへの置換、Ｋ１
１ファージの場合、アミノ酸残基690に対応するアミノ
酸残基のチロシンへの置換をするものである。
ラーゼは、具体的には、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、
ＳＰ６ファージ、またはＫ１１ファージに由来し、Ｔ７
ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの場合、アミノ酸残
基644または667に対応するアミノ酸残基のチロシンへの
置換、Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの場合、
アミノ酸残基645または668に対応するアミノ酸残基のチ
ロシンへの置換、ＳＰ６ファージの場合、アミノ酸残基
670に対応するアミノ酸残基のチロシンへの置換、Ｋ１
１ファージの場合、アミノ酸残基690に対応するアミノ
酸残基のチロシンへの置換をするものである。
【００４３】それに対して、本発明で使用する変異型Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、上記置換に加えて、アミノ酸の欠
失をも有するＲＮＡポリメラーゼであり、上記置換のみ
を有する変異型ＲＮＡポリメラーゼに比べて、3'dNTP誘
導体を取り込む能力がさらに向上したものである。
ＮＡポリメラーゼは、上記置換に加えて、アミノ酸の欠
失をも有するＲＮＡポリメラーゼであり、上記置換のみ
を有する変異型ＲＮＡポリメラーゼに比べて、3'dNTP誘
導体を取り込む能力がさらに向上したものである。
【００４４】本発明の方法で用いる変異型RNAポリメラ
ーゼが有するアミノ酸の欠失は、RNAポリメラーゼタン
パク質に対する大腸菌のプロテアーゼの作用する領域中
に存在する塩基性アミノ酸を含む領域について行われる
ことが好ましい。ここで、「大腸菌のプロテアーゼの作
用する領域」とは、T7RNAポリメラーゼタンパク質を20K
daと80KDaの2つのペプチドに切断するプロテアーゼが認
識するLys-172、またはLys-179の後(これは大腸菌の種
類によりTyr-178の後で切断されることもある)であり、
また同様のT7RNAポリメラーゼタンパク質の分解が起こ
る、トリプシンプロテアーゼ(トリプシンはペプチドの
中央部分にある塩基性アミノ酸に親和性を有し、LysやA
rgのC末端のペプチド結合を選択的に切断するエンドペ
プチダーゼである)の場合は、Lys-173とLys-180の後で
ある。[Daniel K. Muller, et al. Biochemistry, 27:
5763-5771(1988)]
ーゼが有するアミノ酸の欠失は、RNAポリメラーゼタン
パク質に対する大腸菌のプロテアーゼの作用する領域中
に存在する塩基性アミノ酸を含む領域について行われる
ことが好ましい。ここで、「大腸菌のプロテアーゼの作
用する領域」とは、T7RNAポリメラーゼタンパク質を20K
daと80KDaの2つのペプチドに切断するプロテアーゼが認
識するLys-172、またはLys-179の後(これは大腸菌の種
類によりTyr-178の後で切断されることもある)であり、
また同様のT7RNAポリメラーゼタンパク質の分解が起こ
る、トリプシンプロテアーゼ(トリプシンはペプチドの
中央部分にある塩基性アミノ酸に親和性を有し、LysやA
rgのC末端のペプチド結合を選択的に切断するエンドペ
プチダーゼである)の場合は、Lys-173とLys-180の後で
ある。[Daniel K. Muller, et al. Biochemistry, 27:
5763-5771(1988)]
【００４５】本発明におけるRNAポリメラーゼのアミノ
酸欠失領域は、T7RNAポリメラーゼにおいては、Lys-172
及びArg-173(Ikeda, et al. J.Biol.Chem.,262:3190(19
87))並びにTyr-178、Lys-179及びLys-180[Grodberg,J.,
et al.J.Bacteriol., 170:1245(1988)]のいずれかの塩
基性アミノ酸を含む領域であることができる。同様にT3
ファージ由来のRNAポリメラーゼの場合、RNAポリメラー
ゼのアミノ酸欠失領域は、アミノ酸残基173、174、17
9、180及び181のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域
であることができる。また、K11ファージの場合は、19
2、193、198、199及び200のいずれかの塩基性アミノ酸
を含む領域であることができる。SP6ファージ由来のRNA
ポリメラーゼの場合は、アミノ酸残基136、137、140、1
41、142及び143のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域
であることができる。
酸欠失領域は、T7RNAポリメラーゼにおいては、Lys-172
及びArg-173(Ikeda, et al. J.Biol.Chem.,262:3190(19
87))並びにTyr-178、Lys-179及びLys-180[Grodberg,J.,
et al.J.Bacteriol., 170:1245(1988)]のいずれかの塩
基性アミノ酸を含む領域であることができる。同様にT3
ファージ由来のRNAポリメラーゼの場合、RNAポリメラー
ゼのアミノ酸欠失領域は、アミノ酸残基173、174、17
9、180及び181のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域
であることができる。また、K11ファージの場合は、19
2、193、198、199及び200のいずれかの塩基性アミノ酸
を含む領域であることができる。SP6ファージ由来のRNA
ポリメラーゼの場合は、アミノ酸残基136、137、140、1
41、142及び143のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域
であることができる。
【００４６】さらに、欠失したアミノ酸の数、特に、塩
基性アミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数
は、上記アミノ酸残基を含む連続したまたは断続的な１
〜１０のアミノ酸配列であることができる。この連続し
たまたは断続的なアミノ酸配列のアミノ酸数は１〜７で
あること、１〜５であることもできる。また、塩基性ア
ミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数は、
１、２または３であることもできる。
基性アミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数
は、上記アミノ酸残基を含む連続したまたは断続的な１
〜１０のアミノ酸配列であることができる。この連続し
たまたは断続的なアミノ酸配列のアミノ酸数は１〜７で
あること、１〜５であることもできる。また、塩基性ア
ミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数は、
１、２または３であることもできる。
【００４７】ところで、T7RNAポリメラーゼのアミノ酸
残基170-190付近で分解して生成した20kDaと80kDaの二
つのペプチドの断片であるnicked RNAポリメラーゼが知
られている[Macdonald,L.E., et al. J.Mol.Biol., 23
2:1030-1047(1993)]。また、Lyakhovらは、Lys-172とAr
g-173の２つのアミノ酸残基を欠失させたDel172-173と
いう欠失変異型T7 RNAポリメラーゼは、先のnicked T7
RNAポリメラーゼと同様、PTHシグナルと呼ばれる転写終
結シグナルで停止しないこと、及び、T7 RNAポリメラー
ゼ Del172-173が、野生型RNAポリメラーゼが見られる異
常な転写物の合成を抑えること、さらにプロテアーゼ感
受性を示すT7RNAポリメラーゼのLys-172付近のアミノ酸
配列は、他の類似ポリメラーゼであるT3、K11、SP6、に
おいても、相同な配列であることを報告した[Lyakhov,
D.L., et al. Mol Biol. 25(5):679-687(1992)]。
残基170-190付近で分解して生成した20kDaと80kDaの二
つのペプチドの断片であるnicked RNAポリメラーゼが知
られている[Macdonald,L.E., et al. J.Mol.Biol., 23
2:1030-1047(1993)]。また、Lyakhovらは、Lys-172とAr
g-173の２つのアミノ酸残基を欠失させたDel172-173と
いう欠失変異型T7 RNAポリメラーゼは、先のnicked T7
RNAポリメラーゼと同様、PTHシグナルと呼ばれる転写終
結シグナルで停止しないこと、及び、T7 RNAポリメラー
ゼ Del172-173が、野生型RNAポリメラーゼが見られる異
常な転写物の合成を抑えること、さらにプロテアーゼ感
受性を示すT7RNAポリメラーゼのLys-172付近のアミノ酸
配列は、他の類似ポリメラーゼであるT3、K11、SP6、に
おいても、相同な配列であることを報告した[Lyakhov,
D.L., et al. Mol Biol. 25(5):679-687(1992)]。
【００４８】T7 RNAポリメラーゼ Del172-173には上記
性質があることは知られていたが、これを転写シーケン
ス法に利用すること、及びそれにより得られる効果は知
られていなかった。Lyakhovらの報告には、T7 RNAポリ
メラーゼ Del172-173が異常な転写物を生成しないこと
から、RNAプローブの作成に適しているとの記載がある
のみである。
性質があることは知られていたが、これを転写シーケン
ス法に利用すること、及びそれにより得られる効果は知
られていなかった。Lyakhovらの報告には、T7 RNAポリ
メラーゼ Del172-173が異常な転写物を生成しないこと
から、RNAプローブの作成に適しているとの記載がある
のみである。
【００４９】本発明者は、上記T7 RNAポリメラーゼ Del
172-173も、対応する野性型RNAポリメラーゼと比較し
て、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオ
キシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増加する
変異型RNAポリメラーゼであることを見いだした。さら
に、上記T7RNAポリメラーゼのアミノ酸172のリジン及び
173のアルギニンが欠失した変異型RNAポリメラーゼのみ
ならず、178のリジン及び179のリジンが欠失した変異型
RNAポリメラーゼも、対応する野性型RNAポリメラーゼと
比較して、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'
−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増
加する変異型RNAポリメラーゼであることを見いだし
た。
172-173も、対応する野性型RNAポリメラーゼと比較し
て、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオ
キシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増加する
変異型RNAポリメラーゼであることを見いだした。さら
に、上記T7RNAポリメラーゼのアミノ酸172のリジン及び
173のアルギニンが欠失した変異型RNAポリメラーゼのみ
ならず、178のリジン及び179のリジンが欠失した変異型
RNAポリメラーゼも、対応する野性型RNAポリメラーゼと
比較して、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'
−デオキシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増
加する変異型RNAポリメラーゼであることを見いだし
た。
【００５０】即ち、この態様のRNAポリメラーゼのアミ
ノ酸欠失領域は、T7RNAポリメラーゼにおいては、Lys-1
72及びArg-173(Ikeda, et al. J.Biol.Chem.,262:3190
(1987))並びにLys-179及びLys-180[Grodberg,J., et a
l.J.Bacteriol., 170:1245(1988)]のいずれかの塩基性
アミノ酸を含む領域であることができる。同様にT3ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼの場合、RNAポリメラーゼの
アミノ酸欠失領域は、アミノ酸残基173、174、180及び1
81のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域であることが
できる。また、K11ファージの場合は、192、193、199及
び200のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域であるこ
とができる。SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼの場合
は、アミノ酸残基136、137及び143のいずれかの塩基性
アミノ酸を含む領域であることができる。
ノ酸欠失領域は、T7RNAポリメラーゼにおいては、Lys-1
72及びArg-173(Ikeda, et al. J.Biol.Chem.,262:3190
(1987))並びにLys-179及びLys-180[Grodberg,J., et a
l.J.Bacteriol., 170:1245(1988)]のいずれかの塩基性
アミノ酸を含む領域であることができる。同様にT3ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼの場合、RNAポリメラーゼの
アミノ酸欠失領域は、アミノ酸残基173、174、180及び1
81のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域であることが
できる。また、K11ファージの場合は、192、193、199及
び200のいずれかの塩基性アミノ酸を含む領域であるこ
とができる。SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼの場合
は、アミノ酸残基136、137及び143のいずれかの塩基性
アミノ酸を含む領域であることができる。
【００５１】さらに、欠失したアミノ酸の数、特に、塩
基性アミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数
は、上記アミノ酸残基を含む連続したまたは断続的な１
〜１０のアミノ酸配列であることができる。この連続し
たまたは断続的なアミノ酸配列のアミノ酸数は１〜７で
あること、１〜５であることもできる。また、塩基性ア
ミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数は、
１、２または３であることもできる。
基性アミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数
は、上記アミノ酸残基を含む連続したまたは断続的な１
〜１０のアミノ酸配列であることができる。この連続し
たまたは断続的なアミノ酸配列のアミノ酸数は１〜７で
あること、１〜５であることもできる。また、塩基性ア
ミノ酸を含む領域において欠失したアミノ酸の数は、
１、２または３であることもできる。
【００５２】前記変異型RNAポリメラーゼは、例えば、T
7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４
４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニ
ルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１
７２のリジン及び１７３のアルギニンの一方または両方
が欠失したRNAポリメラーゼであることができる。さら
に、前記変異型RNAポリメラーゼは、T7ファージ由来のR
NAポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または
６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシ
ンに置換され、かつアミノ酸残基１７８から１８０の3
つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリ
メラーゼであることもできる。加えて、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６
７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１７２のリジンと１７３のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８か
ら１８０の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４
４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニ
ルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１
７２のリジン及び１７３のアルギニンの一方または両方
が欠失したRNAポリメラーゼであることができる。さら
に、前記変異型RNAポリメラーゼは、T7ファージ由来のR
NAポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または
６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシ
ンに置換され、かつアミノ酸残基１７８から１８０の3
つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリ
メラーゼであることもできる。加えて、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６
７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１７２のリジンと１７３のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８か
ら１８０の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
【００５３】T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７に
おけるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型
RNAポリメラーゼは、特開平11-75867号公報（特許第３
１７２７１０号）に記載されている。上記本発明で使用
する変異型RNAポリメラーゼは、上記のフェニルアラニ
ンがチロシンに置換された変異型RNAポリメラーゼにさ
らに、所定の欠失を導入したものである。
ノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７に
おけるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型
RNAポリメラーゼは、特開平11-75867号公報（特許第３
１７２７１０号）に記載されている。上記本発明で使用
する変異型RNAポリメラーゼは、上記のフェニルアラニ
ンがチロシンに置換された変異型RNAポリメラーゼにさ
らに、所定の欠失を導入したものである。
【００５４】前記変異型RNAポリメラーゼは、例えば、T
3ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４
５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニ
ルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１
７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が
欠失したRNAポリメラーゼであることができる。さら
に、前記変異型RNAポリメラーゼは、T３ファージ由来の
RNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、また
は６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロ
シンに置換され、かつアミノ酸残基１７９から１８１の
3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリ
メラーゼであることもできる。加えて、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、T３ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６
８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９か
ら１８１の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
3ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４
５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニ
ルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１
７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が
欠失したRNAポリメラーゼであることができる。さら
に、前記変異型RNAポリメラーゼは、T３ファージ由来の
RNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、また
は６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロ
シンに置換され、かつアミノ酸残基１７９から１８１の
3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリ
メラーゼであることもできる。加えて、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、T３ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６
８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９か
ら１８１の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
【００５５】T3ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８に
おけるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型
RNAポリメラーゼは、特開平11-75867号公報（特許第３
１７２７１０号）に記載されている。上記本発明で使用
する変異型RNAポリメラーゼは、上記のフェニルアラニ
ンがチロシンに置換された変異型RNAポリメラーゼにさ
らに、所定の欠失を導入したものである。
ノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８に
おけるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型
RNAポリメラーゼは、特開平11-75867号公報（特許第３
１７２７１０号）に記載されている。上記本発明で使用
する変異型RNAポリメラーゼは、上記のフェニルアラニ
ンがチロシンに置換された変異型RNAポリメラーゼにさ
らに、所定の欠失を導入したものである。
【００５６】前記変異型RNAポリメラーゼが、例えば、K
11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの
一方または両方が欠失したRNAポリメラーゼであること
ができる。
11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの
一方または両方が欠失したRNAポリメラーゼであること
ができる。
【００５７】K11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに
置換された変異型RNAポリメラーゼは、特開平11-75867
号公報（特許第３１７２７１０号）に記載されている。
上記本発明で使用する変異型RNAポリメラーゼは、上記
のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型RNA
ポリメラーゼにさらに、所定の欠失を導入したものであ
る。
ノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに
置換された変異型RNAポリメラーゼは、特開平11-75867
号公報（特許第３１７２７１０号）に記載されている。
上記本発明で使用する変異型RNAポリメラーゼは、上記
のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型RNA
ポリメラーゼにさらに、所定の欠失を導入したものであ
る。
【００５８】また、前記変異型RNAポリメラーゼは、K11
ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９０
におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ
アミノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸残基の
少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼであること
もできる。さらには、前記変異型RNAポリメラーゼは、K
11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８か
ら２００の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９０
におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ
アミノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸残基の
少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼであること
もできる。さらには、前記変異型RNAポリメラーゼは、K
11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの
一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８か
ら２００の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼであることもできる。
【００５９】前記変異型RNAポリメラーゼは、例えば、S
P6ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの
一方または両方が欠失したRNAポリメラーゼであること
もできる。
P6ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７
０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、か
つアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの
一方または両方が欠失したRNAポリメラーゼであること
もできる。
【００６０】SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに
置換された変異型RNAポリメラーゼは、特開平11-75867
号公報（特許第３１７２７１０号）に記載されている。
上記本発明で使用する変異型RNAポリメラーゼは、上記
のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型RNA
ポリメラーゼにさらに、所定の欠失を導入したものであ
る。
ノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに
置換された変異型RNAポリメラーゼは、特開平11-75867
号公報（特許第３１７２７１０号）に記載されている。
上記本発明で使用する変異型RNAポリメラーゼは、上記
のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異型RNA
ポリメラーゼにさらに、所定の欠失を導入したものであ
る。
【００６１】また、前記変異型RNAポリメラーゼは、SP6
ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７０
におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ
アミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の
少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。さらには、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシ
ンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３
７のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミ
ノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少な
くとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNAポリメラー
ゼであることもできる。
ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７０
におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ
アミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の
少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。さらには、前記変異型RNA
ポリメラーゼは、SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼの
アミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシ
ンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３
７のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミ
ノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少な
くとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNAポリメラー
ゼであることもできる。
【００６２】前記変異型RNAポリメラーゼは、T7ファー
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７２のリジ
ン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失した
RNAポリメラーゼ、及び、T7ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１７８から１８０の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１７２のリジンと１７３のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７２のリジ
ン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失した
RNAポリメラーゼ、及び、T7ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１７８から１８０の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１７２のリジンと１７３のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
【００６３】前記変異型RNAポリメラーゼは、T3ファー
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７３のリジ
ンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、T３ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１７９から１８１の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、T３ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７３のリジ
ンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、T３ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１７９から１８１の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、T３ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
【００６４】前記変異型RNAポリメラーゼは、K11ファー
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１９２のリジ
ンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、K11ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、K11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２００の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１９２のリジ
ンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、K11ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ、及
び、K11ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基
１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方
が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２００の3つ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメ
ラーゼであることもできる。
【００６５】前記変異型RNAポリメラーゼは、SP6ファー
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１３６のリジ
ンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、SP6ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸
残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNA
ポリメラーゼ、及び、SP6ファージ由来のRNAポリメラー
ゼのアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニン
の一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０
から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩
基性アミノ酸が欠失したRNAポリメラーゼであることも
できる。
ジ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１３６のリジ
ンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失したRN
Aポリメラーゼ、及び、SP6ファージ由来のRNAポリメラ
ーゼのアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸
残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNA
ポリメラーゼ、及び、SP6ファージ由来のRNAポリメラー
ゼのアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニン
の一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０
から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩
基性アミノ酸が欠失したRNAポリメラーゼであることも
できる。
【００６６】本発明で使用する前記変異型RNAポリメラ
ーゼは、前記置換及び欠失以外のアミノ酸の置換、挿入
または欠失をさらに有することもできる。この場合、こ
のようなアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本発明の
変異型ＲＮＡポリメラーゼの特性を維持する範囲で、行
われたものであることが適当である。
ーゼは、前記置換及び欠失以外のアミノ酸の置換、挿入
または欠失をさらに有することもできる。この場合、こ
のようなアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本発明の
変異型ＲＮＡポリメラーゼの特性を維持する範囲で、行
われたものであることが適当である。
【００６７】本発明の方法で使用する置換及び欠失を有
する変異型RNAポリメラーゼは、転写シークエンス法に
これまで使用してきた、例えば、T7 RNAポリメラーゼF6
44Yを高発現するプラスミドpT7RF644Yをベースにして、
部位特異的変異導入法を用いて、例えば、アミノ酸172
番目及び173番目が欠失したDEL172-173を作製し、T7RNA
ポリメラーゼF644Y/DEL172-173を発現するベクターを構
築することができる。
する変異型RNAポリメラーゼは、転写シークエンス法に
これまで使用してきた、例えば、T7 RNAポリメラーゼF6
44Yを高発現するプラスミドpT7RF644Yをベースにして、
部位特異的変異導入法を用いて、例えば、アミノ酸172
番目及び173番目が欠失したDEL172-173を作製し、T7RNA
ポリメラーゼF644Y/DEL172-173を発現するベクターを構
築することができる。
【００６８】本発明の方法で使用する欠失を有する変異
型RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼを高
発現するプラスミドpT7Rをベースにして、部位特異的変
異導入法を用いて、例えば、アミノ酸172番目及び173番
目が欠失したDEL172-173を作製し、T7 RNAポリメラーゼ
DEL172-173を発現するベクターを構築することができ
る。
型RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼを高
発現するプラスミドpT7Rをベースにして、部位特異的変
異導入法を用いて、例えば、アミノ酸172番目及び173番
目が欠失したDEL172-173を作製し、T7 RNAポリメラーゼ
DEL172-173を発現するベクターを構築することができ
る。
【００６９】以下にまず、野生型T7 RNAポリメラーゼΔ
１（＝DEL172-173）及び野生型T7 RNAポリメラーゼΔ２
（＝DEL172-173+DEL178-180）を例に、変異型RNAポリメ
ラーゼの調製法について説明する。アミノ酸172番目と1
73番目をコードする6塩基を含まないPCRプライマーを設
計し、プラスミドpT7Rを鋳型としてPCRを行い一周さ
せ、合成されたPCR産物をセルフライゲーションさせ、
環状とし、大腸菌JM109株に導入し、抗生物質アンピシ
リン耐性株として形質転換する。この形質転換体から、
プラスミドを抽出し、これを鋳型として、アミノ酸172
番目と173番目のアミノ酸をコードする6塩基が欠失した
クローンを得る。また、このスクリーニング中にこの部
位特異的変異導入操作中に新たにアミノ酸172番目と173
番目のアミノ酸をコードする6塩基の欠失だけでなく、
アミノ酸178-180が欠失したクローンも得られる。前者
をT7 RNAポリメラーゼΔ１、後者をT7 RNAポリメラーゼ
Δ２とし、おのおのを生産する発現プラスミドpT7RΔ1
とpT7RΔ2を構築する。そして、このプラスミドをおの
おの大腸菌BL２１株に導入し、IPTGを培養液に添加する
ことによって、trcプロモーターを稼動させ、大腸菌内
に変異ポリメラーゼを蓄積し、特許第3172710号に記載
の方法で野生型T7 RNAポリメラーゼΔ１及び野生型T7 R
NAポリメラーゼΔ２蛋白質を精製する。
１（＝DEL172-173）及び野生型T7 RNAポリメラーゼΔ２
（＝DEL172-173+DEL178-180）を例に、変異型RNAポリメ
ラーゼの調製法について説明する。アミノ酸172番目と1
73番目をコードする6塩基を含まないPCRプライマーを設
計し、プラスミドpT7Rを鋳型としてPCRを行い一周さ
せ、合成されたPCR産物をセルフライゲーションさせ、
環状とし、大腸菌JM109株に導入し、抗生物質アンピシ
リン耐性株として形質転換する。この形質転換体から、
プラスミドを抽出し、これを鋳型として、アミノ酸172
番目と173番目のアミノ酸をコードする6塩基が欠失した
クローンを得る。また、このスクリーニング中にこの部
位特異的変異導入操作中に新たにアミノ酸172番目と173
番目のアミノ酸をコードする6塩基の欠失だけでなく、
アミノ酸178-180が欠失したクローンも得られる。前者
をT7 RNAポリメラーゼΔ１、後者をT7 RNAポリメラーゼ
Δ２とし、おのおのを生産する発現プラスミドpT7RΔ1
とpT7RΔ2を構築する。そして、このプラスミドをおの
おの大腸菌BL２１株に導入し、IPTGを培養液に添加する
ことによって、trcプロモーターを稼動させ、大腸菌内
に変異ポリメラーゼを蓄積し、特許第3172710号に記載
の方法で野生型T7 RNAポリメラーゼΔ１及び野生型T7 R
NAポリメラーゼΔ２蛋白質を精製する。
【００７０】また、T3 RNAポリメラーゼ蛋白質の場合、
この蛋白質を発現するプラスミドpT3Rを鋳型として、先
のT7RNAポリメラーゼの172番目と173番目のアミノ酸に
相当する173番目と174番目のアミノ酸を欠失したpT3RΔ
１及びT7RNAポリメラーゼΔ２に相当する、すなわち、1
73-174番目のアミノ酸と179-181番目のアミノ酸の欠失
したpT3RΔ２を構築する。このプラスミドは、先のT7RN
Aポリメラーゼの酵素を精製した同様の方法で、精製す
ることが出来る。
この蛋白質を発現するプラスミドpT3Rを鋳型として、先
のT7RNAポリメラーゼの172番目と173番目のアミノ酸に
相当する173番目と174番目のアミノ酸を欠失したpT3RΔ
１及びT7RNAポリメラーゼΔ２に相当する、すなわち、1
73-174番目のアミノ酸と179-181番目のアミノ酸の欠失
したpT3RΔ２を構築する。このプラスミドは、先のT7RN
Aポリメラーゼの酵素を精製した同様の方法で、精製す
ることが出来る。
【００７１】また、野生型T7 RNAポリメラーゼΔ３（DE
L178-180）を例に、本発明の変異型RNAポリメラーゼの
調製法について説明する。アミノ酸178番目、179番目及
び180番目をコードする9塩基を含まないPCRプライマー
を設計し、プラスミドpT7Rを鋳型としてPCRを行い一周
させ、合成されたPCR産物をセルフライゲーションさ
せ、環状とし、大腸菌JM109株に導入し、抗生物質アン
ピシリン耐性株として形質転換する。この形質転換体か
ら、プラスミドを抽出し、これを鋳型として、アミノ酸
178番目〜180番目のアミノ酸をコードする9塩基が欠失
したクローンを得る。このクローンをT7 RNAポリメラー
ゼΔ３として、このクローンを生産する発現プラスミド
pT7RΔ3を構築する。そして、このプラスミドを大腸菌B
L２１株に導入し、IPTGを培養液に添加することによっ
て、trcプロモーターを稼動させ、大腸菌内に変異ポリ
メラーゼを蓄積し、特許第3172710号に記載の方法で野
生型T7 RNAポリメラーゼΔ３蛋白質を精製する。
L178-180）を例に、本発明の変異型RNAポリメラーゼの
調製法について説明する。アミノ酸178番目、179番目及
び180番目をコードする9塩基を含まないPCRプライマー
を設計し、プラスミドpT7Rを鋳型としてPCRを行い一周
させ、合成されたPCR産物をセルフライゲーションさ
せ、環状とし、大腸菌JM109株に導入し、抗生物質アン
ピシリン耐性株として形質転換する。この形質転換体か
ら、プラスミドを抽出し、これを鋳型として、アミノ酸
178番目〜180番目のアミノ酸をコードする9塩基が欠失
したクローンを得る。このクローンをT7 RNAポリメラー
ゼΔ３として、このクローンを生産する発現プラスミド
pT7RΔ3を構築する。そして、このプラスミドを大腸菌B
L２１株に導入し、IPTGを培養液に添加することによっ
て、trcプロモーターを稼動させ、大腸菌内に変異ポリ
メラーゼを蓄積し、特許第3172710号に記載の方法で野
生型T7 RNAポリメラーゼΔ３蛋白質を精製する。
【００７２】T3 RNAポリメラーゼ蛋白質の場合、この蛋
白質を発現するプラスミドpT3Rを鋳型として、先のT7RN
Aポリメラーゼの178番目〜180番目のアミノ酸に相当す
る179番目と181番目のアミノ酸を欠失したpT3RΔ３を構
築する。このプラスミドは、先のT7RNAポリメラーゼの
酵素を精製した同様の方法で、精製することが出来る。
白質を発現するプラスミドpT3Rを鋳型として、先のT7RN
Aポリメラーゼの178番目〜180番目のアミノ酸に相当す
る179番目と181番目のアミノ酸を欠失したpT3RΔ３を構
築する。このプラスミドは、先のT7RNAポリメラーゼの
酵素を精製した同様の方法で、精製することが出来る。
【００７３】また、SP6RNAポリメラーゼ及びK11RNAポリ
メラーゼについても同様の操作により変異型RNAポリメ
ラーゼを得ることができる。
メラーゼについても同様の操作により変異型RNAポリメ
ラーゼを得ることができる。
【００７４】T7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ１とT3 RNAポ
リメラーゼF645Y/Δ１を発現するプラスミドは、プラス
ミドDNAの形で、pT7 RF644Y /Δ１はFERM BP-7619とし
て、pT3 RF645YΔ１はFERM BP-7620として、独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨
城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託済みであ
る。
リメラーゼF645Y/Δ１を発現するプラスミドは、プラス
ミドDNAの形で、pT7 RF644Y /Δ１はFERM BP-7619とし
て、pT3 RF645YΔ１はFERM BP-7620として、独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨
城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託済みであ
る。
【００７５】以上のように作製された変異型T7 RNAポリ
メラーゼの内、T7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ１及びT7 R
NAポリメラーゼF644Y/Δ２の酵素的な性質について以下
に説明する。先ず、Izawaらによって、変異型T7RNAポリ
メラーゼF644Yは、これに対応する野生型に較べて約５
倍、3'−デオキシヌクレオチドの取り込み能力が増大す
ることが報告されている[Izawa,M., et al. J.Biol.Che
m., 273(23):14242(1998)]。そこで、T7RNAポリメラー
ゼの野生型、F644Y及びF644Y/Δ１の3'-dATPの取り込み
能力を比較し、結果を以下の表1に示す。実験の詳細は
実施例に示す。
メラーゼの内、T7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ１及びT7 R
NAポリメラーゼF644Y/Δ２の酵素的な性質について以下
に説明する。先ず、Izawaらによって、変異型T7RNAポリ
メラーゼF644Yは、これに対応する野生型に較べて約５
倍、3'−デオキシヌクレオチドの取り込み能力が増大す
ることが報告されている[Izawa,M., et al. J.Biol.Che
m., 273(23):14242(1998)]。そこで、T7RNAポリメラー
ゼの野生型、F644Y及びF644Y/Δ１の3'-dATPの取り込み
能力を比較し、結果を以下の表1に示す。実験の詳細は
実施例に示す。
【００７６】
【表１】
表1に示すように、表１の実験条件では、T7RNAポリメラ
ーゼの野生型とF644Yとの間では、取り込み効率の増大
は約1.45倍であったのに対し、野生型とF644Y/Δ1との
間では、約15.5倍、取り込み効率が増大していた。この
ことは、F644Yが3'-dATPの取り込み効率を上げ、更にア
ミノ酸172-173の欠失が、3'-ATPが取り込まれ、先の複
合体を形成しないで、外れやすくなり、遊離した酵素が
次の転写反応に利用され、取り込み能力が増大した結果
ではないかと推察される。また、F644Y/Δ２もほぼ同様
の結果を示した。この結果は、上記アミノ酸の欠失は、
この3'-dATPの取り込みに関しては影響がないことも示
す。即ち、T7RNAポリメラーゼにおいて178-180の欠失が
加わっても、3'-dATPの取り込みに変化がなく、その意
味で、3'-dATPの取り込みに影響はないと考えられる。
但し、178-179のリジンがなくなると、172-173欠失と同
じようにPTHシグナルで停止しない[Grodberg,J.,et al.
J.Bacteriol., 170:1245(1988)]ことから、178-179欠
失のみでも、172-173欠失と同じような機能を持つと強
く推測される。
ーゼの野生型とF644Yとの間では、取り込み効率の増大
は約1.45倍であったのに対し、野生型とF644Y/Δ1との
間では、約15.5倍、取り込み効率が増大していた。この
ことは、F644Yが3'-dATPの取り込み効率を上げ、更にア
ミノ酸172-173の欠失が、3'-ATPが取り込まれ、先の複
合体を形成しないで、外れやすくなり、遊離した酵素が
次の転写反応に利用され、取り込み能力が増大した結果
ではないかと推察される。また、F644Y/Δ２もほぼ同様
の結果を示した。この結果は、上記アミノ酸の欠失は、
この3'-dATPの取り込みに関しては影響がないことも示
す。即ち、T7RNAポリメラーゼにおいて178-180の欠失が
加わっても、3'-dATPの取り込みに変化がなく、その意
味で、3'-dATPの取り込みに影響はないと考えられる。
但し、178-179のリジンがなくなると、172-173欠失と同
じようにPTHシグナルで停止しない[Grodberg,J.,et al.
J.Bacteriol., 170:1245(1988)]ことから、178-179欠
失のみでも、172-173欠失と同じような機能を持つと強
く推測される。
【００７７】また、T7 RNAポリメラーゼΔ１及びT7 RNA
ポリメラーゼΔ３並びにT7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ１
及びT7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ３の酵素的な性質につ
いて説明する。T7RNAポリメラーゼの野生型、F644Y、Δ
１、Δ３、F644Y/Δ１及びF644Y/Δ３の3'-dATPの取り
込み能力を比較し、結果を以下の表２に示す。実験の詳
細は実施例に示す。
ポリメラーゼΔ３並びにT7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ１
及びT7 RNAポリメラーゼF644Y/Δ３の酵素的な性質につ
いて説明する。T7RNAポリメラーゼの野生型、F644Y、Δ
１、Δ３、F644Y/Δ１及びF644Y/Δ３の3'-dATPの取り
込み能力を比較し、結果を以下の表２に示す。実験の詳
細は実施例に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】表２に示すように、表２の実験条件では、
T7RNAポリメラーゼの野生型とF644Yとの間では、取り込
み効率の増大は1.20±0.3倍であったのに対し、野生型
とΔ1及びΔ３との間では、それぞれ1.86±0.3倍及び1.
90±0.3倍取り込み効率が増大した。さらに、野生型とF
644Y/Δ１及びF644Y/Δ３との間では、2.30±0.3倍及び
2.00±0.3倍取り込み効率が増大した。このことは、ア
ミノ酸172-173の欠失並びにアミノ酸172-173及び178-18
0の欠失が、3'-ATPが取り込まれ、先の複合体を形成し
ないで、外れやすくなり、遊離した酵素が次の転写反応
に利用され、取り込み能力が増大した結果であると推察
される。さらに、これにF644Yが加わることで3'-dATPの
取り込み効率をさらに上げるものと推察される。
T7RNAポリメラーゼの野生型とF644Yとの間では、取り込
み効率の増大は1.20±0.3倍であったのに対し、野生型
とΔ1及びΔ３との間では、それぞれ1.86±0.3倍及び1.
90±0.3倍取り込み効率が増大した。さらに、野生型とF
644Y/Δ１及びF644Y/Δ３との間では、2.30±0.3倍及び
2.00±0.3倍取り込み効率が増大した。このことは、ア
ミノ酸172-173の欠失並びにアミノ酸172-173及び178-18
0の欠失が、3'-ATPが取り込まれ、先の複合体を形成し
ないで、外れやすくなり、遊離した酵素が次の転写反応
に利用され、取り込み能力が増大した結果であると推察
される。さらに、これにF644Yが加わることで3'-dATPの
取り込み効率をさらに上げるものと推察される。
【００８０】次に変異型RNAポリメラーゼを用いた転写
シークエンス法で実際にDNAの塩基配列解析の効果につ
いて説明する。この反応条件は、[Sasaki,N., et al. G
ene,222 (1):17-24 (1998)]に報告されている方法に準
じて行った。すなわち、T7RNAポリメラーゼのプロモー
ターを持つプラスミドpBluescriptIIのDNAを鋳型とし
て、in vitro転写反応を37℃で60分間保温し、反応後に
反応産物中に残存している未反応のダイ・ターミネータ
ーを除去し、ABI PRISM 377XL DNA sequencerにより解
析した。この実験の典型的な結果をゲルイメージで比較
したものを図４に示した。その結果、T7RNAポリメラー
ゼF644Yでは、その泳動像は、特異的な塩基で停止したR
NA断片の分離はしているものノイズが高く、電気泳動し
た各レーンは、連続した棒状の画像になっていることが
判る。しかし、T7RNAポリメラーゼF644Y/Δ2を用いたも
のは、転写反応物のRNAの分離像の一つ一つがはっきり
としており、ノイズが低いことがわかる。このことは、
正確なベースコールが可能であることを示し、結果とし
て、正確な塩基配列の解析を可能にすること示す。
シークエンス法で実際にDNAの塩基配列解析の効果につ
いて説明する。この反応条件は、[Sasaki,N., et al. G
ene,222 (1):17-24 (1998)]に報告されている方法に準
じて行った。すなわち、T7RNAポリメラーゼのプロモー
ターを持つプラスミドpBluescriptIIのDNAを鋳型とし
て、in vitro転写反応を37℃で60分間保温し、反応後に
反応産物中に残存している未反応のダイ・ターミネータ
ーを除去し、ABI PRISM 377XL DNA sequencerにより解
析した。この実験の典型的な結果をゲルイメージで比較
したものを図４に示した。その結果、T7RNAポリメラー
ゼF644Yでは、その泳動像は、特異的な塩基で停止したR
NA断片の分離はしているものノイズが高く、電気泳動し
た各レーンは、連続した棒状の画像になっていることが
判る。しかし、T7RNAポリメラーゼF644Y/Δ2を用いたも
のは、転写反応物のRNAの分離像の一つ一つがはっきり
としており、ノイズが低いことがわかる。このことは、
正確なベースコールが可能であることを示し、結果とし
て、正確な塩基配列の解析を可能にすること示す。
【００８１】この結果をベースコールし、塩基配列を読
み取った結果の一部を図５に提示した。T7RNAポリメラ
ーゼF644Y/Δ2は、T7RNAポリメラーゼF644Yよりもより
正確な塩基配列解析が出来ることが判る。また、F644Y/
Δ3、F644Y変異のないT7RNAポリメラーゼΔ1、Δ2及び
Δ3も同様な効果を有していた。
み取った結果の一部を図５に提示した。T7RNAポリメラ
ーゼF644Y/Δ2は、T7RNAポリメラーゼF644Yよりもより
正確な塩基配列解析が出来ることが判る。また、F644Y/
Δ3、F644Y変異のないT7RNAポリメラーゼΔ1、Δ2及び
Δ3も同様な効果を有していた。
【００８２】
【発明の効果】転写シークエンス法は、PCR鋳型を精製
も必要とせず、直接用いることが出来ることから、大量
のシークエンスを行う際に非常に効果的な塩基配列決定
法である。この塩基配列決定方法に、本発明では、T7 R
NAポリメラーゼF644Y/DEL172-173若しくはT3 RNAポリメ
ラーゼF645Y/DEL173-174、または T7 RNAポリメラーゼD
EL172-173またはT3 RNAポリメラーゼDEL173-174のよう
な変異型RNAポリメラーゼを用いることによって、反応
物のノイズの低減が可能になった。この特性は、大量の
シークエンスを行うことを目的としたキャピラリーシー
ケンサーを用いた場合、特に有用で、鋳型の調製が例え
ば、PCR産物を直接、反応液に加えることが出来るた
め、時間とコストの低減を可能とし、さらに解析された
データの精度の向上と読み取り鎖長が長くなるという利
点を付与することが可能になった。本発明によれば、塩
基配列決定を行うことを目的とした、遺伝子解析分野、
遺伝子診断分野で特に価値のある方法を提供することが
出来る。
も必要とせず、直接用いることが出来ることから、大量
のシークエンスを行う際に非常に効果的な塩基配列決定
法である。この塩基配列決定方法に、本発明では、T7 R
NAポリメラーゼF644Y/DEL172-173若しくはT3 RNAポリメ
ラーゼF645Y/DEL173-174、または T7 RNAポリメラーゼD
EL172-173またはT3 RNAポリメラーゼDEL173-174のよう
な変異型RNAポリメラーゼを用いることによって、反応
物のノイズの低減が可能になった。この特性は、大量の
シークエンスを行うことを目的としたキャピラリーシー
ケンサーを用いた場合、特に有用で、鋳型の調製が例え
ば、PCR産物を直接、反応液に加えることが出来るた
め、時間とコストの低減を可能とし、さらに解析された
データの精度の向上と読み取り鎖長が長くなるという利
点を付与することが可能になった。本発明によれば、塩
基配列決定を行うことを目的とした、遺伝子解析分野、
遺伝子診断分野で特に価値のある方法を提供することが
出来る。
【００８３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 [実施例１]Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙ及びＴ３ＲＮＡポリ
メラーゼＦ６４５Ｙ酵素へのアミノ酸欠失の導入とこれ
らの変異型RNAポリメラーゼの精製 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙのアミノ酸番号１７
２及び１７３を欠失した変異型酵素を発現するプラスミ
ドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙを産生するプ
ラスミドpT7RF644Y（特開平11-75867、生命研国際寄託
番号FERM-BP-5998）を用いて、PCRをベースとした部位
特異的な変異導入操作を行い、作製した。また、Ｔ３Ｒ
ＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙのアミノ酸番号１７３及び
１７４を欠失した変異型酵素を発現するプラスミドは、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙを産生するプラスミ
ドpT3RF645Yを用いて、PCRをベースとした部位特異的な
変異導入操作を行い、作製した。
明する。 [実施例１]Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙ及びＴ３ＲＮＡポリ
メラーゼＦ６４５Ｙ酵素へのアミノ酸欠失の導入とこれ
らの変異型RNAポリメラーゼの精製 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙのアミノ酸番号１７
２及び１７３を欠失した変異型酵素を発現するプラスミ
ドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙを産生するプ
ラスミドpT7RF644Y（特開平11-75867、生命研国際寄託
番号FERM-BP-5998）を用いて、PCRをベースとした部位
特異的な変異導入操作を行い、作製した。また、Ｔ３Ｒ
ＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙのアミノ酸番号１７３及び
１７４を欠失した変異型酵素を発現するプラスミドは、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙを産生するプラスミ
ドpT3RF645Yを用いて、PCRをベースとした部位特異的な
変異導入操作を行い、作製した。
【００８４】尚、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙは
以下のように作製した。大腸菌を宿主とするT3ファージ
を、大腸菌C600に感染させ、その溶菌液からT3ファージ
を常法に従って調製し、最後に除蛋白処理を行ない、T3
ファージ由来のゲノムDNAを得た。T3RNAポリメラーゼ遺
伝子は、このゲノムDNA中に含まれるので、[McGraw,N.
J., et al. Nucleic Acids Res. 13 (18):6753(1985)]
に記載のデータを参考にしてT3RNAポリメラーゼ遺伝子
を増幅するためのプライマーを作成し、PCR法により増
幅した。このDNAフラグメントを制限酵素NcoIで消化
し、1%アガロース電気泳動を行ない、目的DNAフラグメ
ントをアガロースから切り出し、Gene Pure Kit（ニッ
ポンジーン）を用いて精製した。これをNcoIで消化し脱
リン酸化した発現ベクターpTrc99A（ファルマシア・バ
イオテク）と連結することでT3RNAポリメラーゼを高発
現するT3RNAP/pTrc99Aを構築した。本プラスミドは、常
法に従って、IPTGを培養液中に添加することにより、大
量のT3RNAポリメラーゼを発現することが確認された。
以下のように作製した。大腸菌を宿主とするT3ファージ
を、大腸菌C600に感染させ、その溶菌液からT3ファージ
を常法に従って調製し、最後に除蛋白処理を行ない、T3
ファージ由来のゲノムDNAを得た。T3RNAポリメラーゼ遺
伝子は、このゲノムDNA中に含まれるので、[McGraw,N.
J., et al. Nucleic Acids Res. 13 (18):6753(1985)]
に記載のデータを参考にしてT3RNAポリメラーゼ遺伝子
を増幅するためのプライマーを作成し、PCR法により増
幅した。このDNAフラグメントを制限酵素NcoIで消化
し、1%アガロース電気泳動を行ない、目的DNAフラグメ
ントをアガロースから切り出し、Gene Pure Kit（ニッ
ポンジーン）を用いて精製した。これをNcoIで消化し脱
リン酸化した発現ベクターpTrc99A（ファルマシア・バ
イオテク）と連結することでT3RNAポリメラーゼを高発
現するT3RNAP/pTrc99Aを構築した。本プラスミドは、常
法に従って、IPTGを培養液中に添加することにより、大
量のT3RNAポリメラーゼを発現することが確認された。
【００８５】次に、プラスミドT3RNAP/pTrc99Aを用い
て、変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを生産する発現プラ
スミドを以下のように構築した。T3RNAP/pTrc99Aを鋳型
として用い、変異導入用のPCR用プライマーを用い、Pfu
DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いてPCRを
行なった。このPCRフラグメントは、1%アガロース電気
泳動を行ない精製した後、T4DNAリガーゼを用いて16
℃、16時間保温し、ライゲーション反応を行った。この
反応物は、大腸菌JM109に形質転換した後、変異が導入
されたクローンをスクリーニングし、塩基配列を決定す
ることで変異導入が行なわれているかどうか確認した。
そして、変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを生産するプラ
スミドT3RNAP(F645Y)/pTrc99Aを構築した。プラスミドT
3RNAP/pTrc99Aを用いて、特開平11-075867号公報に記載
の方法で変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを精製した。
て、変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを生産する発現プラ
スミドを以下のように構築した。T3RNAP/pTrc99Aを鋳型
として用い、変異導入用のPCR用プライマーを用い、Pfu
DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いてPCRを
行なった。このPCRフラグメントは、1%アガロース電気
泳動を行ない精製した後、T4DNAリガーゼを用いて16
℃、16時間保温し、ライゲーション反応を行った。この
反応物は、大腸菌JM109に形質転換した後、変異が導入
されたクローンをスクリーニングし、塩基配列を決定す
ることで変異導入が行なわれているかどうか確認した。
そして、変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを生産するプラ
スミドT3RNAP(F645Y)/pTrc99Aを構築した。プラスミドT
3RNAP/pTrc99Aを用いて、特開平11-075867号公報に記載
の方法で変異型T3RNAポリメラーゼF645Yを精製した。
【００８６】アミノ酸を欠失した変異型酵素の作製方法
の詳細は以下の通りである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ
６４４Ｙを発現するプラスミドpT7RF644Y DNAを鋳型と
して、プライマーT7RNAP-ΔN（5'-TACAAGAAAGCATTTATGC
AAGTTGTCGAGG-3'）(配列番号1)とプライマーT7RNAP-ΔC
（5'-GACGTGCCCTACGTTGAGTTGTTCCTCAAC-3'）(配列番号
2)でＰＣＲを行った。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの場合
は、pT3RF645Y DNAを鋳型として、プライマーT3RNAP-Δ
N（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAGGTGGTCGAGG-3'）(配列番
号3)とプライマーT3RNAP-ΔC（5'-GACTTGCCCGTGGTTAAGC
TGTTCCTCAAC-3'）(配列番号4)を用いた。いずれの場合
も、Ｔ７の場合は、プライマーT7RNAP-ΔC、Ｔ３の場合
は、プライマーT3RNAP-ΔCにそれぞれ、アミノ酸１７２
−１７３、１７３−１７４のアミノ酸を欠失させるため
に設計したプライマーである（図３）。以上の組み合わ
せで、ＰＣＲを行うと、鋳型ＤＮＡが何れも環状のプラ
スミドを用いるため、結果として得られたＰＣＲプロダ
クトは、ほぼ使用した鋳型プラスミドＤＮＡの長さに等
しいＰＣＲ産物として得られた。このＰＣＲ断片は、１
％アガロース電気泳動を行い、断片を精製し、T4 DNA
ライゲースを用いて再び環状化（セルフライゲーショ
ン）し、大腸菌JM109に形質転換し、抗生物質アンピシ
リンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得
た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミド
DNAの抽出を行い、変異が正確に導入されているかどう
か、また、この変異導入において、少なくともRNAポリ
メラーゼをコードする領域に変化がないかどうかを、複
数のプラスミドDNAのRNAポリメラーゼをコートする領域
の塩基配列の決定を行い確認した。この操作により、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙにおいては、予定通り
アミノ酸１７２−１７３が欠失したプラスミドとこの１
７２−１７３の欠失に加えてアミノ酸１７８−１８０が
欠失したプラスミドが複数得られた。ここで、前者をpT
7RF644Y/Δ1、後者をpT7RF644Y/Δ2とした。
の詳細は以下の通りである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＦ
６４４Ｙを発現するプラスミドpT7RF644Y DNAを鋳型と
して、プライマーT7RNAP-ΔN（5'-TACAAGAAAGCATTTATGC
AAGTTGTCGAGG-3'）(配列番号1)とプライマーT7RNAP-ΔC
（5'-GACGTGCCCTACGTTGAGTTGTTCCTCAAC-3'）(配列番号
2)でＰＣＲを行った。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの場合
は、pT3RF645Y DNAを鋳型として、プライマーT3RNAP-Δ
N（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAGGTGGTCGAGG-3'）(配列番
号3)とプライマーT3RNAP-ΔC（5'-GACTTGCCCGTGGTTAAGC
TGTTCCTCAAC-3'）(配列番号4)を用いた。いずれの場合
も、Ｔ７の場合は、プライマーT7RNAP-ΔC、Ｔ３の場合
は、プライマーT3RNAP-ΔCにそれぞれ、アミノ酸１７２
−１７３、１７３−１７４のアミノ酸を欠失させるため
に設計したプライマーである（図３）。以上の組み合わ
せで、ＰＣＲを行うと、鋳型ＤＮＡが何れも環状のプラ
スミドを用いるため、結果として得られたＰＣＲプロダ
クトは、ほぼ使用した鋳型プラスミドＤＮＡの長さに等
しいＰＣＲ産物として得られた。このＰＣＲ断片は、１
％アガロース電気泳動を行い、断片を精製し、T4 DNA
ライゲースを用いて再び環状化（セルフライゲーショ
ン）し、大腸菌JM109に形質転換し、抗生物質アンピシ
リンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得
た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミド
DNAの抽出を行い、変異が正確に導入されているかどう
か、また、この変異導入において、少なくともRNAポリ
メラーゼをコードする領域に変化がないかどうかを、複
数のプラスミドDNAのRNAポリメラーゼをコートする領域
の塩基配列の決定を行い確認した。この操作により、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼＦ６４４Ｙにおいては、予定通り
アミノ酸１７２−１７３が欠失したプラスミドとこの１
７２−１７３の欠失に加えてアミノ酸１７８−１８０が
欠失したプラスミドが複数得られた。ここで、前者をpT
7RF644Y/Δ1、後者をpT7RF644Y/Δ2とした。
【００８７】また、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼＦ６４５Ｙ
からも先のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの欠失導入した結果
と同じく、予定したアミノ酸１７３−１７４が欠失した
変異プラスミドだけでなく、この変異にアミノ酸１７９
−１８１が欠失した変異プラスミドが得られ、前者をpT
3RF645Y/Δ1（図３）、後者をpT3RF645Y/Δ2とした。こ
こで作製された4つのプラスミドは、何れもおのおのの
プラスミドを含む大腸菌BL21を培養し、イソプロピル-
β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することに
より、発現誘導可能であった。
からも先のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの欠失導入した結果
と同じく、予定したアミノ酸１７３−１７４が欠失した
変異プラスミドだけでなく、この変異にアミノ酸１７９
−１８１が欠失した変異プラスミドが得られ、前者をpT
3RF645Y/Δ1（図３）、後者をpT3RF645Y/Δ2とした。こ
こで作製された4つのプラスミドは、何れもおのおのの
プラスミドを含む大腸菌BL21を培養し、イソプロピル-
β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することに
より、発現誘導可能であった。
【００８８】これらのプラスミドを含む大腸菌BL21か
ら、何れの酵素も基本的にはすべて同じ方法で精製し
た。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマ
トグラフィーの挙動が若干異なることもあるが、特開平
11-75867に記載の方法で精製し、純度、活性検査を行っ
た。これらの方法で、得られたそれぞれのRNAポリメラ
ーゼは、欠失変異を導入していない元のプラスミドに較
べて、その発現量は約３分の１の低下が認められたが、
転写シークエンス法に充分耐えられる品質の酵素の精製
が可能であった。
ら、何れの酵素も基本的にはすべて同じ方法で精製し
た。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマ
トグラフィーの挙動が若干異なることもあるが、特開平
11-75867に記載の方法で精製し、純度、活性検査を行っ
た。これらの方法で、得られたそれぞれのRNAポリメラ
ーゼは、欠失変異を導入していない元のプラスミドに較
べて、その発現量は約３分の１の低下が認められたが、
転写シークエンス法に充分耐えられる品質の酵素の精製
が可能であった。
【００８９】野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼへのアミノ酸欠失の導入とこれ
らの変異型RNAポリメラーゼの精製 アミノ酸を欠失した変異型酵素の作製方法の詳細は以下
の通りである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラ
スミドpT7R DNAを鋳型として、プライマーT7RNAP-ΔN
（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGG-3'）(配列番号
2)とプライマーT7RNAP-ΔC（5'-GACGTGCCCTACGTTGAGTTG
TTCCTCAAC-3'）(配列番号1)でＰＣＲを行った。Ｔ３Ｒ
ＮＡポリメラーゼの場合は、pT3R DNAを鋳型として、プ
ライマーT3RNAP-ΔN（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAGGTGGTC
GAGG-3'）(配列番号3)とプライマーT3RNAP-ΔC（5'-GAC
TTGCCCGTGGTTAAGCTGTTCCTCAAC-3'）(配列番号4)を用い
た。いずれの場合も、Ｔ７の場合は、プライマーT7RNAP
-ΔC、Ｔ３の場合は、プライマーT3RNAP-ΔCにそれぞ
れ、アミノ酸１７２−１７３、１７３−１７４のアミノ
酸を欠失させるために設計したプライマーである（図
３）。以上の組み合わせで、ＰＣＲを行うと、鋳型ＤＮ
Ａが何れも環状のプラスミドを用いるため、結果として
得られたＰＣＲプロダクトは、ほぼ使用した鋳型プラス
ミドＤＮＡの長さに等しいＰＣＲ産物として得られた。
このＰＣＲ断片は、１％アガロース電気泳動を行い、断
片を精製し、T4 DNA ライゲースを用いて再び環状化
（セルフライゲーション）し、大腸菌JM109に形質転換
し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育す
るコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択
し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、変異が正確に
導入されているかどうか、また、この変異導入におい
て、少なくともRNAポリメラーゼをコードする領域に変
化がないかどうかを、複数のプラスミドDNAのRNAポリメ
ラーゼをコートする領域の塩基配列の決定を行い確認し
た。この操作により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて
は、予定通りアミノ酸１７２−１７３が欠失したプラス
ミドとこの１７２−１７３の欠失に加えてアミノ酸１７
８−１８０が欠失したプラスミドが複数得られた。ここ
で、前者をpT7RΔ1、後者をpT7RΔ2とした。
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼへのアミノ酸欠失の導入とこれ
らの変異型RNAポリメラーゼの精製 アミノ酸を欠失した変異型酵素の作製方法の詳細は以下
の通りである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラ
スミドpT7R DNAを鋳型として、プライマーT7RNAP-ΔN
（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGG-3'）(配列番号
2)とプライマーT7RNAP-ΔC（5'-GACGTGCCCTACGTTGAGTTG
TTCCTCAAC-3'）(配列番号1)でＰＣＲを行った。Ｔ３Ｒ
ＮＡポリメラーゼの場合は、pT3R DNAを鋳型として、プ
ライマーT3RNAP-ΔN（5'-TACAAGAAAGCATTTATGCAGGTGGTC
GAGG-3'）(配列番号3)とプライマーT3RNAP-ΔC（5'-GAC
TTGCCCGTGGTTAAGCTGTTCCTCAAC-3'）(配列番号4)を用い
た。いずれの場合も、Ｔ７の場合は、プライマーT7RNAP
-ΔC、Ｔ３の場合は、プライマーT3RNAP-ΔCにそれぞ
れ、アミノ酸１７２−１７３、１７３−１７４のアミノ
酸を欠失させるために設計したプライマーである（図
３）。以上の組み合わせで、ＰＣＲを行うと、鋳型ＤＮ
Ａが何れも環状のプラスミドを用いるため、結果として
得られたＰＣＲプロダクトは、ほぼ使用した鋳型プラス
ミドＤＮＡの長さに等しいＰＣＲ産物として得られた。
このＰＣＲ断片は、１％アガロース電気泳動を行い、断
片を精製し、T4 DNA ライゲースを用いて再び環状化
（セルフライゲーション）し、大腸菌JM109に形質転換
し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育す
るコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択
し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、変異が正確に
導入されているかどうか、また、この変異導入におい
て、少なくともRNAポリメラーゼをコードする領域に変
化がないかどうかを、複数のプラスミドDNAのRNAポリメ
ラーゼをコートする領域の塩基配列の決定を行い確認し
た。この操作により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて
は、予定通りアミノ酸１７２−１７３が欠失したプラス
ミドとこの１７２−１７３の欠失に加えてアミノ酸１７
８−１８０が欠失したプラスミドが複数得られた。ここ
で、前者をpT7RΔ1、後者をpT7RΔ2とした。
【００９０】また、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼからも先の
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの欠失導入した結果と同じく、
予定したアミノ酸１７３−１７４が欠失した変異プラス
ミドだけでなく、この変異にアミノ酸１７９−１８１が
欠失した変異プラスミドが得られ、前者をpT3RΔ1、後
者をpT3RΔ2とした。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの欠失導入した結果と同じく、
予定したアミノ酸１７３−１７４が欠失した変異プラス
ミドだけでなく、この変異にアミノ酸１７９−１８１が
欠失した変異プラスミドが得られ、前者をpT3RΔ1、後
者をpT3RΔ2とした。
【００９１】また、Ｔ７の場合はアミノ酸１７８−１８
０を欠失させるために設計したプライマーであるプライ
マーT7RNAP-Δ3C、Ｔ３の場合は１７９−１８１のアミ
ノ酸を欠失させるために設計したプライマーであるプラ
イマーT3RNAP-Δ3Cをそれぞれ用いて上記と同様にＰＣ
Ｒを行うと、ほぼ使用した鋳型プラスミドＤＮＡの長さ
に等しいＰＣＲ産物が得られ、これらのＰＣＲ産物を精
製し、RNAポリメラーゼをコードする領域に変化がない
ことを確認した。この操作により、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼにおいては、予定通りアミノ酸１７８−１８０が欠
失したプラスミドpT7RΔ3を、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
においては、予定通りアミノ酸１７９−１８１が欠失し
たプラスミドpT3RΔ3を得た。
０を欠失させるために設計したプライマーであるプライ
マーT7RNAP-Δ3C、Ｔ３の場合は１７９−１８１のアミ
ノ酸を欠失させるために設計したプライマーであるプラ
イマーT3RNAP-Δ3Cをそれぞれ用いて上記と同様にＰＣ
Ｒを行うと、ほぼ使用した鋳型プラスミドＤＮＡの長さ
に等しいＰＣＲ産物が得られ、これらのＰＣＲ産物を精
製し、RNAポリメラーゼをコードする領域に変化がない
ことを確認した。この操作により、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼにおいては、予定通りアミノ酸１７８−１８０が欠
失したプラスミドpT7RΔ3を、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
においては、予定通りアミノ酸１７９−１８１が欠失し
たプラスミドpT3RΔ3を得た。
【００９２】ここで作製された6つのプラスミドは、何
れもおのおののプラスミドを含む大腸菌BL21を培養し、
イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添
加することにより、発現誘導可能であった。
れもおのおののプラスミドを含む大腸菌BL21を培養し、
イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添
加することにより、発現誘導可能であった。
【００９３】これらのプラスミドを含む大腸菌BL21か
ら、何れの酵素も基本的にはすべて同じ方法で精製し
た。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマ
トグラフィーの挙動が若干異なることもあるが、特開平
11-75867に記載の方法で精製し、純度、活性検査を行っ
た。これらの方法で、得られたそれぞれのRNAポリメラ
ーゼは、欠失変異を導入していない元のプラスミドに較
べて、その発現量は約３分の１の低下が認められたが、
転写シークエンス法に充分耐えられる品質の酵素の精製
が可能であった。
ら、何れの酵素も基本的にはすべて同じ方法で精製し
た。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマ
トグラフィーの挙動が若干異なることもあるが、特開平
11-75867に記載の方法で精製し、純度、活性検査を行っ
た。これらの方法で、得られたそれぞれのRNAポリメラ
ーゼは、欠失変異を導入していない元のプラスミドに較
べて、その発現量は約３分の１の低下が認められたが、
転写シークエンス法に充分耐えられる品質の酵素の精製
が可能であった。
【００９４】[実施例２]欠失変異型ＲＮＡポリメラーゼの性質
精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼのΔ型酵素の3'-dAT
Pの取り込み能力を野生型、及びF644Y変異と比較した。試験（１） 方法は、in vitro転写反応時に3'-dATPを加えてその合
成阻害から合成量をを比較することで求めた。更に詳し
く説明すると、鋳型としては、制限酵素ScaI(ニッポン
ジーン製)で予め処理したpBluescriptII（ストラタジー
ン社）を用い、反応条件としては、（40mM Tris-HCl, p
H 8.0、25mM NaCl, 8mM MgCl2, 2mM spermidine-(HC
l)3, 5mM DTT）、各ヌクレオチド濃度（ATP, CTP, GTP,
UTP）は、0.5mMとし、このうち、ATPは、0.006mM、0.0
08mM、0.012mM、0.024mMの範囲で、3'-dATP(Sigma)で置
き換えた。この溶液20μl中に、先の精製された酵素を
添加し、37℃、３０〜６０分反応した。反応終了後、5
×Gel Loading Buffer（15% Ficoll, 0.1% BPB, 0.1% X
C, 0.5% SDS, 0.1M EDTA）を4μl加えて、全量を、ホル
ムアルデヒドを含む１％変性アガロースゲルで電気泳動
を行った。泳動終了後、Syber Green II (モレキュラー
・プローブ社製)を10,000倍希釈して、製品に添付され
ているプロトコールに従い染色を２０〜４０分行なっ
た。そして、フルオロＳマルチイメージャー（バイオラ
ッド社）を用いて、紫外線を照射して、その蛍光画像を
取り込んだ。取り込んだ画像から、合成されたＲＮＡ量
を、添付の画像解析ソフトであるマルチアナリストを用
いて定量した。そして、その結果を、おのおのの値を比
較し、3'-dATPの取り込み能力が増大していれば、結果
として合成量は低くなるはずであり、コントロールと比
較して、その逆数を3'-dATPの取込みやすくなった指標
とした。その結果、3'-dATP 濃度が0.024mMのときＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの野生型を１としたときの相対的な
3'-dATPの取り込み能力は、F644Yが、1.45であり、F644
Y/Δ1が15.5であった(前述の表1)。この結果は、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼF644Y/Δ1が、転写シークエンス法に
最適な性質を持った酵素であることを示唆した。
Pの取り込み能力を野生型、及びF644Y変異と比較した。試験（１） 方法は、in vitro転写反応時に3'-dATPを加えてその合
成阻害から合成量をを比較することで求めた。更に詳し
く説明すると、鋳型としては、制限酵素ScaI(ニッポン
ジーン製)で予め処理したpBluescriptII（ストラタジー
ン社）を用い、反応条件としては、（40mM Tris-HCl, p
H 8.0、25mM NaCl, 8mM MgCl2, 2mM spermidine-(HC
l)3, 5mM DTT）、各ヌクレオチド濃度（ATP, CTP, GTP,
UTP）は、0.5mMとし、このうち、ATPは、0.006mM、0.0
08mM、0.012mM、0.024mMの範囲で、3'-dATP(Sigma)で置
き換えた。この溶液20μl中に、先の精製された酵素を
添加し、37℃、３０〜６０分反応した。反応終了後、5
×Gel Loading Buffer（15% Ficoll, 0.1% BPB, 0.1% X
C, 0.5% SDS, 0.1M EDTA）を4μl加えて、全量を、ホル
ムアルデヒドを含む１％変性アガロースゲルで電気泳動
を行った。泳動終了後、Syber Green II (モレキュラー
・プローブ社製)を10,000倍希釈して、製品に添付され
ているプロトコールに従い染色を２０〜４０分行なっ
た。そして、フルオロＳマルチイメージャー（バイオラ
ッド社）を用いて、紫外線を照射して、その蛍光画像を
取り込んだ。取り込んだ画像から、合成されたＲＮＡ量
を、添付の画像解析ソフトであるマルチアナリストを用
いて定量した。そして、その結果を、おのおのの値を比
較し、3'-dATPの取り込み能力が増大していれば、結果
として合成量は低くなるはずであり、コントロールと比
較して、その逆数を3'-dATPの取込みやすくなった指標
とした。その結果、3'-dATP 濃度が0.024mMのときＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの野生型を１としたときの相対的な
3'-dATPの取り込み能力は、F644Yが、1.45であり、F644
Y/Δ1が15.5であった(前述の表1)。この結果は、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼF644Y/Δ1が、転写シークエンス法に
最適な性質を持った酵素であることを示唆した。
【００９５】試験(2)
方法は、in vitro転写反応時に3'-dATPを加えてその合
成阻害から合成量を比較することで求めた。さらに詳し
く説明すると、鋳型としては、制限酵素 ScaI（ニッポ
ンジーン社製）で予め処理したpBluescriptII（ストラ
タジーン社製）を用い、反応条件としては（40mM Tris-
HCl, pH 8.0, 25mM NaCl, 8mM MgCl2, 2mM Spermidine-
(HCl)3, 5mMDTT）、各リボヌクレオチド濃度(rATP,rCT
P,rGTP,rUTP)を0.5mM、biotin標識されたCTPを0.1mM、さ
らに、3'-dATPを、0.00125mM, 0.0025mM, 0.005mMの範囲
で加えた。この溶液を10μl中に先の精製された酵素を2
5U添加し、37℃、60分間反応した。反応終了後、10×Gel
Loading Buffer（1mMEDTA, 1% SDS, 50% Glycerol, 0.0
5% BPB）を1μl加えて全量を1%変性ホルムアミドゲルで
電気泳動を行った。泳動終了後、ノザンハイブリダイゼ
ーションを行い、合成物をナイロンメンブレンに転写し
た後、抗SA-AP抗体（オリエンタル酵母社製、20000倍希
釈）とCDP-StarTM(ロシュ社製)により、添付されている
プロトコールに従い化学発光基質からのシグナルの検出
を行った。検出したシグナル量の定量は、フルオロSマ
ルチイメージャー(バイオラッド社)を用いて画像を取り
込み、添付の画像解析ソフトであるマルチアナリストを
用いて行った。その結果は前記表2に示したように、3'-
dATPの濃度が0.00125mMのとき、野生型の3'-dATPの取り
込み能力を１としたときの各種変異型RNAポリメラーゼ
の値はF644Yが1.20、△１が1.86、△3が1.90、F644Y/△
1が2.30、F644Y/△3が2.00であった。（3回試行した平
均値）
成阻害から合成量を比較することで求めた。さらに詳し
く説明すると、鋳型としては、制限酵素 ScaI（ニッポ
ンジーン社製）で予め処理したpBluescriptII（ストラ
タジーン社製）を用い、反応条件としては（40mM Tris-
HCl, pH 8.0, 25mM NaCl, 8mM MgCl2, 2mM Spermidine-
(HCl)3, 5mMDTT）、各リボヌクレオチド濃度(rATP,rCT
P,rGTP,rUTP)を0.5mM、biotin標識されたCTPを0.1mM、さ
らに、3'-dATPを、0.00125mM, 0.0025mM, 0.005mMの範囲
で加えた。この溶液を10μl中に先の精製された酵素を2
5U添加し、37℃、60分間反応した。反応終了後、10×Gel
Loading Buffer（1mMEDTA, 1% SDS, 50% Glycerol, 0.0
5% BPB）を1μl加えて全量を1%変性ホルムアミドゲルで
電気泳動を行った。泳動終了後、ノザンハイブリダイゼ
ーションを行い、合成物をナイロンメンブレンに転写し
た後、抗SA-AP抗体（オリエンタル酵母社製、20000倍希
釈）とCDP-StarTM(ロシュ社製)により、添付されている
プロトコールに従い化学発光基質からのシグナルの検出
を行った。検出したシグナル量の定量は、フルオロSマ
ルチイメージャー(バイオラッド社)を用いて画像を取り
込み、添付の画像解析ソフトであるマルチアナリストを
用いて行った。その結果は前記表2に示したように、3'-
dATPの濃度が0.00125mMのとき、野生型の3'-dATPの取り
込み能力を１としたときの各種変異型RNAポリメラーゼ
の値はF644Yが1.20、△１が1.86、△3が1.90、F644Y/△
1が2.30、F644Y/△3が2.00であった。（3回試行した平
均値）
【００９６】[実施例３]欠損変異型RNAポリメラーゼの蛍光標識3'-デオキシヌク
レオチドの取り込み能力の比較 精製されたT7RNAポリメラーゼのΔ型酵素の蛍光標識3'-
デオキシヌクレオチドの取り込み能力の比較を行った。
方法は、[Sasaki,N., et al. Gene, 222(1):17-24(199
8)]に準じた反応条件で行った。さらに詳しく述べる
と、鋳型としてpBluescriptII DNAを用い、Bodipy(R6G)
-3'dATP、Bodipy(FL)-3'dGTP、Bodipy(581/591)-3'dCT
P、Bodipy(564/570)-3'dUTP及びATP、GTP、CTP、UTP溶
液を一定の比率で混合したものを用い、精製されたT7RN
Aポリメラーゼのみの異なる反応を行った。この時、使
用した酵素は、T7RNAポリメラーゼ（野生型）とT7RNAポ
リメラーゼF644Yが100単位を使用し、T7RNAポリメラー
ゼF644Y/Δ1は、50単位を使用した。この反応物は、ABI
377 XL Sequencerを用いて、電気泳動した。そして、
その蛍光シグナル強度の平均値を、各ヌクレオチド毎に
比較した。その結果を表３に示した。
レオチドの取り込み能力の比較 精製されたT7RNAポリメラーゼのΔ型酵素の蛍光標識3'-
デオキシヌクレオチドの取り込み能力の比較を行った。
方法は、[Sasaki,N., et al. Gene, 222(1):17-24(199
8)]に準じた反応条件で行った。さらに詳しく述べる
と、鋳型としてpBluescriptII DNAを用い、Bodipy(R6G)
-3'dATP、Bodipy(FL)-3'dGTP、Bodipy(581/591)-3'dCT
P、Bodipy(564/570)-3'dUTP及びATP、GTP、CTP、UTP溶
液を一定の比率で混合したものを用い、精製されたT7RN
Aポリメラーゼのみの異なる反応を行った。この時、使
用した酵素は、T7RNAポリメラーゼ（野生型）とT7RNAポ
リメラーゼF644Yが100単位を使用し、T7RNAポリメラー
ゼF644Y/Δ1は、50単位を使用した。この反応物は、ABI
377 XL Sequencerを用いて、電気泳動した。そして、
その蛍光シグナル強度の平均値を、各ヌクレオチド毎に
比較した。その結果を表３に示した。
【００９７】
【表３】
【００９８】表中の（１）には、今回の実験で得られた
ABI 377 XL Sequencerが表示した蛍光シグナル強度の平
均値を示している。また、（２）は、（１）の値を酵素
単位当りに換算したものである。また、括弧内の数字
は、野生型酵素のシグナル強度を“１”としたときの、
相対値を表した。今回の結果、T7RNAポリメラーゼF644Y
/Δ1は、その蛍光強度は、野生型及びF644Yと較べると
ヌクレオチドにより差はあるが、２〜4倍ほど、効率よ
く蛍光標識3'-デオキシヌクレオチドを取り込んでいる
ことが判った。この結果は、先の蛍光標識していない、
3'-dATPの取り込み実験の結果とその傾向が一致してい
た。今回の結果では、野生型とF644Yの結果がほとんど
変わらない結果となったが、ABI 377 XL Sequencerが定
量的な数字を扱う装置ではないこと、極微量のサンプル
を扱う操作を行うため、誤差が大きいと予想されるが、
Δ1の効果は、この検出系でも充分、その効果が示され
た。
ABI 377 XL Sequencerが表示した蛍光シグナル強度の平
均値を示している。また、（２）は、（１）の値を酵素
単位当りに換算したものである。また、括弧内の数字
は、野生型酵素のシグナル強度を“１”としたときの、
相対値を表した。今回の結果、T7RNAポリメラーゼF644Y
/Δ1は、その蛍光強度は、野生型及びF644Yと較べると
ヌクレオチドにより差はあるが、２〜4倍ほど、効率よ
く蛍光標識3'-デオキシヌクレオチドを取り込んでいる
ことが判った。この結果は、先の蛍光標識していない、
3'-dATPの取り込み実験の結果とその傾向が一致してい
た。今回の結果では、野生型とF644Yの結果がほとんど
変わらない結果となったが、ABI 377 XL Sequencerが定
量的な数字を扱う装置ではないこと、極微量のサンプル
を扱う操作を行うため、誤差が大きいと予想されるが、
Δ1の効果は、この検出系でも充分、その効果が示され
た。
【００９９】[実施例４]変異酵素を用いた転写シークエンス法の例
今回作製、精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y/Δ
2とＴ７ＲＮＡポリメラーゼF644Yを用いて、転写シーク
エンス法に適応し、その結果を比較した。転写シークエ
ンス反応は、[Sasaki,N., et al. Gene,222 (1):17-24
(1998)]に準じて行った。さらに詳しく述べると、pBlue
scriptII DNAを鋳型として用い、3'-dNTPの誘導体とし
ては、Bodipy(R6G)-3'dATP, Bodipy(FL)-3'dGTP, Bodip
y(581/591)-3'dCTP, Bodipy(564/570)-3'dUTP及びATP,
GTP, CTP, UTP溶液をそれぞれを適宜希釈し、混合し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y、50単位を用いて反応
し、ABI 377 DNA XL Sequencerを用いて解析し、約500
塩基程度のベースコールが可能である至適溶液を作製し
た。このヌクレオチド至適溶液及びＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼF644Y/Δ2、50単位を用い、in vitro転写反応を37
℃で60分間保温して行った。反応後に反応産物中に残存
している未反応のダイ・ターミネーターを除去するた
め、セファデックスG-50カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク製）を用いたゲル濾過法により転写産
物を精製し、精製産物は遠心式濃縮機で蒸発乾固した。
この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマージャ
パンのABI PRISM 377XL DNA sequencerの取扱説明書Ver
1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Bluedextran loading b
uffer 6μlに溶解し、そのうちの２μlをABI PRISM 377
XL DNA sequencerにより解析した。この実験の典型的な
結果をゲルイメージで比較したものが図４に示した。そ
の結果、T7RNAポリメラーゼF644Yでは、その泳動像は、
特異的な塩基で停止したRNA断片の分離はしているもの
ノイズが高く、電気泳動した各レーンは、連続した棒状
の画像になっていることが判る。しかし、T7RNAポリメ
ラーゼF644Y/Δ2を用いたものは、転写反応物のRNAの分
離像の一つ一つがはっきりとしており、ノイズが低いこ
とがわかる。このことは、正確なベースコールが可能で
あることを示し、結果として、正確な塩基配列の解析を
可能にすることが容易に推定できる。この性質は、塩基
配列解析を行う際、ノイズが低いために、正確なベース
コールと一回の反応で、読み取ることが出来る塩基長が
長くなることを充分期待させた。
2とＴ７ＲＮＡポリメラーゼF644Yを用いて、転写シーク
エンス法に適応し、その結果を比較した。転写シークエ
ンス反応は、[Sasaki,N., et al. Gene,222 (1):17-24
(1998)]に準じて行った。さらに詳しく述べると、pBlue
scriptII DNAを鋳型として用い、3'-dNTPの誘導体とし
ては、Bodipy(R6G)-3'dATP, Bodipy(FL)-3'dGTP, Bodip
y(581/591)-3'dCTP, Bodipy(564/570)-3'dUTP及びATP,
GTP, CTP, UTP溶液をそれぞれを適宜希釈し、混合し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y、50単位を用いて反応
し、ABI 377 DNA XL Sequencerを用いて解析し、約500
塩基程度のベースコールが可能である至適溶液を作製し
た。このヌクレオチド至適溶液及びＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼF644Y/Δ2、50単位を用い、in vitro転写反応を37
℃で60分間保温して行った。反応後に反応産物中に残存
している未反応のダイ・ターミネーターを除去するた
め、セファデックスG-50カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク製）を用いたゲル濾過法により転写産
物を精製し、精製産物は遠心式濃縮機で蒸発乾固した。
この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマージャ
パンのABI PRISM 377XL DNA sequencerの取扱説明書Ver
1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Bluedextran loading b
uffer 6μlに溶解し、そのうちの２μlをABI PRISM 377
XL DNA sequencerにより解析した。この実験の典型的な
結果をゲルイメージで比較したものが図４に示した。そ
の結果、T7RNAポリメラーゼF644Yでは、その泳動像は、
特異的な塩基で停止したRNA断片の分離はしているもの
ノイズが高く、電気泳動した各レーンは、連続した棒状
の画像になっていることが判る。しかし、T7RNAポリメ
ラーゼF644Y/Δ2を用いたものは、転写反応物のRNAの分
離像の一つ一つがはっきりとしており、ノイズが低いこ
とがわかる。このことは、正確なベースコールが可能で
あることを示し、結果として、正確な塩基配列の解析を
可能にすることが容易に推定できる。この性質は、塩基
配列解析を行う際、ノイズが低いために、正確なベース
コールと一回の反応で、読み取ることが出来る塩基長が
長くなることを充分期待させた。
【０１００】図５は、先のゲルイメージの泳動像の一部
をベースコールし、比較したものである。この結果か
ら、今回作成したΔ型酵素を転写シークエンス法に使用
すると、ノイズが低く、さらに3'-dNTPの取り込みが起
こっても、効率よく転写回転するという理由から、転写
シークエンス法に最適な酵素であることが判明した。
をベースコールし、比較したものである。この結果か
ら、今回作成したΔ型酵素を転写シークエンス法に使用
すると、ノイズが低く、さらに3'-dNTPの取り込みが起
こっても、効率よく転写回転するという理由から、転写
シークエンス法に最適な酵素であることが判明した。
SEQUENCE LISTING
＜110＞ NIPPON GENE TECH
＜120＞ Method for Determining DNA Sequence
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ T7 RNA Polymerase
＜400＞ tacaagaaagcatttatgcaagttgtcgagg
＜210＞ 2
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ T7 RNA Polymerase
＜400＞ gacgtgccctacgttgagttgttcctcaac
＜210＞ 3
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ T3 RNA Polymerase
＜400＞ tacaagaaagcatttatgcaggtggtcgagg
＜210＞ 4
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ T3 RNA Polymerase
＜400＞ gacttgcccgtggttaagctgttcctcaac
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＲＮＡポリメラーゼによる転写の伸長反応の
様子（転写の伸長反応複合体）を示した模式図[ＤＢ
Ｓ、ＨＢＳ及びＲＢＳドメインについては、本文参照]
様子（転写の伸長反応複合体）を示した模式図[ＤＢ
Ｓ、ＨＢＳ及びＲＢＳドメインについては、本文参照]
【図２】 Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼの欠失型
変異酵素の欠失領域のアミノ酸配列[図中のＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼでは、１６１及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼ
では、１６２と示してある数字は、ここに示したポリメ
ラーゼのアミノ酸配列の、最初のＨ（ヒスチジン）のア
ミノ酸番号（各酵素のＮ末端から数えて）を示してい
る。また、この配列については、T7RNAポリメラーゼ及
びT3RNAポリメラーゼは、それぞれ、DDBJ Accesion No.
V01146及びX02981のデータから抽出した。]。
変異酵素の欠失領域のアミノ酸配列[図中のＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼでは、１６１及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼ
では、１６２と示してある数字は、ここに示したポリメ
ラーゼのアミノ酸配列の、最初のＨ（ヒスチジン）のア
ミノ酸番号（各酵素のＮ末端から数えて）を示してい
る。また、この配列については、T7RNAポリメラーゼ及
びT3RNAポリメラーゼは、それぞれ、DDBJ Accesion No.
V01146及びX02981のデータから抽出した。]。
【図３】 欠失変異型Ｔ７ＲＮＡおよびＴ３ＲＮＡポリ
メラーゼを生産する発現プラスミドの作製方法を示した
模式図。
メラーゼを生産する発現プラスミドの作製方法を示した
模式図。
【図４】 変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Yと欠失
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y/Δ2を用いて、転
写シークエンスを行った結果の比較[ABI 377 XL sequen
cerを用いて、泳動し、そのゲルイメージを比較したも
の。泳動先端は、下方向である。]
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y/Δ2を用いて、転
写シークエンスを行った結果の比較[ABI 377 XL sequen
cerを用いて、泳動し、そのゲルイメージを比較したも
の。泳動先端は、下方向である。]
【図５】 変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Yと欠失
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y/Δ2を用いて、転
写シークエンスを行った結果の比較[ABI 377 XL sequen
cerを用いて、泳動し、ベールコールを行い、その一部
を出力して比較した。図４の結果を使用した。]
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼF644Y/Δ2を用いて、転
写シークエンスを行った結果の比較[ABI 377 XL sequen
cerを用いて、泳動し、ベールコールを行い、その一部
を出力して比較した。図４の結果を使用した。]
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA02 DA20
EA04 GA11 HA08 HA11
4B063 QA13 QQ41 QR08 QR32 QR35
QR42 QR58 QR62 QS25 QX02
Claims (39)
- 【請求項１】RNAポリメラーゼ、このRNAポリメラーゼの
ためのプロモーター配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポ
リメラーゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程、
得られた核酸転写反応物を分離する工程、及び得られた
分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むDNAの塩
基配列決定方法であって、 前記RNAポリメラーゼの基質には、3'−デオキシヌクレ
オチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオチドが含ま
れ、かつ前記RNAポリメラーゼが、野生型RNAポリメラー
ゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ少なくと
も１つのアミノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼ
であり、前記アミノ酸の置換及び欠失は、変異型RNAポ
リメラーゼが対応する野性型RNAポリメラーゼと比較し
て、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デオ
キシヌクレオチドを基質として取り込む能力が増加する
ように行われることを特徴とする方法。 - 【請求項２】RNAポリメラーゼ、このRNAポリメラーゼの
ためのプロモーター配列を有する鋳型DNA及び前記RNAポ
リメラーゼの基質を用いて核酸転写反応物を得る工程、
得られた核酸転写反応物を分離する工程、及び得られた
分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むDNAの塩
基配列決定方法であって、前記RNAポリメラーゼの基質
には、3'−デオキシヌクレオチドまたは蛍光標識3'−デ
オキシヌクレオチドが含まれ、かつ前記RNAポリメラー
ゼが、野生型RNAポリメラーゼの少なくとも１つのアミ
ノ酸を欠失させた変異型RNAポリメラーゼであり、前記
アミノ酸の欠失は、変異型RNAポリメラーゼが対応する
野性型RNAポリメラーゼと比較して、3'−デオキシヌク
レオチドまたは蛍光標識3'−デオキシヌクレオチドを基
質として取り込む能力が増加するように行われることを
特徴とする方法。 - 【請求項３】前記アミノ酸の欠失が、プロテアーゼが作
用する領域中に存在する塩基性アミノ酸について行われ
たことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記アミノ酸の欠失が、大腸菌プロテアー
ゼが作用する領域中に存在する塩基性アミノ酸について
行われたことを特徴とする請求項１または２に記載の方
法。 - 【請求項５】塩基性アミノ酸が、リジン及び／又はアル
ギニンである請求項３または４に記載の方法。 - 【請求項６】前記野生型RNAポリメラーゼが、T7ファー
ジ、T3ファージ、SP6ファージまたはK11ファージに由来
するRNAポリメラーゼである請求項１〜５のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項７】前記野生型RNAポリメラーゼが、T7ファー
ジに由来するRNAポリメラーゼであり、かつ前記アミノ
酸の欠失が、アミノ酸172、173、178、179及び180から
成る群から選ばれる少なくとも1種のアミノ酸を含む領
域で行われたことを特徴とする請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項８】前記野生型RNAポリメラーゼが、T3ファー
ジに由来するRNAポリメラーゼであり、かつ前記アミノ
酸の欠失が、アミノ酸173、174、179、180及び181から
成る群から選ばれる少なくとも1種のアミノ酸を含む領
域で行われたことを特徴とする請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項９】前記野生型RNAポリメラーゼが、K11ファー
ジに由来するRNAポリメラーゼであり、かつ前記アミノ
酸の欠失が、アミノ酸192、193、198、199及び200から
成る群から選ばれる少なくとも1種のアミノ酸を含む領
域で行われたことを特徴とする請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項１０】前記野生型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージに由来するRNAポリメラーゼであり、かつ前記アミ
ノ酸の欠失が、アミノ酸136、137、140、141、142及び1
43から成る群から選ばれる少なくとも1種のアミノ酸を
含む領域で行われたことを特徴とする請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項１１】前記欠失したアミノ酸の数が１〜１０で
ある請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】前記欠失したアミノ酸の数が１〜７であ
る請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】前記欠失したアミノ酸の数が１〜５であ
る請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】前記欠失したアミノ酸の数が１、２また
は３である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１５】前記変異型RNAポリメラーゼが、前記以
外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有する請
求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６
６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２の
リジン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失
したRNAポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６
６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７８か
ら１８０の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６
６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２の
リジンと１７３のアルギニンの一方または両方が欠失
し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の3つのアミ
ノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】前記変異型RNAポリメラーゼが、T3ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６
６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３の
リジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失し
たRNAポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】前記変異型RNAポリメラーゼが、T３ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６
６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７９か
ら１８１の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失
したRNAポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】前記変異型RNAポリメラーゼが、T３ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６
６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラ
ニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３の
リジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失
し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の3つのアミ
ノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼ
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方ま
たは両方が欠失したRNAポリメラーゼである請求項１に
記載の方法。 - 【請求項２３】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸残基の少な
くとも１つが欠失したRNAポリメラーゼである請求項１
に記載の方法。 - 【請求項２４】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６９０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方ま
たは両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２０
０の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したRNA
ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方ま
たは両方が欠失したRNAポリメラーゼであることを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２６】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少な
くとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNAポリメラー
ゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基６７０にお
けるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミ
ノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方ま
たは両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０から１４
３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミ
ノ酸が欠失したRNAポリメラーゼであることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項２８】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７２のリ
ジン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失し
たRNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項２９】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７８から
１８０の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失し
たRNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項３０】前記変異型RNAポリメラーゼが、T7ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７２のリ
ジンと１７３のアルギニンの一方または両方が欠失し、
さらにアミノ酸残基１７８から１８０の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼであ
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項３１】前記変異型RNAポリメラーゼが、T3ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７３のリ
ジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失した
RNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項３２】前記変異型RNAポリメラーゼが、T３ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７９から
１８１の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失し
たRNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項３３】前記変異型RNAポリメラーゼが、T３ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１７３のリ
ジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失し、
さらにアミノ酸残基１７９から１８１の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼであ
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項３４】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１９２のリ
ジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失した
RNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項３５】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１９８から
２００の3つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失し
たRNAポリメラーゼである請求項２に記載の方法。 - 【請求項３６】前記変異型RNAポリメラーゼが、K11ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１９２のリ
ジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失し、
さらにアミノ酸残基１９８から２００の3つのアミノ酸
残基の少なくとも１つが欠失したRNAポリメラーゼであ
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項３７】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１３６のリ
ジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失した
RNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項２に記
載の方法。 - 【請求項３８】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１４０から
１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性
アミノ酸が欠失したRNAポリメラーゼであることを特徴
とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項３９】前記変異型RNAポリメラーゼが、SP6ファ
ージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基１３６のリ
ジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失し、
さらにアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸
残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したRNA
ポリメラーゼであることを特徴とする請求項２に記載の
方法。
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