WO1995008110A1 - Procede de dosage d'une enzyme et procede de dosage immunoenzymatique d'un antigene utilisant une electrode modifiee et kit de dosage - Google Patents
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- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
Definitions
- the present invention relates to a method for assaying an enzyme and to an immunoenzymatic method for assaying an antigen, for which the detection is carried out on an electrode modified by a polyonic compound promoting the accumulation of the product of the enzymatic reaction.
- the invention also relates to a dosing kit, used during the implementation of these methods.
- Enzymes are catalysts involved in many reactions in human and animal metabolism. and as such are present in tissues and organs. More specifically, these are proteins having catalytic activity on specific substrates. For example, alkaline phosphatase is present in various tissues and in particular in the liver or in the bones. This enzyme is involved in the metabolism of carbohydrates. The decrease or disappearance of some of these enzymes generally leads to functional disorders in the body. It is therefore important to carry out assays of these enzymes in order to be able to detect certain pathological anomalies.
- immunoenzymatic assay techniques have been developed in recent years and are used in the medical, veterinary, agro-food or ecological industries. They advantageously replace radioimmunoassay techniques. These techniques make it possible to dose all types of antigens, in particular tc ⁇ tques products, drugs and chemical molecules.
- ELISA tests are based on the use of an enzyme as a marker.
- the immunoassay methods allow the determination of antigens even if they are present in small quantities.
- the assay is based on the fact that the antibodies (Ac) recognize and then bind specifically to the antigens (Ag), to give an antibody-antigen complex, according to the following balanced reaction:
- heterogeneous competitive assay consists in introducing and putting in. reaction a defined quantity of antigens labeled by an enzyme and an indefinite quantity of unlabeled antigens (antigen to be assayed) to a limited and known quantity of antibodies fixed on the walls of a test tube.
- a method known as “heterogeneous competitive assay” which consists in introducing and putting in. reaction a defined quantity of antigens labeled by an enzyme and an indefinite quantity of unlabeled antigens (antigen to be assayed) to a limited and known quantity of antibodies fixed on the walls of a test tube.
- After the first immunological reaction only a fraction of the antigens labeled with an enzyme and of the antigens to be measured reacted with the antibodies, while the rest of the antigens to be determined and of the labeled antigens are in the form of a free fraction inside the test tube.
- a test tube is then rinsed and washed before adding the specific substrate for the labeling
- the enzyme linked to the antigen and to the antibody then reacts so as to transform the substrate S into a specific product P generally detected by spectroscopic techniques, such as absorbance or fluorimetry measurements.
- spectroscopic techniques such as absorbance or fluorimetry measurements.
- absorbance measurements are not always sufficiently sensitive and fluorimetric measurements, although having higher detection limits, are also sensitive to endogenous interference, which decreases the specificity of the assay.
- the substrate and the product obtained have electroactivities neighboring and therefore the assay process does not meet the selectivity criteria imposed.
- Product P is detected by the same techniques as those cited for the so-called “heterogeneous competitive assay” method and therefore has the same drawbacks.
- this homogeneous assay technique makes it possible to avoid the transfer, decantation and washing steps, the enzymatic activity of the enzyme present in the complex (Ac / Ag-E) must however be significantly lower. to that of the free antigen labeled with an enzyme (Ag-E), or even negligible, so that the transformation of the substrate S into product P is preferably carried out by the free Ag-E.
- heterosis sandwich techniques in which the antigen to be assayed is “sandwiched" between an antibody fixed on the walls of a test tube and an antibody labeled with an enzyme. This enzyme subsequently makes it possible to transform a substrate S into product P, capable of being detected.
- assay techniques have the aforementioned drawbacks inherent in the type of detection used.
- the invention relates to a method for assaying an enzyme and to an immunoenzymatic assay method with electrochemical detection in which the sensitivity of the detection of product P is increased.
- the method for assaying an enzyme comprises the steps consisting in:
- a "pro-ionic" electroactive product is a product which becomes ionic by anodic oxidation
- pro-cationic compound or by cathodic reduction (“pro-amonic” compound).
- the signal measured by the electrochemical detection means increases with the quantity of enzyme present in the sample.
- the polyionic compound of the electrode is capable, thanks to its great affinity for the product obtained at the end of the enzymatic reaction, of accumulating the latter by ion exchange and thus of enhancing the amplifying effect of the enzyme.
- the association of a sensitive electrochemical sensor with the properties of a specific enzyme leads to a simple analysis technique to implement, inexpensive and extremely efficient since it makes it possible to detect an enzyme at concentrations up to 10 - 12 to 10 -13 mol. 1 -1 .
- the immunoenzymatic assay method of an anti-gene according to the invention comprises the steps consisting in:
- This assay method can be applied to all categories of immunoassay and in particular to homogeneous or heterogeneous competitive assays or to assays of the "sandwich" type.
- the substrate / product pair is chosen judiciously so that the accumulation of the product in the polyionic compound is favored to the detriment of the accumulation of the substrate, or even that the accumulation of the substrate is impossible.
- the electrochemical signal detected at the electrode is amplified, which increases the sensitivity of the technique.
- This assay method quantifies antigens such as drugs, hormones, proteins, pesticides, toxins, with a detection limit of 10 -12 to 10 -13 mol.1 -1 .
- the invention also relates to a dosing kit characterized in that it comprises:
- an electrode provided with a polyionic compound, the charge of which is opposite to that of the ionic or proionic electroactive product, and in which said product is capable of accumulating,
- This dosing kit allows the implementation of the aforementioned dosing methods:
- FIG. 1 is a diagram illustrating the method for assaying an enzyme according to the invention
- FIGS. 2 and 3 illustrate two alternative embodiments of the electrode used in the metering methods according to the invention
- FIGS. 4 and 5 are curves representing results obtained by square wave voltammetry
- FIG. 6 is a curve representing the relationship between the peak intensity and the concentration (C) of 2- (N-ferrocenoyl-amino) 4,6-dimethylphenol,
- FIG. 7 is a graph representing the variation of the peak intensity as a function of the concentration of alkaline phosphatase, under various experimental conditions,
- FIGS. 8, 9 and 10 are diagrams illustrating three alternative embodiments of the method. immunoenzymatic assay according to the invention.
- FIG. 11 is a calibration curve for test 2 described below.
- FIGS. 12 and 13 are curves respectively representing the variation of the intensity of the peak as a function of the concentration of anti-phenytoin or of phenytoin, and
- FIG. 14 is a standard phenytoin titration curve usable in the context of a heterogeneous competitive assay.
- FIG. 1 illustrates the principle of the method for assaying an enzyme according to the invention.
- This process consists in reacting an enzyme E with a substrate S so that this enzyme catalyzes the transformation of the substrate S into product P and so that this product penetrates and accumulates inside a polyionic compound 1 included in an electrode. 3 consisting for example of a glassy carbon cylinder.
- the accumulation of the product P in the polyionic compound 1 makes it possible to amplify the signal observed at the output of the electrode 3.
- This electrode 3 is connected to detection means electrochemical 5 allowing the interpretation of this signal.
- These detection means 5 comprise a measuring device 7 connected to an apparatus 9 for drawing graphs providing result curves.
- the detection means 5 (or more precisely the measuring device 7) use the principle of amperometry, coulometry, voltammetry or advantageously square wave voltammetry.
- the polyionic compound is in the form of a film covering the external surface of the working electrode 3.
- FIG. 2 illustrates an exemplary embodiment of an ultra-microdisc electrode, such as that sold by the company Scotland Sensor.
- the electrode 11 is placed next to a reference electrode 15 in Ag / AgF surrounding the circular part 13.
- the film of polyionic compound 1 is deposited over the part 13 using a syringe and then dried in the oven for 10 minutes .
- FIG. 3 illustrates an exemplary embodiment of an electrode 17 with graphite paste impregnated with the polyionic compound and having a renewable surface.
- This electrode 17 is mounted at the end of a nozzle 19 and it is connected by a conductor 21 to a rotating Taccusel electrode 23. The end of the electrode 17 can be cut after use for a new use.
- the polyionic compound 1 can be of polyanionic or polycationic nature.
- the product P is then respectively cationic (or pro-cationic) or anionic (or pro-anionic).
- the polyionic compound 1 can be of mineral or organic origin.
- mineral compounds with cation exchange properties it is possible to envisage, for example, the use of zeolites and clays
- n is between 5 and 13.5
- n is approximately 1000
- k is an integer between 1 and 3.
- the polymer used has a mass of 1100 g per mole of SO 3 H site. At pH 7.4, this polymer is in polyanionic form. This polymer is also thermally and chemically very stable, insoluble in water alone and therefore in the analytes. It has good ion transfer properties.
- the fluorinated groups ensure the hydrophobic character and the SO- 3 groups the anionic character of the polymer.
- polyanionic organic polymers such as, for example, polypyrrole N-substituted by an alkanoic chain (ex: (CH 2 ) n CO 2 H) or sulphonic, (ex:
- polycationic organic polymers such as one of those given in Table I below by way of example.
- a hydrolase such as cholinesterase EC-3-1-1-8 for example is advantageously used as an enzyme.
- This enzyme is involved in the following reaction:
- polyionic compound 1 is of polyanionic nature, such as Nafion (registered trademark), for example, an oxidoreductase such as peroxidase EC-1-11-1-7, a transferase such as ⁇ -glutamyltransferase is advantageously used as an enzyme EC-2-3-2-2 or a hydrolase such as ⁇ -D-glucuronidase EC-3-2-1-31 or alkaline phosphatase EC-3-1-3-1.
- polyanionic nature such as Nafion (registered trademark)
- an oxidoreductase such as peroxidase EC-1-11-1-7
- a transferase such as ⁇ -glutamyltransferase is advantageously used as an enzyme EC-2-3-2-2 or a hydrolase such as ⁇ -D-glucuronidase EC-3-2-1-31 or alkaline phosphatase EC-3-1-3-1.
- the examples are chosen so that the substrate S is electro-inactive and / or of global charge. negative, which disadvantages its accumulation in the polyanionic film, and the cationic or procationic substrate P. In the latter case, it becomes cationic during the accumulation period when it enters the film of compound 1 and oxidizes at the anode to a cationic form. It is in this form that it accumulates in the polyanionic film.
- D representing the donor, that is to say for example the leuco form of malachite green which leads to malachite green (D + ).
- R 2 NH 2 representing for example an amino acid and R 1 NH 2 electroactive derivatives of aniline.
- ROH representing, for example, one of the alcohols given in Table 2 below.
- alkaline phosphatase A.P.
- the remainder R ensures on the one hand the electroactivity of the alcohol and on the other hand, its cationic or procationic character, so as to favor its accumulation in the film of Nafion.
- the ferrocenyl residue ensures both the electro-reactivity and the procationic nature of the compound.
- the anodic oxidation of ferrocene to ferricinium occurs between 0.2 and 0.4 volts (Ag / Agcl electrode). It is the same for the rest NO. in pair 3. Oxidation of NO- to NO + occurs around 0.5 volts.
- the amine hydrochloride of pair 4 is protonated up to weakly basic pHs. In this case, it is the aminophenol which reversibly oxidizes. For couple 5, cobalticinium reversibly reduces to cobaltocene around -1 volt.
- the spirits of couples 1 and 3 are sold.
- the phosphate ester of pair 3 is also sold and the other esters can be synthesized from the POCI 3 reagent in pyridine.
- the alcohol of couple 2 was prepared from aminophenoldimethyl and chloride of ferrocene carboxylic acid.
- the melting point of this alcohol is. at 221 ° C (ethyl acetate / hexane).
- the phosphate ester of pair 2 has also been prepared and has a melting point varying between 214 and 215 ° C (acetone / CH 2 Cl 2 ).
- the electrolysis cell comprises a central reservoir in which 0.5 to 1 ml of the solution to be analyzed is deposited, containing the substrate S no. 2 or the product P no. 2 diluted in a phosphate buffer pH 7.4.
- the recording of the voltammograms on a stationary electrode was preceded by a period of accumulation of the substrate No. 2 or of the product No. 2 in the Nafion film lasting 5 minutes. During the accumulation period, the electrode covered with the Nafion film is rotated at the rate of 600 revolutions / min and is maintained at a potential of 0.6 volts.
- the voltammograms of FIG. 4 were obtained by scanning potentials between 0.6 volts and 0 volts, which corresponds to the reduction of ferricinium to ferrocene.
- Curve A illustrates the results obtained with the substrate S n ° 2 (concentration 2.10-5 mol.1 -1 in the pH 7.4 buffer) and curve B the results obtained with the product P n ° 2 (concentration 10 - 5 mol.1 -1 in pH 7, 4 buffer). From the results of this figure, it can be seen that the ratio between the value of the peak current and the concentration of substrate or product in the buffer is 80 times higher for the product than for the substrate, which shows the high selectivity. of Nafion in favor of product P n ° 2.
- curve C corresponds to the voltammogram obtained for product P n ° 2 (concentration 10 -5 mol.1 -1 in the buffer pH 7.4), in the absence of the Nafion film.
- FIG. 5 represents the square wave voltammograms obtained for the product P n ° 2 ( concentration 2.10 -5 mol.l -1 in the buffer at pH 7.4).
- Curve A represents the results obtained immediately after soaking the electrode in the solution while curve B represents the results obtained after an accumulation of product P n ° 2 in the Nafion film for 10 minutes.
- the peak current for curve A has a value of 0.065 ⁇ A and passes to a value of 0.23 ⁇ A for curve B. This reflects the accumulation of the product in the Nafion film.
- FIG. 6 illustrates the relationship of linearity existing between the peak intensity and the concentration c of product P n ° 2 in table 2. This electrode therefore makes it possible to obtain reliable and reproducible results.
- Test 1 Determination of an enzyme
- a sample was prepared by mixing in a NaHCO 3 buffer (pH 9.6) the substrate S n ° 2 of table 2 at a concentration of 10 ⁇ 5 mol.1 -1 , MgS ⁇ 4 at a concentration of 10 -2 mol. 1 -1 and alkaline phosphatase (Sigma P 4252), at concentrations varying between 0.24 and 24 units per liter.
- the volume of the sample is 1 ml.
- the sample is maintained at 30 ° C. After 15 minutes of incubation period, the pH is reduced to 7.5 by adding 4 ⁇ l 2'4 M hydrochloric acid and the sample is poured into the electrolysis cell described above.
- TRIS buffer pH 10.2 containing 10 -4 mol.1 -1 of substrate S n ° 2, 5.10 -3 mol.1 of NaCl, 10 -2 mol.1 -1 of MgS ⁇ 4 and l alkaline phosphatase at concentrations varying between 0.24 and 1.8 units per liter. After incubation for 30 minutes, the volume of the sample is reduced to 1.0 ml by adding 900 ⁇ l of NaHCO 3 and 4 ⁇ l of 4 M hydrochloric acid. The sample was then transferred to the electrolysis cell. identical to that described in the previous examples. Line B of Figure 7 illustrates the results obtained. A detection limit of 0.024 units per liter is reached, which corresponds to a concentration of alkaline phosphatase Sigma P 4252 of 1.3.10 -12 mol.1 -1 .
- This immunoenzymatic assay principle applies to homogeneous or heterogeneous competitive assays or to sandwich-type assays.
- FIG. 8 illustrates an example of a homogeneous competitive type immunoassay.
- the antigen to be assayed (Ag) the enzyme labeled antigen (Ag-E), the antibody (Ac) and the substrate S are reacted.
- part of the antigens labeled with an enzyme (Ag-E) and assay antigens (Ag) se. fixed on the antibodies (Ac) while only the fraction remained free of enzyme-labeled antigen (Ag-E) reacts with the substrate S to give the product P which then accumulates in the polyionic compound 1.
- the rest of the device (electrode 3 and detection means) is identical to what has been described for FIG. 1 and has the same references. All the other variants described above concerning the structure of the electrodes, the enzymes, the substrate / product pair and the polyionic compound can also be used here.
- FIG. 9 illustrates an example of a heterogeneous competitive type immunoassay.
- the antibody (Ac) present in limited quantity is fixed on the walls of a test tube, for example, and a fixed quantity of enzyme labeled antigen (Ag-E) is reacted. in competition with the antigen to be assayed (Ag).
- the substrate S is added. Only the Ac / Ag-E complexes will react with the substrate S to transform it into product P in proportion to the quantity of labeled antigen present in the form of Ac / Ag-E complex.
- FIG. 10 illustrates an example of a sandwich type immunoassay.
- the antibody (Ac) present in excess is fixed on the walls of a test tube, for example.
- the antigen to be assayed (Ag) is added and reacts with the antibodies (Ac).
- antibodies labeled with an enzyme (Ac-E) are added in excess and sandwich the antigens linked to the antibodies.
- The. substrate S is added after rinsing the test tube.
- enzyme immunoassay according to the invention can be used to assay any antigen capable of being linked to an enzyme meeting the requirements of the invention or any antigen having a specific antibody capable of being linked to such an enzyme.
- This product is an antiepileptic whose therapeutic index is between 2.10 -5 mol.1 -1 and 8.10 -5 mol.1 -1 .
- Test 2 Competitive dosage in homogeneous phase
- Phenytoin labeled with alkaline phosphatase (Phen-AP, Interchim Ref. FIT) is used. 80-IP30, commercial solution of 50 units / ml in TRIS buffer).
- the affinity between the antigen and the antibody is checked as follows.
- An immunoreaction is carried out at 37 ° C. for 30 minutes between 100 units per liter of labeled antigen
- the enzymatic reaction is then carried out at 37 ° C, after addition of 250 ⁇ l of TRIS buffer containing NaCl (5.10 -3 mol.1 -1 ), MgSO 4 (2.10 -2 mol.1 -1 ) and 2 10 -5 mol .l -1 of substrate n ° 2 of table 2 (phosphate ester of 2- (N-ferrocenoylammo) 4,6-dimethylphenol). The reaction lasts 15 minutes.
- This reaction is repeated by adding increasing amounts of antiserum, the total volume of antiserum and normal rabbit serum being kept constant at 6 ⁇ l and the volume of the final solution containing the labeled phenytoin, the substrate and the antiserum being 1 ml.
- the amount of anti-phenytoma / phenytoma complex labeled with AP increases at the expense of free AP-labeled phenytoin, and the decrease in the electrical signal confirms that the enzymatic transformation of the substrate n ° 2 in product n ° 2 can only be done through the phenytoin marked by free AP.
- a standard phenytoin titration curve (FIG. 13) was obtained by adding increasing amounts of phenytoin at the level of the immunoreaction step.
- This calibration curve is directly usable for dosing clinical samples after dilution, and it was used for the determination of an E1 sample, by introducing 1.5 ⁇ l of E1, 1.5 ⁇ l of normal rabbit serum and 3 ⁇ l anti-phenytoma at the immunoreaction stage.
- a signal of 6.3 ⁇ A is obtained for the peak current corresponding, according to the calibration curve of FIG. 13, to a phenytoin concentration of 4, 0.10 -8 mol.1 -1 , i.e. a concentration of phenytoin, in the sample E1, of 2, 7.10 -5 mol.1 -1 .
- the theoretical value determined in a hospital laboratory by high performance liquid chromatography is 3.2.10 -5 mol.1 -1 .
- the anti-phenytoma antibody is diluted 100 times in a tarpon phosphate pH 7.4, then 200 ⁇ l of this solution are introduced into the test tube. After 15 hours of contact at 4 ° C., the test tube is rinsed with a phosphate / Tween 20 buffer mixture in volume 0.1. [Aldrich 27, 434-8] (400 ⁇ lx3 for 10 minutes).
- the evaluation of the enzymatic activity of the phenytoin marked by alkaline phosphatase, when all the antibodies present on the walls of the tube are complexed by the marked phenytoin is carried out according to the following protocol:
- liquid phase (approximately 200 ⁇ l) extracted with the syringe after incubation and. before rinsing, contains excess free labeled phenytoin.
- the electrochemical detection of substrate no. 2 is carried out after transfer of the 200 ⁇ l of solution into the electrolysis cell then addition of 100 ⁇ l of NaCl (5.10 "3 mol.1 -1 ), 300 ml of NaHCO 3 and 6 ⁇ l of 4 M HCl, and finally an accumulation on an electrode coated with a Nafion film, for 5 minutes at 0.6 V.
- the peak current of the square wave voltammogram obtained is 14.3 ⁇ A.
- the standard phenytoin titration curve in Figure 14 was obtained by adding 6 ⁇ l of phenytoin diluted in phosphate buffer at phase 1 of the protocol (composition of the sample: 10 ⁇ l of alkaline-labeled phenytoin phosphatase (5000 units per liter), 184 ⁇ l of phosphate buffer and 6 ⁇ l of phenytoin). This curve can be used directly in zone I to assay clinical samples after dilution to 1/1000 (addition of 1 ⁇ l of sample in phase 1 of the protocol).
- E2 and E3 also contain du-phenobarbital and 7 (or 8) drugs.
- This dosing kit includes:
- the enzymes, the substrate / product pairs, the measurement electrode, the polyionic compound and the detection means are identical to those which have been described previously.
- the assay kit allows this enzyme to be assayed.
- the assay kit makes it possible to assay this antigen.
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de dosage d'une enzyme, un procédé de dosage immunoenzymatique d'un antigène, avec détection électrochimique, ainsi qu'un kit de dosage, utilisé lors de la mise en ÷uvre de ces procédés. Le but de l'invention est de mettre au point des procédés de dosage dans lesquels la sensibilité de la détection du produit formé lors d'une réaction enzymatique est accrue. Ce but est atteint à l'aide d'un procédé consistant à: faire réagir une enzyme (E) avec un substrat (S); collecter le produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique obtenu à l'issue de la réaction enzymatique sur une électrode (3) munie d'un composé polyionique (1), de charge opposée; mesurer le signal fourni par ladite électrode (3).
Description
PROCEDE DE DOSAGE D'UNE ENZYME ET PROCEDE DE DOSAGE
IMMUNOENZYMATIQUE D'UN ANTIGENE UTILISANT UNE ELECTRODE
MODIFIEE ET KIT DE DOSAGE La présente invention concerne un procédé de dosage d'une enzyme et un procédé de dosage immunoenzymatique d'un antigène, pour lesquels la détection se fait sur une électrode modifiée par un composé polyonique favorisant l'accumulation du produit de la réaction enzymatique. L'invention concerne également un kit de dosage, utilisé lors de la mise en oeuvre de ces procédés.
Les enzymes sont des catalyseurs intervenant dans de nombreuses réactions du métabolisme humain et animal. et à ce titre sont présentes dans les tissus et les organes. Plus précisément, ce sont des protéines ayant une activité catalytique sur des substrats spécifiques. A titre d'exemple, l'alcaline phosphatase est présente dans divers tissus et notamment dans le foie ou dans les os. Cette enzyme intervient dans le métabolisme des glucides. La diminution ou la disparition de certaines de ces enzymes entraine généralement des troubles fonctionnels au niveau de l'organisme. Il est alors important d'effectuer des dosages de ces enzymes afin de pouvoir détecter certaines anomalies pathologiques.
Par ailleurs, de nombreuses techniques de dosage immunoenzymatique se sont développées ces dernières années et sont utilisées dans le domaine médical, vétérinaire, dans l'industrie agro-alimentaire ou en écologie. Elles remplacent avantageusement les techniques de radio-immunodosage. Ces techniques permettent de doser tout type d'antigènes, notamment des produits tcκtques, des médicaments et des molécules chimiques. Ainsi, les tests ELISA sont basés sur l'utilisation d'une enzyme comme marqueur.
Les méthodes de dosage immunologique permettent de doser des antigènes même si ceux-ci sont présents en faibles quantités. Le dosage est basé sur le fait que les anticorps (Ac) reconnaissent, puis se lient de manière spécifique aux antigènes (Ag), pour donner un complexe anticorps-antigène, selon la réaction équilibrée suivante :
Parmi les techniques de dosage immunoenzymatique, on connaît une méthode dite de "dosage compétitif hétérogène" qui consiste à introduire et à mettre en. réaction une quantité définie d'antigènes marqués par une enzyme et une quantité indéfinie d'antigènes non marqués, (antigène à doser), face à une quantité limitée et connue d'anticorps fixés sur les parois d'un tube à essai. Après la première réaction immunologique, seule une fraction des antigènes marqués par une enzyme et des antigènes à doser a réagi avec les anticorps, tandis que le reste des antigènes à doser et des antigènes marqués se présente sous forme de fraction libre à l'intérieur du tube à essai. On effectue alors un rinçage et un lavage du tube à essai avant d'ajouter le substrat spécifique de l'enzyme de marquage. L'enzyme liée à l'antigène et à l'anticorps réagit alors de façon à transformer le substrat S en un produit P spécifique détecté généralement par des techniques spectroscopiques, telles que les mesures d'absorbance ou de fluorimétrie. Toutefois, les mesures d'absorbance ne sont pas toujours suffisamment sensibles et les mesures fluorimétriques, bien que présentant des limites de détection supérieures, sont
également sensibles aux interférences endogènes, ce qui diminue la spécificité du dosage.
On connaît également d'après l'art antérieur des procédés de dosages immunologiques dans lesquels 1 ' en- zyme liée à un antigène transforme un substrat S non électro-actif (ou difficilement électro-actif) en un produit P électro-actif, susceptible d'être détecté par ampérométrie. Ainsi, l'article de V.J. RAZUMAS et al. "Kinetic amperometric détermination of hydrolase activity", Analytica Chimica Acta, (1980) 117, 387-390, décrit l'un de ces procédés de détection utilisant, d'une part, l'alcaline phosphatase comme enzyme et les esters phosphates de polycatéchol et p-aminophénol comme substrat et, d'autre part, la β-D-glucoside. glucohydrolase comme enzyme et la p-aminophénol β -D-glucoside comme substrat. L'article de K.R. Wehmeyer et al., "Compétitive heterogeneous enzyme imunoassay for digoxin with electrochemical détection", Anal. Chem. (1986), 58, 135-139, décrit un dosage immunoenzymatique compétitif, hétérogène, pour la détermination de la digoxine (antigène) dans le plasma humain. L'enzyme utilisée est l'alcaline phosphatase et le substrat est le phénylphosphate. La demande de brevet EP 0 223 541 décrit un procédé de dosage enzymatique électrochimique. Ce procédé permettant de doser l'oestradiol utilise l'alcaline phosphatase comme enzyme et l'ester phosphate du 4-N-ferrocénoylaminophénol comme substrat. Enfin, la demande de brevet EP 0 424 586 divulgue un procédé de dosage immuno-électrochimique de l'alkaline phosphatase consistant à faire réagir cette enzyme avec le 1-naphtyl phosphate pour former le 1-naphtol électroactif, détecté par une électrode au carbone.
Malheureusement, dans certains cas, le substrat et le produit obtenu présentent des électroactivités
voisines et de ce fait, le procédé de dosage ne remplit pas les critères de sélectivité imposés.
Parmi les techniques de dosage immunoenzymatique, on connaît également une méthode dite de "dosage compétitif homogène" qui consiste à faire réagir simultanément dans un tube à essai l'antigène à doser (Ag), un antigène marqué par une enzyme spécifique (Ag-E), l'anticorps (Ac) et le substrat (S) dont la transformation est catalysée par l'enzyme précitée. La réaction est la suivante :
Une partie des antigènes à doser et des antigènes marqués par l'enzyme réagit avec l'anticorps pour for- mer un complexe (Ac/Ag ou Ac/Ag-E), tandis qu'une partie des antigènes marqués par une enzyme reste libre. Seule cette fraction libre réagit avec le substrat S de façon à donner un produit P.
La détection du produit P s'effectue par les mêmes techniques que celles citées pour la méthode dite de "dosage compétitif hétérogène" et présente donc les mêmes inconvénients. En outre, si cette technique de dosage homogène permet d'éviter les étapes de transfert, de décantation et de lavage, il faut toutefois que l'activité enzymatique de l'enzyme présente dans le complexe (Ac/Ag-E) soit nettement inférieure à celle de l'antigène libre marqué par une enzyme (Ag-E), voire même négligeable, pour que la transformation du substrat S en produit P soit effectuée préférentiellement par l'Ag-E libre. Ces
inconvénients limitent donc le choix d'enzymes susceptibles d'être utilisées dans ces tecnmques.
On connaît encore des techniques αe αosage de type "sandwich hétérogène" dans lesquelles l'antigène a doser est pris en "sandwich" entre un anticorps fixe sur les parois d'un tube a essai et un anticorps marqué par une enzyme. Cette enzyme permet ultérieurement de transformer un substrat S en produit P, susceptible d'être détecté. Ces techniques de dosage présentent les inconvénients précédemment cités, inhérents au type de détection utilisé.
En conséquence, l'invention concerne un procédé de dosage d'une enzyme et un procédé de dosage immunoenzymatique avec détection electrochimique dans lesquels la sensibilité de la détection du produit P est accrue.
Selon les caractéristiques de l'invention, le procédé de dosage d'une enzyme comprend les étapes consistant à :
- faire réagir l'enzyme à doser avec un substrat dont la transformation en un produit électroactif ionique ou pro-ionique est catalysée par ladite enzyme,
- collecter ledit produit électroactif ionique ou pro-ionique obtenu, sur une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée a celle dudit produit obtenu, de façon que ce produit se concentre dans ledit composé polyionique pendant une période d'accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite électrode à l'issue de la période d'accumulation, grâce a des moyens de détection eiectrochimique relies a cette électrode.
Un produit electro-actif "pro-ionique" est un produit qui devient ionique par oxydation anodique
(composé "pro-cationique") ou par réduction cathodique (compose "pro-amonique").
Le signal mesuré par les moyens de détection électrochimique augmente avec la quantité d'enzyme présente dans l'échantillon. Le composé polyionique de l'électrode est capable grâce à sa grande affinité pour le produit obtenu à l'issue de la réaction enzymatique, d'accumuler celui-ci par échange ionique et ainsi d'exalter l'effet amplificateur de l'enzyme. L'association d'un capteur électrochimique sensible avec les propriétés d'une enzyme spécifique conduit à une technique d'analyse simple à mettre en oeuvre, peu coûteuse et extrêmement performante puisqu'elle permet de détecter une enzyme à des concentrations pouvant atteindre 10-12 à 10-13mol.1-1.
Le procédé de dosage immunoenzymatique d'un anti-gène selon l'invention comprend les étapes consistant à :
- faire réagir une enzyme servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser avec un substrat dont la transformation en un produit électroactif ionique ou pro-ionique est catalysée par cette enzyme,
- collecter le produit électroactif ionique ou pro-ionique obtenu par la réaction enzymatique, sur une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle dudit produit obtenu, de facon que ce produit se concentre dans ledit composé pol yion i que pendant une période d'accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite électrode à l'issue de la période d'accumulation, grâce a des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode.
Ce procédé de dosage peut s'appliquer à toutes les catégories d'immunodosage et notamment aux dosages compétitifs homogènes ou hétérogènes ou aux dosages de type "sandwich". Le couple substrat/produit est choisi
judicieusement de façon à ce que l'accumulation du produit dans le composé polyionique soit favorisée au détriment de l'accumulation du substrat, voire même que l'accumulation du substrat soit impossible. En concentrant préférentiellement le produit dans le composé polyionique, le signal électrochimique détecté à l'électrode est amplifié, ce qui accroît la sensibilité de la technique. Ce procédé de dosage permet de quantifier des antigènes tels que des médicaments, des hormones, des protéines, des pesticides, des toxines, avec une limite de détection de 10-12 à 10-13 mol.1-1.
Enfin, l'invention concerne également un kit de dosage caractérisé en ce qu'il comprend :
- un substrat susceptible d'être transformé en un produit électroactif ionique ou pro-ionique, sous l'action de catalyse d'une enzyme,
- une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle du produit électroactif ionique ou pro-ionique, et dans lequel ledit produit est susceptible de s'accumuler,
- des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par cette électrode.
Ce kit de dosage permet la mise en oeuvre des procédés de dosage précités:
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation de l'invention donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif. Cette description est faite en faisant référence aux dessins joints, dans lesquels :
- la figure 1 est un schéma illustrant le procédé de dosage d'une enzyme selon l'invention,
- les figures 2 et 3 illustrent deux variantes de réalisation de l'électrode utilisée dans les procédés de dosage selon l'invention,
- les figures 4 et 5 sont des courbes représentant des résultats obtenus par voltamétrie à vague carrée,
- la figure 6 est une courbe représentant la relation entre l'intensité de pic et la concentration (C) en 2-(N-ferrocenoyl-amino)4,6-diméthylphénol,
- la figure 7 est un graphique représentant la variation de l'intensité de pic en fonction de la concentration en alcaline phosphatase, dans diverses conditions expérimentales,
- les figures 8, 9 et 10 sont des schémas illustrant trois variantes de réalisation du procédé de. dosage immunoenzymatique selon l'invention,
- la figure 11 est une courbe de calibration de l'essai 2 décrit ci-après,
- les figures 12 et 13 sont des courbes représentant respectivement la variation de l'intensité du pic en fonction de la concentration en anti-phénytoine ou en phénytoine, et
- la figure 14 est une courbe standard de titrage de la phénytoine utilisable dans le cadre d'un dosage compétitif hétérogène.
La figure 1 illustre le principe du procédé de dosage d'une enzyme selon l'invention. Ce procédé consiste à faire réagir une enzyme E avec un substrat S de façon que cette enzyme catalyse la transformation du substrat S en produit P et que ce produit pénètre et s'accumule à l'intérieur d'un composé polyionique 1 inclu dans une électrode 3 constituée par exemple, d'un cylindre en carbone vitreux. L'accumulation du produit P dans le composé polyionique 1 permet d'amplifier le signal observé à la sortie de l'électrode 3. Cette électrode 3 est reliée à des moyens de détection
électrochimique 5 permettant l'interprétation de ce signal. Ces moyens de détection 5 comprennent un dispositif de mesure 7 relié à un appareil 9 pour tracer des graphiques fournissant des courbes de résultats.
Les moyens de détection 5 (ou plus précisément le dispositif de mesure 7) utilisent le principe de l'ampérométrie, de la coulométrie, de la voltampérométrie ou avantageusement de la voltammétrie à vague carrée.
Dans le mode de réalisation illustré en figure 1, le composé polyionique se présente sous forme d'un film recouvrant la surface extérieure de l'électrode de travail 3. Toutefois, il serait également possible d'utiliser une série d'ultra microélectrodes recouvertes d'un film polyionique ou une électrode formée d'une. pâte de graphite imprégnée du composé polyionique comme cela est illustré respectivement aux figures 2 et 3.
La figure 2 illustre un exemple de réalisation d'électrode à ultra microdisques, telle que celle commercialisée par la Société Ecosse Sensor. Cette élec- trode 11 est réalisée par lithographie et constituée de 500 microdisques de carbone (diamètre = 10 μm, surface totale Sº= 3,9.10-2 mm2) déposés sur un support 12 et contenus dans la partie circulaire 13. L'électrode 11 est placée à côté d'une électrode de référence 15 en Ag/AgF entourant la partie circulaire 13. Le film de composé polyionique 1 est déposé par dessus la partie 13 à l'aide d'une seringue puis séché au four pendant 10 minutes.
La figure 3 illustre un exemple de réalisation d'une électrode 17 à pâte de graphite imprégnée du composé polyionique et présentant une surface renouvelable. Cette électrode 17 est montée à l'extrémité d'un embout 19 et elle est reliée par un conducteur 21 à une électrode tournante Taccusel 23. L'extrémité de
l'électrode 17 peut être découpée après usage pour un nouvel usage.
Le composé polyionique 1 peut être de nature polyanionique ou polycationique. Le produit P est alors respectivement cationique (ou pro-cationique) ou anionique (ou pro-anionique).
Le composé polyionique 1 peut être d'origine minérale ou organique. Comme composés minéraux à propriétés d'échange cationique, on peut envisager par exemple, l'utilisation de zéolithes et d'argiles
(montmorillonite, laponite). Des argiles synthétiques du type hydrotalcite présentent, quant à elles, des propriétés d'échange anionique. Comme composé organique, un exemple de composé polyanionique est un. polymère perfluoré auquel sont greffés des groupements acides sulfoniques. L'un de ces polymères est connu sous le nom de marque Nafion (fabriqué par E.I. Du Pont de Nemours), et présente la formule chimique suivante :
dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3.
De préférence, le polymère utilisé a une masse de 1100g par mole de site SO3H. A pH 7,4, ce polymère se présente sous forme polyanionique. Ce polymère est en outre thermiquement et chimiquement très stable, insoluble dans l'eau seule et donc dans les analytes. Il présente de bonnes propriétés de transfert ionique. Les
groupements fluorés assurent le caractère hydrophobe et les groupements SO-3 le caractère anionique du polymère.
Toutefois, il serait également possible d'utiliser d'autres polymères organiques polyanioniques tels que, par exemple, du polypyrrole N-substitué par une chaîne alcanoique (ex : (CH2)nCO2H) ou sulfonique, (ex :
(CH2)nSO3H).
Il serait également possible d'utiliser des polymères organiques polycationiques, tels que l'un de ceux donnés dans le tableau I ci-dessous à titre d'exemple.
Le choix de l'enzyme E et du couple substrat S/produit P s'effectue en fonction de la nature du composé polyionique 1. Il est en effet nécessaire que le produit P pénètre facilement dans le composé polyionique au détriment du substrat S, ce dernier étant ou non électroactif.
Lorsque le composé polyionique 1 est de nature polycationique (cf tableau 1 précédent), on utilise avantageusement comme enzyme une hydrolase telle que la cholinesterase EC-3-1-1-8 par exemple.
Cette enzyme intervient dans la réaction suivante :
On rappelle ci-après pour chaque enzyme les réactions de transformation entre le substrat S et le produit P suite à la réaction de catalyse de l'enzyme.
Les exemples sont choisis de façon à ce que le substrat S soit électro-inactif et/ou de charge globale. négative, ce qui défavorise son accumulation dans le film polyanionique, et le substrat P cationique ou procationique. Dans ce dernier cas, il devient cationique pendant la période d'accumulation où il pénètre dans le film de composé 1 et s'oxyde à l'anode en une forme cationique. C'est sous cette forme qu'il s'accumule dans le film polyanionique.
- Oxydoréductases :
ex.: péroxydase
D représentant le donneur, c'est-à-dire par exemple la forme leuco du vert de malachite qui conduit au vert de malachite (D+).
- Transférases :
ex.: γ-glutamyltransférase
R2NH2 représentant par exemple un aminoacide et R1NH2 des dérivés électroactifs de l'aniline.
ex : β-D glucuronidase
ROH représentant, par exemple, l'un des alcools donnés dans le tableau 2 ci-après. ex : alcaline phosphatase (A.P.)
;
Le reste R assure d'une part l'électroactivité de l'alcool et d'autre part, son caractère cationique ou procationique, de façon à favoriser son accumulation dans le film de Nafion.
Quelques exemples d' esters de phosphate et d' alcools satisfaisant à ces critères sont donnés ci-dessous dans le tableau 2.
Pour les couples substrat S/produit P I, 2 et 6, le reste ferrocényl assure à la fois l'électroréactivité et le caractère procationique du composé. L'oxydation anodique du ferrocène en ferricinium se produit entre 0,2 et 0,4 volts (électrode Ag/Agcl). Il en est de même du reste NO.
dans le couple 3. L'oxydation du NO- en NO+ se produit vers 0, 5 volt.
Le chlorhydrate d'aminé du couple 4 est protoné jusqu'aux pH faiblement basiques. Dans ce cas, c'est l'aminophénol qui s'oxyde de façon réversible. Pour le couple 5, le cobalticinium se réduit de façon réversible en cobaltocène vers -1 volt.
Les alcools des couples 1 et 3 sont commercialisés. L'ester phosphate du couple 3 est également commercialise et les autres esters peuvent être synthétisés à partir du réactif POCI3 dans la pyridine.
L'alcool du couple 2 a été préparé à partir d'aminophénoldiméthylé et de chlorure de l'acide carboxylique du ferrocene. Le point de fusion de cet alcool est. de 221°C (acétate d' éthyle/hexane).
Analyse de l'alcool :
C19H19NO2Fe (%) calculé : C = 65, 35 ; H = 5,48 ;
N = 4,01 ; Fe = 16, 00,
et
C19H19NO2Fe (%) trouvé : C = 65, 60 ; H = 5,55 ;
N = 3,94 ; Fe = 15,76.
L'ester phosphate du couple 2 a également été préparé et présente un point de fusion variant entre 214 et 215°C (acétone/CH2Cl2).
Analyse de l'ester :
C19H20NO5FeP (%) calculé : C = 53,17 ; H = 4,97 ;
N = 3,26 ; P = 7,22, et
C19H20NO5FeP (%) trouvé : C = 53,38, H = 4,97 ;
N = 3,32 ; P = 7,24.
Mise en évidence des propriétés d'accumulation sélective des électrodes modifiées par un film de Nafion (marque déposée) :
Les propriétés d'accumulation sélective du Nafion ont été démontrées à partir du couple substrat/produit n°2 du tableau 2, en utilisant l'alcaline phosphatase comme enzyme.
Electrode de carbone recouverte d'un film de Nafion :
Ces mesures ont été effectuées par voltammétrie à vague carrée. La cellule d'électrolyse comprend un réservoir central dans lequel on dépose 0,5 à 1 ml de la solution à analyser contenant le substrat S n°2 ou le produit P n° 2 dilué dans un tampon phosphate pH 7,4. Cette cellule comprend en outre une contre-électrode en fil de platine, une électrode de référence Ag/Agcl et l'électrode de travail constituée par un disque de carbone vitreux (diamètre = 3 mm ;surface S°= 7 mm2), recouvert d'un film élaboré à partir de Nafion en poudre en suspension dans un mélange alcools aliphatiques /eau, (disponible chez Aldrich, 27,470-4) d'une épaisseur de 0,4 μm. L'enregistrement des voltammogrammes sur électrode stationnaire a été précédé d'une période d'accumulation du substrat n° 2 ou du produit n° 2 dans le film de Nafion d'une durée de 5 minutes. Pendant la période d'accumulation, l'électrode recouverte du film de Nafion est mise en rotation à raison de 600 tours/min et est maintenue à un potentiel de 0,6 volt. Les voltammogrammes de la figure 4 ont été obtenus par balayage des potentiels entre 0, 6 volt et 0 volt, ce qui correspond à la réduction du ferricinium en ferrocene.
La courbe A illustre les résultats obtenus avec le substrat S n° 2 (concentration 2.10-5 mol.1-1 dans le tampon pH 7,4) et la courbe B les résultats obtenus avec le produit P n° 2 (concentration 10-5 mol.1-1 dans le tampon pH 7, 4).
A partir des résultats de cette figure, on constate que le rapport entre la valeur du courant de pic et la concentration en substrat ou en produit dans le tampon est 80 fois plus élevé pour le produit que pour le substrat, ce qui montre la grande sélectivité du Nafion en faveur du produit P n° 2.
Par ailleurs, la courbe C correspond au voltammogramme obtenu pour le produit P n° 2 (concentration 10-5 mol.1-1 dans le tampon pH 7,4), en l'absence du film de Nafion. La comparaison des courants de pic de la courbe B correspondant au produit P n° 2 et de la courbe C correspondant au produit P n° 2 sans le film de Nafion, montre que le signal est amplifié environ 14 fois sur l'électrode au Nafion par rapport à une. électrode classique.
Ultramicroélectrodes :
Des mesures ont également été effectuées dans des conditions identiques mais avec une électrode du type ultramicroélectrode recouverte par un film de Nafion telle que celle illustrée en figure 2. La figure 5 jointe représente les voltammogrammes à vague carrée obtenus pour le produit P n° 2 (concentration 2.10-5 mol.l-1 dans le tampon à pH 7,4). La courbe A représente les résultats obtenus immédiatement après le trempage de l'électrode dans la solution tandis que la courbe B représente les résultats obtenus après une accumulation du produit P n° 2 dans le film de Nafion pendant 10 minutes. Le courant de pic pour la courbe A présente une valeur de 0,065 μA et passe à une valeur de 0,23 μA pour la courbe B. Ceci traduit l'accumulation du produit dans le film de Nafion.
Electrode à pâte de graphite :
Enfin, une troisième série de mesures a été effectuée avec l'électrode à pâte de graphite telle que celle illustrée en figure 3, (diamètre : 3 mm, surface
S° : 7 mm2). La pâte de graphite imprégnée de Nafion contient entre autres du Nafion (disponible chez Aldrich 27,470-4), et de la poudre de graphite (disponible chez Ultra Corps CO14145-10/UCP 1M). Les conditions expérimentales sont les mêmes que précédemment. La figure 6 illustre la relation de linéarité existant entre l'intensité de pic et la concentration c en produit P n° 2 du tableau 2. Cette électrode permet donc d'obtenir des résultats fiables et reproductibles.
A partir du principe de dosage illustré en figure 1, il est possible d'envisager le dosage indirect d'une enzyme.
Essai 1 : Dosage d'une enzyme
Un exemple de dosage de l'enzyme alcaline phosphatase a été réalisé dans les conditions expérimentales suivantes. Un échantillon a été préparé en mélangeant dans un tampon NaHCO3 (pH 9, 6) le substrat S n° 2 du tableau 2 à une concentration de 10~5 mol.1-1, MgSθ4 à une concentration de 10-2 mol.1-1 et de l'alcaline phosphatase (Sigma P 4252), à des concentrations variant entre 0,24 et 24 unités par litre. Le volume de l'échantillon est de 1 ml. L'échantillon est maintenu à 30°C. Après 15 minutes de période d'incubation, le pH est ramené à 7,5 par ajout de 4 μl 2'acide chlorhydrique 4 M et l'échantillon est versé dans la cellule d' électrolyse précédemment décrite. L'ensemble est maintenu à une température de 25°C. Apres une période d'accumulation de 5 minutes, au cours de laquelle l'électrode recouverte de Nafion est mise en rotation à raison de 500 tours/min et est maintenue à un potentiel de 0,6 V, on mesure le signal du produit P n° 2 formé au cours de la réaction enzymatique. Les résultats de voltammétrie cyclique sont représentes par la droite A de la figure 7.
Une seconde mesure a été effectuée en modifiant légèrement les conditions expérimentales. On utilise 100 μl de tampon TRIS (pH 10,2) contenant 10-4 mol.1-1 du substrat S n° 2, 5.10-3 mol.1 de NaCl, 10-2 mol.1-1 de MgSθ4 et l'alcaline phosphatase à des concentrations variant entre 0,24 et 1,8 unités par litre. Après incubation pendant 30 minutes, le volume de l'échantilon est ramené à 1,0 ml par ajout de 900 μl de NaHCO3 et 4 μl d'acide chlorhydrique 4 M. L'échantillon a ensuite été transféré dans la cellule d'électrolyse identique à celle décrite dans les exemples précédents. La droite B de la figure 7 illustre les résultats obtenus. On atteint une limite de détection de 0,024 unités par litre, ce qui correspond à une concentration en alcaline phosphatase Sigma P 4252 de 1,3.10-12 mol.1-1.
Sur un principe similaire à ce qui vient d'être décrit pour le dosage de l'enzyme, c'est-à-dire en associant une enzyme spécifique, un couple (substrat S /produit P) et un capteur comprenant un composé polyionique susceptible d'accumuler le produit P formé lors de la réaction enzymatique, il est possible d'effectuer des dosages immunoenzymatiques.
Le principe général du dosage immunoenzymatique d'un antigène consiste à :
- faire réagir une enzyme E servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser, avec un substrat S de façon que l'enzyme catalyse la réaction de transformation du substrat S en un produit P électroactif ionique ou pro-ionique, et
- collecter ledit produit P sur une électrode munie d'un des composés polyioniques précédemment
décrits, de façon que le produit P se concentre dans le composé polyionique et puisse ensuite être détecté.
Le principe de détection, les enzymes, les substrats et les produits sont identiques à ce qui vient d'être décrit pour le dosage enzymatique.
Ce principe de dosage immunoenzymatique s'applique aux dosages compétitifs homogènes ou hétérogènes ou aux dosages de type sandwich.
La figure 8 illustre un exemple d' immunodosage de type compétitif homogène. Dans ce cas, on fait réagir l'antigène à doser (Ag), l'antigène marqué par une enzyme (Ag-E), l'anticorps (Ac) et le substrat S. Au cours de la réaction, une partie des antigènes marqués par une enzyme (Ag-E) et des antigènes à doser (Ag) se. fixe sur les anticorps (Ac), tandis que seule la fraction restée libre d'antigène marqué par une enzyme (Ag-E) réagit avec le substrat S pour donner le produit P qui s'accumule alors dans le composé polyionique 1. Le reste du dispositif (électrode 3 et moyens de détection) est identique à ce qui a été décrit pour la figure 1 et porte les mêmes références. Toutes les autres variantes précédemment décrites concernant la structure des électrodes, les enzymes, le couple substrat/produit et le composé polyionique peuvent également être utilisés ici.
La figure 9 illustre un exemple d' immunodosage du type compétitif hétérogène. Dans ce cas, l'anticorps (Ac) présent en quantité limitée est fixé sur les parois d'un tube à essai, par exemple, et l'on fait réagir une quantité fixe d'antigène marqué par une enzyme (Ag-E) en compétition avec l'antigène à doser (Ag). Après les étapes de lavage et de rinçage, le substrat S est ajouté. Seuls les complexes Ac/Ag-E réagiront avec le substrat S pour le transformer en produit P de façon proportionnelle à la quantité
d'antigène marqué présent sous forme de complexe Ac/Ag-E.
Tous les autres paramètres du dosage (enzyme, couple substrat/produit, composé polyionique, électrode et moyens de détection) sont identiques à ce qui a été précédemment décrit en relation avec la figure 1 et le dosage de l'enzyme.
La figure 10 illustre un exemple d' immunodosage du type "sandwich". Dans ce cas, l'anticorps (Ac) présent en excès est fixé sur les parois d'un tube à essai, par exemple. L'antigène à doser (Ag) est ajouté et réagit avec les anticorps (Ac) . Ensuite, des anticorps- marqués par une enzyme (Ac-E) sont ajoutés en excès et prennent en "sandwich" les antigènes liés aux anticorps. Le. substrat S est ajouté après le rinçage du tube à essai.
Tous les autres paramètres du dosage (enzyme, couple substrat/produit, composé polyionique, électrode et moyens de détection) sont identiques à ce qui été précédemment décrit en relation avec la figure 1 et le dosage de l'enzyme.
Ces différents types de dosage immunoenzymatique selon l'invention peuvent être utilisés pour doser n'importe quel antigène susceptible d'être lié à une enzyme répondant aux impératifs de l'invention ou n'importe quel antigène ayant un anticorps spécifique susceptible d'être lié à une telle enzyme.
On donnera ci-après deux exemples de réalisation de dosages compétitifs de type homogène et hétérogène, appliqués au dosage de la phénytoine. Ce produit est un antiépileptique dont l'index thérapeutique est compris entre 2.10-5 mol.1-1 et 8.10-5 mol.1-1.
Essai 2 : Dosage compétitif en phase homogène
On utilise pour ce dosage, la phénytoine marquée par l'alcaline phosphatase (Phen-AP, Interchim Réf. FIT
80-IP30, solution commerciale de 50 unites/ml dans un tampon TRIS).
- courbe de calibration
Celle-ci est illustrée sur la figure 11. Elle a été réalisée selon les conditions expérimentales de la courbe B de la figure 7.
- vérification de l'affinité entre le phénytoine marquée à l'alcaline phosphatase et l' antisérum
L'affinité entre l'antigène et l'anticorps est vérifiée de la façon suivante.
On réalise une immunoréaction à 37°C pendant 30 minutes entre 100 unités par litre d'antigène marqué
(phénytoine marquée à l'alcaline phosphatase AP) et d' antisérum contenant des anticorps anti-phénytome dans un volume de 250 μl de NaCl (5.10-3 mol.1-1) en présence de sérum normal de lapin.
On réalise alors la réaction enzymatique à 37°C, après addition de 250 μl de tampon TRIS contenant NaCl (5.10-3 mol.1-1), MgSO4 (2.10-2 mol.1-1) et 2 10-5 mol.l-1 de substrat n° 2 du tableau 2 (ester phosphate de 2-(N-ferrocénoylammo)4,6-diméthylphénol). La réaction dure 15 minutes.
On ajoute enfin 500 μl de NaHC03 (pH 9,6), 7 μl de HCl 4 M et on procède a une période d'accumulation du produit n° 2 pendant une durée de 5 minutes dans l'électrode de mesure.
La détermination s'effectue par voltammétrie à vague carrée dans les mêmes conditions expérimentales que celle de la courbe A ou B de la figure 4.
Cette réaction est répétée en ajoutant des quantités croissantes d' antisérum, le volume total d' antisérum et de sérum normal de lapin étant maintenu constant à 6 μl et le volume de la solution finale contenant la phénytoine marquée, le substrat et l'antisérum étant de 1 ml.
En présence d'ajouts croissants d'antiserum anti-phenytome, la quantité de complexe anti-phenytome/phénytome marquée par AP augmente aux dépens de la phénytoine marquée par AP libre, et la diminution du signal électrique confirme que la transformation enzymatique du substrat n° 2 en produit n° 2 ne peut se faire que par l'intermédiaire de la phénytoine marquée par AP libre.
A partir des conditions expérimentales correspon- dant au point A de la figure 12, une courbe standard de titrage de phénytoine (figure 13) a été obtenue par ajout de quantités croissantes de phénytoine au niveau de l'étape d'immunoréaction. Cette courbe de calibration est directement utilisable pour doser des échantillons cliniques après dilution, et elle a été utilisée pour le dosage d'un échantillon E1, en introduisant 1,5 μl de E1, 1,5 μl de sérum normal de lapin et 3 μl d'anti-phénytome au niveau de l'étape d'immunoréaction. Après accumulation et détermination voltammetn- que, on obtient pour le courant de pic un signal de 6,3 μA correspondant, d'après la courbe de calibration de la figure 13, a une concentration en phénytoine de 4, 0.10-8mol.1-1, soit une concentration en phenytoine, dans l'échantillon E1, de 2, 7.10-5mol.1-1. La valeur théorique déterminée dans un laboratoire hospitalier par chromatographie liquide haute performance est de 3,2.10-5mol.1-1.
Essai 3 : Dosage compétitif en phase hétérogène
Pour immobiliser l'antisérum sur les parois l'un tube à essai maxisorp (Polylabo réf. 470319), l'anticorps anti-phénytome est dilué 100 fois dans un tarpon phosphate pH 7,4, puis 200 μl de cette solution sont introduits dans le tube a essai . Apres 15 heures de contact a 4°C, le tube a essai est rincé par un melange tampon phosphate/Tween 20 en volume 0,1. [Aldrich 27,
434-8] (400 μlx3 pendant 10 minutes) . L'évaluation de l'activité enzymatique de la phénytoine marquée par l'alcaline phosphatase, lorsque tous les anticorps présents sur les parois du tube sont complexés par la phénytoine marquée, s'effectue selon le protocole suivant :
1° L'introduction dans le tube de 10 μl de phénytoine marquée (5000 unités par litre) et de 190 μl de tampon phosphate, est suivie de 60 minutes d'incubation à 37°C, puis de deux rinçages pendant 10 minutes au tampon phosphate/Tween 20 et de deux rinçages au tampon TRIS.
Il a été vérifié que la phase liquide (environ 200 μl) extraite à la seringue après incubation et. avant rinçage, contient de la phénytoine marquée libre en excès.
2° Après introduction dans le tube de 10 μl du substrat n° 2 (10-3mol.1-1) et de 190 μl de tampon TRIS contenant NaCl (5.10-3mol.1-1) et MgSO4 (10-2mol.1-1), la transformation enzymatique du substrat n° 2 en produit n° 2 s'effectue pendant 15 minutes à 37°c.
3° La détection électrochimique du substrat n° 2 est réalisée après transfert des 200 μl de solution dans la cellule d' électrolyse puis ajout de 100 μl de NaCl (5.10"3mol.1-1), 300 ml de NaHCO3 et 6 μl de HCl 4 M, et enfin une accumulation sur une électrode revêtue d'un film de Nafion, pendant 5 minutes à 0, 6 V. Le courant de pic du voltammogramme à vague carrée obtenu est de 14,3 μA.
La courbe standard de titrage de la phénytoine de la figure 14 a été obtenue en ajoutant 6 μl de phénytoine diluée dans du tampon phosphate au niveau de la phase 1 du protocole (composition de l'échantillon : 10 μl de phénytoine marquée à l'alcaline phosphatase ( 5000 unités par l itre ) , 184 μl de tampon phosphate et
6 μl de phénytoine). Cette courbe est directement utilisable dans la zone I pour doser les échantillons cliniques après dilution au 1/1000 (ajout d'l μl d'échantillon au niveau de la phase 1 du protocole).
Application au dosage de 2 échantillons hospitaliers E2 et E3 :
On notera que E2 et E3 contiennent également du- phénobarbital et 7 (ou 8) drogues.
Enfin, l'invention concerne un kit de dosage susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre des deux procédés précédemment décrits. Ce kit de dosage comprend :
- un substrat susceptible d'être transformé en un produit électroactif ionique ou pro-ionique, sous l'action de catalyse d'une enzyme,
- une électrode munie d'un composé polyionique dont la charge est opposée à celle dudit produit et dans lequel ledit produit est susceptible de s'accumuler,
- des moyens de détection électrochimiques reliés à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par cette électrode.
Les enzymes, les couples substrats/produits, l'électrode de mesure, le composé polyionique et les moyens de détection sont identiques à ceux qui ont été décrits précédemment.
Lorsque l'enzyme est libre, le kit de dosage permet de doser cette enzyme. Lorsque l'enzyme est liée à un antigène donné ou à un anticorps spécifique d'un antigène donné, le kit de dosage permet de doser cet antigène.
Claims
1. Procédé de dosage d'une enzyme (E), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
- faire réagir l'enzyme (E) à doser avec un substrat (S) dont la transformation en un produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, est catalysée par ladite enzyme (E),
- collecter ledit produit électroactif ionique ou pro-ionique (P) obtenu, sur une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) d'origine minérale ou organique dont la charge est opposée à celle dudit produit (P) obtenu, de façon que ce produit (P) se concentre dans ledit composé polyionique (1) pendant une période d'accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite électrode (3) à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode.
2. Procédé de dosage immunoenzymatique d'antigène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
- faire réagir avec une enzyme (E) servant de marqueur à l'antigène à doser ou à un anticorps spécifique de cet antigène à doser, avec un substrat (S) dont la transformation en un produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, est catalysée par cette enzyme (E),
- collecter le produit (P) électroactif ionique ou pro-ionique, obtenu par la réaction enzymatique, sur une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) d'origine minérale ou organique dont la charge est opposée à celle dudit produit (P) obtenu, de façon que ce produit (P) se concentre dans ledit composé polyionique (1) pendant une période d' accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite électrode (3) à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique reliés à cette électrode.
3. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit (P) est cationique ou pro-cationique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et est choisi parmi les zéolithes, la montmorillonite, la laponite, les polypyrroles N-substitués par une chaîne alcanoïque ou sulfonique, ou un polymère perfluoré de formule :
dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3.
4. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit (P) est anicmque ou pro-anionique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique et est choisi parmi les argiles synthétiques du type hydrotalcite, la polytyramine, la poly-4-vinylpyridine, le poly-4-vinyl-1-méthylpyridinium, le polypyrrole ou le polypyrrole N-substitué par une chaîne alkylammonium.
5. Procédé de dosage selon la revendicaticn l ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les oxydoréductases, les transférases ou les hydrolases.
6. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique, en ce que l'enzyme (E) est la cholinesterase et en ce que le substrat (S) électropositif est un ester du chlorure de choline et le produit (P) électronégatif est un acide carboxylique électroactif.
7. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et en ce que l'enzyme (E) est choisie parmi la péroxydase, la γ-glutamyltransférase, la β-D-glucaronidase ou l'alcaline phosphatase.
8. Procédé de dosage selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme est l'alcaline phosphatase, en ce que le substrat (S) est choisi parmi les esters phosphate du type ROPO3 2- et en ce que le produit (P) est choisi parmi les alcools ROH, R étant un groupement cationique ou procationique.
9. Procédé de dosage selon la revendication 8, caractérisé en ce que les couples substrat (S) /produit
(P) sont choisis parmi les couples : ester phosphate de ferrocénylméthanol/ferrocénylméthanol, ester phosphate de 2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthylphénol/2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthyl-phénol, ester phosphate du 4-hydroxy-TEMPO/4-hydroxy-TEMPO, ester phosphate du chlorhydrate de 2-(N,N-diméthylaminométhyl)4-aminophénol/chlorhydrate de 2-(N,N-diméthylaminométhyl)4-aminophénol, ester phosphate de l'hexafluorophosphate de 4-N-cobaltocénoylaminophénol/hexafluorophosphate de 4-(N-cobaltocénoylaminophénol ou l'ester phosphate de 4-ferrocénylphénol/4-ferrocénylphénol.
10. Procédé de dosage selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme (E) sert de marqueur à l'antigène à doser et en ce que le dosage est de type compétitif homogène ou hétérogène.
11. Procédé de dosage selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme (E) sert de marqueur à l'anticorps et en ce que le dosage est de type "sandwich".
12. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique (5) sont choisis parmi l'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie ou la voltammétrie à vague carrée.
13. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode se présente sous forme d'une électrode (3) en carbone vitreux recouverte. d'un film de composé polyionique (1).
14. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode (11) se présente sous forme de microdisques de carbone (13) déposés sur un support (12) et recouverts d'un film du composé polyionique (1).
15. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'électrode (17) se présente sous forme d'une pâte de graphite imprégnée du composé polyionique (1) et connectée électriquement à une électrode tournante (23).
16. Kit de dosage caractérisé en ce qu'il comprend :
- un 'substrat (S) susceptible d'être transformé en un produit (P) électro-actif ionique ou pro-ionique, sous l'action de catalyse d'une enzyme (E),
- une électrode (3, 11, 17) munie d'un composé polyionique (1) dont la charge est opposée à celle du produit (P) électro-actif ionique ou pro-ionique, et dans lequel ledit produit (P) est susceptible de s'accumuler, - des moyens de αetection électrochimique (5) relies à cette électrode et permettant de mesurer le signal électrique fourni par cette électroαe.
17. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le produit (P) est cationique ou pro-cationique et en ce que le composé polyionique est de nature polyanionique et est choisi parmi les zéolithes, la montmoπllonite, la laponite, les polypyrroles N-substitués par une chaîne alcanoïque ou sulfonique ou un polymère perfluoré de formule :
dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3.
18. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le produit (P) est anionique ou pro-anionique et en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique et est choisi parmi les argiles synthétiques du type hydrotalcite, la polytyramme, la poly-4-vmylpyrιdιne, le poly-4-vιnyl-1-méthylpyndιnιum, le polypyrrole ou le polypyrrole N-substitué par une chaîne alkylammonium.
19. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polycationique, en ce que l'enzyme (E) est la cholinesterase et en ce que le substrat (S) électropositif est un ester du chlorure de choline et le produit (P) électronégatif est un acide carboxylique électroactif.
20. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composé polyionique (1) est de nature polyanionique et en ce que l'enzyme (E) est choisie parmi la péroxydase, la γ-glutamyltransférase, la β-D-glucaronidase ou l'alcaline phosphatase.
21. Kit de dosage selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'enzyme (E) est l'alcaline phosphatase et les couples substrat (S) /produit (P) sont choisis parmi les couples : ester phosphate de 2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthylphénol/2-(N-ferrocénoylamino)-4,6-diméthyl-phénol, ester phosphate du 4-hydroxy-TEMPO/4-hydroxy-TEMPO, ester phosphate du chlorhydrate de 2-(N,N-diméthylaminométhyl)4-aminophénol/chlorhydrate de 2-(N,N-diméthylaminométhyl)4-aminophénol, ester phosphate de l'hexafluorophosphate de. 4-N-cobaltocénoylaminophénol/hexafluorophosphate de 4-(N-cobaltocénoylaminophénol ou l'ester phosphate de 4-ferrocénylphénol/4-ferrocénylphénol.
22. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique (5) sont choisis parmi l'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie ou la voltammétrie à vague carrée.
23. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode se présente sous forme d'une électrode (3) en carbone vitreux recouverte d'un film de composé polyionique (1).
24. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode (11) se présente sous forme de microdisques de carbone (13) déposés sur un support (12) et recouverts d'un film du composé polyionique (1).
25. Kit de dosage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'électrode (17) se présente sous forme d'une pâte de graphite imprégnée du composé polyionique (1) et connectée électriquement à une électrode tournante (23).
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| EP1190231A4 (fr) * | 1999-05-05 | 2003-01-02 | Intec Science Inc | Systeme d'analyse electrochimique quantitative d'analytes en phase solide |
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| WO1993025907A1 (fr) * | 1992-06-12 | 1993-12-23 | Centre National De La Recherche Scientifique | Antigene marque par un systeme redox, procede de dosage immunologique avec detection electrochimique et kit de dosage |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2710152A1 (fr) | 1995-03-24 |
| FR2710152B1 (fr) | 1995-12-01 |
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