WO1996012503A1

WO1996012503A1 - Remedy for diseases caused by il-6 production

Info

Publication number: WO1996012503A1
Application number: PCT/JP1995/002169
Authority: WO
Inventors: Tadamitsu Kishimoto; Tomoo Katsume; Hirouki Saito
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 1997-04-21
Also published as: HU225392B1; FI20105844L; CZ118997A3; FI122970B; CN1535728A; NO971816D0; NO330588B1; NO971816L; HK1067062A1; EP0791359A4; JP4896093B2; NO330589B1; HU0304064D0; CA2203182C; FI971669L; FI20115753L; FI121455B; PL182089B1; EP1884524A2; NO331944B1

Description

明細書

I L一 6産生に起因する疾患の治療剤技術分野

本発明はインタ一ロイキン— 6 レセプ夕一（ I L一 6 R ) に対する抗体（抗 I L一 6 R抗体）を含んで成る、インターロイキン一 6 ( I L - 6 ) の産生に起因する疾患の予防又は治療剤に対する。

背景技術

I L一 6は多機能性を有するサイトカインで、免疫、血液、急性期反応等の様々な段階で作用し〔Taga， T.ら、 Critical Reviews i n Immunol.1992:11:265-280.) 、多発性骨髄種の増殖因子として作用するに加え種々の疾患、例えば、リウマチ〔Hirano， T.ら、 Eur J Immunol.1988； 18： 1797-1801； Houssiau, F. A. ら Arth Rheum, 198 8:31 :784 - 788. 〕 Castleman' s disease CYoshizaki, K. ら Blood 1989:74： 1360-1367; Brant, S.J.ら J Clin Invest.1990;86:592-59 9.〕のようなプラズマサイトーシスがみられる病気、あるいはメサンギゥ厶細胞増殖性腎炎〔0hta. K.ら CI in Nephrol. (Germany)1992 ;38:185-189; Fukatsu. A.ら Lab Invest.1991 ;65:61-66; Horii, Y . ら J Immunol.1989;143:3949-3955. 〕、腫瘍増殖に伴う悪液質〔 Strassmann, G.ら J Clin Invest.1992:89： 1681-1684. などでも重要な役割をはたしていると考えられている。

遺伝子操作によって h um a n I L - 6 ( h I L— 6 ) を過剰発現させた H— 2 L^d h I L一 6 トランスジエニックマウス（ I L — 6 T gm) では I g G l プラズマサイト—シス、メサンギゥ厶増殖性肾炎、貧血、血小板減少症、自己抗体の出現などが観察され〔宮井達也ら：第 2 1 回日本免疫学会発表「H - 2 L ^d h I L - 6 トランスジヱニックマウスの加齢に伴う血液および血清学的変化」； 1 9 9 1 〕、 I L— 6の多彩な疾患に対する関与が示唆された。しかしながら、インターロイキン一 6 レセプターに対する抗体が

、ィン夕ーロイキンの生産に対する疾患に対して有効であることは知られていない。発明の開示

従って本発明は、インタ一ロイキン一 6の生産に起因する疾患の予防又は治療剤を提供しょうとするものである。

上記の課題を解決するため、本発明はインタ一ロイキン一 6 レセプ夕一に対する抗体を含んで成る、インターロイキン一 6の生産に起因する疾患の予防又は治療剤を提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、各群の動物の推移の体重の増加を示すグラフである。図 2は、各群の尿蛋白質の陽性率の推移を示すグラフである。 1 群及び 3群以外の群では尿蛋白質の陽性率は 0であった。

図 3は、各群のヘモグロビンレベルの推移を示すグラフである。図 4 は、各群の赤血球数の推移を示すグラフである。

図 5は、各群の血小板数の推移を示すグラフである。

図 6は、各群の白血球数の推移を示すグラフである。

図 7は、各群の血清 I g G l 濃度の推移を示すグラフである。図 8は、 1 〜 5群でのヒト I L一 6濃度の推移を示すグラフである。

図 9は、 1 群及び 2群における、対照抗体 I g G及び G r - 1 抗体による、蛍光抗体セルソーティングの結果を示す図である。図 1 0は、 6群及び 7群における、対照抗体 I g G及び G r— 1 抗体による、蛍光抗体セルソーティングの結果を示す図である。図 1 1 は、実験終了後の各群の動物の脾臓重量を示すグラフである o

図 1 2は、各群の動物の体重の推移を示すグラフである。

図 1 3は、実験 1 1 日目のマウスの血中トリグリセリド濃度を示すグラフである。

図 1 4 は、実験 1 5 日目のマウスの血中グルコース濃度を示すグラフである。

図 1 5は、実験 1 1 日目のマウスの血中イオン化カルシウム濃度を示すグラフである。

図 1 6は、担癌マウスの生存率を示すグラフである。

図 1 7は、実験開始 1 0および 1 2 日目のマウスの体重を示すグラフである。

図 1 8は、実験開始 1 0および 1 2 日目のマウスの血中イオン化カルシウム濃度を示すグラフである。具体的な説明

インターロイキン— 6の生産に起因する疾患としては、例えばプラズマサイト—シス、例えばリウマチ、キャスルマン病（ C a s t 1 e m a n ' s d i s e a s e ) ；高ィ厶ノグロブリン血症；貧血；腎炎、例えばメサンギゥム増殖性腎炎；悪液質等が挙げられる o

本発明で使用される I L一 6 レセブ夕一抗体は、 I L一 6によるシグナル伝達を遮断し、 I L— 6の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来および種類（モノクローナル、ボリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。この抗体は I L— 6 Rと結合することにより、 I L - 6 と I L一 6 Rの結合を阻害して、 I L一 6のシグナル伝達を遮断し、 I L一 6の生物学的活性を阻害する抗体である。

モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからゥサギあるいはげつ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。

このような I L一 6 レセブ夕一抗体としては、 MR 1 6 — 1 抗体 (Tamura, T. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.90, 11924-11928, 1993 ) 、 P M— 1 抗体（Hirata. Y. ら、 J，【mmimol.143, 2900-2906, 1989 ) などが挙げられる。

モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、 I L一 6 Rを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたかって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。

より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としては、欧州特許出願公開番号 E P 3 2 5 4 7 4号に開示されたヒト I L一 6 Rの遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒト I L一 6 Rの遗伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主紬胞中または、培養上清中から目的の I L一 6 Rタンパク質を精製し、この精製 I L— 6 R夕ンパク質を感作抗原として用いればよい。また、マウス由来の前記感作抗原としては、日本特許出願公開番号特開平 3— 1 5 5 7 9 5に開示されたマウス I L— 6 Rの遺伝子配列を用い、上記ヒト I L一 6 Rの遺伝子配列を用いたのと同様な方法にしたがえばよい。

I L - 6 Rは細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱している可能性のもの（ s I L - 6 R) が抗原として使用できる。 s I L— 6 Rは細胞膜に結合している I L— 6 Rの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型 I L - 6 Rと異なっている。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ゥサギ等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原を P B S (P h o s p h a t e - B u f f e r e d S a l i n e ) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4一 2 1 日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 P 3 (P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 ) (J. Immunol.123:1548, 1978), ρ 3 - U 1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81： 1-7, 197 8), N S - 1 (Bur. J. Immunol.6 : 511-519. 1976), M P C - 1 1 ( Cell, 8:405-415, 1976)： S P 2 / 0 (Nature, 276:269-270， 197 8)， F 0 (J. Immunol. Meth.35:1-21, 1980), S 1 9 4 (J. Exp. Med. 148:313-323, 1978). R 2 1 0 (Nature, 277:131-133, 1979)等が好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルスティンらの方法（Milsteinら、 Methods En zymol.73:3-46, 1981)等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ P E G) 、センダイウィルス（HV J ) 等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1 - 1 0倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な R PM I 1 6 4 0培養液、 ME M培養液、この他、その種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ F C S ) 等の血清補液を併用することもできる。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、 3 7で程度に加温した P E G溶液、例えば、平均分子量 1 0 0 0 - 6 0 0 0程度の P E G溶液を通常、 3 0 - 6 0 % (w/ v) の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイプリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を操り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去でさる o

当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液（ヒボキサンチン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培養液 ) で培養することにより選択される。当該 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。

このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性がある喃乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などか採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル濾過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。

このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（R I A) 、酵素免疫測定法（E I A， E L I SA) 、蛍光抗体法 ( I mmu n o f l u o r e s c e n c e A n a l y s i s ) 等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。

本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイプリドーマが産生するモノク口一ナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキヌラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遗伝子組換技法を用いて製造することができる。

さらに、再構成（ r e s h a p e d ) したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができ。

なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ F R ) 領域のァミノ酸を置換してもよい（Satoら、 Cancer Res.53:卜 6. 1993)。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化 PM— 1 ( h PM- 1 ) 抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号 WO 9 2 - 1 9 7 5 9を参照）。

さらには抗原に結合し、 I L一 6の活性を阻害するかぎり抗体の断片、たとえば F a bあるいは F v, H鎖と L鎖の F vを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン F v ( s c F v ) をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、 Birdら、 TIBTECH, 9:132-137 , 1991； Hustonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879 - 5883, 198 8 を参照）。さらに、 s c F Vを作成するために用いる H鎖および L鎖の F Vには、上記再構成された抗体の V領域を用いることができる。本発明の I L - 6 レセプター抗体を有効成分とする I L一 6の生産に起因する疾患の予防治療剤は、 I L - 6のシグナル伝達を遮断し、 I L一 6の生産に起因する疾患に有効である限り、本発明において使用することができる。

本発明の予防治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物ゃキッ卜の形態をとることができる。

本発明の予防治療剤のヒ卜に対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるか、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、およそ 1 一 1 0 0 0 mgZ患者の範囲で 4回以下の分割用量を選択することができる。また、 1 - 1 0 mgZ kgZ週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明の予防治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の予防治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製された I L一 6 R抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、 T w e e n 8 0、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ H S A ) などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであつてもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。実施例

以下、参考例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。参考例 1. B 6 L ^d — I L一 6 トランスジエニックマウスの作製 H - 2 L ^d プロモーターと連結したヒト I L一 6 c DNAを含有する 3. 3 kbp の S p h l — X h o l断片（L ^d — I L— 6 ) (Su ematsuら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 86, 7547, 1989) を、 Yamamu ら、 J. Biochem.96, 357, 1984 に記載されている方法に従って C 5 7 B LZ 6 J ( B 6 ) マウス（日本クレア）からの受精卵の前核にマイクロインジェクションにより注入した。

その受精卵を、疑妊娠処置した雌性】 C Rマウスの卵管内に移植した。その後、生まれたマウスについて、ヒト I L一 6 c DNAの組込みを E c 0 R I消化した尾部 DN Aのサザンブロット分析により、プローブとしてヒト I L一 6 c DNAの³² P—標識 T a q I - B a n ll断片を用いてスクリーニングした。組込みが認められた個体と B 6マウスを交配して同じ遺伝子型を持つマウスのラインを確立した。

参考例 2. ラット抗 I L一 6 R抗体の調製

マウス可溶性 I L一 6 R生産性 C H〇細胞を Saitoら、 J. Immuno 1.147, 168- 173, 1991に記載されているようにして調製した。この紬胞を、 5 %ゥシ胎児血清（F B S ) を含冇するひ ME M中で 3 7 °C にて、空気中 5 %C 0₂ の加湿雰囲気下て培養した。馴化（c o n d i t i o n e d ) 培地を回収し、そしてマウス s I L— 6 R調製物として使用した。培地中のマウス s I L— 6 Rの濃度は、サンドイッチ E L I SAにより、モノクローナル抗マウス I L— 6 R抗体 R S 1 5 (Saito ら、 J. Immunol.147， 168-173.1991) 及びラビットボリクローナル抗一マウス I L一 6 R抗体を用いて測定した。

マウス s I L - 6 Rをマウス s I L— 6 R調製物から、モノクロ —ナル抗マウス I L - 6 R抗体（R S 1 2 ) を吸着させたァフィ二ティーカラムにより精製した。フロインドの完全アジュバント中 5 0 gの精製マウス s I L— 6 Rにより W i s t e rラットを皮下注射免疫し、次に 2週間後から 1週間に 1回、フロインドの不完全アジュノくント中 5 0 z gのマウス s I L一 6 Rにより 4回皮下に追加免疫した。最後の追加免疫から 1週間後、ラットに 1 0 0 1 のリン酸緩衝液（P B S) 中 5 0 z gのマウス s I L— 6 Rを静脈内投与した。

3日後にラットより脾臓を摘出し、そしてポリエチレングリコ一ル（ベーリンガーマンハイム）を用いて、ラットの脾細胞とマウス p 3 U 1 ミエローマ細胞とを 1 0 ： 1の比で融合処理した。 9 6 - ゥエルプレート（F a l c 0 n 3 0 7 5 ) のゥエル中 3 7 °Cにて、 1 0 %F B Sを含有する R PM I 1 6 4 0培地 1 0 0 1 中で一夜インキュベートした後、ヒト I L一 6を含有するヒボキサンチン/ アミノブテリンチミジン（HAT) 含有培地 1 0 0 1を各ゥェルに添加した。 4日間にわたり毎日、培地の半分を HAT培地により置換した。

7日後、抗マウス s I L— 6 Rを産生するハイプリドーマをマウス s I L— 6 R—結合アツセィ（E L I SA) により選択した。要約すれば、ハイブリドーマの培養上清 1 0 0〃 1 を 6 0分間、ラビットポリクローナル抗ーラット I g G抗体を 1 Ci gZmlでコートしたプレート中でインキュベートした。プレートを洗浄し、そして 1 0 0 gZmlのマウス s I L— 6 Rと共にインキュベートした。洗浄後、ラビットボリクローナル抗一マウス I L— 6 R抗体を 2 g /mlで加え、そしてプレートを洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ-結合ャギボリクローナル抗一ラビット I g G抗体（T a g 0 ) と共に 6 0分間インキュベートした。

最後に、洗浄後、プレートを、アルカリホスファタ一ゼの基質（ S i g m a 1 0 4 ； p—二トロフエニルホスフェート）と共にィンキュペートし、そして 4 0 5 ηπιにてプレートリーダ一（東ソ一）を用いて読み取った。マウス s I L - 6 Rを認識するハイブリドーマを限界希釈法により 2回クロ一ニングした。腹水の作製のため、 BA L B/c n uZn uマウスに 0. 5 mlのプリスタンを 2回注射し、そして 3日後に 3 X 1 0⁶ 個の樹立されたハイプリドーマ紬胞を腹腔内注射した。 1 0〜 2 0 日後に腹水を集め、そして腹水からプロテイン Gカラ厶（O n c o g e n e S c i e n c e ) を用いてモノクローナル抗体 MR 1 6— 1 を精製した。

MR 1 6 - 1 により生産された抗体の I L一 6に対する中和効果を、 MH 6 0. B S F 2細胞（Matsuda ら、 Eur. J. Immunol.18:951 -956, 1988) による ³H—チミジンの取り込みにより試験した。 M H 6 0. B S F 2細胞を 9 6—ゥエルプレートに 1 x 1 0 細胞 Z 2 0 0 1ノウエルの量で分配し、マウス I L一 6 ( 1 0 pg/ml) と MR 1 6— 1又は R S 1 2抗体とをゥエルに加え、そして細胞を 3 7 'Cにて 5 % C 0₂ 中で 4 4時間培養した。次に、各ゥエルに ³ H—チミジン（ 1 mci Zゥエル）を加え、 4時間後に ³ H—チミジンの取り込みを測定した。

実施例 1.

参考例 1 において作製した B 6 I L - 6 トランスジエニックマウス（B 6 I L - 6 T gm) を自家繁殖したヒト I L一 6 c DNAを持つトランスジエニックマウス 3 1匹及びヒト I L— 6 c DN Aを持たない正常同腹仔 1 1匹（いずれも 4週齢；雄性）を用いた。 B 6 I L - 6 T gmは 6匹づっ 5群（第 1〜 5群）に分け、第 1群のみ 7匹とした。また正常同腹仔に第 6群 5匹及び第 7群 6匹に分けた。

投与スケジュールは次の通りとした。

第 1群（B 6 I L - 6 T gm) _: 4週齢（実験第 1 日）にラット I g G l抗体（KH 5 ) (対照抗体）を 2 rag 0. 2 ml静脈内注射し、 5週齢（実験第 8 日）以降、週 2回づっ（ 3ないし、 4 日毎） 1 0 0 gの KH 5抗体を皮下注射した。

第 2群（B 6 I L - 6 T gm) : 4週齢に1^1¾ 1 6 - 1抗体を SmgZ O . 2ml静脈内注射し、 5週齢以後週 2回づっ 1 0 0 g の MR 1 6 - 1を皮下注射した。

第 3群（B 6 I L - 6 T gm) ： 4週齢にリン酸緩衝液 0. 2 mlを静脈内注射し、そして 5週齢以降週 2回づっ 1 0 0 gの M R 1 6一 1 を皮下注射した。

第 4群（B 6 I L - 6 T gm) : 4週齢に 2mg/ 0. 2mlの MR 1 6— 1 を静脈内注射し、そして 5週齢以降 2週間ごとに 4 0 O〃 g0MR l 6— 1 を皮下注射した。

第 5群（B 6 I L - 6 T m) : 4週齢に 21^ノ 0. 2mlの MR 1 6— 1 を静脈内注射し、そして 5週齢以降 2週間ごとに l mg の MR 1 6 - 1を皮下注射した。

第 6群（B 6 同腹仔）： 4週齢に対照抗体 K H 5を 2 mgZ 0. 2 ml静脈内注射し、そして 5週齢以降週 2回づっ 1 0 O ^i gの KH 5を皮下注射した。

第 7群（B 6 同腹仔）： 4週齢に 2 0. 2mlの MR 1 6 - 1 を静脈内注射し、そして 5週齢以降週 2回づっ 1 0 O gの MR 1 6 - 1 を皮下投与した。

本発明において使用した試験方法は次の通りである。

体重および尿蛋白測定：毎週体重測定ならびに尿蛋白試験紙（ C 0 m b i s t i c s三共）による尿蛋白測定を行った。尿蛋白は 3 + ( 1 0 0 - 3 0 0 mg/dl) 以上を陽性とした。

実験開始時（ 4週齢）より隔週に眼窩静脈叢より採血を行レ、、実験終了時（ 1 8週齢）には後大静脈より全採血を行った。血球数測定： m i c r o c e l l c o u n t e r ( S y s m e x F— 8 0 0 ) により、白血球数（WB C) 、赤血球数（R B C ) 、血小板数（P LT) ならびにヘモグロビン量（HG B) を測定した。また、実験終了時には一部の群（ 1， 2, 6 , 7群）について血液塗抹標本を作製し、白血球分画を行って百分比を算出した ο

血中 I g G 1濃度測定： s t a n d a r dとして m y e 1 o m a P r o t e i nを用いたマウス I g G 1特異的 E L I S Aで測定を行った。

血中 h I L - 6濃度測定： h I L - 6特異的 E L I S Aで測定を打った。

血中抗ラット I g G抗体価（ I g G c l a s s ) 測定：投与抗体はマウスにとって異種抗体であるため投与抗体に対する抗体産生の有無をラット I g Gを抗原とした E L I S Aで測定を行った。測定はラット抗体を投与された a d u l tの I L一 6 T g m血清を s t a n d a r dとし、ュニット化して表示した。

血清生化学値の測定

実験終了時の 1 , 2， 3， 6および 7群のマウスの血清について、総蛋白質（T P) 、アルブミン（A 1 b ) 、グルコース（G 1 u ) 、トリグリセライド（TG) 、クレアチニン（C R E) 、血中尿素窒素（BUN) 、カルシウム（C a ) 、アルカリフォスファタ一ゼ（AL P) 、グルタミン一ォキサ口酢酸トランスアミナーゼ（G 0 T) およびグルタミン酸一ピルビン酸トランスアミナ一ゼ（ G P T) の各値をオートアナライザー（C O B A S F A R A II, R o c h e社）で測定した。

骨髄および脾細胞の F A C Sによる解析：実験終了時に 1 , 2， 6 , 7群各 1匹づつの骨髄ならびに脾細胞を採取し、 FA C S c a n (べクトン · ディッキンソン）による細胞表面抗原の解析を実施した。使用した抗体は各々 G r — 1 (骨髄細胞）、 C D 4， C D 8 , B 2 2 0 (脾細胞）に対する抗体（ファーミンジェン社）である剖検：実験終了時に剖検を実施し、脾重量の測定ならびに主要臓器の肉眼的観察を行った。体重：各群の体重推移を図 1 に示した。 1 群および 3群では体重増加が観察された。他の群には体重変化の違いは観察されなかった尿蛋白： 1 群では 1 3週齢より尿蛋白陽性個体が出現し（図 2 ) 、剖検時までに 7匹中 4匹（ 1 6週齢で 2匹、 1 7週齢で 2匹）が死亡したが他の群では死亡例は観察されなかった。 3群でも実験終了時までに 6例中 2例で尿蛋白陽性個体が出現したが、それ以外の群では認められなかった。

血液学的所見： 1群では、へモグロンビン量（図 3 ) および赤血球数（図 4 ) の減少が認められ、加齢とともにその程度は著しいものとなつた。血小板数（図 5 ) は一端増加したのち急激に減少した。 3群では、 1 群よりやや遅れて同様の傾向が観察された。一方、 2 , 4 , 5群では何れの群においてもヘモグロビン量、赤血球数の滅少、血小板数の増加およびそれに続く減少は認められなかった。末梢血塗抹による白血球分画の観察では、 1 群で好中球および単球の増加、それにともなうリンパ球比率の減少が認められたが 2群はほぼ正常値を示した（表 1 ) 。また、 6群と 7群の間には有意な差は存在しなかつた。表 1 群幼若好 m 好 m リンハそ于《 1 q

Η U リ. Q Q DO. UU π fid

1

ム \ ) 0 Q, 7 Ι0Ό 0 co oo Q Π^Ι o u, n unu

ΉΖ ½ η υ. ¾Ο3 io. oo 9 i, QQO n on ム uu 01. w

o Λ CO A 17 1 1.

π no Δ oΟo U.00 t 検定 00676 00000 0.0557 00129 00006

平均 0.30 14.10 2.80 0.00 1.30 81.40 0.10

6

標^^ 0.45 4.60 0.91 0.00 1.04 4.08 0.22 平均 0·42 10.67 2.42 0.08 0.58 85.75 0.08

7 標^ n 0,38 2· 32 0.97 0.20 0.49 1.92 0.20 t 検定 0.6484 0.1406 0.5101 0.3816 0.1644 0.0427 0.8992 血中 I g G 1 濃度： 1 群では、実験開始直後より著明な血中 I g G 1 濃度の上昇が観察され最終的には正常マウスの 1 0 0倍程度の濃度に達した（図 7 ) 。 3群は 1 群よりやや遅れて I g G l 濃度の上昇が観察された。これに対し、 2 , 4 , 5群では I g G l 濃度の上昇は観察されず、実験期間中ほぼ一定の濃度であった。また、正常マウスでは抗体投与にともなう変化は観察されなかった。

血中 h I L— 6濃度：血中 h I L - 6濃度（図 8 ) は、 I g G l と同様に推移し、 1 群および 3群で血中濃度の上昇が観察されたのに対し、他の群では実験期間中ほぼ一定であった。

血中抗ラット I g G抗体価： 1 , 3および 6群ではラット I g G に対する抗体が検出された（表 2 ) 。 1 および 3群では全例高い抗体価を示したが、 6群で抗体価が上昇していたのは 5匹中 2匹であつた。一方、その他の群では有意の上昇は観察されなかった。 /12503

O

マウス抗ラット抗体（' ッ卜 Zml) L

^¾ mo. 齢（週） 6 8 10 12 14 16 18

1 0.15 0.78 1.69 7.41 100く 100く 100く 100く

2 0.22 0.34 0.45 0.38 0.43 0.50 0.39 0.30

3 0,14 0.61 0.69 0.67 2.27 4.74 14.25 41.24

4 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 0.57

5 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 0.28

6 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 3.55

7 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N. D. N.D. 0.20

N.D. ： ¾IJ¾W

ιίίι清生化学値の測定

1群と 3群は、 Τ Ρの増加と A 1 bの減少が認められた。 T Gと AL Pは、 1群と 3群で低下し、 1群では G 1 uの低下もみられた。 2群ではこれらの変化はみられなかった。

表 3 群 TP(gAU) Alb(g/dl) Glu(mg/dl) TG(mg/dl) CRE(mg/dl) BL (mg/dl) Ca(mg/dl) ALPCU/l) G0T(IU/1) GPT(U/1)

1 mean 14 2.41 77.4 20.7 0.4 34.8 8.6 27.67 33.33 6

SD 1.33 0.3 14.5 8.33 0.2 23.7 0.35 5.69 5.86 1.73

2 mean 5.68 3.31 199 62.3 0.51 28.3 8.67 156.5 37.5 5.6

SD 0.3 0.2 29.5 10.9 0.22 4.08 0.58 14.31 8.22 1. 14

3 mean 12.6 2.92 253 41 0.61 26.4 9.82 54. 17 27.33 6.83

SD 2.85 0.64 60.2 16.3 0. 17 6.25 0.83 42.62 5.65 1.72

6 mean 5, 9 3.84 289 105 0.87 27.9 8.9 181 33.2 9.6

SD 0.65 0. 6 98.9 28.8 0.22 6.32 0.74 21.24 8.9 5.81

7 mean 5.86 3.63 300 94 0.75 26.8 8.98 196.83 34.5 6.5

SD 0.53 0.34 25.5 20 0.2 5.26 0.82 21.68 4.89 3.08

F A C Sによる解析： 1 , 2 , 6 , 7群の F A C Sによる骨髄細胞（ BM) および脾細胞（ s p ) の解析を行ったところ 1 群の B M 細胞では顆粒球系前駆紬胞である G r - 1 陽性細胞の比率が極端に増加していた（図 9、図 1 0 ) が 2群では同腹仔と同様の値を示した。また、 6群と 7群の間にはほとんど差がなかった。 s p中の C D 4 , C D 8， B 2 2 0陽性細胞の比率は 1 群で形質細胞の増加による C D 8および B 2 2 0陽性細胞の減少が認められた以外は各群間に差は認められなかった（表 4 ) 。

i 1

脾細胞の表面抗原解析群 C D 4 ⁺ C D 8 ⁺ B 2 2 0 ⁺

1 1 3. 2 % 5. 4 % 2 3 1 % 2 1 8. 5 % 1 4. 3 % 5 0 0 % 6 1 9. 9 % 1 5. 0 % 5 3 1 % 7 1 3. 9 % 1 0. 6 % 5 7 3 % 剖検所見： 1 群および 3群では、全身リンパ節の腫脹、

張が顕著であり（図 1 1 ) 、腎臓の退色も著明であった。一部、肝臓の腫大も観察された。これらの変化はその他の群では観察されず、 2， 4 , 5群は同腹仔とくらべて脾臓が軽度に腫脹している以外は著変はみられなかつた。

次に、この実験の結果を説明する。コントロール抗体投与 I L一 6 T gm ( l群）では、 I g G 1 プラズマサイト -シス、貧血、血小板増加、血小板減少、肾不全、血清生化学値の異常など多彩な病態が観察されたが、これらの発症を MR 1 6 - 1 はほぼ完全に抑制し得ることが明らかとなった。

I L - 6は B細胞を形質細胞へ最終分化させることが知られており CMuraguchi, A. ら J Exp Med.1988 ; 167:332-344. 〕、 I L一 6 Tgmは I L - 6産生により、血中の I g G l濃度が上昇し、血清中の TP値の増加および A 】 b値の低下がみられた。これらのことは、 I g G l プラズマサイト一シスが発症したことを示している ο

これに伴い、全身のリンパ節や脾臓などのリンパ系組織が著明に腫大することが、 1 および 3群で病状進行により全身状態が悪化しているにも関わらず体重増加が観察された原因であろう。 MR 1 6 一 1 はこれらの症状を完全に抑制すると同時に血中 I L一 6濃度の増加も抑制した。したがって、 I L一 6 T gmで認められる加齢に伴う血中 I L— 6濃度の増加はプラズマサイトーシスの進行と直接関係していることが確認された。すなわち、増殖した形質钿胞自身が I L - 6を盛んに産生することによってさらに形質細胞が増殖し、結果的に I L— 6が大量に産生されることにあると考えられた o

I L - 6の血液系に対する作用としては、血小板増加作用〔Ishi bashi, T. ら Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:5953-5957; Ishiba Shi, T. ら Blood 1989;74:1241-1244. ) や小球性貧血を引き起こす作用 CHawley, R.G.ら J Exp Med.1992: 176： 1149-1163. 〕が知られている。 I L - 6 T gmではこれらに加えて多クローン性 B細胞活性ザ匕（p o l y c l o n a l B c e l l a c t i v a t i o n) 進行に関連した自己免疫性と考えられる〔宮井達也ら、前掲〕、加齢に伴う血小板減少が観察される。

MR 1 6— 1 はこのような I L一 6の直接および間接的な血球系に対する作用を完全に抑制したが同腹仔の血球数には影響しなかつた。したがって、正常状態において抗 I L一 6 レセプ夕一抗体は血球系になんら影響を及ぼさないことが確認できた。また、 I L一 6 T g mでは骨髄中の顆粒球系前駆細胞と考えられる G r— 1陽性細胞比率の増加および末梢好中球比率の増加が観察された。 I L - 6が好中球を増加させることは知られているもののその詳細な機序は未だ明らかになっていない。今回の検討でこの作用が骨髄の前駆細胞レベルですでに起こっている現象であることが判明した。ここでも MR 1 6— 1は I L一 6の作用を完全に抑制し、骨髄と末梢血中の好中球レベルには影響を与えなかった。

MR 1 6— 1は I L— 6 T gmで観察される腎炎の発症も抑制した。 I L一 6はメサンギゥム細胞のオートクライン増殖因子としてメサンギゥム増殖性腎炎の発症に密接に関与していると報告されており、 I L一 6 Tgmの腎炎も組織学的にメサンギゥム増殖性腎炎であることが確認されているが、 I L一 6によって亢進された免疫系の関与も否定できない〔勝目朝夫ら：第 2 1回日本免疫学会発表「S C I D x (S C I D xH - 2 L ^d h I L— 6 t r a n s g e n i e m o u s e) マウスの特性」； 1 9 9 1〕。いずれにしても今回の実験で尿蛋白出現および腎炎による死亡の抑制がみられたことから、 I L— 6産生に起因する腎炎発症の抑制に抗 I L一 6 レセプター抗体が有効であることが明らかとなった。

I L一 6 Tgmでは、悪液質の指標である血清中 G 1 u値と T g値の著しい低下が観察された。今回の実験では、 1群では G 1 u 値と T g値が低下し、 2群ではこれらの値がほぼ正常と同程度に回復したことから、 MR 1 6 - 1抗体の投与が悪液質の改善に効果があることが示された。

MR 1 6— 1はラット I g G 1で、マウスにとつては異種蛋白であるため投与抗体に対する抗体が産生され投与抗体が無効になることが容易に想像される。

今回の実験では初回感作時に大量の抗原に暴露されることによつて免疫学的寛容が誘導されることを期待して初回に 2 mgZm o u s eの抗体を静脈内投与した群を設定した。 MR 1 6 — 1 投与群の内この処置を施した群（ 2， 4 , 5群）では投与間隔、投与量に関係なく抗ラット I g G抗体は検出されず、完全な発症抑制効果が観察されたが、 3群は抗ラッ卜 I g G抗体が上昇しコントロール抗体投与群である 1 群よりやや発症が遅れたのみで結局は同様の病態を呈した。

したがって、この処置が免疫学的寛容誘導に有効であつたと考えられる力抗ラット I g G抗体は同様のスケジュールでコントロ一ル抗体を投与した 1 群の全例および 6群の 2ノ 5例でも検出された。 I L一 6 T g mはプラズマサイト—シスが進行すると p 0 1 y c l o n a l B c e l l a c t i v a t i o n力起こるため、 1 群および 3群で検出された抗ラット I g G抗体が投与抗体特異的抗体であると断定はできないが、 2 , 4 , 5群では初回感作時に大量の抗原に暴露されたことによる免疫学的寛容誘導効果と大量の MR 1 6 - 1投与による特異抗体産生抑制作用〔斉藤浩之ら、前掲とが相まって完全な寛容が誘導されたのではないかと考えられた ο

今回の実験で、抗 I L一 6 レセプ夕一抗体が正常レベルには影響を与えずに I L一 6産生に起因する種々の疾患に対して極めて有効であることが明らかとなつた。

実施例 2.

c o l o n 2 6誘導悪液質モデルに対するマウス I L一 6 レセプタ一抗体の効果を検討した。マウスは 6週齢の雄性 B A L / c を用い、実験開始日に c o 1 o n 2 6の 2 mra角のブロックをマウスの側腹部皮下に移植した。マウス I L一 6 レセプター抗体 MR 1 6 一 1 (参考例 2参照）は、実験開始日の c o l o n 2 6移植直前に 2 mgZマウスを静脈内投与し、それ以降 7， 1 し 1 4， 1 8 日目に 0. 5 mgZマウスを皮下投与した（ n = 7 ) 。この方法では、異種蛋白のラット抗体に対する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。なお、担癌コントロール群には、ラット

I g G 1 コントロール抗体（K H 5 ) を同様のスケジュールで投与した（ n = 7 ) 。また、非担癌コントロール群として P B S投与群を設置した（ n = 7 ) 。実験開始後、連日体重を測定し、実験開始 1 1 および 1 5 日目に血清生化学的値および血中イオン化カルシゥム濃度を測定した。

担癌コントロール群では、 1 0 日目以降、非担癌コントロール群に比べ著明な体重減少が観られたが、 MR 1 6 - 1 投与群では部分的な体重減少抑制効果を示した（図 1 2 ) 。 1 1 日目の血中トリグリセリド濃度および 1 5 日目の血中グルコース濃度を各々、図 1 3 、図 1 4 に示す。これらの値は担癌コントロール群では非担癌コントロール群に比べ顕著に減少したが、 MR 1 6 - 1 投与群では、グルコースについては抑制傾向が、トリグリセリドについては有意な抑制効果が観察された。

1 1 日目の血中イオン化カルシウム濃度は、担癌コントロール群で非担癌コントロール群に比べ顕著に上昇したが、 MR 1 6 — 1 投与群では有意な抑制効果を示した（図 1 5 ) 。

上記実験と同様のスケジュールで延命効果を確認する実験を行つた（ n = 1 0 ) 。その結果、 MR 1 6 - 1 投与群では、延命効果があることが認められた（図 1 6 ) 。

実施例 3.

高カルシウム血症を伴う o c c — 1 誘導悪液質モデルに対する I L一 6 レセプター抗体の効果を検討した。マウスは、 6週齢の雄性ヌードマウスを用い、実験開始日にヒトロ腔底癌細胞株 0 c c — 1 をマウスの側腹部皮下に移植した。マウス I L一 6 レセプ夕一抗体 MR 1 6 - 1 (参考例 2参照）は、実験開始日の o c c — 1 移植直前に 2 mgZマウスを静脈内投与し、それ以降 7および 1 0 日目に 1 0 0 g/マウスを皮下投与した（ n = 6 ) 。この方法では、異種蛋白のラット抗体に対する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。なお、担癌コントロール群には、ラット I g G 1 コントロール抗体（K H 5 ) を同様のスケジュールで投与した（ n = 6 ) 。また、非担癌コントロール群として P B S投与群を設置した（ n = 7 ) 。実験開始 1 0および 1 2 日目に体重および血中ィオン化カルシウム濃度を測定した。

担癌コントロール群では、体重減少が観察されたが、 MR 1 6 - 1 投与群では非担癌コントロール群と同様の体重の推移を示し、体重減少が抑制された（図 1 7 ) 。

血中イオン化カルシウム濃度は、担癌コントロール群で非担癌コントロール群に比べ著明な上昇が認められたが、 MR 1 6 — 1 投与群では上昇が強く抑制された（図 1 8 ) 。

Claims

請求の範囲

1. インターロイキン一 6 レセプ夕一に対する抗体を含んでなる、インターロイキン一 6 の産生に起因する疾患の予防または治療剤

2. 前記ィンターロイキン一 6 の産生に起因する疾患がプラズマサイト - シスである、請求項 1 に記載の予防または治療剤。

3. 前記インターロイキン— 6 の産生に起因する疾患が高ィムノグロプリン血症である、請求項 1 に記載の予防または治療剤。

4. 前記インターロイキン一 6の産生に起因する疾患が貧血である、請求項 1 に記載の予防または治療剤。

5. 前記インターロイキン— 6の産生に起因する疾患が腎炎である、請求項 1 に記載の予防または治療剤。

6. 前記ィンタ一ロイキン一 6 の產生に起因する疾患が悪液質である、請求項 1 に記載の予防または治療剤。

7. 前記プラズマサイト一シスがリウマチにより惹起される、請求項 2 に記載の予防または治療剤。

8. 前記プラズマサイト — シスがキャッスルマン病により惹起される、請求項 2 に記載の予防または治療剤。

9. 前記腎炎がメサンギゥム増殖性腎炎である、請求項 5 に記載の予防または治療剤。

10. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 1 ないし 9 のいずれか一項に記載の予防または治療剤。

1 1 . 前記抗体が、 P M - 1 抗体である、請求項 1 0 に記載の予防または治療剤。

12. 前記抗体が、キメラ抗体である、請求項 1 0 に記載の予防または治療剤。

13. 前記抗体が、再構成ヒト抗体である、請求項 1 0 に記載の予防または治療剤。

14. 前記抗体が、再構成ヒ卜 P M - 1 抗体である、請求項 1 3 に記載の予防または治療剤。