WO1998048030A1 - Process for producing optically active amino compounds - Google Patents

Description

明 細 書 光学活性ァミノ化合物の製造方法 技術分野

本発明は、 医薬品や農薬等の中間体として用いられる 1位にァリ一ル基等を有 する光学活性なァミノ化合物に関する。 本発明の目的化合物の 1つである 1一 （ 3, 4ージメ トキシフエニル） — 2—ァミノプロパンは、 開発中の抗糖尿病薬、 抗肥満薬として有望な CL 3 1 6 , 24 3 (J. D. Bloom ら、 J. Med. Chem. , 3 5， 3081-3084 (1992))やその類縁化合物の中間体として重要な化合物である。 また、 別の目的化合物である （S) — 2—アミノー 1ーメ トキシプロパンは除 草剤中間体として用いることができる有用化合物である。 背景技術

酵素を用いて 1位にァリ一ル基等を有する光学活性なァミノ化合物を製造する 方法としては、 中道らの報告 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 634-640 (1 990)) 及び特公平 4一 1 1 1 94号公報が挙げられる。 これらは 1一 （置換フエ ニル） 一 2—プロパノン類にアミノ基を酵素的に転移させることによって （S) 体を効率的に合成できることを開示している。 さらに、 特公平 4— 1 1 1 94号 公報には （R) 体の合成についても記載があるが、 （R) 体については、 本発明 者らが特公平 4— 1 1 1 94号公報に記載のある微生物および基質について追試 を行ったところ、 非常に再現性に乏しく、 実用化は困難であると考えられる。 更に、 有機合成的に生産したラセミ体ァミノ化合物に ω—アミノ酸トランスァ ミナーゼを作用させて （S) 体のみを分解し、 残った （R) 体を取得する方法が スターリングら （特開平 3— 1 0 3 1 92号公報） によって開示されているが、 この方法では、 （R) 体を取得するために （S) 体を分解してしまう為、 基質に 対する収率が 5 0 %以下に低下し、 コスト的には有利な方法とは言えない。 また 、 同じくス夕一リングらは ω—アミノ酸トランスアミナーゼを用いて、 ケトン体 からアミノ ドナーの存在下に （S ) —ァミノ化合物のみを合成する方法をも開示 しているが、 この方法では光学活性な （R ) —ァミノ化合物を合成することはで きない。 発明の開示

従って、 本発明の目的は、 微生物酵素による （R ) —ァミノ化合物を主とする 光学活性ァミノ化合物の効率的かつ安価な製造方法を提供することにある。 さら に本発明の目的は、 かかる製造方法に好適に用いることのできる立体選択的なト ランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチド、 及び該ポリペプチドをコードする D N Aを提供することにある。

本発明者らは 1位にァリール基を有するケトン化合物等に、 例えば、 1一 （3 , 4ージメトキシフヱニル） 一 2—プロパノンに （R ) 体選択的にァミノ基を転 移させることによって、 収率良く （R ) — 1— ( 3 , 4—ジメトキシフヱニル） 一 2—ァミノプロパンのような光学活性ァミノ化合物を合成できる微生物を土壌 より発見し、 これを用いる反応の検討をすることによって、 種々の光学活性アミ ノ化合物 （一般式 （2 ) のような立体配置であり、 得られる多くの化合物は上記 のような （R) 体であるが、 不斉炭素に結合する置換基の関係で、 例えば、 （S ) — 2—フエニルグリシノールのように （S ) 体の物もある。 ） を合成できる微 生物を土壌より発見し、 これを用いる反応を検討すると共に、 該反応に関与する 酵素 （以下、 トランスアミナーゼと呼ぶ。 ） の遺伝子を単離し、 大腸菌等を宿主 とした組換え微生物を用いて更に安価にトランスアミナーゼを製造する方法を検 討することによって、 本発明を完成させた。

即ち、 本発明の要旨は、

C 1〕 一般式 （ 1 ) R— (O)p― (CH₂)q— J— (CH₂)r—X (1)

O

(式中、 pは 0または 1を示し、 qは 0〜8の整数を示し、 rは 0〜4の整数を 示し、 Rは炭素数 6〜1 4の置換または無置換のァリール基、 炭素数 4〜1 2の ヘテロァリール基、 カルボシキル基、 炭素数 1〜6のアルコキシカルボニル基、 メチル基、 または水素原子のいずれかを示し、 Xは水酸基、 カルボシキル基、 炭 素数 1〜 6のアルコキシカルボニル基、 または水素原子のいずれかを示す。 ） に 示されるケトン化合物をァミノ基受容体とし、 ァミノ基供与体である第一ァミン の存在下、 トランスァミナ一ゼを作用させて立体選択的にァミノ基転移を行わせ ることにより、

一般式 （ 2 )

H

！

R— (0)p— (CH₂)q— C— (CH₂)r—X (2)

NH₂

(式中、 P、 q、 r、 R、 Xは、 それぞれ一般式 （ 1 ) における p、 q、 r、 R 、 Xと同じである。 ） に示される立体配置を有する光学活性アミノ化合物を得る ことを特徴とする、 光学活性ァミノ化合物の製造方法、

〔2〕 （R ) 体選択的にアミノ基転移を行い、 （R ) 体の光学活性アミノ化 合物を得る前記 〔 1〕 記載の製造方法、

〔3〕 置換ァリール基が、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜6のアルキル基、 水酸 基、 メ トキシ基、 モノフルォロメチル基、 ジフルォロメチル基、 及びトリフルォ ロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ヶ所以上置換さ れたァリール基である、 前記 〔 1〕 又は 〔2〕 記載の製造方法、

〔4〕 Rがメチル基、 フエニル基、 2—メ トキシフエニル基、 3—メ トキシ フエニル基、 4—メ トキシフエ二ル基、 2 , 4—ジメ トキシフヱニル基、 3 , 4 ージメ トキシフエ二ル基、 2 —トリフルォロメチルフエニル基、 3 — トリフルォ ロメチルフエニル基、 及び 4 一トリフルォロメチルフエニル基からなる群より選 択される基である前記 〔 1〕 〜 〔3〕 いずれか記載の製造方法、

〔5〕 ヘテロァリール基がピリジル基、 ビラジニル基、 チェニル基、 フリル 基、 及びチアゾリル基からなる群より選択される基である前記 〔 1〕 又は 〔2〕 記載の製造方法、

〔6〕 pが 0、 qが 1、 rが 1、 Xが水素原子である前記 〔 1〕 〜 〔5〕 い ずれか記載の製造方法、

〔7〕 第一アミンが、 一般式 （3 )

H

一"

(3)

NH₂

' (式中、 R , 、 R ₂ はそれぞれ独立して、 水素原子、 炭素数 1〜1 4の置換若 しくは無置換のアルキル基、 炭素数 6〜1 4の置換若しくは無置換のァリール基 、 炭素数 1〜1 4の置換若しくは無置換のァラルキル基、 カルボキシル基、 又は 炭素数 1〜1 0のアルコキシカルボ二ル基を示し、 R ! と R ₂ は分子内で結合し て環を形成してもよい。 ） に示される化合物である前記 〔 1〕 〜 〔6〕 いずれか 記載の製造方法、

〔8〕 R ! が炭素数 1〜 1 0のアルキル基、 フヱニル基、 又はナフチル基の いずれかであり、 そして R ₂ がメチル基、 ェチル基、 ヒドロキシメチル基、 ヒド ロキシェチル基、 カルボキシル基、 炭素数 1〜 1 0のアルコキシカルボニル基、 又はカルボキシメチル基のいずれかである前記 〔7〕 記載の製造方法、

〔9〕 第一ァミンが （R) 体である前記 〔 1〕 〜 〔8〕 いずれか記載の製造 方法、

〔 1 0〕 第一ァミンが、 D—ァラニンまたはアルキル基の炭素数が 1〜 1 0で ある、 D—ァラニンのアルキルエステルである前記 〔 1〕 〜 〔9〕 いずれか記載 の製造方法、

〔 1 1〕 第一ァミンが、 （R) — 1—フヱニルェチルァミ ン、 （R) — 1— ナフチルェチルァミン、 （R) — 1—メチルプロピルァミン、 （R) — 1—メチ ルへキシルァミン、 （R) — 2—アミノー 1一プロパノール、 （R) — 1—メチ ルブチルァミン、 （R) — 1—フエニルメチルァミン、 （R) — 1—アミノー 1 —フエニルエタノール、 （R) — 2 _アミノー 2—フエニルエタノール、 （R) 一 3—ァミノへブタン、 （R) — 1—アミノー 3—フエニルプロパン、 （R) — 2—アミノー 4—フエニルブタン、 （R) — 2—アミノー 3—フエニルプロパノ —ル、 （R) — 1—メチルヘプチルァミン、 ベンジルァミン、 （S) _ 2—フエ ニルグリシノール、 （R) — 3—ァミノフエ二ルブタン、 L—フエ二ルァラニノ —ル、 （R) — 2—アミノー 1ーメ トキシプロパン、 D—ァラニンメチルエステ ル、 (R) - 1 - (3, 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパン、 （R ) — 1一フエニル— 2—ァミノプロパン、 もしくは D—ァラニンェチルエステル である、 またはこれらのラセミ体である、 前記 〔 1〕 〜 〔 1 0〕 いずれか記載の 製造方法、

〔 1 2〕 立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスアミナー ゼを生産する微生物の培養物、 分離した菌体、 菌体処理物、 または固定化菌体と 、 ケトン化合物及び第一ァミンとを接触させる前記 〔1〕 〜 〔 1 1〕 いずれか記 載の製造方法、

〔 1 3〕 立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスァミナ一 ゼを生産する微生物の無細胞抽出物、 部分精製酵素、 精製酵素、 または固定化酵 素と、 ケトン化合物及び第一アミンとを接触させる前記 〔 1〕 〜 〔 1 1〕 いずれ か記載の製造方法、

〔1 4〕 トランスアミナーゼを生産する微生物がァルスロバクタ一 （Ar t h r ob a c t e r) 属に属する微生物である前記 〔 1 2〕 又は 〔 1 3〕 記載の製 造方法、

〔 1 5〕 ァルスロバクタ一属に属する微生物がァルスロパクター 'スピ一シ一 ズ （A r t h r 0 b a c t e r s p. ) KNK 1 6 8 (F ERM BP— 52 28) である前記 〔 1 4〕 記載の製造方法、

〔 1 6〕 トランスアミナ一ゼを生産する微生物を培養する際に、 該酵素の誘導 物質として （RS) — 1一メチルプロピルァミン、 （RS) — 1—フエ二ルェチ ルァミン、 （R S) — 1一メチルプチルァミン、 （RS) — 3—ァミノ _ 2, 2 ージメチルブタン、 （RS) — 2—アミノー 1ーブ夕ノール、 及び （R) または

(RS) - 1 - (3, 4ージメ トキシフエニル） 一 2—アミノプロパンからなる 群より選択される一種以上のアミン類を培地に添加する前記 〔 1 2〕 〜 〔 1 5〕 いずれか記載の製造方法、

〔 1 7〕 5〜 1 2の範囲の pHでトランスアミナ一ゼを作用させる前記 〔 1〕 〜 〔 1 6〕 いずれか記載の製造方法、

〔 1 8〕 反応促進物質としての界面活性剤又は脂肪酸を添加して、 トランスァ ミナーゼを作用させる前記 〔 1〕 〜 〔 1 7〕 いずれか記載の製造方法、

〔 1 9〕 一般式 （4) で示されるケトン化合物の存在下、 一般式 （5) で示さ れるラセミ体のァミノ化合物にトランスァミナ一ゼを作用させることにより、 立 体選択的にアミノ基転移反応を行い、 一般式 （6) で示される光学活性アミノ化 合物 R厂 g—Rつ (4)

II 一

o

H

R— (O)p— (CH₂)q-(j:— (CH₂)r-X

NH₂

H

R— (O)p— (CH₂)q-C— (CH₂)r-X (₆)

(式中、 R、 P、 q、 r、 X、 R, 、 R₂ は一般式 （ 1 ) 、 一般式 （3) におけ る R、 p、 q、 r、 X、 Ri 、 R₂ と同じである。 ） を得る、 光学活性アミノ化 合物の製造方法、

〔2 0〕 立体選択的にアミノ基を転移させる活性 （ 「立体選択的なトランスァ ミナ一ゼ活性」 と略記する。 ） を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含 有してなる DNA、

〔2 1〕 ポリべプチドがァルスロパクター （A r t h r o b a c t e r) 属に 属する菌株由来のものである前記 〔2 0〕 記載の DNA、

〔2 2〕 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列の全部又はその一部 をコードする DNAであって、 かつ立体選択的なトランスァミナ一ゼ活性を有す るポリべプチドをコ一ドする DNA、

〔2 3〕 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列の全部又はその一部を含 む DN Aであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリぺプ チドをコ一ドする D N A、

〔2 4〕 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列において、 1個以上の塩 基が欠失、 付加、 挿入、 または置換された塩基配列からなる D N Aであって、 か つ立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性を有するポリべプチドをコードする D N 八、

〔2 5〕 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列において、 1個以上 のアミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入、 または置換されたアミノ酸配列からなるポ リぺプチドであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリぺ プチドをコ一ドする D N A、

〔2 6〕 ァルスロパクター属に属する微生物の培養により得ることのできる、 立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリぺプチド、

〔2 7〕 配列表の配列番号： 3、 配列番号： 4、 又は配列番号： 6に記載され た部分ァミノ酸配列を含み、 立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリ ぺプチド、

〔2 8〕 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列の全部又はその一部 を含み、 立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性を有するポリぺプチド、

〔2 9〕 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列において、 1個以上 のアミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入、 または置換されたアミノ酸配列からなるポ リベプチドであって、 かつ立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性を有するポリべ プチド、

〔 3 0〕 前記 〔2 0〕 〜 〔2 5〕 いずれか記載の D N Aを含んでなる組換え D N A、

〔3 1〕 微生物、 動物若しくは動物細胞、 又は植物若しくは植物細胞において 、 コードされたポリペプチドを発現することができる前記 〔3 0 ) 記載の組換え D N A、

〔3 2〕 前記 〔3 0〕 又は 〔3 1〕 記載の組換え D N Aを挿入されてなる、 微 生物、 動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター、

〔33〕 発現べクタ一がプラスミ ド pAT28、 pAT29、 または pAT3 0である前記 〔32〕 記載の発現ベクター、

〔34〕 前記 〔32〕 又は 〔33〕 記載の発現ベクターにより形質転換されて なる形質転換体、

〔35〕 形質転換体が大腸菌である前記 〔34〕 記載の形質転換体、

〔36〕 大腸菌が E. c o l i JM 1 09 (p AT 28) , E. c o 1 i

JM1 09 (pAT29) 、 又は E. c o l i JM1 09 (pAT30) であ る前記 〔35〕 記載の形質転換体、

〔37〕 前記 〔 34〕 〜 〔 36〕 いずれか記載の形質転換体を培養もしくは育 種することによって、 培養に用いた培養液又は該形質転換体より立体選択的なト ランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドを採取することを特徴とする、 立体 選択的なトランスァミナ一ゼ活性を有するポリぺプチドの製造方法、

〔38〕 トランスアミナーゼとして、 前記 〔37〕 記載の製造方法により得ら れる立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを用いる前記 〔 1〕 〜 〔1 9〕 いずれか記載の製造方法、

〔39〕 配列番号： 2に記載した塩基配列を有する DNAの全部あるいは一部 分と、 又は該 DNAの相補鎖の全部あるいは一部分と、 ストリンジヱントな条件 下でハイプリダイズする DN Aであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ 活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA、 並びに

〔40〕 前記 〔20〕 〜 〔25〕 いずれか記載の DNAとストリンジェントな 条件下でハイプリダイズする、 プローブ又はプライマーとして用いることができ るオリゴヌクレオチド、 に関するものである。 図面の簡単な説明

第 1図は、 本酵素の至適 PHを示す図である。 第 2図は、 本酵素の p H安定性を示す図である。

第 3図は、 本酵素遺伝子を持つプラスミ ドの作製方法と簡単な制限酵素地図を 示す図である。 発明を実施するための最良の形態

以下に、 さらに詳しく本発明を説明する。 まず、 本発明における反応スキーム を以下に示す。

R— (O)p一 (CH₂)q— (CH₂)r—X (1)

0

H

R— (O)p— (CH₂)q-C— (CH₂)r—X (2)

NH₂

1 o 本発明者らは、 ケトン類を基質にして （R) 体特異的に （R) —ァミノ化合物 を生成する能力を有する菌を国内土壌より分離すべく、 スクリーニングを重ねた ところ、 ァルスロバクタ一 （Ar t hr ob a c t e r) 属の細菌に本反応を触 媒する強い活性を認めた。 その中で代表的なァルスロパクター 'スピ一シ一ズ 〔 Ar t hr oba c t e r s p. KNK 1 68と命名され、 平成 7年 9月 8 曰 （原寄託日） より受託番号： FERM BP- 5228として、 通商産業省ェ 業技術院生命工学工業技術研究所 （あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305 - 0046 ) ) に寄託されている〕 について、 その菌学的 な性質を以下に示す。

細胞の形態 ：桿菌 （コリネ型）

グラム染色 ：陽性

胞子形成 ：無し

運動性 ：無し

コロニーの形態 ：丸い、 規則的な、 完全な、 黄色、 スムースな、 光沢のある、 やや半透明な、 凸面の、 直径 2 m mのコロニー （Bennett の寒天培地） 生育 （ 30。C) ： +

(37°C) ： - カタラーゼ ： +

ォキシダーゼ ： 一

〇Fテスト （グルコース） ： — （酸化的）

細胞壁 ： ミコール酸無し

ジァミノ酸はリジン

脂肪酸分析 ：殆どが 3つに枝分かれしたイソ、 及びアンティ ソ酸

本菌が生産するトランスアミナ一ゼは、 後に詳述するように、 例えばアミノ基 供与体としては、 （R) — 1ーフヱニルェチルァミンのような （R) 体のァミン を利用し、 アミノ基受容体として 1一 （3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一2—プ ロバノンを用いた場合、 生成物は光学活性な （R) — 1— (3, 4ージメ トキシ フエニル） 一 2—ァミノプロパンを生成する点で、 アミノ基供与体として （S) 体ァミンを利用し、 かつ生成物が光学活性な （S) —ァミノ化合物である、 中道 ら (Appl. Microbiol. Biotechnol., 33， 634-640 (1990)) が用いているブレビ ノくクテリゥム · リーネンス （Br ev i b a c t e r i um l i n en s) I FO 1 2 1 4 1の酵素や、 ス夕一リングら （特開平 3— 1 03 1 92号公報） が 利用した ω—アミノ酸トランスアミナ一ゼとは明らかに異なる。

さらに、 本発明に用いられるァルスロパクターのトランスアミナーゼは、 他の 多くの点で上記のブレビバクテリウムの酵素と異なっている。 例えば、 塩化アン モニゥ厶等の無機のアンモニゥム塩ゃグル夕ミン酸ゃァスパラギン酸等の L—ァ ミノ酸 （ （S) ァミンである。 ） をァミノ基供与体として用いることができない 点等で違っている （表 1)。 表 1

また、 本発明に用いられるァルスロパクターのトランスァミナ一ゼをスターリ ングら （特開平 3— 1 03 1 92号公報） が用いている ω—アミノ酸トランスァ ミナ一ゼと比較すると、 上記の基質特異性についての明確な相違に加えて、 アル スロバクタ一のトランスアミナ一ゼは、 /3—ァラニンや 4—アミノ酪酸等の ω— アミノ酸、 また n —プチルァミン、 ブトレツシンのような ω—ァミン又は D L— 3—ァミノ酪酸等には作用しない点、 そしてヒドロキシルァミンゃフエニルヒド ラジン等の反応阻害剤による影響が微弱である点等が違っている。

また、 本発明者らの酵素と類似する他の酵素としては、 ピルビン酸の存在下で ベンジルァミンに強く作用して Lーァラニンとベンズアルデヒドを生成するベン ジルアミントランスァミナ一ゼが岡田ら （特開平 6— 1 7 8 6 8 5号公報） によ つて開示されているが、 この酵素によるトランスァミナーゼ反応の生成物の光学 活性が、 （S ) 体である L—ァラニンである点で上記のブレビバクテリウ厶の酵 素や ω—アミノ酸トランスァミナーゼと同種の光学選択性を示す酵素であり、 本 発明に使用されるァルスロパク夕一のトランスァミナ一ゼとは全く異なる酵素で あるということができる。

さらに、 これらの酵素を比較した場合、 フヱニルヒドラジン、 D—べ二シラミ ン、 そして ρ —クロロメルクリ安息香酸等の反応阻害剤による影響に差があるよ うに思われる。

以下に ω—アミノ酸トランスアミナーゼとしてよく調べられているシユウドモ ナス s p . F— 1由来の ω—アミノ酸トランスアミナ一ゼ （ァグリカルチユラ ル ·バイオロジカル ·ケミストリ一 （Agri c. Biol. Chem. ), 42 巻， 2363-2367 頁 （1978年） 、 ァグリカルチュラル ·バイオロジカル 'ケミストリー （Agri c. B iol. Chem. ), 43 巻， 1043-1048 頁 （1979年） 、 ジャーナル 'ォブ 'バイオロジ カル 'ケミストリー （J. Biol. Chem. ), 258巻， 2260-2265 頁 （1983年） ） 及び 岡田らのベンジルァミントランスァミナーゼ （特開平 6 - 1 7 8 6 8 5号公報） との違いを表 2にまとめて示す。 本発明のトランスアミナーゼ反応は精製酵素で 、 他の二酵素についてはそれぞれの文献及び公開特許公報に記載されている精製 酵素によるデ一夕で示した。 ァミノ基受容体はいずれもピルビン酸を用いている 表 2

注） * ：数値は相対活性 （％) で示されている。 また、 代表的な ω—アミノ トランスフヱラーゼの基質に対する、 本発明に用い られるトランスアミナーゼ （菌体内酵素） の活性を表 3に示す。 ω—アミノ酸、 ω—アミンをアミノ基供与体とした場合は、 ω—アミノ トランスフェラ一ゼ活性 は極めて小さく、 また ω—アミノ酸一ピルビン酸ァミノ トランスフェラーゼの代 表的基質である —ァラニンには作用しない。 （R ) — 1—フエニルェチルアミ ンに対して特異的に高い活性を示す。 従って、 ω—アミノ トランスアミナ一ゼと は、 基質特異性が全く異なる。 表 3

注） * ：対照 本発明に使用されるァミノ基転移反応を行う際には、 菌の培養時に誘導物質を 添加すれば酵素発現量が上昇する。 かかる誘導物質としては （RS) - 1—メチ ルプロピルァミ ン、 （RS) — 1—フエニルェチルァミ ン、 （RS) — 1—メチ ルブチルァミ ン、 （RS) — 3—アミノー 2, 2—ジメチルブタン、 （RS) — 2—アミノー 1—ブ夕ノール、 及び （R) 又は （RS) — 1一 （ 3, 4—ジメト キシフヱニル） ァミノプロパン等のアミン類からなる群より選択される一種以上 が用いられる。

本発明の DN Aは、 立体選択的にアミノ基を転移させる活性 （ 「立体選択的な トラ ンスアミナーゼ活性」 と略記する。 ） を有するポリペプチドをコードする塩 基配列を含有してなる。 かかる DNAとしては、 例えば、 1 ) 配列表の配列番号 ： 1に記載されたァミノ酸配列の全部又はその一部をコ一ドする DNAであって 、 かつ立体選択的なトラ ンスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする DNA、 2) 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列の全部又はその一部を 含む DNAであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリべ プチドをコードする DNA、 3) 配列表の配列番号： 1に記載されたアミノ酸配 列において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入、 または置換されたァ ミノ酸配列からなるポリべプチドであって、 かつ立体選択的なトランスアミナー ゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA、 及び 4) 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列において、 1個以上の塩基が欠失、 付加、 挿入、 または 置換された塩基配列からなる DNAであって、 かつ立体選択的なトランスァミナ —ゼ活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNAが挙げられる。

本発明の DNAは、 以下に記載する方法でクローニングされ得る。

トランスァミナーゼ遺伝子のクロ一ニング方法としては、 当該活性を指標にす る方法や当該酵素のァミノ酸配列を利用する方法等が利用できる。 本発明ではァ ミノ酸配列を利用する方法について記述するが、 同方法に限定されないことはい うまでもない。 以下、 まず、 トランスアミナーゼの単離精製について説明し、 次 に、 当該トランスァミナーゼ遺伝子をクローニングする方法について説明する。 さらに、 同遺伝子の発現 （トランスアミナーゼの生産） についても説明する。 (トランスアミナ一ゼの単離精製）

用いる菌株としては、 ケトン類を基質にして立体選択的に一般式 （2) で表さ れる様な光学活性ァミノ化合物に変換する立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性 を有するポリべプチドを生産する菌株であればどのような菌株であってもよい。 例えば、 ァルスロバクタ一属に属する菌株由来のものが例示される。 その中で代 表的な菌株ァルスロバクタ一 ·スピーシーズ KNK 1 6 8 (FERM BP- 5 228 ) の生産するトランスアミナーゼの単離精製について以下に示す。

KNK 1 6 8の培養には、 同菌株が生育しかつトランスアミナ一ゼを生産する 培養方法であればどのような方法でもよいが、 好適には次に示す培養方法を用い うる。 2リ ッ トル容ミニジャーを用い、 1. 5リ ッ トルの J培地 （ 5 g// 1 K H₂ P0₄ 5 g/1 K₂ HP〇₄ 、 l gZl Na C K I g/ \ MgS 0₄ · 7Η₂ 〇、 0. 00 5 g/ 1 F e S0₄ · 7Η₂ 0、 0. 0 0 1 g/ 1 Z n S 0₄ · 7Η₂ 0、 0. 0 0 1 g/ 1 Mn C 1₂ · 4 Η₂ 〇、 0. 0 0 05 g/ 1 Cu S0₄ ■ 5H₂ 0 (pH7.5 ) 、 4 0 gZl グリセリン、 3 g /1 粉末酵母エキス、 20 gZl プロエキス （播州調味料製） 、 pH7. 5 に調整） に 30 m 1の同培地で一晩培養した前培養液を植菌し、 30°C、 0. 5 vvm、 4 5 0 111で4 3時間、 pHを 7. 5に調整しながら培養する。 なお 、 培養開始後、 1 4時間後に最終濃度 4 gZl となるように除菌フィルターでろ 過した （RS) — 1一メチルプロピルアミンを添加して培養する。

培養液から遠心分離等の方法によって菌体を集め、 好適な緩衝液、 例えば 20 mMリン酸カリウム緩衝液 （pH 6. 8) 、 0. 0 1 % 2—メルカプトエタノー ルに懸濁する。 ダイノ ミル （Dynomill、 スイス） 等の処理によって菌体を破砕し 、 遠心分離によって上清を得る。 これに、 硫酸プロ夕ミンを 5 OmgZm 1 とな るように添加して核酸を除き、 硫安等の塩折によってトランスアミナ一ゼを沈殿 させる。 好適な例として、 硫安 3 0 %から 6 0 %飽和の間で塩析される画分が集 められる。 これを前記緩衝液に溶解させ、 同緩衝液に対して透析した後、 陰ィォ ン交換樹脂によって更に精製される。 好適な例として、 透析サンプルを 2 0% ( v/v) グリセリン、 0. 3M Na C l、 20 /M ピリ ドキサ一ルリン酸と なるように添加した同緩衝液組成に調整後、 この液で平衡化した D E A E _セフ ァロース、 ファーストフ π— (フアルマシア LKB) カラムに供し、 前記緩衝液 で該カラムを洗浄後、 0. 3— 0. 5 Na C 1直線濃度勾配によって溶出さ せる。 活性画分を集め疎水クロマトグラフィーを行うことによって更に精製され うる。 好適には、 フエニル 'セファロース （フアルマシア LKB) が用いられる 。 活性画分を透析後、 0. 2Mになるように硫安を添加し、 0. 3M Na C 1 のかわりに 0. 2M 硫安を含む前記緩衝液で平衡化したフ 二ルセファロース カラムに供し、 0. 2から 0Mの硫安の直線濃度勾配によって溶出する。 この活 性画分の硫安濃度を 0. 6 Mに調整した後、 0. 2M 硫安のかわりに 0. 6M 硫安を含む緩衝液で平衡化したプチルセファロース （フアルマシア L K B ) 力 ラムに供する。 この活性画分を集め、 限外ろ過等の方法によって濃縮することに より、 S D S —ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動でほぼ単一まで精製されたトラ ンスァミナーゼ標品を得ることができる。

(アミノ酸配列分析）

次に、 精製されたトランスアミナ一ゼについて、 その部分アミノ酸配列に関す る情報を得る。 部分アミノ酸配列を決定は、 エドマン分解法によって行うことが でき、 気相プロテインシークェンサ一 （アプライ ド ·バイオシステム社、 4 7 0 A型） 等を利用することによってァミノ酸配列を決定できる。 精製されたトラン スァミナ一ゼを用いて直接ァミノ酸配列決定を行うことによって、 N末端ァミノ 酸配列を決定できる。 あるいは、 特異性の高いタンパク質加水分解酵素、 例えば 牛眸臓由来 N— トシル— L—フエニルァラニルクロロメチルケトン （T P C K) 一トリプシン、 Staphyrococcus aureus V8 strain 由来 V 8プロテア一ゼ等、 を 作用させて限定加水分解を行い、 得られるぺプチド断片を逆相系 H P L C等を用 いて分離精製した後、 アミノ酸配列を決定し、 内部アミノ酸配列を得ることがで きる。

こうして得られる部分ァミノ酸配列の情報をもとにトランスァミナーゼのクロ 一二ングを行い得る。

(トランスアミナーゼ遺伝子のクローニング）

トランスァミナーゼの部分ァミノ酸配列をもとに同遺伝子のクロ一ニングを行 う方法としては、 一般的に用いられる P C R法やハイプリダイゼーシヨン法、 ま たそれらの組みあわせ等が用いられうる。

a ) 染色体 D NAライブラリーの作成

染色体 D N Aライブラリーの作成はプラスミ ドベクター、 や； Iファージベクタ 一あるいはコスミ ドベクターを用いる方法が Maniat is等によって示されている （ Molecular Cloning ， T. aniatis ら、 Cold Spring Harbor Press; ₀ K N K 1 6 8の染色体 D N Aは Current Protocol in Molecular Biology (F. Ausubel 等 Wi l ly Interscience) に記載の方法等によって調製することができる。 得られ た染色体 D NAを種々の制限酵素、 たとえば Sau3AIや TthHB8I 、 によって部分消 化を行い、 ァガロースゲル電気泳動やショ糖密度勾配遠心等の方法によって、 ベ クタ一に組み込むために適切な大きさの染色体 D N A断片を精製する。 ベクター の挿入部位は染色体 D N Aの調製に使用される制限酵素によって、 適切に選ぶ必 要がある。 例えば、 染色体 D NAを Sau3AIで切断して調製した場合には、 BamHI が好適である。 スファージベクタ一ではおよそ 8 k bから 2 0数 k bの D N A断 片を挿入することが可能であり、 コスミ ドベクターではさらに大きな D N A断片 を挿入することができる。 プラスミ ドを用いたライブラリ一では大きな D NA断 片を揷入することが、 後述するスクリーニングを行う上で有利であるが、 どのよ うなサイズの染色体 D NA断片を挿入してもよい。 プラスミ ドベクタ一としては pUC18， pUC19， pUC119，pTV118Nなどが好適に使用できるが、 特に限定されない。 染色体 D N Aライブラリ一としては上記のいずれを用いてもよいが、 以下、 プ ラスミ ドを用いた場合について詳述する。

b ) 形質転換

上記の方法で作製した組み換えプラスミ ドを宿主に導入して宿主を形質転換す るが、 宿主として大腸菌を使用する場合、 宿主大腸菌としては形質転換能を有す るものであれば野生株、 変異株のいずれも使用できる。 形質転換方法は通常もち いられる方法、 例えば T. Maniatis等の方法 (Molecular Cloning , T. Maniatis 等 、 Cold Spring Harbor Press) によって行うことができる。

形質転換株の選別は、 例えば PUC19 の場合、 アンピシリンを含むプレート培地 上で生育するコロニーとして選別される。 さらに、 染色体 D N Aを挿入された形 質転換株は 5—プロモー 4 一クロ口— 3—インドリル— — D—ガラクトビラノ シド （X— G a 1 ) およびイソプロピル一 /3— D—チォガラク トビラノシド （ I P T G) を含むプレート上で、 アンピシリン耐性を示しかつ白色を呈するコロニ 一を選別することによって得られる。

このようにしてプラスミ ドベクターを用いた染色体 DNAライブラリ一が作製 され得る。

c) プローブの作製

ハイプリダイゼ一ションゃ PCRに用いるためのプローブやプライマーとして 使用される DNAは高い特異性が要求される。 トランスァミナーゼの部分ァミノ 酸配列からプローブやプライマーを作製する場合、 当該アミノ酸配列に対応する 一本鎖 DN Aを作製することが一般的である。 各ァミノ酸に対応するコ ドンはメ チォニンやトリプトファンのように 1種類のものからロイシンのように 6種類の ものまである。 プローブやプライマ一の特異性を高めるためには、 それらの鎖長 を長くする必要があり、 また当該ァミノ酸配列に対応する塩基配列の種類が少な いことも必要である。 好適な例としては、 1 5ヌクレオチド以上の鎖長からなり 、 1 00〜200種類以下の一本鎖 DN Aの混合物が望ましいが、 特異性が得ら れればこれらに限るものではない。 また、 複数の塩基が対応する部位にイノシン を導入することによって、 プローブやプライマ一として使用する場合もある。 こ れらの DN Aは DN A合成機等を用いて合成することができる。

トランスアミナーゼのクロ一ニングをコロニーハイブリダイゼーシヨンによつ て行う場合には、 合成したプローブの 5' 末端を放射能標識や蛍光標識等を行う 。 放射能標識の例としては 〔7—³² P〕 一 ATPと MEGALABEL^TM (宝酒 造 （株） ） を用いることにより、 高比活性のプローブを調製することができる。 部分ァミノ酸配列を基に N末端側と内部の 2本のブライマ一を前述したように 合成し、 染色体 DNAをテンプレートにして PCR反応を行うことにより、 トラ ンスァミナーゼの遺伝子の一部を増幅することができる。 こうして増幅した遺伝 子を放射能標識や蛍光標識等をおこないプローブとしてコロニーハイブリダィゼ —シヨンに供することもできる。 放射能標識の例としては、 〔ひ—³² P〕 一 dC TPと Rand om Pr ime r DN A Lab e l i ng k i t v e r 2 (宝酒造（ 株） ） を用いることにより、 高比活性のプローブを調製すること ができる。 なお当該 PC R増幅 DN Aがトランスァミナ一ゼ遺伝子の一部である ことは、 当該 D N Aを後述する D N A塩基配列の決定法によつて塩基配列を決定 し、 前記塩基配列から推定されるァミノ酸配列と先に得られている部分ァミノ酸 配列とを比較することによつて確認できる。

d) コロニーハイブリダイゼーションによるトランスァミナーゼ遺伝子のクロー ニング

プラスミ ドライブラリーとプローブをもちいてコロニーハイブリダイゼ一ショ ンを行い、 トランスアミナ一ゼ遺伝子のクローニングを行う。 コロニーハイブリ ダイゼーシヨンは T.Maniatis 等の方法 （Molecular Cloning, T. Maniatis 等、 Cold Spring Harbor Laboratry Press) が禾 U用できる。

放射能標識や蛍光標識された部分ァミノ酸配列に対応する合成 D N Aプローブ を利用する場合は、 ハイブリダィゼーシヨンの温度や洗浄の際の温度、 塩濃度を 当該 DN Aの Tm値を考慮してそれぞれのプローブに対して設定する必要がある ο

PCRで増幅した DN A断片をプローブとして利用する場合は、 比較的鎖長が 長いことから、 ハイブリダィゼーシヨンや洗浄の際の温度は 60〜65°Cが用い られる場合が多い。

このようにしてスクリ一二ングされた陽性クローンについてプラスミ ド DNA を抽出し、 塩基配列の決定を行い、 該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と内 部ァミノ酸配列とを比較することによって目的クローンであるかどうか決定する ことができる。

こうしてクローニングされたトランスァミナ一ゼ遺伝子からは 1種類のポリべ プチドが翻訳されるが、 各ァミノ酸に対応するコドンは 1〜 6種類あることから 、 当該ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する遺伝子は多種類存在する。 また、 当該ポリペプチドのアミノ酸配列に、 アミノ酸置換や欠失、 挿入または付加を導 入した立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする 遺伝子も多種類存在する。 更に、 当該遺伝子をクローニングした生物種以外の生 物が有する立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリべプチドをコード する遺伝子は、 当該遺伝子とはアミノ酸配列が全く同一ではないが、 アミノ酸配 列や塩基配列においてホモロジ一が存在する。

塩基配列のホモロジ一を実験的に検出する方法としてハイプリダイゼーション 法が利用できるが、 当該トランスァミナーゼ遺伝子の全てまたは一部分とハイブ リダィズする遺伝子として、 上記トランスアミナーゼ遺伝子は含まれる。 従って 、 当該トランスアミナーゼ遺伝子の全てまたは一部分とハイブリダィズする遺伝 子は、 本発明に包含されると言える。

具体的には、 配列表の配列番号： 2に示される DNAの全部あるいは一部分と 、 又はかかる DNAの相補鎖の全部あるいは一部分と、 ストリンジヱントな条件 下でハイプリダイズする DN Aであって、 かつ立体選択的なトランスァミナ一ゼ 活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNAが挙げられる。

また、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 本発明の DN Aとストリンジヱン卜な 条件下でハイプリダイズするオリゴヌクレオチドであって、 プローブ又はプライ マーとして用いることができる。

ハイブリダイゼーシヨンは、 T. Ma n i a t i sらの方法 （Mo 1 e c u 1 a r C l on i ng, T. Man i a t i sら， Co l d Sp r i ng H a rbo r Labo r a t o r y Pr e s s) 等が利用でき、 その特異性は ハイブリダィズする温度、 洗浄温度、 洗浄液の塩濃度等によって決定される、 プ ローブとして用いる当該トランスァミナーゼ遺伝子の長さや、 対象となる DN A との組合せによってハイプリダイゼーシヨンの条件を適宜選べば良い。 ハイプリ ダイズはストリンジ ントな条件で行われ、 具体的には、 温度と洗浄温度は 30 °C以上が用いられ、 洗浄液の塩濃度は 2XSSCまたは 2XSSP E以下の塩濃 度の洗浄液が用いられる。

e) DNA塩基配列の決定

DNA塩基配列の決定は、 Sanger法あるいは Maxam- Gilbert 法 (Molecular CI oning, T.Maniatis等、 Cold Spring Harbor Laboratory Press ) を用レヽて行わ れ得る。 さらに、 （株） パーキンエルマ一ジャパンの DNA Sequencing kit (Dye T erminater Cycle Sequencing Ready React ion)を用い、 ABI373A DNA シーケンサ 一によつて行うこともできる。

決定された塩基配列を解析し、 該塩基配列から推定されるァミノ酸配列と先に 得られている部分ァミノ酸配列とを比較することにより トランスァミナ一ゼ遺伝 子の構造を明らかにすることができる。

(トランスアミナーゼの遺伝子発現）

トランスァミナーゼの生産を行うためには宿主として微生物、 動物および動物 細胞、 植物および植物細胞等が利用され得る。 それぞれの宿主に対して好適な発 現べクタ一に、 トランスアミナーゼ遺伝子を挿入し、 当該宿主に形質転換を行う 。 得られる形質転換株を培養することにより、 トランスアミナーゼを生産するこ とができる。

好適な例として、 大腸菌を宿主として用いることができる。 発現べクタ一とし てはラク ト一スオペロンのプロモーターを利用した発現ベクター、 例えば pUC NT (WO 94/03613)、 スファージの P_L プロモーターを利用した発現べクタ一、 例えば P PL— 1 ambda (フアルマシア LKB) 、 Ta cプロモー夕一を 利用した発現べクタ一、 例えば PKK 223— 3 (フアルマシア LKB) を利 用することができる。

挿入するトランスアミナーゼ遺伝子は、 当該酵素の翻訳開始コドンから終止コ ドンまでを含む断片が用いられる。 好適には当該遺伝子の上流、 下流それぞれに 余分の DNAを含まないことが望ましいが、 特にこれによつて制限を受けない。 また遺伝子によっては翻訳開始コドンが ATGに代えて GTGや TTG等が使用 されている場合が在り、 このような場合には大腸菌での発現のためには開始コド ンを AT Gに変更することがより好適である。

以上をまとめると、 本発明の立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポ リベプチドとしては、 例えば上記のァルスロパクター属に属する微生物の培養に より得ることができる。 かかるポリペプチドとしては、 例えば、 1) 配列表の配 列番号： 3、 配列番号： 4、 又は配列番号： 6に記載された部分アミノ酸配列を 含み、 立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性を有するポリペプチド、 2) 配列表 の配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、 立体選択 的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチド、 及び、 3 ) 配列表の配列番 号： 1に記載されたアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、 付 カロ、 挿入、 または置換されたアミノ酸からなるポリペプチドであって、 かつ立体 選択的なトランスァミナ一ゼ活性を有するポリべプチドが挙げられる。

本発明の組換え DNAは、 上記の本発明の DNAを含んでなる。 かかる組換え DNAとしては、 好ましくは、 微生物、 動物若しくは動物細胞、 又は植物若しく は植物細胞において、 コードされたポリべプチドを発現することができる発現べ クタ一である。 例えば、 一例として pUCNTに立体選択的なトランスァミナ一 ゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する D N Aを挿入した 、 上記発現ベクターがプラスミ ド p AT 28、 p AT 29、 または p AT 30で ある組換え DNAが挙げられる。 かかるプラスミ ドは、 実施例に記載の方法で得 ることができる。

本発明の形質転換体は上記の本発明の発現べクタ一により形質転換されてなる 。 かかる形質転換体としては、 例えば、 大腸菌 （Escherichia coli (以下、 E. c 01 i) 〕 JM1 09や HB 1 0 1を形質転換した形質転換体が挙げられる。 形質転換体として用いられる大腸菌としては、 具体的には、 E. c o l i JM

1 09 (pAT28) 、 E. c o l i JM 1 09 (pAT29) 、 又は E. c o 1 i JM 1 09 (p AT 30) が挙げられる。 上記の本発明の発現べク夕一で公知の方法により形質転換し、 形質転換体を得 ることができる。

本発明の立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドの製造方 法は、 上記の本発明の形質転換体を培養もしくは育種することによって、 培養に 用いた培養液又は該形質転換体より立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有す るポリペプチドを採取することを特徴とする。 培地組成、 培地の p H、 培養温度 、 I P T Gの使用の有無と添加の時間、 培養時間等について最適条件を決定する ことにより、 効率良く トランスアミナーゼを生産し得る。 本発明のポリペプチド の製造方法により得られるトランスァミナーゼは、 本発明の光学活性ァミノ化合 物の製造方法に好適に用いることができる。

形質転換体の培養物から立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺ プチドを精製するには、 通常の方法が用いられる。 形質転換体が大腸菌の場合の ようにポリべプチドが菌体内蓄積する場合では、 培養終了後遠心分離等によって 形質転換体を集め、 これを超音波処理等によって破砕した後、 遠心分離等によつ て無細胞抽出液を得る。 これを、 塩析や、 イオン交換、 ゲルろ過、 疎水、 ァフィ 二ティーなどの各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精 製することができる。 用いる宿主一ベクター系によっては発現産物が形質転換体 外に分泌される場合があるが、 この場合は培養上清から同様に精製すればよい。 また、 宿主が大腸菌の場合、 発現産物が不溶性の封入体として形成される場合 がある。 この場合、 培養終了後遠心分離によって菌体を集め、 これを超音波処理 などによつて破砕した後、 遠心分離等を行うことにより封入体を含む不溶性画分 を集める。 封入体を洗浄した後、 通常用いられるタンパク質可溶化剤、 例えば尿 素や塩酸グァニジン等で可溶化し、 必要に応じてこれをイオン交換、 ゲルろ過、 疎水、 ァフィ二ティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した 後、 透析法あるいは希釈法などを用いたリフォールデイング操作を行うことによ つて活性を有するトランスァミナーゼを得ることができる。

本発明に用いられるトランスアミナーゼは、 各種の態様で使用することができ る。 すなわち、 微生物の培養物、 分離した菌体、 菌体処理物をはじめ、 無細胞抽 出液、 部分精製酵素、 精製酵素等を用いることができ、 更にはこれらの菌体の固 定化物、 菌体処理物の固定化物、 酵素タンパク質の固定化用担体 （例えば、 陰ィ オン交換樹脂） への固定化物等が使用できる。 なお、 固定化は、 常法 （例えば特 開昭 63— 1 85382号公報） に従って行うことができる。

固定化に使用される支持体としては、 デュオライ ト （Duolite)A 568又は D S 1 7 1 86 (ローム ' アンド 'ハース社 ：登録商標） 等のフヱノール—ホルム アルデヒド陰イオン交換樹脂、 アンバ一ライ ト （Amberlite) I RA 935、 I R A 945、 I RA90 1 (ローム ' アン ド ·ハース社：登録商標） 、 レワタイ ト (Lewatit)OC 1 037 (バイエル社：登録商標） 、 ダイアイオン （Diaion) E X- 05 (三菱化学：登録商標） 等のポリスチレン樹脂のような各種アミンゃァ ンモニゥ厶塩あるいはジエタノールァミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換 樹脂が適している。 その他 DEAE—セルロース等の支持体も使用することがで きる。

更に、 酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、 通常、 架橋剤を用いるが、 好適な例として、 グルタルアルデヒドを挙げることができる。 使用する酵素は、 精製酵素だけではなく、 部分精製酵素、 菌体破砕液、 無細胞抽出液等、 種々の精 製度のものが使用できる。

固定化酵素の調製は支持体に酵素を吸着後、 架橋処理をする等の通常の調製法 が使用できる。

本発明に使用されるァミノ基受容体としては、 一般式 （1) で示されるケトン 化合物が挙げられる。 R— (O)p一 (CH₂)q— (J— (CH₂)r—X (1)

O

式中、 pは 0または 1を示し、 qは 0〜8の整数を示し、 rは 0〜4の整数を 示し、 Rは炭素数 6〜1 4の置換または無置換のァリール基、 炭素数 4〜 1 2の ヘテロァリール基、 カルボシキル基、 炭素数 1〜 6のアルコキシカルボニル基、 メチル基、 または水素原子のいずれかを示し、 Xは水酸基、 カルボシキル基、 炭 素数 1〜6のアルコキシカルボニル基、 または水素原子のいずれかを示す。

置換ァリール基としては、 例えばハロゲン原子、 炭素数 1〜6のアルキル基、 水酸基、 メ トキシ基、 モノフルォロメチル基、 ジフルォロメチル基、 及びトリフ ルォロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ヶ所以上置 換されたァリール基が挙げられる。 具体的には、 2 —メ トキシフヱニル基、 3— メ トキシフエ二ル基、 4ーメ トキシフエ二ル基、 2 , 4—ジメ トキシフエニル基 、 3 , 4 —ジメ トキシフエ二ル基、 2 —トリフルォロメチルフエニル基、 3 —ト リフルォロメチルフヱニル基、 及び 4—トリフルォロメチルフエニル基からなる 群より選択される基が挙げられる。

ヘテロァリール基としては、 例えばピリジル基、 ビラジニル基、 チェニル基、 フリル基、 及びチアゾリル基からなる群より選択される基が挙げられる。

前記一般式 （ 1 ) で示されるケトン化合物の中では、 特に Pが 0、 qが 1、 r が 1、 Xが水素原子の 1 ーァリール— 2—プロパノンが好ましく、 更に詳しくは 、 前記 1 ーァリ一ルー 2 —プロパノン中のァリ一ル基がフエニル基、 2 —メ トキ シフエ二ル基、 3 —メ トキシフエ二ル基、 4 —メ トキシフエニル基、 2 , 4—ジ メ トキシフエ二ル基、 3 , 4—ジメ トキシフヱニル基、 2 —トリフルォロメチル フエニル基、 3—トリフルォロメチルフエニル基、 4—トリフルォロメチルフエ ニル基である化合物が好ましい。

また、 Rがメチル基、 pが 1、 qが 1、 rが 1、 Xが水素原子である、 1 ーメ トキシー 2—プロパノンが好ましい。 更に、 pが 0、 qが 1、 rが 0、 Rが水素 原子であり Xがカルボキシル基のピルビン酸やそのアルキルエステル等も好まし い基質となる。

本発明に使用されるァミノ基供与体は第一ァミンであり、 例えば、 一般式 （3 ) で示される非キラルもしくはラセミ体又は光学活性体ァミノ化合物類が挙げら れる。

H

R—C—R,

(3)

NH₂

式中、 、 R ₂ はそれぞれ独立して、 水素原子、 炭素数 1〜1 4の置換若し くは無置換のアルキル基、 炭素数 6〜1 4の置換若しくは無置換のァリール基、 炭素数 1〜1 4の置換若しくは無置換のァラルキル基、 カルボキシル基、 又は炭 素数 1〜 1 0のアルコキシカルボ二ル基を示し、 R ! と R ₂ は分子内で結合して 環を形成してもよい。

更に詳しくは、 R i が炭素数 1〜 1 0のアルキル基、 フヱニル基、 ナフチル基 のいずれかであり、 R ₂ がメチル基、 ェチル基、 ヒドロキシメチル基、 ヒ ドロキ シェチル基、 カルボキシル基、 炭素数 1〜1 0のアルコキシカルボニル基、 カル ボキシメチル基のいずれかである第一ァミン等が好ましい。

本発明で用いられる第一ァミンの具体例としては、 （R ) — 1 —フヱニルェチ ルァミン、 （R ) — 1 一ナフチルェチルァミン、 （R ) — 1 —メチルプロピルァ ミン、 （R ) — 1 —メチルへキシルァミン、 （R ) — 2 —ァミノ一 1 —プロパノ —ル、 （R ) — 1ーメチルブチルァミン、 （R ) — 1 —フエニルメチルァミン、 (R) — 1ーァミノ一 1一フエニルエタノール、 （R) — 2—アミノー 2—フエ ニルエタノール、 （R) — 3—ァミノヘプタン、 （R) — 1ーァミノ一 3—フエ ニルプロパン、 （R) — 2—ァミノ _ 4一フエニルブタン、 （R) — 2—ァミノ — 3—フエニルプロパノール、 （R) — 1—メチルヘプチルァミン、 ベンジルァ ミン、 （S) — 2—フエニルグリシノール、 （R) — 3—ァミノフエ二ルブタン 、 L—フエ二ルァラ二ノール、 （R) — 2 _アミノー 1—メ トキシプロパン、 D ーァラニン、 アルキル基の炭素数が 1〜9の、 D—ァラニンのアルキルエステル (例えば、 D—ァラニンメチルエステル、 D—ァラニンェチルエステル等） 、 （ R) - 1 - (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパン、 又は （R) — 1ーフヱニル— 2—ァミノプロパン等が挙げられる。 また、 これら化合物のラ セミ体も第一アミンとして挙げられる。

本発明の製造方法は、 上記のケトン化合物に、 上記第一ァミンの存在下、 立体 選択的にァミノ基転移を行わせる活性を有する、 上記のトランスアミナ一ゼを作 用させることにより所望の光学活性ァミノ化合物を得るというものである。

かかる酵素タンパク質をケトン化合物に作用させる方法としては、 例えば、 該 酵素タンパク質を生産する微生物の培養物、 分離した菌体、 菌体処理物、 又は固 定化菌体と、 ケトン化合物及び第一ァミ ンとを接触させる方法や、 該酵素タンパ ク質を生産する微生物の無細胞抽出物、 部分精製酵素タンパク質、 精製酵素タン パク質、 又は固定化酵素タンパク質と、 ケトン化合物及び第一ァミンとを接触さ せる方法等が挙げられる

反応に用いる基質の濃度は、 ァミノ基受容体が 0. 1〜 1 0 %、 好ましくは 3 〜5%であり、 アミノ基供与体としては、 キラ一ルァミ ンの場合は主として （R ) 体を、 アミノ基受容体に対して 8 0〜1 5 0モル％程度の濃度で用いることが 好ましい。 ァミノ基供与体としてラセミ体のァミノ化合物を使用することもでき る。 ただし、 使用濃度は光学活性体の場合の 2倍の濃度を要する。

トランスアミナーゼを作用させる際の pHは、 pH5. 0-1 2. 0が好まし く、 より好ましくは pH 7. 0〜1 0. 0である。 また、 反応時の温度は、 2 5 〜4 0°Cが好ましく、 より好ましくは 3 0〜3 5°Cである。

さらに、 トランスアミナ一ゼを作用させる際に、 ドデシル硫酸ナトリウム （S DS) 、 トリ トン X— 1 0 0、 臭化セチルトリメチルアンモニゥム （CTAB) 等の界面活性剤やリノール酸、 ォレイン酸等の脂肪酸を反応促進物質として添加 することにより、 反応生成物の収率が向上することがある。 このときの界面活性 剤や脂肪酸の添加量は、 ケトン化合物、 第一ァミン、 トランスアミナーゼ等が含 有される反応液の 0. 1〜1 0重量 となる量が好ましい。

本発明の製造方法によって製造されるァミノ化合物は、 一般式 （2) で示され る立体配置を持つ光学活性ァミノ化合物である。

H

f

R— (O)p- (CH₂)q C (CH₂)r—X (2)

i

NH₂ 式中、 P、 q、 r、 R、 及び Xは、 それぞれ一般式 （ 1 ) における p、 q、 r 、 R、 及び Xと同意義を示す。

具体的には、 （R) — 1一フエニル— 2—ァミノプロパン、 （R) — 1 —フエ 二ルー 3—アミノブタン、 （R) — 1 — (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2— ァミノプロパン、 （R) — 3— (トリフルォロメチルフエニル） 一 2—アミノブ 口パン、 （R) — 3— （p—メ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパン、 （R) — 4— (p—メ トキシフエ二ル） 一 2—アミノブタン、 （R) — 4— ( 3' , 4 ' —メチレンジォキシフエニル） 一 2—アミノブタン、 （R) — 4 _ (p—ヒ ド ロキシフエニル） 一 2—アミノブタン、 （R) _ 2—ァミノ一 1 —メ トキシプロ パン等が挙げられる。

本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法によれば、 例えば、 ァルスロバク夕 — ' スピーシーズ KNK 1 6 8 (FERM B P— 5 2 2 8 ) を用い、 1 一 （ 3 , 4—ジメ トキシフエニル） 一 2—プロパノンをアミノ基受容体、 （R) — 1 — フヱニルェチルアミンをァミノ基供与体として、 それぞれ 3 %濃度で 2 0時間程 度の反応をさせた場合、 アミノ基転移反応によって、 7 5 %以上の 1 一 （3, 4 ージメ トキシフヱニル） 一 2—プロパノンを 9 9 % e e以上の光学純度の （R) - 1 - (3, 4—ジメ トキシフエニル） 一 2—ァミ ノプロパンに転換させること ができる。

反応生成物として得られる光学活性ァミノ化合物の定量は、 高速液体クロマト グラフィ一によつて行うことが可能である。 例えば、 反応液を逆相カラム （コス モシル 5 C₁₈— AR、 ナカライテスク等） を用い、 2 5 %ァセ トニトリル等を移 動相として分離し、 2 1 O nmの吸収を、 対照と比較することによって定量分析 を行うことができる。 また光学純度を測定する方法としては、 いくつかの方法が あるが、 例えば、 生成した光学活性アミノ化合物を N—カルボキシー L一口イシ ンアンヒドライ ド等と結合させてジァステレオマ一を形成させ、 これを上記の高 速液体クロマトグラフィーの方法で分離、 定量することによって、 分析を行うこ とができる。

反応後に目的とする光学活性アミノ化合物を分離する方法としては、 有機溶媒 による抽出と蒸留を組み合わせた通常の方法によって行うことができる。 例えば 、 抽出溶媒としては、 酢酸ェチルやトルエン等が使用可能で、 反応液をまず酸性 にして抽出を行うことにより、 ケトン類を除き、 その後アルカリ性にして抽出す ることにより目的化合物を含むァミン類を分離する。 そしてこの抽出画分を更に 蒸留することによって目的の光学活性ァミノ化合物を単離することができる。 本発明に用いられるトランスアミナーゼは立体選択的にァミノ基転移反応を行 う活性を有するため、 一般式 （4) で示されるケトン化合物 （ァミノ基受容体） の存在下に、 一般式 （5) で示されるラセミ体のアミノ化合物に該酵素タンパク 質を作用させると、 一方の立体のァミノ化合物のみが選択的にケトン化合物に変 換され、 その対掌体は変化を受けずにァミノ化合物として回収することができる 従って、 本発明に用いられるトランスアミナーゼを用いて、 ラセミ体のアミノ 化合物から容易に一般式 （6) で示される光学活性アミノ化合物を製造すること が可能である。

II (4)

一

0

H

R— (O)p— (CH₂)q—(^— (CH₂)r—X (5)

H₂

H

R— (O)p— (CH₂)q-C— (CH₂)r-X (6)

NH₂

(式中、 R、 p、 q、 r、 X、 、 R₂ は一般式 （1)、 一般式 （3) におけ る R、 p、 q、 r、 X、 R, 、 R₂ と同じである。 ）

例えば、 ァルスロバクタ一 'スピ一シーズ KNK 1 68 (FERM BP- 5

228 ) を用い、 ラセミ体の 1— (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—了ミノ プロパンや 2—アミノー 1ーメ トキシプロパンをァミノ基供与体とし、 ピルビン 酸をァミノ基受容体として反応させた場合、 アミノ基転移により （R) 体のアミ ノ化合物がケトン体に転換し、 （S) 体のアミノ化合物が約 50%の収率で得ら れ、 高い光学純度まで濃縮された状態で取得することができる。 以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施 例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

国内各地より採取した土壌サンプル各 2 gを 5m 1の生理食塩水に懸濁し、 そ の上澄液 0. 2mlを 4mlの S培地 （2 gZL KH₂ P0₄ 、 2gZL K 2 HP0₄ 0. 3 g/L MgS0₄ · 7H₂ 〇、 5 g/L グリセリン、 3 g/L Na C K 1 g/L 粉末酵母エキス、 0. 004 gZL F e S0₄ • 7H₂ 〇、 0. 0005 g/L Z n S 0₄ · 7Η₂ 0、 0. 0005 g/L

MnC 12 · 4H₂ 0 (pH7. 5 ) 、 高圧蒸気殺菌後除菌フィルターで濾過 した 2—ォキソグルタル酸又はピルビン酸、 及び （R) — 1— (3, 4—ジメ ト キシフヱ二ル） — 2—ァミノプロパンをそれぞれ最終濃度 1. 5 gZL、 1. 0 g/Lとなるように添加） に加えて、 30°Cで 3〜7日間集積培養を行った。 菌 が生育した培養液を 1. 5%寒天を含む S培地プレートに 0. 2mlずつ塗り付 け、 30°Cにて培養を行って生育したコロニーについて、 それぞれ S培地で振盪 培養し、 菌体を集菌後 0. 1M炭酸緩衝液 （pH8. 5) 、 50mMピルビン酸 、 3 OmM (R) - 1 - (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—アミノプロパン を含む 0. 25m 1の反応液に懸濁し、 30°Cで攪拌しながら 24時間反応させ た。

この反応液を薄層クロマトグラフィー （Kieselgel 60F254 (Merck)) 、 展開液 はジェチルエーテル： メタノール：アンモニア水 （27%) = 50 : 50 : 2) で分離し、 基質の減少をニンヒドリンで、 生成物 1一 （3, 4—ジメ トキシフエ 二ル） 一 2—プロパノンの生成を 0. 4% 2, 4—ジヒドロフエニルヒドラジ ンで検出した。 目的生成物の生成が確認できた菌株については、 その逆反応を行 うことによって （R)選択的ァミノ基転移反応活性の有無を調べた。 即ち、 0. 6 % 1— (3， 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 0. 6% (R ) 一 1—フヱニルェチルアミンを含む溶液中に培養した菌体を入れて 30°Cで 2 日間反応させた。 その結果、 （R) - 1 - (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2 —アミノプロパンの生成が認められ、 ァルスロパクター ·スピーシーズ KNK 1 68株に （R) 選択的なアミノ基転移活性を認めた。

実施例 2

ァルスロパクター ·スピーシーズ KNK 1 6 8株を実施例 1に示す方法によつ て培養を行う際に、 培地中に （R) — 1— (3， 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2 —ァミノプロパン （ （R) -DMA) の代わりに、 （RS) — 1—メチルプロピ ルァミン、 （RS) — 1一メチルプチルァミン、 （RS) — 3—アミノー 2， 2 —ジメチルブ夕ン、 （RS) — 2—ァミノ一 1ーブタノール、 又は （RS) — 1 —フヱニルェチルァミンを添加した。 その培養液から菌体を分離し、 この菌体を 用いて 1 % 1 - ( 3, 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 1 % ( RS) 一 1一メチルプロピルアミンを含む反応液中で 3 0で、 20時間反応を行 つたところ、 表 4に示すように反応性の向上がみられた。 表 4

生成 (R)-DMA

(%)

(RS) 一 1—メチルプロピルアミン 22.3

(RS) 一 1—メチルブチルァミン 13.0

(RS) 一 1一フエニルェチルァミン 8.0

(RS) — 3—ァミノ一 2， 2—ジメチルブタン 18.6

(RS) 一 2—アミノー 1ーブタノ一ル 12.9

(R) -DMA 0.9

無添加 0.3 実施例 3

ァルスロパクター ·スピ一シーズ KNK 1 6 8株を R培地 （5 g/L KH₂ P0₄ 、 5 g/L K₂ HP0₄ 、 3 g/L Na C l、 1 g/L MgS〇₄ • 7H₂ 0、 0. 0 0 5 g/L F e S0₄ · 7Η₂ 〇、 0. 0 0 1 g/L Z nS〇₄ ' 7H₂ 〇、 0. 00 1 g/L MnC 1₂ · 4 H₂ 0 (pH 7. 5)

、 1 5 g/L グリセリン、 2 gZL 粉末酵母エキス、 8 gZL プロエキス (播州調味料製） 、 高圧蒸気殺菌後除菌フィルタ一で濾過したピルビン酸、 及び (RS) — 1—メチルプロピルアミンをそれぞれ最終濃度 1. 6 gZL、 2. 0 gZLとなるように添加、 pH7. 2に調製） に接種して、 3 0°Cで 24時間振 盪培養した。 その培養菌体を遠心分離により集菌し、 1 % 1— (3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 0. 1 % トリ トン X— 1 0 0と表 5に 示すアミノ基供与体 1 %を含む反応液 （pH 8. 5) 中に懸濁して 3 5 °C、 20 時間反応させた。 表 5に示すように、 （RS) — 1ーフヱニルェチルァミン、 （ RS) — 1—メチルブチルアミン、 （RS) — 1—メチルプロピルアミン及び （ RS) - 1一メチルプチルァミン等がァミノ基供与体として働くことがわかった 力 \ (RS) 一 1—フヱニルェチルァミンが最も良好であった。

表 5

実施例 4

ァルスロパクター ·スピ一シ一ズ KNK 1 6 8株を R培地で培養して得た菌体 を、 2% 1 — (3， 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 4 % (R S) 一 1 —フ ニルェチルアミンを含む反応液に懸濁し、 表 6に示す界面活性剤 や脂肪酸を添加して、 3 0で、 pH 8. 5で 2 0時間反応させた。 その結果、 反 応液にドデシル硫酸ナトリウムやリノール酸、 ォレイン酸等を添加することによ つて、 反応生成物の収率が向上することが判った。 表 6

実施例 5

ァルスロパクター ·スピ一シ一ズ KNK 1 6 8株を R培地で培養した菌体を用 い、 2% 1— （3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 1. 4 % (RS) — 1 一フエニルェチルァミン、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウムを含 む反応液の pHを 7. 5〜9. 5まで変化させて 3 5°Cで 2 0時間反応を行った 。 その結果、 表 7に示すように、 pH 8. 5〜9. 0での反応生成物の収率が良 好であった。 表 7

実施例 6

ァルスロパクター ·スピ一シ一ズ ΚΝΚ 1 6 8株を 2リッ トル容ミニジャーを 用レヽ、 1. 5リツ トルの J培地 （5 g/L KH₂ P0₄ 、 5 g/L K₂ HP 0₄ 、 1 g/L Na C l、 1 g/L MgS0₄ · 7Η₂ 〇、 0. 0 0 5 g/ L F e S O4 · 7Η₂ 0、 0. 0 0 1 g/L Zn S0₄ · 7Η₂ 〇、 0. 0 0 1 g/L Mn C 12 · 4 Η₂ 〇、 0. 0 0 0 5 g/L CuS〇₄ - 5H₂ 0 (pH7. 5) 、 4 0 g/L グリセリン、 3 g/L 粉末酵母エキス、 20 g/L プロエキス （播州調味料製） 、 pH7. 5に調整） に 3 0m lの一晩前 培養液を植菌し、 3 0°C、 0. 5 vvm、 4 5 0 111で4 3時間、 1 0 %水酸 化ナトリウムを用いて pHを 7. 5に調整しながら培養した。 なお、 培養開始後 、 1 4時間後に最終濃度 4 gZLとなるように除菌フィルタ一で濾過した （RS ) - 1 -メチルプロピルアミンを添加して培養した。 培養終了時の到達菌体濃度 (〇D₆₁。）は約 2 9で、 その時のトランスアミナーゼ活性は培養液当たり 0. 3 単位であった。 なお、 酵素活性単位は、 30°Cで 1 /Mの基質 1— (3， 4ージ メ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノンを 1分間で （R) — 1一 （ 3, 4—ジメ ト キシフ ニル） 一 2—ァミノプロパンに転換する酵素活性量を示す。 培養液し 5リッ トルから集菌した菌体を用いて、 4 5 の 1ー （3, 4—ジ メ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン、 28. 3 gの （R) — 1—フエ二ルェチ ルァミン、 6 5. 0 gのォレイン酸を含む反応液 （pH 8. 5) に懸濁し、 30 でで 3 9時間反応させたところ、 基質の 8 1. 6%が （10 — 1— （3, 4—ジ メ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパンに転換した。 この反応液の pHを塩酸 で 2. 0に調整した後、 トルエンを用いて抽出し有機層にケトン類を移行させて 分離した。 水層の pHを水酸化ナトリウムで 1 2に調整した後、 再びトルエンを 用いて抽出したところ、 有機層に 32. 9 gの （R) — 1— (3, 4—ジメ トキ シフヱニル） 一 2—ァミノプロパンが含まれていた。 この抽出物から蒸留によつ て目的化合物の分離を試みたところ、 その主留画分に 3 0. 3 の （ ） 一 1一

(3, 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパンが含まれていた。 この一 連の操作による総合収率は、 約 68. 7%であり、 光学純度は 9 9. 6%e e ( R体） であった。

実施例 7

ァルスロパクター■スピ一シ一ズ KNK 1 6 8株を 4 0 0 m lの R培地の入つ た坂口フラスコ中で 30°C、 3 0時間振盪培養した。 集菌後、 4 0m lの 20m Mリン酸カリウム緩衝液 （pH 6. 8) 、 0. 1 %の 2—メルカプトエタノール に懸濁し、 超音波によって菌体を破砕した後、 遠心分離により沈殿物を除去して 得られる上清として無細胞抽出液 34m 1を得た。

この無細胞抽出液 1 0m 1を用い、 0. 5 g01— (3, 4—ジメ トキシフヱ 二ル） — 2—プロパノン、 0. 34 gの （R) — 1—フエニルェチルァミンを含 む 0. 1 Mトリス—塩酸緩衝液 （pH8. 5) よりなる 1 0 Om 1の反応液で、 30で、 24時間反応させた。 その結果、 0. 3 6 の （1 — （3， 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパンが生成した。

実施例 8

実施例 7と同様にしてァルスロパクター■スピーシ一ズ KNK 1 6 8株を培養 し、 その 1 m 1から菌体を分離した。 これを l m lの 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液 (pH 8. 5) 、 ラセミ体の 1一 （3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノ プロパン 4 0mg、 ピルビン酸 2 0mg、 ドデシル硫酸ナトリウム 2 %を含む反 応液に懸濁し、 3 0°Cで 4 8時間、 攪拌しながら反応させた。 その反応後の溶液 の分析を行ったところ、 1一 （3， 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロ ノ、。ンが 2 0. 5mg残存しており、 その光学純度は 9 6 % e e (S体） であった ο

実施例 9

実施例 6と同様に、 ァルスロバクタ一 ·スピーシーズ KNK 1 6 8株を 5 リッ トル容ミニジャーを用い、 3. 5 リツ トルの J培地で 3 0°C、 4 3時間培養した 。 菌体を遠心分離によって集め、 1 リッ トルの 2 OmMリン酸カリウム緩衝液 （ pH 6. 8) 、 0. 0 1 %の 2—メルカプトエタノールに懸濁し、 ダイノ ミル （ Dynomill (登録商標） 、 スイス） で破砕後、 遠心して上清 8 1 Om lを分離した 。 これに、 硫酸プロ夕ミンを 5 OmgZm 1 となるように添加し核酸を除き、 3 0 %飽和となるように硫安を添加して沈澱したタンパク質を除いた後、 6 0 %飽 和となるように硫安を添加して沈澱したタンパク質を分離した。 これを上記緩衝 液に溶解させ、 同緩衝液に対して透析した後、 2 0 % (v/v) グリセリン、 0 . 3M Na C K 2 0 Μ ピリ ドキサールリン酸となるように添加した同緩 衝液組成に調整後、 この液で平衡化した DEAE—セファロ一ス ファストフ口 一 （フアルマシア） カラム （ø 4. 4 X 2 O cm) に供し、 0. 3〜0. 5M Na C 1直線濃度勾配によって溶出させた。

この活性画分を集め透析後、 0. 2 Mとなるように硫安を添加した後、 0. 3 M Na C lのかわりに 0. 2M 硫安を含む前記緩衝液で平衡化したフ ニル セファ α—ス （フアルマシア） カラム （02. 2 x 1 7 cm) に供し、 0. 2〜 0Mの硫安の直線濃度勾配により溶出した。 この活性画分の硫安濃度を 0. 6M に調整した後、 0. 2M 硫安のかわりに 0. 6 M硫安を含む前期緩衝液で平衡 実施例 9で得られた精製酵素タンパク質を用いて、 ピルビン酸をァミノ基受容 体として、 種々のァミノ化合物に対する反応性を調べた。 1 5 0 ^ 1の基質溶液 (0. 1 Mリン酸カリウム緩衝液 （pH 8. 3) 、 4 0mMピルビン酸、 0. 1 mMピリ ドキサールリン酸、 4 OmM各種アミノ化合物） に 1 0倍希釈した精製 酵素タンパク質溶液 1 5 0 1を添加し、 3 0°Cで 1時間チューブ内で反応させ た。 反応チューブを沸騰水中に移して反応停止後、 反応液の一部を 5倍希釈し、 その 1 0 1に 0. 1 Mホウ酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 1 0 K 8 0 mM 4 - フルオロー 7—二トロー 2, 1 , 3—べンゾキサジァゾ一ル （NBD— F) のェ 夕ノール溶液 2 0〃 1を添加し、 6 0°Cで 1分間反応後氷冷し、 5mM HC 1

4 6 0〃 1を添加した。 この反応液をファインパック C 1 8— 5カラム （日本 分光社製） I、 0. 1 M リン酸カリウム緩衝液 （pH 6. 5) 、 CH₃ CN ( 9 0 : 1 0) を溶離液として高速液体クロマトグラフィーで分析し、 励起波長を 4 70 nmとし、 5 30 nmで NB D化したァラニンの検出を行った。 その結果 を （R) — 1ーフヱニルェチルァミンを基質とした時の相対活性で表 8に示す。 表 8から明らかなように （S) — 2—フエニルグリシノール、 3—ァミノフエ 二ルブタン等が良好な反応性を示した。

化したプチルセファロース （フアルマシア） カラム （ø 2. 2 X 1 7 cm) に供 し、 0. 6〜0. 2 M硫安の直線濃度勾配によって溶出した。 この活性画分を集 め、 限外濾過で濃縮した後、 SDS -ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行った ところ、 分子量約 37, 0 0 0に相当するところに、 ほぼ単一のバンドを形成し ていた。

実施例 1 0

実施例 9で得られた精製酵素タンパク質を気相プロテインシークェンサ一 （4 7 OA型、 アプライ ド 'バイオシステム社） にて分析することにより、 アミノ末 端のアミノ酸配列を調べた。 その結果、 当該酵素タンパク質は、 ァミノ末端付近 に配列表の配列番号： 3及び配列番号： 4で示される 2種類のアミノ酸配列を持 つことが分かった。 配列番号： 4で示されるアミノ酸配列をァミノ末端に持つ酵 素タンパク質に比べて配列番号： 3で示されるァミノ酸配列をァミノ末端に持つ 酵素タンパク質は微量であった。 両配列の比較より、 ァミノ末端付近のプロセッ シングにより、 配列番号： 3から配列番号： 4で示されるアミノ酸配列をァミノ 末端に持つトランスァミナーゼが生成したと推定された。

精製トランスアミナーゼ 1 0 0 /g (5 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH8. 0 ) 、 1 0%グリセリン、 0. 0 0 5 %メルカプトエタノール、 1 0 /Mピリ ドキ サールリン酸） に 8〃gの TPCKトリブシンを加え、 3 7でで 24時間処理し た。 得られた消化物を、 HPLC (YMC C o. L t d. 製、 YMC— P a c k PROTE I N— RPカラム、 流速 l mLZ分、 溶出液 A： 0. 1 %トリフ ルォロ酢酸、 溶出液 B ： 0. 1 %トリフルォロ酢酸、 8 0%ァセトニトリル、 溶 出条件：溶出液 Aが 90%、 溶出液 Bが 1 0%である混合溶液で平衡化したカラ ムにサンプルをアプライし、 9 0分間で溶出液 Bの割合を 1 0 0%にあげる。 ） で分離精製した。 各べプチド断片についてァミノ酸配列分析を前述の方法で行つ た。 その結果、 配列番号： 5、 配列番号： 6の部分アミノ酸配列を得た。

実施例 1 1

4 1 表 8

実施例 1 2

実施例 9で得られた精製酵素タンパク質を用いて、 （R) — 1一フエ二ルェチ ルァミンをァミノ基供与体として、 種々のカルボニル化合物に対する反応性につ いて調べた。 20 0 1の基質溶液 （0. 1 M T r i s ■ HC 1緩衝液 （pH 8. 5) 、 25mM (R) — 1一フエニルェチルァミ ン、 0. 1 mM ピリ ドキ サールリン酸、 25mM 各種カルボニル化合物） に精製酵素タンパク質溶液 5 0〃 1を添加し、 30°Cで 1〜3時間チューブ内で反応させた。 反応チューブを 沸騰水中に移して反応停止後、 反応液をメタノールで 5倍希釈した。 この希釈液 をファインパック C18— 5カラムで、 メタノール一水 （20 ： 8 0) を溶離液と して、 高速液体クロマトグラフィーで分析し、 反応により生成したァセトフエノ ンの定量を行った。 その時の結果をピルビン酸を基質とした時の相対活性で表 9 に示す。 表 9から明らかなように、 ォキザ口酢酸やフ ノキシ一 2—プロパノ ン 等も良好な反応性を示した。

表 9 化 合 物 相対活性 （ ）

ピルビン酸 100

ォキザ口酢酸 87

グリォキシル酸 4

2 -ケト酪酸 7

ピルビン酸ェチル 27

ァセト酢酸ェチル 4

2—デカン 3

4ーメ トキシフエ二ルァセトン 14

1 -（3， 4-ジメトキシフエニル）- 2 -プロハソン 7

ベンジルァセトン 3

4- (4-メトキシフエニル)-2-ブ夕ノン 7

1 一フエニル一 2—ブタノ ン 1

フエ二ルァセトアルデヒ ド 13

ベンゾィル酢酸ェチル 2

フエノキシ一 2—プロパノ ン 83

ジァセチル 10

1 -メ トキシ一 2—プロパノ ン 16

1 ーテトラロン 1

2ーァセチルピリジン 19

3—ァセチルピリジン 8

4ーァセチルピリジン 27

3—ァセトキシピリジン 1

2—ァセチルビラジン 17

2—ァセチルフラン 2

2—ァセチルチオフエン 1

2一ァセチルチアブール 10 実施例 1 3

実施例 7と同様にしてァルスロバクタ一 ·スピーシーズ KNK 1 6 8株を培養 し、 その培養液 1 m 1から菌体を分離した。 これを l m lの 0. 1 Mトリス塩酸 緩衝液 （pH8. 5) 、 1 0 OmM (R) — 1—フエニルェチルァミ ン、 1 0 OmM メ トキシー 2—プロパノン、 0. 1 %ドデシル硫酸ナトリウムを含む反 応液に懸濁し、 30°Cで 20時間攪拌しながら反応させた。 この反応液の分析を 行ったところ、 基質であるメ トキシ一 2—プロパノンがほとんど消失して 2—ァ ミノ— 1—メ トキシプロパンに転換しており、 その光学純度は 9 9. 4 %e e 〔 (R) 体〕 であった。

実施例 1 4

実施例 1 3と同様にしてァルスロバクタ一 'スピーシーズ KNK 1 6 8株を培 養し、 その培養液 1 m 1から菌体を分離した。 これを l m lの 0. 1 Mトリス塩 酸緩衝液 （ρΗ8. 5) 、 ラセミ体の 2—ァミノ— 1ーメ トキシプロパン 5 0 m g、 ピルビン酸 37. 5mg、 ドデシル硫酸ナトリウム 0. 1 %を含む反応液に 懸濁し、 3 0 で24時間、 攪拌しながら反応させた。 この反応後の分析を行つ たところ、 2—ァミノ一 1—メ トキシプロパンが 23. 4mg残存しており、 そ の光学純度は 9 5%e e (： (S) 体〕 であった。

実施例 1 5

実施例 1 4と同様の反応で、 20 OmMのラセミ体の 2—ァミノ— 1—メ トキ シプロパン、 1 5 OmMの n—ブチルアルデヒド又はプロピオンアルデヒドを用 い、 30°Cで 20時間反応させた。 その分析の結果、 （S) 体の 2—ァミノ _ 1 ーメ トキシプロパンが濃縮されており、 （S) 体の比率が、 n—ブチルアルデヒ ドを用いた場合で 76 %、 プロピオンアルデヒドを用いた場合で 5 8 %となって いた。

実施例 1 6

実施例 9で得られた精製酵素タンパク質を用いて、 pHが活性に及ぼす影響を 調べた。 20〃mo l 1 - ( 3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—プロパノン , 20 mo 1 (R) — 1一フエニルェチルァミン及び 1〃mo 1ピリ ドキサ 一ルリン酸を含み、 以下に示す緩衝液によって pHを調整した 0. 9mlの溶液 に、 適当に希釈した酵素タンパク質溶液 0. 1mlを添加し、 30°Cで 1時間反 応させた。 使用した緩衝液はいずれも最終濃度 0. 1Mで酢酸緩衝液 （CH₃ C ◦〇Naと省略、 pH4〜6) リン酸カリゥム緩衝液 （KPB、 pH5〜8) 及 びトリス塩酸緩衝液 （Tr i s · HC 1、 pH7〜l 0) である。 反応後の反応 液について生成した （R) —DMAを高速液体クロマトグラフィーで定量し、 p H 8. 5の活性を 1 00%としてそれぞれの pHでの相対活性を第 1図に示した 。 本酵素タンパク質は、 pH 8. 5付近 （pH7. 5〜9. 0) が至適 pHであ ることがわかった。

実施例 1 7

実施例 9で得られた精製酵素夕ンパク質を用いて、 p Hが酵素の安定性に及ぼ す影響を調べた。 酵素タンパク質溶液の pHを HC 1又は Na OHで各 pHに調 整後、 20°Cで 23時間保温した後、 実施例 1 6と同様にして pH8. 5で反応 させ、 生成した （R) — DMAを定量した。 その結果を未処理の酵素タンパク質 溶液の活性を 1 00%として各々の pHでの処理サンプルの活性を相対活性で第 2図に示した。 本酵素タンパク質は、 pH7付近が最も安定であることがわかつ た。

実施例 1 8

ァルスロパクター ·スピーシ一ズ KNK 1 68株より染色体 DN Aの調製を行 つた。 下記に示す培地 30m 1の入った 500 m l坂口フラスコにァルスロバク 夕一■スピ一シーズ KNK 1 68を植菌した。 30°Cにて 2日間振とう培養した 後、 培養液を遠心分離し菌体を集めた。 菌体を 1 OmMトリス塩酸緩衝液 pH8 . 0、 1 mM EDTA (TEと略す） に懸濁した後、 Current Protocol in Mo lecular BiologyCF Ausubel 等、 Willy Interscience)の方法に従って染色体 D NAを調製した。 ただし、 この方法で使用する SDS処理濃度を 0. 5%から 2 %に変更した。 1 5m 1の培養液から約 6. 5mgの染色体 DNAを得た。

培地組成

グリセリン

ィーストエキス 0. 8重量％

KH₂ P〇₄ 0. 5重量％

K₂ HP0₄ 0. 5重量％

Β液 1 0容量％

蒸留水

ρΗ 7. 5

Β液組成

MgSO 7H₂ 0 80 g

ZnSO 7H₂ 0 6 g

F e SO 7H₂ 〇 9 g

Cu SO 5H₂ 0 0. 5 g

Mn SO 4H₂ 0 1 g

Na C 1 1 0 g

/ 1 0 L

実施例 1 9

プラスミ ドライブラリーの作製を T.Maniatisらの方法 （Molecular Cloning, Co Id Spring Harbor Press) により作製した。 染色体 DNAを制限酵素 Sau3AIによ つて部分分解し、 ァガロースゲル電気泳動を行った。 約 6〜1 2kbの DNAを 含むゲルを切り出し、 SUPREC^TM— 0 1 (宝酒造 （株） 製） を用いて精製し た。 pUC 1 9を制限酵素 BamH Iで切断し、 アルカリホスファターゼによつ て脱リン酸を行った。 このように処理した pUC 1 9と部分分解した染色体 DN Aを DNA Ligation kit ver2 (宝酒造 （株） 製） を用いて連結した。 大腸菌 JM10 9 を形質転換し、 1 0 0〃 gZm 1アンピシリ ン、 4 0〃gZm l X— GAL (5—プロモー 4一クロロー 3—インドリル一 — D—ガラク トビラノシド） ， 1 0 0 I PTG (イソプロピル— — D—チォガラク トビラノシド） を含 む L培地にプレーティングした。 染色体 DNAを組み込まれた pUC 1 9は白色 のコロニーを形成し、 一方、 染色体 DNAを組み込まれていない pUC 1 9は青 色のコロニーを形成するので容易に判別することができる。

実施例 20

実施例 1 0によって得られた配列表の配列番号： 3、 配列番号： 4、 及び配列 番号： 5に示されるアミノ酸配列から、 配列番号： 7 (AT- 1 ) 及び配列番号 ： 8 (AT- 3) に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。

AT— 1 と AT— 3をプライマ一 DNAとして、 ァルスロバクタ一 ·スピ一シ —ズ KNK 1 6 8株の染色体 DNAをテンプレートとして PCR反応を行った。 DNAポリメラーゼとして TaKaRa Ex Ta q (宝酒造 （株） 製） を用 い、 反応組成は同プロトコールに準じた。 反応温度条件は下記の条件で行った。

1 ) 94°C 2分間

2) 94°C 1分間

3) 44 °C 1分間

4) 6 8°C 2分間

5) 68°C 5分間

2：) 〜 4) を 30サイクル

反応終了後、 6%ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にて生成物を調べた結果、 約 4 5 0 b pの増幅 DNA断片が少ないながらも確認できた。

約 4 5 0 b pの DNA断片を含むゲルを切りだし、 ガラス棒にて粉砕後、 TE 緩衝液にて抽出し、 精製した。 このフラグメントを Regular pT7Blue T-vector k it (Novagen 社製） を用いて pT7Blue Vectorにクローニングし、 pATlを得た。 pA Tlの挿入断片について （株） パーキンエルマ一ジャパンの DNA sequencing kit(D ye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction)を用い、 ABI373A DNA シーケ ンサー （パーキンエルマ— （株） 製） によって塩基配列を決定した。 その結果、 実施例 1 0で得た配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 及び配列番号： 6に示されるァミノ酸配列に対応する塩基配列が存在することが明らかになった 。 pATlの挿入 DNA断片 （約 450 b p) の塩基配列を配列表の配列番号： 2 1 に示した。

実施例 21

pATl を BamH Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動によって分離した約 45 0 b pの DNA断片含むゲルを切りだし、 SUPUREC^TM— 0 1 (宝酒造 （株 ) 製） を用いて同 DNA断片を精製した。 この DN A断片を Random Primer DNA Labeling kit Ver.2 (宝酒造 （株） 製） を用いて [ひ- ³² P] dCTPで放射能標 識し、 プローブとして用いた。 実施例 1 9で作製したプラスミ ドライブラリーに 対して同プローブでコロニーハイブリダイゼーションを行い、 スクリ一ユングし た。 コロニーハイブリダィゼ一シヨンは T.Maniatisらの方法（T.Maniatis ら、 Mo lecular Cloning、 Cold Spring Harbor Press) に従って行った。 約 2000株 のクローンからなるプラスミ ドライブラリーをスクリーニングした結果、 2株の 陽性クローン JM109(pATll)と JM109(pAT17)を得た。 pATll は約 8 kb、 pAT17 は約 1 0. 5 kbの染色体 DN A断片が挿入されていた。

PATH を種々の制限酵素で切断し制限酵素地図を作製した （第 3図） 。 pATlの 挿入 DNA断片の塩基配列 （配列番号： 21) と pATll の制限酵素地図を比較し た結果と、 トランスアミナ一ゼの分子量 （MW 37, 000 ) から推定される〇 RF (約 1 kb) の大きさより、 pATll の Pstl切断によって得られる約 1.6kb の DN A断片に当該遺伝子の全長が含まれていることが示唆された。

pATll を Pst Iで切断し、 ァガロース電気泳動し、 1. 6 kbの DNA断片を 含むゲルを切り出し、 SUPRE M— 01 (宝酒造 （株） 製） を用いて抽出精製した。 PUC19 を Pstlで切断し、 1. 6 kbの DNA断片と混合し、 DNA Ligation kit V er.2 (宝酒造 （株） 製） を用いてライゲ一シヨンを行った。 ライゲーシヨンした DNAで大腸菌 JM109 を形質転換し、 形質転換体を得た。 得られた形質転換体よ りプラスミ ド DNAを調製した。 このプラスミ ド DNAを Pst Iを含む種々の制 限酵素で切断し解析を行った結果、 挿入方向の異なる pAT22、 pAT23 が得られた ことが分かった。 簡単な PAT22、 PAT23 の制限酵素地図を第 3図に示した。 前記 P AT22を保持する菌は、 E. c o l i JM 1 0 9 (p AT 22) と命名さ れ、 平成 9年 4月 8日 （原寄託日） より受託番号： FERM BP - 5 9 0 2と して通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 〔あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 - 0 04 6 ) ) に寄託されている。

1. 6 kbの Pst I断片の塩基配列を決定するために、 種々のプラスミ ド DN Aを作製した。 pATll を EcoRI と Smalにてそれぞれ切断し DNA Ligation kit ver .2 (宝酒造 （株） 製） を用いてライゲーシヨンを行った。 ライゲ一シヨンした D NAで大腸菌 JM109 をそれぞれ形質転換し、 形質転換体を得た。 得られた形質転 換体よりプラスミ ド DNAを調製し、 種々の制限酵素で切断した結果、 それぞれ 挿入 DNA断片内の Stul近傍の EcoRI 、 Smal部位からベクターの EcoRI 、 Smal部 位まで欠失したプラスミ ド pAT20、 pAT21 をそれぞれ得たことが分かった。 pAT2 2 を Sma Iと Stulで切断し、 DNA Ligation kit Ver.2 (宝酒造 （株） 製） を用い てライゲ一シヨンをした。 ライゲ一シヨンした DNAで大腸菌 JM109 を形質転換 し、 形質転換体を得た。 得られた形質転換体よりプラスミ ド DNAを調製し、 種 々の制限酵素で切断し解析した結果、 約 3 5 0 b pの Smal- Stul 断片の欠失した プラスミ ド pAT26 を得たことが分かった。 pAT23 を EcoRI で切断し同様にライゲ ーシヨンを行い、 大腸菌 JM109 を形質転換した。

形質転換体よりプラスミ ド DNAを調製し、 種々の制限酵素で解析した結果、 ベクターの EcoRI から揷入 DNA断片内の EcoRI 部位までの約 9 0 0 b pの欠失 したプラスミ ド pAT24 を得たことが分かった。 pAT23 を Smalで切断し同様にライ ゲーシヨンを行い大腸菌 JM109 を形質転換した。 形質転換体よりプラスミ ド DN Aを調製し種々の制限酵素で解析した結果、 ベクタ一の Smalから挿入 DNA断片 内の Smal部位までの約 1， 100 b pを欠失したプラスミ ド pAT25 を得たことが分か つた。 pAT22 を Sailで切断し、 同様にライゲーシヨンを行い大腸菌 JM109 を形質 転換した。 形質転換体よりプラスミ ド DNAを調製し種々の制限酵素で解析した 結果べクタ一の Sailから揷入 DNA断片内の Sail部位までの約 20 0 b pの欠失 したプラスミ ド pAT27 を得た。 pAT20 から pAT27 までの各プラスミ ドの作製方法 と簡単な制限酵素地図を第 3図に示した。

これらのプラスミ ド DN Aをテンプレートとし、 M 1 3— 4 7 (宝酒造 （株） 製） 、 RV— M (宝酒造 （株） 製） をプライマー DNAとして用い、 実施例 20 で示した方法によって塩基配列を決定した。 また、 この様にして順次決定された 塩基配列に基づいて、 配列番号： 9〜1 5のオリゴヌクレオチドを合成し、 配列 表の配列番号： 9〜1 5のオリゴヌクレオチド （AT— 6〜9、 1 1、 1 2、 1 8) をプライマーとしてさらに塩基配列を決定した。 こうして決定した 1. 6 k bの P s t I断片の塩基配列を配列表の配列番号： 1 6に示した。

配列番号： 1 6の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、 実施例 1 0で決定した ァミノ末端付近のアミノ酸配列 （配列番号： 3および 4) と比較した結果、 トラ ンスァミナ一ゼをコードする遺伝子の翻訳は、 配列番号： 1 6の塩基配列の 3 8 6番から 3 8 8番の GTGから開始されることが分かった。 またアルスロバクタ ― ·スピ一シーズ KNK 1 6 8より調製されたトランスァミナーゼの大部分は、 ァミノ末端メチォニンより 6ァミノ酸が切断除去され、 ァミノ末端がスレオニン であることが判つた。 タンパク質をコードする領域に対応するァミノ酸配列と塩 基配列は、 それぞれ配列表の配列番号： 1 と配列番号： 2に示されている。

実施例 22

トランスァミナーゼを大腸菌において生産するために当該遺伝子の発現べクタ 一の構築を行った。 発現べクタ一としてラク ト一スオペロンのプロモーターを有 する pUCNT(W0/03613) を用いた。

トランスアミナーゼ遺伝子を発現べクタ一に挿入するために必要な制限酵素部 位を導入するために PCR法を行った。 ァミノ末端プライマ一 DNAとして配列 番号： 1 7〜 1 9 (AT— 1 3〜 1 5)、 カルボキシル末端プライマ一 DN Aと して配列番号： 20 (AT- 1 6) のオリゴヌクレオチドを合成した。 AT— 1 3は翻訳開始コドン GTGを ATGに変更するためであり、 AT— 1 4は翻訳開 始コドンとして 5番目の Asp コドン G ATを ATGに変更するために合成した。 また AT— 1 5は翻訳開始コドン GTGをそのまま用いるために作製した。

3種類のァミノ末端プライマー DN Aとカルボキシル末端プライマ一 DN Aを 用いてそれぞれ PCRを行った。 PCRは TaKaRa Ex Taq を使用し、 下記の温度 条件にて実施した。

1 ) 94 °C 2分間

2) 94 °C 1分間

3) 50°C 1分間

4) 68°C 2分間

5) 68°C 5分間

2)〜4) を 30サイクル

それぞれ約 1 kbの DNA断片の増幅が認められた。 AT— 1 3と AT— 1 6 をプライマー DNAとして用いた PCRにより増幅した DNA断片と、 AT— 1 4と AT— 1 6をプライマ一 DNAとして用いた PC Rにより増幅した DN A断 片を Nd e Iと B amH Iによって切断し、 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動に て分離し、 DNA断片を含むゲルを切り出して、 DNA断片を SUPREC^TM— 0 1 (宝酒造 （株） 製） にて抽出精製した。 これらの DNA断片を、 Nd e Iと B amH Iで切断しァガロースゲル電気泳動し、 切り出したゲルから S U P R E C™- 0 1 (宝酒造 （株） 製） にて抽出精製した pUCNTと DNA L i ga t i on k i t v e r . 2 (宝酒造 （株） 製） を用いてライゲーシヨンを行 レ、、 それぞれで大腸菌 JM1 09を形質転換した。 形質転換体よりプラスミ ド D NAを調製し解析した結果、 それぞれトランスァミナーゼ遺伝子の挿入された発 現プラスミ ド pAT28、 pAT29が得られた。

AT- 1 5と AT— 1 6をプライマ一 DNAとして用いた PC Rにより増幅し た DNA断片を Pma C Iと B amH Iで切断し 0. 8 %ァガロースゲル電気泳 動にて分離し、 DNA断片を含むゲルを切り出して、 SUPREC^TM— 0 1 (宝 酒造 （株） 製） にて抽出精製を行った。 pUCNTを Nd e Iで切断し DNA B l un t i ng k i t (宝酒造 （株） 製） にて切断部位を平滑にした後、 B amH Iにて切断した。 その後、 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動にて DNA断 片を分離し、 DNA断片を含むゲルを切り出して、 SUPREC^TM— 0 1 (宝酒 造 （株） 製） にて抽出精製した。 このようにして調製した DNA断片とベクタ一 をライゲーシヨンし、 大腸菌 JM1 09を形質転換した。 形質転換体よりプラス ミ ド DN Aを調製し解析した結果、 トランスアミナ一ゼ遺伝子の挿入されたブラ スミ ド pAT30を得たことが分かった。

実施例 23

実施例 22で作製した p AT 28を保持する大腸菌 JM1 09、 〔以下、 E. c 01 i JM1 09 (pAT28) のように略記する〕 、 E. c o 1 i JM 1 09 (pAT29) 、 E. c o l i JM 1 09 (p AT 30) を用いてトラ ンスァミナーゼの発現 （生産） を行った。 対照として E. c 01 i JM 1 09 (pUCNT) を用いた。 また実施例 9で示したァルスロパクター 'スピーシー ズ KNK 1 68のダイノミルによる粉砕後の遠心上清液も、 対照として用いた。 それぞれの株を 1 00〃 g/m 1 I PTG、 1 00〃 g/m 1アンピシリンを 含有する 1 0mlの L培地の入った試験管 （直径 22mm、 長さ 220 mm) に 植菌した後、 37 °Cで一晩振とう培養した。 こうして得た培養液 1. 5mlを遠 心分離 （1 5， 000 r pm, 5分， 4 °C) して集菌した。 4°Cに冷却した 20 mMリン酸緩衝液 pH6. 8、 20〃Mピリ ドキサ一ルリン酸、 0. 0 1 %2 —メルカプトエタノールから成る抽出バッファー 1 m 1を加え菌体を懸濁した。 この懸濁液を氷上にて超音波破砕 （トミー精ェ （株） Handy s on i c mo d e l UR- 20 P, p owe r maxにて 90秒 2回） し、 1 50 00 r pm 4°C, 1 0分の遠心分離を行い、 細胞残渣を除き、 上清を粗酵素夕 ンパク質溶液とした。

トランスアミナ一ゼ活性は次のようにして測定した。 25mM (R) —フエ ニルェチルァミン、 25 mMピルビン酸、 0. 1 mMピリ ドキサールリン酸、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液 pH8. 5から成る基質溶液 0. 8mlに酵素タンパ ク質溶液 0. 2mlを加え、 30で、 1時間反応させた。 沸騰水中にて 3分間加 熱し反応を停止した。

反応生成物であるァセトフヱノンを HP L Cにて分析することによって、 酵素 活性を求めた。 分析条件を以下に示す。 なお、 トランスアミナーゼの量は、 精製 トランスァミナ一ゼの比活性より推定される値である。

HP LCカラム ： 日本分光社製 F i n ep a c S I L C 1 8 - 5 展開溶媒 ：ァセトニトリル/水 = 25/75

流速 ： 1 m 1 / m i n

検出 ： 21 0 nm

ァセトフヱノンは約 24分に検出される。 結果を以下に示す。

菌株 トランスアミナーゼ （mgZL)

E.coli JM109(pAT28) 8 1

E.coli JM109(pAT29) 66

E.coli JM109(pAT30) 3. 4

Arthrobactor sp. KN 168 1 9

実施例 24

ァルスロパクター■スピ一シ一ズ KNK 1 68株を実施例 6と同様に酵素誘導 物質として （RS) ― 1一メチルプロピルアミンを用い振とう培養した。 培養液 1 リッ トルから集菌した菌体を 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液 1 リットルに懸濁し、 3 0 gの 1— (3—トリフルォロメチルフエニル） 一 2—プロパノン、 1 8 の (R) — 1—フヱニルェチルァミンを 44 gのォレイン酸を加え （pH 8. 5)

、 30°Cで 4 0時間反応させた。 反応後、 実施例 6と同様に抽出、 蒸留し （R) — 1— ( 3—トリフルォロメチルフエニル） 一 2—ァミノプロパンが 1 9. 5 g 得られた。 光学純度は 1 0 0 e e、 収率は 6 5%であった。 産業上の利用可能性

本発明により、 従来合成の困難であった 1位にァリ一ル基等を有する光学活性 ァミノ化合物等を高収率で容易に製造することが可能となる。 また、 本発明のポ リベプチドは立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するものであり、 本発明 の製造方法に好適に用いることができる。 また、 本発明の DNAは本発明のポリ ぺプチドをコ一ドするものである。

9 9

I^OJdusvAiOdsvi¾A-i8SIWdO-^Idd-ilI¾A l0^10¾IVJ lJ lsAoAion9qiBAⁿ10dsv¾IVdsvn9in9 nio¾ivn9qjm9H dsvBIVn919n¾lvniOS!H^IOⁿ91^J9SⁿIO¾iV3IiniOⁿ91IWlsAq8JV-^I¾ 911

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¾JOJSa33VVg333a3333a3JS93J33333SJSJ38uvi3J,l,uL3gvojiVJ3039o3IVvvvvv 33s33s3331gJS033g33i33JlvJ033a3 133303,LVv;1IvVvv1031vv}1s333g33v1vvvv

33g90 33J33,uv,s3g3g3a3333S331vv333ovgo3Q1lJvLviv35J1vf303J33i3alvvlVV_

謹3JS30l3vj3s )3sdlvav33 )ll - 配列番号： 3

配列の長さ ： 1 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列の特徴： 1、 2、 1 5 (不明のアミノ酸）

配列：

Xaa Xaa Ser Ala Asp Thr Ser Glu l ie Val Tyr Thr His Asp Xaa Gly Leu Asp Tyr 配列番号： 4

配列の長さ ： 2 0

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Thr Ser Glu l ie Val Tyr Thr His Asp Thr Gly Leu Asp Tyr l ie Thr Tyr Ser Asp Tyr 配列番号： 5

配列の長さ ： 1 1

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 配列の種類：ぺプチド

配列：

Ala Val Pro Tyr Gin Trp Lys Val Pro Phe Asp 配列番号： 6

配列の長さ ： 1 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

l ie Ser l ie Phe Asp Gin Gly Tyr Leu Hi s Ser Asp Val Thr Tyr

Thr Val Phe 配列番号： 7

配列の長さ ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)

配列の特徴： Rは Aまたは G、 Yは Cまたは T、 Ηは A、 Cまたは Τ、 および Ν は A、 C . Gまたは Τをそれぞれ示す。

配列：

CGCGGATCCG ARATHGTNTA YACNCAYGA 配列番号： 8 配列の長さ ： 1 7

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)

配列の特徴： Rは Aまたは G、 Yは Cまたは T、 および Νは A、 C Gまたは T をそれぞれ示す。

配列：

ACYTTCCAYT GRTANGG 配列番号： 9

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)

配列：

GCATCATCCC TCCGCTCACA 配列番号： 1 0

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)

配列： GAACTCGATC CTGCTAACCC 配列番号： 1 1

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：

TGTGAGCGGA GGGATGATGC 配列番号： 1 2

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：

GCGGAGTGTG GCCATTCGTC 配列番号： 1 3

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：

GGCACGAATG CACCCTCGAT 配列番号： 1 4

配列の長さ ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：

CGTAGTCGCT ATAAGTGATG 配列番号： 1 5

配列の長さ ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：

CCTTCTACGA CGACCCGAAG 配列番号： 1 6

配列の長さ ： 1 5 74

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

30333J333v33s33i3393331031vvvvv1vi33303vo3ivJvivo3vo3JS3303o )vivvlv 配列の長さ ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：

ACACATATGG CATTCAGCGC CGATACCTCC 配列番号： 1 8

配列の長さ ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：

ACACATATGA CCTCCGAGAT CGTCTACACG 配列番号： 1 9

配列の長さ ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：

AGACACGTGG CATTCAGCGC CGATACCTCC 配列番号： 2 0

配列の長さ ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 D NA)

配列：

AGAGGATCCT CAGTACTGCA CAGGCGTAAG 配列番号： 2 1

配列の長さ ： 4 6 5

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列：

GGAT(

GCTAACCCGCTCGCGGGAGGTGCGGCATGGATCGAGGGTGCATTCGTGCCGCCGTCGGAGGCGCGGATCTCG ATCTTCGATCAGGGTTACCTCCACTCGGACGTCACCTACACGGTCTTCCACGTCTGGAACGGAAATGCATTC CGCCTCGACGACCACATCGAACGCCTCTTCTCCAACGCGGAGTCGATGCGCATCATCCCTCCGCTCACACAG GACGAAGTGAAGGAGATTGCGCTCGAACTCGTCGCGAAGACCGAATTGCGTGAGGCCTTCGTGTCCGTGTCG ATTACCCGCGGTTACAGCTCGACTCCGGGCGAGCGCGACATCACGAAGCACCGCCCGCAGGTGTACATGTAT GCCGTCCCATACCAGTGGAAAGTAATCGGATCC

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 一般式 （ 1 )

R— (0)p—— (CH₂)q— J— (CH₂)r—X (1)

0

(式中、 pは 0または 1を示し、 qは 0〜8の整数を示し、 rは 0〜4の整数を 示し、 Rは炭素数 6〜 1 4の置換または無置換のァリール基、 炭素数 4〜 1 2の ヘテロァリール基、 カルボシキル基、 炭素数 1〜 6のアルコキシカルボニル基、 メチル基、 または水素原子のいずれかを示し、 Xは水酸基、 カルボシキル基、 炭 素数 1〜6のアルコキシカルボニル基、 または水素原子のいずれかを示す。 ） に 示されるケトン化合物をァミノ基受容体とし、 アミノ基供与体である第一アミン の存在下、 トランスアミナーゼを作用させて立体選択的にァミノ基転移を行わせ ることにより、

一般式 （ 2 )

H

！

R— (0)p一 (CH₂)q— C— (CH₂)r—X (2)

NH₂

(式中、 p、 q、 r、 R、 Xは、 それぞれ一般式 （ 1 ) における p、 q、 r、 R 、 Xと同じである。 ） に示される立体配置を有する光学活性アミノ化合物を得る ことを特徴とする、 光学活性アミノ化合物の製造方法。

2 . ( R ) 体選択的にアミノ基転移を行い、 （R ) 体の光学活性アミノ化合物 を得る請求項 1記載の製造方法。

3 . 置換ァリール基が、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜6のアルキル基、 水酸基、 メ トキシ基、 モノフルォロメチル基、 ジフルォロメチル基、 及びトリフルォロメ チル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ヶ所以上置換された ァリール基である、 請求項 1又は 2記載の製造方法。

4 . Rがメチル基、 フエニル基、 2 —メ トキシフエ二ル基、 3 —メ トキシフエ ニル基、 4ーメ トキシフエ二ル基、 2 , 4 —ジメ トキシフエ二ル基、 3 , 4—ジ メ トキシフエニル基、 2 —トリフルォロメチルフエニル基、 3 —トリフルォロメ チルフヱニル基、 及び 4—トリフルォロメチルフェニル基からなる群より選択さ れる基である請求項 1〜 3いずれか記載の製造方法。

5 . ヘテロァリール基がピリジル基、 ビラジニル基、 チェニル基、 フリル基、 及びチアゾリル基からなる群より選択される基である請求項 1又は 2記載の製造 方法。

6 . pが 0、 qが 1、 rが 1、 Xが水素原子である請求項 1〜5いずれか記載 の製造方法。

7 . 第一アミンが、 一般式 （3 )

(式中、 R, 、 R₂ はそれぞれ独立して、 水素原子、 炭素数 1〜1 4の置換若 しくは無置換のアルキル基、 炭素数 6〜1 4の置換若しくは無置換のァリール基 、 炭素数 1〜1 4の置換若しくは無置換のァラルキル基、 カルボキシル基、 又は 炭素数 1〜1 0のアルコキシカルボ二ル基を示し、 R, と R₂ は分子内で結合し て環を形成してもよい。 ） に示される化合物である請求項 1〜6いずれか記載の 製造方法。

8. Ri が炭素数 1〜1 0のアルキル基、 フエニル基、 又はナフチル基のいず れかであり、 そして R₂ がメチル基、 ェチル基、 ヒドロキシメチル基、 ヒドロキ シェチル基、 カルボキシル基、 炭素数 1〜1 0のアルコキシカルボニル基、 又は 力ルボキシメチル基のいずれかである請求項 7記載の製造方法。

9. 第一ァミンが （R) 体である請求項 1〜8いずれか記載の製造方法。

1 0. 第一ァミンが、 D—ァラニンまたはアルキル基の炭素数が 1〜 1 0であ る、 D—ァラニンのアルキルエステルである請求項 1〜 9いずれか記載の製造方

1 1. 第一ァミンが、 （R) — 1一フエニルェチルァミン、 （R) — 1—ナフ チルェチルァミン、 （R) — 1一メチルプロピルァミン、 （R) — 1一メチルへ キシルァミン、 （R) — 2—アミノー 1一プロパノール、 （R) — 1ーメチルブ チルァミン、 （R) — 1—フエニルメチルァミン、 （R) — 1—アミノー 1—フ ェニルエタノール、 （R) — 2—ァミノ一 2—フエニルエタノール、 （R) — 3 ーァミノヘプタン、 （R) — 1—アミノー 3—フエニルプロパン、 （R) — 2— アミノー 4一フエニルブタン、 （R) — 2—ァミノ一 3—フエニルプロパノール 、 （R) — 1—メチルヘプチルァミン、 ベンジルァミン、 （S) — 2—フエニル グリシノール、 （R) — 3—ァミノフエ二ルブタン、 L—フエ二ルァラ二ノール 、 (R) — 2—アミノー 1ーメ トキシプロパン、 D—ァラニンメチルエステル、 (R) — 1— （3, 4—ジメ トキシフエ二ル） 一 2—ァミノプロパン、 （R) — 1—フエニル一 2—ァミノプロパン、 もしくは D—ァラニンェチルエステルであ る、 またはこれらのラセミ体である、 請求項 1〜1 0いずれか記載の製造方法。

1 2. 立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスアミナーゼ を生産する微生物の培養物、 分離した菌体、 菌体処理物、 または固定化菌体と、 ケトン化合物及び第一ァミンとを接触させる請求項 1〜 1 1いずれか記載の製造 方法。

1 3. 立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスアミナ一ゼ を生産する微生物の無細胞抽出物、 部分精製酵素、 精製酵素、 または固定化酵素 と、 ケトン化合物及び第一ァミンとを接触させる請求項 1〜1 1いずれか記載の 製造方法。

1 4. トランスアミナ一ゼを生産する微生物がァルスロバクタ一 （Ar t h r ob a c t e r) 属に属する微生物である請求項 1 2又は 1 3記載の製造方法。

1 5. ァルスロバクタ一属に属する微生物がァルスロバクタ一 'スピ一シ一ズ (Ar t h r ob a c t e r s p. ) KNK 1 6 8 (F ERM BP— 5 22 8) である請求項 1 4記載の製造方法。

1 6. トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、 該酵素の誘導物 質として （RS) — 1—メチルプロピルァミン、 （RS) — 1—フエニルェチル ァミン、 （RS) — 1—メチルプチルァミン、 （RS) — 3—アミノー 2, 2 - ジメチルブタン、 （RS) — 2—アミノー 1—ブ夕ノール、 及び （R) または （ RS) - 1 - (3, 4ージメ トキシフエ二ル） 一 2—アミノプロパンからなる群 より選択される一種以上のアミン類を培地に添加する請求項 1 2〜1 5いずれか 記載の製造方法。

1 7. 5〜1 2の範囲の pHで Rトランスアミナーゼを作用させる請求項 1〜1 6いずれか記載の製造方法。 O CH

一

1 8. 反応促進物質としての界面活性剤又は脂肪酸を添加して、 トランスアミ ナーゼを作用させる請求項 1〜 1 7いずれか記載の製造方法。

1 9. 一般式 （4) で示されるケトン化合物の存在下、 一般式 （5) で示され るラセミ体のァミノ化合物にトランスァミナ一ゼを作用させることにより、 立体 選択的にアミノ基転移反応を行い、 一般式 （6) で示される光学活性アミノ化合 物

(4)

H I

R— (0)p——(CH₂)q— (CH₂ —X (5)

丽₂ H

— (O)p— (CH₂)q-C— (CH₂)r-X ₍₆₎

(式中、 R、 P、 q、 r、 X、 、 R₂ は一般式 （1) 、 一般式 （3) におけ る R、 p、 q、 r、 X、 R, 、 R₂ と同じである。 ） を得る、 光学活性アミノ化 合物の製造方法。

20. 立体選択的にアミノ基を転移させる活性 （ 「立体選択的なトランスアミ ナ一ゼ活性」 と略記する。 ） を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有 してなる DNA。

21. ポリべプチドがァルスロバクタ一 （Ar t h r oba c t e r) 属に属 する菌株由来のものである請求項 20記載の DNA。

22. 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列の全部又はその一部を コードする DNAであって、 かつ立体選択的なトランスァミナ一ゼ活性を有する ポリべプチドをコ一ドする DNA。

23. 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列の全部又はその一部を含む D N Aであって、 かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリべプチ ドをコ一ドする DNA。

24. 配列表の配列番号： 2に記載された塩基配列において、 1個以上の塩基 が欠失、 付加、 挿入、 または置換された塩基配列からなる DNAであって、 かつ 立体選択的なトランスァミナ一ゼ活性を有するポリべプチドをコードする D N A

2 5 . 配列表の配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列において、 1個以上の アミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入、 または置換されたアミノ酸配列からなるポリ ぺプチドであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリぺプ チドをコ一ドする D N A。

2 6 . ァルスロバクタ一属に属する微生物の培養により得ることのできる、 立 体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチド。

2 7 . 配列表の配列番号： 3、 配列番号： 4、 又は配列番号： 6に記載された 部分ァミノ酸配列を含み、 立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺ プチド。

2 8 . 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列の全部又はその一部を 含み、 立体選択的なトランスアミナ一ゼ活性を有するポリぺプチド。

2 9 . 配列表の配列番号： 1に記載されたァミノ酸配列において、 1個以上の アミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入、 または置換されたアミノ酸配列からなるポリ ぺプチドであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活性を有するポリぺプ チド。

3 0 . 請求項 2 0〜2 5いずれか記載の D N Aを含んでなる組換え D N A。

3 1 . 微生物、 動物若しくは動物細胞、 又は植物若しくは植物細胞において、 コードされたポリべプチドを発現することができる請求項 30記載の組換え DN

32. 請求項 30又は 31記載の組換え DNAを揷入されてなる、 微生物、 動 物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現べクタ一。

33. 発現ベクターがプラスミ ド pAT28、 pAT29、 または pAT30 である請求項 32記載の発現べクタ一。

34. 請求項 32又は 33記載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質 転換体。

35. 形質転換体が大腸菌である請求項 34記載の形質転換体。

36. 大腸菌が E. c 01 i JM 1 09 (p AT 28) , E. c o 1 i J M1 09 (pAT29) 、 又は E. c o l i JM1 09 (pAT30) である 請求項 35記載の形質転換体。

37. 請求項 34〜 36レ、ずれか記載の形質転換体を培養もしくは育種するこ とによって、 培養に用いた培養液又は該形質転換体より立体選択的なトランスァ ミナ一ゼ活性を有するポリべプチドを採取することを特徴とする、 立体選択的な トランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドの製造方法。

38. トランスアミナーゼとして、 請求項 37記載の製造方法により得られる 立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリぺプチドを用いる請求項 1〜 1 9いずれか記載の製造方法。

39. 配列番号： 2に記載した塩基配列を有する DNAの全部あるいは一部分 と、 又は該 DNAの相補鎖の全部あるいは一部分と、 ストリンジヱントな条件下 でハイプリダイズする DNAであって、 かつ立体選択的なトランスァミナーゼ活 性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。

40. 請求項 20〜25いずれか記載の DNAとストリンジヱン卜な条件下で ハイプリダイズする、 プローブ又はプライマ一として用いることができるオリゴ ヌクレオチド。