WO1996031530A1 - Novel peptides and remedy for bone diseases containing the same as active ingredient - Google Patents

Description

明細 S

新規べプチド及びそれを有効成分とする骨疾患治療薬

技術分野

本発明は、 新規なぺプチド及びそれを有効成分として含有する骨疾患治療薬に 関する。

背肇技術

生体内には数多くの生理活性物質が存在し、 生体の正常な生命活動の維持に密 接に関与していることは周知の事実である。 それらの生体内生理活性物質及び合 成生理活性物質はそれら自身、 新しい医薬としての可能性を有すると共に、 新た な医薬を開発するための知見を提供するものでもある。 従って、 これらの生理活 性物質の探索は極めて重要なものである。

一方、 骨粗鬆症のような骨疾患の治療には、 現在、 カルシ卜ニン、 女性ホルモ ン及び活性化ビタミン D 3 等が用いられているが、 その治療効果は必ずしも満 足できるものではない。

発明の開示

本発明の目的は、 骨疾患治療薬として有用な新規物質を提供することである。 本発明者は、 骨形成に関与する骨芽細胞に対し、 その細胞の活性を促進する物 質を探索している際にこの作用を有する新規なぺプチドを見出し本発明を完成し た。

すなわち、 本発明は、 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺ プチド及びその誘導体であって骨芽細胞に対する増殖促進作用及び活性促進作用 を有するペプチドを提供する。 また、 本発明は、 上記本発明のペプチドを有効成 分として含有する骨疾患治療薬を提供する。

本発明により、 新規なペプチドが提供された。 本発明のペプチドは、 上記実施 例によリ実験的に確認されたように、 骨芽細胞に対し増殖促進作用及び活性促進 作用を有しており、 骨疾患治療薬としての作用があることが明らかになった。

発明を実施するための最良の形態

本発明のペプチドは、 基本的に配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を 有する。

さらに、 本発明の範囲には、 配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有 する上記べプチドに加え、 該ぺプチドの誘導体であって骨芽細胞に対する増殖促 進作用及び活性促進作用を有するペプチドも包含される。 例えば、 上記ペプチド に、 上記作用を損なわない化学的な修飾を加えたものはここで言う 「誘導体」 に 包含される。 例えば、 ペプチドの C末端のカルボキシル基をァミノ基に変えるこ とにより生体内での安定性が高められることが知られているが， このような化学 修飾を施したものも本発明の範囲に含まれる。

さらに、 一般に生理活性を有するペプチドにおいて、 その少数のアミノ酸が他 のアミノ酸に置換し、 少数のアミノ酸が付加され、 又は少数のアミノ酸が欠失し た場合でも、 その生理活性が維持される場合があることは当業者に周知の事実で ある。 従って、 本発明の範囲には、 配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有する 上記べプチドを構成するアミノ酸のうち、 少数のアミノ酸が他のアミノ酸に 換 し、 少数のアミノ酸が付加され、 又は少数のアミノ酸が欠失したものも本願発明 で言う 「誘導体」 に包含され、 これらのうち、 骨芽細胞に対する増殖促進作用及 び活性促進作用を有するペプチドは本発明の範囲に含まれる。 例えば、 5個以下 のァミノ酸が付加、 S換又は欠失したもの及びァミノ酸配列の相同性が 7 0 %以 上であって骨芽細胞に対する増殖促進作用及び活性促進作用を有するぺプチドは 本発明の範囲に含まれる。 なお、 ペプチド誘導体が骨芽細胞に対する増殖促進作 用及び活性促進作用を有するか否かは、 下記実施例 2及び 4に記載した方法によ リ調べることができる。

配列番号 1で示される本発明のぺプチドは、 構成アミノ酸数が 1 6個と比較的 小さいので、 常法に基づき化学合成により容易に製造することができる。 例えば、 市販のペプチド合成機を用いて容易に製造することができる。 あるいは、 該アミ ノ酸配列をコードする D N Aを D N A合成機により合成し、 これを市販のクロー ニングベクターのクローニング部位に挿入し、 これで宿主微生物を形質転換し、 培養するという、 常法の遺伝子工学的手法によつても容易に製造することができ る。 下記実施例において実験的に確認されたように、 本発明のぺプチドは骨芽細胞 に対する増殖促進作用及び活性促進作用を有する。 従って、 本発明のペプチドは、 骨粗鬆症のような骨疾患の治療薬として有用である。 本発明のぺプチドによリ治 療可能な骨疾患としては、 骨粗鬆症の他に骨軟化症等を例示することができる。 本発明のペプチドは、 分子量も比較的小さいので、 静脈投与、 皮下投与及び筋 肉内投与の他、 製剤化技術により経口投与及び経皮投与も可能である。 本発明の ペプチドは、 そのまま投与することもできるし、 常法により薬理的に許容できる 担体と混合して投与することもできる。

投与量は、 患者の状態に応じて適宜判断されるが、 通常、 大人 1 日当たり、 本 発明のペプチド 0. 1 〜 1 0mg程度である。

また、 静脈内投与、 皮下投与及び筋肉内投与の場合、 本発明のペプチドを、 く えん酸緩衝液 （p H 4〜6) 又は齚酸緩衝液 （p H 4〜6) のような弱酸性の緩 衝液に溶解して投与することが好ましい。 この場合、 緩衝液中のペプチドの溏度 は通常 0. 1 mgZm I 〜 1 OmgZm I程度である。 また、 経口投与及び経皮 投与の場合には、 脂溶性の物質 （例えば、 ワセリン等） に溶解し、 吸収性の向上 を図ることが望ましい。 この場合、 本発明のペプチドの濃度は通常 0. 1 mg/ m I 〜 "！ 0 OmgZm I程度である。

以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。

実施例 1 ペプチドの製造

市販のぺプチド合成機を用い、 配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を有するぺ プチドを合成した。

実施例 2 骨芽細胞増殖促進作用

骨芽細胞であるラッ 卜由来 ROS細胞 （入手先： AT CC) を 1 0%牛胎児血 清を含む F 1 0¾地 （入手先：大日本製薬） にて培養し、 5%炭酸ガス加湿 37 °C恒温器内にて育成した。 トリプシン処理により 24穴 ¾養プレー卜に 1x10⁵個 ノ穴 （wel l) 蒔種し、 コンフルーェン卜になったところで培地を 1 %牛胎児血清 F 1 0培地に交換し、 24時間培養した。 その後、 実施例 1 で製造した本発明の ペプチドを 1 %牛胎児血清 F 1 0埯地に溶解し、 容量を変化させながら we I I に加えてさらに 24時間培養を継続した。 埯養後、 本ペプチドによる細胞の増殖 促進効果を MTTアツセィによリ測定し、 非処理群に対する增殖促進効果を求め た。 なお、 MT Tアツセィ及び增殖促進率の算出は具体的には次のように行った _c フナコシ （株） よリ市販されている MT F— C e l l — G r ow t h A s s a y k i tの手順に従い、 本物質を用量を変化させながらゥヱルに加え一昼夜放 置後、 生細胞のミ トコンドリア中に存在する酵素により MT T (3-4, 5Di methyl thiazol-2YL)-2, 5Di phenyl Tetrazol ium bromide が暗靑色のホルマザンに関 裂する現象を利用し比色法にて生細胞を計数した。 本物質を加えない対照群を 1 00%とし用量を変化させて加えた群の比色度を求めると次のようになった。 結 果を下記表 1に示す。

表 1

表 1から明らかなように、 本発明のペプチドは、 骨芽細胞に対し増殖促進的に 作用することが確認された。 従って、 本発明のペプチドは骨量の増加に結びつく ものと考えられ、 骨粗鬆症等の骨疾患の治療に対し有用である。

実施例 3 本ペプチドに対する骨芽細胞上の受容体の存在

本ぺプチドが骨芽細胞に対し増殖促進作用があることが判明したことにより、 骨芽細胞が本ぺプチドに対する受容体を持っていることが推察される。 もし受容 体が存在するならば本べプチドは生命にとり根源的な物質であることが考えられ, 次に骨芽細胞に受容体が存在するか否かを調査した。

実施例 1で得られたぺプチドをピオチンで摞鏃し、 実施例 2と同様に培養した R OS轴胞に一定量に標識した本ぺプチドを加え、 さらに競合反応をさせるため に非標識の本ペプチドを 1 0%牛胎児血清 F 1 0铯地に溶解し、 容量を変化させ ながら加えて競合反応を見た。 この実験操作は具体的には次のように行った。 S U I LON社製の蛋白ビォチン化標識キッ卜の手順に従い本ぺプチドをビォチ ン化し、 ゥエルに播種された一定数の細胞に対し一定量のピオチン化ぺプチドを 加え非摞識ぺプチド 0~0. 51 2 g/ ell を各々加え競合反応を 6時間行 い、 その後、 細胞を PBSにて洗浄しストレプトアビジンで標識したペルォキシ ダーゼで細胞表面にある受容体に結合したビォチン化べプチドに反応して発色反 応を見る。 細胞表面に本べプチドの受容体が存在すれば非標識のぺプチドと競合 反応が起こリ発色強度は低下する。 結果を下記表 2に示す。

表 2

表 2に示されるように、 非標識体の添加量に依存して加えた標識体に対する割 合が変化しているので、 骨芽細胞が本べプチドに対する受容体を持っていること は明らかであり、 本物質が根源的な役割を担っていることが推察される。 急性毒性試験

実施例 1で作製したペプチドについて、 d d y雄性マウス （体重 40~45g ) を用い、 その急性毒性を試験した。 本ペプチドを生理食塩水 （PH6. 0) に 溶解し、 これをマウスの尾静脈より投与し、 1 4日間観察した。 投与量は 1、 1 0、 1 00 g/k gとした。 この結果を下記表 3に示す。

表 3

以上の様に、 1 00 gZk gまでの範囲では死亡例は認められなかった。

産業上の利用可能性

本発明のペプチドは、 上記実施例により実験的に確認されたように、 骨芽細胞 に対し増殖促進作用及び活性促進作用を有しており、 骨疾患治療薬として有用で ある。

【配列表】

配列番号： 1

配列の長さ ： 1 6

配列の型： アミノ酸

配列

Lys Leu Thr Thr lie Phe Pro Leu Asn Trp Lys Tyr Arg Lys Ala Leu 1 5 10 15

Claims

請求の範囲

1 配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド及びその锈導 体であって骨芽細胞に対する増殖促進作用及び活性促進作用を有するぺプチド。

2 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する請求項 1記載のぺプチ

3 請求項 1又は 2記載のぺプチドを有効成分として含有する骨疾患治療薬。

4 請求項 1又は 2記載のぺプチドと薬理的に許容できる担体とを含む骨疾患治療組 成物。