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WO1994025605A1 - Gene d'aspartokinase variant - Google Patents

Gene d'aspartokinase variant Download PDF

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WO1994025605A1
WO1994025605A1 PCT/JP1993/001809 JP9301809W WO9425605A1 WO 1994025605 A1 WO1994025605 A1 WO 1994025605A1 JP 9301809 W JP9301809 W JP 9301809W WO 9425605 A1 WO9425605 A1 WO 9425605A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ala
val
glu
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1993/001809
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masakazu Sugimoto
Yuri Ogawa
Tomoto Suzuki
Akiko Tanaka
Hiroshi Matsui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to DE69332805T priority Critical patent/DE69332805T2/de
Priority to EP94902116A priority patent/EP0699759B1/en
Priority to DK94902116T priority patent/DK0699759T3/da
Priority to AT94902116T priority patent/ATE235555T1/de
Priority to US08/532,828 priority patent/US5688671A/en
Publication of WO1994025605A1 publication Critical patent/WO1994025605A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a novel aspartokinase derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium used for fermentative production of amino acids and the like, a DNA fragment encoding the enzyme, and a recombinant DNA containing the DNA fragment. About. Further, the present invention relates to a Corynebacterium bacterium having the recombinant DNA, and to a method for producing L-lysine, which comprises culturing the microorganism. Background art
  • L-lysine used as a feed additive is usually produced by fermentation using an L-lysine-producing mutant of a coryneform bacterium.
  • L-lysine producing bacteria currently known are produced by artificial mutation of a wild strain of coryneform bacterium.
  • Such artificial mutants include the following. S- (2-aminoethyl) -cysteine (hereinafter abbreviated as AEC) resistant mutant, mutant that requires an amino acid such as L-homoserine for its growth (JP-B-48-28078, JP-B) No.
  • vector plasmids in the genus Brevipacterium and the genus Corynebacterium, vector plasmids (see U.S. Patent Application No. 386980), which are capable of autonomous growth in cells and have a drug resistance marker gene
  • An introduction method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791
  • the possibility of growing L-threonine or L-isoleucine-producing bacteria using these techniques is disclosed (US Patent Application Nos. 376396 and 392145). No.).
  • An object of the present invention is to provide AK, an important enzyme for lysine biosynthesis in microorganisms of the genus Corynebacterium, in such a manner that feedback inhibition by L-lysine and L-threonine and release of feedback inhibition by lysine alone are released.
  • AK an important enzyme for lysine biosynthesis in microorganisms of the genus Corynebacterium
  • the present inventors have conducted intensive studies and succeeded in obtaining a mutant AK gene from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, thereby completing the present invention. That is, the invention of the present application A Corynebacterium bacterium having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence in which the Thr residue at position 279 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is changed to an amino acid residue other than Ala and other than acidic amino acid An aspartokinase alpha subunit protein and a DNA fragment encoding the protein, from which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is substantially released.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing has the Thr residue at position 30 changed to an amino acid residue other than Ala and other than acidic amino acid.
  • An aspartokinase-subunit protein which is derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium and has substantially released synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine, and a DNA fragment encoding the protein.
  • the present invention provides a recombinant DNA containing the above DNA fragment, which is capable of replicating in a microorganism of the genus Corynebacterium, and an asbestos kinase ratio obtained by introducing the recombinant DNA into a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • a transformant whose activity has increased 2- to 20-fold that of the parent strain and in which synergistic feedback inhibition of aspartokinase activity by L-lysine and L-threonine or feedback inhibition by L-lysine alone has been substantially released. is there.
  • the present invention provides a method for producing L-lysine, which comprises culturing the above transformant in a suitable medium and isolating the resulting L-lysine.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium according to the present invention is defined in Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p. 599 (1974). A group of microorganisms that are aerobic, gram-positive, nonacidic, and have no sporulating activity.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium according to the present invention includes a bacterium belonging to the genus Brevibacterium which has been conventionally classified into the genus Corynebacterium, but is now integrated as a bacterium belonging to the genus Corynebacterium. Includes bacteria of the genus Brevibagterium very closely related to the genus Bacteria.
  • glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Corynebacterium (genus Brevibacterium) described below are most preferred in the present invention.
  • some bacteria of the genus Microbacterium accumulate glutamate. And these can also be used in the present invention.
  • Examples of wild strains of glutamate-producing bacteria of the genus Corynebacterium include the following.
  • a DNA fragment containing the wild-type AK gene can be obtained.
  • synergistic feedback of L-lysine and L-threonine on AK activity is required. It can be obtained by using a mutant strain whose inhibition has been substantially released.
  • the mutant strain is obtained, for example, from a group of cells that have been subjected to a conventional mutagenesis method, ultraviolet irradiation, or treatment with a mutagen such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogazine (NTG). be able to.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogazine
  • Examples of donors of the DNA fragment containing the AK gene include L-lysine-producing bacteria AJ3463 derived from the wild-type strains of Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofarmentum) ATCC13869 and ATC C13869 by mutation treatment. FERMP-1987) is the most preferred and donor bacterium.
  • mutant AK gene a gene encoding wild-type AK gene and aspartokinase from which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine has been substantially released (hereinafter referred to as mutant AK gene) ) Is isolated, ligated to a vector capable of autonomous growth in Corynebacterium (Brevibacterium) bacteria, and introduced into Corynebacterium (Brevibacterium) bacterial cells.
  • the method of isolating the AK gene is as follows. First, a chromosomal gene is extracted from a strain of the genus Corynebacterium that has the AK gene (for example, H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta !, 619, The method of (1963) can be used.) This is cut with an appropriate restriction enzyme. Then, it is connected to a vector that can grow in Corynebacterium bacteria cells, and the resulting recombinant vector is used to transform an AK-deficient mutant of Corynebacterium microorganisms, which possesses AK-forming activity. The AK gene can be isolated from the resulting strain. The method of inducing an AK-deficient mutant can be performed in the same manner as the method of inducing a mutant in which synergistic feedback inhibition of L-lysine and L-threonine on AK activity has been substantially released.
  • restriction enzymes can be used if the degree of cleavage is adjusted by adjusting the cleavage reaction time, etc., in order to cut the chromosomal gene.
  • the vector that can be used in the present invention may be any vector as long as it can be propagated in Corynebacterium bacteria cells. Specific examples include the following.
  • Cleavage of the vector is carried out by cleaving the DNA with a restriction enzyme that cuts at a single site or by partially using a restriction enzyme that cuts a plurality of sites.
  • the vector is cleaved by the restriction enzyme used to cut the chromosomal gene, or a chromosomal DNA cleavage fragment and an oligonucleotide having a complementary nucleotide sequence are connected to both ends of the cleaved vector. It is subjected to a Ligation reaction between the vector and the chromosomal DNA fragment.
  • the method used in Bacillus subtilis described above can be obtained at a sufficiently high frequency, and the method described in JP-A-57-183799 can be used to add polyethylene glycol or polyethylene glycol to the protoplasts of the genus Corynebacterium.
  • a method of incorporating DNA in the presence of polyvinyl alcohol and divalent metal ion can also be used.
  • polyethylene glycol or polyvinyl alcohol Equivalent results can be obtained by a method that promotes the uptake of DNA by adding carboxymethylcellulose, dextran, ficoll, or bunore nick F68 (Selva).
  • the AK gene is obtained by amplifying the AK gene from the chromosomal DNA obtained as described above by PCR (see Polymerase chain reaction; White, TJ et al; Trends Genet. 5, 185 (1989)). You can also do it.
  • the DNA primer used for amplification a primer complementary to both 3 'ends of a DNA double strand containing the entire region or a partial region of the AK gene is used.
  • it is necessary to screen from the gene library by amplifying the DNA fragment including the entire region using the DNA fragment of the region as a primer.
  • the DNA fragment is subjected to agarose gel electrophoresis, and then the target band is cut out to collect the DNA fragment containing the AK gene.
  • DNA primers include, for example, Corynebacterium glutamicum (Korynebacteriura glutamicum) -1204, ol. Gen. Genet. (1990), 317-324), to amplify a region of about 1643 bp encoding the AK gene, so that 5'-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3 'and 5'- Optimum is a single-stranded DNA of 23mer or 21mer having a sequence of ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3 '
  • the DNA was synthesized using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems using the phosphoramidite method (Tetrahedron Letters (198 1), , 1859)
  • the PCR reaction can be performed using Takara Shuzo Co., Ltd. MA Sa-Marcycla PJ2000, using Taq DNA polymerase according to the method specified by the supplier.
  • the amplified AK gene is connected to a vector that can grow in the above-mentioned Corynebacterium bacterium cell, and is introduced into the Corynebacterium bacterium cell by the above-described method.
  • Examples of a host into which the obtained AK gene is introduced and amplified to produce lysine include the above-mentioned wild-type strain of a glutamic acid-producing bacterium of the genus Corynebacterium. Replication origin and mutant A of the constructed recombinant DNA Any bacteria capable of functioning the K gene, capable of replicating recombinant DIII and capable of enhancing mutant AK activity can be used as a host.
  • the most preferred host is the AJ12036 strain (FERM-P7559), which is a wild-type strain of Corynebacterium glutamicum (Brevobacterium lactophamentum).
  • the transformant obtained by the above method and having the recombinant DNA containing the gene encoding aspartokinase from which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine has been substantially released has been cultured. Then, the desired L-lysine was produced and accumulated in the culture solution and collected.
  • the medium used for L-lysine production is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required.
  • carbon sources include sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose and hydrolysates of starch, alcohols such as glycerol monosorbitol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid, and succinic acid. Can be used.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, ammonia water and the like
  • organic trace nutrients it is desirable to contain required substances such as vitamin B 1 and L-homoserine, or yeast extract and the like in appropriate amounts.
  • required substances such as vitamin B 1 and L-homoserine, or yeast extract and the like in appropriate amounts.
  • a small amount of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion, or the like is added as needed.
  • FIG. 1 shows p399AKY and p399A from AK gene fragment amplified by PCR from chromosome. This figure shows the process of constructing p399AKYB and p399AK9B by introducing a DNA fragment (Coryne.
  • p399AK9B was constructed through exactly the same process except that it had a single nucleotide difference from P399AKYB, and is therefore shown together with ⁇ .
  • Figure 2 shows the inhibition of wild-type and mutant (Thr) AK by lysine, threonine, and lysine + threonine.
  • the activity when no lysine or threonine was added was defined as 100%, and the activity when added was expressed as the activity retention rate (inhibition release degree).
  • Figure 3 shows the degree of lysine-induced inhibition of AK in eight wild-type and mutant-type AKs.
  • Fig. 4 shows the results of investigation on the degree of release of inhibition of AK by threonine in eight wild-type and mutant-type AKs.
  • Figure 5 shows the degree of release of concerted inhibition by lysine + threonine of 8 wild type and mutant AKs.
  • Figure 6 shows the thermal stability of eight wild-type and mutant AKs.
  • Example 1 Acquisition of wild-type and mutant AK genes and preparation of plasmids for corynebacterium Corynebacterium glutamicum (brevipa, cterium 'lactofermentum) A wild-type ATCC13869 strain, and a mutant strain obtained therefrom. Chromosomal DNA was prepared from the obtained L-lysine-producing mutant AJ3463 (FERM P-1987) according to a conventional method. Stained by PCR (polymerase chain reaction; White, T. J. et al; Trends Genet.
  • the MA primer used for the amplification is a sequence known from Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-Orchid, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324). 5'-TCGCGAA to amplify an approximately 1643 bp region encoding the AK gene based on Single-stranded DNAs of 23mer and 21mer having a sequence of GTAGCACCTGTCACTT-3 "(SEQ ID NO: 15) and 5'-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3 '(SEQ ID NO: 16) were synthesized. The DNA was synthesized by Applied Biosystems.
  • PHSG399 Takeshita, S ⁇ i; see Gene (1987), 63-74) was used as a vector for gene fragment cloning. pHSG399 was digested with restriction enzyme Smal (Takara Shuzo Co., Ltd.) and restriction enzyme EcoRI, and the fragment was connected to the amplified AK gene fragment. The DNA was connected using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the specified method. In this way, a plasmid in which the AK gene fragment amplified from the brepinocacterium chromosome was connected to PHSG399 was prepared.
  • the plasmid having the AK gene derived from ATCC13869 which is a wild strain was named p399AKY, and the plasmid having the AK gene derived from AJ3463 which was an L-lysine producing bacterium was named P399AK9.
  • Coryne.-ori DNA fragments capable of autonomously propagating plasmids in Corynebacterium bacteria were introduced into p399AKY and p399AK9, respectively.
  • a plasmid vector pHK4 capable of autonomous replication in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria was constructed.
  • a novel shuttle vector pHK4 was constructed from pAJ1844 (see JP-A-58-216199) and pHSG298 (see S.
  • Transformants were selected on a M-C M2G plate containing 5 g of kanamycin (glucose 5 g, polypeptone 10 g, yeast extract 10 g, NaC 15 g, DL-methionine 0.2 g, agar 15 g in pure water 11). Performed in 2). Plasmid was prepared from the transformant, the one with the smallest size was selected, and named pHK4. This plasmid is capable of autonomous growth in Escherichia coli and Corynebacterium bacteria and confers kanamycin resistance on its host.
  • PHK4 was cut with the restriction enzyme Kpnl (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended.
  • C- blunting was performed using the DM Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the designated method. .
  • a phosphorylated BamHI linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected, and a modification was made so that the DNA fragment of the Coryne.-ori portion was cut out of pHK4 by cleavage with BamHI alone.
  • This plasmid was digested with BamHI, and the resulting Coryne.-ori DNA fragment was ligated to p399AKY and p399AK9 also digested with BamHI to obtain a plasmid capable of autonomous replication in Corynebacterium bacteria and containing the AK gene.
  • a plasmid containing the wild-type AK gene derived from P399AKY was named p399AKYB
  • a plasmid containing the mutant AK gene derived from p399AK9 was named p399AK9B.
  • Figure 1 shows the process of construction of p399AK9B and p399AKYB.
  • Corynebacterium glutamicum (breviba, terium lactofermentum) AJ12091 strain, in which the mutant AK plasmid P399AK9B has been introduced into the wild-type strain AJ12036 (FERM-P7559), has the accession number (FERM-P12918). ) And deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry.
  • Example 2 Determination of Nucleotide Sequence of Wild-type AK and Mutant-type AK Gene of Corynepa 'Cterium glutamicum'
  • Plasmid P399AKY containing the wild-type AK gene and P399AK9 containing the mutant AK gene were prepared, and the nucleotide sequences of the wild-type and mutant AK genes were determined.
  • the nucleotide sequence was determined by the method of Sanger et al. (F. Sanger et al: Proc. Natl. Acad. Sci.! 45463 (1977) and the like).
  • the nucleotide sequence of the wild-type AK gene encoded by p399AKY is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the nucleotide sequence of the mutant AK gene encoded by P399AK9 is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • Mutant AK gene is wild Compared to type AK, it has only a single-base mutation in which the 1st G is changed to A.
  • the AK gene it is known that two subunits of ⁇ and ⁇ are encoded in the same DNA strand in the same reading frame (Kalinowski, J et al! Olecular Microbiology (1991) 5). Judging from homology, this gene is considered to have two subunits a and y3 encoded on the same DNA strand in the same reading frame.
  • the amino acid sequence of the ⁇ -subunit of the wild-type AK protein deduced from the DNA base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, and the amino acid sequence of the ⁇ subunit is shown in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing.
  • the ⁇ -subunit is shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing, and the ⁇ subunit is shown in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing.
  • nucleotide sequences of the open reading frame of each subnet are shown in SEQ ID Nos: 11 and 13 in the sequence listing.
  • amino acid sequence of the ⁇ -subunit of the mutant ⁇ protein deduced from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the ⁇ -subunit is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • the DNA sequence and the amino acid sequence are shown at the same time.
  • a Subunit is shown in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing, and ⁇ -subunit is shown in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing.
  • the base sequence of the open reading frame of each of the ⁇ ⁇ subunits is shown as SEQ ID NOS: 12 and 14 in the sequence listing.
  • GTG is used as the start codon, and the corresponding amino acid is described as methionine, which means methionine, ⁇ phosphorus, or formylmethionine. is there.
  • the mutation point in the mutant A ⁇ gene is that the mutant AK protein causes an amino acid substitution in the amino acid sequence, in which the alanine at position 279 in the ⁇ -subunit is replaced with threonine, and the alanine in position 30 is replaced with threonine in the ⁇ -subunit.
  • Example 3 Effect of L-Lysine Production Ability by Introducing Mutant ⁇ and Wild-type A ⁇ Plasmid in Corynebacterium glutamicum Wild Strain Corynebacterium glutamicum (Blevibacterium 'lactofermen) Tum) Strains were prepared by introducing wild-type AK plasmid p399AKYB and mutant AK plasmid p399AK9B into the wild-type strain AJ12036 (FERM-P7559). Gene transfer into Corynebacterium was performed by the electric pulse method.
  • Table 1 shows the specific activity of AK was increased by about 10 to 15 times by the introduction of AK plasmid, and the synergistic effect of L-lysine and L-threonine was obtained only for the mutant AK plasmid-introduced strain. It was confirmed that the inhibition was released.
  • Table 1 shows the wild-type strain AJ12036 of Corynebacterium 'Gnoretamicum' (Breviva 'Cterium' Lactofamentum), the AJ12690 strain carrying the wild-type AK plasmid, and the AJ12691 strain carrying the mutant AK plasmid. Fig.
  • Example 5 shows the specific activity of aspartokinase in the cell lysate of Example 1 and the degree of synergistic inhibition by L-lysine and L-threonine.
  • the inhibitors L-lysine and L-threonine were each added to a final concentration of 1 mM.
  • the lysine-producing ability of the wild-type strain AJ12036, the wild-type AK plasmid-holding strain AJ12690, and the mutant AK-plasmid holding strain AJ1269KFERM-P12918) was evaluated by culture.
  • Culture evaluation is lysine Production medium (glucoside Ichisu 100g, (title 4) 2 S0 4 55g, KH 2 P0 4 lg, MgS0 4 ⁇ 7 ⁇ 2 0 ⁇ , soy protein acid hydrolyzate "Mameko" 50mUFeS04-7H 2 010nig.MnS04- 4H 2 0 10 mg, nicotinic acid Ami de 5Rag, and was inoculated in.
  • Table 2 shows corynebacterium glutamicum (brevibacterium lactofermentum) wild-type strain AJ12036, AJ12690 strain holding wild-type AK plasmid, and AJ12691 strain holding mutant-type AK plasmid.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the fermentative productivity of L-lysine of the strain and the retention of plasmid at the end of the culture.
  • a cell-free extract was prepared from the lever cells, and the enzyme activity of AK was measured.
  • various concentrations of lysine-threonine were added to the enzyme reaction solution, and the degree of inhibition was examined (Fig. 2).
  • mutant AK showed almost no improvement in the inhibition of lysine alone compared to the wild type, but the inhibition by threonine was 100% released, and it was further activated slightly.
  • Example 5 Preparation of AK Gene for Deactivating Inhibition of Corynebacterium glutamicum From Example 4, it was found that mutant AK was insufficiently released by lysine alone, so a mutation was introduced to improve this property. I decided to do it.
  • a method for producing the inhibition-released AK gene site-specific mutation was used, and the mutation point ( 279 Ala ⁇ Thr) shown in Example 2 was replaced with another amino acid residue.
  • a site-directed mutagenesis method for causing a target mutation at a target site a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology (Erlich, HA Eds., Stockton press (1989))) Methods used (Kramer, W. and Frits, HJeth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, TA et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • amino acid residues introduced by mutation 20 types of amino acids are classified according to their properties such as polarity and molecular structure, and 8 types are representative (Arg, Asp, Cys, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val). Table 3 shows the amino acid mutation and base substitution at each mutation point.
  • a single-stranded DNA having a sequence of 5′-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3 ′, a complementary single-stranded DNA thereof, a single-stranded DNA having a sequence of SEQ ID NO: 15 and a sequence of SEQ ID NO: 16 PCR was performed using the single-stranded DNA as a primer and P399AKY as type I.
  • Example 4 Giil06Ml was transformed with eight types of plasmids containing the respective mutant AK genes obtained in Example 5, cell-free extracts were prepared, and enzyme analysis was performed.
  • Table 4 shows the degree of inhibition release and the specific activity when 5 mM lysine, 5 mM threonine, 5 mM lysine + 5 mM threonine were added.
  • Figures 3, 4, and 5 graphically show the degree of inhibition release when lysine and threonine were added at different concentrations.
  • AK When changed to an acidic amino acid such as Asp, AK was inactivated, and when changed to any other amino acid, inhibition by threonine was released.
  • Other properties are roughly divided into four groups. Mutants similar to the mutant type (Thr) of Example 2 include mutants in which Val residue is introduced and mutants in which Arg residue is introduced. Cys residue-introduced mutants and Ser residue-introduced mutants showed the same inhibition of lysine alone as the wild type, but the concerted inhibition resulted in enhanced inhibition. This is probably because the behavior of threonine is activated at low concentrations, but is a characteristic characteristic of a mountain-shaped graph that is inhibited at high concentrations.
  • a strain was prepared by introducing eight types of plasmids shown in Table 3 into AJ12036 strain (FERM-P7559), which is a wild strain of Corynebacterium glutamicum (Breviba's Cterium lactofarmentum). AK activity was measured for the strain. As shown in Table 5, the AK specific activity of the strain into which each plasmid was introduced was increased by about 20 to 80 times as compared with the AK specific activity of the host.
  • the degree of inhibition by lysine and threonine was the same as in Example 6, and the highest degree of inhibition was by Pro residue-introduced mutant AK, which was inhibited by concerted inhibition by lysine alone, threonine alone or both. Harm release degree exceeded the Thr residue introduced mutant type AK ivy c Table 5 Further, the lysine-producing ability of these nine strains was evaluated by culture in the same manner as in Example 3. Table 6 shows the amount of lysine produced in the culture solution at each culture level. It can be seen that the introduction of the mutant AK plasmid significantly improved the L-lysine production ability.
  • mutations other than the mutants with the introduction of Cys residues and the mutants with the introduction of Ser residues showed a high accumulation of about 25 g / l.
  • the retention of plasmid at the end of the culture was almost 100%, indicating high stability of the plasmid.
  • Brevipacterium lactofermentum AK gene which is obtained by changing Ala at amino acid number 279 in SEQ ID NO: 3 or amino acid number 30 in SEQ ID NO: 5 to an amino acid other than acidic amino acid. Then, the inhibition by threonine was completely released, and as a result, AK in which the concerted inhibition by lysine + threonine was released was obtained. In particular, by changing the amino acid residue at the above position to Pro, AK in which the single inhibition by lysine was partially released was obtained. By changing this site to Val, Tyr, and Phe, AK with improved thermal stability was obtained. By increasing the activity of these mutant AKs in coryneform bacterial cells, L-lysine productivity could be significantly increased. Sequence Listing SEQ ID NO: 1
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Corynebacterium, Cuterium * ku, 'Rutamicam (Corynebacterium glutamicum)
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of distribution system J: genomic DNA
  • Organism name Corynebacterium glutamicum * Corynebacterium glutamicum
  • Organism Name Coryneha, 'Cterium ku,''Revenue micum (Corynebacterium glutamicum) Stock Name: ATCC13869
  • Glu Arg lie Arg Asn Val Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala
  • Val Ala Met Ala lie Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr
  • Lys lie Cys lie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
  • Organism name Corynebacterium, Cuterium * Cortamicum (Corynebacterium glutamicum) Strain name: AJ3463
  • Glu Arg lie Arg Asn Val Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala
  • Val Ala Met Ala lie Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr
  • Lys lie Cys l ie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
  • Organism name Corynebacterium glutamicum Strain name: ATCC13869
  • Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
  • Organism name Coryneha, 'Cterium-ku,' Rutamicam (Corynebacteriuni glutamicum) Strain name: AJ3463
  • Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of system IJ genomic DNA
  • Organism name Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum)
  • AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum
  • Sequence type nucleic acid
  • Distribution system ij type genomic awake
  • Organism name Corynebacterium, Cteridumuk, 'Rutamicum (Corynebacterium glutamicum)
  • GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC
  • GAG ACT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly He Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Corynebacterium glutamicum
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Corynebacteriuni, glutamicuin
  • AAAGAAACCC GCGATGTCAC CACGTTGGGT CGTGGTGGTT CTGACACCAC TGCAGTTGCG 480
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of system IJ genomic DNA
  • Organism name Corynebacterium, Corynebacterium glutamicuir
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of system IJ genomic DNA
  • Organism name Corynebacterium, Cteridum, 'Rutamicam (Corynebacterium glutamicum)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書 変異型ァスパルトキナーゼ遺伝子 技術分野
本発明は、 アミノ酸などの発酵生産に用 、られているコリネバクテリウム属細 菌由来の新規なァスパルトキナ一ゼ及び該酵素をコ一ドする D N A断片に関し、 また、 該 D N A断片を含有する組み換え D N Aに関する。 さらに本発明は、 該組 み換え D N Aを保有するコリネバクテリゥム属細菌に関し、 該微生物を培養する ことを特徴とする L—リジンの製造法に関する。 背景技術
飼料添加物として用いられている Lーリジンは通常、 コリネ型細菌の L—リジ ン生産変異株を使つて発酵法により生産されている。 現在知られている種々の L ―リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作られている。 この様 な人工変異株としては次の様なものがある。 S— ( 2—アミノエチル） —システ イン （以下、 AECと略記する） 耐性変異株、 その成長に L一ホモセリン等のアミ ノ酸を必要とする変異株 （特公昭 48- 28078号、 特公昭 56- 6499号） 、 AECに耐性を 示し、 更に L一口イシン、 L—ホモセリン、 L—プロリン、 L—セリン、 Lーァ ルギニン、 L—ァラニン、 L—パリン等のアミノ酸を要求する変異株 （米国特許 第 3708395号及び第 3825472号） 、 D L— α—ァミノ— ε—力プロラクタム、 α— アミノーラウリルラクタム、 ァスパラギン酸一アナログ、 スルファ剤、 キノイド 、 Ν—ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱 炭酸酵素 （デカルボキシラ一ゼ） または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示す L—リジ ン生産変異株 （特開昭 50- 53588号、 特開昭 50- 31093号、 特開昭 52- 102498号、 特 開昭 53- 9394号、 特開昭 53- 86089号、 特開昭 55- 9783号、 特開昭 55- 9759号、 特開 昭 56- 32995号、 特開昭 56- 39778号、 特公昭 53-43591号、 特公昭 53- 1833号） 、 ィ ノシトールまたは酢酸を要求する L—リジン生産変異株 （特開昭 55- 9784号、 特 開昭 56- 8692号） 、 フルォロピルビン酸または 34て以上の温度に対して感受性を 示す L一リジン生産変異株 （特開昭 55- 9783号、 特開昭 53- 86090号） 、 エチレン グリコールに耐性を示し、 Lーリジンを生産するブレビバクテリゥム属またはコ リネバクテリウム属の生産変異株 （米国特許出願第 333455号） 。
さらに、 先行技術には組み換えベクターを用いて形質転換されたェシヱリヒア •コリ株が開示され、 この株はアミノ酸の生産を増加する （米国特許第 4278765 号参照） 。
一方、 ブレビパクテリゥム属及びコリネバクテリゥム属においては菌体内で自 律増殖可能でかつ、 薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラスミ ド （米国 特許願第 386980号参照） 、 遺伝子の菌体への導入方法（特開平 2- 207791号等） が 開示されており、 これらの技術を用いた Lースレオニンまたは L一イソロイシン 生産菌育成の可能性が開示されている （米国特許願 376396号、 及び第 392145号参 照） 。 また、 L—リジン生産菌育成に関しても、 ベクタ一プラスミ ドに L—リジ ン生合成に関与する遺伝子を組み込み、 菌体内で増幅させる技術 （特開昭 56-160 997号などがある） があるが、 遺伝子をァスパルトキナ一ゼ （以下 A Kと記す） と特定し、 かつ、 L—リジンおよび Lースレオニンによるフィードバック阻害が 実質的に解除するような A K遺伝子上の変異点を明示し、 かつその変異が L—リ ジンの生産性と直接に関与することを明示した例はない。 また、 変異型 A K遺伝 子の記載がある例でも、 変異型 A K遺伝子を安定なプラスミ ドとして保持させる こと力、、でさていない (Cremer, J. et al ; Applied and Environmental Microbiolo gy, June 1991， p. 1746- 1752参照） 。
本発明の課題は、 コリネバクテリゥム属細菌の微生物中のリジン生合成の重要 な酵素である A Kを Lーリジン及び L -スレオニンによるフィードバック阻害、 さらにリジン単独によるフィードバック阻害を解除した性質のものに改質し、 か つその活性を上昇させることにより、 Lーリジンの生成 ·分泌速度が高まつたも のに改良することである。 発明の開示
本発明者らは鋭意研究の結果、 コリネバクテリゥム属細菌より変異型 A K遺伝 子を取得することに成功し、 本発明を完成させた。 すなわち本願発明は、 配列表 の配列番号 4記載のァミノ酸配列あるいは配列番号 4記載ァミノ酸配列の 279番 目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化した配列を 有する、 コリネバクテリウム属細菌由来であり Lーリジン及び L一スレオニンに よる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されるァスパルトキナーゼ αサ ブュニッ ト蛋白質及び該蛋白質をコードする D N A断片である。 また本願発明は 、 配列表の配列番号 6記載のァミノ酸配列ある t、は配列番号 6記載ァミノ酸配列 の 30番目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化した 配列を有する、 コリネバクテリウム属細菌由来であり Lーリジン及び Lースレオ ニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されるァスパルトキナ一 ゼ^サブュニット蛋白質及び該蛋白質をコ一ドする D N A断片である。
さらに本願発明は、 上記 D N A断片を含有し、 コリネバクテリウム属の微生物 中で複製可能な組み換え D N A、 及び該組み換え D N Aが、 コリネバクテリゥム 属の微生物に導入されて得られるァスバルトキナーゼ比活性が親株の 2— 2 0倍 に上昇し、 かつァスパルトキナ一ゼ活性の Lーリジン及び L—スレオニンによる 相乗的なフィードバック阻害あるいは L—リジン単独によるフィードバック阻害 が実質的に解除された形質転換体である。
本願発明は、 上記形質転換体を好適な培地にて培養し、 生じた L一リジンを分 離することを特徴とする Lーリジンの製造法である。
本発明にいうコリネバクテリゥム属の微生物とは、 バージ一ズ ·マニュアル · ォブ ·デタ一ミネィティブ ·バクテリオロジー (Bargeys Manual of Determinat ive Bacteriology) 第 8版 599頁 （1974) に定義されている一群の微生物であり、 好気性， グラム陽性， 非抗酸性， 胞子形成能を有しない桿菌である。 また本発明 にいうコリネノ クテリゥム属の微生物とは、 従来ブレビパクテリゥム属に分類さ れていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリゥム 属細菌を含み、 またコリネバクテリゥム属細菌と非常に近縁なブレビバグテリゥ ム属細菌を含む。 このようなコリネバクテリゥム属 （ブレビバクテリウム属） の 微生物のうち特に以下に述べるようなコリネバクテリゥム属 （ブレビバクテリウ ム属） のグルタミン酸生産性細菌が本発明においては、 最も好ましいものである 。 さらに、 ミクロバクテリゥム属細菌の中にもグルタミン酸を蓄積するものが知 られており、 これらも本願発明において使用可能である。
コリネバクテリゥム属 （ブレビパ、クテリウム属） のグルタミン酸生産性細菌の 野性株の例としては次のようなものがあげられる。
コリネバクテリゥム ·ァセトアンドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリゥム 'ァセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリゥム 'カルナェ ATCC 15991 コリネバクテリゥム 'グルタミクム ATCC 13032,
13060
(ブレビバクテリゥム ·ディバリカタム） ATCC 14020 (ブレビバ'クテリゥム ·ラクトフエノレメンタム） ATCC 13869 コリネパ'クテリウム リリゥム ATCC 15990 コリネパ 'クテリゥム メラセコーラ ATCC 17965 ブレビパ'クテリゥム サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバ'クテリゥム ィンマリオフィルム ATCC 14068 ブレビノ クテリゥム ロゼゥム ATCC 13825 ブレビパクテリゥム フラバム ATCC 13826 ブレビパクテリゥム チォゲ二タリス ATCC 1 9240 ミクロバクテリゥム アンモニアフィラム ATCC 15354 本発明のコリネバクテリゥム属 （ブレビバクテリゥム属） のグルタミン酸生産 性細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタミン 酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含まれる。
A K遺伝子を含む D N A断片の供与菌として野生株を用 L、た場合、 野生型の A K遺伝子を含む DN A断片が取得できる。 また、 L—リジン及び L—スレオニン による相乗的なフィ一ドバック阻害が実質的に解除された A K遺伝子を含む D N A断片を取得するには、 A K活性に対する Lーリジン及び L -スレオニンによる 相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除された変異株を用いることによって 取得することができる。 該変異株は、 例えば、 通常の変異処理法、 紫外線照射ま たは N—メチルー N' —二トロー N—二トロソグァ二ジン （NTG) 等の変異剤 処理を施した細胞群の中から取得することができる。 AK活性の測定は、 Miyaji ma,R et al;The Journal of BiochemistryC 1968)63(2), 139- 148に記載される方 法を用いることができる。
AK遺伝子を含む DNA断片の供与菌としては、 コリネバクテリゥム ·グルタ ミカム （ブレビバクテリゥム .ラクトフアーメンタム）野生株 ATCC13869及び ATC C13869株より変異処理により誘導された L一リジン生産菌 AJ3463 (FERMP-1987) が最も好ましし、供与菌である。 これらの菌の染色体 D N Aより野生型 A K遺伝子 、 及び L—リジン及び L -スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質 的に解除されたァスパルトキナ一ゼをコ一ドする遺伝子 （以下変異型 AK遺伝子 と記す） を分離し、 コリネパクテリゥム属 （ブレビバクテリウム属） 細菌中で自 律増殖可能なベクターに連結し、 コリネバクテリゥム属 （ブレビバクテリゥム属 ) 細菌細胞に導入する。
A K遺伝子を単離する方法は、 コリネバクテリウム属細菌の A K遺伝子を有し ている株より、 まず染色体遺伝子を抽出し （例えば H.Saito and K. Miura Bioch em. Biophys. Acta ! ,619, (1963)の方法が使用できる。 ） 、 これを適当な制限酵 素で切断する。 ついで、 コリネパクテリゥム属細菌細胞内で増殖し得るベクタ一 に接続し、 得られた組み換えベクターを用いてコリネバクテリゥム属の微生物の A K欠損変異株を形質転換せしめ、 A K生成活性を保有するにいたつた菌株を単 離し、 これより AK遺伝子を分離できる。 A K欠損変異株の誘導方法は、 上記 A K活性に対する L—リジン及び L—スレオニンによる相乗的なフィ一ドバック阻 害が実質的に解除された変異株の誘導方法と同様にして行うことができる。
染色体遺伝子を切断するために、 切断反応時間等を調節して切断の程度を調節 すれば、 幅広い種類の制限酵素が使用できる。
本発明にて使用されうるベクターは、 コリネバクテリゥム属細菌細胞内におい て増殖し得るものであればどのようなものでも良い。 具体的に例示すれば、 以下 のものがあげられる。
(1) pAM 330 特開昭 58— 67699参照
(2) pHM 1519 特開昭 58— 77895参照
(3) pAJ 655 特開昭 58— 192900参照
(4) p A J 611 同 上 (5) pAJ 1844 同 上
(6) p CG 1 特開昭 57— 1 34500参照
(7) p CG 2 特開昭 58 - 351 97参照
(8) p CG 4 特開昭 57 - 183799参照
(9) p CG 1 1 同 上
ベクターの開裂は、 当該 DN Aを一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する か、 複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的に切断することにより行う。 ベクターは、 染色体遺伝子を切断した際に用いられた制限酵素により切断され 、 または染色体 DNA切断フラグメント及び切断されたベクターのそれぞれの両 端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、 ついでべク ターと染色体 DNAフラグメントとのライゲ一シヨン反応に付される。
このようにして得られた、 染色体 D N Aとべクタ一とが連結された組み換え D N Aをコリネバクテリウム属細菌に属する受容菌へ導入するには、 ェシエリヒア 'コリ K— 12について報告されている様な (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol.， Bi ol. , 53- 159(1970)) 受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を増 す方法、 またはバチルス ·ズブチリスについて報告されている様に （Duncan, C. H.， Wilson, G. A. and Young, F. E. , Gene, 1, 153(1977)) 細胞が D N Aを取り込み得る様 に増殖段階 （いわゆるコンビテントセル） に導入する方法により可能である。 あ るいは、 バチルス 'ズプチリス、 放線菌類および酵母について知られている様に (Chang, S. and Choen, S. N. , Molec. Gen.， Genet. , 168· 111(1979)； Bibb, M. J.， Ward, J. M. and Hopwood, 0. A. , Nature, 274.398(1978) ;Hinnen, A. , Hicks, J. B. and Fink, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929(1978))、 DNA受容菌を、 組み換え DNA を容易に取り込むプロトプラストまたはスフ 口プラス卜にして組み換え DNA を D N A受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス ·ズブチリスにおいて使用されている方 法でも充分高 、頻度を得ることができるし、 特開昭 57— 183799に記載さ れたコリネバクテリウム属のプロトプラストにポリェチレングリコールまたはポ リビニルアルコールと二価金属ィオンとの存在下に DNAをとり込ませる方法も 当然利用できる。 ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに 、 カルボキシメチルセルロース、 デキストラン、 フイコール、 ブノレ口ニック F 6 8 (セルバ社） などの添加によって D N Aのとり込みを促進させる方法でも同等 の結果が得られる。
あるいは A K遺伝子の取得は、 上記のようにして取得された染色体 D N Aより PCR (polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends Genet. 5, 185(19 89)参照） により A K遺伝子を増幅することによつても行える。 増幅に用いる D N Aプライマーは A K遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有する D N A二重鎖 の両 3'末端に相補するものを用いる。 A K遺伝子の一部領域だけを増幅した場合 には、 該領域の D N A断片をプライマーとして用い、 全領域を含む D N A断片を 増幅することにより遺伝子ライブラリーよりスクリ一二ングする必要がある。 全 領域を増幅した場合には、 該 D N A断片をァガロースゲル電気泳動に供した後、 目的のバンドを切り出すことによって A K遺伝子を含有する D N A断片を回収で さる。
D N Aプライマ一としては、 例えば、 コリネバクテリゥム ·グルタミカム （Co rynebacteriura glutamicum) (こお！/ゝて既知となって (/ヽる配歹 U (Molecular icrob iology(1991)5(5), 1197-1204, ol. Gen. Genet. (1990) ， 317- 324参照) を基に して、 A K遺伝子をコードする約 1643bpの領域を増幅すべく、 5' -TCGCGAAGTAGCA CCTGTCACTT- 3'と 5' -ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3'という配列の 23mer及び 21merの一 本鎖 D N Aが最適である。 D N Aの合成は Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 380Bを使用し、 ホスホアミダイド法を用いて （Tetrahedron Letters (198 1), ，1859参照） 常法に従って合成できる。 PCR反応は、 宝酒造 （株） 製 MAサ —マルサイクラ一 PJ2000型を用い、 TaqDNAポリメラーゼを用い、 供給者により 指定された方法に従って行うことができる。
増幅された A K遺伝子は、 上記したようなコリネパクテリゥム属細菌細胞内に おいて増殖し得るベクターに接続され、 上記したような方法でコリネバクテリウ 厶属細菌細胞に導入される。
リジンを生産するために、 取得された A K遺伝子が導入され増幅される宿主と しては、 上記したコリネバクテリゥム属グルタミン酸生産性細菌の野生株があげ られるが、 これ以外にも、 ここで構築した組み換え D N Aの複製起点と変異型 A K遺伝子が機能し、 組み換え D Ν Αが複製可能でかつ変異型 A K活性の増強が可 能な菌なら、 全て宿主として利用できる。 最も好ましい宿主は、 コリネパクテリ ゥム ·グルタミカム （ブレビバクテリゥム ·ラクトファ一メンタム） 野生型株で ある AJ12036株 （FERM- P7559) である。
以上の方法で取得した、 Lーリジン及び L—スレオニンによる相乗的なフィー ドバック阻害が実質的に解除されたァスパルトキナ一ゼをコ一ドする遺伝子を含 有する組み換え D N Aを保有する形質転換体を培養し、 培養液に目的の L—リジ ンを生成蓄積せしめ、 これを採取した。
使用する L—リジン生産用の培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に 応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、 グルコース、 ラクトース、 ガラクトース、 フラク卜ースやで んぶんの加水分解物などの糖類、 グリセ口一ルゃソルビトールなどのアルコール 類、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム 等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 ァ ンモニァ水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、 ビタミン B l、 L—ホモセリンなどの要求物質また は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。 これらの他に、 必要に応じて 、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加 される。
培養は好気的条件下で 1 6〜 7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 3 0 〜 4 5 に、 培養中 p Hは 5〜7に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有機 の酸性あるいはアル力リ性物質、 更にアンモニアガス等を使用することができる 。 発酵液からの芳香族アミノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、 沈澱法その他の 公知の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 染色体より P C Rにて増幅された A K遺伝子断片より p399AKY、 p399A KY、 更にコリネパクテリゥム属細菌中でプラスミ ドを自律増殖可能にする能力を もつ D N A断片 （Coryne. -ori) を導入して p399AKYB、 p399AK9Bを構築する過程を 示したものである。 p399AK9Bは P399AKYBと一塩基の違いがある他は全く同様な過 程を経て構築されているので、 一緒に 〇 付きで示した。
図 2は野生型と変異型 （Thr) A Kのリジン、 スレオニン、 リジン +スレオニン による阻害について調べたものである。 リジン、 スレオニン無添加時の活性を 100%とし、 添加時の活性を活性保持率 （阻害解除度） として表わした。
図 3は野生型および変異型 8種の A Kのリジンによる阻害の解除度につ 、て調 ベたものである。
図 4は野生型および変異型 8種の A Kのスレオニンによる阻害の解除度につ ヽ て調べたものである。
図 5は野生型および変異型 8種の A Kのリジン +スレオニンによる協奏阻害の 解除度につ 、て調べたものである。
図 6は野生型および変異型 8種の A Kの熱安定性について調べたものである。
55 、 90分処理後の活性保持率を％で表わした。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づき、 発明の内容を詳細に説明する。
実施例 1 野生型及び変異型 A K遺伝子の取得とコリネバクテリゥム用プラス ミ ドの作製 コリネノくクテリゥム ·グルタミカム （ブレビパ、クテリゥム 'ラクトフアーメン タム） 野生株 ATCC13869株、 及びそれより変異処理により得られた L一リジン生 産性変異株 AJ3463 (FERM P-1987) より常法に従い、 染色体 DNAを調製した。 染色 体醒より PCR (polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends Genet.
5, 185(1989)参照） により A K遺伝子を増幅した。 増幅に用いた MAプライマー はコリネノ クテリゥム ·グルタミカムにおいて既知となっている配列 (Molecula r Microbiology(1991)5(5), 1197-蘭, Mol. Gen. Genet. (1990)224, 317- 324参照 ) を基にして A K遺伝子をコードする約 1643bpの領域を増幅すべく、 5' - TCGCGAA GTAGCACCTGTCACTT-3" (配列番号 1 5 ) と 5' -ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3' (配列番 号 1 6 ) という配列の 23mer及び 21merの一本鎖 D N Aを合成した。 D N Aの合成 は Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 380Bを使用し、 ホスホアミダイ ド法を用いて （Tetrahedron 1^1^ （1981)，2，1859参照） 常法に従って合成し た。 PCR反応は、 宝酒造 （株） 製 D N Aサ一マルサイクラ一 PJ2000型を用い、 Ta QDNAポリメラ一ゼを用 t、、 供給者により指定された方法に従つて遺伝子増幅を行 なった。 増幅された 1643kbの遺伝子断片をァガ口ースゲル電気泳動により確認し た後、 ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、 制限酵素 Nrul (宝酒造 (株
) 製） 及び EcoRI (宝酒造 （株） 製） にて切断した。 遺伝子断片のクローン化用 ベクターには PHSG399 (Takeshita, S ^i;Gene(1987)， 63- 74参照） を用い た。 pHSG399を制限酵素 Smal (宝酒造 （株） 製） 及び制限酵素 EcoRIにて切断し 、 増幅された A K遺伝子断片と接続した。 D N Aの接続は D N Aライゲーシヨン キッ 卜 （宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なった。 この様にして PHSG399にブレピノ クテリウム染色体より増幅された A K遺伝子断片が接続された プラスミ ドを作製した。 野生株である ATCC13869由来の A K遺伝子を有するブラ スミ ドを p399AKY、 L一リジン生産菌である AJ3463由来の A K遺伝子を有するプ ラスミ ドを P399AK9と命名した。
p399AKY、 p399AK9に、 それぞれコリネバクテリゥム属細菌中でプラスミ ドを自 律増殖可能にする能力をもつ D N A断片 （以下 Coryne. - oriと記す） を導入し、 コリネバクテリゥム属細菌中で自律複製可能な A K遺伝子を搭載したブラスミ ド を作製した。 Coryne. -oriを取得するために、 ェシヱリヒア ·コリと、 コリネバ クテリゥム属細菌の双方の菌体中で自律増殖可能なプラスミ ドベクター pHK4を作 成した。 ェシエリヒア ·コリとコリネバクテリゥム属細菌中の双方で自律増殖可 能なプラスミ ドベクターは、 いくつか報告がある。 ここでは、 pAJ1844(特開昭 58 - 216199参照）と、 pHSG298(S. Takeshita et l ： Gene 61, 63- 74(1987)参照）から 、 新規のシャトルべクタ一 pHK4を構築した。 PAJ1844を制限酵素 Sau3AIで部分切 断し、 制限酵素 BamHIで完全切断した PHSG298と連結した。 連結後の D N Aをコリ ネ /くクテリゥム ·グノレタミカム （ブレビパ'クテリゥム 'ラク トファーメンタム） AJ12036(FERM-P7559)に形質転換した。 形質転換の方法は、 電気パルス法 (特開平 2-207791参照)を用いた。 形質転換体の選択は、 カナマイシン 25 g/mlを含む M- C M2Gプレート（グルコース 5g、ポリペプトン 10g、酵母エキス 10g、NaC15g、DL-メチォ ニン 0. 2g、寒天 15gを純水 11に含む。 pH7. 2)にて行った。 形質転換体からプラスミ ドを調製し、 大きさの最も小さいものを選択し、 pHK4と命名した。 このプラスミ ドは、 ェシヱリヒア ·コリと、 コリネバクテリゥム属細菌中で自律増殖でき、 宿 主にカナマイシン耐性を付与する。
PHK4を制限酵素 Kpnl (宝酒造 （株） 製） にて切断し、 切断面を平滑末端化した c 平滑末端化は DM Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて 行なった。 平滑末端化後、 リン酸化済み BamHIリンカー （宝酒造 （株）製） を 接 続し、 pHK4より Coryne. - ori部分の DNA断片を BamHIのみによる切断によって切 り 出される様改変した。 このプラスミ ドを BamHIにより切断し、 生じた Coryne. -ori D N A断片を同じく BamHIにて切断した p399AKY、 p399AK9に接続し、 コリネバ ク テリゥム属細菌中で自律増殖可能でかつ A K遺伝子を含むプラスミ ドを作製した。 P399AKY由来の野生型 A K遺伝子を含むプラスミ ドを p399AKYBと命名し、 p399AK9 由来の変異型 A K遺伝子を含むプラスミ ドを p399AK9Bと命名した。 p399AK9B 、 p399AKYB構築の過程を図 1に示す。 コリネバクテリウム ·グルタミカム （ブレ ビバ、クテリゥム ·ラクトファーメンタム） 野生型株である AJ 12036株 （FERM- P755 9) に変異型 A Kプラスミ ド P399AK9Bを導入した株 AJ12691は、 受託番号 (FERM- P1 2918)が付与され通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 実施例 2 コリネパ 'クテリゥム ·グルタミカムの野生型 A K及び変異型 A K 遺伝子の塩基配列の決定
野生型 A K遺伝子を含むプラスミ ド P399AKY及び変異型 A K遺伝子を含むブラ スミ ド P399AK9を調製し、 野生型及び変異型 A K遺伝子の塩基配列の決定を行な つた。 塩基配列の決定はサンガーらの方法 （F. Sanger et al ： Proc. Natl. Acad. S ci. !45463(1977)などがある） によった。 p399AKYにコードされている野生型 A K遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 1に、 P399AK9にコードされている変異 型 A K遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 2に記す。 変異型 A K遺伝子は野生 型 A Kと比べ、 1 0 5 1番目の Gが Aに変化しているという 1塩基の変異のみを 有する。 A K遺伝子は、 同一の D N A鎖に α、 の 2本のサブユニットが同一の リーディングフレームでコ一ドされていることが知られているが （Kalinowski, J et al ! olecular Microbiology(1991) 5), 1197- 1204参照) 、 相同性から判断 して本遺伝子も同一の D N A鎖に a、 y3の 2本のサブュニッ 卜が同一のリ一ディ ングフレームでコードされていると考えられる。
D N A塩基配列より推定される野生型 A K蛋白質の αサブュニッ卜のアミノ酸 配列を配列表の配列番号 3に、 ^サブュニットのァミノ酸配列を配列表の配列番 号 5に示す。 D N Α配列とアミノ酸配列を同時に示したものとしては、 αサブュ ニットは配列表の配列番号 7に、 ^サブュニットは配列表の配列番号 9に示す。
各サブュニッ卜のオープンリーディングフレーム部の塩基配列を配列表の配 列番号 1 1、 1 3に示す。
同様に D N Α塩基配列より推定される変異型 Α Κ蛋白質の αサブュニッ トのァ ミノ酸配列を配列表の配列番号 4に、 βサブュニ 卜のァミノ酸配列を配列表の 配列番号 6に示す。 D N A配列とアミノ酸配列を同時に示したものとしては、 a サブュニッ 卜は配列表の配列番号 8に、 βサブュニットは配列表の配列番号 1 0 に示す
。 α ^各サブュニッ卜のオープンリ一ディングフレーム部の塩基配列を配列表の 配列番号 1 2、 1 4に示す。
尚、 各サブユニットとも、 開始コドンに G T Gが用いられており、 対応するァ ミノ酸をメチォニンと表記しているが、 これは、 メチォニン、 《リン、 またはフ オルミルメチォニンを表すものである。 変異型 A Κ遺伝子の変異点は、 変異型 A K蛋白質がアミノ酸配列において、 αサブュニットにおいて 2 7 9番目のァラニ ンがスレオニンに、 βサブュニットにおいて 3 0番目のァラニンがスレオニンに というアミノ酸置換を起こしていることを意味する。 実施例 3 コリネバクテリゥム ·グルタミカム野生株における変異型 Α Κと 野生型 A Κプラスミ ドの導入による L—リジン生産能への効果 コリネバクテリゥム ·グルタミカム （ブレビバクテリゥム 'ラクトファーメン タム） 野生型株である AJ12036株 （FERM- P7559) に野生型 A Kプラスミ ド p399AKY B及び変異型 A Kプラスミ ド p399AK9Bを各々導入した株を作製した。 コリネバク テリゥムへの遺伝子導入は、 電気パルス法によった。 宿主のコリネバクテリゥム •グルタミカム （ブレビバクテリゥム ·ラクトファ一メンタム） AJ12036株、 野 生型 A Kプラスミ ドを保持する AJ12690株および、 変異型 A Kプラスミ ドを保持 する AJ12691(FERM- P12918)株のァスバルトキナーゼ活性を測定した。 活性測定は 、 常法に従った (Miyaj ima, R et al ;The Journal of BiocheraistryC 1968)63(2), 139- 148参照） 。 表 1に示す様に A Kプラスミ ド導入により A Kの比活性が約 1 0〜1 5倍に増大していること、 及び変異型 A Kプラスミ ド導入株についてのみ 、 L—リジン及び L—スレオニンによる相乗阻害が解除していることを確認した 。 表 1は、 コリネバクテリゥム 'グノレタミカム （ブレビバ'クテリゥム 'ラクトフ アーメンタム） 野生型株 AJ12036株、 及びそれに野生型 A Kプラスミ ドを保持さ せた AJ12690株、 変異型 A Kプラスミ ドを保持させた AJ12691株の菌体破砕液のァ スバルトキナーゼ比活性、 及びその L—リジン及び Lースレオニンによる相乗阻 害の程度を表わしたものである。 阻害剤の L—リジン、 及び Lースレオニンは各 々最終濃度 1 mMとなるよう添加した。
Figure imgf000015_0001
野生株 AJ12036、 野生型 A Kプラスミ ド保持株 AJ12690、 変異型 A Kプラスミ ド 保持株 AJ1269KFERM- P12918)のリジン生産能を培養評価した。 培養評価はリジン 生産培地（グルコ一ス 100g、（題 4 )2S0455g、KH2P04 lg、MgS04 ·7Η20^、大豆蛋白酸加 水分解物 「豆濃」 50mUFeS04-7H2010nig.MnS04-4H20 10mg、ニコチン酸アミ ド 5rag、 及び CaC0350gを純水 11に含む。 pH8.0 )に植菌し、 31.5 にて 72時間往復振とう 培養しておこなった。 培養後の培養液中のリジン生成量は表 2に示す通りである 。 変異型 AKプラスミ ド導入株により、 L—リジン生産能が著しく向上している ことがわかる。 また、 培養終了時のプラスミ ド保持率をプラスミ ドの薬剤耐性マ 一力一であるクロラムフヱニコールの耐性を指標にして測定したが、 ほぼ 1 00 %と極めて高いプラスミ ドの安定性を示した （表 2) 。 表 2は、 コリネバクテリ ゥム ·グルタミカム （ブレビバクテリゥム ·ラクトファーメンタム） 野生型株 AJ 12036株、 及びそれに野生型 AKプラスミ ドを保持させた AJ12690株、 変異型 AK プラスミ ドを保持させた AJ12691株の L—リジンの発酵生産能、 及び培養終了時 のプラスミ ド保持率を測定した結果である。
菌株 Lys蓄積量 (g/1) プ ラ ス ミ ド保持率 （％ )
AJ 12036 0
AJ12690 2 100
AJ 12691 25 98 はデータ無 し 実施例 4 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカムの野生型 A K及び変異型 A K の酵素解析
A Kの酵素活性を測定、 評価するにあたり、 宿主としてェシヱリヒア .コリの A K完全欠損株 Gifl06Ml を用いた (Boy, E and Patte, J. C. , J. Bacteriol. 112, 84-92 (1972), Theze, J. et al. , J. Bacteriol.117, 133-143 (1974)) 。 コリネバクテリゥム属細菌には A K欠損株が無いために、 宿主の A Kとプラス ミ ド由来の A Kが混在してしまい、 正確に測定できないと考えられたためである 。 多くのコリネバクテリゥム属細菌の遺伝子はェシヱリヒア ·コリ中で発現する ことが知られており、 またこの A K遺伝子は pHSG399上の lac プロモーター下 流に連結されているため、 ェシヱリヒア，コリ中で発現可能であると予想された まず Gifl06Ml を実施例 1で作製した p399AKY、 p399AK9 で形質転換し、 以下 に示す最少培地 M9 での生育を相補することを確認した。 これによりコリネバク テリゥム属細菌の A Kがェシェリヒア ·コリ菌体中で発現、 機能することを確認 した。
最少培地 M9
A 20 M9 (g/L)
Na2HP0412H20 303
KH2P04 60
NaCl 10
Figure imgf000017_0001
B 1M MgS04
C 50% Glucose
D lg/L Thiamine
別々に滅菌し、 A： B C ： D ：水 = 5:0. 1 : 1 :0. 1 :95 の割合で混合 する。
続 t、てこの菌体より無細胞抽出液を調製し、 A Kの酵素活性を測定した。 A Kの酵素活性を測定する際、 酵素反応液中に種々の濃度のリジンゃスレオニ ンを加え、 阻害の度合を調べた （図 2 ) 。 その結果、 変異型 A Kは、 リジン単独 の阻害は野生型に比べほとんど改善がみられな t、が、 スレオニンによる阻害は、 100% 解除され、 さらに若干活性化すること、 このスレオニンによる阻害解除 の結果、 リジン +スレオニンの協奏阻害が緩和されていることがわかった （ Ki 値 0. 4mM― 5. OmM ) 。 実施例 5 コリネバクテリゥム ·グルタミカムの阻害解除型 A K遺伝子の作製 実施例 4より変異型 A Kはリジンによる単独阻害の解除が不十分であることが 判明したため、 変異を導入しこの性質の改良を行うことにした。
阻害解除型 A K遺伝子の作製方法としては、 部位特異的変異を用い、 実施例 2 で示した変異点 （279Ala→Thr) を他のアミノ酸残基に置換することにした。 目的 部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては P C Rを用いる方法 (Higu chi, R. , 61, in PCR technology (Erlich, H. A. Eds. , Stockton press(1989)))、 ファ —ジを用いる方法 (Kramer, W. and Frits, H. J. eth. in Enzymol. , 154， 350(1987) ； Kunkel, T. A. et al. , Meth. in Enzymol.， 154, 367(1987))などがある。
変異によって導入されるアミノ酸残基の種類としては、 20種類のアミノ酸を極 性や分子構造などの各々の性質により分類し、 代表的なもの 8種 (Arg, Asp, Cys, P he, Pro, Ser, Tyr, Val)を選んだ。 各々の変異点のァミノ酸変異、 及び塩基置換を表 3に示す。
(本頁以下余白）
卜 CO
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
変異の導入方法としては、 変異が導入される 279番目の Ala残基のコドンを目的 のァミノ酸残基のコドンに置換した 23nierの合成 D N A 8種を考案し (Arg導入用 合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3" ：配列番号 1 7、 As 導入用合 成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG GAT GCCAAGGTTT-3' ：配列番号 1 8、 Cys導入用合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG TGT GCCAAGGTTT-3' ：配列番号 1 9、 Phe導入用合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG TTT GCCAAGGTTT-3' ：配列番号 2 0、 Pro導入用合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG CCT GCCAAGGTTT-3' ：配列番号 2 1、 Ser導入用合成 D N A は 5' -GCCAGGCGAG TCT GCCAAGGTTT-3* ：配列番号 2 2、 Tyr導入用合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG TAT GCCAAGGTTT-3' ：配列番号 2 3、 Val 導入用合成 D N Aは 5' -GCCAGGCGAG GTT GCCAAGGTTT-3* ：配列番号 2 4である) 、 その相補配列と併せ て 1 6種類の 23mer—本鎖 D N Aを合成した。 たとえば Arg残基を導入する場合 、 5' -GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT- 3'なる配列を有する一本鎖 D N A、 その相補 鎖一本鎖 D N A、 配列番号 1 5の配列を有する一本鎖 D N A、 及び配列番号 1 6 の配列を有する一本鎖 D N Aをプライマーとし、 P399AKYを铸型にして PCR法を 行った。 非特異的変異の導入を除くため、 作製された D N Aから変異点を含む約 280塩基対を制限酵素 (Nael -Avai l) を用いて切り出し、 p399AKY の該当部位と 置換した。 置換した領域につ t、ては塩基配列の確認を行った。 実施例 6 変異型 A K遺伝子 8種の酵素解析
実施例 4と同様の方法により、 Giil06Ml を実施例 5で得られた各変異型 A K 遺伝子を含むプラスミ ド 8種で形質転換し、 無細胞抽出液を調製し、 酵素解析を 行った。 表 4にリジン 5mM、 スレオニン 5mM、 リジン 5mM+スレオニン 5mM添 加時の阻害解除度、 比活性を示す。 図 3、 図 4、 図 5にリジン、 スレオニン各濃 度添加時の阻害解除度をグラフで示す。
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
Asp のような酸性アミノ酸に変化させた場合は A Kは失活したカ、 その他のい ずれのァミノ酸に変化させた場合もスレオニンによる阻害は解除された。 それ以 外の性質についてはほぼ 4つのグループに分けられ、 実施例 2の変異型 （Thr) に類似した変異としては Val残基導入変異株、 Arg残基導入変異株がある。 Cys 残基導入変異株、 Ser残基導入変異株はリジン単独の阻害は野生型と同等であ るが、 協奏阻害になると阻害が強化される結果となった。 これはスレオニンに対 する挙動が、 低濃度では活性化されるが、 高濃度になると阻害を受ける山型のグ ラフとなる特徴的な性質であるために協奏阻害が強化したと考えられる。 芳香族 ァミノ酸である Phe残基導入変異株、 Tyr残基導入変異株のリジン単独の阻害 は野生型よりも強化された。 Pro は立体構造に与える影響が大きいためか Pro残 基導入変異株は比活性が低いが （野生型の約 1/5 ) 、 リジンの単独阻害は緩和 しており、 スレオニンによる活性化の度合も大きくなつている （120% 以上） 。 そのため協奏阻害も解除された。
変異導入によってできた酵素の構造の安定性の指標として、 熱安定性の検討を 行なった。 処理条件は野生型 A Kの活性が約 80% になる 55 1. 5 時間に設定 した。 Cys残基導入変異株、 Thr残基導入変異株、 Phe残基導入変異株、 Tyr残 基導入変異株、 Val残基導入変異株は野生型よりも安定性が高く、 中でも最も安 定性の高いもは Val 残基導入変異株であった （図 6 ) 。 実施例 7 コリネパ 'クテリゥム ·グルタミカム野生株における変異型
A K遺伝子 8種と野生型 A K遺伝子含有プラスミ ドの導入 による Lーリジン生産能への効果
実施例 3と同様にコリネバクテリウム ·グルタミカム （ブレビバ'クテリウム ラクトフアーメンタム） 野生株である AJ12036株 （FERM-P7559) に表 3に示す 8 種のプラスミ ドを導入した株を作製し、 それぞれの株について A K活性を測定し た。 表 5に示すように、 各プラスミ ドを導入した株の A K比活性は宿主の A K比 活性に比べて約 20〜80倍に増大した。 リジン、 スレオニンによる阻害解除度は実 施例 6と同様であり、 もっとも阻害解除度の高いものは Pro残基導入変異型 A K であり、 リジン単独、 スレオニン単独、 両方による協奏阻害いずれにおいても阻 害解除度は Thr残基導入変異型 A Kを上回つた c 表 5
Figure imgf000023_0001
さらにこれらの 9種の株について実施例 3と同様の方法でリジン生産能を培養 評価した。 培養度の培養液中のリジン生成量は表 6に示す通りである。 変異型 A Kプラスミ ド導入により Lーリジン生産能が著しく向上していることがわかる。 特に Cys 残基導入変異株、 Ser残基導入変異株以外の変異では約 25g/lの高い 蓄積を示した。 また培養終了時のプラスミ ド保持率もほぼ 100%と高いプラスミ ドの安定性を示した。
表 6
Figure imgf000024_0001
産業上の利用可能性
ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタムの A K遺伝子であって、 配列番号 3のアミノ酸番号にして 279位または配列番号 5のアミノ酸番号にして 3 0位 の Ala を酸性アミノ酸以外のアミノ酸に変化させることにより、 スレオニンに よる阻害が完全に解除し、 その結果リジン +スレオニンによる協奏阻害の解除さ れた A Kを取得した。 特に上記位置のアミノ酸残基を Pro に変化させることによ り、 リジンによる単独阻害が部分的に解除された A Kを取得した。 同部位を Val、 Tyr, Phe に変化させる ことにより、 熱安定性が向上した A Kを取得した。 コリ ネ型細菌細胞中でこれら変異型 A Kの活性を増大させることにより、 Lーリジン の生産性を著しく上昇させることができた。 配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic應
起源
生物名 ：コリネハ、、クテリウム*ク、'ルタミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名 ： ATCC 13869
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620
CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号： 2
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹' Jの種類： genomic DNA
起源
生物名 ：コリネハ クテリゥム *ク-ルタミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名 ： AJ3463
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960
CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020
GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG ACTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620
CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号： 3
配列の長さ ： 421
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ：コリネハ、'クテリゥム ·ク、'ル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum) 株名： ATCC13869
配列
Met Ala Leu Val Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg lie Arg Asn Val Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg l ie Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80
Val Ala Met Ala lie Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110 l ie Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys lie Cys lie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg lie Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205 Ser Lys l ie Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg V l Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240
He Ala Gly Ser Met Glu Asp l ie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly lie
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu lie Asn lie Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320
Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn l ie Glu Leu lie Ser Thr Ser Glu l ie Arg
370 375 380
l ie Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420 配列番号： 4
配列の長さ ： 421
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ：コリネハ、、クテリウム*ク ルタミカム (Corynebacterium glutamicum) 株名： AJ3463
配列
Met Ala Leu Val Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg lie Arg Asn Val Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg l ie Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80
Val Ala Met Ala lie Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110 l ie Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys lie Cys l ie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp V l Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg lie Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys lie Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 lie Ala Gly Ser Met Glu Asp l ie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly lie
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu lie Asn lie Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320
Arg Ala Met Glu He Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn l ie Glu Leu lie Ser Thr Ser Glu l ie Arg 370 375 380 I le Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420 配列番号： 5
配列の長さ ： 172
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ：コリネハ クテリウム-ク "ルタミカム (Corynebacterium glutamicum) 株名： ATCC13869
配列
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn lie Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95 Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn l ie Glu Leu
115 120 125 lie Ser Thr Ser Glu l ie Arg lie Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly 145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170 配列番号： 6
配列の長さ ： 172
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ：コリネハ、 'クテリウム-ク、'ルタミカム（Corynebacteriuni glutamicum) 株名 ： AJ3463
配列
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly l ie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn lie Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie Thr Phe Thr 50 55 60 P
-32-
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn He Glu Leu
115 120 125
lie Ser Thr Ser Glu lie Arg lie Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly 145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170 配列番号： 7
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic DNA
起源
生物名：コリ本ハ-'クテリウム*ク、、ル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名： ATCC13869
配列の特徴： mat peptide
存在位置： 217. . 1482
特徴を決定した方法： S
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234
Met Ala Leu Val Val Gin
1 5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg l ie Arg Asn Val
10 15 20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
25 30 35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg lie Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala lie Glu
75 80 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg lie Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys lie Cys lie Val Ala
120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg l ie Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys l ie Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu lie Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp lie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn lie Asp
280 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie
295 300 305 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu lie Leu
315 320 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
330 335 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 lie Glu Leu lie Ser Thr Ser Glu l ie Arg lie Ser Val Leu lie Arg
375 380 385 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin
395 400 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
410 415 420 421
AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 P T/JP /
- 36-
TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 配列番号： 8
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic醒
起源
生物名：コリネハ、、ク ίリウム 'ク"ルタミカム（Corynebacterium glutamicum)
株名： AJ3463
配列の特徴： mat peptide
存在位置： 217. . 1482
特徴を決定した方法： S
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234
Met Ala Leu Val Val Gin
1 5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg He Arg Asn Val
10 15 20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg lie Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg lie Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala l ie Glu
75 80 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg lie Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys lie Cys lie Val Ala
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810
Asp Pro Arg lie Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys l ie Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu lie Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002
Asp l ie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly l ie Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275
ACT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098
Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn He Asp
280 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146
Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie
295 300 305 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu l ie Leu
315 320 325 mm
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6： 骤 31
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-6ε-
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OS AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu lie Asn l ie Asp Met Val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys
65 70 75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val
80 85 90 95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn lie Glu
115 120 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu lie Ser Thr Ser Glu He Arg l ie Ser Val Leu He Arg Glu Asp
130 135 140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly
145 150 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170 172
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号： 10
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 ijの種類： genomic醒
起源
生物名：コリネハ、、クテリゥム ク、'ルタミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名： AJ3463
配列の特徴： mat peptide
存在位置： 964. · 1482
特徴を決定した方法： S
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
1 5 10 15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG ACT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly He Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala
20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu lie Asn l ie Asp Met Val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu l ie Leu Lys Lys
65 70 75 -
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val
80 85 90 95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn lie Glu
115 120 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu lie Ser Thr Ser Glu lie Arg l ie Ser Val Leu l ie Arg Glu Asp
130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly
145 150 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170 172
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号： 11
配列の長さ ： 1263
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状配列の種類： genomic DNA
起源
生物名 ：コリ本ハ'、クテリゥム 'ノ ルタミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名： ATCC 13869
配列
GTGGCCCTGG TCGTACAGAA ATATGGCGGT TCCTCGCTTG AGAGTGCGGA ACGCATTAGA 60 AACGTCGCTG AACGGATCGT TGCCACCAAG AAGGCTGGAA ATGATGTCGT GGTTGTCTGC 120 TCCGCAATGG GAGACACCAC GGATGAACTT CTAGAACTTG CAGCGGCAGT GAATCCCGTT 180 CCGCCAGCTC GTGAAATGGA TATGCTCCTG ACTGCTGGTG AGCGTATTTC TAACGCTCTC 240 GTCGCCATGG CTATTGAGTC CCTTGGCGCA GAAGCTCAAT CTTTCACTGG CTCTCAGGCT 300 GGTGTGCTCA CCACCGAGCG CCACGGAAAC GCACGCATTG TTGACGTCAC ACCGGGTCGT 360 GTGCGTGAAG CACTCGATGA GGGCAAGATC TGCATTGTTG CTGGTTTTCA GGGTGTTAAT 420 AAAGAAACCC GCGATGTCAC CACGTTGGGT CGTGGTGGTT CTGACACCAC TGCAGTTGCG 480 TTGGCAGCTG CTTTGAACGC TGATGTGTGT GAGATTTACT CGGACGTTGA CGGTGTGTAT 540 ACCGCTGACC CGCGCATCGT TCCTAATGCA CAGAAGCTGG AAAAGCTCAG CTTCGAAGAA 600 ATGCTGGAAC TTGCTGCTGT TGGCTCCAAG ATTTTGGTGC TGCGCAGTGT TGAATACGCT 660
CGTGCATTCA ATGTGCCACT TCGCGTACGC TCGTCTTATA GTAATGATCC CGGCACTTTG 720
ATTGCCGGCT CTATGGAGGA TATTCCTGTG GAAGAAGCAG TCCTTACCGG TGTCGCAACC 780
GACAAGTCCG AAGCCAAAGT AACCGTTCTG GGTATTTCCG ATAAGCCAGG CGAGGCTGCC 840
AAGGTTTTCC GTGCGTTGGC TGATGCAGAA ATCAACATTG ACATGGTTCT GCAGAACGTC 900
TCCTCTGTGG AAGACGGCAC CACCGACATC ACGTTCACCT GCCCTCGCGC TGACGGACGC 960
CGTGCGATGG AGATCTTGAA GAAGCTTCAG GTTCAGGGCA ACTGGACCAA TGTGCTTTAC 1020
GACGACCAGG TCGGCAAAGT CTCCCTCGTG GGTGCTGGCA TGAAGTCTCA CCCAGGTGTT 1080
ACCGCAGAGT TCATGGAAGC TCTGCGCGAT GTCAACGTGA ACATCGAATT GATTTCCACC 1140
TCTGAGATCC GCATTTCCGT GCTGATCCGT GAAGATGATC TGGATGCTGC TGCACGTGCA 1200
TTGCATGAGC AGTTCCAGCT GGGCGGCGAA GACGAAGCCG TCGTTTATGC AGGCACCGGA 1260
CGC 1263 配列番号： 12
配列の長さ ： 1263
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 !Jの種類： genomic DNA
起源
生物名 ：コリネハ、、クテリゥム ク ルタミカム (Corynebacteriuni glutamicuin)
株名 ： AJ3463
配列
GTGGCCCTGG TCGTACAGAA ATATGGCGGT TCCTCGCTTG AGAGTGCGGA ACGCATTAGA 60 AACGTCGCTG AACGGATCGT TGCCACCAAG AAGGCTGGAA ATGATGTCGT GGTTGTCTGC 120 TCCGCAATGG GAGACACCAC GGATGAACTT CTAGAACTTG CAGCGGCAGT GAATCCCGTT 180 CCGCCAGCTC GTGAAATGGA TATGCTCCTG ACTGCTGGTG AGCGTATTTC TAACGCTCTC 240 GTCGCCATGG CTATTGAGTC CCTTGGCGCA GAAGCTCAAT CTTTCACTGG CTCTCAGGCT 300 GGTGTGCTCA CCACCGAGCG CCACGGAAAC GCACGCATTG TTGACGTCAC ACCGGGTCGT 360 GTGCGTGAAG CACTCGATGA GGGCAAGATC TGCATTGTTG CTGGTTTTCA GGGTGTTAAT 420
AAAGAAACCC GCGATGTCAC CACGTTGGGT CGTGGTGGTT CTGACACCAC TGCAGTTGCG 480
TTGGCAGCTG CTTTGAACGC TGATGTGTGT GAGATTTACT CGGACGTTGA CGGTGTGTAT 540
ACCGCTGACC CGCGCATCGT TCCTAATGCA CAGAAGCTGG AAAAGCTCAG CTTCGAAGAA 600
ATGCTGGAAC TTGCTGCTGT TGGCTCCAAG ATTTTGGTGC TGCGCAGTGT TGAATACGCT 660
CGTGCATTCA ATGTGCCACT TCGCGTACGC TCGTCTTATA GTAATGATCC CGGCACTTTG 720
ATTGCCGGCT CTATGGAGGA TATTCCTGTG GAAGAAGCAG TCCTTACCGG TGTCGCAACC 780
GACAAGTCCG AAGCCAAAGT AACCGTTCTG GGTATTTCCG ATAAGCCAGG CGAGACTGCC 840
AAGGTTTTCC GTGCGTTGGC TGATGCAGAA ATCAACATTG ACATGGTTCT GCAGAACGTC 900
TCCTCTGTGG AAGACGGCAC CACCGACATC ACGTTCACCT GCCCTCGCGC TGACGGACGC 960
CGTGCGATGG AGATCTTGAA GAAGCTTCAG GTTCAGGGCA ACTGGACCAA TGTGCTTTAC 1020
GACGACCAGG TCGGCAAAGT CTCCCTCGTG GGTGCTGGCA TGAAGTCTCA CCCAGGTGTT 1080
ACCGCAGAGT TCATGGAAGC TCTGCGCGAT GTCAACGTGA ACATCGAATT GATTTCCACC 1140
TCTGAGATCC GCATTTCCGT GCTGATCCGT GAAGATGATC TGGATGCTGC TGCACGTGCA 1200
TTGCATGAGC AGTTCCAGCT GGGCGGCGAA GACGAAGCCG TCGTTTATGC AGGCACCGGA 1260
CGC 1263 配列番号： 13
配列の長さ ： 516
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic DNA
起源
生物名 ：コリネハ'、クテリゥム ク"ルタミカム（Corynebacterium glutamicuir)
株名 ： ATCC 13869
配列
GTGGAAGAAG CAGTCCTTAC CGGTGTCGCA ACCGACAAGT CCGAAGCCAA AGTAACCGTT 60 CTGGGTATTT CCGATAAGCC AGGCGAGGCT GCCAAGGTTT TCCGTGCGTT GGCTGATGCA 120 GAAATCAACA TTGACATGGT TCTGCAGAAC GTCTCCTCTG TGGAAGACGG CACCACCGAC 180
ATCACGTTCA CCTGCCCTCG CGCTGACGGA CGCCGTGCGA TGGAGATCTT GAAGAAGCTT 240
CAGGTTCAGG GCAACTGGAC CAATGTGCTT TACGACGACC AGGTCGGCAA AGTCTCCCTC 300
GTGGGTGCTG GCATGAAGTC TCACCCAGGT GTTACCGCAG AGTTCATGGA AGCTCTGCGC 360
GATGTCAACG TGAACATCGA ATTGATTTCC ACCTCTGAGA TCCGCATTTC CGTGCTGATC 420
CGTGAAGATG ATCTGGATGC TGCTGCACGT GCATTGCATG AGCAGTTCCA GCTGGGCGGC 480
GAAGACGAAG CCGTCGTTTA TGCAGGCACC GGACGC 516 配列番号： 14
配列の長さ ： 516
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic DNA
起源
生物名 ：コリネハ、、クテリゥム ク、'ルタミカム（Corynebacterium glutamicum)
株名 ： AJ3463
配列
GTGGAAGAAG CAGTCCTTAC CGGTGTCGCA ACCGACAAGT CCGAAGCCAA AGTAACCGTT 60 CTGGGTATTT CCGATAAGCC AGGCGAGACT GCCAAGGTTT TCCGTGCGTT GGCTGATGCA 120 GAAATCAACA TTGACATGGT TCTGCAGAAC GTCTCCTCTG TGGAAGACGG CACCACCGAC 180 ATCACGTTCA CCTGCCCTCG CGCTGACGGA CGCCGTGCGA TGGAGATCTT GAAGAAGCTT 240 CAGGTTCAGG GCAACTGGAC CAATGTGCTT TACGACGACC AGGTCGGCAA AGTCTCCCTC 300 GTGGGTGCTG GCATGAAGTC TCACCCAGGT GTTACCGCAG AGTTCATGGA AGCTCTGCGC 360 GATGTCAACG TGAACATCGA ATTGATTTCC ACCTCTGAGA TCCGCATTTC CGTGCTGATC 420 CGTGAAGATG ATCTGGATGC TGCTGCACGT GCATTGCATG AGCAGTTCCA GCTGGGCGGC 480 GAAGACGAAG CCGTCGTTTA TGCAGGCACC GGACGC 516 配列番号： 15
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 配列番号： 16
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 配列番号： 17
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG CGTGCCAAGG TTT 23 配列番号： 18
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG GATGCCAAGG TTT 23 配列番号： 19
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG TGTGCCAAGG TTT 23 配列番号： 20
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG TTTGCCAAGG TTT 23 配列番号： 21
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG CCTGCCAAGG TTT 23 配列番号： 22
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG TCTGCCAAGG TTT 23 配列番号： 23
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG TATGCCAAGG TTT 23 配列番号： 24
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GCCAGGCGAG GTTGCCAAGG TTT 23

Claims

請求の範囲
1 . 配列表の配列番号 4記載のァミノ酸配列ある 、は配列番号 4記載のァミノ 酸配列の 279番目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変 化した配列を有する、 コリネバクテリウム属細菌由来であり L—リジン及び L― スレオニンによる相乗的なフィ一ドバック阻害が実質的に解除されるァスバルト キナーゼ αサブュニット蛋白質をコードする D N A断片。
2 . 配列表の配列番号 6記載のァミノ酸配列ある L、は配列番号 6記載ァミノ酸 配列の 30番目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化 した配列を有する、 コリネバクテリゥム属細菌由来であり L—リジン及び L—ス レオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されるァスパルトキ ナーゼ^サブュニット蛋白質をコードする D N A断片。
3 . 配列表の配列番号 1 2記載の塩基配列を有するものである請求項 1記載の D N A断片。
4 . 配列表の配列番号 1 4記載の塩基配列を有するものである請求項 2記載の D N A断片。
5 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載された D N A断片を含有し、 コリネ バクテリゥム属の微生物中で複製可能な組み換え D N A。
6 . 請求項 5に記載された組み換え D N Aが、 コリネバクテリウム属の微生物 に導入されて得られるァスパルトキナ一ゼ比活性力親株の 2— 2 0倍に上昇し、 かつァスパル卜キナーゼ活性の Lーリジン及び L―スレオニンによる相乗的なフ イードバック阻害あるいは L—リジン単独によるフィードバック阻害が実質的に 解除された形質転換体。
7 . 請求項 6に記載された形質転換体を好適な培地にて培養し、 生じた L—リ ジンを分離することを特徴とする L—リジンの製造法。
8 . 配列表の配列番号 4記載のァミノ酸配列ある t、は配列番号 4記載ァミノ酸 配列の 279番目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化 した配列を有する、 コリネバクテリゥム属細菌由来であり Lーリジン及び L—ス レオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されるァスパルトキ ナーゼひサブユニッ ト蛋白質。
9 . 配列表の配列番号 6記載のァミノ酸配列あるし、は配列番号 6記載ァミノ酸 配列の 30番目の Thr残基が Ala以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化 した配列を有する、 コリネバクテリゥム属細菌由来であり Lーリジン及び L—ス レオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されるァスパルトキ ナーゼ βサブュニット蛋白質。
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