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WO1997008294A1 - Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation - Google Patents

Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation Download PDF

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WO1997008294A1
WO1997008294A1 PCT/JP1996/001944 JP9601944W WO9708294A1 WO 1997008294 A1 WO1997008294 A1 WO 1997008294A1 JP 9601944 W JP9601944 W JP 9601944W WO 9708294 A1 WO9708294 A1 WO 9708294A1
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WO
WIPO (PCT)
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strain
valine
glutamic acid
activity
coli
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1996/001944
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhiko Matsui
Kumiko Hukase
Nobuharu Tsujimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
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Priority to DE19681532T priority patent/DE19681532T1/de
Priority to US09/011,479 priority patent/US6110714A/en
Publication of WO1997008294A1 publication Critical patent/WO1997008294A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-glutamic acid by a fermentation method.
  • L-glutamic acid is an important amino acid for foods, pharmaceuticals and the like. Background art
  • L-glutamic acid has been produced by a fermentation method using a so-called coryneform L-glutamic acid-producing bacterium belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium or Microbacterium or a mutant thereof (amino acids). Fermentation, Jikkai Shuppan Center, 195-215, pp. 1986).
  • a method for producing L-glucamic acid by fermentation using other strains a method using a microorganism such as genus Bacillus, Streptomyces or Penicillium (US Pat. No. 3,220,92) No.
  • Bacteria belonging to the genus Xechia have a potential to be used as excellent L-glutamic acid-producing bacteria in the future due to their high growth rate and progress in gene analysis.
  • Previous reports have shown that mutants derived from the wild strain Escherichia coli E. coli belonging to the genus Escherichia I. accumulated very low levels of 2.3 g ZI of L-glucamic acid. (J ⁇ Biochem., Vol. 50, pp.
  • ⁇ -KGDH ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase
  • An object of the present invention is to breed L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Escherichia and to provide a more inexpensive and efficient method for producing L-glutamic acid. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing monoglutamic acid by a bacterium belonging to the genus Escherichia. (Hereinafter, abbreviated as PPC.) The inventors have found that a strain whose activity has been amplified has a high L-glucaminic acid-producing ability, and completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • Escherichia coli belongs to the genus L. lichen, exhibits valine sensitivity, amplifies citrate synthase activity and phosphoenol pyruvate carboxylase activity, and has an ability to produce L-glucamic acid.
  • Strains. (Invention 2) The strain according to Invention 1, wherein the ⁇ -KGD ⁇ activity is deficient or reduced.
  • Invention 3 The strain according to Invention 1 or 2, which belongs to Escherichia coli.
  • Invention 4 The strain according to Invention 3, which belongs to the Escherichia coli strain.
  • Invention 5 The strain according to Invention 3, which belongs to the E. coli '12 strain.
  • Invention 6 A method for producing L-glutamic acid by fermentation, comprising culturing the strain according to any one of Inventions 1 to 5 in a liquid medium, producing and accumulating L-glutamic acid in the culture solution, and collecting the L-glutamic acid.
  • Fig. 1 shows the construction process of plasmid p MWCWC.
  • a valine-sensitive mutant strain is obtained by using a wild strain or a mutant strain thereof belonging to the genus Escherichia I and exhibiting valine resistance as a parent strain.
  • the following are specific examples of such wild strains.
  • a method for isolating a valine-sensitive mutant from a strain belonging to the genus Xechiae and exhibiting valine resistance is as follows.
  • the above-mentioned palin-resistant strain is treated with a conventional mutagenesis method, for example, irradiation with X-rays or ultraviolet rays or mutagen such as ⁇ -methyl-N'-two-row Apply a method such as contact, and introduce the variation.
  • a conventional mutagenesis method for example, irradiation with X-rays or ultraviolet rays or mutagen such as ⁇ -methyl-N'-two-row Apply a method such as contact, and introduce the variation.
  • the target mutation can be efficiently introduced by using a genetic engineering technique, for example, transduction or genetic recombination.
  • the method for obtaining a valine-sensitive strain by transduction is as follows.
  • Escherichia coli K-12 is known to be sensitive to valine (Amino Acid: Biosynthesis and Genetic Regulation, Claus Herman and Ronald Soma Ville, Addison-Wesley Publishing) Company, 250-251, 1983), so that P1 phage and the like are infected with Escherichia coli K-12, and a phage lysate prepared is used to transform the strain into a strain that exhibits valine resistance.
  • valine sensitivity derived from Escherichia coli K-112 can be introduced.
  • the target valine-sensitive strain can be isolated as a mutant strain that cannot grow on a minimal medium containing valine or has a significantly reduced growth rate.
  • valine-sensitive strain obtained as described above includes Escherichia coli B11.
  • Escherichia coli B11 is a valine-sensitive strain derived from Escherichia coli B by mutation.
  • the flow of the biosynthetic pathway from pyruvate to valine is suppressed by imparting pallin sensitivity, and as a result, the flow of the biosynthetic pathway from pyruvate to acetyl COa is improved. It is expected that.
  • Such strains include Escherichia coli K-12 strain, and Escherichia coli L3110 strain.
  • a strain deficient or reduced in ⁇ -KGD ⁇ activity is more preferable as the strain of the present invention because it has an improved ability to produce glumic acid.
  • strains belonging to the genus Escherichia and having 0 and 5 activities amplified were obtained mainly using valine-sensitive strains belonging to the genus Xesihia.
  • breeding that imparts valine sensitivity may be performed after obtaining a strain having amplified PPC activity and CS activity using a valine-resistant strain belonging to the genus Escherichia as a host.
  • the host used to prepare a strain with amplified PPC activity and CS activity belongs to the genus Xesihia, a mutant strain imparted with valine sensitivity or belongs to the genus Escherichia, and has a valine resistance. Or a mutant strain thereof. Specific examples of such a host include the following strains.
  • genes encoding PPC and CS may be cloned into an appropriate vector, and the above-mentioned host may be transformed using the obtained recombinant vector.
  • the vector includes a plasmid vector, a phage vector, a transposon vector, and the like.
  • the Ppc gene and the gItA gene can be obtained by isolating a gene that complements the auxotrophy using a mutant strain that lacks PPC activity and CS activity, respectively.
  • the nucleotide sequences of these genes of Escherichia coli have already been elucidated (J. Biochem., Vol. 95, pp. 99-1916, 19).
  • primers were synthesized based on the respective nucleotide sequences, and the chromosomal DNA was transformed into type III and subjected to PCR. It can be obtained by law.
  • the plasmid used for gene cloning may be any plasmid that can be replicated in Escherichia bacteria.Specifically, pBR322, pTWV228, pMW119, pUC 19 and the like.
  • the Ppc gene and the gItA gene can be cloned on one type of vector and introduced into the above-mentioned starting parent strain to be a host, or separately cloned on two types of coexistent vectors and used as a host. Introduced into the strain.
  • Amplification of the PPC activity and the CS activity can be achieved by ligating the ppc gene and the gItA gene to a plasmid vector and maintaining the cells in the form of a plasmid. Alternatively, it can be achieved by causing the gene to be present in multiple copies on the chromosomal DNA of the host.
  • homologous combinations are used by targeting the sequences present in multiple copies on the chromosomal DNA. This is done by replacement.
  • sequences that exist in multiple copies on chromosomal DNA reactive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used.
  • the ppc gene and the gItA gene are mounted on a transposon, transferred and transfected, and multiple copies are introduced into chromosomal DNA. It is also possible.
  • Amplification of the PPC activity and the CS activity can also be achieved by replacing the promoters of the ppc gene and the gItA gene with strong ones, in addition to the gene amplification described above.
  • promoters of the ppc gene and the gItA gene are known as strong promoters.
  • lac promoter, trp promoter, trc promoter, TAC promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter and the like are known as strong promoters. The substitution with these promoters enhances the expression of the ppc gene and the gItA gene, thereby amplifying the PPC activity and the CS activity.
  • Escherichia coli To produce L-glutamic acid using a strain that belongs to the genus ⁇ -richia, has palin sensitivity, has amplified PPC and CS activities, and has the ability to produce monoglutamic acid, a carbon source, nitrogen, Normal nutrients containing organic trace nutrients such as amino acids, bimin, etc. It can be performed by a conventional method using a medium. Either a synthetic medium or a natural medium can be used. As the carbon source and the nitrogen source used in the medium, any type can be used as long as the strain to be cultured can be used.
  • sugars such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, starch hydrolyzate, molasses, etc. are used, and other organic acids such as acetic acid, citric acid, etc. Can be used alone or in combination with other carbon sources.
  • ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate, or nitrates are used.
  • organic micronutrients amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and peptones, casamino acids, yeast extracts, and soybean protein decomposed products containing these are used, and auxotrophic mutants that require amino acids for growth are used. It is necessary to supplement the required nutrients when using.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like are used.
  • aeration culture is performed while controlling the fermentation temperature to 20 to 45 ° C and the pH to 5 to 9. If the pH drops during culturing, add calcium carbonate or neutralize with an alkali such as ammonia gas. Thus, by culturing for about 10 hours to about 4 days, a remarkable amount of L-glutamic acid is accumulated in the culture solution.
  • a method for collecting monoglutamic acid from the culture solution after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, it is collected by a method in which cells are removed from the culture solution and then concentrated and crystallized, or by ion exchange chromatography.
  • Escherichia coli Isolation of a valine-sensitive strain from T. coli B
  • the cells were collected, washed with a phosphate buffer, partially inoculated into a 2YT liquid medium, and cultured overnight at 37 ° C to fix the mutation.
  • the cells were collected, washed with a phosphate buffer, partially inoculated in M9 minimal liquid medium containing 100 mg of valine ZI, and cultured at 37 ° C for 2 hours. After that, add penicillin to a concentration of 200 units / ml, further culture overnight, and Phosphorus sensitive mutants were enriched.
  • the culture solution was appropriately diluted, and the viable cell count was measured.
  • the culture solution was diluted based on the viable cell count so as to be suitable for manipulation of the replicity, applied to M9 minimal agar medium, and cultured overnight at 3 ° C. Transfer the resulting colonies to the M9 minimal agar medium containing no valine and the minimal agar medium containing 100 mg / I valine by the Repli-force method, and culture overnight at 37 ° C.
  • a valine-sensitive candidate strain that cannot grow on the medium was isolated. ⁇ The obtained candidate strain was isolated on a single colony, and the growth on M9 minimal agar medium containing various concentrations of valine was investigated. Three valine-sensitive mutants were isolated as mutants that could not grow on M9 minimal agar medium. E.
  • valine-sensitive strain I was not able to admit.
  • a representative strain of the isolated valine-sensitive strains was named Escherichia coli B11 and used in the following experiments.
  • Table 1 Ingredient concentration (I) Glucose 40
  • SEQ ID NO: 1 is the first and second position of the nucleotide sequence of the gItA gene described in Biochemistry, Vol. 2, p. To-3 2 3 It corresponds to the sequence from the 3rd base, but-3 3 1
  • the base G is changed to C, and the recognition sequence of the restriction enzyme PstI is changed.
  • SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the gItA gene described in Biochemistry, Vol. 22, p. 522, p.
  • the sequence corresponding to the base at the 270th base was changed, but the base at the 270th base A was changed to G, and the recognition sequence of the restriction enzyme Ec0RI was inserted.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is the base sequence from the 260th to the 279th base shown in Biochemistry, Vol. The reverse strand of the sequence is shown from the 5 'side.
  • the chromosome DNA of the Escherichia coli 'W3110 strain was prepared by a conventional method (Biotechnological Experiments, edited by the Biotechnology Society of Japan, pages 97-98, Baifukan, 19
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, reacted with the restriction enzymes PstI and EcoRI, and digested with PstI and EcoRI using a ligation kit (Takara Shuzo). 8 (Takara Shuzo) and transformed using Escherichia Hia coli JM109 combined cells (Takara Shuzo) to obtain IPTG (isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalactobyranoside).
  • Plasmid was prepared from the transformant using the alkaline method (Bioengineering Experiments, edited by The Society of Biotechnology, Japan, p. 105, Baifukan, 1992). Create a restriction map of the DNA fragment inserted into the plasmid, compare it with the reported restriction map of the 9ItA gene, and identify the plasmid containing the DNA fragment with the same restriction map as p. Named TWV C.
  • pTWV C was analyzed by the rubidium chloride method (Basics of the latest agricultural experiments, edited by the Department of Agriculture, Faculty of Agriculture, Tohoku University, Soft Science, p. GItA-deficient strain ME8330 (gltA6, fur :: Tn5, gaI ⁇ 30 pyrD36, reIARPs L129, thi) 1, supE44, ⁇ -) into the competent cells, confirm the nutritional requirements of the resulting transformant, and confirm that p TWV C Was confirmed to be complementary.
  • ME8330 strain was obtained from the National Institute of Genetics, Institute for Genetic Research and Biological Preservation, and showed monoglutamic acid requirement due to gItA deficiency, and was supplemented with thiamine, peracyl, and L-glutamic acid. Can grow on M9 minimal medium.
  • the CS activity of the W3110, git A-deficient strain ME8330, and the ME8330 strain carrying pTWV C was determined by the method of Weitzman et al. (Methodsin Enzymology, Vol. 13, 2 2 to 26, 1969). As a result, as shown in Table 2, no CS activity was observed in the ME8330 strain, whereas about 4% of the wild-type W3110 strain was observed in the ME8330 strain carrying pTWV C. It was confirmed that CS activity was doubled. Table 2 CS Strain CS activity (units / mg protein)
  • FIG. 1 shows the construction process of a plasmid pMWCP having a PPc gene and a gItA gene.
  • the plasmid pBR322 containing a 4.4 Kb SalI fragment containing the entire region of the pPc gene derived from Escherichia coli K112 was introduced into the SalI site of pBR322.
  • S 2 J. Biochem., Vol. 95, 909-916, 1984
  • the SaII fragment was isolated and inserted into the SaII site of pMW119 (manufactured by Tsutsubon Gene). This plasmid was named p MWP.
  • pTWV C into which a DNA fragment having the gItA gene had been inserted was digested with PstI, both ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase, and further digested with EcoRI.
  • the thus obtained DNA fragment was mixed with pMWP digested with Smal and EcoRI, and subjected to a ligation reaction.
  • the ME8330 strain was transformed using the DNA sample after the ligation reaction, and a transformant which was resistant to ampicillin and had lost the requirement for monoglutamic acid was isolated. Liplasmid was prepared from this strain, and the ME8330 strain was transformed again, and it was confirmed that the auxotrophic acid requirement was lost.
  • Escherichia coli Introduction of pMWCP into E. coli 'E. coli B and valine-sensitive mutant B11 and culture evaluation
  • Escherichia coli E. coli B strain and its valine-sensitive B11 strain were transformed with plasmid p MWCP by the rubidium chloride method, and the three transformants obtained independently were as shown in Table 1.
  • the medium was inoculated into a large test tube having a volume of 50 ml into which 5 ml of the medium having the above composition was injected, and cultured at 37 ° C with shaking until the sugar in the medium was consumed.
  • a plasmid pMWP in which only the ppc gene was cloned into pMW119 in the B11 strain, or a PstI—EcoRI fragment containing the gItA gene prepared from pTWV C was used.
  • a transformant obtained by introducing plasmid p MWC linked between the Pstl site of pMW119 and the EcoRI site was cultured in the same manner.
  • ampicillin was added at a concentration of 100 ⁇ g ZmI in order to stably maintain the plasmid.
  • Table 3 shows the results of measurement of L-glutamic acid accumulated in the culture solution after the completion of the culture.
  • the culture results of the transformed strains showed the average value of three strains.
  • L-glutamic acid was not accumulated in strains with enhanced CS and PPC activities using Escherichia coli X. coli B showing valine resistance as a host, whereas valine-sensitive B11 strain
  • CS activity and PPC activity were amplified using E. coli as a host, significant accumulation of L-glutamic acid was observed.
  • p MWP was introduced into the B11 strain and only PEPC activity was amplified
  • no glutamate accumulation was observed
  • p MWC was introduced into the B11 strain and only CS activity was reduced.
  • the valine-sensitive mutant strain B11 derived from N. rhiaria 'coli B can be obtained by removing the plasmid in the host cell from the deposited AJ13138 strain without damaging the host cell. Plasmids can be lost naturally by the host or can be removed by a removal procedure (Bact. Rev., 36, 361-405, 1972). ). To remove the plasmid, remove the AJ13138 strain in L broth overnight at 40 ° C, dilute the culture solution appropriately, and apply it to L medium without ampicillin. After incubation at 37 ° C for 1 hour, the resulting colonies are transferred to an L medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin, and the ampicillin-sensitive colonies are separated. O 97/08294 17 The strain thus obtained is the B11 strain.
  • Table 5 shows the results of measurement of L-glutamic acid accumulated in the culture solution after the culture. The results of culturing the transformants showed the average value of 4 strains. Significant accumulation of L-glutamic acid was observed when CS and PPC activities were amplified using ⁇ -KGD ⁇ -deficient strains derived from valine-sensitive Escherichia coli K-12 strain as hosts. . Table 5
  • the L-glutamic acid-producing ability of a wild strain belonging to the genus Phellinus X Rhizia and exhibiting valine resistance can be increased, and L-glucamic acid can be produced inexpensively and efficiently.
  • Escherichia coli AJ 1 2 6 2 4 was assigned to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) on July 24, 1991. Deposited as FE RM P—1 2 3 7 9 The strain has been transferred to an international deposit under the Bush Estuary Treaty on May 15, 1992, and has been assigned the accession number FE RM BP-3853. I have.
  • Esshi: L Richia 'Kori AJ2 628 is the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (July 24, 1991, Postal code: 1-35, 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) Deposit No. FE RM P—123800.
  • This strain has been transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on May 15, 1992, and has been assigned the accession number FE RM BP-3854. 3 1 3 8 was assigned to the Research Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) on August 17, 1995 under the accession number FE RM P-1. Deposited as 5 1 1 5.
  • This strain has been transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on June 7, 1996, and has been assigned the accession number F ERMBP-555565 Sequence Listing SEQ ID NO: 1
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書 発酵法による L一グルタミン酸の製造法 技術分野
本発明は、 発酵法による L一グルタミン酸の製造法に関する。 Lーグ ルタミン酸は、 食品、 医薬品等として重要なアミノ酸である。 背景技術
従来、 L—グルタミン酸は、 主としてブレビバクテリウ厶属、 コリネ バクテリゥ厶属またはミクロバクテリウ厶属に属するいわゆるコリネ型 L一グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製 造されている （アミノ酸発酵、 学会出版センター、 1 9 5〜 2 1 5頁、 1 9 8 6年） 。 その他の菌株を用いた発酵法による L—グル夕ミン酸の 製造法としては、 バチルス属、 ストレプトミセス属、 ぺニシリウ厶属等 の微生物を用いる方法 （米国特許第 3 , 2 2 0 . 9 2 9号） 、 シユード モナス属、 アースロバクター属、 セラチア属、 キャンディダ属等の微生 物を用いる方法 （米国特許第 3 . 5 6 3 , 8 5 7号） 等が知られている。 従来の方法により L一グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいる力^ 今後の需要の一層の増大に応えるためには、 さらに安価かつ効率的な L 一グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
ェシ Xリヒア属細菌は、 その増殖速度の大きさ及び遺伝子解析の進み 方から将来的に優れた L一グルタミン酸生産菌として利用される可能性 を有している。 従来の報告では、 ェシ Iリヒア属に属する野生株ェシェ リヒア . コリ W由来の変異株が極めて低いレベルである 2 . 3 g Z I の L 一グル夕ミン酸を蓄積したことが報告されているのみであった （ J · B i o c h e m. 、 第 5 0卷、 1 6 4〜 1 6 5頁、 1 9 6 1年） が、 最 近、 α—ケ トグルタル酸デヒ ドロゲナーゼ （以下、 α— K G D Hと略 す） 活性が欠損もしくは低下したェシエリヒア · コリ Κ一 1 2由来の変 異株が高い L一グルタミン酸生産能を有することが明らかにされた （特 開平 5— 2 4 4 9 7 0号） 。 工シヱリヒア属に属する野生株には、 ェ シヱリヒア ' コリ Κ— 1 2やその変異株より優れた性質を有するものが ある。 例えば、 ェシエリヒア · コリ Βはェシエリヒア · コリ Κ一 1 2及 び Κ一 1 2株由来の変異株よりも高い生育速度を示し、 かつ消費糖当り の菌体収率が高いことが報告されている （J . B i o t e c h n o l o g y、 第 2巻、 1 9 1 〜 2 0 6頁、 1 9 8 5年： A p p に E n v i r o n. M i c r o b i o l . 、 第 5 6巻、 1 0 0 4〜 1 0 1 1頁、 1 9 9 0年） 。
本発明の目的は、 ェシェリヒア属に属する L—グルタミン酸生産菌を 育種し、 より安価かつ効率的な L一グル夕ミン酸の製造法を提供するこ と i*»ある。 発明の開示
本発明者らは、 ェシヱリヒア属細菌によるし一グルタミン酸の製造法 について鋭意研究を重ねた結果、 バリン感受性株に、 クェン酸シンター ゼ （以下、 C Sと略す） 活性及びフォスフォェノールピルペートカルボ キシラーゼ （以下、 P P Cと略す） 活性を増幅させた菌株が高い Lーグ ル夕ミン酸生産能を持つことを見いだし、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
(発明 1 ) ェシ: Lリヒア属に属し、 バリン感受性を示し、 クェン酸シ ン夕ーゼ活性及びフォスフォェノールピルべ一トカルボキシラーゼ活性 が増幅され、 かつ L—グル夕ミン酸生産能を有する菌株。 (発明 2 ) α - K G D Η活性が欠損もしくは低下している発明 1記載 の菌株
(発明 3 ) ェシエリヒア · コリに属する発明 1又は 2記載の菌株。 (発明 4 ) ェシ リヒア ' コリ Β株に属する発明 3記載の菌株。
(発明 5 ) ェヒヱリヒア ' コリ Κ一 1 2株に属する発明 3記載の菌株。 (発明 6 ) 発明 1 ないし 5記載の菌株を液体培地に培養し、 培養液中 に L一グルタミン酸を生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とす る発酵法による L一グルタミン酸の製造法。 図面の簡単な説明
弟 1図は、 プラスミ ド p MWC Ρの構築過程を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
( 1 ) バリン感受性変異株の取得
本発明の菌株を育種するためには、 まず、 ェシ Iリヒア属に属し、 バ リン耐性を示す野生株もしくはその変異株を親株とし、 バリン感受性変 異株を得る。 このような野生株の具体的な例としては、 次の様な株が挙 げられる。
ェシエ リ ヒア ♦ コ リ B (A T C C 1 1 3 0 3 )
ェシエ リ ヒア · 〕 υ (Α Τ〇 〇 9 6 3 了）
ェシ Xリヒア属に属し、 バリン耐性を示す株からバリン感受性変異株 を分離する方法は以下の様である。
まず、 上記のパリン耐性株に通常の変異処理法、 例えば、 X線や紫外 線の照射あるいは Ν—メチルー N' —二トロー Ν—二トロソグァ二ジン (以下、 N Gと略す） 等の変異剤に接触せしめる等の方法を適用し、 変 異を導入する。 あるいは、 遺伝子工学的手法、 例えば形質導入、 遺伝子組換え法等を 用いることによつても目的の変異を効率良く導入することができる。 形質導入によるバリン感受性株の取得方法は以下の通りである。 すな わち、 ェシエリヒア . コリ K一 1 2はバリン感受性であることが知られ ている （ァミノ ァシド ： バイオシンセシス アンド ジェネティック レギュ レーショ ン、 クラウス ハーマン アン ド ロナルド ソマ ヴィル編、 アディソン一ウェスリーパブリツシングカンパニー、 2 5 0 〜 2 5 1項、 1 9 8 3年） ので、 P 1 ファージ等をェシェリヒア ' コリ K - 1 2に感染させ、 調製したファージ溶菌液を用いてバリン耐性を示 す株にェシヱリヒア ' コリ K一 1 2由来のバリン感受性を導入すること ができる。
親株への変異処理または形質導入によりバリン感受性を導入した後、 目的とするバリン感受性株は、 バリンを含む最少培地で生育できないか もしくは生育速度が著しく低下した変異株として分離できる。
以上の様にして得られるバリン感受性株の具体的例としてはェシェリ ヒア ' コリ B 1 1が挙げられる。
ェシ： cリヒア ' コリ B 1 1 は、 ェシヱリ ヒコリ . コ リ Bから突然変異 により誘導されたバリン感受性株である。 このような変異株は、 パリン 感受性の付与によりピルビン酸からバリンに至る生合成経路の流れが抑 えられており、 結果としてピルビン酸からァセチル C o Aに向かう生合 成経路の流れが改善されていることが予想される。
なお、 ェシエリヒア属に属し、 バリン感受性を示す株を新たに取得し なくとも、 既知のものを用いても問題ない。 そのような株としてェシェ リヒア · コリ K一 1 2株、 ェシ： Lリ ヒア · コリ W 3 1 1 0株等がある。 また、 特開平 5 - 2 4 4 9 7 0号公報に開示されるェシヱリヒア ' コリ A J 1 2 6 2 4株及びェシ Iリヒア · コリ A J 1 2 6 2 8株はいずれも ェシヱリヒア · コリ W3 1 1 0株に由来し、 α— K G D H活性が欠損も しくは低下している株である。 α— K G D Η活性が欠損もしくは低下し ている株は、 グル夕ミン酸生産能が向上しているので本発明の菌株とし てより好ましい。
( 2 ) P P C活性と C S活性の増幅
後述の実施例では、 ェシエリヒア属に属し、 0活性と〇 5活性が 増幅された菌株の取得を、 ェシ Xリヒア属に属するバリン感受性株を宿 主として行った。 しカゝし、 ェシエリヒア属に属するバリン耐性株を宿主 とし、 P P C活性と C S活性が増幅された菌株の取得を行った後に、 バ リン感受性を付与するという育種を行ってもかまわない。
従って、 P P C活性と C S活性が増幅された菌株を調製するために使 用される宿主としては、 ェシ Xリヒア属に属し、 バリン感受性が付与さ れた変異株またはェシヱリヒア属に属し、 バリン耐性を有する野生株も しくはその変異株が用いられる。 このような宿主の具体的な例としては. 次の様な株が挙げられる。
ェシエ リ ヒア · コ リ Β 1 1
ェシエ リ ヒア · コ リ Κ— 1 2 (A T C C 1 0 7 9 8 )
ェシエ リ ヒア · コ リ B (A T C C 1 1 3 0 3 )
ェシエ リ ヒア ' ] UW (A T C C 9 6 3 7 )
P P C活性と C S活性を増幅するには、 P P C及び C Sをコードする 遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、 得られた組み換えべク ターを用いて上記宿主を形質転換すればよい。 形質転換株の細胞内の P P C及び C Sをコードする遺伝子 （以下、 それぞれ p p c遺伝子及び g I t A遺伝子と略する） のコピー数が上昇する結果、 P P C活性及び C S活性が増幅される。 なお、 ベクターとはプラスミ ドベクター、 ファー ジベクター、 トランスポゾンベクター等がある。 P p c遺伝子及び g I t A遺伝子は、 それぞれ P P C活性及び C S活 性を欠失した変異株を用いて、 その栄養要求性を相補する遺伝子を単離 することによって取得できる。 また、 ェシ Iリヒア · コリのこれらの遺 伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから （ J. B i o c h e m. 、 第 9 5巻、 9 0 9〜 9 1 6頁、 1 9 8 4年： B i o c h e m i s t r y、 第 2 2巻、 5 2 4 3〜 5 2 4 9頁、 1 9 8 3年） 、 それぞれの 塩基配列に基づいてプライマーを合成し、 染色体 D N Aを铸型にして P C R法により取得することが可能である。
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミ ドとしては、 ェシェリア 属細菌において複製可能なものであればよく、 具体的には、 p B R 3 2 2、 p TWV 2 2 8、 p MW 1 1 9、 p U C 1 9等が挙げられる。
P p c遺伝子及び g I t A遺伝子は、 一種類のベクター上にクローン 化されて宿主となる上記出発親株に導入されるか、 または共存可能な二 種類のベクター上に別々にクローン化されて宿主菌株に導入される。
P P C活性及び C S活性の増幅は、 p p c遺伝子及び g I t A遺伝子 をプラスミ ドベクターに連結してプラスミ ドの形で細胞内に維持させて 達成できる。 あるいは同遺伝子を上記宿主の染色体 D N A上に多コピー 存在させることによつても達成できる。 ェシ： ϋリヒア属に属する微生物 の染色体 D N Α上に p p c遺伝子及び g I t A遺伝子を多コピーで導入 するには、 染色体 D N A上に多コピー存在する配列を標的に利用して相 同組換えにより行う。 染色体 D N A上に多コピー存在する配列としては， レぺッティブ D N A、 転移因子の端部に存在するインバーティッ ド · リ ピートが利用できる。 あるいは、 特開平 2— 1 0 9 9 8 5号公報に開示 されているように、 p p c遺伝子及び g I t A遺伝子をトランスポゾン に搭載してこれを転移させて染色体 D N A上に多コピー導入することも 可能である。 いずれの方法によっても形質転換株内の P P c遺伝子及び g I t A遺伝子のコピー数が上昇する結果、 P P C活性及び C S活性が 増幅される。
P P C活性と C S活性の増幅は、 上記の遺伝子増幅による以外に、 p p c遺伝子及び g I t A遺伝子のプロモーターを強力なものに置換する ことによつても達成される。 たとえば、 l a cプロモーター、 t r pプ □モーター、 t r cプロモーター、 t a cプロモーター、 ラムダファー ジの P Rプロモーター、 P Lプロモーター等が強力なプロモーターとして 知られている。 これらのプロモーターへの置換により、 p p c遺伝子及 び g I t A遺伝子の発現が強化されることによって P P C活性及び C S 活性が増幅される。
し一グルタミン酸分解活性の低下した性質や、 マレートシン夕ーゼ ' イソシトレートリァーゼ ·イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ Z フォスファターゼ才ペロン （以下、 a c eオペ口ンと略す） の発現が構 成的になった性質を併せ持たせることにより Lーグルタミン酸の生産性 が向上することが報告されており （特開平 5— 2 4 4 9 7 0号） 、 これ らの性質を本発明の L—グル夕ミン酸生産株が併せ持つことは Lーグル タミン酸の生産性向上に有利であることは容易に予測される。
また、 従来より L一グルタミン酸生産菌の生産能向上に有効な性質と して知られている各種栄養要求性、 薬剤耐性、 薬剤感受性、 または薬剤 依存性等の性質を本発明の L一グルタミン生産株が更に併せ持つことが、 L一グル夕ミン酸生産性向上の面から有利であることはいうまでもない。
( 3 ) 本発明の菌株を用いた L一グルタミン酸の生産
ェシ： πリヒア属に属し、 パリン感受性が付与され、 かつ P P Cと C S 活性が増幅されたし一グルタミン酸生産能を有する菌株を用いて Lーグ ルタミン酸を生産させるには、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 その他必要 に応じてアミノ酸、 ビ夕ミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養 培地を用いて常法により行うことができる。 合成培地または天然培地の いずれも使用可能である。 培地に使用される炭素源及び窒素源は、 培養 する菌株の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。
炭素源としては、 グルコース、 グリセロール、 フラク トース、 シュク ロース、 マル トース、 マンノース、 ガラク 卜ース、 澱粉加水分解物、 糖 蜜等の糖類が使用され、 その他、 酢酸、 クェン酸等の有機酸等も単独あ るいは他の炭素源と併用して用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 硫酸アンモニゥム、 炭酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥ厶等のアンモ 二ゥ厶塩または硝酸塩等が使用される。
有機微量栄養素としては、 アミノ酸、 ビタミン、 脂肪酸、 核酸、 更に これらのものを含有するペプトン、 カザミノ酸、 酵母エキス、 大豆蛋白 分解物等が使用され、 生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を 使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
無機塩類としてはリン酸塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 鉄塩、 マンガン塩等が使用される。
培養方法は、 発酵温度 2 0ないし 4 5 °C、 p Hを 5ないし 9に制御し つつ通気培養を行う。 培養中に p Hが下がる場合には、 炭酸カルシウム を加えるか、 アンモニアガス等のアルカリで中和する。 かく して 1 0時 間ないし 4日間程度培養することにより培養液中に著量の L一グルタミ ン酸が蓄積される。
培養終了後の培養液からし一グルタミン酸を採取する方法は、 公知の 回収方法に従って行えばよい。 例えば、 培養液から菌体を除去した後に 濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィ一等によって採 取される。 実施例
次に、 実施例によつて本発明をさらに詳細に説明する。
( 1 ) ェシ: tリヒア · コリ Bからのバリン感受性株の分離
ェシエ リ ヒア ' コ リ B及びェシエ リヒア ' コ リ K— 1 2由来の W 3 1 1 0株の細胞懸濁液 （ 1 0 5 m I ) 5 μ I を各種濃度のバリンを含む M 9最少寒天培地 （ァ ショー 卜 コース イン バクテリアル ジエネテイクス、 コールド スプリング ハーバー ラボラ トリープレ ス、 ジ 1フリー ミラー著、 4 3 7頁、 1 9 9 2年） 上に接種し、 3 了。 Cで一晩培養し、 生育の可否を検討したところ、 ェシ: Lリヒア . コリ Bは 5 g Z I のパリンを含む M 9最少培地上で生育可能であつたのに対 して、 ェシエリヒア ' コリ W3 1 1 0は 5 0 m gZ I のバリンを含む M 9最少培地上ですら生育できなかった。 尚、 いずれの株もバリンを含ま ない M 9最少培地上では良好な生育が見られた。
そこで、 ェシエリヒア ' コリ Bから W 3 1 1 0株と同等のバリン感受 性を有する変異株の分離を以下のようにして行った。
2 Y T液体培地 （バク 卜 トリプトン 1 6 g Z I 、 バク トイーストェキ ス トラク ト 1 0 g Z I 、 N a C I 5 g Z I 、 p H 7. 2 ) にて 3 7。Cで 一晩培養したェシ xリヒア · コリ Bを再度 2 Y T液体培地に接種して 3 7 °Cにて培養し、 対数増殖期にある菌体を集菌し、 5 0 mMのリン酸 バッファー （ p H 6. 0 ) で洗浄後、 2 0 0 y g Zm l の N Gを含むリ ン酸バッファーに懸濁し、 3 7°Cで 3 0分間振とう培養した。 ついで集 菌し、 リン酸バッファーで洗浄後、 一部を 2 Y T液体培地に接種し、 3 7°Cで一晩培養し、 変異の固定を図った。 培養後の菌体を集菌後 、 リン酸バッファ一で洗浄し、 一部をバリン 1 0 0 m g Z I を含む M 9 最少液体培地に植菌し、 3 7 °Cにて 2時間培養した。 その後 2 0 0ュ ニッ ト/ m I になるようにペニシリンを添加し、 さらに一晩培養し、 バ リン感受性変異株の濃縮を行った。 次いで培養液を適当に希釈し、 生菌 数を測定した。 生菌数に基づいてレプリ力の操作に適するように培養液 を希釈し、 M 9最少寒天培地に塗布し、 3 了 °Cで一晩培養した。 出現し たコロニーをレプリ力法によりバリンを含まない M 9最少寒天培地及び 1 0 0 m g / I のバリンを含む最少寒天培地に移植し、 3 7 °Cで一晩培 養し、 バリンを含む培地で生育できないバリン感受性候補株を分離した < 得られた候補株は単コロニー分離の後、 各種濃度のバリンを含む M 9最 少寒天培地上での生育を調査し、 バリン 5 O m g Z I を含む M 9最少寒 天培地で生育できない変異株としてバリン感受性変異株 3株を分離した。 ェシ； Eリヒア ' コリ B及び得られたバリン感受性株 3株を表 1 の組成 の培地 5 m I を分注した 5 0 m I容大型試験管に接種し、 3 7 °Cにて培 地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 培養終了後、 培養液上清の Lーグルタミン酸蓄積量を旭化成工業製バイォテックアナライザ一によ リ測定した。 その結果、 ェシエリヒア · コリ B及びいずれのバリン感受 性株も培養液中に L一グルタミン酸を蓄積しなかった。 一方、 薄層クロ マ卜グラフィ一上でのニンヒ ドリン発色により、 各培養液上清中のバリ ンの生成を調べたところ、 B株ではわずかに認められたバリンのスポッ 卜がバリン感受性株では認められなかった。
分離したバリン感受性株の内の代表株をェシ Iリヒア · コリ B 1 1 と 名付け、 以下の実験に用いた。 表 1 成 分 濃 度 （ I ) グルコース 4 0
( N H4) 2S 04 2 0
K H2 P 04 1
M g S 04 · 7 H20 1
F e S 04 · 7 Η2θ 0. 0 1
M n S 04 · 5 H20 0. 0 1
酵母エキス 2
チアミン塩酸塩 0. 0 1
C a C 03 2 0
( 2 ) ェシエリヒア · コリ W3 1 1 0の g I t A遺伝子のクローニング ェシヱリヒア · コリ K— 1 2の g I t A遺伝子の塩基配列は既に明ら 力、にされている （ B i o c h e m i s t r y、 第 2 2巻、 5 2 4 3〜 5 2 4 9頁、 1 9 8 3年） 。 報告されている塩基配列に基づいて配列表配 列番号 1及び 2に示すプライマーを合成し、 ェシヱリヒア ' コリ W3 1 1 0の染色体 D N Aを錶型にして P C R法により g I t A遺伝子を増幅 した。
合成したプライマ一の内、 配列番号 1 は、 B i o c h e m i s t r y 第 2 2巻、 5 2 4 6頁、 1 9 8 3年に記載されている g I t A遺伝子の 塩基配列図の一 3 4 2番目から— 3 2 3番目の塩基に至る配列に相当す るが、 — 3 3 1番目の塩基 Gを Cに変更し、 制限酵素 P s t I の認識配 列を揷入している。 配列番号 2は、 B i o c h e m i s t r y、 第 2 2 巻、 5 2 4 7頁、 1 9 8 3年に記載されている g I t A遺伝子の塩基配 列図の 2 0 6 0番目から 2 0 7 9番目の塩基に至る配列に相当するが、 2 0 7 0番目の塩基 Aを Gに変更し、 制限酵素 E c 0 R I の認識配列を 揷入した。 尚、 配列番号 2に記載した塩基配列は、 B i o c h e m i s t r y、 第 2 2巻、 5 2 4了頁、 1 9 8 3年に示された 2 0 6 0番目か ら 2 0 7 9番目に至る塩基配列の逆ストランドを 5' 側から表記したも のである。
ェシ 1リヒア ' コリ W3 1 1 0株の染色体 D N Aの調製は常法によつ た （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 9 7〜 9 8頁、 培風館、 1 9
9 2年） 。 また、 P C R反応は、 P C Rテクノロジー （ヘンリーエー リッヒ編、 ストック トンプレス、 1 9 8 9年） 8頁に記載されている標 準反応条件を用いた。
生成した P C R産物を常法により精製後、 制限酵素 P s t I と E c o R I を反応させ、 ライゲーシヨンキッ 卜 （宝酒造製） を用いて P s t I と E c o R I で切断した p TWV 2 2 8 (宝酒造製） と連結した後、 ェ シエリ ヒア ' コ リ J M 1 0 9のコンビテン 卜セル （宝酒造製） を用いて 形質転換を行い、 I P T G (イソプロピル一 β— D—チォガラク トビラ ノシド） 1 0 y gノ m l 、 X— G a l ( 5—ブロモ一 4—クロ□— 3— インドリル一 β— D—ガラク トシ ド） 4 0 μ g m I 及びアンピシリン
1 0 0 μ g /m I を含む L培地 （バク 卜 卜リプトン 1 0 g I 、 バク ト イーストエキストラク ト 5 g Z し 3 0 1 5 9ノ 1 、 寒天 1 5 9 1 p H 7. 2 ) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上 げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 1 0 5頁、 培風館、 1 9 9 2年） を用いてプラスミ ドを調製した後、 べク ターに挿入された D N A断片の制限酵素地図を作成し、 報告されている 9 I t A遺伝子の制限酵素地図と比較し、 同一制限酵素地図を有する D N A断片が揷入されているプラスミ ドを p TWV Cと名づけた。
さらに g I t A遺伝子が発現していることを確認するため、 p TWV Cを塩化ルビジウム法 （最新農学実験の基礎、 東北大学農学部農学科編、 ソフ トサイエンス社、 1 5 7頁、 1 9 9 0年） により調製した g I t A 欠損株 M E 8 3 3 0 ( g l t A 6、 f u r : ： T n 5、 g a I Κ 3 0 p y r D 3 6、 r e I A r p s L 1 2 9、 t h i — 1 、 s u p E 4 4、 λ-) のコンビテントセルに導入 し、 得られた形質転換株の栄養要 求性を確認し、 p TWV Cが Μ Ε 8 3 3 0株の g I t A 6を相補するこ とを確認した。 M E 8 3 3 0株は、 国立遺伝学研究所遺伝実験生物保存 研究センターから入手したもので、 g I t A欠損によりし一グルタミン 酸要求性を示し、 チアミン、 ゥラシルと L一グルタミン酸を添加した M 9最少培地上で生育できる。
W3 1 1 0 , g i t A欠損株 M E 8 3 3 0、 及び p TWV Cを保持す る M E 8 3 3 0株の C S活性を W e i t z m a n等の方法 （M e t h o d s i n E n z y m o l o g y、 第 1 3巻、 2 2〜 2 6頁、 1 9 6 9年） により測定した。 その結果、 表 2に示すように、 M E 8 3 3 0株 では C S活性は全く認められず、 一方 p TWV Cを保持する M E 8 3 3 0株では野生株 W 3 1 1 0株の約 4倍の C S活性を示すことが確認され 表 2 囷 株 C S活性 （units/mg蛋白質）
W3 1 1 0 0. 6 9
M E 8 3 3 0 0
M E 8 3 3 0/p TWV C 2. 7 1
( 3 ) p p c遺伝子及び g I t A遺伝子を有するプラスミ ドの作成 P P c遺伝子及び g I t A遺伝子を有するプラスミ ド p MWC Pの構 築過程を図 1 に示した。
まず、 p B R 3 22の S a l Iサイ 卜にェシエリヒア · コリ K一 1 2 に由来する p P c遺伝子の全領域を含む 4. 4 K bの S a l I断片が揷 入されたプラスミ ド p S 2 (J. B i o c h e m. 、 第 9 5卷、 90 9 一 9 1 6頁、 1 9 84年） を S a l Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳 動により p p c遺伝子を含む 4. 4 K bの S a I I断片を分離し、 pM W 1 1 9 (二ツボンジーン製） の S a I Iサイ 卜に挿入した。 本プラス ミ ドを p MWPと名付けた。 一方、 g I t A遺伝子を有する D N A断片 が揷入されている p TWV Cを P s t I で消化し、 T 4 D N Aポリメ ラーゼで両末端を平滑末端にし、 さらに E c o R Iで消化した。 このよ うにして得られた D N A断片と S m a l 、 E c o R Iで消化した p MW Pを混合し、 ライゲーシヨン反応に供した。 ライゲージヨン反応後の D N Aサンプルを用いて M E 8 3 3 0株を形質転換し、 アンピシリン耐性 でし一グルタミン酸要求性を消失した形質転換株を分離した。 この株よ リプラスミ ドを調製し、 再度 M E 8 3 3 0株を形質転換し、 し—グル夕 ミン酸要求性の消失を確認した。 さらに制限酵素地図を作成し、 本ブラ スミ ド上に p p c遺伝子、 g I t A遺伝子が存在することを確認し、 本 プラスミ ドを p MWC Pと名付けた。 形質転換方法は塩化ルビジウム法 用いに o
( 4 ) ェシ： E リ ヒア ' コリ B及びバリン感受性変異株 B 1 1 への p MW C Pの導入と培養評価
ェシ: Eリヒア · コリ B株及びそのバリン感受性 B 1 1株を塩化ルビジ ゥ厶法によりプラスミ ド p MWC Pで形質転換し、 それぞれ独立に得ら れた形質転換株 3株をそれぞれ表 1 の組成の培地 5 m I を注入した 5 0 m I容大型試験管に接種して、 3 7°Cにて培地中の糖が消費されるまで 振とう培養した。 また、 B 1 1株に p MW 1 1 9に p p c遺伝子のみが クローン化されているブラズミ ド p MWP、 または p TWV Cから調製 した g I t A遺伝子を含む P s t I — E c o R I 断片を p MW 1 1 9の P s t lサイ トと E c o R Iサイ 卜の間に連結したプラスミ ド p MWC を導入して得た形質転換株についても同様に培養した。 尚、 形質転換株 の培養に際しては、 プラスミ ドを安定に保持させるため、 アンピシリン を 1 0 0 μ g Zm I の濃度で添加した。
培養終了後、 培養液中に蓄積した L一グルタミン酸を測定した結果を 表 3に示す。 形質転換株の培養結果は 3株の平均値を示した。 バリン耐 性を示すェシ Xリヒア · コリ Bを宿主として C S活性と P P C活性を増 幅した株では L一グルタミン酸の蓄積が見られなかったのに対して、 バ リン感受性である B 1 1株を宿主として C S活性と P P C活性を増幅し た場合には、 著量の L—グルタミン酸の蓄積が見られた。 また、 B 1 1 株に p MWPを導入し P E P C活性のみを増幅した株ではし—グルタミ ン酸の蓄積が全く見られず、 一方、 B 1 1株に p MWCを導入し C S活 性のみを増幅した株ではし—グルタミン酸の蓄積が見られたが、 その蓄 積暈は C S活性と P E P C活性を同時に増幅した場合に及ばず、 培養結 果にバラツキが見られ、 安定した結果が得られなかった, 表 3 菌 株 宿主の形質 L -ク"ルタミン酸蓄積量
( g/L)
B / p MWC P バリン耐性 0 B 1 1 / p MWC P バリン感受性 9. 8 B 1 1 / p MWP バリン感受性 0 B 1 1 / p WC バリン感受性 3. 6 以上の結果から、 ェシヱリヒア · コリ Bのようにバリン耐性を示す野 生株から L一グルタミン酸生産菌を育種するには、 バリン感受性変異と C S活性及び P P C活性の増幅を組み合わせることが必須であることが 判明した。 g I t A遺伝子と p p c遺伝子を有するプラスミ ド p MWC Pを B 1 1株に導入した株を A J 1 3 1 3 8と命名した。
ェシ； nリヒア ' コリ B由来のバリン感受性変異株 B 1 1 は、 寄託した A J 1 3 1 3 8株より宿主細胞を損なうことなく宿主細胞中のプラスミ ドを除去することにより得られる。 プラスミ ドは宿主より自然に失われ ることもあるし、 除去操作によって除くこともできる （B a c t . R e v. 、 第 3 6巻、 3 6 1 — 4 0 5頁、 1 9 7 2年） 。 プラスミ ドを除去 操作により除くには、 A J 1 3 1 3 8株を Lブロス中で 4 0 °Cで一晩培 養後、 培養液を適当に希釈してアンピシリンを含有しない L培地に塗布 し、 3 7 °Cで一晚培養後、 出現したコロニーをアンピシリン 1 0 0 μ g /m I を含む L培地に移植し、 アンピシリン感受性のコロニーを分離す O 97/08294 17 る。 かく して得られる株が B 1 1株である。
( 5 ) ェシヱリヒア ' コリ K一 1 2への p MWC Pの導入と培養評価 ェシ： cリヒア * コリ\^3 1 1 0 3 1_1 0八 ： ： K m rを塩化ルビジゥ厶 法によりプラスミ ド p MWP、 p MWC及び p MWC Pで形質転換し、 それぞれ独立に得られた形質転換株 4株ずつをそれぞれ表 4の組成の培 地 2 0 m I を注入した 5 0 0 m l容坂ロフラスコに接種して、 3 7 に て培地中の糖が消費されるまで 2 5時間振とう培養した。 尚、 形質転換 株の培養に際しては、 プラスミ ドを安定に保持させるため、 アンピシリ ンを 1 0 0 μ g /m I の濃度で添加した。 ェシエリヒア . コリ W 3 1 1 0 s u c A : : K m r は E P公開公報 0 6 7 0 3 7 0に開示される株で, s u e A遺伝子が破壊されているため α— K G D Η活性が欠損している。 表 4 成 分 濃 度 （ 9ノ I ) グルコース 2 0
( Ν Η4) 2S 04 2 0
Κ Η2Ρ 04 1
M g S 04 · 7 H20 1
F e S 04 · 7 Η2θ 0 0 1
M n S 04 · 5 Η2θ 0. 0 1
酵母エキス 2
チアミン塩酸塩 0. 0 1
C a C 03 3 培養終了後、 培養液中に蓄積した L一グルタミン酸を測定した結果を 表 5に示す。 形質転換株の培養結果は 4株の平均値を示した。 バリン感 受性であるェシエリヒア · コリ K一 1 2株由来の α— K G D Η欠損株を 宿主として C S活性と P P C活性を増幅した場合に、 著量の L一グルタ ミン酸の蓄積が見られた。 表 5
¾ 株 L -ク"ルタミン酸蓄積収率
(%)
W3 1 1 0 s u c A K m 「 4 1 . 1
W3 1 1 0 s u c A K m r / p MWP 4 2. 3
W3 1 1 0 s u c A K m r / p MWC 44. 5
W3 1 1 0 s u c A K m r / p MWC P 4 7. 3 産業上の利用可能性
本発明の方法により、 ェシ Xリヒア属に属し、 バリン耐性を示す野生 株の L一グルタミン酸生産能を高めることができ、 L—グル夕ミン酸を 安価かつ効率的に製造することができる。 ェシヱリヒア · コリ A J 1 2 6 2 4は、 平成 3年 7月 2 4日付で工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 郵 便番号 3 0 5 ) に受託番号 F E RM P— 1 2 3 7 9として寄託されて いる。 本株は平成 4年 5月 1 5日付けでブ夕ぺス卜条約に基づく国際寄 託に移管されており、 受託番号 F E RM B P— 3 8 5 3が付与されて いる。
ェシ: Lリヒア ' コリ A J 2 6 2 8は、 平成 3年 7月 2 4日付で工業技 術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 郵便 番号 3 0 5 ) に受託番号 F E RM P— 1 2 3 8 0として寄託されてい る。 本株は平成 4年 5月 1 5日付けでブタぺス卜条約に基づく国際寄託 に移管されており、 受託番号 F E RM B P— 3 8 5 4が付与されてい ェシ Iリヒア ' コリ A J 1 3 1 3 8は、 平成 7年 8月 1 7日付で工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 郵 便番号 3 0 5 ) に受託番号 F E RM P— 1 5 1 1 5として寄託されて いる。 本株は平成 8年 6月 7日付けでブタぺスト条約に基づく国際寄託 に移管されており、 受託番号 F E RM B P— 5 5 6 5が付与されてい る 配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列の特徴： ェシ iリヒア · コリ g I t A遺伝子増幅用プライマー 配列
TCTGTTACCT GCAGACGTCG 20 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鑛
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列の特徴： ェシヱリヒア ' コリ g I t A遺伝子増幅用プライマー 配列
AAGTGAATTC CGCCAGAACC 20

Claims

請求の範囲
1 . ェシヱリヒア属に属し、 バリン感受性を示し、 クェン酸シンター ゼ活性及びフォスフォェノールピルべ一卜力ルボキシラーゼ活性が増幅 され、 かっし—グルタミン酸生産能を有する菌株。
2 . α—ケトグルタル酸デヒ ドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下し ている請求の範囲第 1項記載の菌株
3 . ェシ: πリヒア · コリに属する請求の範囲弟 1項又は第 2項記載の
¾株
4 . ェシ： I：リヒア · コリ Β株に属する請求の範囲第 3項記載の菌株。
5 . ェヒヱリヒア · コリ Κ一 1 2株に属する請求の範囲第 3項記載の 囷株。
6 . 請求の範囲弟 1項ないし第 5項記載の菌株を液体培地に培養し， 培養液中に L一グルタミン酸を生成蓄積せしめ、 これを採取することを 特徴とする発酵法による L一グルタミン酸の製造法。
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