WO1991005257A1

WO1991005257A1 - Kit for immunoassay of human tissue plasminogen activator/human plasminogen activator inhibitor complex and method of immunoassay

Info

Publication number: WO1991005257A1
Application number: PCT/JP1990/001269
Authority: WO
Inventors: Schuichiro Hino; Kazuhiko Itou; Ryoichi Hasegawa; Naomi Okamoto; Atsushi Noro; Toshinobu Murakami; Yoichi Sakata
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-10-02
Filing date: 1990-10-02
Publication date: 1991-04-18
Anticipated expiration: 1992-04-02
Also published as: US5352583A; EP0450086A4; AU633366B2; EP0450086A1; AU6421990A; CA2042594A1

Description

ヒト組親ブラスミノ—ゲンァクチべ一ター · ヒトブラスミ二ンァクチベータ一ィンヒビタ一《仓体の免 ffi学的痴定キ，ト反び《定方法

1 発明の名称ヒト組織プラスミノーゲンァクチベータ一 ' ヒトプラスミノーゲンァクチベータ一複合体の免疫学的測定キット及び測定方法

2 発明の詳細な説明 a . 産業上の利用分野本発明は、ヒト検体中のヒト組織ブラスミノーゲンァクチベータ一 ' ヒトプラスミノ一ゲンァクチベーターィンヒビター複合体の免疫学的測定に関する。更に詳しくはヒト検体中の前記複合体の量を高感度且つ安定して測定するための免疫学的測定方法及びそのためのキッ卜に関する, 本明細書において使用される記号は、特に断らない限り下記の意味を有する

P A ：ヒト組織ブラスミノーゲンァクチべ一ター

P A I ：ヒトプラスミノ一ゲンァクチベーターィンヒビター（ t P

Aに対するィンヒビタ一）

P A - P A I複合体；ヒト組繳ブラスミノ一ゲンァクチべ一ターヒトプラスミノーゲァクチベーターィンヒビター複合体 b . 従来技術フイブリンを溶解する酵素であるブラスミンは、プラスミノ一ゲンが組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ター（ t P A ) により変換されて生成する。 ^年、このヒ卜 ¾織ブラスミノーゲンァクチべ一ターに対するィンヒビター（ヒトプラスミノーゲンァクチーベ一ターインヒビター（P A I ) が血管内皮細胞、皮細胞、血小板、胎盤などに存在しており、速やかにヒト組織ブスミノ一ゲンァクチべ一ターと複合体を形成しヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ター活性を抑制することがわかった（M. Philips et al， B lochem B iophys, Acta, 802, 99 - 1 1 0 , 1 984 , S . Thorsen, B iochem B iophys Acta, 802, 1 1

1 - 1 1 8 , 1 984, T. Wun et al, J , Biol Chem. 262, 3646 - 3653 , 1 987， M. A. S anzo et al B iochem,

26 , 7443 - 7449 , 1 987 , Y . S akataet al, J . B iol Chem. 263 , 1 960 - 1 969 , 1 988) 。また血中ブラスミノ一ゲンァクチベータ一ィンヒビター（PA I ) 活性値と疾患との関係が明らかになりつつあり（B. Wiman et al. Scand. j . Clin L ab I nvest 45 , 43— 43、 1 985、 P. Vague et al , Metabolism 35 , 250 - 253 , 1 986 , A. Haras ten,

Lancet 8549 , 3— 8 , 1 987) 、プラスミノ一ゲンァクチべ一ターインヒビター（P A I ) は血液凝固線系の開始機構の重要な制御因子であることが示唆されている。従って P A I、 t P A及び t PA · P A I複合体の血中澳度を知ることができれば線溶系の以上や病態をモ二ターできる可能性は大きい。

現在、 t P Aの測定法としてはサンドイッチェンザィムィムノアツセィによる方法（特開昭 59 - 1 74759号公報）や市販キット（バィォプール社 I MUL Y S E t - P A) などがあり、一方 PA Iを測定する方法としては放射性物質を用いる方法（R. R. S chief et al, J . Lab Clin Med 1 06 , 40 8 , 1 985) やモノク口ーナル抗体を用いたサンドイッチェンザィムィムノアッセチイキット（バイオプール社 I MULY S E PA I - I ) などがある。

また、 t P A · PA I複合体は血漿中に微量存在すると言われ、この t PA。 P A I複合体の測定方法として高田ら（Thrombosis R esear ch 55巻、 285 - 28 9ページ、 1 98 9年）による、固定化抗体として P A Iに対するモノクローナル抗体を用い、標識抗体として t P Aに対するポリクローナル抗体を用い、かつそのフラグメントが -ガクトシダーゼにより標識された、蛍光法によるェンサイムィムノアツセィ法がある

この t PA · P A I複合体を測定する系は、まず固定化モノクローナル抗 P A I - 1抗体と検体とを 3 0。Cで 3時間反応させ、しかるのち洗浄し、 -ガラク卜シダーゼ標識されたポリクローナル抗 t P Aの F ab 'フラグメントと 4°Cで一夜反応させ、免疫反応を完了し、 4 -メチル-ゥンベルフエリルガラクトシドを分解させ、生じた 4 -メチルゥンベリエフヱロンを、蛍光法で測定し、 t PA · PA I複合体を定量しているものである。かかる方法は 2つの免疫反応における反応温度が異なり、かつ反応時間も一夜必要で、非常に長く、さらに特殊な測定装置である蛍光光度計を用いるため、工業的および臨床的には効率的に測定することが困難であった,

—方、 t P A · P A I複合体の測定方法としてアミラルらは、 PA Iに対するモノクロナール抗体及び t PAに対するモノクローナル抗体を用いることによる t PA * PA I複合体の測定方法を提案している（Thr ombosis Research, Supplement 99 - 1 1 3、 1 988 ) o この方法は 2種のモノクロ一ナル抗体を使用しており、 t PA · PA I 複合体は比較的良好な感度で測定されるが、この文献に記載されたエラィザ法に従えば、合計で約 5時間以上を必要とする。従ってこの 2種のモノクロ一ナル抗体を使用した前記測定システムは実際に臨床で援用するには、更に測定感度を上げまた操作を箇便にし時間も短縮することが不可欠である。

c . 癸明が解決しょうとする課題

そこで本発明の第 1の目的は、ヒト検体中の t PA · PA I複合体を高感度で測定することができる免疫測定方法及びキットを提供するこにある

本発明の第 2の目的は、ヒト検体中の t P A · P A I複合体を実際に臨床に使用しうる簡便な手段で測定する方法及びキットを提供することにある ,

本発明の他の目的は、ヒト検体中の t P A · P A I複合体を、測定する人や測定条件（時間、温度など）などの影響を出来る限り受けないで、安定して高感度で測定しうる免疫学的方法及びキットを提供することにある,

本発明のさらに他の目的は、ヒ卜検体中の活性型 P A Iの測定方法を提供することにある

本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一餍明らかとなるであろフ

d . 課題を解決するための手段

かくして本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的並びに利点は, ヒト検体中の t P A · P A I複合体を免疫学的に測定するためのキッ卜であって、

( i) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトプラスミノーゲンァクチベータ一ィンヒビターに対するモノクローナル抗体（第 1抗体）

(ii) 酵素により標識化されたヒト組截ブラスミノーゲンァクチべターに対するポリクローナル抗体（第 2抗体）

( iii ) 酵素活性を測定するための基質および'反応停止剤

(iv) 希釈剤

および

(V) HLB (Hydrophile L ipophile B alance) 値が少くとも 16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤よりなることを特徴とする免疫学的測定キッ卜によって達成されることが見出された。

さらに本凳明者らの研究によれば下記の t P A · P A Iの免疫学的測定方法及び活性型 P A Iの測定方法が提供される

t P A · P A Iの免疫学的測定方法；

(1) 不溶性固体担体に結合した第 1抗体にヒト検体を接触させ、次いで標識化された第 2抗体を接触させるか、或いは (2) 不溶性固体担体に結合した第 1抗体、標識化された第 2抗体及びヒ卜挨体を同時に接触させる、

ことにより、ヒト検体中のヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ター · ヒトプラスミノ一ゲンァクチベーターィンビター複合体を免疫学的に測定する方法であって、

(a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトプラスミノ一ゲンァクチベーターィンヒビターに対するモノクロナ一ル抗体を第 1抗体として使用し、

(b) 酵素により標識化されたヒ卜組織ブラスミノ一ゲンァクチべ

—ターに対するポリクロ一ナル抗体を第 2抗体として使用し, 且つ

( c ) HLB (Hydrophile L ipophile B akance) 値が少くとも 16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤を洗浄剤として使用する、

ことを特徵とする免疫学的測定方法 _c

活性型 PA Iの測定方法；

(A) ヒト検体中に存在するヒト钽織ブラスミノ一ゲンァクチベータ一 · ヒ卜ブラスミノーゲンインヒビタ一複合体及び

(B) ヒト組織プラスミノーゲンァクチべ一ターを添加したヒト検体中に存在するヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ター ♦ ヒトプラスミノ一ゲンィンヒビター複合体を夫々サンドィツチ法による免疫学的測定法によって測定し、その測定値の差に基いてヒト検体中の活性型ヒトプラスミノ一ゲンァクチべ一ターィンヒビターの量を測定する方法において、

(a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトブラスミノーゲンァクチベーターィンヒビタ一に対するモノクロナ一ル抗体を第 1抗体として使用し、

(b) 酵素により標識化されたヒト組截ブラスミノ一ゲンァクチべ

一ターに対するポリクローナル抗体を第 2抗体として使用し、且つ

(c) HLB (Hydrophile L ipophile B akance) 値が少くとも 16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤を洗浄剤として使用する、

ことを特徵とする活性型ヒトブラスミノーゲンァクチべ一ターオンヒビターの測定方法 _c

前記した本発明は、

( i ) 第 1抗体（固体化抗体）として P A Iに対するモノクローナル抗体を、第 2抗体として酵素標識化された t P Aに対するボリクローナル抗体を組合せて使用すること、

(ii) 第 1抗体を固定化するための不溶性固体担体として、その表面が鏡面化された、すなわち極めて平滑な表面を有する固体担体を使用すること、及び

Ciii) 非イオン界面活性剤であってその HL B値が一定値以上のものを含む洗浄剤を使用すること、に特徴があるのであり、これら（ i ) 、（ii ) 及び（iii ) が相乗的に影響することによって本発明の目的が達成される。すなわち、前記（ i ) 、 ( ii ) 及び（iii ) の相乗的効果として、ヒト検体中に存在する多数のタンパク質、為に t P A、 P A I らの固体担体への非特異的吸着が極力抑制され、また第 2抗体の非特異的吸着が抑制され且つ特異的な吸着が選択的に促進され、免疫反応に不必要な成分を効果的に洗浄除去できる。かくして本発明によれば、ヒト検体中に極めて微量含まれる t P A · P A Iを高感度に、簡便に正確に且つ安定して測定できるのであり、しかも測定に要する時間は、従来法と比べて大巾に短縮されまた洗浄剤の使用量も低減されるという実用上の効果も達成される,

さらに本発明によれば、免疫反応を 2 -ステップで行う場合、各ステップで異なる温度を設定する必要はなく、同じ温度で実施することが容易に可能であり、免疫反応及び酵素反応を含め全工程を 2時間或いはそれ以下の短い時間で行うことができる

従って本発明にける免疫測定系は、凝固線溶活性に異常があるか或いはその疑いあるヒト検体を効率的に且つ迅速に測定することができるので、その臨床的意義は極めて甚大である

以下本癸明についてさらに詳細に説明する

[A ] 抗原の調製及び精製；

本発明において使用される P A Iに対するモノクローナル抗体及び t

P Aに対するポリクローナル抗体は、下記に説明する抗原を用いることによって得ることができるすなわち、これら抗体を得るための抗原としての t P A或いは P A I は原則的には天然の材料から抽出した天然型のものと遺伝子組換え技術によるリコンピナント型のものいずれも用いられるが、 t P Aまたは P A Iの天然型と同等の免疫学的性質を持つ物であれば、遺伝子工学的手法によってえられるものでよい。天然型の t P Aまたは P A Iを得る材料としては細胞培養液が好んで用いられる。分離、精製は、通常用いられる蛋白分離技術、例えば塩析、注出、遠心分離、限凱沪過、各種のク口マトグラフィ一などを組み合わせて行うことができる。

このようにして得られた t P Aまたは P A Iを抗原としてポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体を作成することができる

[A ] - ( 1 ) t P Aに対するポリクローナル抗体の調製；

本発明において使用される r P Aに対するポリクローナル抗体は、前期の t P Aを抗原として、それ自体公知の方法に従って得ることができる。例えば「日本生化学会編、銃生化学実験講座、 5巻、 1 - 1 0頁、東京化学同人、 1 9 8 6年」に記載されているように、免疫動物、例えぱモルモット、ゥサギ、ラット、マウス、ャギなど抗体産生能力のある動物を用いる通常の方法で t P Aを用いて免疫した後、採血し、抗血清を得る。抗血清より通常用いられる方法、例えば、塩析、抽出、遠心分離、限外泸過、各種のクロマトグラフィーなどを組み合わせて精製抗体を得ることができる。

[A ] - ( 2 ) P A Iに対するモノクローナル抗体の調製

本発明において使用される P A Iに対するモノクローナル抗体は、 P A Iを抗原として使用し、それ自体知られたケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（G . Kohler and Mulstein, Nature ( L ind on) , 2 5 6 , 4 9 5 - 4 9 7 ( 1 9 7 5 ) により作成されたハイプリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離することにより得ることができる。すなわち、 P A Iでマウスを免疫した後、このマウスの脬臓細胞とマウスミエコ一マ細胞を融合させハイプリドーマを作成する。このようにして得たハイプリドーマは融合された種々のリンパ球に応じて種々のモノクローナル抗体を産生するので、目的とするモノクローナル固体を産生するハイプリドーマをクローニングによってクローン化されたハイブリドーマとして単離する。このクローン化されたハイプリド一マをイン ' ビトロまたはマウス腹腔内で培養してモノクロ一ナル抗体を分泌させる。この培養液から通常の方法に従って P A Iに対するモノクローナル抗体を分離する,

かかる P A Iに対するモノクロ一ナル抗体には、本出願人により先に提案され、ヨーロッパ特許公開第 3 3 9 3 0 2号に記載された J T I -

1、 J T I - 2 , J T I - 3または J T I — 4を使用することができる , これらのうち、本発明においては、 J T I - 3および J T I - 4が好ましく、特に J T I - 4が優れている,

の J T I - 3および J T I - 4の 2つのモノクローナル抗体は、下記に説明するようにブタぺスト条約による国際寄記されている

P A Iに対するモノクローナル抗体 J T I - 3 ；

この P A Iに対するモノクローナル抗体 J T I - 3は、それを産生するハイブリドーマが、ブダペスト条約に基づく国際寄託期間である微ェ F ermenatat ion Research I nstaitute ίこ 1 988年 1 1月 22日に FERMp - 1 0405として寄託され、その後 1 989年 3 月 2日に国際寄託に変更された（国際寄託； N o . BP - 23 1 7) 。この PA Iに対するモノクローナル抗体 J T I - 3は、サブクラスが I g であり PA Iに t PAが結合した場合（すなわち、 t P A - P A I複合体に対して）でも P A Iに対して結合を阻害されないが、 PA Iに対して結合した場合、 t PAは結合を阻害されるような抗原決定部位を認識する特性を有している '

PA Iに対するモノクロ一ナル抗体 J T I - 4

この PA Iに対するモノクローナル抗体 J T I - 4は、それを産生するハイブリドーマ力上記微ェ研に 1 988年 1 1月 22日に FERM P - 1 0406として寄託され、その後 1 989年 3月 2日に国際寄託に変更された（国際寄託 N o . B P - 23 1 8)

の PA Iに対するモノクローナル抗体 J T I - 4は、サブクラスが

I g であり、 P A Iに t PAが結合しても PA Iに対する結合を阻害されない。

[B] t PA- PA I複合体の測定キットの調製；

[B] -(l ) 第 1抗体の調製

本発明の第 1抗体としては、鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合した P A Iに対するモノクローナル抗体を使用することが必要であるこの固体担体として表面が鏡面化されたものすなわち表面が極めて平滑なものを使用することにより非特異的吸着が低くなり、 t PA- PA I複合体の測定惑度が向上する。

従来、高惑度な測定のための不溶性固体担体としては、むしろその表面を研摩して粗くし、表面積を大きくしたものが用いられてきた。確かに表面積を大きくすると、抗体の固定量を増加させるというメリッ卜がある力しかしながら非特異的吸着も大きくなるというデメリツトがぁつた。本発明者らの研究したところによれば、 t P A - P A I複合体の測定においては、中心線平均粗さ（R a) が 1.5 m以下である鏡面化された固体担体は、抗体の固定量は粗面化された固体担体とほぼ同等であるが、非特異的吸着は飛躍的に減少し、 t PA- PA I複合体の高感度測定に有利であることを見出した。かかる鏡面化された不溶性固体としては、その材質形状は特に制限されているが例えばポリスチレンビーズ、ガラスビーズがあげられる。

中心線平均粗さ（R a) は、粗さ曲線からその中心線の方向に測定長さ β の部分を抜取り、この抜取り部分の中心線を X軸、縦倍率の方向を Υ軸とし、あらさ曲線を y= f (x) で表わしたとき、次式で与えられる R aの値をミクロン単位で表わした値を意味する。

R a = ί^β /1 Cx) ノ d x

o の中心線平均粗さ（R a) については、 J I S B 060 1 - 1 982 (日本）、 ANS I B 46.1 - 1 979 (USA) 及び R 4 68 - 1 966 (I SO) に説明されている。

なお以下の本発明の実施例では、不溶性担体は東京精密（株）製の表面粗さ計サーフコム ®を用いて表面粗さを測定した。

かくなる不溶性担体に固定される P A Iに対するモノクロー +ル抗体としては、前記のモノクローナル抗体分子のみならず抗尿結合能が失われないそのフラグメンン卜たとえば（a b') ₂、 F a b, F a b \ F a c bなどあるいは抗原結合能が失われない抗体またはそのフラグメン卜の誘導体である。これらの抗体を不溶製担体へ固定する方法は、物理的吸着法たとえばポリスチレンの担体を該抗体の溶液に浸漬する方法など；イオン結合法たとえばイオン交換樹脂あるいはアミン基、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基などのイオン化する官能基をもった担体を用いる方法など；あるいは化学反応による共有結合法たとえばカルポキシ . クロライド法、カルポジィミド法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖法、ジァゾ法、活性ェステル法、架橋試薬による担体結合法（架橘試薬としてグルタールアルデヒド、へキサメチレンイソシアナート、コハク酸イミド ·マレイミド化合物など）など、更には F A Iに対しては結合能はないが P A Iに対するモノクローナル抗体に対して生物学的反応により結合しうる物質を介して結合する方法例えばブロティン A結合担体を用いる方法などである。

[B]-(2) 第 2抗体（標識化抗体）の調製；本発明においては、第 2抗体として酵素により標識化された t PAに対するポリクロ一ナル抗体が使用される。前記 [A] - (1) で説明した t PAに対するポクローナル抗体またはそれと同等のフラグメントを免疫測定法に使用される酵素を用いて標識化する。

この標識化のために使用される酵素としては、例えばリゾチームマレート · デヒドロゲナーゼ、グルコース - 6 -フォスフヱ一ト、デヒドロゲナ一ゼ、ペルォキシダーゼ、グルコース ·ォキシダーゼ、アルカリフォスフアクターゼ、ルシフェラーゼ、 -ガラクトシダーゼなどが挙げられる。これら酵素とポリクローナル抗体との結合方法は、グルタルアルデニド法、過ョーソ酸法、マレイミド法など通常の方法に従うことができる力マレイミド法が好ましく用いられる。

抗体や酵素のマレイミド化はそれ自体公知の方法（石川栄治編「酵素免疫測定法」、医学書院）、例えばサクシンイミジル 4 - (N -マレイミドメチル）シクロへキサンカーボネート（SMCC) 、スルホサクシンィミジル 4一（N -マレイミドメチル）シクロへキサン力一ポネート（スルホ SMC C) 、サクシンィミジル—メタマレイミドベンゾェ一ト（MB S) 、サクシンィミジル 6 -マレイミドへキサノエ一ト（EMC S) などの架橋試薬を使用して行うことができる。

t PAに対するポリクローナル抗体またはそのフラグメントと標識物質との反応は、前記架橘試薬によりマレイミド化したポリクローナル抗体またはそのフラグメントと、例えば δ -ァセチルメル力プトコハク酸無水物により SH基を導入した酵素とを、例えば 4~30°Cの温度でしかも前記抗体またはフラグメントと S H基を導入した酵素のモル比 1 ： 1〜 1 ： 80の割合で、且つ 1 ~48時間行なわれる。

この場合には主として、抗体またはそのフラグメン卜の硫黄原子を介して標識物質が抗体またはそのフラグメン卜 1分子当り 1分子標識されたものを得ることが好ましい。

[BJ -C3) 洗浄剤

サンドィツチ法による免疫学的測定法において、固定抗体（第 1抗体）と標識抗体（第 2抗体）とを単に組み合わせるだけでは、非特異的吸着が起こり高感度な測定系を組み立てられない。従って非特異的反応を抑えることが高感度測定のポイントである。例えば、界面活性剤を測定系に用いると非特異的吸着が少なくなるが、全ての界面活性剤が t PAPA I複合体の測定系に有効であるわけではない。

本発明者らによれば、前記の如く第 1抗体及び第 2抗体を組合せると共に特定の界面活性剤が t PA- PA I複合体の測定系における免疫反応を抑制せず、免疫反応に関与しない物質や標識抗体の非特異的吸着のみを抑制する効果があることがわかった。

本発明においては、このような界面活性剤を免疫活性剤を免疫反応液中に存在させたり、洗浄液中に存在させると高感度測定に有利である。免疫反応が 2段反応の場合には、いずれに存在させることもできるが、

2段目の反応に存在させるのが好ましレ、

太発明に用いられる界面活性剤は HL B値（Hydraphile L ipophi le Balance) が 1 6以上の非イオン界面活性剤である, 11し8が1 6未満の界面活性剤は、非特異的吸着を抑制すると同時に免疫反応を抑制してしまい、好ましくない。

11 8値が1 6位上の非 1イオン界面活性剤としては、例えば、ポリォキシアルキレンアルキルァリールエーテル系、ボリォキシアルキレンアルキルエーテル系、ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンポリオール系などの HL B値が 1 6位上のものであればよく、例えばトリトン X- 305 (HLB 1 7.3) 、トリトン X- 405 (HLB 1 7.9) 、エマルゲン 950 (HLB 1 8.2) 、ェマルゲン 985 (HLB 1 8.9) 、 T ween 20 (HLB 1 6.7) ブルロニック F 68 (HLB 29) 、テトラニック 707 (HLB〉20) などが挙げられる。

これらの界面活性剤は単独で使用することもできるし、二種以上の界面活性剤を併用することもできる。

洗浄液等における界面活性剤ののうどは 1 wZw%以下であり、好ましくは 0.00 1 %以上 0.1 wZw%以下である

本発明においては、 0.1 wZw%以下の界面活性剤量でも洗浄効果に優れ、更に洗浄時の泡立ちが少くなり、その結果泡立ちが激しくて、泡の除去が煩雑となったり、その除去が不十分になって逆に洗浄としては不十分になったりするといつた問題も少なくなるので、好ましい。非イオン界面活性剤の溶媒としては水、生理食塩水、あるいはリン酸緩衝液のような緩衝液など、測定に悪影響を及ぼさないものならいずれであってもよレ' [B] -(4) 希釈剤

本発明の測定キットおよび測定方法に使用される希釈剤としては、免疫学的測定において通常使用されるものであればよい。該希釈剤として免疫反応に悪影響を与えないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、卜リス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などの P Hが 6.0〜 8.0の範囲のものが主として使用される。

[B]一（5) 酵素活性を測定するための基質および反応停止剤：

本発明の測定キットおよび測定方法に使用される前記基質および反応停止剤は、標識物質としての酵素の種類に対応して、免疫学的測定において通常知られているものを使用することができる。その例としては、ペルォキシダーゼの基質として 2， 2 ' -アジノ -ジ一 [ 3ェチルベンツチアゾリンスルフォン酸] ジアンモニゥム塩（ABTS) 、オルトフエ二レンジァミン（0 P D) 、 3 , 3 '， 5 , 5 'ーテトラメチルベンヂジン (TMB) 等があり、停止剤としては H₂S 0" H C 1、齚酸、グリシン緩衝液（P H 1 0.3) 、フッ化ナトリゥム溶液等がある

アル力リフォスファタ一ゼの基質としては 4一二トロフエニルフォスフェート、 4 -メチルゥンベリフェリルフォスフェート、 NAD P等がある

-ガラストシダーゼの基質としては 2 -ニトロフエニル - yS - D— ガラクトシド、 4 -メチルゥンベリフェリル - - D -ガラクトシド等がある。停止剤としては、 0.1 M N a₂C0₃などがある。 [B] -（6) 蛋白質の使用

本発明者らの研究によれば、 tP A - P A I複合体の測定において、免疫反応溶液中に分子量 1 .6万〜 5.0万、好ましくは 2.0 ~4.6万及び等電点 1 .0~ 5.0、好ましくは 1 .2〜 4.8である蛋白質を存在せしめ、この蛋白質の免疫反応溶液における最終濃度が 0.0 2〜0.9 重量％となるように調整すると、一層非特異的吸着が抑制され、従ってバックグランドが著しく低くなりさらに高感度が得られやすいことがわかった。かかる物質としては、例えばカゼイン、 βカゼイン、なカゼィン、ペプシン、オボグリコプロテイン、ォロソムコィドなどが挙げられる。あるいはまた、かかる蛋白質はその混合物を使用することもできる。このような混合物としては、例えば主成分として前記蛋白質 1 0 ~ 6 0 重量％、好ましくは 2 0~5 0重量％、糖（例えば乳糖） 3 0〜8 0重量％、好ましくは 4 0〜6 0重量％、その他脂肪（例えば 0.5〜2重量％) 、灰分（例えば 5 ~ 1 2重量％) 、水分（例えば 2〜8重量％) などを含むことができる。このような混合物として典型的なのはスキムミルクである。スキムミルクは蛋白質としてカゼィンを含むものである力;、カゼインを単独で使用した場合に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中における分散性がよく、蛋白質単位重量当りの非特異的吸着抑制効果が高く、温度 4 °Cにおける保存性がよい（沈澱が生じにくい）という特長を有する。なお、本発明に用いるスキムミルクとしては、脱脂したミルクであれば何の由来の乳であってもよい。すなわち、免疫反応溶液にスキムミルクを存在せしめ免疫反応溶液におけるその最終濃度が 0.0 0 2〜 0.8重量％となるように調整すること力;、同様に高感度が得られるので好ましい。 0.0 0 2重量％より低濃度では十分な抑制効果が得られず、また、スキムミルクの場合には 0 . 8重量％、上記蛋白の場合には 0 . 9重量％ょり高濃度とすると、特異的反応も抑制されるので好ましくない。

上記蛋白質は、前述したように免疫反応溶液中に前記濃度となるように使用すればよく、希釈剤中に存在させていてもよくまた二次抗体中に含有させていてもよい。

[ B ] -（7 ) 測定方法

本発明の測定方法におけるヒト検体としては、通常の臨床サンプル、例えば血清あるは血漿形態の血液、関節液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、細胞組織液、骨髄液、尿などの t P A - P A I複合体を含有する液体であればいずれであってもよい。好ましいのは血清または血漿形態の血液である。

本発明の測定方法においては、前記一次抗体および二次抗体を組合せて使用し、

( i ) 不溶性固体担体に結合した第 1抗体にヒ卜検体を接触させ、洗浄後、次いで標識化された第 2抗体を接触させるか、或いは、 ( ii ) 不溶性固体担体に結合した第 i抗体、標識化された第 1抗体、標識化された第 2抗体及びヒト検体を同一系に存在せしめる、ことにより、ヒト検体中の t P A - P A I複合体の量を高感度に測定することができる。前記（ i ) の方法はヒ卜検体中に高澳度で t P Aが存在する場合、例えば t P Aを治療の目的で投与された患者検体においても t P Aの影響を受けず（ii ) の方法より優れている。

測定に際しての免疫反応温度条件は、構成要素である蛋白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制しないかぎり制限はないが、一般には、 5 0°c以下、好ましくは約 4〜 4 5 °c程度の温度条件下に約 5 分から 5時間好ましくは 3 0分〜 3時間程度を要して反応を行えばよレ、。例えば、反応温度を 3 7 °Cの如き体温に近い温度の場合、非特異的吸着反応は非常に少なくすることができ、測定系の高感度化という点において大きな威力を発揮するのも、本発明系の特徴の一つである。

[C] 活性型 P A Iの測定方法

前記した本発明による tP A - P A I複合体の測定方法は、極めて感度よくヒ卜検体中の tP A - P A I複合体を測定することができるので、この方法を利用することにより、ヒト検体中の活性型 P A Iの量を容易に且つ感度よく測定することが可能となる。

従来活性型 P A Iの濃度を測定する方法として tP Aか P A I と反応して tP A - P A I複合体を生成することを利用した方法が髙田らにより報告されている。 [Thrombosis Reseaech5 5巻、 2 8 5 ~ 5 8 9 ページ（ 1 9 8 9 ) ] 。この方法においては、検体中の P A I と tP A との反応は 4 °Cで一夜行ない、次いで生成に tP A - P A I複合体の量を測定している。

そしてこの tP A - P A I複合体を測定する方法は、まず 3 0 °Cで 3 時間反応させ、しかるのち洗浄し、 -ガラクトダーゼ標識されたポリクローナル抗体 tP A · Fab'フラグメントと 4 °Cで一夜反応させ、免疫反応を完了し、 4 - メチル -ゥンベルフェリルガラクトシドを分解させ、生じた 4 -メチルゥンベリフエロンを、蛍光性で測定し、 t P A - P A I複合体を定量しているものである。かかる方法は 2つの免疫反応における反応温度が異なり、測定に関する時間も 2 日間必要で、非常に長く、さらに特殊な測定装置である蛍光光度計を用いるため、工業的および臨床的には効率的に測定することが困難であった。

これに対して本発明によれば、ヒト検体に tP Aを加え活性型 P A I と tP Aとを反応させ、生じた tP A - P A I複合体の量を測定し、 tP Aを加えなかった検体中の該複合体の量との差から活性型 P A Iの量が簡便でしかも短時間で測定できる。

e. 発明の効果

かくして、本発明方法によれば、臨床サンプルなどの微量の tP A - P A I複合体を含む試料を検体として、該検体中の tP A - P A I複合体を高感度、高精度に、しかも簡便な操作で定量することができる。さらに同様に検体中の活性型 P A Iの量を高感度、高精度に簡単に且つ短時間に測定することができる。

f. 実施例

以下実施例により本発明を詳細に説明する。実施例中、％表示は重量 %を示す。 '

図面の説明

第 1図は、 tP A - P A I複合体の免疫学的測定のための検量線を示すものであり、 tP A - P A I複合体の澳度と吸光度との関係を示すものである。

第 2図は、 tP A - P A I複合体の免疫学的測定において洗浄時間と吸光度との関係を示すものである。

第 3図は、 tP A - P A I複合体の免疫学的測定において不溶性固体担体の表面粗さの程度と非特異的吸着率との関係を示すものである。参考例 [ペルォキシダーゼ標識抗 tP Aモノクローナル抗体 Fab'フラグメントの作成] ヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ターに対するモノクローナル抗体（ J TA - 1 ；ョ一口ッパ特許公開第 3 3 9 3 0 2号参照）の F ab' フラグメントをニソノフの方法に準じて調整し、常法によりペルォキシダーゼと結合してペルォキシダーゼ標識 F a を得た（日本生化学会編、続生化学実験講座、 5巻、 1 0 9 - 1 1 2頁、東京化学同人、 1 9 8 6 年）。すなわち、該モノクローナル抗体の 1 . OtngZmfi溶液（0.0 1 M リン酸- 0.1 5 M NaC]2 _PH 7.2 (P B S) ) の 2ηιβに 4 0 μもべプシンを加え、 1 Μクェン酸緩衝液（ρΗ 3.5) で ΡΗ 3.7に調整したあと 3 7 °Cで 1時間消化分解した。反応液に 1 N NaOHを滴下し、 p H 8 として反応を停止した。 T S K Gei G— 3 0 0 0 S Wカラム（東ソー） - H P L Cで溶出液に 5mM E DTA - 0.1 Mリン酸緩衝液（p H 6 - 0 ) を用いて、この反応液から分子量 1 0万の F(al )₂フラグメントを分離した。

これを限外濾過器により澳縮した。これに 0.1 M 2 -メルカプトェチルァミン 2 0 0〃£を加え、 3 7 °Cで 2時間還元処理した。この反応液を限界濾過器によって、澳縮後、 F(ab')₂と同様に H P L Cによつて分子量 5万の Fab'を分離し 1 .0 7fflg/mi2の Fab'フラグメン卜の液を 1 . Omfi得た。

一方、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（東洋紡 I 一 C) の 6. Omgを 0. 1 Mリン酸ナ卜リゥム緩衝液（PH 7.0) 0.9πιβに溶解し、 Ν -サクシンィミジル- 3 —マレイミドメチル—シクロへキサン力ルポネート（ピアース社、 SMC C) のジメチルホルムアミド溶液を 6 0 β ( 2.9mg 滴下し、 3 0 °Cで 1時間反応した。この反応液をセフアデックス G - 2 5力ラムに添加、 0.1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液（pH 6. 0) を流してマレイミド化ペルォキシダーゼを分離した。かくして得られたマレイミド化ペルォキシダーゼ 3.2mgと Fab'フラグメント 1 .0m gを 2 5 °Cで 2 4時間反応させ T S K Gefi G - 3 0 0 0 SWカラム - H P L C (溶出液 0.0 1 M P B S) にて分離精製したところ、分子量約 1 3万のペルォキシダーゼ標識マウス抗 tP A抗体 Fab 'フラグメントが 0.3 5 rag得られた。得られた標識抗体の 2 8 Onmと 4 0 3 nm の吸光度より求めた Fab'フラグメントとペルォキシダーゼの結合モル比は 1 ： 2であった。

実施例 1

[ペルォキシダ一ゼ標識抗 tP Aポリクローナル抗体の作成]

ャギ抗ヒト tP A抗体（バイオプール社）の P B S溶液（ 1 mg/mi2) 5.0 mfiに N - (m-マレイミド安息香酸）サクシンィミドエステノレ（MB S、ピアース社）のジメチルホルムアミド溶液（ 1

2 5 0 y"J2を加え、 2 5 °Cの温度で 3 0分間反応させたあと、セファテツクス G - 2 5を充填したカラムを用い、 0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6. 0 ) でゲル濾過を行い、マレイミド化ポリクローナル抗体と未反応の M B Sとを分離した。

—方、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（H R P) の 0.1 Mリン酸緩衝液（PH 6.5) の溶液（ 1 OmgZmiZ) 5.4 mJ2に S -ァセチル無水コハク酸のジメチルホルムアミド溶液（6 0m_g ini2) を 1 9 7 加え、 2 5 °Cの温度で 3 0分間反応し、次に 0.1 M - トリス緩衝液（PH 7.0) を 2.2mj2、 1 M- ヒドロキシルァミン水溶液 4.3m<2、 0.1 M E D T A水溶液 0.4mi2を加え 4分間撹拌し、セファテックス G - 2 5を充填したカラムを用いて、 0 . 1 Μリン酸緩衝液（PH 6 .0 ) でゲル濾過を行い、 S H化されたペルォキシダーゼを分離した。

MB S化した抗体（2.4mg) と S H化されたペルォキシダーゼ（5. 3 mg) を 2 5 °Cで 2 0時間反応させ、 HP L C (T S K Gel G - 3 0 0 0 S W) を用いるゲル濾過でペルォキシダーゼ標識、抗 tPAポリクローナル抗体 1 .9mgを得た。

[固定抗体の作成]

中心線平均粗さ（ R a) が 1 .3 5 mであるポリスチレンビーズ（ィ厶ノケミカル社、 D - 7) をマウス抗 P A Iモノクローナル抗 P A I抗体（ J T I - 4) の 0.1 Mリン酸クヱン酸緩衝液（pH 3.0 ) の溶液 (2 0 y«gZmfi) に浸し、 4 °Cで 2 0時間放置した。ビーズを P B S溶液で洗浄したあと、 1 %B S A - P B S溶液に室温で 2時間静置後、再度 P B S溶液で洗浄し、マウス抗 PA I抗体固定ビーズを得た。

[検量線の作成]

ヒト tP A · P A I複合体を 0.2 5 %スキムミルクを含む、 0.0 1 Mリン酸- 0.5 M NaCfi- 2 %B S A緩衝液（pH 7.2 ) で希釈して 2 5、 1 2.5、 6.2 5、 3.1 2 5、 1 .5 6、 0ngZmi2の溶液を作成した。各濃度の溶液 0.4πιβとマウス抗 P A I抗体固定ビーズを小試験管に入れ、 3 7 °Cで 1時間ィンキュベーションした。次に P B Sに 0. 0 5 Tween 2 0を含む洗浄液で 2回洗浄した。

ペルォキシダーゼ標識 tP Aポリクローナル抗体を 1 gノであるように P B S - 0.0 5 %Tween 2 0溶液で調整し、 0.4ml2づっ小試験管に加えた 3 7 °Cで 3 0分間ィンキュベーションした。洗浄液で 3回洗浄後、 0.4ηιβのペルォキシダーゼ用基質液、 2.5mM H₂0₂- 0.0 2 5 %、 3 , 3'， 5， 5' -テトラメチルベンチジン 0.1 M リン酸クェン酸（PH 4.0) 溶液を加え 3 7。Cで 3 0分間発色させ、 1 N硫酸で発色を停止し、 4 5 Onmの吸光度を測定した。

検量線を第 1図に示す。

実施例 2 [ペルォキシダーゼ標識した抗 tP Aモノクローナル抗体と抗 t P Aポリクローナル抗体の比較]

ヒト tP A · P A I複合体を 0.2 5 %スキムミルクを含む 0.0 1 M リン酸 - 0.5M NaCリットル - 2 %B S A緩衝液（PH 7.2 ) で希釈して 2 5、 1 2.5、 6.25、 0 ngZmfiの溶液を作成した。各濃度の濃度 0.4m£と実施例 1 〖固定抗体の作成] で作成したマウス抗 P A I 抗体固定ビーズを小試験管に入れ 3 7°Cで 1時間にィンキュベーションした。次に P B Sに 0.05 %Tw_een2 0を含む洗浄液で 2回洗浄後実施例 1で得られたペルォキシダーゼ標識抗 tP Aポリクローナル抗体又は参考例で得られたペルォキシダーゼ標識マウス抗 tP A抗体 Fab'フラグメントを 1 g/mi2であるように P B S— 0.0 5 %Tween2 0溶液で調整し、 0.4mi2づっ小試験管に加えて 3 7 °Cで 3 0分間インキュベーシヨンした。洗浄液で 2回洗浄したあと、 3 rafiの洗浄液を小試験管に入れて、 0、 1 5、 1 0、 2 0、 3 0分間静置後ァスピレーターで吸引除去した。次いで、 0.4πιβのペルォキシダ一ゼ基質（実施例 1 と同じ）を加え、 3 0分間発色させ、 1 Ν硫酸で発色を停止し 4 5 Onmの吸光度を測定した。洗浄液を入れて静置した時間を吸光度の関係を第 2図に示す。この図よりペルォキシダーゼ標識抗 tP Aポリクローナル抗体を使用した場合には吸光度の減少が少く、洗浄操作所要時間による影響を受けにくいことが判る。

実施例 3 直系が 6.3 5醫で表面の粗さが異なるボリスチレン製のビーズと実施例 1の [固定抗体の作成] と同様に処理して、マウス抗体 P A I抗体固定ビーズを得た。ヒト tP A · P A I複合体を 0.2 5mg/mi2を含む溶液を 0.2 5 %スキムミルク一 0.0 1 Mリン酸- 0.5 M NaCfi- 2 %B S A緩衝液で作成し、各濃度の溶液 0.4ηιβと表面粗さの異なるマウス抗 P A I抗体固定ビーズと小試験管に入れ 3 7°Cで 1時間ィンキュ一べーションした。次に P B Sに 0.0 5 %Tween2 0を含む洗浄液で 2回洗浄した。実施例 1で得られたペルォキシダーゼ標識抗体 tP Aポリクローナル抗体の P B S - 0.0 5 %Tween2 0溶液（ 1 A gZmfi) を 0.4 ιηβづっ小試験管に加え 3 7°Cで 3 0分間ィンキューべ一ションした。洗浄液で 3回洗浄したあと、 0.4mfiのペルォキシダーゼ用基質流を加えて 3 7 °Cで 3 0分間発色させ、 1 N硫酸で発色を停止、 4 5 0tnm の吸光度を測定した。得られた吸光度から非特異的吸着率（OngZmfiの吸光度 ÷ 2 50_£ノ11^の吸光度>< 1 0 0) を求めた。ボリスチレンビーズの表面粗さは東京精密（株）の表面粗さサーフコム ®で測定した。非特異的吸着率を縦軸に、表面粗さを示す中心線平均粗さ（Ra) を横軸にとると第 3図の如くなり、この図より表面粗さが小さい程非特異的吸着率に小さいことが判る。非特異的吸着率が 2.5 %以下のとき、中心線平均粗さは 1 .5 m以下であった。

実施例 4

実施例 1 [検量線の作成] における洗浄液として、第 1表記載の各種の表面活性剤を生理水に溶解して使用した時の tP A · P A I濃度 Ong mQ (N) 、 2 5 ng/mi2 (S) の吸光度とその比（SZN) を示す。 S ZN比が 4 0を非特異的吸着の許容限度とするとき、第 1表の如く、 H L Bが 1 6以上の非ィオン界面活性剤を使用した場合非特異的吸着抑制に有効である。しかし H L Bが 1 6以下の非イオン界面活性剤である P ' 8 Pや Tween4 0では非特異的吸着は抑制するが特異反応（S) も抑制し高感応分析には有効ではなかった。

第 1表各種界面活性剤使用時の SZN比

実施例 5 [スキムミルク添加による非特異的吸着の抑制]

(a) —次反応溶液へのスキムミルク添加効果

スキムミルクを 0、 0.0 1、 0.1 2 5、 0.2 5、 0.5、 0.8、 1 0 %含有する、 0.0 1 M P B - 0.5 M NaCfi- 2 % B S A (_PH 7.2) 緩衝液でヒト tP A · PA I複合体を希釈し、 0、 2 5ngZmfiの溶液を作成した。各溶液 0.4 m2とマウス抗 P A I抗体固定ビーズを小試験管に入れ、 3 7 °Cで 1時間ィンキュベーションした。次に P B Sに 0.0 5 %Tween2 0を含む洗浄液で 2回洗浄した。ペルォキシダーゼ標識抗 tP Aポリクローナル抗体を 1 であるように B P S - 0. 0 5 %Tween2 0溶液で調整し、 0.4 mfiづっ小試験管に加えて、 3 7 °Cで 3 0分間ィンキュベ一ションした。洗浄液で 3回洗浄後 0.4πιβのペルォキシダーゼ用基質液を加え 3 7 °Cで 3 0分間発色させ、 1 N硫酸で発色を停止し、 4 5 Onmの吸光度を測定した。その結果を表 2aに示す。非特異的吸着（N) と特異反応（S) の SZN比が 4 0.0を許容限界とするとスキムミルク澳度が 0.0 1 ~ 0.8 %の間で有効であることがわかる。

(b) 二次反応溶液へのスキムミルクの添加効果

スキムミルクを 0.2 5 %含有する 0.0 1 M- P B - 0.5 M NaC d- 2 % B S A (PH 7.2) 緩衝液でヒト tP A · F A I複合体を希釈し、 0、 2 5ng/mfiの溶液を作成した。各溶液 0.4ηιβとマウス抗 P A I抗体固体ビーズを小試験管に入れ、 3 7 °Cで 1時間ィンキュベーションした。次に P B Sに 0.0 5 %Tween2 0を含む洗浄液で 2回洗浄した。ペルォキシダーゼ標識抗 tP Aポリクローナル抗体を l *gノ! nfiの濃度で含有しスキムミルクを 0、 0.0 1、 0.2 5、 0.5、 0.8、 1 . 0 %含有する P B S - 0.0 5 %Tween2 0の溶液を調整し、 0.4 mi2づつ小試験管に加え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベーションした。洗浄液で 3回洗浄後、 0.4πιβのペルォキシダーゼ用基質を加えて 3 7 °Cで 3

0分間発色させ、 I N硫酸で発色を停止し、 4 5nmの吸光度を測定した _c その結果を第 2表 bに示す。非特異的吸着（N) と特異反応（S) による SZN比はスキムミルクを 0.0 1 ~0.8 %添加することにより上昇し、スキムミルクが有効であることがわかる。表 2a スキムミルク添加による非特異的吸着の抑制

表 2b スキムミルク添加による非特異的吸着の抑制吸光度番号スキムミルク濃度（％) tPA'PAI tPA'PAI S/N

0ng/mi2(N) 25ng/rai2(S)

1 0 0.023 1.328 57.7

2 0.002 0.023 1-320 59.4

3 0.01 0.022 1.315 59.8

4 0.125 0.021 1.261 66-0

5 0.25 0.021 1.245 59.3

6 0.5 0.021 1.240 29.0

7 0.8 0.021 1.050 50.0

8 1-0 0.024 0.953 39.7 実施例 6 [正常人、患者検体の測定]

実施例 1 [検量線の作成] において、検体として正常人 5名と血栓症の患者 3名の血漿を 4倍希釈して測定した結果を第 3表に示す。

第 3表正常人、血栓症患者検体測定結果

血栓症の患者の tP Α·Ρ A I複合体濃度は明らかに高値を示し、 tP Α·Ρ A I複合体濃度は血栓症の診断でマーカーとなり得ることがわかつた。

実施例 7

[活性型 P A I濃度の測定]

正常人血漿、血栓症患者血漿（5 0 >" ) にヒト tP Α溶液（ 0.5 /mfi、 5 を加え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベーションした。このあと実施例 1の検量線の作成に従って tP A · P A I複合体の濃度を求めた（結果 A) 。同時に tP Aを添加していない正常人血漿、血栓症患者の血漿を実施例 1の検量線の作成にしたがってヒト tP A · P A I複合体の濃度を求めた（結果 B) 。活性型 P A Iの濃度は両者測定値の差を求め、 P A Iの分子量換算をして求めた（結果 C) 。結果を表 4 に示す。

表 4

C単： ng/m/2)

： active PAIfe度：

(結果 A-結果 B)X 0.42**

PAI分子量（5万）

**： 0.42 =

tPA'PAI分子量（12万）

血栓症の活性型 P A I濃度は正常人に比べて、有意に上昇しており活性型 P A I濃度は血栓症の診断マーカーとなり得ることがわかった,

Claims

請求の範囲

1 . ヒト検体中のヒト組織プラスミノーゲンァクチべ一ター · ヒトプラスミノ一ゲンァクチベーターィンヒビター複合体を免疫学的に測定するためのキッ卜であって、

(i) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトブラスミノーゲンァクチべ一ター · ィンヒビターに対するモノクローナル抗体（第 1抗体）

(ii) 酵素により標識化されたヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチベータ一に対するボリクロ一ナル抗体（第 2抗体）

酵素活性を測定するための基質および反応停止剤

(iv) 希釈剤

および、

(V) H L B (Hydrophi l e Lipophi l e Balance)値力 S少なくとも 1 6である非ィオン界面活性剤を含有した洗浄剤

よりなることを特徴とする免疫学的測定キット。

2 . 分子量約 1 6，0 0 0〜約 5 0 , 0 0 0及び等電点 1 . 0〜 5 . 0の蛋白質がさらに前記二次抗体および Zまたは前記希釈剤に含まれている請求項 1記載の免疫学的測定キット。

3 - 該非イオン界面活性剤が、ポリオキシアルキレンアルキルァリールエーテル系、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル系、ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル系およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンポリオール系からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項 1 または 2記載の免疫学的測定キット。

4 . 該不溶性固体担体が、鏡面化されたポリスチレンビーズである請求項 1 ~ 3のいずれかに記載の免疫学的測定キット。

5 . 該モノクローナル抗体は J T I 一 4である請求項 1 ~ 4のいずれかに記載の免疫学的測定キット。

6 . 該蛋白質がスキムミルクである請求項 2〜 5いずれかに記載の免 s 疫学的測定キット。

7 . (1) 不溶性固体担体に結合した第 1抗体にヒ卜検体を接触させ、次いで標識化された第 2抗体を接触させるか、或いは

(2) 不溶性固体担体に結合した第 1抗体、標識化された第 2抗体及びヒト検体を同時に接触させる、

1 0 ことにより、ヒト検体中のヒト組織プラスミノーゲンァクチベータ一 ' ヒ卜プラスミノーゲンァクチべ一ターインヒビター複合体を免疫学的に測定する方法であって、

(a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトプラスミノーゲンァクチべ一ターィンヒビターに対するモノ

! 5 クローナル抗体を第 1抗体として使用し、

(b) 酵素により標識化されたヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ターに対するポリクローナル抗体を第 2抗体として使用し、且つ

(c) H L B (Hydrop i le Lipoph i le Balance)値が少なくとも 1 6 0 である非ィオン界面活性剤を含有した洗浄剤を洗浄剤として使用する、

ことを特徵とする免疫学的測定方法。

8 . 不溶性固体担体に結合した第 1抗体にヒ卜検体を接触させ、次いで標識化された第 2抗体を接触させることによる請求項 7記載の免疫学的測定方法。

9 . 分子量約 1 6 , 0 0 0〜約 5 0，0 0 0及び等電点 1 . 0〜 5 . 0の蛋白質がさらに前記二次抗体および Zまたは前記希釈剤に含まれている請求項 7または 8記載の免疫学的測定方法。

1 0 . 該非イオン界面活性剤が、ポリオキシアルキレンアルキルァリールエーテル系、ボリォキシアルキレンアルキルエーテル系、ボリォキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル系およびポリオキシェチレンポリオキシプロピレンポリオール系からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項 7〜 9のいずれかに記載の免疫学的測定方法。

1 1 . 該不溶性固体担体が、鏡面化されたボリスチレンビーズである請求項 7 ~ 1 0のいずれかに記載の免疫学的測定方法。

1 2 - 該モノクローナル抗体は J T I 一 4である請求項？〜 1 1のいずれかに記載の免疫学的測定方法。

1 3 . 該蛋白質がスキムミルクである請求項 9〜 1 2のいずれかに記載の免疫学的測定方法。

1 4 . (A) ヒト検体中に存在するヒ卜組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ター ' ヒ卜プラスミノーゲンインヒビタ一複合体及び

(B) ヒト組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一ターを添加したヒト検体中に存在するヒト組織ブラスミノーゲンァクチべ一ター · ヒトプラスミノーゲンインヒビター複合体をそれぞれサンドィツチ法による免疫学的測定方法によって測定し、その測定値の差に基いてヒト検体中の活性型ヒ卜プラスミノーゲンァクチベーターィンヒビターの量を測定する方法において、

(a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に結合したヒトブラスミノーゲンァクチベーターィンヒビタ一に対するモノク口一ナル抗体を第 1抗体として使用し、

(b) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノーゲンァクチべ一ターに対するポリクローナル抗体を第 2抗体として使用し、且つ

(c) H L B (Hydrophi le Lipophi le Balance)値が少なくとも 1 6 である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤を洗浄剤として使用する、

ことを特徵とする活性型ヒトプラスミノ一ゲンァクチべ一ターインヒビターの測定方法。