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WO1993003374A2 - Verfahren und anordnung zur analyse von agglutinationsreaktionen - Google Patents

Verfahren und anordnung zur analyse von agglutinationsreaktionen Download PDF

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WO1993003374A2
WO1993003374A2 PCT/DE1992/000601 DE9200601W WO9303374A2 WO 1993003374 A2 WO1993003374 A2 WO 1993003374A2 DE 9200601 W DE9200601 W DE 9200601W WO 9303374 A2 WO9303374 A2 WO 9303374A2
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WO
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agglutination reactions
reactions according
analyzing
arrangement
analysis
Prior art date
Application number
PCT/DE1992/000601
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French (fr)
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WO1993003374A3 (de
Inventor
Anton Horn
Barbara Horn
Heindrun Rhode
Original Assignee
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich-Schiller-Universität Jena filed Critical Friedrich-Schiller-Universität Jena
Publication of WO1993003374A2 publication Critical patent/WO1993003374A2/de
Publication of WO1993003374A3 publication Critical patent/WO1993003374A3/de

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B01L3/50255—Multi-well filtration
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6052—Construction of the column body

Definitions

  • the invention relates to a method and an arrangement for analyzing agglutination reactions in medicine and biology.
  • Agglutination reactions are traditionally carried out on a large scale in blood group serology. Agglutination tests for a number of proteins and other ligands have become increasingly known. For these tests, antibodies to the substance to be determined are usually bound to specially prepared erythrocytes or defined particles, very often latex particles. There are a variety of possible variations when using such tests. The agglutination reaction is predominantly evaluated semi-quantitatively by visual observation or after dilution of at least one of the reactants in titer levels.
  • erythrocytes and other cells can be separated from low molecular weight accompanying substances in suitable media by means of molecular sieve gels. Furthermore, it is known that agglutinates from erythrocytes can only pass through certain agarose gels with difficulty. By visual inspection of such gel arrangements, which are designed as closed centrifuge tubes, agglutination reactions with erythrocytes can be assessed semi-quantitatively.
  • the invention has for its object a cost-effective, practical, widely applicable and automatable analysis system for
  • Reactants are introduced into a micro column that the agglutination reaction takes place in the micro column, that after the agglutination reaction there is a separation of
  • the reactants are placed in a micro column.
  • Agglutination reaction takes place in the microcolumn, preferably before the reactants pass through the filtering substance.
  • Particles are preferably separated by force-accelerated filtration.
  • the separation of particles by particle size can be done either by molecular sieve gels or by filtration, either through special filters or through filter aids. Gravity, centrifugal force, hydrostatic pressure or air pressure can be used to move the material to be separated. An electrical or magnetic field can also be used for separation.
  • the use of the method is expanded by the fact that at least one reaction partner is firmly connected to a marker substance.
  • marker substances can be radioactive isotopes, enzymes, luminescent markers, fluorescent markers or biospecific ligands with high affinity for substances that can be easily detected analytically. Marking with magnetic particles leads to a further possibility of expanding the use of the system.
  • the coupling of reactants to latex or other particles opens up the use of known particle agglutination techniques.
  • the measurement of the natural properties of participants for example the cloudiness of the solution of erythrocyte suspensions, ensures use in blood group serology and forms the basis for universal blood group automatons.
  • the analysis of the agglutination reaction can either be carried out directly by optical measurements of the properties of the labeled or unlabeled reactants, or after the interposition of an auxiliary step.
  • the layered arrangement of various chromatography materials in the micro column enables the pre-separation of various accompanying substances.
  • An extension of the entrance part of the micro column allows the reactants to be mixed.
  • the arrangement of the individual columns and collecting vessels in certain rows and matrix arrangements allows a high sample throughput and the automation of the process.
  • the fitable arrangement of the microcolumns to microtiter plates is particularly favorable, since commercially available microtiter plate readers can be used for many analytical questions.
  • the entire arrangement can be used in centrifuge rotors if the material is separated by centrifugal force.
  • the material separation can advantageously also be carried out by means of liquid pressure or air pressure.
  • the invention is illustrated by 9 exemplary embodiments.
  • FIG. 1 Plurality of microcolumns (microcolumn chamber), collecting vessels (microtiter plate) and pipettes (multichannel pipettes)
  • Fig. La shows the arrangement for analyzing agglutination reactions consisting of a microcolumn (1), which is composed of an input-side part (2) and an output-side part (3), separated by a filter (4).
  • the input part contains an extension (5) for introducing and mixing the reactants and a column part (6).
  • the column passage (7) is collected in a collecting vessel (8).
  • Fig. Lb shows the arrangement with a filter element (9) and the filling of the column with a chromatography material (10).
  • Fig. Lc shows the arrangement with a filter element and two different chromatography materials (11 and 12).
  • Example 4 Micro column for chromatography and filtration.
  • Fig. Id shows the arrangement with a filter (4) and a chromatography material (10).
  • Fig. 2 shows the plurality of the arrangement of the micro-columns (1) in micro-column chambers (13), the collecting vessels (8) in Microtiter plates (14) and the pipette tips in multi-channel pipettes (15).
  • Example 6 Blood group determination in the ABO system by separating the agglutinated particles by filtration
  • the agglutinates remain on the filter surface, the nonagglutinated erythrocytes sediment from the outlet part into the microtiter plate.
  • the microtiter plate is shaken on a horizontally rotating shaker and evaluated in a reader at 405 nm.
  • the non-agglutinated erythrocytes suspended in the microtiter plate have the following extinctions:
  • Each column part (6) of the columns of the micro column chamber (13) is filled with 30 ⁇ l of Sephadex G 200 soaked in 0.9% NaCl as the chromatography material (10) by filling 150 ⁇ l of a 20% gel suspension into the columns and at 500 U centrifuged for 5 min / min. Then 20 ⁇ l of an antiserum dilution are pipetted onto the gel surface. 5 ⁇ l of the 5% erythrocyte suspension are pipetted into this. All pipetting steps (gel suspension, antiserum dilution,
  • Erythrocyte suspension are carried out with multichannel pipettes (8, 12 or 96-fold) (15).
  • the column chambers are centrifuged at 250 rpm for 10 min over a microtiter plate and the column outlet of each column is thus collected in a hole in the microtiter plate, which contains 100 ⁇ l 0.9% NaCl per hole.
  • the erytrocyte agglutinates are on the gel or in the upper parts of the gel. The non-agglutinated erythrocytes sediment into the microtiter plate.
  • microtiter plate is then shaken by means of a shaker and then measured at 405 nm in a microtiter plate reader or an equivalent photometer.
  • the non-agglutinated erythrocytes suspended in the microtiter plate have the following extinctions: Reaction of A erythrocytes
  • Each column part (6) of the columns of the micro column chamber (13) is filled with 30 ⁇ l of Biogel 200 soaked in 0.9% NaCl, as described in application example 7. 20 ⁇ l of Coombs serum (anti-human globulin) are pipetted onto the gel surface. 5 ⁇ l of the unwashed, sensitized erythrocytes from whole blood are also pipetted onto the gel surface from a 5% suspension. The column chambers are incubated for 15-30 min at room temperature and then centrifuged and measured photometrically as in Application Example 7.
  • the erythrocytes agglutinated with Coombs serum are located as a sharp band on the gel surface or in the upper half of the gel.
  • the non-agglutinated erythrocytes sediment into the microtiter plate.
  • the non-agglutinated erythrocytes suspended in the microtiter plate have the following extinctions:
  • Application example 9 determination of antistreptolysin antibodies by means of latex agglutination and particle separation by chromatography.
  • Each column part (6) of the columns of the micro column chamber (13) is filled with 30 ⁇ l of poured Sephadex G200 superfine, as described in application example 7. 20 ⁇ l of the serum sample to be examined are pipetted onto the gel surface. For this purpose, 5 ⁇ l streptolysin-O-labeled latex particles (diluted 1: 2 in 0.9% NaCl, from rheumajet ASO, biokit) are pipetted. After incubation for 10 min at room temperature, the microcolumn chambers are centrifuged as in application example 6 over a microtiter plate. The agglutinated latex particles remain on the gel surface or in the upper parts of the gel, the non-agglutinated particles sediment into the microtiter plate. The microtiter plate is shaken and evaluated in a reader at 380 nm.
  • the non-agglutinated latex particles suspended in the microtiter plate have the following extinctions:

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen, wobei die Reaktionspartner in eine Mikrosäule gegeben werden. Die Agglutinationsreaktion erfolgt in der Mikrosäule, vorzugsweise vor Durchlauf der Reaktionspartner durch die Gelmatrix. Agglutinierte und nichtagglutinierte Partikel werden vorzugsweise mittels durch Krafteinwirkung beschleunigter Filtration getrennt. Das nichtagglutinierte Partikel enthaltende Eluat wird nach Verlassen der Mikrosäule einer quantitativen Analyse unterzogen.

Description

Verf-ihren und Anordnung zur Analyse von Aqσlutinationsreaktionen
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen in der Medizin und der Biologie.
Stand der Technik
Agglutinationsreaktionen werden im großen Umfang traditionsgemäß in der Blutgruppenserologie durchgeführt. Zunehmend sind Agglutinationsteste für eine Reihe von Proteinen und anderen Liganden bekannt geworden. Für diese Teste werden in der Regel Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an speziell präparierte Erythrozyten oder definierte Partikel, sehr häufig Latexpartikel, gebunden. Es gibt eine Vielfalt von Variations¬ möglichkeiten beim Einsatz solcher Teste. Die Auswertung der Agglutinationsreaktion erfolgt überwiegend semiguantitativ durch visuelle Beobachtung oder nach Verdünnung wenigstens eines der Reaktanden in Titerstufen.
Versuche zur guantitativen Auswertung von Agglutinations¬ reaktionen unter Nutzung von Bildauswerteverfahren, von speziellen Verfahren zur Messung der Verteilung von freien Reaktanden und Agglutinaten in Mikrotiterplatten sind aufwendig und bedürfen einer großen Zahl von Kontrolluntersuchungen, da besonders im Falle von schwach ausgebildeten Agglutinaten die Differenzierung zur Nichtagglutination schwierig ist. Spezielle Automaten zur BlutgruppenbeStimmung sind aufwendig und sehr teuer. Hinzu kommt, daß besonders in der Blutgruppenserologie spezielle Erythrozyteneigenschaften, beispielsweise im Coombs-Test, erst nach mehrfacher Waschung der Erythrozyten bestimmbar sind. Diese Waschschritte sind zeitaufwendig und umständlich und erlauben keine einheitliche Probenhandhabung im Gesamtprozeß der Analyse. Es ist seit langem bekannt, daß Erythrozyten und andere Zellen in geeigneten Medien durch Molekularsiebgele von niedermolekularen Begleitstoffen getrennt werden können. Darüberhinaus ist bekannt, daß Agglutinate von Erythrozyten bestimmte Agarosegele nur schwer passieren können. Durch visuelle Besichtigung solcher Gelanordnungen, die als geschlossene Zentrifugenröhrchen ausgebildet sind, lassen sich Agglutinationsreaktionen mit Erythrozyten semiguantitativ beurteilen.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein kostengünstiges, praktikables, breit einsetzbares und automatisierbares Analysesystem für
Agglutinationsreaktionen zu schaffen, welches die sichere Analyse von Agglutinationen auch nach der essentiellen Entfernung von störenden Begleitstoffen semiguantitativ und guantitativ erlaubt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die
Reaktionspartner in eine Mikrosäule eingebracht werden, daß die Agglutinationsreaktion in der Mikrosäule erfolgt, daß nach der Agglutinationsreaktion eine Trennung von
Agglutinaten und nicht verbrauchten Reaktionspartnern durch
Stofftrennung nach Partikelgröße unter Krafteinwirkung erfolgt, daß die nichtagglutinierten Partner unter der
Mikrosäule aufgefangen werden, und daß der Verbrauch von
Reaktionspartnern im Durchlauf bestimmt wird.
Die Reaktionspartner werden in eine Mikrosäule gegeben. Die
Agglutinationsreaktion erfolgt in der Mikrosäule, vorzugsweise vor Durchlauf der Reaktionspartner durch den filternden Stoff. Agglutinierte und nichtagglutinierte
Partikel werden vorzugsweise mittels durch Krafteinwirkung beschleunigter Filtration getrennt.
Das nichtagglutinierte Partikel enthaltende Eluat wird nach
Verlassen der Mikrosäule unter dieser aufgefangen und einer guantitativen Analyse unterzogen. Die Stofftrennung nach Partikelgröße kann entweder durch Molekularsiebgele oder durch Filtration, entweder über speziellen Filtern oder durch Filterhilfen erfolgen. Zur Bewegung des zu trennenden Stoffgutes können die Gravitationskraft, Zentrifugalkraft, hydrostatischer Druck oder Luftdruck eingesetzt werden. Ebenso kann ein elektrisches oder magnetisches Feld zur Trennung eingesetzt werden.
Der Einsatz des Verfahrens wird erweitert dadurch, daß zu¬ mindest ein Reaktionspartner mit einer Markersubstanz fest verbunden wird. Solche Markersubstanzen können radioaktive Isotope, Enzyme, Lumineszensmarker, Fluoreszensmarker oder biospezifische Liganden mit hoher Affinität zu Substanzen sein, die sich leicht analytisch nachweisen lassen. Markierung mit magnetischen Partikeln führt zu einer weiteren Möglichkeit der Erweiterung des Einsatzes des Systems. Die Kopplung von Reaktionspartnern an Latex- oder andere Partikel erschließt den Einsatz der bekannten Partikelagglutinationstechniken. Die Messung der natürlichen Eigenschaften von Teilnehmern, beispielsweise der Trübung der Lösung von Erythrozytensuspensionen, sichert den Einsatz in der Blutgruppenserologie und bildet die Grundlage für universelle Blutgruppenautomaten. Werden vor der eigentlichen Agglutinationsreaktion in der Säule Abtrennungsschritte, die die Prinzipien der Chromatographie nutzen, vorgesehen, so kann die Spezifität der Technik stark erweitert werden. Mit Molekularsiebgelen können niedermolekulare Begleitstoffe abgetrennt werden. Der Einsatz von spezifischen Immunoliganden erlaubt hochspezifisch nahezu jeden beliebigen Begleitstoff zu entfernen. Auch andere Affinitätsgele und unspezifische Chromatographiegele können zur Entfernung von Begleitstoffen vor der Agglutination genutzt werden. Die zur Durchführung des Verfahrens vorgesehene Anordnung trennt in einer Mikrosäule einen eingangsseitigen Teil von einem ausgangsseitigen Teil durch ein Filterelement. Paßfähig zur Mikrosäule ist ein lösbares Auffanggefäß vorgesehen, in dem der Durchlauf aufgenommen wird. In diesem Auf anggefäß kann die Analyse der Agglutinationsreaktion entweder direkt durch optische Messungen der Eigenschaften der markierten oder unmarkierten Reaktanten, oder nach Zwischenschaltung eines Hilfsschrittes erfolgen. Die schichtweise Anordnung verschiedener Chromatographiematerialien in der Mikrosäule erlaubt die Realisierung der Vorabtrennung verschiedener Begleitstoffe. Eine Erweiterung des Eingangsteils der Mikrosäule gestattet das Mischen der Reaktanden. Die Anordnung der Einzelsäulen und Auffanggefäße in bestimmten Reihen und Matrixanordnungen erlaubt einen hohen Probendurchsatz und die Automatisierung des Verfahrens. Besonders günstig ist die paßfähige Anordnung der Mikrosäulen zu Mikrotiterplatten, da für viele analytische Fragen sofort kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten- Reader eingesetzt werden können.
Die gesamte Anordnung kann in Zentrifugenrotoren eingesetzt werden, wenn die Stofftrennung durch Zentrifugalkraft erfolgt. Durch die Anbringung geeigneter Verbindungsstücke zu Pipetten und Multipipetten kann die Stofftrennung vorteilhaft auch durch Flüssigkeitsdruck oder Luftdruck erfolgen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird durch 9 Ausführungsbeispiele erläutert.
Es zeigen:
Figur 1: Mikrosäulen und Auffanggefäße
Figur la: Mikrosäule mit Filter
Figur lb: Mikrosäule mit Filterelement und
Chromatographiematerial Figur 1c: Mikrosäule mit Filterelement und zwei verschiedenen Chromatographiematerialien Figur ld: Mikrosäule mit Filter und einem
Chromatographiematerial Figur 2: Pluralität von Mikrosäulen (Mikrosäulenkammer) , Auffanggefäßen (Mikrotiterplatte) und Pipetten (Mehrkanalpipetten)
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung Anwendunσsbeispiel 1 - Mikrosäule zur Filtration
Die Fig. la zeigt die Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen bestehend aus einer Mikrosäule (1), die aus einem eingangsseitige Teil (2) und einem ausgangsseitigem Teil (3), getrennt durch ein Filter (4), zusammengesetzt ist. Der eingangsseitige Teil enthält eine Erweiterung (5) zum Einbringen und Mischen der Reaktanden und einen Säulenteil (6). Der Säulendurchlauf (7) wird in einem Auffanggefäß (8) aufgefangen.
Anwendunσsbeispiel 2. - Mikrosäule zur Chromatographie
Die Fig. lb zeigt die Anordnung mit einem Filterelement (9) und die Füllung der Säule mit einem Chromatographiematerial (10).
Anwendunσsbeispiel 3 - Mikrosäule zur Chromatographie mit verschiedenen Chromatographiematerialien.
Die Fig. lc zeigt die Anordnung mit einem Filterelement und zwei verschiedenen Chromatographiematerialien (11 und 12).
Anwendunσsbeispiel 4 - Mikrosäule zur Chromatographie und Filtration.
Die Fig. Id zeigt die Anordung mit einem Filter (4) und einem Chromatographiematerial (10).
Anwendungsbeispiel 5 - Pluralität von Mikrosäulen
Fig. 2 zeigt die Pluralität der Anordung der Mikrosäulen (1) in Mikrosäulenkammern (13), der Auffanggefäße (8) in Mikrotiterplatten (14) und der Pipettenspitzen in Mehrkanalpipetten (15) .
Anwendunσsbeispiel 6 - Blutgruppenbestimmung im ABO-System mittels Abtrennung der agglutinierten Partikel durch Filtration
Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13), der mit einem Filter (4) mit einer Porengröße von 10 μm vom ausgangsseitigen Teil getrennt ist, wird mit 20 μl - Antiserum (Anti-A, Anti-B oder Anti-A+B) gefüllt. In das Antiserum werden 5 μl einer 5%igen Erythrozytensuspension in 0,9% NaCl pipettiert und durch Heben und Senken des Pipettenkolbens gemischt. Die Mikrosäulenkammer wird 10-20 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach 30 min bei 250 U/min über einer Mikrotiterplatte (14), die in jedem Loch 100 μl 0,9% NaCl enhält, zentrifugiert. Die Agglutinate verbleiben auf der Filteroberfläche, die niσhtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren aus dem ausgangsseitigen Teil in die Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte wird auf einem horizontal rotierenden Schüttler geschüttelt und in einem Reader bei 405 nm ausgewertet.
Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht- agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf:
Reaktion von A-Erythrozyten
Antiserum Verdünnung Erythrozyten Extinktion
20 μl 5 μl 5 %
Anti-B 1:4 A 0,8 (=E)
Anti-A unv. A 0,03 x E
1:4 A 0,08 x E
1:8 A 0,2 x E
1:16 A 0,5 x E
1:32 A 0,8 X E Anwendungsbeispiel 7 - Blutgruppenbestimmung im ABO-System mittels Partikeltrennung durch Chromatographie
Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl in 0,9 % NaCl geguollenem Sephadex G 200 als Chromatographiematerial (10) gefüllt, indem 150 μl einer 20 %igen Gelsuspension in die Säulen gefüllt werden und bei 500 U/min für 5 min zentrifugiert werden. Danach werden 20 μl einer Antiserumverdünnung auf die Geloberfläche pipettiert. Dazu werden 5 μl der 5%igen Erythrozytensuspension pipettiert. Alle Pipettierschritte (Gelsuspension, Antiserumverdünnung,
Erythrozytensuspension) werden mit Mehrkanalpipetten (8-, 12- oder 96-fach)(15) vorgenommen.
Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur werden die Säulenkammern bei 250 U/min für 10 min über einer Mikrotiterplatte zentrifugiert und damit der Säulenauslauf jeder Säule in einem Loch der Mikrotiterplatte, die 100 μl 0,9 %iges NaCl pro Loch enthält, aufgefangen. Die Erytrozytenagglutinate befinden sich nach Zentrifugation auf dem Gel bzw. in den oberen Gelanteilen. Die nichtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren in die Mikrotiterplatte.
Die Mikrotiterplatte wird nun mittels eines Schüttlers geschüttelt und danach bei 405 nm in einem Mikrotiterplattenreader oder einem äguivalenten Photometer gemessen.
Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht¬ agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf: Reaktion von A-Erythrozyten
Antiserum
Anti-B Anti-A
Figure imgf000010_0001
Anwendungsbeispiel 8 - Coombs-Test nach Abtrennung von störenden Begleitstoffen mittels Chromatographie
Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl in 0,9 % NaCl geguollenem Biogel 200 gefüllt, wie in Anwendungsbeispiel 7 beschrieben. Es werden 20 μl Coombs-Serum (Anti-Human-Globulin) auf die Geloberfläche pipettiert. 5 μl der ungewaschenen sensibilisierten Erythrozyten aus Vollblut werden aus einer 5 % igen Suspension ebenfalls auf die Geloberfläche pipettiert. Die Säulenkammern werden 15-30 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach wie in Anwendungsbeispiel 7 zentrifugiert und photometrisch gemessen.
Die mit Coombs-Serum agglutinierten Erythrozyten befinden sich nach der Zentrifugation als scharfe Bande auf der Geloberfläche oder in der oberen Hälfte des Geles. Die nichtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren in die Mikrotiterplatte.
Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht¬ agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf:
Reaktion von Coombs-positiven O-Erythrozyten
Antiserum Verdünnung Erythrozyten Extiktion 20 μl 5 μl 5 AHG-Serum unverdünnt Coombs +++ 0-0,01 AHG-Serum unverdünnt Coombs - 0,16
Anwendunσsbeispiel 9 - Bestimmung von Antistreptolysin- Antikörpern mittels Latexagglutination und Partikeltrennung durch Chromatographie.
Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl geguollenem Sephadex G200 superfine, wie in Anwendungsbeispiel 7 beschrieben, gefüllt. Auf die Geloberfläche werden 20 μl der zu untersuchenden Serumprobe pipettiert. Dazu werden 5 μl Streptolysin-O-markierte Latexpartikel (1:2 in 0,9% NaCl verdünnt, aus rheumajet ASO, biokit) pipettiert. Nach Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur werden die Mikrosäulenkammern wie in Anwendungsbeispiel 6 über einer Mikrotiterplatte zentrifugiert. Die agglutinierten Latexpartikel bleiben auf der Geloberfläche oder in den oberen Gelteilen liegen, die nichtagglutinierten Partikel sedimentieren in die Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte wird geschüttelt und in einem Reader bei 380 nm ausgewertet.
Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nichtagglutinierten Latexpartikel weisen die folgenden Extinktionen auf:
20 μl Serum 5 μl 1:2 verdünnte Partikel Extinktion
ASO-negativ Streptolysin-beschichtet 0,6 ASO-poεitiv Streptolysin-beschichtet 0,005
Bezugszeichen
1 Mikrosäule
2 eingangsseitiger Teil der Mikrosäule
3 ausgangsseitiger Teil der Mikrosäule
4 Filter
5 Erweiterung im emgangsseitigen Teil
6 Säulenteil der Mikrosäule Säulendurchlauf Auffanggefäß Filterelement 0 Chromatographiematerial a 1 Chromatographiematerial b 2 Chromatographiematerial c 3 Mikrosäulenkammer 4 Mikrotiterplatte 5 Mehrkanalpipette

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionspartner in eine Mikrosäule eingebracht werden, daß die Agglutinationsreaktion in der Mikrosäule erfolgt, daß nach der Agglutinationsreaktion eine Trennung von Agglutinaten und nicht verbrauchten Reaktionspartnern durch Stofftrennung nach Partikelgröße unter Krafteinwirkung erfolgt, daß die nichtagglutinierten Partner unter der Mikrosäule aufgefangen werden, und daß der Verbrauch von Reaktionspartnern im Durchlauf bestimmt wird.
2. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch Filter mit der Porengröße im Bereich von
1 μm bis 50 μ erfolgt.
3. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße mit Hilfe von Gelen für die Gelchromatographie vorzugsweise mit Korngrößen im Bereich von 10 μm bis 100 μm erfolgt.
4. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch Einwirkung der Gravitationskraft realisiert wird.
5. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch Einwirkung der Zentrifugalkraft erfolgt.
6. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch Einwirkung von Luftdruck auf die Reaktionsprodukte erfolgt.
7. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch Einwirkung von Flüssigkeitsdruck auf die Reaktionsprodukte erfolgt.
8. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch elektrische Felder erfolgt.
9. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen dadurch gekennzeichnet, daß die Stofftrennung nach Partikelgröße durch magnetische Felder erfolgt.
10. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß zumindest einer der Reaktionspartner meßbar markiert wird.
11. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch radioaktive Isotope erfolgt.
12. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch Markerenzyme erfolgt.
13. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch Lumineszenzmarker erfolgt.
14. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch Liganden erfolgt, die spezifisch und hochaffin Komplexe mit Molekülen bilden, die analytisch empfindlich nachweisbar sind.
15. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch Fluoreszensmarker erfolgt.
16. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch Biotin oder Avidin erfolgt.
17. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung durch magnetische Partikel erfolgt.
18. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß einer der Reaktionspartner an Zellen gebunden wird.
19. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß einer der Reaktionspartner an Partikel mit einer Korngröße im Bereich von 0.001 μm bis 1 μm gebunden wird.
20. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Menge wenigstens eines der Reaktionspartner im Durchlauf durch Nutzung der natürlichen Eigenschaften wenigstens eines der Reaktionspartner oder von Teilen von ihm erfolgt.
21. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Menge wenigstens eines der Reaktionspartner im Durchlauf durch Nutzung der spezifischen Eigenschaften der Markierung erfolgt.
22. Verfahren zur- Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Reaktionspartner der Agglutinationsreaktion vor der Agglutination in einem eingangsseitigen Teil der Mikrosäule durch Chromatographie von definierten Begleitstoffen befreit wird und die Agglutination mit dem Reaktionspartner in einem darauffolgenden Teil der Mikrosäule erfolgt.
23. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 und 22 dadurch gekennzeichnet, daß die Begleitstoffe durch Gele für die Stofftrennung nach Größe mit Ausschlußgrenzen größer als 100 000 - 1 000 000 abgetrennt werden.
24. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 und 22 dadurch gekennzeichnet, daß die Begleitstoffe durch Gele, die spezifische Immunoliganden tragen, abgetrennt werden.
25. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 und 22 dadurch gekennzeichnet, daß die Begleitstoffe durch Ionenaustauschgele abgetrennt werden.
26. Verfahren zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 1 und 22 dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der Begleitstoffe durch Gele, die Lektine tragen, erfolgt.
27. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen dadurch gekennzeichnet, daß eine Mikrosäule (1), bestehend aus einem eingangsseitigen Teil (2) und einem ausgangsseitigen Teil (3), die durch ein flüssigkeitsdurchlässiges Filterelement (9,4), welches für die freien Reaktionspartner durchlässig ist, voneinander getrennt sind, paßfähig mit seinem ausgangsseitigen Teil über einem Auffanggefäß (8) lösbar angeordnet ist.
28. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß sich in dem eingangsseitigen Teil der Mikrosäule (2) Chromatographiematerialien (10,11,12) befinden.
29. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß diese Chromatographiematerialien Molekularsiebgele sind, die vorzugweise aus Dextranen, Agarose oder Polyacrylamid hergestellt sind.
30. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 27 und 28 dadurch gekennzeichnet, daß sich in dem eingangsseitigem Teil der Mikrosäule verschiedene Chromatographiematerialien in mehreren Schichten befinden.
31. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 und 28 dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographiematerialien Molekularsiebgele, Gele für die Affinitätschromatographie, Gele für die Immunosorbentchromatographie und Gele für die Ionenaustauschchromatographie sind.
32. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß im eingangsseitigen Teil der Mikrosäule eine Erweiterung (7) zum Einbringen und Mischen der Reaktanden vorgesehen ist.
33. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß die flüssigkeits¬ durchlässigen Filterelemente durchlässig für Zellen aber undurchlässig für Chromatographiematerialien sind.
34. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß die Filterelemente Filter mit Porengrößen vorzugsweise im Bereich von 0.001 μm bis 50 μm sind.
35. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß das Auffanggefäß zumindest in seinem Bodenteil aus einem Material besteht, welches die optische Auswertung des Durchlaufs gestattet.
36. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 22 dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrosäulen Säulen mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm bis 3,0 mm und einer Länge von 5 mm bis 50 mm sind.
37. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß eine Pluralität von Mikrosäulen und Auffangbehältern paßfähig zueinander in Reihen angeordnet ist.
38. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß eine Pluralität von Mikrosäulen und Auffangbehältern in Form einer Matrixanordnung zueinander paßfähig ist.
39. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 und 38 dadurch gekennzeichnet, daß die Auffanggefäße Mikrotiterplatten sind.
40. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach den Ansprüchen 27, 37 und 38 dadurch gekennzeichnet, daß die Pluralität von Mikrosäulen und Auffangbehältern paßfähig zu einem Zentrifugenrotor ausgebildet ist.
41. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß an den Mikrosäulen eingangsseitig ein Innenkonus zur Aufnahme eines paßfähigen Pipettenkonus vorgesehen ist.
42. Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen nach Anspruch 27 und 39 dadurch gekennzeichnet, daß die Messung des Durchlaufs in Mikrotiterplatten mit kommerziellen Readern erfolgt.
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