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WO1998049274A1 - Adn polymerase thermostable et inteines de l'espece thermococcus fumicolans - Google Patents

Adn polymerase thermostable et inteines de l'espece thermococcus fumicolans Download PDF

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Publication number
WO1998049274A1
WO1998049274A1 PCT/FR1997/000761 FR9700761W WO9849274A1 WO 1998049274 A1 WO1998049274 A1 WO 1998049274A1 FR 9700761 W FR9700761 W FR 9700761W WO 9849274 A1 WO9849274 A1 WO 9849274A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glu
lys
leu
val
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1997/000761
Other languages
English (en)
Inventor
Joël QUERELLOU
Marie-Anne Cambon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
APPLIGENE-ONCOR
Original Assignee
APPLIGENE-ONCOR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by APPLIGENE-ONCOR filed Critical APPLIGENE-ONCOR
Priority to PCT/FR1997/000761 priority Critical patent/WO1998049274A1/fr
Priority to PCT/FR1998/000868 priority patent/WO1998049275A2/fr
Publication of WO1998049274A1 publication Critical patent/WO1998049274A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a new thermostable DNA polymerase and its two inteins, originating from an archaebacterium of the species Thermococcus fumicolans.
  • DNA polymerases are enzymes involved in the replication and repair of DNA in any living cell. Many DNA polymerases isolated from microorganisms such as E. coli are known today.
  • DNA polymerase I DNA polymerase I
  • phage T4 DNA polymerases have also been identified and purified and from thermophilic microorganisms such as Thermus aqua ticus (Taq polymerase, Chien, A. et a. J. Bact. 1976,
  • Thermus thermophilus or species of the genus Bacillus (European patent application published under No. 699 760), Thermococcus (European patent application No. 455 430), Sulfolobus and Pyrococcus (patent application
  • DNA polymerases The mechanism of action of DNA polymerases is relatively well known today and consists of replication of DNA identically according to a semi-conservative mode. The copied strand serves as a matrix and the four nucleotide triphosphates are the substrate for this polymerization. Enzymes with DNA polymerase activity are increasingly used today in vitro to work in molecular biology for various purposes such as cloning, error detection,
  • This amplification, in vi tro, of deoxyribonucleic acid sequences calls upon the technique of the polymerase chain reaction (PCR) described in European patents Nos. 200 362 and 201 184.
  • the principle of this technique is based on the carrying out successive cycles of extension of primers using the four nucleotide triphosphates as well as a DNA polymerase and a template DNA to be copied.
  • the enzyme doubles the number of DNA strands available and between each cycle thermodenaturation is necessary in order to open the DNA double helix for the next cycle.
  • the temperatures used for this thermodenaturation step are not compatible with the conservation of the activity of most of the known DNA polymerases, such as Klenow.
  • thermophilic microorganisms are known today, it still remains difficult to obtain these thermostable enzymes with sufficient production yields.
  • Molecular biology and genetic engineering overcome this drawback.
  • the gene coding for DNA polymerase is cloned, sequenced and then recloned in an expression vector in order to produce the so-called recombinant protein, in a mesophilic host which is easier to cultivate such as E. coli or S. cerevisiae.
  • This expression method in E. coli has in particular been described in the international patent application PCT published under No. WO 89/06691 for producing DNA polymerase from Thermus aquaticus.
  • the DNA polymerase of the invention comes from an archaebacterium of the species Thermococcus fumicolans. In addition to its thermostable properties making it particularly effective in particular in a PCR process, this DNA
  • ISAEP polymerase is remarkable in that it has two "protein introns”, also called “inteins”, at the level of its precursor polypeptide.
  • the nucleotide sequence of its inteins is inserted into that of DNA polymerase, generally at the level of conserved sites involved, after translation, in catalytic reactions. These sequences are transcribed and translated at the same time as that of DNA polymerase and the autocatalytic splicing of the inteins then produces three enzymes: two inteins and one DNA polymerase.
  • inteins are also found in other molecules such as vacuolar ATPase in S. cerevisiae (4), GyrA in Mycobacterium leprae (7), Rec A in Mycobacterium tuberculosis (5, 6).
  • the inteins belong for the most part to the family of endonucleases of the "homing endonucleases” type since they cut DNA at a recognized site, at the very place where their nucleotide sequence is inserted.
  • the development of biotechnologies both in research and in the fields of medicine or agri-food requires having various types of DNA polymerases capable of improving quantitatively and qualitatively techniques as diverse as cloning, detection , amplification of DNA sequences.
  • the present invention aims precisely to offer a new thermostable DNA polymerase which is derived from a recently described species: Thermococcus fumi colans (8).
  • This isolate was isolated from fragments of chimneys taken in the North Fidgian basin during the Franco-Japanese STARMER campaign in 1989.
  • This species strict anaerobic, has an optimal growth temperature of 90 ° C, which is relatively high for a Thermococcus. Its optimum pH is 8.8, and its salinity level from 20 g / 1 to 40 g / 1.
  • the subject of the invention is therefore a purified thermostable DNA polymerase of archaebacteria of
  • the invention therefore relates to purified thermostable DNA polymerase of archaebacteria of the species Thermococcus fumicolans having a molecular weight of the order of 89,000 daltons as well as its enzymatically equivalent derivatives.
  • the term “enzymatically equivalent derivatives” is understood to mean the polypeptides and proteins constituted by or comprising the amino acid sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2 as soon as they exhibit the properties of the DNA polymerase of Thermococcus fumi col ans.
  • the invention more particularly contemplates a DNA polymerase, the amino acid sequence of which is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof or an assembly of such fragments, such as the 774 amino acid sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2.
  • derivatives is also understood to mean the amino acid sequences modified above by insertion and / or deletion and / or substitution of one or more amino acids, provided that the properties of the DNA polymerase of T. fumicolans which result therefrom are not significantly changed.
  • the invention also relates to a DNA sequence consisting of or comprising the sequence coding for a DNA polymerase of the invention.
  • the DNA sequence represented in the annexed sequence list under the number SED ID NO: 1 represents such a sequence.
  • the DNA coding for the DNA polymerase of T. fumicolans and its two inteins consists of nucleotides 357 to 5028. Nucleotides 1 to 356 correspond to the promoter region of this gene. Consequently, the subject of the invention is a DNA sequence constituted by or comprising the sequence between nucleotides 357 to 5028 of SED ID NO: 1, or a fragment thereof, or an assembly of such fragmen s .
  • the invention relates more particularly to a DNA sequence constituted by or comprising nucleotides 357 to 1674 and 2755 to 3156 and 4324 to 5028 of the DNA sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SED ID NO : 1.
  • This sequence codes for the DNA polymerase of T. fumicolans whose sequence of 774 amino acids is represented in the sequence list in the appendix under the number SED ID NO: 2.
  • the invention relates as much to DNA polymerase isolated and purified from the Thermococcus fumicolans strain as to DNA polymerase prepared by chemical synthesis, for example by ligation of polypeptide fragments, or also by genetic engineering methods. Within the framework of these genetic engineering methods, the invention also relates to a vector comprising a DNA sequence defined above, as well as a process for the production or expression in a cellular host of the thermostable DNAs of the invention. .
  • a process for the production of a DNA polymerase according to the invention consists in:
  • the cell host used in the above methods can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and in particular from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells.
  • the vector used is chosen according to the host to which it will be transferred.
  • thermostable DNA polymerase of the invention is useful in particular in the methods of enzymatic amplification of nucleic acid sequences. Consequently, the subject of the invention is such methods using the thermostable DNA polymerase described above, as well as the amplification kits comprising, in addition to the reagents generally used, an adequate quantity of this DNA polymerase.
  • the invention also relates to a purified thermostable intein of archaebacteria of the species Thermococcus fumicolans.
  • the inteins are also defined as protein introns which are not spliced at the level of the messenger RNA but at the level
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP protein maturation. They therefore relate to a single gene translated and transcribed in a single step, and constitute by-products of the maturation of the protein encoded by this gene (Xu, MG, Comb, DG., Paulus H., Noren CJ, Shao Y ., Perler, F., 1994, Protein splicing: an analysis of the branched intermediate and its resolution by succinimidine formation. EMBO J. 13, 5517-5522.)
  • the inteins are restriction endonucleases which have the property of cutting DNA at the very place where their gene is inserted, and therefore they can be considered as selfish sequences.
  • the inteins have in their sequence all the information necessary for their own splicing since they splice in E. coli.
  • a first step in the formation of a linear intermediary which has an ester function is a first step in the formation of a linear intermediary which has an ester function.
  • This reaction is dependent on the pH and the local environment of this bond (nature of the amino acids).
  • This principle is used in cloning, expression or purification kits using inteins, because a change in the environment causes splicing or not. Indeed, it would be inhibited at pH 11 and activated at pH 7.5.
  • the third step consists in a cyclization of 1 asparagine releasing the intein.
  • the fourth step is the stabilization of the mature protein and the formation of a real peptide bond.
  • thermosensitive mutants making it possible to block splicing.
  • This possibility of controlling protein splicing by temperature can be used in cloning vectors with a sequence coding for the intein and around cloning sites. If the protein to be cloned and expressed is toxic to the host, it can be cloned into two fragments around the intein sequence. Thus, overall, the gene to be cloned is complete but it is interrupted by the sequence of the intein. During expression, the intein is found in the expressed protein, thus making it inactive. It is then possible by heating, at the end of the induction, to release the intein by autocatalytic splicing and thus find the cloned active protein.
  • the inteins thus make it possible to carry out purifications and are used in kits according to the principle described below. Certain residues around the intein splicing site are modified.
  • the expression of the recombinant protein is carried out at low temperature to block possible splicing too early.
  • At the C-terminal of the intein is fixed a site having a strong affinity for chitin.
  • the cloned protein is expressed as well as the intein and the chitin binding site.
  • the purification is then carried out with the chitin, on affinity columns, which retain the chitin and also the intein and the cloned protein, the whole being part of the same pre-protein.
  • the N-terminal end of the intein is then hydrolyzed with DTT or ⁇ -mercaptoethanol to release the cloned protein.
  • thermostable restriction endonucleases which have as a recognition site the very place where their gene is inserted in the "host” sequence. They have a twice repeated nucleic sequence (LAGLIDADG) in the protein,
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP more or less conserved sequence which corresponds to the active DNA recognition and cleavage site. These enzymes also seem to need g ++ for their activity. It should be noted that the two inteins of the invention are co-expressed in E. coli and are self-splicing. This means that they have no toxicity for the host, unlike one of the inteins of Thermococcus li toralis (9), and therefore their use in expression or purification kits is easy. .
  • a first intein sequence according to the invention is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 3.
  • This intein, called I-Tfu-1 has a molecular weight of 41,409 Da and a pi of 9.13, deduced from the 360 amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • a second intein sequence according to the invention is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 4.
  • This intein called I-Tfu-2, has a molecular weight of 44,765 Da and pi of 9 , 6, deduced from the 389 amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 4.
  • thermostable inteins of the invention are useful in particular in methods of restriction of nucleic acids and in the development of expression vectors making it possible to reduce the toxicity of the protein to be expressed by inserting one of the two sequences of inteins in the sequence of the protein to be expressed. This can be done without manipulation of the sequence of inteins if the cloning is carried out in E. coli, the expression techniques used having demonstrated their harmlessness for this host organism. Consequently, the subject of the invention is such processes using one or both of the two thermostable inteins described above, as well as the expression or purification kits containing one or the two sequences coding for said thermostable inteins.
  • the invention also relates to a DNA sequence consisting of or comprising the sequence coding for an intein of the invention.
  • nucleotides 1675 and 2754 in the sequence SED ID NO: 1 in the appendix This DNA sequence codes for the intein, the amino acid sequence of which is represented in the annexed sequence list under the number SED ID NO: 3.
  • the invention relates both to these thermostable inteins isolated and purified from the Thermococcus fumicolans strain as to inteins prepared by chemical synthesis, for example by ligation of polypeptide fragments, or also by genetic engineering methods.
  • the invention also relates to a vector comprising a DNA sequence defined above, as well as a process for the production or expression in a cellular host of DNA coding for the inteins of the invention. Such methods are identical to those reported previously for T DNA polymerase. fumicolans.
  • thermostable DNA of the invention RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP of the thermostable DNA of the invention, and referring to the accompanying drawings in which:
  • FIG. 1 shows the DNA-DNA hybridization of the genomic DNA of T. fumicolans digested with various restriction enzymes and hybridized with the probes GE23ClaI-HindIII and GE23XhoI-SalI.
  • FIG. 2 shows the cloning strategy, the gene structure of the DNA polymerase of T. fumiculans and the gene products.
  • FIG. 3 shows the results of purification of the recombinant polymerase of T. fumi colans after a heparin sepharose column, visualized by SDS-PAGE.
  • FIG. 4 represents the results of purification of the recombinant polymerase of T. fumiculans after a Blue column HTrap n ° 2, visualized by SDS-PAGE.
  • FIG. 5 shows the purification results of the recombinant polymerase of T. fumi col years after a phosphocellulose column, visualized by SDS-PAGE.
  • FIG. 6 represents the results of purification of the recombinant polymerase of T. fumicolans after a MonoQ column, visualized by SDS-PAGE.
  • FIG. 7 shows the PCR results with DNA polymerase from T. fumicolans with the exclusion fractions from the MonoQ column.
  • the strain Pyrococcus sp. GE 23 was isolated from chimneys of deep hydrothermal vents and was supplied by G Erauso (CNRS, Station Bitician de Roscoff, France).
  • the Thermococcus fumicolans strain was obtained from the Marine Microbiology laboratory of G. Barbier (IFREMER-DRV-VP-CMM) in Brest, France.
  • This strain, Thermococcus fumicolans was obtained by purification from fragments of hydrothermal vents collected in the North Fidgian basin during the Franco-Aponais campaign STARMER carried out in 1989 at 2000 meters depth.
  • Pyrococcus sp.GE23 was cultured at 85 ° C in 2216S medium (DIFCO) at a pH of 6.5.
  • Thermococcus fumi col ans described in 1996 (Godfroy et al.) Is cultivated under anaerobic conditions in a medium containing the following elements: peptone 2g / 1; yeast extracts 0.5 g / l; sea salt (Sigma) 30g / l; PIPES buffer 6.05g / l, elemental sulfur 10g / 1, rezasurin lmg / 1. The pH is adjusted to 8.5 with 5N sodium hydroxide at 20 ° C.
  • the Escherichia coli SURE strain (Stratagene, La Jolla, Calif.) was cultured in LB medium with the appropriate antibiotic (s), at 37 ° C. with stirring. This strain was used as a host to receive the primary constructs from the pUC 18 or pBluescript vectors.
  • the NovaBlue, BL21 (DE3) and BL21 (DE3) pLysS strains (Novagen, Madison, Wi.) Were cultured in 2xYT medium with the appropriate antibiotics at 37 ° C or 30 ° C. These strains were used as hosts for the expression plasmids.
  • Thermococcus fumicolans was isolated by the modified Charbonnier method (3).
  • the cells were resuspended in TE-Na IX buffer, then lysed at 40 ° C for three hours
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP with a mixture of 1% N-Lauryl-sarcosine, 1% sodium dodecyl sulfate and 0.4 mg / ml of proteinase K. After lysis, centrifugation at 5000 g for 10 minutes makes it possible to remove cellular debris.
  • the DNA is extracted by a treatment with Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol or PCI (25-24-1), then treated with RNAse at 5 ⁇ g / ml at 60 ° C for one hour. These steps are followed by two additional PCI extractions and a chlorophoric extraction.
  • the DNA is then precipitated with absolute ethanol at -20 ° C, then centrifuged, air dried and taken up in TE-1x buffer. The concentration and purity of this DNA are measured by spectrophotometry at 230, 260 and 280nm with a GeneQuantlI device (Pharmacia, Upsalla, Sweden).
  • the DNA was completely digested overnight at 37 ° C. by a series of restriction enzymes (BamHI, HindIII, EcoRI, EcoRV, PvuII, Sali , Xbal and Xhol) by simple and double digestions.
  • DNA fragments are fractionated on 0.8% agarose gel in TBE-1X and transferred in vacuo to a Hybond-N + nylon membrane (Amersham, UK). These membranes were hybridized with DNA probes prepared by PCR with specific primers selected from the DNA polymerase genes of P. furi osus, T. li toral is and Pyrococcus sp. GE23. These probes are previously marked with 32P by "random primmg" in accordance with the manufacturer's recommendations (Megaprime, Amersham, UK).
  • Tli I and Tli T covering respectively the regions delimited by base pairs 297 to 1768 and 4631 to 5378 respectively, as defined by Hodges et al. (9).
  • Pyrococcus sp GE23 probes were used, one containing the 5 'part of the gene (Clal-HindIII fragment
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP corresponding to sites pb 8 and pb 1353 of the coding section) and the other containing the terminal part of this same gene obtained by PCR (primers known as expression Ndel and Sali corresponding to sites pb -1 and pb 2318, then digestion by Xhol and Sali including the bases of Nos. 1879 to 2318). Positive fragments were identified by DNA-DNA hybridization (14). Only hybridizations with Pyrococcus sp. GE 23 provided positive signals at 55 ° C in less than 24 h of exposure. The probes from T. li toralis and P. furiosus gave no results, even at 50 ° C in a standard buffer without formamide.
  • HindIII fragments of 1.9 kb were selected, then prepared by appropriate digestion of 100 ⁇ g of genomic DNA, purified in dialysis bags from agarose gels, and precipitated with absolute ethanol after PCI extraction. The fragments were ligated into a dephosphorylated pUC 18 / HindIII.
  • the transformations of the host strains were carried out by electroporation (Gene Inc., Biorad).
  • the screening of the recombinant clones was carried out by selection with ampicillin, alpha-complementation on X-Gal-IPTG substrate then hybridization of colonies according to standard techniques (12). The temperature of the colony hybridizations was 55 ° C.
  • the plasmid DNA was isolated according to the method described by Birnboim and Doly (1), then purified by anion exchange chromatography in solid phase (Quiagen, Chatsworth, Calif.). The restriction fragments of the plasmids were purified on agarose gel by the GeneClean method (Bio 101, La Jolla, Calif.) For later cloning.
  • Thermococcus fumicolans 16S and 23S rRNA was amplified by PCR using the following primers:
  • the PCR product was cloned into the vector pUC18 for subsequent sequencing.
  • the DNA sequences were obtained by the chain termination method (13) using an Applied Biosyste s automatic DNA analysis system.
  • the two strands of the genes coding for DNA polymerase and the two inteins were sequenced using universal primers localized on vectors as well as internal primers.
  • the 16S rDNA sequence was carried out on both strands, after cloning (SureClone, Pharmacia, Uppsala, Sweeden), using the Hot-Tub kit (Amersham, UK.) In order to remove the compressions.
  • PCR was used to prepare the complete fragment of DNA polymerase and the two inteins in using primers containing the NdeI and BamHI restriction sites:
  • the reaction mixture contained GOLDSTAR DNA polymerase (Eurogentec, B), the Taq Extender enzyme (containing Pfag from Stratagene), the extension buffer with the four dNTPs (each at 0.2mM) and the primers Tfu Dir and Tfu Rev at 50 pmol in a volume of 50 ⁇ l final.
  • the amplification was carried out over 20 cycles: 1 min 94 ° C, 1 min at 54 ° C and 6 min at 72 ° C using a Stratagene 96-gradient thermocycler.
  • the PCR fragments were then digested with the enzymes NdeI and BamHI and then ligated to the same sites of the vector, thus restoring the initiation codon.
  • the construction thus obtained was named PARHS2TFU1.
  • This construction was sequenced at the junction sites to verify its integrity with respect to the genomic DNA sequence.
  • the expression tests were carried out according to the following protocol: selection of the recombinant clones in the E. coli Novablue strain, expression with the BL21 (DE3) pLysS strain in a 2xYT medium and induction for four hours at ImM of IPTG.
  • the first induction tests were carried out on 5 ml cultures, whether induced or not. Night precultures are carried out without an inductor and restarted in a fresh medium in the morning (to the tenth), until the optical density (measured at 600nm) is 0.6, then either induced for 4 hours, or not induced and stopped after 2, 4 or 14 hours. Four ml of cultures are then centrifuged at 4 ° C, 5000 rpm for 10 minutes. The pellet is then taken up in a lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2). The cells thus taken up are then lysed, either with triton X-100 1% v / v, or lysozyme at 1 mg / ml of
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP lysis and left on ice about 5 to 10 min.
  • the cells are then thermodenatured by an exposure of 20 min at 72 ° C. This largely destroys the cells of the mesophilic host without destroying the recombinant proteins.
  • the lysis product is then centrifuged for 20 min at 10 000 rpm at 4 ° C. The supernatant is recovered in order to test it in incorporation, in PCR or on gel.
  • the incorporations are carried out according to two techniques: - With tritiated thymidine as tracer.
  • the incorporation is carried out on activated calf thymus (SIGMA Aldrich, F) in the following reaction medium: Tris-HCl 50mM pH 8.8; DTT ImM; MgCl2 10 mM; KCl 10MM;
  • the active fractions thus recovered are dialyzed for 5 h against a buffer C: 10 mM Tris-Ci pH 7.5; 0.5 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM -mercaptoethanol; 0.2% Triton x100; 10% glycerol; 50 mM NaCl.
  • the products resulting from dialysis are successively loaded onto an affinity column for the proteins binding to DNA (Pharmacia, Blue HiTrap) and eluted in NaCl gradient with the same buffers as above.
  • the column is adjusted to 0.2 ml / min, the loading buffer A is composed of KP04 pH7 20mM, EDTA 0, lmM, DTT ImM, Glycerol 5%, Triton X-100 0.1% and the gradient (between 0% and 50% deB) is produced by KCl present in buffer B at 2M.
  • the second dialysis is carried out with the following buffer: K2HP04 pH 7.5, 10 lMM, K2PO4 lOmM, KCl 25 mM, DTT ImM, Triton X-100 0.1%, Glycerol 10%, for 1 hour.
  • the solution is then loaded onto a MonoQ column at 0.5 ml / min with a NaCl gradient of 0 to 20% (buffers used for heparin).
  • the 3 '-5' exonuclease assays are quantified by the release of P labeled nucleotides.
  • a first step makes it possible to carry out the labeling: the DNA of is digested with HindIII and then, the Klenow fragment copies the DNA from the free 3 '-OH ends, in a medium containing, in addition to the buffer, l DNA and the enzyme, 3 P dATP and 32 P dTTP, the dGTP and dCTP being cold. After one hour at 37 ° C, the four cold dNTPs are added in excess for half a hour. Kleno and dNTPs are removed by phenol extraction and precipitated with ethanol.
  • the exonuclease tests are carried out in solutions containing the enzyme buffers, 0.02 mg / ml of labeled DNA, and incubated overnight at 72 ° C, 80 ° C and 95 ° C. Different buffers containing MgCl2 or MnS04 are tested. The same test is carried out with the Wind as a positive control. 101 of reaction solution are then deposited on DE81 paper (Watmann), dried and then counted before and after washing (3 times 5 min with a2HP04, 1 time with water and then with 95% ethanol) using the technique from Cerenkov.
  • the labeling reaction uses the polynucleotide kinase to label the 5' substrate.
  • the Southern blot hybridization revealed fragments of two types: a HindIII-HindIII fragment of 1.9 kb and an Xhol-Xhol fragment of 5 kb. These two fragments were revealed only with the probe
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISAEP digested with Xhol. About 400 recombinants (E. Coli SURE) were screened with the Clal-HindIII probe. Of these 400 colonies, two gave a positive signal during hybridization. (n ° 9.26 and 12.79). The two clones were cultured in LB-Amp medium and their restriction profiles were identical, with an insert of 1.8 kb. The subsequent sequencing of one of these clones (designated 557MACa) and the sequence comparison (Megalign, DNASTAR program) have shown that it corresponds to the promoter region and to the first 1404 base pairs of a DNA gene. polymerase belonging to the family B (2).
  • fragment obtained by digestion of PCR product This fragment was cloned as before. About 200 recombinant clones were screened and four of them gave a positive signal. The four clones have an identical profile after digestion with the restriction enzyme HindIII. One of them, 557MACc, was sequenced and the sequence comparison demonstrated that it was the end of the DNA polymerase gene previously identified.
  • Thermococcus fumicolans is a new species of Thermococcales described by Godfroy et al (8).
  • the second is inserted at the base n ° 3157 and ends at 4323. It is also distributed between the clone 557MACb and 557MACC.
  • the coding section of the DNA polymerase gene therefore consists of three disjoint parts.
  • the first part of the gene, carried by 557MACa comprises the zone coding for the 3'-5 'exonuclease, where, after translation, the motif FDIET is recognized.
  • the second part, carried by 557MACb and the third part carried by 557MACC include the preserved sites SLYPSI, and YG.DTD.
  • the two insertion sequences are located on conserved areas of DNA polymerase, the first at the DFR / SLYPSII site such as I-KOD-1 of Pyrococcus sp. KOD1 and the second at the D / TDG site as T-I-Tli-1. l i toral i s.
  • I-Tfu-1 and I-Tfu-2 seem to represent two new "alleles” of "homing" archaebacterial endonucleases of classes A and C.
  • I-Tfu-1 is the third known allele of intein inserting into the A site of Archaea DNA polymerase, while I-Tfu-2 is the second of its class.
  • rTful00-2 clone Two other clones, also tested, are weakly inducible and express very little DNA polymerase. The rTful-1 and rTful00-2 clones are then tested in a 50 ml Erlenmeyer flask under the conditions described above. Only the inducible rTfulOO-2 clone has a constant volume expression of 50 ml. The rest of the work was therefore carried out on this clone.
  • the culture of the clone Tful00-2 was carried out in a 16 liter fermenter, in the 2xYT medium supplemented with ampicillin and chloramphenicol.
  • the fermenter has been prepared and put in temperature at 30 ° C with the culture medium.
  • the preculture was returned to 30 ° C one hour before its transfer to the fermenter.
  • the final culture volume is 15 liters.
  • the pH of the culture was adjusted to 7 during the acidification phase and then left free during the alkaline phase.
  • the bacteria were removed after four hours of induction, when the pH was 8.3.
  • the culture was then centrifuged and the cells were divided into three batches. One of them, 20 g of paste, was taken up in 80 ml of lysis buffer for further processing indicated in the Materials and methods chapter.
  • Fractions 54 to 60 are loaded at a rate of 0.25 ml / min. The elution makes it possible to recover 65 fractions of 5 ml with peaks of activity for fractions 36 to 56.
  • the dosage of the activity shows a concentration of 3 to 5 units for fractions 36 to 40.
  • FIG. 4 shows the result on SDS-PAGE gel. Following these three columns, the purity of the polymerase is significantly improved. Nevertheless, traces of DNA from E. coli attached to the polymerase and demonstrated by PCR remain. Two additional columns will therefore be implemented. 30ml of active fractions obtained previously are loaded onto a phosphocellulose column (this should fix the DNA and the polymerase differently).
  • the activity of the polymerase is identified by its high 3 '-5' exonuclease activity at 72 ° C. on the DNA of Lambda digested with HindIII. The strongest activity is located between fractions 40 and 49 with a sharp peak at 46 and 47. On these fractions 40 to 49 the pBR322 DNA is intact after overnight at 37 ° C.
  • Figure 5 shows us the results on gel with activities
  • T buffer Tris HC1 pH 8.8: 600mM; KCl: 500mM; MgC12: 15mM; Tween 20: 0.1%
  • FIG. 8 presents the results obtained with a reaction volume of 50 ⁇ l for quantities of DNA polymerase from Thermococcus fumicolans of 2.7 units. As it stands, the best results with Tfu are obtained with buffer R.
  • thermostability measured according to the protocol described above (Materials and Methods), or better, the residual activity in incorporation at 72 ° C. after exposure of the enzyme to high temperatures for variable times, is given in table 5 below. below.
  • thermostability which is lower than that of polymerases from more hyperthermophilic organisms such as Pyrococcus, is nonetheless very much greater than that of polymerases from Thermus and in particular all Taq.
  • the thermostability of the purified recombinant enzyme, both for the polymerase domain and for the exonuclease, is in any case very much higher than all known requirements in PCR.
  • GAG TTC GCC GAG GGG CCT ATT CTT ATG ATA AGC TAT GCC
  • GAC GAG GAA 954 Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu 155 160 165
  • GTT GCC AAA AAA GAG GTT TAT CTT AGG GTT AGG GAA ATT ATG GAT GGC 2298 Val Ala Lys Lys Glu Val Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ile Met Asp Gly 620 625 630
  • NAME / KEY DNA polymerase of THERMOCOCCUS fumicolans Tfu (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCES: SEQ ID NO: 2:
  • Trp Glu Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gin 145 150 155 160

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Abstract

La présente invention concerne une ADN polymérase purifiée thermostable ADN polymérase thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89 000 daltons, ainsi que ses intéines thermostables.

Description

ADN POLYMERASE THERMOSTABLE ET INTEINES DE L'ESPECE THERMOCOCCUS FUMICOLANS
La présente invention concerne une nouvelle ADN polymerase thermostable ainsi que ses deux intéines, provenant d'une archaebactérie de l'espèce Thermococcus fumicolans .
Les ADN polymérases sont des enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de 1 'ADN dans toute cellule vivante. On connaît aujourd'hui de nombreuses ADN polymérases isolées de micro-organismes tel que E. coli
(ADN polymerase I) ou du phage T4. Des ADN polymérases ont aussi été identifiées et purifiées et à partir de micro-organismes thermophiles comme Thermus aqua ticus (Taq polymerase, Chien, A. et a l . J. Bact. 1976,
127:1550-1557 ; Kaladin et al . Biokhymiya 1980, 45:644-
651), Thermus thermophilus , ou encore des espèces du genre Bacillus (demande de brevet Européen publiée sous le No. 699 760), Thermococcus (demande de brevet Européen No. 455 430), Sulfolobus et Pyrococcus (demande de brevet
Européen publiée sous le No. 547 359) . Parmi ces ADN polymérases issues d'archaebactéries on peut citer la
Pfu , isolées de Pyrococcus furiosus (18), la Vent™ polymerase de Thermococcus li toralis (10), la 9°N de Pyrococcus sp. 9 °N (15) et la DeepVent™ de Pyrococcus GB-
D, les deux premières provenant de souches du littoral (Baie de Naples) , les deux suivantes de souches sous- marines profondes .
Le mécanisme d'action des ADN polymérases est aujourd'hui relativement bien connu et consiste en une réplication de l'ADN à l'identique selon un mode semi- conservatif. Le brin recopié sert de matrice et les quatre nucléotides triphosphates sont le substrat de cette polymérisation. Les enzymes ayant une activité ADN polymerase sont aujourd'hui de plus en plus utilisées in vi tro afin de travailler en biologie moléculaire dans divers buts tels le clonage, la détection d'erreurs, le
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP séquençage, le marquage, et de façon générale, l'amplification de séquences d'acides nucléiques.
Cette amplification, in vi tro , de séquences d'acide désoxyribonucléique fait appel à la technique de la réaction de polymérisation en chaine (PCR) décrite dans les brevets Européens No. 200 362 et 201 184. Le principe de cette technique est basé sur la réalisation de cycles successifs d'extension d'amorces mettant en oeuvre les quatre nucléotides triphosphates ainsi qu ' une ADN polymerase et un ADN matrice à recopier. A chaque cycle, l'enzyme double le nombre de brins d'ADN disponibles et entre chaque cycle une thermodénaturation est nécessaire afin d'ouvrir la double hélice d'ADN pour le cycle suivant. Les températures utilisées pour cette étape de thermodénaturation ne sont pas compatibles avec la conservation de l'activité de la plupart des ADN polymérases connues, telle la Klenow. C'est ainsi que des nombreux efforts de recherche ont été réalisés afin de trouver des enzymes supportant ces températures . Cependant, si les micro-organismes thermophiles sont aujourd'hui connus, il reste encore difficile d'obtenir ces enzymes thermostables avec des rendements de production suffisants. La biologie moléculaire et le génie génétique permettent de palier cet inconvénient. Ainsi, une fois repéré dans le génome, le gène codant pour l'ADN polymerase est clone, séquence puis recloné dans un vecteur d'expression afin de produire la protéine dite alors recombinante, chez un hôte mésophile plus aisé à cultiver tel E. coli ou S. cerevisiae. Cette méthode d'expression chez E. coli a notamment été décrite dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. W0 89/06691 pour produire l'ADN polymerase de Thermus aquaticus .
L'ADN polymerase de l'invention provient d'une archaebactérie de l'espèce Thermococcus fumicolans . Outre ses propriétés thermostables la rendant particulièrement efficace notamment dans une processus de PCR, cette ADN
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP polymerase est remarquable en ce qu'elle présente deux " introns protéiques", encore appelés "intéines", au niveau de son polypeptide précurseur.
La séquence nucléotidique de ses intéines est insérée dans celle de l'ADN polymerase, généralement au niveau de sites conservés impliqués, après traduction, dans les réactions catalytiques . Ces séquences sont transcrites et traduites en même temps que celle de l'ADN polymerase et l'épissage autocatalytique des intéines produit alors trois enzymes: deux intéines et une ADN polymerase .
On trouve de telles intéines également au sein d'autres molécules telles l'ATPase vacuolaire chez S . cerevisiae (4), GyrA chez Mycobacterium leprae (7), Rec A chez Mycobacterium tuberculosis (5, 6). Les intéines font partie pour leur majorité de la famille des endonucléases de type "homing endonucléases" puisqu'elles coupent l'ADN en un site reconnu, à l'endroit même où leur séquence nucléotidique vient s'insérer. Le développement des biotechnologies tant dans la recherche que dans les domaines de la médecine ou de 1 ' agro-alimentaire, nécessite de disposer de divers types d'ADN polymérases susceptibles d'améliorer quantitativement et qualitativement des techniques aussi diverses que le clonage, la détection, l'amplification de séquences d'ADN. La présente invention vise précisément à offrir une nouvelle ADN polymerase thermostable qui est issue d'une espèce récemment décrite: Thermococcus fumi colans (8) . Cet isolât a été isolé à partir de fragments de cheminées prélevées dans le bassin Nord- Fidgien lors de la campagne franco-japonnaise STARMER en 1989. Cette espèce, anaérobie stricte, présente une température optimale de croissance de 90°C, ce qui est relativement élevé pour un Thermococcus . Son pH optimum est de 8,8, et son taux de salinité de 20 g/1 à 40 g/1.
L'invention a donc pour objet une ADN polymerase purifiée thermostable d'archaebactéries de
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP l'espèce Thermococcus fumi colans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89000 Da ainsi que ses intéines thermostables , dont le gène comportant les deux séquences codant pour lesdites intéines a été clone.
Les travaux de recherche ayant permis d'identifier, de sequencer et d'étudier l'ADN polymerase de 1 ' invention ont été réalisée à partir de la souche Thermococcus fumicolans ST557 déposée à la Collection de l'Institut Pasteur (CIP) sous le numéro CIP 104680. Cette ADN polymerase sera dénommée dans ce qui suit Tfu . Sa séquence de 774 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Un poids moléculaire de 89797 Da et un pi de 8.1 ont été déduits de cette séquence.
L'invention concerne donc l'ADN polymerase purifiée thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89 000 daltons ainsi que ses dérivés enzymatiquement équivalents . On entend par dérivés enzymatiquement équivalent, les polypeptides et protéines constitués par ou comprenant la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 dès lors qu'ils présentent les propriétés de l'ADN polymerase de Thermococcus fumi col ans . A ce titre l'invention envisage plus particulièrement une ADN polymerase dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragments, comme la séquence de 774 acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
En effet, la présence de deux intéines I-Tfu-1 et I-Tfu-2 dans la séquence numéro SEQ ID NO:l, sont susceptibles de conduire lors de la préparation par synthèse chimique ou par génie génétique, à des séquences d'ADN polymerase de T. fumiculans tronquées dont les
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP propriétés enzymatiques sont équivalente à celle de l'ADN polymerase de T. fumicolans purifiée.
On entend aussi par dérivés, les séquences en acides aminés ci-dessus modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides , pour autant que les propriétés de l'ADN polymerase de T. fumicolans qui en résultent ne soient pas significativement modifiées.
L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une ADN polymerase de l'invention.
La séquence d'ADN représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO: 1 représente une telle séquence. L'ADN codant pour l'ADN polymerase de T. fumicolans et ses deux intéines est constituée par le nucleotides 357 à 5028. Les nucleotides 1 à 356 correspondent à la région promotrice de ce gène. En conséquence, l'invention a pour objet une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence comprise entre les nucleotides 357 à 5028 de la SED ID NO: 1, ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragmen s .
1 ' invention se rapporte tout particulièrement à une séquence d'ADN constituée par ou comprenant les nucleotides 357 à 1674 et 2755 à 3156 et 4324 à 5028 de la séquence d'ADN représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO : 1.
Cette séquence code pour l'ADN polymerase de T. fumicolans dont la séquence de 774 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO : 2.
L'invention concerne autant l'ADN polymerase isolées et purifiées de la souche Thermococcus fumicolans que l'ADN polymerase préparées par synthèse chimique, par exemple par ligature de fragments polypeptidiques , ou encore par les méthodes du génie génétique. Dans le cadre de ces méthodes du génie génétique, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN thermostables de l'invention.
Un procédé de production d'une ADN polymerase conforme à l'invention consiste:
- à transférer une séquence d'acide nucléique codant pour l'ADN polymerase ou un vecteur contenant ladite séquence dans un hôte cellulaire,
- à cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape précédente dans des conditions permettant la production de l'ADN polymerase,
- à isoler, par tous moyens appropriés, ladite ADN polymerase.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré.
L'ADN polymerase thermostable de l'invention est utile notamment dans les procédés d'amplification enzymatique de séquences d'acides nucléiques. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre l'ADN polymerase thermostable décrite précédemment, ainsi que les kits d'amplification comprenant, outre les réactifs généralement utilisés, une quantité adéquate de cette ADN polymerase.
L'invention a également pour objet une intéine purifiée thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans. Comme indiqué précédemment, les intéines sont aussi définies comme des introns protéiques qui sont non pas épissés au niveau de l'ARN messager mais au niveau
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP d'une maturation proteique. Elles relèvent donc d'un seul gène traduit et transcrit en une seule étape, et constituent des sous produits de la maturation de la protéine codée par ce gène (Xu, M. G. , Comb, D.G ., Paulus H., Noren C.J., Shao Y., Perler, F., 1994, Protein splicing : an analysis of the branched intermediate and its resolution by succinimidine formation . EMBO J . 13, 5517-5522.)
Les intéines sont des endonucléases de restriction qui ont la propriété de couper l'ADN à l'endroit même où s'insère leur gène, et en conséquence, elles peuvent être considérées comme des séquences égoïstes .
Les intéines possèdent dans leur séquence toute l'information nécessaire à leur propre épissage puisqu'elles s'épissent dans E. coli .
Il est possible de distinguer quatre grandes étapes de maturation proteique :
Une première étape de formation d'un intermédiaire linéaire qui possède une fonction ester.
Cette réaction est dépendante du pH et de l'environneme t local de cette liaison (nature des acides aminés) . Ce principe est utilisé dans les kits de clonage, d'expression ou de purification mettant en oeuvre des intéines, car un changement de l'environnement provoque ou non un épisssage. En effet, celui-ci serait inhibé à pH 11 et activé à pH 7,5.
- Une deuxième étape de transestérif ication qui permet de transformer l'intermédiaire précédent et de déplacer l'équilibre de la première étape.
La troisième étape consiste en une cyclisation de 1 ' asparagine libérant l'intéine.
- La quatrième étape est la stabilisation de la protéine mature et la formation d'une réelle liaison peptidique.
Il est donc possible de construire des mutants thermosensibles permettant de bloquer l' épissage
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP proteique aux températures d'expression (30°C) et de 1 ' induire par chauffage .
Cette possibilité de contrôle de l' épissage proteique par la température peut-être utilisée dans des vecteurs de clonage avec une séquence codant pour 1 ' intéine et des sites de clonage autour. Si la protéine à cloner et à exprimer est toxique pour l'hôte, on peut la cloner en deux fragments autour de la séquence d' intéine. Ainsi, globalement, le gène à cloner est complet mais il est interrompu par la séquence de l' intéine. Lors de l'expression, 1 ' intéine se retrouve dans la protéine exprimée, la rendant ainsi inactive. Il est alors possible par chauffage, à la fin de l'induction, de libérer 1 ' intéine par épissage autocatalytique et ainsi retrouver la protéine clonée active .
Les intéines permettent ainsi de réaliser des purifications et sont utilisés dans des kits selon le principe décrit ci-après. Certains résidus autour de site d' épissage de 1 ' intéine sont modifiés. L'expression de la protéine recombinante est réalisée à basse température pour bloquer un éventuel épissage trop précoce. En C- terminal de l' intéine est fixé un site ayant une forte affinité pour la chitine. Lors de l'induction, la protéine clonée est exprimée ainsi que 1 ' intéine et le site de fixation à la chitine. La purification est alors réalisée avec la chitine, sur des colonnes d'affinité, qui retiennent la chitine et aussi 1 ' intéine et la protéine clonée, le tout faisant partie de la même pré- protéine. On hydrolyse alors l'extrémité N-terminale de 1 ' intéine avec du DTT ou du β-mercaptoéthanol pour libérer la protéine clonée.
Les intéines sont aussi des endonucléases de restrictions thermostables, qui ont pour site de reconnaissance l'endroit même où s'insère leur gène dans la séquence "hôte" . Elles possèdent une séquence nucléique répétée deux fois (LAGLIDADG) dans la protéine,
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP séquence plus ou moins conservée et qui correspond au site actif de reconnaissance et de coupure de l'ADN. Ces enzymes semblent aussi avoir besoin de g++ pour leur activité. II convient de remarquer que les deux intéines de 1 ' invention sont coexprimées dans E. coli et sont autoépissées . Ce qui signifie qu'elle n'ont pas de toxicité pour l'hôte, à la différence de l'une des intéines de Thermococcus li toralis (9), et en conséquence leur utilisation dans des kits d'expression ou de purification est aisée.
Une première séquence d' intéine selon 1 ' invention est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3. Cette intéine, dénommée I-Tfu-1, présente un poids moléculaire de 41 409 Da et un pi de 9,13, déduits de la séquence de 360 acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 3.
Une seconde séquence d' intéine selon 1 ' invention est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. Cette intéine, dénommée I-Tfu-2, présente un poids moléculaire de 44 765 Da et pi de 9,6, déduits de la séquence de 389 acides aminés de la séquence SEQ ID NO: 4.
Comme rappelé précédemment, les intéines thermostables de 1 ' invention sont utiles notamment dans les procédés de restriction d'acides nucléiques et dans la mise au point de vecteurs d'expression permettant de réduire la toxicité de la protéine à exprimer en insérant l'une des deux séquences d' intéines dans la séquence de la protéine à exprimer. Ceci peut se faire sans manipulation de la séquence des intéines si le clonage s'effectue chez E. coli , les techniques d'expression utilisées ayant démontré leur inocuité pour cet organisme hôte. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre l'une des deux ou les deux intéines thermostables décrites précédemment, ainsi que les kits d'expression ou de purification contenant l'une ou les deux séquences codant pour les dites intéines thermostables .
L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une intéine de 1 ' invention .
Une séquence d'ADN codant pour 1 ' intéine I-Tfu-
1 est comprise entre les nucleotides 1675 et 2754 dans la séquence SED ID NO: 1 en annexe. Cette séquence d'ADN code pour 1 ' intéine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO : 3.
Une séquence d'ADN codant pour 1 ' intéine I-Tfu-
2 est comprise entre les nucleotides 3157 et 4323 dans la séquence SED ID NO: 1 en annexe. Cette séquence d'ADN code pour l' intéine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SED ID NO : 4.
L'invention concerne autant ces intéines thermostables isolées et purifiées de la souche Thermococcus fumicolans que des intéines préparées par synthèse chimique, par exemple par ligature de fragments polypeptidiques, ou encore par les méthodes du génie génétique. Dans le cadre de ces méthodes du génie génétique, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN codant pour les intéines de l'invention. De tels procédés sont identiques à ceux rapportés précédemment pour l'ADN polymerase de T . fumicolans .
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs et concernant le clonage, l'expression, la caractérisation et l'activité
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP de l'ADN thermostable de l'invention, et se référant aux dessins annexés dans lesquels :
- La figure 1 représente l'hybridation ADN-ADN de l'ADN genomique de T. fumicolans digéré par diverses enzymes de restriction et hybride avec les sondes GE23ClaI-HindIII et GE23XhoI-SalI .
- La figure 2 représente la stratégie de clonage, la structure du gène de l'ADN polymerase de T. fumiculans et les produits du gène. - La figure 3 représente les résultats de purification de la polymerase recombinante de T. fumi colans après une colonne d'héparine sépharose, visualisés par SDS-PAGE.
- La figure 4 représente les résultats de purification de la polymerase recombinante de T. fumiculans après une colonne Bleue HTrap n°2 , visualisé par SDS-PAGE.
- La figure 5 représente les résultats de purification de la polymerase recombinante de T. fumi col ans après une colonne de phosphocellulose , visualisés par SDS-PAGE.
- La figure 6 représente les résultats de purification de la polymerase recombinante de T. fumicolans après une colonne MonoQ, visualisés par SDS- PAGE.
- La figure 7 représente les résultats de PCR avec l'ADN polymerase de T. fumicolans avec les fractions d'exclusion de la colonne MonoQ.
I- Matériel et méthodes .
1) Conditions de culture, plasmides et souches utilisées . Les souches Thermococcus li toralis (DSM 5474 T) et Pyrococcus furiosus (DSM 3638 T ) ont été obtenues auprès de la collection du Deutsche Sammlung von
Microorganismen (DSM) Braunschweig-Stocheim, Allemagne.
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP La souche Pyrococcus sp. GE 23 a été isolée de cheminées de sources hydrothermales profondes et a été fournie par G Erauso (CNRS, Station Biologique de Roscoff , France) . La souche Thermococcus fumicolans à été obtenue auprès du laboratoire de Microbiologie Marine de G. Barbier (IFREMER-DRV-VP-CMM) à Brest, France. Cette souche, Thermococcus fumicolans à été obtenue par purification à partir de fragments de cheminées hydrothermales receuillies dans le bassin nord-Fidgien lors de la campagne franco- aponaise STARMER effectuée en 1989 à 2000 mètres de profondeur.
Pyrococcus sp.GE23 a été cultivée à 85°C dans un milieu 2216S (DIFCO) à un pH de 6 , 5.
Thermococcus fumi col ans , décrite en 1996 (Godfroy et al.) est cultivée en conditions anaérobies dans un milieu contenant les éléments suivants: peptone 2g/ 1; extraits de levure 0,5g/l; sel de mer (Sigma) 30g/l; tampon PIPES 6,05g/l, soufre élémentaire 10g/1, rézasurine lmg/1. Le pH est ajusté à 8,5 par de la soude 5N à 20°C.
La souche de Escherichia coli SURE (Stratagene, La Jolla, Calif.) a été cultivée dans du milieu LB avec le ou les antibiotiques appropriés, à 37°C sous agitation. Cette souche a été utilisée comme hôte pour recevoir les constructions primaires à partir des vecteurs pUC 18 ou pBluescript. Les souches NovaBlue, BL21(DE3) et BL21(DE3)pLysS (Novagen, Madison, Wi . ) ont été cultivées dans du milieu 2xYT avec les antibiotiques appropriés à 37°C ou 30°C. Ces souches ont été utilisées commes hôtes pour les plasmides d'expression.
2) Isolement de l'ADN, hybridation et ADN recombinants .
L'ADN de haut poids moléculaire de Thermococcus fumicolans a été isolé par la méthode de Charbonnier modifiée (3) . Les cellules ont été resuspendues dans un tampon TE-Na IX, puis lysées à 40°C pendant trois heures
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP avec un mélange de N-Lauryl-sarcosine 1%, dodecyl sulfate de sodium 1% et 0,4 mg/ml de protéinase K. Après la lyse, une centrifugation à 5000g pendant 10 minutes permet d'éliminer les débris cellulaires. L'ADN est extrait par un traitement au Phenol-Chloroforme-alcool Isoamylique ou PCI (25-24-1) , puis traité par la RNAse à 5μg/ml à 60°C pendant une heure. Ces étapes sont suivies de deux extractions additionelles par PCI et d'une extraction au chlorophorme . L'ADN est ensuite précipité à l'éthanol absolu à -20°C, puis centrifugé, séché à l'air et repris dans un tampon TE-lx. La concentration et la pureté de cet ADN sont mesurées par spectrophotométrie à 230, 260 et 280nm avec un appareil GeneQuantlI (Pharmacia, Upsalla, Sweden) . Pour la construction de la mini-banque genomique en pUC 18 (17), l'ADN a été totalement digéré pendant une nuit à 37°C par une série d'enzymes de restriction (BamHI, HindIII, EcoRI , EcoRV, PvuII, Sali, Xbal et Xhol) par simples et doubles digestions. Puis les fragments d'ADN sont fractionnés sur gel d'agarose à 0,8% dans de TBE-1X et transférés sous vide sur une membrane de nylon Hybond-N+ (Amersham, UK) . Ces membranes ont été hybridées avec des sondes d'ADN préparées par PCR avec des amorces spécifiques sélectionnées à partir des gènes d'ADN polymérases de P . furi osus , T . l i toral i s et Pyrococcus sp . GE23. Ces sondes sont préalablement marquées au 32P par "random primmg" conformément aux recommandations du fabricant (Megaprime, Amersham, UK) .
Deux sondes de P. furiosus ont été utilisées, Pfu et Pfu
F, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de bases 8 à 2316 et 819 à 1915 de la section codante du gène de la polymerase comme défini par Uemori et al . (18) . Deux sondes de T. li toralis, Tli I et Tli T, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de bases 297 à 1768 et 4631 à 5378, comme défini par Hodges et al . (9) . Deux sondes de Pyrococcus sp GE23 ont été utilisées, l'une contenant la partie 5' du gène (fragment Clal-HindIII
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP correspondant aux sites pb 8 et pb 1353 de la section codante) et l'autre contenant la partie terminale de ce même gène obtenu par PCR (amorces dites d'expression Ndel et Sali correspondant aux sites pb -1 et pb 2318, puis digestion par Xhol et Sali comprenant les bases du n° 1879 à 2318) . Les fragments positifs ont été identifiés par hybridation ADN-ADN (14). Seules les hybridations avec les sondes de Pyrococcus sp . GE 23 ont fourni des signaux positifs à 55°C en moins de 24 h d'exposition. Les sondes issues de T. li toralis et de P. furiosus n'ont donné aucun résultat, même à 50°C dans un tampon standard sans formamide . A partir des hybridations avec les sondes de Pyrococcus sp. GE 23, des fragments HindIII de 1,9 kb ont été sélectionnés, puis préparés par une digestion appropriée de lOOμg d'ADN genomique, purifiés dans des sacs de dialyse à partir des gels d'agarose, et précipités à l'éthanol absolu après une extraction au PCI. Les fragments ont été ligaturés dans un pUC 18/HindIII déphosphorylé. Les transformations des souches hôtes ont été réalisées par électroporation (Gène Puiser, Biorad) . Le criblage des clones recombinants a été effectué par sélection à 1 ' ampicilline , alpha- complémentation sur substrat X-Gal-IPTG puis hybridation de colonies selon les techniques standards (12) . La température des hybridations de colonies était de 55°C avec les sondes de Pyrococcus sp GE23, dans un tampon standard sans formamide. L'ADN plasmidique a été isolé selon la méthode décrite par Birnboim et Doly (1) , puis purifié par chromatographie échangeuse d'anions en phase solide (Quiagen, Chatsworth, Calif.). Les fragments de restriction des plasmides ont été purifiés sur gel d'agarose par la méthode du GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.) pour un clonage ultérieur.
L'ARNr 16S et 23S de Thermococcus fumicolans a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes :
- amorce directe Aa: 5' TCCGGTTGATCCTGCCGGAA-3 '
- amorce réverse 23Sa: 5 ' -CTTTCGGTCGCCCCTACT-3 '
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP - étape initiale 3 minutes à 94°C suivi de 30 cycles (94°C, 1min/ 49°C, lmn/ 72°C, 2mn) et, élongation finale de 5 irai à 72°C.
Le produit de PCR a été clone dans le vecteur pUC18 pour séquençage ultérieur.
3 ) Sé uencaσe des ADN.
Les séquences d'ADN ont été obtenues par la méthode de terminaison de chaine (13) en utilisant un système d'analyses automatique d'ADN Applied Biosyste s. Les deux brins des gènes codant pour l'ADN polymerase et les deux intéines ont été séquences en utilisant des amorces universelles localisées sur des vecteurs ainsi que des amorces internes . La séquence d'ADNr 16S a été réalisée sur les deux brins, après clonage (SureClone, Pharmacia, Uppsala, Sweeden) , en utilisant le kit Hot-Tub (Amersham, UK. ) afin de lever les compressions .
L'analyse de séquence a été réalisée avec le logiciel DNASTAR (Madison, Wis . , USA) et le programme de Genetic Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Wis., USA) accessible en ligne sur INFOBIOGEN. Les recherches informatisées de similitude ont été réalisées avec le programme BLAST, les alignements multiples avec CLUSTAL V, et les arbres phylogénétiques ont été établis selon la méthode dite de "Neighbour- oining" (11).
4 ) Construction du recombinant exprimant l'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans .
L'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans ainsi que ses deux intéines, ont été exprimées en même temps chez E. coli avec le vecteur d'expression PARHS2 qui appartient à la famille des systèmes d'expression T7 ( 16 ) acquis auprès d ' Eurogentec .
La PCR a été utilisée pour préparer le fragment complet de l'ADN polymerase et des deux intéines en utilisant des amorces contenant les sites de restriction Ndel et BamHI :
- amorce Tfu Dir : 5 ' -TGG GGA TCC ATA TGA TCC TCG ATA CAG ACT ACA TC-3 ' - amorce Tfu Rev :
5 ' -AAG CTT GGA TCC TCA TTT CTT CCC CAT TTT GAG CC-3 '
Le mélange réactionnel contenait l'ADN polymerase GOLDSTAR (Eurogentec, B) , l'enzyme Taq Extender (contenant la Pfu de Stratagene) , le tampon d'extension avec les quatre dNTP (chacun à 0,2mM) et les amorces Tfu Dir et Tfu Rev à 50 pmoles dans un volume de 50μl final. L'amplification a été effectuée sur 20 cycles : 1 mn 94°C, 1 mn à 54°C et 6 mn à 72°C en utilisant un thermocycleur Stratagene 96-gradient. Les fragments de PCR ont ensuite été digérés par les enzymes Ndel et BamHI puis ligaturés aux mêmes sites du vecteur, rétablissant ainsi le codon d'initiation. La construction ainsi obtenue a été nommée PARHS2TFU1. Cette construction a été séquencée aux sites de jonction afin de vérifier son intégrité par rapport à la séquence de l'ADN genomique. Les tests d'expression ont été réalisés selon le protocole suivant: sélection des clones recombinants dans la souche E. coli Novablue, expression avec la souche BL21 (DE3 )pLysS dans un milieu 2xYT et induction de quatre heures à ImM d'IPTG.
Les premiers essais d'induction ont été réalisés sur des cultures de 5 ml, induites ou non. Des précultures de nuit sont réalisées sans inducteur et relancées dans un milieu frais le matin (au dizième) , jusqu'à ce que la densité optique (mesurée à 600nm) soit de 0,6, puis soit induites pendant 4 heures, soit non induites et arrêtées au bout de 2 , 4 ou 14 heures . Quatre ml de cultures sont alors centrifugés à 4°C, 5000rpm pendant 10 minutes. Le culot est ensuite repris dans un tampon de lyse (Tris-HCl lOmM pH 7,5; NaCl lOmM, MgCl2 2 mM) . Les cellules ainsi reprises sont alors lysées , soit avec du triton X-100 1% v/v, soit du lysozyme à lmg/ml de
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP lyse et laissées sur glace environ 5 à 10 min. Les cellules sont ensuite thermodénaturées par une exposition de 20 min à 72°C. Ceci permet de détruire en grande partie les cellules de l'hôte mésophile sans détruire les protéines recombinantes . Le produit de lyse est ensuite centrifugé 20 min à 10 OOOrpm à 4°C. Le surnageant est récupéré afin de le tester en incorporation, en PCR ou sur gel. Les incorporations sont réalisées suivant deux techniques : - Avec de la thymidine tritiée comme traceur.
L'incorporation est réalisée sur du thymus de veau activé (SIGMA Aldrich, F) dans le milieu de réaction suivant: Tris-HCl 50mM pH 8,8 ; DTT ImM ; MgCl2 lOmM ; KCl lOmM ;
BSA 0,4 mg/ml; chaque dNTP à 0,4 mM. - Avec du 32 P -dATP (Amersham) comme traceur.
L'incorporation est réalisée sur de l'ADN thymus de veau activé (Appligene) dans le milieu de réaction suivant:
Tris-HCl pH 9 50mM; KCl 50mM; MgCl2 7mM; BSA 0,2mg/ml et
(NH4+)S04 (filtré) 16mM, avec un mélange des 4 dNTP à 500μM final chacun. Cette seconde méthode permet d'estimer avec précision le nombre d'unités d'enzyme.
5) Purification.
a) Culture.
Après des essais en petits volumes, les cultures destinées à l'expression de l'enzyme recombinante ont été réalisées comme suit: production d'un inoculum de 700 ml (milieu 2x YT complémenté en ampicilline et chloramphenicol) cultivé à 30°C jusqu'à DO = 0,8; ensemencement d'un fermenteur contenant 16 1 du même milieu; culture pendant 4 h jusqu'à DO= 0,6, puis induction à l'iPTG 1 mM et culture pendant 4 h. La biomasse résultante est centrifugée 20 mn à 6 000 rpm à 4°C (Centrifugeuse JOUAN) .
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP b) Lyse cellulaire et première étape de purification.
20 g de biomasse sont repris dans 80 ml de tampon (20 mM Tris-Ci pH 7 , 5 ; 10 mM NaCl; 2 mM MgC12 ; 1 mM EGTA; 1% Triton xlOO; 2,2 mM PMSF) . Le mélange résultant, maintenu à 4°C maximum, est soniqué à 12 reprises successives (cycle de 15 s) jusqu'à obtention d'une solution liquide. Le surnageant est ensuite centrifugé 20 mn à 4°C à 20 000 rpm (SORVALL Ti45) . Le surnageant est récupéré et traité par la chaleur (70°C pendant 10 mn) afin de thermodénaturer l'essentiel des protéines natives de E. coli , puis centrifugé à nouveau.
c) Chromatoσraphie . Les 70 ml de surnageant issus de l'étape précédente sont chargés sur une colonne Pharmacia Héparine Sépharose (30 ml de résine) , après équilibration avec un tampon A (10 mM Tris-Ci pH 7 , 5 ; 0 , 5 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM β-mercaptoéthanol ; 0,2% Triton xlOO et 10% glycerol. Un lavage est effectué avec un tampon B (idem tampon A + 2 M NaCl) à raison de 0,3 ml/mn sur un système FPLC Pharmacia. Les différentes fractions sont récupérées en gradient de NaCl .
Les fractions actives ainsi récupérées sont dialysées pendant 5 h contre un tampon C: 10 mM Tris-Ci pH 7,5; 0,5 mM EGTA; 5 mM MgCl2 ; 10 mM -mercaptoéthanol; 0,2% Triton xlOO; 10% glycerol; 50 mM NaCl. Les produits issus de dialyse sont successivement chargés sur une colonne d'affinité pour les protéines se liant à l'ADN (Pharmacia, Bleue HiTrap) et élues en gradient de NaCl avec les mêmes tampons que précédemment .
30ml de fractions actives obtenues précédemment sont chargées sur une colonne de phosphocellulose avec de la résine Pli de Whatmann ( volume :20ml; diamètre: 2,5cm). Ces fractions ont été dialysées 5 heures contre le tampon suivant : KP04 pH7 20mM, EDTA 0,lmM, DTT ImM, Glycerol 5%, Triton X-100 0,1% et KCl 0,1M. Le débit de
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP la colonne est réglé à 0,2ml /min, le tampon A de chargement est composé de KP04 pH7 20mM, EDTA 0,lmM, DTT ImM, Glycerol 5%, Triton X-100 0,1% et le gradient (entre 0% et 50% deB) est réalisé par le KCl présent dans tampon B à 2M.
Ayant déjà mis en évidence que cette polymerase ne se fixe pas sur une MonoQ ou une ressource Q et ce, quel que soit le pH utilisé, nous avons essayé de la récupérer en exclusion en faisant l'hypothèse d'une fixation de l'ADN contaminant par la colonne.
Tout d'abord un essai a été réalisé en sortie de la deuxième Bleue HiTrap avec un aliquot de 5ml et dialyse selon la même méthode que pour un passage sur une Bleue HiTrap. Une deuxième tentative a été réalisée après la phosphocellulose et après deux dialyses des fractions les plus actives 45, 46 et 49. Les fractions sont tout d'abord chauffées 40 min à 85°C. Une première dialyse est alors réalisée contre le tampon KCl 0,lmM, K2HP04 1M pH7 , 5 pendant 3 heures. La deuxième dialyse est réalisée avec le tampon suivant : K2HP04 pH 7 , 5 lOmM, K2P04 lOmM, KCl 25mM, DTT ImM, Triton X-100 0,1%, Glycerol 10%, pendant 1 heure. La solution est alors chargée sur une colonne MonoQ à 0,5ml/min avec un gradient en NaCl de 0 à 20% (tampons utilisés pour l'Héparine) .
6) Activités exonucléasiques .
Les tests d' exonuclease 3 '-5' sont quantifiés par la libération de nucleotides marqués au P . A cette fin, une première étape permet de réaliser le marquage: l'ADN de est digéré par HindIII puis, le fragment de Klenow recopie l'ADN à partir des extrémités 3 ' -OH libres , dans un milieu contenant outre le tampon, l'ADN et l'enzyme, du 3 P dATP et du 32P dTTP, les dGTPet dCTP étant froids. Après une heure à 37°C, les quatre dNTP froids sont rajoutés en excès pour une demi- heure. La Kleno et les dNTP sont éliminés par une extraction au phénol et précipités à l'éthanol.
Les tests exonucléasiques sont effectués dans des solutions contenant les tampons des enzymes, 0,02mg/ml d'ADN marqué, et incubées toute la nuit à 72°C, 80°C et 95°C. Différents tampons contenant du MgCl2 ou du MnS04 sont testés. Le même test est réalisé avec la Vent en témoin positif. 101 de solution de réaction sont alors déposés sur papier DE81 (Watmann) , séchés puis comptés avant et après lavage (3 fois 5 min avec du a2HP04, 1 fois à l'eau puis à l'éthanol à 95%) en utilisant la technique de Cerenkov.
Pour le test d'actvité exonucléasique 5'-3', la réaction de marquage utilise la polynucléotide kinase afin de marquer le substrat en 5 ' .
II - Résultats .
1) Isolement du gène de l'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans ainsi σue des deux gènes d' intéines .
L'ADN de Thermococcus fumicolans , digéré par une série d'enzymes de restriction, a été hybride à des sondes de P. furiosus et T. li toralis, préparées par PCR et aux sondes de Pyrococcus sp. GE23 obtenues lors du clonage de cette autre ADN polymerase (Dépôt de brevet n°96 08631 auprès de l'INPI) . Comme montré dans les figures la et lb, l'hybridation de type Southern blot a révélé des fragments de deux types : un fragment HindlII- HindIII de 1,9 kb et un fragment Xhol-Xhol de 5 kb. Ces deux fragments ont été révélés uniquement avec la sonde
Clal-HindIII du gène de Pyrococcus sp. GE23, marquée au
32 P avec une exposition de deux heures. Les deux fragments repérés ont ensuite été récupérés et purifiés comme décrit précédemment dans Matériel et Méthodes puis clones dans le vecteur pUC18 déphosphorylé et digéré par
HindIII ou dans le vecteur pBluescript déphosphorylé et
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP digéré par Xhol . Environ 400 recombinants ( E. Coli SURE) ont été criblés avec la sonde Clal-HindIII . Sur ces 400 colonies, deux ont donné un signal positif lors de l'hybridation. (n° 9.26 et 12.79). Les deux clones ont été mis en culture en milieu LB-Amp et leurs profils de restriction étaient identiques, avec un insert de 1,8 kb. Le séquençage ultérieur de l'un de ces clones (désigné 557MACa) et la comparaison de séquence (Megalign, programme DNASTAR) ont montré qu'il correspond à la région promotrice et aux 1404 premières paires de base d'un gène d'une ADN polymerase appartenant à la famille B (2) .
En ce qui concerne le fragment Xhol-Xhol de 5 kb, 700 recombinants ont été criblés sans aucun signal positif lors de l'hybridation. Cette absence de réussite pourrait être due à la présence d'une intéine au sein de ce fragment, le rendant alors instable dans un vecteur à haut nombre de copies de type pBluescript .
Après 12 heures d'exposition, un deuxième fragment HindIII-HindIII de 2 kb a été repéré par hybridation de type Southern sur la même membrane que précédemment, en utilisant comme sonde marquée la fin du gène de Pyrococcus sp. GE23 entre les sites Xhol et Sali
(fragment obtenu par digestion de produit de PCR). Ce fragment a été clone comme précédemment. Environ 200 clones recombinants ont été criblés et quatre d'entre eux ont donné un signal positif. Les quatres clones ont un profil identique après digestion par l'enzyme de restriction HindIII. L'un d'entre eux, 557MACc, a été séquence et la comparaison de séquence a démontré qu'il s'agissait de la fin du gène de l'ADN polymerase précédemment identifiée.
Supposant que les fragments de gènes obtenus appartenaient à la même ADN polymerase, des oligonucléotides ont été utilisés afin d'amplifier la zone manquante. Ce fragment de PCR a ensuite été purifié sur gel comme décrit dans Matériel et Méthodes, et utilisé comme sonde marquée radioactivement pour repérer sur la membrane le fragment manquant. Après deux heures de révélation un fragment HindIII-HindIII a été révélé, de 2 kb environ. Clone comme précédemment, 600 colonies ont alors été criblées, donnant quatre clones positifs. Les quatre clones avaient le même profil et l'un d'entre eux, nommé 557MACb a été séquence et les comparaisons de séquences ont démontré qu'il s'agit de la partie intermédiaire de l'ADN polymerase et ce fragment, délimité par deux sites HindIII, s'insère parfaitement entre 557MACa et 557MACc. L'ensemble de ces trois clones donne la séquence complète de l'ADN polymerase de T. fumicolans .
2 ) Position phylogénétiσue de Theirmococcus fumicolans
Thermococcus fumicolans est une nouvelle espèce de Thermococcales décrite par Godfroy et al (8) .
3 ) Séquences nucléotidiαues et polypeptidiques de l'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans .
a) Séquences nucléotidicrues
Les trois fragments délimités par des sites HindIII ont été assemblés (figures 2 et 3) . Ils forment à eux trois un fragment de 5039 paires de bases. Le premier fragment, issu du clone 557MACa, contient le codon de départ ATG en position 457 pb . La phase ouverte de lecture est alors ininterrompue sur 4572 paires de bases jusqu'à rencontrer un codon STOP sur le fragment issu du clone 557MACc en position 5028 pb, six paires de bases avant le dernier site HindIII. Par alignement, avec les autres gènes d'ADN polymérases disponibles en banques
(Pfu, Tli, GB-D, KOD, ..), avec la méthode CLUSTAL V, complétée par un alignement manuel final nécessaire pour restituer les sites d' autoépissage des intéines, deux séquences d'insertions ont été mises en évidence. - La première est insérée à la paire de base n° 1675 et se termine à 2754, étant ainsi répartie entre le fragment issu du clone 557MACa et celui du clone 557MACb.
- La deuxième est insérée à la base n° 3157 et se termine à 4323. Elle est, de même, répartie entre le clone 557MACb et 557MACC.
Ces deux séquences d'insertions forment, avec le reste de la séquence codant pour l'ADN polymerase, un seul cadre de lecture.
b) Séquences polypeptidiques .
La section codante du gène de l'ADN polymerase est donc constituée de trois parties disjointes. La première partie du gène, portée par 557MACa, comporte la zone codant pour 1 ' exonucléase 3'- 5', où après traduction, on reconnaît le motif FDIET. La deuxième partie, portée par 557MACb et la troisième partie portée par 557MACC comprennent les sites conservés SLYPSI, et YG.DTD. Les deux séquences d'insertion sont situées sur des zones conservées de l'ADN polymerase, la première au site DFR/SLYPSII comme I-KOD-1 de Pyrococcus sp . KOD1 et la deuxième au site D/TDG comme I-Tli-1 de T . l i toral i s . Ces deux protéines sont libérées par autoépissage proteique. Elles comportent les sites de type LAGLIDADG répétés deux fois à 100 paires de bases de distance environ. Les alignements avec les autres intéines déposées dans les banques de séquences permettent de les assimiler à des endonucléases de restriction de type archaebactérien, endonucléases qui coupent l'ADN à l'endroit précis où leur gène s'insère.
c) Comparaison avec les autres séquences d'ADN polymérases . L'alignement des différentes séquences polypeptidiques des ADN polymérases de Thermococcales disponibles en banque, P. abyssi strain GE5 , Pyrococcus sp. GE23, Pyrococcus sp . KOD1 , Pyrococcus sp. GB-D, P. furi os us , Pyrococcus sp 9°N, T. l i toralis avec la séquence de T. fumicolans (sans intéines), réalisé avec le programme CLUSTAL utilisant la matrice PAM250, donne les niveaux de similarité entre ces diverses polymérases figurant au tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Figure imgf000026_0001
Le niveau de similarité le plus proche est celui observé avec Pyrococcus sp . 9°N (90,6%), ce qui indique clairement que l'ADN polymerase de T. fumicolans est originale au niveau de sa séquence et constitue de ce fait une nouvelle ADN polymerase.
d) Comparaison des intéines avec les autres intéines disponibles dans les banques .
Les séquences disponibles en banque ont été alignées selon les mêmes méthodes que précédemment. Les comparaisons de l'ensemble des intéines démontrent que celles-ci sont réparties en trois groupes correspondant aux sites d'insertion des motifs A (R/SLYPSI), B (KILAN/S) et C (D/TDG) . L'analyse des niveaux de similarité et la recherche de relations phylogénétiques n'ont de sens que pour des intéines appartenant à la même classe, c'est à dire s ' insérant dans un motif donné. Les niveaux de similarités pour I-Tfu-1 (classe A) et I-Tfu-2 (classe C) avec leurs intéines homologues déjà décrites sont donnés respectivement aux tableaux 2 et 3 ci- dessous . Tableau 2
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA EP
Figure imgf000027_0001
Tableau 3
Figure imgf000027_0002
I-Tfu-1 et I-Tfu-2 semblent représenter deux nouveaux "allèles" des "homing" endonucléases archaebactériennes des classes A et C.
I-Tfu-1 est le troisième allèle connu d' intéine s ' insérant au site A des ADN polymerase d'Archaea, tandis que I-Tfu-2 est le second de sa classe.
5 ) Expression, caractérisation et activité de l'ADN polymerase de T. fumicolans .
a) Clonaσe et expression. Un insert de 4595 pb obtenu par PCR longue- distance avec les amorces TfuDir et TfuRev et couvrant la totalité du gène de l'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans, avec les deux intéines, a été clone aux sites Ndel et BamHI d'un vecteur pour transformer la souche E. coli Novablue. Des mini-préparations d'ADN plasmidique ont été réalisées sur une dizaine de clones transformants et ont toutes donné un signal positif à l'hybridation. Deux clones ont été retenus sur la base de leur profil après une digestion par Ndel et Sali ou par HindIII. Ces deux plasmides ont ensuite été transformés dans la souche E. coli BL21(DE3)pLysS.
Des essais d'expression ont été réalisés en culture de 5 ml afin de déterminer les conditions optimales de culture et d'induction. Tout d'abord les essais de cultures ont été réalisés à 37°C, où l'on observe une lyse cellulaire trop importante, puis à 30°C où la culture ne lyse pratiquement pas. La culture est réalisée en milieu 2xYT, où le rendement de production est meilleur et la lyse réduite, supplémenté avec de l'ampicilline (lOOμg/ml) et du chloramphenicol (15μg/ml) . L'expression est alors induite en phase exponentielle de croissance (DO600nm = 0,6 à 0,7) avec une concentration en IPTG de ImM, concentration qui s'est avérée optimale. Des échantillons sont prélevés avant induction puis 2 heures, 4 heures et 6 heures après induction, ainsi qu'après une nuit. Des prélèvemments sont aussi réalisés sur les cultures non induites après 6, 8, 12 et 24 heures de culture .
Les échantillons sont alors traités comme indiqué au chapitre Matériel et Méthodes, afin de tester le niveau d'activité de l'ADN polymerase recombinante par
39 incorporation de thymidine tritiée ou de P dCTP. Cette première technique, qui permet une approche qualitative, nous donne deux types de comportement. Un des clones est non inductible et la meilleure activité est obtenue après une nuit de culture (clone rTful-1) . Un second clone est inductible et présente une activité maximale après quatre heures d'induction, activité qui diminue par la suite
(clone rTful00-2). Deux autres clones, aussi testés sont faiblement inductibles et expriment très peu l'ADN polymerase . Les clones rTful-1 et rTful00-2 sont ensuite testés en erlenmeyer de 50 ml dans les conditions décrites précédemment. Seul le clone inductible rTfulOO-2 a une expression constante en volume de 50 ml. La suite des travaux a donc été réalisée sur ce clone .
b) Fermentation et extraction des cellules .
La culture du clone Tful00-2 à été réalisée dans un fermenteur de 16 litres, dans le milieu 2xYT supplémenté en ampicilline et chloramphenicol. La préculture, de 750ml a été réalisée la veille et arrêtée en phase exponentielle (DO 600nm= 0,7-0,8) et laissée à
4°C pour la nuit. Le fermenteur a été préparé et mis en température à 30°C avec le milieu de culture. La préculture a été remise à 30°C une heure avant son transfert dans le fermenteur. Le volume final de culture est de 15 litres. Les conditions sont les suivantes: température = 30°C ; agitation = 300 rpm. L'induction avec 1 mM d'IPTG a été réalisée à DO 600 = 0,58. Le pH de la culture a été régulé à 7 pendant la phase d'acidification puis laissé libre lors de la phase alcaline. Les bactéries ont été prélevées après quatre heures d'induction, alors que le pH était de 8,3. La culture a ensuite été centrifugée puis les cellules ont été divisées en trois lots. L'un d'eux, 20 g de pâte, a été repris dans 80 ml de tampon de lyse pour un traitement ultérieur indiqué au chapitre Matériel et méthodes .
c) Purification de l'ADN polymerase de T. fumicolans .
La purification a été .effectuée comme indiqué précédemment (Matériel et Méthodes) . Pour la colonne Héparine -Sépharose, un gradient de 3 à 50% de tampon B, correspondant aux volume 365 ml à 1363 ml, permet de récupérer 73 fractions de 6 ml . Le pic d'activité de la polymerase est obtenu pour une valeur de gradient de 0,5 M environ, et correspond aux fractions 55/56 (dosées à 10 et 12 unités respectivement) comme indiqué à la figure 7. Ces fractions, incubées à 37°C pendant la nuit en présence d'ADN de pBR322, dégradent l'ADN et présentent en conséquence des traces de nucléase de l'hôte, non visibles sur gel. Leur élimination, ou tout au moins une réduction substancielle de leur concentration a été réalisée par un passage sur colonne d'affinité (Bleue Hitrap) .
Les fractions 54 à 60, regroupées et dialysées, sont chargées à raison de 0,25 ml/mn. L'élution permet de récupérer 65 fractions de 5 ml avec des pics d'activité pour les fractions 36 à 56. Le dosage de l'activité fait apparaître une concentration de 3 à 5 unités pour les fractions 36 à 40. Ces fractions, mises en présence d'ADN à 37°C, pressentent une faible activité nucléasique. Néanmoins, l'activité sur le plasmide pBR322 à
37°C toute la nuit montre une nette amélioration de la pureté de l'enzyme. Une deuxième colonne Bleue HiTrap a été réutilisée en prenant les fractions 36 à 44 et dialysées comme précédemment. 25ml sur les 30ml de fraction ont été injectés sur la colonne avec un débit de 0,25ml/min (5 ml étant gardés pour essayer une MonoQ) . Après cette deuxième colonne Bleue HiTrap, l'activité sur le plasmide pBR322 fermé et incubé toute la nuit avec des fractions de la colonne, est nulle. L'incubation d'une heure à 72°C de fractions avec l'ADN de Lambda digéré par HindIII montre une très nette dégradation, mettant en évidence l'activité exonucléase 3 '-5' associée à notre ADN polymerase. Le pic d'activité se situe entre les fractions 27 et 32. L'ADN polymerase plus pure est donc sortie plus tôt sur le gradient de NaCl. Sur les fractions les plus actives, un comptage a été réalisé donnant une activité supérieure à 5U/μl pour les fractions 29, 30 et 31. La figure 4 montre le résultat sur gel SDS-PAGE. Suite à ces trois colonnes, la pureté de la polymerase est nettement améliorée. Néanmoins, il reste des traces d'ADN de E. coli fixé à la polymerase et mises en évidence par PCR. Deux colonnes supplémentaires vont donc être mis en oeuvre. 30ml de fractions actives obtenues précédemment sont chargées sur une colonne de phosphocellulose (celle-ci devrait fixer différemment l'ADN et la polymerase). L'activité de la polymerase est repérée par son activité exonucléasique 3 '-5' élevée à 72°C sur l'ADN de Lambda digéré par HindIII. L'activité la plus forte se situe entre les fractions 40 et 49 avec un pic net en 46 et 47. Sur ces fractions 40 à 49 l'ADN de pBR322 est intact après une nuit à 37°C. La figure 5 nous montre les résultats sur gel avec des activités
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP mesurées de 6U/μl pour la fraction 46, 4,5U/μl pour la 47 et 3U/μl pour la 48. Néanmoins il reste encore des traces d'ADN de E. coli .
Ayant déjà mis en évidence que cette polymerase ne se fixe pas sur une MonoQ ou une ressource Q et ce quel que soit le pH utilisé, nous avons essayé de la récupérer en exclusion en espérant une fixation de l'ADN contaminant par la colonne.
Tout d'abord un essai a été réalisé en sortie de la deuxième Bleue HiTrap avec 5ml dialyses Les résultats ont été décevants, les fractions d'exclusion étant peu actives en incorporation.
Une deuxième tentative a été réalisée après la phosphocellulose et après deux dialyses des fractions les plus actives 45, 46 et 49. Les fractions sont tout d'abord chauffées 40 min à 85°C en raison d'une détection de contaminant dégradant le pBR322 à 72°C en une nuit. Aucune floculation n'est alors visible et l'extrait est mis sur glace. Un nouveau test démontre que la contamination semble réduite. Après les dialyses et le passage sur colonne, l'activité exonucléasique est mise en évidence sur les fractions d'exclusion 3 à 7. L'activité est dosée à 2U/μl et l'enzyme est visualisée sur la figure 10. Suite a cette dernière étape de purification, nous avons obtenu des résultats positifs en PCR et comparables à ceux obtenus pour la Vent.
d) Caractérisation des activité des fractions purifiées . L'activité de l'ADN polymerase des différentes
32 fractions a été dosée par incorporation au P dATP selon le protocole décrit en Matériel et Méthodes.
- Amplification de gènes in vi tro . Un fragment de 459 pb a été amplifié à partir d'un ADN genomique d'Archaebactérie ( Thermococcus sp. GE
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP 8) avec des amorces spécifiques. Différents tampons ont été utilisés:
- tampon lOx R: Tris HC1 pH 8,8: 300mM; KCl: 500mM; MgC12: 30mM; T een 20: 0,1% - tampon lOx H: Tris HC1 : pH 8,8: 300 mM; KCl:
500mM; MgC12 : 15mM; Tween 20: 0,1%
- tampon lOx T: Tris HC1 pH 8,8: 600mM; KCl: 500mM; MgC12 : 15mM; Tween 20: 0,1%
- tampon lOx S: Tris Hcl pH 8,8: 200mM; KCl: 250mM; MgC12 : 20mM; Tween 20: 0,1%
Trente cycles ont été réalisés, chacun comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 sec., une étape d'hybridation des amorces à 51°C pendant 1 min. puis une étape d' élongation à 72°C pendant 2 min. La figure 8 présente les résultats obtenus avec un volume reactionnel de 50 μl pour des quantités d'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans de 2,7 unités. En l'état actuel, les meilleurs résultats avec la Tfu sont obtenus avec le tampon R . La figure 9 représente les résultats de l'amplification d'un fragment de 1,6 kb avec la Tfu purifiée sur colonnes d'héparine puis de séphacryl-bleue, et un tampon reactionnel lOx ayant la composition suivante: Tris HC1 pH 8,8: 200mM; KCl: lOOmM; (NH4)2Sθ4: lOOmM; MgS04 : 20mM; Triton X-100 : 1%.
- Activité exonucléasique.
Les tests d'activité, selon le protocole détaillé en Matériels et Méthodes, ne révèlent pas d'activité exonucléasique 5 '-3' chez la Tfu. Ceci est en conformité avec la structure de l'enzyme déduite de l'analyse de la séquence polypeptidique qui ne fait pas apparaître de domaine fonctionnel exonucléase 5 '-3', contrairement à ce qui est observé pour DNA poli de E. coli et la Taq.
Les tests d'activité, selon le protocole détaillé au chapitre Matériels et Méthodes, font apparaître une activité exonucléasique 3 '-5' (activité proof-reading ou de correction d'erreurs) chez la Tfu, à un niveau sensiblement égal à celui de la Vent comme montré dans le tableau 4 ci-dessous. Le tableau 4 rapporte la mesure de l'actvité exonucléasique 3 '-5' de la Tfu en fonction de la concentration en dNTP, et en comparaison avec la Vent.
Tableau 4
Figure imgf000033_0001
Ces résultats sont en conformité avec la structure de l'enzyme déduite de l'analyse de la séquence polypeptidique qui révèle la présence d'un domaine exonucléasique 3 '-5' en position N-terminale, ainsi que la présence des motifs catalytiques caractéristiques de ce domaine. La Tfu est sensible à une concentration de l'ordre de 0 , 8 mM de dNTP, tandis que la Vent manifeste une sensibilité dès 0,5 mM. Cette activité est connue pour améliorer in vi tro la fidélité des polymérases utilisées en PCR. En outre, cette activité exonucléasique est confirmée par un test plus simple. Les fractions purifiées, dépourvues d'activité nucléasique à 37°C, mises en présence d'ADN de digéré par HindIII puis exposé à 72°C pendant la nuit, dégradent complètement cet ADN, mettant ainsi en évidence la présence de l'activité 3 '-5' exonucléase de la T f u ainsi que sa thermostabilité .
- Thermostabilité.
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP 32
La thermostabilité mesurée selon le protocole décrit précédemment (Matériel et Méthodes), ou mieux, l'activité résiduelle en incorporation à 72°C après exposition de l'enzyme à des températures élevées pendant des temps variables, est donnée dans le tableau 5 ci- dessous .
Tableau 5
Figure imgf000034_0001
Cette thermostabilité, inférieure à celle des polymérases issues d'organismes plus hyperthermophiles tels que les Pyrococcus , n'en demeure pas moins très largement supérieure à celles des polymérases issues des Thermus et en particulier toutes les Taq. La thermostabilité de l'enzyme recombinante purifiée, tant pour le domaine polymerase que pour l' exonucléase, est de toute manière très largement supérieure à tous les besoins connus en PCR.
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LISTE DE SEQUENCES
;i) INFORMATION GÉNÉRALES :
(i) DEPOSANT : APPLIGENE - ONCOR
( ii) TITRE DE L' INVENTION: ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTÉRIES DE L 'ESPECE THERMOCOCCUS fumicolans (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 5039 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: séquence codante de l 'ADN polymerase de THERMOCOCCUS fumicolans Tfu
(B) EMPLACEMENT: de 457 à 5028 ( ix ) CARACTERI STIQUES
(A) NOM/CLE: séquence codante de 1 ' intéine I-Tfu-1
(B) EMPLACEMENT: de 1675 à 2754 ( ix ) CARACTERI STIQUES
(A) NOM/CLE: séquence codante de 1 ' intéine I-Tfu-2
(B) EMPLACEMENT: de 3157 à 4323 ( ix ) CARACTERI STIQUES
(A) NOM/CLE: codon stop
(B) EMPLACEMENT: de 5026 à 5028
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:l :
AGCTTAAAGC GTCCGCCACT ACTTCCTGAA AGCTCACGCG GTAAAACAGC TCCATGCTCG 60
GCTCTTCGAT GGGAGGTTTA AAAAGGTGGT GGTGAGGTTT ATTAGGAAGA AGGCTCAACT 120
AGAGACGGTG GGAGTATGGA AGAGGTCGAC AGGCTCGTGT TCAACTTTCC CCTCTTCAAA 180
GATTACTGGG AAAAGGAGCG GTTCCTCAAG GTCGTTGGGC TTCTGGTGAG CCACCAGATA 240
ACGTTTGAGA AAGCTGCCGA GCTTCTGGAC ATGAGGCTCG AAGAGCTGGC GTTCCTCCTT 300
GACAAGCTCG GCGTTGAGTA CTCGCTTCTT GATGATGAAG AGGCCAGACT TGAGAGAGAA 360
GAGGCCAATA AGCTCATGGG GGAAATGAAG GGTGGAGCGT TTGTCTGATT CTTCTGAGCT 420
GTTATTGGTG TTTCACAGGC TGGGAGGTGG TGGATT ATG ATC CTC GAT ACA GAC 474
Met Ile Leu Asp Thr Asp 1 5
TAC ATC ACC GAA GAC GGA AGG CCC GTC ATC AGG GTG TTC AAG AAG GAG 522
Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Arg Pro Val Ile Arg Val Phe Lys Lys Glu 10 15 20 AAC GGC GAG TTC AAA ATC GAG TAC GAC AGG GAC TTC GAG CCT TAC ATC 570 Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Asp Phe Glu Pro Tyr Ile 25 30 35
TAC GCT CTC CTG AAG GAC GAT TCC GCG ATC GAG GAC GTC AAG AAG ATA 618 Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Asp Val Lys Lys Ile 40 45 50
ACT GCA AGC CGG CAC GGT ACC ACC GTC AGG GTC GTC AGG GCC GGG AAG 666 Thr Ala Ser Arg His Gly Thr Thr Val Arg Val Val Arg Ala Gly Lys 55 60 65 70
GTG AAG AAG AAG TTC CTC GGC AGG CCG ATA GAG GTC TGG AAG CTC TAC 714 Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys Leu Tyr 75 80 85
TTC ACC CAT CCC CAG GAC GTT CCG GCA ATC AGG GAC AAA ATC AGG GAG 762 Phe Thr His Pro Gin Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu 90 95 100
CAC CCT GCC GTG GTC GAC ATA TAT GAG TAC GAC ATA CCC TTT GCC AAG 810 His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys 105 110 115
CGC TAC CTC ATC GAT AAG GGC CTC ATC CCG ATG GAG GGC GAC GAG GAG 858 Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu 120 125 130
CTC AAG ATG CTC GCC TTC GAC ATC GAG ACG CTC TAC CAC GAG GGC GAG 906 Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu 135 140 145 150
GAG TTC GCC GAG GGG CCT ATT CTT ATG ATA AGC TAT GCC GAC GAG GAA 954 Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu 155 160 165
GGG GCG AGG GTA ATA ACC TGG AAG AAG ATC GAC CTT CCC TAC GTT GAC 1002 Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile Asp Leu Pro Tyr Val Asp 170 175 180
GTC GTT TCA ACG GAG AAG GAG ATG ATA AAG CGC TTC CTG AAG GTT GTC 1050 Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Lys Val Val 185 190 195
AAG GAG AAG GAC CCC GAT GTC CTC ATA ACC TAC AAC GGC GAC AAC TTC 1098 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe 200 205 210
GAC TTC GCT TAC CTC AAG AAG CGC TCC GAG AAG CTC GGC GTT AAG TTC 1146 Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu Lys Leu Gly Val Lys Phe 215 220 225 230
ATC CTC GGA AGG GAC GGC AGC GAG CCG AAG ATA CAG AGG ATG GGC GAC 1194 Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gin Arg Met Gly Asp 235 240 245
CGC TTC GCC GTC GAG GTG AAG GGA AGA ATA CAC TTC GAC CTC TAC CCC 1242 Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro 250 255 260 GTC ATA AGA CAC ACC ATC AAC CTG CCC ACC TAC ACG CTG GAG GCC GTC 1290 Val Ile Arg His Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val 265 270 275
TAC GAG GCG ATT TTT GGG CAG CCA AAG GAG AAG GTC TAC GCT GAG GAG 1338 Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Gin Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu 280 285 290
ATA GCG CAG GCC TGG GAA ACG GGC GAG GGG CTT GAG CGC GTC GCG CGC 1386 Ile Ala Gin Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Val Ala Arg 295 300 305 310
TAC TCG ATG GAG GAC GCC AAG GTA ACC TAC GAG CTG GGA AGG GAG TTC 1434 Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Arg Glu Phe 315 320 325
TTC CCG ATG GAG GCC CAA CTT TCT CGG CTG GTC GGT CAG AGC TTC TGG 1482 Phe Pro Met Glu Ala Gin Leu Ser Arg Leu Val Gly Gin Ser Phe Trp 330 335 340
GAC GTC TCG CGC TCC AGC ACC GGC AAC CTC GTC GAG TGG TAC CTC CTC 1530 Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Tyr Leu Leu 345 350 355
AGG AAG GCC TAC GAG AGG AAC GAG CTG GCA CCG AAC AAG CCC TCC GGC 1578 Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser Gly 360 365 370
AGA GAA CTT GAG AGG CGC CGC GGG GGC TAC GCC GGC GGC TAC GTC AAG 1626 Arg Glu Leu Glu Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Tyr Val Lys 375 400 405 410
GAG CCG GAG AGG GGA CTT TGG GAG AAC ATA GCT TAT TTA GAT TTT AGG 1674 Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Ala Tyr Leu Asp Phe Arg 415 420 425
TGT CAT CCT GCC GAC ACT AAA GTC ATT GTC AAA GGG AAG GGC GTT GTA 1722 Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Ile Val Lys Gly Lys Gly Val Val 430 435 440
AAC ATC AGC GAA GTT AGG GAG GGG GAC TAC GTT CTC GGC ATA GAC GGC 1770 Asn Ile Ser Glu Val Arg Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 445 450 455
TGG CAG AAG GTT CAA AGG GTC TGG GAG TAT GAT TAC GAG GGA GAA CTC 1818 Trp Gin Lys Val Gin Arg Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Leu 460 465 470
GTA AAT ATA AAC GGC CTT AAG TGC ACA CCG AAC CAT AAG CTT CCG GTC 1866 Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 475 480 485 490
GTT AGG AGG ACT GAG AGG CAG ACT GCG ATA AGG GAC AGC CTT GCA AAG 1914 Val Arg Arg Thr Glu Arg Gin Thr Ala Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 495 500 505
TCT TTT CTC ACG AAA AAA GTT AAA GGT AAG CTG ATA ACC ACG CCT CTC 1962 Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Leu Ile Thr Thr Pro Leu 510 515 520 TTT GAA AAA ATC GGG AAG ATC GAG CGA GAG GAC GTG CCA GAA GAG GAG 2010 Phe Glu Lys Ile Gly Lys Ile Glu Arg Glu Asp Val Pro Glu Glu Glu 525 530 535
ATA CTC AAA GGA GAA CTC GCC GGA ATA ATC CTG GCT GAG GGC ACA CTC 2058 Ile Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Ile Leu Ala Glu Gly Thr Leu 540 545 550
CTG AGA AAG GAT GTC GAG TAC TTT GAC TCT TCC AGA GGG AAG AAG AGA 2106 Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Gly Lys Lys Arg 555 560 565 570
GTA TCA CAC CAG TAC AGG GTT GAA ATA ACC GTT GGG GCG CAG GAG GAG 2154 Val Ser His Gin Tyr Arg Val Glu Ile Thr Val Gly Ala Gin Glu Glu 575 580 585
GAC TTC CAG AGG AGG ATC GTT TAC ATT TTC GAA CGC CTC TTT GGG GTA 2202 Asp Phe X Arg Arg Ile Val Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Val 590 595 600
ACT CCC AGT GTT TAC CGG AAA AAG AAC ACA AAC GCA ATA ACG TTC AAA 2250 Thr Pro Ser Val Tyr Arg Lys Lys Asn Thr Asn Ala Ile Thr Phe Lys 605 610 615
GTT GCC AAA AAA GAG GTT TAT CTT AGG GTT AGG GAA ATT ATG GAT GGC 2298 Val Ala Lys Lys Glu Val Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ile Met Asp Gly 620 625 630
ATT GAG AAC CTC CAC GCT CCT TCT GTG TTA AGG GGC TTT TTT GAA GGA 2346 Ile Glu Asn Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 635 640 645 650
GAC GGA AGC GTC AAC AAG GTC CGG AAG ACA GTG GTA GTG AAT CAG GGC 2394 Asp Gly Ser Val Asn Lys Val Arg Lys Thr Val Val Val Asn Gin Gly 655 660 665
ACC AAT AAT GAA TGG AAA ATT GAA GTG GTG TCA AAA CTC CTC AAC AAG 2442 Thr Asn Asn Glu Trp Lys Ile Glu Val Val Ser Lys Leu Leu Asn Lys 670 675 680
TTG GGG ATT CCG CAT AGA AGG TAC ACA TAC GAT TAC ACC GAA AGA GAA 2490 Leu Gly Ile Pro His Arg Arg Tyr Thr Tyr Asp Tyr Thr Glu Arg Glu 685 690 695
AAA ACC ATG ACA ACG CAT ATA CTT GAG ATA GCC GGC AGG GAT GGG TTA 2538 Lys Thr Met Thr Thr His Ile Leu Glu Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu 700 705 710
ATC CTT TTC CAG ACC ATT GTG GGA TTC ATA AGC ACT GAG AAG AAC ATG 2586 Ile Leu Phe Gin Thr Ile Val Gly Phe Ile Ser Thr Glu Lys Asn Met 715 720 725 730
GCG CTG GAG GAG GCA ATC AGG AAC AGG GAA GTG AAC CGC CTA GAA AAC 2634 Ala Leu Glu Glu Ala Ile Arg Asn Arg Glu Val Asn Arg Leu Glu Asn 735 740 745
AAT GCC TTC TAT ACC CTA GCC GAC TTT ACG GCG AAG ACA GAG TAC TAC 2682 Asn Ala Phe Tyr Thr Leu Ala Asp Phe Thr Ala Lys Thr Glu Tyr Tyr 750 755 780 AAG GGC AAA GTT TAC GAC TTA ACC CTT GAG GGA ACG CCC TAT TAC TTC 2730 Lys Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 785 790 795
GCC AAT GGC ATA CTG ACC CAC AAT TCG CTA TAT CCT TCG ATT ATA ATT 2778 Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile 800 805 810
TCC CAC AAC GTC TCC CCC GAT ACG CTC AAC CGC GAG GGC TGC GGG GAG 2826 Ser His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Gly Glu 815 820 825 830
TAC GAC GAG GCT CCG CAG GTA GGG CAT CGC TTT TGT AAG GAC TTC CCC 2874 Tyr Asp Glu Ala Pro Gin Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro 835 840 845
GGC TTC ATC CCC AGC CTC CTC GGT GAC CTG CTC GAC GAG AGG CAG AAG 2922 Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gin Lys 855 860 865
GTA AAG AAG CAC ATG AAG GCC ACG GTG GAC CCG ATA GAG AAG AAG CTC 2970 Val Lys Lys His Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Ile Glu Lys Lys Leu 870 875 880
CTC GAT TAC AGG CAG CGC GCA ATT AAA ATC CTC GCC AAC AGC TTC TAC 3018 Leu Asp Tyr Arg Gin Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr 885 890 895
GGC TAC TAT GGC TAC GCA AAG GCC CGC TGG TAC TGC AAG GAG TGC GCC 3066 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala 900 905 910 915
GAG AGC GTT ACC GCC TGG GGC AGG CAG TAC ATT GAG ACC ACC ATG AGG 3114 Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gin Tyr Ile Glu Thr Thr Met Arg 920 925 930
GAA ATA GAG GAA AAA TTT GGC TTT AAA GTG CTG TAC GCG GAT AGT GTT 3162 Glu Ile Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Ser Val 935 940 945
ACA GGG GAC ACA GAG GTA ACC ATC AGA AGA AAC GGC AGG ATT GAG TTC 3210 Thr Gly Asp Thr Glu Val Thr Ile Arg Arg Asn Gly Arg Ile Glu Phe 950 955 960
GTT CCA ATC GAG AAA CTC TTT GAG CGC GTT GAT CAC CGT GTT GGT GAG 3258 Val Pro Ile Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp His Arg Val Gly Glu 965 970 975
AAG GAG TAC TGC GTT CTT GGA GGG GTT GAG GCA CTG ACA CTC GAC AAC 3306 Lys Glu Tyr Cys Val Leu Gly Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu Asp Asn 980 985 990 995
AGG GGC AGG CTC GTG TGG AAG AAG GTT CCG TAC GTC ATG AGA CAT AAA 3354 Arg Gly Arg Leu Val Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val Met Arg His Lys 1000 1005 1010
ACG GAC AAA AGA ATC TAT AGG GTA TGG TTC ACC AAC TCT TGG TAC CTT 3402 Thr Asp Lys Arg Ile Tyr Arg Val Trp Phe Thr Asn Ser Trp Tyr Leu 1015 1020 1025 GAC GTG ACG GAG GAT CAC TCG CTA ATA GGC TAC CTG AAC ACA AGC AAA 3450 Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Asn Thr Ser Lys 1030 1035 1040
GTC AAA CCC GGA AAG CCC TTG AAA GAG CGT CTC GTC GAG GTC AAG CCA 3498 Val Lys Pro Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Leu Val Glu Val Lys Pro 1045 1050 1055
GAA GAA TTG GGG GGT AAG GTC AAG TCT CTC ATT ACG CCC AAT CGG CCA 3546 Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Lys Ser Leu Ile Thr Pro Asn Arg Pro 1060 1065 1070 1075
ATT GCC CGT ACC ATC AAG GCC AAC CCC ATT GCC GTC AAG CTC TGG GAG 3594 Ile Ala Arg Thr Ile Lys Ala Asn Pro Ile Ala Val Lys Leu Trp Glu 1080 1085 1090
TTA ATT GGC CTG CTG GTG GGA GAT GGC AAC TGG GGT GGA CAA TCG AAC 3642 Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gin Ser Asn 1095 1100 1105
TGG GCC AAA TAC TAC GTT GGC CTC TCC TGT GGG CTG GAT AAA GCC GAA 3690 Trp Ala Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Ser Cys Gly Leu Asp Lys Ala Glu 1110 1115 1120
ATA GAG AGA AAA GTC CTG AAC CCT TTA AGA GAG GCA AGC GTC ATC TCC 3738 Ile Glu Arg Lys Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Ala Ser Val Ile Ser 1125 1130 1135
AAC TAC TAC GAC AAG AGC AAG AAG GGC GAC GTT TCC ATA CTC TCC AAG 3786 Asn Tyr Tyr Asp Lys Ser Lys Lys Gly Asp Val Ser Ile Leu Ser Lys 1140 1145 1150 1155
TGG CTC GCC GGA TTC ATG GTC AAA TAC TTC AAA GAT GAA AAT GGG AAC 3834 Trp Leu Ala Gly Phe Met Val Lys Tyr Phe Lys Asp Glu Asn Gly Asn 1160 1165 1170
AAG GCC ATT CCC AGC TTC ATG TTC AAC CTT CCA AGG GAA TAC ATA GAG 3882 Lys Ala Ile Pro Ser Phe Met Phe Asn Leu Pro Arg Glu Tyr Ile Glu 1175 1180 1185
GCC TTT CTA CGG GGG CTG TTT TCA GCG GAC GGA ACG GTA AGC TTG CGT 3930 Ala Phe Leu Arg Gly Leu Phe Ser Ala Asp Gly Thr Val Ser Leu Arg 1190 1195 1200
AGA GGA ATC CCA GAA ATT AGA CTG ACA AGC GTT AAC AGA GAG CTT AGT 3978 Arg Gly Ile Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Val Asn Arg Glu Leu Ser 1205 1210 1215
GAT GCC GTG AGA AAG TTG CTG TGG CTG GTT GGG GTC TCC AAC TCA CTA 4026 Asp Ala Val Arg Lys Leu Leu Trp Leu Val Gly Val Ser Asn Ser Leu 1220 1225 1230 1235
TTC ACC GAA ACC AAG CCA AAC CGG TAC CTG GAG AAA GAA AGT GGA ACG 4074 Phe Thr Glu Thr Lys Pro Asn Arg Tyr Leu Glu Lys Glu Ser Gly Thr 1240 1245 1250
CAT TCG ATT CAC GTG AGG ATA AAG AAC AAG CAT CGC TTT GCC GAT AGA 4122 His Ser Ile His Val Arg Ile Lys Asn Lys His Arg Phe Ala Asp Arg 1255 1260 1265 ATA GGC TTT CTC ATA GAC AGA AAA TCC ACC AAA CTC TCC GAG AAC CTG 4170 Ile Gly Phe Leu Ile Asp Arg Lys Ser Thr Lys Leu Ser Glu Asn Leu 1270 1275 1280
GGG GGA CAT ACA AAC AAG AAG AGG GCT TAC AAA TAT GAT TTT GAC TTG 4218 Gly Gly His Thr Asn Lys Lys Arg Ala Tyr Lys Tyr Asp Phe Asp Leu 1285 1290 1295
GTA TAC CCC AGA AAA ATC GAA GAG ATA ACC TAC GAC GGC TAC GTC TAT 4266 Val Tyr Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr Val Tyr 1300 1305 1310 1315
GAC ATC GAG GTT GAG GGA ACC CAC AGG TTC TTC GCC AAC GGA ATA CTC 4314 Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly Ile Leu 1320 1325 1330
GTT CAC AAC ACA GAC GGC TTT TTC GCA ACA ATC CCC GGA GCG GAC GCC 4362 Val His Asn Thr Asp Gly Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala 1335 1340 1345
GAG ACG GTC AAA AAG AAG GCC AGG GAG TTC CTT AAC TAC ATT AAC CCC 4410 Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Arg Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Pro 1350 1355 1360
AAG CTG CCC GGT CTC CTC GAA CTC GAG TAC GAG GGC TTC TAC AGG CGC 4458 Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Arg Arg 1365 1370 1375
GGT TTC TTC GTA ACC AAG AAG AAG TAC GCG GTG ATA GAC GAG GAG GGC 4506 Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly 1380 1385 1390 1395
AAG ATA ACG ACG CGC GGG CTT GAG ATC GTC CGG CGC GAC TGG AGT GAG 4554 Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu 1400 1405 1410
GTG GCT AAG GAG ACG CAG GCG AGG GTC TTG GAG GCC ATA CTG CGG CAC 4602 Val Ala Lys Glu Thr Gin Ala Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His 1415 1420 1425
GGT GAC GTC GAG GAG GCC GTG AGG ATT GTC AAG GAA GTG ACG GAA AAG 4650 Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys 1430 1435 1440
CTG AGC AAG TAC GAG GTT CCG CCA GAG AAG CTC GTC ATC CAC GAG CAG 4698 Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gin 1445 1450 1455
ATT ACC AGG GAG CTG AAG GAC TAC AAG GCC ACC GGC CCG CAC GTG GCC 4746 Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala 1460 1465 1470 1475
ATA GCG AAG CGC CTC GCC GCG AGG GGG ATT AAG GTT CGC CCT GGG ACA 4794 Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr 1480 1485 1490
GTC ATC AGC TAC ATC GTC CTG AAA GGT TCC GGC AGG ATA GGG GAC AGG 4842 Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg 1495 1500 1505 ACG ATA CCC TTC GAC GAG TTC GAC CCC ACG AAG CAC AGG TAC GAT GCG 4890 Thr Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala 1510 1515 1520
GAG TAC TAC ATC GAG AAC CAG GTT CTG CCG GCG GTG GAG AGA ATC CTC 4938 Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gin Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu 1525 1530 1535
AAG GCC TTC GGC TAC AAG AAG GAG GAT TTG CGC TAC CAG AAG ACG CGG 4986 Lys Ala Phe Gly Tyr Lys Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gin Lys Thr Arg 1540 1545 1550 1555
CAG GTT GGG CTG GGG GCG TGG CTC AAA ATG GGG AAG AAA TGA 5028
Gin Val Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Met Gly Lys Lys
1560 1565 1568
AGGCCAAGCT T 5039
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 774 acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: ADN polymerase de THERMOCOCCUS fumicolans Tfu (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO : 2 :
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Arg Pro Val Ile 1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30
Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Ser Arg His Gly Thr Thr Val Arg 50 55 60
Val Val Arg Ala Gly Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile 65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gin Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95
Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190
Arg Phe Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu 210 215 220
Lys Leu Gly Val Lys Phe Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240
Ile Gin Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg His Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Gin Pro Lys Glu 275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gin Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gin Leu Ser Arg Leu 325 330 335
Val Gly Gin Ser Phe Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350
Val Glu Trp Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365
Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Leu Glu Arg Arg Arg Gly Gly Tyr 370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400
Ala Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Ser His 405 405 410
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Gly Glu Tyr Asp 415 420 425
Glu Ala Pro GÏn Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 430 435 440
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gin Lys Val Lys 445 450 455
Lys His Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Ile Glu Lys Lys Leu Leu Asp 460 465 470 475
Tyr Arg Gin Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr 480 485 490 Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 495 500 505
Val Thr Ala Trp Gly Arg Gin Tyr Ile Glu Thr Thr Met Arg Glu Ile 510 515 520
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 525 530 535
Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 540 545 555 560
Arg Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Arg Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Val Ala Lys Glu Thr Gin Ala 610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val 625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gin Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685
Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Thr Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gin 725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Lys Lys 740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gin Lys Thr Arg Gin Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765
Leu Lys Met Gly Lys Lys 770 774 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 3 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 360 acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine ( ix ) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: intéine I-Tfu-1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO: 3 :
Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Ile Val Lys Gly Lys Gly Val Val 1 5 10 15
Asn Ile Ser Glu Val Arg Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 20 25 30
Trp Gin Lys Val Gin Arg Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Leu 35 40 45
Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 50 55 60
Val Arg Arg Thr Glu Arg Gin Thr Ala Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 65 70 75 80
Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Leu Ile Thr Thr Pro Leu 85 90 95
Phe Glu Lys Ile Gly Lys Ile Glu Arg Glu Asp Val Pro Glu Glu Glu 100 105 110
Ile Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Ile Leu Ala Glu Gly Thr Leu 115 120 125
Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Val Ser His Gin Tyr Arg Val Glu Ile Thr Val Gly Ala Gin Glu Glu 145 150 155 160
Asp Phe X Arg Arg Ile Val Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Val 165 170 175
Thr Pro Ser Val Tyr Arg Lys Lys Asn Thr Asn Ala Ile Thr Phe Lys 180 185 190
Val Ala Lys Lys Glu Val Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ile Met Asp Gly 195 200 205
Ile Glu Asn Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 210 215 220
Asp Gly Ser Val Asn Lys Val Arg Lys Thr Val Val Val Asn Gin Gly 225 230 235 240
Thr Asn Asn Glu Trp Lys Ile Glu Val Val Ser Lys Leu Leu Asn Lys 245 250 255
Leu Gly Ile Pro His Arg Arg Tyr Thr Tyr Asp Tyr Thr Glu Arg Glu 260 265 270 Lys Thr Met Thr Thr His I le Leu Glu I le Ala Gly Arg Asp Gly Leu 275 280 285
Ile Leu Phe Gin Thr Ile Val Gly Phe Ile Ser Thr Glu Lys Asn Met 290 295 300
Ala Leu Glu Glu Ala Ile Arg Asn Arg Glu Val Asn Arg Leu Glu Asn 305 310 315 320
Asn Ala Phe Tyr Thr Leu Ala Asp Phe Thr Ala Lys Thr Glu Tyr Tyr 325 330 335
Lys Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 340 345 350
Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn 355 360
(2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 4 :
( i ) CARACTRERI STIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 389 acides aminés ( ii ) TYPE DE MOLECULE : protéine ( ix ) CARACTERI STIQUES
(A) NOM/CLE : intéine I-Tfu-2 (xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES : SEQ ID NO : 4 :
Ser Val Thr Gly Asp Thr Glu Val Thr I le Arg Arg Asn Gly Arg I le 1 5 10 15
Glu Phe Val Pro Ile Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp His Arg Val 20 25 30
Gly Glu Lys Glu Tyr Cys Val Leu Gly Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu 35 40 45
Asp Asn Arg Gly Arg Leu Val Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val Met Arg 50 55 60
His Lys Thr Asp Lys Arg I le Tyr Arg Val Trp Phe Thr Asn Ser Trp 65 70 75 80
Tyr Leu Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Asn Thr 85 90 95
Ser Lys Val Lys Pro Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Leu Val Glu Val 100 105 110
Lys Pro Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Lys Ser Leu Ile Thr Pro Asn 115 120 125
Arg Pro Ile Ala Arg Thr Ile Lys Ala Asn Pro Ile Ala Val Lys Leu 130 135 140
Trp Glu Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gin 145 150 155 160
Ser Asn Trp Ala Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Ser Cys Gly Leu Asp Lys 165 170 175 Ala Glu Ile Glu Arg Lys Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Ala Ser Val 180 185 190
Ile Ser Asn Tyr Tyr Asp Lys Ser Lys Lys Gly Asp Val Ser Ile Leu 195 200 205
Ser Lys Trp Leu Ala Gly Phe Met Val Lys Tyr Phe Lys Asp Glu Asn 210 215 220
Gly Asn Lys Ala Ile Pro Ser Phe Met Phe Asn Leu Pro Arg Glu Tyr 225 230 235 240
Ile Glu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Phe Ser Ala Asp Gly Thr Val Ser 245 250 255
Leu Arg Arg Gly Ile Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Val Asn Arg Glu 260 265 270
Leu Ser Asp Ala Val Arg Lys Leu Leu Trp Leu Val Gly Val Ser Asn 275 280 285
Ser Leu Phe Thr Glu Thr Lys Pro Asn Arg Tyr Leu Glu Lys Glu Ser 290 295 300
Gly Thr His Ser Ile His Val Arg Ile Lys Asn Lys His Arg Phe Ala 305 310 315 320
Asp Arg Ile Gly Phe Leu Ile Asp Arg Lys Ser Thr Lys Leu Ser Glu 325 330 335
Asn Leu Gly Gly His Thr Asn Lys Lys Arg Ala Tyr Lys Tyr Asp Phe 340 345 350
Asp Leu Val Tyr Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr 355 360 365
Val Tyr Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly 370 375 380
Ile Leu Val His Asn 385 389

Claims

REVENDICATIONS
1) ADN polymerase purifiée thermostable d ' archabactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans ayant un poids moléculaire de l'ordre de 89 000 daltons et ses dérivés enzymatiquement équivalents .
2 ) ADN polymerase selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragments .
3 ) ADN polymerase selon la revendication 2 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2.
4) Une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une ADN polymerase selon quelconque des revendications 1 à 3.
5) Une séquence d'ADN selon la revendication 4 constituée par ou comprenant la séquence comprise entre les nucleotides 357 à 5028 de la séquence SED ID NO : 1, ou un fragment de celle-ci ou encore un assemblage de tels fragments .
6) Une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5 constituée par ou comprenant les nucleotides 357 à 1674 et 2755 à 3156 et 4324 à 5028 de la séquence d'ADN représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SED ID NO : 1.
7) Un vecteur contenant la séquence d'ADN de l'une quelconque des revendications 4 à 6. 8) Un hôte transformé par un vecteur selon la revendication 7.
9) Procédé de préparation d'une ADN polymerase thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans , caractérisé en ce que l'on cultive l'hôte selon la revendication 8 dans des conditions permettant 1 ' expression de ladite ADN polymerase et en ce que 1 ' on extrait et récupère celle-ci par tout moyen approprié.
10) Procédé d'amplification enzymatique d'une séquence d'acide nucléique caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une ADN polymerase thermostable selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
11) Intéine purifiée thermostable d'archaebactéries de l'espèce Thermococcus fumicolans.
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