RU2207376C2 - Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) - Google Patents
Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2207376C2 RU2207376C2 RU99121636/13A RU99121636A RU2207376C2 RU 2207376 C2 RU2207376 C2 RU 2207376C2 RU 99121636/13 A RU99121636/13 A RU 99121636/13A RU 99121636 A RU99121636 A RU 99121636A RU 2207376 C2 RU2207376 C2 RU 2207376C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- gene
- amino acids
- amino acid
- rusa
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 44
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 40
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 34
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 29
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims abstract description 16
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims abstract description 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 49
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 19
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000017304 Ruaghas Nutrition 0.000 description 36
- 241000554738 Rusa Species 0.000 description 36
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 26
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 101150061612 rus gene Proteins 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 15
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 101150107375 rusA gene Proteins 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 101100032149 Bacillus subtilis (strain 168) pyc gene Proteins 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 4
- ACIOXMJZEFKYHZ-BXKDBHETSA-N (6r,7r)-7-amino-8-oxo-3-(pyridin-1-ium-1-ylmethyl)-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)N)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 ACIOXMJZEFKYHZ-BXKDBHETSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- -1 glucose and sucrose Chemical class 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 101150016257 pycA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 2
- 101100355997 Bacillus subtilis (strain 168) recA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100033691 Bacillus subtilis (strain 168) resE gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 101100301301 Escherichia coli (strain K12) recE gene Proteins 0.000 description 2
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 2
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynorvaline Chemical compound CCC(O)C(N)C(O)=O LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 1
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 101150019588 resE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150118377 tet gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. L-Аминокислоты, такие как L-треонин, L-гомосерин, L-метионин, L-аргинин, L-пролин, L-изолейцин или L-глутаминовая кислота, получают культивированием бактерии Escherichia coli, трансформированной геном, кодирующим пируваткарбоксилазу. Причем E. coli обладает способностью к продукции L-аминокислот. После накопления L-аминокислот их извлекают из питательной среды. Штамм бактерии E. coli MG 442 или 44 трансформируют плазмидой, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу. В первом случае штамм продуцирует L-треонин и L-глутаминовую кислоту, в последнем - L-гомосерин. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 3 с. и 2 з.п.ф-лы, 3 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот, а именно к способу получения L-треонина, L-глутаминовой кислоты, L-гомосерина, L-метионина, L-аргинина, L-пролина или L-изолейцина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.
Такие L-аминокислоты, как L-треонин и L-глутаминовая кислота, обычно производятся методамии ферментации с использованием преимущественно кориноформных бактерий, принадлежащих роду Brevibacterium, Corynebacterium и Microbacterium или их мутантным разновидностям ("Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, p. 195-215, 1986).
С другой стороны, известен метод выведения бактерий, производящих L-аминокислоты и принадлежащих роду Escherichia, с помощью техники генетической рекомбинации.
Например, был открыт метод получения L-лизина с помощью Escherichia coli, в которой гены, кодирующие дигидродипико-линатсинтетазу и аспартокиназу, утратили чувствительность к ингибированию по типу отрицательной обратной связи L-лизином и L-треонином, а гены, кодирующие диаминопимелатдегидрогеназу (или тетрагидродипиколинатсукцинилазу и сукцинилдиаминопимелатдеацилазу), обладали повышенной активностью (WO 95/16042).
Хотя продукция L-аминокислот была значительно усовершенствована выведением микроорганизмов, указанных выше, или улучшением процессов производства, необходимо разрабатывать более эффективные процессы получения L-аминокислот, чтобы удовлетворить ожидаемое в будущем существенное повышение спроса на аминокислоты.
Пируваткарбоксилаза [пируват: диоксид углерода лигаза (ADP-образующая), ЕС 6.4.1.1] является ферментом, содержащим биотин. Она катализирует карбоксилирование пирувата с образованием оксалоацетата. Пируваткарбоксилаза из Escherichia coli неизвестна, но Brevibacterium (Diesterhaft M.D. and Freese E. , J. Biol. Chem. , 248, No. 17, p. 6062-6070 (1973)) и Corynebacterium (Peters-Wendish P.G. et al., Microbiology, 144, p. 915-927 (1988)) содержат пируваткарбоксилазу, и нуклиотидная последовательность генов, кодирующих этот фермент, была опубликована.
Кроме того, известны штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых активность пируваткарбоксилазы увеличена, или штаммы Corynebacterium glutamicum, ген пируваткарбоксилазы которых инактивирован (Peters-Wendish, P.G. et al., Microbiology, 144, p. 915-927 (1988)). Однако эти микроорганизмы были созданы в качестве экспериментальных образцов для изучения ферментов, необходимых для роста на среде с глюкозой. Связь между активностью пируваткарбоксилазы и продукцией L-аминокислот была неизвестна. Также неизвестны попытки введения гена пируваткарбоксилазы в бактерии, принадлежащие роду Escherichia.
Настоящее изобретение выполнено на основе вышеупомянутых фактов, и его целью является разработка способа получения L-аминокислот, а именно L-треонина, L-глутаминовой кислоты, L-гомосерина, L-метионина, L-аргинина, L-пролина, L-изолейцина, с высокой степенью эффективности.
В результате кропотливого исследования с целью достижения указанной выше цели авторами настоящего изобретения было установлено, что введение гена, кодирующего пируваткарбоксилазу (здесь и далее упоминающегося как "ген рус"), в бактерию, принадлежащую роду Escherichia, может усилить продукцию бактерией L-аминокислот. Таким образом было совершено настоящее изобретение.
То есть предметом настоящего изобретения является бактерия, принадлежащая роду Escherichia, трансформированная с помощью гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, и обладающая способностью продукции L-аминокислот.
В настоящем изобретении также представлена бактерия, описанная выше, в которой ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, получен из бактерии, принадлежащей роду Bacillus.
Далее, в настоящем изобретении предложена бактерия, описанная выше, в которой ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, введен в названную бактерию в малом числе копий.
Более того, в настоящем изобретении предложена бактерия, описанная выше, в которой L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-глутаминовой кислоты, L-гомосерина, L-метионина, L-аргинина, L-пролина и L-изолейцина.
Также в настоящем изобретении предложен способ получения L-аминокислот, включающий в себя культивирование указанной выше бактерии в среде, производство и накопление в среде L-аминокислот и выделение L-аминокислот из среды.
Далее, в настоящем изобретении представлен способ получения L-аминокислот, описанный выше, в котором L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-глутаминовой кислоты, L-гомосерина, L-метионина, L-аргинина, L-пролина и L-изолейцина.
Термин "продукция L-аминокислот" означает способность бактерии продуцировать и накапливать L-аминокислоту в среде в количестве, большем, чем у дикого штамма этого типа.
В соответствии с настоящим изобретением продукция L-аминокислоты, такой как L-треонин, L-глутаминовая кислота, L-гомосерин, L-метионин, L-аргинин, L-пролин или L-изолейцин, бактерией, принадлежащих к роду Escherichia, может быть улучшена. Более того, настоящее изобретение может быть использовано для выведения продуцентов L-аминокислот, принадлежащих роду Escherichia.
На фиг. 1 показана схема получения штамма-реципиента Bacillus subtilis pycA::KmR для клонирования гена русА.
На фиг.2 показана схема русА из Bacillus subtilis 168.
На фиг.3 показана схема конструирования плазмиды, содержащей ген русА.
Далее настоящее изобретение будет описано подробнее.
<1> Бактерия, принадлежащая роду Escherichia, трансформированная с помощью гена рус.
Бактерия, принадлежащая роду Escherichia, согласно настоящему изобретению является бактерией, трансформированной с помощью гена рус. Примером бактерии, принадлежащей роду Escherichia, является Escherichia coli. Хотя ген рус, используемый в настоящем изобретении, не ограничивается тем условием, что он может кодировать белок с активностью пируват-карбоксилаэы, примерам гена рус может служить ген рус, полученный из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, или ген рус из коринеподобных бактерий. Была опубликована нуклеотидная последовательность гена рус, полученного из Bacillus subtilis, (Genbank/EMBL/DDBJ Accession, Z97025, NID g2224758) и гена рус из Corynebacterium Glutamicum (Peters-Wendish P. G. et al., Microbiology, 144, p. 915-927 (1988)). Поэтому ген рус может быть получен с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции: White T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с применением праймеров (затравок), синтезированных в соответствии с нуклеотидной последовательностью, и с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК бактерии, принадлежащей роду Bacillus, такой как Bacillus subtilis, или бактерии соrуnеform, такой как Corynebacterium Glutamicum.
Штамм Escherichia coli 44/pmMW119-pycA, в котором присутствует pMW119-pycA, содержащий ген рус Bacillus subtilis был депонирован в Российской национальной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ВНИИГенетика; Дорожный проезд, 1, 113545, Москва, Россия, под регистрационным номером ВКПМ В-7822.
Штамм Escherichia coli MG442/pmMW119-pycA, в котором присутствует pMW119-pycA, содержащий ген рус Bacillus subtilis, был депонирован в Российской национальной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ВНИИГенетика; Дорожный проезд, 1, 113545, Москва, Россия, под регистрационным номером ВКПМ В-7821.
В этой связи ген, кодирующий пируваткарбоксилазу из Bacillus subtilis (ген русА), был клонирован, как это описано ниже, в процессе выполнения настоящего изобретения.
Сначала был сконструирован штамм Bacillus subtilis, дефицитный по гену русА. Затем, с использованием этого штамма в качестве реципиента, ген русА был клонирован посредством выделения фрагмента ДНК, который способствовал восстановлению ауксотрофности штамма по аспартату или цитрату, из библиотеки геномной ДНК штамма Bacillus subtilis дикого типа. После того как Bacillus subtilis образует оксалоацетат с помощью пируваткарбоксилазы, Bacillus subtilis не может расти на минимальной среде, если у нее наблюдается дефицит активности этого фермента. Однако рост восстанавливается при добавлении L-аспартата, L-глутамата, цитрата или сукцината. Нуклеотидная последовательность гена русА и аминокислотная последовательность, кодированные геном, показаны в SEQ ID Nos:3 и 4.
Штамм, дефицитный по гену русА, может быть получен, например, как описано ниже. Частичный фрагмент ДНК гена ylaP, расположенный на хромосоме сразу после гена русА, был получен с помощью ПЦР. В качестве затравок для ПЦР могут быть использованы олигонуклеотиды, например SEQ ID Nos:1 и 2. Затем штамм Bacillus subtilis дикого типа был трансформирован с помощью ДНК-плазмиды, содержащей полученный ДНК и маркерный ген, с последующей интеграцией ДНК-плазмиды в ген ylaP в составе хромосомной ДНК методом гомологичной рекомбинации. Затем, с помощью фермента рестрикции, например, такого как PstI, узнающего рестрикционный сайт внутри гена русА, была сконструирована библиотека хромосомной ДНК полученного штамма. Рекомбинантная плазмида, содержащая маркерный ген и частичный фрагмент гена русА, может быть получена трансформацией штамма Bacillus subtilis дикого типа с помощью библиотеки и последующим отбором клонов, экспрессирующих маркерный ген. Затем штамм Bacillus subtilis дикого типа был трансформирован линеаризованной рекомбинантной плазмидой, и клоны, экспрессирующие маркерный ген, были отобраны для получения дефицитного по гену русА штамма, в котором ДНК-плазмида интегрирована в ген русА в хромосомной ДНК этого штамма.
Трансформация бактерии, принадлежащей роду Escherichia, геном рус может быть произведена путем введения гена рус, в подходящий вектор, который функционирует в бактерии, принадлежащей роду Escherichia, чтобы сконструировать рекомбинантный вектор, и введения этого рекомбинантного вектора в бактерию, принадлежащую роду Escherichia.
В качестве примера вектора может служить плазмида pBR322, pMW118, pMW119, pUC18, pUC19 или подобная, фаговый вектор, такой как λ, λ, М13mр9 или подобный, и транспозон, такой как Мu, Тn10, Тn 5 или подобный. Однако в настоящем изобретении плазмида с малым числом копий, такая как pMW118 или pMW119, предпочтительна в виду того, что бактерия, трансформируемая вектором, может быть нестабильной, если в качестве вектора для введения гена русА используется плазмида с высоким числом копий.
Введение ДНК в бактерию рода Escherichia может быть произведено, например, по методу D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, h. 326 (1979)) или по методу, в котором бактериальные клетки, включающие ДНК, для увеличения их проницаемости для ДНК обрабатываются хлоридом кальция (Mandel M. and Higa A. , J. Mol. Biol., 53, p. 159 (1970)) или другим сходным способом.
Приготовление геномной ДНК, конструирование библиотеки геномной ДНК, гибридизация, ПЦР, приготовление ДНК-плазмиды, разрезание и лигирование ДНК, трансформация и тому подобное могут быть произведены любым способом, известным специалисту, имеющему навыки и опыт работы в этой области. Такие способы описаны Sambrook J., Frritsche E.F., Maniatis T. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)).
Продукция L-аминокислот бактерией рода Escherichia может быть улучшена путем придания или усиления активности пируваткарбоксилазы в бактерии путем трансформации этой бактерии геном рус. Это происходит, вероятно, из-за того, что щавелевоуксусная кислота образуется не только из фосфоенолпировиноградной кислоты, но также из пировиноградной кислоты. А именно, транспорт молекулы глюкозы (или сахарозы) в бактериальную клетку, опосредованный системой фосфоенолпировиноградной кислоты, протекает с расходованием одной молекулы фосфоенолпировиноградной кислоты и образованием одной молекулы пировиноградной кислоты. И хотя образовавшаяся пировиноградная кислота не участвует напрямую в синтезе L-аминокислот в бактериальной клетке, продукция L-аминокислот может быть повышена вследствие образования щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной кислоты.
В качестве бактерии, принадлежащей роду Escherichia, в которую ген рус должен быть введен, для производства L-аминокислот использован штамм, уже обладающий этим свойствам. Или же способность к продукции L-аминокислот бактерией рода Escherichia может быть придана в результате ее трансформации геном рус. Кстати ген рус из Escherichia coli неизвестен, однако, если этот ген будет найден в дальнейшем, он также может быть использован.
Примеры бактерий, принадлежащих роду Escherichia и производящих L-аминокислоты, описаны ниже.
(1) Бактерии, продуцирующие L-треонин.
Примером бактерий, продуцирукщих L-треонин, принадлежащих роду Escherichia, может служить штамм MG442 (был депонирован в Российской национальной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ВНИИГенетика; Дорожный проезд, 1, 113545, Москва, Россия, под регистрационным номером ВКПМ B-1628 (VKPM B-1628) (USP 4, 278, 765; Гусятинер М.М. и др., Генетика, 14, с. 947-956, (1978)). Штамм MG442 был получен как мутант, устойчивый к 2-амино-3-гидроксивалериановой кислоте - аналогу L-треонина. Этот штамм также был неполным (leaky type) ауксотрофом по изолейцину. Он продуцировал L-треонин и L-глутамат в качестве побочных продуктов.
В качестве альтернативы штамм MG442, трансформированный pVC40 (USP 5, 175, 107), предпочтительно может быть использован в качестве штамма, продуцирующего L-треонин.
(2) Бактерии, продуцирующие L-гомосерин.
Примером бактерий, продуцирующих L-гомосерин, принадлежащих роду Escherichia, может служить штамм 44 (thrB). Этот штамм был получен из известного ранее штамма С600 (thrB, leuB) (Appleyard R.K., Genetics, 39, р. 440-452) как Leu+-peвертант. Штамм 44, трансформированный с помощью плазмиды, содержащей ген thrA, кодирукший аспартаткиназу - гомосериндегидрогеназу I, может быть предпочтительно использован.
Штамм Escherichia coli 44 был депонирован в Российской национальной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ВНИИГенетика; Дорожный проезд, 1, 113545, Москва, Россия, под регистрационным номером ВКПМ В-2175.
(3) Бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту.
Примером бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, принадлежащих роду Escherichia, может служить штамм, устойчивый к L-валину, например штаммы Escherichia coli B11, K-12 (АТСС10798), В (АТСС11303) и W (ATCC9637).
(4) Бактерии, продуцирующие L-изолейцин.
Примером бактерий, продуцирующих L-изолейцин, принадлежащих роду Escherichia, может служить штамм TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi К. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), p. 672-679 (1999) или AJ12919, описанный в ЕРО 685555Al.
<2> Способ получения L-аминокислот.
Продуцирование L-аминокислот может происходить с высокой эффективностью при культивировании бактерии, принадлежащей роду Escherichia, трансформированной геном рус, как это описано выше, и обладающей способностью к продукции L-аминокислот в соответствующей питательной среде, при продуцировании и накоплении L-аминокислот в питательной среде и сборе L-аминокислот из питательной среды.
Примером L-аминокислот может служить L-треонин, L-глутаминовая кислота, L-гомосерин, L-метионин, L-аргинин, L-пролин и L-изолейцин. L-Аминокислоты могут производиться с помощью способа согласно настоящему изобретению как по отдельности, так и в смеси из двух и более аминокислот разного вида.
В способе согласно изобретению выращивание бактерии, принадлежащей роду Escherichia, накопление, выделение L-аминокислот из жидкой питательной среды и их очистка могут быть произведены способом, сходным с общепринятыми способами получения аминокислот методом ферментации с использованием бактерий. Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как искусственной, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода и азота, минеральные вещества и, если необходимо, питательные вещества, требующиеся для роста бактерий в соответствующем количестве. В качестве источников углерода могут быть использованы различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от усваивающей способности используемой бактерии может быть использован спирт, такой как этанол, и глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие источники азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментализат микробной биомассы. В качестве минеральных веществ могут быть использованы фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция.
Выращивание осуществляют предпочтительно в аэробных условиях, таких как качалочная культура, а также при аэрации и перемешивании. Температура культуры обычно устанавливается в интервале от 20 до 40oС, предпочтительно в интервале от 30 до 38oС. рН среды обычно устанавливается в интервале от 5 до 9, предпочтительно в интервале от 6,5 до 7,2. рН культуральной среды может быть отрегулирован с помощью аммония, карбоната кальция, различных кислот, оснований и буферов. Обычно культивирование в течение 1-3 суток приводит к накоплению целевых L-аминокислот в питательной среде.
Сбор и очистка L-аминокислоты после культивирования могут быть произведены путем удаления из среды нерастворимых компонентов, таких как клетки, путем центрифугирования или фильтрации через мембрану с последующей очисткой на ионообменнике, концентрированием и кристаллизацией.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение будет более подробно проиллюстрировано ниже со ссылкой на примеры.
Настоящее изобретение будет более подробно проиллюстрировано ниже со ссылкой на примеры.
Пример 1. Клонирование гена русА штамма Bacillus subtilis 168.
<1> Конструирование штамма реципиента В. subtilis pycA::KmR для клонирования.
Штамм реципиент В. subtilis был сконструирован при помощи инсерционного мутагенеза гена русА. Фрагмент гена русА был клонирован в две стадии (см. фиг.1 и 2).
Одна из рамок считывания (ylaP) в базе данных проекта определения последовательности генома Bacillus subtilis была охарактеризована как ген русА, кодирующий пируваткарбоксилазу. Область, расположенная сразу после терминатора гена русА, была получена с помощью ПЦР с использованием следующей пары олигонуклеотидов: 5'-GATATAAGGGGACTTCAGAG и
5'-GGCGCXXXATGCGXXXCAATC.
5'-GGCGCXXXATGCGXXXCAATC.
Концы полученного фрагмента ДНК длиной 269 п.н. были затуплены с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, и фрагмент клонирован в сайт ScaI плазмиды pBR322 штамма Е. coli. Полученная плазмида pBRPYCA11 была подвержена перевариванию под действием Clal и лигирована с фрагментом ДНК длиной 1628 п. н. , содержащим ген cat, полученным после переваривания плазмиды рС194 с помощью ClaI. Затем штамм Bacillus subtilis 168 trpC2 был трансформирован полученной плазмидой pBRYCA11CmR3, и клоны CmR были отобраны. Плазмида pBRYCA11CmR3 не может самопроизвольно воспроизводиться при клеточном делении бактерии, принадлежащей роду Bacillus, но может встраиваться в хромосому рядом с геном русА ввиду гомологии с фрагментом ДНК длиной 269 п.н. Штамм был назван В. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3. Интегрант содержал репликон pBR322, обусловливающий устойчивость к тетрациклину ген tet, полученный из pBR322, и маркер СmR.
Хромосомная ДНК штамма В. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3 была выделена и использована для клонирования дистальной части гена русА. Обработанная с помощью PstI хромосомная ДНК была самолигирована и трансформирована в штамм Е. coli TG1. Затем были отобраны клоны с рекомбинантными плазмидами, устойчивые к тетрациклину и хлорамфениколу. Из одного клона была выделена плазмида и названа pPYCl. Плазмида pPYCl содержала единственный сайт, подверженный рестриктазе BglII, расположенный внутри гена русА. Этот сайт был использован для включения фрагмента ДНК длиной 1818 п.н., содержащего маркер устойчивости В. subtilis к канамицину. Для получения плазмиды pPYCl::KmR плазмида pPYCl была обработана рестриктазой BglII и лигирована с pUC7KmR, предварительно обработанной рестриктазой BamHI.
Инактивация гена русА в штамме дикого типа В. subtilis 168 trpC2 была произведена в одну стадию при трансформации этого штамма линеаризованной плазмидой pBYCl: : KmR с последующим отбором на бульоне Луриа (Luria) с добавлением канамицина. С помощью гомологичной рекомбинации по типу двойного кроссинговера KmR был введен в ген русА хромосомной ДНК.
Сконструированный штамм В. subtilis pycA::KmR trpC2 не был способен к росту на минимальной среде Спицайзена (Spizizen) (Anagnotopoulos С. and Spizizen J., J.Bacteriol., 81, p. 741-746 (1961)), содержащей триптофан, до тех пор пока не были добавлены цитрат или аспартат.
Состав минимальной среды Спицайзена, г/л:
К2НРO4•3Н2O - 18,3
КН2РO4 - 6,0
(NH4)2SO4 - 2,0
Цитрат натрия - 1,2
MgSO4•7H2O - 0,2
Глюкоза - 10,0
рН - 7,0
Штамм В. subtilis trpC2 русА::KmR rесЕ::TcR был сконструирован путем переноса инактивированного аллеля гена rесЕ штамма Bacillus subtilis recE:: TcR с помощью фага Е40 (фиг.2). Было необходимо инактивировать рекомбинацию в штамме-реципиенте, предназначенном для клонирования гена русА В. subtilis. Для клонирования гена русА был использован полученный штамм В. subtilis trpC2 русА::КmR rесЕ::TcR.
К2НРO4•3Н2O - 18,3
КН2РO4 - 6,0
(NH4)2SO4 - 2,0
Цитрат натрия - 1,2
MgSO4•7H2O - 0,2
Глюкоза - 10,0
рН - 7,0
Штамм В. subtilis trpC2 русА::KmR rесЕ::TcR был сконструирован путем переноса инактивированного аллеля гена rесЕ штамма Bacillus subtilis recE:: TcR с помощью фага Е40 (фиг.2). Было необходимо инактивировать рекомбинацию в штамме-реципиенте, предназначенном для клонирования гена русА В. subtilis. Для клонирования гена русА был использован полученный штамм В. subtilis trpC2 русА::КmR rесЕ::TcR.
<2> Клонирование природного гена русА В. subtilis методом комплементации.
Ген русА был клонирован из штамма В. subtilis 168 trpC2. Хромосомная ДНК, выделенная из штамма 168 trpC2, была частично переварена EcoRI и лигирована с предварительно обработанной с помощью EcoRI pCB20 (EmR) (любезно предоставленной д-ром Ю.Йомантасом, см. "Genetic transformation and expression" L.O. Butler et al eds., Intercert Ltd., PO Box 402, Wimborne, Dorset, BH229T2, UK,1989, p. 269-281 (1989)). Затем штамм trpC2 русА::KmR recE::TcR был трансформирован лигирующей смесью (фиг.2). Клоны Asp+, ЕmR, КmR были отобраны на минимальной среде Спицайзена без добавления цитрата или аспартата в присутствии триптофана, эритромицина и канамицина. Плазмида pPYCRS, присутствующая в одном из отобранных клонов, дополненных мутацией в гене русА, имела предсказанную структуру, и подтвердила тот же фенотип Asp+, EmR после вторичной трансформации.
<3> Клонирование фрагмента ДНК, содержащего ген русА штамма B. subtilis 168 trpC2, в плазмиды pUC18 и pUC19 с высоким числом копий.
Плазмида pPYCR3 была переварена рестриктазами HindII и ScaI, и полученный HindII-ScaI фрагмент длиной 4414 п.н., содержащий ген русА с 5'-концевой нетранслируемой последовательностью, включающей в себя промотор и сайт связывания рибосомы, был клонирован в плазмиду pUC18-pycA, переваренную SmaI. Таким образом была получена плазмида pUC18-pycA (фиг.3, сверху). Реакция лигирования была проведена следующим подробно описанным способом. 90 нг плазмиды pUC18, переваренной SmaI, и 300 нг очищенного методом электрофореза в агарозном геле HindII-Scal фрагмента длиной 4414 п.н., содержащего ген русА, были лигированы с помощью Т4 ДНК-лигазы (2 единицы активности) (Pharmacia, Sweden) в 45 мкл реакционной смеси, содержащей 1-кратный буфер One-Phor-All (Pharmacia, Sweden) и 1мМ АТФ.
Штамм Е. coli TG1 был трансформирован плазмидой pUC18-русА. Полученные после трансформации клоны анализировали с помощью эндонуклеаз Kpnl, Xbal, BamHI, HindIII, EcoRI. Все клоны содержали ген русА в обратной ориентации по отношению к промотору lac плазмиды pUC18. Однако гены русА, клонированные в pUC18, могут быть экспрессированы под контролем внутреннего промотора этого гена.
Далее, для того чтобы переставить ген русА под контроль промотора lac, KpnI-XbaI фрагмент pUC18-pycA был клонирован в pUC19, расщепленную с помощью KpnI и XbaI. Однако полученные клоны не были стабильными и отторгали плазмиду после небольшого (6-8 часов) промежутка времени в процессе культивирования.
<4> Клонирование фрагмента ДНК, несущего ген русА в плазмиду pMW119 с низким числом копий.
KpnI-XbaI-фрагмент pUC18-pycA был лигирован в плазмиду pMW119 с низким числом копий, предварительно расщепленную с помощью KpnI и XbaI (фиг.3, снизу). Реакция лигирования проводилась в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 60 нг pMW119, переваренной с помощью KpnI и XbaI, 120 нг KpnI-XbaI-фрагмента pUCl8-pycA, очищенного методом электрофореза в агарозном геле, 1-кратный буфер One-Phor-All (Pharmacia, Sweden), 1 мМ АТФ и Т4-ДНК-лигазу (1 единица активности) (Pharmacia, Sweden).
Штамм Е. coli TG1 был трансформирован с помощью лигирующей смеси. Полученные трансформанты анализировали с помощью SacI, KpnI, XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI. Все клоны содержали ген русА, находящийся под контролем промотора lac плазмиды pMW119 и его собственного промотора. Полученный таким образом клон был назван TG1 (pMW119-pycA). Из этого клона была получена плазмида pMW119-pycA.
Пример 2. Продукция L-треонина и L-глутаминовой кислоты.
Штамм Е. coli MG442 был трансформирован с помощью плазмиды pMW119-pycA, и 10 клонов Аmpr были отобраны. Способность этих клонов продуцировать L-треонин и L-глутаминовую кислоту была проверена в следующей ферментационной среде.
Состав ферментационной среды, г/л:
Глюкоза - 60,0
(NH4)2SO4 - 1,5
КН2РO4 - 1,5
MgSO4•7H2O - 1,0
L-Изолейцин, мг/л - 10,0
Тиамин, мг/л - 0,1
СаСО3 (стерилизованный отдельно) - 20,0
Ферментация проводилась в пробирках (20 x 300 мм) при 32oС в течение 72 часов на роторной качалке. Одна петля каждого из 10 клонов была высеяна в пробирку, содержащую 2,0 мл среды. В качестве контроля были использованы 10 отдельных колоний штамма без плазмиды. Концентрации L-треонина и L-глутаминовой кислоты после ферментации были измерены с помощью тонкослойной хроматографии. Результаты измерений приведены в таблице.
Глюкоза - 60,0
(NH4)2SO4 - 1,5
КН2РO4 - 1,5
MgSO4•7H2O - 1,0
L-Изолейцин, мг/л - 10,0
Тиамин, мг/л - 0,1
СаСО3 (стерилизованный отдельно) - 20,0
Ферментация проводилась в пробирках (20 x 300 мм) при 32oС в течение 72 часов на роторной качалке. Одна петля каждого из 10 клонов была высеяна в пробирку, содержащую 2,0 мл среды. В качестве контроля были использованы 10 отдельных колоний штамма без плазмиды. Концентрации L-треонина и L-глутаминовой кислоты после ферментации были измерены с помощью тонкослойной хроматографии. Результаты измерений приведены в таблице.
Пример 3. Продукция L-гомосерина.
L-Гомосеринпродуцирующий штамм 44 E. coli был трансформирован плазмидой pMW119-pycA, и было получено пять резистентных к ампициллину клонов. Анализ продукции L-гомосерина проводили, как указано в примере 1, но ферментационную среду при этом дополняли 0,5 г/л L-треонина. В качестве контроля использовали пять колоний штамма 44, не содержащих плазмиду. После ферментации средние концентрации L-гомосерина составляли 4,5 г/л (штамм 44) и 5,7 г/л (штамм 44 с плазмидой pMW119-pycA).
Claims (5)
1. Способ получения L-аминокислоты, где L-аминокислота представляет собой L-треонин, L-глутаминовую кислоту, L-гомосерин, L-метионин, L-аргинин, L-пролин или L-изолейцин, включающий стадии выращивания штамма бактерии Escherichia coli - продуцента L-аминокислоты, продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и извлечения L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерии Escherichia coli, трансформированный плазмидой, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, получен из штамма бактерии, принадлежащего к роду Bacillus.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, введен в штамм вышеупомянутой бактерии в малом числе копий.
4. Штамм бактерии Escherichia coli MG442 (pMW119-русА), трансформированный плазмидой, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу - продуцент L-треонина и L-глутаминовой кислоты.
5. Штамм бактерии Escherichia coli 44 (pMW119-русА), трансформированный плазмидой, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, - продуцент L-гомосерина.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99121636/13A RU2207376C2 (ru) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| JP2000302598A JP2001136991A (ja) | 1999-10-14 | 2000-10-02 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE60011974T DE60011974T2 (de) | 1999-10-14 | 2000-10-05 | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels Fermentation eines Escherichia Stammes, transformiert mit einem Pyruvat-carboxylase Gen aus Bacillus subtilis |
| EP00121763A EP1092776B1 (en) | 1999-10-14 | 2000-10-05 | Method for producing L-amino acids by fermentation of an Escherichia strain which is transformed with a pyruvate carboxylase-encoding gene from Bacilus subtilis |
| SK1511-2000A SK285997B6 (sk) | 1999-10-14 | 2000-10-11 | Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, a spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou |
| BR0004832-1A BR0004832A (pt) | 1999-10-14 | 2000-10-13 | Bacéteria pertencendo ao gênero escherichia, e, processo para produzir l-aminoácido |
| CNB001348914A CN1247783C (zh) | 1999-10-14 | 2000-10-14 | 发酵生产l－氨基酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99121636/13A RU2207376C2 (ru) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99121636A RU99121636A (ru) | 2002-05-27 |
| RU2207376C2 true RU2207376C2 (ru) | 2003-06-27 |
Family
ID=20225848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99121636/13A RU2207376C2 (ru) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1092776B1 (ru) |
| JP (1) | JP2001136991A (ru) |
| CN (1) | CN1247783C (ru) |
| BR (1) | BR0004832A (ru) |
| DE (1) | DE60011974T2 (ru) |
| RU (1) | RU2207376C2 (ru) |
| SK (1) | SK285997B6 (ru) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2288264C2 (ru) * | 2004-02-12 | 2006-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-треонина и способ получения l-треонина |
| RU2304615C2 (ru) * | 2005-10-12 | 2007-08-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia |
| US7491519B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-02-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine |
| RU2447146C2 (ru) * | 2005-07-18 | 2012-04-10 | Эвоник Дегусса Гмбх | Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин |
| WO2020096492A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Genetic Diagnostics And Therapy 21 Ltd | Dna vector for targeted gene therapy |
| RU2733426C1 (ru) * | 2018-05-28 | 2020-10-01 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или l-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы |
| RU2833333C2 (ru) * | 2021-07-26 | 2025-01-17 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизм, имеющий ДНК-связывающий регулятор транскрипции семейства LacI с ослабленной активностью, и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175351C2 (ru) * | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
| JP2006230202A (ja) * | 2003-06-23 | 2006-09-07 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| BRPI0707229B8 (pt) | 2006-01-27 | 2017-06-27 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
| WO2007086618A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| CN1986777B (zh) * | 2006-07-11 | 2010-09-08 | 湖北大学 | 活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法 |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| BRPI0816429A2 (pt) * | 2007-09-04 | 2019-09-24 | Ajinomoto Kk | microorganismo, e, método para a produção de um l-aminoácido. |
| JP2010263790A (ja) | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| RU2395579C2 (ru) | 2007-12-21 | 2010-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| CN102348806A (zh) | 2008-01-23 | 2012-02-08 | 味之素株式会社 | L-氨基酸的生产方法 |
| PE20110369A1 (es) | 2008-09-08 | 2011-06-24 | Ajinomoto Kk | Un microorganismo que produce l-aminoacido y un metodo para producir un l-aminoacido |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| PE20150681A1 (es) | 2013-05-13 | 2015-05-15 | Ajinomoto Kk | Metodo para producir l-aminoacidos |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| RU2628696C1 (ru) | 2013-10-02 | 2017-08-21 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения основной аминокислоты (варианты) |
| ES2694011T3 (es) | 2013-10-21 | 2018-12-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para producir L-aminoácido |
| BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
| JP2015156844A (ja) * | 2014-02-25 | 2015-09-03 | 花王株式会社 | 枯草菌変異株及びそれを用いたジピコリン酸の製造方法 |
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
| JP6623690B2 (ja) | 2015-10-30 | 2019-12-25 | 味の素株式会社 | グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法 |
| CN106148261B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN116583605A (zh) | 2020-10-28 | 2023-08-11 | 味之素株式会社 | L-氨基酸的制造方法 |
| US20240117393A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19831609A1 (de) * | 1997-10-04 | 1999-04-15 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU875663A1 (ru) * | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| BR9610016A (pt) * | 1995-08-23 | 1999-07-06 | Ajinomoto Kk | Microorganismo e processo para a produção do ácido l-glutâmico por fermentação |
| CN1323171C (zh) * | 1997-10-04 | 2007-06-27 | 德古萨股份公司 | 天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备方法和该方法用的添加剂 |
| AU760575C (en) * | 1998-04-13 | 2005-04-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc., The | Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells |
-
1999
- 1999-10-14 RU RU99121636/13A patent/RU2207376C2/ru active
-
2000
- 2000-10-02 JP JP2000302598A patent/JP2001136991A/ja active Pending
- 2000-10-05 EP EP00121763A patent/EP1092776B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 DE DE60011974T patent/DE60011974T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-11 SK SK1511-2000A patent/SK285997B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-10-13 BR BR0004832-1A patent/BR0004832A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-14 CN CNB001348914A patent/CN1247783C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19831609A1 (de) * | 1997-10-04 | 1999-04-15 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Biol. Chem. - 1973, vol. 248, №17, p. 6062-6070. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7491519B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-02-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterium having ability to produce L-glutamic acid, L-proline or L-arginine and method for producing L-glutamic acid, L-proline or L-arginine |
| RU2288264C2 (ru) * | 2004-02-12 | 2006-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-треонина и способ получения l-треонина |
| RU2447146C2 (ru) * | 2005-07-18 | 2012-04-10 | Эвоник Дегусса Гмбх | Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин |
| RU2304615C2 (ru) * | 2005-10-12 | 2007-08-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia |
| RU2733426C1 (ru) * | 2018-05-28 | 2020-10-01 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или l-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы |
| WO2020096492A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Genetic Diagnostics And Therapy 21 Ltd | Dna vector for targeted gene therapy |
| RU2833333C2 (ru) * | 2021-07-26 | 2025-01-17 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизм, имеющий ДНК-связывающий регулятор транскрипции семейства LacI с ослабленной активностью, и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1092776A1 (en) | 2001-04-18 |
| EP1092776B1 (en) | 2004-07-07 |
| CN1247783C (zh) | 2006-03-29 |
| SK285997B6 (sk) | 2008-01-07 |
| DE60011974T2 (de) | 2005-03-10 |
| BR0004832A (pt) | 2001-05-22 |
| JP2001136991A (ja) | 2001-05-22 |
| DE60011974D1 (de) | 2004-08-12 |
| SK15112000A3 (sk) | 2001-06-11 |
| CN1305002A (zh) | 2001-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2207376C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) | |
| RU2244007C2 (ru) | Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты) | |
| JP5486029B2 (ja) | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 | |
| RU2275424C2 (ru) | Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia | |
| JP5319489B2 (ja) | アミノ酸産生の代謝工学 | |
| EP0358940A1 (en) | DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains | |
| US20050255567A1 (en) | Mutant glutamine synthetase and method for producing amino acids | |
| RU2245919C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты, штамм escherichia coli tdh7δ mlc::cat/pprt614-продуцент l-треонина | |
| KR19990077974A (ko) | Ｌ-글루타민산을생산하는박테리아및ｌ-글루타민산을생산하는방법 | |
| KR20010032426A (ko) | 아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법 | |
| EP1792976B1 (en) | Microorganism of corynebacterium genus having enhanced L-lysine production ability and method of producing L-lysine using the same | |
| RU2305132C2 (ru) | МИКРООРГАНИЗМ С ВЫКЛЮЧЕННЫМ ГЕНОМ fadR НА ХРОМОСОМЕ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ПОСРЕДСТВОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ДАННЫМ МУТАНТОМ | |
| RU2288265C2 (ru) | Способ получения l-треонина | |
| RU2243260C2 (ru) | Способ получения l-лейцина (варианты), штамм escherichia coli 505/pacyc-tyr b - продуцент l-лейцина | |
| RU2339699C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА | |
| US7074602B2 (en) | Method for producing L-threonine | |
| RU2333950C2 (ru) | СПОСОБ ПРОДУКЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Methylophilus | |
| KR20030036146A (ko) | 발효법에 의한 ｌ-아미노산의 제조방법 | |
| RU2215785C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| MXPA06006334A (en) | L-threonine producing bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-threonine |