WO1997018703A1

WO1997018703A1 - Method for constructing transgenic animals

Info

Publication number: WO1997018703A1
Application number: PCT/JP1996/003375
Authority: WO
Inventors: Yutaka Toyoda; Izumu Saito
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1996-11-18
Publication date: 1997-05-29
Anticipated expiration: 1998-05-20
Also published as: JPH09140292A; JP3799426B2; AU7588196A

Description

明細書トランスジヱニック動物の作成方法

技術分野

本発明は非増殖型組換えアデノウイルスを用、て外来遺伝子をゲノム内に導入して得られるトランスジヱニック動物、および該トランスジヱニック動物の作成方法に関するものである c

背景技術

トランスジヱニック動物の作成は、従来より困難であり、目的とするトランスジヱニック動物の作成が可能な施設は極めて限られているのが現状である。

従って、トランスジニック動物の簡便かつ効率的な作成方法の開発が強く望まれている。

一方、本発明者らは、非増殖（E 1 A欠損）型の組換えアデノウイルスが宿主ゲノム中にほとんど組み込まれないこと（Rosenfeld et al., Science— 252， 43 1-434 (1991)) から、遺伝子制御の研究や体細胞遺伝子治療の開発のための遺伝子発現に利用されてきた（Akli et al.， Nat. Genet. _3, 224-228 (1993)) ことに着目して種々研究を重ね、 L a c Z遺伝子を含む非増殖型アデノウイルスが、前核期の無卵膜マウス卵子に感染することが可能であり、悪影響なしに卵割期の着床前胚において発現することを明らかにした（Tsukui et al.， J. Ma鼠 Ova. Res., 10(1), (1993,4) 150-151) 。

しかし、この方法によっても発現は一過性であり、安定なトランスジヱニック動物を作成することには成功していなかった（Tsukui et al.， ol. Reprod.

Dev. 42， 291-297 (1995)) 。

従って、本発明の第 1の目的は、外来遺伝子をゲノムに導入されたトランスジヱニック動物の簡便かつ効率的な作成方法を提供することにある。さらに本発明の第 2の目的は、本発明の方法によって作成されたトランスジヱニック動物を提供することにある。

発明の開示本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、非増殖型組換えァデノウィルスが動物の卵子のゲノム中に組み込まれ、そして組み込まれた該アデノウィルス DN Aが動物の生殖細胞系に移行すること、すなわち非増殖型組換えアデノウイルスを用いることによりトランスジヱニック動物を作成し得ることを発見した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を重ねて完成するに至ったものである。

即ち、本発明の要旨は、

( 1 ) 外来遺伝子を導人した非増殖型組換えアデノウィルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴とするトランスジエニック動物の作成方法、

(2) 外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色夕ンパクまたはマーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコ一ドする塩基配列を有するヌクレオチドである前記（ 1 ) 記載のトランスジヱニック動物の作成方法、

(3) 非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させる場合の投与量が 5 X 1 0⁷ 〜1 0⁸ p f / 1であることを特徴とする前記 (1) または（2) 記載のトランスジュニック動物の作成方法、

(4) 非増殖型組換えアデノウイルスが、 C AGプロモーター支配下に発現するものである前記（1) 〜（3) いずれかに記載のトランスジヱニック動物の作成方法、

(5) 非増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含むものである前記（1) 〜（4) いずれかに記載の卜ランスジエニック動物の作成方法、

(6) 外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスの 1コピーだけが動物受精卵のゲノムに組み込まれることを特徴とする前記（1) ~ (5) いずれかに記載のトランスジヱニック動物の作成方法、並びに

( 7 ) 外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって作成されたトランスジヱニック動物、

に関する。図面の簡単な説明

図 1は、非増殖型アデノウイルス DN Aの組み込みのサザン分析による同定を示す電気泳動の写真である。 27匹の動物の尾から単離されたゲノム DN Aを E c。尺ぉょび^! i n d III で消化し、 AxCANL a c Z配列と 9 8 %の相同性を有する pAxCANL a c Zのコスミド DN Aをプローブとして用いた。 aは E c oRV消化、 bは H i n d 1【1 消化のデータである。白丸は、アデノウィルスの末端断片である。星印は組み込み事象後のウィルス一細胞 D N Aの連結断片を示す。

図 2は、 3匹のトランスジェニックマウスゲノムに組み込まれたアデノウィルス DNAを示す。太線は組換えアデノウイルス Ax CANL a c Zの制限酵素地図を示す。

図 3は、 F 1子孫への生殖細胞系の遺伝および F 1上でのアデノウイルストランスジーンの発現を示す電気泳動の写真である。 L a c Z発現性のトランスジェニックマウス（AC L9.23) を I CR雌と交配させ、発生した 1 0匹の F 1胎仔を妊娠後 1 3. 5日に試験に供した。その 1 0個の胎盤から単離されたゲノム DN Aを図 1に示すものと同様の手順によりサザン分析に付した。レーン 1、 3、 4、 7、 8および 1 0はアデノウイルストランスジーンの伝達があったことを示し、レーン 2、 5、 6および 9は、かかる伝達がなかったことを示す。星印は組み込み事象後のゥィルス一細胞 D N Aの連結断片を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明に用いられる ^増殖型アデノウイルスは、鐘ケ江裕美、原田志津子および斎藤泉「実験医学別冊」バイオマニュアルシリーズ 4 「遺伝子導入と発現♦解析法」 4 3〜 58頁「アデノウイルスを用いた遺伝子導入」 1 9 9 4年に記載の方法によって調製することができ、また外来遺伝子を導入した非増殖型ァデノウィルスを調製することができる。

本発明に用いられる非増殖型アデノウイルスは、幾つかの特徴を有する。すなわち、アデノウイルスは、第 1に宿主の範囲がきわめて広く、第 2に組み換え遺伝子を非分裂細胞中に導入させることが可能である。非増殖型組換えアデノウイルスは、かかる性質を有することから、前核期における動物受精卵に対するベクターとして期待される。し力、しな力ら、本発明者らの研究では、非増殖型アデノウイルスベクタ一の 1種である SRaプロモ一夕一の制御下にある大腸菌 L a c Z遺伝子を含む Adex4SRLacZLを使用して前核期における動物受精卵に対する遺伝子導入を試みたが、感染卵子から発育した 1 3. 5 日胎仔において発現を検出することができなかった（Tsukui, T.， et al. ol.

Reprod. Dev. 42, 291-297 (1995))。

本発明においては、. 動物細胞に感染した後、外来遺伝子の発現を可能とするため、アデノウイルスベクタ一にプロモータ一を導入する必要がある力く、かかるプロモ一ターとしては従来アデノウイルスを用いる遺伝子導入に使用されてきたものはいずれも使用可能であり、特に C AGプロモータ一（Araki et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 160-164 (1995)) が好適に用いられる。

本発明において、外来遺伝子の発現産物が細胞質に蓄積されることによる毒性が懸念される場合は、外来遺伝子とともに核移行シグナル配列を組み込んでもよい。核移行シグナル配列はアデノウイルスベクタ一により感染細胞の核内で発現され核外に分泌された外来遺伝子産物が再び核内に移行することを促進する (Daniel Kalderon et al., Cell 39 , 499-509 (1984)) 。

本発明者らは、ウィルス組み込みの結果を明確にするために、以下には i例として、新たなベクタ一である Ax C ANL a c Zを用いる。この

Ax C ANL a c Zは、外来遺伝子（L a c Z) により発現する —ガラクトシダ一ゼ (β - g a 1 ) 活性の同定のために、トランスジヱニックマウスで普遍的発現に用いられる C AGプロモーターの支配下にある核標的化された L a c Z遺伝子を含む。このべクタ一の調製は以下のようにして行うことができる。例えば、

Kanegae らの方法 (Kanegae, Y. et al. , ucleic Acids Research, 1995， vol. 23, 3816-3821 ) により、アデノウイルスの複製に必要な E 1 A蛋白質を産生させず、外来遺伝子を発現するように設計し、また細胞および組織での発現を確認できるように、 C AGプロモーターの支配下に大腸菌由来の L a c Z遺伝子を揷入することにより調製できる。

本発明に用いられる外来遺伝子としては、特に限定されるものではなく、その有用性の観点から、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色夕ンパク、マーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパク等をコードする塩基配列を有するヌクレオチドが挙げられる。生理活性タンパクとしては、サイト力イン類（例えば、インターロイキン一 1〜 1 5、インターフェロン一，もしくはァ、腫瘍壊死因子ひもしくは、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリン、インシュリン様成長ホルモン等）、神経栄養因子類、 α— 1アンチ卜リブシン、血液凝固第 8因子、血液凝固第 9因子、 α ガラクトシダーゼ等が挙げられる。マーカー遺伝子としての発色タンパクとしては、 β— ガラクトシダ一ゼ、 GFP (Green fluorescent protein)等が挙げられる。マ一カー遺伝子としての薬剤耐性タンパクとしては、アミノグリコシドフォスフォトランスフヱラ一ゼ等が挙げられる。

本発明のトランスジヱニック動物を作成する方法は、以下のようにして行うことができる。本発明において、トランスジエニック動物とは、生殖系に導入された外来遺伝子を含有するヒト以外の哺乳動物をいう。このような動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ャギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ等が挙げられる _c 以下にマウスを例として、卜ランスジニック動物の典型的な作成方法を説明する。

まず、雌マウスに PMSG (ゥマ絨毛性性腺刺激ホルモン）、 hCG (ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を腹腔内に注射して過排卵を誘起する。精子提供用の雄には同系統の雄マウスを用いる。培養およびウィルスとの反応は、すべて 5% CO, , 9 5 %空気、 3 7 °Cの条件で行う。

}1じ0の投与後 1 6時間に、卵丘細胞に包まれた未受精卵を TYH( マウス体外受精用培地 (Toyoda et al. , Jpn. J. Anim. Reprod. 16 , 147 - 151 (1971))) 中に採取し、予め TYHで 2時間前培養を行った精子を最終濃度が 1 5 0精子/ Lとなるように加えて体外受精を行う。受精してから 3 ~6時間後に受精卵を WM - EDTA (受精卵発生用培地（Hoshi et al., Jpn. J. Zootech. Sci. 56， 931-937 (1985)))に移し、ヒアルロニダ一ゼおよび酸性タイロード液（pH 2. 5) で卵丘細胞および卵膜を除去する。

次に、 AxCANL a c Z等の、外来遺伝子の導入された非増殖型アデノウィルスを 1 0 〜 1 0 ^a p f u Zm 1、好ましくは 5 x 1 0 ⁷ 〜 1 0 " p f u /m 1の投与量で、該ウィルスとの反応時間を 2 ~ 8時間としてウイルス感染を行う。ゥィルス感染後の胚を借り親マウスの子宮に移植する。

得られた産仔のゲノムに外来遺伝子の導入された非増殖型アデノウイルスが伝達されたか否かを確認する。

次に、以上のようにして得られたトランスジヱニックマウスと野生型のマウスとを交配して得られる子孫の F 1において、該トランスジーンが安定に伝達され、組換え非増殖型アデノウイルス由来の外来遺伝子が発現していることを確認する以上のようにして得られるトランスジヱニックマウスについては、以下のような性質が観察される。

後述の実施例において示すように、 3匹のマウスすべてにおいて、 1 コピーの組み込み、すなわち完全なアデノウイルス D N Aが観察される（図 1 ) 。これに反して、卵子の前核中に D N Aをマイクロインジェクションした場合には、トランスジヱニック動物への組み込みは、縦列の頭一尾方式で配列された多数のトランスジーンのクラスタ一となって生ずる。これらの現象は、アデノウイルスの末端蛋白質が、裸の D N A分子の場合と異なり、マウス卵子中でのウィルスゲノムの縦列形成を阻止しているのかも知れない。

メンデルの法則に従った安定な生殖細胞系遺伝が認められるが、この事実は、アデノウイルスゲノムの組み込みが 1—細胞期における D N A合成の期間前または期間中に起こったことを示す。前核中への D N Aのマイクロジヱクシヨンの場合には、 1一細胞期の受精卵への遺伝子の組み込みが約 Ί 0 %の頻度で起こることが報告されている (Bi shop et aし Mol. Biol. Med. , 6， 283-298 (1989)) 。レ卜ロウィルスベクターの他の場合は、分裂中の胚（好ましくは 4一または 8— 細胞期）に感染するときは (Rubenstei n et al.， Proc. Nat l. Acad. Sci.

U. S. A. 83, 366-368 (1986))、前ウィルス組み込み (provi ral integrat i on) が 1個以上の細胞中で独立に起こり得る。従って、生殖細胞系遺伝率は、モザイク形成により (Jaeni sch et al. , Cel l 24， 519 529 (1981)) 、一般的に低い。

F 1子孫へのアデノウイルストランスジーンの遺伝の場合は、転位は一切示されない（図 3 ) 。これに反して、ウィルス複製と宿主細胞に対する細胞毒性の誘導を支配する E 1 A遺伝子を含む野生型のアデノウイルスの場合の組み込み事象は、培養された細胞系中で多くの転位が起こるようにみえる（Dorsch, M. K. et aし， J. Virol. 34, 305-314 (1980)、 Visser, L. et al. , J. Virol. 39， 684 -693 (1981))。一つの可能性は、細胞毒性をもつ E 1 A遺伝子の欠損により、組み込まれたアデノウイルス DNA力 <、マウスの 1 細胞から生殖細胞系へゲノム中で安定な状態で維持されるというものである。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによつて制限されるものではな、 o

なお、実施例中のコスミド、 DNA、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作およびサザン分析は、特に断らない限り、「Molecular Cloning A Laboratory Manual. T. Maniatisら編、第 2版（1989) , Cold Spring Harbor Laboratory に記載の方法に準じて行った。

実施例 1

組換えアデノウイルスゲノムの卵子前核における転写および翻訳の確認

まず、卵膜の存在または非存在の状態で、前核期にある 1 一細胞卵子に感染する Ax CANL a c Zの能力を試験した。

マウスの 1 細胞卵を卵膜を有するまま又は卵膜を除去したのち、 1 X 1 0⁸ p f u/m lの Ax CANL a c Z (核移行シグナルを有するアデノウイルス）で感染させた。感染させた卵子を培養し、感染 2 4時間後の 2—細胞期で染色した。 —ガラクトシダーゼ活性は、組織化学的（X— G a 1 ) 染色（Beddington et al., Development 106， 37-46 (1989)) により検出した。

その結果、 β - g a 1活性は、感染卵から発育した 2—細胞胚（ウィルス感染 2 4時間後）の核中に、明確に局在していることが分かった。この結果は、組換えアデノウイルスゲノムが卵子の前核中に移行し、そして感染後 2 4時間以内に転写 Z翻訳されることを示した。他方、卵膜の存在下では、 /3— g a l活性は検出されなかった。従って、卵膜の除去は、感染のための前提条件である。

実施例 2 アデノウイルスゲノムがマウス卵子ゲノム中に組み込まれたか否かを明らかにするために、 b stocyst (培養 4日後）における感染胚を借り親の子宮に移植した。 27匹の生まれたマウスの尾静脈血から単離したゲノム DN Aを制限酵素 E c o R Vおよび H i n d III で消化した。サザンプロット分析を行うと、図 1 に示すよ.うに、 3匹のものはアデノウイルス DNAを含んでいた。 2〜4レーンはそれぞれ、ウィルスの内部断片と同定された。そして、宿主ゲノムへのアデノウィルスゲノムの組み込みにより生じたウィルス一細胞 DNAの連結断片と推定されたものに星印を付した。

3匹のマウス（ A C L9.！、 9.3 および 9.23) はすべて、 1個のアデノゥィルスゲノムを保持し、以上の分析により、アデノウイルスゲノムはマウスゲノム中にランダムに組み込まれたことが分かった。

実験方法

マウスのゲノム DN A ( 1 0 g) を E c。尺または！ i n dill で消化し、 1. 0 %ァガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜ハイボンド一 N (アマシャム社製）上にブロッ卜し、そしてランダムにジゴキシゲニン標識されたプローブにハイブリダィズさせ、サザン分析を行った。

実施例 3

トランスジヱニック動物中での外来遺伝子; L a c Zの発現

さらに、本発明者らは、この 3匹のトランスジヱニック動物中での外来遺伝子 L a c Zの発現を試験した。耳のパンチングにより採取した組織片を常法により X- g a 1染色法（Beddington et al.， Development 106, 37-46 (1989)) で染色した。 3匹のトランスジエニック動物のうち 2匹（ACL9.3 と 9.23) において実際に — g a 1活性が検出された。しかし他の 1匹（ACL9.1)では検出され、つた

実施例 4

子孫 F 1への組換えアデノウイルスの伝達

アデノウイルス DN Aが子孫 F 1に伝達したか否かを確かめるために、 3匹の卜ランスジエニックマウスを I CR系マウスと自然交配させた。トランスジェニックマウスの 1匹（図 1、 AC L9.23) に由来した妊娠 1 3. 5日目の 1 0匹の F 1の胎盤から単離したゲノム DNAを H i n d III で消化した。サザン分析により、アデノウイルストランスジーン（ ansgene)は F 1子孫 1 0匹の中の 6匹に伝達したことが分かった（図 3) 。これらの断片パターン（図 3、レーン 1、 3、 4、 7、 8および 1 0 ) は、親のトランスジエニックマウスの断片パターン (図 3、レーン AC L 9. 2 3) と一致した。他の 2匹のトランスジエニックマウス（ACL9.1 および AC L9.3)のウィルストランスジーンも子孫 F 1に伝達した（それぞれ、 2 1匹中の 1 1匹および 1 3匹中の 7匹）。したがって、アデノウィルストランスジーンは、 F 1子孫に安定に遺伝することが確認されたといえる。アデノウイルストランスジ―ンの生殖細胞系への伝逹はメンデルの法則に従っており、転位は全く認められなかった（図 3) 。

実施例 5

ァ f 'ノイルス—トランスジ一ンの発現の確認

F 1子孫でのアデノウイルス卜ランスジーンの発現をさらに検討するために、同じサンプル（図 3) 由来の 1 0匹の F 1胎仔についてS— g a 1活性の染色を行った。全面的かつ強烈な暗青色の染色が 1 0匹の F 1胎仔中の 6匹で観察された。このことは、遺伝したアデノウイルストランスジーンが実際に L a c Z遺伝子を発現したことを示すものである。対照的にアデノウイルストランスジーンを受け取らなかった他の 4匹の胎仔は、全く染色されなかった。他のトランスジヱニックマウスの系列については、 ACL9.3 由来の 1 3匹の F 1胎仔のうちの 7 匹が /3— g a 1活性を示した。以上を総合すると、これらのデータは、 F 1子孫における L a c Z発現がアデノウイルストランスジーンの安定な状態での伝達から生じたことを明示するものである。

実験方法

胎仔全体を、 Allen らの方法（Allen, N. D. et al.， Nature 333 ， 852-855 (1988)) の改良法により /3— g a 1活性を調べるため X— g a 1を用いて染色した。すなわち、胎仔を 0. 5 %ホルムアルデヒド、 2. 5 %グルタールアルデヒド、および 0. 0 5 %N P 4 0を含むリン酸緩衝液（pH 7. 7) 中に 4 °Cで 3 0分間浸潰して固定した。そしてさらに 1 5分間、 2回目の固定を行った。固定された胎仔をリン酸緩衝液で 3回洗浄し、染色溶液（5mMフリシアン化カリゥ厶、 5 mMフエロシアン化カリウム、 0. 1 %NP 4 0ぉょび0. 5mgZ l ϋ m Iの X— g a 1を含むリン酸緩衝液）中に 3 7 °Cで 4時間ィンキュベー卜した _c 実施例 6

組み込まれたアデノウイルストランスジーンは 1 コピーであることの確認 3匹のマウスすべてにおいて、 1 コピーの組み込み、すなわち完全なアデノウィルス DN Aが観察された（図 1 ) 。これに反して、卵子の前核中に DN Aをマイク口インジヱクションした場合には、トランスジヱニック動物への組み込みは、縦列の頭一尾方式で配列された多数のトランスジーンのクラスタ一となって生ずる。これらの現象は、アデノウイルスの末端蛋白質が、裸の DN A分子の場合と異なり、マウス卵子中でのウィルスゲノムの縦列形成を阻止しているのかも知れない。

実施例 7

組み込み効率に対するゥィルス投与の影響

受精卵の卵丘細胞および卵膜を除去した後、表 1に記載の投与量で

Ax CANL a c Zを感染させ、インビトロで b 1 a s t o c y s tまで培養した後、借り親の子宮に戻した。実際、 1 X 1 0⁷ 、 5 X 1 0⁷ および 1 X 1 0⁸ (p f u/m 1 ) で感染した胚を移植し、それぞれ 5 5、 3 2、および 3 6匹の動物個体が得られた。これらの個体について、 L a c Z遺伝子をプローブとするサザンブロット解析により得られた結果を表 1に示す。表 1から明らかなように、ゥィルスの投与量が 1 X 1 0⁷ p f u/m 1の場合（ 2 Z 5 5 ) に比べて、 5 x 1 0⁷ p f u/m 1の場合（4Z3 2) および i x 1 0⁸ p f u/m 1の場合 (4/3 6) は、組み込み効率が飛躍的に向上することが分かる。これは、通常のウイルス感染の場合と異なりウイルス投与量の増加による動物細胞の死滅を考慮する必要がないため、ゥィルス投与量の高い方が効率が向上するという結果が得られたものと思われる。表 1 ：ウィルス投与量の組み込み効率に対する影響

N D ：未測定

産業上の利用可能性

本発明の方法によって簡便かつ効率的にトランスジェニック動物を作成するとができる。

Claims

請求の範囲

1. 外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴とする卜ランスジヱニック動物の作成方法。

2. 外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまたはマーカ一遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコ一ドする塩基配列を有するヌクレオチドである請求の範囲 1記載のトランスジヱニック動物の ί乍成方法。

3. 非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させる場合の投与量が 5 x i 0 ⁷ 〜1 0 ^B p f u Zm lであることを特徴とする請求の範囲 1または 2記載のトランスジェニック動物の作成方法。

4. 非増殖型組換えアデノウイルスが、 C A Gプロモータ一支配下に発現するものである請求の範囲 1〜3のいずれかに記載のトランスジヱニック動物の作成方法。

5. 非増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含むものである請求の範囲 1〜 4のいずれかに記載のトランスジヱニック動物の作成方法。

6. 外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスの】コピーだけが動物受精卵のゲノ厶に組み込まれることを特徴とする請求の範囲！〜 5のいずれかに記載のトランスジヱニック動物の作成方法。

7. 外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって作成された卜ランスジヱニック動物。