JP2509001B2

JP2509001B2 - ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法、そのための試薬及びそのためのキツト

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Publication number: JP2509001B2
Application number: JP2514881A
Authority: JP
Inventors: 公彦松沢; 了一長谷川
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-11-02
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1996-06-19
Anticipated expiration: 2011-06-19

Description

【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用本発明は、試料、殊にヒト検体中のヒト・トロンボモ
ジユリンの免疫学的測定に関する。更に詳しくは試料中
に微量存在するヒト・トロンボモジユリンを免疫学的に
高感度で、正確に且つ容易に測定する方法、そのための
試薬及びそのためのキツトに関する。

b.従来技術トロンボモジユリンは、1981年にシー・テイーエスモ
ンらによつて、ウサギ肺の血管内細胞からトロビンによ
るプロテインＣの活性化を著しく促進するコフアクター
蛋白質として発見され［C.T.Esmon,W.G.Owen:Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,78,2249〜2252（1981）］、翌年精製さ
れた［N.L.Esmon,W.G.Owen,C.T.Esmon:J.Biol.Chem.,25
7,859〜864（1982）］。その後ヒト・トロンボモジユリ
ンも肺および胎盤から精製され［S.Kurosawa,et al.:Th
romb.Res.37,353〜364（1985）など］、ヒト胎盤からの
トロンボモジユリンは、分子量が還元剤の存在下105,00
0、非存在下75,000である糖蛋白質であることが報告さ
れた。トロンボモジユリンは、動脈、静脈、毛細血管、
リンパ管の内皮細胞の細胞膜上にある膜蛋白質で、脳を
のぞいたほとんどの臓器中に存在するが、特に肺と胎盤
に多く存在することが知られている。またその生理作用
は、脈管の内皮細胞上でトロンビンの血液凝固促進作用
を凝固阻害作用へと転換する生理活性物質であることが
知られている。すなわちトロンボモジユリンは細胞膜上
でトロンビンと1:1の複合体を形成することによりトロ
ンビンはその凝固因子としての性質を失うとともにプロ
テインＣ活性促進作用を発現し、この活性化プロテイン
Ｃを介して血液凝固因子中の活性型第Ｖ因子、活性型第
VIII因子を不活性化することにより、凝固阻害作用を示
すことが知られている。更にトロンボモジユリンは活性
型第Ｘ因子に直接結合してその活性を阻害することによ
りプロトロンビンからのトロンビン生成を抑制すること
も知られている。

以上述べた如き生理作用を有するトロンボモジユリン
は、血液凝固・線溶系の新たな調節因子として注目され
ている。したがつて、溶液中の微量なトロンボモジユリ
ンを容易かつ正確に測定することは、循環器系の基礎医
学、臨床医学の研究において果たす役割は非常に大き
い。

殊にヒト検体中に微量存在するヒト・トロンボモジユ
リンを高感度で測定することは、血管壁の障害を伴なう
各種の疾患の病態をモニターできる可能性を有してい
る。

近時、試料中、殊にヒト検体中の微量成分を測定する
方法として抗原抗体反応を利用する免疫学的測定方法が
用いられている。この測定方法を診断薬として医療現場
での多数検体の測定などに用いる場合、主な必要条件と
して次の点が挙げられる。すなわち検体中の微量成分を
測定しえる感度があること、測定対象のみを測定する得
異性があること、再現性よく測定値が得られること、か
つ測定操作が容易、簡便などである。

上記した観点から従来知られているヒト・トロンボモ
ジユリンの測定手段を見る時必ずしも充分満足しえない
のが現状である。すなわち、エツチ・イシイらの放射免
疫測定法（radiommunoassay、以下RIAと略）の報告（H.
Ishii et al.:J.Clin.Invest.,76,2178（1985）,H.Ishi
i et al.,Blood67,362（1986））がなされているが、こ
の報告では、ヒト・トロンボモジユリンに対するポリク
ローナル抗体と¹²⁵Ｉ−トロンボモジユリンを用いた競
争法が記載されているが、その感度は１〜2.5ng/ml程度
であり、また測定時間は19時間以上必要とされることか
ら、この測定方法は微量のトロンボモジユリンを正確に
かつ簡便に測定するには不満足な方法であつた。また抗
体としてポリクローナル抗体のみを用いるための特異性
の点でも危険性が考えられる。

その後、サンドイツチ法による免疫学的測定方法が報
告された。西岡らは、ヒト肺から精製したトロンボモジ
ユリンを抗原として得たポリクローナル抗体を用いた方
法を報告している［西岡淳二ら、第10回日本血栓止血学
会要旨集、51頁、（1987）］。この方法では抗体として
ポリクローナル抗体のみを用いていることから前記方法
と同様、ポリクローナル抗体の特異性の点で問題が予想
される。更に特開昭64−45398及び特開昭64−47391号広
報が開示されている。ここでは２種のモノクローナル抗
体のみを用いたサンドイツト法が示されているが、本発
明者らの検討によれば、必ずしもモノクローナル抗体の
みを使ったサンドイツチ法によるヒト・トロンボモジユ
リンの測定は実際の医療現場で使用する測定方法として
は充分満足すべきものではなかつた。すなわち、試料中
の微量なヒト・トロンボモジユリンを測定するに必要な
感度を短時間にえることが出来なかった。

c.発明が解決使用とする課題そこで本発明者らは、前述した従来技術の問題点を解
決し、診断薬として必要条件を備えた免疫学的測定方
法、試薬及びキツトを提供するため研究を進めた。

本発明の第１の目的は、試料中、殊にヒト検体中の微
量のヒト・トロンボモジユリンを高感度で測定すること
ができる免疫測定方法、試薬及びキツトを提供すること
にある。

本発明の第２の目的は、試料中のヒト・トロンボモジ
ユリンを実際の医療、殊に臨床の場において、使用しう
る簡便で且つ短時間で測定することができる免疫学的測
定方法、試薬及びキツトを提供することにある。

本発明の他の目的は試料中のヒト・トロンボモジユリ
ンを、測定する人や測定条件（時間、温度）の影響を受
けるので、また使用する抗体の特異性に出来る限り影響
されることなく、安定して高感度で測定することができ
る免疫学的測定方法、試薬及びキツトを提供することに
ある。

本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一層明ら
かとなるであろう。

d.課題を解決するための手段かくして本発明者らの研究によれば、前記本発明の目
的及び利点は、下記ヒト・トロンボモジユリンの免疫学
的測定方法、免疫学的測定試薬及び免疫学的測定キツト
によつて達成されることが見出された。

［Ｉ］ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法；試料中のヒト・トロンボモジユリンをサンドイツチ法
により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に
固定化した抗体（第１抗体）と標識化した抗体（第２抗
体）は、いずれか一方がヒト・トロンボモジユリンを認
識するポリクローナル抗体であり、他方がヒト・トロン
ボモジユリンを認識するモノクローナル抗体であるヒト
・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法。

［II］ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定試薬；試料中のヒト・トロンボモジユリンを、不溶性担体に
固定化した第１抗体及び標識化した第２抗体を使用して
免疫学的に測定するための試薬であつて、一方の抗体が
ヒト・トロンボモジユリンを認識するポリクローナル抗
体であり、他方の抗体がヒト・トロンボモジユリンを認
識するモノクローナル抗体であることを特徴とする免疫
学的測定試薬。

［III］ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定キツ
ト；試料中のヒト・トロンボモジユリンの免疫学的に測定
するためのキツトであつて、（ｉ）不溶性固体担体に固定化したヒト・トロンボモジ
ユリンを認識する抗体（第１抗体）、（ii）標識化したヒト・トロンボモジユリンを認識する
抗体（第２抗体）、但し、上記第１抗体及び第２抗体
は、いずれか一方がヒト・トロンボモジユリンを認識す
るポリクローナル抗体であり、他方がヒト・トロンボモ
ジユリンを認識するモノクローナル抗体である。

（iii）酵素で標識化した場合には、酵素活性を測定す
るための基質および反応停止剤、（iv）希釈剤、（ｖ）洗浄剤及び（vi）標準物質よりなる免疫学的測定キツト。

以下本発明について更に詳細に説明する。

［Ａ−１］抗原の調製及び精製本発明に使用されるポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体を得るための抗原としてのヒト・トロンボ
モジユリンは、原則しては天然の材料から抽出した天然
型のものが用いられるが、天然型のヒト・トロンボモジ
ユリンと同等の免疫学的性質をもつものであれば蛋白工
学的又は遺伝子工学的手法によつて得られるものでもよ
い。その例として、ハプテンすなわち天然型のヒト・ト
ロンボモジユリンの抗原決定部位を含むペプチドであつ
てもよい。更に、ヒト・トロンボモジユリンを蛋白分解
酵素、例えばエラスターゼ、トリプシンなどによつて得
られるフラグメントであつてもよい。

天然型のヒト・トロンボモジユリンを得るための材料
としては、例えばヒト肺、ヒト血管あるいは培養ヒト・
血管内皮細胞とその培養上清などが挙げられるが入手が
比較的容易な点から好ましくはヒト胎盤である。分離・
精製は、通常用いられる蛋白分離技術、例えば塩析、抽
出、遠心分離、限外濾過、各種のクロマトグラフイー等
を組み合せて行うことができるが、前記したエス・クロ
サワらの文献記載の方法は、その１例である。

かくして得られた精製ヒト・トロンボモジユリンを抗
原として使用し、以下に説明する方法によりポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体を調製することができ
る。

［Ａ−２］ヒト・トロンボモジユリンを認識するポリク
ローナル抗体の調製：本発明において使用されるヒト・トロンボモジユリン
を認識するポリクローナル抗体は、前記の如くして得ら
れたヒト・トロンボモジユリン或いはそのフラグメント
を抗原として、それ自体知られた方法に従つて得ること
ができる。

例えば「日本生化学会編、続生化学実験講座、５巻、
１−10頁、東京化学同人、1986」記載の方法によつて得
られる。

免疫動物としては、哺乳動物であれば特に限定される
ものではないが、例えばヒト・トロンボモジユリンを抗
原とする場合、山羊、ウサギ、モルモツテ、ラツトある
いはマウスなどが好んで挙げられる。

免疫した後、採血し、抗血清を得る。得られた抗血清
を通常使用される方法、例えば塩析、抽出、遠心分離、
限外濾過、種々のクロマトグラフイーなどを組合せて精
製されたポリクローナル抗体を得ることができる。

［Ａ−３］ヒト・トロンボモジユリンを認識するモノク
ローナル抗体の調製；本発明において使用されるヒト・トロンボモジユリン
を認識するモノクローナル抗体は、前記ヒト・トロンボ
モジユリン或いはそのフラグメントを抗原として使用
し、それ自体知られたケーラーとミルシユタインによる
細胞融合法（G.Kkler and Milstein,Nature（Londo
n），256,495−497（1975））により作製されたハイブ
リドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離する
ことにより調製される。すなわち、ヒト・トロンボモジ
ユリンでマウスを免疫した後、このマウスのリンパ球を
マウス・ミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作
製する。このようにして得たハイブリドーマは、融合さ
れた種々のリンパ球のそれぞれに応じて種々のモノクロ
ーナル抗体を産生するので、目的とするモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマをクローニングによつて
クローン化されたハイブリドーマとして単離する。この
クローン化ハイブリドーマをイン・ビトロで培養してモ
ノクローナル抗体を分泌させる。この培養上清から抗ヒ
ト・トロンボモジユリン・モノクローナル抗体を分離す
る。

本発明において、モノクローナル抗体としては、ヒト
・トロンボモジユリンとトロンビンとの複合体形成に対
する阻害作用を有し且つヒト・プロテインＣの活性化に
阻害作用を有するものを使用するのが好ましい。このよ
うなモノクローナル抗体は公知であり、例えば、I.Maru
yama et al.:J.Biol.Chem.,260,15432（1985）記載のモ
ノクローナル抗体特開昭64−45398号公報記載のTM−A73
と表示されたモノクローナル抗体がある。

前記した阻害作用を有するモノクローナル抗体を使用
することが好ましい理由は、試料中のヒト・トロンボモ
ジユリンとトロンビンとの複合体又はそのフラグメント
を認識せず、遊離のヒト・トロンボモジユリン又はその
フラグメントを直接認識し測定できるからである。

［Ｂ］第１抗体及び第２抗体の調製：本発明においては、上記ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体を不溶性担体に固定化した抗体（第１抗
体）或いは標識化した抗体（第２抗体）に用いるが、そ
の組合せは一方をポリクローナル抗体とし、他方をモノ
クローナル抗体として用いる。この組合せにより、ヒト
・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法においてポリ
クローナル抗体の持つ高い親和性とモノクローナル抗体
の持つ高い特異性を同時にに発現させることが可能であ
る。その結果、感度、特異性、再現性に優れた簡便な免
疫学的測定方法を得ることができる。

しかしながら、本発明者らの研究によれば、固定化し
た抗体（第１抗体）が、ヒト・トロンボモジユリンを認
識するポリクローナル抗体であり、標識化した抗体（第
２抗体）がヒト・トロンボモジユリンを認識するモノク
ローナル抗体である組合せが、特に好ましい結果が得ら
れることがわかつた。

［Ｂ−１］固定化した抗体の調製不溶性（固体）担体に固定化された抗ヒト・トロンボ
モジユリン抗体（第１抗体）は以下のようにして得るこ
とができる。

不溶性固体担体としては、天然から得られる重合体と
その誘導体、合成重合体とその誘導体を挙げることが出
来る。前者には、多糖類とその誘導体、例えばセルロー
ス、セフアデツクス、セフアロース、カルボキシメチル
セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、デキ
ストランなど、あるいはガラス、シリカゲルなどの無機
重合体などがある。また後者にはビニル系重合体、例え
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、AB
S、ポリフツ化ビニル、ポリアミン−メチルビニルエー
テル−マレイン酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重
合体など；縮合系重合体、例えば６−ナイロン、6,6−
ナイロンなどのポリアミド、ポリエチレン・テレフタレ
ートなどのポリエステル、アミノ酸重合体などがある。
また、その形状は試験管、マイクロタイタープレート、
ビーズあるいはメンブレンなど特に限定されない。かく
なる不溶性固体担体に固定される抗体としては、前述の
如き抗ヒト・トロンボモジユリン抗体の抗体分子、抗原
結合能が失われないそのフラグメント例えばＦ（ab′）
₂、Fab′、Fab或いはFacbなど；あるいは抗原結合能が
失われない抗体分子またはそのフラグメントの誘導体で
ある。これらの抗体を不溶性固体担体へ固定する方法
は、物理的吸着法、例えばポリスチレンの固体担体を抗
ヒト・トロンボモジユリン抗体の溶液に浸漬する方法な
ど；イオン結合法、例えばイオン交換樹脂あるいはアミ
ノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基などのイ
オン化する官能基を有する固体担体を用いる方法など；
あるいは化学反応による共有結合法、例えばカルボキシ
・クロライド法、カルボジイミド法、無水マレイン酸誘
導体法、イソシアネート誘導体法、臭化シアン活性化多
糖法、ジアゾ法、活性エステル法、架橋試薬による担体
結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサ
メチレンイソシアネート、コハク酸イミド、マレイミド
化合物など）など；更には、ヒト・トロンボモジユリン
に対しては結合能はないが抗ヒト・トロンボモジユリン
抗体に対し生物学的反応により結合し得る物質を介して
結合する方法、例えばプロテインＡ結合固体担体を用い
る方法などである。

さらに本発明者らの研究によれば、不溶性固体担体と
してその表面が鏡面化されたもの、すなわち表面が極め
て平滑なものを使用することにより、非特異的吸着が低
くなり、ヒト・トロンボモジユリンの測定感度が向上す
ることがわかつた。

従来、高感度な測定のための不溶性固体担体として
は、むしろその表面を研磨して粗くし、表面積を大きく
したものが用いられてきた。確かに表面積を大きくする
と、抗体の固定量を増加させるというメリツトがある
が、しかしながら非特異的吸着も大きくなるというデメ
リツトがあつた。本発明者らの研究したところによれ
ば、ヒト・トロンボモジユリンの測定においては、中心
線平均粗さ（Ra）が1.5μｍ以下である鏡面化された固
体担体は、抗体の固定量は粗面化された固体担体とほぼ
同等であるが、非特異的吸着は飛躍的に減少し、ヒト・
トロンボモジユリンの高感度測定に遊離であることを見
出した。かかる鏡面化された不溶性固体としては、その
材質形状は特に制限されているが例えばポリスチレンビ
ーズ、ガラスビーズがあげられる。

中心線平均粗さ（Ra）は、粗さ曲線からその中心線の
方向に測定長さｌの部分を抜取り部分の中心線をＸ軸、
縦倍率の方向をＹ軸とし、あらさ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で
表わしたとき、次式で与えられるRaの値をミクロン単位
で表わした値を意味する。

この中心線粗さ（Ra）については、JIS B 0601−1982
（日本）＜ANSI B46.1−1979（USA）及びR468−1966（I
SO）に説明されている。

なお以下の本発明の実施例では、不溶性担体は東京精
密（株）製の表面粗さ計サーフコム（Surfcom570A）
を用いて表面粗さを測定した。

［Ｂ−２］標識化した抗体の調製；本発明において標識化した抗ヒト・トロンボモジユリ
ン抗体（第２抗体）は、以下のようにして得ることがで
きる。

標識化すべき抗体としては、抗体全分子のみならず、
抗原結合能が失われないそのフラグメント例えばFa
b′、Ｆ（ab′）₂又はFacbフラグメントなどを使用する
ことができる。

かかるフラグメントは、Ｆ（ab′）₂やFab′の場合に
は、上述のようにして得られたポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を公知の方法、たとえば該抗体を
ペプシンで分解してＦ（ab′）₂フラグメントとなすか、更にＦ（ab′）₂フラグメントを還元処理することによつてF
ab′フラグメントとなすことにより得られる（II.Nison
off et al.,Arch.Biochem.Biophys.,89,230（1960）:P.
Parham.,J.Immunol.,131,2895（1983）など）。

標識化に使用される標識物質としては、ラジオアイソ
トープが良く知られているが、工業的な生産を考える
と、公害に結びつく可能性がある点、使用期限がある
点、また使用者の特殊訓練が必要な点で、これらの欠点
がなくかつ増巾作用のある酵素が適している。

またかかる抗ヒト・トロンボモジユリン抗体と結合さ
せる酵素としては、例えばリゾチーム、マレート・デヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−フオスフエート・デヒ
ドロゲナーゼ、パーオキシダーゼ、グルコース・オキシ
ダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、ルシフエラーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、アルコール・デヒドロゲナー
ゼ、インベルターゼなどを例示することが出来る。これ
ら酵素と前記抗ヒト・トロンボモジユリン抗体との結合
抗体の結合方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸
法、マレイミド法など通常の方法に従うことが出来る。
例えばマレイミド化された抗体又は抗体のフラグメント
とSH化された酵素を溶液中で反応することにより行うこ
とができる。抗体又は抗体のフラグメントのマレイミド
化は、例えばサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサンカーボネート（SMCC）、スルホサ
クシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサンカーボネート（スルホSMCC）、サクシンイミジル
−メタマレイミドベンゾエート（MBS）、サクシンイミ
ジル６−マレイミドヘキサノエート（EMCS）などにより
マレイミド化することができる。酵素へのSH基の導入は
公知の方法（例えば石川編「酵素免疫測定法」医学書院
参照）に従うことができる。例えば酵素とＳ−アセチル
メルカプト無水コハク酸（AMSA）又はＮ−サクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPD
P）などと反応することにより得られる。

かくして得られた酵素と抗ヒト・トロンボモジユリン
抗体との結合抗体（第２抗体）、すなわち酵素標識化抗
体における酵素の標識数は、分子量の測定や吸光度、酵
素活性などの測定などにより求めることができる。たと
えば、酵素がペルオキシダーゼの場合には、抗体とペル
オキシダーゼに由来する280nmの吸光度と、ペルオキシ
ダーゼに由来する403nmの吸光度を測定することにより
標識数を求めることができる（E.Ishikawa et al.,J.Im
munoassay.,４,209−327,（1983）、p243参照）。

すなわち403nmでは抗体の吸光度はなく、ペルオキシ
ダーゼのみ由来の吸光どである故に、該吸光度からペル
オキシダーゼの濃度を算出する。280nmでは抗体、ペル
オキシダーゼ両者由来の吸光度であることから、抗体の
濃度は測定された280nmの吸光度から、403nmの吸光度に
よつて算出されたペルオキシダーゼの濃度と280nmのペ
ルオキシダーゼの分子吸光係数から算出されるペルオキ
シダーゼの280nmの吸光度の寄与分を引いた値と、280n
での抗体の分子吸光係数から算出する。かくして得られ
たペルオキシダーゼと抗体の濃度から抗体へのペルオキ
シダーゼの標識数を求めることが出来る。

かくして本発明の標識した抗ヒト・トロンボモジユリ
ン抗体の標識数を求め、測定感度との相関を研究した結
果、抗体全分子、Fab′、Ｆ（ab′）₂又はFacbフラグメ
ントに酵素が、抗体１分子当り平均1.0分子以上結合の
ものであればよいが、かなでも1.5分子以上結合したも
の（多標識化抗体）がより好ましい結果を生ずることが
明らかとなつた。試料中のヒト・トロンボモジユリンを
測定するに充分な測定感度を得るためには、該多標識化
抗体は酵素が抗体全分子、Fab′、Ｆ（ab′）₂又はFacb
フラグメント１分子当り平均1.5分子以上結合したもの
がよく、より好ましくは２分子以上である。

かかる多標識化抗体は、たとえば前記マレイミド化抗
体又は抗体フラグメントとSH化された酵素とを反応させ
ることによつて製造される。該反応条件としては、たと
えば該抗体と該酵素とのモル比1:1以上、好ましくは1:3
以上、反応温度４〜40℃、好ましくは４〜30℃、反応pH
5.5〜7.5、反応時間５〜48時間の条件に従うことができ
るが、本発明の多標識化抗体がえられれば前記反応条件
に限定されるものではない。この様にして得られた多標
識化抗体は例えば、ゲルクロマトグラフイーを用いて反
応液より分離精製することができる。

かくして得られた本発明の酵素で標識した抗体は、試
料中の微量のヒト・トロンボモジユリンを測定するに必
要な測定感度で正しく測定することが出来る。

［Ｃ］免疫学的測定方法：本発明の測定方法における試料、殊にヒト検体として
は、通常の臨床サンプル、例えば血清あるいは血漿形態
の血液、間節液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、細胞
組織液、骨髄液、尿などのヒト・トロンボモジユリンを
含有する液体であればいずれであってもよい。好ましい
のは血清または血漿形態の血液である。

本発明の免疫学的測定方法においては、前記第１抗体
及び第２抗体を組合せて使用し、いわゆるサンドイツチ
法により、試料中のヒト・トロンボモジユリンを測定す
る。

サンドイツチ法としては大きく１ステツプサンドイツ
チ法と２ステツプサンドイツチ法とがある。１ステツプ
サンドイツチ法は、測定しようとするとヒト・トロンボ
モジユリンを含む試料、不溶性担体に固定化した抗体
（第１抗体）及び標識化した抗体（第２抗体）を同一反
応系で抗原・抗体反応を行なわせ、固定化抗体・抗原・
標識化抗体の複合体を形成せしめ、洗浄操作の後、標識
物質の量を測定する方法である。この場合、試料（検
体）と固定化抗体と標識化抗体とを同時に存在させて反
応させてもよいし、先ず試料と固定化抗体とを反応させ
てから標識化抗体を添加して反応させてもよい。また、
試料と標識化抗体とを予め反応させてから固定化抗体を
添加してもよい。いずれにしても洗浄操作前に固定化抗
体・抗原・標識化抗体の複合体を形成しさえすればよ
い。一方、２ステツプサンドイツチ法は、試料と固定化
抗体とを先ず反応して固定化抗体・抗原の複合体を形成
せしめ、しかる後試料を除去、洗浄してから標識化抗体
を添加して固定化抗体・抗原・標識化抗体の複合体を形
成せしめる。次いで洗浄操作の後、標識物質の量を測定
する方法である。ポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体を用いる本発明によれば、１ステツプサンドイツチ
法あるいは２ステツプサンドイツチ法により試料中にお
ける微量なヒト・トロンボモジユリンを高い感度、特異
性をもって再現性よく簡便に測定することが出来る。

上記における免疫反応に用いられる溶媒としては、反
応に悪影響を与えない通常の各種のものいずれであって
もよい。例えばリン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、酢
酸緩衝液などのpHが6.0から8.0程度のものを用いるのが
好ましい。

測定に際しての免疫反応温度条件は、構成要素である
蛋白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制
しない限り特に制限はないが、一般には50℃以下、好ま
しくは約４℃〜45℃程度の温度条件下に約５分から５時
間程度、好ましくは約30分から３時間、を要して反応を
行えばよい。

［Ｄ］免疫学的測定キツト：本発明においては、不溶性固体担体に固定化した抗ヒ
ト・トロンボモジユリン抗体（第１抗体）、標識化した
抗ヒト・トロンボモジユリン抗体（第２抗体）に、免疫
学的測定に際し必要なその他のものを組み合せて、ヒト
・トロンボモジユリンの量を測定するためのキツトを構
成することができる。

本発明の免疫学的測定キツトにおいて、（ｉ）前記第
１抗体及び（ii）第２抗体と共に組合される他の試剤と
しては、下記の（iii）〜（vi）のものが挙げられる。

（iii）酵素で標識化した場合には、酵素活性を測定す
るための基質および反応停止剤（iv）希釈剤（ｖ）洗浄剤及び（vi）標準物質以下これらについて説明するが、これらは通常免疫学
的測定に使用されるものであればよい。

酵素活性を測定するための基質および反応停止剤：本発明の測定キツトおよび測定方法において、標識物
質として酵素を使用した場合に使用される前記基質およ
び反応停止剤は、標識物質としての酵素の種類に対応し
て、免疫学的測定において通常知られているものを使用
することができる。その例としては、ペルオキシダーゼ
の基質として2,2′−アジノ−ジ−［３エチルベンツチ
アゾリンスルフオン酸］ジアンモニウム塩（ABTS）、オ
ルトフエニレンジアミン（OPD）、3,3′,5,5′−テトラ
メチルベンヂジン（TMB）等があり、停止剤としてはH₂S
O₄、HCl、酢酸、グリシン緩衝液（pH10.3）、フツ化ナ
トリウム溶液等がある。

アルカリフオスフアターゼの基質としては４−ニトロ
フエニルフオスフエート、４−メチルウンベリフエリル
フオスフエート、NADP等がある。

β−ガラストシダーゼの基質としては２−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフエ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド等がある。停止剤として
は、0.1M Na₂CO₃などがある。

希釈剤：本発明の測定キツトおよび測定方法に使用される希釈
剤としては、免疫学的測定において通常使用されるもの
であればよい。該希釈剤として免疫反応に悪影響を与え
ないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス
塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などのpHが6.0〜8.0の範囲のも
のが主として使用される。

洗浄剤本発明においては、免疫反応測定において一般に使用
される洗浄剤をそのまま使用することができる。しかし
ながら本発明者らによれば、前記の如く第１抗体及び第
２抗体を組合せると共に特定の界面活性剤がヒト・トロ
ンボモジユリンの測定における免疫反応を抑制せず、免
疫反応に関与しない物質や標識抗体の非特異的吸着のみ
を抑制する効果があることがわかった。

本発明においては、このような界面活性剤を免疫活性
剤を免疫反応液中に存在させたり、洗浄液中に存在させ
ると高感度測定に有利である。免疫反応が２段反応の場
合には、いずれに存在させることもできるが、２段目の
反応に存在させるのが好ましい。

本発明に用いられる界面活性剤は両面界面活性剤及び
／又はHLB値（Hydraphile Lipophile Balance）が16以
上の非イオン界面活性剤である。

HLBが16未満の界面活性剤は、非特異的吸着を抑制す
ると同時に免疫反応を抑制してしまい、好ましくない。

HLB値が16以上の非イオン界面活性剤としては、例え
ば、ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル
系、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル系、ポリオ
キシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル系、ポリ
オキシエチレンポリオキシプロピレンポリオール系など
のHLB値が16以上のものであればよく、例えばトリトン
Ｘ−305（HLB17.3）、トリトンＸ−405（HLB17.9）、エ
マルゲン950（HLB18.2）、エマルゲン985（HLB18.9）、
Tween20（HLB16.7）、ブルロニツクF68（HLB29）、テト
ラニツク707（HLB＞20）などが挙げられる。

両性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸塩型
（ベタイン型）、スルホン酸塩型（スルホベタイン型）
およびリン酸塩型のものなどが挙げられる。スルホベタ
イン型は発癌性が問題になることもあり、その使用は工
業的には必ずしも好ましいとは言えない。好ましくはベ
タイン型両性界面活性剤であり、一般式R₁R₂R₃NR₄［式
中、R₁はC₅〜C₂₂アルキル基、R₂およびR₃はC₁〜C₅アル
キル基、R₄はCOO置換基を有するC₁〜C₅アルキル基を
表わす］で示されるベタイン型である。更に好ましく
は、R₂、R₃がそれぞれメチル基であり、R₄はCH₂COOで
ある。この種の好適な界面活性剤としては、R₁がラウリ
ル基である「アンヒトール24B」（商品名）が花王株式
会社より販売されている。

これらの界面活性剤は単独で使用することもできる
し、二種以上の界面活性剤を併用することもできる。

洗浄液等における界面活性剤の濃度は１重量％以下で
あり、好ましくは0.0025〜１重量％である。

本発明においては、0.1重量％以下の界面活性剤量で
も洗浄効果に優れ、更に洗浄時の泡立ちが少くなり、そ
の結果泡立ちが激しくて、泡の除去が煩雑となったり、
その除去が不十分になって逆に洗浄としては不十分にな
ったりするといった問題も少なくなるので、好ましい。

これら界面活性剤の溶媒としては水、生理食塩水、あ
るいはリン酸緩衝液のような緩衝液など、測定に悪影響
を及ぼさないものならいずれであってもよい。

標準物質本発明の測定キツトおよび測定方法において使用され
る標準物質は第１抗体及び第２抗体のそれぞれが認識す
る抗原決定部位をいずれも少なくとも１つ以上有する蛋
白質またはポリペプチドが用いられる。

その代表的なものの１つは、天然の材料から抽出した
天然型のヒト・トロンボモジユリンまたはそのフラグメ
ントである。

天然型のヒト・トロンボモジユリンを得るための材料
としては、例えばヒト胎盤、ヒト肺、ヒト血管あるいは
培養ヒト・血管内皮細胞とその培養上清などが挙げられ
るが入手が比較的容易な点から好ましくはヒト胎盤であ
る。分離・精製は、通常用いられる蛋白分離技術、例え
ば塩析、抽出、遠心分離、限外濾過、各種のクロマトグ
ラフイー等を組み合せて行うことができるが、前記した
エス・クロサワらの文献記載の方法は、その１例であ
る。

また、ヒト・トロンボモジユリンのフラグメントは、
前記の如くして得られた天然型のヒト・トロンボモジユ
リンを蛋白分解酵素、例えばエステラーゼ、トリプシン
など或いは蛋白分解試薬、例えば臭化シアンなどを用い
て、それ自体知られた方法によって得ることができる
［例えばS.Kurosawa et al.,J.Biol.Chem.,262.2206（1
987）参照］。

さらに上記天然型のみならず、蛋白工学的または遺伝
子工学的手法によって得られた前記性質を有するポリペ
プチドであってもよい。

蛋白質の使用本発明者らの研究によれば、ヒト・トロンボモジユリ
ンの測定においては、免疫反応溶液に分子量1.6万〜5.0
万及び等電点1.0〜5.0である蛋白質又はそれを含む混合
物を存在せしめ、これらの免疫反応溶液における最終濃
度が0.005〜0.8重量％となるように調整すると、非特異
的吸着が抑制され、したがってバツクグランドが著しく
低くなり高い測定感度が得られることがわかった。かか
る蛋白質又はそれを含む混合物は、本発明の免疫測定試
薬或いはキツトに免疫反応溶液中に前記所定の量となる
ように含有せしめることもできる。かかる蛋白質として
は、例えばカゼイン、ペプシン、オボグリコプロテイ
ン、オロソムコイドなどがあげられる。分子量1.6万以
下の蛋白質を用いた場合特異的吸着が上昇する結果を得
ており、また5.0万以上の分子量では免疫非特異的反応
の低減が不充分かつ特異的免疫反応の低下が見られるこ
とにより、分子量を1.6万〜5.0万と定めた。また等電点
に関しても5.0以上の蛋白質を添加した場合非特異的吸
着が上昇し、また等電点が1.0より低い場合特異的反応
が抑制されるために等電点を1.0〜5.0と定めた。

また種々の濃度の該蛋白質溶液たとえばスキム・ミル
クも用いて免疫測定方法を行なったところ、0.005重量
％未満で抗原が０であるにもかかわらず非特異的反応が
著しく増加し、また、１ケ月間、該蛋白質たとえばスキ
ムミルク溶液の冷蔵庫における保存試験を行なった結
果、0.8重量％より大ではスキムミルク溶液が再溶解不
能の沈澱を生じたため、その保存安定性の面から0.8重
量％以下と定めた。以上２つの事実を考慮し、試薬の安
定性を満足し、かつ非特異的反応を効果的に減ずるか該
蛋白濃度は0.005〜0.8重量％の範囲が適当である。この
ような混合物としては、例えば主成分として前記タンパ
ク質10〜60重量％、好ましくは20〜50重量％、糖（例え
ば乳糖）30〜80重量％、好ましくは40〜60重量％、その
他脂肪（例えば0.5〜２重量％）、灰分（例えば５〜12
重量％）、水分（例えば２〜８重量％）などを含むこと
ができる。このような混合物として典型的なのはスキム
ミルクである。スキムミルクはタンパク質としてカゼイ
ンを含むものであるが、カゼインを単独で使用した場合
に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中における分
散性が良く、非特異的反応を抑制する効果が高く、温度
４℃における保存性が良い（沈澱が生じにくい）という
特徴を有する。なお、本発明に用いるスキムミルクとし
ては、脱脂したミルクであれば、何の由来の乳であって
も良い。一番典型的なもののひとつとしては、市販され
ているDifco社製のスキムミルクである。

なお本発明において、タンパク質の「分子量」は浸透
圧法によって測定した分子量を意味し、具体的には高分
子溶液と純溶媒と溶媒分子は自由に透すが、溶出高分子
は透さない半透膜を境として接した際に両液の浸透圧差
が高分子の分子量のパラメータとなることを利用してタ
ンパク質の分子量を測定するもので、本発明では6.66M
尿素溶液を用いて４℃で測定した値である。また「等電
点」はタンパク質をその等電点に従って分離するクロマ
トフオーカシング法によって測定した値をいい、具体的
にはPBE94（フアルマシア製）ゲルを充填したカラム
（0.5cmφ×45cm）を用い溶出液0.025Mイミダゾール塩
酸（pH7.4）で測定した値をいう。

前記蛋白質は、免疫反応溶液中において、前記濃度と
なるように使用されるが、キツトの場合、蛋白質は、標
準物質、第２抗体又は希釈剤のいずれかに少なくとも含
有せしめておくのが好ましい。含有量は免疫反応溶液中
において前記濃度となるようにして適宜決められるべき
である。

本発明方法でのヒト・トロンボモジユリンの測定にお
ける、免疫反応溶液中に、前記した分子量16,000〜50,0
00及び等電点1.0〜5.0である蛋白質又はそれを含む混合
物とともにγ−グロブリンまたはγ−グロブリン誘導体
を免疫反応溶液における最終濃度が0.0025〜0.1重量％
の濃度で存在せしめる時、非特異的吸着の抑制すなわち
バツクグラウンドの低下が更に得られ、該蛋白質単独で
用いられる場合に比較して更に高い測定感度が得られる
ので好ましい。γ−グロブリンとしては、ヒトまたは哺
乳動物、例えば牛、ウサギ、ヤギ、などの血清から分離
されたものが挙げられるが、特にヒト・γ−グロブリン
が好ましい。またγ−グロブリン誘導体としては、化学
的に修飾された前記γ−グロブリン、例えばＳ−アルキ
ル化γ−グロブリン、Ｓ−スルホ化γ−グロブリンなど
が挙げられる。次にその添加量は、0.0025重量％未満で
はγ−グロブリン又はその誘導体の添加によるバツクグ
ランドの低下は小さく、実質的に十分なその添加効果は
得られない。また0.1重量％より多く添加しても0.1重量
％添加した時以上の効果は認め難いことと、γ−グロブ
リンが比較的高価であるため製造コストの観点から添加
量の上限を0.1重量％が適当である。以上の理由によっ
て添加量は前記の範囲が適当である。

ｅ発明の効果かくして、本発明によれば、試料、例えば臨床サンプ
ルなどの極く微量のヒト・トロンボモジユリンを高感度
で精度よく、しかも簡便な操作で測定することができ
る。しかも測定の操作は比較的短かい時間で実施するこ
とができる。

殊に本発明によれば、試料検体中にヒト・トロンボモ
ジユリンとトロンビンの複合体が存在していても、その
存在によって遊離のヒト・トロンボモジユリンの測定の
精度は、何等の影響を受けない。

図面の説明第１図は、本発明におけるポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体を組合せてヒト・トロンボモジユリン
を測定した場合の検量線を示すものであり、参考のため
本発明以外の抗体を組合せた場合の検量線も併せて示し
た。

第２図は、ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定
において、蛋白質の添加濃度と吸光度との関係を示すも
のである。

第３図は、ヒト・トロンボモジユリンの濃度と吸光度
との関係（検量線）を示すものである。

ｆ実施例以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例１家兎の皮下に、前記エス・クロサワらの文献記載の方
法に従ってヒト胎盤から精製したヒト・トロンボモジユ
リン500μｇとフロイント完全アジユバンドとのエマル
ジヨンを投与した。14日後にヒト・トロンボモジユリン
250μｇを同様にして皮下投与した。更に14日間隔で２
回同様に皮下投与し、10日目に採血し、血清とした後、
酵素免疫定量法、すなわちヒト・トロンボモジユリンを
抗原とし第２抗体にホースラデイツシユパーオキシダー
ゼ標識したヤギ抗ウサギIgG抗体で、ヒト・トロンボモ
ジユリンに対する抗体価を測定し300万倍であることを
認識した。その後、全血を採取、血清とし、それをプロ
テインA-セフアローズ‐4Bカラムで精製してヒト・トロ
ンボモジユリンに対するポリクローナル抗体を取得し
た。

実施例２ 1.抗ヒト・トロンボモジユリン・モノクローナル抗体の
マレイミド化ヒト・トロンボモジユリンのトロンビンとの複合体形
成に対する阻害活性を有し、かつプロテインＣの活性化
を阻害するモノクローナル抗体（特開昭64−45398号公
報記載のTM-A73）830μｇのPBS溶液に、サクシンイミジ
ル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサンカーボネー
ト（SMCC）のDMF溶液（10mg/ml）13.9μｌを25℃で滴下
した。30分間攪拌した後、セフアデツクスG-25のカラム
（1cm×45cm）で溶離液として0.1Mリン酸緩衝液を用い
て、ゲル濾過しマレイミド化されたモノクローナル抗体
を得た。

2.ペルオキシダーゼのチオール基導入ペルオキシダーゼ（東洋紡）143mgの0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.0）溶液14.3mlにS-アセチルメルカプト無水コ
ハク酸のDMF溶液（60mg/ml）176.4μｌを25℃で攪拌下
徐々に滴下し、60分間反応させた。この溶液に0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.0）5.72mlと0.1M EDTA溶液（pH7.
0）1.14ml、1Mヒドロキシルアミン溶液（pH7.0）11.44m
lを加え30℃で５分間攪拌した。溶液を透析チユーブに
入れ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）−5mM EDTAを外液と
して４℃で二夜透析し、SH基の導入されたペルオキシダ
ーゼ溶液を得た。

3.マレイミド化モノクローナル抗体とチオール基を導入
したペルオキシダーゼの結合マレイミド化モノクローナル抗体830μｇとチオール
基導入ペルオキシダーゼ溶液（4.05mg/ml）1.02mlとを
混合し、該混合液を限外濾過によって約600μｌに濃
縮、25℃で24時間反応させた。反応液をHPLC（カラムTS
K Gel3000SW）、溶離液PBS（pH7.2）で分離しペルオキ
シダーゼ結合モノクローナル抗体を得た。

得られたペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体の
抗体とペルオキシダーゼのモル比は1:4.6であった。

実施例３実施例１に記載の抗ヒト・トロンボモジユリン・ポリ
クローナル抗体を、0.1M炭酸緩衝液（pH9.5）で５μg/m
lの濃度に調整し、鏡面化されたポリスチレンビーズ
（イムノケミカル：イムノビーズ、Surfcom570A（東京
精密社製）で測定した表面中心線平均粗さ（Ra）:1.3μ
ｍ）を浸し４℃で17時間静置した。ビーズを１％BSA-TB
S（pH7.4）で室温で２時間静置した。TBS（pH7.4）で再
度３回洗浄し、抗体固定ビーズＡを得た。TBS（pH7.4）
中に使用するまで４℃で保存した。

上記抗体固体ビーズＡと同様の方法によって実施例２
に記載の抗ヒト・トロンボモジユリン・モノクローナル
抗体（TM-A73）を固定した抗体固定ビーズＢを得た。

一方、0.5％BSA-0.05％Tween20-5mMCaCl₂‐TBS（pH7.
4）の希釈緩衝液でヒト・トロンボモジユリンの０、0.6
25、1.25、2.5、5.0、10.0ng/ml溶液を作成した。この
0.4mlづつをポリプロピレン製プラスチック小試験管に
入れ、ヒト・トロンボモジユリン濃度０〜10ng/mlの希
釈列ＡとＢを作成した。この希釈列Ａの各試験管に抗体
固定ビーズＡを１づつ加え、また希釈列Ｂに抗体固定ビ
ーズＢを１つづつ加え、それぞれを37℃で90分間インキ
ユーベーシヨンした。

TBS（pH7.4）にTween20を0.05％溶解した液（TBS-Tと
略）で３回洗浄した後、希釈列Ａの各試験管には実施例
２で調製したペルオキシダーゼ標識抗ヒト・トロンボモ
ジユリン・モノクローナル抗体を抗体濃度１μg/mlに0.
5％BSA-0.05％Tween20-5mM CaCl₂‐TBS（pH7.4）で溶
解した液を0.4mlづつ加え、また希釈列Ｂの各試験管に
は、実施例２と同様の方法で、実施例１に記載の抗ヒト
・トロンボモジユリン・ポリクローナル抗体から調製し
たペルオキシダーゼ標識抗ヒト・トロンボモジユリン・
ポリクローナル抗体を前記と同様にして調製した抗体濃
度４μm/mlの液を0.4mlづつ加え、それぞれ37℃で30分
間インキユーベーシヨンした。

TBS-Tで５回洗浄した後、発色剤として、2.5mM H₂O₂
‐0.025％ 3,3′,5,5′テトラメチルベンジジンの溶液
を0.4mlづつ加え、37℃で30分間インキユーベーシヨン
し、１規定硫酸1mlを加え発色反応を停止し、450nmの吸
光度を測定した。

その結果得た検量線を第１図に示した。

比較として、実施例２の抗ヒト・トロンボモジユリン
・モノクローナル抗体とエピトープを異にするモノクロ
ーナル抗体を、前記抗体固定ビーズＡ、Ｂと同様にして
鏡面化されたポリスチレンビーズに固定し抗体固定ビー
ズＣを得た。該固定ビーズの外は前記抗体固定ビーズＡ
を用いた時と同様にして（希釈剤Ｃ）ヒト・トロンボモ
ジユリンに対する検量線を得た。その結果を比較例とし
て第１図に示した。

第１図から明らかな如く、２種のモノクローナル抗体
の組み合せ（希釈列Ｃ）にくらべて、本発明のポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体の組み合せ（希釈列Ａ
及びＢ）においては、高感度の検量線が得られることが
明らかである。

実施例４実施例１に記載の抗ヒト・トロンボモジユリン・ポリ
クローナル抗体を、0.1M炭酸緩衝液（pH9.5）で20μg/m
lの濃度に調整し、下記第１表に示した各種中心線平均
粗さのEIA用のポリスチレンビーズを浸し、４℃で17時
間静置した。ビーズを１％BSA-TBS（pH7.4）で室温で２
時間静置した。TBSで３回洗浄し、各種抗体固定ビーズ
を得た。

一方、0.5％BSA-0.2％スキム・ミルク‐0.015％ヒト
‐γグロブリン‐15mM CaCl₂‐TBS（pH7.4）の希釈緩
衝液でヒト・トロンボモジユリンの０、17ng/ml溶液を
作成し、この0.2mlづつをポリプロピレン製プラスチッ
ク小試験管に入れた。更に、各試験管に実施例２で調製
したペルオキシダーゼ標識抗ヒト・トロンボモジユリン
・モノクローナル抗体の抗体濃度３μg/mlの0.5％BSA-5
mMCaCl₂‐TBS（pH7.4）溶液を加え、上記抗体固定ビー
ズを１ケづつ入れて、37℃で90分間インキユーベーシヨ
ンした。TBS-Tで３回洗浄した後、発色剤として2.5mM
H₂O₂‐0.025％3,3′,3,5′‐テトラメチルベンジジンの
溶液を0.4mlづつ加え37℃で30分間インキユーベーシヨ
ンし、１規定硫酸1mlづつ加えて発色反応を停止した。

この溶液の450nmの吸光度を測定し、各種抗体固定ビ
ーズのS/N比（ここでＮはヒト・トロンボモジユリン0ng
/mlにおける吸光度であり、Ｓはヒト・トロンボモジユ
リン17ng/mlにおける吸光度である）及び測定感度（ヒ
ト・トロンボモジユリン0ng/mlの変動係数を10％とし、
これから求めた０点における［吸光度＋３×標準偏差］
値がヒト・トロンボモジユリン濃度が0ng/mlと17ng/ml
とを結ぶ直線と交わる点におけるヒト・トロンボモジユ
リン濃度を測定感度と定義する）を算出した。その結果
を第１表に示す。

第１表で明らかなごとく、本発明のRaが1.5μｍ以下
の鏡面化された不溶性担体の使用により優れた感度でヒ
ト・トロンボモジユリン測定が可能となった。

実施例５実施例１に記載の抗ヒト・トロンボモジユリン・ポリ
クローナル抗体を、0.1M炭酸緩衝液（pH9.5）に５μg/m
lの濃度に調整し、鏡面化されたポリスチレンビーズ
（イムノケミカル：イムノビーズ、Surfcom 570A（東
京精密社製）で測定した表面中心線平均粗さ（Ra）:1.3
μｍ）を浸し４℃で17時間静置した。ビーズをTBS（pH
7.4）にて３回洗浄後、１％BSA-TBS（pH7.4）で室温で
２時間静置した。TBSで再度３回洗浄し、TBS中に使用す
るまで４℃で保存した。

ヒト・トロンボモジユリンの０、10ng/ml溶液を、0.5
％BSA-5mM CaCl₂‐TBS（pH7.4）にスキム・ミルクを最
終濃度０、0.005、0.012、0.025、0.05、0.1、0.2％含
有させた溶液で調製し、その0.4mlづつをポリプロピレ
ン製プラスチック小試験管に入れた。各チユーブに前記
抗ヒト・トロンボモジユリン固定ビーズを１ケづつ加
え、37℃で90分間インキユーベーシヨンした。

TBSにTween20を0.05％溶解した液（TBS-Tと略）で２
回洗浄した後、実施例２で作成したペルオキシダーゼ標
識抗ヒト・トロンボモジユリン・モノクローナル抗体の
抗体濃度１μg/mlに0.5％BSA-5mM CaCl₂‐TBS（pH7.
4）にスキムミルクを最終濃度０、0.005、0.012、0.02
5、0.05、0.1、0.2％含有させた溶液で調製し、前記ス
キム・ミルク濃度と同じチユーブにそれぞれ0.4mlづつ
加え、37℃で30分間インキユーベーシヨンした。

TBS-Tで３回洗浄した後、発色剤として、2.5mM H₂O₂
‐0.025％ 3,3′,5,5′テトラメチルベンジジンの溶液
を0.4mlづつ加え、37℃で30分間インキユーベーシヨン
し、１規定硫酸1mlを加え発色反応を停止し、450nmの吸
光度を測定した。

その結果得た免疫反応溶液中のスキム・ミルク濃度
と、ヒト・トロンボモジユリン０、10ng/mlでの吸光度
との関係を第２図に示した。図から明らかな如く、スキ
ム・ミルクの添加は特異的反応に影響しないで非特異的
吸着を抑制することが明らかである。

実施例６実施例５に記載と同様にして抗ヒト・トロンボモジユ
リン・ポリクローナル抗体固定ビーズを調製した。

一方、0.5％BSA-0.015％スキム・ミルク‐5mM CaCl-
TBS（pH7.4）でヒト‐γグロブリンの下記第２表に記載
の濃度の溶液を調製し、これらを希釈緩衝液としてヒト
・トロンボモジユリンの0ng/ml及び14ng/ml溶液を調製
した。各々0.2mlづつをポリプロピレン製小試験管に加
えた。実施例２で調製したペルオキシダーゼ標識抗ヒト
・トロンボモジユリン・モノクローナル抗体の抗体濃度
３μg/mlの溶液を上記希釈緩衝液で調製し、ヒト・γグ
ロブリン濃度を対応させて上記小試験管に0.2mlづつ加
えた。

その後、おのおのの試験管に上記抗体固体ビーズを１
ケづつ入れ、37℃で90分間インキユーベーシヨンした。

TBS-Tで３回洗浄した後、発色剤として2.5mM H₂O₂‐
0.025％ 3,3′,5,5′‐テトラメチルベンジジン溶液を
0.4mlづつ加え、37℃で30分間インキユーベーシヨン
し、１規定硫酸1mlを加え発色反応を停止して450nmの吸
光度を測定した。

測定した吸光度から、各ヒト・γグロブリン濃度での
S/N比及び測定感度を実施例４と同様にして算出した。
その結果を第２表に示す。

第２表の結果から、スキム・ミルクを含有する免疫反
応溶液中に更にγグロブリンを0.0025％以上添加するこ
とによってヒト・トロンボモジユリンの測定感度を高め
ることが出来ることがわかる。

実施例７ヒト・トロンボモジユリンの0ng/mlおよび17ng/ml濃
度の0.5％BSA-0.2％スキム・ミルク‐0.015％ヒト・γ
グロブリン‐5mM CaCl₂‐50mM Tris/HCl-0.1M NaCl
（pH7.4）溶液0.2mlと、実施例２で得られたペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒト・トロンボモジユリン・モノクローナ
ル抗体の抗体濃度が３μg/mlである0.5％BSA-5mM CaCl
₂50mM Tris/HCl-0.1M NaCl（pH7.4）溶液0.2mlをポリ
プロピレン製小試験管にとり、次に実施例５に記載と同
様にして調製した抗ヒト・トロンボモジユリン・ポリク
ローナル抗体固定ビーズを１ケづつ上記各小試験管に入
れ、37℃で90分間インキユーベーシヨンした。

各小試験管内の溶液を吸引除去した後、第３表に示し
た書類の界面活性剤の0.05％を含有する生理食塩液3ml
で３回洗浄した。洗浄後、発色剤として2.5mM H₂O₂‐0.025％ 3,3′,5,5′‐テトラメチルベンジジン
溶液を0.4mlづつ加え、37℃で30分間インキユーベーシ
ヨンし、１規定硫酸1mlを加え発色反応を停止して450nm
の吸光度を測定した。この吸光度から実施例４と同様に
してS/N比を算出した。その結果を第３表に示す。

第３表から明らかにように、両性界面活性剤、HLB値
が16以上の界面活性剤を含有するする洗浄剤を用いる
時、ヒト・トロンボモジユリンを感度よく測定出来る。

実施例８洗浄剤として第４表に示した各濃度のテトロニック70
2の生理食塩液を用い、実施例７と同様に操作して使用
濃度の効果を調べた。その結果を第４表に示す。

上記結果から明らかなように0.0025〜1.0％の範囲でS
/N比を大きく、すなわち高感度にヒト・トロンボモジユ
リンを測定できる。２％では泡立ちが激しく、かつヒト
・トロンボモジユリン濃度17ng/mlの吸光度が著るしく
低下した。

実施例９実施例５に記載と同様にて抗ヒト・トロンボモジユリ
ン・ポリクローナル抗体固体ビーズを調製した。

一方、0.5％BSA-0.2％スキム・ミルク0.015％ヒト・
γ−グロブリン−5mM CaCl−50mM Tris/HCl-0.1M Cl
NaCl（pH7.4）で段階希釈したヒト・トロンボモジユリ
ン溶液（０〜33.3ng/ml）を調製し、各0.2mlづつをポリ
プロピレン製小試験管に加えた。次に実施例２で作成し
たペルオキシダーゼ標識抗ヒト・トロンボモジユリン・
モノクローナル抗体の抗体濃度３μg/mlの液を0.5％BSA
−5mM CaCl₂−50mM Tris/HCl−0.1M NaCl（pH7.4）
で調製し、上記小試験管の各々に0.2mlづつ加えた。さ
らにこれらの小試験管に上記抗体固体ビーズを１ケづつ
入れ、37℃で90分間インキユーベーシヨンした。

0.005％テトロニック702−5mM CaCl−生理食塩液で
３回洗浄した後、発色剤として2.5mM H₂O₂−0.025％3,
3′,5,5′‐テトラメチルベンジジン溶液を0.4mlづつ加
え、37℃で30分間インキユーベーシヨンした後、１規定
硫酸1mlを加え発色反応を停止して450nmの吸光度を測定
した。その結果得た検量線を第３図に示した。

第３図から明らかな如く、バックグランドが低く高感
度（実施例４の方法により算出した測定感度:63pg/ml）
の検量線が得られることが明らかである。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭64−47391（ＪＰ，Ａ) 特開昭50−89525（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−272156（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−12960（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−36964（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−500845（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／9402（ＷＯ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】スキム・ミルクならびにγ−グロブリンま
たはγ−グロブリン誘導体の存在する免疫反応溶液中
で、第１抗体としての不溶性担体に固定化した抗体と第
２抗体としての標識化した抗体とを試料中のヒト・トロ
ンボモジユリンと反応させるサンドイツチ法にる試料中
のヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法であっ
て、 A.該スキム・ミルクを、該免疫反応溶液における該スキ
ム・ミルクの最終濃度が0.015〜0.8重量％になるように
該免疫反応溶液中に存在せしめ、 B.該γ−グロブリンまたはγ−グロブリン誘導体を、該
免疫反応溶液中に0.0025〜0.1重量％の濃度で存在せし
め、そして C.該第１抗体がヒト・トロンボモジユリンを認識するポ
リクローナル抗体であり、該第２抗体がヒト・トロンボ
モジユリンを認識するモノクローナル抗体であり、且つ
該不溶性担体が1.5μｍ以下の中心線平均粗さの鏡面を
もつ、ことを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】該モノクローナル抗体が、ヒト・トロンボ
モジユリンとヒト・トロンビンとの複合体形成に対する
阻害作用を有し、且つヒト・プロテインＣの活性化に対
する阻害作用を有するものである請求項１記載の免疫学
的測定方法。
【請求項３】免疫学的測定方法における洗浄剤として、
両性界面活性剤および／またはHLB値が16以上の非イオ
ン界面活性剤を0.0025〜１重量％の濃度で含有する洗浄
剤を使用する請求項１または２記載の免疫学的測定方
法。
【請求項４】スキム・ミルクならびにγ−グロブリンま
たはγ−グロブリン誘導体の存在する免疫反応溶液中
で、第１抗体としての不溶性担体に固定化した抗体と第
２抗体としての標識化した抗体とを使用する試料中のヒ
ト・トロンボモジユリンの免疫学的測定試薬であって、 A.該スキム・ミルクを、該免疫反応溶液における該スキ
ム・ミルクの最終濃度が0.015〜0.8重量％になるように
該免疫反応溶液中に存在せしめ、 B.該γ−グロブリンまたはγ−グロブリン誘導体を、該
免疫反応溶液中に0.0025〜0.1重量％の濃度で存在せし
め、そして C.該第１抗体がヒト・トロンボモジユリンを認識するポ
リクローナル抗体であり、該第２抗体がヒト・トロンボ
モジユリンを認識するモノクローナル抗体であり、且つ
該不溶性担体が1.5μｍ以下の中心線平均粗さの鏡面を
もつ、ことを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項５】該モノクローナル抗体が、ヒト・トロンボ
モジユリンとヒト・トロンビンとの複合体形成に対する
阻害作用を有し、且つヒト・プロテインＣの活性化に対
する阻害作用を有するものである請求項４記載の免疫学
的測定試薬。
【請求項６】試料中のヒト・トロンボモジユリンを免疫
学的に測定するためのキツトであって、（ｉ）不溶性担体に固定化した、ヒト・トロンボモジユ
リンを認識し且つポリクローナル抗体である第１抗体、（ii）標識化した、ヒト・トロンボモジユリンを認識し
且つモノクローナル抗体である第２抗体、（iii）該抗体を酵素で標識化した場合には、該酵素活
性を測定するための基質および反応停止剤、（iv）スキム・ミルク、（ｖ）γ−グロブリンまたはγ−グロブリン誘導体、（vi）希釈剤、（vii）洗浄剤、及び（viii）標準物質、を含んでなり、そして該スキム・ミ
ルクおよびγ−グロブリンまたはγ−グロブリン誘導体
が該第２抗体、該希釈剤または該標準物質中に含まれて
おり、且つ該不溶性担体が1.5μｍ以下の中心線平均粗
さの鏡面をもつ、ことを特徴とするキツト。
【請求項７】該モノクローナル抗体が、ヒト・トロンボ
モジユリンとヒト・トロンビンとの複合体形成に対する
阻害作用を有し、且つヒト・プロテインＣの活性化に対
する阻害作用を有するものである請求項６記載のキツ
ト。
【請求項８】該洗浄剤が、両面界面活性剤及び／又はHL
B値が16以上の非イオン界面活性剤を0.0025〜１重量％
の濃度で含有している請求項６または７項に記載のキツ
ト。