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WO1993025907A1 - Antigene marque par un systeme redox, procede de dosage immunologique avec detection electrochimique et kit de dosage - Google Patents

Antigene marque par un systeme redox, procede de dosage immunologique avec detection electrochimique et kit de dosage Download PDF

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WO1993025907A1
WO1993025907A1 PCT/FR1993/000561 FR9300561W WO9325907A1 WO 1993025907 A1 WO1993025907 A1 WO 1993025907A1 FR 9300561 W FR9300561 W FR 9300561W WO 9325907 A1 WO9325907 A1 WO 9325907A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
antigen
labeled
film
antigens
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1993/000561
Other languages
English (en)
Inventor
Chantal Degrand
Ronald Blankespoor
Benoit Limoges
Pierre Brossier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO1993025907A1 publication Critical patent/WO1993025907A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
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    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/30—Electrochemically active labels

Definitions

  • the present invention relates to an antigen labeled with a redox system, one of the forms of which is ionic, an immunological assay method with electrochemical detection of at least one antigen and a kit for assaying at least one antigen.
  • certain drugs such as amphetamines or cardiotonics may be used for doping purposes. It is important to be able to measure these drugs reliably after a sports competition.
  • Radioactive markers in 1959, by the pioneers BERSON and YALOW, was a considerable success and gave birth to radioimmunology (RIA).
  • RIA radioimmunology
  • this technique has serious drawbacks. Radioactive tracers are expensive and short-lived.
  • the use of radioactive material is highly regulated and can only be done by a laboratory approved by CEA.
  • Immunoenzymatic assay techniques are known from the prior art under the name of ELISA Test (registered trademark). Some of these techniques are based on the so-called “competitive assay” principle which consists in introducing and putting in competition a defined quantity of labeled antigens (by an enzyme) and an undefined quantity of unlabeled antigens, facing a limited and known quantity of antibodies.
  • competitive assay the separation of the free and bound fractions is carried out by transfer of the reaction medium into test tubes or wells, on the walls of which are fixed second specific antibodies.
  • transfer, decantation and washing steps are carried out before adding the enzyme substrate. This is then colored in a more or less long period of time. The intensity of the coloration is then measured by spectrophotometric assays.
  • the object of the invention is to get rid of these conditions and, therefore, relates in particular to a dosing process in homogeneous phase, simpler and faster.
  • the invention also aims to remedy the aforementioned drawbacks.
  • the invention relates to an antigen labeled with a redox system, one of the forms of which is ionic, intended for use in an immunoassay method with electrochemical detection of this antigen, or in an immunoassay kit for this antigen.
  • this labeled antigen is chosen from the nortriptyline labeled with hexafluorophosphate of cobalticinium carboxylic acid, with pyrrolidinyloxy or with ethyl alkyl viologene dibromide; amphetamine labeled with cobalticinium carboxylic acid tetrafluoroborate or pyrrolidinyloxy; desipramine labeled with cobalticinium carboxylic acid hexafluorophosphate, pyrrolidinyloxy or ethyl alkyl viologene dibromide; or biotin labeled with tetraphenylborate of the cobalticinium carboxylic acid.
  • the invention also relates to an immunological assay method with electrochemical detection of at least one antigen comprising at least one functional group. This process includes the steps of
  • this process then consists in: - collecting on an electrode comprising a polyionic compound of polarity opposite to that of the redox system, (that is to say preferably, polyanionic), the labeled antigens, not linked to the specific antibody, so that these labeled antigens concentrate in said compound during a period of accumulation,
  • a “pro-ionic” redox system is a system one of the forms of which becomes ionic by anodic oxidation (“procationic” redox system) or by cathodic reduction (“pro-anionic” redox system).
  • the electrode is coated with a poly-ionic film.
  • this polyionic film is polyanionic and comprises a perfluoropolymer carrying anionic sites at physiological pH. This film thus has both hydrophobic and ionic character.
  • This process allows selective measurements to be made very quickly and with good sensitivity due, on the one hand, to the use of specific antibodies and, on the other hand, to the characteristics of the modified electrode. This is capable of concentrating the labeled antigens even if they are only present in very small quantities inside the analytical solution, which has the effect of amplifying the signal before it is not transmitted to the electrochemical detection means.
  • this method is very simple to use and of low cost because the apparatus used is extremely simplified. These two characteristics ticks justify the use of this process not only in medical circles, but also in veterinary or agricultural environments, for dosing pesticides for example.
  • this process is easily self-employable due to the very small number of manipulations to be carried out.
  • the antigen assayed by this method is a molecule comprising at least one functional group, preferably a primary or secondary amino function or a carboxylic function. This opens up a wide range of possibilities among the substances, pesticides or drugs which can be dosed by this process.
  • the electrochemical detection means are chosen from amperometry, coulometry, voltammetry, and preferably, square wave voltammetry.
  • the redox system can be any system corresponding to a rapid electronic exchange at physiological pH (close to 7.4).
  • the redox labeling system is chosen from ferrocene, cobal ⁇ ticinium, pyrrolidinyloxy or viologene derivatives.
  • These different redox marker systems are cationic or procationic.
  • the cationic systems are already cationic at the start, this is the case for the cobalticinium and viologene derivatives, while the procationic systems are neutral at the start and become cationic when, after having penetrated in the anionic film, they are anodically oxidized by polarization of the electrode; this is the case for ferrocene and pyrrolidinyloxy derivatives.
  • these marking systems have very different standard redox potentials leading to well individualized electrical signals.
  • each of the antigens which it is desired to assay is labeled with a redox marker acting at a different potential.
  • the invention also relates to an immunoassay kit for at least one antigen comprising at least one functional group. According to the characteristics of the invention, this kit includes:
  • At least one support or container having at least one type of antibody-antigen complex labeled with a redox system, one of the forms of which is ionic, the antigen corresponding to that which it is desired to assay, and
  • An electrode comprising a polyionic compound of opposite polarity to that of said redox system.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the various stages of the immunoassay method according to the invention
  • - Figure 2 is a sectional view of the cell and the electrode used in the dosing process
  • - Figure 3 shows a theoretical example of a curve obtained by square wave voltammetry
  • FIG. 5 is a curve illustrating on a logarithmic scale, the evolution of the intensity as a function of the concentration of an analyte containing as labeled antigen alone, amphetamine labeled with cobalticinium,
  • FIG. 6 is a graph representing the possible interference of the unlabeled antigens on the percentage of electrical signal provided by the labeled antigen
  • FIG. 7 is a graph illustrating the influence of normal serum on the accumulation of the labeled antigen inside the film of the electrode
  • - Figure 8 is a curve illustrating the percentage of electrical signal supplied by cobalticinium-labeled desipramine as a function of the specific antibody concentration of desipramine
  • - Figure 9 is a graph representing the results of square wave voltammetry obtained during a test assay
  • FIG. 10 is a calibration curve obtained for the modified desipramine dosed with the cobalticinium-labeled desipramine
  • - Figure 11 is a curve representing the simultaneous measurement by square wave voltammetry of two labeled antigens and a tracer (case of a multidose)
  • - Figure 12 is a diagram illustrating the various elements present in the kit assay according to the invention and the immunological reactions taking place during its use.
  • the metering method according to the invention consists in bringing into balance at least one antigen to be assayed 1 with the same antigen labeled with a cationic or procationic redox system 3, facing an antibody 5 specific for said antigen 1 and present in a limited quantity.
  • the antigen 1 marked by the redox system 3 carries the global reference 7.
  • the affinities of antibody 5 for antigens 1 and 7 are similar.
  • the quantities of labeled anti-genes 7 and of antibodies 5 are known.
  • the labeled antigens 7 react with the specific antibodies 5 so as to form complexes 9 and respectively the antigens 1 and the antibodies 5 form complexes 10.
  • the limited quantity of antibodies 5 not all antigens 1 or 7 can react with antibodies 5, and some of them remain free.
  • the antigens marked 7 can penetrate inside a polyanionic film 11 which covers the surface of an electrode 13 consisting of a glassy carbon cylinder.
  • the complexes 9 labeled antibody-antigen cannot accumulate in the polyanionic film 11, because of their size and their molecular mass. This allows selection and therefore reliable measurements.
  • the electrode 13 covered with the polyanionic film 11 could be replaced by a carbon paste electrode in which the polyanionic compound is embedded. This variant is not shown in the figures and in the description, only the first variant using the polyanionic film is described in detail.
  • the accumulation of the marked antigens 7 inside the polyanionic film 11 makes it possible to amplify the signal observed at the output of the electrode 13.
  • This electrode 13 is in fact connected to electrochemical detection means 15 allowing the inter- preparation of this signal.
  • detection means 15 include, for example, an amperometric, coulometric or voltammetric measurement device 17 which will be detailed later, the latter being connected to an apparatus for drawing graphs 19 providing result curves.
  • the film 11 is anionic and the marking system 3 is cationic or procationic, however it is obvious that the reverse could also be achieved without harming the operation of the invention.
  • the assay method according to the invention makes it possible to assay for antigens, and more specifically for drugs for which it is necessary to carry out, ie therapeutic monitoring, that is to say determining at regular intervals the quantity present in a biological sample, i.e. an emergency toxicology assay, that is to say to determine the presence or absence thereof in a sample taken from a patient arriving at the hospital.
  • antigens to be able to be labeled with one of the cationic or procatio ⁇ nic redox systems 3 which will be described later, must have at least one functional group and preferably, a primary or secondary amino function or a carboxylic function. In addition, they must be made up of molecules small enough to be able to penetrate the film.
  • - tricyclic antidepressants such as desipramine, imipramine, nortriptyline, ami-triptyline, clomipramine, maprotiline and atypical drugs such as nomifensine, mianserine, amineptine, zimelidine, - antiepileptics such as barbiturate derivatives, especially phenobarbital, mephobarbital, or such as hydantoines, in particular phenytoine, mephenytoine, carbamazepine and valproic acid, - tranquilizers derived from benzodiazepines, in particular diazepam, nitrazepam,
  • antitumor drugs such as methotrexate, 5-fluorouracil and azathioprine
  • the labeling systems meeting these requirements and capable of binding with a substance or a drug having at least one functional group and in particular a primary or secondary amino function or a carboxylic function, are chosen from derivatives of the pairs:
  • salts such as hexafluorophosphate, tetraphenylborate or tetrafluoroborate of carboxyic acid of cobalticinium.
  • Table 1 illustrates four examples of drugs which have been labeled with some of the various redox poten ⁇ tial labeling systems.
  • the marked drugs obtained are numbered from 1 to 10.
  • the table also gives the elementary analysis of these marked drugs.
  • the antigens marked No. 1 to 3 and 5 to 10 were developed during the carrying out of the assay method and are also particularly suitable for the assay kit described later.
  • the method of labeling drugs with one of the aforementioned redox systems is carried out as follows.
  • DCC is dicyclohexylcarbodiimide
  • FIG. 2 illustrates the structure of the cell in which the accumulation on the modified electrode 13 is carried out, then the amperometric measurement after the antigen-antibody reaction has taken place.
  • This cell consists for example of a central reservoir 21 with an internal diameter of 13 mm, inside which is deposited 0.5 to 1 ml of solution to be analyzed 23 containing the biological sample to be analyzed (serum, urine , etc.) diluted in a pH 7.4 buffer. This sample is generally present in an amount of a few tens of microliters.
  • the reservoir 21 further comprises two lateral tubes 24 in which are disposed a platinum wire counter electrode 25 and an Ag / AgCl reference electrode 27.
  • the electrode 13 in vitreous carbon covered with a layer of anionic polymer film 11 and on which the reaction of the invention takes place is immersed in the tank 21.
  • the glassy carbon cylinder 13 for single use is placed in a sleeve 29 of Teflon (registered trademark). This set is fixed to a 31 Tacussel EDI 101T rotating electrode. The contact between the carbon cylinder 13 and the electrical conductors 33 of the electrode 31 is ensured by a spring 35.
  • the polymer film will be polyanionic in nature.
  • this polymer is a perfluorinated polymer to which are grafted sulfonic acid groups. It is known by the brand name
  • Nafion manufactured by E.I. DUPONT DE NEMOURS
  • chemical formula
  • n is between 5 and 13.5
  • n is approximately 1000
  • k is an integer between 1 and
  • the polymer used has a mass of
  • the electrode will be manufactured to present reproducible results from a solution tion of Nafion 117 sold by Aldrich, (reference 27, 470-4).
  • This polymer is thermally and chemically very stable, insoluble in water alone and therefore in the analytes. It has good ion transport properties.
  • the fluorinated groups ensure the hydrophobic character and the S ⁇ 3 ⁇ groups, the ionic character of the polymer.
  • the antigens marked 7 can bind, via an ion exchange, either to the surface of the film 11, or in depth, after the immunological reaction has taken place.
  • the modified electrode 13 is immersed in the solution 23 (see FIG. 2) and this for a determined period, called "accumulation time", so that the antigens marked 7 have time to concentrate in the film 11 and that the electrode 13 can thus provide an ampli ⁇ fied signal, by electrochemical detection means 15.
  • the electrode 13 is maintained in open circuit when the marker is cationic (cobalticinium and viologen, for example) or at a constant anodic potential for procationic markers (ferrocene and pyrrolidinyloxy, for example).
  • the modified electrode is driven in a rotational movement so as to facilitate the path of the labeled antigens 7 towards the film 11. Then, the rotation is interrupted to carry out the electrochemical measurement.
  • the electrochemical detection means 15 comprise a measuring device 17 which can be a device for measuring by amperometry, by coulometry or voltammetry, and advantageously, by square wave voltammetry.
  • Square wave voltammetry uses the. counter electrode 25, the reference electrode 27 and the working electrode 13 modified by a Nafion film, illustrated in FIG. 2.
  • square wave voltammetry consists in carrying out a voltage sweep between the reference electrode 27 and the modified electrode 13. We obtain peaks of intensity A whose maximum value H is measured.
  • curve C1 illustrates the results obtained with an electrode made of bare vitreous carbon and curve C2 shows the results obtained by an electrode covered with a Nafion film, after accumulation for 5 minutes.
  • the value of the peak current of the curve C1 is 1.5 uA while the value of the peak of the curve C2 is 63.05 uA.
  • one of the preliminary steps consists in carrying out a calibration curve for the labeled drug, alone in solution and for measuring the different peak currents obtained as a function of known increasing concentrations of labeled drug.
  • 5 is a calibration curve obtained for amphetamine labeled with cobalticinium, alone, in a pH 7.4 buffer, for an accumulation time of 5 minutes and an electrode rotation speed of 600 revolutions / minutes. This curve shows that the linearity domain is important (logarithmic scale).
  • the layer 11 of Nafion polymer is able to accumulate, not only the antigens 7 labeled by a cationic or procationic redox system 3, but possibly also the protonated form of antigens 1 when these correspond to the formula Med-NR - ⁇ - H.
  • Tests performed on amphetamine have shown that the signal produced by amphetamine labeled 7 is not modified by the increasing intake of amphetamine 1 alone.
  • nortriptyline and desipramine it has been observed, in the case of nortriptyline and desipramine, that this interference resulted in a reduction in the electrical signal observed at the output of the electrode 13.
  • FIG. 6 represents the influence exerted by increasing concentrations of simple desipramine (curve C1) and of desipramine modified to present itself in an anionic form (curve C2), on the percentage of electrical signal which the desipramine labeled with cobalticinium provides.
  • the latter is present at a concentration of 2.10 " ⁇ M.
  • simple desipramine (curve Cl) the latter occupies anionic sites of the film 11, in an abusive manner and that the desipramine labeled with cobalticinium does not can react completely with the film 11 sites. Consequently, the percentage of electrical signal due to redox systems decreases, on the contrary, in the presence of the modified drug in anionic form (curve C2), the percentage of signal is not influenced.
  • this chemical transformation of the drug (antigen) has a second advantage: the antibody 5 (see FIG. 1) has a better affinity for the antigen 1 when the latter is in anionic form. sensitivity dosing.
  • FIG. 7 illustrates the influence of normal rabbit serum on the accumulation in the electrode of the labeled antigen, here the nortriptyline marked respectively with cobalticinium (curve C1), pyrrolidinyloxy (curve C2) and ferrocene (curve C3).
  • curve C1 the concentration in labeled drug is 5.10 ⁇ 7 M. This results from the ionic character, therefore hydrophyle of the marker.
  • FIG. 8 il ⁇ illustrates the assay of the antiserum, that is to say of the serum containing the antibody. (It should be noted that before the immunoassay itself, it is necessary to determine the quantity of antibodies which will have to be added later during the assays to be in antibody defect).
  • labeled antigen here desipramine labeled with cobalticinium, (concentration 10 ⁇ 5 M), dissolved in ethanol,
  • solution B antigen alone, modified, that is to say the desipramine modified in its anionic form and dissolved in a buffer pH 7.4, (that is to say solution E) concentration 10 ⁇ ⁇ M
  • - solution C normal diluted rabbit serum 1/5 in the pH 7.4 buffer (i.e. solution E)
  • solution D antibody, here anti-rabbit serum diluted 1/5 in the pH 7.4 buffer, (that is to say solution E),
  • control tube (1) solution A + solution C + solution E
  • zero tube (2) solution A + solution D + solution E
  • tube standard (3) solution A + solution
  • the solutions were homogenized, then incubated for example at 37 ° C for 60 minutes, so as to reach the equilibrium of the antibody-antigen reaction.
  • the percentage of signal is defined by (I00.l2) / I ⁇ and the signal B / B 0 (%) is equal to 100 (I 1 -I) / (I 1 -I 2 ) .
  • a calibration curve can be drawn, such as the one illustrated in FIG. 10. This curve can be used for the analysis of a sample containing an unknown quantity of modified (anionic) desipramine. .
  • the method according to the invention makes it possible to envisage the realization of multidoses. Indeed, as illustrated in FIG. 1, it is possible to assay ' in parallel not only an antigen 1 but also a different antigen l' and to react the latter in competition with an antigen 1 'marked by a different redox system 3' facing 5 'antibodies specific for the antigen 1'.
  • the derivatives of ferrocene, cobalticinium, pyrrolidinyloxy and viologene exhibit peaks of intensity at potentials sufficiently different from each other so that a succession of peaks can be detected on a results curve.
  • ACO Accumulation in Open Circuit
  • FIG. 11 precisely illustrates a triple assay carried out on a sample containing simultaneously nortriptyline labeled with cobalticinium, amphetamine labeled with ferrocene and dimethyl viologene.
  • the measurements were carried out at a temperature of 25 ° C., with an electrode coated with Nafion, rotating at 600 rpm, after 5 minutes of accumulation at 0.6 V. During the measurement, one swept the potential between + 0.6 V and - 1.4 V and three peaks numbered PI, P2 and P3 were observed respectively.
  • the PI peak located near 0.19 V corresponds to the drug labeled with ferrocene
  • the P2 peak located at -0.77 V corresponds to the reduction of dimethyl viologene
  • the P3 peak located at approximately -1.11 V corresponds to a drug marked with cobalticinium.
  • the invention also relates to a dosing kit using the principle of the method which has just been described.
  • This kit is shown diagrammatically in FIG. 12. It includes a container 40 which contains at least one type of antibody 5'-5'-antigen complex labeled with the ionic redox system 3'3 '. This complex may or may not be attached to the container. The antigen corresponds to that which one wishes to assay.
  • the container 40 takes the form of a test tube and makes it possible to carry out a sequential analysis. However, it is obvious that this container could also be in the form of a multi-well assay plate.
  • the assay kit according to the invention also comprises an electrode 13 coated with a poly ⁇ ionic film 11, of polarity opposite to that of the system 3, 3 'and advantageously polyanionic.
  • this film 11 is the polyanionic film of Nafion (registered trademark) previously described and the redox labeling system 3, 3 ′ is of cationic or procationic nature, such as those which have been previously described.
  • the kit can possibly include test tubes 42, 44 containing standard samples of known quantities of antigen to be assayed 1 and 1 respectively. These tubes allow the calibration curve to be produced according to the principle previously described. The user can also prepare his standard samples himself.
  • the biological sample 23, containing the antigens 1, 1 ', possibly treated to be presented in anionic form, is poured into the tube 40.
  • the competition reaction takes place and certain antigens 1, 1' will dislodge the antigens labeled 7, 7 'to attach in their place on the antibodies 5, 5'.
  • the rest of the reaction is identical to what has been described above for the process, in particular as regards the electrochemical detection means and the analysis of the results on the basis of the calibration curve.

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Abstract

L'invention concerne un antigène marqué par un système redox, un procédé de dosage immunologique d'au moins un antigène et un kit de dosage. Le but de l'invention est de réaliser un procédé de multidosage en phase homogène, rapide, fiable, spécifique et automatisable. Ce but est atteint à l'aide d'un procédé consistant à: mettre en compétition au moins l'un des antigènes à doser (1, 1') avec le même antigène (7, 7') marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique (3, 3'), face à un anticorps (5, 5') spécifique desdits antigènes (1, 7; 1', 7') et présent en quantité limitée, collecter sur une électrode (13) comprenant un composé polyionique (11) de polarité contraire à celle du système redox (3, 3'), les antigènes marqués (7, 7') non liés à l'anticorps spécifique (5, 5'), de façon que ces antigènes marqués (7, 7') se concentrent dans ledit film (11), mesurer le signal amplifié fourni par ladite électrode (13) grâce à des moyens de détection électochimique (15), reliés à cette électrode.

Description

ANTIGENE MARQUE PAR UN SYSTEME REDOX,
PROCEDE DE DOSAGE IMMUNOLOGIQUE AVEC
DETECTION ELECTROCHIMIQUE ET KIT DE DOSAGE
DESCRIPTION
La présente invention concerne un antigène marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique, un procédé de dosage immunologique avec détection électrochimique d'au moins un antigène et un kit de dosage d'au moins un antigène.
La consommation croissante de certains médi¬ caments, de produits toxiques ou de drogues a conduit à la mise au point de méthodes de détection précises, spécifiques et rapides utilisées notamment dans les hôpitaux et les laboratoires d'analyse. Ces méthodes ont pour but de permettre un suivi thérapeutique de médicaments prescrits au malade mais également d'ef¬ fectuer des dosages en toxicologie d'urgence. De nombreux médicaments comme les antidépres¬ seurs, les anti-épileptiques, les tranquillisants et les neuroleptiques sont administrés de façon régulière à des patients. Toutefois, leur index thérapeutique, (c'est-à-dire la gamme des valeurs comprises entre leur seuil d'efficacité et leur seuil de toxicité) est parfois extrêmement faible. A titre d'exemple, dans le cas des antidépresseurs, il y a un risque d'in¬ toxication dès que ce médicament dépasse une concentra¬ tion de 2.10~6M dans le sérum. En conséquence, il est nécessaire d'effectuer des prélèvements réguliers sur les patients pour pouvoir doser et suivre l'évolu¬ tion de la concentration du médicament dans les fluides biologiques.
Par ailleurs, certains médicaments comme les amphétamines ou les cardiotoniques peuvent être utilisés à des fins de dopage. Il est important de pouvoir doser de façon fiable ces médicaments après une compétition sportive.
Enfin, certains patients peuvent ingérer de façon volontaire ou accidentelle des médicaments ou produits toxiques. Lorsque ces patients arrivent dans un hôpital en état d'urgence, il est nécessaire d'effectuer des dosages très rapides et précis, afin de déterminer la nature du produit qu'ils ont absorbé et de les soigner de façon appropriée.
De nombreuses méthodes de dosage, fiables et spécifiques se sont développées. Ces méthodes sont basées sur l'association d'un détecteur d'origine biolo¬ gique, capable de se lier de façon spécifique avec le médicament que l'on souhaite doser, d'un transducteur qui génère un signal représentatif de la liaison du détecteur et du médicament, et d'un analyseur qui trans¬ forme le signal obtenu en une information accessible à l'utilisateur. Parmi les méthodes de dosage, les méthodes immunologiques permettent de doser de faibles quantités d'antigène. Elles sont basées sur le fait que des anti¬ corps (Ac) reconnaissent puis se lient de manière spéci¬ fique aux antigènes (Ag), pour donner un complexe anti- gène-anticorps selon la réaction équilibrée suivante : Ac + ha** ~TAc-Aq fraction libre fraction liée
L'introduction des marqueurs radioactifs en 1959, par les pionniers BERSON et YALOW, a connu un succès considérable et a donné naissance à la radio- immunologie (RIA) . Cette technique présente toutefois de sérieux inconvénients. Les traceurs radioactifs sont d'un prix élevé et d'une courte durée de vie. En outre, l'utilisation de matériel radioactif est fortement réglementée et ne peut être faite que par un laboratoire agréé par le CEA.
Pour éviter ces inconvénients, on a également essayé de mettre au point des marqueurs photosensibles dont la présence est détectée par absorption moléculaire (infrarouge ou fluorescence) ou atomique, infrarouge ou fluorescence. Toutefois, ces techniques nécessitent un appareillage sophistiqué de coût élevé.
Des techniques de dosage immuno-enzymatique sont connues d'après l'art antérieur sous le nom de Test ELISA (marque déposée). Certaines de ces techniques sont basées sur le principe dit du "dosage compétitif" qui consiste à introduire et à mettre en compétition une quantité définie d'antigènes marqués (par une enzyme) et une quantité non définie d'antigènes non marqués, face à une quantité limitée et connue d'anticorps. Dans les tests ELISA, la séparation des fractions libre et liée est réalisée par transfert du milieu réactionnel dans des tubes à essai ou des cupules, sur les parois desquels sont fixés des seconds anticorps spécifiques. Après la première réaction immunologique, des étapes de transfert, décantation et lavage sont opérées avant d'ajouter le substrat de l'enzyme. Celui-ci se colore ensuite dans un laps de temps plus ou moins long. L'intensité de la coloration est alors mesurée par des dosages de spectrophotométrie.
Toutefois, le marquage enzymatique des anti¬ gènes est délicat et d'une stabilité limitée. En outre, cette technique ne présente pas une très bonne spéci- ficité, les résultats obtenus ne sont donc pas tout à fait fiables. Par ailleurs, des interférences peuvent inhiber l'activité de l'enzyme. Enfin, cette approche nécessite une étape de transfert pour séparer les frac¬ tions libre et liée, suivie de plusieurs lavages, donc un temps de manipulation long et coûteux. Cette ap- proche est le propre des méthodes en phase hétérogène.
L'invention a pour objectif de s'affranchir de ces conditions et de ce fait, concerne notamment un procédé de dosage en phase homogène, plus simple et plus rapide.
Dans le domaine de l'immunologie, on connaît également d'après les demandes de brevet EP-0 142 301 et EP-0-167 248, des méthodes de dosage électrochimique utilisant des centres redox tels que le ferrocene, et une électrode de travail solide en carbone vitreux ou en métal. Dans les demandes citées, les centres redox peuvent éventuellement intervenir comme médiateurs de transfert d'électrons dans des réactions enzyma- tiques, ce qui permet une amplification du signal élec- trique et par conséquent une augmentation de la sensi¬ bilité de la méthode électrochimique.
On connaît également d'après la demande de brevet EP 241 309 une méthode de dosage de la théophylline avec détection électrochimique à l'aide d'un marqueur au ferrocene. La détection par coulométrie est amplifiée à l'aide d'une catalyse enzymatique et d'une électrode modifiée par un film de polyvinyl ferrocene dont le rôle est de servir de relais entre l'électrode et le médicament marqué (celui-ci ne pénètre pas dans le film).
Toutes ces techniques, outre leurs inconvé¬ nients spécifiques, ne permettent pas de doser simul¬ tanément plus de deux médicaments présents dans un échantillon biologique. Or, il serait souhaitable lorsqu'un patient arrive en état d'urgence, de pouvoir effectuer un unique multi-dosage de plusieurs médicaments employés couramment et avec lesquels les risques d'intoxication sont fréquents.
L'invention a également pour objectif de remédier aux inconvénients précités. A cet effet, l'invention concerne un antigène marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique, destiné à être utilisé dans un procédé de dosage immunologique avec détection électrochimique, de cet antigène, ou dans un kit de dosage immunologique de cet antigène.
Selon les caractéristiques de l'invention, cet antigène marqué est choisi parmi la nortriptyline marquée à 1'hexafluorophosphate de l'acide carboxylique du cobalticinium, au pyrrolidinyloxy ou au dibromure d'éthyl alkyl viologène ; l'amphétamine marquée au tétrafluoroborate de l'acide carboxylique du cobalticinium ou au pyrrolidinyloxy ; la désipramine marquée à 1'hexafluorophosphate de l'acide carboxylique du cobalticinium, au pyrrolidinyloxy ou au dibromure d'éthyl alkyl viologène ; ou la biotine marquée au tétraphénylborate de 1' cide carboxylique du cobalticinium.
Ces antigènes marqués spécifiques ont été mis au point lors de la réalisation de procédés ou de kits de dosage immunologiques et donnent des résultats particulièrement intéressants, comme cela sera expliqué ultérieurement.
L'invention concerne également un procédé de dosage immunologique avec détection électrochimique, d'au moins un antigène comprenant au moins un groupement fonctionnel. Ce procédé comprend les étapes consistant
- préparer une solution à analyser comprenant une solution aqueuse tamponnée au pH physiologique,
(de préférence pH 7,4) et un échantillon biologique contenant au moins l'un des antigènes à doser,
- mettre en compétition au moins l'un desdits antigènes à doser avec le même antigène marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique (et de préférence cationique ou procationique) , face à un anticorps spécifique desdits antigènes et présent en quantité limitée.
Selon les caractéristiques de l'invention, ce procédé consiste ensuite à : - collecter sur une électrode comprenant un composé polyionique de polarité contraire à celle du système redox, (c'est-à-dire de préférence, polyanionique), les antigènes marqués, non liés à l'anticorps spécifique, de façon que ces antigènes marqués se concentrent dans ledit composé pendant une période d'accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite élec¬ trode, à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique, reliés à cette électrode.
Un système redox "pro-ionique" est un sys¬ tème dont l'une des formes devient ionique par oxyda¬ tion anodique (système redox "procationique) ou par réduction cathodique (système redox "pro-anionique") . De préférence, l'électrode est revêtue d'un filmpolyionique. Selon une variation de réalisation, ce film polyionique est polyanionique et comprend un polymère perfluore porteur de sites anioniques au pH physiologique. Ce film présente ainsi un caractère à la fois hydrophobe et ionique.
Ce procédé permet de réaliser très rapidement des mesures sélectives et avec une bonne sensibilité due, d'une part, à l'emploi d'anticorps spécifiques et d'autre part, aux caractéristiques de l'électrode modifiée. Celle-ci est capable de concentrer les anti¬ gènes marqués même s'ils ne sont présents qu'en très faibles quantités à l'intérieur de la solution analy¬ tique, ce qui a pour effet d'amplifier le signal avant qu'il ne soit transmis aux moyens électrochimiques de détection. En outre, ce procédé est très simple à employer et d'un faible coût car l'appareillage uti¬ lisé est extrêmement simplifié. Ces deux caractéris- tiques justifient l'utilisation de ce procédé non seule¬ ment dans les milieux médicaux, mais également en milieu vétérinaire ou agricole, pour doser des pesticides par exemple. De plus, ce procédé est facilement auto a- tisable du fait du nombre très réduit de manipulations à effectuer.
L'antigène dosé par ce procédé est une molé¬ cule comprenant au moins un groupement fonctionnel, de préférence une fonction aminé primaire ou secondaire ou une fonction carboxylique. Ceci ouvre un large champ de possibilités parmi les substances, pesticides ou médicaments que l'on peut doser par ce procédé.
De façon avantageuse, les moyens de détection électrochimiques sont choisis parmi 1'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie, et de préférence, la voltammétrie à vague carrée.
Ces moyens de détection permettent de réaliser rapidement et de façon fiable les mesures, y compris en milieu trouble, comme c'est le cas lorsque l'échan- tillon biologique de l'analyte est un sérum par exemple. Ceci présente un avantage par rapport aux méthodes spectroscopiques utilisées fréquemment dans les dosages immunologiques.
Le système redox peut être tout système cor- respondant à un échange électronique rapide aux pH physiologiques (voisins de 7,4).
De préférence, le système redox de marquage est choisi parmi les dérivés du ferrocene, du cobal¬ ticinium, du pyrrolidinyloxy ou du viologène. Ces différents systèmes de marqueurs redox sont cationiques ou procationiques. Les systèmes catio- niques sont déjà cationiques au départ, c'est le cas des dérivés du cobalticinium et du viologène, tandis que les systèmes procationiques sont neutres au départ et deviennent cationiques lorsque, après avoir pénétré dans le film anionique, ils sont oxydés anodiquement par polarisation de l'électrode ; c'est le cas des dérivés du ferrocene et du pyrrolidinyloxy. En outre, ces systèmes de marquage possèdent des potentiels stan- dard redox très différents conduisant à des signaux électriques bien individualisés. En conséquence, on peut envisager un multidosage, dans lequel chacun des antigènes que l'on souhaite doser est marqué avec un marqueur redox agissant à un potentiel différent. L'invention concerne également un kit de dosage immunologique d'au moins un antigène comprenant au moins un groupement fonctionnel. Selon les caractéristiques de l'invention, ce kit comprend :
- au moins un support ou un contenant pos- sédant au moins un type de complexe anticorps-antigène marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique, l'antigène correspondant à celui que l'on souhaite doser, et
- une électrode comprenant un composé polyionique de polarité contraire à celle dudit système redox.
Il s'agit généralement d'un film polyionique.
L'invention dans son ensemble sera mieux comprise à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation spécifique de l'invention, donné à titre d'exemple illustratif et non limitatif, cette description étant faite en faisant référence aux dessins joints, dans lesquels :
- la figure 1 est un schéma illustrant les diverses étapes du procédé de dosage immunologique selon 1'invention,
- la figure 2 est une vue en coupe de la cellule et de l'électrode utilisées dans le procédé de dosage, - la figure 3 représente un exemple théorique de courbe obtenue par voltammétrie à vague carrée,
- la figure 4 représente deux courbes obtenues par voltamétrie à vague carrée, respectivement avec une électrode nue en carbone vitreux et avec une élec¬ trode modifiée selon l'invention,
- la figure 5 est une courbe illustrant sur une échelle logarithmique, l'évolution de l'intensité en fonction de la concentration d'un analyte contenant comme antigène marqué seul, l'amphétamine marquée au cobalticinium,
- la figure 6 est un graphique représentant l'interférence éventuelle des antigènes non marqués sur le pourcentage de signal électrique que fournit l'antigène marqué,
- la figure 7 est un graphique illustrant l'influence du sérum normal sur l'accumulation de l'antigène marqué, à l'intérieur du film de l'électrode,
- la figure 8 est une courbe illustrant le pourcentage de signal électrique fourni par la dési- pramine marquée au cobalticinium en fonction de la concentration en anticorps spécifique de la désipramine, - la figure 9 est un graphique représentant des résultats de voltammétrie à vague carrée obtenus lors d'un dosage test,
- la figure 10 est une courbe d'étalonnage obtenue pour la désipramine modifiée dosée avec la désipramine marquée au cobalticinium,
- la figure 11 est une courbe représentant la mesure simultanée par voltammétrie à vague carrée de deux antigènes marqués et d'un traceur (cas d'un multidosage) , et - la figuré 12 est un schéma illustrant les divers éléments présents dans le kit de dosage selon l'invention et les réactions immunologiques se déroulant lors de son utilisation.
Comme illustré en figure 1, le procédé de dosage selon l'invention consiste à mettre en compé- tition au moins un antigène à doser 1 avec le même antigène marqué par un système redox 3 cationique ou procationique, face à un anticorps 5 spécifique dudit antigène 1 et présent en quantité limitée. L'antigène 1 marqué par le système redox 3 porte la référence globale 7.
Les affinités de l'anticorps 5 pour les anti¬ gènes 1 et 7 sont voisines. Enfin, les quantités d'anti¬ gènes marqués 7 et d'anticorps 5 sont connues. Lors de l'immunoréaction, les antigènes mar¬ qués 7 réagissent avec les anticorps spécifiques 5 de façon à former des complexés 9 et respectivement les antigènes 1 et les anticorps 5 forment des complexes 10. Compte tenu de la quantité limitée d'anticorps 5, tous les antigènes 1 ou 7 ne peuvent pas réagir avec les anticorps 5, et certains d'entre eux restent à l'état libre. Parmi ceux-ci toutefois, seuls les antigènes marqués 7 pourront pénétrer à 1'intérieur d'un film polyanionique 11 qui recouvre la surface d'une électrode 13 constituée d'un cylindre de carbone vitreux. Par contre, les complexes 9 anticorps-antigène marqué ne pourront pas s'accumuler dans le film poly¬ anionique 11, en raison de leur taille et de leur masse moléculaire. Ceci permet d'effectuer une sélection et donc des mesures fiables.
On notera que l'électrode 13 recouverte du film polyanionique 11 pourrait être remplacée par une électrode en pâte de carbone dans laquelle le composé polyanionique serait noyé. Cette variante n'est pas représentée sur les figures et dans la description, seule la première variante utilisant le film polyanionique est décrite en détail.
L'accumulation des antigènes marqués 7 à l'intérieur du film polyanionique 11 permet d'ampli- fier le signal observé à la sortie de l'électrode 13. Cette électrode 13 est en effet reliée à des moyens de détection électrochimique 15 permettant l'inter- prétation de ce signal. Ces moyens de détection 15 comprennent par exemple, un dispositif de mesure ampé- rométrique, coulométrique ou voltammétrique 17 qui sera détaillé ultérieurement, ce dernier étant relié à un appareil pour tracer des graphes 19 fournissant des courbes de résultats.
Dans le mode de réalisation de l'invention qui vient d'être décrit, le film 11 est anionique et le système de marquage 3 est cationique ou procationique, toutefois il est bien évident que l'inverse pourrait également être réalisé sans nuire au fonctionnement de l'invention.
Les diverses étapes de ce procédé et les moyens mis en oeuvre pour le réaliser vont maintenant être décrits plus en détail.
Comme cela a été expliqué précédemment, le procédé de dosage selon 1'invention permet de doser des antigènes, et plus spécifiquement des médicaments pour lesquels il est nécessaire de faire, soit un suivi thérapeutique, c'est-à-dire d'en déterminer à interval¬ les réguliers la quantité présente dans un échantillon biologique, soit un dosage en toxicologie d'urgence, c'est-à-dire d'en déterminer la présence ou l'absence dans un prélèvement effectué sur un malade arrivant à l'hôpital.
Ces antigènes, pour pouvoir être marqués avec l'un des systèmes redox cationique ou procatio¬ nique 3 qui seront décrits ultérieurement, doivent présenter au moins un groupement fonctionnel et de préférence, une fonction aminé primaire ou secondaire ou une fonction carboxylique. En outre, ils doivent être constitués par des molécules suffisamment petites pour être en mesure de pénétrer dans le film.
Parmi les médicaments répondant à ces caracté- ristiques et qui peuvent être dosés avec le procédé selon l'invention, on citera notamment :
- les antidépresseurs tricycliques tels que la désipramine, 1'imipramine, la nortriptyline, l'ami- triptyline, la clomipramine, la maprotiline et atypiques tels que la nomifensine, la miansérine, l'amineptine, la zimélidine, - les antiépileptiques tels que les dérivés des barbituriques, notamment le phénobarbital, le mépho- barbital, ou tels que les hydantoines, notamment la phenytoine, la mephenytoine, la carbamazepine et l'acide valproïque, - les tranquilisants dérivés des benzodiazé- pines, notamment le diazépam, le nitrazépam,
- les neuroleptiques tricycliques tels que la chlorpromazine et la trifluopérazine,
- les neuroleptiques tels que l'halopéridol, le fluospirilène,
- les antitumoraux tels que le méthotrexate, le 5-fluoro-uracile et 1'azathioprine,
- les vitamines telles que la biotine,
- les alcaloïdes, - les amphétamines;
- les antibiotiques,
- les cardiotoniques et les antiarrythmiques,
- les neurotransmetteurs et leurs dérivés,
- les antihistaminiques, - les immunosuppresseurs telle la cyclospo- rine,
- la théophylline, ou
- les pesticides.
Parmi ceux-ci, on donne ci-après la formule chimique de :
- la nortriptyline
Figure imgf000014_0001
- la désipramine :
Figure imgf000015_0001
- 1'amphétamine :
Figure imgf000015_0002
- la biotine:
H
° NHD „ *-CH -CH -CH -CH -C00H
H 2 2 2 2
Comme cela a été expliqué précédemment, pour que la réaction immunologique qui a été décrite en figure 1 se déroule correctement, il est nécessaire que le système de marquage redox 3 ne perturbe pas la reconnaissance par l'anticorps 5, de l'antigène marqué 7.
Les systèmes de marquage répondant à ces impératifs et susceptibles de se lier avec une substance ou un médicament présentant au moins un groupement fonctionnel et notamment une fonction aminé primaire ou secondaire ou une fonction carboxylique, sont choisis parmi les dérivés des couples :
- ferrocène/ferricinium (Fc/Fc+) :
Figure imgf000015_0003
F* ë> - cobalticinium/cobaltocène (Cc+/Cc) :
<S$
<S>
- pyrrolidinyloxy/pyrrolidinyloxonium
(N0-/N0+)
0* I
Figure imgf000016_0001
-- éthyl alkyl viologène (sous forme de dibromure) /radical viologène (EV2+/EV-+) :
Figure imgf000016_0002
Br Br
et leurs dérivés.
Parmi ces dérivés, on pourra citer par exem¬ ple des sels tels que 1*hexafluorophosphate, le tétra- phénylborate ou le tétrafluoroborate de l'acide carboxy- iique du cobalticinium.
Le tableau 1 figurant ci-après illustre quatre exemples de médicaments qui ont été marqués avec cer¬ tains des différents systèmes redox de marquage poten¬ tiels. Les médicaments marqués obtenus sont numérotés de 1 à 10. Le tableau donne également l'analyse élémen¬ taire de ces médicaments marqués.
Figure imgf000017_0001
Tableau 1 : Les composés préparés et leur analyse élémentaire
Médicament marqué Système de marquage : N' Analyse Elémentaire Calculé (Trouvé) M : Formule
Figure imgf000017_0002
(Suite tableau 1)
Figure imgf000018_0001
Les antigènes marqués n° 1 à 3 et 5 à 10 ont été mis au point lors de la réalisation du procédé de dosage et sont également particulièrement adaptés au kit de dosage décrit ultérieurement.
Le procédé de marquage des médicaments par l'un des systèmes redox précités est réalisé de la façon suivante.
Les médicaments présentant une fonction aminé primaire ou secondaire peuvent être symbolisés par la formule Med-NRlϋ, tandis que le système de marquage redox M se présente sous forme de chlorure d'acide ou d'ester d'hydroxysuccinimide. En l'occurrence, le procédé de marquage peut s'effectuer selon la réac¬ tion (1) (qui a servi à préparer les médicaments marqués
1, 5 et 7 du tableau 1) ou selon les deux réactions (1') et (2") (qui ont servi à préparer les médicaments
2, 4, 6 et 8 du tableau 1) :
MCC1 + Méd-NRlH -HC1 . Méd-NR!CM (1)
S ^ Il O
ou
Figure imgf000019_0001
où DCC est le dicyclohexylcarbodiimide
(2')
Figure imgf000019_0002
Les médicaments présentant une fonction carbo¬ xylique peuvent être symbolisés par la formule R2C00H. Ils sont préalablement traités avec l'hydrazine NH2-NH2 selon la réaction (3) et l'hydrazine ainsi obtenue réagit avec un chlorure d'acide selon la réaction (1) précédente :
R2C0H + H2-NH2 >R2CNHNH2 + H20 (3)
O O
Cette réaction a servi à marquer le médica¬ ment 10 du tableau 1.
Enfin, le marquage au viologène s'effectue en deux étapes (4) et (5) qui ont permis de préparer les médicaments 3 et 9 du tableau 1 :
Méd-NR1!. + Br(CH2)5CCl -HCl^ Méd-NR^CI^)5-Br (4)
O O
Figure imgf000020_0001
La figure 2 illustre la structure de la cel¬ lule dans laquelle sont effectuées l'accumulation sur l'électrode modifiée 13 puis la mesure ampérométrique après que la réaction antigène-anticorps ait eu lieu.
Cette cellule se compose par exemple d'un réservoir central 21 d'un diamètre interne de 13 mm, à l'intérieur duquel on dépose 0,5 à 1 ml de solution a analyser 23 contenant l'échantillon biologique à analyser (sérum, urine, etc..) dilué dans un tampon pH 7,4. Cet échantillon est généralement présent en une quantité de quelques dizaines de microlitres. Le réservoir 21 comprend en outre deux tubulures latérales 24 dans lesquelles sont disposées une contre-électrode en fil de platine 25 et une électrode de référence Ag/AgCl 27. L'électrode 13 en carbone vitreux recouverte d'une couche du film polymère anionique 11 et sur laquelle a lieu la réaction de l'invention est plongée dans le réservoir 21.
Le cylindre de carbone vitreux 13 à usage unique est placé dans un manchon 29 de Téflon (marque déposée). Cet ensemble est fixé sur une électrode tournante 31 Tacussel type EDI 101T. Le contact entre le cylindre de carbone 13 et les conducteurs électriques 33 de l'électrode 31 est assuré par un ressort 35.
Du fait de la nature cationique des marqueurs, le film de polymère sera de nature polyanionique.
De façon avantageuse, ce polymère est un polymère perfluore auquel sont greffés des groupements acide sulfonique. Il est connu sous le nom de marque
Nafion (fabriqué par E.I. DUPONT DE NEMOURS), et pré- sente la formule chimique suivante :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle, m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et
3. De préférence, le polymère utilisé a une masse de
1100 g par mole de site SO3H. A pH 7,4, il est sous forme polyanionique.
L'électrode sera fabriquée de façon à présen- ter des résultats reproductibles, à partir d'une solu- tion de Nafion 117 commercialisée par la Société Aldrich, (référence 27, 470-4).
Ce polymère est thermiquement et chimiquement très stable, insoluble dans l'eau seule et donc dans les analytes. Il présente de bonnes propriétés de transport ionique. Les groupements fluorés assurent le caractère hydrophobe et les groupements Sθ3~, le caractère ionique du polymère.
Sur la figure 1, les antigènes marqués 7 peuvent se fixer, via un échange ionique, soit à la surface du film 11, soit en profondeur, après que la réaction immunologique ait eu lieu. L'électrode modi¬ fiée 13 est plongée dans la solution 23 (voir figure 2) et ce pendant une durée déterminée, dite "durée d'accumulation", de façon que les antigènes marqués 7 aient le temps de se concentrer dans le film 11 et que l'électrode 13 puisse ainsi fournir un signal ampli¬ fié, au moyen électrochimique de détection 15. Pendant cette période d'accumulation, l'électrode 13 est main- tenue en circuit ouvert lorsque le marqueur est catio¬ nique (cobalticinium et viologène, par exemple) ou à un potentiel anodique constant pour les marqueurs procationiques (ferrocene et pyrrolidinyloxy, par exem¬ ple). En outre, de façon avantageuse, l'électrode modifiée est animée d'un mouvement de rotation de façon à faciliter le cheminement des antigènes marqués 7 vers le film 11. Puis, on interrompt la rotation pour effectuer la mesure électrochimique.
Il faut cependant noter qu'une fois la mesure effectuée, le polymère est pollué par l'antigène marqué et qu'il ne peut plus être utilisé pour une nouvelle mesure. Il est donc nécessaire de remplacer le cylindre de carbone 13 recouvert du film 11, à chaque mesure.
Comme décrit précédemment, les moyens électrochimiques de détection 15 comprennent un dispositif de mesure 17 qui peut être un appareil de mesures par ampérométrie, par coulométrie ou voltampérométrie, et de façon avantageuse, par voltammétrie à vague carrée. La voltammétrie à vague carrée utilise la . contre-électrode 25, l'électrode de référence 27 et l'électrode de travail 13 modifiée par un film de Nafion, illustrées à la figure 2.
Comme illustré en figure 3, la voltammétrie à vague carrée consiste à effectuer un balayage en tension entre l'électrode de référence 27 et l'électrode modifiée 13. On obtient des pics d'intensité A dont on mesure la valeur maximale H.
Afin de montrer l'efficacité du film de Nafion, on a effectué un test comparatif entre une électrode recouverte d'un film de Nafion et une électrode en carbone vitreux nu (voir figure 4).
Des mesures de voltamétrie à vague carrée ont été effectuées avec une concentration connue (0,9.10~ M) en amphétamine marquée au cobalticinium, seule, en solution. Sur la figure 4 jointe, la courbe Cl illustre les résultats obtenus avec une électrode en carbone vitreux nu et la courbe C2, les résultats obtenus par une électrode recouverte d'un film de Nafion, après accumulation pendant 5 minutes. La valeur du courant de pic de la courbe Cl est de 1,5 uA tandis que la valeur du pic de la courbe C2 est de 63,05 uA.
On peut donc constater que pour une concentra¬ tion identique de produits présents dans un échantillon, l'électrode recouverte du film de Nafion permet d'ampli¬ fier le signal d'environ 40 fois, dans ce cas. La sensibilité des résultats est donc grandement améliorée par la présence du film de Nafion, qui permet en outre de détecter des quantités extrêmement faible de produits présents dans l'échantillon initial. Pour réaliser le procédé selon l'invention, l'une des étapes préliminaires consiste à effectuer une courbe d'étalonnage du médicament marqué, seul en solution et de mesurer les différents courants de pics obtenus en fonction de concentrations croissantes connues de médicament marqué. La figure 5 est une courbe d'étalonnage obtenue pour l'amphétamine marquée au cobalticinium, seule, dans un tampon pH 7,4, pour un temps d'accumulation de 5 minutes et une vitesse de rotation de l'électrode de 600 tours/minutes. Cette courbe montre que le domaine de linéarité est impor¬ tant (échelle logarithmique).
Divers tests ont été effectués afin de prouver l'efficacité du procédé selon l'invention. Test d'interaction antigène marqué/antigène non marqué
Dans les conditions de l'immunodosage, c'est- à-dire à pH 7,4, la couche 11 de polymère de Nafion est en mesure d'accumuler, non seulement les antigènes 7 marqués par un système redox 3 cationique ou procationique, mais éventuellement aussi la forme protonée des antigènes 1 lorsque ceux-ci correspondent à la formule Méd-NR-^-H. Des tests effectués sur l'amphétamine ont montré que le signal produit par l'amphétamine marquée 7 n'est pas modifié par l'apport croissant d'amphétamine 1 seule. En revanche, on a pu constater, dans le cas de la nortriptyline et de la désipramine, que cette interférence entraînait une diminution du signal électrique observé à la sortie de l'électrode 13. Compte tenu de ces résultats, il est souhai¬ table de transformer chimiquement l'antigène 1 initia¬ lement cationique en une forme anionique qui ne pourra pas réagir avec le film anionique 11. Cette transfor¬ mation s'effectue en ajoutant à cet antigène Méd-NR^-H, de l'anhydride succinique selon la réaction chimique (6). On obtient ainsi les formes acides modifiées de la nortriptyline et de la désipramine :
Méd-NRlH + O- (6)
Figure imgf000025_0001
On notera qu'inversement, si on utilisait un antigène 1 anionique, on le traiterait de façon à l'avoir sous une forme cationique ne réagissant pas avec un film cationique.
Cette modification du médicament supprime l'interférence et en conséquence restaure le signal initial.
La figure 6 représente l'influence exercée par des concentrations croissantes de désipramine simple (courbe Cl) et de désipramine modifiée pour se présenter sous une forme anionique (courbe C2) , sur le pourcentage de signal électrique que fournit la désipramine marquée au cobalticinium. Cette dernière est présente selon une concentration de 2.10"^ M. On constate qu'en pré¬ sence de désipramine simple (courbe Cl), cette dernière occupe des sites anioniques du film 11, de façon abusive et que la désipramine marquée au cobalticinium ne peut réagir complètement avec les sites du film 11. En conséquence, le pourcentage de signal électrique dû aux systèmes redox diminue. Au contraire, en présence du médicament modifié sous forme anionique (courbe C2), le pourcentage de signal n'est pas influencé. En outre, cette transformation chimique du médicament (antigène) a un second avantage. L'anticorps 5 (voir figure 1) présente une meilleure affinité pour l'antigène 1 lorsque celui-ci est sous forme anionique. En conséquence, on observe une meilleure sensibilité de dosage .
Test d'interaction antigène marqué/sérum normal de lapin
En l'absence d'anticorps 5, il faut évaluer les interactions non spécifiques (liaisons protéiniques) du sérum avec les médicaments marqués, car le signal électrique correspond aux molécules n1interagissant pas. La figure 7 illustre l'influence du sérum normal de lapin sur l'accumulation dans l'électrode de l'anti- gène marqué, ici la nortriptyline marquée respectivement avec du cobalticinium (courbe Cl), du pyrrolidinyloxy (courbe C2) et du ferrocene (courbe C3) . Lorsque les médicaments sont marqués au cobalticinium, l'addition de sérum normal de lapin influe peu sur le signal élec- trique. C'est ce qu'illustre la courbe Cl où la concen¬ tration en médicament marqué est de 5.10~7M. Ceci résul¬ te du caractère ionique, donc hydrophyle du marqueur. En revanche, lorsque ce médicament à une concentration de 10~^M est marqué au pyrrolidinyloxy (courbe C2) ou au ferrocene (courbe C3), la chute du signal est plus importante en raison du caractère hydrophobe des médicaments marqués. Test d'interaction anticorps/antigène marqué
Afin de vérifier que la réaction immunolo- gique s'effectue correctement, il est nécessaire de montrer que les anticorps spécifiques 5 sont non seule¬ ment efficaces vis-à-vis des antigènes 1 seuls mais également vis-à-vis des antigènes marqués 7 et que la présence du système de marquage redox 3 ne modifie pas l'interaction avec l'anticorps. La figure 8 il¬ lustre le dosage de l'antisérum, c'est-à-dire du sérum contenant l'anticorps. (Il faut noter qu'avant le dosage immunologique proprement dit, il est nécessaire de déterminer la quantité d'anticorps que l'on devra ajouter par la suite lors des dosages pour être en défaut d' nticorps) .
On a ajouté à une solution contenant une quantité fixe d'antigènes marqués 7 (ici la désipramine marquée par du cobalticinium, concentration 2,7.10~7 M) et dans laquelle plongeait l'électrode 13, des quantités croissantes d'anticorps 5. Cette addition d'anticorps fait chuter le signal électrique obtenu à l'électrode 13 en raison de l'appauvrissement de la solution en désipramine marquée libre, seule susceptible de pénétrer à l'intérieur du film polyanionique 11. En d'autres termes, les complexes anticorps/antigènes marqués 9 ne peuvent pas pénétrer dans ce film 11 et ne sont donc plus comptés, ce qui explique la diminution du pourcentage de signal électrique. A titre d'exemple purement illustratif, la méthode de SCATCHARD a permis de déterminer la constante d'affinité de l'anticorps pour la désipramine marquée par le cobalticinium, et cette constante est égale à 5.107 M"1. Exemple de réalisation pratique du procédé selon l'in¬ vention
Comme dans tout dosage immunologique, avant d'entreprendre des déterminations de concentrations inconnues sur des échantillons biologiques, il est nécessaire d'établir une courbe d'étalonnage pour une gamme de concentrations données. Pour cela, cinq solu¬ tions ont été préparées, ce sont les suivantes :
- solution A : antigène marqué, ici de la désipramine marquée au cobalticinium, (concentration 10~5 M), dissoute dans de l'éthanol,
- solution B : antigène seul, modifié, c'est- à-dire la désipramine modifiée sous sa forme anionique et dissoute dans un tampon pH 7,4, (c'est-à-dire la solution E) concentration 10~^M, - solution C : sérum normal de lapin dilué au 1/5 dans le tampon pH 7,4, (c'est-à-dire la solution E),
- solution D : anticorps, ici anti-sérum de lapin dilué au 1/5 dans le tampon pH 7,4, (c'est-à- dire la solution E),
- solution E : tampon pH 7,4 (2,7 g de Na HP04, 12 H2θ+0,338 g NaH2Pθ4, 2 H2θ+l,64 g NaCl+eau jusqu'à 500 ml) .
Ensuite, on a préparé 3 tubes à essai dans lesquels on a effectué les mélanges suivants : tube témoin (1) : solution A + solution C + solution E, tube de zéro (2) : solution A + solution D + solution E, tube étalon (3) : solution A + solution
B + solution D + solution E.
Les solutions ont été homogénéisées, puis mises à incuber par exemple à 37°C pendant 60 minutes, de façon à atteindre l'équilibre de la réaction anti- corps-antigène.
On les a ensuite transférées successivement dans la cellule d'électrolyse 21, elle-même plongée dans un bain thermostaté à 25°C. Les mesures sont ef¬ fectuées en plongeant l'électrode 13 revêtue du film de Nafion 11 dans la cellule et en lui imposant une rotation de 600 tours par minute pendant 5 minutes (période d'accumulation des antigènes marqués libres). On effectue ensuite la mesure de voltammétrie à vague carrée. L'obtention d'une courbe d'étalonnage fait intervenir trois mesures pour chaque point. Tube 1 : Ag marqué + sérum — courant de pic Ii, Tube 2 : Ag marqué + Ac —^courant de pic 12, Tube 3 : Ag marqué + Ag seul + Ac—^ courant de pic I3. Les résultats sont illustrés dans la figure
9 jointe. Dans le premier cas, tous les antigènes mar¬ qués peuvent se fixer sur l'électrode et se concentrer dans le film de polymère, ce qui explique la valeur élevée du courant de pic Iι« Dans le deuxième cas, une partie des antigènes marqués réagit avec les anti¬ corps et seuls les antigènes marqués en excès se concen- trent sur l'électrode. Ceci explique la faible valeur du courant de pic 12- Enfin, dans le troisième cas, la réaction de compétition entre les antigènes marqués et les antigènes non marqués, face aux anticorps a lieu. Une fraction des antigènes marqués libres moins importante que dans la deuxième mesure, se concentre sur l'électrode. Le courant de pic 13 est donc une valeur intermédiaire entre Ii et I2.
Le pourcentage de signal est défini par (I00.l2)/Iι et le signal B/B0 (%) est égal à 100(I1-I )/(I1-I2 ).
A partir de ce type de résultats, on peut tracer une courbe d'étalonnage, telle que celle il¬ lustrée en figure 10. Cette courbe peut être utilisée pour l'analyse d'un échantillon contenant une quantité inconnue de désipramine modifiée (anionique).
Par ailleurs, le procédé selon l'invention permet d'envisager la réalisation de multidosages. En effet, comme illustré en figure 1, il est possible de doser' en parallèle non seulement un antigène 1 mais également uh antigène différent l' et de faire réagir ce dernier en compétition avec un antigène 1' marqué par un système redox différent 3' face à des anticorps 5' spécifiques de l'antigène l'. En effet, les dérivés du ferrocene, du cobalticinium, du pyrrolidinyloxy et du viologène présentent des pics d'intensité à des potentiels suffisamment différents les uns des autres pour que l'on puisse détecter une succession de pics sur une courbe de résultats.
Pour les médicaments 1 à 10 du tableau 1, les valeurs des potentiels correspondants aux pics d'intensité des différents systèmes redox sont données dans le tableau 2 ci-après . Tableau 2
Médicament marqué Système de marquage Potentiel de Pic (V) Sensibilité ip/C (A.l.mol-1)
nortriptyline cobalticinium - 1,13 51 ACO
31 accumulation à'+0,7V
2 nortriptyline pyrrolidinyloxy + 0,34 13 accumulation à +0,8V nortriptyline viologène - 0,78
amphétamine ferrocene + 0,20 amphétamine cobalticinium - 1,13 amphétamine pyrrolidinyloxy + 0,34 désipramine cobalticinium - 1,13 désipramine pyrrolidinyloxy + 0,34
Figure imgf000030_0002
désipramine viologène - 0,78
10 biotine cobalticinium - 1,07 ACO
Ag/AgCl ; Cl" (0,05M)
* : aucune mesure de sensibilité effectuée
ACO : Accumulation en Circuit Ouvert
Figure imgf000030_0001
Ainsi, en utilisant au moins deux systèmes de marquage différents, on peut doser simultanément en une seule mesure, au moins deux médicaments présents dans un unique échantillon provenant d'un malade. On comprend bien qu'en toxicologie d'urgence, ce type de tests de dépistage peut permettre de dépister rapi¬ dement la présence et les concentrations de plusieurs médicaments d'usage courant.
La figure 11 illustre justement un triple dosage effectué sur un échantillon contenant simulta¬ nément de la nortriptyline marquée au cobalticinium, de l'amphétamine marquée au ferrocene et du diméthyl- viologène.
Les mesures ont été réalisées à une tempé- rature de 25°C, avec une électrode revêtue de Nafion, tournant à 600 t/min, après 5 minutes d'accumulation à 0,6 V. Au cours de la mesure, on a balayé le poten¬ tiel entre + 0,6 V et - 1,4 V et l'on a observé trois pics numérotés respectivement PI, P2 et P3. Le pic PI situé au voisinage de 0,19 V correspond au médicament marqué par le ferrocene, le pic P2 situé à -0,77 V correspond à la réduction du diméthyl viologène et le pic P3 situé à environ -1,11 V correspond à un médi¬ cament marqué par le cobalticinium. En reportant les valeurs d'intensité obtenues sur une courbe d'étalonnage préétablie, il serait pos¬ sible de déduire les concentrations des différents médicaments. Ici la concentration de la nortriptyline marquée au Cc+ était de 5,0.10~7 mol.l-!, celle de l'amphétamine marquée au Fe de 3,45.10~7 mol.l"! et celle du méthyl viologène de 5,2.10"° mol.l"!.
L'invention concerne également un kit de dosage utilisant le principe du procédé qui vient d'être décrit. Ce kit est schématisé en figure 12. II comprend un contenant 40 qui contient au moins un type de complexe anticorps 5, 5'-antigène marqué par le système redox ionique 3, 3'. Ce complexe peut être fixé ou non sur le contenant. L'antigène correspond à celui que l'on souhaite doser. Sur cette figure 12, le contenant 40 revêt la forme d'un tube à essai et permet de réaliser une analyse séquentielle. Toutefois, il est bien évident que ce contenant pourrait également se présenter sous forme d'une plaque de dosage multi-puits. Par ailleurs, il est également possible d'effectuer une analyse en flux continu et dans ce cas, le complexe Ac/Ag marqué 9, 9' est fixé sur des billes de natures diverses qui jouent le rôle de support 40. Ces différents types de contenants ou de supports sont donnés à titre d'exem- pie illustratifs. Ils sont à usage unique.
Le kit de dosage selon l'invention comprend également une électrode 13 revêtue d'un film 11 poly¬ ionique, de polarité contraire à celle du système 3, 3' et avantageusement polyanionique. De façon avanta- geuse, ce film 11 est le film polyanionique de Nafion (marque déposée) précédemment décrit et le système de marquage redox 3, 3' est de nature cationique ou procationique, tels que ceux qui ont été précédemment décrits. On pourrait également utiliser un kit compre- nant des complexes Ac/Ag marqués par un système redox anionique ou proanionique et une électrode revêtue d'un film polycationique.
Enfin, le kit peut comprendre éventuellement des tubes à essais 42, 44 contenant des échantillons standard de quantités connues d'antigène à doser l' et 1 respectivement. Ces tubes permettent de réaliser la courbe d'étalonnage selon le principe précédemment décrit. L'utilisateur peut également préparer lui-même ses échantillons standard. Lors de l'utilisation de ce kit de dosage, on verse l'échantillon biologique 23, contenant les antigènes 1, l', éventuellement traités pour se pré¬ senter sous forme anionique, dans le tube 40. La réac¬ tion de compétition a lieu et certains antigènes 1, 1' vont déloger les antigènes marqués 7, 7' pour se fixer à leur place sur les anticorps 5, 5'. La suite de la réaction est identique à ce qui a été décrit précédemment pour le procédé, notamment en ce qui concerne les moyens de détection électrochimique et l'analyse des résultats sur la base de la courbe d'étalonnage.

Claims

REVENDICATIONS
1. Antigène marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique, destiné à être utilisé dans un procédé de dosage immunologique avec détection électrochimique, de cet antigène ou dans un kit de dosage immunologique de cet antigène, caractérisé en ce que l'antigène marqué est choisi parmi la nortriptyline marquée à 1'hexafluorophosphate de l'acide carboxylique du cobalticinium, au pyrrolidinyloxy ou au dibromure d'éthyl alkyl viologène ; l'amphétamine marquée au tétrafluoroborate de l'acide carboxylique du cobalticinium ou au pyrrolidinyloxy, la désipramine marquée à 1'hexafluorophosphate de l'acide carboxylique du cobalticinium, au pyrrolidinyloxy ou au dibromure d'éthyl alkyl viologène ; ou la biotine marquée au tétraphénylborate de 1'acide carboxylique du cobalticinium.
2. Procédé de dosage immunologique avec détec- tion électrochimique, d'au moins un antigène comprenant au moins un groupement fonctionnel, comprenant les étapes consistant à :
- préparer une solution à analyser comprenant une solution aqueuse tamponnée au pH physiologique et un échantillon biologique (23) contenant au moins l'un des antigènes à doser (1, l'),
- mettre en compétition au moins l'un desdits antigènes à doser (1, l') avec le même antigène (7, 7') marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique (3, 3'), face à un anticorps (5, 5') spécifique desdits antigènes (1, 7 ; l', 7') et présent en quantité limitée, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste en outre à :
- collecter sur une électrode (13) comprenant un composé polyionique (11) de polarité contraire à celle du système redox (3, 3'), les antigènes marqués (7, 7') non liés à l'anticorps spécifique (5, 5'), de façon que ces antigènes marqués (7, 7') pénètrent à l'intérieur dudit composé polyionique (11) et se concentrent dans celui-ci pendant une période d'accumulation,
- mesurer le signal fourni par ladite électro¬ de (13) à l'issue de la période d'accumulation, grâce à des moyens de détection électrochimique (15), reliés à cette électrode.
3. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'électrode (13) est revêtue d'un film polyionique (11).
4. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le système redox (3, 3') est cationique ou procationique et en ce que le film (11) recouvrant l'électrode (13) est polyanionique.
5. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 4, caractérisé en ce que le film poly¬ anionique (11) recouvrant l'électrode (13) est un poly¬ mère perfluore, porteur de sites anioniques, au pH physiologique.
6. Procédé de dosage immunologique selon l revendication 5, caractérisé en ce que le film poly¬ anionique (11) recouvrant l'électrode (13) est un poly¬ mère perfluore de formule ;
- "
Figure imgf000035_0001
dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3.
7. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'antigène (1, l' ; 7, 7') est une molécule comprenant au moins, une fonction aminé primaire ou secondaire ou une fonc¬ tion carboxylique.
8. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 2 ou 7, caractérisé en ce que les antigènes (1, l') à doser sont choisis parmi :
- les antidépresseurs tricycliques tels que la désipramine, 1'imipramine, la nortriptyline, l'ami- triptyline, la clomipramine, la maprotiline et atypiques tels que la nomifensine, la iansérine, l'amineptine, la zimélidine,
- les antiépileptiques tels que les dérivés des barbituriques, notamment le phénobarbital, le mépho- barbital, ou tels que les hydantoines, notamment la phenytoine, la mephenytoine, la carbamazepine et l'acide valproïque,
- les tranquilisants dérivés des benzodia- zépines, notamment le diazépam, le nitrazépam,
- les neuroleptiques tricycliques tels que la chlorpromazine et la trifluopérazine, - les neuroleptiques tels que l'halopéridol, le fluospirilène,
- les antitumoraux tels que le méthotrexate, le 5-fluoro-uracile et l'azathioprine,
- les vitamines telles que la biotine, - les alcaloïdes,
- les amphétamines,
- les antibiotiques,
- les cardiotoniques et les antiarrythmiques,
- les neurotransmetteurs et leurs dérivés, - les antihistaminiques. - les immunosuppresseurs tels que la cyclo- sponne.
- la théophylline, ou
- les pesticides.
9. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 4, caractérisé en ce que le système redox de marquage (3, 3') est choisi parmi les dérivés du ferrocene, du cobalticinium, du pyrrolidinyloxy ou du viologène.
10. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'avant d'être mis en compétition, l'antigène à doser (1, l') est traité de façon à ce qu'il se présente sous une forme ionique de même polarité que celle du film (11) recou- vrant l'électrode (13).
11. Procédé de dosage immunologique selon les revendications 4 et 10, caractérisé en ce qu'avant d'être mis en compétition, l'antigène à doser (1, l') est traité par l'anhydride succinique de façon à prendre une forme anionique.
12. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique (15) sont choisis parmi l'ampérométrie, la coulométrie, la voltampérométrie ou la voltammétrie à vague carrée.
13. Procédé de dosage immunologique selon les revendications 4 et 6, caractérisé en ce que les moyens de détection sont la voltammétrie à vague carrée.
14. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 4, caractérisé en ce que le système redox (3, 3') est procationique et en ce que l'électrode (13) est maintenue à un potentiel positif pendant la période d'accumulation.
15. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le système redox (3, 3') est cationique et en ce que l'électrode (13) est maintenue en circuit ouvert pendant la période d'accumulation.
16. Procédé de dosage immunologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, carac¬ térisé en ce que l'électrode (13) revêtue du film poly¬ ionique (11) est à usage unique.
17. Kit de dosage immunologique d'au moins un antigène (1, l') comprenant au moins un groupement fonctionnel, caractérisée en ce qu'il comprend :
- au moins un support ou un contenant (40) possédant au moins un type de complexe (9, 9') anti¬ corps (5)-antigène (7, 7') marqué par un système redox dont l'une des formes est ionique (3, 3'), l'antigène (7, 7') correspondant à celui (1„ l') que l'on souhaite doser et
- une électrode (13) comprenant un composé polyionique (11) de polarité contraire à celle dudit système redox (3, 3' ) .
18. Kit de dosage selon la revendication
17, caractérisé en ce que l'électrode (13) est revêtue d'un film polyionique (11).
19. Kit de dosage selon la revendication
18, caractérisé en ce que le système de marquage redox est cationique ou procationique et en ce que le film
(11) recouvrant l'électrode (13) est polyanionique.
20. Kit de dosage selon la revendication
19, caractérisé en ce que le film polyanionique (11) recouvrant l'électrode (13) est un polymère perfluore de formule :
- [(CF2-CF2 -
Figure imgf000038_0001
dans laquelle m est compris entre 5 et 13,5, n vaut environ 1000 et k est un entier compris entre 1 et 3.
21. Kit de dosage selon la revendication 17, 18, 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une série de tubes échantillons (42, 44) contenant des quantités connues d'au moins un des anti¬ gènes (1, l') à doser, afin de permettre la réalisation d'une courbe d'échantillonnage.
22. Kit de dosage selon la revendication
17, caractérisé en ce que le système redox de marquage (3, 3') est choisi parmi les dérivés du ferrocene, du cobalticinium, du pyrrolidinyloxy ou du viologène.
23. Kit de dosage selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'antigène (1, l' ; 7, 7') est une molécule comprenant au moins une fonction amine primaire ou secondaire ou une fonction carboxylique.
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