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WO1990008548A1 - Liquid preparation for intraocular perfusion - Google Patents

Liquid preparation for intraocular perfusion Download PDF

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WO1990008548A1
WO1990008548A1 PCT/JP1990/000106 JP9000106W WO9008548A1 WO 1990008548 A1 WO1990008548 A1 WO 1990008548A1 JP 9000106 W JP9000106 W JP 9000106W WO 9008548 A1 WO9008548 A1 WO 9008548A1
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WO
WIPO (PCT)
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intraocular
corneal
perfusion
solution
intraocular perfusion
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PCT/JP1990/000106
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Awata
Shunji Sogo
Takahiro Matsumoto
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Senju Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Senju Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
Application filed by Senju Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Senju Pharmaceutical Co Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/665—Phosphorus compounds having oxygen as a ring hetero atom, e.g. fosfomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring

Definitions

  • the present invention relates to a liquid preparation for intraocular perfusion with reduced tissue damage, which is used in the field of treatment of ophthalmic diseases by surgery, which is used during surgery in which the surgical site is inside the eyeball.
  • the present invention specifically relates to a substance (
  • CH 2 a liquid preparation for intraocular perfusion with enhanced safety, which contains ⁇ ⁇ ⁇ or a pharmaceutically acceptable salt thereof, with reduced tissue damage to intraocular tissues, particularly corneal endothelium.
  • cataract surgery and vitrectomy both of which are typical in terms of the number of cases performed, are performed on the diseased part located inside the eyeball It is.
  • These operations are performed by incising the cornea or sclera, which forms the outermost layer of the eyeball, inserting the tip of a surgical instrument into the eyeball, and emulsifying or excising the diseased tissue and aspirating it.
  • the aqueous humor and vitreous leak out of the incision and cause a decrease in intraocular pressure, but if no precautionary measures are taken, the intraocular pressure generated by aspiration of diseased tissue can be reduced. It is evident that extreme decline will cause temperamental and functional damage to intraocular tissues.
  • intraocular perfusion solution a solution for intraocular perfusion
  • intraocular perfusion solution a solution for intraocular perfusion
  • the intraocular perfusion solution is constantly in contact with the intraocular tissue near the surgical site during the operation. Therefore, depending on the composition and properties of the intraocular perfusion solution, the intraocular tissue that contacts it Is known to cause temporary or permanent disability.
  • the corneal endothelium is the innermost layer (the inner side of the eyeball) of the three layers of the epithelium, parenchyma and endothelium, which constitute the cornea, which is the transparent membrane that forms the anterior part of the eyeball.
  • the corneal endothelium which is formed by corneal endothelial cells having a substantially hexagonal shape, is a layer having a thickness equivalent to one cell, but has various functions necessary to control the physiological state of the entire cornea. It plays a crucial role in maintaining the physiological function of the entire cornea.
  • corneal endothelium functions as a barrier to material movement between the cornea and aqueous humor (hereinafter referred to as “corneal endothelial barrier function”). ").
  • the function of the corneal endothelial barrier is to close the intercellular space by a healthy and maintained endothelial intercellular binding complex. This prevents substances in the aqueous humor from freely migrating to the cornea ⁇ .
  • the corneal endothelium regulates the entry and exit of various substances across the entire pair of corneas by selectively transmitting and transporting water and other substances on the basis of the function of the corneal endothelial barrier. It maintains a physiological state and plays an essential role in maintaining the transparency of the cornea.
  • corneal endothelial cells play such a crucial role in maintaining the physiology and transparency of the cornea and maintaining their clarity, cells of other tissues in the eye and tissues of the body other than the eye are important. Mechanical irritation associated with surgery compared to cells. Extremely vulnerable to the chemical effects of intraocular perfusion solutions, which can very easily cause injury and death.
  • corneal endothelial cells in the corneal endothelial layer once completed have almost lost the ability to divide and proliferate in primates. Therefore, if some of these cells are damaged and die due to any cause, the lost parts are hardly supplemented by the proliferation of surviving endothelial cells. Most of the ⁇ is performed by the cells around the shedding part expanding and entering the shedding part to cover the part.
  • corneal endothelial cells are lost, the continuity of the corneal endothelium is restored, but the total number of cells composing the corneal endothelial layer remains almost reduced.
  • the density of corneal endothelial cells per unit area of the corneal endothelial layer decreased significantly, and when the number of dead and deceased endothelial cells exceeded a certain level, they were retained by the corneal endothelium until then. It becomes difficult to maintain the physiological state of the cornea, It is known that irreversible corneal opacity occurs.
  • the various functions of the corneal endothelium which are extremely important in maintaining the physiological function of the entire cornea, namely, the function of regulating the amount of water in the parenchyma, the selection of various substances between the aqueous humor side and the parenchymal side of the cornea
  • the corneal endothelial barrier function among the functional permeation and transport functions and the corneal endothelial barrier function, the corneal endothelial barrier function is easily and rapidly reduced even by the extremely slight stimulation given to the endothelial cells. It is valuable as a sensitive indicator, and its functional deterioration can be easily measured experimentally with high accuracy.
  • CF 5 (6) -carboxyfluorescein
  • CF which is a fluorescent substance
  • the corneal epithelium side is immersed in a solution containing CF, and while the corneal endothelium side, that is, the anterior chamber side is gently perfused with a liquid for intraocular perfusion, the amount of the transfer of the substance from the corneal epithelium side to the endothelium side is measured.
  • the corneal endothelium side is perfused with a liquid for intraocular perfusion, or the animal is used as it is, and the solution in the anterior chamber of the eyeball with the liquid for intraocular perfusion.
  • a method of directly measuring the influence of a solution for intraocular perfusion on the cornea by perfusion and measuring the change occurring in the corneal thickness over time is known (HF Edelhauser et al., Arch.Ophthalmol., 93: 648). (1975) and Teruo Tanijima et al., Clinical Ophthalmology, 75 1189 (1981)).
  • the present inventors have improved and established the Shinya method described above in order to find a substance capable of removing or significantly reducing the impairment in a conventional solution for intraocular perfusion.
  • the conventional method for intraocular perfusion Based on the liquid formulation, various new substances for intraocular perfusion were prepared by adding various substances to these solutions, and the effects on the cornea were measured.
  • the present inventors have found that a certain phosphoric ester of L-ascorbic acid has an action of suppressing the occurrence of corneal damage caused by a solution for intraocular perfusion, and completed the present invention by further study.
  • the present invention relates to a known substance (I)
  • a liquid preparation for intraocular perfusion characterized by containing a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • substance (I) and various salts thereof for example, sodium salt, calcium salt, calcium salt and magnesium salt
  • use of ascorbic acid as a stable preparation is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-28757. No. 59, and as an antioxidant, for example, JP-A-63-95 287, and as an agent for preventing the abnormal formation of egg shell, for example, JP-A-62-19 No. 8615, JP-A-62-175152 as an agent for preventing fish abnormalities, and JP-A No.
  • JP-A-6-63616 As a stabilizer for stored erythrocytes, and in JP-A-6-96408 as an antiodor agent.
  • substance (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof has an effect of preventing damage to corneal endothelial cells, and the effect is not considered in the process of the present invention. It was first revealed.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the substances contained in the intraocular perfusion solution of the present invention include sodium salts, potassium salts of magnesium salts and alkali salts of calcium salts and magnesium salts of magnesium salts.
  • Earth metal salts can be used, and any of these salts can be used alone or together with other salts.
  • the substance (I) contains sodium chloride and potassium chloride, which are usually indispensable for composing the intraocular perfusion solution, and sodium chloride.
  • Lithium is usually 80 mmo 1 / 'S ⁇ l25 mmo 1 / ⁇ concentration range and chloride is 4 m mo 1 ⁇ ' ⁇ to 10 mm o 1 no ⁇ can be suitably formulated, and other components that can be generally used in forming a solution for intraocular perfusion, such as calcium chloride and chloride
  • Various electrolytes such as magnesium, magnesium sulfate, sodium acetate, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium citrate, sodium hydrogen carbonate, glucose, etc.
  • Monosaccharides, peptides such as glutathione and glutathione disulfide, and nucleosides such as adenosine.
  • the amount of the substance (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof contained in the intraocular perfusion solution of the present invention may be from 0.25 mmol ZJ3 to 20.0 mmo1Z ⁇ . Preferably in the range of 0.5 mm 0 1 / ⁇ to 10 0.O mmol / ⁇ , more preferably in the range of 1.O mmol / i3 to 5.0 mmo 1 Z It is most preferable that the value is in the range of J3.
  • the intraocular perfusion solution of the present invention preferably has a pH in the range of 7.0 to 7.5, and an osmotic pressure in the range of 260 m sm to 310 m 0 sm. It is more preferably prepared to be in the range of 275 mO sm to 305 mO sm.
  • a male white rabbit's eyes were enucleated and added to a Dulbecco's Modified Eagle Medium Nissui (2): Nissui Yakuhin) with 10% fetal bovine serum in a culture solution (hereinafter referred to as “Dulbecco's Modified Eagle Medium Nissui”).
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium Nissui fetal bovine serum in a culture solution
  • Endothelial cells are harvested together with the Descemet's membrane from the cut corneal pieces (for 8 eyes), cut into small pieces with scissors, and placed in a 75 cm 2 culture flask (trade name: Nunclon Tissue Culture Flasks 147589: Nunc). Seed with 5 mj2 DMEM.
  • the collected cells were suspended again in DMEM and filtered with a 200- ⁇ m nylon mesh to remove the Descemet's membrane to obtain a cell-only suspension.
  • DMEM is added to the cell suspension to make a total volume of 20 mJ3, and the entire lower opening of a plastic cylinder with an inner diameter of 10 mm and a height of 6 mm with four 2 mm legs on the outer circumference With a permeable collagen membrane attached to it (trade name: Cellgen permeable membrane CM-24: manufactured by Koken Co., Ltd., hereinafter referred to as “permeation cell”).
  • the permeation cell was immersed in a 10 cm diameter dish containing each of the following test solutions to wash the endothelial cells on the permeable collagen membrane gently.
  • the cells were transferred into each of the corresponding test liquids placed in a cm Petri dish, cultured for 37 hours under the conditions of 37%, 5% CO 2 and 95% air.
  • test liquids were the same as those described in Examples 1 and 2, except that they contained 1.2 mm 01 ZJ3 magnesium sulfate instead of substance (I).
  • a solution for intraocular perfusion (hereinafter referred to as “reference solution”) having the following composition and the same osmotic pressure was used.
  • each test solution was added to each culture solution of a plate (Clusters dishes 3512: manufactured by Costar), which was formed by integrally molding 12 cylindrical culture tanks with an inner diameter of 23 mm and a depth of 13 mm. I put 5. After inverting the permeation cell cultured in each test solution and removing the test solution from the same cell on the filter paper, place the cell upright in each test solution corresponding to each culture solution and settle. , the corresponding test solution of each CF solution 3 0 0 ⁇ 2 in addition to the transmission cell in Le 3 7 ° (, 5% C 0 2, 9 at 5% air and cultured.
  • the test solution was collected at a time interval of 20 minutes at a rate of 200 ⁇ J3 to obtain a sample for CF measurement
  • the culture tank was immediately refilled with 200 S of each test solution.
  • Each was diluted 10-fold, and the fluorescence intensity was measured using a spectrophotometer (Spectrophotometer F3000: Ueda Seisakusho) at an excitation wavelength of 497 nm and a measurement wavelength of 543 nm. Then, the CF concentration was calculated.
  • the eyeball of an adult rabbit is excised with the conjunctiva and eyelid attached to it, and applied to a corneal perfusion device according to the method of Dikstein et al. (Dikstein, S. et al., J. Physiol., 221: p. 29 (1972)). After fixation, the corneal endothelium was perfused with the following test solution. For the perfusion, use an automatic injection device (KN204: Natsume Seisakusho), the temperature of the perfusate is 37 ° C, the perfusion rate is 0.027 m2Z min, and the perfusion pressure is 15 mmHg.
  • KN204 Natsume Seisakusho
  • the corneal epithelium side was filled with silicon oil (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) to prevent drying of the corneal epithelium during perfusion. Coup (Product name: Colin Clinical Sukiyu Lamai) The measurement was performed at hourly intervals up to 4 hours later using a croscope 400 VZ (Konan Riki Co., Ltd.) and a pachometer attached to it. Test liquid
  • test liquid As the test liquid, the liquid for intraocular perfusion and the reference liquid described in Example 1 were used.
  • Example 1 intraocular perfusion in Example 1 containing substance (I) (3Z2 magnesium salt).
  • substance (I) 3Z2 magnesium salt
  • the cornea perfused with the reference liquid as the control liquid was used.
  • the increase in cultured corneal thickness which is an indicator of abnormal swelling of the corneal stroma, was significantly suppressed.
  • the control reference solution contained almost the same amount of magnesium ion as the intraocular perfusion solution of Example 1, the effect observed with the intraocular perfusion solution was the same as that of substance (I). The effect was recognized by itself.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The drawing shows the increase in corneal thickness caused by perfusing the rabbit cornea.
  • the horizontal axis represents the time after the start of perfusion
  • the vertical axis represents the change in corneal thickness (increase). Is shown.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiment 1 Predetermined amounts of the following components are sequentially dissolved in distilled water, the pH is adjusted with hydrochloric acid, and then sterile filtered to give a liquid for intraocular perfusion.
  • Predetermined amounts of the following components are sequentially dissolved in distilled water, the pH is adjusted with hydrochloric acid, and the mixture is sterile-filtered to give a liquid for intraocular perfusion.
  • the intraocular perfusion solution was found to protect the barrier function of corneal endothelial cells and to suppress abnormal swelling of the cornea, which is considered to be caused by dysfunction of the corneal endothelium.
  • the use of the intraocular perfusion solution according to the present invention in intraocular surgery prevents the occurrence of damage to the corneal endothelium, thereby maintaining the entire cornea in a healthy physiological state. Injuries to the cornea and other intraocular tissues due to intraocular perfusion, which are indispensable for intraocular surgery, can be prevented, and the operation can be made safer than before.

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Description

明 細
発明の名称
眼内灌流用液剤
技術分野
本発明は眼科的疾患の手術による治療の分野において、 手術部 位が眼球内部である手術の際に使用する、 組織障害性を抑えた眼 内灌流用液剤に関するものである。 本発明は具体的には、 物質 （
D Ο
( I )
Figure imgf000003_0001
C I Η - Ο Η
I
C H2— Ο Η 又はその医薬として許容される塩を含有することを特徴とする、 眼内組織特に角膜内皮に対する組織障害性を抑えた、 安全性を高 められた眼内灌流用液剤に関するものである。 背景技術 近年、 眼科学の分野における外科的療法の急速な発達と共に、 従来は主 して薬物療法のみによつて治療された、 あるいは治療 法が無いものされて諦められていた種々の眼科的疾患が外科的治 療の対象となっており、 その対象とされ得る疾患の範囲は更に着 実に拡大しつつある。 眼科的疾患における外科的療法のうちで今 日最も一般化したものと.しては白内障手術があげられ、 他には増 殖性網膜硝子体炎等の治療のために施される硝子体切除術がよく 知られている。
眼科的疾患の外科的療法のうち、 白内障手術および硝子体切除 術は、 眼球の内部に存する疾患部位に対して施される手術の内で 施術例数の多さの点において共に代表的なものである。 これらの 手術は眼球の最外層を形成する角膜あるいは強膜を切開し眼球内 に手術器具の先端を揷入して病変組織を乳化又は切除して吸引す ることにより行なわれるため、 手術中に切開孔から眼内房水や硝 子体が漏出して眼内圧の低下を招くおそれがあるのみならず、 予 防措置をなんら構じなかった場合には病変組織の吸引によって生 じる眼内圧の極度な低下により、 眼球内組織に気質的及び機能的 な障害を生じることが明白である。 従って、 それらの危険を防止 する目的で、 手術中においては眼内の手術部位付近に一定の圧力 下において眼内灌流用の液剤 （以下 「眼内灌流甩液剤」 という。 ） の絶え間ない注入をおこなっている。 そうすることにより、 眼内 房水の漏出や病変組織の吸引により生じた眼球内容の量的欠損が 補塡されて手術中眼球の内圧が一定範囲に維持され、 併せて手術 中に手術部位に流入した血液や組織片等が洗い流され、 それらに よる局所的視野の妨害が防止され、 明瞭な手術視野が確保される • 眼内灌流用液剤は手術中絶えず手術部位付近の眼内組織に接触 し続けるため、 眼内灌流用液剤の組成や性状の如何によつては、 それに接触する眼内組織に対し一時的又は永続的障害を与えるこ とが知られている。
眼内灌流用液剤が眼内の組織に与える障害のうち重大なものと して注目されているのは角膜に対する障害であり、 更に詳しく は- 角膜内皮に与える障害である。 角膜内皮は眼球前部を形成する透 明な膜である角膜を構成する、 上皮、 実質及び内皮の 3層のうち- 最も内側 （眼球内側） の層であり、 唯一層に緻密に配列した各々 ほぼ六角形の形状を有する角膜内皮細胞によって形成されている 角膜内皮はこの様に 1細胞に相当する厚みしかない層ではあるが、 角膜全体の生理状態を制御するに必要な種々の機能を有し、 それ により角膜全体の生理的機能を維持する上で極めて重大な役割を 担っている。 それらの機能の中心をなすものは、 角膜の透明性に 重大な影響を有する因子たる実質中の水分量を調節する機能及び 房水側と角膜実質側との間での種々の物質の選択的透過及び輸送 の機能である。 また、 これらの機能が有効に働く上で欠く ことの できない基本的機能として、 角膜内皮は角膜と房水との間での物 質移動に対する障壁 （バリアー） としての機能 （以下 「角膜内皮 バリアー機能」 という。 ） を有する。 角膜内皮バリァ一機能は、 健全に維持された内皮細胞間結合複合体によつて細胞間隙が閉鎖 されていることによるものであり、 これにより房水中の物質が角 膜內に自由に移行することが阻止されている。 この様に角膜内皮 は、 角膜内皮バリア一機能の基礎の上に水分及び他の物質の選択 的透過及び輸送を行なうことによつて、 角膜全対の種々の物質の 出入りを調節して角膜の生理状態を維持し、 角膜の透明性の維持 に欠く ことのできない役割を果たしている。
角膜内皮細胞は角膜の生理状態の維持及び透明.性の維持の上で この様な極めて重要な役割を果たしているにも拘らず、 眼内の他 の組織の細胞や眼以外の体の組織の細胞に較べて手術に伴う機械 的剌激ゃ眼内灌流用液剤による化学的影響に対して極めて脆く、 これらによって極めて容易に障害を起こして死滅脱落する。 しか も、 一旦完成した角膜内皮層における角膜内皮細胞は霊長類にお いてはもはや分裂増殖する能力を殆んど失っていることが知られ ている。 そのため、 何等かの原因によってそれらの細胞の一部が 障害を受けて死滅脱落した場合、 その脱落部分は生存する内皮細 胞の増殖によつては補塡されることが殆んどなく、 補塡の大部分 は脱落部分の周辺の細胞が拡大しつつ脱落部分に進入してその部 分を覆うことによって行なわれる。 角膜内皮細胞の脱落があった 場合には、 こうして角膜内皮の連続性は回復されるものの、 角膜 内皮層を構成する総細胞数については殆んど減少したままである c 死滅脱落した角膜内皮細胞の数が多数に及ぶ場合には、 角膜内皮 層の単位面積当りの角膜内皮細胞の密度の減少が甚だしくなり、 死滅脱落した内皮細胞の数がある程度以上になるとそれまで角膜 内皮によって保たれていた角膜の生理状態の維持が困難となり、 不可逆的な角膜混濁等が生ずることが知られている。
この様に、 内皮細胞が傷害されるとその影響は恒久的であり且 つ角膜混濁等の重篤な障害となって発現するため、 手術に使用す る眼内灌流溶液剤としては、. それ自身が角膜内皮の障害を引き起 こす作用を持つものでないことが最優先の要件である。 現在、 こ の要件を可能な限り満たすことを意図'して調整され実用に供され ている ものには、 オペガード M A (商品名、 千寿製薬株式会社） . ビーエスエス （商品名 B S S、 アルコ ン ラボラ ト リ一ズ ィ ンコーポレイ テッ ド） 、 ビーエスエス プラス （商品名 B S S P U L U S 、 アルコ ン ラ ボラ ト リーズ イ ンコーポレイ テ ツ ド） 等が知られている。
しかしながら、 これらの眼内間流用液剤にも角膜内皮細胞等の 眼内組織に障害を全く与えないという要件を完全に満たすに至つ たものはないため、 これらよりも更に優れたものを作り出すため の基礎的研究が鋭意進められている。
角膜全体の生理的機能を維持する上で極めて重要な角膜内皮の 前記の諸機能すなわち、 実質中の水分量を調節する機能、 房水側 と角膜実質側との間での種々の物質の選択的透過及び輸送の機能 及び角膜内皮バリァー機能のうち、 角膜内皮バリァー機能は内皮 細胞に与えられた極めて軽微な剌激によつても容易且つ速やかに 低下を起こすことから、 角膜内皮の障害の極めて鋭敏な指標と し ての価値があり、 またその機能低下を実験的に高い精度で容易に 測定することが可能となっている。 これらの理由から、 近年、 角 膜内皮バリァ一機能の測定が眼内灌流用液剤の角膜内皮に対する 影響を研究するための方法の一つとして重要視されている。 その 具体的方法としては、 例えば、 角膜の上皮を剝離した後、 同側を 蛍光物質である 5 ( 6 ) —カルボキシフルォレツセイ ン （以下 「 C F」 と略記する。 ） の溶液に浸した状態におき、 内皮を通過し て前房側へと移行した C F量を経時的に測定するものである （新 家、 Arch. Ophtha lmol. , 104 : 435 (1986) ) 。 蛍光物質である C Fは角膜内皮バリァー機能が完全に働いている場合には角膜内皮 を殆んど通過せず、 そのため C Fは上皮側から前房側又は前房側 から上皮側に殆んど移行しないことが知られている。 従って、 角 膜上皮側を C Fを含む溶液に浸し、 角膜内皮側すなわち前房側を 眼内灌流用液剤で緩やかに灌流しながら、 角膜上皮側から内皮側 への同物質の移行量を測定することによって、 内皮細胞間の結合 複合体に生じた間隙の程度をすなわち角膜内皮パリァー機能に加 えられた障害の程度を定量的に知ることができ、 またそれによつ て角膜内皮細胞に与えられた障害の程度を知ることができる。 一方、 角膜内皮の生理的な機能が障害されると角膜実質中に水 分が異常に浸透して角膜実質が膨潤し角膜の厚さが増大すること がよく知られているが、 このことを利用して、 動物眼より摘出し た角膜を使用して角膜内皮側を眼内灌流用液剤にて灌流し、 ある いは動物をそのまま使用して眼球の前房内を眼内灌流用液剤で灌 流し、 角膜厚に生ずる変化を経時的に測定することによって、 眼 内灌流用液剤が角膜に与える影響を直接測定する方法が知られて いる ( H. F. Edelhauser 他、 Arch. Ophthalmol . , 93 : 648 (1975 ) 及び谷島輝夫他、 眼科臨床医報、 75 ·· 1189 (1981 ) ) 。 発明の開示 本発明者らは、 従来の眼内灌流用液剤に存する障害性を取り除 く若しくは著明に減少させることのできる物質を見いだすべく、 上記新家の方法等を改良して確立した、 培養角膜内皮細胞層を用 いた角膜内皮バリア一機能測定法 （実験例 1 に記載） を利用し、 更に上記の角膜培養による角膜厚の変化の測定方法をも用いて、 従来の眼内灌流用液剤を基礎として、 これらに種々の物質を添加 する等して新たな眼内灌流用液剤を種々調整してそれらが角膜に 与える影響を測定することにより、 鋭意検討を重ねた結果、 以外 にも L 一ァス コルビン酸のある種のリン酸ェステルに眼内灌流用 液剤による角膜障害の発生を抑制する作用のあることを見いだし、 更に検討を加えることによつて本発明を完成した。
即ち本発明は既知の物質 （ I )
Figure imgf000009_0001
C I H - O H
C H- O H 又はその医薬として許容される塩を含有してなることを特徴とす る眼内灌流用液剤である。 物質 （ I ) 及びその各種の塩、 例えば ナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 カルシウム塩及びマグネシウム塩に ついてはァスコルビン酸の安定な製剤としての利用が例えば特開 昭 6 2 _ 2 8 5 7 5 9号に開示されいるほか、 抗酸化剤として例 えば特開昭 6 3 - 9 5 2 8 7号に、 卵の殻の形成異常の防止剤と して例えば特開昭 6 2 - 1 9 8 6 1 5号に、 魚の体型異常の防止 剤として例えば特開昭 6 2— 1 7 5 1 4 2号に、 皮膚の色素脱色 剤として例えば特開昭 6 2 - 9 6 4 0 5号に、 保存赤血球の安定 剤として例えば特開昭 6 2 - 6 3 6 1 6号に及び口臭防止剤とし て特開昭 6 2 - 9 6 4 0 8号に開示されている。 しかしながら、 上記のとおり、 公知記述には物質 （ I ) 又はその医薬として許容 される塩が角膜内皮細胞の障害の防止効果を有することを示唆す るものはなく、 当該効果は本発明の過程において初めて明かにさ れたものである。
本発明の眼内灌流用液剤に含有される物質の医薬として許容さ れる塩としては、 ナ ト リゥム塩、 力 リゥム塩糖のアル力リ金属塩 又は、 カルシウム塩、 マグネ シウム塩糖のアルカ リ土類金属塩を 用いることができ、 これらの内いずれの塩もそれぞれ単独で又は 他の塩とともに使用することができる。
また、 本発明の眼内灌流用液剤を組成するに際し、 物質 （ I ) は、 通常眼内灌流用液剤を組成するに不可欠とされる塩化ナト リ ゥム及び塩化カ リ ウムと、 塩化ナ ト リウムが通常 8 0 m m o 1 /' S〜 l 2 5 m m o 1 / βの濃度範囲且つ塩化力 リゥムが通常 4 m m o 1 Ζ'β〜 1 0 mm o 1ノ βの濃度範囲において好適に配合す ることができるほか、 一般に眼内灌流用液剤を組成するに際し使 用し得るその他の成分、 例えば塩化カルシウム、 塩化マグネシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 酢酸ナ ト リ ウム、 リン酸ナ ト リ ウム、 リ ン酸カ リ ウム、 く えん酸ナ ト リ ウム及び炭酸水素ナ ト リ ゥム等の 各種の電解質や、 ぶどう糖等の単糖類、 グルタチオ ン及びグル夕 チオンジスルフ ィ ド等のぺプタイ ド類、 アデノ シン等のヌク レオ シドとも配合することができ る。
また、 本発明の眼内灌流用液剤に含有される物質 （ I ) 又はそ の医薬として許容される塩の量としては、 0. 2 5 mm o l ZJ3 から 2 0. 0 mm o 1 Z βの範囲にあることが望ま しく、 0. 5 mm 0 1 / β ~ 1 0. O mm o l / βの範囲にあることが更に望 ましく、 1. O mmo l /i3〜5. 0 m m o 1 Z J3 の範囲にある ごとが最も望ましい。
また、 本発明の眼内灌流用液剤は P Hが 7. 0から 7. 5の範 囲にあることが望ましく、 浸透圧は 2 6 0 mひ s m〜3 1 0 m 0 s mの範囲に入るように調製されることが望ましく、 2 7 5 mO s m〜 3 0 5 mO s mの範囲に入るように調製されることが更に 望ましい。
以下に本発明に係る眼内灌流用液剤の角膜内皮バリァー機能に 対する保護作用及び角膜の膨潤に対する保護作用を示す。
卖験例 1 ：角膜内皮バリアー機能に対する効果
試 験 方 法 角膜内皮細胞の調整方法
雄性白色家兎の眼球を摘出し、 ダルベッコ変法 MEM (商品名 ： Dulbecco s Modified Eagle Medium Nissui ②： 日水 薬) ' に牛胎児血清を 1 0 %になるように添加した培養液 （以下 「DM EM」 と略記する。 ） 中で角膜と強膜との境界をはさみで切り、 角膜片を切り出した。 切り出した角膜片 （8眼分） よりデスメ膜 とともに内皮細胞を剝ぎ採り、 はさみで細切した後、 75 cm2の 培養フラスコ （商品名： Nunclon Tissue Culture Flasks 147589 ： N u n c製） 中に約 5 mj2の DMEMとともにはん種する。 細 胞が底に着いたのを確認した後、 DME Mを約 20 m β加え、 細 胞が培養容器壁に隙間なく完全な細胞層を形成するに至る （即ち confluent になる） まで約 7 日間培養した。 この間 3日毎に培養 液を交換した。 培養後、 細胞を E D TA— ト リプシン （0. 0 1 %E D TA、 0. 1 25 %ト リプシンを含有しカルシウムイオ ン 又はマグネシウムイオンを含有しないリ ン酸緩衝液） 5 m S中で 消化し、 多量の DMEMと混和し消化を停止させた後、 1 0 0 0 r pmで 2分間遠心分離して細胞を集めた。 集めた細胞を再び D MEMに懸濁し、 2 0 0〃mのナイ ロンメ ッ シュで瀘過してデス メ膜を取り除き、 細胞のみの懸濁液を得た。 細胞懸濁液に更に D MEMを加えて全量 20 m J3 とし、 外周上の 4箇所に高さ 2 mm の脚を有する内径 1 0 mm高さ 6 mmのプラスチッ クの円筒の下 部開口部全体に透過性コラーゲン膜を張り付げたもの （商品名： Cellgen 透過性膜 CM- 24：株式会社高研製、 以下 「透過セル」 と いう。 ） の透過性コラーゲン膜の内側表面上にその 3 0 0 i3 を はん種して 3 7 °Cにて 2 曰間培養した。
被験液による培養
培養後、 透過セルを下記の各被験液の入った直径 1 0 c mのシ ャ一レ中に浸して透過性コラーゲン膜上の内皮細胞を緩やかに洗 つた後、 同セルを別の直径 1 0 c mのシャーレに入れた対応する 各被験液中に移し、 3 7て、 5 %C 02 、 9 5 %空気の条件下で 4時間培養した。
被験液
被験液としては実施例 1及び 2に記載した眼内灌流用液剤及び、 物質 （ I ) の代わりに 1. 2 mm 0 1 Z J3の硫酸マグネシゥムを 含む以外はこれらの実施例と組成、 ρ Η及び浸透圧において同等 な、 下記の組成の眼内灌流用液剤 （以下 「基準液剤」 という。 ） を使用した。
基準液剤の組成 （単位： mm 0 1 ZS )
硫酸マグネシゥム 2
塩化力ルシゥ ム 1 2
塩化ナ ト リ ウ ム 1 1 2 9
塩化力 リ ウ厶 4 8
酢酸ナ ト リ ウ ム 4 4
く えん酸ナ ト リ ウム 3 4
ぶどう糖 8 3
炭酸水素ナ ト リ ウム 2 5 0
p H 7. 3 浸透圧 2 9 0 m 0 s m C F透過量の測定
じ？を0. 1 %になるように各被験液に溶解し、 0. 4 5 m のフィ ルタ一で濾過し、 じ？の 0. 0 2 5 %溶液を調整した。 内 径 2 3 mm、 深さ 1 3 mmの円筒状の培養槽 1 2個を一体成型し て有するプレー ト （Clusters dishes 3512： C o s t a r製） の 各々の培養液に各被験液のそれぞれ 2 m 5を入れた。 各被験液で 培養した前記の透過セルを倒置してろ紙上で同セル內の被験液を 取り除いた後、 同セルを各培養液の対応する各被験液中に正立さ せて静置し、 同被験液に対応する各 C F溶液 3 0 0 μ 2を透過セ ル内に加え 3 7 ° ( 、 5 % C 02 、 9 5 %空気にて培養した。 培養 開始後、 透過セル外部の被験液を 2 0分間隔で 2 0 0 ^ J3ずつ採 取し、 C F測定用の試料とした。 各試料採取後は培養槽に各被験 液 2 0 0 Sを直ちに補充した。 採取した試料の各々を 1 0倍に 希釈し、 分光光度計 （分光光度計 F 3 0 0 0形： 曰立製作所) を 用いて、 励起波長 4 9 7 n m、 測定波長 5 4 3 nmにて蛍光強度 を測定し、 C F濃度を算出した。
試 験 結 果
表 1に示すとおり、 被験液による培養中に透過セルの透過性コ ラーゲン膜上の角膜内皮細胞を透過する C Fの量は被験液中の物 質 （ I ) の濃度に依存して減少している。 この結果は、 培養角膜 内皮細胞の C Fに対する透過性が物質 （ I ) の添加にともなって 抑制されることを示しており、 従って、 物質 （ I ) の添加によつ て角膜内皮バリアー機能が保護されたことを強く示唆している。 表 1 C F透過:
し f ： J2l過星 、 β g)
被験液： 基準液剤 実施例 1 実施例 2
(例数） ( 6 ) ( 7 ) ( 7 )
0 分 0 0 0
2 0 分 3. 5 4 3. 0 9 2. 9 5
士 0. 5 8 ± 0. 3 3 土 0.. 5 2
4 0 分 7. 4 1 6. 7 8 6. 0 4
土 0. 9 8 ± 0. 6 6 士 1 . 0 6
6 0 分 1 1 . 0 1 1 0. 0 5 8. 8 4
土 1 . 5 0 ± 0. 8 8 土 1 . 3 7
(平均土 S . D. ) 実験例 2 ：培養角膜の膨潤に対する作用
試 験 方 法
成熟家兎の眼球を、 結膜と眼瞼とを付着させたまま摘出して、 Dikstein 等の方法 （Dikstein, S. 他、 J. Physiol. , 221: p.29 (1972)) に従い角膜灌流装置に固定し、 下記の被験液を用いて角 膜内皮側を灌流した。 灌流には自動注入装置 （K N 2 0 4 ：夏目 製作所〉 を使用し、 灌流液の温度は 3 7 °C、 灌流速度は 0. 0 2 7 m 2 Z分、 灌流圧は 1 5 m mH gとした。 角膜上皮側にはシリ コ ンオ イ ル （信越化学工業株式会社） を満たして灌流中の角膜上 皮側の乾燥を防止した。 角膜の厚さの測定はスぺキュラーマイ ク ロ ス コ一プ （商品名： コ一ナ ン ク リ ニカル スぺキユ ラ一マイ ク ロスコープ 4 0 0 V Z :株式会社甲南力メ ラ） 及びそれに取 り付けたパコメータを用いて 1時間間隔で 4時間後まで行なった。 被験液
被験液としては実施例 1に記載した眼内灌流用液剤及び基準液 剤を使用した。
試 験 結 果
図に示す通り、 物質 （ I ) ( 3 Z 2マグネシゥム塩） を含有す る実施例 1の眼内灌流.用液剤にて灌流した角膜においては、 対照 液である基準液剤にて灌流した角膜に比較して角膜実質の異常な 膨潤の指標である培養角膜厚の増加が大幅に抑制された。 また、 対照である基準液剤には実施例 1の眼内灌流用液剤とほぼ同量の マグネシウムィォンが含有されていることから、 同眼内灌流用液 剤においてみられた効果は物質 （ I ) 自体による効果であると認 められた。 図面の簡単な説明 図面は家兎角膜を灌流することによつて生ずる角膜厚の增加を 示し、 図において横軸は灌流開始後の時間を、 縦軸は角膜の厚さ の変化 （増加分） を示す。 発明を実施するための最良の形態 実施例 1 下記の成分の所定量を蒸留水に順次溶解し、 塩酸にて p Hを調 整した後、 無菌濾過して眼内灌流用液剤とする。
組成 （単位： m m o 1 ,/ β )
塩化カルシウ ム 1 2
塩化ナ'ト リ ウム 1 1 2 9
塩化力 リ ウム 4 8
酢酸ナ ト リ ウ ム 4 4
くえん酸ナ ト リ ウム 3 4
ぶどう糖 8 3
物質 （ I ) ( 3ノ2 マグネ シウム塩） 1 0
炭酸水素ナ ト リ ウム — 2 5 0
ρ Η 7 . 3 2 9 0 m 0 s m 実施例 2
下記の成分の所定量を蒸留水に順次溶解し、 塩酸にて p Hを調 整した後、 無菌瀘過して眼内灌流用液剤とする。
組成 （単位： m m o 1ノ S )
塩化力ルシゥ ム 1 . 2
塩化ナ ト リ ウ ム 1 1 2 . 9
塩化力 リ ウム 4 . 8
酢酸ナ ト リ ウ ム 4 . 4
くえん酸ナト リ ウム 3 . 4
ぶどう糖 8 . 3
物質 （ I ) ( 3 ζ,' 2 マグネ シゥム塩） 3 . 0 炭酸水素ナ ト リ ウム 2 5 . 0
ρ H 7 . 3 浸透圧 2 9 0 m 0 s m 産業上の利用可能性 本発明によって物質 （ I ) 又はその医薬として許容される塩を 含有する安全性の高い眼内灌流用液剤を製することができる。 該 眼内灌流用液剤は、 前記実験例に示す通り、 角膜内皮細胞のバリ ァ一機能を保護し、 また角膜内皮の機能障害によって生じると考 えられる角膜の異常な膨潤を抑制することが認められる。 従って、 眼球内部の手術において、 本発明のに係る、 眼内灌流用液剤を使 用すれば、 角膜内皮の障害発生が防止され、 それにより角膜全体 が健全な生理状態に維持ざれることにより、 眼内手術に不可欠の 眼内灌流に帰因する角膜等の眼内組織の障害を防止して、 手術を 従来より安全なものとすることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 物質 （ I )
( I )
Figure imgf000019_0001
CH2-OH 又はその医薬として許容される塩を含有することを特徵とす る眼内灌流用液剤。
2. 物質 （ I ) 又はその医薬として許容される塩の含有量が 0.
2 5 mm o 1 Z β〜 2 0. O mm o I / 2である請求の範囲 第 1項記載の眼内灌流用液剤。
3. 溶液の p Hが 7. 0〜7. 5であり、 かつ溶液の浸透圧が 2 6 0 m O s rr！〜 3 1 0 mO s mである請求の範囲第 2項記 載の眼内灌流用液剤。
4. 眼内灌流用液剤によって眼内局所を灌流しつつ行なう人眼 の眼科的手術において、 該眼内灌流用液剤として下記の物質 ( I )
Figure imgf000020_0001
CH— OH
Figure imgf000020_0002
を0. 2 51111110 1 /2〜2 0. O mm o l Z Sの濃度範囲 で含有することを特徴とする眼内灌流用液剤を使用すること による、 眼内灌流に帰因する眼内組織の障害発生を防止する 方法 o
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