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WO1997008327A1 - Gene de l'acetolactate synthase resistant aux herbicides - Google Patents

Gene de l'acetolactate synthase resistant aux herbicides Download PDF

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WO1997008327A1
WO1997008327A1 PCT/JP1996/002448 JP9602448W WO9708327A1 WO 1997008327 A1 WO1997008327 A1 WO 1997008327A1 JP 9602448 W JP9602448 W JP 9602448W WO 9708327 A1 WO9708327 A1 WO 9708327A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid fragment
herbicide
amino acid
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1996/002448
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takaomi Fushimi
Kunimitsu Nakahira
Michito Tagawa
Tsutomu Nawamaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissan Chemical Corp
Original Assignee
Nissan Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissan Chemical Corp filed Critical Nissan Chemical Corp
Publication of WO1997008327A1 publication Critical patent/WO1997008327A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a mutated nucleic acid fragment exhibiting resistance to a herbicide such as sulfonylprea that inhibits plant acetolactate synthase, by introducing the above-mentioned gene into a herbicide-sensitive plant.
  • the present invention relates to a nucleic acid fragment intended to impart resistance to a herbicide and to be used as a selection marker when introducing a gene into a plant.
  • weed control mainly involves chemical agents, but selective herbicides that do not cause harm to target crops are used for such chemical agents.
  • selective herbicides that do not cause harm to target crops are used for such chemical agents.
  • a large number of herbicide-resistant genes that exhibit resistance to non-selective herbicides have been isolated by genetic engineering techniques. The plants shown can be produced.
  • a promoter and an enhancer are used upstream of the gene of interest, and a recombinant DNA with a transcription termination signal added downstream is generally used.
  • a method using a patterm is used, but a particle gun method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, and the like are also used.
  • a gene showing resistance to phosphinothricin, a non-selective herbicide is introduced into a plant such as tobacco using agrobacterium, and expressed in plant cells.
  • phosphinothricin a non-selective herbicide
  • a full-length gene has been isolated from a puffer tree as one of the resistance genes to sulfonylurea herbicides, and by analyzing its structure, mutations in amino acids involved in resistance have been elucidated. If a gene can be introduced into a plant, the resistance to herbicides can be easily imparted to the plant, and it should be used as a selection tool when introducing the gene into the plant. Becomes possible.
  • the present inventors focused on the above-mentioned report that pufferfish is resistant to a sulfonylurea herbicide, and used the known gene sequence of the main A region of the acetolacto-synthetase gene to develop resistance to the herbicide.
  • the full-length gene was isolated from the cDNA of Butterfly, which showed the following expression.
  • the new amino acid mutation can be made resistant to The present invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid fragment encoding plant acetolactate synthase, wherein the amino acid sequence translated from the nucleotide sequence of the nucleic acid fragment includes ⁇ in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. , ⁇ , 7, 5 comprising at least one nucleotide fragment encoding one amino acid of the substantially conserved amino acid sequence, wherein said nucleotide fragment is
  • a has a sequence encoding an amino acid other than aspartic acid and glutamic acid;
  • b) ⁇ has a sequence encoding an amino acid other than valine
  • c) has a sequence encoding an amino acid other than tryptophan
  • d) ⁇ has a sequence encoding an amino acid other than asparagine
  • nucleic acid fragment satisfies at least one condition of The above ⁇ is alanine, arginine, asparagine, cystine, gel Cow
  • glycine histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine are preferable, and glycine is preferable.
  • the above include: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threbonin And tyrosine, and preferably glumic acid.
  • the above 7 includes: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine. , Tyrosine and balin, and preferably arginine.
  • the above S includes alanine, arginine, aspartic acid, cisdin, dalsiminic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tributanphan , Tyrosine and palin, and preferably serine.
  • glycine is glutamic acid
  • y is arginine
  • ⁇ is serine
  • the present invention also relates to a protein translated from the nucleic acid fragment, which is characterized by having resistance to a sulfonylurea herbicide.
  • the present invention relates to a method for imparting resistance to a sulfonylurea herbicide to a plant by expressing all or part of the gene in a plant sensitive to the sulfonylurea herbicide. Related.
  • a method for selecting a plant cell transformed with the nucleic acid fragment comprising transgene-introducing all or a part of the nucleic acid fragment into a plant cell sensitive to a sulfonylprea herbicide, And selecting transformed cells with a selective concentration of the herbicide that inhibits the growth of untransformed cells.
  • the nucleic acid fragment encoding acetacetate synthase conferring herbicide resistance is a nucleic acid fragment bound to the second nucleic acid fragment conferring the second property, and is used for transforming a plant.
  • the present invention also relates to the binding nucleic acid fragment, wherein the expression of herbicide resistance by the plant is used to detect the presence of the second nucleic acid fragment when a sulfonylprea herbicide is applied. .
  • Figure 1 shows the deduced amino acid sequence of the sulfonylurea herbicide-resistant asteracetate synthase shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, which was previously reported from an acetate from a sulfonylurea-sensitive plant. The result compared with the amino acid sequence of lactate synthase is shown.
  • A shows the amino acid sequence of a sulfonylurea herbicide-resistant peas perilla.
  • a and A indicate the amino acid sequences of the radish
  • B the tobacco
  • C the Arabidopsis
  • D rapeseed
  • E the corn.
  • An asterisk (*) is shown below the conserved part in each amino acid sequence. Amino acids are indicated by the following one-letter codes.
  • FIG. 2 shows a continuation of FIG.
  • FIG. 3 shows a continuation of FIG.
  • FIG. 4 shows a continuation of FIG.
  • 5 to 7 are schemes showing a method for constructing an expression vector in the present invention. Detailed description of the invention
  • the DNA sequence encoding the acetate reductase synthase exhibiting sulfonylprea herbicide resistance of the present invention specifically includes a single open reading frame as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It consists of going out.
  • the open reading frame has a translation start at the 5 'end from ATG having a base sequence of 54 to 56, an untranslated region of 53 bases upstream of the ATG, and a TGA having a base sequence of 2052 to 2054 at the 3' end.
  • the sequence is completed, and the sequences AA AT AA and TA AT AA, which are presumed to be poly (A) -added signals, are present downstream of the sequence.
  • the nucleotide sequence of this cDNA includes the nucleotide sequence of the domain A region that has already been reported.
  • FIGS. 1 to 4 show the results of comparison of the already isolated acetotractate synthase gene of tobacco, Arabidopsis, rapeseed, corn and the like with the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the gene of the present invention. Because of high homology with these, it can be said that the gene of the present invention contains the entire nucleotide sequence encoding acetotractate synthase.
  • the amino acid sequence deduced from this nucleotide sequence is simultaneously described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the protein represented by the deduced amino acid sequence consists of 666 amino acid residues.
  • valine is present in the sensitive strain, while dalminic acid is present in the resistant strain.
  • Figures 1 to 4 show a comparison with the amino acids of herbicide-sensitive acetolactocinase, which has been identified in other plants.
  • Aspartic acid or daltamic acid is present at position ⁇ , and glycine is present in the resistant strain.
  • amino acid substitutions in the four amino acid-inserted regions are only in pests, where susceptible strains have palin and resistant strains have glutamic acid.
  • Glutamin is conserved at position ⁇ 5, but serine is present in resistant strains.
  • proline corresponding to amino acid SEQ ID NO: 189 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was replaced with serine. (1992), vol. 100, 662—668), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • An example in which proline equivalent to 649 was substituted with asparagine to acquire resistance Jiro Hattori a 1. Mo 1. G En. Genet. (1992), vol. 232.
  • the amino acid to be substituted is not limited to one type of amino acid, but also to various amino acids other than the conserved amino acids. It has been shown to exhibit resistance (JP-A-63-71184, European Patent Publication No. 257993).
  • nagas are amino acids other than aspartic acid and glutamic acid, and preferably acquire resistance by being substituted with glycine.
  • Is an amino acid other than valine, and preferably obtains resistance by being replaced with glutamic acid.
  • a is an amino acid other than tributophan, and preferably acquires resistance by being substituted with arginine.
  • ⁇ 5 is an amino acid other than asparagine, and preferably obtains resistance by being replaced with serine.
  • the acetratractate synthase protein in which the amino acid of / 3, rS has been substituted with at least one other amino acid has resistance to a sulfonylprea herbicide.
  • the DNA sequence of the present invention can be identified based on the primary sequence of amino acid of acetotractate synthase and its functional characteristics. Furthermore, SEQ ID NO: in the sequence listing showing resistance to sulfonylrea herbicides A nucleic acid fragment encoding an acetate synthase consisting of 2300 bases represented by 1 can be provided.
  • the gene for acetolactate synthase resistant to a sulfonylprea herbicide of the present invention is prepared, for example, from mRNA of syrup which is resistant to a sulfonylprea herbicide, and then synthesizes cDNA. From the identified partial base sequence, the desired full-length gene can be isolated by PCR (Polymerase chain reaction) amplification or by screening a cDNA library. ?
  • PCR amplification of the acetate synthase gene involves extracting mRNA from plant tissues resistant to sulfonylrea, synthesizing cDNA using reverse transcriptase, and converting it into a double strand by the polymerase reaction.
  • the cDNA is linked to a synthetic DNA that functions as a primer used in the PCR method at both ends as an adapter.
  • the cDNA is type II, and the nucleotide sequence in the domain A region that has already been identified (for example, the sequence in the sequence listing).
  • PCR should be performed using, as a primer, a synthetic DNA containing the base sequence downstream of the domain A region (for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 3) and the base sequence of the adapter. Can be amplified. Furthermore, the full-length gene can be isolated by cleaving the both with the restriction enzyme EcoRI between base sequence numbers 974 and 975 represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and ligating them.
  • a probe For screening of the cDNA library of the acetate reductase gene, for example, a probe may be prepared and, for example, plaque hybridization may be performed.
  • probes used for screening oligo DNA synthesized based on a partial sequence of the domain A region that has already been clarified, and the domain A region amplified by the PCR method and the DN of the target region A fragment can be used.
  • cDNA is synthesized using reverse transcriptase, and double-stranded by polymerase reaction.
  • a cDNA library can be prepared by cloning into one or plasmid vectors and transforming into E. coli or the like.
  • Various cDNA synthesis kits are commercially available and may be used.
  • a large number of vectors are commercially available for use in the production of libraries, and these can be used.
  • a primer was synthesized from the previously reported partial nucleotide sequence of domain A, and a plaque hybridization was carried out using a partial DNA fragment obtained by PCR amplification of a crude extract of the DNA of Bentaria as a probe.
  • a cDNA library is screened using a method such as a selection method, a clone containing DNA having complementarity with the probe is selected, DNA is prepared from the clone, and the clone is analyzed in detail to obtain an acetate synthase.
  • a cDNA clone containing the full-length gene can be obtained.
  • nucleotide sequence can be determined by the dideoxy method or the like, and a commercially available kit or a fluorescent sequencer can also be used.
  • a commercially available kit or a fluorescent sequencer can also be used.
  • the gene encoding the sulfonylurea-resistant acetolactate synthase of the present invention includes the full length, it is linked to, for example, the 35S promoter derived from the reflex mosaic virus or the ubiquitin gene promoter derived from maize.
  • a vector constructed so that the present gene is expressed in a plant it is possible to construct an expression system in the plant.
  • Figures 5 to 7 show an example of a method for constructing an expression vector.
  • Transformation of a plant susceptible to a sulfonylprea herbicide by using all or a part of the acetolactate synthase gene of the present invention including a protein translation region enables the resistance to a sulfonylprea herbicide. Can be provided.
  • all or a part of the acetate reductase synthase gene nucleic acid fragment of the present invention is sensitive to the sulfonylprea herbicide.
  • the resulting transformed cells are resistant to herbicides. Therefore, treatment with a selective concentration of a herbicide that suppresses the growth of untransformed cells is performed.
  • transformed cells can be selected from non-transformed cells.
  • a transformed plant cell susceptible to the drug shows resistance and allows the growth of untransformed cells to grow.
  • Transformed cells can be selected at a suppressed selective concentration, and they are used as a gene for selecting plant cells into which a target gene has been introduced.
  • the selection gene This is generally called the selection gene, but the sulfonylprea herbicide resistance gene can also be used as a selection marker when introducing the gene into plants (Zh ijian Liet. A 1. Plant Ph ysio 1. (1992), vol. 100, 662-668).
  • nucleic acid fragment obtained by combining the above-described nucleic acid fragment encoding an acettractate synthase that imparts herbicide resistance with a second nucleic acid fragment that imparts a second property, wherein the nucleic acid fragment transforms a plant.
  • the expression of herbicide resistance by the plant can be used as a marker for detecting the presence of the second nucleic acid fragment.
  • Tris-HCl (pH 7.5) was dissolved in 4 ml of an RNA solution of 1 mM EDTA, added to an oligo (dT) cellulose span column (Pharmacia), and adsorbed by shaking for 10 minutes. Wash 3 times with 3 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl solution, 3 ml l OmM Tris-HC1 (pH 7.5) , LmM EDTA, ' / 3
  • c DNA synthesis was performed by reverse transcription using a Firrst-Strandc DNA Synthesis Kit (Pharmacia) and a Not I-d (T) 18 primer to obtain a 1 st strand c DN A was synthesized.
  • the I st strand c DNA solution was prepared using the Not I — d (T) 18 primer and the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (the sequence shown in base sequence numbers 553 to 582 shown in SEQ ID NO: 1) (5 'TCGTGC C CGGGTTTG Using a PA4 primer of CTGATGCTTTG CTCG 3 '), PCR amplification was performed with Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo) to amplify a fragment of about 1750 base. The obtained amplification fragment was digested with restriction enzymes SmaI and N0tI, and then subcloned into pBluescript SK (I) plasmid vector. A clone having the target insert of about 1750 base was screened to obtain a clone having a region 3 ′ downstream from nucleotide sequence number 561 shown in SEQ ID NO: 1.
  • a clone having a target insert of about 1000 bases was screened to obtain a clone having a region 5 'upstream from nucleotide sequence No. 979 shown in SEQ ID No. 1.
  • the cloned cDNA clone was used to obtain clones containing DNA fragments of various sizes by using KiLe-Sequence Deletion Kit (manufactured by Takara Shuzo).
  • the obtained clone was sequenced using Sequencing High-Cycle-Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using the M13 Forward HT primer and T3 HT primer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the base was obtained. The arrangement was determined.
  • the obtained base sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • FIGS. 1 to 4 show comparisons with known acetolactate synthases isolated from various plants, and the homology was recognized.
  • mRNA was extracted in the same manner as in Example 1, and 1st strand cDNA was synthesized.
  • a fragment of about 350 bp was amplified by PCR amplification with ⁇ th DNA polymerase.
  • the obtained amplification fragment was digested with restriction enzymes BamHI and XhoI, and then subcloned into pB1uescript SK (-) Plasmid.
  • a clone having the desired insert of about 350 bp was screened to obtain a clone having the 5 ′ terminal region of the tobacco ALS gene having the sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • a clone having a region from 553 to 3 ′ downstream of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the susceptible acetate reductase gene A fragment obtained by digestion with Not I and restriction enzymes Mun I and N of a clone having a region 5 'upstream from 984 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the acetate reductase gene
  • a full-length acetolactosynthase gene of a susceptible clover was constructed (Fig. 5). ).
  • a fragment obtained by digestion with the restriction enzymes EcoRI and NotI of a clone obtained by point-mutating the amino acid 570 of the amino acid SEQ ID NO: 1 shown in SEQ ID NO: 1 of the acetate reductase gene, and acetractate synthase The fragment obtained by digesting with a restriction enzyme EcoRI and NotI of a clone having a region 5 'upstream of 984 of the nucleotide sequence number shown in SEQ ID NO: 1 of p-Bluescript SK (-) plasmid
  • a full-length acetotractate synthase gene of the Japanese cypress having only four new mutations ( ⁇ , 7, and ⁇ ) was constructed.
  • Fragment obtained by digesting a clone having a region from 553 to 3 'downstream of the nucleotide sequence number shown in SEQ ID NO: 1 of the resistant acetactate synthase gene with restriction enzymes Ec ⁇ 22I and SacI The restriction enzymes EcoT22I and Sac of the clone containing the full-length acetate reductase synthase gene obtained by point mutation of 570 amino acids of the amino acid SEQ ID NO: 1 shown in SEQ ID NO: 1 of the acetate reductase gene.
  • the gene was inserted into a site cleaved with I to construct a full-length acetolactate synthase gene of resistant broomwood (Fig. 6).
  • the obtained clone was digested with restriction enzymes BamH I and SacI, and the fragment containing the full-length acetotractate synthase gene was transferred to a binary vector — PBI121 restriction enzymes BamHI and SacI. Inserted.
  • fragments obtained by digesting the clone having the 5 'terminal region of the tobacco ALS gene with the restriction enzymes BamHI and XhoI were used to express the above three types of full-length acetolactocin synthase genes in plants. Insertion into a site cleaved by the restriction enzymes BamHI and h011 allows the expression of three kinds of Asteracetate synthase genes in three pearl oysters having a region considered to be a tobacco chloroplast transport signal.
  • Agrobacterium LBA 4404 strain cells cultured in a ⁇ ⁇ medium were resuspended in a 2 OmM calcium chloride solution and used as a competent cell frozen and stored at -80 ° C.
  • Agrobacterium competent cell 100 jtz 1 was dissolved at room temperature, about 1 ⁇ g of the constructed expression vector was added, the mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes, and lml of LB medium was added. Later it was kept at 28 for 2 hours. The cells were collected as a pellet by centrifugation, resuspended in 100 ⁇ 1 LB medium, and used as an antibiotic (25 # g / ml kanamycin, 300 g / ml streptomycin).
  • An agrobacterium strain having an expression vector was transformed into an LB medium containing antibiotics (25 g / m1 kanamycin, 300 gZm1 streptomycin, 100 gm1 rifampicin) on an LB medium containing 28, Cultured for 24 hours. 5 mm square leaf sections of tobacco grown under aseptic conditions were immersed in the culture medium. After 5 minutes, the leaf sections were placed on sterile paper, excess medium was removed, and placed on MS-NB agar, 25. C, cultured under 3000 lux light. Three days later, leaf sections were transferred onto MS-NB agar medium containing 500 ⁇ g / ml claforan.
  • leaf sections were transferred to MS-NB agar medium supplemented with 100 # g / m 1 kanamycin and 500 / 3 ⁇ 4 gZml claforan, and transformants were selected.
  • the differentiated foliage of kanamycin resistance was transplanted to an MS medium containing 100 gZm1 of kanamycin.
  • the rooted plants were transplanted into pits and cultivated.
  • the transformant obtained from pBI-SH was designated as SH strain, the one derived from pBI-RH was designated as RH strain, and the one derived from pBI-RMH was designated as RMH strain.
  • Leaf slices (approximately 0.2 g) cut at intervals were mixed with 2 ml phosphate buffer (pH 6.0 10 mM potassium phosphate buffer, 0.0125% Triton X—100 50 ppm HOE—704, (In the presence or absence of chlorsulfuron) for 12 hours 24 hours under bright light conditions, and then ground with a Polytron homogenizer. This was centrifuged at 12,000 g for 10 minutes, the supernatant was removed, 0.1 ⁇ l of 6 ⁇ sulfuric acid was added, and the mixture was incubated at 60 ° C for 15 minutes.c Further, 5% of 1-naphthol was added.
  • 2 ml phosphate buffer pH 6.0 10 mM potassium phosphate buffer, 0.0125% Triton X—100 50 ppm HOE—704, (In the presence or absence of chlorsulfuron) for 12 hours 24 hours under bright light conditions, and then ground with a Polytron homogenizer. This was centrifuged at 1
  • Hoe 704 is a potent inhibitor of the enzyme ace t o 1 ac t a t e reduct i soierase.
  • R H 22 shares 100% 51% 34%
  • Acetractrates resistant to sulfonylprea herbicides according to the invention
  • a DNA sequence encoding a tosynthase is provided. This makes it possible to transform a plant, to impart resistance to a sulfonylurea herbicide to a plant, and to use it as a selection marker when introducing another gene. It becomes possible.
  • Sequence type nucleic acid
  • CTCCACACTC CTCTCTTTCA TTTTCTCTCT GATCATACCT TCAACCTTCA ACA ATG 56
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid ⁇ Number of chains: double strand
  • Organism name tobacco (Ni cot i ana tabacum;

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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Description

明 細 書
除草剤抵抗性ァセトラクテ一トシンタ一ゼ遺伝子
発明の属する技術分野
本発明は、 植物のァセトラクテートシンタ一ゼを阻害するスルホニルゥレアな どの除草剤に対する抵抗性を示す変異した核酸断片に関し、 除草剤感受性の植物 に上記抵抗性遣伝子を導入することにより除草剤に対し抵抗性を付与すること、 および植物に遺伝子導入する際の選抜マーカ一として利用することを目的とした 核酸断片に関する。
従来の技術
作物の栽培において、 雑草防除は化学薬剤を中心とする防除が行われているが、 このような化学薬剤は対象作物に薬害が現れないような選択性除草剤が用いられ ている。 しかし最近では遺伝子操作技術により、 非選択性除草剤等に抵抗性を示 すような除草剤抵抗性遺伝子が数多く単離されており、 実際に植物に遺伝子導入 することにより除草剤に抵抗性を示す植物が作製することが可能である。
植物で遺伝子を発現する際には目的遺伝子の上流にプロモーター、 ェンハンサ 一、 さらに下流には転写終結シグナルを付加した組換え体 D N Aが用いられ、 植 物に遣伝子導入する方法は一般にァグロパクテリゥムを用いる方法が使用される が、 パーティ クルガン法、 エレク トロポーレーショ ン法、 ポリエチレングリコ一 ル法なども用いられる。
例えば非選択性除草剤であるフォスフィ ノスリ シンに抵抗性を示す遺伝子 をタバコなどの植物にァグロバクテリゥムを用いる方法で遺伝子導入し、 植 物細胞中で発現させることにより、 除草剤に対する抵抗性を付与している （W. W o h 1 1 e b e n e t . a 1 . G e n e 1 9 8 8 v o l . 7 0 , 2 5 - 3 7 ) o
一方、 スルホニルゥレア除草剤に対して抵抗性を有する植物のァセトラクテー トシンクーゼの遣伝子に関しては、 タバコ、 酵母、 シロイヌナズナ、 テンサイ、 トウモロコシなど人工的な変異により抵抗性になった個体からその遣^子配列が 明らかにされ、 ァセトラクテートシンターゼ遺伝子中の 10箇所の変異が抵抗性 に関与することが解明されている （特開昭 63— 71184、 欧州特許公開公報 第 257993号） 。
また、 ホウキギのスルホニルゥレア除草剤抵抗性に関しては、 自然条件下 で抵抗性を獲得してきていること （K. S i v a k uma r a n e t. a 1. We e d S c i e n c e 1993. v o l . 41, 159— 165) 、 また、 ァセ トラクテートシンタ一ゼ遺伝子の一部である ドメイン A領域のみの塩基 配列が明らかにされており、 ドメイン A領域中のプロリンが他のァミノ酸に置 換することにより変異を獲得していることなどが明らかにされている （M. J. Gu t t i e r i e t. a 1. We e d S c i e n c e 1992 v o l . 40， 67 0 - 674, M. J. Gu t t i e r i e t. a 1. We e d S c i e n c e 1995 v o l . 43, 175— 178) 。 しかし、 ドメイ ン A以外の領域においてはその遣 子配列も解明されておらず、 スルホニルゥレ ァ除草剤に対する抵抗性に関与する変異についても全く明らかにされていない。 このようにスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性ァセトラクテートシンタ一 ゼ遺伝子に関する研究は、 タバコ、 酵母、 シロイヌナズナ、 テンサイ、 トウモロ コシなどで全長遺伝子が解明され、 除草剤に対する抵抗性とアミノ酸変異との関 係の解明が行われてきた。
しかし、 ホウキギのスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性に関する研究につ いては、 ァセトラクテ一トシンターゼ遺伝子の変異が抵抗性機構に関与すると考 えられているが、 ドメィン A領域の一部の遺伝子領域ではその変異について報告 されているものの、 それ以外の領域での変異がスルホニルゥレア除草剤の抵抗性 に関与することを明らかにした報告はない。
したがって、 ホウキギのァセトラクテ一トシンタ一ゼの遺伝子は、 その全長の 遣伝子を単離し、 単離遺伝子の構造及びタンパク質の一次構造を明らかにし、 ァ ミノ酸の変異と除草剤に対する抵抗性を解明するとともに、 植物体で発現させ、 その抵抗性を詳細に検討することは必要であろう。 本発明においてスルホニルゥ レア除草剤に対する抵抗性遺伝子の一つとしてホウキギから全長遺伝子を単離し、 その構造解析により、 抵抗性に関与するアミノ酸の変異を解明するとともに、 抵 抗性遺伝子を植物へ遣伝子導入することができれば、 除草剤に対する抵抗性を植 物に容易に付与することが可能となり、 さらに植物に遺伝子導入する際の選抜マ 一力一として利用することが可能となる。
すなわち、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性ァセトラクテートシン夕一 ゼ遺伝子を植物に導入していくためにはその全長遺伝子を単離することが不可欠 である。 従って本発明の目的はスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を示す新 規の変異を有するァセトラクテ一トシンタ一ゼをコ一ドする D N A配列を提供し、 さらにその配列を含み、 かつ適当な植物発現べクタ一に組み込むことのできる全 長ァセトラクテートシンターゼ遺伝子を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは上述したホゥキギがスルホニルゥレア除草剤に抵抗性を示す報告 に注目し、 公知のァセトラクテ一トシンタ一ゼ遺伝子の メイン A領域の遣伝子 配列を用いて、 除草剤に抵抗性を示すホウキギの c D N Aから全長遣伝子を単離 した。
又、 得られた上記遣伝子とホウキギより得られたスルホニルゥレア除草剤に感 受性を示すァセトラクテ一トシンタ一ゼ遺伝子とを比較解析することにより、 新 規のァミノ酸変異が抵抗性に関与するとを明らかにし、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 植物のァセトラクテートシン夕一ゼをコ一ドする核酸断 片であって、 前記核酸断片のヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列の内、 配列表の配列番号 1中 α , β , 7 , 5と表示する、 実質的に保存されたアミノ酸 配列の内 1つのァミノ酸をコ一ドする少なくとも 1つのヌクレオチド断片を含み、 該ヌクレオチド断片は
a ) aが、 ァスパラギン酸、 グルタミ ン酸以外のアミノ酸をコードする配列を有 する、
b ) βが、 バリン以外のアミノ酸をコードする配列を有する、
c ) ァが、 トリプトファン以外のアミノ酸をコードする配列を有する、
d ) δが、 ァスパラギン以外のアミノ酸をコードする配列を有する、
の少なくとも 1つの条件を満足することを特徴とする前記核酸断片に関する。 上記 αとしては、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン、 システィン、 ゲル々 牛
ミ ン、 グリ シン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリ ン、 セリ ン、 ト レオニン、 ト リプトファン、 チロシン、 バリンが挙げられ、 好ましくは、 グリシンが挙げられる。
上記 としては、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン、 ァスパラギン酸、 シ スティン、 グルタ ミ ン酸、 グルタ ミ ン、 グリ シン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リ ジン、 メチォニン、 フヱニルァラニン、 プロリ ン、 セリン、 トレォ ニン、 トリブトファン、 チロシンが挙げられ、 好ましくはグル夕ミン酸が挙げら れる。
上記 7としては、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン、 ァスパラギン酸、 シ スティン、 グルタ ミ ン酸、 グルタ ミ ン、 グリ シン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリ ン、 セリン、 トレォ ニン、 チロシン、 バリ ンが挙げられ、 好ましくは、 アルギニンが挙げられる。
上記 Sとしては、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 シスディン、 ダル 夕ミ ン酸、 グルタ ミ ン、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リ ジ ン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリブト ファン、 チロシン、 パリンが挙げられ、 好ましくはセリンが挙げられる。
なが、 グリシンで、 がグルタミン酸で、 yがアルギニンで、 δがセリンであ る組み合わせが望ましい。
又、 本発明は、 上記核酸断片から翻訳された蛋白質であって、 スルホニルウレ ァ除草剤に対する抵抗性を有することを特徵とするァセトラクテ一トシンターゼ 蛋白質にも関する。
さらに、 本発明は、 上記遣伝子の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感 受性の植物で発現することにより、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を植 物に付与する方法にも関する。
そして、 上記核酸断片で形質転換された植物細胞を選択する方法であって、 核 酸断片の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感受性である植物細胞に遣伝 子導入し、 該除草剤に対し抵抗性である形質転換細胞を得、 さらに、 形質転換さ れない細胞の生育を抑制する選択的濃度の該除草剤において形質転換細胞を選択 することを特徴とする方法にも関する。 又、 除草剤抵抗性を与えるァセトラクテートシンタ一ゼをコ一ドする上記記載 の核酸断片が第 2特性を与える第 2核酸断片と結合した核酸断片であつて、 植物 を形質転換するために用いられ、 スルホニルゥレア除草剤を適用したとき、 前記 植物による除草剤抵抗性の発現が前記第 2核酸断片の存在を検出するために利用 されることを特徵とする前記結合核酸断片にも関する。
図面の説明
図 1は、 配列表の配列番号 1に表すスルホニルゥレア除草剤抵抗性ホウキギの ァセトラクテートシンタ一ゼの推定されるアミノ酸配列を、 既に報告されている スルホニルゥレア感受性の植物からのァセトラクテートシン夕一ゼのァミノ酸配 列と比較した結果を示す。 Aはスルホニルゥレア除草剤抵抗性ホウキギのァミノ 酸配列を示す。 以下、 スルホニルゥレア感受性の植物の場合を示し、 A， はホウ キギ、 Bはタバコ、 Cはシロイヌナズナ、 Dはナタネ、 Eはトウモロコシのそれ ぞれのァミノ酸配列を示す。 それぞれのァミノ酸配列で保存されている箇所の下 に *を示す。 アミノ酸は以下の 1文字表記で示す。
A =ァラニン
C =システィン
D =ァスパラギン酸
E ==グル夕ミン酸
=フヱ二ルァラニン
G =グリシン
H =ヒスチジン
I =イソロイシン
K =リジン
L =ロイシン
M =メチォニン
N =ァスパラギン
P =プロリ ン
Q =グルタ ミン
R =アルギニン S =セリ ン
τ = ト レオニン
Υ = リン
w=トリプトファン
γ =チロシン
図 2は、 図 1の続きを示す。
図 3は、 図 2の続きを示す。
図 4は、 図 3の続きを示す。
図 5〜 7は本発明における発現ベクターの構築方法を示すスキームである。 発明の詳細な説明
以下、 本発明を具体的に説明する。 本発明のスルホニルゥレア除草剤抵抗性を 示すァセトラクテートシンタ一ゼをコ一ドする DNA配列は、 具体的には配列表 の配列番号 1に示されるごとく単一のオープンリーディ ングフレームを含んでい ることからなる。
このオープンリ一ディ ングフレームは 5' 末端は塩基配列 54〜56の ATG から翻訳開始され、 その上流に 53塩基の非翻訳領域を含み、 3' 末端は塩基配 列 2052〜 2054の TG Aで終了し、 さらに、 その下流にポリ （A) 付加シ グナルと推定される配列 AA AT A A、 T A AT A Aが存在しているので、 完全 長を含んでいるといえる。
また、 この c DN Aの塩基配列は、 既に報告されているドメイン A領域の塩基 配列を含む。 既に単離されているタバコ、 シロイヌナズナ、 ナタネ、 トウモロコ シなどのァセトラクテートシンターゼ遺伝子と、 本発明の遺伝子の塩基配列から 推定されるアミノ酸配列とを比較した結果を図 1〜図 4に示す。 これらと相同性 が高いことから、 本発明の遺伝子はァセトラクテートシン夕一ゼをコ一ドする全 塩基配列を含むといえる。 この塩基配列から推定されるァミノ酸配列を同時に配 列表の配列番号 1に併記する。 推定されるァミ ノ酸配列で表すタンパク質は 666アミノ酸残基よりなる。
注目すべき点はスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性株から得られたァセト ラクテ一トシンタ一ゼ遺伝子を、 感受性株から得られた遺 子と比較したとこ 、 配列表の配列番号 1に表すァミ ノ酸配列番号 2 6 0 (α 、 2 7 6 ( ） 、 487 (7) 、 561 (6) の 4箇所で、 新規のァミノ酸置換をコードする変異 を有することである。
位置 αにおいては感受性株ではァスパラギン酸が存在するが、 抵抗性株ではグ リシンが存在する。
位置 においては感受性株ではバリンが存在するが、 抵抗性株ではダル夕ミン 酸が存在する。
位置 7においては感受性株ではトリブトファンが存在するが、 抵抗性株ではァ ルギニンが存在する。
位置 <5においては感受性株ではァスパラギンが存在するが、 抵抗性株ではセリ ンが存在する。
これまでに他の植物で明らかにされている除草剤感受性のァセトラクテ一トシ ン夕一ゼのアミノ酸との比較を図 1〜図 4に示した。
位置 αにおいてはァスパラギン酸かダルタミ ン酸が存在しており、 抵抗性株で はグリシンが存在する。
位置 /3においては、 ホウキギにおいてのみ 4個のァミノ酸が挿入された領域で のアミノ酸置換で、 感受性株ではパリンが存在しており、 抵抗性株ではグルタミ ン酸が存在する。
位置 7においてはトリプトファンで保存されているが、 抵抗性株ではアルギニ ンが存在する。
位置 <5においてはグルタミ ンで保存されているが、 抵抗性株ではセリンが存在 する。
一方、 シロイヌナズナから単離されたスルホニルゥレア除草剤に対する抵 抗性ァセ トラクテー トシンターゼの遺伝子解析により、 配列表の配列番号 1 に表すァミノ酸配列番号 189に相当するプロリンがセリンに置換されることに より抵抗性を獲得した例 （ Z h i j i a n L i e t. a 1. P l a n t P h y s i o l . (1992) , v o l . 100, 662— 668) 、 また、 配 列表の配列番号 1に表すァミノ酸配列番号 649に相当するプロリンがァスパラ ギンに置換されることにより抵抗性を獲得した例 （J i r o H a t t o r i e t. a 1. M o 1. G e n. G e n e t. (1992) , v o l . 232. 167 - 173) などがあり、 ァセトラクテートシン夕ーゼの 1箇所のアミノ酸 置換により抵抗性を獲得することが知られている。 また、 1箇所のアミノ酸の置 換で抵抗性を獲得する場合、 置換されるアミノ酸は 1種類のァミノ酸だけではな く、 保存されているアミノ酸以外の種々のァミノ酸への置換においても同様に抵 抗性を示すことが明らかにされている （特開昭 63— 71184、 欧州特許公開 公報第 257993号） 。
すなわち、 本発明において、 ながァスパラギン酸、 グルタミ ン酸以外のァミノ 酸であり、 好ましくはグリシンに置換されることにより抵抗性を獲得する。 また、 がバリン以外のァミノ酸であり、 好ましくはグルタミ ン酸に置換されることに より抵抗性を獲得する。 また、 ァがトリブトファン以外のアミノ酸であり、 好ま しくはアルギニンに置換されることにより抵抗性を獲得する。 また、 <5がァスパ ラギン以外のァミノ酸であり、 好ましくはセリンに置換されることにより抵抗性 を獲得する。 上記のようにな、 /3、 r Sのアミノ酸が少なくとも 1箇所で他の アミノ酸に置換したァセトラクテートシン夕一ゼ蛋白質がスルホニルゥレア除草 剤に対する抵抗性を有することである。
以上のようにァセトラクテートシンターゼのァミノ酸の一次配列とその機能的 特徵から、 本発明の DN A配列を特徵付けることができ、 さらに、 スルホニルゥ レア除草剤に抵抗性を示す配列表の配列番号 1に表す 2300ベースからなるァ セトラクテートシンターゼをコ一ドする核酸断片を提供することができる。
以下の記載において、 常法として用いられる組換え D N A技術は、 特筆しな い限り以下の文献： Mo l e c u l a r C l o n i n ^ F r i s t c h等、 C o l d S p r i n g H a r b o u r P r e s s (1989) に記載され ている技術を使用して実施することができる。
本発明のスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性ァセ卜ラクテートシン夕一ゼ 遣伝子は、 例えばスルホニルゥレア除草剤に対し抵抗性を示すホウキギから mRNAを調製し、 次に c DNAを合成し、 その明らかにされている部分塩基配 列から、 目的の全長遺伝子を PCR (Polymerase chain reaction ) 法による増 幅を行うか、 c DNAライブラリーをスクリ一二ングことにより単離するこ が ？
できる。
ァセトラクテ一トシンターゼ遺伝子の P CR法による増幅としては、 スルホ二 ルゥレア抵抗性の植物組織から mRN Aを抽出し、 逆転写酵素を用いて c DN A を合成し、 ポリメラ一ゼ反応によって 2本鎖化し、 両末端に P CR法で用いるプ ライマーとして機能する合成 DN Aをアダプタ一として連結した c DN Aを铸型 とし、 既に明らかにされているドメイン A領域中の塩基配列 （例えば配列表の配 列番号 2に表す配列） をもとに合成した D N Aとアダプタ一の塩基配列を含む合 成 DNAをプライマ一として P CRを行うことにより、 ドメイン A領域の 3' 下 流域を増幅することができる。 また、 5' 上流域は、 例えばドメイン A領域の下 流にある塩基配列 （例えば配列表の配列番号 3に表す配列） とアダプターの塩基 配列を含む合成 DN Aをプライマ一として P CRを行うことにより増幅できる。 さらに、 両者を例えば配列表の配列番号 1に表す塩基配列番号 974— 975間 を制限酵素 E c oR Iで切断し、 連結することにより全長遺伝子を単離すること ができる。
ァセトラクテートシンターゼ遺伝子の c DNAライブラリ一のスクリ一二ング としては、 例えばプローブを作製し、 例えばプラークハイプリダイゼーションを 行えば良い。 スクリーニングに用いるプローブとしては、 既に明らかにされてい るドメィン A領域中の一部の配列をもとに合成したォリゴ DNA、 およびドメィ ン A領域を P CR法で増幅し、 目的とする領域の DN A断片を用いることができ る。
一方、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性および感受性の植物組織から mRNAを抽出し、 逆転写酵素を用いて c DN Aを合成し、 ポリメラーゼ反応に よって 2本鎖化したものを市販のファ一ジベクタ一あるいはプラスミ ドべク夕一 等にクロ一ニングし、 大腸菌などに形質転換することにより cDNAライブラリ —を作製することができる。 各種 c DNA合成キッ 卜が市販されているのでこれ らを使用しても良い。 ライブラリーの作製に使用するべクタ一は、 多数市販され ておりこれらを使用することができる。 さらに、 ドメイン Aの既に報告されてい る部分塩基配列よりプライマ一を合成し、 ホウキギの DN A粗抽出物の P CR増 幅により得られた部分 DN A断片をプローブとして用い、 プラークハイブリダィ ゼーシヨンなどにより、 c D N Aライブラリ一をスクリーニングし、 プローブと 相補性を持つ D N Aを含むクローンを選択し、 該クローンより D N Aを調製し、 これを詳細に解析することにより、 ァセトラクテートシンタ一ゼの全長遺伝子を 含む c D N Aクローンを得ることができる。 クローン化された c D N Aの解析は ダイデォキシ法などによりその塩基配列を決定することができ、 市販されている キッ ト、 または蛍光シークェンサ一も使用できる。 本発明において、 c D N Aか らのァセトラクテートシンターゼ遺伝子を単離するための材料とする植物組織お よびその方法をなんら限定するものではない。
本発明のスルホニルゥレア抵抗性ァセトラクテ一トシンターゼをコ一ドする遣 伝子は全長を含むことから、 例えば力リフラヮ一モザイクウィルス由来の 3 5 S プロモーターやトウモロコシ由来のュビキチン遺伝子のプロモーターなどと連結 し、 植物体中で本遺伝子が発現するよう構築したベクターを用いることにより、 植物体中での発現系の構築が可能となる。 図 5〜 7に発現べクタ一の構築方法の 一例を示す。
構築された発現ベクターを例えばダイズ、 テンサイ、 ジャガイモ、 トマト、 ァ ルフアルファ、 メ ロン、 ヮ夕、 レタス、 コムギ、 タノ コ、 イネ、 トウモロコシ、 芝などの植物にァグロパクテリゥムを利用した方法やエレク トロポーレーション 法、 パーティクルガン法などによって導入することが可能であり、 得られる形質 転換体植物でスルホニルゥレア抵抗性ァセトラクテ一トシンタ一ゼを生産させる ことが可能となる。 その結果として、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を 植物に付与することが可能となる。
本発明のァセトラクテートシンタ一ゼ遺伝子の全部又は蛋白質翻訳領域を含む 一部を用いて、 スルホニルゥレア除草剤に感受性の植物を形質転換することによ り、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を付与することができる。
すなわち、 核酸断片で形質転換されたスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性 を有する植物細胞を選択するにあたって、 本発明のァセトラクテートシンターゼ 遺伝子核酸断片の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感受性である植物細 胞に遺伝子導入すると、 得られる形質転換細胞は除草剤に対し抵抗性を有する。 そこで、 形質転換されない細胞の生育を抑制する除草剤の選択的濃度で処理する 〃 ことにより、 形質転換細胞を形質転換されない細胞から選択することができる。
さらに抗生物質や除草剤など、 薬剤に対する抵抗性遺伝子を植物細胞などに遺 伝子導入することにより、 薬剤に感受性の形質転換された植物細胞は抵抗性を示 し、 形質転換されない細胞の生育を抑制される選択的濃度において形質転換細胞 を選択することができ、 目的とする遺伝子を導入した植物細胞を選択する際のマ 一力一遺伝子として利用している。
これは一般に選抜マ二力一遺伝子とよばれているが、 スルホニルゥレア除草剤 抵抗性遺伝子も植物などに遺伝子導入する際の選抜マーカーとしても利用するこ とができる （Zh i j i a n L i e t . a 1. P l a n t Ph y s i o 1. (1992) , v o l . 100, 662 - 668) 。
すなわち、 除草剤抵抗性を与えるァセトラクテートシンターゼをコ一ドする前 記の核酸断片と第 2特性を与える第 2核酸断片とを結合した核酸断片であつて、 該核酸断片は植物を形質転換するために用いられ、 スルホニルゥレア除草剤を適 用したとき、 前記植物による除草剤抵抗性の発現を前記第 2核酸断片の存在を検 出するためのマーカーとして利用することができる。
実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに説明するが、 これら実施例によって限定さ れるものではない。
参考例 1
ホウキギのスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性
1/10, 000アールポッ トに洪積土壌をつめ、 スルホニルゥレア系除草剤 感受性または抵抗性ホウキギの種子を播種し、 約 1. 5 cm覆土した。 14曰後 スルホニルゥレア系除草剤であるハロスルフ口ンェチルを所定の薬量になるよう に調製した水溶液を小型スプレーで均一に散布した。 処理後 17日目にホウキギ の生育状況を肉眼で観察し、 0 (影響なし） から 9 (完全枯死） の 10段階の判 定基準に従い、 表 1の結果を得た。 表 1で明らかなように、 感受性ホウキギはハ ロスルフロンェチル 0. 1 gZa処理においても著しい生育抑制を受けるが、 抵 抗性ホウキギは 6. 3 g/aでも影響は受けなかった。 I 2
スルホニルゥレア感受性ホウキギおよび抵抗性ホウキギに対す
るハロスルフロンェチルの除草沽性 化合物 a . 1 .
g / a 感受性 抵抗性
ハロスルフロンェチル 0. 1 7. 0 0. 0
0. 4 8. 0 0. 0
1. 6 9. 0 0. 0
6. 3 9. 0 0. 0
無処理 0. 0 0. 0
0=影響なし〜 9 =完全枯死 実施例 1
ホウキギ mRN Aの単離及び c DN Aの合成
スルホニルゥレア除草剤感受性および抵抗性のホウキギ （K 0 c h i a s c o p a r i a) の茎葉部約 1 gを液体窒素で凍らせ、 乳鉢で破砕した。 これ を 5m lの l O OmM L i C l、 l O OmM トリスー HC 1 (p H 8. 0) 、 10 mM EDTA、 1%、 S D S溶液と 5 m 1のフヱノ一ルを 80 °Cに加熱し ておいた溶液に加え、 攪拌した後、 さらに 5 m 1のクロロホルムノィソアミルァ ルコール （容量比 24 : 1) を加え攪拌した後、 12000 r pm、 15分間遠 心し、 上清を回収した。 これに当量の 4M 塩化リチウム溶液を加え、 一 80で に 1時間放置したのち、 遠心分離により沈澱を回収した。 沈澱に lm l滅菌水を 加え溶解したのち、 3M酢酸ナトリウム溶液 100 1とエタノール 2m l を加え、 一 8 (TCに一晚放置し、 遠心分離により全 RN Aを沈澱として回収した。 沈澱を 10mM トリス— HC l (p H 7. 5) 、 1 mM EDTAの RNA溶 解液 4m 1に溶解し、 オリゴ （dT) セルローススパンカラム （フアルマシア 社製） に加え、 10分間振盪し吸着させた。 さらに、 3m lの 10mM トリ ス— HC l (p H 7. 5) 、 1 mM EDTA、 0. 5 M N a C 1溶液で 2回 洗浄、 3m lの l OmM トリスー HC l (p H 7. 5) 、 lmM EDTA、 ' /3
0. 1M N a C 1溶液で 2回洗浄した後に、 65°Cに加温した 0. 25m lの 10 mM トリスー HC 1 (p H 7. 5) 、 1 mM EDTAを加え、 遠心分離 し、 この操作を 3回繰り返すことにより mRN Aを回収した。 溶出液 500 1 に 3 Μ酢酸ナトリウム 50 1 とエタノール 1 m 1を加え— 80。Cに 1時間 放置し、 遠心沈澱により約 2 gの mRN Aを回収した。 mRNAを滅菌水 30 1に溶解し、 この 5 1を c DN Α合成に用いた。
c D N A合成は F i r s t— S t r a n d c DNA S y n t h e s i s K i t (フアルマシア社製） を用い、 N o t I - d (T) 18プライマ一を用いて 逆転写することにより、 1 s tス トラン ド c DN Aを合成した。
P CR法によるァセトラクテートシン夕一ゼ遺伝子の増幅
I s tストランド c DN A溶液を N o t I — d (T) 18プライマーと配列表の 配列番号 2に表す配列 （配列番号 1に表す塩基配列番号 553から 582に示す 配列） （5' TCGTGC C CGGGTTTG CTGATGCTTTG CTCG 3' ) の P A 4プライマーを用いて T t h DNAポリメラ一ゼ （東洋紡社製） で P CR増幅することにより、 約 17 5 0ベースのフラグメントを増幅した。 得られた増幅フラグメ ン トを制限酵素 S m a I と N 0 t I で消化した後、 p B l u e s c r i p t S K (一） プラスミ ドベクター中にサブクローニング した。 目的とする約 1750ベースのインサートを持つクローンをスクリーニン グし、 配列番号 1に表す塩基配列番号 561から 3' 下流の領域を有するクロー ンを得た。
また、 Ma r a t h o n c DNA Am p l i f i c a t i o n K i t ( C L 0 N T E C H社製） を用いて 2 n dス トラン ド c D N Aを合成し、 Ma r a t h o n c D N Aアダプターを連結した後、 アダプタ一プライマ一 1 と配列表の配列番号 3に表す配列 （配列番号 1に表す塩基配列番号 984から 955に示す配列） （5， C C C CAGAATT CAAACAC CCGC CTC C CACAT 3' ) の PA 1 0プライマーを用いて T t h DNAポリメラーゼ (東洋紡社製） で P CR増幅することにより、 約 1000ベースのフラグメント を増幅した。 得られた増幅フラグメントを制限酵素 E c o R I と No t 〖で消化 した後、 p B 1 u e s c r i p t S K (一） プラスミ ドべク々一中にサブクロ '
—ニングした。 目的とする約 1000ベースのインサ一トを持つクローンをスク リーニングし、 配列番号 1に表す塩基配列番号 979から 5' 上流の領域を有す るクローンを得た。
cDNAクローンのシークェンス
ク ロ一ニングした c D N Aクロ一ンは K i 1 o— S e q u e n c e用 D e l e t i o n K i t (宝酒造社製） を用いて種々の大きさの D N A断片を 含むクローンを得た。 得られたクローンを M 13 F o rwa r d HTプライ マーと T3 HTプライマ一 （東洋紡社製） を用いて、 S e q u e n c i n g H i gh-Cy c l e -K i t (東洋紡社製） により、 シークェンスし、 塩基配 列を決定した。 得られた塩基配列を配列表の配列番号 1に示す。
塩基配列とァミノ酸配列の解析
DN Aとアミノ酸配列は、 SD C— GENETYX (S DCソフトウェア開発 社製） を用いて解析した。 種々の植物から単離された公知のァセトラクテ一トシ ンターゼとの比較を図 1〜図 4に示すが、 相同性が認められた。
夕ンパク質の N末端付近に葉緑体に輸送されると考えられる相同性の低いシグ ナル領域が存在し、 その下流、 図 1〜図 4に示すアミノ酸配列番号約 80から以 下 C末端の領域において相同性が認められた。
さらにスルホニルゥレア除草剤に対する感受性および抵抗性のァセトラクテ一 トシンターゼ遺伝子配列間でこれまで除草剤抵抗性に関連づけられ解明された変 異とは異なる新規な 4箇所 （な、 β、 < 、 δ の変異が明らかとなった （表 2) c 表 2
スルホニルゥレア除草剤抵抗性を示すァセトラクテートシンタ一ゼ 遺伝子の突然変異 ァミノ酸の位置 感受性 感受性 抵抗性 抵抗性
37 ド、ン ァミノ酸 nド、ン ァミノ酸
260 (α) G A Τ A s p G G T G 1 y
276 ( ） G T G V a 1 GAG G 1 u
487 (r) T G G T r p C G G A r g
561 (5) A A C Λ s n AG C S e r /5" 実施例 2
点突然変異によるアミノ酸の置換
スルホニルゥレアに対する抵抗性のホウキギから単離した 3' 下流域を含む c DN A断片を制限酵素 S a c I、 P s t Iで切断し得られた約 1700ベース のフラグメン卜を Ml 3 t V 19ファージベクターにサブクローニングし、 配列 表の配列番号 4に表す点突然変異用 PA7プライマー （5' TAAAAC CTA T C T T C C C ATT G TT C C A C C AT A 3' ) により、 S i t e - d i r e c t e d mu t a g e n e s i s s y s t em . Mu t a n— G K i t (宝酒造社製） を用いることにより配列表の配列番号 1に表すアミノ酸番 号 570のロイシンをトリプトファンに置換した。 点突然変異処理し得られたク ローンから 2本鎖ファージベクタ一を単離し、 制限酵素 Mu n Iで消化で切断さ れない、 点突然変異されたクローンを得た。 このクローンをスルホニルゥレア除 草剤に対する抵抗性ホウキギの 3' 下流域を含む c DN Aクローンとして用いた。 実施例 3
タバコ A L S遺伝子の 5' 末端領域の P C R増幅
タバコの葉片約 1 gから実施例 1に示す方法と同様に mRN Aを抽出し、 1 s tス トラン ド c DNAを合成した。 配列表の配列番号 5に表す配列 （5' CATTAGGATCCTTYCAGTTTCGTCTCTC 3' ) のプライ マ一と配列表の配列番号 6に表す配列 （5' T CT C T CT C GAG GG C CTCCACGAGAACGTCGGAACCC 3， ；） のプライマ一を用いて ΔΤ t h DN Aポリメラーゼで P CR増幅することにより約 350 b pのフラ グメ ン トを増幅した。 得られた増幅フラグメ ン トを制限酵素 B a mH I と X h o Iで消化した後、 p B 1 u e s c r i p t S K (—） プラスミ ツ ドべク 夕一にサブクローニングした。 目的とする約 350 b pのインサートを持つクロ ーンをスクリーニングし、 配列表の配列番号 7に表す配列のタバコ A L S遺伝子 の 5' 末端領域を有するクローンを得た。
発現ベクターの構築
感受性のァセトラクテートシンターゼ遺伝子の配列表の配列番号 1に表す塩基 配列番号の 553から 3' 下流領域を有するクローンを制限酵素 M u n I と N o t Iで消化して得られたフラグメ ン トと、 ァセ トラクテー トシン夕一ゼ 遺伝子の配列番号 1に表す塩基配列番号の 984から 5' 上流領域を有する クローンの制限酵素 Mu n I と N o t Iで消化しして得られたフラグメ ントを p B l u e s c r i p t SK (—） プラスミ ツ ドベクターに挿入することによ り、 感受性ホウキギの全長ァセ トラクテ一 トシンタ一ゼ遺伝子を構築した (図 5) 。
ァセ トラクテー トシンターゼ遣伝子の配列番号 1に表すァミノ酸配列番号の 570のアミノ酸を点突然変異させたクローンの制限酵素 E c o R Iと N o t I で消化したフラグメントと、 ァセトラクテートシン夕一ゼ遺伝子の配列番号 1に 表す塩基配列番号の 984から 5' 上流領域を有するクローンの制限酵素 E c o R Iと N o t Iで消化して得られたフラグメ ン トを p B l u e s c r i p t S K (―) プラスミ ツ ドベクターに挿入することにより、 新規 4箇所 （な、 β、 7、 δ) のみの変異を有するホウキギの全長ァセトラクテートシンタ一ゼ遺伝子を構 築した。 抵抗性のァセトラクテートシンターゼ遺伝子の配列表の配列番号 1に表 す塩基配列番号の 553から 3' 下流領域を有するクローンを制限酵素 E c οΤ 22 Iと S a c Iで消化し得られたフラグメントを、 ァセトラクテートシン夕一 ゼ遺伝子の配列番号 1に表すァミノ酸配列番号の 570のアミノ酸を点突然変異 させた全長ァセトラクテートシンターゼ遺伝子を含むクローンの制限酵素 E c o T 22 Iと S a c Iで切断されるサイ 卜に挿入し、 抵抗性ホウキギの全長ァセト ラクテートシンタ一ゼ遺伝子を構築した （図 6) 。
得られたクローンを制限酵素 B amH I と S a c Iで消化することにより得た 全長ァセトラクテ一トシンターゼ遣伝子を含むフラグメントをバイナリーベクタ — P B I 121の制限酵素 B amH I と S a c Iサイ トに挿入した。
さらに、 タバコ A L S遺伝子の 5' 末端領域を有するクローンの制限酵素 B amH Iと Xh o Iで消化して得たフラグメントを上記 3種類の全長ァセトラ クテー トシン夕一ゼ遺伝子の植物での発現べクターの制限酵素 B a mH I と h 0 1で切断されるサイ トに挿入することにより、 タバコ葉緑体輸送シグナル と考えられる領域を持つ 3種類のホウキギのァセトラクテートシンタ一ゼ遺伝子 の発現べクタ一 （p B I— SH ;感受性遺伝子， p B I - R H ；抵抗性遣伝子， II p B I — RMH ;新規 4箇所 （α、 β、 Ίヽ δ) のみの変異を有する遺伝子） を 構築した （図 7) 。
ァグロバクテリムへの形質転換
ァグロバクテリム L BA 4404株は Υ Ε Ρ培地で培養した菌体を 2 OmM塩 化カルシウム溶液に再懸濁し、 ― 80°Cで凍結保存したコンビテントセルを用い た。 ァグロパクテリゥムのコンビテントセル 1 00 jtz 1を室温で溶解し、 構築し た発現ベクターを約 1〃 g添加し、 37°Cで 5分間保温し、 さらに lm lの L B 培地を添加した後に 28でで 2時間保温した。 遠心することにより菌体を沈緞と して回収し、 100 ^1 の L B培地に再び懸濁させ、 これを抗生物質 （25 # g /m lのカナマイシン、 300 g/m 1のス トレプトマイシン、 l O O gZ m lのリファンピシン） を含む L B寒天培地上に広げ、 28でで 2日間培養した。 生育してきた発現べクタ一が導入されたァグロパクテリゥム株をタバコへの形質 転換に用いた。 タバコへの形質転換はリーフディスク法 （内宮博文、 植物遺伝子 操作マニュアル、 1990、 講談社） を用いた。
発現べクタ一を持つァグロパクテリゥム株を抗生物質 （25 g/m 1のカナ マイシン、 300〃 gZm 1のス トレプトマイシン、 100〃 g m 1のリファ ンピシン） を含む L B培地で 28 、 24時間培養した。 無菌条件下で成育さた タバコの 5 mm角の葉切片を培養液に浸漬した。 5分後、 葉切片を滅菌した慮紙 上に置き、 余分な培養液を除き、 MS— NB寒天培地上に置床し、 25。C、 30 00ルックスの光の下で培養した。 3日後、 葉切片を 500 ^ g/m 1のクラホ ランを含む MS— NB寒天培地上に移した。 7曰後、 葉切片を 100 # g/m 1 のカナマイシンと 500 /¾ gZm lのクラホラン 添加した MS— N B寒天培地 上に移し、 形質転換体を選抜した。 約 3週間後カナマイシン耐性の分化した茎葉 部を 100〃 gZm 1のカナマイシンを含む MS培地に移植した。 約 2週間後、 発根した植物体をピ一卜に移植し、 栽培した。
p B I — SHから得られた形質転換体を SH株とし、 p B I— RHからのもの を RH株、 p B I — RMHからのものを RMH株とした。
ァセトラクテートシンタ一ゼ阻害活性試験
3種類のァセトラクテートシンタ一ゼ遺伝子を導入したタバコから約 2 mm 間隔で切り出した葉切片 （約 0. 2 g) を、 2m 1のリン酸バッファー （p H 6. 0 10 mM カリウムリ ン酸バッファー、 0. 0125%トライ トン X— 100 50 p pm HOE— 704、 クロルスルフロンの存在下または不存在 下） で 12時間 24 全明条件下でィンキュベーション後、 ポリ トロンホモジナ ィザ一で粉砕した。 これを、 12, 000 gで 10分間遠心後、 その上清を取り 出し、 6 ^^の硫酸0. lm 1を添加し 60°Cで 15分間インキュベーションした c 更に、 5%の 1一ナフトールの 2. 5 N N a OH水溶液および 0. 1%のクレ ァチン水溶液をそれぞれ 0. 5m 1添加後室温にて 30分間ィンキュベーション した。 続いて、 3, 000 gで 3分間遠心した後、 その上清の 530 nmでの吸 光度を測定した。 その結果、 表 3に示すように感受性の遺伝子を導入した SH 1 株ではスルホニルゥレア剤であるク口ルスルフロン 5 p pm, 20 p p mの添加 により、 無添加に比べ 10〜20%程度までァセトラクテ一トシンターゼ活性が 阻害されるのに対し、 抵抗性の遺伝子を導入した RH 2 2株では 3 0〜 5 0 %の活性が残存し抵抗性を示した。 新規 4箇所の変異を持つ遺伝子を導入した RMH 9株でも RH 2 2株と同様に 4 0 %以上の活性が残存し、 抵抗性を示 したことから、 新規 4箇所の変異が抵抗性に関与することが明らかとなった。
Arno Schu 1 z 等， The herbicidally active expe imenta 1 compound Hoe 704 is a potent inhibitor of the enzyme a c e t o 1 ac t a t e reduct i soierase. FEBS Letters, 238 375-378 (1988) )
表 3 ァセトラクテートシンタ一ゼ阻害活性試験 クロルスルフロン無添加時の吸光度を 100%とし、 残存率を算出した。
0 p p m 5 p p m 20 p p m
S H 1株 1 00% 23% 1 1%
R H 22株 1 00% 51 % 34%
RMH 9株 1 00% 46% 41 % 発明の効果
本発明によってスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を有するァセトラクテ ―トシンターゼをコ一ドする D N A配列が提供される。 これによつて、 植物体に 形質転換することが可能になり、 植物にスルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性 を付与することが可能となり、 また、 他の遺伝子を導入するときの選抜マーカー として利用することが可能となる。
ス D 配 列
配列番号： 1
配列の長さ ： 2300
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名 ：ホウキギ (Kochia scoparia
細胞の種類：葉および茎
配列の特徴
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 54. · 2051
特徴を決定した方法： P
配列
CTCCACACTC CTCTCTTTCA TTTTCTCTCT GATCATACCT TCAACCTTCA ACA ATG 56
Met
1
GCG TCT ACT TCT GCA AAT CCC ACT TTT ACC CCT TTC ACC AGT AAA CCC 104
Ala Ser Thr Ser Ala Asn Pro Thr Phe Thr Pro Phe Thr Ser Lys Pro
5 10 15
CTT AAA CCC CGT TCT CCC TTT CAC TCT TTC CCA TTT CCC TCA AAC CCC 152
Leu Lys Pro Arg Ser Pro Phe His Ser Phe Pro Phe Pro Ser Asn Pro
20 25 30
AAA ACC CCT TCC TCT TCA TTT CGC AAC CTC AAA ATC ACA TCT TCT CTC 200
Lys Thr Pro Ser Ser Ser Phe Arg Asn Leu Lys He Thr Ser Set Leu
35 40 45
TCT TCT TCA CAA CCC CCG AAA CCA CCT TCC GCC GTC AAA ATC CAC TCA 248 HZ S61
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3C 3：
His Val Leu Pro Met lie Pro Ser Gly Ala Ala Phe Lys Asp He lie
645 650 655
AAC GAA GGT GAT GGA AGA ACA AGT TAT TGATGTTCGT ATCGATGGTT 2071 Asn Gin Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
GAAAGCATCT ATAGAGGGGG AAGCAAAATA AGAATAATAA TCTGTATGTA TAATAGTATG 2131
TTCCTTTTAA ATTTTTAGCG TCTGTTTACT TGTTTTTTTA GTTTTCTAGT TAGTTTGTCG 2191
TTGTTATGTT GCTTGTTACT TTGAGAATGC TTTTTTGTAG TTTTTCAAGA GACGAGTAAT 2239
GGATGATCTT CCTATATTGT TCAAAGATTT CAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2300 配列番号： 2
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鑌伏
配列の種類：合成 DN A
配列
TCGTGCCCGG GTTTGCTGAT GCTTTGCTCG 30 配列番号： 3
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A
配列
CCCCAGAATT CAAACACCCG CCTCCCACAT 30 配列番号： 4
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A
配列
TAAAACCTAT CTTCCCATTG TTCCACCATA 30
配列番号： 5
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A
配列
CATTAGGATC CTTYCAGTTT CGTCTCTC 28 配列番号： 6
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A
配列
TCTCTCTCGA GGGCCTCCAC GAGAACGTCG GAACCC 36 配列番号： 7
配列の長さ ： 337
配列の型：核酸 ^ 鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： c DNA to mRNA
起源
生物名： タバコ (Ni cot i ana tabacum;
細胞の種類：葉
配列
GGATCCTTTC AGTTTCGTCT CTCACTGCTC TCATTCAACA ATAATGGCGG CGGCTGCGGC 60 GGCTCCATCT CCCTCTTTCT CCAAAACCCT ATCGTCCTCC TCCTCCAAAT CCTCCACCCT 120 CCTCCCTAGA TCCACCTTCC CTTTTCCCCA CCACCCCCAC AAAACCACCC CACCACCCCT 180 CCACCTCACC CCCACCCACA TTCACAGCCA ACGCCGTCGT TTCACCATCT CCAATGTCAT 240 TTCCACTACC CAAAAAGTTT CCGAGACCCA AAAAGCCGAA ACTTTCGTTT CCCGTTTTGC 300 CCCTGACGAA CCCAGAAAGG GTTCCGACGT TCTCGAG 33T

Claims

請 求 の 範 囲
1. 植物のァセトラクテートシンターゼをコ一ドする核酸断片であって、 前記 核酸断片のヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列の内、 配列表の配列番 号 1中 α, β, 7, 6と表示する、 実質的に保存されたアミノ酸配列の内 1つの アミノ酸をコードする少なく とも 1つのヌクレオチド断片を含み、 該ヌクレオチ ド断片は
a) なが、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸以外のアミノ酸をコードする配列を有 する、
b) βが、 パリン以外のアミノ酸をコードする配列を有する、 c) 7が、 トリプ トファン以外のァミノ酸をコードする配列を有する、
d) δが、 ァスパラギン以外のアミノ酸をコードする配列を有する、
の少なくとも 1つの条件を満足することを特徴とする前記核酸断片。
2. αが、 ァスパラギン酸、 グルタミ ン酸以外のアミノ酸をコードする配列を 有する請求項 1記載の核酸断片。
3. ;3が、 バリン以外のアミノ酸をコードする配列を有する請求項 1記載の核 酸断片。
4. yが、 トリブトファン以外のアミノ酸をコードする配列を有する請求項 1 記載の核酸断片。
5. δが、 ァスパラギン以外のアミノ酸をコードする配列を有する請求項 1記 載の核酸断片。
6. aが、 グリシンである請求項 2記載の核酸断片。
7. βが、 グルタミ ン酸である請求項 3 己載の核酸断片。
8. yが、 アルギニンである請求項 4記載の核酸断片。
9· δが、 セリ ンである請求項 5記載の核酸断片。
10. aが、 グリシンであり、 βが、 グルタミン酸であり、 7が、 ァルギニン であり、 5が、 セリ ンである配列表の配列番号 1に示した核酸断片。
1 1. 請求項 1記載の核酸断片から翻訳された蛋白質であって、 スルホニルゥ レア除草剤に対する抵抗性を有することを特徴とするァセトラクテートシンター ゼ蛋白質。
1 2 . 核酸断片の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感受性の植物で発 現することにより、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗性を植物に付与するた めの請求項 1記載の核酸断片。
1 3 . 請求項 1記載の核酸断片の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感 受性の植物で発現することを特徵とする、 スルホニルゥレア除草剤に対する抵抗 性を植物に付与する方法。
1 4 . 請求項 1記載の核酸断片で形質転換された植物細胞を選択する方法であ つて、 核酸断片の全部又は一部をスルホニルゥレア除草剤に感受性である植物細 胞に遺伝子導入し、 該除草剤に対し抵抗性である形質転換細胞を得、 さらに、 形 質転換されない細胞の生育を抑制する該除草剤の選択的濃度において形質転換細 胞を選択することを特徴とする方法。
1 5 . 除草剤抵抗性を与えるァセトラクテ一トシンターゼをコ一ドする請求項 1記載の核酸断片と第 2特性を与える第 2核酸断片とを結合した核酸断片であつ て、 植物を形質転換するために用いられ、 スルホニルゥレア除草剤を適用したと き、 前記植物による除草剤抵抗性の発現が前記第 2核酸断片の存在を検出するた めに利用されることを特徵とする前記結合核酸断片。
1 6. 請求項 1記載の核酸断片を含有することを特徵とする植物。
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