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WO1994000430A1 - Delaminomycines, antibiotiques nouveaux presentant une activite immunosuppressive, et leur production - Google Patents

Delaminomycines, antibiotiques nouveaux presentant une activite immunosuppressive, et leur production Download PDF

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Publication number
WO1994000430A1
WO1994000430A1 PCT/JP1993/000845 JP9300845W WO9400430A1 WO 1994000430 A1 WO1994000430 A1 WO 1994000430A1 JP 9300845 W JP9300845 W JP 9300845W WO 9400430 A1 WO9400430 A1 WO 9400430A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
delaminomycin
general formula
mycin
delaminomine
machine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1993/000845
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaaki Ishizuka
Mitsuhiro Ueno
Hironobu Iinuma
Hiroshi Naganawa
Masa Hamada
Kenji Maeda
Tomio Takeuchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Microbial Chemistry Research Foundation
Original Assignee
Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP10492193A external-priority patent/JP3386842B2/ja
Application filed by Microbial Chemistry Research Foundation filed Critical Microbial Chemistry Research Foundation
Priority to US08/356,267 priority Critical patent/US5527820A/en
Priority to EP93913563A priority patent/EP0647625A1/en
Publication of WO1994000430A1 publication Critical patent/WO1994000430A1/ja
Priority to KR1019940704690A priority patent/KR950702182A/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/38—2-Pyrrolones
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    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/96—Spiro-condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibiotic, Delaminomycins, which has an immunosuppressive activity and also has an antibacterial activity and an antitumor activity, and to a process for producing them.
  • the present invention provides novel antibiotics having immunosuppressive activity, antibacterial activity against gram-positive bacteria, and antitumor activity as delaminomycin A and delaminomycin.
  • B Delaminomicin C, Delaminomicin A2, Delaminomicin B2 and Delaminomicin C2, and more
  • the invention also relates to pharmaceutically acceptable salts of the same and to the production of these novel antibiotics.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, particularly an immunosuppressant composition, containing these novel antibiotics as active ingredients.
  • the present invention also relates to an ester sulfate of delaminomine mycin A 2, B 2 or C 2 or a salt thereof.
  • cyclosporin A, FK506, and spagarin have been known as immunosuppressive substances produced by microorganisms, but these are immunosuppressants. It is not completely satisfactory.
  • the present inventors aimed to find useful immunosuppressive active substances in microbial products, isolated more microorganisms than in natural soil, and conducted various studies on the products of those microorganisms. Was performed. As a result, the present inventors have found that MJ202-72 has excellent immunosuppressive activity in cultures of microorganisms belonging to the genus Streptomyces newly isolated from soil.
  • F 3 Three types of antibiotics, initially designated as substances A, B and C, were found to be produced and accumulated. These materials were isolated and characterized for their biological and physicochemical properties.
  • P TJP9300845 Three types of antibiotics, initially designated as substances A, B and C, were found to be produced and accumulated. These materials were isolated and characterized for their biological and physicochemical properties.
  • the present inventors have used the above-mentioned delaminomycins A, B and C as raw materials, respectively, and used them as a chemical method comprising a ring-closure reaction accompanied by dehydration.
  • delaminomycin A2 from delaminomycin A delaminominebine B2 from delaminominebine B, and delaminominecin B2
  • delaminomine mycin C2 We succeeded in producing delaminomine mycin C2 from C.
  • the biological and physicochemical properties of these delaminomycins A2, B2 and C2 were also examined, and these substances showed immunosuppressive activity and antibacterial activity against Gram-positive bacteria. It has been found that the compound has activity and antitumor activity, and that it is a novel compound by the determination of the chemical structural formula.
  • the present invention relates to a novel antibiotic delaminomycin A, B and C having immunosuppressive activity, antibacterial activity and antitumor activity, and each of A2, B2 and C2. It provides substances and provides methods for their manufacture.
  • X represents a hydroxyl group, a methoxy group, or a hydrogen atom
  • X is a hydroxyl group in delaminomycin A.
  • Substance, Delamino My A, Delaminomicin B and Delaminomicin C, and their salts are provided.
  • the compound represented by the general formula [I] and the compound represented by the general formula [1 '] are in a tautomeric relationship.
  • pharmaceutically acceptable metals for example, sodium, are included in the salts of delaminomine machines A, B, or C of the general formula [I] or the general formula [1 ']. Salts with alkaline metals, such as lithium and potassium, salts with alkaline earth metals, such as potassium, or ammonium salts. You.
  • Y represents a hydroxyl group, a methoxy group, or a hydrogen atom
  • Y is a hydroxy group in the delaminomicin A2.
  • Antibiotics, Delaminomicin A2, Delaminomicin B2, and Delaminomicin C2 are provided.
  • V KBr 3400, 2950, 2900, 1660, 1590, 1430, 1100, 950 cm "
  • the metabolite in heavy metal (49.00 ppm) was measured as the reference substance.
  • V KBr 3400, 2950, 2900, 1670, 1600, 1430, 1400, 1100 cm 1 max
  • the measurement was made using the medium (3.30 ppm) in the heavy metal as the reference substance.
  • the metabolite in heavy metal (49.00 ppm) was measured as the reference substance.
  • the present invention relates to delaminomine machine C (a compound of the general formula [I] or [I '], wherein X is hydrogen) according to the present invention.
  • the measurement was made using methanol (3.30 ppm) in heavy metal as a reference substance.
  • the metabolite in heavy methanol (49.00 ppm) was measured as the reference substance.
  • Solubility Soluble in methanol, poorly soluble or insoluble in water, acetate, ether, n-hexane.
  • the measurement was performed using heavy fluorochlorozolem (77.00 ppm) as the reference substance.
  • Solubility Soluble in methanol, ethyl acetate, chloroform, ether, ⁇ -hexane, poorly soluble or insoluble in water.
  • Heavy black hole medium Medium heavy black hole form (77.00 ppm) was measured as the reference substance.
  • Solubility Soluble in methanol, ethyl acetate, cross-linked home and ether, n-Hexane, hardly soluble or insoluble in water.
  • Solubility Soluble in methanol, ethyl acetate, cross-linked porphyrin, poorly soluble or insoluble in water, n-hexane.
  • Delaminomacin A, B and C according to the present invention and each of Delaminomacin A2, B2 and C2 are resistant to Gram-positive bacteria. Has a strong antibacterial effect.
  • Splenocytes contain T cells (also called T lymphocytes) involved in cell-mediated immunity and antibody production: B cells (also called B lymphocytes) involved in the underlying immunity. Is done. T cells contained in spleen cells are activated when treated with concananocin A, a mitogen that acts selectively on T cells. It is known that the blast cells are transformed into blasts and become proliferative and proliferate. However, B cells receive concanapalin A treatment. It is known that they are not activated and do not proliferate.
  • Whether a compound has the activity of suppressing T-cell-mediated cellular immunity can be determined by culturing splenocytes treated with concanapalin A in the presence of the compound. It can be determined by measuring the degree to which the proliferative response of spleen cells is inhibited by the compound [Ref. 1; Larson, EL et al .: Mechanism of T cell activation. I. A screening of step one i gands "Eur. J. Immunol. J 10, 93-99 (1980), and Reference 2: Ueno. M. et al .: Dethymicin, a novel immunosuppressant isolated from an Amycolatopsis. Fermentation, isolation, physico-chemical.
  • Delaminomycin A, B, C, A2, B2 or C2 is a reaction in which mouse spleen cells activated by concanavalin A treatment proliferate. It has been shown by in vitro tests that it has an activity to inhibit the activity.
  • spleen cells taken from one mouse individual are treated with mitomycin C, and then treated with stimulator cells (stimulators) taken from another mouse individual.
  • Cells that are mixed with splenocytes that act as It is known that when cells are cultured, the T cells contained in the former spleen cells (responders) are stimulated to cause a reaction of blast formation, i.e., immature growth and proliferation.
  • This reaction is called a mixed lymphocyte culture reaction.
  • T cells are selectively introduced into a medium in which mixed lymphocyte cultures are cultured. It has been known that the addition of a compound exhibiting an inhibitory activity inhibits the histocompatibility antigen-dependent T cell proliferation reaction in a mixed lymphocyte culture reaction [Reference 1; Ishizuka. M. et al .: Induction of antitumor
  • A2, B2, and C2 according to the present invention are used for the in vitro test of a mixed lymphocyte culture reaction to produce T cells that serve as reaction cells. It was found to have an activity to inhibit the growth reaction.
  • DTH delayed type hypersensitivity
  • the delaminomycins of the present invention have an activity of selectively inhibiting T cells, and as an immunosuppressant required for organ transplantation. It is also useful as a drug useful for the treatment of autoimmune diseases, which are hyperimmune conditions caused by cellular immune responses. In addition, it has been found that it exhibits a cancer cell growth inhibitory activity against certain types of cancer cells, and thus the delaminomycins of the present invention have use as anticancer agents.
  • each of the delaminomycins A, B, C, A2, B2 and C2 according to the present invention may be useful in the treatment of Gram-positive bacterial infections.
  • immunosuppressants or immunomodulators useful for organ transplantation and autoimmune diseases there are also uses as immunosuppressants or immunomodulators useful for organ transplantation and autoimmune diseases. In addition, it has application as a useful anticancer agent for certain types of cancer.
  • Inhibition rate () 100- (T / CX 100) where T represents the amount of 3 H-thymidine incorporation when treated with the test compound, and C represents the amount without treatment. Indicates the amount of insertion. Table 1 shows the obtained test results.
  • splenocytes collected from a WKY rat were treated with mitomycin C 50 g / m £ -V at 37 ° C for 20 minutes as stimulator cells.
  • a reaction cell a non-wall adherent cell of spleen cells collected from Fisher F 344 rat was used. These cells are mixed, and the mixed cells are mixed in RPMI 164 medium (5%, containing fetal calf serum) at various concentrations of a test compound (Delaminomia). The cells were cultured in the presence or absence of cin) and reacted at 37 ° C and 5% CO2 for 120 hours.
  • CDF Ma cormorant nests after the sheep red blood cells (10 5 Z Ma c scan) and intravenous immune, sensitized sheep red blood cells (10 8 Z Ma c scan) was injected subcutaneously in the leg lameness in 4 days Caused delayed-type hypersensitivity (DTH).
  • the test compound was intraperitoneally administered once daily from day 0 to day 4 after immunization.
  • the inhibitory effect on DTH was determined by measuring the thickness of mouse foot lameness.
  • the inhibitory effect of “” was evaluated by the inhibition rate (%) calculated by the following formula.
  • T represents the thickness of foot lame when the test compound was administered
  • C represents the thickness of foot when no test compound was administered.
  • Table 3 shows the obtained test results.
  • the present invention inhibits the growth of various animal cancer cells and human cancer cells by 50%, and inhibits the ⁇ 415 of these cultured cancer cells by 50%.
  • de la Mi Roh My Thin a, B, C, ⁇ 2 concentration of ⁇ 2 your good beauty C 2, Sunawa Chi IC 5.
  • the values were measured to evaluate the growth inhibitory activity on cancer cells. Table 4 shows the obtained results.
  • Table 5a Table 5b show the minimum growth inhibitory concentration (MIC.) (I / ⁇ ) of the novel antibiotic of the present invention against various bacteria and filamentous fungi measured by the agar plate dilution method. And Tables 5c and 5d. [Table 5a]
  • Staphylococcus aureus MS9610 25 6.25 ⁇
  • Top Z Staphylococcus aureus No.5 (M8SA) 25 ⁇ .2 ⁇
  • A2 B2 C2 Sufi Filococcus ⁇ areus FDA209P 12.5 50 100 Staphylococcus ⁇ Aureus Smith 12.5>100> 100 Staphylococcus * Aureus MS9610 12.5>100> 100 Staphylococcus ⁇ areus No.5 (lffiSA) 12.5>100>12.5>100> 100 Micrococcus luteus FDA16 6.25 12.5> 100 Micrococcus luteus IF03333 6.25 12.5 100 Micrococcus luteus PCI1001 12.5>100> 100 Pacillus anthracis 6.25 25 100 Basilas Subtilis IffiKL B-558 6.25>100> 100 Bacillus, subtilis PCI219 '12.5>100> 100 Pacillus ⁇ Cereus ATCC10702 6.25 50> 100 Corynebacterium bovis 1810 12.5 100> 100 Escherichia coli NIHJ>100>100> 100 Escherichia Kori 1 [1 12>100
  • a bacterium producing Delaminomycins A, B, and C belonging to the genus Streptomyces is cultured, and the cultivation thereof is performed.
  • Immunosuppression characterized in that delaminomycin A and / or delaminomycin B and / or delaminomycin C are collected from the object.
  • Methods for the production of a novel active antibiotic, delaminomycin A, and / or delaminomycin B and / or delaminominecin C are provided. It is.
  • the strain producing delaminomycins A, B and C used in the method of the present invention is a strain of the genus Streptomyces and is a strain of delaminomycin A, B and C. It is sufficient if it has at least one production ability.
  • a bacterium that can be used for Delaminomycin A, B, and C that can be used without being limited to one strain is In January 1990, there was an actinomycete isolated from the soil in Otsuki City, Yamanashi Prefecture, with a strain number of MJ202-72F3.
  • the bacteriological properties of the strain MJ202-72F3 are described below.
  • the MJ202-72F3 strain elongates aerial hyphae, which is relatively longer than the divided base hyphae, and forms a spiral of 5-6 turns at the tip. Rotational techniques and spores are not recognized. A chain of more than 50 spores was observed at the tip of the aerial hyphae, and the size of the spores was about 0.5 to 0.7 X 0.8 to 1.2 micropores. The surface of the spores was spiny. It has a wart-like shape. 2. Growth in various media
  • Tyrosin agar medium (ISP—culture medium 7, 30 eC culture) White aerial hyphae grow on the growth of light yellow (2 gc, bamboo), and dissolve. No pigment is found.
  • Nutrient agar medium (culture at 30 ° C) Light yellow, aerial mycelium does not grow, and no soluble pigment is observed.
  • D-glucose and inositol does not use sucrose, D-mannitol or lactose.
  • D—Xylose, D—Fructose is unknown, and L—Arabinose, Ramnorth, and LaFinose are probably Not likely to use.
  • Nitrate reduction (0.1% potassium nitrate containing Water, ISP — Medium 8, culture at 30 ° C)
  • the morphology of the MJ202-72F3 strain elongates aerial hyphae with 5 to 6 turns of helical formation from the divided basal hyphae, No spores are found. More than 50 spores are linked to the tip of the aerial hyphae, and the surface of the spores is spiny or warty. In various media, the growth is colorless to light yellow, and the formation of aerial hyphae is poor. However, in a few media, bright ash aerial hyphae are partially formed. No soluble dye is observed. The optimum growth temperature is around 27 ° C to 30 ° C. The formation of melanin-like dye was negative, the starch did not show hydrolyzability, and its proteolytic activity was weak.
  • 2,6-diaminopimelic acid contained in the cell wall was of the LL type.
  • the ⁇ 202-273 strain is considered to belong to the genus Streptomyces.
  • a search for known strains of the genus Streptomyces reveals that closely related species are Streptomyces albulus (Literature, International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 22, 271, 1972; The Journal, Volume 30,
  • strain MJ202—72F3 is named Streptomyces sp. MJ202—72F3.
  • MJ 202 — 72 F3 strain was deposited with the Institute of Microbiology and Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Japan, located in Tsukuba, Ibaraki Prefecture), and on December 24, 1991, It was commissioned as No. 12674.
  • the MJ202-72F3 strain and the two strains described above ⁇ Streptomyces annulables IMCS-0802 (ISP54992), Streptomyces 'Natalensis IMSS-0 6 8 7 (ISP 5 3 5 7)>
  • the MJ202-72F3 strain and both strains differed slightly in gelatin liquefaction, milk coagulation, obutonization, and starch hydrolyzability.
  • their properties are subject to change and are not considered significant differences.
  • the MJ202-72F3 strain was more similar to Streptomyces varvus, based on the color of the aerial mycelium and the availability of carbon sources.
  • the strain MJ202—72F3 was identified as a strain of Streptomyces albulus MJ202-72F3, and MJ202— The 7 2 F 3 strain has been deposited under the Budapest Treaty and transferred to the Institute of Microorganisms and Technology (currently renamed the Institute of Biotechnology and Industrial Technology) as the deposit number “FERMBP — 40079” Has been deposited.
  • novel antibiotics delaminomycins A, B and C are used to produce bacteria producing delaminomycins A, B and C belonging to the genus Streptomyces.
  • a suitable medium preferably under aerobic conditions
  • the desired antibiotic is produced and accumulated in the medium, and then from the culture. It can be produced by collecting the desired antibiotic.
  • the culture medium may contain any nutrient sources available to the bacteria producing Delaminomycins A, B and C.
  • glucose, inositol, maltose, oils and fats can be used as a carbon source, and soybean powder, cottonseed and so on can be used as a nitrogen source.
  • Organic matter such as dried yeast extract, dried yeast extract, polypeptone and corn starch, and ammonium salts or nitrates such as ammonium sulfate, sodium nitrate and the like.
  • Inorganic substances such as ammonium chloride can be used.
  • inorganic salts such as salt, potassium chloride, calcium carbonate, phosphate, and heavy metal salts can be added to the medium.
  • an appropriate antifoaming agent for example, a silicone-based antifoaming agent can be added according to a conventional method.
  • Any culture method may be used as long as it is a commonly used culture method of microorganisms for producing a bioactive antibiotic and the like.
  • the aerobic liquid submerged culture method is particularly suitable.
  • the culture temperature is suitably 20 to 37 ° C, but preferably 27 to 30 ° C. In this way, the production of delaminomine machines A, B, and C reaches a maximum in 5 to 7 days of cultivation in both shaking culture and aeration-agitation culture. Nomycins A, B and C are produced and accumulated in the culture medium to obtain a culture.
  • delaminomycin A, B and C are present in the cells and in the culture filtrate, but are mainly present in the cells.
  • Any suitable method can be used to collect delaminomine machines A, B and C from such cultures. These methods are based on the principle of extraction. Specifically, for example, delaminomycins A, B and C are extracted from a culture filtrate with water. There is a method of extracting with a miscible organic solvent, such as butyl acetate, n-butanol.
  • a miscible organic solvent such as butyl acetate, n-butanol.
  • the cell bodies obtained by filtration, centrifugation, etc. are collected from methanol, ethanol, and ethanol.
  • the culture can be subjected to the above extraction operation without isolating the cells.
  • a countercurrent distribution method using a suitable solvent can also be included in the scope of the extraction method. For example, Centrifugal Partition Graph
  • Extract delaminomycin A, B, and C from culture Yet another method is based on the principle of adsorption. For example, using a culture filtrate or an extract obtained by performing an extraction operation as described above, a suitable adsorbent, a gel filtration agent, for example, Silica gel, Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), Toyono. Column chromatograph, Nucleo using a HW-40 (manufactured by Tohso Corporation), Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), etc.
  • the target antibiotic is adsorbed to the adsorbent by high-performance liquid chromatography using Syl 5C, 8 (Nagel, West Germany) or other means.
  • delaminomine machines A, B, and C alone or as a mixture.
  • Solution containing delaminomine mycin A and / or delaminomine mycin B and Z obtained in this way or delaminomine mycin C Is concentrated under reduced pressure to dryness to obtain a crude sample of Delaminomicin A or Delaminomicin B and Z or Delaminomicin C. It is possible.
  • Delaminomines, sin A and __ or delaminomin mycin B and crude of delamino mycin C obtained in this way may be combined as necessary and performed as many times as necessary.
  • column chromatography using an adsorbent or gel filtration agent such as Diaion HP-20, Sephadex LH_20 (trade name) Separate centrifugal fluids using filters and CPCs Use chromatographic and silica gel High-performance liquid chromatography using normal-phase chromatography and Nucleosil 5C! 8 etc. can be carried out in appropriate combinations. .
  • the fourth aspect of the present invention is characterized in that delaminomycin A, delaminomine B or delaminomycin C is subjected to a dehydration ring closure reaction.
  • a method for producing a novel antibiotic delaminomycin A2 or delaminomycin B2 or delaminomycin C2 is provided.
  • delaminominecin A, B or C is used as a raw material in the form of an anhydrous organic solvent such as methanol or ethanol. N, dissolved in butanol or acetone, to which an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid can be added and reacted at room temperature or under heating .
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid
  • the solvent is distilled off, and the obtained residue is subjected to various chromatographic methods. It can be done by applying the law.
  • the delaminomycin A or B or C of the general formula [I] or [1 '] according to the present invention or a salt or second salt thereof.
  • the use of the delaminomicin A2, B2 or C2 of the general formula [I] according to the present invention as an immunosuppressant or other medicament Alternatively, it can be formulated as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable ordinary solid or liquid carrier.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier mixed with and mixed with the carrier.
  • An immunosuppressant or immunomodulator of one or more of the delaminomycins of the general formula [I], [I '] or general formula [I] according to the present invention When used as a drug or other drug, it can generally be administered orally or parenterally.
  • Della Mi Bruno My Thin A is shows the 500 mg kg or more LD 5 beta value when administered intraperitoneally in ICR mice, low extremely toxic.
  • the active ingredient compound in the composition of the present invention that is, delaminomycin A, B, C, or a salt thereof, Delamininomycin A2, B2 or C2 may be used alone, or in combination with excipients or carriers for injection, buccal or oral administration. It is administered in the form of a suppository or other preparation.
  • Pharmaceutically acceptable excipients and carriers are selected, and their type and composition are determined by the administration route and administration method. For example, water, alcohol or soybean oil, animal and vegetable oils such as sesame oil, mineral oil, and synthetic oils are used as the liquid carrier.
  • Cellulose derivatives such as sugars such as maltose and sucrose, amino acids such as lysine, and hydroxypropyl mouth pilcellulose as solid carriers
  • Polysaccharides such as cyclodextrin, and organic acid salts such as magnesium stearate are used.
  • physiological saline When formulated as an injection, physiological saline, various buffers, saccharide solutions such as glucose, inositol, mannitol, etc., and ethylene glycol are generally used. And glycols such as polyethylene glycol are desirable.
  • sugars such as inositol, mannitol, glucose, mannose, maltose, sucrose, and phenylalanine Lyophilized formulation together with excipients such as amino acids such as carbohydrates, etc., at the time of administration and suitable solvents for injection, for example, sterile water, saline, glucose solution, electrolyte solution, It can also be used by dissolving it in a liquid for intravenous administration such as minoic acid.
  • the content of the delaminomycin compound in the prepared composition varies depending on the preparation type, but is usually 0.1 to 100% by weight, preferably 1 to 100% by weight. — 90% by weight.
  • injection solution In this case, it is usually good to include 0.1 to 5% by weight of the delaminomycin compound.
  • oral administration it is used in the form of tablets, capsules, powders, granules, dry syrups, liquids, syrups and the like together with the above-mentioned solid carriers or liquid carriers.
  • the content of the delaminomycin compound is generally 3 to 100% by weight, preferably 5 to 90% by weight, and the rest is a carrier.
  • the dosage of delaminomycin or a salt thereof according to the present invention is determined by the patient's age, weight, symptoms, treatment purpose, etc., but the dosage is generally determined by general guidelines.
  • Parenteral administration is 110 mg kg / day, and oral administration is 5-500 mg / kg Z-day.
  • the dose can be administered continuously or intermittently within a range that does not exceed a certain amount in consideration of various situations such as the results of animal tests.
  • the total dose may be appropriately changed according to the administration method, patient condition, for example, age, weight, gender, diet, concomitant medication, etc. It is. Appropriate doses and frequency of administration under certain conditions should be determined by a specialist based on the above guidelines. These administration conditions are the same for oral administration.
  • delaminomycins A, B and C of the general formula [I] or [1 '] according to the first present invention, and the general formula [H] according to the second present invention are extremely poorly soluble in water and are orally administered. JP93 / 00845
  • the present inventors have found that the above delaminomycins are easily soluble and easily absorbed orally, that is, they can be easily prepared as injections. Furthermore, they continued their research with the aim of synthesizing novel derivatives with improved oral absorption efficiency.
  • R is a sulfate group (- S0 3 H) or other indicates a salt pharmaceutically allowable
  • Y is Ri Della Mi Roh My Thin A 2
  • Non mud key Sill group der Is a methoxy group in delaminomycin B2, and a hydrogen atom in delaminomycin C2).
  • Novel sulfate of delaminomycin B2 and delaminomycin C2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is synthesized. It was found that they had high water solubility, improved absorption efficiency upon oral administration, and had immunosuppressive activity.
  • the delamino mycin A 2 the dela mino mycin B 2 and the dela mino mycin represented by the above general formula [II] are obtained.
  • a sulfate or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • a sulfating agent is allowed to act on delaminomycin ⁇ 2, ⁇ 2, or C 2 in a nonprotonic solvent.
  • the amount of the sulfating agent is usually at least equimolar to the amount of the raw material delaminomycin ⁇ 2, ⁇ 2 or C2.
  • the sulfating agent include anhydrous sulfuric acid-pyridine complex salt and chlorosulfonic acid.
  • Preferred solvents for the sulfation reaction include ⁇ , ⁇ -dimethylformamide and pyridin.
  • an inorganic base such as an organic base such as pyridin or triethylamine, calcium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, or potassium carbonate is used. Bases can be used.
  • the reaction is usually carried out at a temperature not higher than the boiling point of the solvent used, preferably at about 20 to room temperature.
  • the compound of the general formula [1] which has been converted into a sulfuric ester is obtained by extracting the reaction solution containing the same with water and ethyl acetate or a diluent, etc. Concentrate the layer containing the target compound. The obtained concentrated residue can be dried if necessary.
  • the compound of the general formula [M] according to the fifth aspect of the present invention can be obtained by isolation by a conventional method after purification by mouth chromatography or the like.
  • the sulfate derivative of the general formula [ ⁇ ] is a non-toxic metal, for example, an alkali metal such as sodium or potassium, or a non-toxic metal according to a conventional method. It can form salts with organic bases, such as triethylamine.
  • the solubility of the compound of the general formula [II] obtained according to the fifth invention, particularly of sodium salt, in ice is greatly increased as compared with the corresponding non-sulfate compound. It became easily soluble in water.
  • Solubility Soluble in water, methanol, ethyl acetate, chloroform, and hardly soluble or insoluble in ether and ⁇ -hexane.
  • Solubility Soluble in water, methanol, ethyl acetate, chloroform, and poorly soluble or insoluble in ether and ⁇ -hexane.
  • TMS (Oppm) in heavy-mouthed form was measured as a reference substance.
  • Chromophore hologram (77.00 ppm) in heavy chloroform was measured as a reference substance.
  • Solubility Soluble in water, methanol, ethyl acetate, chloroform, and poorly soluble or insoluble in ether and n-hexane.
  • the sodium salt of the fifth compound of the present invention represented by the general formula [BI] is resistant to mouse delayed type hypersensitivity (DTH).
  • DTH mouse delayed type hypersensitivity
  • T represents the thickness of the foot when the test compound was administered
  • C represents the thickness of foot lame when the test compound was not administered.
  • the delaminomycin A2, B2 and C2 sulfate esters of the general formula [II] according to the present invention can also be used as immunosuppressants or other drugs. When used, it can be formulated as a pharmaceutical composition by admixing it with an ordinary pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier.
  • the active ingredient is at least one antibiotic selected from the group consisting of sulfates of terramine and delaminomicin C2 and their pharmaceutically acceptable salts.
  • a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier mixed therewith.
  • the sulfate compound represented by the general formula [m] can also be formulated in the same manner as the above-mentioned pharmaceutical composition according to the fourth aspect of the present invention. Or the same range as the delaminomycin compound of the general formula [II]. ,
  • Fig. 1 is an infrared absorption spectrum of delaminomycin A by the KBr disk method.
  • Figure 2 is an infrared absorption spectrum of Delamininomycin B by the KBr disk method.
  • Figure 3 is an infrared absorption spectrum diagram of Delaminomicin C by the KBr disk method.
  • FIG. 4 is an infrared absorption spectrum diagram of delaminomycin A2 by the KBr disk method.
  • FIG. 5 is an infrared absorption spectrum diagram of the delaminomycin B2 by the KBr disk method.
  • FIG. 6 is an infrared absorption spectrum diagram of delaminomycin C2 by the KBr disk method.
  • FIG. 7 is an infrared absorption spectrum diagram of a sulfate ester of delaminomine machine A2 by the KBr disk method.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • This example shows an example of production of the antibiotics delaminomycins A, B and C by culturing the strain MJ202-72F3.
  • the culture medium used for the preparation of the seed mother had the following composition dissolved in 1 ⁇ of water. pH was not adjusted.
  • the above culture medium 110m is transformed into a 500 ⁇ triangular flask.
  • Streptomyces' SP MJ202-72F3 strain (Seiken Bacteria No. 12674 or FER III) BP-4079) was inoculated from a slant with one platinum loop and spun in a rotary shaker at 30 ° C and 180 rpm for 72 hours as a seed. I got it.
  • the medium used as the production medium contains the following components.
  • the cells were extracted with methanol, the methanol was distilled off, the remaining aqueous layer was extracted with n-butanol, and n-butanol was extracted.
  • the roll layer was concentrated to dryness under reduced pressure. Approximately 3 g of the obtained crude extract was applied to a centrifugal liquid-separation chromatograph (CPC, Miki Engineering Ring). You. The lower layer of chloroform (2: 2: 1) was used as the stationary phase, and the upper layer was used as the mobile phase under the conditions of 20 DC , 400 rpm, and 1 / min. Separation and purification were performed by the ascending method.
  • Delaminomicins A, B and C were eluted in the positively eluted fraction, and concentrated under reduced pressure to dryness. 830 mg of the resulting crude product was obtained on Sephadex LH-20. (Manufactured by Fanoremasia Co., Ltd.) was used for gel chromatography. Elution was performed with methanol, and the delaminomycin A, B and C fractions were collected and concentrated to dryness under reduced pressure. The obtained Delamino Mycin A,
  • This example shows the production of the antibiotic delaminomycin A2 by dehydration and ring closure of delaminomycin A.
  • This example shows an antibiotic obtained by dehydration and ring closure of delaminomine b This shows the production of high quality delaminomicin B2.
  • This example shows the production of the antibiotic delaminomycin C2 by dehydration and ring closure of delaminomycin C.
  • the fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain llmg of powder. After dissolving this in a small amount of methanol, the mixture was applied to a gel chromatograph using Sephadex LH-20 and Delamino Mycin C The fraction containing 2 was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 9.8 mg of a colorless to white solid of delaminominecin C2.
  • Delaminomycin B 2 10mg dissolved in 1 ⁇ ⁇ black mouth solution, and anhydrous sulfuric acid monopyridin complex 15mg dissolved in N, N'-dimethylformamide 1 The mixture was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 hours to react. After removing the form of the mouth of the reaction mixture under reduced pressure, the remaining liquid was subjected to liquid-liquid partition extraction with 10% citric acid and ethyl acetate. The ethyl acetate layer containing the target compound is washed with saturated saline, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to form a single spot on TCL. 6.6 m of the sulfate ester of nomycin B2 was obtained.
  • Delamininomycin C2 (12 mg) was dissolved in l-mi mouth mouth solution, and anhydrous sulfuric acid-pyridin complex salt (18 m) was dissolved in N, N'-dimethylformamide 1 The mixture was added, and the mixture was stirred and reacted at room temperature for 20 hours. After removing the form of the mouth of the reaction mixture under reduced pressure, the remaining liquid was subjected to liquid-liquid partition extraction with 10% citric acid and ethyl acetate. The ethyl acetate layer containing the target compound is washed with saturated saline, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to form a single spot on TCL. 7.9 mg of sulfated ester of mycin C2 was obtained.
  • the present invention provides a novel antibiotic having immunosuppressive activity, antibacterial activity against Gram-positive bacteria, and anticancer activity.
  • delaminomine mycins A to C2 and the ester sulfate of delaminomine mycins A2 to C2 are used as immunosuppressants required for organ transplantation. Therefore, they are expected to be useful as therapeutic agents for treating immunodeficiency diseases and local inflammation.

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Description

明 細 書
免疫抑制活性を有する新規抗生物質、 デ
ラ ミ ノ マイ シ ン類お よ びそれ らの製造法
技 術 分 野
本発明 は免疫抑制活性を有 し且つ抗菌活性お よ び抗 腫瘍活性 も 有す る 新規抗生物質 デ ラ ミ ノ マ イ シ ン 類 (Delaminomycins)に関 し、 ま たそれ らの製造法に関する。
詳 し く は、 本発明は免疫抑制活性、 グラ ム陽性細菌に 対する抗菌活性お よ び抗腫瘍活性を有する新規な抗生物 質 と してデラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン B、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 お よ びデ ラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 、 な ら びに こ れ らの製薬学的に許容でき る塩に関 し、 ま た こ れ らの新規な抗生物質の製造法に も関する。 ま た、 本発 明は こ れ ら の新規な抗生物質を有効成分 と して含む医薬 組成物、 特に免疫抑制剤組成物に関する。 更に、 本発明 はデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 B 2 ま た は C 2 の硫酸エス テル ま た はその塩に も 関す る。
上記のデラ ミ ノ マ イ シ ン A、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 は こ れ ら新規な抗生物質を本発明者が収得する の に成功 した 当初では、 それぞれに抗生物質 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 — A、 M J 2 0 2 - 7 2 F 3 - B , M J 2 0 2 - 7 2 F 3 - C . M J 2 0 2 - 7 2 F 3 - A ' . M J 2 0 2 - 7 2 F 3 - B ' お よ び M J 2 0 2 — 7 2 F 3 — C ' と命名 さ れた抗生物質であ り 、 それ らの研究所名称で 日 本特許出 願平 4 — 187403号明細書 （ 1992年 6 月 23日 出願） に記載 さ れてあ る けれ ど も、 最近は M J 2 0 2 - 7 2 F 3 の名 称の代 り にデラ ミ ノ マイ シ ン （Delaminomycin) の新名称 を用 いる こ と に した。
背 景 技 術
従来、 微生物が生産す る免疫抑制物質 と してサイ ク ロ ス ポ リ ン A、 F K 5 0 6 お よ びスパガ リ ン等が知 られて いるが、 こ れ ら は免疫抑制剤 と して完全に満足でき る も のではない。
臓器移植や免疫不全疾患お よ び局所の炎症の医療に有 用であ る よ り 優れている新規な免疫抑制物質を得る こ と、 ま た優れた抗腫瘍活性物質を得る こ と は長年、 要望さ れ ている。
発 明 の 開 示
本発明者 ら は微生物生産物中に有用な免疫抑制活性物 質を見出す 目 的で、 天然の土壌よ り数多 く の微生物を単 離 し、 そ れ ら微生物の生産物について種 々 の研究を行 な っ た。 そ の結果、 本発明者 らが新たに土壌か ら分離 し たス ト レ プ ト ミ セ ス属に属する微生物の培養液中に優れ た免疫抑制活性を有 して M J 2 0 2 — 7 2 F 3 — A、 B お よ び C物質 と当初に命名 さ れた 3 種の抗生物質が生産 さ れ蓄積さ れる こ とを認めた。 それ らの物質を単離 し、 生物学的お よ び物理化学的性状を調べ、 こ れ らの物質が P TJP9300845
免疫抑制活性 と グラ ム陽性細菌に対す る抗菌活性お よ び 抗腫瘍活性を有する こ と、 お よ び化学構造式の決定に よ り 新規化合物であ る こ と、 ま た互変異性体があ る こ とを 見出 した。
なお、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 — A、 — B お よ び— C物 質が夫々 にデラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン B お よ びデラ ミ ノ マイ シ ン C と最近に改名 したのは、 前述の とお り であ る。
さ ら に、 本発明者 ら は上記のデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C をそれぞれに原料 と して用い、 それ らを、 脱 水を伴う 閉環反応か らな る 化学的方法に よ り 、 デラ ミ ノ マイ シ ン Aか らデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 を、 デラ ミ ノ マイ シ ン B か らデラ ミ ノ マイ シ ン B 2 を、 ま たデラ ミ ノ マイ シ ン C か らデラ ミ ノ マイ シ ン C 2 を製造す る こ と に成功 した。 こ れ らデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 、 B 2 お よ び C 2 について も生物学的お よ び物理化学的性状 を調べ、 こ れ らの物質が免疫抑制活性 と グラ ム陽性細菌 に対する抗菌活性お よ び抗腫瘍活性を有する こ と、 お よ び化学構造式の決定に よ り 新規化合物であ る こ とを見出 した。
すなわち、 本発明は免疫抑制活性、 抗菌活性お よ び抗 腫瘍活性を有する新規抗生物質デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C な ら びに A 2 、 B 2 お よ び C 2 の各物質を提 供 し、 ま たそれ らの製造法を提供する も のであ る。
詳 し く 言えば、 第 1 の本発明に よ る と、 次の一般式 C I )
Figure imgf000006_0001
ま た は次の一般式 〔 I ' 〕
Figure imgf000006_0002
(式中、 X は ヒ ド ロ キ シル基、 メ ト キ シ基 ま たは水素原 子を表 し、 X はデ ラ ミ ノ マ イ シ ン Aでは ヒ ド ロ キ シ ル 基であ り 、 デ ラ ミ ノ マ イ シ ン B では メ ト キ シ基であ り 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C では水素原子であ る 〕 で表 さ れ る 免疫抑制活性を有す る新規な抗生物質、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A、 デラ ミ ノ マ イ シ ン Bお よ びデラ ミ ノ マ イ シ ン C、 お よ びそ れ ら の塩が提供 さ れ る。
一般式 〔 I 〕 で表 さ れ る 化合物 と一般式 〔 1 ' 〕 で表 さ れ る 化合物 は互変異性の 関 係 に あ る 。 ま た、 一般式 〔 I 〕 ま たは一般式 〔 1 ' 〕 のデラ ミ ノ マ イ シ ン A、 Bま た は Cの塩に は、 製薬学的に許容でき る 金属、 例え ばナ ト リ ウ ム、 カ リ ウ ム の如 き ア ルカ リ 金属 と の塩、 力 ル シ ゥ ム の如 き ア ル力 リ 土類金属 と の塩、 あ る いはア ン モニ ゥ ム塩があ る。
ま た、 第 2 の本発明 に よ る と、 次の一般式 〔 I〕
〔 I〕
Figure imgf000007_0001
〔式中、 Yは ヒ ド ロ キ シル基、 メ ト キ シ基 ま たは水素原 子を表 し、 Yはデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2では ヒ ド ロ キ シ ル基であ り 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2では メ ト キ シ基で あ り 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2では水素原子であ る 〕 で 表 さ れ る 免疫抑制活性を有す る新規な抗生物質、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マ イ シ ン C 2が提供 さ れ る。 1 〕 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の物理化学的 性質
(a) 第 1 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A (—般 式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 で Xが ヒ ド ロ キ シル基であ る 化合物） の物理化学的性状は下記の とお り であ る
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(2) 分子式 ： C2 SH 4306 N
(3) 元素分析 ： C29H4306 N ' H20と して
C H 0 N 実測値 67.37 % 8.79 % 21.22 % 2.61 % 計算値 67.03 % 8.73 21.55 % 2， 70 %
(4) 分子量 ： 501
(5) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス ス ぺ ク ト ル ： m Z z 500 C M - H ) - が観測さ れた。
(6) 紫外線吸収ス ペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中で測 定 した吸収 ピー ク を次に示す。 iMe0H腿 (Εϊ% ) 232(728)、 288(208)
(7) 赤外線吸収ス ペ ク ト ル （ K B r 法） 添付図面 の第 1 図に示す。
V KBr ： 3400、 2950、 2900、 1660、 1590、 1430、 1100、 950 cm"
(8) 1 H — N M R ス ペ ク ト ル （400MHz) ：
δ 6.13(lH, dd).5.80(lH, m), 5.79(lH, m),
5.57(1H, dd), 5.48(1H, dd).5.39(1H, m), 4.82(1H， s)， 4.03(1H， m)， 3.27(1H, br), 3.22(1H, m) 2.17(1H, m), 1.90(1H， m), 1.81 (2H， m)， 1.78(1H, m)， 1.71 (1H, m), 1.63(1H, in), 1.50(3H, s), 1.48C1H, m), 1.30(1H, m), 1.28(1H, m), 1.11 (1H, m), 1.06(1H, m), 0.99C3H, d), 0.92(3H, d), 0.91 (3H, dd), 0.91 (1H, m) 0.84(3H, d)
重 メ タ ノ ー ル中 メ タ ノ ー ル（3.30 ppm)を基準物 質 と して測定 した。
(9) 1 3 C — N M R スペ ク ト ル（100MHz) ：
5 204.8s, 192.9 s, 181.5 s, 138 Id, 137. Id, 131.6d, 131. Od, 130.8d, 129. Id, 101.3s, 79.7d, 78. Id, 71.6d, 51.5s， 48.3t, 45.5d, 44.3d, 44.3t, 43.6t， 43.5d, 40.5d, 37.2d, 35.7d, 28.3t, 24.3q, 22.9q, 16.5q, 15.4q, 11.0q
重 メ タ ノ ー ル中 メ タ ノ ー ル（49.00 ppm) を基準 物質 と して測定 し た。
αο) 溶解性 ： メ タ ノ ー ルに可溶、 水、 ア セ ト ン 、 ェ 一テル、 η —へキサ ン に難溶ま た は不溶であ る。 ΐ) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク 社製 シ リ カ ゲ ル 60 F 254 Art.5554使用） ： R f 値を次表に示す
Figure imgf000009_0001
α¾ 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びァニス ア ルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る。
(b) 第 1 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン B (—般 式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 で Xがメ ト キ シ基であ る化 合物） の物理化学的性状は下記の とお り であ る。
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(2) 分子式 ： C3。H 4506 N
(3) 分子量 ： 515
(4) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス ズぺ ク ト ル ： m Z z 514 〔 M— H〕 - が観測さ れた。
(5) 紫外線吸収ス ペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中で測 定 した吸収 ピー ク を次に示す。
AMe0H nm (E\% ) ： 232は 63)、 288(138)
max icm
(6) 赤外線吸収ス ペ ク ト ル （ K B r 法） ： 添付図面 の第 2 図に示す。
V KBr ： 3400、 2950、 2900、 1670、 1600、 1430、 1400、 1100 cm 1 max
(7) 1 H — N M R ス ペ ク ト ル （400MHz) ：
d 6.10(1H, dd), 5.99(1H. dd), 5.77(1H, m),
5.57(1 H, dd), 5.50 ( 1 H, dd) , 5.40 ( 1 H, m) ,
4.77(1H， s), 4.02(1H, m), 3.28(3H, s)， 3.22(1H, m), 2.99(1H, br), 2.17(1H, m), 1.80(1H, m), 1.79C1H, m), 1.77(1H, m), 1.64(1H, m), 1.62(1H, m), 1.53(1H, m), 1. 7(1H, m), 1.4K3H, s), 1.34(1H, m), 1.29(1H, m). 1.21 (1H, m), 1.02(1H, Hi), 1.00(3H. d).0.92(3H, dd), 0.9K3H, d), 0.88(1H. m), 0.72(3H. d)
重 メ 夕 ノ 一 ル中 メ 夕 ノ 一 ル （3.30 ppm)を基準物 質 と して測定 した。
(8) 1 3 C — N M R スぺ ク ト ル（100MHz) ：
d 204.2s, 189.2S, 179.6s, 137.8d, 136.7d, 131.0d, 131.0d, 130.6d, 128.6d, 104.4s( 86.1d, 77.9d, 71.0d, 52.6q, 51.6s, 47.8t, 46.4d, 44.3d, 44.2t, 43.8t, 41.9d, 38.6d, 38.6d, 34.8d, 28.4t, 23.7q, 16.4q， 16.4q， 10.7q
重 メ タ ノ ー ル中 メ タ ノ ー ル（49.00 ppm) を基準 物質 と して測定 した。
(9) 溶解性 ： メ タ ノ ー ル に可溶、 水、 ア セ ト ン 、 ェ 一テル、 n —へキサ ン に難溶 ま だ は不溶であ る。 ο) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク 社製 シ リ カ ゲ ル 60 F 2 δ 4 Art.5554使用） ： R f 値を次表に示す
Figure imgf000011_0001
(11) 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びァニスア ルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る 。
(c) 第 1 の本発明に よ る デラ ミ ノ マ イ シ ン C (一般 式 〔 I 〕 ま た は 〔 I ' 〕 で X が水素であ る 化合物） の と お り であ る。
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体 (2) 分子式 ： C2 9H430sN
(3) 分子量 ： 485
(4) F A B (Fast Atom Bombardment) マススぺ ク ト ル ： m z 484 〔 M — H〕 - が観測さ れた。
(5) 紫外線吸収スペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中で測 定 した吸収 ピー ク を次に示す。
ス MeOH nm (Ei% ) . 232(530), 286(144)
max lcm
(6) 赤外線吸収ス ペ ク ト ル （ K B r 法） ： 添付図面 の第 3 図に示す。 リ KBr ： 3400、 2950、 2900； 1650、 1560、 1430、 1400、 900 cm ― max
(7) ' H — N M R ス ペ ク ト ル （400MHz) ：
δ 6.02(1H. dd), 6.01 (1H, dd), 5.80(1H, m),
5.58(lH, dd), 5.48(lH, dd), 5.47(lH, m),
4.07(1H, m), 3.72(2H. br. s), 3.24C1H. m),
2.82(1H， br), 2.18(1H, m), 1.86(1H, m), 1.82(1H， m).
1.69(1H, m), 1.69(1H, m), 1.66(1H, m), 1.53(1H, m),
1.53(3H. s), 1.47(1H, m), 1.4K1H, m).1.30(1H, m), 1.26(1H, m), 1.12(1H, m), 1.01 (3H, d).0.94(3H， d)，
0.94(3H, dd), 0.91(1H, m), 0.78 (3H, d)
重 メ タ ノ ー ル中 メ タ ノ ール（3.30 ppm)を基準物 質 と して測定 した。
(8) 13 C — N M R ス ペ ク ト ル （100MHz) ：
(5203.3s.192.6s, 179.8s, 138.2d, 136.4d, 131.5d, 130.9d, 130.9d， 128. Od, 103.0s, 77.9d.70.5d, 51. I t, 50.5s, 47.6t, 45.5d, 44.3d, 44.3d, 44. Ot, 43.7t, 42.3d, 38.9d, 34.9d( 28.4t, 23.5q, 22.8q, 16.3q, 16.3q, 10.7q
重メ タ ノ ール中 メ タ ノ ー ル（49.00 ppm) を基準 物質 と して測定 した。
(9) 溶解性 ： メ タ ノ ールに可溶、 水、 ア セ ト ン 、 ェ 一テル、 n —へキサ ン に難溶ま たは不溶であ る。
(10) 薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ メ ノレ ク社製シ リ カ ゲ ル 60F 2 54 Art.5554使用） ： R f 値を次表に示す
Figure imgf000013_0001
(11) 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びァニスアルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る。
(d) 第 2 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 (— 般式 〔 II 〕 で Yが ヒ ドロ キ シル基であ る化合物） の 物理化学的性状は下記の通 り であ る。
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(2) 分子式 ： C 2 9 H 4 , 05 N
(3) 元素分析 ： C2 9H4 105N と して
C H 0 N 実測値 71.22 % 8.46 % 16.91 % 3.28 % 計算値 72.02 % 8.54 % 16.54 % 2.90 % to
CJ1 o n o
Figure imgf000014_0001
屮 Φ 1:) ( 4834 47.3t, 46.1d, 44.1d( 43.7d, 42.3t, 42.0d, 40.4d(
35.6d, 33.1d, 32.0t, 26.4t, 22.1q, 19.0q, 17.1q,
14.2q, 10.6q
重 ク ロ ロ ホ ノレ ム 中 重 ク ロ ロ ホ ゾレ ム （77.00 ppm) を基準物質 と して測定 した。
αο) 溶解性 ： メ タ ノ ー ル、 酢酸ェチル、 ク ロ 口 ホル ム、 エーテルに可溶、 η — へキサ ン、 水に難溶ま たは不溶であ る。
(11) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク社製シ リ カ ゲ ル 60F 254 Art.5554使用） ： R f 値を次表に示す
Figure imgf000015_0001
α¾ 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びァニスアルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る。
(e) 第 2 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 (— 般式 〔 I 〕 で Yが メ ト キ シ基であ る化合物） の物理 化学的性状は下記の通 り であ る。
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(2) 分子式 ： C3。H 4305 N
(3) 分子量 ： 497
(4) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス ス ぺ ク ト 60M寸、
Figure imgf000016_0001
< LT5
40.5d, 35.5d, 33. 1d, 32.3t, 27.0t, 22. 1q, 19.0q, 17.2q. 14.8q, 10.3q
重 ク ロ 口 ホ ルム 中重 ク ロ 口 ホルム （77.00 ppm) を基準物質 と して測定 した。
(9) 溶解性 ： メ タ ノ ー ル、 酢酸ェチ ル、 ク ロ 口 ホ ル ム、 エー テルに可溶、 n — へキサ ン、 水に難溶 ま た は不溶であ る。
ο) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ノレ ク 社製 シ リ カ ゲ ル 60F 2 5 4 Art.5554使用 ） ： R f 値を次表に示す
Figure imgf000017_0001
αι) 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びア ^スア ルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る。
(f) 第 2 の本発明 に よ る デ ラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 (— 般式 〔 E 〕 で Yが水素であ る 化合物） の物理化学的 性状は下記の と お り であ る。
(1) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(2) 分子式 ： C2 9H4 104N
(3) 分子量 ： 467
(4) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ススぺ ク ト ル ： m z 468 〔 M + H〕 + 、 466 〔 M — H〕 が観測 さ れた。
(5) 紫外線吸収スペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中で測
Figure imgf000018_0001
を基準物質 と して測定 した。
(9) 溶解性 ： メ タ ノ ー ル、 酢酸ェチル、 ク ロ 口 ホ ル ム に可溶、 水、 n — へキサ ン に難溶 ま た は不溶で あ る 。
αο) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ノレ ク 社製 シ リ カ ゲ ノレ 60 F 2 5 4 A r t . 5554使用 ） ： R f 値を次表に示す 展 開 溶 媒 系 R f 値 ク π 口 ホ ルム / メ 夕 ノ — ル /ァ ン モニ
ァ水 0， 80
( 40 ： 1 0 ： 1 ) ΐ) 呈色反応 ： バニ リ ン硫酸お よ びァ ニスア ルデ ヒ ド硫酸に対 して陽性であ る。
〔 2 〕 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C、 A 2 、 B 2 お よ び じ 2 の生物学的活性
本発明に よ る デラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B お よ び C な ら びにデ ラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 B 2 お よ び C 2 の各 々 は グラ ム陽性細菌に対 して強い抗菌作用 を有す る こ と が認 め ら れた。
脾細胞に は、 細胞性免疫に関与す る T細胞 （ T リ ンパ 球 と も 言 う ） と 抗体産生 ： 基づ く 免疫 に 関す る B 細胞 ( B リ ンパ球 と も言 う ） と が含有さ れる。 脾細胞に含有 さ れてレ、 る T細胞は、 T細胞に選択的に作用す る マ イ ト ジ ェ ンであ る コ ン カ ナ ノく リ ン Aで処理 さ れ る と、 活性化 さ れ芽球化即 ち幼若化 して増殖す る反応を起す こ と が知 ら れ る 。 しか し、 B 細胞は コ ン カ ナパ リ ン A処理を受 け て も活性化さ れず増殖 しない こ とが知 られる。 コ ン カ ナ バ リ ン A処理に よ り 活性化さ れた T細胞を含有する脾細 胞が増殖する反応の程度は、 T細胞に よ る 3H— チ ミ ジ ンの取 り 込み（incorporation) の量を測定する こ と に よ り 評価でき る。
或る化合物が T細胞に よ る細胞性免疫を抑制す る活性 を有するか否かは、 コ ン カ ナパ リ ン A処理さ れた脾細胞 をその化合物の存在下で培養 し、 その際の脾細胞の増殖 反応がその化合物に よ り 阻害さ れる程度を測定する こ と で判定でき る 〔参考文献 1 ； Larson, E. L. ら ： Mechanism of T cell activation. I . A screening of step one 1 i gands. 「Eur. J. Immunol. J 10巻， 93— 99 ( 1980), お よ び参考文献 2 : Ueno. M. ら ： Dethymicin, a novel immunosuppressant isolated from an Amycolatopsis. Fermentation, isolation, physico-chemical
properties and biological activities.
「 J. Antibiot.」 45巻， 1819〜 1826 ( 1992)参照〕 。
本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C、 A 2、 B 2 ま たは C 2 は コ ン カ ナバ リ ン A処理で活性さ れたマ ウ ス脾細胞が増殖する反応を阻害する活性を有する こ と が i n vitro の試験に よ り 認め られた。
更に、 或るマ ウ ス個体か ら取っ た脾細胞 （ リ ンパ球） を、 別のマ ウ ス個体か ら取 られて予 じめマイ ト マイ シ ン C処理を受けて刺激細胞（stimulator)と して作用する脾 細胞 （ リ ンパ球） と混合 し、 こ の よ う に混合 さ れた細胞 を培養する と、 前者の脾細胞 （反応細胞、 responder)に 含有さ れる T細胞が刺激さ れて芽球化即ち幼若化 して増 殖する反応を起す こ とが知 られる。
こ の反応は混合 リ ンパ球培養反応 （Mixed Lymphocyte Culture Reaction) と言われるが、 混合 リ ンパ球培養反 応において、 混合 さ れた リ ンパ球を培養する培地中に、 T細胞に選択的に阻害活性を示す化合物を添加 して置 く と、 混合 リ ンパ球培養反応での組織適合抗原依存性の T 細胞の増殖反応に対 し阻害する こ とが知 られる 〔参考文 献 1 ； Ishizuka. M. ら ： Induction of antitumor
resistance to mouse leukemia L 1210 by spergualins.
「 J. Antibiot.」 39巻， 1736〜 1743 ( 1986)お よ び参考文 献 2 ； Ueno.M. ら ： Dethymicin, a novel
immunosuppressant isolated from an Amycolatopsis. Fermentation, isolation, phys i co-chemi cal properties and biolo ical activities. 「 J. An t i b i o t . J 45巻， 1819〜 1826 ( 1992)参照〕 。
本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C . A 2 、 B 2 お よ び C 2 は混合 リ ンパ球培養反応の in vi tro試験 で反応細胞 と して働 く T細胞の増殖反応を阻害する活性 を有する こ とが認め られた。
更に ま た、 羊赤血球を抗原 と して注射さ れて免疫を受 けたマ ウ ス に、 羊赤血球を再度注射する こ と に よ り 遅延 型過敏症 （ D T H ) が起る現象を利用する こ と に よ り 、 或る 化合物が細胞性免疫を抑制する活性を有するか否か を評価する試験が知 られている 〔参考文献 1 ；
「 J. Antibiot. j 33巻， 642〜 652 ( 1990)お よ び参考文献 2 ； 「 J. Antibiot,」 45巻， 1819〜 1826 ( 1992)参照〕 。 羊赤血球を抗原 と して注射さ れたマ ウ ス の遅延型過敏 症の in vivo試験において、 本発明のデラ ミ ノ マイ シ ン 類（delaminomycins)は抑制活性を示 した。 一方、 B細胞 が関与す る抗体産生試験においては ま つ た く 阻害活性を 示さ なか っ た。 従っ て、 本発明に よ る一般式 〔 I 〕 ま た は 〔 1 ' 〕 お よ び一般式 〔 I〕 のデラ ミ ノ マイ シ ン類は 免疫抑制活性を も ち、 ま た抗菌活性 も有する。
こ れ らの結果か ら、 本発明のデラ ミ ノ マイ シ ン類は T 細胞を選択的に阻害する活性を有する と認め られ、 臓器 移植で必要 と さ れる免疫抑制剤（immunosuppressant) と して、 ま た細胞性免疫反応を原因 とする過敏免疫状態で あ る 自 己免疫疾患の治療に有用な薬剤 と しての用途があ る。 ま た、 あ る種の癌細胞に対 し癌細胞の増殖阻害活性 を示す事 も認め られる こ と よ り 本発明のデラ ミ ノ マイ シ ン類は抗癌剤 と しての用途があ る。 要約する と、 本発明 に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C、 A 2、 B 2 お よ び C 2 の各々 は グラ ム陽性菌感染症の治療に有用であ る と と も に臓器移植や自 己免疫疾患に有用な免疫抑制剤ま たは免疫調節剤 と しての用途があ る。 さ らに、 あ る種の 癌に対 して有用な抗癌剤 と しての用途があ る。
第 1 お よ び第 2 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C . A 2、 B 2 およ び C 2 の生理活性を後記の試験 例で評価 した。
試験例 1
マイ ト ジ ン に よ り 起さ れた脾細胞の増殖反応に対す デラ ミ ノ マイ シ ン の阻害活性
R P M I 1 6 4 0 培地 （ 10%、 牛胎児血清を含む） 中 に懸濁さ れた C D F , マ ウ ス脾細胞に供試化合物 （デラ ミ ノ マイ シ ン ） を種々 の濃度で添加 し、 更にマイ ト ジ ェ ン と して コ ン カ ナノく リ ン Aを 0.5 /mdとな る よ う に添 加 した後に 37°C、 5 %炭酸ガス濃度の条件下にて、 72時 間脾細胞を培養 した。 培養終了時の 16〜 18時間前に 3H — チ ミ ジ ンを添加 し、 その後、 細胞増殖を 3H— チ ミ ジ ン の細胞内取 り 込みを基準 と して判定 した。 ま た、 細胞 増殖を 50%阻害する供試化合物濃度、 すなわち I C 60値 も測定 した。 そ の脾細胞増殖に対する供試化合物の阻害 活性を次式の阻害率で評価 した。
阻害率 （ ） = 100- (T / C X 100) 但 し、 Tは供試化合物で処理 した時の 3H— チ ミ ジ ン の取 り 込み量を表わ し、 C は処理 しない時の取 り 込み量 を表わす。 得 られた試験結果を表 1 に示す。
Γ表】〕 Con Λによる脾臓リンパ球の幼若化と増殖反応による阻害活性 供試化合物濃度 阻害率 IC50 供試化合物
Figure imgf000024_0001
100 88 デラミノマイシン 25 57 17.5
A 6.25 31
1.56 0
inn 70
25 69
デラミノマイシン
6.25 77 4.0 B 1.56 0
0.39 0
100 76 デラミノマイシン 25 76
6.25 75 1.0 C 1.56 75
0.39 1
κη or: R
デラミノマイシン 12.5 95.1
3.1 76.3 0.78 A 2 0.78 50.5
0.20 1.5
50 96.7
デラ：ノマイシン 12.5 94.1
3.1 92.7 0.85
B 2 0.78 47.6
0.20 12.3
100 93 テフミノマイシン 25 85
6.25 84 1.6 C 2
1.56 49
0.39 0
0.1 0 試験例 2
混合 リ ンパ球培養反応（Mixed Lymphocyte Culture Reaction) に対す る デラ ミ ノ マイ シ ン の阻害活性
混合 リ ンパ球培養反応を行う ため、 刺激細胞 と して、 W K Y ラ ッ ト か ら採取 した脾細胞をマイ ト マイ シ ン C 50 g/m£ -V 37°C , 20分間処理 した も のを用 い、 反応細胞 と して、 フ ィ ッ シ ャ ー F 344 ラ ッ ト か ら採取 した脾細胞 のナイ ロ ン ウ ー ル非付着細胞を用 いた。 こ れ ら細胞を混 合 し、 混合 さ れた細胞を R P M I 1 6 4 0 培地 （ 5 %、 牛胎児血清を含む） 中にて、 種々 の濃度で添加 さ れる供 試化合物 （デラ ミ ノ マイ シ ン） の存在下又は非存在下で 培養する こ と に よ り 37 °C、 5 %炭酸ガス濃度の条件下で 120時間反応さ せた。 反応終了の 16〜 18時間前に 3H — チ ミ ジ ンを添加 し、 反応細胞への 3 H — チ ミ ジ ンの取 り 込みを液体 シ ンチ レ 一 シ ヨ ンカ ウ ン タ 一 にて測定 した。 混合 リ ンバ球培養反応に対する供試化合物の阻害活性は 阻害率 〔 100— (T Z C X 100), % ) で評価 した。 ま た、 こ の反 応 を 50% 阻害す る 供試化合物濃度、 す な わ ち I C 6。値 も測定 した。 その試験結果を表 2 に示す。
〔表 2〕 混合リ ンパ球培養反応に する阻害活性
Figure imgf000026_0001
試験例 3
マ ウ ス遅延型過敏症 （ D T H ) に対する デラ ミ ノ マイ シ ン の抑制効果
C D F , マ ウ ス に羊赤血球 （ 105 個 Zマ ウ ス ） を静注 して免疫後、 4 日 目 に羊赤血球 （ 108 個 Zマ ウ ス ） を足 跛に皮下注射 して感作させ、 遅延型過敏症 （ D T H ) を 惹起 した。 供試化合物は免疫後 0 〜 4 日 目 ま で毎日 1 回 腹腔内投与 した。 感作 5 日 目 に、 マ ウ ス足跛の厚さ を測 定す る事に よ り D T H に対する抑制効果を判 した。 」 の抑制効果は次式で算出 さ れる阻害率 （％ ) で評価 した 阻害率 （ ） = 100- (T ο ο ο ο / C X 100)
ι ^ »
但 し、 Tは供試化合物を投与 した時の足跛の厚さ を表 し、 C は供試化合物無投与の時の足摭の厚さ を表す。 得 られた試験結果を表 3 に示す。
1 C C t COOoOt
〔表 3〕 マウス遅延型過敏症に対する効果 ¾tt cn¾
投与量 投与時期 阻害率 供試化合物
Figure imgf000027_0001
(曰） （％)
1000 0~4 99.2 デラミノマイシン 250 0-4 85.3
A 62.5 0-4 52.8
15.6 0-4 0.1 デラミノマイシン
A2 デラミノマイシン
B2
Figure imgf000027_0002
試験例 4
癌細胞に対す る デラ ミ ノ マイ シ ンの増殖阻害活性 各種動物癌細 fl お よ び人癌細胞を培養 し、 こ れ ら の培 養癌細胞の增笳を 50 %阻害す る本発明のデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B 、 C , Α 2 、 Β 2 お よ び C 2 の濃度、 すなわ ち I C 5。値を测定 して癌細胞に対す る増殖阻害活性を評 価 した。 得 られた結果を表 4 に示す。
(¾4〕 癌欄 曾殖に女 -るデラミノマイシンの阻害 St生： 1 C50値 ( g/
7 "ラ ミ ノマイ シンの 1 し 50
彼 胞
A B C A 2 B 2 C 2 マウス白血病 L一 1210 >100 30.0 42.0 3.7 8.0 3.6 マウス白血病 P388Di 14.0 13.3 3.1 10.0 12.1 N.D. マウス白血病 EL - 4 17.9 11.1 1.9 4.1 6.8 N.D. マゥス黒色)！ B - 16 21.1 >100 7.4 8.3 17.9 N.D. ヒ ト リ ンパ腿 Jurkat 3.6 8.2 1.2 5.9 11.4 N.D. 注 ： N.D.は-^! を実 Miしないことを示す。
試験例 5
抗菌活性
さ らに本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン、 A、 B 、 C、 A 2 、 B 2 お よ び C 2 は各種の細菌に対 して抗菌活性を 有する。 寒天平板希釈法に よ っ て測定 した各種細菌お よ び糸状菌に対する本発明の新規抗生物質の最小生育阻止 濃度 （ M I C . ) ( i/τηβ ) の測定結果をそれぞれ表 5 a > 表 5 b 、 表 5 c お よ び表 5 d に示す。 [表 5 a〕
チ フ ノ マ イ シ ン の
Λ小生育阻止澳度 （ i/td 披 検 蹈
A B c
C or
2.5 丄 スタフィロコッカス ·ァゥレウス FDA209P 1 z スタフイロコッカス ·ァウレウス スミス 25
スタフィロコッカス ·ァウレウス MS9610 25 6.25 丄 上 Z スタフィロコッカス ·ァゥレウス No.5(M8SA) 25 Ό.2Ό
<3·丄 スタフイロコッカス *ァウレウス No.l7(MRSA) 25 C K
6.25 丄, ミクロコッカス ·ルテウス FDA16
ミクロコヅカス《ルテウス IF03333 6.25 3.12 l.OD ミクロコッカス *ルテウス PCI1001 100 6.25 l.DO バシラス ·アンスラシス 3.12 1.56 <0.7o バシラス ·サチリス NRRL B-558 6.25 6.25 3.12 バシラス ·サチリス PCI219 6.25 6.25 ΰ.12 バシラス ·セレウス ATCC10702 6.25 3.12 l.oo fi o
コリネパクテリゥム ·ボビス 1810 3.12
ェシエリキア.コリ NIHJ >100 、 >10n0 ェシエリキア'コリ K-12 >100 >100 >1UU ェシヱリキア ·コリ K-12ML1629 >100 >100 >100 ェシエリキア ·コリ BEM11 >100 >100 >100 ェシヱリキア ·コリ BE1121 >100 >100 >100 ェシエリキア ·コリ BE1186 >100 >100 >100 シゲラ ·ディセンテリエ JS11910 >100 >100 >100 シゲラ ·フレクスネリ 4b JS11811 >100 >100 >100 シゲラ ·ソンネィ JS11746 >100 >100 >100 サルモネラ，チフィ T-63 >100 >100 >100 サルモネラ ·ェンテリチジス 1891 >100 >100 >100 プロテウス ·ブルガリス 0X19 >100 >100 >100 プロテウス · ミラビリス Ιίϊ 0Ϊ-9 >100 >100 >100 プロテウス ·レツトゲリ GN311 >100 >100 >100 プロテウス ·レツトゲリ GN466 >100 >100 >100 セラチア ·マルセッセンス >100 >100 >100 シユードモナス ·ァエルギノーザ A3 >50 >60 >50 シユードモナス ·ァエルギノーザ G315 >100 >100 >100 クレプシエラ ·ニューモニエ PCI602 >100 >100 >100 マイコパクテリゥム *スメグマチス ATCC607 >100 >100 >100 注： Muller Hinton ¾天培地 (Difco让 )で 37'C、 1811き|1«培獍後に g'Tl した, (表 5 b〕
デ ラ ミ ノ マ イ シ ン，の ·、 最小生育胆止 «度
披 検 菌
A B C
カンジダ* トロピカリス F-1 > 100 > 100 >100 カンジダ ·シユードトロビカリス F-2 > 100 > 100 >100 カンジダ*アルビカンス 3147 >100 >100 >100 カンジダ Yu-1200 >100 >100 >100 カンジダ，クルゼィ F-5 >100 > 100 >100 サッカ οミセス ·セレビシァェ F-7 > 100 >100 >100 クリブトコッカス ·ネオホルマンス F-10 >100 >100 >100 ココリオボルス · ミヤべアヌス >100 > 100 >100 ビリキユラリア ·オリザェ >100 > 100 >100 ペリキユラリア ·ササキ > 100 >60 >50 キサントモナス ·シトリ >100 > 100 >100 キサントモナス《オリザェ >100 >100 >100 ァスペルギルス ·二ガー F-16 >100 >100 >100 トリコフィ トン *ァステロイデス 429 >100 >100 >100 トリコフィ トン ·メンタグロフィテス F-15(833) >100 > 100 >100 注： グルコース添加の栄锭祭天培地で 27て、 42時間培！？後に虾価した
ほ 5 c〕
デ ラ ミ ノ マ イ シ ン の Λ小生宵阻止 «度 披 検 ffi
A2 B2 C2 ス夕フィロコッカス ·ァゥレウス FDA209P 12.5 50 100 スタフイロコッカス《ァウレウス スミス 12.5 >100 >100 スタフイロコッカス *ァウレウス MS9610 12.5 >100 >100 スタフィロコッカス ·ァゥレウス No.5(lffiSA) 12.5 >100 >100 ス夕フィロコッカス ·ァゥレウス No.170KSA) 12.5 >100 >100 ミクロコッカス ·ルテウス FDA16 6.25 12.5 >100 ミクロコヅカス ·ルテウス IF03333 6.25 12.5 100 ミクロコッカス ·ルテウス PCI1001 12.5 >100 >100 パシラス ·アンスラシス 6.25 25 100 バシラス ·サチリス IffiKL B-558 6.25 >100 >100 バシラス，サチリス PCI219' 12.5 >100 >100 パシラス《セレウス ATCC10702 6.25 50 >100 コリネバクテリウム ·ボビス 1810 12.5 100 >100 ェシヱリキア ·コリ NIHJ >100 >100 >100 ェシエリキア ·コリ 1 [一 12 >100 >100 >100 ェシエリキア ·コリ K-12 IL1629 >100 >100 >100 ェシエリキア ·コリ BEM11 >100 >100 >100 ェシヱリキア ·コリ BE1121 >100 >10,0 >100 ェシ リキア ·コリ BE1186 >100 >100 >100 シゲラ，ディセンテリエ JS11910 >100 >100 >100 シゲラ ·フレタスネリ 4b JS11811 >100 >100 >100 シゲラ ·ソンネィ JS11746 >100 >100 >100 サルモネラ ·チフィ T-63 >100 >100 >100 サルモネラ，ェンテリチジス 1891 >100 >100 >100 プロテウス，ブルガリス 0X19 >100 >100 >100 プロテウス · ミラピリス IFM 0M-9 >100 >100 >100 プロテウス ·レツ トゲリ GN311 >100 >100 >100 プロテウス ·レツトゲリ GN466 >100 >100 >100 セラチア ·マルセッセンス >100 >100 >100 シユードモナス ·ァエルギノ一ザ A3 >50 >50 >50 シユードモナス ·ァエルギノーザ G 315 >100 >100 >100 クレブシエラ ·ニューモニエ PCI602 >100 >100 >100 マイコバクテリゥム，スメグマチス ATCC607 12.5 >1D0 >100 注： MuUer Hinton寒天培地 (Difco社 S4)で 37て、 18Bき |Bj培 後に 8Τ·価した。 30
[表 5 d〕
デラミノマイシン ft小生育阻止 «度
½ τΆ 快 ½ oa ( wf)
A 2 B 2 カンジダ · トロビカリス F-1 ヽ 100
カンジダ ·シユードトロビカリス F-2 >ιοο >ιοο カンジダ*アルビカンス 3147 >100 >100 カンジダ Yu-1200 >100 >100 カンジダ《クルゼィ P-5 >100 >100 サッカロミセス ·セレビシァェ F-7 >100 >100 ヮ、}7 7} 》不 ノレマノス p-10 >100 >100 ココリオボルス ·ミヤべアヌス >100 >100 ビリキユラリア ·オリザェ >100 >100 ペリキユラリア ·ササキ >50 >50 キサントモナス ·シトリ >100 >100 キサントモナス《オリザェ >100 >100 ァスペルギルス ·二ガー F-16 >100 >100 トリコフィ トン ·7ステ Dイデス 429 >100 >100 トリコフィ トン ·メンタグロフィテス Ρ- (833) >100 >100 注： グルコース添加の栄锭¾天培地で 27'C、 42時 11!)培^後に STiiした《
TJP 00845
31 さ ら に、 第 3 の本発明に よ る と、 ス ト レ プ ト ミ セ ス属 に属す る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の生産菌を 培養 し、 そ の培養物か らデラ ミ ノ マイ シ ン Aお よ び ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン B お よ び /ま たはデラ ミ ノ マ イ シ ン C を採取する こ とを特徴 とする、 免疫抑制活性 を有する新規な抗生物質、 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 お よ び /ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン B お よ び ま たはデラ ミ ノ マ イ シ ン C の製造法が提供さ れる。
本発明の方法に用 いる デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の生産菌はス ト レ プ ト ミ セス属の菌株でデラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B お よ び C の少な く と も 1 つの生産能を有 する も のであれば良 く 、 特に一つの菌株に限定さ れない 使用でき る デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の生産菌 の一例には平成 2 年 1 月 、 山梨県大月市の土壌よ り 分離 さ れた放線菌で M J 2 0 2 — 7 2 F 3 の菌株番号が付さ れた菌株があ る。
以下、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株の菌学的性状について 述べる。
1 . 形 態
M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株は、 分技 した基生菌糸 よ り 比 較的長い気菌糸を伸長 し、 その先端は 5 〜 6 回転の らせ んを形成する。 輪生技お よ び胞子の う は認め られない。 気菌糸の先端には 50個以上の胞子の連鎖を認め、 胞子の 大 き さ は 約 0.5〜 0. 7 X 0.8〜 1.2ミ ク 口 ン で あ っ た なお、 胞子の表面は と げ状あ る いはいぼ状を呈する。 2 . 各種培地にお ける生育状態
色の記載について 〔 〕 内に示す標準は、 コ ンテ イ ナ 一 · コ ー ポ レ ー シ ョ ン · ォブ ' ァ メ リ カ のカ ラ ー ' ノヽ一 モ ニ ー · マ 二 ユ ア ノレ (Container Corporation of America の color harmony manual) を用いた。
(1) シ ュ ク ロ ー ス · 硝酸塩寒天培地 （ 30°C培養）
無色〜 う す黄の発育上に、 部分的に明る い灰 〔 2 f e, Covert Gray) の気菌糸を着生 し、 溶解性色素 は認め られない。
(2) グル コ ース · ァスパラ ギ ン寒天培地 （ 30°C培養） 発育は う す黄、 気菌糸は着生せず、 溶解性色素 も 認め られない。
(3) グ リ セ リ ン · ァスパラ ギ ン寒天培地 （ I S P —培 地 5 、 30°C培養）
う す黄 〔 2 gc, Bamboo) の発育上に、 白の気菌糸 を う つ す ら と着生 し、 溶解性色素は認め られない。
(4) ス タ ーチ · 無機塩寒天培地 （ I S P—培地 4 、 30 で培養）
無色〜う す黄の発育上に、 明 る い灰 〔 3 fe， Silver Gray 〕 の気菌糸をわずかに着生する。 溶解性色素 は認め られない。
(5) チ ロ シ ン寒天培地 （ I S P —培地 7 、 30eC培養） う す黄 〔 2 gc, Bamboo) の発育上に、 白の気菌糸 を う つす ら と着生 し、 溶解性色素は認め られない。 (6) 栄養寒天培地 （ 30°C培養） 発育は う す黄、 気菌糸は着生せず、 溶解性色素は 認め られない。
(7) イ ー ス ト · 麦芽寒天培地 （ I S P —培地 2、 30°C 培養）
う す黄 〔 1 ½ ic, Lt Antique Gold] の発育上に - 部分的に明る い灰 〔 f , 〜 2 fe, Covert Gray) の 気菌糸を着生 し、 溶解性色素は認め られない。
(8) オー ト ミ ール寒天培地 （ I S P -培地 3、 30°C培 養）
う す黄の発育上に、 白の気菌糸をわずかに着生 し - 溶解性色素は認め られない。
(9) グ リ セ リ ン · 硝酸塩寒天培地 （ 30°C培養）
発育は無色〜う す黄、 気菌糸ば着生せず、 溶解性 色素は認め られない。
αο) ス タ ー チ寒天培地 （ 30°C培養）
発育は無色、 気菌糸は着生せず、 溶解性色素は認 め られない。
ΐ) リ ン ゴ酸石灰寒天培地 （ 3oec培養）
発育は無色、 気菌糸は着生せず、 溶解性色素は認 め られない。
¾ セ ル ロ ー ス （濾紙片添加合成液、 3o°c培養）
40日 間培養後 も生育は認め られない。
(13 ゼラ チ ン穿刺培養
15%単純ゼラ チ ン培地 （ 20°C培養） では、 発育は う す黄、 茶白の気菌糸をわずかに着生 し、 溶解性色 素は認め られない。 グル コ ース ' ペプ ト ン · ゼラ チ ン培地 （ 27°C培養） の場合、 発育は う す黄、 気菌糸 は着生せず、 溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる， (14) 脱脂牛乳 （ 30°Cお よ び 37°C培養）
30°C培養で、 発育は う す黄、 気菌糸は着生せず、 溶解性色素 も認め られない。 37°C培養の場合、 発育 は極めて悪 く 、 う す黄の発育がわずかに観察さ れる が、 気菌糸お よ び溶解性色素は認め られない。
. 生理的性質
(1) 生育温度範囲
グル コ ース · ァスノ ラ ギ ン寒天培地 （グルコ ース
1.0%、 L 一ァ ス ノ、°ラ ギ ン 0.05 %、 リ ン酸二力 リ ウ ム 0.05%、 紐寒天 3.0%、 PH7.0)を用い、 20。C、 24 °C、 27°C、 30で、 37°C、 50°Cの各温度で試験 した結 果、 50°Cを除き、 そのいずれの温度で も発育 したが .
37°Cの生育は極めて悪い。 なお、 生育至適温度は 27 。C〜 30°C付近と思われる。
(2) ゼラ チ ン の液化 （ 15%単純ゼラ チ ン培地、 20°C培 養 ； グル コ ース ' ペプ ト ン · ゼラ チ ン培地、 27°C培 養）
15 %単純ゼラ チ ン培地お よ びグルコ ー ス · ぺプ ト ン · ゼラ チ ン培地のいずれの場合 も 21日 間の観察で 液化性は認め られない。
(3) ス タ ー チの加水分解 （ス ダ一チ ' 無機塩寒天培地 お よ びス タ ーチ寒天培地、 いずれ も 30°C培養） いずれの培地において も水解性は認め られない。
(4) 脱脂牛乳の凝固 · ペプ ト ン化 （脱脂牛乳、 30°Cお よ び 37°C培養）
30°C培養では、 培養後 21日 目 頃よ り 凝固する こ と な く ペプ ト ン化が始ま るが、 その作用 は極めて弱い ,
37°C培養の場合、 生育は極めて悪 く 、 それ らの作用 は観察さ れない。
(5) メ ラ ニ ン様色素の生成 （ ト リ プ ト ン ' イ ース ト ' ブロ ス、 I S P —培地 1 ; ペプ ト ン ' イ ース ト ' 鉄 寒天培地、 I S P —培地 6 ; チ ロ シ ン寒天培地、 I
S P -培地 7 ； いずれ も 30°C培養）
いずれの培地で も陰性であ る。
(6) 炭素源の利用性 （プ リ ドハム · ゴ ド リ ーブ寒天培 地、 I S P —培地 9 ； 30°C培養）
D — グルコ ー ス、 イ ノ シ ト ールを利用 して生育 し シ ュ ク ロ ー ス、 D — マ ンニ ト ール、 ラ ク ト 一スは利 用 しない。 D — キ シ ロ ース、 D — フ ル ク ト ースの利 用 の存否は判然 とせず、 L — ァ ラ ビノ ース、 ラ 厶 ノ ース、 ラ フ イ ノ ースは、 おそ ら く 利用 しない と思わ れる。
(7) リ ン ゴ酸石灰の溶解 （ リ ン ゴ酸石灰寒天培地、 30 °C培養）
培養後 7 日 目 頃よ り、 リ ン ゴ酸石灰の溶解が認め られ、 その作用 は中等度であ る。
(8) 硝酸塩の還元反応（0.1 %硝酸カ リ ウ ム含有ぺプ ト ン水、 I S P —培地 8 、 30°C培養）
陰性であ る。
(9) セ ル ロ ー ス の分解 （濾紙片添加合成液、 30°C培養） 40日 間培養の観察では生育せず、 分解は認め られ ない。
以上の性状を要約する と、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株の 形態は、 分技 した基生菌糸よ り 5 〜 6 回転の らせん形成 を有す る気菌糸を伸長 し、 輪生枝お よ び胞子の う は認め られない。 気菌糸の先端には 50個以上の胞子を連鎖 し、 胞子の表面は と げ状あ る いはいぼ状であ る。 種々 の培地 で、 発育は無色〜 う す黄、 気菌糸の着生は悪いが、 2 〜 3 の培地では、 明 る い灰の気菌糸を部分的に着生する。 溶解性色素は認め られない。 生育至適温度は 27°C〜30°C 付近であ る。 メ ラニ ン様色素の生成は陰性、 スタ ーチの 水解性は認め られず、 蛋白分解力は弱い。
ま た、 細胞壁に含ま れる 2 , 6 — ジア ミ ノ ピメ リ ン酸 は L L 一型であ っ た。
こ れ ら の性状よ り 、 ^ 2 0 2 — 7 2 3 株は、 ス ト レ プ ト ミ セス （ Streptomyces) 属に属する と考え られる。 ス ト レ ブ ト ミ セス属の既知菌種を検索する と近縁の種 と して、 ス ト レ プ ト ミ セ ス ， ア ルプルス （Streptomyces albulus ， 文献， International Journal of Systematic Bacteriology, 22巻， 271頁， 1972年 ； 同誌， 30巻，
371頁， 1980年 ) お よ びス ト レ プ ト ミ セス ' ナ夕 レ ン シ ス （ Streptomyces natalensis, 文献， International 845
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Journal of Systematic Bacteriology, 22巻， 323頁， 1972年） があげ られた。 当面は、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株をス ト レ プ ト ミ セス - エス ピー ( Streptomyces sp. ) M J 2 0 2 — 7 2 F 3 と命名する。
なお、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株を工業技術院微生物ェ 業技術研究所 （ 日 本、 茨城県つ く ば市にあ る） に寄託申 請 し、 平成 3 年 12月 24日 、 微ェ研菌寄第 12674号 と して 受託さ れた。
更に、 M J 2 0 2 - 7 2 F 3 株 と、 前述の 2 菌株 < ス ト レ プ ト ミ セス · ァノレブルス I M C S — 0 8 0 2 ( I S P 5 4 9 2 ) 、 ス ト レ プ ト ミ セ ス ' ナ タ レ ン シス I M S S - 0 6 8 7 ( I S P 5 3 5 7 ) > とを実地に 比較検討 した。 その結果、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株 と上 記の両菌株は、 ゼラ チ ンの液化、 ミ ル ク の凝固、 ぺブ ト ン化、 及びス タ ーチの水解性にやや相違が認め られた。 しか し、 それ らの性質は変化 し易 く 、 大き な相違 と は考 え られない。 さ らに、 気菌糸の色調、 炭素源の利用性等 よ り 、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株はス ト レ ブ ト ミ セス ' ァ ルブルスに、 よ り 類似 していた。 そ こで、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株をス ト レ ブ ト ミ セス ■ アルプルス （ Strepto- myces albulus) M J 2 0 2 - 7 2 F 3 株 と同定 した 現在、 M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株はブダペス ト条約の規 約下に寄託を移行 さ れて上記の微生物工業技術研究所 (現在は生命工学工業技術研究所 と改称） に寄託番号 「 F E R M B P — 4 0 7 9 」 と して寄託さ れてあ る。 発明を実施する ための最良の形態
次に、 第 3 の本発明の方法に よ る抗生物質、 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の製造について説明する。
本発明に よ る新規抗生物質デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C は、 ス ト レ プ ト ミ セス属に属する デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の生産菌を適当な培地で培養する こ と に よ り 、 好ま し く は好気的条件下に培養する こ と に よ り 、 培地中に 目 的の抗生物質を産生、 蓄積さ せ、 次いで 培養物か ら 目 的の抗生物質を採取する こ と に よ り 製造す る こ とができ る。
培地はデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の生産菌が 利用 し う る任意の栄養源を含有する も のであ り う る。 具 体的には、 例えば、 炭素源 と して グルコ ース、 イ ノ シ ト ール、 マル ト 一スお よ び油脂類な どが使用でき、 窒素源 と して大豆粉、 綿実柏、 乾燥酵母エキス、 ボ リ ペプ ト ン お よ びコ ー ンステ ィ 一プ リ カ ーな どの有機物並びにア ン モニゥ ム塩ま たは硝酸塩、 例えば硫酸ア ンモニゥ ム、 硝 酸ナ ト リ ゥ ムお よ び塩化ア ンモニゥ ムな どの無機物が利 用でき る。 ま た必要に応 じて食塩、 塩化カ リ ウ ム、 炭酸 カ ル シウ ム、 リ ン酸塩、 重金属塩な どの無機塩類を培地 に添加する こ とができ る。 発酵中の発泡を抑制する ため に常法に従 っ て適当な消泡剤、 例えばシ リ コ ー ン系消泡 剤を添加する こ と も でき る。
培養方法 と しては、 一般に行なわれている生理活性抗 生物質等の生産のための微生物の培養方法であればよ く 、 特に好気的液体深部培養法が適 している。 培養温度は 20 〜 37°Cが適当であ るが、 27〜 30 °Cが好ま しい。 こ の方法 でデラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B お よ び C の生産量は、 振盪 培養、 通気攪拌培養共に培養 5 〜 7 日 間で最高に達する， こ の よ う に してデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C が培 地中に生産、 蓄積さ れて培養物が得 られる。
得 られた培養物中では、 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C は菌体中お よ び培養濾液中に存在するが、 菌体中 に よ り 主に存在する。 こ の よ う な培養物か らデラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B お よ び C を採取する には、 合 目 的な任意 の方法が利用可能であ る。 それ らの方法には、 抽出の原 理に基づ く 方法であ っ て、 具体的には、 例えば、 培養濾 液中か らデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C を水不混和性 の有機溶媒、 例えば酢酸プチル、 n — ブ夕 ノ ールな どで 抽出する方法があ る。 ま た菌体内のデラ ミ ノ マイ シ ン A . B お よ び C を回収する場合は濾過ま たは遠心分離な どで 得た菌体集体を メ タ ノ ール、 エタ ノ ール、 ア セ ト ンな ど で処理 して抽出する こ と に よ り 回収する方法があ る。 菌 体を分離せずに培養物をそのま ま を上記の抽出操作に付 す こ と もでき る。 適当な溶媒を用いた向流分配法 も抽出 方法の範ち ゅ う に入れる こ とができ る。 例えば遠心分配 ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ Centrifugal Partition
Chromatograph ； 三鬼ェ ン ジ ニ ァ リ ン グ社製 C P C ) (注 ； C P C は商標名） も使用でき る。
培養物か ら デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C を採取 す る 他の方法の ひ とつは、 吸着の原理に基づ く も のであ る 。 例え ば、 培養濾液あ る い は上記の よ う に して抽出操 作を行な う こ と に よ っ て得 ら れ る 抽出液を用 い、 適当 な 吸着剤、 ゲル濾過剤、 例え ば、 シ リ カ ゲル、 セ フ ア デ ッ ク ス L H — 20 ( フ ア ルマ シア社製） 、 ト ヨ ノ、。一ル H W— 40 (東 ソ 一社製） 、 ダイ ヤ イ オ ン H P — 20 (三菱化成ェ 業社製） な どを用 いたカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 ヌ ク レ オ シル 5 C , 8 (西独ナ ー ゲル社製） な どを用 いた高速 液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ 一又はそ の他の手段に よ っ て 目 的 の抗生物質を吸着剤に吸着 さ せ、 そ の後溶離 さ せ る こ と に よ り デ ラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B お よ び C を単独に又は 混合物 と して得る こ とができ る。 こ の よ う に して得 られ たデラ ミ ノ マ イ シ ン A お よ び ま た はデラ ミ ノ マ イ シ ン B お よ び Z ま た はデラ ミ ノ マ イ シ ン C の含有溶液 を減圧濃縮乾固すれば、 デラ ミ ノ マイ シ ン A お よ び ま た はデラ ミ ノ マ イ シ ン B お よ び Zま た はデラ ミ ノ マ イ シ ン C の粗標品が得 られ る 。
こ の よ う に して得 られ る デラ ミ ノ マ イ、シ ン A お よ び _ ま た はデラ ミ ノ マイ シ ン B お よ びノ ま たはデラ ミ ノ マ イ シ ン C の粗標品を更に精製す る ために は、 上記の抽 出法お よ び吸着法を必要に応 じて組み合わせ必要回数行 な え ば よ い。 例え ば、 ダ イ ヤ イ オ ン H P — 20、 セ フ ァ デ ッ ク ス L H _ 20 (商品名 ） な どの吸着剤 ま た はゲル濾 過剤を用 いた カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー、 C P C を用 い た遠心液 々 分配 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 シ リ カ ゲルを用 い た順相 ク ロ マ ト グラ フ ィ ーお よ び ヌ ク レ オ シル 5 C ! 8な どを用いた高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ーを適宜組合わせ て実施する こ とができ る。
更に、 本発明者 ら は研究を進めて、 その結果、 上記の 一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 1 ' 〕 で表さ れる抗生物質デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B ま たは C を無水の有機溶媒中に溶解 し、 その溶液を無機酸 と と も に撹拌する と、 脱水を伴 う 閉環反応が起きて前記の一般式 〔 I 〕 で表さ れる抗生物 質デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 ま たは B 2 ま たは C 2 を生成 する こ とが認め られた。
従って、 第 4 の本発明に よ る と、 デラ ミ ノ マイ シ ン A ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン B ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン C を、 脱水閉環反応にかける こ とを特徴 とする、 新規 な抗生物質デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン B 2 ま たはデラ ミ ノ マイ シ ン C 2 の製造法が提 供さ れる。
こ の第 4 の本発明の方法を実施する には、 原料 と して デラ ミ ノ マイ シ ン A ま たは B ま たは C を無水の有機溶 剤、 例えば メ タ ノ ー ル、 エタ ノ ール、 n — ブ夕 ノ ー ルま たはアセ ト ン に とか し、 その溶液へ無機酸、 例えば塩酸 ま たは硫酸を加えて室温ま たは加温下に反応する こ とが でき る。 反応液か ら 目 的のデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 ま た は B 2 ま たは C 2 を採取する のには、 溶剤を留去後に、 得 られた残渣を各種の ク ロマ ト グラ フ ィ 一法にかける こ と に よ り 行い得る。 第 1 の本発明に よ る一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 1 ' 〕 のデ ラ ミ ノ マイ シ ン A ま たは B ま たは C ま たはそれ らの塩 あ る いは第 2 の本発明に よ る一般式 〔 I 〕 のデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 ま たは B 2 ま たは C 2 は、 免疫抑制剤ま た はそ の他の医薬 と して使用する場合、 製薬学的に許容で き る通常の固体ま たは液体状の担体 と混和する こ と に よ り 医薬組成物 と して製剤でき る。
従っ て、 第 4 の本発明に よ る と、 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン B、 デラ ミ ノ マイ シ ン C 、 デ ラ ミ ノ マイ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 お よ び デラ ミ ノ マイ シ ン C 2 か らな る群よ り 選ばれる少 く と も 1 つの抗生物質ま たはそれの製薬学的に許容さ れる塩 を有効成分 と して含有 し且つこ れ と混和 さ れた製薬学的 に許容でき る 固体ま たは液体状の担体を含有する医薬組 成物が提供さ れる。
本発明に よ る一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 あ る いは一 般式 〔 I 〕 のデラ ミ ノ マイ シ ン類の 1 種又はそれ以上を 免疫抑制剤ま たは免疫調節剤あ る いはその他の医薬 と し て用いる場合は、 一般に経口的にま たは非経口的に投与 でき る。
デラ ミ ノ マイ シ ン A は I C Rマウ スに腹腔内投与 し た場合に 500 mg kg以上の L D 5 β値を示 し、 毒性が極め て低い。
本発明の組成物における有効成分化合物、 すなわち、 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B、 C、 ま たはそれ らの塩、 あ る レ、 はデ ラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 B 2 ま た は C 2 は単独 に、 ま た は賦形剤あ る い は担体 と混合 して注射剤、 経 口 剤 ま た は坐剤な どの製剤の形で投与 さ れ る 。 賦形剤お よ び担体 と して は製薬学上許容 さ れ る も のが選ばれ、 そ の 種類お よ び組成は投与経路や投与方法に よ っ て決 ま る。 例え ば、 液状担体 と して水、 ア ル コ ー ル も し く は大豆油 . ゴマ油、 ミ ネ ラ ル油な どの動植物油、 ま た は合成油な ど が用 い られ る 。 固体担体 と してマ ル ト 一 ス、 シ ュ ク ロ ー スな どの糖類、 リ ジ ン な どのア ミ ノ 酸類、 ヒ ド ロ キ シプ 口 ピルセ ル ロ ー スな どのセ ル ロ ー ス誘導体、 シ ク ロ デキ ス ト リ ン な どの多糖類、 ス テア リ ン酸マ グネ シ ウ ムな ど の有機酸塩な どが使用 さ れ る。
注射剤 と して製剤す る 場合に は、 一般に生理食塩水、 各種緩衝液、 グル コ ー ス、 イ ノ シ ト ー ル 、 マ ンニ ト ー ル な どの糖類溶液、 エチ レ ン グ リ コ ー ル、 ポ リ エチ レ ン グ リ コ ー ルな どの グ リ コ ー ル類が望ま しい。 ま た、 イ ノ シ ト 一 ノレ 、 マ ン ニ ト ー ノレ、 グル コ ー ス、 マ ン ノ ー ス 、 マ ル ト 一 ス、 シ ュ ク ロ ー スな どの糖類、 フ エ 二ルァ ラ ニ ンな どのァ ミ ノ 酸類な どの賦形剤 と共に凍結乾燥製剤 と し、 それを投与時に注射用 の適当 な溶剤、 例え ば滅菌水、 生 理食塩水、 ブ ド ウ糖液、 電解質溶液、 ア ミ ノ 酸な どの静 脈投与用液体に溶解 して用 い る こ と も でき る。
製剤 さ れた組成物中 にお け る デラ ミ ノ マ イ シ ン化合物 の含量は製剤型に よ り 種々 異な る が、 通常は 0 . 1— 1 0 0 重量％、 好 ま し く は 1 — 9 0重量％であ る 。 例えば注射液 の場合には、 通常 0 . 1— 5 重量％のデラ ミ ノ マイ シ ン化 合物を含むよ う にす る こ とがよ い。 経口投与の場合には、 前記固体担体 も し く は液状担体 と共に錠剤、 カ プセル剤、 粉剤、 顆粒剤、 ドラ イ シ ロ ッ プ剤、 液剤、 シ ロ ッ プ剤な どの形態で用い られる。 カ プセル、 錠剤、 顆粒、 粉剤の 場合、 一般にデラ ミ ノ マイ シ ン化合物の含量は 3 — 1 0 0 重量％、 好ま し く は 5 — 9 0重量％であ り 、 残部は担体で あ o
本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン ま たはその塩の投与量 は、 患者の年令、 体重、 症状、 治療目 的な どによ り 決定 さ れるが、 投与量は一般的な指針 と して非経口投与で 1 一 1 0 0 mg kgノ 日、 ま た経口投与で 5 — 500 mg / kg Z日 であ る。 しか し、 その投与量は動物試験の結果な ど種々 の状況を勘案 して総投与量が一定量を越えない範囲で、 連続的ま たは間 けつ的に投与でき る。
非経口投与の場合におけ る その総投与量は投与方法、 患者の状況、 例えば年令、 体重、 性別、 食事、 併用薬剤 な どに応 じて適宜変更 して投与する こ とは も ち ろんであ る。 一定の条件下における適量 と投与回数は、 上記の指 針を基に して専門医の決定によ らな ければな らない。 こ れ らの投与条件は経口投与において も同様である。
第 1 の本発明に よ る一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 1 ' 〕 のデ ラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C な ら びに第 2 の本発明に よ る一般式 〔 H 〕 のデラ ミ ノ マイ シ ン A 2、 B 2 お よ び C 2 は水に対 して極めて難溶性であ り 、 かつ経口投与 JP93/00845
45 時に消化管で吸収さ れ難い性状であ っ た。 本発明者 ら は 前記デラ ミ ノ マイ シ ン類に関 して易溶 とな り 、 かつ経口 吸収さ れやすい性状を有 し、 すなわち、 注射剤 と しての 調製が容易 と な り 、 さ ら に経口吸収効率を向上させた新 親な誘導体を合成する こ と を 目 的 と して研究を続けた。
そ こ で本発明者 ら は水溶性を高めたデラ ミ ノ マイ シ ン の種々 な誘導体を合成 して種々 検討 した。 その結果、 次 の一般式 〔 m〕
〔 I〕
Figure imgf000047_0001
〔式中、 Rは硫酸基 （ - S03H) ま たはその製薬学的に許 容さ れる塩を示 し、 Yはデラ ミ ノ マイ シ ン A 2では ヒ ドロ キ シル基であ り 、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2では メ ト キ シ基であ り 、 ま たデラ ミ ノ マイ シ ン C 2では水素原 子であ る 〕 で表 さ れる デラ ミ ノ マイ シ ン A 2、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マイ シ ン C 2 の新規 な硫酸エステルま たはその製薬学的に許容される塩を合 成する こ と に成功 し、 こ れ らが高い水溶性を もつ こ と、 お よ び経口投与時の吸収効率が向上する こ と、 並びに免 疫抑制活性を有する こ とを見出 した。
従っ て、 第 5 の本発明に よれば、 上記の一般式 〔 II〕 で表さ れる デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マイ シ ンの硫酸エステルま たはそれ の製薬学的に許容さ れる塩が提供さ れる。
本発明に よ る一般式 〔 ΠΙ〕 の化合物を製造する には、 例えば次の よ う な方法を行 う のがよい。 すなわち、 デラ ミ ノ マイ シ ン Α 2 ま たは Β 2 ま たは C 2 に、 非プロ ト ン性溶媒中で硫酸化剤を作用 させる。 硫酸化剤の量は原 料デラ ミ ノ マイ シ ン Α 2 、 Β 2 ま たは C 2 に対 し、 通 常は等モル以上使用すればよい。 硫酸化剤 と しては無水 硫酸一 ピ リ ジ ン複合塩、 ク ロ ルスルホ ン酸な どがあげ ら れる。 硫酸化反応の溶媒 と しては Ν， Ν — ジ メ チルホル ムア ミ ド、 ピ リ ジ ンな どが好ま しい。
反応中に加え る 中和剤 と して、 ピ リ ジ ン、 ト リ ェチル ァ ミ ンな どの有機塩基、 水酸化カ ルシウ ム、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム、 炭酸カ リ ウ ムな どの無機塩基を使用する こ と ができ る。 反応温度は通常使用する溶媒の沸点以下で行 われるが、 好ま し く は一 20て〜室温程度で行われる。
硫酸エステル化さ れた一般式 〔 1〕 の化合物は、 こ れ を含む反応液を水 と酢酸ェチ ルあ るいはジ ク 口 口 メ 夕 ン な どで抽出 した後、 一般式 〔 IK〕 の 目 的化合物の含有層 を濃縮する。 得 られた濃縮残查は必要に応 じてカ ラ ム ク 口 マ ト グラ フ ィ 一等にて精製後、 常法に よ り 単離する こ と に よ り 第 5 の本発明に よ る一般式 〔 M〕 の化合物を得 る こ とができ る。
第 5 の本発明に よ る一般式 〔 ΠΙ〕 の硫酸エステル誘導 体は常法に よ り 非毒性の金属例えばナ ト リ ウ ム、 力 リ ウ ムの如 き アルカ リ 金属、 あ る いは有機塩基例えば ト リ エ チルァ ミ ン と塩を形成さ せる こ とができ る。
第 5 の本発明に よ っ て得 られる一般式 〔 II〕 の化合物 特にそれのナ ト リ ウ ム塩の氷に対する溶解性は、 対応す る硫酸エステル型でない化合物に比べ大巾 に上昇 し、 水 に対 し易溶 と な っ た。
( a ' ) 第 5 の本発明に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 の 硫酸エステル （一般式 〔 II〕 で Yが ヒ ドロ キシル基で あ る化合物） のナ ト リ ウ ム塩の物理化学的性状を示す , (1) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク社製シ リ カ ゲル 60 F 2 5 4 Art.5554使用 ) ：
Rf 0.65 (展開溶媒 ： 2 — プロパノ 一ル
ア ン モニア水 /水 = 9 ： 1 ： 2 )
Rf 0.15 (展開溶媒 ： ク ロ 口 ホルム メ タ ノ ール / ア ン モニア水 = 40： 10： 1 )
(2) 呈色反応 ：
バニ リ ン硫酸に対 して陽性であ る。
(3) 物質の色お よ び性状 ：
無色〜白色、 固体
(4) 分子式 ： C29H4。08 NSNa (5) 元素分析 ： C2 9H4。08 NSNa - 2 H20と して
C H 0 N S Na 実測値 （％ ) 55.83 6.81 N. D. 1.94 5.06 . N. D. 計算値 （％ ) 56.03 7. 13 25.73 2.25 5. 15 3.70
( N. D. は測定 して いな い こ と を表す） 。
(6) 分子量 ： 585
(7) 負イ オ ン高分解能 F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス スペ ク ト ル ：
C2 9H4 o08 NSNa ( ( M - N a)" ， m / z ) と して 実測値 562.2471
計算値 562.2475
(8) 紫外線吸収スペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中に測定 した吸収 ピー ク を示す。
, MeOH n一 1¾ 232 (492)
(9) 赤外線吸収スペ ク ト ル （ K B r 法） 添付図面の 第 7 図に示す。
V KBr
Max 3430, 2950, 2900, 1785, 1710, 1680, 1250, 1210, 1060,
940 cm"' αθ) 1 Η - N M R スペ ク ト ル（400MHz) ：
5 8.0(1H, m), 6.0(2H, m), 5.4-5.6(4H, m).5.0(1H, s), 4.2(1H, m), 3.0(3H, m), 2.3~2.6(3H, m) , 2.0(2H, m) , 1.6~1.8(4H, m), 1.4~1.5(4H， m), 1.5(3H, d),
0.9~1.0(9H, m), 0.7(3H. d)
重 ク ロ 口 ホ ルム中 T M S ( 0 ppm)を基準物質 と し て測定 した。
(11) 1 3 C _ N M R スぺ ク ト ノレク（100MHz)：
(5 212. l(s), 202.4(s), 169.3(s)， 136.4(d)， 134.1(d) 130.7(d), 129.9(d), 128.3(d).126.8(d), 85.9(d), 78.6(d)71.0(s), 54.1(s), 47.2(t), 46.0(d), 44.4(d) 43, 8(d), 42.4(t), 40.4(d)' 39.3(d), 35.5(d),
33.2(d), 32.0(t), 22.1 (t, q), 19.5(q), 17.3(q), 17. l(q), 9.9(q)
重 ク ロ 口 ホ ルム 中 ク ロ 口 ホルム （77.00 ppm) を基 準物質 と して測定 した。
¾ 溶解性 ： 水、 メ タ ノ ー ル、 酢酸ェチル、 ク ロ ロ ホ ルム に可溶、 エー テル、 η — へキサ ン に難溶 ま た は 不溶であ る。
( b ' ) 第 5 の本発明 に よ る デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 の 硫酸エス テル （一般式 〔 Π〕 で Υが メ ト キ シ基であ る 化合物） のナ ト リ ウ ム塩の物理化学的性状を示す。
(1) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク 社製 シ リ カ ゲル 60F 25 4 Art.5554使用） ：
Rf 0.19 (展開溶媒 ： ク ロ 口 ホルム / メ タ ノ ー ル Z
ア ン モ ニ ア水 = 40 ： 10 ： 1 )
(2) 呈色反応 ：
バニ リ ン硫酸に対 して陽性であ る。
(3) 物質の色お よ び性状 ：
無色〜白色、 固体
(4) 分子式 ： C3。H 4208 NSNa (5) 分子量 ： 599
(6) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス ス ぺ ク ト ノレ ： m / z 576 ( M - N a )-
(7) 紫外線吸収スペ ク ト ル ： メ タ ノ ー ル溶液中 に測定 した吸収 ピー ク を示す。
Figure imgf000052_0001
(E 1% ： 2 2 (470)
(9) 赤外線吸収ス ペ ク ト ル （ K B r 法） ：
：
Figure imgf000052_0002
3450, 2900, 1780, 1710, 1200-1250, 940 cnf， αο) 1 3 C — N M R ス ぺ ク ト ノレ （ 10 OMH z ) ：
δ 53.0(q), 85.9(d)
αΐ) 溶解性 ： 水、 メ タ ノ ー ル、 酢酸ェチ ル、 ク ロ ロ ホ ルム に可溶、 エー テ ル、 η — へキサ ン に難溶 ま た は 不溶であ る 。
( c ' ) 第 5 の本発明 に よ る デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の 硫酸エステル （一般式 〔 1〕 で Υが水素であ る 化合物） のナ ト リ ゥ ム塩の物理化学的性状を示す。
(1) 薄層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ メ ル ク 社製 シ リ カ ゲル 60F 2 54 Art.5554使用 ) ：
f 0.27 (展開溶媒 ： ク ロ 口 ホ ルム メ タ ノ ー ル Z
ア ン モ ニ ア水 = 40 : 10 : 1 )
(2) 呈色反応 ：
バニ リ ン硫酸に対 して陽性であ る 。
(3) 物質の色お よ び性状 ： 無色〜白色、 固体
(4) 分子式 ： C2 9H4。07 NSNa
Β a
(5) Γ X分子量 ： 569
(6) F A B (Fast Atom Bombardment) マ ス ス ぺ ク ト ル m / z 546 ( M - N a )-
(7) 紫外線吸収スペ ク ト ル ： メ タフ ー ル溶液中に測定
. H
した吸収 ピー ク を示す。
(Ε \% ： 232 (502)
Max
(8) 赤外線吸収ス ペ ク ト ル （ K B r 法） v 3430, 2950, 2310, 1790, 1710, 1240, 1210, 1040 cnT
(9) ' Η — N M R ス ぺ ク ト ル （400MHz) ：
δ 3.9(1Η, d).3.7(1Η, d),
重 ク ロ 口 ホルム中 T M S ( O p pm)を基準物質 と して測定 した。
αο) 1 3 C — N M R ス ぺ ク ト ノレ （100MHz) ：
δ 50.9(t), 86. 1 (d) 、
重 ク ロ ロ ホ ノレ ム中 ク ロ 口 ホ ル ム （77.00 ppm) を 基準物質 と して測定 した。
(11) 溶解性 ： 水、 メ タ ノ ール、 酢酸ェチル、 ク ロ ロ ホ ルム に可溶、 エーテル、 n — へキサ ン に難溶ま たは 不溶であ る。
次に、 一般式 〔 BI〕 で表わさ れる第 5 の本発明の化合 物のナ ト リ ウ ム塩がマ ウ ス遅延型過敏症 （ D T H ) に対 する抑制効果を示 し、 従っ て免疫抑制活性を有する こ と を次の試験例に よ り 示す。
試験例 6
C D F ！ マ ウ ス に羊赤血球 （ 105 個 /マ ウ ス） を静注 して免疫後、 4 日 目 に） 羊赤血球 （ 108 個 マ ウ ス） を 足躕に皮下注射に よ り 感作 して遅延型過敏症を惹起 した。 供試化合物は免疫後 0 〜 4 日 まで毎日 1 回、 経口投与 し、 感作 5 日 目 にマ ウ ス足跛の厚さ を測定する こ と に よ り 抑 制効果を判定 した。 こ の抑制効果は次式で算出 さ れる 阻 害率 （ ％ ) で評価 した。
阻害率 （ ） = 100- (T / C X 100)
ただ し、 T は供試化合物を投与 した時の足躕の厚さ を 表 し、 C は供試化合物無投与の時の足跛の厚さ を表す。
その結果を次の表 6 に示す。
〔表 6〕 マウス遅延型過敏症に対する効果 投与量 投与時期 阻害率 供試化合物
(mZマウス） (曰） {%) デラミノマイシン A2 8. 0 0〜4 85. 2
2. 0 0〜4 56. 3 硫酸エステル （Na塩） 0. 5 0〜4 -0. 7 、 .ノ ϋ
丁つ ノマインノ Β 2 2. 0 Π〜 4 A 0 9 エス "ノレ tJNa デラミノマイシン C2 硫酸エステル （Na塩） 2. 0 0〜4 35. 4
デラミノマイシン A2 8. 0 0〜4 36. 1
2. 0 0〜4 23. 4
0. 5 0〜4 7. 7 デラミノマイシン B2 2. 0 0〜4 1 8. 4 デラミノマイシン C2 2. 0 0〜4 25. 7 第 5 の本発明に よ る一般式 〔 II〕 のデラ ミ ノ マイ シ ン A 2、 B 2 お よ び C 2 の硫酸エ ス テ ル も 、 免疫抑制剤 ま たはその他の医薬 と して使用する場合、 製薬学的に許 容でき る通常の固体ま たは液体状の担体 と混和する こ と に よ り 医薬組成物 と して製剤でき る。
従っ て、 第 6 の本発明に よ る と、 一般式 〔 ΠΙ〕 で表さ れる デラ ミ ノ マイ シ ン Α 2 の硫酸エ ス テ ル、 デラ ミ ノ マ イ シ ン Β 2 の硫酸エ ス テ ル、 デ ラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の硫酸エステルお よ びこ れ らの製薬学的に許容さ れる 塩よ り 群か ら選ばれる少な く と も 1 つの抗生物質を有効 成分 と して含有 し且つ こ れ と混和 さ れた製薬学的に許容 でき る固体ま たは液体状の担体を含有する 医薬組成物が 提供さ れる。
一般式 〔 m〕 の硫酸エステル化合物 も、 前記の第 4 の 本発明に よ る 医薬組成物 と同様に製剤でき、 それの有効 成分化合物の投与量 も一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 1 ' 〕 あ る いは一般式 〔 II 〕 のデラ ミ ノ マイ シ ン化合物 と同様な範 囲であ り 得る。 、
図面の簡単な説明
第 1 図はデラ ミ ノ マイ シ ン Aの K B r デ ィ ス ク法に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る。
第 2図はデラ ミ ノ マイ シ ン Bの K B r ディ ス ク 法に よ る赤外部吸収スペ ク ト ル図であ る。
第 3 図はデラ ミ ノ マイ シ ン Cの K B r ディ ス ク法に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る。 第 4 図はデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 の K B.r デ ィ ス ク 法 に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る。
第 5 図はデラ ミ ノ マイ シ ン B 2 の K B r デ ィ ス ク 法 に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る。
第 6 図はデラ ミ ノ マイ シ ン C 2 の K B r ディ ス ク 法 に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る。
第 7 図 は デ ラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の硫酸エ ス テ ル の K B r デ ィ ス ク 法に よ る赤外部吸収スぺ ク ト ル図であ る 以下、 本発明を実施例に よ り 更に具体的に説明するが 本発明は こ れ ら実施例に限定さ れない。
以下において 「 」 は 「 w Z v , %」 を示す。
実施例 1
本例は M J 2 0 2 - 7 2 F 3 株の培養に よ る抗生物質 デラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C の製造例を示す。
(1) 種母の調製
種母の調製に使用 した培地は、 下記の成分を 1 ^ の水に溶解 した組成の も のであ る。 p H は無調整 と した。
グル コ ー ス 1.5 % 酵母エキス （大五栄養社製） 0.25% カザ ミ ノ 酸 （ディ フ コ社製） 0.25% 炭酸カ ノレ シ ゥ 厶 0.4 % 上記培地 110m を 500τη の三角 フ ラ ス コ に分注 し 殺菌後、 ス ト レ ブ ト ミ セ ス ' エス ピー M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株 （微ェ研菌寄第 12674号ま たは F E R Μ B P - 4 0 7 9 ) をス ラ ン ト よ り 1 白金耳摂取 し 30°C、 180 rpm の ロ ー タ リ ー シ ェ ー カ ー にて 72時間 回転培養 した も のを種母 と して得た。
(2) 培 養
生産培地 と して使用 した培地は、 下記の成分を 1
£ の水に溶解 した組成の も のであ る。 p H は無調整 と した。 こ の培地を 1 ずつ 500^の三角 プ ラ ス コへ分注殺菌 した も のへ、 上記種母 2. を添加 し
D — 々 リ ー シ ェ ー カ ーを用レヽて 27 °C、 180 rpm にて 攪拌下に培養を行な っ た。
グル コ一ス 3.0 %
酵母ヱキス （大五栄養社製） 0.5 %
カザ ミ ノ 酸 （ディ フ コ社製） 0.5 %
NaN03 0.2 %
KC 0.2 %
CaC03 0.4 %
(3) 抗生物質デラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン B お よ び Zま たはデラ ミ ノ マイ シ ン C の採取 上記（2)の条件で 6 日 間の M J 2 0 2 — 7 2 F 3 株 を培養の後、 培養液約 20 ^ を遠心分離 し (3000 rpm,
15分間） 、 菌体を メ タ ノ ールで抽出処理後、 メ 夕 ノ 一ルを溜去 した後、 残っ た水層を n — ブ夕 ノ ールに て抽出 し、 n —ブ夕 ノ ー ル層を減圧下にて濃縮乾固 した。 得 られた粗抽出物約 3 g を遠心液々 分配ク ロ マ ト グラ フ ( C P C ， 三鬼ェ ン ジニア リ ン グ） に付 す。 ク ロ ロ ホ ノレ 厶 ー メ タ ノ 一 ノレ 一 水 （ 2 ： 2 ： 1 ) の下層 を固定相 と し、 上層 を移動相 と して 20DC、 400 rpm 、 1 /minの条件下、 上昇法にて分離精製 を行な っ た。 正溶出画分にデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C は溶出 さ れ、 こ れを減圧下濃縮乾固 した 得 られた粗精製物 830mgをセ フ ア デ ッ ク ス L H — 20 ( フ ァ ノレマ シア社製） を用いたゲル ク ロマ ト グラ フ ィ 一 に付 した。 メ タ ノ ールにて溶出を行ないデラ ミ ノ マイ シ ン A、 B お よ び C画分を集め減圧下に て濃縮乾固 した。 得 られたデラ ミ ノ マイ シ ン A、
B お よ び C粗精製物 813mgを メ タ ノ ー ルに溶解 し、 その一定量をカ プセルパ ッ ク 5 C 1 8 (資生堂社製） のカ ラ ム （ 2Omm 0 x 250謹） を用いた高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ 一 にかけ、 メ タ ノ 一ノレ 一 25mM酢酸ア ン モ ニ ゥ ム ー ア セ ト ニ ト リ ノレ （ 60 : 10 : 30) に て溶出 し、 デラ ミ ノ マイ シ ン Aお よ び B お よ び C の各フ ラ ク シ ヨ ンを得た。
こ れ ら フ ラ ク シ ョ ンを各々 に減圧下で濃縮乾固後 少量の メ タ ノ ールに溶解後、 セ フ ア デ ッ ク ス L H — 20を用いたゲル ク ロ マ ト グラ フ ィ ーに付 し、 デラ ミ ノ マイ シ ン A ま たは B ま たは C を含むフ ラ ク シ ョ ン を減圧下濃縮乾固する とデラ ミ ノ マイ シ ン Aの 無色〜白色の固体 320mg、 デラ ミ ノ マイ シ ン B の 無色〜白色の固体 30mg、 デラ ミ ノ マイ シ ン C の無 色〜白色の固体 13mgが得 られた。 実施例 2
本例 はデ ラ ミ ノ マ イ シ ン A の脱水閉環に よ る抗生物 質デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の製造を示す。
デラ ミ ノ マ イ シ ン A 220mgを メ タ ノ ー ル 3 τ^に溶解 後、 1 N塩酸 を添加 し室温にて一晩攪拌 した。 T L C にて原料の デラ ミ ノ マ イ シ ン Aが残 っ ていな い こ と を確認の後、 反応液を減圧下濃縮乾固 した。 得 ら れた残 渣 277mgを少量の メ タ ノ ー ルに溶解後、 シ リ カ ゲルカ ラ ム （20隱 φ X 250腿） を用 いた高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー にか け、 n — へキサ ン 一 ク ロ ロ ホノレム 一 ァ セ ト ニ ト リ ル （ 60 ： 27 ： 13) にて溶出 し、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の フ ラ ク シ ョ ン を得た。
こ の フ ラ ク シ ョ ン を減圧下濃縮乾固後、 少量の メ タ ノ — ルに溶解後、 カ プセ ルパ ッ ク 5 C , 8 (資生堂社製） の カ ラ ム （ 20醒 φ X 250mm ) を用 いた高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー にか け、 メ タ ノ ー ル 一 水 （ 80 ： 20) にて溶出 し デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の フ ラ ク シ ョ ン を得た。 こ れを 減圧下濃縮乾固す る と 64mgの粉末が得 られた。 さ ら に こ れを少量の メ タ ノ ー ルに溶解後、 セ フ ア デ ッ ク ス L H — 20を用 レ、たゲル ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に付 し、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 を含む フ ラ ク シ ョ ンを減圧下濃縮乾固す る と デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の無色〜白色の固体 56.5mgが 得 られた。
実施例 3
本例はデラ ミ ノ マ イ シ ン B の脱水閉環に よ る 抗生物 質デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の製造を示す。
デラ ミ ノ マ イ シ ン B約 200 mgを メ タ ノ ー ノレ 3 m に溶 解後、 1 N塩酸 1 m を添加 し室温にて一晩攪拌 した。 T L C にて原料の デラ ミ ノ マ イ シ ン B が残 っ ていな い こ と を確認の後、 反応液を減圧下濃縮乾固 した。 得 られた 残渣 を少量の メ タ ノ ー ル に 溶解後、 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム
( 20腿 φ X 250隱） を用 レ、た高速 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に か け、 n — へキ サ ン 一 ク ロ ロ ホ ノレ ム 一 ァ セ ト ニ ト リ ル
( 60 ： 27 ： 13) にて溶出 し、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の フ ラ ク シ ョ ン を減圧下濃縮乾固 した。
得 ら れた デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の粗精製物 65mgを少 量の メ タ ノ ー ル に溶解後、 カ プセ ルノ ッ ク 5 C 1 8 (資生 堂社製） の カ ラ ム （ 20讓 250画 ） を用 いた高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー にかけ、 メ タ ノ ー ル 一 水 （ 80 : 20) にて溶出 し、 デ ラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の フ ラ ク シ ョ ン を 得た。 こ れを減圧下濃縮乾固す る と 43mgの粉末が得 られ た。 こ れを少量の メ タ ノ ー ルに溶解後、 セ フ ア デ ッ ク ス L H — 20を用 いたゲル ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に付 し、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 を含む フ ラ ク シ ョ ンを減圧下濃縮乾 固す る と デ ラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の無色〜 白 色の 固体 34.6mgが得 ら れた。
実施例 4
本例はデ ラ ミ ノ マ イ シ ン C の脱水閉環に よ る抗生物 質デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の製造を示す。
デラ ミ ノ マ イ シ ン C約 30 mgを メ タ ノ ー ル 3 に溶解 後、 I N塩酸 l m を添加 し室温にて一晩攪拌 した。 T L C にて原料の デラ ミ ノ マ イ シ ン C が残 っ ていなレ、 こ と を確認の後、 反応液を減圧下濃縮乾固 した。 得 られた残 渣を少量の メ タ ノ ー ルに溶解後、 カ ブセ ルパ ッ ク 5 C , 8
(資生堂社製） のカ ラ ム （ 2Omm 0 x 250匪 ） を用 いた高 速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー にか け、 メ タ ノ ー ル 一 水 （ 80
： 20) か ら メ タ ノ ー ルの グラ ジェ ン ト 溶出法にて溶出 し デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の フ ラ ク シ ョ ン を得た。
こ の フ ラ ク シ ョ ン を減圧下濃縮乾固す る と、 llmgの粉 末が得 られた。 さ ら に こ れを少量の メ タ ノ ー ルに溶解後 セ フ ア デ ッ ク ス L H — 20を用 いたゲル ク ロ マ ト グラ フ ィ — に付 し、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 を含むフ ラ ク シ ョ ン を減圧下濃縮乾固す る と デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の無色 〜白色の固体 9.8mgが得 られた。
実施例 5
デ ラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 350mgを 5 の ク ロ ロ ホ ノレム に溶解 した溶液に、 無水硫酸— ピ リ ジ ン複合塩 525mgを N， N ' — ジ メ チ ルホ ルムア ミ ド 3 に溶解 した も のを 添加 し、 室温にて 24時間攪拌 し反応さ せた。 反応液中の ク ロ 口 ホ ルムを減圧下留去 した後、 残 っ た液体を 10% ク ェ ン酸 と酢酸ェチルにて液液分配抽出を行な っ た。 目 的 化合物を含む酢酸ェチル層 を飽和食塩水で洗滌 した後、 無水硫酸ナ ト リ ウ ムで脱水処理 し、 減圧下濃縮す る と T C L上で単一な ス ポ ッ ト と な る デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の硫酸エス テル 404mg (収率 96% ) が得 ら れた。 実施例 6
デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 10mgを 1 ? ^の ク ロ 口 ホルム に溶解 した溶液に、 無水硫酸一 ピ リ ジ ン複合塩 15mgを N， N ' — ジ メ チルホ ルム ア ミ ド 1 に溶解 した も のを添加 し、 室温にて 20時間攪拌 し反応させた。 反応液中の ク ロ 口 ホルムを減圧下留去 した後、 残っ た液体を 10% ク ェ ン 酸 と酢酸ェチルにて液液分配抽出を行な っ た。 目 的化合 物を含む酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗滌 した後、 無水 硫酸ナ ト リ ウ ムで脱水処理 し、 減圧下濃縮する と T C L 上で単一なス ポ ッ ト とな る デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 の硫 酸エステル 6.6 m が得 られた。
実施例 7
デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 12mgを l miの ク ロ 口 ホ ルム に溶解 した溶液に、 無水硫酸一 ピ リ ジ ン複合塩 18m を N， N ' ー ジ メ チルホルムア ミ ド 1 に溶解 した も のを添加 し、 室温にて 20時間攪拌 し反応させた。 反応液中の ク ロ 口 ホルムを減圧下留去 した後、 残っ た液体を 10% ク ェ ン 酸 と酢酸ェチルにて液液分配抽出を行な っ た。 目 的化合 物を含む酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗滌 した後、 無水 硫酸ナ ト リ ウ ムで脱水処理 し、 減圧下濃縮する と T C L 上で単一なスポ ッ ト とな る デラ ミ ノ マイ シ ン C 2 の硫 酸エステル 7.9mgが得 られた。
産業上の利用可能性
以上の よ う に、 本発明において、 免疫抑制活性 と グラ ム陽性菌に対する抗菌活性 と抗癌活性を有する新規抗生 P TJP93/00845
62 物質 と して、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A、 B、 C、 A 2 、 B 2 お よ び C 2 、 な ら びにデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 B 2 お よ び C 2 の硫酸エス テルが収得 さ れた。 こ れ ら のデラ ミ ノ マ イ シ ン A〜 C 2 、 な ら びにデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 〜 C 2 の硫酸エス テルは、 臓器移植に必要 と さ れ る 免 疫抑制剤 と して、 あ る いは免疫不全疾患お よ び局所の炎 症の治療に有用であ る 治療薬 と して期待 さ れ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 次の一般式 〔 I 〕
Figure imgf000065_0001
ま た は次の一般式 〔 I ' 〕
Figure imgf000065_0002
〔式中、 X は ヒ ド ロ キ シル基、 メ ト キ シ基 ま た は水素原 子を表 し、 X はデラ ミ ノ マ イ シ ン Aでは ヒ ド ロ キ シル 基であ り 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B では メ ト キ シ基であ り デラ ミ ノ マ イ シ ン C では水素原子であ る 〕 で表 さ れ る 免疫抑制活性を有する抗生物質 デラ ミ ノ マイ シ ン A デラ ミ ノ マイ シ ン B お よ びデ ミ ノ マイ シ ン C、 お よ びそれ らの塩。
2 . 次の一般式 〔 丑 〕
〔 I 〕
Figure imgf000066_0001
〔式中、 Yは ヒ ドロキ シル基、 メ トキ シ基ま たは水素原 子を表 し、 Y はデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 では ヒ ドロ キ シ ル基であ り 、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 では メ トキ シ基で あ り、 デラ ミ ノ マイ シ ン C 2 では水素原子であ る〕 で 表さ れる免疫抑制活性を有する抗生物質、 デラ ミ ノ マイ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マイ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マ イ シ ン C 2。
3 . —般式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 において、 Xが ヒ ド 口キ シル基を表す化合物であ る請求の範囲 1 に記載のデ ラ ミ ノ マ イ シ ン A。
4 . —般式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 において、 Xが メ ト キ シ基を表す化合物であ る請求の範囲 1 に記載のデラ ミ ノ マ イ シ ン B。
5 . 一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 I ' 〕 において、 Xが水素 原子を表す化合物であ る請求の範囲 1 に記載のデラ ミ ノ マ イ シ ン C。
6 . 一般式 （ I〕 において、 Yが ヒ ド ロ キ シル基を表 す化合物であ る請求の範囲 2 に記載のデラ ミ ノ マイ シ ン A 2 o
7. 一般式 〔 II〕 において、 Yがメ ト キ シ基を表す化 合物であ る 請求の範囲 2 に記載のデ ラ ミ ノ マ イ シ ン
B 2 o
8 . 一般式 〔 I〕 において、 Yが水素原子を表す化合 物であ る請求の範囲 2 に記載のデラ ミ ノ マイ シ ン C 2
9 . ス ト レ ブ ト ミ セス属に属する デラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン Bおよ びデラ ミ ノ マイ シ ン C の生産菌を培養 し、 その培養物か らデラ ミ ノ マイ シ ン
Aお よ びノま たはデラ ミ ノ マイ シ ン Bお よ びノま たは デラ ミ ノ マイ シ ン Cを採取する こ とを特徴 とする免疫 抑制活性を有する新規な抗生物質、 デラ、ミ ノ マイ シ ン Aお よ びノま たはデラ ミ ノ マイ シ ン Bお よ び ま たは デラ ミ ノ マイ シ ン Cの製造法。
10, デラ ミ ノ マイ シ ン A、 デラ ミ ノ マイ シ ン Bお よ びデラ ミ ノ マイ シ ン Cの生産菌がス ト レ ブ ト ミ セス 了 ノレ ブ ゾレ ス ( Streptomyces alublus) M J 2 0 2 - 7
2 F 3株であ る請求の範囲 9記載の製造法。
11. 請求の範囲 1 に記載の一般式 〔 I 〕 ま たは 〔 1 ' 〕 のデ ラ ミ ノ マ イ シ ン A、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B ま た は デラ ミ ノ マ イ シ ン Cを脱水を伴 う 閉環反応にか け る こ と を特徵 とす る 、 請求の範囲 2 に記載の一般式 〔 I〕 で 表 さ れ る 抗生物質、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 ま た はデラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の製造法
12. デラ ミ ノ マ イ シ ン A、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B、 " ラ ミ ノ マ イ シ ン C、 デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 お よ びデラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 カヽ ら な る群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 つの抗生物質 ま た はそ の製薬学的に許容 さ れ る塩を有効成分 と して含有 し且つ こ れ と混和 さ れた製薬学的 に許容で き る 固体 ま た は液体 状の担体を含有す る 医薬組成物。
13. 次の一般式 〔皿〕
〔 I〕
Figure imgf000068_0001
〔式中、 R は硫酸基 （ 一 S03H) ま たはそ の製薬学的 に許 容 さ れる 塩を示 し、 Yはデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 では ヒ ド ロ キ シル基であ り 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 では メ ト キシ基であ り 、 デ ラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 では水素原子で あ る 〕 で表 さ れ る デラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 お よ び C 2 の硫酸エス テル、 ま た はその製 薬学的 に許容 さ れ る塩。
14. 請求の範囲 13に記載のデラ ミ ノ マ イ シ ン A 2 の 硫酸エス テル、 デラ ミ ノ マ イ シ ン B 2 の硫酸エス テル、 デラ ミ ノ マ イ シ ン C 2 の硫酸エス テルお よ び こ れ ら の 製薬学的 に許容 さ れ る塩 よ り な る 群か ら選ばれる 少な く と も 1 つの抗生物質を有効成分 と して含有 し且つ こ れ と 混和 さ れた製薬学的に許容でき る 固体 ま た は液体状の担 体を含有す る 医薬組成物。
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