CZ253899A3 - Protilátky, které se váží na doménu lamininu pro nidogen, způsob přípravy takových protilátek a jejich použití - Google Patents

Description

Předkládaný vynález .se týká monoklonálních a polyklonálních protilátek a jejich částí, které se specificky váží na nidogenovou vazebnou doménu lamininu, způsobu jejich přípravy a také jejich použití jako léku, diagnostického prostředku pro detekci isoforem lamininu, a použití jako modelové látky pro vývoj a hodnocení dalších látek, které ovlivňují interakci nidogen-laminin. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části se výhodně váží na doménu γΐ III-4 lamininu, zvláště na hlavní vazebné místo pro nidogen ve vysoce konzervativní oblasti smyček a a c, a mohou tak inhibovat asociaci lamininu a nidogenu.

Dosavadní stav techniky

Asociace lamininu (glykoprotein velikosti 800 kDa) a nidogenu (glykoprotein velikosti 160 kDa) se považuje ze rozhodující biomolekulární mechanismus při syntéze a stabilizaci bazální membrány (Mayer, U., Timpl, R. (1994) in: Extracellular Matrix Assembly and Structure (Ed. : P.D.· ,

Yurchenco et al.) S. 389 - 416, Academie Press, Orlando, FL). Díky schopnosti nidogenu vytvářet.terciární komplexy se všemi základními složkami bazální membrány jako jsou např. isoformy lamininu obsahujícíc γΐ (nomenklatura viz: Burgeson, R.E. et al. (1994) Matrix Biology 14:209 - 21 1 )., kolagenem IV, perlecanem a fibulin, nebo jej.ich jakýmikoliv asociačními „ » · · · ··· «·· • · · • · ···· ·· ···· strukturami, přebírá funkci vazebného článku, který rozdílné makrostruktury navzájem spojuje, organizuje v prostoru a stabilizuje (Fox, J.W. et al. (1991) EMBO J. 10:3137 3146; Aumailley,M. et al. Významnou informaci (1993) Kidney Int. 43:7 - 12). o centrální funkci interakce laminin-nidogen při syntéze funkční bazální membrány mohou poskytnout protilátkou pokusy

Popsané anti-lamininovou získány imunizací s polyklonální protilátky byly králíků lamininem PÍ nebo byly získány jako. rekombinantní fragment lamininu γΐ III 3-5 a přečištěny pomocí afinitní matrici lamininu PÍ nebo chromatografie na lamininu γΐ III-3-5. V testech inhibice vykazovaly* úplnou inhibici asociace laminin-nidogen. Ta je založena na · tom, že protilátky, jejichž vazebná oblast leží v blízkosti vazebných stericky blokují přístup et al., 1993, EMBO J, sekvencí lamininu pro nidogen, nidogenu k lamininu (Mayer, U.

12: 1879-1885). V embryonálních orgánových kulturách popsané protilátky také inhibovaly genezi ledvinných tubulů a také vytváření plicních sklípků. Oba ontogenetické procesy jsou závislé na nenarušené nové syntéze bazální membrány (Ekblom, P. et al., 1994, Development 120: 2003-2014, Ekblom, P., 1993 in: Molecular and Cellular aspeets oř Basement Membranes ( (ed. Rohrbach, D.H., Timpl, R.),, s. 359-383, Academie Press, San Diego, CA).

Vazebná doména lamininu pro nidogen byla jednoznačně lokalizace, sekvence krystalografie a NMREMBO J. 12: ,1879-1885) .

charakterizována z hlediska své a prostorové struktury (Rentgenová struktura) (Mayer, U. et al. (1993)

Existuje v podobě tzv. LE modulu· (laminin-type epidermal growth factor - like) krátkého ramene řetězce yl lamininu v doméně yl III 4. LE moduly jsou strukturní motivy složené . z 50 až 60 aminokyselin, které vytvářejí komplexní složenou *99·

9 9

999 999

9999

9 · · · • 999 9 · · • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 999 99 9 strukturu se 4 disulfidovými můstky analogickou epidermálnímu růstovému faktoru (Bairoch, A. (1995) Nomenclature of extracelfular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310; Engel, J. (1989) FEBS Letters 251:_l-7).

Vysokoafinitni .vazba ’ nidogenu ke komplemetární doméně lamininu byla prokázána pro lamininin PÍ z EHS nádoru myši, laminin-2 a laminin-4 z lidské placenty a laminin drozofily. Příčinou pro takovou mezidruhovou vazebnou afinitu je mimořádně vysoká míra identity aminokyselinové sekvence domény γΐ III-4 lamininu u zkoumaných biologických druhů. Tato identita je 97 % pro člověka a myš a překvapivě 61 % pro člověka a drozofilu, pokud se bere do úvahy celý modul. Pokud se vezme do úvahy jenom omezený, úsek smyček a až c, který obsahuje podstatné vazebné místo pro nidogen, pak se míra identity zvýší až na 100 % a druhém případě 75 % (Pikkarinen, T. et al. (1987) J. Biol.- Chem. 263: 6751-6758; Chi, H.-C. a Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1543-1550).

Kromě toho, že vazba nidogenu je závislá na intaktní trojrozměrné struktuře, je možné identifikovat určité úseky sekvencí, které se nacházejí v S-S stabilizujících smyčkách a a c domény γΐ III 4. Bylo zde identifikováno 5 esenciálních aminokyselin: čtyři se nacházejí uvnitř úseku 7 aminokyselin ve smyčce a, a jeden tyrosinoivý postranní řetězec ve smyčce c (Poschl, E. et ai. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885;-Poschl, E. et al. (1996) EMBO J.' 15: 5154-5159) .

Syntetické peptidy, které je možné odvodit z odpovídajících úseků lamininové domény γΐ III 4, mají schopnost zcela inhibovat vazbu laminin-nidogen ve speciálních vazebných testech (patent US 5 493 008). I přesto, že tyto syntetické peptidy v inhibičních testech vykazují aktivitu, která je 400x až lOOOx slabší než aktivita

44 ► 4 4 · » 4 4 4 · · * ·

44« 444 •4 4444 intaktního lamininu Pl nebo lamininu γΐ III-3-5 (Poschi, E. et al. (1994) EMBOJ. 13: 3741-3747; US 5,493,008). Interakce laminin-nidogen je (Mayer, U. et al. inhibiční působení ovlivněna silnou konformační složkou (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Slabší syntetickýh peptidů je · vysvětlitelné, neboť peptidy ve vodném roztoku zaujímají nespočetné množství různých konformací, a proto jen' jisté procento peptidu se vyskytuje v biologicky aktivní konformací.

Použití takových peptidů jako léčiva je proto značně omezené vzhledem k jejich konformační flexibilitě, a také jejich nestálosti vůči proteázám, a také jejich špatné biologické dostupnosti a farmakodynamice, (Milner-White, E. J. (1989) Trends .Pharmacol. Sci. 10: 70-74; Hrubý, V.J. (1994) in: Peptides,, Proč. Thirteenth American Peptide Symposium; (Ed. : Hodges, R.S. Smith, J.A.) S. 3-17; ESCOM: Leiden, Netherlands).

•Protilátky, které se specificky váží na vazebnou doménu lamininu pro nidogen, a tím kompetitivně inhibují asociaci mezi lamininem a nidogenem při nízké koncentraci, jsou vzhledem k jejich vyšší afinitě a aviditě, větší stabilitě a- také dobré farmakokinetice, vhodnější jako léčivo pro léčení určitých nemocí. Tyto protilátky se také mohou použit jako diagnostický nebo pomocný prostředek v biologických a farmakologických modelech pro vývoj a hodnocení látek ovlivňujících interakci laminin-nidogen.

Doposud produkované protilátky anti-laminin Pl nebo anti-laminin γΐ III-3-5 byly schopné sotva částečně inhibovat vazbu. Navíc nerozpoznávaly vazebné místo pro nidogen na řetězci γΐ lamininu přímo, ale inhibovly vazbu lamininnidogen sférickým působením (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J.

12: 1879 - 1885) . Vazebná doména lamininového řetězce γΐ pro nidogen je mezidruhově mimořádně siln.ě konzervativní. Mimo to » · · · ··« ··· • ··· ·« ··«· je laminin extracelulární protein, který jako integrální součást bazální membrány, a také ve formě cirkulující složky séra (viz EP 0 696 597 A2)., přichází do kontaktu s imunitním systémem. Na zákldě schopnosti imunitního systému rozlišit vlastní, od nevlastního by vyplývalo, že každý imunizovaný biologický druh vysoce konzervativní imunizační antigen rozpozná jako vlastní a nebude tvořit protilátky. Tvorba specifických protilátek se proto nedá očekávat. Potvrzením' tohoto všeobecně uznávaného názoru je fakt, že při imunizaci králíků lamininenm PÍ a laminininem γΐ III-3-5 nebyly dosud získány žádné protilátky proti vazebné doméně lamininu pro nidogen (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Výše popsané monoklonální protilátky, které' se váží na nepřesně definovaný epitop ležící mimo vazebnou doménu lamininu pro nidogen, jsou jako léčiva, diagnostické prostředky, popřípadě modelové látky pro vývoj a hodnocení dalších látek, které ovlivňují interakci nidogen-laminin, určené jen ve velmi omezené míře a-nebo vůbec ne: Sférická inhibice je závislá na prostorovém uspořádání inhibitoru, takže z farmakologických důvodů použití částí těchto protilátek jako léčiva je sotva možné. Dalším omezením pro použití v diagnostických testech je možná s nežádoucím analytem.

těchto protilátek křížová reaktivita

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného protilátky, poskytnout na vazebnou takové doménu vynálezu je které se specificky váží lamininu pro nidogen, tedy rozpoznávají přímo vazebnou doménu pro nidogen na řetězci ,γΐ lamininu, a které jsou určeny k použití jako léčivo, diagnostické činidlo k detekci • ···· ·· 9 · ’ • ·«· · « • · · · « »» ♦··* ·· ·· » · · · ·*· ··· »« · ··· ··

99 isoforem lamininu, a jako modelová látka pro, vývoj a hodnocení látek ovlivňujících interakci laminin/nidogen.

, Řešením jsou podle předkládaného vynálezu zde popsané protilátky, způsob jejich přípravy a jejich použití.

Protilátky podle předkládaného vynálezu se vyznačují tím, že se váží na vazebnou doménu lamininu pro nidogen, a sice doménu γΐ ΙΞΙ 4, výhodně vysoce konzervativní úsek smyčky a, popřípadě smyček a a c, domény γΐ III 4 lamininu.' Zvláště výhodně se protilátky podle předkládaného vynálezu váží, s ohledem na epitop, způsobem závislým na konformaci (vazebné místo lamininu pro nidogen rozpoznává v jeho nativní konformaci, srovnej příklad 6) , a sice buďto, přímo nebo překrývajícím způsobem, na vysoce konzervativní úseky smyčky a, popřípadě smyček a a c. Součástí vynálezu jsou zvláště protilátky nebo jejich části, které se váží na alespoň jeden z peptidů uvedených v tabulce 1. Předkládaný vynález se týká jak polyklonálních tak i monoklonálních protilátek.

Protilátky chimérické, protilátky.

jsou výhodně oligospeci fické laminin-nidogen podle předkládaného vynálezu' humanizované, bi- nebo Zvláště výhodně je vazba prostřednictvím protilátek podle předkládaného vynálezu inhibována kompetitivně nebo částečně kompetitivně (srovnej příklad 7).

Tabulka 1

Aminokyselinová sekvence peptidů použitých pro imunizaci

1) DNIDPNAVGNL

2) DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR -(forma s S~S můstkem) ·· lze získat «··<

00* ·Φ

0 0 0 • 00 000

Ί

Protilátky podle předkládaného vynálezu imunizaci imunokompetentních obratlovců, jako např. králíků, myší, ovcí, koz, morčat, krys nebo slepic, a sice lamininem, lamininem Pl, lamininem γΐ III-3-5, lamininnem yl III 4, a zvláště pak peptidy, které obsahují podstatné vazebné místo pro nidogen, ale nikoliv celou aminokyselinovou sekvenci domény yl III 4 lamininu, zvláště výhodné jako imunizační antigeny jsou buďto jeden nebo oba peptidy uvedené v tabulce 1.

V případě imunizace lamininem, popřípadě lamininem Pl, se protilátky identifikují pomocí lamininu γΐ III-3-5 a/nebo lamininu yl III 4, a nakonec se testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibicí vazby laminin-nidogen.

V případě imunizace lamininem yl III-3-5 se protilátky identifikují prostřednictvím lamininu a/nebo lamininu Pl a nakonec se testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibicí vazby laminin-nidogen.

Zvláště výhodné je použít jako uminizační antigen laminin yl III 4 nebo jeden či více peptidů podle tabulky 1. Protilátky získané imunizací takovým imunizačním antigenem se výhodně identifikují pomocí . lamininu ef/nebo lamininu Pl. Takto identifikované protilátky se pak testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibicí vazby laminin-nidogen.

Kromě po.lyklonální ch protilátek je také možné získat monoklonální protilátky (MAK), přičemž se připraví hybridomové buňky produkující MAK. Protilátky lze také získat v purifikované formě, kdy se protilátky podle předkládaného vynálezu z materiálu obsahujícího protilátky, jako je např. antisérum imunizovaných zvířat, supernatant z kultur, hybridomovývh buněk, ascites nebo buňky, purifikují pomocí • β · · · 9 9·· 9

9999 9 9 9 9 99 9 • 9 9 · 9 9 9 999999 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 afinitní chromatografie, . výhodně na lamininu a/nebo lamininu PÍ jako afinitní matrici.

Protilátky podle předkládaného vynálezu nebo jejich části mohou inhibovat interakci laminin-nidogen a jako nadřazený pojem obsahují také odpovídající chiméry, humanizované protilátky, bi- nebo oiigospecifické protilátky a analogy protilátek, které budou blíže popsány na jiném místě.

Předkládaný vynález se také týká živočišných, rostlinných a prokaryotických buněk a buněčných .linií, které tvoří protilátky nebo části protilátek podle vynálezu, výhodně např. hybridomu DSMACC 2327, který byl uložen 27, října 1997 ^: v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur, s.r.o. (DSMZ, Marscheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Německo) v souladu s Budapešťskou smlouvou. Předkládaný vynález se také týká monoklonálních protilátek, které jsou produkovány zmíněným hybridomemem uloženým pod č. DSMACC 2327.

Dále je předmětem předkládaného, vynálezu způsob přípravy výše popsaných protilátek, kdy se imunokompetetntní obratlovci, jako např. králíci, myši, ovce, kozy, morčata, krysy nebo slepice, imunizují lamininem, lamininem Pl, iamininem γΐ III-3-5 a nebo lamininnem γΐ III 4, výhodně peptidem, který neobsahuje celou aminokyselinovou sekvenci domény γΐ III 4, a zvláště výhodně jedním nebo oběma peptidy v tabulce 1. .Pod pojmem peptidy se rozumí jak -oligopeptidy a polypeptidy, tak i proteiny a fragmenty proteinů. Peptidy použité jako imunizační antigeny se výhodně naváží na nosič jako je protein, např. ovalbumin, albumin nebo hemocyanin, nebo polymer, např. polyetylenglykol, polyakrylamid nebo poly-D-glutamin-D-lysin.

• · • · • · · · ··· ·· · · ··· • · · · · · · · · · · • ··· · · · ······ • · · · · · · ······ ·» · · · · ·

V případě imunizace- lamininem, popřípadě lamininem Pl, se protilátky identifikují pomocí lamininu γΐ III-3-5 a/nebo lamininu yl III 4, a nakonec se testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

V případě' imunizace lamininem γΐ III-3-5 se protilátky identifikují prostřednictvím lamininu a/nebo lamininu Pl a nakonec se testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici vazby lamínin-nidogen.

Výhodně se ve způsobu podle předkládaného vynálezu užije jako imunizační antigen laminin γΐ III 4 nebo libovolný z peptidů nebo oba peptidy z tabulky 1, který je výhodně navázán na nosič.

Protilátky připravené imunizací lamininem γΐ III 4 nebo libovolným z peptidů nebo oběma peptidy z tabulky 1, se identifikují pomocí lamininu a/nebo lamininu Pl, a nakonec se výhodně testují na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

Způsob podle předkládaného vynálezu obsahuje přípravu hybridomových buněk monoklonální protilátky (MAK). Ukázalo se, purifikovat protilátky podle předkládaného vynálezu' nebo jejich části z materiálu obsahujícího protilátky, jako je např. antisérum imunizovaných zvířat, supernatant z kultur hybridomovývh buněk, ascites nebo buňky, pomocí afinitní chromatografie, výhodně na lamininu a/nebo lamininu Pl jako afinitní matrici.

Protilátky podle předkládaného vynálezu ' nebo jejich části mohou být použit mnoha způsoby, např. kalo léčivo, jako diagnostické činidlo, jako pomocný prostředek v biologických a' farmakologických modelech pro vývoj a hodnocení látek ovlivňujících interakci laminin-nidogen, jako modelová látka k hodnocení prostorové struktury kontaktní zóny komplemetární případně také produkuj ících že je výhodné • · » · • · · · · • · · · · • · · · · · · • · • · ·· · · • · » · • · · • · · · · • « · · • · « k vazebnému místu lamininu pro nidogen a jejích potenciálních valencí, a také ke zkoumání biosyntézy bazální membrány a zkoumání vlivu bazální membrány v různých fyziologických procesech, např. při vývoji orgánů, angiogenezi nebo embryogenezi. Předmětem předkládaného vynálezu je také lék a diagnostický prostředek, které obsahují jednu nebo několik protilátek podle předkládaného vynálezu nebo jejich část.

Dále se předkládaný vynález týká použití jedné nebo několika protilátek podle předkládaného, vynálezu nebo jejich, částí pro • výrobu léku pro léčení nemocí, které jsou charakterizovány zvýšenou nebo nežádoucí syntézou bazální membrány, zvláště fíbrózy, především alkoholická jaterní fibróza, plicní fibróza, a také všechny formy pozdních komplikací při diabetů, které jsou doprovázeny ztluštěním bazální membrány, zejména v ledvinách, oku a cévním systému, také arteriosklěrózy a všech nemocí, u kterých' přispívá angiogeneze ke zhoršení klinického obrazu, jako např. rakovinná onemocnění, diabetická retinopatie, a onemocnění se silnou zánětlivou ' složkou jako je revmatoidní artritida, osteoartritida, vaskulitida, hemangiom a psoriáza.

• výrobu diagnostického prostředku pro detekci isoforem lamininu obsahujícího γΐ v biologických vzorcích, např. tělních tekutinách jako je krev, sérum, plazma, moč, sliny nebo likvor, a také v tkáních. Pod termínem diagnostický prostředek se rozumí různé formy provedení heterogenních a homogenních imunotestů, testovacích souprav pro imunohistochemii, a také reagencie pro in vivo diagnostiku jako je např. imunoscintigrafie. Prostředky obsahující protilátky podle předkládaného vynálezu nebo jejich části mohou být buďto samotné nebo mohou být ve formě diagnostické soupravy společně s dalšími pomocnými reagenciemi jako jsou pufry, promývací roztoky, kalibrační roztoky a jiné pomocné prostředky, jako jsou např. kyvety.

V další části popisu bude vynález podrobněji vyložen a uvedeny podrobně příklady provedení vynálezu.

Překvapivě byly pomocí peptidů uvedených v tabulce 1, které nevytvářejí žádnou složenou strukturu jako např. LE moduly, připraveny protilátky proti vysoce konzervativním aminokyselinovým sekvencím vazebné domény lamininu pro nidogen. K tomuto účelu byly peptidy uvedené v tabulce 1 pomocí karbodiimidu navázány na ovalbumin , a tyto konjugáty byly použity k imunizaci králíků. Rozvoj titru specifických protilátek proti lamininu Pl a laminin γΐ III-3-5 se sledoval pomocí enzymového imunotestu.

Polyklonální protilátky s požadovanou specifičností byly purifikovány afinitní chromatografii s matrix s navázaným lamininem Pl z lidské placenty a nakonec filtrační gelovou chromatografii. Způsobí čištění a charakterizace lamininu z lidské placenty a jeho použití pro imunizaci myší a k získání hybridomů syntetizujících protilátky anti-laminin-Pl bylo popsáno v dokumentu EP 0 696 597 A2.

Protilátky získané afinitní chromatografii na lamininu Pl vykazují vazebnou' specifičnost pro laminin Pl z lidské placenty, laminin Pl myši (EHS nádor) a laminin z krysy (žloutkový vak). Protilátky rozpoznávají nejen specifické sekvence, ale také biologicky aktivní konformace vazebné domény lamininu pro nidogen. Jsou schopné úplně inhibovat vazbu laminin-nidogen. Protilátky podle předkládaného vynálezu je množné získat také imunizací jiných imunokompetentních obratlovců, např. králíků, myší, ovcí, koz,,, morčat, krys nebo slepic, a sice lamininem, lamininem • «

Pl, lamininem γΐ III-3-5, lamininnem γΐ III 4, a zvláště pak peptidy, které obsahují podstatné vazebné místo pro nidogen, ale nikoliv celou aminokyselinovou sekvenci domény γΐ III 4 lamininu, zvláště výhodné jako imunizační antigeny jsou buďto jeden nebo oba peptidy uvedené v tabulce 1. Polyklonální protilátky podle předkládaného vynálezu se pak mohou purifikovat ze séra imunizovaných zvířat.

Pro přípravu odpovídajících monoklonálních protilátek je možné užít všeobecně známých způsobů (viz např. Harlow, E. a Lané, D. (1988) Antibodies: A ^Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) , kdy se imunitní buňky imunizovaného zvířete, např. myši, fúzují s myelomovými buňkami, čímž se připraví hybridomové buňky produkující monoklonální protilátky (MAK), a nakonec se izolují určité klony. Výběr požadovaných .klonů produkujících MAK se provádí pomocí specifických testovacích metod. Přitom afinita protilátek vyloučených do k imunizačnímu antigenu, k nosiči se testuje kultivačního imunizačního lamininu, enzymovým přenosem.

vazebná média antigenu, k nativnímu nebo rekombinantnímu případně k jejich fragmentům, a to výhodně imunotestem, radioimunotestem nebo westernovým Dalším možným selekčním kritériem je schopnost protilátek rušit vazbu laminin-nidogen. To lze testovat např. inhibičním testem, který je podrobně popsán v příkladech. Hybridomy, které produkují MAK specificky se vážící na vazebnou doménu lamininu pro nidogen se pak klonují. Jsou potom trvale k dispozici pro produkci MAK. Podle požadovaného účelu použití může být výhodné připravit jen části protilátek, např. fragmenty F(ab)₂, Fab'nebo Fab. Ty lze připravit např. odborníkovi známým enzymatickým štěpením (viz např. Harlow, E. & Lané, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor).

i • β 99 » · 0 · » · · ·

9 · 0 0 0 • · · · · · · «000 0 0 0 9 9 ·

9999 99 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

0 0 0 0 0 9 9 W «0

Protilátky podle předkládaného vynálezu a jejich části mohou být modifikovány, např. tím, že se označí radioaktivním izotopem nebo paramagnetickou sloučeninou pro použití při in vivo diagnostice, nebo se naváží na farmaceuticky účinnou látku, a tím se připraví ještě účinnější lék.

Následující, příklady slouží k podrobnějšímu vysvětlení jednotlivých aspektů předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Metody SDS-elektroforézy, westernového přenosu a stanovení proteinů BCA byly prováděny standardními postupy nebo podle návodů výrobců. Pokud není uvedeno jinak, použité chemikálie byly získány od firem Merck (Darmstadt) , Sigma (Mnichov) nebo Riedel de Haen (Seelze) .

Příklad 1

Syntéza peptidů

Syntéza peptidů na pevné ' fázi probíhala na peptidovém syntetizátoru ABI 433, se 148 mg (0,1 mmol) pryskyřice FMOC-PAM s amidovou kotvou. Po skončení syntézy byl patrný přírůstek hmotnosti pryskyřice na 513 mg. Pryskyřice pak byla 2 hodiny promývána roztokem z 10 ml kyseliny trifluoroctové a 365 pil trietylsilanu při-teplotě místnosti. Po odfiltrování zbytků pryskyřice rotoval roztok ve vakuu, precipitoval se 50 ml 10% kyseliny octové (AcOH) a byl lyofilizován. Získalo se tak 145 mg (54% výtěžek) surového peptidu. Surový peptid se poté rozpustil ve 3 ml 80% AcOH a tento roztok se přikapával k.rychle míchanému roztoku obsahujícímu 0,006 mmol jódu a 0, 006 mmol octanu sodného v 55 ml 80% AcOH. „Po 5 • ·· · • ·· minutách byla reakce ukončena přidáním 0,1 N roztoku kyseliny askorbové. Roztok byl pak zahuštěn na objem 2 ml a nanesen na kolonu s náplní Sephadex® G25 aktivovanou 0, IM AcOH. Izolovaný peptid byl pak chromatograficky dokonale purifikován pomocí HPLC s reverzní fází.

Výtěžek: 36 mg peptidu DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCCDR-NH₂ (13,5% teoretického).

Struktura byla potvrzena hmotnostní spektroskopií (molekulová hmotnost 2673 Da) a analýzou aminokyselin.

Analogickým způsobem byl připraven také peptid

DNIDPNAVGNL-NH₂.'

Výtěžek: -268 mg peptidu (67% teoretického), molekulová hmotnost 1140 Da.

Příklad 2 ,

Navázání peptidu na ovalbumin mg ovalbuminu (Sigma A-2512) bylo rozpuštěno v 1 ml fosfátového pufru, pH 7,4 a přidalo se 200 pil vodného roztoku ze 7 mg sodné soli N-hyroxysulfosukcinátu (Fluka 56485) a 300 μΐ vodného roztoku ze 100 mg í-etyl-3-(3diaminópropyl)-karbodiimid-HCl (Sigma E-6383). Po 5 minutách byl přidán roztok' peptidu (30 mg odpovídajícího peptidu v 1 ml lOmM Na-fosfátového pufru, pH 7,4) . Konjugačni reakce probíhala 16 hodin při teplotě místnosti v temnu. Po této době se roztok . odstředil, aby se odstranil zákal. Nezreagované chemikálie a soli byly odstraněny chromatograficky na koloně NAP-25 (Pharmacia). Konjugat ovalbumin-peptid se tím převedl do PBS+0,04% Tween 20. Výtěžek byl 50 až 55' mg konjugátu.

····

Konjugát-1:

ovalbumin-DNIDPNAVGNL

Konjugát-2:

ovalbumin-DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR (forma S S-S můstkem)

Příklad 3

Imunizace králíků

Králíci smíšeného původu o hmotnosti asi 3 kg byly imunizováni konjugátem ovalbumin-peptid. Pro tento účel byl rozpuštěn 1 mg odpovídajícího konjugátu v 0,5 ml fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) a pak doplněn stejným objemem Freundovva adjuvans a pečlivě emulgován. 1 ml takto získané emulze byl injikován intradermálně králíkům, a sice po pětině objemu na pět různých míst v blízkosti lymfatických uzlin. Po 21 a 53 dnech byly aplikovány imunitní reakci zesilující injekce s poloviční koncentrací antigenové emulze (antigen byl emulgován pomocí Freundova adjuvans).

Příklad 4

Rozvoj titru protilátek u čtyř imunizovaných králíků

Rozvoj titru specifických protilátek byl u 4 zvířat podrobněji sledován enzymovým imunotestem pomocí mikrodestiček s jamkami potaženými lamininem Pl, popřípadě lamininem γΐ III-3-5. Odpovídající séra zvířat byla označena K2, K3, K4 a K905. Séra K3 a K4 byla získána po imunizace konjugátem 1, séra K2 a K905 po imunizaci konjugátem 2.

, U všech králíků se velmi rychle vyvinula imunitní reakce, ···· • · · · · · · · · · • · ·· ·· · ·· ·· • · · · * ft · ······ • · · · · · · ······ ·· · ·· «· která po 21 dnech (po první zesilující injekci) zůstala stálá, popřípadě se pomalu ale trvala zmenšovala. Nová stimulace po druhé zesilující injekci nebyla pozorována. Vytvářené protilátky reagovaly jak s lamininem Pl tak i s doménou γΐ III-3-5 lamininu. Vazba k lamininu Pl byla sice vyjádřena slaběji než k lamininu γΐ III-3-5, a ukázalo se, že proces imunitní reakce byl podroben značnému kolísání.

To může poukazovat na existenci více populací protilátek v polyklonálním séru, které se váží s různou afinitou k vazebnému motivu pro nidogen, popřípadě jeho konformaci v lamininu Pí a laminin γΐ III-3-5.

Příklad 5

Afinitní purifikace protilátek

Pro podrobnější charakterizaci byly specifické protilátky odděleny od zbývajících imunoglobulinů ve zvířecím séru, dalších složek séra a protilátek namířených proti ovalbuminu. Pro tento účel byla už.ita afinitní chromatograf ie s afinitní matricí s lamininem Pl. Jako nosič (gelová matrice) byl· užit Fractogel® EMD Azlacton 650 S (Merck, Darmstadt). 0,3 g tohoto materiálu se 15 minut před konjugací inkubovalo v 6 ml PBS, 1M Na₂SO₃, pH 7,4, a pak se slil nadbytečný roztok. Během inkubace nabobtnal materiál na objem 1 ml a matrice se tak mohla přímo použít ke kovalentnímu navázání požadovaného ligandů.'

3,4 g lidského lamininu Pl se rozpustilo ve 2 ml 0,2M uhličitanu amonného, pH 8,0, a inkubovalo se s 1 ml aktivovaného nosiče (viz výše) při 4 °C přes noc (>16 hodin). Nakonec byl gelový materiál propláchnut roztokem 0,2M uhličitanu amonného, pH 8,0. Zbývající aktivní skupiny nosičového materiálu se -blokovaly 24hodinovou inkubací s 5 ml ···· ···♦ • · · · • * · ···«· ·«· · · · 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9·· 99 9 ·'' 9 9 9 9

9 99 9 9 9 99 99 nm) průtokového Pak následovala

0,2M glycinu, pH 8,0, při 4 °C. Příprava matrice pro afinitní navázání byla ukončena' třemi promývacími cykly, sestávajícími ze střídavé inkubace v PBS, IM Na₂SO₃, pH 7,4, 0, IM octanu sodném, pH 4,0, a 0,2M glycinu, pH 8,0. Matrice byla naplněna do kolony HR 5/5 od firmy Pharmacia a ekvilibrována roztokem PBS/0,04% Tween 20.

Pro purifikaci protilátek vázajících laminin Pl ze l

zvířecího séra bylo sérum naředěno 1:2 PBS s 0,04% Twen 20 a nanášeno na kolonu rychlostí 2 ml/min. Poté se kolona promývala pufrem, dokud UV-signál (220 monitoru nedosáhl opět základní hodnoty, eluce navázaných protilátek, a .sice tak, že nanášecí pufr byl zaměněn za 0,lM glycin/HCl s pH 2,7.

Analýza roztoku protékajícího kolonou a také eluátu byla¹ provedena pomocí enzymového imunotestu s imobilizovaným lamininem yl ÍII-3-5.

Ze sér všech čtyř zvířat byly purifikovány protilátky výše popsaným způsobem afinitní purifíkace. Výtěžek byl v průměru 0,3 mg na 50 ml séra (v případě séra K2 byl výtěžek bohužel pouze 0,1 mg). Většina protilátek ve všech sérech (>80%) se však nevázala na laminin Pl, zřejmě vzhledem k pomalé vazebné kinetice nebo k mimořádné afinitě sekvencí peptidů použitých k imunizaci.'

Afinitní chromatografie na okoloně s lamininem Pl vedla k selektivnímu vyčištění stabilní a rychle se vážící varianty protilátky (hledané protilátky) ze séra.

Příklad 6

Vazebná specifičnost afinitně purifikovaných protilátek

Pomocí westernového přenosu bylo prokázáno, že afinitně purifikované protilátky si uchovávají. svou vazebnou ·· ·· · 4» ···· ·· ·* • · · · e · · · · · • · · · · · · ···· • · · · · · · ······ '«···· · · ······ ·♦ · · · · · specifičnost k lamininu PÍ a že různé preparáty silněji reaguji s neredukovaným lamininem PÍ než s lineárním fragmentem lamininu PÍ separovatelným diky redukci disulfidových můstků (Gerl, M et al., 1991, Eur. J. Biochem.

202: 167-174). To ukazuje na složku vazebné specifičnosti protilátky závislou na konformaci. Dále se ukázalo, že čtyři připravené protilátky se navzájem lišily svou vazebnou specifičností. Oba protilátkové preparáty K3 a K4 získané imunizací konjugátem 1 rozpoznávaly identické pásy lamininu PÍ po neredukujíci SDS(dodecylsulfát sodný) - gelové elektroforéze. Oba protilátkové preparáty K2 a K905 (tj. anti-konjugát 2) vykazovaly shodný reakční vzorec, avšak rozpoznávaly méně pásů lamininu PÍ než protilátkové preparáty anti-konjugát 1. Při imunochemickém testu s redukující SDSelekroforézou separovanými pásy lamininu Pi bylo zjevné, že jednotlivé protilátkové preparáty mají odlišné vazebné preference k fragmentům obsahujícím laminin γΐ III 4.

Příklad 7

Inhibiční test: Inhibice vazby laminin-nidogen afinitně purifikovanou protilátkou

Inhibiční aktivita afinitně purifkované protilátky se dá' identifikovat pomocí testu s potaženou zkumavkou (coated. tube assay), kdy se měří vazba radioaktivně značeného nidogenu na stěnu lamininem PÍ (z lidské placenty) potažené zkumavky v přítomnosti protilátek.

Radioaktivní značení nidogenu pomocí ¹²⁵jódu

Rekombinantně získaný lidský nidogen (35 μς, popis klonů, kultivačních a purifikačních podmínek - viz Meyer, U. et al., 1995, Eur. J. Biochem. 227: 681-686) byl rozpuštěn ve • · · · ···· ·· ·· • · · ·· · · · « · 9 9 99 9 9 9 9 99 9

999 99 9 999999

	19	9 9 999 999	9 9 9 9 99 9 .99
250	μΐ	PBS, a pak se přidalo 0,405	mCi ( =	15MBq)	roztoku Nal
(U5	I) (	= 1,55 μΐ, Nordion Europe),	10 μΐ	0,5M	Na-fosfátu,
pH	7,4,	a 40 μg chloraminu T (sodná sůl	amidu	N-chlor-4-
toluolsulfonové kyseliny, Merck) ve	100 μΐ	0,05M	Na-fosfátu,
pH	7,4.	Reakce probíhala 60 s při	teplotě	místnosti a byla

zastavena přidáním roztoku 40 μρ disiřičitanu sodného (Riedel de Haen) ve 100 μΐ 0,05M Na-fosfátu, pH 7,4. To proběhlo maximálně do 30 sekund, pak se přidalo 900 μΐ 1% BSA.(Sigma) v PBS. Oddělení volné radioaktivity a přebytečných solí probíhalo pomocí filtrační gelové chromatografie s kolonou PD 10 (Pharmacia). Eluovaný jodovaný nidogen v PBS byl sloučen a pak naředěn roztokem ·1%BSA/O, 05 Na-fosfát/0,01%NaAzid, pH 7,4, takže výsledná koncentrace byla 50 ng/ml.

Potažení reakčních zkumavek

Reakční zkumavky (Greiner, 75x12, č. 115061) byly potaženy pomocí roztoku s lamininem Pl, 4 μς/ηχΐ v uhličitanovém pufru (0,159 g Na₂CO₃, 0,293 NaHCO₃, 0,02g NaN₃ vil destilované vody) , 20 μg/ml BSA (hovězí sérový albumin, Serva) , pH 9,2, přes noc při 4°C. Volná vazebná místa byla pak blokována 2hodinovou inkubací s 0,5' ml 0,5% BSA v PBS/0,04% Tween 20.

Inhibiční test s lamininmimetickými strukturami (postupná inhibice)

V reakční zkumavce se pří teplotě místnosti třepalo 200 μΐ jodovaného nidogenu (10 ng, tj. asi 40000 cpm) a 200 μΐ inhibitoru (např. peptidu, který byl odvozen z domény yl III 4 lamininu) nebo standardu (laminin yl III-35). Jak inhibitor tak standard byly rozpuštěny v PBS/0,04% Tween 20. Po inkubaci probíhající 3 hodiny bylo 150 μΐ této směsí přeneseno do potažené zkumavky a inkubováno další • 99 9

9 9

9 9

9 9

9999 • 9 · 9 9 9 • 999 99 9 hodiny při teplotě místnosti. Pak byl roztok slit, zkumavka byla dvakrát propláchnuta 1 ml PBS/0,04% Tween 20 a navázaná radioaktivita (nidogen) se měřila na gamma-počítači. Množství navázaného nidogenu v roztoku s inhibitorem bylo srovnáno s nidogenem bez přidání inhibitoru.

Inhibiční test . s nidogenmimetickými strukturami (postupná inhibice)

V reakčních zkumavkách potažených lamininem PÍ se po hodiny třepalo 150 μΐ inhibitoru (tj. např. protilátka vázající se na doménu γΐ III 4 lamininu nebo peptid, který je odvozen ze sekvence nidogenu) nebo standardu (což je rekombinantní nidogen). Jak inhibitor tak standard byly rozpuštěny v PBS/0,04% Tween 20. Po odsátí vzorku se na 2 hodiny přidalo 150 μΐ jodovaného nidogenu, (10 ng, tj . asi 40 000 cpm), aby se vytěsnil navázaný inhibitor. Nakonec se roztok slil, zkumavka se dvakrát propláchla 1 ml PBS/0,.04% Tween 20 a navázaná radioaktivita (nidogen). se měřila na gamma-počítači. Množství navázaného radioaktivního nidogenu se srovnalo s inhibitorem, popřípadě koncentrací standardu.

Inhibiční test (simultánní inhibice)

Při této variantě testu se neprováděla žádná předběžná inkubace. V několika opakováních se 75 μΐ jodovaného nidogenu (10 ng) se 75 μΐ inhibitoru (nebo standardu) pipetovalo do potažené zkumavky a inkubovalo se 2 hodiny při teplotě místnosti, ostatní probíhalo analogicky variantě testu s postupnou inhibici.

Výsledky

Z 10 nezávisle provedených testů se standardem lamininem γΐ III-3-5 byla vypočtena, hodnota ICso% 0,22nM se směrodatnou

9999'

99

9999 odchylkou ± 15%. Hodnota IC₅o% je definována jako taková koncentrace látky, která je potřebná k dosažení 50% inhibice vazby nidogenu na laminin Pl. Testem 'popsaným v dokumentu' US 5 493 008 (rovnovážný inhibiční test) se získala odpovídající hodnota IC₅₀% 0,05 nM se směrodatnou odchylkou ± 52 %.

V tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty ICso% pro protilátkové preparáty. K3, K905, Kl.2, K2.2 a K3.2 a také pro různé volné peptidy. Protilátkové preparáty Kl.2, K2.2 a K3.2 pocházejí z druhé imunizace králíků novým konjugátem 2, a byly srovnatelným způsobem purifikovány. Výsledky dokládají reprodukovatelnost celého postupu.

Tabulka 2

Inhibice vazby laminin-nidogen protilátkami podle vynálezu

Inhibitor	K3	K905	Kl.2	K2.2	K3.2	Peptid(1)*	Peptid(2)*
	ic50%	ic50%	IC5O%	IC5O%	IC5O%	IC5O%'	ic50%
	nM	nM	nM	nM	nM	nM	nM
postupná** inhibice	72	150	' 500	80	350	60 000	20 000
s imultánni inhibice**	110	-	600	80	500	60 000	20 000

* aminokyselinová sekvence viz tab. 1 ** typ testu 'V dokumentu US 5 493 008 byly pro inhibiční peptidy, odvozené z vazebné domény pro nidogen, uvedeny, hodnoty ICso% mezi 22 nM a 1000 nM. Tyto hodnoty nemohly být vybraným testem dosaženy, vzhledem k drasticky zkrácené inkubační • ···· • · · · · • ··· te · · • · · · · · • · · · · ··· ··· ·· · ·· tetetec době, peptid DNIDPNAVGNL měl ve zde popsaném testu hodnotu IC_£Ú% 60 000 nM.

Příklad 8

Charakterizace vazebné kinetiky pomocí systému BIAcore®

Pomocí systému BIAcore® firmy Pharmacia Biosensor je možné sledovat biospecifické interakce v režimu on-line. Princip měření spočívá v optickém -jevu (povrchová plazmonová rezonance), který je ovlivňován hmotou navázanou na zlatém filmu. Zjednodušeně řečeno se jedná o miniaturizovanou afinitní chromatografií na povrchu zlatého senzoru. Množství specificky navázaného ligandu je možné zobrazit ve formě rezonančního signálu (Chaiken, I. et al., 1992, Anal. Biochem. 201: 197-201, Karlsson, R. et al., 1992, in: Structure of Antigens, (ed. van Regenmortel), s. 127-148, CRC Press, Boča Raton, Fl) . Laminin PÍ byl imobilizován podle pokynů výrobce imobilizován na senzorový čip v koncentraci 200 ^ig/ml v 10 mM Na-ačetátu, pH 4,0. Vznikla tak matrice se 4000 RU vázaného lamininu PÍ. Pro regeneraci afinitní matrice se může provést dvojitý impulz po 4 μιΐ lOOmM HCl.

Při průtoku 2 μΐ/rnin v pufru HBS. (10 mM HEPES, 3,4mM EDTA, 150mM NaCl, 0,005% BIA-surfaktant P20, pH 7,4) se nidogen (20 pig/ml) vázal na laminin PÍ s parabolickou saturační kinetikou a afinitně purifikované protilátkové preparáty K905 a K3 s lineární závislostí na antigenu. Příčinou toho, že ani po 1400 vteřinách nebyl pozorován žádný přechod k rovnovážnému stavu, může být fakt, že specifická sekvence lamininu Pl, která je zodpovědná za vazbu nidogenu, byla dobře přístupná pro protilátky. Protilátka se vázala na tuto sekvenci nezávisle na tom, zda byla v biologicky aktivní konformaci nebo v jiné konformaci. Dokladem toho je • ···

9 · · • 9 99 · · • · 9 9 '9 • · · ·

999 99 *9 999**

99 • 9 · · · • 9 9 9 9 • 9 999 999 • 9 9 • 9 9 99 pozorování, že nidogen již po navázání 600 RU vykazoval zřetelný přechod do saturační fáze. Zřejmě také ne všechny imobilizované molekuly lamininu Pl mají struktururozpoznatelnou nidogenem, takže teoretická saturační hodnota odpovídající hladině 2500 RU nebude dosažena. Ale přesto jí obě protilátky dosáhly při delším kontaktním čase. Nápadné bylo, že vzorek K905 musel být použit v desetkrát vyšší koncentraci (320 μg/ml) než K3 (33 pig/ml) pro dosažení stejné vazebné rychlosti. Vazba K905 k lamininu Pl byla naproti tomu stabilnější než K3, neboť disociační rychlost K905 (určitelná z doby výměny HBS pufru: 1500 vteřin) byla podstatně pomalejší než u preparátu K3. ,

Tato zjištění vysvětlují rozdíly mezi K3 a K905 zjištěné v inhibičních testech:

• Protilátkový -preparát K3 inhibuje vazbu laminin-nidogen lépe než K905, neboť je charakterizován rychlejší asociační kinetikou.

• Protilátkový preparát K3 inhibuje i tehdy, je-li simultánně inkubován s nidogenem ve zkumavce potažené lamininem Pl, neboť má při koncentraci srovnatelné s koncentrací nidogenu dobrou asociační kinetiku.

• Protilátkový preparát K905 inhibuje pouze při variantě testu s postupnou inhibici, neboť je charakterizován pomalejší disociační rychlostí a proto již dále není možné ho později přidaným nidogenem dobře vytěsnit. Při současné konkurenci o vazebná místa preparát K905 vzhledem k jeho pomalejší asociační kinetice, podlehne nidogenu.

·· ·· • · · · · • · · · · • · «·· ··· • · · • ·· ·· * ···· • 9 9 9 · • ··· * · • · · · · • · · · «····· »· • 4 ···<»

Příklad 9

Průkaz vazebné specifičnosti ,afinitně purifikovaných proti látkových preparátů K3 a K905 pomocí westernového přenosu

Při analýze westernovými přenosem se zkoumala interakce protilátkových preparátů K3 a K905 s konjugátem-2 a ovalbumínem. Antigeny byly elektroforetičky rozděleny pomocí 4 až 12% gelu NuPAGE™ (Novex™, San Diego, CA) s pufrem MOPS podle pokynů výrobce (Novex™) a pak pomocí přenosového pufru NuPAGE™ (Novex™) přeneseny na nitrocelulózovou membránu.. Po zablokování volných vazebných míst na membráně pomocí 1 Lig/ml polyvinylalkoholu (1 minuta) byly inkubovány antigeny s testovanými protilátkami. Průkaz navázaných protilátek se pak provedl pomocí anti-králičí protilátky IgG, na kterou byla kovalentně navázána alkalická fosfatáza.

Ukázalo se, že afinitně purifikované protilátky se váží výlučně na peptid, zatímco interakce s nosičovým proteinem ovalbumínem nebyla prokazatelná. Nebyla pozorovánataké žádná interakce s modře obarveným markerovým See Blue standardem (Novex™).

Dále bylo prokázáno, že jak K3 tak K905 reagují s lamininem a deriváty lamininu z různých biologických druhů (laminin z lidské placenty, laminin ze žloutkověho vaku krysy (Calbiochem), laminin Pl z lidské placenty, laminin z nádoru EHS myši, rekombinantně připravený myší laminin γΐ HI-3-5) . To je důsledkem vazby protilátky na konzervativní sekvenci uvnitř vazebné domény pro nidogen. Žádný z protilátkových preparátů nevykazoval křížovou reaktivitu s lidským nidogenem ani lidským kolagenem typu IV. To je- předpokladem pro využití protilátek podle předkládaného vynálezu jako antagonistů nidogenu.

• 0 · •00 00· •Příklad 10

Příprava monoklonálních protilátek

Pro přípravu monoklonálních protilátek byly vybraní obratlovci, výhodně myši nebo krysy, standardním způsobem imunizováni např. lamininem, lamininem Pl, lamininem γΐ III3-5, laminin yl III 4 nebo konjugáty uvedenými v příkladu 2. V případě specifické imunitní reakce antiséra byly pak standardním· způsobem získány hybridomy produkující monoklonální protilátky (MAK.) .

Screening požadovaných protilátek, popřípadě odpovídajících hybridomových klonů, byl prováděn kromě jiného vazebným testem (např. tečkový test dot blot nebo westernový přenos s lamininem yl III-3-5 nebo lamininem yl III 4), a především pomocí inhibičních testů popsaných v příkladu 7. Takto vybrané klony představují, zdroj pro syntézu velkých množství protilátek podle předkládaného vynálezu.

Pro čištění požadovaných, protilátek je možné užít obvyklých metod jako je např. navázání na protein G nebo protein A. Výhodné je užití afinitní chromatografie s kolonou s lamininem Pl. ' Tento purifikační krok dovoluje, jako v případě výše popsaných polyklonálních protilátek, výběr a selektivní obohacení monoklonálních protilátek s nej lepšími vazebnou konstantou.

Příkladem protilátky podle předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka (MAK), která je produkována buněčným klonem A6/2/4, který byl jako položka č. DSMACC 2327 uložen 27. října 1997 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur, s.r.o. (DSMZ, Marscheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Německo) v souladu s Budapešťskou smlouvou.

Tento hybridom pochází z imunizace myši lamininem Pl, který byl izolován z lidské placenty. Purifikace antigenu

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 · 4 · 4 · • · 4 4 4.4 .4

4 44 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 *4 4 4

6 a příprava hybridomu jsou popsány v dokumentu EP 0 696 597 A2. Protilátka A6/2/4. byla identifikována na základě vazebných vlastností s lamininem γΐ III-3-5 a lamininem γΐ III 4. Jedná se o monoklonální protilátku subtypu IgM, která může být purifikována pomocí gelové chromatografie. Vazba této protilátky k lamininu PÍ je vzhledem ke stanovené polyvalenci mimořádně silná. Z tohoto důvodu a také vzhledem k velikosti protilátek typu IgM není možné dosáhnout eluce z afinitní kolony s lamininem Pl. Silná vazba na laminin Pl se také odráží v ínhibičním testu (simultánní varianta). Monoklonální protilátka A6/2/4 je schopna inhibovat asociaci laminin-nidogen s hodnotou IC₅₀ 30 nM.

Vzhledem k výrazné konformační závislosti vazby není možné vazebný epitop v doméně lamininu γΐ III 4 (vazebná doména lamininu pro nidogen) zřetelně vymezit. Fakt, že peptidy, které jsou odvozeny z vazebné sekvence lamininu pro nidogen, potlačují částečně vzájemné působení protilátek s lamininem Pl .(75 až 80%), znamená totiž, že vazebný epitop protilátky A6/2/4 se překrývá s nidogenem.

V následující části se popisuje příprava inhibičních monoklonálních protilátek, které byly podobně jako výše popsané polyklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, připraveny pomocí konjugátů peptid-ovalbumin.

Myši kmene SJL/J byly imunizovány subkutánní injekcí 50 ug konjugátu peptid 2-ovalbumin (konjugát 2, viz výše) v přítomnosti Freundova kompletního adjuvans. Po 4 a 8 týdnech byla imunitní reakce zesílena další subkutánní injekcí 25 ug konjugátu 2 s kompletním Freundovým adjuvans a pak se čekalo 7 týdnů. Tři dny před fúzí byla imunitní • · » ·

I 9

9 • · · · odpověď ještě zesílena intraperitoneální injekcí dalších μς konjugátu 2.

Pro fúzi byly myši usmrceny a byla odebrány buňky ze sleziny. V přítomnosti polyetylénglykolu byly buňky fúzovány s buněčnou myelomovou linií P3X63AG8.653 . Kultivací fúzní směsi v médiu s hypoxantinem, aminopetrinem a thymidinem po dobu , 3 týdnů se selektovaly hybridy (slezinné buňky x P3X63AG8.653) . Aby se získala stabilní linie, byly vybrané buněčné klony několikrát subklonovány. Vzniklé buněčné kolonie byly testovány ' pomocí různých vazebných imunologických testů, zda produkují protilátky. Vzniklé buněčné linie E79/1/6 a E82/1/10 byly vybrány na základě dále popsané strategie screeningu.

Testy sloužící k charakterizaci a identifikaci specifických monoklonálních protilátek

Imunizace myší kmene SJL/J konjugátem 2 vedla ke vzniku mimořádně velkého počtu hybridomových klonů produkujících protilátky. Protilátky z kultivačního média vykazovaly silnou imunitní reakci s lamininem γΐ III-3-5, 'lamininem PÍ a ovalbuminem. ,

Aby se našly klony, které produkují monoklonální protilátky proti nidogenu s nativní strukturou vazebné domény pro nidogen, musel se provést vhodný screening. Hlavním zřetelem této metody je zaměření na vazbu protilátky na laminin PÍ a laminin γΐ III-3-5. Současně, se vzhledem k subklonování musí dbát na to, aby reakce s nosičovým proteinem, ovalbuminenm, byla zanedbatelná a protilátky výlučně rozpoznávající ovalbumin se odstraní.

V tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny výsledky, kterých bylo dosaženo se dvěma takto identifikovanými klony (E79 a E82).

• ·· ·

Tabulka 3

Stanovení vazby E79 testem ELISA

	Potažení lamininem yl 111-3-5.: 2,5 pg/ml	Potažení lamininem Pl: 2,0 pg/ml	Potažení ovalbuminem 20 pg/ml
Hybridom E79, nezředěné kultivační médium	1,33	0, 68	1,63
E79/1/6, 1.klonování nezředěné kultivační médium	2, 03	0,16	0,27
E79/1/6 purifikovaná protilátka 2,5 pg/ml	0,56	0,33	0, 05

Tabulka 4

Stanovení vazby E82 testem ELISA

	Potažení lamininem yl III-3-5: 2,5 pg/ml	Potažení lamininem Pl: 2,0 pg/ml	Potažení ovalbuminem 20 pg/ml
Hybridom E82, nezředěné kultivační médium	1,77	1, 48	2,33
E82/1/10, 1.klonování nezředěné kultivační médium	1,32	0,26	0, 05
E79/1/6 purifikovaná protilátka 6,4 pg/ml	1,55	0, 5	0, 18

Klonováním buněk se zřejmě podařilo Oddělit buňky, které vykazovaly imunitní reakci s ovalbuminem. Současně mohl být izolován buněčný klon, který produkuje protilátku, která vykazuje vazbu s lamininem γΐ III-3-5 a lamininem Pl. Tato • · ► » » * • · · · · · · · • · · skutečnost, a také skutečnost, že byla úspěšná imunizace peptidem, který byl odvozen z vazebné domény lamininu pro nidogen, dokládá, že vzniklá protilátka se váže na lamininový vazebný motiv pro nidogen s nativní strukturou.

Přímý důkaz vazebné specifičnosti poskytla simultánní varianta inhibičního testu (viz výše), kde si připravené protilátky přímo konkurují s jodovaným nidogenem o vazbu k vazebnému motivu pro nidogen intaktního lamininu (laminin z myšího EHS nádoru, Chemicon, č. CC095). Protilátka (subtyp IgG2a) produkovaná buněčným klonem E79/1/6 inhibuje asociaci laminin-nidogen s hodnotou ICso 19 nM, protilátka (subtyp IgGl) produkovaná buněčným klonem E82/1/10 inhibuje asociaci laminin-nidogen s hodnotou ICso 190 nM.

Claims (39)

1. Protilátka, která se váže na vazebnou doménu pro nidogen γΐ III-4 lamininu, nebo část takové protilátky.

2. Protilátka nebo její část podle nároku 1, která se váže na vysoce konzervativní úsek smyčky a, popřípadě smyček a a c, vazebné domény lamininu γΐ III-4 pro nidogen nebo v bezprostřední blízkosti této smyčky.

3. Protilátka nebo její část podle nároku 2, která ' se, s ohledem na epitop, v závislosti na konformaci váže přímo nebo překrývajícím způsobem na vysoce konzervativní úsek smyčky a, popřípadě smyček a a c.

4. Protilátka nebo její část podle jednoho nebo několika předchozích nároků 1 až 3, která se váže alespoň ne jeden z peptidů uvedených v tabulce 1.

5. Protilátka podle jednoho nebo několika předchozích nároků 1 až 4, která je polyklonální protilátka.

6. Protilátka podle jednoho nebo několika předchozích nároků 1 až 4', která je monoklonální protilátka.

7. Protilátka podle nároku 6, která je chimérická, humanizovaná,' bi- nebo oligospecifická protilátka.

8. Protilátka podle jednoho nebo několika předchozích nároků 1 až 7, která kompetitivně nebo částečně kompetitivně inhibuje vazbu laminin-nidogen.

0 0 0 0 •00 000

9. , Protilátka, která se získá tak, že se imunizuje imunokompetentní obratlovec lamininem nebo lamininem Pl o jakožto imunizačním antigenem, a pak se protilátka identifikuje pomocí lamininu γΐ III-3-5 a/nebo lamininu γΐ III-4 a testuje se na kompetitivní nebo částečně kompetitívní inhibici vazby laminin-nidogen.

10. Protilátka, , která se získá tak, že se· imunizuje imunokompetentní obratlovec lamininem γΐ III-3-5 jakožto imunizačním antigenem, á pak se protilátka identifikuje pomocí lamininu a/nebo lamininu Pl a testuje- se na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

11. Protilátka, která se získá tak, že se imunizuje imunokompetentní obratlovec imunizačním antigenem, kterým je laminin γΐ III-4 a/nebo peptidy, které obsahují podstatnou část nidogenového vazebného místa, ale nikoliv celou aminokyselinovou sekvenci domény γΐ III-4 lamininu.

12. Protilátka podle nároku - 11, která se získá tak, že se použije jako imunizační antigen laminin γΐ III-4..

13. Protilátka podle nároku 11, která se získá tak, že se použije jako imunizační antigen buďto jeden nebo oba peptidy uvedené v tabulce 1.

14. Protilátka podle, jednoho nebo několika nároků 11 až 13, která je identifikována pomocí lamininu a/nebo lamininu Pl.

4 4 4· • 44 • · 4 · · 4 4

4 4 4 4 4 4 4

444 4 4 β 444 444

4 4 4 4 · · · ······ ·4 4 «· ··

15. Protilátka podle jednoho nebo několika nároků 11 až 14, která byla otestována na kompetitivní nebo . částečně kompetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

16. Protilátka podle kteréhokoliv z nároků 9 až 15, která je produkována hybridomovými buňkami tvořícími monoklonální protilátku.

17. Protilátka podle kteréhokoliv z nároků 9 až 16, která je získána přečištěním materiálu obsahujícího protilátku pomocí afinitní chromatografie.

18. Protilátka podle nároku 17, kde se provede afinitní chromatografie na matrici.lamininu nebo lamininu Pl..

19. Buňka nebo buněčná linie, která produkuje protilátku podle jednoho, nebo několika nároků 1 až 8 nebo část této protilátky.

20. Hybridom DSMACC2327.

21. Protilátka, která je produkována hybridomem DSMACC2327.

22. Způsob výroby protilátky podle kteréhokoliv nároku 1 až 8 vyznačující setím, že se imunokompetentní obratlovec imunizuje lamininem nebo lamininem Pl, protilátka se identifikuje pomocí lamininu yl III-3-5 a/nebo lamininu γΐ III-4, a pak se testuje na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici. vazby laminin-nidogen.

···· • · « · • · ♦ · * · · « · · « · ·· ·· · 4 · 4 · • 4 · · · 4 · ···««· • · · · · 4 · !·»«<· »· · 4 4 44

23. Způsob výroby protilátky podle kteréhokoliv nároku 1 až 8 vyznačující s ,e tím, že se imunokompetentní obratlovec imunizuje lamininem γΐ III-3-5, protilátka se identifikuje pomocí lamininu a/nebo .lamininu Pl, a pak se testuje na kompetitivní nebo částečně kompetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

24. Způsob výroby protilátky podle kteréhokoliv nároku 1 až 8 vyznačující se tím, že se imunokompetentní obratlovec imunizuje lamininem γΐ III-4 a/nebo peptidy, které obsahují podstatnou část nidogenového vazebného místa, ale nikoliv celou aminokyselinovou sekvenci domény γΐ III 4 lamininu.

25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že se jako imunizační antigen použije laminin γΐ III-4.

26. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že se jako imunizační antigen použije buďto jeden nebo oba peptidy uvedené v tabulce 1.

27. Způsob podle nároku 26 v y. znač'uj ící se tím, že imunizační antigen se naváže na nosič.

28. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 24 až 27 vyznačující se tím, že se protilátka identifikuje pomocí lamininu a/nebo lamininu Pl.

29. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 24 až 28 vyznačující se tím, že se protilátka testuje na kompetitivní nebo částečně koiipetitivní inhibici vazby laminin-nidogen.

ft · · · · · • ft·

3 4 ' • · · · · ······ · · · « 30. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 22 až 2 9 vyznačuj ící s e tím, že se připraví hybridomové buňky produkující monoklonální protilátku. 31. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 22 až 30 vyznačující s e tím, že se protilátka vyčistí z' materiálu obsahuj ícího protilátku pomocí afinitní chromatografíe • 32. Způsob podle nároku 31 v y z n a č u j ící se tím, že se provede afinitní chromatografíe na afinitní matrici

lamininu a/nebo lamininu Pl.

33. Protilátka nebo její část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 nebo 21 pro použití jako lék.

34. Lék vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo několik protilátek nebo jejich částí podle alespoň jednoho z nároků 1 až 18 a 21.

35. Použití jedné nebo několika protilátek nebo jejich částí podle alespoň jednoho z nároků 1 až 18 a 21 pro výrobu léku pro léčení nemocí, které jsou charakteristické zvýšenou nebo nežádoucí syntézou bazální membrány.

36. Použití podle nároku 35, kdy nemoc je forma pozdních komplikací při diabetů, doprovázená ztluštěním bazální membrány, forma arteriosklerózy, fibróza nebo nemoc, při které ke zhoršení klinického obrazu přispívá angiogeneze.

• · · · · · • flflflfl • · · fl • flflfl · • flflfl • flfl • flfl flflfl flfl flfl • flflfl • flfl · • flfl flflfl • ·

37. Použití podle nároku 35 nebo 36 pro výrobu léku pro léčení diabetické retinopatie, alkoholické jaterní fibrózy, plicní fibrózy, rakoviny, diabetické nefropatie nebo onemocnění se silnou zánětlivou složkou jako je např. revmatoidní artritida, ost.eoartritida,. vaskulitida, hemangiom a psoriáza.

38. Protilátka nebo její část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 nebo 21 pro použití jako diagnostický prostředek.

39. Diagnostický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo několik protilátek nebo jejich části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 a 21.

40. Použití jedné nebo několika. protilátek nebo jejich částí podle alespoň jednoho nároku 1 až 18 a 21 pro výrobu diagnostického prostředku k prokázání isoforem lamínínu obsahujících γΐ v biologických vzorcích, tělních tekutinách nebo tkáních.

41. Použití jedné nebo několika protilátek nebo jejich částí podle alespoň jednoho nároku 1 až 18 a 21 jako pomocného prostředku v biologických a farmakologických modelech pro vývoj a· vyhodnocování látek ovlivňujících interakci laminin-nidogen.

42. Použití podle nároku 41 v biologickém nebo farmakologickém modelu pro vývoj a vyhodnocování látek ovlivňujících interakci laminin-nidogen.