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WO1998031709A1 - Antikörper, die an die nidogen-bindungsdomäne des laminins binden, deren herstellung und verwendung - Google Patents

Antikörper, die an die nidogen-bindungsdomäne des laminins binden, deren herstellung und verwendung Download PDF

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WO1998031709A1
WO1998031709A1 PCT/EP1997/007241 EP9707241W WO9831709A1 WO 1998031709 A1 WO1998031709 A1 WO 1998031709A1 EP 9707241 W EP9707241 W EP 9707241W WO 9831709 A1 WO9831709 A1 WO 9831709A1
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WO
WIPO (PCT)
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laminin
antibody
nidogen
antibodies
binding
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP1997/007241
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Gerl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to AU59853/98A priority Critical patent/AU5985398A/en
Priority to BR9714207-7A priority patent/BR9714207A/pt
Priority to CA002278477A priority patent/CA2278477A1/en
Priority to IL13080897A priority patent/IL130808A0/xx
Priority to JP53230298A priority patent/JP2001509020A/ja
Priority to EP97954750A priority patent/EP0954535A1/de
Priority to HU0001808A priority patent/HUP0001808A3/hu
Publication of WO1998031709A1 publication Critical patent/WO1998031709A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Antibodies that bind to the nidogen binding domain of laminin their production and use
  • the invention relates to monoclonal and polyclonal antibodies and their parts which bind specifically to the nidogen-binding domain of laminin, processes for their preparation and their use as medicaments, as diagnostic agents for the detection of laminin isoforms and as model substances for the development and evaluation of the nidogen / Substances influencing laminin interaction.
  • the antibodies according to the invention or their parts preferably bind to the ⁇ 1 IM 4 domain of the laminin, in particular to essential nidogen binding sites in the highly conserved area of loop a or loops a and c, and can inhibit the association of laminin and nidogen.
  • laminin an 800 kDa glycoprotein
  • nidogen a 160 kDa glycoprotein
  • the localization, sequence and spatial structure (X-ray structure and NMR structure) of the laminin nidogen-binding domain could be clearly identified and characterized (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885; Baumgartner , R. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 658-668; Stetefeld, J. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 644-657). It is located in a "LE module" (laminin-type epidermal growth factor-like) of the short arm of the ⁇ 1 chain of the laminin, in the domain ⁇ 1 III 4.
  • LE module laminin-type epidermal growth factor-like
  • LE modules are structural motifs from 50 - 60 amino acids which are complex , Folding pattern analogous to the "epidermal growth factor” with 4 disulfide bridges (Bairoch, A. (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310; Engel, J. (1989) FEBS Letters 251: 1 - 7).
  • Synthetic peptides that can be derived from the corresponding areas of the laminin domain ⁇ 1 III 4 are able to completely inhibit the laminin / nidogen binding in special binding assays (US Pat. No. 5,493,008).
  • synthetic peptides show an activity in inhibition assays that is about 400 or 10,000 times weaker than that of the intact laminin P1 or laminin ⁇ 1 I 3-5 (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; US 5,493,008).
  • the laminin / nidogen interaction is influenced by a strong conformational component (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885).
  • the weaker inhibitory effect of the synthetic peptides can be explained, since peptides in aqueous solution can have a myriad of different conformations and therefore only a certain percentage of the peptides can be found in the biologically active
  • Antibodies that specifically bind to the ninogen binding domain of laminin and which can competitively inhibit the association between laminin and nidogen at low concentrations are better suited as a therapeutic agent for the treatment of diseases due to their higher affinity and avidity, their high stability and their good pharmacokinetics . Furthermore, they can be used as diagnostic agents or as aids in biological and pharmacological models for the development and evaluation of substances influencing the laminin / nidogen interaction.
  • laminin is an extracellular protein that is in constant contact with the immune system both as an integrated component of basement membranes and in the form of a circulating serum component (EP 0 696 597 A2).
  • polyclonal antibodies described above that target unspecified epitopes outside the nidogen Bind laminin binding domain are only very limited or not suitable as a therapeutic, diagnostic or model substance for the development and evaluation of substances influencing the nidogen / laminin interaction: steric inhibition depends on the spatial extent of the inhibitor, so that the use of parts of these antibodies as a therapeutic agent, which is preferred for pharmacological reasons, is hardly possible. Furthermore, possible cross-reactions with undetectable analytes limit the use of these antibodies in diagnostic tests
  • the object of the present invention is to generate antibodies which bind specifically to the nidogen binding domain of the laminin, that is to say recognize the nidogen binding domain of the laminin- ⁇ 1 chain directly, and which are used as medicaments, as diagnostic agents for the detection of laminin isoforms and are suitable as a model substance for the development and evaluation of substances influencing the nidogen / laminin interaction.
  • the antibodies or parts thereof according to the invention are characterized in that they bind to the nidogen binding domain of the laminin, the laminin ⁇ 1 IM 4 domain, preferably to the highly conserved region of the loop a or the loops a and c of the laminin ⁇ 1 III 4 domain tie.
  • the antibodies according to the invention particularly preferably bind with respect to the epitope depending on the conformation (ie recognizing the nidogen binding site of the laminin in its native conformation; see Example 6) directly or overlapping to the highly conserved area of loop a or loops a and c.
  • the invention includes antibodies or parts thereof which bind to at least one peptide according to Table 1.
  • the present invention provides both polyclonal and monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the present invention are preferably chimeras, humanized, bi- or oligo-specific Antibody.
  • the laminin-nidogen binding is particularly preferably inhibited competitively or partially competitively by the antibodies according to the present invention (cf. Example 7).
  • the antibodies according to the invention can be obtained by immunizing immunocompetent vertebrates, e.g. Rabbits, mice, sheep, goats, guinea pigs, rats and chickens with laminin, laminin P1, laminin ⁇ 1 III-3-5, laminin ⁇ 1 III4 and especially with peptides, which contain essential nidogen binding sites but do not contain the complete amino acid sequence of ⁇ 1 IM 4 Domain of the laminin, very particularly preferably one or both of the peptides according to Table 1, as immunization antigen.
  • immunocompetent vertebrates e.g. Rabbits, mice, sheep, goats, guinea pigs, rats and chickens with laminin, laminin P1, laminin ⁇ 1 III-3-5, laminin ⁇ 1 III4 and especially with peptides, which contain essential nidogen binding sites but do not contain the complete amino acid sequence of ⁇ 1 IM 4 Domain of the laminin, very particularly preferably one
  • the antibody is identified using laminin ⁇ 1 III-3-5 and / or laminin ⁇ 1 IM-4 and finally checked for competitive or partially competitive inhibition of the laminin-nidogen binding.
  • the antibody is identified using laminin and / or laminin P1 and finally tested for competitive or partially competitive inhibition of the laminin-nidogen binding.
  • Laminin ⁇ 1 III-4 or one or more peptides according to Table 1 are particularly preferably used as immunization antigen.
  • the antibodies obtainable by immunization using these immunization antigens are preferably identified using laminin and / or laminin P1.
  • the identified antibodies tested for competitive or partially competitive inhibition of the laminin binding site.
  • monoclonal antibodies are also available, with the latter initially producing MAK-producing hybridoma cells.
  • the antibodies can also be obtained in purified form by making the antibodies according to the invention from antibody-containing material, such as e.g. Antiserum of the immunized animal, hybridoma cell culture supernatant, ascites or cells, for example by affinity chromatography, preferably on laminin and / or laminin P1 as an affinity matrix.
  • the antibodies according to the invention or parts thereof can inhibit the laminin / nidogen interaction and, as an umbrella term, also include the corresponding chimeras, humanized, bi- or oligospecific antibodies and antibody analogs described in more detail elsewhere.
  • the invention also includes animal, plant and prokaryotic cells and cell lines which produce the antibodies and antibody parts according to the invention, preferably the hybridon DSMACC 2327, which was released on October 27, 1997 by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ, Marscheroder Weg 1b, D -38124 Braunschweig, DE) according to the provisions of the Budapest Treaty.
  • the present invention also relates to the monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under the deposit number DSMACC 2327.
  • the invention further comprises a method for producing the antibodies described above, in which immunocompetent vertebrates, such as rabbits, mice, sheep, goats, guinea pigs, rats and chickens, with laminin, laminin P1, laminin ⁇ 1 III 3-5 and laminin ⁇ 1 III4, particularly preferred peptides which do not contain the complete amino acid sequence of the ⁇ 1 III 4 domain of the laminin, very particularly preferably one or both of the peptides according to Table 1.
  • peptides is to be understood as meaning oligopeptides, polypeptides and proteins and protein fragments.
  • the peptides used as immunization antigen are preferably coupled to carriers such as proteins, for example ovalbumin, albumin or hemocyanin, or polymers, for example polyethylene glycol, polyacrylamide or poly-d-glutamine-d-lysine.
  • carriers such as proteins, for example ovalbumin, albumin or hemocyanin, or polymers, for example polyethylene glycol, polyacrylamide or poly-d-glutamine-d-lysine.
  • the antibody is identified using laminin ⁇ 1 III-3-5 and / or laminin ⁇ 1 IM-4 and checked for competitive or partially competitive inhibition of the laminin-nidogen binding.
  • the antibody is identified by means of laminin and / or laminin P1 and checked for competitive or partially competitive inhibition of the laminin-nidogen binding.
  • Laminin ⁇ 1 MI-4 or, optionally, one or both of the peptides according to Table 1, which is preferably coupled to a carrier, is preferably used in the method according to the invention.
  • the antibody generated by immunization with laminin ⁇ 1 IM-4 or with one or both of the peptides according to Table 1 is preferably identified by means of laminin and / or laminin P1 and advantageously tested for competitive or partially competitive inhibition of the laminin-nidogen binding.
  • the method also includes the generation of MAK-producing hybridoma cells. It has proven to be advantageous to purify the antibodies according to the invention or their parts from antibody-containing material, such as, for example, antiserum from the immunized animal, hybridoma cell culture supernatant, ascites or cells, for example with the aid of affinity chromatography, preferably a laminin and / or laminin P1 - Affinity matrix is used.
  • antibody-containing material such as, for example, antiserum from the immunized animal, hybridoma cell culture supernatant, ascites or cells, for example with the aid of affinity chromatography, preferably a laminin and / or laminin P1 - Affinity matrix is used.
  • the antibodies according to the invention or parts thereof can be used in a variety of ways, for example as medicines, as diagnostic agents, as aids in biological and pharmacological models for the development and evaluation of substances influencing the laminin / nidogen interaction, for example as model substances for evaluating the spatial structure of the nidogen -Binding site of the laminin complementary contact zone and its potential binding valences, as well as for the investigation of the biosynthesis of basement membranes and the influence of basement membranes in different physiological processes, such as organ development, angiogenesis or embryogenesis.
  • the invention also includes medicaments and diagnostics which contain one or more of the antibodies or antibody parts according to the invention.
  • diagnostic agent for the detection of ⁇ 1 -containing laminini isoforms in biological samples, e.g. in body fluids such as blood, serum, plasma, urine, saliva or liquor, as well as in tissues.
  • diagnostic includes, for example, the various embodiments of heterogeneous and homogeneous immunoassays, test systems in immunohistochemistry and also Reagents for in vivo detection methods such as immunoscintigraphy.
  • the preparations containing the antibodies or antibody parts according to the invention can also be combined on their own or together with further auxiliary reagents, such as, for example, buffers, washing solutions, solutions which trigger the measurement signal, and / or other auxiliaries, such as cuvettes, in the form of diagnostic kits.
  • the peptides listed in Table 1 which are unable to form a folding pattern as is present in LE modules, were able to generate antibodies against the highly conserved amino acid sequence of the nidogen binding domain of the laminin.
  • the peptides according to Table 1 were coupled to ovalbumin using carbodiimide and these conjugates were used to immunize rabbits.
  • the development of a specific antibody titer against Laminin P1 and Laminin ⁇ 1 I 3-5 was analyzed using an enzyme immunoassay.
  • polyclonal antibodies of desired specificity were then enriched by affinity chromatography on a matrix to which laminin P1 from human placenta was bound, and subsequent sieve gel chromatography.
  • affinity chromatography on a matrix to which laminin P1 from human placenta was bound
  • sieve gel chromatography The methods for the purification and characterization of laminin from human placenta and its use for the immunization of mice and for the production of hybridomas synthesizing anti-laminin P1 antibodies are described in EP 0 696 597 A2.
  • the antibodies enriched according to laminin P1 affinity chromatography of the antiserum show a binding specificity to laminin P1 from the human placenta, laminin P1 from the mouse (EHS tumor) and laminin from the rat (yolk sac).
  • the antibodies not only recognize the specific sequence but also also the biologically active conformation of the laminid's nidogen binding domain. They are able to completely inhibit laminin / nidogen binding.
  • the antibodies of the invention are also obtainable by immunizing other immunocompetent vertebrates, such as mice, sheep, goats, guinea pigs, rats and the like.
  • Chickens preferably with laminin ⁇ 1 III4 and in particular with peptides, which contain essential nidogen binding sites but do not contain the complete amino acid sequence of the ⁇ 1 III 4 domain of the laminin, very particularly preferably the peptides according to Table 1.
  • Polyclonal antibodies according to the invention can be obtained from the antiserum of the immunized Animals are cleaned. In order to generate corresponding monoclonal antibodies, the immune cells of immunized animals, such as mice, are isolated using generally known methods (see, for example, Harlow, E. & Lane, D.
  • Hybridomas that produce MAK that bind specifically to the laminid's nidogen binding domain are cloned. They are then permanently available for MAK production.
  • F (ab) 2 , Fab ' or Fab fragments can be generated, for example, using enzymatic cleavage methods known to the person skilled in the art (see, for example, Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor).
  • the antigen binding sites of an antibody are located in the so-called variable domains, which are encoded by the corresponding V genes.
  • V genes The antigen binding sites of an antibody are located in the so-called variable domains, which are encoded by the corresponding V genes.
  • known genetic engineering methods see, for example, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd. Edition; McCafferty, J. et al. (1990) Nature 348 : 552-554
  • Hybridoma cells or the antibody-producing immune cells of immunized mammals are used as the starting material for the analyzes.
  • humanized or chimeric, bi- or oligo-specific antibodies can then be used with the aid of conventional genetic engineering and molecular biological methods (see also Johnson, KS & Chiswell, DJ. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571) and antibody analogs, such as, for example, polypeptides derived from the "complementarity determining region"("minimal recognition units"), "single chain” fragments or functional fusion products - such as, in particular, recombinantly produced antibody-enzyme or complement constructs - which are produced specifically bind to the laminid's nidogen binding domain.
  • antibody analogs such as, for example, polypeptides derived from the "complementarity determining region"("minimal recognition units"), "single chain” fragments or functional fusion products - such as, in particular, recombinantly produced antibody-enzyme or complement constructs - which are produced specifically bind to the laminid's nid
  • antibody or a part thereof used in this document.
  • the antibodies or parts thereof can be produced in plant (eg yeast), animal and prokaryotic cells.
  • the antibodies according to the invention and parts thereof can be modified, for example by labeling with radioactive isotopes or paramagnetic compounds for use in in vivo diagnostics or by linking pharmacologically active substances to produce an even more effective drug.
  • the crude peptide was then dissolved in 3 ml of 80% AcOH and this solution was added dropwise to a rapidly stirred solution (0.006 mmol iodine, 0.006 mmol sodium acetate in 55 ml 80% AcOH). After 5 min the reaction was complete Addition of 0.1 N ascorbic acid solution ended. The solution was concentrated to a volume of 2 ml and applied to a Sephadex® G25 column developed with 0.1 M AcOH. The isolated peptide was highly purified by reversed phase HPLC chromatography.
  • the peptide DNIDPNAVGNL-NH2 was produced analogously. Yield: 268mg (67% of theory); Molar mass: 1140 Da
  • ovalbumin (Sigma A-2512) were dissolved in 1 ml Na phosphate buffer, pH 7.4 and with 200 ul of an aqueous solution of 7 mg of N-hydroxysulfosuccinimide Na salt (Fluka 56485) and 300 ul of an aqueous solution 100 mg of 1-ethyl-3- (3-diaminaminopropyl) carbodiimide, HCl (Sigma E-6383) were added. After 5 minutes, the peptide solution (30 mg of the corresponding peptide in 1 ml of 10 mM Na phosphate buffer, pH 7.4) was added. The coupling reaction was in the dark for 16 hours at room temperature.
  • Conjugate-1 ovalbumin-DNIDPNAVGNL
  • Conjugate-2 ovalbumin-DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR (s-s bridged form)
  • the specific antibody titer development was examined in more detail in four animals using an enzyme immunoassay using Laminin P1 or Laminin ⁇ 1 IM 3-5 coated plastic vessels.
  • the corresponding animal sera are specified with the designations K2, K3, K4 and K905.
  • Sera K3 and K4 were obtained by immunization with conjugate-1, sera K2 and K905 by immunization with conjugate-2.
  • An immune response was stimulated very quickly in all rabbits, which then remained constant after 21 days (1st booster), or slowly but slowly subsided. A renewed stimulation of the immune response by a second booster injection was not observed.
  • the antibodies formed reacted both with laminin P1 and with the laminin domain ⁇ 1 IM 3-5.
  • the specific antibodies were separated from the other immunoglobulins in the animal serum, further serum components and the antibodies directed against ovalbumin.
  • affinity chromatography was carried out on a Laminin P1 affinity matrix. Fractogel® EMD Azlacton 650 (S) (Merck, Darmstadt) was used as the carrier (gel matrix). 0.3 g of the material was incubated for 15 minutes in 6 ml of PBS, 1 M Na2SO3, pH 7.4 before coupling, then the liquid supernatant was poured off. During the incubation, the material swelled to a volume of 1 ml and the matrix could be used directly for the covalent coupling of the desired ligand.
  • the respective serum was diluted 1: 2 with PBS / 0.04% Tween-20 and passed over the column at a flow rate of 2 ml / min. It was then washed with buffer until the baseline was reached again in the UV signal (220 nm) from the flow monitor. The bound antibodies were finally eluted by changing the running buffer to 0.1 M glycine / HCl, pH 2.7. The column runs and column eluates were analyzed using an enzyme immunoassay using immobilized laminin ⁇ 1 IM 3-5.
  • Antibodies could be purified from the four animal sera by the affinity purification described.
  • the average yield was 0.3 mg per 50 ml serum (in the case of serum K2, the yield was only 0.1 mg).
  • a large part of the antibodies in all sera did not bind to laminin P1, presumably due to a too slow binding kinetics or due to an exclusive affinity for the sequence of the peptide used for the immunization.
  • Affinity chromatography on laminin P1 columns consequently leads to a selective accumulation of the rapidly and stably binding antibody variants (the antibodies sought) from the serum.
  • the two antibody preparations K3 and K4 obtained by immunization with conjugate-1 recognized identical laminin P1 bands after SDS (sodium dodecyl sulfate) gel electrophoresis of the non-reduced sample.
  • the two antibody preparations K2 and K 905 (anti-conjugate-2) also showed an identical reaction pattern, but fewer laminin P1 bands were recognized than in the two anti-conjugate-1 antibody preparations.
  • immunochemical detection of the laminin P1 bands separated by reduction and SDS gel electrophoresis it is noticeable that all four antibody preparations had different binding preferences to fragments containing laminin ⁇ 1 IM 4.
  • Example 7 Inhibition Assays - Inhibition of Laminin / Nidogen Binding with Affinity-Purified Antibodies
  • the inhibitory activity of the affinity-purified antibodies can be identified using a "coated tube assay" in which the binding of radioactively labeled nidogen to laminin P1 (from human placenta) coated tubes is measured in the presence of the antibodies.
  • Reaction tubes (Greiner, 75 x 12, No. 115061) are mixed with a Laminin P1 solution, 4 ⁇ g / ml in carbonate buffer (0.159g Na2C ⁇ 3; 0.293g NaHCOs; 0.02g NaNs in 1 liter of distilled water), 20 ⁇ g / ml BSA (bovine serum albumin, Serva) pH 9.2 coated overnight at 4 ° C. Free binding sites are then blocked by incubation with 0.5 ml of 0.5% BSA in PBS / 0.04% Tween-20 for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Inhibitone assay with "laminin-mimetic" structures (sequential inhibition)
  • 200 ⁇ l iodinated nidogen (approx. 10 ng, approx. 40,000 counts per min) and 200 ⁇ l of the inhibitor (eg peptides derived from the domain ⁇ 1 IM 4 of the laminin) can be shaken) or standards (Laminin ⁇ 1 III 3-5) at room temperature.
  • Both the inhibitor and the standard were dissolved in PBS / 0.04% Tween-20. After an incubation period of 3 hours, 150 ⁇ l from this batch were transferred to the coated tubes and incubated for a further 2 hours at room temperature.
  • the solution was dumped, washed twice with 1 ml PBS / 0.04% Tween-20 and the bound radioactivity (Nidogen) was measured in the gamma counter.
  • the amount of bound nidogen in the inhibitor solutions was related to that of the nidogen without inhibitor addition.
  • Inhibitone assay with "nidogen-mimetic" structures (sequential inhibition)
  • 150 ⁇ l of the inhibitor for example an antibody binding to the domain ⁇ 1 IM 4 of the laminin or a peptide which can be derived from the sequence of the nidogen
  • Standards recombinant nidogen
  • Both inhibitor and standard were dissolved in PBS / 0.04% Tween-20.
  • 150 ⁇ l of iodinated nidogen (about 10 ng, about 40,000 counts per min) were added in order to displace the bound inhibitor.
  • an IC 50 o o of 0.22 nM with a standard deviation of +/- 15% was determined from ten independently performed assays.
  • the IC 50 o o is defined as the substance concentration which is required for 50% inhibition of the nidogen binding to laminin P1.
  • an IC 50 o o of 0.05 nM with a standard deviation of +/- 52% was comparatively obtained.
  • Table 2 shows the IC 50 % values of the antibody preparations K3, K905, K1.2, K2.2 and K3.2 and various free peptides.
  • the antibody preparations K1.2, K2.2 and K3.2 come from a second immunization campaign in rabbits with new conjugate-2 and comparable purification. The results demonstrate the reproducibility of the process.
  • Table 2 Inhibition of laminin / nidogen binding by the antibodies according to the invention.
  • Laminin P1 was immobilized on the sensor chip in accordance with the instructions in the user manual at a concentration of 200 ⁇ g / ml in 10 mM Na acetate, pH 4.0. The result is a matrix with 4000 RU-bound laminin P1. A double pulse of 4 ⁇ l 100 mM HCI can be performed to regenerate the affinity matrix.
  • Antibody preparation K3 inhibits laminin-nidogen binding better than K905 because it is characterized by faster association kinetics.
  • the antibody preparation K3 also inhibits when it is incubated simultaneously with the nidogen in the tubes coated with laminin P1, because it has good association kinetics at a concentration comparable to the nidogen.
  • the antibody preparation K905 can only inhibit in the "sequential inhibition" assay variant because it is characterized by a slow dissociation rate and can therefore no longer be displaced as well by the antigen by the later added nidogen. With simultaneous competition for the binding site, K905 is inferior to the nidogen due to the very slow association kinetics.
  • Example 9 Detection of the binding specificities of the affinity-purified antibody preparations K3 and K905 using Western blot
  • the interaction of the antibody preparations K3 and K905 with the conjugate-2 and the ovalbumin was examined in west blot analyzes.
  • the antigens were separated using 4-12% NuPAGE TM gels (NOVEX TM, San Diego, CA) with the aid of a MOPS buffer in accordance with the instructions from NOVEX TM and then using NuPAGE TM transfer buffer (NOVEX TM) on nitrocellulose Transfer membranes. After blocking the free binding sites on the membrane with 1 ⁇ g / ml polyvinyl alcohol (1 min), the antigens were incubated with the test antibodies. Bound antibodies were then detected with the aid of anti-rabbit IgG antibodies to which the enzyme alkaline phosphatase was covalently bound.
  • affinity-purified antibodies bind exclusively to the peptide, since there is no interaction with the carrier protein ovalbumin detectable. A reaction with the blue colored markers of the "See Blue” standard (NOVEX TM) was also not observed.
  • suitable vertebrates preferably mice or rats
  • suitable vertebrates are processed using standard methods, e.g. immunized with laminin, laminin P1, laminin ⁇ 1 IM 3-5, laminin ⁇ 1 III 4 or with the conjugates listed in Example 2.
  • MAK-producing hybridomas are obtained according to standard procedures.
  • the screening for the desired antibodies or the corresponding hybridoma clones enables, inter alia, Binding assays (e.g. dot blot or Western blot with Laminin y 1 IM 3-5 and / or Laminin y 1 III 4) as well as especially the inhibition assays described in Example 7.
  • Binding assays e.g. dot blot or Western blot with Laminin y 1 IM 3-5 and / or Laminin y 1 III
  • the selected clones represent a source for the synthesis of large amounts of the antibodies according to the invention.
  • an antibody according to the present invention is the monoclonal antibody (MAK), which of the under the deposit number DSMACC2327 on October 27, 1997 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ, Marscheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) monoclonal cell clone A6 / 2/4 deposited in accordance with the provisions of the Budapest Treaty.
  • MAK monoclonal antibody
  • the hybridoma comes from an immunization of mice with laminin P1, which had been isolated from human placenta.
  • the purification of the antigen and the generation of the hybridomas is described in EP 0 696 597 A2.
  • the antibody A6 / 2/4 was identified on the basis of its binding properties to laminin ⁇ 1 IM 3-5 and laminin ⁇ 1 IM 4. It is a monoclonal antibody of the IgM subtype that can be purified by sieve gel chromatography.
  • the binding to Laminin P1 is i.a. extremely strong due to the given polyvalence. For this reason and due to the size of the IgM antibody, elution from Laminin P1 affinity columns (see above) cannot be achieved.
  • the strong binding to Laminin P1 is reflected in the inhibition assay ("simultaneous variant", see above).
  • the MAK A6 / 2/4 is able to inhibit the laminin / nidogen association with an IC50 of 30 nM.
  • the binding epitope in the laminin ⁇ 1 IM 4 domain (the nidogen-binding domain of the laminin) cannot be clearly restricted.
  • the fact that peptides that can be derived from the laminid's nidogen binding sequence partially (75-80%) suppress the interaction of the antibody with laminin P1 indicates that the binding epitope of MAK A6 / 2/4 with that of the nidogen overlaps.
  • the following describes the production of inhibitory monoclonal antibodies which, like the polyclonal antibodies according to the present invention, can be produced with the aid of the peptide / ovalbumin conjugate.
  • conjugate 2 see above
  • conjugate 3 see above
  • the immune reaction is strengthened by further subcutaneous injections of 25 ⁇ g each of conjugate 2 in the presence of an incomplete Freund 's adjuvant, and a further seven weeks are waited.
  • the immune response is strengthened by intraperitoneal injection of a further 25 ⁇ g of conjugate 2.
  • the animals are sacrificed and the spleen cells isolated.
  • the spleen cells are fused with the myeloma cell line P3X63AG8.653.
  • Selection of spleen cells x P3X63AG8.653 hybrids is carried out by culturing the fusion mixture in hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium over a period of three weeks. To achieve a stable cell line, the cell clones obtained are subcloned several times. The resulting cell colonies are tested for antibody production in various immunological binding tests.
  • the resulting cell lines E79 / 1/6 and E82 / 1/10 were selected based on the screening strategy below.
  • the immunization of SJUJ mice with conjugate 2 leads to an exceptionally large number of antibody-producing hybridoma clones.
  • the antibodies in the culture supernatant show a strong immune reaction with laminin ⁇ 1 III 3-5, laminin P1 and ovalbumin.
  • Carrier protein ovalbumin, is negligible and antibodies are used exclusively
  • Tables 3 and 4 show the results obtained with two clones (E79 and E82) identified in this way.
  • the cloning has apparently succeeded in separating cells which show an immune reaction with ovalbumin.
  • a cell clone could be separated, which produces antibodies that bind to laminin ⁇ 1 IM 3-5 and laminin P1.
  • This fact and the fact that the immunization was carried out with a peptide derived from the nidogen binding domain of the laminin shows that the antibodies found bind to the natively structured nidogen binding motif of the laminin.

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Abstract

Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper sowie deren Teile, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen und als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die erfindungsgemässen Antikörper oder deren Teile binden bevorzugt an der gamma 1 III 4-Domäne des Laminins, insbesondere im hochkonservierten Bereich der Loops a und c, und können die Assoziation von Laminin und Nidogen inhibieren.

Description

Antikörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und Verwendung
Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper sowie deren Teile, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen und als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile binden bevorzugt an der γ1 IM 4- Domäne des Laminins, insbesondere an wesentliche Nidogen-Bindungsstellen im hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c, und können die Assoziation von Laminin und Nidogen inhibieren.
Die Assoziation von Laminin (ein 800 kDa Glycoprotein) und Nidogen (ein 160 kDa Glycoprotein) wird als ein entscheidender biomolekularer Mechanismus bei der Synthese und Stabilisierung von Basalmembranen betrachtet (Mayer, U. & Timpl, R. (1994) in: Extracellular Matrix Assembly and Structure (Ed.: P.D. Yurchenco et al.) S. 389 - 416, Academic Press, Orlando, FL). Durch die Fähigkeit des Nidogens mit allen Hauptbestandteilen der Basalmembran wie z.B. γ1 enthaltenden Laminin- Isoformen (zur Nomenklatur siehe: Burgeson, R.E. et al. (1994) Matrix Biology 14:209 - 211), Kollagen IV, Perlecan und Fibulin sowie deren jeweiligen Assoziationsstrukturen ternäre Komplexe auszubilden, übernimmt es die Funktion eines Bindegliedes, welches die voneinander unterschiedlichen Makrostrukturen miteinander verbindet, räumlich organisiert und stabilisiert (Fox, J.W. et al. (1991) EMBO J. 10:3137 - 3146; Aumailley, M. et al. (1993) Kidney Int. 43:7 - 12).
Einen deutlichen Hinweis auf die zentrale Funktion der Laminin/ Nidogen-Interaktion bei der Synthese einer funktionalen Basalmembran konnten Experimente mit polyklonalen Anti-Laminin-Antikörpern liefern. Die beschriebenen Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 oder dem rekombinant erzeugten Lamininfragment γ1 III 3-5 gewonnen und über eine Affinitätschromatographie an Laminin P1 oder Laminin γ1 III 3-5-Matrices angereichert. Sie zeigten in Inhibitionstests eine komplette Hemmung der Laminin/Nidogen-Assoziation. Diese basiert aber auf einer sterischen Blockade des Nidogenzugangs zum Laminin durch die Antikörper, deren Bindungsregionen nur in der Nähe der nidogenbindenden Sequenzen des Laminins liegen (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885). In embryonalen Organkulturen konnten die beschriebenen Antikörper sowohl die Genese von Nierentubuli, als auch die Ausbildung von Lungenbläschen inhibieren. Beides sind Ontogeneseprogramme die von einer ungehinderten Neusynthese einer Basalmembran abhängen (Ekblom, P. et al. (1994) Development 120:2003 - 2014; Ekblom, P. (1993) in: Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes (Ed.: Rohrbach, D.H. & Timpl, R.) S. 359 - 383; Academic Press, San Diego, CA.).
Die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins konnte in ihrer Lokalisation, Sequenz und in ihrer räumlichen Struktur (Röntgenkhstallstruktur und NMR-Struktur) eindeutig identifiziert und charakterisiert werden (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885; Baumgartner, R. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257:658 - 668; Stetefeld, J. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257:644 - 657). Sie befindet sich in einem "LE Modul" (laminin- type epidermal growth factor-like) des kurzen Arms der γ1 - Kette des Laminins, in der Domäne γ1 III 4. "LE Module" sind Strukturmotive aus 50 - 60 Aminosäuren die ein komplexes, zum "epidermal growth factor" analoges Faltungsmuster mit 4 Disulfidbrücken aufweisen (Bairoch, A. (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310; Engel, J. (1989) FEBS Letters 251 :1 - 7).
Eine hochaffine Bindung des Nidogens zur komplementären Laminin-Domäne konnte für Laminin P1 aus dem EHS Tumor der Maus, Laminin-2 und Laminin-4 aus humaner Plazenta und Laminin aus Drosophila nachgewiesen werden. Ursache für diese speziesübergreifende Bindungsspezifität ist die außerordentlich hohe Aminosäuresequenzidentität, die in der Laminin γ1 IM 4-Domäne bei den untersuchten Spezies vorliegt. Sie beträgt 97% zwischen Mensch und Maus und erstaunliche 61 % zwischen Mensch und Drosophila, wenn das ganze Modul berücksichtigt wird. Beschränkt man den Vergleich auf den Bereich der loops a bis c, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten, dann erhöhen sich die Werte auf 100% bzw. 75% (Pikkarinen, T. et al. (1987) J. Biol. Chem. 263:6751 - 6758; Chi, H.-C. & Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264:1543 - 1550).
Neben der Abhängigkeit der Nidogen-Bindung von einer intakten dreidimensionalen Struktur, konnten eindeutige Sequenzbereiche identifiziert werden, die sich in den S- S stabilisierten loops a und c der Laminin-Domäne γ1 III 4 befinden. Fünf essentielle Aminosäuren wurden identifiziert: Vier befinden sich innerhalb eines Abschnitts aus 7 Aminosäuren im loop a und eine Tyrosinseitenkette im loop c (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13:3741 - 3747; Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885; Pöschl, E. et al. (1996) EMBO J. 15:5154 - 5159).
Synthetische Peptide, die aus den entsprechenden Bereichen der Laminin-Domäne γ1 III 4 abgeleitet werden können, sind in der Lage die Laminin/Nidogen-Bindung in speziellen Bindungsassays komplett zu inhibieren (US 5,493,008). Allerdings zeigen derartige synthetische Peptide in Inhibitionsassays eine Aktivität, die etwa 400- bzw. 10000-fach schwächer ist als die des intakten Laminin P1 oder Laminin γ1 I 3-5 (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13:3741 - 3747; US 5,493,008). Die Laminin/Nidogen-Interaktion ist durch eine starke konformationelle Komponente beeinflußt (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885). Die schwächere inhibitorische Wirkung der synthetischen Peptide ist erklärbar, da Peptide in wäßriger Lösung eine Myriade von unterschiedlichen Konformationen einnehmen können und deshalb nur ein gewisser Prozentsatz der Peptide in der biologisch aktiven Konformation anzutreffen ist.
Die Verwendung solcher Peptide als Medikament ist daher aufgrund ihrer konformationellen Flexibilität, aber auch wegen ihrer Instabilität gegenüber Proteasen sowie ihrer schlechten Bioverfügbarkeit und Pharmakodynamik erheblich limitiert (Milner-White, E.J. (1989) Trends Pharmacol. Sei. 10:70 - 74; Hruby, V.J. (1994) in: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Ed.: Hodges, R.S. & Smith, J.A.) S. 3 - 17; ESCOM: Leiden, Netherlands).
Antikörper, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins binden und die Assoziation zwischen Laminin und Nidogen bei geringer Konzentration kompetitiv zu inhibieren vermögen, sind aufgrund ihrer höheren Affinität und Avidität, ihrer hohen Stabilität sowie ihrer guten Pharmakokinetik besser als Therapeutikum zur Behandlung von Krankheiten geeignet. Weiterhin können sie als Diagnostikum oder als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen eingesetzt werden.
Die bisher erzeugten Anti-Laminin P1- oder Anti-Laminin γ1 III 3-5-Antikörper können zwar zum Teil die Nidogen/Laminin-Bindung inhibieren. Sie erkennen jedoch die Nidogen-Bindungsstellen der Laminin γ1 -Kette nicht direkt, sondern die Inhibition der Nidogen/Laminin-Bindung erfolgt über sterische Wechselwirkung (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885). Die Nidogen-Bindungsdomäne der Laminin γ1- Kette ist speziesübergreifend außerordentlich stark konserviert . Darüber hinaus ist Laminin ein extrazelluläres Protein, das sowohl als integrierter Bestandteil von Basalmembranen, als auch in Form einer zirkulierenden Serumkomponente (EP 0 696 597 A2) ständig mit dem Immunsystem in Kontakt steht. Aufgrund der Fähigkeit des Immunsystems, "selbst" von "nicht-selbst" zu unterscheiden, muß gefolgert werden, daß jede immunisierte Spezies das hoch konservierte Immunisierungsantigen als eigenen Körperbestandteil erkennt und daher keine Antikörper gegen diesen entwickelt. Die Erzeugung eines spezifischen Antikörpertiters konnte deshalb nicht erwartet werden. Bestätigung fand diese allgemein anerkannte Lehrmeinung durch die Tatsache, daß durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 und Laminin γ1 IM 3-5 bisher keine Antikörper gegen die Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins erzeugt werden konnten (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12:1879 - 1885). Die oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die an nicht genau definierte Epitope außerhalb der Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins binden, sind jedoch als Therapeutikum, als Diagnostikum bzw. als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen nur sehr eingeschränkt bzw. überhaupt nicht geeignet: Die sterische Inhibition ist abhängig von der räumlichen Ausdehnung des Hemmstoffs, so daß der aus pharmakologischen Gründen bevorzugte Einsatz von Teilen dieser Antikörper als Therapeutikum kaum möglich ist. Des weiteren schränken mögliche Kreuzreaktionen mit nicht-nachzuweisenden Analyten die Verwendung dieser Antiköper in diagnostischen Testen ein
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, also die Nidogen- Bindungsdomäne der Laminin-γ1 -Kette direkt erkennen, und die als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen sowie als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen geeignet sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, durch die im folgenden beschriebenen Antikörper sowie die Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon sind dadurch gekennzeichnet, daß sie an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins, die Laminin γ1 IM 4- Domäne, bevorzugt an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c der Laminin γ1 III 4-Domäne binden. Besonders bevorzugt binden die erfindungsgemäßen Antikörper in bezug auf das Epitop konformationsabhängig (d.h. die Nidogenbindungsstelle des Laminins in deren nativen Konformation erkennend; vgl. Beispiel 6) direkt oder überlappend an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c. Insbesondere werden von der Erfindung Antikörper oder Teile davon miteingeschlossen, die mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1 binden. Die vorliegende Erfindung stellt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper bereit. Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische Antikörper. Besonders bevorzugt wird die Laminin-Nidogen-Bindung durch die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kompetitiv oder partiell kompetitiv inhibiert (vgl. Beispiel 7).
Tabelle 1 : Aminosäuresequenz der zu Immunisierung verwendeten Peptide
(1): DNIDPNAVGNL
(2) DN I DP NAVG N LKC IYNTAGFYC DR (S-S verbrückte Form)
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch die Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere, wie z.B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten und Hühner mit Laminin, Laminin P1 , Laminin γ1 III-3-5, Laminin γ1 III4 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen- Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 IM 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 , als Immunisierungsantigen.
Im Falle der Immunisierung mit Laminin bzw. Laminin P1 wird der Antikörper mittels Laminin γ1 III-3-5 und/oder Laminin γ1 IM-4 identifiziert und schließlich auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.
Im Falle der Immunisierung mit Laminin γ1 IM-3-5 wird der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und schließlich auf kompetitive oder prtiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.
Besonders bevorzugt werden als Immunisierungsantigen Laminin γ1 III-4 oder eines oder mehrere Peptide gemäß Tabelle 1 eingesetzt. Die durch die Immunisierung mittels dieser Immunisierungsantigene erhältlichen Antikörper werden vorzugsweise mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert. Vorteilhafterweise werden die identifizierten Antikörper auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Bindungsstelle geprüft.
Neben polyklonalen Antikörpern sind auch monoklonale Antikörper (MAK) erhältlich, wobei bei letzteren zunächst MAK-produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden. Die Antikörper sind auch in gereinigter Form erhältlich, indem die erfindungsgemäßen Antikörper aus Antikörper-enthaltendem Material, wie z.B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen, beispielsweise durch Affinitätschromatographie, vorzugsweise an Laminin und/oder Laminin P1 als Affinitätsmatrix, gereinigt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können die Laminin/Nidogen- Interaktion inhibieren und umfassen als Überbegriff auch die an anderer Stelle näher beschriebenen entsprechenden Chimären, humanisierten, bi- oder oligospezifischen Antikörper sowie Antikörperanaloga.
Die Erfindung beinhaltet auch tierische, pflanzliche und prokaryontische Zellen sowie Zelllinien, die die erfindungsgemäßen Antikörper und Antiköperteile produzieren, vorzugsweise das Hybridon DSMACC 2327, welches am 27. Oktober 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Marscheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DE) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft auch den von dem unter der Hinterlegungsnummer DSMACC 2327 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper.
Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Antikörper, wobei immunkompetente Wirbeltiere, wie z.B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten und Hühner, mit Laminin, Laminin P1 , Laminin γ1 III 3-5 sowie Laminin γ1 III4, besonders bevorzugt Peptide, die nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins enthalten, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1. Unter dem Begriff "Peptide" sind Oligopeptide, Polypeptide sowie Proteine und Proteinfragmente zu verstehen. Die als Immunisierungsantigen verwendeten Peptide werden bevorzugt gekoppelt an Träger wie beispielsweise Proteine, z.B. Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin, oder Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin, eingesetzt.
Im Falle der Immunisierung mit Laminin oder Laminin P1 wird der Antikörper mittels Laminin γ1 III-3-5 und/oder Laminin γ1 IM-4 identifiziert und auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.
Im Falle der Immunisierung mit Laminin γ1 III-3-5 wird der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.
Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Laminin γ1 MI-4 oder wahlweise eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen eingesetzt, welches vorzugsweise an einen Träger gekoppelt ist.
Der durch Immunisierung mit Laminin γ1 IM-4 oder mit einem der oder beiden Peptiden gemäß Tabelle 1 erzeugte Antikörper wird vorzugsweise mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und vorteilhafterweise auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.
Optional beinhaltet das Verfahren auch die Erzeugung von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile aus Antikörper enthaltendem Material, wie z.B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen beispielsweise mit Hilfe der Affinitätschromatographie zu reinigen, wobei bevorzugt eine Laminin und/oder Laminin P1 -Affinitätsmatrix verwendet wird. Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können vielfältig verwendet werden, z.B. als Arzneimittel, als Diagnostikum, als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen, z.B. als Modellsubstanz zur Evaluierung der räumlichen Struktur der zur Nidogen-Bindungstelle des Laminins komplementären Kontaktzone und deren potentieller Bindungsvalenzen, sowie zur Untersuchung der Biosynthese von Basalmembranen und des Einflusses von Basalmembranen bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie z.B. der Organentwicklung, Angiogenese oder Embryogenese. Die Erfindung schließt auch Arzneimittel und Diagnostika mit ein, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthalten.
Ferner umfaßt ist die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern oder Antikörperteilen
* zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind, insbesondere von Fibrösen, vor allem die alkoholische Leberfibrose sowie die Lungenfibrose, sowie alle Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basalmembran begleitet sind - vor allem in Niere, Auge und Gefäßsystem -, sowie die Arteriosklerose und alle Krankheiten, bei denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt, z.B. Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie und Erkrankungen mit einer starken entzündlichen Komponente wie z.B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis;
* zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von γ1 -enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, z.B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Liquor, sowie in Geweben. Unter den Begriff Diagnostikum fallen z.B. die verschiedenen Ausführungsformen heterogener und homogener Immunoassays, Testsysteme in der Immunhistochemie sowie auch Reagenzien für in vivo Nachweisverfahren wie z.B. der Immunszintigraphie. Die die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthaltenden Zubereitungen können auch alleine oder zusammen mit weiteren Hilfsreagenzien, wie z.B. Puffer, Waschlösungen, Meßsignal-auslösenden Lösungen, und/oder anderen Hilfsmitteln, wie z.B. Küvetten, in Form von Diagnostika-Kits zusammengefaßt werden.
Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben und anhand diverser Beispiele im Detail erläutert:
Überraschenderweise konnte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden, die kein Faltungsmuster auszubilden vermögen wie es in LE-Modulen vorliegt, Antikörper gegen die hochkonservierte Aminosäuresequenz der Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins erzeugt werden. Hierzu wurden die Peptide gemäß Tabelle 1 mit Hilfe von Carbodiimid an Ovalbumin gekoppelt und diese Konjugate zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörper-Titers gegen Laminin P1 und Laminin γ1 I 3-5 wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays analysiert.
Die polyklonalen Antikörper gewünschter Spezifität wurden dann per Affinitätschromatographie über eine Matrix, an die Laminin P1 aus humaner Plazenta gebunden war, und anschließender Siebgelchromatographie angereichert. Die Methoden zur Reinigung und Charakterisierung von Laminin aus humaner Plazenta sowie dessen Verwendung zur Immunisierung von Mäusen und zur Gewinnung von Anti-Laminin P1 -Antikörper synthetisierenden Hybridomen sind in der EP 0 696 597 A2 beschrieben.
Die nach Laminin P1 -Affinitätschromatographie des Antiserums angereicherten Antikörper zeigen eine Bindungsspezifität gegenüber Laminin P1 aus der Humanplazenta, Laminin P1 aus der Maus (EHS Tumor) und Laminin aus der Ratte (Dottersack). Die Antikörper erkennen nicht nur die spezifische Sequenz sondern auch die biologisch aktive Konformation der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins. Sie sind in der Lage, die Laminin/Nidogen-Bindung komplett zu inhibieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind aber auch erhältlich durch die Immunisierung anderer immunkompetenter Wirbeltiere, wie z.B. Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin γ1 III4 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt die Peptide gemäß Tabelle 1. Erfindungsgemäße polyklonale Antikörper können aus dem Antiserum der immunisierten Tiere gereinigt werden. Um entsprechende monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden nach allgemein bekannten Verfahren (siehe z.B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) die Immunzellen immunisierter Tiere, wie z.B. Mäuse, mit Myelomzellen zum Erzeugen von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen verschmolzen und anschließend geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die gewünschten MAK-produzierenden Klone wird mit Hilfe spezifischer Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die Bindungsspezifität der in den Kulturüberstand abgegebenen Antikörper z.B. an das Immunisierungsantigen, an den Träger des Immunisierungsantigens, an natives wie rekombinantes Laminin bzw. an dessen Fragmente bevorzugt mittels Enzym- oder Radioimmunoassays sowie Western Blots überprüft. Ein weiteres mögliches Selektionskriterium ist die die Fähigkeit der Antikörper, die Nidogen/Laminin-Bindung zu verhindern. Diese kann z.B. mittels der in den Beispielen näher beschriebenen Inhibitionsassays bewertet werden. Hybridome, die spezifisch an die Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins bindende MAK herstellen, werden kloniert. Sie stehen sodann für die MAK-Produktion auf Dauer zur Verfügung. Je nach gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft, nur Teile der Antikörper, wie z.B. F(ab)2, Fab'oder Fab-Fragmente, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren (siehe z.B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) erzeugt werden. Die Antigenbindungstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten variablen Domänen, die durch die entsprechenden V-Gene kodiert sind. Mit den bekannten gentechnischen Methoden (siehe z.B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd. edition; McCafferty, J. et al. (1990) Nature 348:552-554) kann auch die entsprechende Nukleinsäuresequenz eines an die Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins bindenden Antikörpers ermittelt werden sowie dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für die Analysen werden Hybridoma-Zellen bzw. die Antikörper-produzierenden Immunzellen immunisierter Säugetiere eingesetzt.
In Kenntnis der Nuklein- und Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher gentechnischer und molekularbiologischer Methoden (siehe auch Johnson, K.S. & Chiswell, DJ. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571) dann humanisierte oder chimäre, bi- oder oligospezifische Antikörper sowie Antikörperanaloga, wie z.B. von der "complementarity determining region" abgeleiteten Polypeptide ("minimal recognition units"), "single chain"-Fragmente oder funktioneile Fusionsprodukte - wie insbesondere rekombinant hergestellte Antikörper-Enzym oder -Komplement-Konstrukte - hergestellt werden, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden. Diese vom erfindungsgemäßen Antikörper bzw. Antikörpergen abgeleiteten Moleküle werden von dem in dieser Schrift verwendeten Überbegriff "Antikörper oder ein Teil desselben" mitumfaßt. Mit diesen Molekülen kann z.B. eine Verringerung der Immunogenität und/oder eine verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichung als Arzneimittel erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als Diagnostikum bzw. als Hilfsmittel für die Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die Antikörper oder Teile derselben sind herstellbar in pflanzlichen (z.B. Hefe), tierischen und prokaryontischen Zellen. Die erfindungsgemäßen Antikörper sowie Teile derselben können modifiziert werden, z.B. durch die Markierung mit radioaktiven Isotopen oder paramagnetischen Verbindungen zum Einsatz für die in vivo-Diagnostik oder durch die Anbindung von pharmakologisch wirksamen Substanzen zur Erzeugung eines noch wirksameren Arzneimittels.
Die im folgenden aufgeführten Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte der Erfindung.
Beispiele:
SDS-Gelelektrophorese, Western Blotting, BCA Proteinbestimmung wurden nach Standardprotokollen oder nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Wenn nicht ausdrücklich angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma (München) oder Riedel de Haen (Seelze) bezogen.
Beispiel 1 : Synthese von Peptiden
148 mg (0,1 mmol) eines FMOC-Amidanker-PAM Harzes wurden zur Festphasensynthese - ABI 433 Peptidsynthesizer - des Peptides eingesetzt. Nach Beendigung der Synthese beobachtete man eine Gewichtszunahme des Harzes auf 513 mg. Das Harz wurde mit einer Lösung aus 10 ml Trifluoressigsäure und 365 μl Triethylsilan für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Abfiltration des Harzes wurde die Lösung im Vakuum einrotiert und mit 50 ml 10% Essigsäure (AcOH) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhielt 145 mg (54% Ausbeute) an Rohpeptid. Das Rohpeptid wurde anschließend in 3 ml 80% AcOH gelöst und diese Lösung zu einer schnell gerührten Lösung (0,006 mmol Jod, 0,006 mmol Natriumacetat in 55 ml 80% AcOH) zugetropft. Nach 5 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 N Ascorbinsäurelösung beendet. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 2 ml eingeengt und auf eine Sephadex® G25 Säule, die mit 0,1 M AcOH entwickelt wurde, aufgetragen. Das isolierte Peptid wurde durch Reversed Phase HPLC-Chromatographie hochgereinigt.
Ausbeute: 36 mg von DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2 (13,5% der Theorie.)
Die Struktur wurde durch Massenspektroskopie (Molmasse: 2673 Da) und Aminosäureanalyse bestätigt.
Analog wurde das Peptid DNIDPNAVGNL-NH2 hergestellt. Ausbeute: 268mg (67% der Theorie); Molmasse: 1140 Da
Beispiel 2: Kopplung der Peptide an Ovalbumin
30 mg Ovalbumin (Sigma A-2512) wurden in 1 ml Na-Phosphat Puffer, pH 7,4 gelöst und mit 200 μl einer wäßrigen Lösung aus 7 mg N-Hydroxysulfosuccinimid Na - Salz (Fluka 56485) sowie 300 μl einer wäßrigen Lösung aus 100 mg 1-Ethyl-3-(3- Diaminaminopropyl)-carbodiimid, HCI (Sigma E-6383) versetzt. Nach 5 Minuten wurde die Peptidlösung ( 30 mg des entsprechenden Peptids in 1 ml 10 mM Na- Phosphat Puffer, pH 7,4) zugegeben. Die Kopplungsreaktion verlief 16 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Reaktionszeit wurde die Lösung zentrifugiert, um eventuell auftretende Trübungen zu entfernen. Unreagierte Chemikalien und Salze wurden anschließend durch Chromatographie über eine NAP-25 Säule (Pharmacia) entfernt. Das Ovalbumin/Peptid Konjugat wurde dadurch in PBS + 0,04% Tween-20 überführt. Die Ausbeute betrug 50 - 55 mg Konjugat.
Konjugat-1 : Ovalbumin-DNIDPNAVGNL
Konjugat-2: Ovalbumin-DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR (s-s verbrückte Form)
I I Beispiel 3: Immunisierung von Kaninchen
Gemischtrassige Kaninchen mit einem Körpergewicht von ca. 3 kg wurden mit den Ovalbumin/Peptid Konjugaten immunisiert. Hierfür wurden 1 mg der entsprechenden Konjugate in 0,5 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS) gelöst und dann mit demselben Volumen komplettes Freund 'sches Adjuvans gemischt und sorgfältig emulgiert. 1 ml der so erhaltenen Emulsion wurde einem Kaninchen intradermal injiziert; dabei wurde jeweils ein Fünftel des Volumens in fünf unterschiedliche Stellen, nahe der regionalen Lymphknoten, appliziert. Booster-Injektionen (das Antigen wurde hierfür mit unkompletten Freund 'schem Adjuvans emulgiert) wurden mit halbkonzentrierter Antigenemulsion nach 21 Tagen und 53 Tagen durchgeführt.
Beispiel 4: Titerentwicklung in vier immunisierten Kaninchen
Die spezifische Antikörper-Titerentwicklung wurde bei vier Tieren mit einem Enzymimmunoassay unter Verwendung von Laminin P1 bzw. Laminin γ1 IM 3-5 beschichteten Kunststoffgefäßen näher untersucht. Die entsprechenden Tierseren sind mit den Bezeichnungen K2, K3, K4 und K905 spezifiziert. Die Seren K3 und K4 wurden durch Immunisierung mit Konjugat-1 erhalten, die Seren K2 und K905 durch Immunisierung mit Konjugat-2. In allen Kaninchen wurde sehr schnell eine Immunreaktion angeregt, die dann nach 21 Tagen (1. Booster) konstant blieb, bzw. langsam aber kontinuierlich abklang. Eine erneute Stimulierung der Immunantwort durch eine zweite Boosterinjektion wurde nicht beobachtet. Die gebildeten Antiköper reagierten sowohl mit Laminin P1 als auch mit der Laminin-Domäne γ1 IM 3-5. Die Bindung zum Laminin P1 war allerdings etwas weniger ausgeprägt als die zum Laminin γ1 IM 3-5 und schien im Prozeß der Immunreaktion stärkeren Schwankungen unterworfen zu sein. Dies kann ein Hinweis sein auf mehrere Antikörperpopulationen im polyklonalen Serum, die mit verschiedenen Affinitäten die Nidogen-bindenden Motive, bzw. deren Konformationen im Laminin P1 und im Laminin γ1 IM 3-5 binden. Beispiel 5: Affinitätsreinigung der Antikörper
Zur weiteren Charakterisierung wurden die spezifischen Antikörper von den übrigen Immunglobulinen im Tierserum, weiteren Serumbestandteilen und den gegen Ovalbumin gerichteten Antikörpern abgetrennt. Hierfür wurde eine Affinitätschromatographie an einer Laminin P1 -Affinitätsmatrix durchgeführt. Als Träger (Gelmatrix) wurde Fractogel® EMD Azlacton 650(S) (Merck, Darmstadt) verwendet. 0,3 g des Materials wurden vor der Kopplung 15 Minuten in 6 ml PBS, 1 M Na2Sθ3, pH 7,4 inkubiert, anschließend wurde der flüssige Überstand abgegossen. Während der Inkubation quoll das Material auf ein Volumen von 1 ml und die Matrix konnte direkt zur kovalenten Kopplung des gewünschten Liganden eingesetzt werden.
3,4 mg humanes Laminin P1 wurden in 2 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0 gelöst und mit 1 ml aktiviertem (s.o.) Trägermaterial bei 4°C über Nacht (> 16 h) inkubiert. Anschließend wurde das Gelmaterial mit 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0 gewaschen. Die verbliebenen aktiven Gruppen des Trägermaterials wurden durch eine 24-stündige Inkubation in 5 ml 0,2 M Glyzin, pH 8,0 bei 4°C blockiert. Schließlich wurde die Gelmatrix mit drei Waschzyklen, bestehend aus alternierenden Inkubationen in PBS, 1 M Na2S03, pH 7,4, 0,1 M Na-Azetat, pH 4,0 und 0,2 M Glyzin, pH 8,0 für die Affinitätsbindung vorbereitet. Die Matrix wurde in eine HR 5/5 Säule von Pharmacia gefüllt und mit PBS / 0,04% Tween-20 equilibriert.
Zur Reinigung Laminin P1 - bindender Antikörper aus den Tierseren wurde das jeweilige Serum 1 :2 mit PBS / 0,04% Tween-20 verdünnt und bei einer Flußrate von 2 ml/min über die Säule geleitet. Anschließend wurde mit Puffer nachgewaschen bis im UV-Signal (220 nm) des Durchflußmonitors die Grundlinie wieder erreicht wurde. Die Elution der gebundenen Antikörper erfolgte schließlich durch den Wechsel des Laufpuffers zu 0,1 M Glycin/HCI, pH 2,7. Die Analyse der Säulendurchläufe und Säuleneluate erfolgte mit Hilfe eines Enzymimmunoassays unter Verwendung von immobilisiertem Laminin γ1 IM 3-5.
Aus den vier Tierseren konnten durch die beschriebene Affinitätsreinigung Antikörper gereinigt werden. Die Ausbeute betrug durchschnittlich 0,3 mg pro 50 ml Serum (im Falle des Serums K2 betrug die Ausbeute lediglich 0,1 mg). Ein Großteil der Antikörper in allen Seren (> 80%) band allerdings nicht an Laminin P1 , vermutlich aufgrund einer zu langsamen Bindungskinetik oder aufgrund einer ausschließlichen Affinität zur Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Peptids.
Die Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen führt folglich zu einer selektiven Anreicherung der schnell und stabil bindenden Antikörpervarianten (der gesuchten Antikörper) aus dem Serum.
Beispiel 6: Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörper
Mittels Western Blot wurde nachgewiesen, daß die affinitätsgereinigten Antikörper ihre Bindungsspezifität zum Laminin P1 bewahrt haben und daß die verschiedenen Präparationen stärker mit dem nicht reduzierten Laminin P1 reagierten als mit den durch Reduktion der Disulfide separierbaren linearen Laminin P1 -Fragmenten (Gerl.M. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 202:167 - 174). Dies ist ein Indiz für eine konformationsabhängige Komponente in der Bindungsspezifität der Antikörper. Weiterhin zeigte sich, daß sich die vier Antikörperpräparationen in ihren Bindungspräferenzen voneinander unterschieden. Die beiden durch Immunisierung mit Konjugat-1 gewonnenen Antikörperpräparationen K3 und K4 erkannten identische Laminin P1 -Banden nach SDS (Sodiumdodecylsulfat) Gelelektrophorese der nicht reduzierten Probe. Die beiden Antikörperpräparationen K2 und K 905 (Anti- Konjugat-2) zeigten ebenfalls ein zueinander identisches Reaktionsmuster, allerdings wurden weniger Laminin P1 -Banden erkannt als bei den beiden Anti- Konjugat-1-Antikörpernpräparationen. Beim immunchemischen Nachweis der durch Reduktion und SDS-Gelelektrophorese separierten Laminin P1-Banden fällt auf, daß alle vier Antikörperpräparationen unterschiedliche Bindungspräferenzen zu Laminin γ1 IM 4 enthaltenden Fragmenten aufwiesen.
Beispiel 7: Inhibitionsassays - Hemmung der Laminin/Nidogen-Bindung mit affinitätsgereinigten Antikörpern
Die inhibitorische Aktivität der affinitätsgereinigten Antikörper kann mit einem "coated tube assay" identifiziert werden, in dem die Bindung von radioaktiv markiertem Nidogen an Laminin P1 (aus humaner Plazenta) beschichtete Röhrchen in Anwesenheit der Antikörper gemessen wird.
Radioaktive Markierung von Nidogen mit 125Jod
Rekombinant produziertes humanes Nidogen (35 μg, Beschreibung des Klons, Kultur- und Reinigungsbedingungen, siehe Mayer, U. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 227:681 - 686) wurde in 250 μl PBS gelöst und mit 0,405 mCi (= 15 MBq) Na-Jodid (125l)Lösung (= 1 ,55 μl, Nordion Europe), 10 μl 0,5 M Na-Phosphat, pH 7,4 sowie 40 μg Chloramin T (N-Chlor-4-Toluolsulfonsäureamid Natriumsalz, Merck) in 100 μl 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 versetzt. Die Reaktion erfolgte 60 Sekunden bei Raumtemperatur und wurde durch Zugabe einer Lösung von 40 μg Na-Meta-Bisulfit (Riedel-de-Haen) in 100 μl 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 gestoppt. Dies erfolgte in maximal 30 Sekunden, dann wurde der Ansatz mit 900 μl 1% BSA (Sigma) in PBS versetzt. Die Abtrennung freier Radioaktivität und überschüssiger Salze erfolgte durch Siebgelchromatographie mit Hilfe einer PD 10 Säule (Pharmacia). Das in PBS eluierte jodierte Nidogen wurde gepoolt und so mit 1% BSA/0,05 M Na- Phosphat/0,01 % Na-Azid, pH 7,4 verdünnt, daß eine Konzentration von 50 ng/ml resultierte. Beschichtung von Reaktionsröhrchen
Reaktionsröhrchen (Greiner, 75 x 12, No. 115061 ) werden mit einer Laminin P1 Lösung, 4 μg/ml in Carbonat Puffer (0,159g Na2Cθ3; 0,293g NaHCOs; 0,02g NaNs in 1 Liter destilliertem Wasser), 20 μg/ml BSA (Rinderserumalbumin, Serva) pH 9,2 über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen werden anschließend durch 2-stündige Inkubation mit 0,5 ml 0,5% BSA in PBS/0,04% Tween-20 blockiert.
Inhibitonsassay mit "lamininmimetischen" Strukturen (sequentielle Inhibition) In einem Reaktionsgefäß wurden 200 μl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) und 200 μl des Inhibitors (z.B. Peptide, die aus der Domäne γ1 IM 4 des Laminins abgeleitet werden können) oder Standards (Laminin γ1 III 3-5) bei Raumtemperatur geschüttelt. Sowohl der Inhibitor als auch der Standard waren in PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden 150 μl aus diesem Ansatz in die gecoateten Röhrchen überführt und weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem Nidogen in den Lösungen mit Inhibitor wurde mit der des Nidogens ohne Inhibitorzusatz in Beziehung gesetzt.
Inhibitonsassay mit "nidogenmimetischen" Strukturen (sequentielle Inhibition) In den mit Laminin P1 beschichteten Reaktionsgefäßen wurden 150 μl des Inhibitors ( z.B. ein an die Domäne γ1 IM 4 des Laminins bindender Antikörper oder ein Peptid, welches aus der Sequenz des Nidogens abgeleitet werden kann) oder Standards (rekombinantes Nidogen) für 3 Stunden geschüttelt. Sowohl Inhibitor als auch Standard waren in PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach dem Absaugen der Probe wurde für 2 Stunden 150 μl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) zugegeben, um den gebundenen Inhibitor zu verdrängen. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem radioaktiven Nidogen wurde mit der Inhibitor- bzw. Standardkonzentration in Beziehung gesetzt.
Inhibitonsassay (simultane Inhibition)
Bei dieser Assayvariante erfolgte keine Vorinkubation. Es wurden vielmehr 75 μl jodiertes Nidogen (10 ng) mit 75 μl Inhibitor oder Standard direkt in die gecoateten Röhrchen pipettiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, ansonsten wurde analog zu den sequentiellen Assayvarianten verfahren.
Ergebnis
Für den Standard Laminin γ1 IM 3-5 wurde aus zehn unabhängig durchgeführten Assays eine IC50oo von 0,22 nM mit einer Standardabweichung von +/- 15 % ermittelt. Die IC50oo ist als die Stoffkonzentration definiert, die für eine 50%ige Hemmung der Nidogen-Bindung an Laminin P1 benötigt wird. Mit dem in US 5,493,008 beschriebenen (Equilibrium-) Inhibitionsassay wurde vergleichsweise ein IC50oo von 0,05 nM mit einer Standardabweichung von +/- 52 % erhalten.
Der Tabelle 2 sind die IC50%-Werte der Antikörperpräparationen K3, K905, K1.2, K2.2 und K3.2 sowie verschiedener freier Peptide zu entnehmen. Die Antikörperpräparationen K1.2, K2.2 und K3.2 stammen aus einer zweiten Immunisierungskampagne von Kaninchen mit neuem Konjugat-2 und vergleichbarer Aufreinigung. Die Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens.
Tabelle 2: Inhibition der Laminin/Nidogen-Bindung durch die erfindungsgemäßen Antikörper.
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*: Aminosäuresequenz s. Tabelle 1 **: Assaytyp
In US 5,493,008 werden für inhibitorische Peptide, die aus der Nidogen/Bindungsdomaine abgeleitet werden können, IC50oo-Werte zwischen 22 nM und 1000 nM angegeben. Diese Werte konnten mit dem gewählten Assay - aufgrund der drastisch verkürzten Inkubationszeiten - nicht erreicht werden; Das Peptid DNIDPNAVGNL erreichte im hier beschriebenen Assay z.B. nur einen ιc50% = 6°°00 nM.
Beispiel 8: Charakterisierung der Bindungskinetiken mit dem BIAcore® System
Mit dem BIAcore® System der Firma Pharmacia Biosensor können biospezifische Interaktionen on-line verfolgt werden. Das Prinzip der Messung beruht auf einem optischen Phänomen (surface plasmon resonance), das durch die auf einem Goldfilm gebundene Masse beeinflußt wird. Vereinfacht ausgedrückt handelt es sich um eine miniaturisierte Affinitätschromatographie auf einer Gold-Sensoroberfläche. Die Menge des spezifisch gebundenen Liganden kann in Form eines Resonanzsignals bildlich dargestellt werden (Chaiken.l. et al. (1992) Anal. Biochem. 201 :197 - 201 ; Karlsson, R. et al. (1992) in: Structure of Antigens; (Ed.: van Regenmortel). S. 127 - 148; CRC Press, Boca Raton.FI.) Laminin P1 wurde gemäß den Instruktionen des User-Manuals bei einer Konzentration von 200 μg/ml in 10 mM Na-Acetat, pH 4,0 auf dem Sensorchip immobilisiert. Es resultiert eine Matrix mit 4000 RU gebundenem Laminin P1. Zur Regeneration der Affinitätsmatrix kann ein Doppelimpuls ä 4 μl 100 mM HCI durchgeführt werden.
Bei einer Flußrate von 2 μl/min in HBS Puffer (10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% BIAsurfactant P20; pH = 7,4) band Nidogen (20 μg/ml) mit einer parabolischen Sättigingskinetik an Laminin P1 , die affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K905 und K3 in einer lineraren Abhängigkeit zum Antigen. Die Tatsache, daß nach 1400 Sekunden noch kein Übergang zur Gleichgewichtseinstellung zu beobachten war, kann Ausdruck dafür sein, daß die spezifische Peptidsequenz des Laminin P1 , welche für die Nidogen-Bindung verantwortlich ist, für die Antikörper gut zugänglich war. Die Antikörper banden an diese Sequenz unabhängig davon, ob sie in der biologisch aktiven oder in einer davon unterschiedlichen Konformation vorlag. Beleg dafür ist die Beobachtung, daß das Nidogen bereits nach einer Bindung von 600 RU einen deulichen Übergang in die Sättigungsphase aufwies. Es lagen also offensichtlich nicht alle immobilisierten Laminin P1 Moleküle in einer für das Nidogen erkennbaren Struktur vor, da die theoretische Maximalsättigung der Schicht von 2500 RU nicht erreicht wurde. Diese wäre aber von den beiden Antikörpern nach langer Kontaktzeit erreicht worden. Auffallend ist, daß die Probe K905 zehnfach höher konzentriert eingesetzt werden (320 μg/ml) mußte, um eine mit K3 (33 μg/ml) vergleichbare Bindungsrate zu erreichen. Die Bindung von K905 zum Laminin P1 war hingegen stabiler als die von K3, denn die Dissoziationsrate von K905 (erkennbar ab dem Zeitpunkt des Wechsels zum HBS Puffer: 1500 Sekunden) war erheblich langsamer als die der Präparation K3.
Diese Befunde erklären die in den Inhibitionsassays festgestellten Unterschiede zwischen K3 und K905: Die Antikörperpräparation K3 inhibiert die Laminin-Nidogen-Bindung besser als K905, weil sie durch eine schnellere Assoziationskinetik charakterisiert ist. Die Antikörperpräparation K3 inhibiert auch dann, wenn sie simultan mit dem Nidogen in den mit Laminin P1 beschichteten Röhrchen inkubiert wird, weil sie bei einer zum Nidogen vergleichbaren Konzentration eine gute Assoziationskinetik hat. • Die Antikörperpräparation K905 kann nur in der Assayvariante "sequentielle Inhibition" inhibieren, weil sie durch eine langsame Dissoziationsrate charakterisiert ist und deshalb von dem später zugesetzten Nidogen nicht mehr so gut vom Antigen verdrängt werden kann. Bei einer gleichzeitigen Konkurrenz um die Bindungsstelle ist K905 aufgrund der sehr langsamen Assoziationskinetik dem Nidogen unterlegen.
Beispiel 9: Nachweis der Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K3 und K905 mittels Western Blot
In Westen Blot-Analysen wurde die Interaktion der Antikörperpräparationen K3 und K905 mit dem Konjugat-2 und dem Ovalbumin untersucht. Hierzu wurden die Antigene mit Hilfe von 4-12%NuPAGE™ Gelen (NOVEX™, San Diego, CA) unter Zuhilfenahme eines MOPS-Puffers gemäß Instruktionsanleitung von NOVEX™ aufgetrennt und anschließend unter Verwendung von NuPAGE™ Transferpuffer (NOVEX™) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit 1 μg/ml Polyvinylalkohol (1 min) wurden die Antigene mit den Testantikörpern inkubiert. Der Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgte dann mit Hilfe von Anti-Kaninchen IgG-Antikörpern, an die das Enzym alkalische Phosphatase kovalent gebunden war.
Es zeigte sich, daß die affinitätsgereinigten Antikörper auschließlich an das Peptid binden, denn eine Interaktion mit dem Trägerprotein Ovalbumin ist nicht nachweisbar. Eine Reaktion mit den blaugefärbten Markern des "See Blue" Standards (NOVEX™) konnte ebenfalls nicht beobachtet werden.
Weiterhin wurde nachgewiesen, daß sowohl K3 als auch K905 mit Laminin und Lamininderivaten unterschiedlicher Spezies (Laminin aus der humanen Plazenta sowie aus dem Dottersack der Ratte (Caibiochem), Laminin P1 aus der humanen Plazenta sowie dem EHS Tumor der Maus, rekombinant hergestelltes Maus-Laminin γ1 IM 3-5) reagieren. Dies belegt die Bindung der Antikörper an die konservierte Sequenz innerhalb der Nidogen-Bindungsdomäne. Beide Antikörperpräparationen zeigten keine Kreuzreaktivität zum humanen Nidogen und zum humanen Kollagen Typ IV. Dies ist die Voraussetzung für die eindeutige Verwendung der beschriebenen Antikörper als Nidogen-Antagonisten.
Beispiel 10: Herstellung monoklonaler Antikörper
Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper werden geeignete Wirbeltiere, bevorzugt Mäuse oder Ratten, nach Standardverfahren z.B. mit Laminin, Laminin P1 , Laminin γ1 IM 3-5, Laminin γ1 III 4 oder mit den im Beispiel 2 aufgeführten Konjugaten immunisiert. Im Falle einer spezifischen Immunreaktion des Antiserums werden gemäß Standardverfahren MAK-produzierende Hybridome gewonnen.
Das Screening nach den gewünschten Antikörpern bzw. den entsprechenden Hybridoma-Klonen ermöglichen u.a. Bindungsassays (z.B. Dot Blot oder Western Blot mit Laminin y 1 IM 3-5 und/oder Laminin y 1 III 4) sowie vor allem auch die im Beispiel 7 beschriebenen Inhibitionsassays. Die selektierten Klone stellen eine Quelle für die Synthese großer Mengen der erfindungsgemäßen Antikörper dar.
Zur Reinigung der gewünschten Antikörper können übliche Verfahren eingesetzt werden, wie z.B. die Bindung an Protein G oder A. Bevorzugt erfolgt jedoch eine Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen. Dieser Reinigungsschritt erlaubt, wie im Falle der weiter oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die Auswahl und selektive Anreicherung der monoklonalen Antikörper mit den besten Bindungskonstanten.
Ein Beispiel für einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper (MAK), welcher von dem unter der Hinterlegungsnummer DSMACC2327 am 27. Oktober 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Marscheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegten monoklonalen Zeilklon A6/2/4 produziert wird.
Das Hybridom stammt aus einer Immunisierung von Mäusen mit Laminin P1 , welches aus Humanplazenta isoliert worden war. Die Reinigung des Antigens, sowie die Erzeugung der Hybridome ist in der EP 0 696 597 A2 beschrieben. Der Antikörper A6/2/4 wurde aufgrund seiner Bindungseigenschaften an Laminin γ1 IM 3-5 und Laminin γ1 IM 4 identifiziert. Es handelt sich um einen monoklonalen Antikörper des IgM-Subtyps der durch Siebgelchromatographie gereinigt werden kann. Die Bindung zum Laminin P1 ist u.a. aufgrund der gegebenen Polyvalenz außerordentlich stark. Deshalb und aufgrund der Größe des IgM Antikörpers ist eine Elution von Laminin P1 Affinitätssäulen (s.o.) nicht zu erzielen. Die starke Bindung zum Laminin P1 spiegelt sich im Inhibitionsassay ("simultane Variante", s.o.) wider. Der MAK A6/2/4 ist in der Lage, die Laminin/Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 30 nM zu inhibieren.
Aufgrund der ausgeprägten Konformationsabhängigkeit in seiner Bindung kann das Bindeepitop in der Laminin γ1 IM 4 Domäne (der Nidogen bindenden Domäne des Laminins) nicht eindeutig eingekränzt werden. Die Tatsache, daß Peptide, die aus der Nidogenbindungssequenz des Laminins abgeleitet werden können, die Wechselwirkung des Antikörpers mit Laminin P1 partiell (75-80 %) unterdrücken, deutet aber darauf hin, daß das Bindeepitop des MAK A6/2/4mit dem des Nidogens überlappt. Im folgenden wird die Herstellung von inhibitorischen, monoklonalen Antikörpern beschrieben die, wie die polyklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, mit Hilfe des Peptid/Ovalbumin Konjugats erzeugt werden können.
Mäuse vom SJLΛJ - Stamm werden mit 50 μg Peptid-2/Ovalbumin Konjugat (Konjugat 2, s.o.) in Gegenwart von komplettem Freund 'sehen Adjuvans subeutan immunisiert. Nach 4 und 8 Wochen wird die Immunreaktion durch weitere subcutane Injektionen von je 25 μg Konjugat 2 in Gegenwart von inkomplettem Freund 'sehen Adjuvans verstärkt und sieben weitere Wochen gewartet. Drei Tage vor der Fusion wird die Immunantwort durch intraperitoneale Injektion von weiteren 25 μg Konjugat 2 verstärkt.
Zur Fusion werden die Tiere getötet und die Milzzellen isoliert. In Gegenwart von Polyethylenglycol werden die Milzzellen mit der Myeloma Zellinie P3X63AG8.653 fusioniert. Durch Kultivierung der Fusionsmischung in Hypoxanthin-Aminopterin- Thymidin-Medium über einen Zeitraum von drei Wochen wird auf Milzzell x P3X63AG8.653-Hybride selektioniert. Zur Erreichung einer stabilen Zellinie werden die erhaltenen Zellklone mehrfach subkloniert. Die entstehenden Zellkolonien werden in verschiedenen immunologischen Bindungstests auf Antikörperproduktion getestet. Die entstandenen Zellinien E79/1/6 und E82/1/10 wurden aufgrund der unten stehenden Screeningstrategie selektioniert.
Versuche zur Charakterisierung und Identifizierung der spezifischen monoklonalen Antikörper.
Die Immunisierung von SJUJ - Mäusen mit Konjugat 2 führt zu einer außerordentlich großen Anzahl Antikörper produzierender Hybridomaklone. Die Antikörper im Kulturüberstand weisen eine starke Immunreaktion mit Laminin γ1 III 3-5, Laminin P1 und Ovalbumin auf.
Um nun Klone zu finden die monoklonale Antikörper gegen die nativ stukturierte Nidogen Bindungsdomäne des Laminins produzieren, mußte ein geeignetes Screeningverfahren durchgeführt werden.
Hauptaugenmerk bei diesem Screeningverfahren wird auf die Bindung der
Antikörper an Laminin P1 und Laminin γ1 IM 3-5 gelenkt. Gleichzeitig muß im Zuge der Subklonierungen darauf geachtet werden, daß die Reaktion mit dem
Trägerprotein, Ovalbumin, vernachlässigbar wird und Antikörper die ausschließlich
Ovalbumin erkennen aussortiert werden.
In den Tabellen 3 und 4 sind die Ergebnisse dargestellt, die mit zwei derart identifizierten Klonen (E79 und E82) erzielt werden.
Tabelle 3: Bestimmung der Bindung von E79 im ELISA
Figure imgf000029_0001
Tabelle 4: Bestimmung der Bindung von E82 im ELISA
Figure imgf000030_0001
Durch die Klonierung ist es offensichtlich gelungen, Zellen abzutrennen, die eine Immunreaktion mit Ovalbumin zeigen. Gleichzeitig konnte jeweils ein Zellklon separiert werden, der Antikörper produziert der eine Bindung zu Laminin γ1 IM 3-5 und Laminin P1 zeigt. Diese Tatsache und die Tatsache, daß die Immunisierung mit einem Peptid erfolgte, das aus der Nidogen Bindungsdomäne des Laminins abgeleitet ist, belegt, daß die gefundenen Antikörper an das nativ strukturierte Nidogen Bindungsmotif des Laminins binden. Den direkten Beweis für die Bindungsspezifität liefert die "simultane" Variante des Inhibitionsassays (s.o.), in dem die gefundenen Antikörper direkt mit jodiertem Nidogen um die Bindung an das Nidogen Bindungsmotif des intakten Laminins (Laminin aus Maus EHS Tumor, Chemicon, Nr. CC095) konkurrieren. Der von Zellklon E79/1/6 gebildete Antikörper (lgG2a - Subtyp) inhibiert die Laminin - Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 19 nM, der von Zellklon E82/1/10 gebildete Antikörper (lgG1 - Subtyp) inhibiert die Laminin - Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 190 nM.

Claims

Patentansprüche
1. Antikörper oder Teil desselben, dadurch gekennzeichnet, daß er an die Nidogenbindungsdomäne γ1 IM-4 des Laminins bindet.
2. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß er an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c der Nidogenbindungsdomäne γ1 MI-4 des Laminins oder in unmittelbarer Nähe dieser Loops bindet.
3. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er in bezug auf das Epitop konformationsabhängig direkt oder überlappend an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c bindet.
4. Antikörper oder Teil desselben nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1 bindet.
5. Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er polyklonal ist.
6. Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
7. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein chimärer, humanisierter, bi- oder oligospezifischer Antikörper ist.
8. Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß er die Laminin-Nidogen-Bindung kompetitiv oder partiell kompetitiv inhibiert.
9. Antikörper, erhältlich durch Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere mit Laminin oder Laminin P1 als Immunisierungsantigen und nachfolgender Identifizierung des Antikörpers mittels Laminin γ1 III-3-5 und/oder Laminin 1 IM-4 und Prüfung desselben auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung.
10. Antikörper, erhältlich durch Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere mit Laminin γ1 MI-3-5 als Immunisierungsantigen, nachfolgender Identifizierung des Antikörpers mittels Laminin und/oder Laminin P1 und Prüfung desselben auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung.
11. Antikörper, erhältlich durch Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere mit Laminin γ1 IM-4 und/oder mit Peptiden, die wesentliche Anteile der Nidogenbindungsstellen enthalten, aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der Laminin γ1 IM-4-Domäne, als Immunisierungsantigen.
12. Antikörper nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß Lamininγ1 III- 4 als Immunisierungsantigen eingesetzt wird.
13. Antikörper nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen eingesetzt werden.
14. Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert wird.
15. Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft wird.
16. Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.
17. Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Antikörper enthaltendem Material durch Affinitätschromatographie gereinigt wird.
18. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätschromatographie an Laminin und/oder Laminin P1 als Affinitätsmatrix erfolgt.
19. Zelle oder Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese einen Antikörper oder Teile desselben gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 produziert.
20. Hybridom DSMACC2327.
21. Antikörper, produziert von dem Hybridom DSMACC2327.
22. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß immunkompetente Wirbeltiere mit Laminin oder Laminin P1 immunisiert werden, der Antikörper mittels Laminin γ1 IM-3-5 und/oder Laminin γ1 MI-4 identifiziert und derselbe auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft wird.
23. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß immunkompetente Wirbeltiere mit Laminin γ1 IM-3-5 immunisiert werden, der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und derselbe auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft wird.
24. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß immunkompetente Wirbeltiere mit Laminin γ1 IM-4 und/oder mit Peptiden, die wesentliche Anteile der Nidogenbindungsstellen enthalten, aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der Laminin γ1 III-4- Domäne, immunisiert werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Laminin γ1 III- 4 als Immunisierungsantigen eingesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen eingesetzt werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurchgekennzeichnet, daß das Immunisierungsantigen an einen Träger gekoppelt ist.
28. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert wird.
29. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft wird.
30. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.
31. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper aus Antikörper enthaltendem Material durch Affinitätschromatographie gereinigt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätschromatographie an Laminin und/oder Laminin P1 als Affinitätsmatrix erfolgt.
33. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 21 , zur Verwendung als Arzneimittel.
34. Arzneimittel enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18 und 21.
35. Verwendung eines oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18 und 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind.
36. Verwendung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Form von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basalmembran begleitet sind, eine Form der Arteriosklerose, eine Fibröse, oder eine Krankheit ist, bei der eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt.
37. Verwendung nach Anspruch 35 oder 36 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der diabetischen Retinopathie, der alkoholischen Leberfibrose, der Lungenfibrose, einer Krebserkrankung, der diabetischen Nephropathie oder einer Erkrankung mit einer starken entzündlichen Komponente wie z.B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis.
38. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 21 zur Verwendung als Diagnostikum.
39. Diagnostikum enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18 und 21.
40. Verwendung eines oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18 und 21 zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von γ1 -enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, Körperflüssigkeiten oder in Geweben.
41. Verwendung eines Antikörpers oder eines Teils desselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 21 als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen.
42. Verwendung nach Anspruch 41 in einem biologischen und pharmakologischen Modell zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen.
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