CN119842818A

CN119842818A - 一种感染柯萨奇病毒a16型的小鼠模型及其构建方法

Info

Publication number: CN119842818A
Application number: CN202510326520.XA
Authority: CN
Inventors: 黄璋琼; 吴海婷; 范胜涛; 叶尤松; 黄真; 张艺薇; 王子鸥; 江勤芳; 李云
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2025-03-19
Filing date: 2025-03-19
Publication date: 2025-04-18

Abstract

本发明公开一种感染柯萨奇病毒A16型的小鼠模型及其构建方法，具体步骤为把Rosa26位点的左同源臂LHA连接到质粒pCAG‑GFP‑N1上，成功构建出质粒pCAG‑GFP‑N1‑Rosa26 LHA。然后使用高保真酶PCR扩增Rosa26‑RHA和hSCARB2片段以及wpre‑polyA片段；再使用Hind3进行酶切并回收大片段作为连接载体备用，最后使用Gibson Assembly一步法将三个片段成功构建到载体上，即获得我们所需要的目的载体：pmRosa26‑CAG‑hSCARB2。然后将目的载体和靶向sgRNA、Cas9 mRNA混合，共注射于C57小鼠受精卵中，随后移植入假孕ICR母鼠的输卵管，最终获得hSCARB2定点（Rosa26）敲入小鼠。通过颅内注射CVA‑16病毒，其结果证实该敲入鼠在10日龄，21日龄、30日龄均能成功感染CVA‑16病毒，并且该模型首次出现了后肢麻痹及死亡等严重现象，为疫苗评价和药物筛选提供了一个有力的工具。

Description

一种感染柯萨奇病毒A16型的小鼠模型及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种感染柯萨奇病毒A16型的小鼠模型及其构建方法。

背景技术

手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是由人类肠道病毒引起的传染病，粪-口传播和接触被认为是手足口病的主要传播途径，与柯萨奇病毒A16型（CoxsackievirusA16，CVA-16）感染有关。2017年以后全球范围内的大多数HFMD疫情都是由CVA-16引起，目前尚无针对手足口病的特效抗病毒药物。而目前针对手足口病的疫苗有肠道病毒71型（Enterovirus71，EV-71）疫苗可有效预防EV-71相关手足口病，对CVA-16和CVA-10及其他肠道病毒所致手足口病无交叉保护效果，基于全球化的人口流动性及我国的特定社会背景和人群构成，考虑CVA-16的疫苗开发是十分重要的。

当前报道的能成功感染CVA-16的小鼠模型与EV-71的感染小鼠模型相似，只能感染小于7日龄的乳鼠，感染年龄偏小和感染病期过短严重限制了小鼠在基础研究和疫苗药物评价中的作用，与此同时，乳鼠体型过小也给操作上带来了无法规避的困难。其次乳鼠模型尚不能完整反映感染的全过程和病理学效应。虽也有研究者使用小鼠适应病毒株或免疫缺陷的新生小鼠建立CVA-16动物模型，然而，适应病毒株的突变、病毒的进入途径以及免疫功能缺陷的小鼠并不能准确地反映人类疾病的发病机制。因此，亟需构建新的实验动物模型来克服这些局限性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种柯萨奇病毒A16型小鼠模型的构建方法，构建方法包括以下步骤：

1）以质粒pCAG-GFP-N1为基础骨架，把Rosa26位点的左同源臂LHA连接到pCAG-GFP-N1上，构建出质粒pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA；

2）然后对Rosa26-RHA和hSCARB2片段以及wpre-polyA片段进行PCR扩增，在使用Hind3进行酶切后，并回收大片段作为连接载体备用；

3）将所述2）中的大片段使用Gibson Assembly一步法成功构建到所述1）的pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA上，获得质粒pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector；即为目的片段的donor序列；

4）待受精卵有明显的原核出现时，用TE缓冲液稀释，将Cas9 mRNA、靶向hSCARB2的sgRNA和所述3）中获得的目的片段的donor序列共同注射入受精卵；将注射完之后的受精卵移入另一个新鲜的M2培养液中进行培养；

5）体外培养后，移植入假孕ICR母鼠的输卵管，饲养待产；20-21天后获得F0代鼠，将F0代阳性鼠与野生型鼠交配获得FI代阳性鼠，即获得hSCARB2 -KI小鼠；

6）再将CV-A16经颅内注射到所述hSCARB2 -KI小鼠中，即为成功构建感染柯萨奇病毒A16型小鼠模型。

进一步，4）中靶向hSCARB2的sgRNA的终浓度为12.5ng/μl；所述Cas9 mRNA的终浓度为25ng/μl；所述目的片段的donor序列终浓度为10ng/μl。

进一步，5）中的体外培养的时间为2-3小时。

进一步，构建方法还包括：7）通过PCR、WB对所述6）中构建的感染柯萨奇病毒A16型小鼠模型进行基因型鉴定，通过RT-qPCR和HE染色方法检测病毒载量和病理组织学变化，结果表明柯萨奇病毒A16型的小鼠构建成功。

有益效果

1、hSCARB2靶向插入Rosa26位点，在小鼠中并不会引起强烈的免疫排斥反应而被清除，可长期表达存在。因为Rosa26最早是由Friedrich和Soriano在研究小鼠胚胎干细胞基因突变时发现的。位于小鼠第6号染色体上，该区域极易进行基因插入操作，目前尚未发现功能性表达蛋白，容易进行同源重组，敲入该区域的蛋白可以很好地在所有细胞类型和发育阶段广泛表达，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥，所以小鼠的Rosa26位点常常被用作基因打靶的“安全港”；因此，本发明也同时实现了外源基因稳定的全身性表达。避免了由于内源性基因表达沉默而可能导致的表型异常。这也是本发明与已有的通过ESCs构建的hSCARB2 KI小鼠的明显区别之一。

2、作为一种靶向基因敲入策略，所需的小鼠数量比BAC转基因和PiggyBac转基因要少，大大提升了工作效率，降低了生产成本。

3、该hSCARB2 KI小鼠使用相对安全的CRISPR-Cas9技术，以广泛性的CAG为启动子，添加wpre元件和bGH-polyA序列，使用wpre元件的载体，可以增强目的基因的表达，在提高蛋白表达效率方面具有很大优势。相比于信号较强的SV40 late polyA和rbGlobpolyA（被认为可以更加有效的终止转录），带有稍弱的poly(A)信号的bGH能够增强mRNA的稳定性，为蛋白质的持续合成提供较长时间的模板。其次，bGH PolyA序列能够促进mRNA的出核转运，使其更容易进入细胞质并进行翻译。因此本研究设计的wpre元件和bGH-polyA组合，能提高hSCARB2的稳定性和翻译效率。这种靶向策略也使hSCARB2在小鼠组织广泛性表达，使其在反映病毒对不同组织器官的损伤方面具有显著优势，这一点从载体结构设计方面体现了其创新性。另外，首建动物（F0代）中很少或者没有脱靶损伤；更为重要的是，CRISPR-Cas9 系统的具有迅速、操作简便等优点使用极为方便，任何实验室都可以开展工作，推广应用更为方便、快捷。

4、CVA-16乳鼠模型存在与人类受体差异性且只能间接评价疫苗保护效果等问题，给疫苗的研发和应用带来一定困难，而该模型实现了CVA-16人受体（hSCARB2）的插入，并在10日龄，21日龄、30日龄均能成功感染CVA-16病毒，并且10日龄小鼠感染病毒后出现了后肢麻痹及死亡等严重现象。进一步的研究特征表明，杂合小鼠在脑组织和后肢组织中的hSCARB2表达到峰值，而感染CVA-16后，在脑组织以及后肢组织中检测到CVA-16抗原的高表达，首次证明了此KI小鼠在颅内感染病毒后病毒抗原与病毒受体的表达量具有同一性，且均有脑及后肢组织的趋向性。

5、该模型为CVA-16疫苗的评价和相关药物筛选提供了一个有力的工具，同时在研究CVA-16感染与神经损伤的机制方面具有极高应用价值。

附图说明

通过结合附图对本申请示例性实施方式进行更详细的描述，本申请的上述以及其他目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本申请示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1是本申请实施例打靶载体包含5个元件的示意图；图中，Rosa26-LHA：指Rosa26基因位点的左侧同源臂；CAG promoter：指CAG启动子；hSCARB2：指清道夫受体2；wpre-polyA：指土拨鼠元件（构建载体时常用）后面加polyA尾，提高mRNA的翻译效率；Rosa26-RHA：指Rosa26基因位点的右侧同源臂。

图2是中间载体质粒pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA经PCR鉴定凝胶电泳图。

图3是中间载体质粒4#克隆菌测序比对结果图。

图4是完整的pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector质粒图谱。

图5是质粒pmRosa26-CAG-hSCARB2 targeting Vector菌落鉴定凝胶电泳图。

图6是12#克隆菌测序比对结果。

图7是PCR鉴定7只带有hSCARB2基因的KI小鼠电泳图。

图8是hSCARB2 KI小鼠部分序列（723bp）测序结果图。

图9是Western blot鉴定hSCARB2蛋白的表达图。

图10是攻毒以后脑及后肢等组织的RT-gPCR检测病毒载量图；其中：A，10日龄小鼠攻毒以后脑、心、肝、肺及后肢组织的RT-qPCR检测病毒载量图；B，21日龄小鼠攻毒以后脑、心、肝、肺及后肢组织的RT-GPCR检测病毒载量图；C，30日龄小鼠攻毒以后脑、心及后肢组织的RT-gPCR检测病毒载量图。

图11是攻毒以后脑和后肢组织病理结果（HE染色）。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本申请的实施方式。虽然附图中显示了本申请的实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本申请更加透彻和完整，并且能够将本申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。

传统的方法如使用基因打靶来生产突变小鼠，但需要步骤较多，构建靶向载体，建立具有所需突变的胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）克隆，产生嵌合小鼠，以及确认所需突变的种系传递。可能需要一年以上的时间才能获得突变小鼠；另外，ESCs获取过程复杂且成本高昂，通常需要在严格控制的环境下进行，这限制了实验室的普及使用；其次，ESCs基因组不稳定性是生殖系传递失败的原因之一，与培养ESCs细胞中所看到的基因组不稳定性相比，因此，本申请采用CRISPR-Cas9技术进行打靶。

实施例1：pmRosa26-CAG-hSCARB2打靶载体构建

主要试剂：KOD OneTM PCR Master Mix -Blue（日本东洋纺株式会社）；2×Es TaqMasterMix（Dye）（北京康为世纪）；DNA Ligation Kit Ver.2.1（takara）；MinElute PCRPurification Kit (50)（QIAGEN）；EndoFree Plasmid Maxi Kit（QIAGEN）；pEASY®-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit（北京康为世纪）；限制性内切酶SpeI(R3133V)和HindIII(R3104V)（美国NEB）。

主要实验仪器：PCR仪（美国BIO RAD）；干式恒温器（杭州米欧仪器有限公司）；电泳仪（美国BIO RAD），恒温振荡器（美国BIO RAD）。

本实验中打靶载体包含5个元件，如图1所示。我们是以质粒pCAG-GFP-N1为基础骨架进行构建的，首先把Rosa26位点的左同源臂LHA连接到质粒pCAG-GFP-N1上，成功构建出质粒pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA。然后使用高保真酶PCR扩增Rosa26-RHA和hSCARB2片段以及wpre-polyA片段，回收备用；使用Hind3酶切pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA并回收大片段作为连接载体备用，然后使用Gibson Assembly一步法将三个片段成功构建到载体上，即获得pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector质粒。

1、中间载体pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA的构建

载体pCAG-GFP-N1（北京维通达生物技术公司构建），使用限制性内切酶Spe1酶切，回收5.5 kb的片段备用。待连接片段Rosa26-LHA的获得则使用KOD OneTM PCR Master Mix-Blue-进行PCR扩增，扩增引物为rosa-LHA-spe1F和rosa-LHA-spe1R（北京德奥平生物公司合成），引物序列见表1。扩增模板为质粒mROSA FOXO1-7MU targeted allele（维通达生物技术公司构建）。然后将载体pCAG-GFP-N1（Spe1）和片段Rosa26-LHA使用DNA Ligation KitVer.2.1试剂盒进行连接，转化后挑选单克隆使用引物Rosa-LHA-jcF2和rosa-LHA-jcR2进行PCR鉴定，阳性条带大小为864 bp，鉴定凝胶电泳图见图2。选择4#菌液送测序，测序结果经比对后发现完全正确，成功获得中间载体pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA，测序结果见图3。

2、打靶载体pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector的构建

中间载体pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA使用限制性内切酶Hind3酶切，回收6 kb片段作为连接载体备用。片段hSCARB2使用引物hscarb2-GF hscarb2和hSCARB2-R hSCARB2进行扩增，片段wpre-polyA使用引物wpre-F hSCARB2和bGHpolyA-R hscarb2进行扩增，片段Rosa26 RHA使用引物mRosa26-RHA-F hscarb2 和mRosa26-RHA-GR hscarb2进行扩增，引物序列见表1，最后使用pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit将pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA（Hind3）(6kb)、片段hSCARB2 (1.4kb)、片段wpre-polyA(860bp)，片段Rosa26 RHA(1.8kb)一步法连接，成功构建pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector。载体质粒图谱见图4。打靶载体pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector菌液鉴定凝胶电泳图见图5。使用3对引物进行菌落鉴定，分别为wpre-F hSCARB2+bGH polyA-R hscarb2，产物大小为860bp；H11-hPSGP-jcf2+hSCARB2-R hSCARB2 产物大小1512bp；H11-RHA-jcR1+mRosa26-RHA-F hscarb2，产物大小2449bp。引物序列见表1：rosa-LHA-spe1F的序列为：SEQID NO.1；rosa-LHA-spe1R的序列为：SEQ ID NO.2；Rosa-LHA-jcF2的序列为：SEQ ID NO.3；rosa-LHA-jcR2的序列为：SEQ ID NO.4；bGHpolyA-R hscarb2的序列为：SEQ ID NO.5；wpre-F hSCARB2的序列为：SEQ ID NO.6；hscarb2-GF hscarb2的序列为：SEQ ID NO.7；hSCARB2-R hSCARB2的序列为：SEQ ID NO.8；mRosa26-RHA-F hscarb2的序列为：SEQ IDNO.9；mRosa26-RHA-GR hscarb2的序列为：SEQ ID NO.10；H11-hPSGP-jcf2的序列为：SEQID NO.11；H11-RHA-jcR1的序列为：SEQ ID NO.12。

根据菌落鉴定结果，把12#送测序，经比对发现序列完全正确，测序比对序列见图6，因此将12#菌液使用EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)进行大提后-80℃保存为显微注射备用。

表1 引物序列

实施例2：KI小鼠构建

主要试剂：M2 Embryo Media（货号：MR-015，美国Sigma）；三气培养箱（美国FORMA）；解剖显微镜和倒置显微镜（日本NIKON公司）；显微操作系统（德国EPPENDORF公司）；培养皿、巴斯德吸管（美国FALCON公司）；移液管（德国EPPENDORF公司）；注射用尿促性腺素(PMSG)和注射用绒促性素(HCG)购自宁波三生制药；矿物油（美国Sigma）。

1、受体母鼠的准备

选择6-8周龄、体重22-28g的ICR小鼠作为受体鼠，移植前一天晚上与切除输精管的ICR小鼠交配，次日挑选见精栓母鼠作为受体移植。

2、小鼠促排卵

选择4-8周龄c57bl/6J雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，约在48-54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内，之后与性成熟的8-12周龄雄性c57bl/6J小鼠合笼。

3、受精卵的采集

合笼次日挑选见精栓的小鼠收集受精卵。用透明质酸酶消化卵丘复合物，再用M2培养液漂洗干净后，将受精卵置于M2培养液中，上层覆盖矿物油（Sigma，货号：M8410-1L），放于37℃、5% CO₂孵箱培养。

4、显微注射

受精卵在孵育过程中注意观察原核的形成，一般受精卵培养2-4小时后，有明显的原核出现，此时将Cas9 mRNA（终浓度25ng /μl）、靶向人类清道夫受体B类成员2（hSCARB2）的sgRNA（终浓度12.5 ng /μl）和实施例1中获得pmRosa26-CAG-hSCARB2 TargetingVector质粒（10 ng /μl）共同注射入受精卵原核中，注射完之后的受精卵移入另一个新鲜的M2培养液中培养2-3小时。

5、输卵管移植

5.1 移植用口径为150-160μm玻璃毛细管，长度约为7-10cm，先吸取约0.05cm长的M2液，然后再吸0.05cm的空气段，再吸约0.05cm长的M2液，再吸0.05cm的空气柱，完成2个液柱和2个气柱后，最后吸取受精卵15个，再吸0.05cm的空气柱，最后一段为0.05cm长的M2液，即整个移植液体柱顺序为：M2液柱-空气柱-M2液体柱-空气柱-胚胎液柱-空气柱-M2液体柱；

5.2 将假孕雌鼠用1.25%阿佛丁，按0.2 mL/10g剂量肌肉注射麻醉后置于37℃恒温垫上，用碘酒棉擦拭小鼠背部，再用70%酒精擦拭，在离中线左侧约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作竖行小切口（0.3-0.5cm）。用眼科镊钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢及输卵管。用小弹簧夹固定住脂肪垫。移动恒温垫使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管膨壶部清晰可见。用眼科小剪刀于漏斗部透明囊膜处剪开一小口约0.02cm，将上面准备好的移植管轻轻从此口插入到输卵管中约0.1-0.2cm深度，轻轻将受精卵吹进入漏斗部，见到漏斗部有3个气泡即可缓慢收回移植管，之后取掉弹簧夹用钝口镊子把脂肪垫和输卵管恢复原位，缝合创口，缝合完毕后创面涂抹红霉素眼膏；同样的步骤移植小鼠右侧输卵管。

移植完毕小鼠在恒温垫上苏醒后转移至原来的笼子饲养。

5.3小鼠基因型鉴定

将实施例2中得到的小鼠出生后7天可以取小鼠尾尖提取DNA，通过PCR进行基因型鉴定，结果显示，在35只新生小鼠中，成功获得14只带有hSCARB2基因的首建KI小鼠（F0），选取其中F0-1号雄性首建KI小鼠与WT小鼠交配，获得F1代小鼠16只，通过PCR进行基因型鉴定，表明有7只阳性（图7），同时把PCR产物送测序公司测序，其结果表明目的条带序列与hSCARB2完全一致（图8）。出生后10天安乐处死，通过Western blot鉴定显示，hSCARB2蛋白在F1代小鼠的大多组织，包括脑（Brain）、心(Heart)、肝(Liver)、脾(Spleen)、胃(Stomach)、小肠(Intestine)中均有表达（图9）。由此表明hSCARB2 -KI小鼠构建成功。

实施例3：柯萨奇病毒A16型（CVA-16）感染模型的建立

1、将日龄为10d、21d、30d的KI小鼠和野生型小鼠（WT小鼠）经颅内注射（i.c.）1*10⁷PFU/ml的CVA-16。

2、本申请利用RT-qPCR检测了CVA-16感染后5天（5dpi）、7天（7dpi）、10天（10dpi）的小鼠心（Heart）、肝（Liver）、肺（Lung）、脑（Brain）及后肢（Lung）中的病毒载量。其结果显示：10日龄的KI小鼠在病毒感染后5天及7天，脑、心、肝、肺及后肢组织中均观察到了病毒的复制，随着感染的继续，在感染后第7天病毒载量达到了峰值，并在心、肝以及肺组织中观察了病毒的高复制情况(图10A)，在感染后第10天，小鼠出现了后肢麻痹及瘫痪的症状；21日龄的小鼠在病毒感染后第5天及第7天，在心、肝、肺、脑以及后肢组织中观察到了高病毒载量(图10B)；30日龄的小鼠在病毒感染后第5天及第7天，在脑及后肢组织中观察到了病毒的高水平复制(图10C)。不同日龄的KI小鼠在感染病毒后的共同特点是，在第7天，脑及后肢均检测到了较高的病毒载量，与WT感染小鼠相比，差异极显著（p<0.01）(图10A、B、C)，表明CVA-16病毒在各组织中的分布与hSCARB-KI小鼠体内成功感染和复制，且感染日龄可以延长到30日。

3、通过组织病理检测，HE染色结果显示：

3.1 KI小鼠脑组织可见中等面积水肿，神经元排列稀疏；多量神经元细胞坏死，核碎裂，神经元细胞排列紊乱，伴多量小胶质细胞浸润；多量神经元固缩、深染，胞核胞质分界不清，嗜碱性增强（图11，KI）；WT小鼠脑组织可见各区神经元细胞形态规则，排列整齐密集，胞核大而圆，染色质少，核仁明显，未见明显异常（图11，WT）。

3.2 KI小鼠后肢肌肉组织可见弥漫性肌细胞坏死，核碎裂，肌纤维排列紊乱，伴大量淋巴细胞浸润（图11，KI）；WT小鼠后肢肌肉组织可见横切面与纵切面相间分布的肌细胞，纵切面中的肌细胞是细长呈圆柱状的细胞，肌质内含有许多沿细胞长轴平行排列的肌原纤维，细胞核位于细胞周边近肌膜处，呈椭圆形；横切面显示数个边界清楚的肌纤维束，肌束内的肌纤维排列紧密,多数呈角状外观，可见典型的明暗相间排列的横纹，未见明显异常（图11，WT）。

因此，通过颅内注射CVA-16病毒实验表明，我们构建的基因编辑小鼠能成功感染CVA-16，重要的是10日龄小鼠感染后出现了后肢麻痹及死亡的严重现象，并且病毒感染日龄可以延续到30日。

本申请的方案以质粒pCAG-GFP-N1为基础骨架，首先把Rosa26位点的左同源臂LHA连接到质粒pCAG-GFP-N1上，成功构建出质粒pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA。然后使用高保真酶PCR扩增Rosa26-RHA和hSCARB2片段以及wpre-polyA片段，回收备用；使用Hind3酶切pCAG-GFP-N1-Rosa26 LHA并回收大片段作为连接载体备用，然后使用Gibson Assembly一步法将三个片段成功构建到载体上，即获得所需质粒pmRosa26-CAG-hSCARB2 Targeting Vector(图1)。为了验证小鼠的基因型，通过PCR分析从小鼠尾部提取的基因组。结果显示，在35只F0代鼠中，使用CRISPR/Cas9编辑技术成功获得14只带有hSCARB2基因的KI小鼠（F0），选取F0代中的1号（F0-1）号雄性首建KI小鼠与WT小鼠交配，获得的16只F1代小鼠通过PCR鉴定后有7只杂合阳性小鼠，见图7(标记为1.1，1.2，2.1，3.1，3.2，5.1，5.2的为杂合阳性鼠)。同时进行测序验证和WB鉴定均为阳性(图8、9)，因此将该小鼠命名为B6-Gt(Rosa)26Sor ^em1(CAG ^-hSCARB2)敲入鼠（简称为hSCARB2-KI鼠）。并且此hSCARB2-KI鼠能成功感染CVA-16病毒，这个模型首次出现了后肢麻痹及死亡等严重现象，可用于开展CVA-16对神经系统（CNS）的影响方面的研究；也可用于CVA-16致病机制的研究和CVA-16疫苗的评价。

以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其他普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims

1.一种感染柯萨奇病毒A16型小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

4）待受精卵有明显的原核出现时，用TE缓冲液稀释，将Cas9 mRNA、靶向hSCARB2的sgRNA和所述3）中获得的目的片段的donor序列共同注射入受精卵的原核中；将注射完之后的受精卵移入另一个新鲜的M2培养液中进行培养；

5）体外培养后移植入假孕ICR母鼠的输卵管，饲养待产；20-21天后获得F0代鼠，将F0代阳性鼠与野生型鼠交配获得FI代阳性鼠，即获得hSCARB2 -KI小鼠；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述4）中靶向hSCARB2的sgRNA的终浓度为12.5ng/μl；所述Cas9 mRNA的终浓度为25ng/μl；所述目的片段的donor序列终浓度为10ng/μl。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述5）中的体外培养的时间为2-3小时。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：7）通过PCR、WB对所述6）中构建的感染柯萨奇病毒A16型小鼠模型进行基因型鉴定，通过RT-qPCR和HE染色方法检测病毒载量和病理组织学变化，结果表明感染柯萨奇病毒A16型的小鼠构建成功。