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WO1997046261A1 - Procede de fabrication de complexes medicamenteux - Google Patents

Procede de fabrication de complexes medicamenteux Download PDF

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Publication number
WO1997046261A1
WO1997046261A1 PCT/JP1997/001915 JP9701915W WO9746261A1 WO 1997046261 A1 WO1997046261 A1 WO 1997046261A1 JP 9701915 W JP9701915 W JP 9701915W WO 9746261 A1 WO9746261 A1 WO 9746261A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gly
compound
solution
spacer
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/001915
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhiro Inoue
Hiroshi Susaki
Masahiro Ikeda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP50042298A priority patent/JP4137184B2/ja
Priority to AT97924326T priority patent/ATE273716T1/de
Priority to US09/147,341 priority patent/US6291671B1/en
Priority to DE69730352T priority patent/DE69730352T2/de
Priority to EA199900002A priority patent/EA001897B1/ru
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CA002257233A priority patent/CA2257233A1/en
Priority to AU29788/97A priority patent/AU723442B2/en
Publication of WO1997046261A1 publication Critical patent/WO1997046261A1/ja
Priority to NO19985667A priority patent/NO323626B1/no
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a drug conjugate in which a polysaccharide derivative is bound to a pharmaceutical compound such as an antitumor agent.
  • Antitumor agents used in the treatment of solid cancers such as lung cancer and gastrointestinal cancer, and blood cancers such as leukemia are systemically administered by intravenous or oral administration routes and then migrate to specific tumor sites It inhibits or suppresses the growth of cancer cells and exerts a therapeutic effect.
  • systemically administered antitumor agents are rapidly taken up from the blood into the liver and reticulo-organs or excreted into the urine promptly, resulting in lower blood levels and migration to tumor sites. May not be enough.
  • normal antitumor agents themselves have low selectivity to transfer to the tumor site (tumor selectivity), so the antitumor agent is distributed to various cells and tissues throughout the body in a tight manner, resulting in normal cells.
  • 7-84481 discloses a drug complex in which the above-mentioned antitumor agent is introduced into a carboxymethylated mannoglucan derivative via a Schiff base diamide amide bond. These drug compounds The conjugation is characterized by having a better antitumor effect than the antitumor agent itself not bound to the carrier for drug delivery and reduced toxic side effects.
  • these drug conjugates are prepared by preparing a polysaccharide derivative having a carboxyl group such as carboxymethyl pullulan or carboxymethyl mannoglucan as a sodium salt, and then preparing the carboxyl group of the polysaccharide derivative and the amino group of the antitumor agent ( Alternatively, it is produced by acid amide bonding with an N-terminal amino group of a peptide chain bound to an antitumor agent. Since the sodium salt of the polysaccharide derivative does not dissolve in the organic solvent at all, in performing this reaction, the sodium salt of the polysaccharide derivative is prepared as a solution of water or an aqueous organic solvent containing water. A method of dissolving a condensing agent and an antitumor agent in the form of a hydrochloride (or an antitumor agent having a peptide chain) in this solution has been adopted.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a drug conjugate capable of site-selectively transferring an active ingredient such as an antitumor agent or an anti-inflammatory agent to a tumor site or the like.
  • a polysaccharide derivative having a carboxyl group is efficiently reacted with a pharmaceutical compound such as an antitumor agent or a spacer such as oligopeptide to which the pharmaceutical compound is bound, so that a large amount of the drug conjugate can be obtained. It is to provide a method that can be manufactured at low cost.
  • the present inventors have made intensive efforts to solve the above-mentioned problems, and as a result, when reacting a polysaccharide derivative having a carboxyl group with a pharmaceutical compound or a spacer to which the pharmaceutical compound is bound, a polysaccharide conventionally used has been used.
  • a salt with an organic amine is used instead of the sodium salt of the derivative, the salt of the polysaccharide derivative can be dissolved at a high concentration in an organic solvent substantially free of water, and the polysaccharide derivative and the pharmaceutical compound can be dissolved.
  • they have found that a reaction with a spacer to which a pharmaceutical compound has been bound can be performed at an extremely high yield, and that by-products and the like can be reduced.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention relates to a method in which a polysaccharide derivative having a carboxyl group and a residue of a pharmaceutical compound are converted into a spacer consisting of one amino acid or a spacer consisting of 2 to 8 amino acids bound by peptide.
  • a method for producing a drug conjugate in which a carboxyl group-containing polysaccharide derivative and a drug compound residue are bonded without passing through the spacer comprising: A non-aqueous reaction of a salt of a polysaccharide derivative with an organic amine and a pharmaceutical compound or a pharmaceutical compound to which a spacer is bound; and a method for producing the drug conjugate.
  • the above-mentioned method wherein the polysaccharide derivative having a carboxyl group is a carboxy- 4 alkyldextran polyalcohol;
  • the above method wherein the dextran polyalcohol constituting the alkyl dextran polyalcohol is a dextran polyalcohol obtained by treating dextran under conditions that allow substantially complete polyalcoholization; said method c lambda _ 4 Arukirudekisu Tran polyalcohol carboxymethyl de Kiss Bok Ranpori alcohol; carboxy 4 Arukirudekisu Bok run polyalcohols, molecular weight 5, 000-500, the range of 000, preferably 50, 000 to 450, Carboxymethyl dextran polyalcohol in the range of 000, more preferably in the range of 200,000 to 400,000, and the carboxymethylation degree is preferably in the range of 0.01 to 2.0 per constituent sugar residue. Is in the range of 0.1 to 1.0, more preferably in the range of 200,000 to 400,000
  • the pharmaceutical compound is a compound capable of forming a lactone ring; a reaction between a salt of an organic amine and the pharmaceutical compound or a spacer to which the pharmaceutical compound is bound.
  • the method using a pharmaceutical compound having a lactone ring or a spacer to which a pharmaceutical compound having a lactone ring is bound; and the above-mentioned pharmaceutical compound capable of forming a lactone ring comprises (1S, 9S) ) -Triamino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] Indolizino [2]
  • the method as described above, which is [quinoline-10,13 (9H, 15H) -dione] is provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a GPC ticket of the drug conjugate of Example 8 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 8 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 9 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 9 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 5 shows an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 10 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 6 shows a GPC chart of the drug conjugate of Example 15 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 15 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 8 is a GPC chart of the drug conjugate of Example 28 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 28 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 29 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 29 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 34 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 34 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 14 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 39 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 15 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 39 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 16 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 41 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 41 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing a GPC chart of the drug conjugate of Example 44 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 19 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of the drug conjugate of Example 44 produced by the method of the present invention.
  • FIG. 20 is a diagram showing the pharmacokinetics of the drug conjugate of the example produced by the method of the present invention. Each point in the figure shows the average value of three cases.
  • the drug conjugate produced by the production method of the present invention comprises 2 to 8 polysaccharide derivatives having a carboxyl group and a residue of a pharmaceutical compound, each of which is a single amino acid or a peptide bond. Or a polysaccharide derivative having a carboxyl group and a residue of a pharmaceutical compound are bound without the spacer.
  • the residue of the pharmaceutical compound contained in the drug conjugate may be, for example, a pharmaceutical compound used for the treatment and Z or prevention of human diseases including humans as a drug such as an antitumor agent, an anti-inflammatory agent, and an antibacterial agent. Originated from its partial structure.
  • the pharmaceutical compound from which the residue is derived is not limited to the above.
  • a compound having one or more reactive functional groups for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an ester group, etc.
  • the term “pharmaceutical compound” also includes a prodrug compound capable of regenerating the compound in a living body, which contains the main structure of the compound itself having a medicinal effect as its partial structure.
  • the residue of the drug compound is a compound in which the bond between the polysaccharide derivative or the peptide and the drug compound residue is a reactive functional group in the drug compound and the polysaccharide derivative or the spacer. It means a partial structure derived from a pharmaceutical compound present in a compound after binding, assuming that the compound is formed by a reaction with a reactive functional group (eg, dehydration condensation).
  • the pharmaceutical compound is D- NH 2, D COOH, D -COOR, if D- OH, D-SH, D -CONH, D-NH-COOR (R is a lower alkyl group or the like) represented by a pharmaceutical of
  • the residues of the compound are D-NH- (D-NH-C0-Q etc.), D-CO- (D-CO-NH-Q, D-C0-0-Q, D-C0-SQ etc.) , D-CO- (D-CO-NH-Q, D-C0-0-Q, D-C0-SQ, etc.), D-0- (D-0-CO-Q, D-0-Q, etc.) , DS- (DS-CO-Q, DS-Q, etc.), D-C0NH- (D-CO-NH-CO-Q, etc.), D-NH-CO- (D-NH-C0-0- Q, D-NH-CO-NH-Q, etc.) Alternatively, it indicates a bond between a polysaccharide derivative and
  • the type of bond between the spacer or polysaccharide derivative and the drug compound residue is not limited to the above.
  • the residue of the drug compound binds to the carboxyl group of the polysaccharide derivative, the N-terminal amino group or the C-terminal carboxyl group of the spacer, or the reactive functional group present in the amino acid constituting the spacer. It may be.
  • residue of the pharmaceutical compound examples include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinblastine, methotrexet, platinum antitumor agent (cisbratin or a derivative thereof), taxol Or a derivative thereof, camptothecin or a derivative thereof (the antitumor agent described in JP-A-6-87746, preferably (IS, 9S) -1-amino-9-ethyl-5 described in claim 2).
  • the residue of the pharmaceutical compound may be directly bonded to the polysaccharide derivative, or may be bonded via a spacer.
  • a spacer a spacer consisting of one amino acid or a spacer consisting of 2 to 8 amino acids bound by peptide can be used. More specifically, when the residue of the pharmaceutical compound and the polysaccharide derivative are bonded via a spacer, the spacer is a residue of one amino acid (amino acid).
  • Residue means one amino acid and one hydroxyl group removed from the amino group and carboxyl group, respectively), or the residue of an oligopeptide consisting of 2 to 8 amino acids linked to a peptide (N Residue means one hydrogen atom and one hydroxyl group removed from the terminal amino group and the C-terminal carboxyl group, respectively).
  • Preferred spacers are oligopeptide residues consisting of 2 to 6 amino acids.
  • the type of amino acid constituting the spacer is not particularly limited.
  • L- or D-amino acids preferably L-amino acids, can be used, and in addition to single amino acids, ⁇ -alanine, ⁇ -aminocaproic acid, 7-aminobutyric acid, and the like may be used.
  • Such an amino acid other than an ⁇ -amino acid is preferably arranged at a position close to the polysaccharide derivative in the spectrumr.
  • carboxy Cj_ 4 Arukirudekisu Trang polyalcohol acid ami de coupling the N-terminal of the scan Bae colonel foremost carboxyl group And the C-terminus of the spacer can be bound to the amino group of the pharmaceutical compound.
  • a lysine residue is included as a constituent unit of the peptide spacer, and the ⁇ -amino group and the £ -amino group of the lysine residue are each amide-bonded to the carboxyl group of another amino acid.
  • a diamine compound or a dicarboxylic acid compound for example, a residue of a diamine such as ethylene diamine, a residue of a dicarboxylic acid such as succinic acid, etc.
  • a spacer having both terminals at both ends and a spacer having both terminals at the C terminal may be used.
  • the amino acid sequence in the case of using a oligonucleotide consisting of oligopeptides is not particularly limited.
  • a residue of a dipeptide represented by - ⁇ - ⁇ - represents a residue of a hydrophilic amino acid
  • I represents a residue of a hydrophilic amino acid
  • - ⁇ - ⁇ - represents a hydrophobic amino acid (X) and a hydrophilic amino acid ( ⁇ ) at the ⁇ -terminal and the C-terminal, respectively.
  • X hydrophobic amino acid
  • ⁇ hydrophilic amino acid
  • a spacer containing the peptide residue as a partial peptide sequence can be suitably used.
  • the hydrophobic amino acid for example, phenylalanine, tyrosine, oral isine and the like can be used, and as the hydrophilic amino acid, for example, glycine, alanine and the like can be used.
  • the spacer may have a repeating sequence of such a peptide residue (eg, -X --- X- ⁇ -, -X- ⁇ - ⁇ - ⁇ - ⁇ - ⁇ - ⁇ - ⁇ -, etc.). .
  • the peptide When a spacer containing such a peptide structure is used, the peptide is hydrolyzed at a tumor site or an inflammatory site which is considered to be rich in peptide enzyme, and the site is hydrolyzed. Since the pharmaceutical compound is released at a high concentration in the above, the structure formed by bonding the spacer containing the peptide and the pharmaceutical compound is a preferable partial structure of the drug complex produced by the method of the present invention. It is.
  • Anti-tumor agent that exhibits a concentration-dependent anti-tumor effect as a residue of a pharmaceutical compound Anti-tumor agent that exhibits stronger anti-tumor effect at higher concentration: concentration-dependent anti-tumor agent, such as doxorubicin
  • concentration-dependent anti-tumor agent such as doxorubicin
  • a residue of the above-mentioned type it is particularly preferable to use a spacer consisting of the above dipeptide residue represented by -xz- or a spacer containing the peptide residue as a partial peptide sequence. I like it.
  • the use of the above-mentioned spacer is high.
  • an antitumor effect can be achieved, and examples thereof include the antitumor agents described in JP-A-6-87746, preferably the antitumor agents described in claim 2.
  • it is not limited to the above-mentioned spacers, but is preferably selected from the viewpoint of the mechanism of action of the antitumor agent, the characteristics of pharmacokinetics and toxicity, the release of the antitumor agent in the body, and the like. It is necessary to select a spacer. In general, it is preferable to select the above spacer that can release a high concentration of a pharmaceutical compound in a short period of time for a rapidly growing cancer type.
  • spacers are shown in the following table, but the spacers used in the method for producing the drug conjugate of the present invention are not limited to the following, and the optimal It goes without saying that a person skilled in the art can appropriately select a release rate.
  • the left side of the peptide sequence is the N-terminal, and the residue of the pharmaceutical compound is bonded to the C-terminal side.
  • D-Phe indicates a D-phenylalanine residue, and other amino acids indicate L-amino acids.
  • the magnitude of the release rate was determined by the degree of drug effect of the drug conjugate bound to doxorubicin on Walker 256 tumor-bearing rat, or the concentration of free doxorubicin at the tumor site of Walker 256 tumor-bearing rat. .
  • doxorubicin one capable of releasing a high concentration of a pharmaceutical compound such as (N-terminal) -Gly-Gly-Phe-Gly- in a short time is used. It is preferable to use it. table 1
  • the polysaccharide derivative having a carboxyl group constituting the polysaccharide derivative portion of the drug conjugate is, for example, a polysaccharide or a derivative obtained by chemically or biologically modifying them and having a carboxyl group in the molecule. Anything may be used.
  • polysaccharides such as hyaluronic acid, pectic acid, alginic acid, chondroitin, heparin, pullulan, dextran, mannan, chitin, inulin, renokun, quinran, araban, mannoglucan
  • chitosan those obtained by introducing a functional group having a carboxyl group into a part or all of the hydroxyl groups of the polysaccharide can be used.
  • those obtained by carboxyalkylating a hydroxyl group those obtained by esterifying a carboxyl group of a polybasic acid to a hydroxyl group, and the like can be suitably used.
  • a product obtained by introducing a functional group having a carboxyl group after polyalcoholizing the above polysaccharide may be used.
  • carboxy (trialkyl dextran polyalcohol) is preferable to use.
  • the degree of polyalcoholization of carboxy (, 4 alkyl dextran polyalcohol is not particularly limited, but carboxy ( ⁇ _ 4 alkyl dextran) It is preferable that the dextran polyalcohol constituting the polyalcohol is a dextran polyalcohol obtained by treating dextran under conditions under which polyalcoholization can be performed substantially completely.
  • Carboxy ( ⁇ - 4 Arukirudekisu Thorens polyalcohol type of dextrin Bok run used to produce is not particularly limited, a -.
  • D- 1, 6- coupling may be contained in an arbitrary ratio for example, a Dextran having a -D- 1,6- bond ratio of 85% or more, 90% or more, or 95!% Or more can be used, etc.
  • the molecular weight of dextran is not particularly limited. those from about 000 to 2, 000, about 000, preferably from 50, 000 to or et 800, about 000 may be used.
  • carboxy _ 4 alkyl dextranase down polyalcohol carboxy alkyl groups ( ⁇ _ the 4 alkyl, straight-chain or branched alkyl, such as methyl, Echiru group, n- propyl group, an isopropyl group, n- butyl group, a force good that may be used as sec- butyl group Preferably a methyl group It can be used.
  • a salt of a polysaccharide derivative having a carboxyl group with an organic amine and the pharmaceutical compound itself or a compound having a carboxyl group is used. It is characterized in that a salt of a polysaccharide derivative with an organic amine and a spacer to which a pharmaceutical compound is bound are reacted in an organic solvent substantially free of water, that is, in a non-aqueous system.
  • carboxy-4 alkyl dextran polyalcohol is used as a polysaccharide derivative will be specifically described. The scope of the present invention is not limited to these embodiments.
  • dextran When dextran is used as a starting material, dextran is treated with a large excess of sodium periodate and sodium borohydride in that order to make dextran substantially completely polyalcoholized with dextran. Alcohol can be produced.
  • the method for polyalcoholization of dextran is not limited to the above, and any method may be employed as long as it can be used by those skilled in the art.
  • Carboxyalkylation can be performed, for example, by using chloroacetic acid, bromoacetic acid, ⁇ -chloropropionic acid, monomethyl-monochloropropionic acid, / S-chloropropionic acid, monomethyl- ⁇ -chlorine for the hydroxyl group of dextran polyalcohol.
  • dextran polyalcohol is dissolved in an inert solvent that does not participate in the reaction (eg, water, ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc.), and a base (eg, sodium hydroxide or hydroxylase) is dissolved.
  • an inert solvent eg, water, ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc.
  • a base eg, sodium hydroxide or hydroxylase
  • Halogenated in the presence of lime, etc.)- 4- alkyl sulfonic acid or a salt thereof is added, and the reaction is carried out under ice cooling or at a temperature range of about 100 ° C for several minutes to several days.
  • the degree of introduction of the carboxy ( ⁇ - 4 alkyl group is, for example, easily by appropriately selecting the amount of halogenated C j- 4 alkyl force Rupon acids and bases to be used as the reaction temperature and the reagents force Rubokishi _ lambda alkylation
  • the degree of carboxyalkylation of the dextran polyalcohol to the hydroxyl group is not particularly limited, but may be, for example, 0.01 to 2.0 per constituent sugar residue.
  • the molecular weight of the carboxy 4 alkyl dextran polyalcohol is from 5,000 as measured by gel filtration method, preferably from 0.1 to 1.0, more preferably from 0.3 to 0.5.
  • the carboxy produced ( ⁇ -. 4 Arukirudekisu Bok Ranporiaruko one le, in the method of the present invention prepared as aqueous solutions in the form of Al force Li metal salts, such as Natoriumu salt or force Riumu salts, such
  • an organic amine is used instead of the polysaccharide derivative in the form of an alkali metal salt.
  • the polysaccharide derivative in the form of a salt with an organic amine can be dissolved at a high concentration in a substantially water-free organic solvent. Since the reaction can be carried out in a non-aqueous system, the reaction efficiency can be remarkably increased.
  • salts with organic amines include triethylamine, trimethylamine, and trimethylamine.
  • salts of aliphatic amines such as triethanolamine, alicyclic or aromatic amines such as N-methylpyrrolidine, N-methylpyridine, N-methylmorpholine and dimethylaminopyridine Salts
  • quaternary ammonium salts such as tetramethylammonium chloride, tetraethylammonium chloride, etc.
  • Conversion of sodium salts of polysaccharide derivatives into salts with organic amines can be performed by ion exchange. Resin, etc.
  • Resin etc.
  • An acid amide bond may be formed between the reactive amino group or the N-terminal amino group of the spectrum and the carboxyl group of carboxymethyl dextran polyalcohol of the pharmaceutical compound.
  • the bond between the pharmaceutical compound or spacer and the carboxyl group of carboxymethyl dextran polyalcohol is not limited to the above, and other chemical bonds or one or more spacers may be used. It may be a combined connection.
  • the C-terminal carboxyl group of a probe or the carboxyl group of a pharmaceutical compound An acid anhydride may be formed with the carboxyl group of methyl dextran polyalcohol, and a diamine compound such as ethylene diamine is used as a spacer to convert each carboxyl group to each amino group of diamine.
  • An acid amide bond may be used.
  • the reactive amino group of the pharmaceutical compound or the N-terminal amino group of the spacer is bonded to the carboxyl group of carboxymethyl dextran polyalcohol by an acid amide bond
  • the peptide chain is synthesized.
  • Conventional dehydrating condensing agents used for, for example, ,, ⁇ ′-dicycloalkyl carbodiimides such as N, ⁇ ′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethyla) Carpoimide derivatives such as minopropyl) carpoimide (EDAPC), benzotriazole derivatives such as 1-hydroxybenzotriazole ( ⁇ 0 ⁇ ), and ethoxyquincarbonyl-2-ethoxy-1,1
  • 2-dihydroxyquinoline (EEDQ) can be used.
  • the reaction may be carried out by an active ester method, an acid halide method, or the like.
  • the reaction is an organic solvent containing substantially no water, and dissolves the reactive species (salt of carboxymethyl dextran polyalcohol with organic amine and drug compound or spacer to which drug compound is bound). Anything that can do so may be used.
  • the reactive species salt of carboxymethyl dextran polyalcohol with organic amine and drug compound or spacer to which drug compound is bound. Anything that can do so may be used.
  • the amount of the drug compound residue introduced into the carboxymethyl dextran polyalcohol by reacting the drug compound or a spacer with the drug compound bound thereto is not particularly limited, but the physical chemistry of the drug compound residue is Should be selected as appropriate from the viewpoints of chemical properties, pharmacokinetics, efficacy and toxicity of the drug complex. Generally, a range of about 0.1 to 30% by weight, preferably about 1 to 15% by weight can be selected.
  • the ratio of drug compound residues introduced into carboxymethyl dextran polyalcohol can be easily determined by, for example, absorbance analysis.
  • a method of introducing oligopeptide linked to a pharmaceutical compound which is an antitumor described in claim 2 of JP-A-6-87746 into carboxymethyl dextran polyalcohol Is shown in the following scheme, but the method of the present invention is not limited to that shown in this scheme.
  • the following scheme In the above, the introduction amount of the drug compound residue is, for example, about 1 to 15% by weight, preferably about 4 to 8% by weight.
  • only structural units in which one or two carboxymethyl groups are introduced among structural units of polyalcohols are exemplarily described, but the polysaccharide derivative portion of the drug conjugate is described above. It should be understood that they are not formed by repeating structural units.
  • the equilibrium of the pharmaceutical compound in an acidic aqueous medium is biased toward a compound forming a lactone ring (ring-closed body), while in a basic aqueous medium (for example, about pH 10). It is known that the equilibrium tends to be biased toward the compound (ring-opened) in which the lactone ring is opened. Has tumor effects. However, when carboxymethyl dextran polyalcohol is reacted with a spacer (eg, oligopeptide spacer) to which the above-mentioned pharmaceutical compound is bound, a ring-opening type reactive species is present in the reaction system.
  • a spacer eg, oligopeptide spacer
  • a condensation reaction proceeds between the carboxyl group derived from the lactone ring and the amino group derived from the spacer, which not only significantly reduces the reaction yield, but also decreases the yield of the desired homogeneous drug.
  • Product complex may not be obtained.
  • Such side reactions can be avoided by using a ring-closure as a reactive species in a non-aqueous system in which equilibrium is not achieved. Therefore, the method of the present invention is particularly suitable for producing a drug conjugate containing the above-mentioned pharmaceutical compound.
  • the above-mentioned drug conjugate produced by the method of the present invention has a desired pharmaceutical activity depending on the type of the residue of the pharmaceutical compound (for example, the residue of the pharmaceutical compound such as an antitumor agent or an anti-inflammatory agent). It is characterized in that it can be specifically expressed at a site such as a site or an inflammatory site, and that the toxicity of the pharmaceutical compound itself can be reduced.
  • carboxymethyl dextran polyalcohol which is a polysaccharide derivative moiety, is an extremely excellent drug delivery carrier and has excellent blood retention and accumulation at tumor sites and inflammation sites.
  • the drug conjugate has tumor selectivity and inflammatory site selectivity.
  • a protease peptidase
  • a drug conjugate having a spacer consisting of an oligopeptide is easily hydrolyzed by a part of the spacer.
  • the released pharmaceutical compound exerts its medicinal effect.
  • the medicament containing the drug conjugate produced by the method of the present invention can be usually filled in a vial or the like in the form of a lyophilized product or the like.
  • the pharmaceutical form of such a drug is not limited to the above embodiment.
  • a pharmaceutical composition produced using manufacturing additives available in the art such as a solubilizing aid, a pH adjuster, and a stabilizer can be used.
  • the dose of the above drug is not particularly limited, but usually, the dose of the drug compound constituting the drug compound residue, the amount of the drug compound residue introduced into the drug conjugate, the condition of the patient or disease. The decision should be based on the type and other factors.
  • a drug conjugate in which the residue of the antitumor agent described in claim 2 of JP-A-6-87746 is introduced at a ratio of about 6% by weight or less is administered parenterally, generally, It is preferably administered once in a range of about 1 to 500 mg, preferably about 10 to 100 mg, per body surface area per day, and is preferably repeated every 3 to 4 weeks.
  • A-NH- is a compound such as the pharmaceutical compound described in claim 2 of JP-A-6-87746 (which may be referred to as "DX-8951" in the examples).
  • A-NHo a drug compound residue in which the lactone ring is closed
  • A-NHo an example of which is A-NH- in the scheme described above. This is the group indicated by (a lactone ring is formed).
  • ⁇ ′-NH— indicates that the lactone ring in the drug compound residue represented by ⁇ - ⁇ ⁇ -is either a ring-closed type or a ring-opened type, or a mixed form thereof.
  • the degree of carboxymethylation of carboxymethyldextranpolyalcohol is the same as that of sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol. After conversion to the free acid form, it was determined by dissolving in a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution and titrating with 0.1N hydrochloric acid. An aqueous solution of a sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol was applied to a Bio-Rad AG50W-X2 (H + type) column, and the passed solution was lyophilized and used as a sample.
  • This sample was dissolved in a predetermined excess amount of a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, and titrated with 0.1N hydrochloric acid using phenolphthalene as an indicator.
  • the amount of sample collected is s (mg)
  • the predetermined excess amount of IN aqueous sodium hydroxide solution is a (ml)
  • the titration of IN hydrochloric acid is b (ml)
  • the degree of carboxymethylation is 13.4 ( a-b) / [s-5.8 (ab)].
  • the amount (% by weight) of the drug introduced was determined from absorbance analysis (around 362 nm) using the characteristic absorption of the drug.
  • the gel filtration method was performed under the following conditions (power column: TSK gel G4000 PW, eluent: 0.1 M NaCl, flow rate: 0.8 ml / min, power column temperature: 40 ° C).
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly 600 mg
  • N-hydroxysuccinimide 160 mg
  • ⁇ , ⁇ ′-dicyclohexylcarbodiimide 280 mg
  • a methanesulfonic acid salt of a pharmaceutical compound described in claim 2 of JP-A-6-87746 600 mg: the compound described in Example 50 of the above-mentioned publication
  • triethylamine 0.16 ml
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Phe 600 mg
  • N-hydroxysuccinimide 160 mg
  • ⁇ , ⁇ -dimethylformamide 20 ml
  • ⁇ ⁇ , ⁇ '-disil hexylcarbodiimide 280 mg
  • DX-8951 methanesulfonate 600 mg
  • triethylamine 0.16 ml
  • Dextran T2000C 10 g was added to 0.1 It was dissolved in M acetate buffer (pH 5.5, 1,000 ml), and an aqueous solution (1000 ml) of sodium periodate (33.0 g) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (7.0 ml) was added, and the mixture was stirred overnight. The pH of the reaction solution was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice cooling. After adding and dissolving sodium borohydride (14 g), the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • the reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, stirred at 4 ° C for 1 hour, and then adjusted to pH 7.5 with 8 M aqueous sodium hydroxide under ice-cooling.
  • the resulting aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-30 membrane (manufactured by Millipore) to remove low molecular fractions.
  • the high molecular fraction was freeze-dried to obtain dextran polyalcohol. After treating this dextran polyalcohol at pH 3.0 for 1 hour, the low-molecular fraction is removed with a Biomax-50 membrane, and then the high-molecular fraction is removed with a Biomax-100 membrane and lyophilized. Purified dextran polyalcohol (2.0 g) was obtained. The molecular weight of this material (gel filtration, dextran standard) was 220 K.
  • This purified dextran polyalcohol (1.8 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (10.5 g) in water (45 nil) and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (15 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours. After the pH of the reaction solution was adjusted to 8 with acetic acid, the low-molecular fraction was removed by ultrafiltration using a Biomax-10 membrane. The polymer fraction was freeze-dried to obtain sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (1.8 g). The molecular weight (gel filtration, dextran standard) of this material was 330 K and the degree of carboxymethylation was 0.8.
  • the precipitate was washed with methanol, dissolved in water (5 ml), and added with a 3 M aqueous sodium chloride solution (0.15 ml).
  • the aqueous solution was filtered through a Millipore filter (0.45 m), the filtrate was dropped into 35 ml of ethanol, and the precipitated precipitate was collected by centrifugation (3500 rpm, 8 minutes).
  • the precipitate was washed with ethanol, dissolved in water, and dialyzed against pure water using a dialysis membrane (Spectrapore 1, cut-off molecular weight 6,000-8,000).
  • the dialysate was filtered through a Millipore filter (0.22 ⁇ m) and freeze-dried to obtain sodium carboxymethyldextran polyalcohol (0.18 g).
  • the carboxymethylation degree per sugar residue (alkaline titration) of this substance was 1.2.
  • the purified dextran polyalcohol (0.2 g) obtained in Example 5 was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (0.84 g) in water (6 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (1.2 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 18 hours. The pH of the reaction solution was adjusted to 8 with acetic acid, and the solution was added dropwise to 120 ml of methanol. A 3 M aqueous solution of sodium chloride (0.2 ml) was added, and the precipitated precipitate was centrifuged (3500 rpm, 8 minutes).
  • the precipitate was washed with methanol, dissolved in water (5 ml), and added with a 3 M aqueous sodium chloride solution (0.2 ml). This aqueous solution was filtered through a Millipore filter (0.45 / ra), the filtrate was dropped into 35 ml of ethanol, and the precipitated precipitate was collected by centrifugation (3500 rpm, 8 minutes). The precipitate was washed with ethanol, dissolved in water, and dialyzed against pure water using a dialysis membrane (Spectrapore 1, cut-off molecular weight 6,000-8,000).
  • the dialysate was filtered through a Millipore filter (0.22 m) and freeze-dried to obtain sodium carboxymethyldextran polyalcohol (0.20 g). Degree of carboxymethylation per sugar residue of this substance Lucari titration) was 0.4.
  • reaction solution was adjusted to pH 10 with a 1 M aqueous sodium hydroxide solution, and then added dropwise to 25 ml of ethanol in 5 ml portions. To this mixture was added a 3M aqueous solution of sodium chloride (1 ml) and ethyl ether (5 ml), and the precipitated precipitate was collected by centrifugation (3500 rpm, 8 minutes).
  • This precipitate was dissolved in water, dialyzed against pure water using a dialysis membrane (Stolupore 1, cut-off molecular weight 6,000-8,000), and the dialysate was filtered using a Millipore filter ( 0.22 ( ⁇ ) and freeze-dried.
  • the obtained crude product was dissolved in water (30 ml), adjusted to pH 9 with a 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution, and treated at 37 ° C for 1 hour. After the treated solution was dialyzed in the same manner as described above, the inner solution of the dialyzed solution was filtered through a Millipore filter (0.22 m), and lyophilized to obtain 289 mg of the title compound.
  • Figure 1 and Figure 2 show the UV absorption spectrum of this compound (0.1 M Tris buffer, pH 9.0, 0.25 mg / ml). The content of the drug compound residue in this compound was determined to be 5.3% (W / W) based on the absorbance at 362 nm in 0.1 Tris buffer (pH 9.0). .
  • Example 11 Antitumor effect of the drug conjugate of the present invention
  • Meth A tumor-bearing mice were implanted with zero mouse fibrosarcoma Meth A cells lx lO right groin subcutaneously BALB / c system male mice (7 weeks old) (1 group 7 rats).
  • the drug conjugate of Example 9 dissolved in distilled water for injection was administered into the tail vein of Meth A tumor-bearing mice four times every four days.
  • Example 9 the drug conjugate of the present invention obtained in Example 9 exhibited a significant antitumor effect as compared to the pharmaceutical compound itself (without spacer and polysaccharide derivative) without developing toxicity (weight loss). Had been strengthened.
  • Table 2 Test compound Dose Ong / kg) Inhibition rate 50 Pharmaceutical compound itself 7.5 X 4 76
  • Meth A tumor-bearing mice were prepared in the same manner as in Example 11 (6 mice per group), and the antitumor effects of a single administration of the drug conjugates of Examples 8 and 9 on day 7 were compared.
  • the degree of antitumor effect was (polysaccharide derivative) -Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A '> (polysaccharide derivative) -Gly-Gly-Gly-Ply-NH-A'> pharmaceutical compound itself.
  • a compound in which the drug compound residue was directly bonded to the carboxyl group of the carboxymethyl dextran polyalcohol of Example 5 without using a spacer (the amount of the drug compound residue introduced: 6.2% by weight) was ineffective. .
  • Dextran T500 (10 g, manufactured by Pharmacia, molecular weight 500K) was dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 5.5, 1000 ml), and an aqueous solution of sodium periodate (33 g) (1000 ml) was added. ) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (7.0 ml) was added, and the mixture was stirred overnight. The pH of the reaction solution was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous solution of sodium hydroxide. After adding and dissolving sodium borohydride (14 g), the mixture was stirred with stirring.
  • the reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, stirred at 4 ° C for 1 hour, and adjusted to pH 7.5 with aqueous sodium hydroxide solution to obtain Solution 1.
  • Dextran T500 (10 g, manufactured by Pharmacia Co., Ltd., molecular weight: 500K) to obtain a solution 2.
  • Dextran T250 (10 g each, manufactured by Pharmacia, molecular weight 250K) to obtain Solution 3 and Solution 4.
  • These solutions 1 to 4 were combined, and a low-molecular fraction was removed by ultrafiltration using a Biomax-50 membrane.
  • the polymer fraction was freeze-dried to obtain dextran polyalcohol (25 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 163K.
  • Monochloroacetic acid (66 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature.
  • This reaction solution was adjusted to pH 9 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-30 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was freeze-dried to obtain sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (13 g).
  • the molecular weight (gel surface, pullulan standard) of this substance was 228K and the degree of carboxymethylation was 0.4.
  • This sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol 600 mg was dissolved in water, and the mixture was added to a Bio-Rad AG 50W-X2 (200-400 mesh, H + type) column (diameter: 44 mm, length: 210 mm). ) And eluted with water. Triethylamine (0.93 ml) was added to the eluate, followed by lyophilization to obtain the title compound (690 mg).
  • trifluoroacetic acid 3 ml
  • This precipitate is dissolved in a 0.5 M aqueous sodium chloride solution, adjusted to pH 9 with a 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution under ice-cooling, and then used with a dialysis membrane (spectrum pore 1, cut-off molecular weight 6000-8000). And dialyzed against pure water. The dialysate was filtered through a Millipore filter (0.22 m) and lyophilized to give the title compound (600 mg). After dissolving this compound in 0.1 M sodium chloride aqueous solution, it was analyzed by GPC (power column: Toso TSK Gel PW-4000XL, solvent: 0.1 M NaCl, flow rate: 0.8 ml / rain).
  • GPC power column: Toso TSK Gel PW-4000XL, solvent: 0.1 M NaCl, flow rate: 0.8 ml / rain.
  • the absorption spectrum (0.1 M Tris buffer, pH 9.0, 0.1 mg / ml) is shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
  • the content of the drug compound residue of this compound was determined based on the absorbance at 362 nm in 0.1 M Tris buffer (pH 9.0), and was found to be 5.8% (W / W).
  • the dialysate was filtered through a Millipore filter (0.22 // m) and lyophilized to give the title compound (1.4 g).
  • the content of the drug compound residue of this compound was determined based on the absorbance at 362 nm in 0.1 M Tris buffer (pH 9.0), and was found to be 5.23 ⁇ 4 (W / W).
  • Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl (l.7 g) obtained in Example 19 was dissolved in a mixed solution of ethyl acetate (30 ml) and methanol (30 ml), and 5% Pd-C (1.5 g) was dissolved. ) was added to perform catalytic reduction. The reaction solution was filtered, and the filtrate was evaporated to dryness under reduced pressure to obtain the title compound (1. g).
  • Example 24 Synthesis of triethylammonium salt of carboxymethyldextran polyalcohol Dextran T500 (50 g, manufactured by Pharmacia, molecular weight 500K) was dissolved in 0.1 M acetic acid buffer (pH 5.5, 5000 ml), and an aqueous solution of sodium periodate (165.0 g) (5000 ml) was added. ) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (35.0 ml) was added, and the mixture was stirred overnight. The reaction solution was adjusted to pH using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution.
  • the pH was adjusted to 7.5 using an aqueous solution of sodium hydroxide.
  • the resulting aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-50 membrane to remove low molecular fractions.
  • the polymer fraction was freeze-dried to obtain dextran polyalcohol (27.1 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 140K.
  • This dextran polyalcohol (5 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (21) in water (150 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (30 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give carboxymethyldextran polyalcohol sodium salt (5.6 g). The molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this substance was 263K and the carboxymethylation degree was 0.4.
  • Example 26 The sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (1.0 g) obtained in Example 24 was dissolved in water, and Bio-Rad AG 50W-X2 (200-400 mesh, Me 3 NH + type) was dissolved in water. Eluted with water on a column. The eluate was lyophilized to give the title compound (950 mg).
  • Example 27 Carboxymethyl de kiss Trang polyalcohols - Synthesis of Gly-Gly-Phe-Gly- NH-A '(A -NH 0 -DX- 8951)
  • An amide (10 ml) solution, triethylamine (51) and triethoxyquincarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (0.1 g) are added sequentially, and the mixture is allowed to react at room temperature with stirring.
  • Example 28 Carboxymethyl de kiss Trang polyalcohols - Synthesis of Gly-Gly-Phe-Gly- NH-A '(A -NH 2 -DX- 8951)
  • the carboxymethyl dextran polyalcohol trimethylammonium salt (0.1) obtained in Example 25 was dissolved in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (6 ml).
  • aqueous solution was desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-30 membrane.
  • a Millipore filter (0.22 ⁇ m) and lyophilized to obtain the title compound (80 rag).
  • FIGS. 8 and 9 are shown in FIGS. 8 and 9, respectively.
  • the content of the drug compound group of this compound was determined based on the absorbance at 362 nm in 0.1 M Tris buffer (pH 9.0), and was found to be 15% (W /).
  • Dextran T250 (20 g, EXTRASYNTHESE, average molecular weight 250K) was dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 5.5, 2000 ml), and an aqueous solution of sodium periodate (66.0 g) (2000 ml) was added. ) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (14.0 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature. The pH of the reaction solution was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice-cooling. 7 Sodium boron sodium (28 g) was added and dissolved, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • the reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, stirred at 4 ° C. for 1 hour, and then adjusted to pH 7.5 with 8 M aqueous sodium hydroxide under ice-cooling.
  • the obtained aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-30 membrane to remove a low-molecular fraction, and a residual solution 1 not passing through the membrane was obtained.
  • dextran T250 50 g, EXTRASYNTHESE, average molecular weight 250K
  • 0.1 M acetate buffer pH 5.5, 5000 ml
  • an aqueous solution (5000 ml) of sodium periodate (165 g) was added.
  • the obtained aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-30 membrane to remove a low-molecular fraction, thereby obtaining a residual solution 2 not passing through the membrane.
  • the residual solution 1 and the residual solution 2 are combined, and the fraction passing through the Biomax-50 membrane is removed by ultrafiltration to remove the low-molecular-weight fraction using the Biomax-30 membrane.
  • Trampoli alcohol (25.7 g) was obtained.
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 47K.
  • This dextran polyalcohol (5 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (35 g) in water (150 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (50 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and the mixture was reacted at room temperature for 18 hours. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give the sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (7.2 g). The molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this substance was 127 K and the degree of carboxymethylation was 0.8.
  • This sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (2.2 g) was dissolved in water, and the mixture was added to a Bio-Rad AG 50-X2 (200-400 mesh, 11+ type) column (diameter 44 mm, length 210 mm). mm) and eluted with water. Triethylamine (4 ml) was added to the eluate, followed by lyophilization to obtain triethylammonium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (2.69 g).
  • aqueous solution of sodium periodate (66.0 g) was added to a solution of dextran T10 (20 g, Pharmacia, average molecular weight 10K) in a 0.1 M acetic acid buffer solution (pH 5.5) (2000 ml). 2000 ml) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (14.0 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was adjusted to pH 7.5 with an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice-cooling. After adding and dissolving sodium borohydride (28 g), the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • the reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, stirred at 4 ° C for 1 hour, and then adjusted to pH 7.5 with 8M aqueous sodium hydroxide under ice-cooling.
  • the resulting aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-5 membrane (manufactured by Millipore) to remove low molecular fractions, and the remaining solution not passing through the membrane was passed through a Biomax-30 membrane.
  • the obtained passing solution was freeze-dried to obtain dextran polyalcohol (8.0 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 13K.
  • This dextran polyalcohol (3.7 g), sodium hydroxide (25.9 g) and water (111 ml), and the mixture was dissolved at room temperature.
  • Monochloroacetic acid (37 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours.
  • the reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give the sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (6.2 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 37K and the carboxymethylation degree was 0.9.
  • Dextran polyalcohol (3.9 g) obtained in Example 30 was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (16.3 g) in water (117 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (23.4 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and the mixture was reacted at room temperature for 18 hours. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (5.0 g).
  • Dextran 4 (20 g, Funakoshi, average molecular weight 4K-6K) in a 0.1 M acetate buffer (pH 5.5) solution (2000 ml) was added to sodium periodate (66.0 g). (2000 ml) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (14.0 ml) was added and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was adjusted to 11 to 7.5 using an aqueous solution of sodium hydroxide under ice cooling. After adding sodium borohydride (28 g) and dissolving, Stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, stirred at 4 ° C for 1 hour, and then adjusted to pH 7.5 with 8M aqueous sodium hydroxide under ice-cooling. .
  • the resulting aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-3 membrane (manufactured by Millipore) to remove low molecular fractions.
  • the obtained passing solution was freeze-dried to obtain dextran polyalcohol (6.0 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 9K.
  • This dextran polyalcohol (2.7 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (18.9 g) in water (81 ml) and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (27 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (4.2 g). The molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 20K and the carboxymethylation degree was 0.9.
  • Dextranbori alcohol (2.7 g) obtained in Example 32 was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (11.3 g) in water (81 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (16.2 g) was added to this solution under ice-cooling to dissolve it, and the mixture was reacted at room temperature for 18 hours. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The residual solution that did not pass through the membrane was freeze-dried to obtain sodium carboxymethyldextran polyalcohol (2.7 g). The molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 16K and the carboxymethylation degree was 0.5. This sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (2.7 g) was converted to a triethylammonium salt in the same manner as in Example 30 to obtain the title compound (3.1 g).
  • N, N-Dimethylformamide (90 ml) was dissolved in carboxymethyl dextran polyalcohol triethylbenzene salt (1.2 g) obtained in Example 31.
  • Preparative Rifuruoro acetate 168 rag
  • a solution of ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (30 ml) and triethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (1.2 g) were successively added, and the mixture was reacted at room temperature with stirring at room temperature.
  • Triethylammonium carboxymethyl dextran polyalcohol salt (1.2 g) obtained in Example 32 was dissolved in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (90 ml).
  • preparative Riechiruami emissions (0. 056 ml) and 3 '-N- (Gly- Gly- Phe- Gly ) - NH- A (A-NH 2 DX-8951) of the Application Benefits Furuoro acetate (168 mg) in N, N-dimethylformamide (30 ml), 1-ethoxycarbon-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (1.2 g), and then add at room temperature. ⁇ ⁇ Reacted with stirring.
  • Triethylammonium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (1.5 g) obtained in Example 33 was dissolved in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (90 ml).
  • preparative Riechiruami emissions (0. 07 ml) and 3 '- ⁇ - (Gly- Gly- Phe- Gly ) - NH - A (A-NH 2 DX - 8951) of the Application Benefits Furuoro acetate (210 mg) of N, N-dimethylformamide (40 ml), and ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (1.5 g) were added successively, and the mixture was stirred at room temperature overnight. While reacting.
  • Triethylammonium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (175 mg) obtained in Example 24 was dissolved in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (20 ml).
  • ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (20 ml).
  • To this solution 3 obtained in Example 38 '- N- (Boc- Gly- Gly -Phe- Gly) - NH- A (A - NH 2 DW-8286) (27 mg) from the same manner as Example 4
  • An amide (5 ml) solution and triethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (175 mg) were sequentially added, and the mixture was reacted at room temperature with stirring overnight.
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (163 mg) and N-hydroxysuccinimide (45 mg) were dissolved in N, N-dimethylformamide (10 ml) and cooled to 4 ° C. Thereafter, N, N'-dicyclohexylcarposimide (79 mg) was added.
  • This solution has the following formula: o,
  • Dextran T150 (20 g, Pharmacia, average molecular weight 150K) was dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 5.5, 2000 ml), and an aqueous solution of sodium periodate (66.0 g) was added. (2000 ml) was added. After stirring at 4 ° C for 10 days while shielding from light, ethylene glycol (14.0 ml) was added, and the mixture was stirred overnight. The pH of the reaction solution was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice-cooling. After sodium borohydride (28 g) was added and dissolved, the mixture was stirred at room temperature overnight. The reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, and stirred at 4 hours.
  • This dextran polyalcohol (2.5 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (17.5 g) in water (75 ml) and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (25 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours. The pH of the reaction solution was adjusted to 9 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The remaining solution that did not pass through the membrane was lyophilized to give the sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (4.0 g). The molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this substance was 45K, and the degree of CM conversion was 0.9.
  • the reaction solution was adjusted to pH 10 with a 1 M aqueous sodium hydroxide solution, and 5 ml each was added dropwise to 25 ml of ethanol.
  • This precipitate was dissolved in water, dialyzed against pure water using a dialysis membrane (Stoporepore 1, cut-off molecular weight 6000-8000), and the dialysate solution was filtered using a Millipore filter (0. After filtration through 22 jum), the residue was freeze-dried to obtain the title compound (3.4 g).
  • the dextran polyalcohol (2 g) obtained in Example 42 was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (14 g) in water (60 ml), and dissolved at room temperature. ⁇ -Bromopropionic acid (19 ml) was added to this solution under ice-cooling to dissolve it, followed by reaction at room temperature for 18 hours. The reaction solution was adjusted to pH 8 with acetic acid, and then desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane. After not passing through the membrane, the remaining solution was freeze-dried to obtain sodium salt of ⁇ -methylcarboxymethyldextran polyalcohol (2.95 g).
  • the molecular weight of this substance was 451 (The ⁇ -methylcarboxymethylation degree per sugar residue was determined as follows based on the case of carboxymethyldextran polyalcohol.
  • An aqueous solution of sodium salt of polymethylcarboxymethyl dextran polyalcohol was applied to a Mo-Rad AG 50W-X 2 (H + type) column, and the passed solution was lyophilized and used as a sample. It was dissolved in a specified excess amount of 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution, and titrated with 0.1 N hydrochloric acid using phenolphthalein as an indicator.
  • a (ml) be the predetermined excess amount of the aqueous solution of lithium and b (ml) the titer of 0.1 N hydrochloric acid, and determine the degree of ⁇ -methyl carboxymethylation as 13.4 (a-b) / [s-7.2 (a-b)] The result was ⁇ -methylcarboxymethylation It was 0.8.
  • Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl (1.78 g) was dissolved in ethyl acetate (60 ml). It was catalytically reduced in the presence of -Pd-C (1.8 g) for 24 hours. The catalyst was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain Boc-Gly-Phe-Gly-OH (1.41).
  • N, N-dimethylformamide (10 ml). To this solution was added an N, N-dimethylformamide (50 ml) solution of DX-8951 methyl sulfonate (530 rag) and triethylamine (0.146 ml), and the mixture was cooled to 4 ° C. , N, N'-disuccinic hexylcarbodiimide (268 mg) was added, and the mixture was reacted with stirring at room temperature overnight under light shielding.
  • Boc-Phe-Gly (771 mg) and N-hydroxysuccinimide (300 mg) were dissolved in N, N-dimethylformamide (10 ml).
  • N, N-dimethylformamide (50 ml) solution of M-8951 methanesulfonate (1058 rag) and triethylamine (0.293 ml) was added, and the mixture was reacted with stirring at room temperature overnight under light shielding.
  • Dextran T500 50 g., Manufactured by Pharmacia, molecular weight 500K
  • 0.1 M acetate buffer pH 5.5, 5000 ml
  • an aqueous solution of sodium periodate (165.0 g) 5000. ml
  • ethylene glycol 35.0 ml
  • the reaction solution was adjusted to pH with 8 M aqueous sodium hydroxide solution.
  • An amide (5 ml) solution, triethylamine (0.014 ml), and triethoxyquin-2-yl-1,2-diquinoxy-1,2-dihydroxyquinoline (100 mg) are sequentially added, and the mixture is stirred overnight at room temperature. Reacted.
  • Example 24 The sodium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (2.5 g) obtained in Example 24 was dissolved in water, and Bio-Rad AG 50W-X2 (200-400 mesh, Et 3 NH + type) was dissolved in water. ) Put on column and elute with water. The eluate was freeze-dried to obtain triethylammonium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol (2.5 g).
  • ml) of ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (5 ml) and 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (200 mg) are added sequentially, and the mixture is shielded from light and room temperature is added. With stirring overnight.
  • Triethylammonium salt of carboxymethyldextran polyalcohol (370 mg) obtained in Example 48 was dissolved in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (10 ml).
  • Example 52 Antitumor effect of drug conjugate of the present invention
  • Meth A tumor-bearing mice were prepared in the same manner as in Example 11, and 6 mice in Group U were tested.
  • the drug conjugate of Example 15 was examined for its antitumor effect when administered once in the same manner as in Example 12. As a result, the drug conjugate of Example 15 showed remarkable enhancement of the antitumor effect and expansion of the effective dose range as compared with the drug compound of Example 12 itself.
  • Test compound dose (mg / kg) 1 ) Inhibition rate (Compound 10 of Example 15 100
  • a tumor mass of human gastric carcinoma SC-6 was implanted subcutaneously into the right inguinal region of a nude mouse (BALB / c-nu / nu, male) to produce a tumor bearing SC-6 nude mouse (5 mice per group). 24 days after transplantation
  • the drug conjugate of Example 15 dissolved in distilled water was administered once intravenously, and the antitumor effect was compared with that of the drug compound itself. As a result, the drug conjugate of Example 15 exhibited a high antitumor effect without showing any toxic death as compared with the pharmaceutical compound itself.
  • Example 54 Antitumor effect of drug conjugate of the present invention
  • Example 15 human lung cancer QG-90 tumor-bearing nude mice were prepared (5 mice per group).
  • the drug conjugate of Example 15 dissolved in distilled water for injection was administered once intravenously, and the antitumor effect was compared with that of the drug compound itself.
  • the drug conjugate of Example 15 showed remarkable enhancement of the antitumor effect and expansion of the effective dose range as compared with the drug compound itself.
  • Test compound Dose (mg / kg) Inhibition rate (number of dead mice / number of mice used No. of drug compound 50 60 0/5
  • Example 55 Antitumor effect of drug conjugate of the present invention
  • Meth A tumor-bearing mice were prepared in the same manner as in Example 11 (6 mice per group). ratio Compared. As a result, the drug conjugate of Example 41 showed remarkable enhancement of the antitumor effect and expansion of the effective dose range as compared with the pharmaceutical compound itself.
  • Example 56 Antitumor effect of drug conjugate of the present invention
  • a Meth A tumor-bearing mouse was prepared in the same manner as in Example 11 (6 mice per group), and a single administration of each of the drug conjugates in Examples 29, 43 and 44 was performed in the same manner as in Example 12. The antitumor effect was examined.
  • Test compound Dose (mg / kg) 1 ) Inhibition rate) Compound of Example 29 30 99
  • Example 11 A Meth A tumor-bearing mouse was prepared in the same manner as in Example 11, and the drug conjugate of Example 1 was administered once (10 mg / kg : equivalent amount of a drug compound) in the same manner as in Example 12 to give a drug conjugate. Changes in concentration in each body tissue were examined. As a result, the drug conjugate of Example 15 showed remarkably high retention in blood, high transferability to tumor tissues, and high tumor selectivity for liver and small intestine. The results are shown in FIG. Industrial applicability
  • a polysaccharide derivative having a carboxyl group can be reacted with a pharmaceutical compound or a pharmaceutical compound having a spacer bonded thereto in good yield, and a side reaction is caused when a pharmaceutical compound having a lactone ring is reacted. Since it can be suppressed, it is extremely useful as a method for producing a drug conjugate.

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Description

明 細 書 薬物複合体の製造方法 技術分野
本発明は、 多糖誘導体と抗腫瘍剤などの医薬化合物とを結合させた薬物複合体 の製造方法に関するものである。 背景技術
肺癌や消化器癌などの固形癌や白血病などの血液癌の治療に際して用いられる 抗腫瘍剤は、 静脈内投与や経口投与などの投与経路により全身的に投与された後、 特定の腫瘍部位に移行して癌細胞の増殖を阻害ないし抑制することにより治療効 果を発揮する。 しかしながら、 全身投与された抗腫瘍剤は、 血中から肝臓 .網内 系臓器に速やかに取り込まれたり、 あるいは速やかに尿中排泄されるために、 血 中濃度が低下して腫瘍部位への移行が十分でない場合がある。 また、 通常の抗腫 瘍剤自体では腫瘍部位への移行選択性 （腫瘍選択性） が低いために、 抗腫瘍剤が 全身の様々な細胞や組織に満逼なく分布してしまい、 正常な細胞や組織に対して も細胞毒として作用するので、 嘔吐、 発熱、 あるいは脱毛などの副作用を極めて 高率に発生させるという問題がある。 従って、 抗腫瘍剤を効率的かつ選択的に腫 瘍部位に移行させる手段の開発が求められている。
このような手段の一つとして、 カルボキシル基を有する多糖誘導体を薬物担体 として用い、 該多糖誘導体に対して抗腫瘍剤を結合させて抗腫瘍剤の血中からの 消失を遅延させるとともに、 癌組織への指向性を高める方法が提案されている。 例えば、 国際公開 W094八 9376 号には、 カルボキシル基を有する多糖のカルボキシ ル基にペプチド鎖 （アミノ酸数 1〜8)が結合されており、 さらにこのペプチド鎖を 介して ドキソルビシン、 ダウノルビシン、 マイ 卜マイシン C、 又はブレオマイシ ンなどを結合した薬物複合体が開示されている。 また、 特公平 7- 84481 号公報には、 カルボキシメチル化されたマンノグルカン誘導体にシッフ塩基ゃ酸ァミ ド結合を 介して上記の抗腫瘍剤を導入した薬物複合体が開示されている。 これらの薬物複 合体は、 薬物送達のキヤリア—に結合されていない抗腫瘍剤自体に比べてより優 れた抗腫瘍効果を有するとともに、 毒性 '副作用が軽減されていることを特徴と している。
その他、 ポリアルコール化多糖誘導体を薬物送達のキヤリア一として用いた薬 物複合体に関する技術については、 「多糖—ペプチド一 ドキソルビシン複合体に 関する研究 ·多糖誘導体の血中安定性と抗腫瘍効果の関係」 （第 10回日本 D D S学 会講演要旨集， 279, 1994)； 「多糖一ペプチド - ドキソルビシン複合体に関する研 究 ·体内動態と抗腫瘍効果」 （第 9回日本薬物動態学会年会講演要旨集， 292, 1994) ；第 19回研究開発動向セミナー （医薬品機構主催） 要旨集， D- 9， 1995 ；及 び 「多糖キャ リア—による腫瘍への薬物送達に関する研究」 （第 12回コロイ ド .界 面技術シンポジウム， 日本化学会， 講演要旨集， 51, 1995) などの報告がある。 従来、 これらの薬物複合体は、 カルボキシメチルプルラン、 カルボキシメチル マンノグルカンなどのカルボキシル基を有する多糖誘導体をナ トリウム塩として 調製した後に、 該多糖誘導体のカルボキシル基と抗腫瘍剤のアミ ノ基 （又は抗腫 瘍剤に結合したペプチド鎖の N末端アミ ノ基） とを酸アミ ド結合させることによ り製造されている。 多糖誘導体のナトリゥム塩は有機溶媒には全く溶解しないた めに、 この反応を行うにあたっては、 多糖誘導体のナ ト リ ウム塩を水又は水を含 む水性有機溶媒の溶液として調製しておき、 この溶液中に縮合剤と塩酸塩などの 形態の抗腫瘍剤 （又はペプチド鎖を有する抗腫瘍剤） とを溶解させる方法が採用 されてきた。
しかしながら、 この反応では脱水縮合反応を水を含む溶媒中で行うために、 目 的物を高収率で得ることが不可能であった。 反応原料として用いる抗腫瘍剤など は一般に高価であり、 製造コス卜の観点から上記の薬物複合体を効率よく製造す る方法の開発が求められていた。 また、 抗腫瘍剤として有用な特開平 6- 87746 号公 報に記載された化合物は分子中にラク トン環を有しているため、 これにペプチド 鎖が結合した化合物を上記の反応に付すると塩基及び水の存在下でラク トン環が 開環し、 生じたカルボキシル基が抗腫瘍剤に結合したぺプチド鎖の N末端アミノ 基と反応して目的物の収率を著しく低減させてしまい、 また、 目的とする均一な 薬物複合体が得られないという問題があった。 このため、 ラク トン環が開環した 化合物の生成を回避できる反応方法の開発が求められていた。 発明の開示
本発明は、 抗腫瘍剤ゃ抗炎症剤などの有効成分を腫瘍部位などに対して部位選 択的に移行させることができる薬物複合体を効率的に製造する方法を提供するこ とを課題としている。 より具体的には、 カルボキシル基を有する多糖誘導体と抗 腫瘍剤等の医薬化合物又は医薬化合物を結合させたォリゴぺプチド等のスぺーサ一 とを効率よく反応させて、 薬物複合体を大量かつ安価に製造することができる方 法を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、 カルボキシル基を有 する多糖誘導体を医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスぺーサ—と反応させ るにあたり、 従来用いられてきた多糖誘導体のナ卜リゥム塩に替えて有機ァミ ン との塩を用いると、 多糖誘導体の塩を実質的に水を含まない有機溶媒中に高濃度 に溶解することができ、 多糖誘導体と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたス ぺーサ一との反応を極めて収率よく行うことができ、 しかも副生成物などを低減 させることができることを見出した。 本発明はこれらの知見を基にして完成され たものである。
すなわち本発明は、 カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基と が 1個のァミノ酸からなるスぺ一サ一若しくはべプチド結合した 2〜8 個のァミノ 酸からなるスぺーサーを介して結合している薬物複合体、 又はカルボキシル基を 有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが該スぺ一サーを介さずに結合している 薬物複合体の製造方法であって、 カルボキシル基を有する多糖誘導体の有機ァミ ンとの塩と医薬化合物又はスぺ一サを結合させた医薬化合物とを非水系で反応さ せることを特徴とする方法；並びに、 該薬物複合体の製造方法であって、 以下の 工程：（1) カルボキシル基を有する多糖誘導体のアルカリ金属塩を有機アミ ンとの 塩に変換する工程；及び (2) 該有機ァミンとの塩と医薬化合物又はスぺーサを結合 させた医薬化合物とを非水系で反応させる工程を含む方法を提供するものである。 本発明の好ましい態様によれば、 カルボキシル基を有する多糖誘導体がカルボ キシ —4アルキルデキス 卜ランポリアルコールである上記方法； カルボキシ アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキス トランポリアルコールが、 実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキス トランを処理して得られ たデキス トランポリアルコールであることを特徴とする上記方法； カルボキシ c λ _ 4アルキルデキス トランポリアルコールがカルボキシメチルデキス 卜ランポリ アルコールである上記方法； カルボキシ 4アルキルデキス 卜ランポリアルコール が、 分子量 5, 000〜500, 000 の範囲、 好ましくは 50, 000〜450，000 の範囲、 より好 ましくは 200, 000〜400, 000 の範囲のカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコ一 ルであり、 カルボキシメチル化度が構成糖残基あたり 0. 01〜2. 0 の範囲、 好ましく は 0. 1〜1. 0 の範囲、 より好ましくは 0. 3〜0. 5 の範囲である上記方法；並びに、 医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である上記方法が提供される。
さらに本発明の好ましい態様により、 医薬化合物がラク トン環を形成しうる化 合物である上記方法；有機ァミ ンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させ たスぺーサ一との反応において、 ラク トン環を形成した医薬化合物又はラク 卜ン 環を形成した医薬化合物を結合させたスぺ一サーを用いる上記方法；及び、 ラク トン環を形成しうる上記医薬化合物が （1S，9S) -卜 アミノ- 9- ェチル- 5- フルォロ -2, 3 - ジヒ ドロ- 9- ハイ ドロキシ -4- メチル- 1H, 12H-ベンゾ [de]ピラノ [3 ' , 4 ' : 6, 7] インドリジノ [し 2- b] キノ リン - 10， 13(9H, 15H)- ジオンである上記方法が提供 される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の方法で製造した例 8の薬物複合体の GPC チヤ— 卜を示す図で ある。
第 2図は、 本発明の方法で製造した例 8の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トル を示す図である。
第 3図は、 本発明の方法で製造した例 9の薬物複合体の GPC チヤ一トを示す図で ある。
第 4図は、 本発明の方法で製造した例 9の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トル を示す図である。
第 5図は、 本発明の方法で製造した例 1 0の薬物複合体の紫外線吸収スぺク 卜 ルを示す図である。
第 6図は、 本発明の方法で製造した例 15の薬物複合体の GPC チヤ—トを示す図で め 。
第 7図は、 本発明の方法で製造した例 15の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。
第 8図は、 本発明の方法で製造した例 28の薬物複合体の GPC チャートを示す図で ある。
第 9図は、 本発明の方法で製造した例 28の薬物複合体の薬物複合体の紫外線吸収 スぺク トルを示す図である。
第 10図は、 本発明の方法で製造した例 29の薬物複合体の GPC チヤ一トを示す図で ある。
第 11図は、 本発明の方法で製造した例 29の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。
第 12図は、 本発明の方法で製造した例 34の薬物複合体の GPC チヤ—トを示す図で ある。
第 13図は、 本発明の方法で製造した例 34の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。
第 14図は、 本発明の方法で製造した例 39の薬物複合体の GPC チャートを示す図で ある。
第 15図は、 本発明の方法で製造した例 39の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。
第 16図は、 本発明の方法で製造した例 41の薬物複合体の GPC チヤ—トを示す図で ある。
第 Π図は、 本発明の方法で製造した例 41の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。
第 18図は、 本発明の方法で製造した例 44の薬物複合体の GPC チヤ一卜を示す図で ある。
第 19図は、 本発明の方法で製造した例 44の薬物複合体の紫外線吸収スぺク トルを 示す図である。 第 20図は、 本発明の方法で製造した例 の薬物複合体の体內動態を示す図である。 図中の各点は 3例の平均値を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の製造方法により製造される薬物複合体は、 カルボキシル基を有する多 糖誘導体と医薬化合物の残基とが 1個のァミノ酸からなるスぺ一サ一若しくはべ プチド結合した 2〜8 個のァミノ酸からなるスぺ一サ一を介して結合しているか、 又はカルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが該スぺ—サ—を 介さずに結合していることを特徴としている。
薬物複合体に含まれる医薬化合物の残基は、 例えば、 抗腫瘍剤、 抗炎症剤、 抗 菌剤などの医薬としてヒ トを含む哺乳類の病気の治療及び Z又は予防に用いられ る医薬化合物に由来し、 その部分構造により構成される。 もっとも、 該残基が由 来する医薬化合物は上記のものに限定されることはない。 また医薬化合物として は、 多糖誘導体又はスぺ—サ一との結合に関与できる 1又は 2以上の反応性官能 基 （例えば、 アミノ基、 カルボキシル基、 水酸基、 チオール基、 エステル基など） を有するものであればいかなるものを用いてもよい。 本明細書において医薬化合 物という場合には、 それ自体が医薬作用を有する化合物の主要構造をその部分構 造として含み生体内で該化合物を再生することができるプロ ドラッグ化合物も含 まれる。
より具体的には、 本明細書において医薬化合物の残基とは、 多糖誘導体又はス ぺ―サ一と医薬化合物残基との結合が医薬化合物中の反応性官能基と多糖誘導体 又はスぺーサ一中の反応性官能基との反応 （例えば脱水縮合など） により形成さ れたと仮定した場合において、 結合後の化合物中に存在する医薬化合物に由来す る部分構造を意味している。 例えば、 医薬化合物が D- NH2, D COOH, D-COOR, D- OH, D-SH, D-CONH , D-NH-COOR (R は低級アルキル基等） で表される場合、 医薬化 合物の残基はそれぞれ D-NH- (D-NH-C0-Q など）， D-CO- (D-CO-NH-Q, D-C0-0-Q, D-C0-S-Q など）， D-CO- (D-CO-NH-Q, D-C0-0-Q, D-C0-S-Q など）， D-0- (D - 0- CO - Q, D- 0- Qなど）， D-S- (D-S-CO-Q, D- S - Qなど）， D-C0NH- (D- CO- NH- CO- Qなど）， D-NH-CO- (D-NH-C0-0-Q, D-NH- CO- NH-Qなど） で表される （カツコ内はスぺ—サ— 又は多糖誘導体と医薬化合物残基との結合を示し、 Q はスぺ—サー及び多糖誘導体 からそれぞれ反応性官能基及びカルボキシル基を除いた残りの部分構造を示す） 。 もっとも、 スぺーサ—又は多糖誘導体と医薬化合物残基との結合の種類は上記の ものに限定されることはない。 医薬化合物の残基は、 多糖誘導体のカルボキシル 基、 スぺーサ一の N末端ァミノ基若しくは C末端カルボキシル基、 又はスぺ一サ一 を構成するァミ ノ酸に存在する反応性官能基に結合していてもよい。
医薬化合物の残基としては、 例えば、 ドキソルビシン、 ダウノルビシン、 マイ トマイシン C、 ブレオマイシン、 シクロシチジン、 ビンク リスチン、 ビンブラス チン、 メ ト トレキセ一 卜、 白金系抗腫瘍剤 （シスブラチン若しくはその誘導体） 、 タキソ一ル若しくはその誘導体、 カンプトテシン若しくはその誘導体 （特開平 6 - 87746 号公報に記載された抗腫瘍剤、 好ましくは請求項 2に記載された （IS, 9S) - 1 - ァミ ノ- 9- ェチル -5- フルォロ- 2, 3 - ジヒ ドロ- 9- ハイ ドロキシ- 4- メチル- 1H, 12H-ベンゾ [de]ピラノ [3 ' , 4 ' : 6, 7] イン ドリ ジノ [1， 2 - b] キノ リ - 10, 13(9H, 15H)- ジオン等） などの抗腫瘍剤の残基を好適に用いることができる。 また、 例え ば、 コハク酸ヒ ドロコルチゾン、 コハク酸プレ ドニゾロンなどのステロイ ド系抗 炎症剤、 又はメ フヱナム酸、 フルフヱナム酸、 ジクロフヱナク、 ィブプロフェン、 チノ リジンなどの非ステロイ ド系抗炎症薬の残基も好適である。
医薬化合物の残基は多糖誘導体と直接結合していてもよいが、 スぺ—サ—を介 して結合していてもよい。 このようなスぺ一サ一としては、 1個のアミ ノ酸から なるスぺ一サ一又はべプチド結合した 2〜8 個のァミノ酸からなるスぺ一サ一を用 いることができる。 より具体的には、 医薬化合物の残基と多糖誘導体とがスぺ一 サ一を介して結合している場合には、 該スぺーサ一は、 1個のアミノ酸の残基 （ァ ミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基からそれぞれ 1個の水素原子及び 1個の水 酸基を除いた残基を意味する） 、 又はペプチド結合した 2ないし 8個のアミノ酸 からなるォリゴぺプチドの残基 （N末端のァミノ基及び C末端のカルボキシル基 からそれぞれ 1個の水素原子及び 1個の水酸基を除いた残基を意味する） の形態 を有している。
好ましいスぺ一サ一は 2〜 6個のァミノ酸からなるォリゴぺプチドの残基であ る。 スぺ一サ一を構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、 例えば、 L-又は D-アミノ酸、 好ましくは L-アミノ酸を用いることができ、 ひ一アミノ酸のほか、 β —ァラニン、 ε —アミ ノカプロン酸、 7—ァミ ノ酪酸などを用いてもよい。 この ような α —アミノ酸以外のァミノ酸は、 スぺ一サ—中で多糖誘導体に近接した位 置に配置されることが好ましい。
例えばォリゴぺプチドスぺーサ一を用いる場合の結合方向は特に限定されない 力、 一般的には、 カルボキシ Cj_4アルキルデキス トランポリアルコールのカルボキ シル基にスぺ一サ一の N末端を酸アミ ド結合によって結合し、 医薬化合物のアミ ノ基にスぺ一サ一の C末端を結合することができる。 また、 例えば、 ペプチドス ぺーサの構成単位としてリジン残基を含めておき、 リジン残基の α —アミノ基及 び £—アミ ノ基をそれぞれ他のァミノ酸のカルボキシル基と酸ァミ ド結合させる と、 ペプチドスぺーサ一の両末端が Ν末端になるので、 医薬化合物のカルボキシ ル基を結合することが可能になる。 さらに、 スぺーサ一中に 1個又は 2個以上の ジア ミ ン化合物またはジカルボン酸化合物の残基 （例えばエチレンジアミ ンなど のジアミ ンの残基ゃコハク酸などのジカルボン酸の残基など） を構成単位として 含めておき、 それぞれ両末端が Ν末端のスぺ一サー及び両末端が C末端のスぺー サーを利用してもよい。
ォリゴぺプチドからなるスぺ一サ一を用いる場合のァミノ酸配列は特に限定さ れないが、 例えば、 スぺ一サ一が -Χ-Ζ-で表されるジペプチドの残基 （X は疎水性 ァミノ酸の残基を示し、 I は親水性ァミノ酸の残基を示し、 - Χ-Ζ- は疎水性ァミノ 酸（X) と親水性アミノ酸 (Ζ) とがそれぞれ Ν末端側及び C末端側となってペプチド 結合したジぺプチドの Ν末端のァミノ基及び C末端のカルボキシル基からそれぞ れ 1個の水素原子及び 1個の水酸基を除いた残基を意味する） であるか、 又は該 ジぺプチドの残基を部分べプチド配列として含むスぺーサ一を好適に用いること ができる。 疎水性アミ ノ酸としては、 例えば、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 口 イシンなどを用いることができ、 親水性ァミノ酸としては、 例えば、 グリシン、 ァラニンなどを用いることができる。 スぺーサ一がこのようなジぺプチド残基の 繰り返し配列 （例えば- X- Ζ- X- Ζ- , - X- Ζ-Χ- Ζ- Χ-Ζ-など） を有していてもよい。
このようなジぺプチド構造を含むスぺーサ一を用いると、 スぺ一サ一がぺプチ ダ―ゼが豊富であると考えられる腫瘍部位や炎症部位で加水分解され、 当該部位 において医薬化合物が高濃度に遊離するので、 上記ジぺプチドを含むスぺーサー と医薬化合物とが結合して形成される構造は、 本発明の方法により製造される薬 物複合体の好ましい部分構造である。 医薬化合物の残基として、 濃度に依存した 抗腫瘍作用を発現する抗腫瘍剤 （より高い濃度でより強い抗腫瘍作用を発現する 抗腫瘍剤：濃度依存型の抗腫瘍剤、 例えば、 ドキソルビシンなど） の残基を用い る場合には、 - x-z- で示される上記のジペプチド残基からなるスぺ一サ一又は該ジ ぺプチド残基を部分べプチド配列として含むスぺーサーを用いることが特に好ま しい。
また、 医薬化合物の残基として、 一定の濃度以上で作用時間の持続を必要とす る時間依存型の抗腫瘍剤を用いる場合にも、 上記のスぺ一サ一を用いることによ つて高い抗腫瘍効果を達成できる場合があり、 例えば、 特開平 6- 87746 号公報に記 載された抗腫瘍剤、 好ましくは請求項 2に記載された抗腫瘍剤が挙げられる。 一 般的には、 上記のスぺーサ一に限定されることなく、 抗腫瘍剤の作用機作、 体内 動態や毒性発現の特徴、 体内での抗腫瘍剤の遊離性などの観点から好ましいスぺー サ一を選択する必要がある。 なお、 一般的に、 増殖の速い癌種に対しては、 短時 間に高濃度の医薬化合物を遊離することができる上記のスぺーサ一を選択するこ とが好ましい。
スぺーサ一の具体例を以下の表に示すが、 本発明の薬物複合体の製造方法に用 いられるスぺーサ一は以下のものに限定されることはなく、 医薬化合物の至適な 遊離速度を与えるように当業者が適宜選択可能であることはいうまでもない。 表 中、 ペプチド配列は左側が N末端であり、 C末端側に医薬化合物の残基が結合す る。 D - Phe は D-フヱニルァラニン残基を示し、 その他のアミノ酸は L -アミノ酸を示 す。 なお、 遊離速度の大小はドキソルビシンを結合した薬物複合体の Walker 256 担癌ラッ 卜に対する薬効の発現の程度、 または Walker 256 担癌ラッ 卜の腫瘍部 位における遊離ドキソルビシンの濃度によって判定したものである。 これらのス ぺ一サ一のうち、 ドキソルビシンに対しては （N末端）- Gly-Gly- Phe- Gly-等の短時 間に高濃度の医薬化合物を遊離することができるスぺーサ一を用いることが好ま しい。 表 1
(a) 遊離速度が大きいスぺーサー - Leu - Gly -
-Tyr-Gly- -Phe-Gly- - Gly- Phe- Gly - -Gly-Gly-Phe-Gly- - Gly- Phe- Gly- Gly- -Phe- Gly- Gly- Gly - - Phe- Phe-Gly- Gly- - Gly- Gly- Gly- Phe- Gly -
(b) 遊離速度が比較的大きいスぺ—サ' - Gly- Gly- Phe- Phe -
- Gly - Gly - Gly - Gly - Gly - Gly -
(c) 遊離速度が比較的小さいスぺ—サ' - Phe - Phe -
- Ala - Gly - -Pro-Gly- - Gly- Gly- Gly- Phe -
(d) 遊離速度が小さいスぺーサ— - Gly-
- D - Phe- Gly-
-Gly- Phe- 一 Ser— 丄 y—
— Gly—ij丄 y—
-Gly-Gly-Gly-
- Gly - Gly - Gly - Gly- 薬物複合体の多糖誘導体部分を構成するカルボキシル基を有する多糖誘導体と しては、 例えば、 多糖類又はそれらを化学的若しくは生物学的に修飾した誘導体 であって分子中にカルボキシル基を有するものであればいかなるものを用いても よい。 例えば、 ヒアルロン酸、 ぺクチン酸、 アルギン酸、 コンドロイチン、 へパ リンなどの多糖類のほか、 プルラン、 デキストラン、 マンナン、 キチン、 ィヌ リ ン、 レノくン、 キンラン、 ァラバン、 マンノグルカン、 キ トサンなどの多糖の一部 又は全部の水酸基に対してカルボキシル基を有する官能基を導入したものなどを 用いることができる。 例えば、 水酸基をカルボキシ アルキル化したものや、 水 酸基に多塩基酸の一のカルボキシル基をエステル結合させたものなどを好適に用 いることができる。 また、 上記の多糖類をポリアルコール化した後に、 カルボキ シル基を有する官能基を導入したものを用いてもよい。
これらの多糖誘導体のうち、 カルボキシ (卜 アルキルデキストランポリアルコ一 ルを用いることが好ましい。 カルボキシ (， 4アルキルデキストランポリアルコール のポリアルコール化度は特に限定されないが、 カルボキシ (^_4アルキルデキストラ ンポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、 実質的に完全にポ リアルコール化可能な条件下においてデキストランを処理して得られたデキス 卜 ランポリアルコールであることが好ましい。
カルボキシ (^— 4アルキルデキス トランポリアルコールを製造するために用いる デキス 卜ランの種類は特に限定されず、 a - D- 1, 6- 結合を任意の割合で含んでいて もよい。 例えば、 a -D- 1, 6- 結合の割合が 85%以上、 90%以上、 又は 95!¾ 以上のデ キストランなどを用いることができる。 デキス 卜ランの分子量は特に限定されな いが、 例えば 10, 000 程度から 2, 000， 000程度のもの、 好ましくは 50, 000 程度か ら 800, 000程度のものを用いることができる。 カルボキシ _4アルキルデキストラ ンポリアルコールのカルボキシ アルキル基を構成する (^_4アルキルとしては、 直鎖又は分枝鎖の アルキル、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n-プロピル基、 イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基などを用いることができる力 好まし くはメチル基を用いることができる。
本発明の方法は、 上記の薬物複合体を製造するにあたり、 カルボキシル基を有 する多糖誘導体の有機アミ ンとの塩と医薬化合物自体、 又はカルボキシル基を有 する多糖誘導体の有機ァミ ンとの塩と医薬化合物を結合させたスぺ一サ—とを実 質的に水を含まない有機溶媒中、 すなわち非水系で反応させることを特徴として いる。 以下、 本発明の方法の好ましい態様として、 カルボキシ —4アルキルデキス トランポリアルコールを多糖誘導体として用いる場合について具体的に説明する 力、 本発明の範囲はこれらの態様に限定されることはない。
出発原料としてデキストランを用いる場合には、 デキストランに大過剰の過ョ ゥ素酸ナ卜リゥムと水素化ホウ素ナ卜リゥムとを順次作用させてデキス トランを 実質的に完全にポリアルコール化したデキストランポリアルコールを製造するこ とができる。 もっとも、 デキス トランのポリアルコール化の方法は上記のものに 限定されることはなく、 当業者に利用可能なものであればいかなる方法を採用し てもよい。 カルボキシ アルキル化は、 例えば、 デキストランポリアルコールの 水酸基に対してクロル酢酸、 ブロム酢酸、 α —クロルプロピオン酸、 ひ 一メチル — ひ 一クロルプロピオン酸、 /S —クロルプロピオン酸、 ひ 一メチルー ^—クロル プロピオン酸、 α —クロル酪酸、 /S —クロル酪酸、 ァ一クロル酪酸などのハロゲ ン化 —4アルキルカルボン酸、 好ましくはクロル酢酸を反応させて水酸基を部分的 又は完全にカルボキシ アルキル化することにより行うことができる。
例えば、 デキス トランポリアルコールを反応に関与しない不活性溶媒 （例えば、 水、 Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） に溶解し、 塩基 （例え ば、 水酸化ナ卜リゥムゃ水酸化力リゥム等） の存在下にハロゲン化 —4アルキル力 ルボン酸またはその塩を添加し、 氷冷下ないし 100 °C程度の温度範囲で数分ないし 数日間反応させればよい。 カルボキシ (^ー4アルキル基の導入の程度は、 例えば、 力 ルボキシ _λアルキル化の反応温度や試薬として用いるハロゲン化 C j—4アルキル力 ルポン酸及び塩基の量を適宜選択することにより容易に調節可能であり、 そのよ うな手段は当業者に周知である。 デキストランポリアルコールの水酸基に対する カルボキシ アルキル化の程度は特に限定されないが、 例えば、 構成糖残基あた り 0. 01〜2, 0 の範囲、 好ましくは 0. 1〜1. 0 、 より好ましくは 0. 3〜0. 5 の範囲で ある。 カルボキシ 4アルキルデキストランポリアルコールの分子量は、 ゲルろ過 法で測定した場合に 5, 000から 500， 000程度、 好ましくは 50， 000〜450, 000 程度、 より好ましくは 200, 000 〜400, 000 程度である。 このようにして製造されるカルボキシ (^—4アルキルデキス 卜ランポリアルコ一 ルは、 ナトリゥム塩又は力リゥム塩などのアル力リ金属塩の形態の水溶液として 調製される。 本発明の方法では、 このような多糖誘導体のカルボキシル基に対し て医薬化合物又は医薬化合物の残基と結合させたスぺ一サーを結合させるにあた り、 上記のアルカリ金属塩の形態の多糖誘導体に替えて、 有機アミ ンとの塩の形 態の多糖誘導体を用いることを特徴としている。 このような有機ァミ ンとの塩の 形態の多糖誘導体は、 実質的に水を含まない有機溶媒中に高濃度に溶解でき、 反 応を非水系で行うことを可能にするので、 反応効率を著しく高めることができる。 有機ァミ ンとの塩としては、 例えば、 ト リェチルァミ ン、 卜リメチルァ ミ ン、 トリエタノールァミ ンなどの脂肪族ァミ ン類の塩のほか、 N-メチルピロリジン、 N -メチルピぺリ ジン、 N-メチルモルホリ ン、 ジメチルァミ ノ ピリ ジンなどの脂環式 又は芳香族ァミ ン類の塩、 塩化テトラメチルアンモニゥム、 塩化テトラェチルァ ンモニゥムなどの四級アンモニゥム塩、 などを用いることができる。 多糖誘導体 のナトリ ゥム塩から有機ァミ ンとの塩への変換は、 イオン交換樹脂などを用いて 行うことができる。 例えば、 カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナ 卜リゥム塩を水に溶解し、 Bio- Rad AG50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 H + 型） 樹脂を 充填したカラムに付して水で溶出した後、 トリェチルァミ ンなどの有機ァミ ンを 添加して凍結乾燥することができる。 また、 カルボキシメチルデキス トランポリ アルコールのナ 卜リゥム塩を水に溶解し、 卜リェチルアンモニゥム型の樹脂を通 過させることによって一工程で変換を行うことも可能である。
医薬化合物自体とカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのカルボキシ ル基との結合、 又は医薬化合物を結合させたスぺーサ一とカルボキシメチルデキ ス トランポリアルコールのカルボキシル基との結合は、 一般的には、 医薬化合物 が有する反応性ァミノ基又はスぺ一サ一の N末端ァミ ノ基とカルボキシメチルデ キス トランポリアルコールのカルボキシル基とを、 酸アミ ド結合させればよい。 もっとも、 医薬化合物又はスぺーサ一とカルボキシメチルデキス 卜ランポリアル コールのカルボキシル基との結合は上記のものに限定されることはなく、 他の化 学結合や 1又は 2以上のスぺーサーを利用した結合であってもよい。 例えば、 ス ぺ一サ一の C末端カルボキシル基又は医薬化合物のカルボキシル基とカルボキシ メチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とにより酸無水物を形成さ せてもよく、 また、 エチレンジアミ ン等のジァミ ン化合物をスぺ一サ一として用 いてそれぞれのカルボキシル基をジァミ ンの各アミノ基に酸ァミ ド結合させても よい。
医薬化合物が有する反応性ァミノ基又はスぺ一サ一の N末端ァミ ノ基とカルボ キシメチルデキス トランポリアルコールのカルボキシル基とを酸ァミ ド結合によ り結合させる場合には、 ペプチド鎖の合成に用いる通常の脱水縮合剤、 例えば、 N, Ν ' - ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド（DCC) のような Ν, Ν ' - ジシクロアルキル力 ルボジイミ ド類、 1-ェチル- 3 -（3 -ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ド（EDAPC) 等のカルポジイ ミ ド誘導体、 1-ヒ ドロキシベンゾ卜 リアゾ一ル（Η0ΒΤ)のようなベン ゾ卜 リアゾ一ル誘導体のほか、 卜エトキンカルボニル- 2- エトキシ- 1, 2- ジヒ ドロ キシキノ リ ン （EEDQ) などを用いることができる。 また、 活性エステル法や酸ハラ ィ ド法などにより反応を行ってもよい。
反応は実質的に水を含まない有機溶媒であって、 反応種 （カルボキシメチルデ キス トランポリアルコールの有機ァミ ンとの塩及び医薬化合物又は医薬化合物を 結合させたスぺーサ一） を溶解することができるものならばいかなるものを用い てもよい。 例えば、 Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシ ド、 ァセ 卜ァ ミ ド、 Ν -メチルピロリ ドン、 スルホランなどを用いることが好適である。 医薬化合 物又は医薬化合物を結合させたスぺ一サーを反応させることによりカルボキシメ チルデキストランポリアルコールに導入される医薬化合物残基の量は特に限定さ れないが、 医薬化合物残基の物理化学的性質、 並びに薬物複合体の体内動態、 薬 効、 及び毒性などの観点から適宜選択すべきである。 一般的には、 0. 1 〜30重量％、 好ましくは 1〜15重量％程度の範囲を選択することができる。 カルボキシメチルデ キストランポリアルコールに導入された医薬化合物残基の割合は、 例えば、 吸光 度分析などにより容易に決定することが可能である。
本発明の製造方法の好ましい態様として、 特開平 6- 87746 号公報の請求項 2に記 載された抗腫瘍剂である医薬化合物を結合したォリゴぺプチドをカルボキシメチ ルデキス トランポリアルコールに導入する方法を以下のスキームに示すが、 本発 明の方法はこのスキームに示されたものに限定されることはない。 下記スキーム において、 医薬化合物残基の導入量は、 例えば 1〜15重量％、 好ましくは 4〜8 重量％程度である。 また、 下記スキーム中には、 ポリアルコール類の構成単位の うち 1個又は 2個のカルボキシメチル基が導入された構成単位のみを例示的に記 載したが、 薬物複合体の多糖誘導体部分は上記構成単位の繰り返しによつて構成 されるものではないことを理解すべきである。
ポリアルコール
Figure imgf000018_0001
-NH-A
Figure imgf000018_0002
薬物複合体
Figure imgf000019_0001
上記スキーム中の医薬化合物は、 酸性水性媒体中 （例えば pH 3程度） ではラク 卜 ン環を形成した化合物 （閉環体） に平衡が偏り、 一方、 塩基性水性媒体中 （例え ば pH 10 程度） ではラク トン環が開環した化合物 （開環体） に平衡が偏ることが知 られているが、 このような閉環体及び開環体に対応する残基を導入した薬物複合 体は同等の抗腫瘍効果を有している。 しかしながら、 カルボキシメチルデキス 卜 ランポリアルコールと上記医薬化合物を結合させたスぺ一サ— （例えばォリゴぺ プチド · スぺーサ一） とを反応させる場合に開環型の反応種が反応系に存在する と、 ラク トン環に由来するカルボキシル基とスぺ一サ一由来のァミ ノ基との間で 縮合反応が進行し、 著しく反応収率が低下するだけでなく、 目的とする均一な薬 物複合体が得られない場合がある。 このような副反応は、 平衡が達成されない非 水系において反応種として閉環体を用いることにより回避することができる。 従 つて、 本発明の方法は上記の医薬化合物を含む薬物複合体の製造に特に好適であ る。
本発明の方法により製造される上記の薬物複合体は、 医薬化合物の残基の種類 (例えば、 抗腫瘍剤または抗炎症剤などの医薬化合物の残基） に応じて、 所望の 医薬活性を腫瘍部位や炎症部位などの局所において特異的に発現させることがで き、 かつ、 医薬化合物自体の有する毒性を低減できるという特徴を有する。 例え ば、 多糖誘導体部分であるカルボキシメチルデキス トランポリアルコールは薬物 送達のキヤリア一として極めて優れた血中滞留性及び腫瘵 ·炎症部位への集積性 を有しており、 上記の薬物複合体は腫瘍選択性及び炎症部位選択性を有している。 また、 腫瘍部位や炎症部位ではプロテアーゼ （ぺプチダ—ゼ） が発現されている と考えられるので、 ォリゴぺプチドからなるスぺーサ一を有する薬物複合体はス ぺ―サ一部分で容易に加水分解され、 遊離した医薬化合物が薬効を発揮する。 本発明の方法により製造された薬物複合体を含む医薬は、 通常、 凍結乾燥品な どの形態でバイアル等に充填することができ、 用時溶解型の注射用または点滴用 製剤等の非経口投与用製剤として臨床に提供されるが、 このような医薬の製剤形 態は上記態様に限定されることはない。 上記製剤の製造には、 例えば、 溶解補助 斉 lj、 pH調節剤、 安定化剤など当業界で利用可能な製剂用添加物を用いて製造される 医薬組成物を用いることができる。 上記医薬の投与量は特に限定されないが、 通 常は、 医薬化合物残基を構成する医薬化合物の投与量、 薬物複合体中に導入され た医薬化合物の残基の量、 患者の状態や疾患の種類などを勘案して決定すべきで ある。 例えば、 特開平 6-87746 号公報の請求項 2に記載された抗腫瘍剤の残基が約 6重量! ¾ 程度の割合で導入された薬物複合体を非経口投与する場合には、 一般に 一日あたり体表面積 1 にっき約 1〜500 mg程度、 好ましくは約 10〜100 mg の 範囲で一回投与し、 3〜4 週毎に繰り返すことが好ましい。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。 実施例中、 「A- NH- 」 は、 特開平 6- 87746 号公 報の請求項 2に記載された医薬化合物 （実施例中で 「DX- 8951 」 という場合がある） などのようにラク トン環を有する医薬化合物において、 ラク トン環が閉環した医 薬ィ匕合物を A-NHoで表した場合の医薬化合物残基を表し、 その一例は、 上記のスキー ム中に A- NH- で示した基 （ラク トン環を形成したもの） である。 また、 Α ' - NH -は、 Α-ΝΗ- で表される医薬化合物残基中のラク トン環が閉環型若しくは開環型のいずれ か又はそれらの混合形態であることを示す。
また、 実施例中、 特に言及しない場合には、 カルボキシメチルデキス 卜ランポ リアルコールのカルボキシメチル化度 （構成糖残基あたりのカルボキシメチル基 の置換度） は、 カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を 遊離酸型に変換した後、 0. 1N 水酸化ナトリウム水溶液に溶解して 0. 1N 塩酸で滴 定することにより求めた。 カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナト リウム塩の水溶液を Bio- Rad AG50W-X 2(H+ 型） カラムに付して通過液を凍結乾燥 して試料として用いた。 この試料を所定過剰量の 0. 1N水酸化ナトリゥム水溶液に 溶解し、 フエノールフタレンを指示薬として 0. 1N 塩酸で滴定した。 試料の採取量 を s(mg)、 0. IN 水酸化ナトリゥム水溶液の所定過剰量を a(ml)、 0. IN 塩酸の滴 定量を b(ml)とし、 カルボキシメチル化度を 13. 4(a - b)/ [s - 5. 8(a-b)] の式により 求めた。 また、 薬物の導入量 （重量％) は、 薬物の特性吸収を利用した吸光度分 析 （362 nm付近） から求めた。 さらに、 ゲル濾過法は次の条件に従って行った （力 ラム ： TSK gel G4000 PW 、 溶離液： 0. 1M NaCl、 流速： 0. 8 ml/min、 力ラム温度： 40°C)
例 1 ： 3 ' - N- (Boc- Gly- Gly- Phe- Gly)- NH- A (A-NH2 =M- 8951)
Figure imgf000021_0001
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (600 mg)および N- ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （160 mg) を N, N- ジメチルホルムアミ ド （20 ml)に溶解し、 4 °Cに冷却した後、 Ν, Ν ' - ジ シクロへキシルカルボジィ ミ ド （280 mg) を添加した。 この溶液に特開平 6- 87746 号公報の請求項 2に記載された医薬化合物のメタンスルホン酸塩 （600 mg : 上記 公報の実施例 50に記載された化合物） とトリエチルァミン （0. 16 ml)を溶解した N, N -ジメチルホルムアミ ド （30 ml)溶液を加えて、 遮光下に室温で 16時間撹拌しなが ら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ フィー （溶出液： 0. 5%酢酸を含むジクロロメタン ： メタノール = 10 : 1 溶液） で精 製して標記化合物 （1. 0 g)を得た。
H-NMR (DMSO-dg) δ： 8. 40 (d, 1H, J=8. 3 Hz), 8. 10-8. 17 (m, 2H), 7. 91-8. 01 (m, 1H), 7.78 (d, 1H, J=10.75 Hz), 7.32 (s, 1H), 6.94-6.96 (m, 1H), 6.50 (s, 1H),
5.57 (t, 1H, J= 4.5Hz), 5.43 (s, 2H)， 5.23 (s, 2H), 3.77 (dd, 2H, J= 5.85Hz, J = 8.80Hz), 3.70 (d, 2H, J= 4.40Hz), 3.65 (d, 2H, J= 5.35Hz), 3.56 (d, 2H, J= 5. 85), 3.15-3.25 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.05-2.25 (m, 1H), 1.86 (ra， 2H)， 1.35 (s, 9H)， 0.88 (t, 3H, J- 7.35).
Mass (FAB)； m/e 854 (M+l)
例 2 ： 3 ' -N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A- NH2 =DX- 8951)の合成
Boc - Gly - Gly - Gly-Phe (600 mg)および N-ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （160 mg) を Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド （20 ml)に溶解し、 4°Cに冷却した後、 Ν,Ν'- ジシク 口へキシルカルボジィ ミ ド （280 mg) を添加した。 この溶液に DX- 8951 のメタン スルホン酸塩 （600 mg) と ト リエチルァミ ン （0.16 ml)を溶解した Ν,Ν-ジメチルホ ルムアミ ド （30 ml)溶液を加えて、 遮光下に室温で 16時間撹拌しながら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィー （溶出液： 0.5 酢酸を含むジクロロメタン ： メタノール = 10:1 溶液） で精製して標記化合物 (700 nig) を得た。
½-NMR (DMSO-dg) δ： 8.57 (d, 1H, J= 7.8Hz), 8.19 (d, III), 8.05-8.07 (m, 2H), 7.79 (d, 1H, J= 11.2Hz), 7.32 (s, 1H), 7.10 (d, 2H, J= 7.8Hz), 6.93-7.03 (m, 4H),
6.51 (s, 1H), 5.52-5.55 (m, 1H), 5.44 (s,2H), 5.18 (d, 111, J= 18.5Hz), 4.84 (d, 1H, J= 18.5Hz), 4.57-4.59 (m, 1H), 3.57-3.71 (in, 6H)， 3.15-3.25 (m, 2H)， 3.00-3.02 (m, 1H), 2.80- 2.90 (m， 1H)， 2.40 (s, 3H), 2.05-2.25 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.35 (s, 9H)， 0.88 (t, 3H, J= 7.35Hz).
Mass (FAB) ； m/e 854 (M+l)
例 3 ： 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-匪2 =DX- 8951)の合成
Boc - Gly- Gly- Gly - Gly (120 mg)および N -ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （39 mg)を N, N-ジメチルホルムアミ ド （20 ml)に溶解し、 4 °Cに冷却した後、 Ν,Ν' - ジシクロへ キシルカルボジィ ミ ド （70 mg)を添加した。 この溶液に M-8951 のメタンスルホ ン酸塩 （150 mg) と トリェチルアミ ン （0.039 ml) を溶解した N， N-ジメチルホルム アミ ド （10 ml)溶液を加えて、 遮光下に室温で 16時間撹拌しながら反応させた。 こ の反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマ 卜グラフィ 一 （溶出液 ： ジクロロメタン ： メタノール = 10:1 溶液） で精製して標記化合物 （100 mg) を得 た。
½ - NMR (DMSO-d^) δ： 8.40 (d, 1H, J= 8.3 Hz), 8.10-8.17 (ra, 2H), 7.91-8.01 (m, 1H), 7.78 (d, 1H, J= 10.75 Hz), 7.32 (s, 1H)， 6.94-6.96 (m, 1H), 6.50 (s, 1H),
5.57 (t, 1H, J= 4.5Hz), 5.43 (s，2H)， 5.23 (s, 2H), 3.77 (dd, 2H, J= 5.85Hz' J = 8.80Hz), 3.70 (d, 2H, J= 4.40Hz), 3.65 (d, 2H, J= 5.35Hz), 3.56 (d, 2H, J= 5. 85Hz), 3.15-3.25 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.05-2.25 On, 1H), 1.86 (m， 2H)， 1.35
(s, 9H), 0.88 (t，3H, J= 7.35Hz).
Mass (FAB)； m/e 764 (M+l)
例 4 ： 3 ' -N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-N112 -DX-8951)トリ フルォロ酢酸塩の合成
Figure imgf000023_0001
3 ' -N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A- NH2 =DX-8951) (79 mg)をトリフルォロ酢 酸 （3 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール （30 ml)で共沸 を 2回、 エタノール （30 ml)で共沸を 2回行った後、 残渣をエーテルで洗浄して、 標記化合物 （80 mg)を得た。
½ - NMR (DMS0- c )(5: 8.59-8.61 (m, 1H), 8.50 (d, 1H, J= 8.3Hz), 8.21-8.27 (m, 2H), 7.91-8.01 (br, 3H), 7.81 (d, 1H, J= 11.2Hz), 7.32 (s, 111), 6.50-6.52 (br, 1H), 5.57-5.59 0n， 1H), 5.43 (s, 2H), 5.23 (s, 2H)， 3.80-3.82 (m, 3H), 3.70- 3.75 (m, 3H), 3.15-3.25 (m， 2H), 2.41 (s, 3H), 2.05-2.25 (m, 1H), 1.86-1.88 On, 211), 0.88 (t, 3H, J= 7.35Hz).
例 5 ： カルボキシメチルデキストランポリアルコールの ト リェチルアンモニゥム 塩の合成
デキス トラン T2000C10 g， フアルマシア社製， 平均分子量 2,000,000) を 0.1 M酢酸緩衝液 （pH 5. 5, 1, 000 ml) に溶解し、 過ヨウ素酸ナ ト リ ウム （33. 0 g) の水溶液 （1000 ml)を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレング リコール （7. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 M水酸化ナトリゥ ム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調整した。 水素化ホウ素ナト リウム （14 g) を加えて 溶解した後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH5. 5に調整して 4 °C で 1時間撹拌した後、 氷冷下で 8 M水酸化ナトリウム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調 整した。 得られた水溶液をバイオマックス- 30膜 （ミ リポア社製） を用いて限外濾 過法による低分子画分の除去を行なった。 高分子画分を凍結乾燥して、 デキス ト ランポリアルコールを得た。 このデキストランポリアルコールを pH 3. 0で 1時間処 理した後、 バイオマックス- 50 膜で低分子画分を除去し、 次いで高分子画分をバイ ォマックス- 100膜で除去し、 凍結乾燥して精製デキス トランポリアルコール （2. 0 g)を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過法、 デキス トラン標準） は、 220 K であ つた。
この精製デキス 卜ランポリアルコール （1. 8 g)を、 水酸化ナ ト リゥム （10. 5 g) を水 （45 nil)に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に 氷冷下でモノクロル酢酸 (15 g) を加えて溶解させた後、 室温で 20時間反応させた。 この反応液を酢酸で pHを 8 に調整した後、 バイオマックス- 10 膜を用いて限外濾過 法による低分子画分の除去を行なった。 高分子画分を凍結乾燥して、 カルボキシ メチルデキス 卜ランポリアルコールのナトリゥム塩 （1· 8 g)を得た。 この物質の分 子量 （ゲル濾過、 デキス トラン標準） は 330 K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 8 であった。
上記のカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ ト リゥム塩 （300 mg) を水に溶解し、 Bio- Rad AG50W-X2 (200 - 400 メ ッシュ、 H + 型） カラム （1. 5 x 8. 6 cm)にのせ、 水で溶出した。 この溶出液にトリェチルァミ ン （0. 5 ml ) を加 えた後、 凍結乾燥してカルボキシメチルデキス トランポリアルコールの ト リェチ ルアンモニゥム塩 （380 rag) を得た。 カルボキシメチルデキス トランポリアルコ一 ルのナ ト リウム塩 （各 300 mg)を上記と同様にカラム処理して、 カルボキシメチル デキス 卜ランポリアルコールの 卜リェチルアンモニゥム塩 （380 mg, 400 mg) を得 た。 例 6 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ 卜 リ ゥム塩の合成 上記例 5で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩
(0. 15 g) を、 水酸化ナトリウム （1. 05 g) を水 （4. 5 ml) に溶かして得られる 水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸 （1. 5 g) を加えて溶解させた後、 室温で 18時間反応させた。 この反応液を酢酸で pHを 8 に調 整し、 90 ml のメタノール中に滴下した後、 3 M 塩化ナトリゥム水溶液 （0. 15 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱を メタノ一ルで洗浄した後、 水 （5 ml) に溶解し、 3 M 塩化ナトリゥム水溶液 （0. 15 ml)を加えた。 この水溶液をミ リポアフィルタ一 （0. 45 m)で濾過し、 濾液を 35 mlのエタノール中に滴下して、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） に より集めた。 この沈澱をエタノールで洗浄した後、 水に溶解し、 透析膜 （スぺク トラポア 1、 カッ トオフ分子量 6, 000-8, 000) を用いて、 純水に対して透析した。 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0. 22〃m)で濾過した後に凍結乾燥してカルボキシ メチルデキス トランポリアルコールのナ トリウム塩 (0. 18 g) を得た。 この物質の 糖残基あたりのカルボキシメチル化度 （アルカリ滴定法） は 1. 2 であった。
例 7 ： カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩の合成
例 5で得た精製デキス トランポリアルコール （0. 2 g)を、 水酸化ナトリウム （0. 84 g) を水 （6 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶 液に氷冷下でモノクロル酢酸 （1. 2 g)を加えて溶解させた後、 室温で 18時間反応さ せた。 この反応液を酢酸で pHを 8 に調整し、 120 mlのメタノール中に滴下した後、 3 M 塩化ナ 卜リゥム水溶液 （0. 2 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱をメタノールで洗浄した後、 水 （5 ml) に 溶解し、 3 M 塩化ナ卜リウム水溶液 （0. 2 ml) を加えた。 この水溶液をミ リポアフ ィルター （0. 45 / ra)で濾過し、 濾液を 35 mlのエタノール中に滴下して、 析出した 沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱をエタノールで洗浄し た後、 水に溶解し、 透析膜 （スぺク トラポア 1、 カツ トオフ分子量 6, 000-8, 000) を用いて、 純水に対して透析した。 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0. 22 m)で 濾過した後、 凍結乾燥してカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールのナ ト リウム塩 （0. 20 g) を得た。 この物質の糖残基あたりのカルボキシメチル化度 （ァ ルカ リ滴定法） は 0. 4 であった。
例 8 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly-Gly- Gly- Phe- NH- A ' (A -NH2 =DX- 8951)の合成
例 5で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリェチルアンモ 二ゥム塩 （380 rag, カルボキシメチル化度 0. 8) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド （30 ml)に溶解した。 この溶液に、 3 ' - N -（Gly - Gly - Gly- Phe)-NH- A (A- NH2 =DX-8951) の 卜リ フルォロ酢酸塩 （49 mg)の Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液、 卜 リエチルァミ ン （0. 017 ml) 、 卜エトキンカルボニル -2-エトキシ -1, 2 ジヒ ドロ キシキノ リン （380 mg) を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反 応液を 1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 10に調整した後、 25 mlのエタノール中 に 5 ml ずつ滴下した。 この混合物に 3 M塩化ナ トリゥム水溶液 （1 ml) 、 ジェチ ルエーテル （5 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により 集めた。
この沈澱を水に溶解し、 透析膜 （スぺク トルポア 1、 カツ 卜オフ分子量 6, 000 -8, 000) を用いて純水に対して透析し、 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0. 22 ί πι) で濾過した後、 凍結乾燥した。 得られた粗生成物を水 （30 ml)に溶解し、 0. 1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 9に調整し、 37°Cで 1時間処理した。 この処理液を上 記と同様に透析した後、 透析内液をミ リポアフィルタ— （0. 22 m)で濾過し、 凍結 乾燥して標記化合物を 289 mg 得た。 本化合物を 0. 1 M塩化ナ卜リゥム水溶液に溶 解後、 GPC (カラム ：東ソ—株式会社製 TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0. 1 M NaCl、 流速： 0. 8 ml/min) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M トリス緩衝液， pH 9. 0, 0. 25 mg/ml) をそれぞれ図 1及び図 2に示す。 本化合 物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm におけ る吸光度に基づいて定量したところ 5. 3% (W/W) であった。
例 9 ： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコール- Gly-Gly- Phe- Gly-NH- A ' (A -NH2 =DX-8951)合成
3 ' -N-(Boc- Gly-Gly- Phe- Gly)- NH- A (A-NH0 =DX-8951) (50 mg)から例 4と同様の 方法により脱 Boc化して得られる 3 ' - N- (Gly- Gly- Phe_Gly)- NH- Aのトリフルォロ酢 酸塩を、 例 8と同様の方法に従って、 例 5で得たカルボキシメチルデキス トラン ポリアルコールのトリエチルアンモニゥム塩 （380 mg) に導入して標記化合物 （300 mg) を合成した。 本化合物を 0. 1 M塩化ナ卜リゥム水溶液に溶解後、 GPC (カラ ム ：東ソ—株式会社製 TSK Gel PW-4000XL. 溶媒： 0. 1 M NaCl、 流速： 0. 8 ml/inin) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M 卜リス緩衝液， pH 9. 0, 0. 19 mg/ral) をそれぞれ図 3及び図 4に示す。 本化合物の医薬化合物残 基の含量を 0. 1 M 卜リス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づい て定量したところ 5. 3¾ (W/W) であった。
例 10： カルボキシメチルデキス トランポリアルコ一ル -Gly- Gly-Gly- Gly-NH- A ' (A -NH2 =M- 8951)の合成
3 -（Boc- Gly- Gly- Gly- Gly)- NH - A (A - NH2 =DX- 8951) (41 mg)から例 4と同様の 方法により脱 Boc化して得られる 3 ' - N- (Gly- Gly- Gly-Gly)- NH- Aの卜リフルォロ酢 酸塩を、 例 8と同様の方法に従って、 例 5で得たカルボキシメチルデキス トラン ポリアルコールの 卜 リエチルアンモニゥム塩 （380 mg) に導入して標記化合物 （190 mg) を合成した。 本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M 卜リス緩衝液， pH 9. 0, 0. 34 mg/ml) を図 5に示す。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M トリ ス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ 5. 3% (I/W) であった。
例 11 ：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
マウス線維肉腫 Meth A 細胞 l x lO0 個を BALB/c 系の雄マウス （7 週齢） の 右鼠蹊部皮下に移植して Meth A 担癌マウスを作成した （1群 7匹） 。 7 日目に注 射用蒸留水に溶解した例 9の薬物複合体を Meth A 担癌マウスの尾静脈内に 4日毎 に 4回投与した。 移植後 21日目に腫瘍を摘出して重量を測定し、 腫瘍増殖抑制率を 次式：腫瘍増殖抑制率《) = [1- (検体投与群の平均腫瘍重量/コン卜ロール群の平 均腫瘍重量)] X 100 により算出した。 その結果、 例 9で得られた本発明の薬物複合 体は、 毒性 （体重減少） を発現することなく、 上記医薬化合物自体 （スぺーサー 及び多糖誘導体なし） に比較して抗腫瘍効果が大幅に増強されていた。 多糖誘導 体自体 （例 5 ) 及びスぺーサ—のみを導入した医薬化合物残基 （例 1の化合物か ら例 4の方法に従って脱 B0Cィヒして得られたる H2N- Gly- Gly- Phe - Gly-NH A (A-NH2 =DX-8951) のトリフルォロ酢酸塩） は無効であった。 表 2 被検化合物 投与量 Ong/kg) 抑制率（50 医薬化合物自体 7.5 X 4 76
1.875 X 4 46
0.9375 X 4 36
例 9の化合物 1.4° 4 94
0.7° X 4 59
0.351} x 4 41
1)医薬化合物換算量 例 12：本発明の薬物複合体の抗腫癟作用
例 11と同様の方法により Meth A担癌マウスを作成し （1群 6匹） 、 7 日目に例 8 及び例 9の薬物複合体を単回投与した場合の抗腫瘍作用を比較した。 その結果、 抗腫瘍作用の程度は （多糖誘導体） -Gly-Gly-Phe- Gly- NH- A' > (多糖誘導体）- Gly -Gly-Gly-Phe-NH-A' >医薬化合物自体であった。 スぺ一サーを介することなく医 薬化合物残基を例 5のカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのカルボキ シル基に直接結合した化合物 （医薬化合物残基の導入量： 6.2重量％ ) は無効であ つた。
表 3 被検化合物 投与量 (mg/kg) 抑制率 (¾) 医薬化合物自体 60 77
20 59
例 8の化合物 1)
10 85
) 76
例 9の化合物 ■1)
98
1)
2. 5 87
1 )
医薬化合物換算量 例 13： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールの 卜 リェチルアンモニゥム塩 の合成
デキス 卜ラン T500 ( 10 g, フアルマシア社製， 分子量 500K ) を 0, 1 M 酢酸緩衝 液 （pH5. 5, 1000 ml) に溶解し、 過ヨウ素酸ナト リ ウム （33 g) の水溶液 （1000 ml)を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール （7. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を 8 M 水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pH を 7. 5に調整した。 水素化ホウ素ナトリウム （14 g) を加えて溶解した後、 ー晚撹 拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5に調整して 4 °Cで 1時間撹拌した後、 8 水酸化ナトリゥム水溶液で pH 7. 5に調整して溶液 1を得た。 別に、 デキス トラン T500 (10 g, フアルマシア社製， 分子量 500K) について、 上記の一連の操作を行い、 溶液 2を得た。 さらに、 デキス トラン T250 (各 10 g, フアルマシア社製， 分子量 250K ) について、 上記の一連の操作を行い、 溶液 3と溶液 4を得た。 これらの溶 液 1〜4を合して、 バイオマックス- 50膜を用いて限外濾過法により、 低分子画分 の除去を行った。 高分子画分を凍結乾燥して、 デキス トランポリアルコール （25 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 163Kであった。 このデキス トランポリアルコール （11 g) を、 水酸化ナトリウム （46. 2 g) を水 (330 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷 冷下でモノクロル酢酸 （66 g) を加えて溶解させた後、 室温でー晚反応させた。 こ の反応液を酢酸で pHを 9に調整した後、 バイオマックス - 30膜を用いた限外濾過法 により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキ ス トランポリアルコールのナトリウム塩 （13 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル 顏、 プルラン標準） は 228K であり、 カルボキシメチル化度は 0.4であった。 このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ ト リ ゥム塩 （600 mg) を水に溶解し、 Bio- Rad AG 50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 H+ 型） カラム （直径 44mm. 長さ 210删）にのせ、 水で溶出した。 この溶出液にトリェチルァミ ン （0.93 ml)を加えた後、 凍結乾燥して標記化合物 （690 mg) を得た。
例 14： 3 ' -N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A- NH2 =DX-8951)トリフルォロ酢酸塩の合成 例 1で得た 3'- N-(Boc- Gly-Gly- Phe- Gly)- NH- A (A- NH。 二 DX - 8951) (79 mg)を卜 リフルォロ酢酸 （3 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール (30 ml)で共沸を 2回、 エタノール （30 ml)で共沸を 2回行った後、 残渣をエーテ ルで洗浄して、 標記化合物 （80 mg)を得た。
½ - NMR (DMSO-dg) δ： 8.53 (d, 1H, J= 8-3Hz), 8.40-8.48 (m, 2H), 8.28 (d, 111, J= 8.3Hz), 7.95-8.07 (br, 311), 7.81 (d, 1H, J= 10.2Hz)， 7.30-7.37 On, 2H)， 7. 15-7.30 (m, 5H), 6.50-6.55 (br, 1H), 5.50-5.57 (m, 111), 5.41 (d, 2H, J= 7.82Hz),
5.25 (s, 2H), 4.55-4.62 (m, 111), 3.55-3.92 (m, 6H), 3, 15-3.25 (br, 2H), 2.98 -3.03 (m, 1H), 2.73-2.82 (m, 1H), 2.40 (s， 3H)， 2.05-2.25 (m, 111), 1.84 1.92
Cm, 2H), 0.88 (t, 3H, J= 7.35Hz).
例 15： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール - Gly- Gly- Phe- Gly- NH-A'(A -NH =DX- 8951)の合成
例 13で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナト リゥム塩 （400 mg) を ト リェチルアンモニゥム塩 （470 mg) に変換し、 N， N-ジメチルホルムアミ ド（30 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 14で得た 3 N- (Gly- Gly-Phe- Gly) - NH- A (A-NH =DX-8951) のト リフルォロ酢酸塩 （62 mg)の N，N-ジメチルホルムァミ ド
(5 ml) 溶液、 ト リェチルァミ ン（0.02 ml) 、 卜ェ トキシカルボニル- 2- ェ トキ シ- 1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （470 mg) を順次加え、 遮光して室温で一晩撹拌し ながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に滴下した。 これに 3 塩ィ匕ナトリウ厶水溶液 （2.5 ml) 、 ジェチルエーテル （20 ral)を加えて、 析出した沈澱を遠心分離により集めた。 この沈澱を 0.5 M塩化ナトリウム水溶液に 溶解し、 氷冷下 0.1 M 水酸化ナ卜リウム水溶液で pH 9に調整した後、 透析膜 （スぺ ク トルポア 1、 カツ 卜オフ分子量 6000-8000) を用いて、 純水に対して透析した。 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0.22^m)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物 (600 mg) を得た。 本化合物を 0.1 M 塩化ナトリゥム水溶液に溶解後、 GPC (力 ラム ：東ソ— TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0.1 M NaCl 、 流速： 0.8 ml/rain)で分 析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0.1 M 卜 リス緩衝液、 pH 9. 0、 0.1 mg/ml ) をそれぞれ図 6及び図 7に示す。 本化合物の医薬化合物残基の含 量を 0.1 M トリス緩衝液 (pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量 したところ 5.8% (W/W) であつた。
例 16： 3 ' -N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A- NH。 =M - 8951)トリフルォロ酢酸塩の合成 例 2で得た 3'- N- (Boc-Gly- Gly- Gly- Phe)- NH- A (A-NH2 =DX-8951) (79 mg)をトリ フルォロ酢酸 （3 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール（30 ml) で共沸を 2回、 エタノール（30 ml) で共沸を 2回行った後、 残渣をエーテル で洗浄して、 標記化合物（80 mg) を得た。
丄 H- MR (DMSO-dg) δ： 8.62-8.66 (m, 210, 8.23 (d, 111, J= 8.3Hz), 8.18-8.20 On, 1H), 7.98-8.10 (br, 2H), 7.79 (d, 1H, J= 10.7Hz), 7.32 (s， 1H), 7.09 (d, 2H， J = 7.3Hz), 6.93-7.03 (m，4H)， 6.50-6.60 (br, 1H), 5.52-5.55 (m, 1H), 5.44(s, 2H), 5.18 (d, 1H, J= 18.5Hz), 4.80 (d, 1H, J= 18.5Hz), 4.57-4.59 (m, 1H), 3.57 -3.71 (m, 6H), 3.15-3.25 (m, 2H), 3.00-3.02 (m, 1H), 2.80-2.90 (m, 1H), 2.50
(s, 3H), 2.05-2.25 (m, 1H), 1.86-2.00 (m， 2H)， 0.88 (t, 3H, J= 7.35Hz).
例 17： カルボキシメチルデキストランポリアルコール- Gly-Gly - Gly - Phe-NH- A'(A -NH2 =DX- 8951)の合成
例 13で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナ卜リゥム塩 （1. 0 g)をトリェチルアンモニゥム塩（1.2 g) に変換し、 N，N -ジメチルホルムアミ ド（90 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 16で得た 3 N- (Gly- Gly- Gly-Phe)-NH- A (A - NH2 =DX-8951) の ト リフルォロ酢酸塩 （158 mg) の N, N-ジメチルホルムアミ ド（15 ml) 溶液、 トリェチルアミ ン（0.05 ml) 、 卜ェ卜キシカルボニル -2- エトキシ- 1,2- ジヒ ドロキシキノ リン（1.2 g) を順次加え、 遮光して室温で一晩撹拌しなが ら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に滴下した。 これ に 3 M塩化ナトリゥム水溶液 （2.5 ml) 、 ジェチルエーテル（20 ml) を加えて、 析 出した沈澱を遠心分離により集めた。 この沈澱を 0.5 M塩化ナ卜リゥム水溶液に溶 解し、 氷冷下 0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で pH 9 に調整した後、 透析膜 （スぺ ク トルポア 1、 カツ トオフ分子量 6000 - 8000) を用いて、 純水に対して透析した。 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0.22//m)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物 (1.4 g) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0.1 M トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ 5.2¾ (W/W) であつ た。
例 18： Boc- Gly- Phe- Leu- 0Hの合成
H-Gly-Phe-Leu-OH (3.0 g)を 50¾ジォキサン水溶液（48 ml) に加えて氷冷した。 この溶液に 1 N水酸化ナトリウム水溶液（9.45 ml) と （Boc)20 (2.27 g) を含むジ ォキサン（24 ml) 溶液を加え、 1B免撹拌した。 反応液に 1 N塩酸 (9.45 ml) を加え、 溶媒を溜去した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液： ジクロロメタン： メタノール = 5 : 1溶液） で精製して標記化合物（2.5 g) を得た。 例 19： Boc- Gly- Phe- Leu- Gly- OBzlの合成
例 18で得た Boc- Gly - Phe Leu- OH (2.4 g)および N -ヒ ドロキシスクシンイ ミ ド （656 mg) を N, N-ジメチルホルムアミ ド（50 ml) に溶解し、 4°Cに冷却した後、 Ν，Ν' - ジシクロへキシルカルポジイ ミ ド （1.17 g) を添加し、 2時間撹拌した。 この溶 液に H- Gly-OBzl のトシル酸塩（1.9 g) とトリエチルァミ ン（0,79 ml) を溶解した Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（40 ml) 溶液を加えて、 室温で 16時間撹拌しながら反応 させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリ力ゲルカラムクロマトグラフィ一 (溶出液： ジクロロメタン タノ一ル = 50 : 1溶液） で精製して標記化合物（2. 0 g) を得た。
½ - NMR(DNS0- δ 8.20-8.30 (m, 1H), 8.12 (d, 1H, J= 8.3Hz), 7.83 (d, 1H, J= 8.3Hz), 7.32-7.37 (m, 5H), 6.89-6.95 (ra, 1H), 5.12 (s, 1H), 4.52-4.59 (br, 1H), 4.34 (dd, 1H, J= 7.3Ilz, J= 15.1Hz), 3.93 (dd, 1H, J- 5.5Hz, J= 17.2Hz), 3 .84 (dd, 1H, J= 5.5Hz, J= 17.2Hz), 3.54 (dd, 1H, J= 5.9Hz, J= 16.7Hz), 3. 42 (dd, J= 5.9Hz, J= 16.7Hz), 3.00 (dd, 1H, J= 4.4Hz, 13.7Hz), 2.78 (dd, 1H, J= 8.8Hz' J= 13.2Hz), 1.50-1.65 (m, 1H), 1.45 (ΐ, 2H, J= 7.3Hz), 1.36 (s.9H),
0.86 (d, 3H, J= 6.4Hz), 0.82 (d, 3H, J= 6.4Hz).
例 20： Boc- Glv- Phe- Leu-Gly-OHの合成
例 19で得た Boc - Gly- Phe- Leu-OBzl(l.7 g) を酢酸ェチル（30 ml) とメタノール (30 ml) の混合溶液に溶解させた後、 5 % Pd-C (1.5 g)を加え、 接触還元を行った。 反応液を濾過し、 濾液を減圧乾固して、 標記化合物 （1. g) を得た。
例 21： 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 X- 8951)の合成
例 20で得た Boc- Gly- Phe - Leu - Gly- 0H (200 mg) および N-ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド（58 mg) を N，N-ジメチルホルムアミ ド （5 ml) に溶解し、 4°Cに冷却した後、 Ν,Ν'- ジシクロへキシルカルポジイ ミ ド （104 mg) を加えて溶解させた。 この溶液 に DX- 8951 のメタンスルホン酸塩 （224 rag) と ト リエチルァミ ン （0.059 ml) を 溶解した N，N-ジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液を加えて、 遮光下に室温で 16時間 撹拌しながら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （溶出液： 0.5 !¾酢酸を含むジクロロメタン ： メタノール =10：
1溶液） で精製して標記化合物 （200 mg) を得た。
½- NMR (DMSO-dg) δ ： 8.35 (d, 1H, J=7.8Hz), 8.08-8.18 (m, 2H), 7.75-7.85 (m, 211)， 7.32 (s, 1H)， 7.10 (d, 2H, J=6.8Hz), 7.08 - 7.13 (m, 3H), 6.85-6.95 (br, 110, 6.40-6.65 (br, 1H)， 5.52-5.55 (m, 1H)， 5.46 (d, 1H, J=18.5Hz), 5.37(d, 1H, J=18.5Hz), 5.24 (s, 2H), 4.44-4.52 (m, 1H), 4.15-4.25 (m, 1H), 3.68-3.72 (m, 2H), 3.40-3.52 (m, 2H), 3.15-3.25 (br, 2H), 2.85-2.95 (m, 1H), 2.65-2.75 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.05-2.25 (m, 1H), 1.80-1.91 (m, 2H)， 1.50-1.65 (m, 1H), 1.45 (t, 2H, J=7.3Hz), 1.35 (s, 910, 0.88 (t, 3H, J=7.4), 0.86 (d, 3H, J=6.4Hz),
0.82 (d， 3H， J=6.4Hz).
例 22： 3' - N- (Gly-Phe - Leu- Gly)_NH- A (A-N112 =DX-8951)トリフルォロ酢酸塩の合成 例 21で得た 3'-N- (Boc- Gly- Phe- Leu- Gly)- NH- A (A- 2 =DX-8951) (97 mg)をト リフルォロ酢酸 (3 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール（30 ml) で共沸を 2回、 エタノール（30 ml) で共沸を 2回行った後、 残渣をェ—テル で洗浄して、 標記化合物（95 mg) を得た。
½- NMR (D SO-dg) δ ： 8.57 (d, 1H， J=8.3Ηζ)， 8.47 (d, 1H, J=8.3Hz), 8.32 (d, 1H, J=7.8Hz)， 8.17 (t, 1H, J=5.5Hz), 7.81-7.91 (br, 3H), 7.79 (d, 1H, J=10.7Hz), 7.32 (s, 1H), 7.21-7.23 (m, 5H), 7.12-7.17 (m, 1H), 6.45-6.55 (br, 1H), 5.57 (q, 1H, J=4.4Hz), 5.43 (d, 111, J = 16. lHz)， 5.34 (d, 1H, J=16.1Hz), 5.23 (s， 2H), 4.67 (dt, 1H， J =4.0Hz, J=9.0Hz), 4.31 (dd, 1H, J=8.5Hz, J=15.0Hz), 4.0—4.4 (br, 1H), 3.74-3.76 (m,2H)， 3.56 (dd, 1H, J=6.0Hz, J=16.0Hz), 3.41 (dd, 1H, J=6.0Hz, J-16.0Hz), 3.17-3.19 (br，2H)， 3.02 (dd, 111, J=4.0Hz, J=14.0Hz), 2.70 (dd, 1H， J=10.0Hz, J-14.0Hz), 2.40 (s, 3H), 2.05-2.15 (ra, 1H), 1.85 (dt, 2H, J=7.0Hz, J =14.0Hz), 1.50-1.55 (m, 111), 1.45 (t, 2H, J=6.0Hz), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H， J=7.4), 0.85 (d, 3H, J=6.4Hz), 0.80 (d, 3H, J=6.4Hz).
例 23： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコール- Gly-Phe- Leu- Gly-NH- A'(A -NH2 =DX-8951)の合成
例 13で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールの ト リェチルァンモ 二ゥム塩 （690 mg) を N，N -ジメチルホルムアミ ド（50 ml) に溶解させた。 この溶液 に、 例 22で得た 3'- N- (Gly-Phe - Leu- Gly)- NH- A (A- NH2 =DX - 8951) のトリフルォロ 酢酸塩 （95 mg)の N， N-ジメチルホルムアミ ド（10 ml) 溶液、 ト リェチルアミ ン（0. 03 ml) 、 ：1 -エトキンカルボニル -2- エトキシ -1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （690 mg) を順次加え、 室温でー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを 各 10 ml のエタノール中に滴下した。 これに 3 M塩化ナ卜リゥム水溶液 （2.5 ml)
、 ジェチルエーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離により集めた。 この沈澱を 0.5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0.1 M 水酸化ナ卜 リゥム水溶液で pH 9 に調整した後、 透析膜 （スペク トルポア 1、 カツ トオフ分子量 6000-8000) を用 いて、 純水に対して透析した。 透析内液をミ リポアフィルタ一 （0.22 ίπ で濾過し た後、 濾液を凍結乾燥して標記化合物 （600 mg) を得た。 本化合物の医薬化合物残 基の含量を 0.1 M トリス緩衝液 （pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基づい て定量したところ、 4.8% (W/ ) であった。
例 24： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールの卜 リェチルアンモニゥム塩 の合成 デキス トラン T500 (50 g, フアルマシア社製， 分子量 500K ) を 0. 1 M 酢酸緩 衝液 （PH5. 5, 5000 ml) に溶解し、 過ヨウ素酸ナト リウム（165. 0 g) の水溶液 (5000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（35. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を 8 M 水酸化ナ卜リウム水溶液を用いて pH
7. 5 に調整した。 水素化ホウ素ナ ト リウム （70 g) を加えて溶解した後、 ー晚撹 拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹拌した後、 8
M 水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pH 7. 5 に調整した。 得られた水溶液をバイ ォマックス- 50 膜を用いて限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。 高分子 画分を凍結乾燥して、 デキストランポリアルコール （27. 1 g) を得た。 この物質の 分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 140Kであった。
このデキストランポリアルコール（5 g) を、 水酸化ナ ト リウム （21 ) を水 （150 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷下で モノクロル酢酸 （30 g) を加えて溶解させた後、 室温でー晚反応させた。 この反応 液を酢酸で pHを 8に調整した後、 バイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過法により 脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストラ ンポリアルコールのナトリウム塩（5. 6 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は 263K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 4 であった。
このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ 卜 リゥム塩（2. 0 g) を 水に溶解し、 Bio -Rad AG 50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 1Γ 型） カラム （直径 44 mm、 長さ 210 mm)にのせ、 水で溶出した。 この溶出液に 卜 リエチルァミ ン （4 ml) を加えた後、 凍結乾燥して標記化合物（2. 2 g) を得た。
例 25： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールの 卜リメチルアンモニゥム塩 の合成
例 24で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ ト リ ゥム塩（1. 0 g) を水に溶解し、 Bio- Rad AG 50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 Me3N H+ 型） カラ ムにのせ、 水で溶出した。 この溶出液を凍結乾燥して標記化合物 （950 mg) を得た。 例 26： 3 * -N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 =DX- 8951 )塩酸塩の合成
例 14と同様の方法で 3 ' - N- (Boc- Gly- Gly- Phe- Gly)- NH- A (A-NH2 =DX- 8951) (400 mg) から得た 3 ' -N- (Gly-Gly- Phe- Gly)- NH- A ト リ フルォロ酢酸塩を水 - MeOH (1： 4) に溶解して、 Bio- Rad AG 1-X8 (200-400 メッシュ、 CI— 型） カラム （1.5 cm x 8.6 cm ) にのせ、 上記溶媒で溶出した。 この溶出液を濃縮した後、 凍結乾燥し て標記化合物 （310 mg) を得た。
½-N R (DMSO-dg) δ： 8.53 (d, 1Η,
Figure imgf000036_0001
8.46-8.48 (m, 1H), 8.37-8.39 (ra , 1H), 7.95 (d, 111, J =8. OHz), 7.80 (s, 3H)， 7.78 (d, 1H, J=ll.1Hz), 7.34 (s, 111), 7.14-7.24 (m, 5H), 6.50(s, 1H), 5.56-5.60 (m, 1H), 5.35-5.40 (m, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.51-4.56 (m, 1H), 3.86 (dd, J=4.8,13.5Hz, 1H), 3.68-3.79 (m, 3H)， 3. 54 (s, 2H)， 3.15-3.22 (m, 2H), 3.01 (dd, J=5.6, 13.5Hz, 1H), 2.78 (dd, J=9.6, 3. 5Hz, 1H), 2.41 (s,3H), 2.12-2.23 (m, 2H), 1.81-1.89 (m, 2H), 0.88 (t, 3H, J=7. 2Hz).
Mass (FAB)； m/e 753 (M+l)
例 27： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A'(A -NH0 -DX- 8951)の合成
例 25で得たカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの ト リ メチルアンモ 二ゥム塩（0.1 ) を N，N-ジメチルホルムアミ ド （6 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 26で得た 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)NH-A (A-NH0 =DX- 8951) の塩酸塩 (24 mg) の Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（10 ml) 溶液、 卜リエチルァミ ン（5 1)、 卜エトキン カルボ二ル- 2 エトキシ- 1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（0.1 g) を順次加え、 室温で ー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に 滴下した。 これに 3 M塩化ナ ト リウム水溶液 （2.5 ml) 、 ジェチルエーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈 澱を 0.5 M食塩水に溶解し、 氷冷下 0.1 M 7K酸化ナトリウム水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 30膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を 通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0.22 m)で濾過した後、 凍結乾燥して 標記化合物（90 mg) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0.1 M 卜リス緩衝 液 （pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ 11% (W/ ')であつた。
例 28： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A'(A -NH2 -DX- 8951)の合成 例 25で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールの ト リメチルアンモ 二ゥム塩（0. 1 ) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド （6 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 26で得た 3 ' - N- (Gly- Gly- Phe- Gly)-NH- A (A-匪2 =DX- 8951 ) の塩酸塩 （36 rag) の Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド（10 ml) 溶液、 卜 リエチルァミ ン（8 1)、 1-エ トキシ カルボ二ル- 2- エトキシ- 1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（0. 1 g) を順次加え、 室温で ー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に 滴下した。 これに 3M塩化ナ ト リウム水溶液 （2. 5 ml) 、 ジェチルエーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱 を 0. 5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0. 1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 12とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 30 膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を 通過しな L、残留溶液をミ リポアフィルタ—（0. 22 μ m)で濾過した後、 凍結乾燥して 標記化合物（80 rag) を得た。 本化合物を 0. 1 M塩化ナトリゥム水溶液に溶解後、 GPC
(カラム ：東ソー TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0. 1M NaCl、 流速： 0. 8 ml/rain) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M トリス緩衝液、 pll
9. 0、 36 μ g/ l ) をそれぞれ図 8及び図 9に示す。 本化合物の医薬化合物基の 含量を 0. 1 M 卜リス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定 量したところ 15% (W/ ) であった。
例 29 ： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコール- Gly-Gly- Gly-Phe- NH- A ' (A -NH2 =DX- 8951 )の合成
デキス トラン T250 (20 g, EXTRASYNTHESE製， 平均分子量 250K)を 0. 1 M 酢酸緩衝 液 （pH5. 5, 2000 ml) に溶解し、 過ヨウ素酸ナト リウム （66. 0 g) の水溶液（2000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（14. 0 ml) を加え、 ー晚撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 M 水酸化ナトリウム水溶液を用 いて pHを 7. 5 に調整した。 7 素ィ匕ホウ素ナトリウム （28 g) を加えて溶解した後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹 拌した後、 氷冷下で 8 M 水酸化ナトリウム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調整した。 得 られた水溶液をバイオマックス - 30膜を用いた限外濾過法により低分子画分を除去 して、 膜を通過しない残留溶液 1 を得た。 別に、 デキス トラン T250 ( 50 g, EXTRASYNTHESE製， 平均分子量 250K)を 0. 1 M 酢酸緩衝液 (pH5. 5, 5000 ml) に溶 解し、 過ヨウ素酸ナトリウム（165 g) の水溶液（5000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（35. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 M 水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調整した。 水素 化ホウ素ナトリウム （70 g) を加えて溶解した後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を 氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹拌した後、 氷冷下で 8 M 水酸化 ナトリウム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調整した。 得られた水溶液をバイオマックス -30 膜を用いた限外濾過法により低分子画分を除去して、 膜を通過しない残留溶液 2を得た。 残留溶液 1 と残留浍液 2を合して、 限外濾過法によりバイオマックス - 50 膜を通過する画分をバイオマックス- 30 膜を用いて低分子画分を除去し、 凍結 乾燥してデキス トランポリアルコール （25. 7 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル 濾過、 プルラン標準） は、 47K であった。
このデキス トランポリアルコール（5 g) を、 水酸化ナ ト リウム （35 g) を水 （150 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷下で モノクロル酢酸 （50 g) を加えて溶解させた後、 室温で 18時間反応させた。 この反 応液を酢酸で pHを 8に調整した後、 バイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過法によ り脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナトリウム塩（7. 2 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾 過、 プルラン標準） は 127K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 8 であった。 この カルボキシメチルデキス卜ランポリアルコールのナトリゥム塩（2. 2 g) を水に溶解 し、 Bio- Rad AG 50 -X2 (200-400 メ ッシュ、 11+ 型） カラム （直径 44 mm、 長さ 210 mm)にのせ、 水で溶出した。 この溶出液に卜リエチルァミ ン （4 ml) を加え た後、 凍結乾燥してカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの 卜 リエチル アンモニゥム塩 （2. 69 g) を得た。
このカルボキシメチルデキス卜ランポリアルコールの トリエチルアンモニゥム 塩 （2. 67 g) を N，N-ジメチルホルムアミ ド （200 ml) に溶解した。 この溶液に、 例 2と同様に合成した 3 ' -N-(Boc- Gly-Gly- Gly- Phe)- NH- A (A-冊 2 =DX-8951 ) (350 mg) から例 16と同様の方法で脱 Boc 化して得られる 3 ' -N- (Gly- Gly - Gly- Phe)- NH - A のトリフルォロ酢酸塩とトリエチルァミン （0. 116 ml) を N，N-ジメチルホルムァ ミ ド （10 ml)に溶かして得られる溶液、 1-エトキシカルボニル -2- エトキシ- 1, 2 - ジヒ ドロキシキノリン （2. 67 g) を Ν, Ν -ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶かし て得られる溶液を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液に 3 M塩化ナトリゥム水溶液 （100 ml) を加え、 8 mlずつを各 30 ml のェタノール中 に滴下した。 それぞれに 3 M 塩化ナトリゥム水溶液 （1 ml) 、 ジェチルエーテル (5 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpra, 8分） により集めた。 こ の沈澱をァセトンで洗浄した後、 水に溶解し、 3 M 塩化ナトリウム水溶液（10 ml) を加えた後、 0. 1 M 水酸化ナ卜リゥム水溶液で pH 9 に調整し、 37°Cで 1時間処 理した。 この処理液をバイオマックス- 10膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0. 22 m)で濾過した後、 凍結乾燥 して標記化合物 （2. 30 g) を得た。 本化合物を 0. 1 M塩化ナ卜リウム水溶液に溶解 後、 GPC (カラム ：東ソー TSK Gel PW-4000XL. 溶媒： 0. 1M NaCl、 流速： 0. 8 ml/min) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M 卜リス緩 衝液， pH 9. 0， 0. 20 mg/ml) をそれぞれ図 10及び図 11に示す。 本化合物の医薬化合 物残基の含量を 0· 1 M 卜リス緩衝液 （PH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基 づいて定量したところ、 5. 8% (W/W) であった。
例 30： カルボキシメチルデキス卜ランポリアルコールのトリェチルアンモニゥム塩 の合成
デキストラン T10 (20 g， フアルマシア社製、 平均分子量 10K ) の 0. 1 M 酢酸緩 衝液 （pH 5. 5) 溶液 （2000 ml)に、 過ヨウ素酸ナ卜 リゥム （66. 0 g) の水溶液（2000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（14. 0 ml) を加え、 ー晚撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 M 水酸化ナ卜リゥム水溶液を用 いて pH 7. 5 に調整した。 水素化ホウ素ナトリウム （28 g) を加えて溶解した後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹 拌した後、 氷冷下で 8 M 水酸化ナトリウム水溶液を用いて pH 7. 5 に調整した。 得 られた水溶液をバイオマックス- 5膜 （ミ リポア社製） を用いた限外濾過法により低 分子画分を除去して、 膜を通過しない残留溶液をバイオマックス- 30 膜を通過させ た。 得られた通過液を凍結乾燥して、 デキストランポリアルコール (8. 0 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 13K であった。
このデキス トランポリアルコール（3. 7 g) を、 水酸化ナトリウム （25. 9 g) を水 (111 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷 冷下でモノクロル酢酸 （37 g) を加えて溶解させた後、 室温で 20時間反応させた。 この反応液を酢酸で pH 8 に調整した後、 バイオマックス - 5膜を用いた限外濾過法 により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキシメチルデ キス卜ランポリアルコールのナトリウム塩（6. 2 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲ ル濾過、 プルラン標準） は、 37K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 9 であった。 このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナトリゥム塩（6. 0 g) を水 に溶解し、 Bio - Rad AG 50I-X2 (200-400 メッシュ、 H+ 型） カラムにのせ、 水で 溶出した。 この溶出液に卜リエチルアミン （9. 3 ml) を加えた後、 凍結乾燥して標 記化合物（7. 2 g) を得た。
例 31 ： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールのト リェチルアンモニゥム塩 の合成
例 30で得たデキス トランポリアルコール（3. 9 g) を、 水酸化ナトリウム （16. 3 g) を水 （117 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この 溶液に氷冷下でモノ クロル酢酸 （23. 4 g) を加えて溶解させた後、 室温で 18時間反 応させた。 この反応液を酢酸で pH 8 に調整した後、 バイオマックス - 5膜を用いた 限外濾過法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキ シメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩（5. 0 g) を得た。 この物質の 分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 28K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 5 であった。 このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナト リゥム塩（4. 8 g) を例 30と同様にトリェチルアンモニゥム塩に変換して、 標記化合物（5. 6 g) を得た。
例 32： カルボキシメチルデキストランポリアルコールのト リェチルァンモニゥム塩 の合成
デキス トラン 4 (20 g 、 フナコシ社製、 平均分子量 4K-6K) の 0. 1 M 酢酸緩衝液 (pH 5. 5) 溶液（2000 ml) に、 過ヨウ素酸ナト リ ウム （66. 0 g) の水溶液（2000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（14. 0 ml) を加え、 ー晚撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 水酸化ナ卜リウム水溶液を用 ぃて 11を7. 5 に調整した。 水素化ホウ素ナトリウム （28 g) を加えて溶解した後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹 拌した後、 氷冷下で 8 M水酸化ナ卜リウム水溶液を用いて pH 7. 5 に調整した。 得 られた水溶液をバイオマックス- 3膜 （ミ リポア社製） を用いた限外濾過法により低 分子画分を除去した。 得られた通過液を凍結乾燥してデキストランポリアルコー ル（6. 0 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 9Kであった。 このデキス トランポリアルコール（2. 7 g) を、 水酸化ナトリウム （18. 9 g) を水 (81 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷下で モノクロル酢酸 （27 g) を加えて溶解させた後、 室温で 20時間反応させた。 この反 応液を酢酸で pH 8 に調整した後、 バイオマックス- 5膜を用いた限外濾過法により 脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキシメチルデキス ト ランポリアルコールのナトリゥム塩 (4. 2 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 20K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 9 であった。
このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ 卜 リウ厶塩（4. 0 g) を 例 30と同様にトリエチルアンモニゥム塩に変換して、 標記化合物（4. 8 g) を得た。 例 33： カルボキシメチルデキス卜ランポリアルコールのトリェチルァンモニゥム塩 の合成
例 32で得たデキス トランボリアルコール（2. 7 g) を、 水酸化ナ ト リウム （11. 3 g) を水（81 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶 液に氷冷下でモノクロル酢酸 （16. 2 g) を加えて溶解させた後、 室温で 18時間反応 させた。 この反応液を酢酸で pH 8 に調整した後、 バイオマックス- 5膜を用いた限 外濾過法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキシ メチルデキス 卜ランポリアルコールのナ ト リウム塩（2. 7 g) を得た。 この物質の分 子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 16K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 5 であった。 このカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナ 卜 リゥム塩（2. 7 g) を例 30と同様にトリェチルアンモニゥム塩に変換して、 標記化合物（3. 1 g) を得た。
例 34： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコール- Gly- Glv-Phe- Glv- NH- A ' (A - NH2 =M- 8951)の合成
例 30で得たカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの ト リェチルアンモニ ゥム塩（1.5 g) N，N-ジメチルホルムアミ ド（90 ml) 溶解させた。 この溶液に、 ト リ ェチルアミ ン（0.07 ml) と 3' - N- (Gly-Gly- Phe- Gly)- NH- A (A-NH2 =DX- 8951)のトリ フルォロ酢酸塩 （210 mg) の Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（40 ml) 溶液、 卜ェ 卜キン カルボニル- 2- エトキシ- 1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（1.5 g) を順次加え、 室温で ー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に 滴下した。 それぞれに 3 H塩化ナ卜リゥム水溶液 （2.5 ml) 、 ジェチルェ—テル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この 沈澱を 0.5 食塩水に溶解し、 氷冷下 0· 1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 9 とし た。 得られた水溶液をバイオマックス- 3膜を用いた限外滤過法により脱塩した。 膜 を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0.22 /ζπι)で濾過した後、 凍結乾燥し て標記化合物（1.3 g) を得た。 本化合物を 0.1 M塩化ナ卜リウム水溶液に溶解後、 GPC (カラム ：東ソー TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0, 1M NaCl、 流速： 0.8 ml/ min ) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0.1 M 卜 リス緩衝 液、 pH 9.0、 65 i/g/ml) をそれぞれ図 12及び図 13に示す。 本化合物の医薬化合物 残基の含量を 0.1 卜リス緩衝液 （pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基づ いて定量したところ 6.4% (W/W) であった。
例 35： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- Glv-Phe-Gly-NH-A'(A -NH9 =DX- 8951)の合成
例 31で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールの ト リェチルァン乇ニ ゥム塩（1.2 g) を N, N-ジメチルホルムアミ ド（90 ml) 溶解させた。 この溶液に、 卜 リエチルアミ ン （0.056 ml) と 3' - N- (Gly- Gly- Phe- Gly)- NH- A (A -匪2 =DX-8951) の ト リフルォロ酢酸塩 （168 rag) の Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（30 ml) 溶液、 卜エトキシカルボニル- 2- エトキシ- 1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（1.2 g) を順次加 え、 室温でー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタ ノール中に滴下した。 それぞれに 3 M 塩化ナ ト リウム水溶液 （2.5 ml) 、 ジェチル エーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集 めた。 この沈澱を 0.5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0.1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 3膜を用いた限外濾過法により 脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0.22 m)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物（1. 0 g) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M 卜リス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したと ころ、 4. 8% (W/W) であった。
例 36 ： カルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコール- Gly-Gly-Phe-Gly- - A ' (A -NH =DX- 8951)の合成
例 32で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールの卜リェチルァンモニ ゥム塩（1. 2 g) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド（90 ml) 溶解させた。 この溶液に、 ト リエチルアミ ン （0. 056 ml) と 3 ' -N- (Gly- Gly- Phe- Gly)- NH- A (A-NH2 =DX-8951 ) の ト リ フルォロ酢酸塩 （168 mg) の N, N-ジメチルホルムア ミ ド（30 ml) 溶液、 1 - エ トキシカルボ二ル- 2- エトキシ- 1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（1. 2 g) を順次加 え、 室温でー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタ ノール中に滴下した。 それぞれに 3 M塩化ナトリウム水溶液 （2. 5 ml) 、 ジェチル エーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集 めた。 この沈澱を 0. 5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0. 1 M 水酸化ナトリウム水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 3膜を用いた限外濾過法により 脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0. 22 tn)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物（1. 0 g) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したと ころ、 5. 9¾S (W/W) であった。
例 37 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- Gly-Phe- Gly - NH A ' (A -NH9 =DX- 8951 )の合成
例 33で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールの卜リェチルアンモニ ゥム塩（1. 5 g) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド（90 ml) 溶解させた。 この溶液に、 ト リエチルアミ ン（0. 07 ml) と 3 ' -Ν- (Gly- Gly- Phe- Gly)- NH - A (A-NH2 =DX - 8951 ) の ト リ フルォロ酢酸塩 （210 mg) の N, N-ジメチルホルムァ ミ ド（40 ml) 溶液、 卜 ェトキシカルボ二ル- 2- ェトキシ- 1， 2- ジヒ ドロキシキノ リン（1. 5 g) を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のェタノ一 ル中に滴下した。 それぞれに 3 M塩化ナトリゥム水溶液 （2. 5 ml) 、 ジェチルェ一 テル (20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱を 0.5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0.1 M 水酸化ナトリゥム水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 3膜を用いた限外濾過法により脱塩し た。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルター（0.22 m)で濾過した後、 凍結 乾燥して標記化合物（1.3 g) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0.1 M トリス緩衝液 (pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ、
4.6¾ (W/W) であった。
例 38： Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 =DW- 8286) の合成
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (42 mg) および N-ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド（12 mg) を N, N-ジメチルホルムアミ ド （2 ml) に溶解し、 4。Cに冷却した後、 Ν,Ν'- ジシクロ へキシルカルポジイ ミ ド（22 rag) を添加した。 この溶液に下記式：
Figure imgf000044_0001
で表される化合物 [(ls， 9s)-卜アミ ノ- 5- クロロ- 9- ェチル- 2, 3- ジヒ ドロ- 9- ハイ ドロキシ- 1H, 12H -べンゾ [de]ピラノ [3'，4':6，7] イン ドリ ジノ [1, 2-b] キノ リ ン- 10, 13(9H, 15H)- ジオン： Μ'- 8286]の塩酸塩（50 mg) と トリエチルアミ ン（0.01 ml) を溶解した Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド （6 ml) 溶液を加えて、 遮光して、 室 温で 16時間撹拌しながら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲル カラムクロマ トグラフィー （溶出液： 0.5!¾酢酸を含むジクロロメタン ： メタノ一 ル = 10 : 1溶液） で精製して標記化合物（27 mg) を得た。
½ - NMR(CDC1。） δ ： 8.10-8.20 (br, 1H), 7.95-8.05 (br, 1H), 7.70-7.80 (br, 2H), 7.50-7.60 (br, 1H), 7.40-7.50 (br， 1H)， 7.10-7.25 (m, 5H), 7.05-7.15 (br, 1H), 5.85-5.95 (br, 111), 5.50-5.60 (br, 1H), 5.40-5.50 (m, 1H), 5.25-5.35 (m, 1H), 5.05-5.15 (m, HI), 4.90-5.00 (m， 1H)， 4.70-4.80 (br, 1H), 4.10-4.25 (br, 2H), 3.60-3.90 (m, 4H), 3.10-3.40 (m, 3H), 2.95-3.05 (br, 1H)， 2.15-2.30 (br, 1H), 1. 75-1. 90 (br, 2H), 1. 39 (s, 9H), 0. 80-1. 00 (m, 3H).
例 39 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly - Gly- Phe- Glv - NH- A ' (A -NH2 =DW-8286)の合成
例 24で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのトリェチルアンモニ ゥム塩 （175 mg) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド（20 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 38で得られた 3 ' - N- (Boc- Gly- Gly-Phe- Gly)- NH- A (A - NH2 =DW-8286) (27 mg)から 例 4と同様の方法で脱 Boc 化して得られる 3 ' - N -（Gly - Gly- Phe- Gly)- NH-Aの トリフ ルォロ酢酸塩（29 mg) と トリエチルァミ ン（9〃1)の N，N -ジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液、 卜エトキシカルボニル- 2- エトキシ- 1, 2- ジヒ ドロキシキノ リン （175 mg) を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを 各 10 ml のェタノ一ル中に滴下した。 これに 3 M 塩化ナ卜リゥム水溶液 （2. 5 ml) 、 ジェチルエーテル（20 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8 分） により集めた。 この沈澱を 0. 5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0. 1 M 水酸化ナ卜リ ゥム水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 30 膜を用いた限外 濾過法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0. 22 〃m) で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物 （135 rag) を得た。 本化合物を 0. 1 M塩化 ナ卜リゥム水溶液に溶解後、 GPC (カラム ：東ソ— TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0. 1M NaCl、 流速： 0. 8 ml/min ) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収ス ぺク トル （0. 1 M 卜リス緩衝液、 Ph 9. 0、 99 g/ml) をそれぞれ図 14及び図 15 に示す。 本化合物の医薬化合物残基の含量は、 0. 1 M トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中で の 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ、 6. 1% CW/W) であった。 例 40： 3 ' -N- (Boc-Gly-Gly-Phe-Gly) -NH-A (A- 2 =DW- 8089)の合成
Boc - Gly- Gly- Phe- Gly (163 mg)および N -ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド（45 mg) を N, N -ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶解し、 4 °Cに冷却した後、 N, N ' -ジシクロへ キシルカルポジイ ミ ド（79 mg) を添加した。 この溶液に下記の式： o、
0 H で表される化合物 [(Is, 9s)-l -アミノ- 9- ェチル -2， 3- ジヒ ドロ- 9- ハイ ドロキシ -1H, 12H-ベンゾ [de]ピラノ [3'， 4' :6, 7] イン ドリ ジノ [1， 2 - b] キノ リ ン- 10, 13C9H, 1510- ジオン： - 8089]の 卜シル酸塩 （170 mg) と ト リェチルアミ ン （0.054 ml) を溶解した Ν,Ν -ジメチルホルムアミ ド（30 ml) 溶液を加えて、 遮光下に室温で一 晚撹拌しながら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー （溶出液： 0.5酢酸を含むジクロロメタン ： メタノール =94： 6溶液） で精製して標記化合物 （100 mg) を得た。
½-N R (DMSO-dg) δ： 8.51 (d, 1H, J=8.5Hz), 8.41 (t, 1H, J=5.6Hz), 8.29 (s, 1H), 8.17 (d.lH, J=8.0Hz), 8.03 (d, 1H， J=8.0Hz)， 7.90 (dd, 1H, J-4.8, 5.6Hz), 7.79 (t， 1H, J=5.6Hz), 7.53 (d, 1H, J=7.2Hz), 7.36 (s, 1H), 7.13-7.25 (m, 5H), 6.94 -6.95 (m, 1H), 5.60-5.63 (m, 1H), 5.36-5.47 (m， 2H)， 5.21-5.30 (m, 2H), 4.42 -4.47 (m, 1H), 3.63-3.96 (m, 3H), 3.51-3.59 (m, 3H), 3.31-3.40 (m, 111)， 3.09 -3.21 (m, 1H), 3.02 (dd, 111. J=4.8, 13.5Hz), 2.76-2.81 (m, 1H), 2.13-2.17 Cm, 2H), 1.85-1.90 (m, 2H)， 1.37 (s, 9H)， 0.89 (t, 3H, J=8.0Hz).
Mass (FAB)； m/e 822 (M+l)
例 41： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- Gly- Phe- Gly- NH- A '(A -NH2 =DW-8089)の合成
例 24で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのト リエチルアンモニ ゥム塩（1.6 g) を N，N-ジメチルホルムアミ ド（60 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 40で得られた 3'- N- (Boc- Gly- Gly- Phe- Gly)- NH- A (A- NH2 =DW-8089) (200 mg) から例 4と同様の方法で脱 Boc化して得られる 3' - N- (Gly-Gly- Phe-Gly)- NH - Aのト リ フルォロ酢酸塩と ト リヱチルァミ ン（0.07 ml) を N，N-ジメチルホルムアミ ド（20 ml) に溶かして得られる溶液、 卜エトキンカルボニル- 2- エ トキシ -1， 2-ジヒ ド 口キシキノ リン（1. 6 g) を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反 応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール中に滴下した。 それぞれに 3 M塩化ナトリ ゥム水溶液 （2. 5 ml) 、 ジェチルエーテル（25 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心 分離 （2500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱をエタノールで洗浄した後、 水に 溶解し、 3 M 塩化ナトリウム水溶液（20 ml) を加え、 0. 1 M 水酸化ナトリゥム水溶 液で pH 9 に調整した。 この溶液をバイオマックス- 10 膜を用いた限外濾過法によ り脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルター（0. 22 m)で濾過した 後、 凍結乾燥して標記化合物 （1. 20 g) を得た。 本化合物を 0. 1 M塩化ナト リウム 水溶液に溶解後、 GPC (カラム ：東ソー TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0. 1M NaCl, 流速： 0. 8 ml/min) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0. 1 M 卜リス緩衝液， pH 9. 0, 0. 26 mg/ml) をそれぞれ図 16及び図 17に示す。 本化合 物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nra におけ る吸光度に基づいて定量したところ、 5. 0% (W/1) であった。
例 42： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールの 卜 リェチルアンモニゥム塩 の合成
デキス トラン T150 (20 g、 フアルマシア社製、 平均分子量 150K ) を 0. 1 M 酢酸 緩衝液 （pH 5. 5、 2000 ml)に溶解し、 過ヨウ素酸ナ ト リウム （66. 0 g) の水溶液 (2000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール (14. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を氷冷下で 8 M 水酸化ナトリウム水溶液 を用いて pHを 7. 5 に調整した。 水素化ホウ素ナト リウム （28 g) を加えて溶解した 後、 室温で一晩撹拌した。 反応液を氷冷して、 酢酸で pH 5. 5 に調整し、 4 で] 時間撹拌した。 氷冷下で 8 水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 7. 5 に調整した。 得られた水溶液をバイオマックス- 5膜 （ミ リポア社製） を用いた限外濾過法により、 500 mlまで濃縮して溶液 1を得た。 別に、 デキストラン T110 (20 g) について上記 の一連の操作を行い、 溶液 2を得た。 溶液 1と溶液 2を混合し、 混合溶液の pHを 3. 0 とし、 40°Cで 4時間インキュベートした後、 pHを 7に調整して低分子化されたデ キス トランポリアルコールを含む溶液を得た。 バイオマックス - 30 膜を通過させ、 次いでバイオマックス- 5膜を用いて脱塩した後、 凍結乾燥してデキストランポリア ルコール（4. 6 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 17K
^あった ο
このデキス トランポリアルコール（2, 5 g) を、 水酸化ナ ト リウム (17. 5 g) を水 (75 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷下 でモノクロル酢酸 （25 g) を加えて溶解させた後、 室温で 20時間反応させた。 この 反応液を酢酸で pHを 9に調整した後、 バイオマックス - 5膜を用いた限外濾過法によ り脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、 カルボキシメチルデキス トランポリアルコールのナトリウム塩 (4. 0 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾 過、 プルラン標準） は 45Kであり、 CM化度は 0. 9 であった。
このカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールのナ 卜リゥム塩（3. 7 g) を水 に溶解し、 Bio- Rad AG 50W-X2 (200-400 メッシュ、 Ητ 型） カラムにのせ、 水で 溶出した。 この溶出液にトリェチルァミ ン （5. 8 ml) を加えた後、 凍結乾燥して標 記化合物（4. 4 g) を得た。
例 43： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- Gly- Gly- Phe- N1【- A ' (A - NH2 =DX- 8951)の合成
例 42で得られたカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの ト リェチルアン モニゥム塩（4. 4 g) を Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド （300 ml) に溶解させた。 この溶 液に、 ト リエチルアミ ン（0. 19 ml) と 3 ' - N- (Gly - Gly- Gly-Phe)- NH- A (A-匪2 =DX - 8951)の ト リ フルォロ酢酸塩 （580 mg) を含む N, N-ジメチルホルムアミ ド（45 ml) 溶液、 卜エ トキシカルボ二ル- 2 - エ トキシ -1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン（4. 4 g) を順次加え、 遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液を 1 M 水 酸化ナトリゥム水溶液で pH 10に調整した後、 5 mlずつを各 25 ml のェタノール中 に滴下した。 これに 3 M 塩化ナ ト リウム水溶液 （1 ml) 、 ジェチルエーテル （5 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈 澱を水に溶解し、 透析膜 （スぺク トルポア 1、 カツ 卜オフ分子量 6000-8000) を用 いて、 純水に対して透析し、 透析内液をミ リポアフィルタ一（0. 22 ju m)で濾過した 後、 凍結乾燥して標記化合物（3. 4 g) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したと ころ、 4. 6% (W/ ) であった。 例 44： α —メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコール- Gly- Gly-Gly- Phe -NH-A ' (A-NH2 =DX- 8951)の合成
例 42で得られたデキス トランポリアルコール（2 g) を、 水酸化ナトリウム （14 g) を水（60 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶 液に氷冷下で α —ブロモプロピオン酸（19 ml) を加えて溶解させた後、 室温で 18 時間反応させた。 この反応液を酢酸で pH 8 に調整した後、 バイオマックス - 50 膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を通過しな t、残留溶液を凍結乾燥して、 α —メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩 （2. 95 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 451 (であった。 糖残基あたりの α —メチルカルボキシメチル化度は、 カルボキシメチルデキス 卜 ランポリアルコールの場合に準じて以下の様に求めた。 ひーメチルカルボキシメ チルデキス トランポリアルコールのナトリウム塩の水溶液を Mo- Rad AG 50W-X 2 (H+ 型） カラムに付し、 通過液を凍結乾燥して試料として用いた。 この試料を所 定過剰量の 0. 1 N 水酸化ナ卜リゥム水溶液に溶解し、 フエノールフタレインを指示 薬として 0. 1 N 塩酸で滴定した。 試料の採取量を s mg 、 0. 1 N 水酸化ナト リウム 水溶液の所定過剰量を a (ml) 、 0. 1 N塩酸の滴定量を b (ml) とし、 α —メチル カルボキシメチル化度を 13. 4(a- b)/ [s- 7. 2(a- b)] の式により求めた。 その結果 α 一メチルカルボキシメチル化度は 0. 8 であった。
このひ —メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩
(2. 2 g) を水に溶解し、 Bio- Rad AG 50W-X2 (200-400 メッシュ、 H+ 型） カラム (直径 44 mm、 長さ 210 隱）にのせ、 水で溶出した。 この溶出液にトリェチルアミ ン （4 ml) を加えた後、 凍結乾燥してひ 一メチルカルボキシメチルデキストランポ リアルコールのトリェチルアンモニゥム塩 （2. 69 g) を得た。
この α —メチルカルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリェチルァ ンモニゥム塩 (2. 68 g) を N， N-ジメチルホルムアミ ド（60 ml) に溶解した。 この溶 液に、 例 2と同様に合成した 3 ' - N- (Boc-Gly- Gly- Gly- Phe)- NH- A (A-NH2 =DX-8951) (350 mg) から例 16と同様の方法で脱 Boc 化して得られる 3 '-Ν- (Gly - Gly- Gly- Phe) -NH- A のトリフルォロ酢酸塩とトリェチルァミン （0. 116 ml) を Ν, Ν-ジメチルホル ムアミ ド （10 ml) に溶かして得られる溶液、 卜エトキンカルボニル- 2- エトキシ - 1,2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （2.68 g) を Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶 かして得られる溶液を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応 液に 3 M 塩化ナトリウム水溶液（40 ml) を加え、 6 mlずつを各 30 ml のエタノール 中に滴下した。 それぞれに 3 M塩化ナトリゥム水溶液 （1 ml) 、 ジェチルェ一テル
(5 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 こ の沈澱をァセトンで洗浄した後、 水に溶解し、 3 M 塩化ナトリゥム水溶液（10 ml) を加え、 0.1 M 水酸化ナトリゥム水溶液で pH 9 に調整し、 37°Cで 1時間処理し た。 この処理液をバイオマックス- 10 膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を 通過しない残留溶液をミ リポアフィルター（0.22 πθで濾過した後、 凍結乾燥して 標記化合物 （2.15 g) を得た。 本化合物を 0.1 M 塩化ナトリウム水溶液に溶解後、 GPC (カラム ：東ソー TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： 0.1M NaCl、 流速： 0.8 ml/ min ) で分析した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル （0.1 M 卜 リス緩衝 液， pH 9.0, 0.21 mg/ ml)をそれぞれ図 18および図 19に示す。 本化合物の医薬化合 物残基の含量を 0.1 M トリス緩衝液 （pH 9.0) 中での 362 nm における吸光度に基 づいて定量したところ、 5.9% (W/W) であった。
例 45： 3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A (A- NH2 =DX-8951)トリフルォロ酢酸塩の合成
Phe - Gly- OBzlの p-トルエンスルホン酸塩 （3.06 g) 、 Boc-Gly-OH (1.10 g) 、 N -ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （941 mg) 、 N-メチルモルフオ リ ン （0.725 ml) 、 N, N-ジメチルホルムアミ ド（40 ml) の混合物を 4 °Cに冷却した後、 N, Ν'- ジンクロへ キシルカルボジィ ミ ド （1.56 g) を加えた。 室温で一 B免撹拌しながら反応させた後、 反応液を減圧乾固した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一 （溶出液： ジクロロメタン ： メタノール = 98 : 2溶液） で精製して Boc - Gly- Phe - Gly- OBzl (1. 93 g) を得た。
lH-NMR (DMSO-dg) δ： 8.52 (dd, 1H, J=5.6, 6.4Hz), 7.97 (d, 1H, J=8.8Hz), 7.30- 7.39 (m, 5H), 7.15-7.26 (m, 5H), 6.83 (t, 1H, J=5.6Hz), 5.14 (s, 1H), 4.52-4. 57 (m, 1H), 3.87-3.96 (m, 2H), 3.57 (dd, 111, J-5.6, 16.7Hz), 3.43 (dd, 1H, J=5. 6, 16.7Hz), 3.01 (dd, 1H, J=4.8, 14.3Hz), 2.77 (dd, 1H, J=5.6, 14.3Hz), 1.37 (s, 9H).
得られた Boc- Gly- Phe- Gly- OBzl (1.78 g) を酢酸ェチル（60 ml) に溶解し、 5¾ -Pd-C (1.8 g) 存在下、 24時間接触還元した。 触媒を濾去し、 濾液を減圧濃縮し、 Boc-Gly-Phe-Gly-OH (1.41 ) を得た。
½-NMR (DMSO-d.) δ： 8.35 (t, 111, J=5.6Hz), 7.94 (d， 1H, J=8.8Hz), 7.15-7.26 (m.5H), 6.85 (dd， 1H， J=5.6， 6.4Hz)， 4.52-4.58 (m, III), 3.76 (d, 2H, J=5.6Hz),
3.56 (dd, 111, J=6.4, 16.7Hz), 3.43 (dd, 1H, J=5.6, 16.7Hz), 3.03 (dd, 1H, J=5.0, 13.5Hz), 2.79 (dd, 1H, J=9.5,13.5Hz), 1.37 (s, 9H).
上で得られた Boc- Gly- Phe- Gly - OH (500 mg) および N-ヒ ドロキシスクシンイミ ド
(161 mg) を N，N-ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶解した。 この溶液に DX- 8951 のメ夕ンスルホン酸塩 （530 rag) とトリェチルァミ ン （0.146 ml) を溶解した N， N-ジメチルホルムアミ ド（50 ml) 溶液を加えて、 4 °Cに冷却した後、 N, N' - ジシク 口へキシルカルボジィミ ド （268 mg) を加えて、 遮光下に室温で一晩撹拌しながら 反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフ ィ一 （溶出液： ジクロロメタン ： メタノール =96： 4溶液） で精製して 3' - N-(Boc -Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-匪2 =DX-8951) (100 mg) を得た。
½- NMR (DMSO-dg) δ： 8.39 (d, 1H, J=8.0Hz), 8.34 (t, 1H, J=5.6Hz), 7.98 (d, 1H, J=7.2Hz), 7.78 (d, 1H, J=10.3Hz), 7.33 (s, 1H), 7.13-7.24 (m, 5H), 6.80 (dd, 1H, J=5.6, 6.4Hz), 5.55-5.61 (m, 1H), 5.44 (d, 1H, J = 16.0Hz), 5.41 (d， 1H， J=16. 0Hz), 5.25 (s, 2H), 4.43-4.46 (m, 1H), 3.69-3.79 (m, 2H), 3.50 (dd, 1H, J=5.6, 16.7Hz), 3.41 (dd, 111, J=5.6, 16.7Hz), 3.16-3.19 (m, 2H), 2.98 (dd, 1H， J=4.8, 14.3Hz)， 2.79 (dd, 1H, J=9.5,14.3Hz), 2.41 (s, 3H), 2.19-2.25 (m, 1H), 2.10- 2.15 (m，lH), 1.82-1.90 (m, 2H), 1.35 (s, 9H)， 0.88 (t, 3H, J=8.0Hz).
Mass (FAB)； m/e 797 (M+l)
得られた 3'- N -（Boc-Gly- Phe- Gly)- NH-A (A- NH0 =DX - 8951) (100 mg) を卜リフル ォロ酢酸 （3 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール（30 ml) で共沸を 2回、 エタノール（30 ml) で共沸を 2回行った後、 残渣をェ一テルで洗 浄して、 標記化合物（80 mg) を得た。
½ - NMR (DMSO-dg) δ： 8.52-8.62 (m, 1H), 7.94 (s, 3H), 7.79 (t, 1H, J = ll.1Hz), 7.34 (s, 1H), 7.15-7.27 (m, 5H), 6.52 (s， 1H)， 5.57-5.61 (m, 1H), 5.36-5.46 On, 2H)， 5.24 (s, 2H), 4.66-4.70 (m, 1H), 3.69-3.81 (m, 2H), 3.61-3.68(m, 1H), 3.40-3.47 (m, 1H), 3.15-3.23 (m, 1H), 3.01 (dd, 1H, J=4.0, 13.5Hz)， 2.77 (dd, 1H, J=9.5, 13.5Hz), 2.12-2.23 (m, 2H), 1.81-1.91 (m, 2H), 0.89 (t, 3H, J=7.2Hz).
Mass (FAB); m/e 697 (M+l)
例 46： 3'- N- (Phe- Gly)- NH- A (A- NH2 =DX- 8951) 卜 リフルォロ酢酸塩の合成
Boc-Phe-Gly(771 mg) および N-ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド （300 mg) を N, N -ジ メチルホルムアミ ド（10 ml) に溶解した。 この溶液に M - 8951 のメタンスルホン 酸塩（1058 rag) と トリエチルァミ ン （0.293 ml) を溶解した N, N-ジメチルホルムァ ミ ド（50 ml) 溶液を加えて、 4°Cに冷却した後、 Ν,Ν'- ジシクロへキシルカルポジ ィ ミ ド （494 rag) を加えて、 遮光下に室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反 応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液： ジク ロロメタン ： メ タノール = 98 : 2溶液） で精製して 3' - N -（Boc- Phe - Gly)- NH - A (A - NH2 =DX- 8951) (1.20 g)を得た。
½-NMR (DMSO-dg) δ： 8.29 (d, 1H, J=8. OIIz), 8.21 (t, 1H, J=4.8Hz), 7.76 (d, 1H,
J=10.3Hz), 7.32 (s, 1H)， 7.13-7.25 (m, 5H), 6.92 (d, HI, J=7.2Hz), 6.49 (s， 1H)， 5.56-5.61 (m, 1H), 5.44 (d, 1H, J=15.9Hz), 5.38 (d, 1H, J=15.9Hz), 5.25 (s, 2H), 4.08-4.12 (m, 1H), 3.78 (d, 1H, J=4.8Hz), 3.16-3.25 (m, 2H), 2.99 (dd, 1H, J:
4.0, 13.5Hz), 2.72 (dd, 1H, J=10.3, 13.5Hz), 2.40 (s, 311)， 2.09-2.35 (m, 210,
1.80-1.91 (m, 2H), 1.16 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J=8.0Hz).
Mass (FAB)； m/e 741 (M+l)
上記で得られた 3'- N- (Boc- Phe- Gly)- NH- A (170 mg)をトリフルォロ酢酸 (4 ml) に溶かし、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール（10 ml) で共沸を 2回、 エタノール（10 ml) で共沸を 2回行った後、 残渣をエーテルで洗浄して、 標記化合 物 （100 mg) を得た。
½- NMR (DMSO-dg) δ： 8.88 (t, 111, J=4.8Hz), 8.68 (d, 1H, J=8.7Hz), 8.05-8.15 (m, 3H), 7.79 (d, 1H, J=ll.1Hz), 7.26-7.36 (ra， 5H), 6.52 (d, 1H， J=7.2Hz), 5.57 -5.62 (m, 1H), 5.43 (d, 1H, J=15.9Hz), 5.38 (d, 1H, J=15.9Hz), 5.19-5.28 (m, 1H), 4.10-4.18 (m, 1H), 3.93 (dd, 1H, J=4.8, 16.7Hz), 3.82 (dd, 1H, J=4.8.16.7Hz), 3.17-3.24 (m, 2H), 3.14 (dd, 1H, J=4.8, 13.5Hz), 2.95 (dd, 1H, J=8.0, 13.5Hz), 2. 42 (s, 3H), 2. 14-2. 25 (ra, 2H), 1. 83-1. 91 (m, 2H), 0. 89 (t, 3H, J=8. 0Hz). Mass (FAB)； m/e 640 (M+l)
例 47： 3 ' -N-Gly-NH-A (A-NH2 =DX-8951)トリフルォロ酢酸塩の合成
DX-8951 のメタンスルホン酸塩 （530 mg) と ト リエチルァミ ン（0. 28 ml) を N, N -ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶解し、 4 °Cに冷却した後、 Boc- Gly の N -ヒ ド ロキシスクシンィ ミ ドエステル （327 mg) を加えた。 遮光下に室温で一晩撹拌しな がら反応させた。 この反応液を減圧乾固し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィ一 （溶出液： ジクロロメタン ： メタノール = 98： 2溶液） で精製して 3 ' - N -(Boc-Gly)-NH-A (A-匪2 =DX-8951) (500 mg) を得た。
½- NMR (DMS0-dP) δ： 8. 38 (d( 1H, J=8. 3Hz), 7. 77 (d, 1H, J = 10. 7Hz), 7. 31 (s， 1H), 6. 89-6. 91 (ra, 1H), 6. 49 (s, 1H), 5. 55-5. 59 (m, 1H), 5. 45 (d, 111, J=16. 1Hz), 5. 38 (d, 1H, J=16. 1Hz), 5. 27 (d, 1H, J=19. 0Hz), 5. 18 (d, 111, J-i9. 0Hz), 3. 50- 3. 62 (m, 2H), 3. 15-3. 19 (ra, 2H), 2. 41 (s, 311), 2. 18-2. 24 (m, 1H), 2. 08-2. 12 Cm, 1H), 1. 81-1. 91 (m， 2H), 1. 31 (s, 9H), 0. 87 (t， 3H, J=8. 0Hz).
Mass (FAB)； m/e 593 (M+l)
上で得られた 3 ' - N -（Boc- Gly)- NH- A (100 mg)をトリフルォロ酢酸 （2 ml) に溶か し、 1時間放置した。 溶媒を留去し、 メタノール（10 ml) で共沸を 2回、 エタノー ル（10 ml) で共沸を 2回行った後、 残渣をエーテルで洗净して、 標記化合物（70 mg) を得た。
½-NMR (DMSO-dg) δ： 8. 88 (d, 1H, J=8. 8Hz), 8. 08 (s, 3H), 7. 81 (d, 1H, J=ll. 2Hz), 7. 34 (s, 1H), 6. 52 (s, 1H), 5. 63-5. 67 (m, 1H), 5. 45 (d. 1H， J=16. 7Hz), 5. 40
(d, 1H， J=16. 7Hz), 5. 36 (d, 1H, J=19. lHz), 5. 25 (d, 111， J=19. 1Hz), 3. 56 (s, 2H), 3. 11-3. 19 (m, 2H), 2. 43 (s, 3H), 2. 23-2. 28 On, 1H), 2. 11-2. 19 (m, 1H), 1. 81
-1. 91 0n, 2H), 0. 88 (t, 3H, J=8. 0Hz).
Mass (FAB) ; m/e 493 (M+l)
例 48： カルボキシメチルデキス トランポリアルコールのト リメチルアンモニゥム塩 の合成
デキストラン T500 (50 g. フアルマシア社製， 分子量 500K ) を 0. 1 M 酢酸緩衝 液 （PH5. 5, 5000 ml) に溶解し、 過ヨウ素酸ナ卜 リゥム（165. 0 g) の水溶液（5000 ml) を加えた。 遮光しながら 4 °Cで 10曰間撹拌した後、 エチレングリコール（35. 0 ml) を加え、 一晩撹拌した。 反応液を 8 M 水酸化ナトリウム水溶液を用いて pH
7 に調整した。 水素化ホウ素ナト リウム （70 g) を加えて溶解した後、 一晩撹拌 した。 反応液を氷冷し、 酢酸で pH 5. 5 に調整して 4 °Cで 1時間撹拌した後、 8 M 水酸化ナトリウム水溶液を用いて pH 7. 5 に調整した。 得られた水溶液をバイオ マックス- 50 膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。 膜を通過しない残留溶 液を凍結乾燥して、 デキス トランポリアルコール （20. 2 g) を得た。 この物質の分 子量 （ゲル濾過、 プルラン標準） は、 159Kであった。
このデキス トランポリアルコール（7. 5 g) を、 水酸化ナトリウム （31. 5 g) を水
(225 ml) に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷 冷下でモノクロル酢酸 （45 g) を加えて溶解させた後、 室温でー晚反応させた。 こ の反応液を酢酸で pHを 8に調整した後、 バイオマックス- 50 膜を用いた限外燫過法 により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキ ス トランポリアルコールのナ ト リウム塩（8. 5 g) を得た。 この物質の分子量 （ゲル 濾過、 プルラン標準） は 274K であり、 カルボキシメチル化度は 0. 4 であった。 こ のカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩（2. 0 g) を水に溶 解し、 Bio- Rad AG 50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 H+ 型） カラム （直径 44 MK 長 さ 210 mm)にのせ、 水で溶出した。 この溶出液に卜リエチルァミ ン （4 ml) を加え た後、 凍結乾燥して標記化合物（2. 2 g) を得た。
例 49： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- Phe- Gly_NH- A ' (A- NH2 =DX- 8951)の合成
例 48で得たカルボキシメチルデキス トランポリアルコールのトリェチルアンモ 二ゥム塩 （200 mg) を N，N-ジメチルホルムアミ ド （7 ml) に溶解させた。 この溶液 に、 例 45で得た 3 ' - N- (Gly- Phe- Gly)- NH- A (Λ- NH2 =DX- 8951) のトリフルォロ酢酸 塩（41 rag) の Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液、 ト リェチルァミ ン （0. 014 ml) 、 卜エトキンカルボ二ル- 2- エトキン - 1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （100 mg) を順次加え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノ一ル中に滴下した。 これに 3 M 塩化ナトリゥム水溶液 （2. 0 ml) 、 ジェチルエーテル（25 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この沈澱を 0. 5 M 食塩水に溶解し、 氷冷下 0. 1 M 水酸化ナト リウム 水溶液で pH 9 とした。 得られた水溶液をバイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過 法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0. 22 m)で濾 過した後、 凍結乾燥して標記化合物 （190 mg) を得た。 本化合物の医薬化合物残基 の含量を 0. 1 M 卜リス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて 定量したところ 4. 5% (W/W) であった。
例 50 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Phe-Gly - NH-A ' (A-NH9 =DX -8951 )の合成
例 24で得たカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールのナ ト リ ゥム塩（2. 5 g) を水に溶解し、 Bio - Rad AG 50W-X2 (200-400 メ ッシュ、 Et3N H+ 型） カラ ムにのせ、 水で溶出した。 この溶出液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキス ト ランポリアルコールの ト リェチルアンモニゥム塩（2, 5 g) を得た。
このカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの ト リェチルァンモニゥム 塩 （200 mg) を N, N-ジメチルホルムアミ ド（12 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 46で得た 3 ' - N-(Phe- Gly)- NH- A (A- NH2 =DX-8951) の ト リフルォロ酢酸塩（42 mg) と 卜 リエチルァミ ン （0. 016 ml) の Ν, Ν-ジメチルホルムァミ ド （5 ml) 溶液、 1 -ェ トキシカルボ二ル- 2- ェ トキシ -1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （200 mg) を順次 加え、 遮光して室温で一晩撹拌しながら反応させた。 この反応液に水 （300 ml) を加え、 限外濾過膜 10K (フィルトロン社製） を用いて限外濾過した。 膜を通過し ない残留溶液を 0. 1 N 水酸化ナ トリゥム水溶液で pH 10とし、 濾過膜 （0. 16 / m 、 フィルトロン社製） を通過させた。 通過した溶液をバイオマッ クス- 50 膜を用いた 限外濾過法により脱塩し、 次いでミ リポアフィルター（0. 22 ^ m)で濾過した後、 凍 結乾燥して標記化合物 （180 mg) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M トリス緩衝液 （pH 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したと ころ 6. 1% (W/W) であった。
例 51 ： カルボキシメチルデキス トランポリアルコール- Gly- NH- A ' (A- NH2 =DX- 8951) の合成
例 48で得たカルボキシメチルデキス 卜ランポリアルコールの ト リェチルァンモニ ゥム塩 （370 mg) を Ν, Ν -ジメチルホルムアミ ド（10 ml) に溶解させた。 この溶液に、 例 47で得た 3 ' - N-Gly- NH- A (A- N =DX- 8951 ) の卜リフルォロ酢酸塩（57 mg) の N, N -ジメチルホルムァミ ド （3 ml) 溶液、 卜 リェチルァミ ン （0. 027 ml) 、 卜ェトキ シカルボ二ル- 2- エトキン - 1, 2- ジヒ ドロキシキノ リ ン （185 mg) を順次加え、 室 温でー晚撹拌しながら反応させた。 この反応液の 5 mlずつを各 10 ml のエタノール 中に滴下した。 これに 3 M塩化ナトリウム水溶液 （2. 0 ml) 、 ジェチルエーテル（25 ml) を加えて、 析出した沈澱を遠心分離 （3500 rpm, 8分） により集めた。 この 沈澱を 0. 5 食塩水に溶解し、 氷冷下 0. 1 M 水酸化ナトリゥム水溶液で pH 9 とし た。 得られた水溶液をバイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を通過しない残留溶液をミ リポアフィルタ一（0. 22 m)で濾過した後、 凍結乾燥 して標記化合物 （290 mg) を得た。 本化合物の医薬化合物残基の含量を 0. 1 M トリ ス緩衝液 （pll 9. 0) 中での 362 nm における吸光度に基づいて定量したところ 0. 5¾ (W/W) であった。
例 52：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例 11と同様の方法により Meth A 担癌マウスを作成し U群 6匹） 、 例 15の薬物 複合体について、 例 12と同様の方法で単回投与した場合の抗腫瘍作用を調べた。 そ の結果、 例 15の薬物複合体は例 12の医薬化合物自体に比べて、 顕著な抗腫瘍効果の 増強と有効用量域の拡大を示した。 被検化合物 投与量 (mg/kg) 1) 抑制率 ( 例 15の化合物 10 100
5 99
2. 5 95
1. 25 83 υ医薬化合物換算量
例 53：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
ヒ ト胃癌 SC - 6 の腫瘍塊をヌ— ドマウス （BALB/c- nu/nu, 雄） の右鼠径部皮下に 移植して SC - 6 担癌ヌー ドマウスを作成した （1群 5匹） 。 移植後 24日目に注射用 蒸留水に溶解した例 15の薬物複合体を静脈内に単回投与し、 抗腫瘍作用を医薬化合 物自体と比較した。 その結果、 例 15の薬物複合体は医薬化合物自体に比べて、 毒性 死を示すことなく、 高い抗腫瘍効果を発揮した。 被検化合物 投与量 Ong/kg) 抑制率 (¾) 死亡マウス数/使用マウス数 医薬化合物自体 60 98 2/5
15 61 0/5
1 )
例 15の化合物 8 100 0/5
>1 ) 71 0/5 υ医薬化合物換算量
例 54：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例 53と同様の方法によりヒ ト肺癌 QG- 90担癌ヌ—ドマウスを作成した （ 1群 5 匹） 。 移植後 16日目に注射用蒸留水に溶解した例 15の薬物複合体を静脈内に単回投 与し、 抗腫瘍作用を医薬化合物自体と比較した。 その結果、 例 15の薬物複合体は医 薬化合物自体に比べて、 顕著な抗腫瘍効果の増強と有効用量域の拡大を示した。 被検化合物 投与量 (mg/kg) 抑制率（ 死亡マウス数ノ使用マウス数 医薬化合物自体 50 60 0/5
12. 5 51 0/5
例 の化合物 1)
15 7」 98 0/5
1 )
1. 75 97 0/5
D医薬化合物換算量
例 55：本発明の薬物複合体の抗腫瘍作用
例 11と同様の方法により Meth A 担癌マウスを作成し （1群 6匹） 、 例 12と同様 の方法で例 41の薬物複合体を単回投与した場合の抗腫瘍作用を医薬化合物自体と比 較した。 その結果、 例 41の薬物複合体は医薬化合物自体に比べて、 顕著な抗腫瘍効 果の増強と有効用量域の拡大を示した。 被検化合物 投与量 (mg/kg) 抑制率（¾i) 医薬化合物自体 100 64
50 56
25 34
例 41の化合物 25 1 ) 99
Figure imgf000058_0001
医薬化合物換算量
例 56：本発明の薬物複合体の抗腫癟作用
例 11と同様の方法により Meth A 担癌マウスを作成し （1群 6匹） 、 例 12と同様 の方法で例 29、 例 43および例 44の各薬物複合体をそれぞれ単回投与した場合の抗腫 瘍作用を調べた。
その結果、 何れの薬物複合体も高い抗腫瘍効果と広い有効用量域を示した。 被検化合物 投与量 (mg/kg) 1) 抑制率 ） 例 29の化合物 30 99
20 99
10 89
5 79
例 43の化合物 100 94
80 92
40 82 20 75
例 44の化合物 100 96
80 94
40 97
20 75 υ医薬化合物換算量
例 57：本発明の薬物複合体の体内動態
例 11と同様の方法により Meth A 担癌マウスを作成し、 例 の薬物複合体につい て、 例 12と同様の方法で単回投与 （10 mg/kg :医薬化合物換算量） して、 薬物複合 体の各組織内における濃度推移を調べた。 その結果、 例 15の薬物複合体は著しく高 い血中滞留性、 腫瘍組織への高い移行性および肝臓と小腸に対する高い腫瘍選択 性を示した。 結果を図 20に示す。 産業上の利用可能性
カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物又はスぺーサーを結合させた 医薬化合物との反応を収率よく行うことができ、 しかも、 ラク トン環を有する医 薬化合物などを反応させる場合に副反応を抑制することができるので、 薬物複合 体の製造方法として極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが 1個のァミノ酸 からなるスぺ一サ一若しくはべプチド結合した 2~8 個のァミノ酸からなるスぺ一 サーを介して結合している薬物複合体、 又はカルボキシル基を有する多糖誘導体 と医薬化合物の残基とが該スぺ—サーを介さずに結合している薬物複合体の製造 方法であって、 カルボキシル基を有する多糖誘導体の有機ァミ ンとの塩と医薬化 合物又は医薬化合物を結合させたスぺ一ザとを非水系で反応させることを特徴と する方法。
2 . カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが 1個のァミノ酸 からなるスぺーサ一若しくはぺプチド結合した 2〜8 個のァミノ酸からなるスぺ一 サ一を介して結合している薬物複合体、 又はカルボキシル基を有する多糖誘導体 と医薬化合物の残基とが該スぺ—サーを介さずに結合している薬物複合体の製造 方法であって、 以下の工程：
(1) カルボキシル基を有する多糖誘導体のアルカリ金属塩を有機アミ ンとの塩に変 換する工程；及び
(2) 該有機アミンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスぺーサ—とを 非水系で反応させる工程
を含む方法。
3 . カルボキシル基を有する多糖誘導体がカルボキシ アルキルデキス 卜ランポ リアルコールである請求項 1又は 2に記載の方法。
4 . カルボキシ (^—4アルキルデキス 卜ランポリアルコールを構成するデキス トラン ポリアルコールが、 実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストラ ンを処理して得られたデキス 卜ランポリアルコールであることを特徴とする、 請 求項 3に記載の方法。
5 . カルボキシ —4アルキルデキス 卜ランポリアルコールがカルボキシメチルデキ ストランポリアルコールである請求項 3または 4に記載の方法。
6 . 医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である請求項 1ないし 5のいずれか 1項 に記載の方法。
7 . 医薬化合物がラク ト ン環を形成しうる医薬化合物である請求項 1ないし 5の いずれか 1項に記載の方法。
8 . 有機アミ ンとの塩と医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスぺーサ一との 反応において、 ラク トン環を形成した医薬化合物又はラク ト ン環を形成した医薬 化合物を結合させたスぺ—サーを用いる請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載 の方法。
9 . ラク トン環を形成しうる請求項 7に記載の医薬化合物が （IS, 9S)-1 - アミノ- 9- ェチル -5- フルオロ- 2, 3- ジヒ ドロ- 9- ハイ ドロキシ- 4- メチル- 1H, 12H-ベン ゾ [de]ピラノ [3 ' , 4 ' : 6, 7] イン ドリ ジノ [1, 2- b] キノ リ ン- 10, 13(9H, 15H)- ジオン である請求項 8に記載の方法。
1 0 . カルボキシル基を有する多糖誘導体と医薬化合物の残基とが 1個のアミ ノ 酸からなるスぺ一サ一若しくはべプチド結合した 2〜8 個のァミノ酸からなるスぺ一 サ一を介して結合している薬物複合体、 又はカルボキシル基を有する多糖誘導体 と医薬化合物の残基とが該スぺ一サーを介さずに結合している薬物複合体の製造 に用いる、 カルボキシル基を有する多糖誘導体の有機ァミ ンとの塩。
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