WO1987000050A1

WO1987000050A1 - Nouvelle substance physiologiquement active limitant la coagulation du sang

Info

Publication number: WO1987000050A1
Application number: PCT/JP1986/000330
Authority: WO
Inventors: Koji Suzuki; Shuji Yamamoto
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1985-06-28
Filing date: 1986-06-27
Publication date: 1987-01-15
Anticipated expiration: 1987-12-28
Also published as: EP0239644A4; EP0239644A1

Description

明細書血液凝固制御作用を有する新たな生理活性物質技術分野

本発明は、血液凝固制御作用を有する新たな生理活性物質に関する。更に詳しくは本発明は血栓溶解作用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有し、循環器系の疾患の治療に有用な新規生理活性物質であるヒト由来のトロンボモジュリン（以後屢々ヒト卜ロンボモジユリンと称す）に閬する。

背景技術

現在、血栓溶解剤として用いられているものには、ス卜レプ卜キナーゼゃゥ口キナーゼがぁリ、また、プラスミノーゲン * ァクチベータ一が開発中である。また、抗血液凝固剤としては、へパリンやワープアリンが用いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としては、ァスピリン、スルフィンビラゾン、ジピリダモール等が使われている。

現在、これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用して、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（D I C ) 、狭心症、一過性脍虚血発作等の循環器系の疾患の治療および予防に用いられている。

ところで、血液凝固機構において重要な役割を演じているビタミン K依存性の蛋白質としてプロテイン Cが知られている^、近年、このプロテイン Cの活性化を著しく促進する物質が家兎肺よリ分雜精製され、卜ロンボモジュリンと命名された〔ェヌ · エル * エスモン（N. L . E smon) ら、ジャーナル · ォブ · バイオロジカルケミストリー（ J . Biol. Chen.), 257卷， 859頁， 1982年〕。活性型プロテイン Cは、生体内で血液凝固系補酵素の活性型第 V因子、および活性型第观因子を失活化させ、また、 .血栓溶解作用を有するプラスミノーゲン ' ァクチべ —ターの産生に関与していることが知られている（鈴木宏治，医学のあゆみ，第 125卷， 901頁， 1983年）。このようにして、プロテイン Cはトロンビンにより活性化されて括性型プロテイン Cとなり、抗血液凝固作用および血栓溶解作用を示すが、このとき、トロンビンのコファクタ一として、トロンボモジュリンが存在すると、この活性型プロテイン Cの生成反応は著しく進む〔シ一，ティー · エスモン（C . T . E smon) ら、プロシーディングス · ォブ · ザ · ナショナル · アカデミー · ォブ · サイエンシズ · ユー - エス - エー (Proc . Natl. Acad. Sci. USA) , 78卷， 2249頁， 1981年〕。すなわち、トロンボモジュリンは、プロテイン Cの活性化を促進し、それによつて抗血液凝固作用および血栓溶解作用を示す活性型プ口ティン Cを大量に生成させることになるので、トロンボモジユリンは生体における抗血液凝固および血栓瑢解に大きく寄与するものである。

ここで注意すべきことは、トロンビンは、上記したようにプロテイン Cを活性化する能力を有するが、その一方フイブリノ一ゲンを活性化してフイブリンに変換したリ、血小板を凝集するなどの作用を有することである。 - このトロンボモジュリンはトロンビンと強く結合し、卜ロンビンの上記の作用を直接阻害する〔シ一 . ティー . エスモン（C . T . E smon) ら、ザ · ジャーナル . ォブ . ノィォロジカル · ケミストリー（ J . B iol. Chem.) 257卷， 7944直， 1982年及びェヌ ' エル ' エスモン ( N · L . E somon)ら、ザ ' ジャーナル ' ォブ ' ノィォロジカル · ケミストリー（ J . B iol. Chem.) , 258卷， 12238頁， 1983年〕。すなわち、トロンボモジュリンは血栓溶解作用の他に、上記したフイブリン形成阻害を通じて血液凝固を阻害し、抗血液凝固作用を有し、さらに血小板凝集をも抑制するものである。また、最近、ヒト胎盤より上記トロンボモジュリンと類似の作用を有する蛋白質性物質が報告された〔特開昭 60-199819 号及びエッチ ·エッチ * サ一レム（H . H . S alem) ら、ザ · ジャーナル ' ォブ · ノィォロジカル，ケミストリー ( J . Biol. Chem.) , 259卷， 12246頁， 1984年〕が、ァミノ酸配列がわかるほどまでには精製されていない。

現在用いられている血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤等の循環器系疾患治療用薬剤は、併用して用いられる場合が多く、また、治療に際し必要な効果を得るには、大量に投与しなければならず、出血等の副作用が出現することがある。かかる実情から、少量でも効果がぁリ、一^で抗血液凝固作用ならびに血小扳凝集抑制作用があるだけでなく、血栓溶解作用も有する薬剤が望まれている。

すでに報告されている前述の家兎のトロンボモジユリンは，この点においては面期的な薬剤になリ得ると期待されるが、これを循環器系疾患治療用薬剤として人体に投与すると、いおゆるアナフィラキシーショックを起こす可能性がある。なぜならば、卜ロンボモジユリンはぺプチドを含有しているので、トロンボモジュリンが該トロンボモジュリンの由来でない動物に投与されると、このトロンボモジュリンは抗原として働き、抗体を産生せしめるからである。この理由から、トロンボモジュリンを人体に投与しょうとするならば、ヒ卜由来の卜ロンボモジュリンの使用が非常に望ましい。しかしながら、これまで髙鈍度のヒ卜卜ロンボモジュリンは得られていなかった。

発明の開示

本発明は抗血液凝固作用、血小扳凝集抑制作用、血栓溶解作用等を有する生理活性物質であるヒト由来のトロンボモジュリンを提供することを目的とする。

即ち、本発明によれば、下記の性質を有することを特徴とする血液凝固制御作用を有する生理活性物質が提供される。

(a)分子量

105,000 ± 10,000 (還元後の SDS—ポリアクリルアミ . ド電気泳動法による測定値として）

(b)安定性

(1) 60 、 30分で安定

(2) 100 ¾、 10分で失活せず

(3) pH2~10で安定

(4) 1 % SDS処理で安定

(5)6 M尿素処理で安定

(6) 6 M塩酸グァニジン処理で失活せず

(7) 3 M KSCN処理で失活せず

(8) 1 % 2—メルカプトエタノール処理で失活する (。活性

(1) トロンビンのコファクタ一としてプロテイン Cを活性化する。

(2) トロンビンによるフイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換を阻害し血液凝固を実質的に阻害する。

(3) 卜ロンビンの血小扳凝集作用を実質的に阻害する。 (d)化学的構造

ァミノ末端よリ 2番目のアミノ酸からのアミノ酸配列が

Pro― Ala― Glu - Pro一 Gin - Pro -Gly-Gly- Ser-Gln であるペプチドを含有する。本発明の生理活性物質はァミノ末端より 2番目のアミノ酸からのアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列であるという特徴を有する。

Pro - Ala― Glu一 Pro一 Gin— Pro一 Gly— Gly一 Ser一 Gin— (但し、 Proはプロリン残基、 Alaはァラニン残基、 Glu はグルタミン酸残基、 Ginはグルタミン残基、 Glyはグリシン残基及び Serはセリン残基を表おす）。

尚、本発明の生理活性物質のァミノ末端アミノ酸はァラニン、セリン又はグリシンである。

本発 ¾の生理活性物質はまた、還元処理後の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定値で分子量 105 , 000 ± 10 , 000を有し、前述の如く種々の化学的及び物理的安定性を示すという特徴を有する。

更に本発明の生理活性物質は（1 ) トロンビンのコファクタ一としてプロテイン Cを活性化する；（2) トロンビンによるフイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換を阻害し血液凝固作用を実貧的に阻害する；及び（3) 卜ロンビンの血小板凝集作用を実質的に阻害するという特徵を有する。

本発明の生理活性物質の物理化学的性質の測定方法について、以下に説明する。なお、本発明の生理活性物質の力価測定は * 合成基質、 Boc - Leu - Ser - Thr - Arg - MCA (Boc及び MCAはそれぞれ t一ブトキシカルボ二ル基及び 4一メチルクマリル一 7—アミドの略称である）を用いる公知のプロテイン C測定法にしたがった〔ワイ ·ォーノ (Y.Ohno)ら，ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー (J. Biochen.) , 90卷、 1387頁（1981年）〕。すなわち、 0· 5 μ Μのプロテイン C及び 80 ηΜのトロンビンを含有する反応液に本発明物質を含む水溶液 5 μ β(0~0·01 A₂₈₀ /m J¾ ) を加え、 0.15 M NaC £ 、 2.5 σΜ CaC ώ ₂ , lmg/n fl 牛血清アルブミンを含む 20 mMトリス '塩酸緩衝液（ρΗ7·4)を加え、全量を 30 # & とする。得られた混合物を 37。Cで 15分間反応させてプロテイン Cを活性化した後に 2 Μのアンチトロンビン 1Πを 10 # β及び ΙΟϋ/m % のへパリンを含有する水溶液を β加え 37 で 15分間加温して反応を停止させる。得られた反応混合物に、前述の合成基質 Boc 一 Leu-Ser— Thr— Arg— MCA〔財団法人蛋白質研究奨励会ぺプチド研究所（日本）製（Peptide Institute) ) 200 μ Η ^ 含む 20raMトリス'塩酸緩衝液（ρΗ7·4)250 ρ β を加え、 37 ^eCで 10分間反応させた後、 20 酢酸 0·5ιπ β を加えて反応を停止させ、遊離してきた AMC (7—アミノー 4ーメチルークマリン）の濃^:を励起 ¾Γ長 380ηιη、発光波長 440nmで蛍光分光光度計により測定する。得られた蛍光強度を既知濃度の AMCの蛍光強度と比較して、遊離した AMC量を求める。この AMC量はサンプル中のトロンボモジュリン活性の強さに依存するのでトロンボモジュリン活性は 1分間当リに生成する AMC量で表おす。

ここで、プロテイン Cはヒト血漿から鈴木らの方法で精褽した〔鈴木（Suzuki)ら、ザ ·ジャーナル ·ォブ.バイオロジカル · ケミストリー（J. Biol. Chen.), 258巻、 1914頁、 1983年）〕。また，ヒトトロンビンはランドブラッド（Lundblad)らの方法で精製した〔ランドブラッド

(Lundblad)ら、ノィォケミカル 'アンド ·バイオフイジ力ノレ'リサーチ'コミュニケーション (Biochem.Biophys.Res. Comnun.) 66巻、 482頁、 1975年〕。

(a)分子量測定法

ユー.ケ一.レムリ（U.K.Laemmli)の方法〔ネィチヤ一

(Nature) , 227卷、 680頁、（1970年）〕にしたがって、 2— メルカプトエタノール処理した試料を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。標準分子量キッ卜（スゥエーデン国フアルマシア社製）を用いて分子量検量線を作成し、活性測定とクーマシー ·ブリリアント 'ブルー R— 250による染色により本発明の活性物質の泳動位置を確認し、この位置を上記分子量検量線と比較することにより分子量を決定する。

0>)安定性試験法

(1)本発明の生理活性物質を 0.006 A₂₈₀ /m & (In & 当リ波長 280ηπにおける吸光度が 0·006である濃度）含有する 0·1 Μ食塩を含む 0·02 Μトリス '塩酸緩衝液（ΡΗ7·5)を 6 CC , 30分加熱処理する。

(2)上記（1)と同じ緩衝液を調製して 100¾に加熱して、 50 失活する時間を求める。 (3)本発明物賓を 0.09A_2S。/n β の濃度で、 0.1 H NaCl、 0.02 Mグリシン、 1 BJMベンズアミジン塩酸、 0·1 (ν/ν) Triton X- 100, 5 mM CaC fl ₂ , PH2の溶液で 2時間半 ¾k理する。また、同じ組成であるが PHIOを有する溶液で別途処理する。

(4) 0.007 A_3S0/m & の濃度の本発明物質を含有する 1 (w/v)SDS (ラゥリル疏酸ナトリゥム）及び 0.1 M NaC iB を含む 0·02 Μトリス'塩酸緩衝液（ρΗ7·5)で、室温において 2時間半処理後、 0.1 M NaC β、 1 mg/m & ゥシ血清アルブミンを含む 0.02 Mトリス '塩酸緩衝液（ρΗ7· 5)で 100倍に希釈して、ただちに活性を測定する。

(5) l (w/v)SDSの替わリに 6 M尿素を用いる他は、前記（4)と同様な処理を行なう。

(6) l (w/v)SDSの替わりに 6 M塩酸グァニジンを用いる他は，前記（4)と同様な処理を行なう。

(7) l (w/v)SDSの替わリに 3MKSCNを用いる他は、前記 (4)と同様な処理を行なう。

(8) l!S(w/v)SDSの替わリに 0·1 (ν/ν)及び 1·0 (ν/ν)2 一メルカプトエタノールを用いる他は、全く前記（4)と同様な処理を行なって、メルカプトエタノール処理の影響を調べる。

(C)活性評価法

(1)トロンビンのコファクタ一としてプロテイン Cを括性化することは以下の方法によって評価する。 Aひすなわち、 0,1 M NaC & , 3.6 mM CaC ϋ ₂、 lOmg/in & ゥシ血清アルブミンを含む 0.02M トリス*塩酸緩衝液（pH 7.5)に 50 # g/m β のプロテイン C, 5 ηΜのトロンビンおよび 5 ηΜのトロンボモジュリンを加えて 37^eCで反応させる。反応を 300 /* g/B β のアンチトロンビン III(米国シグマ社製）および 5 mM EDTAで停止して、生成した括性型プロティン Cの量を前述の合成基質を用いる方法で測定する。

(2) トロンビンによるフイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換を阻害し血液凝固を実質的に阻害することはハインリツヒァメルング（Heinrich Amelung)社（西独）製のコアギュロメーター KC一 10を用いて血液凝固時間を測定することによって調べる。すなわち、 5 mH CaC £ ₂、 0. 1 H NaC & を含む 0·05 Μトリス-塩酸緩衝液（_ΡΗ7 · 5)に、 3 0/t gのフイブリノ一ゲン（米国シグマ社製、フラクション I )を加え、これに 0~50nMのトロンボモジユリンを加え、次いで、全量が 0.4m £ になるように ΙΟηΜのトロンビンを加えて凝固時間を測定する。

(3) トロンビンの血小板凝集作用を実質的に阻害することは SIENC0社（米国）製のプレートレットァグリゴメ一ター（Platelet aggregomet er)を用いて評価する。すなおち、 30万 cells//* の血小板溶液（Platelet Rich Plasma, P. R. P. )250 μ & に 1単位のトロンビン（約 0.4;tg) を加えると血小板が凝集するが、トロンビンを加える前に本発明の生理活性物質を加えたときの血小板凝集反応を観察する。

(d)化学的構造

本発明の生理活性物質のアミノ酸配列は以下のようにして分析する。

精製したヒトトロンボモジュリンを 0. 1 ¾ (v/v)ラウリル疏酸ナトリゥム（SDS)水溶液で室温で 1 &時間透析してアミノ酸配列用分析試料とする。アプライドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークェンシングアナライザ一（モデル 470A)を用い、アール'ェム 'へウィック（R . M . Hewick)らの方法（ザ 'ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル- ケミストリー、 256卷、 7990頁、 1981年）に準じて、 N末端側よリ頫次エドマン分解を行なう。遊離してくるフエ二ルチオヒダントイン*アミノ酸を，スぺクトロフイジクス社（米国）製高速液体クロマトグラフィー用装置（SP 8100)及び米国デュポン社製ゾルバックス 0DSカラムを用いて分析を行ない、アミノ酸配列を決定する。

本発明の生理活性物質はヒト肺から抽出精製することによって得ることができる。ヒト肺としては肺疾患以外の原因により死亡した成人ヒトから病理解剖によって得られる肺、即ち肺組織の正常なヒト肺が用いられる。ヒ卜肺からの本発明の生理活性物質の抽出は肺を細片に切リ、ホモジナイズした後適当な溶媒を用いて行なうことができる。得られた抽出物は、通常の公知の方法を用いる精製に供して本発明の生理活性物貧を精製することができる。本発明の生理活性物貧の精製法としては通常の蛋白貧の精製に使用される方法、たとえば、担体による吸着法、イオン交換法、分別沈殿法、ゲルろ過法、電気泳動法、各種ァフィ二ティクロマトグラフィー、特異抗体を用いた方法等が挙げられ、これらを単独または組み合わせて使用できる。

具体的な分離精製方法の一例を挙げれば、ヒト肺をホモゲナイザーで処理後、得られたペレットを Triton X 一 100等の界面活性剤で処理して、トロンボモジュリンを遊離させて抽出する。

次いで、得られた抽出物をジイソプロピルホスフォロトロンビン（以下屢々 DIP - トロンビンと称す）ァガロースカラムに通し、 0 . 3 M NaC & を含む洗浄液でカラムを洗浄後、 1 M NaC S. を含む溶出液で溶出させ、透析後、透析液をさらに D IP—トロンビン'ァガロースカラムに通し， 0 . 4 M NaC ϋ を含む洗浄液で洗浄後、 1 M NaC & を含む溶出液で溶出させ.、透析後、再び第 2回目の DIP—トロンビン *ァガロースと全く同じ条件で、 DIP—トロンビン · ァガロースカラムでの精製をさらに 2回くリ返す。かくして本発明の生理活性物質は実質的に鈍粋な形で得ることができる。

本発明の生理活性物質は抗血液凝固作用、血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（DIC)、狭心症、一過性脑虚血発作等の循環器系の疾患の治療および予防に用いることができる。本発明の生理活性物赏を上記の疾患の治療に用いる際には薬剤として使用可能な担体と混合することができる。即ち、本発明の生理活性物質の有効量を適当な量の担体と混ぜて、患者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調製することができる。

本発明の生理活性物質は注射剤などとして用いることができる。注射剤として用いる場合は、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤、各種無機塩の P H調整剤などを添加剤として加えることができる。

本発明の生理活性物質の成人 1回当りの投与量は年令、性別、体重、症状などにより異なるが、一般に約 0.

200nigであり、一日当り一回または必要に応じて数回投与する。

発明を実施するための最良の形態

本発明をよリ詳細に記述するために実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例にのみ限定されるものではない，

実施例 1

病理解剖によって得られたヒト肺約 800gをはさみで約 1 CB四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に ΙσΜの D M P (Diisopropyl f luorophosphate)を含む 4 に冷却した 500π>1の生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーを用いて 4 で 5分間、ホモジナイズした。ホモジナイズ後、混合物を氷中で 5分間冷却した。次に混合物を更に 4 で 5分間、ホモジナイズし氷中で 5分間冷却した。上記のホモジナイズ及び冷却操作を更に 3回くリ返した。得られたホモジェネートを 12,000gで 4^eCにおいて 30分間遠心分雜にかけて上澄液とペレットに分け、ぺレットを集めた。これに 0.5 (v/v) トリトン X -100、 0·25Μ麄糖、 ImMベンズアミジン塩酸、 0.5 nM CaCl₂を含む 0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5)100mlに懸濁し、ヮーリングブレンダーを用いて 4 で 5分間、 5回ホモジナイズして抽出した。

得られた抽出物を 35,000g, 10«Cで 60分間遠心分雜にかけて上澄液を集めた。ェヌ 'エル'エスモン（N.L.Esiaon)ら

〔ザ · ジャーナル · ォブ · バイオロジカル ' ケミストリ — (J. Biol. Chen ), 2 5 7 巻， 8 5 9頁， 1 9 8 2 年〕の方法にしたがって作成した DIP—トロンビン〔ジイソプ口ピルホスフォロ卜ロンビン (diisopropylphosphoro- thrombin) ] を、ピー · クオ卜レカサス（P · Cuatrecasas) の方法〔ザ ' ジャーナル · ォブ ' バイオロジカル . ケミストリー（J. Biol. Cheo. )，2 4 5卷、 3 0 5 9頁， 1 9 7 0 年〕にしたがってブロムシアン化したァガロースに結合させて、 DIP-トロンビン - ァガロースを作成した。

次に DIP-トロンビン - ァガロースを 2.5cm ø xlO cm の大きさのカラムに充填して DIP-トロンビン - ァガロースカラムを作成し、室温で 0.1 M NaCl, 0.5 nM CaCl₂ ,

ΙηΜベンズアミジン塩酸， 0.5 ¾(v/v) Lubrol PX (半井化学薬品製、日本）を含む 0.02 M トリス · 塩酸緩衝液 (ρΗ 7.5)でカラムを平衝化した。次いで、上記の抽出上澄液をカラムに通過させた。カラムを 0.3 M NaCl, 0.5mM CaCl₂ , 1 mM ベンズアミジン塩酸、 0.5¾(v/v) Lubrol PX を含む 0·02 Μ トリス*塩酸緩衝液（ΡΗ 7.5)で洗浄した後、 1 M NaCl, 0.1 mM EDTA、 1 nM ベンズアミジン塩酸 0.5¾ (v/v) Lubrol PXを含む 0.02 M トリス '塩酸緩衝液（_PH 7·5)で溶出した。溶出によって得られる各フラクションについて前記の方法でトロンボモジュリン活性を測定した。同時に島津製作所（日本）製スぺクトロフォトメータ一 ϋν-240を用いて各フラクシ 3 ンの波長 280ηπにおける吸光度（A_2S0)を測定した。

トロンボモジュリン活性のある画分を回収し、 0.1 M NaCl, 0.5 mH CaCl₂ , 0.05¾(v/v) Lubrol PXを含む 0·02 M トリス'塩酸緩銜液（PH 7·5)で透析する。得られた透祈液を 2回目の DIP— トロンビンーァガロースカラムク口マトグラフィ一に供した，即ち、透析液を 10 cmの大きさの DIP- 卜ロンビン - ァガロースカラムに通し * 0.4 M NaCl, 0.5 mH CaCl₂ , 0.1$(ν/ν) Lubrol ΡΧ を含む 0·02 Μ トリス'塩酸緩衝液（ρΗ 7.5) で洗浄後、さらに 0·4 M NaCl, 0.1 nM EDTA. 0.1¾(v/v) Lubrol PX を含む 0.02 M トリス*塩酸緩衝液（PH 7.5)で洗浄し、次いで 1 M NaCl, 0.5 nM EDTA, 0.1¾(v/v) Lubrol PXを含む 0·02 M トリス'塩酸緩衝液（PH 7.5)で溶出した。トロンボモジュリン活性のある画分を回収し、さらに 0.1 M NaCl, 0.05¾(v/v). Lubrol PXを含む 0·02 Μ 卜リス-塩酸緩衝液（ΡΗ 7·5)で透析する。得られた透析液を 3回目の DIP- トロンビン - ァガロースのカラムに通過させた。カラムの大きさ、洗浄条件ぴ溶出条件は、 2回目の DIP- トロンビン - ァガロースカラムクロマ卜グラフィ一の条件と全く同じ条件で行なった。尚、溶出して得られるフラクシ 3 ンは 2 mlずつ集め ¾:。

この第 3回目の DIP-トロンビン - ァガロースカラムク口マトグラフィ一の溶出パターンを第 1図に示す。フラクシヨンナンバー 7 2 番目から 8 2 番目までを回収し、 0.1 M NaCl, 0·05 (ν/ν) Lubrol PXを含む 0·02 Μ 卜リス*塩酸緩衝液（ΡΗ 7.5)で透析後、 O.9ciD 0 X 8 cm の大きさの DIP-トロンビン-ァガロースカラムに通した。

0.35 M NaCl. 0.5 BM CaCl 0.1¾(v/v) Lubrol PXを含む 0·02 M トリス'塩酸緩衝液（ρΗ7·5)で洗浄後、 1 M NaCi; 0.5 DM EDTA, 0.1¾(V/V) Lubrol PXを含む 0·02 M トリス*塩酸緩銜液（ΡΗ7·5)で溶出した。溶出して得られるフラクションは 1·9 mlずつ集めた。

この第 4回目の DIP-トロンビン - ァガロースカラムク口マトグラフィ一の溶出パターンを第 2図に示す。フラクシヨンナンバー 48番目から 56番目までを回収した。

このようにして精製されたトロンボモジュリンを含むフラクションの吸光度から、精製されたトロンボモジュリンの分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい 10·0(Ε^ — つ。 _n =10.0)と規定してそれに基づき精製トロンボモジュリンの量を計算したところ約 50 0 μ &であつす。尚、得られた精製トロンボモジュリン画分を 5~10 のグラジェントを用いる SDS -ポリアクリルァミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ？! "認された。得られた卜ロンボモジュリンは一 80 で凍結保存した。

得られた精製ヒトトロンボモジュリンの一部を 0.1 %

(v/v) S D S水溶液に対して室温で 16時間透析してアミノ酸配列用分析試料として用い、前述の化学的構造の分析法にょリ分析を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、 N末端より 2番目のアミノ酸からのアミノ酸配列は下記のとおりであった。

P ro- A la- G lu- P ro- G ln-Pro-Gly-Gly-Ser-Gln 得られた精製ヒトトロンボモジュリンの一部を用いてスパックスマンらの方法にしたがって日立 8 3 5 型アミノ酸アナライザー（日立製作所製、日本）'を用いてァミノ酸組成分析を行なった〔スパックスマン（ Spackman ) ら、アナリアティカル，ケミストリー（ Anal.Chem.) 30卷， 1190莨， 1958年〕。結果を第 1表に示す。なお、参考までに、ヒト胎盤由来の本物質のアミノ酸組成の結果を.文献〔エッチ · エッチ · サーレム（ H.H.Salem )ら、ザ · ジャーナル，ォブ · バイオロジカル · ケミストリー (J. Biol. Chem), 259卷， 12246頁， 1984年〕に記載のデーターより、同じ基準で計算したものを比較のために第 1 表に併記したが、本発明のアミノ酸組成分析の結果と一致しなかった。このことは本発明の肺由来の:トロンボモジュリンと先行文献の胎盤由来のものとが異なる物質であることを示唆している。

第 1表組成（％) アミノ酸本発明参考文献※

5 ァスパラギン酸 8.1 9.1

スレオニン 6.0 4.4 セリン 7.9 7.4 グルタミン酸 6.8 12.5 プロリン 6.5 5.9

10 グリシン 11.0 14.1

ァラニン 8.3 8.8 バリン 8.4 6.3 メチォニン 1.4 1.6 イソロイシン 5.4 3.4

15 ロイシン 10.4 8.8

チロシン 2.8 2.8 フエ二ルァラニン 3.2 2.9 ヒスチジン 2.7 2.2 リジン 3.6 5.0

20 アル二ギン 5.1 4.7

システィン 2.5 測定せずヒト胎盤由来のトロンボモジュリンのアミノ酸組成を文献〔エッチ · エッチ · サーレム（ H.H.Salem ) ら、ザ · ジャーナル · ォブ · バイオロジカル · ケミストリー（J. Biol. Chen ),2 5 9 卷， 1 2 2 4 6頁， 1 9 8 4 年〕に記載のデータより組成比に計算しなおしたもの。

更に得られたトロンボモジュリンについて、前述の分子量測定法及び安定性試験法に従い分子量及び安定 ½について調べたところ以下の結果が得られた。

(a) 分子量

本発明の生理活性物質は、 105，000±10,000の位置に染色バンドを示し、かつその位置に移動した物質はプロティン c活性化能を示した。

(b) 安定性

(1) 0.1 M食塩を含む 0.02Mトリス · 塩酸緩衝液（pH 7. 5)に溶解した本発明物質（0.006 A₂₈₀ /nl)を 60'C、 30分加熱処理したが、活性の低下は認められなかった。

(2)上記（1)と同じ濃度の本発明物質を含む緩衝液を 100 に加熱して， 5.0%失活する時間を求めたところ、約 9分だった。

(3)本発明物質を 0.09 Α_2β0/π1の濃度になるよう 0·1

N NaCl, 0.02 M グリシン、 ImM ベンツアミジン- HC1, 0.1¾(v/v) Triton X-100,5 mM CaCl₂ , pH 2の溶液に力 B え 2時間半処理したところ、約 70 の活性が残存した。また，同じ組成を有するが、 PH 10である溶液で処理したところ、活性の低下は認められなかった。 (4)本発明物質を 0.007 A_2eD/m A の濃度で、 l¾(_W/v)SD Sを含む 0·1 M NaC H を含む 0·02Μトリス'塩酸緩衝液（ρΗ7. 5)で、室温において 2時間半処理後、 0·1 M NaC & , 1 mg /m & ゥシ血清アルブミンを含む 0.02 Mトリス'塩酸锾衡液（ΡΗ7·5)で 100倍に希釈して、ただちに測定したところ、活性の低下は認められなかった。

(5) l (w/v)SDSの替わりに 6 M尿素を用いる他は、全く前記（4)と同様な処理を行なって、 6 M尿素処理の影響を調べたところ、活性の低下は認められなかった。

(6)1% (w/v)SDSの替りに 6 M 塩酸グァニジンを用いる他は、全く前記（4)の同様な処理を行なって、 6 M 塩酸グァニジン処理の影響を調べたところ、残存活性は約 40 ¾であった。

(7) l (w/v)SDSの替わりに 3 M KSCNを用いる他は、全く前記（4)と同様な処理を行なって、 3 M KSCN処理の影響を調べたところ、残存活性は約 40 であった。

(8) l (w/v)SDSの替わリに 2—メルカプトエタノールを用いる他は、全く前記（4)と同様な処理を行なって、メルカプトエタノール処理の影響を調べたところ、メルカプトエタノールの濃度が 0.1 Wv)の場合の残存活性は約 2 、 l (v/v)の場合は、残存活性は 0JKであった。

(c)活性

(1)プロテイン C活性化作用

トロンビンのコファクタ一としてプロテイン Cを活性化する作用について前述の活性評価法によって調べた。桔果を第 3図に示すが、トロンボモジュリン無添加（B) では、活性型プロテイン Cの生成は認められなかった（点線）が、トロンボモジュリンを添加する（A)と、反応時間と共にプロテイン Cが増大した（実線）。

( 2)抗血液凝固作用

トロンビンによるフイブリノ一ゲンのフイブリンへの転換を阻害し、血液凝固を実質的に阻害する作用について前述の括性評価法により調べた。結果を第 4図に示す。図中、点線は用いた緩衝液のみで測定した結果で、実線がトロンボモジュリン添加試料の測定値であるが、トロンビンにくらべ、トロンボモジュリンの量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長されることが確認された。

(3)血小板凝集抑制作用

トロンビンの血小扳凝集抑制作用を実質的に阻害する作用について前述の活性評価法により調べた。その結果 30万 cells/ it & の血小拔溶液（Platelet Rich Plasma . P . R . P . ) 250 μ & に 1 単位のトロンビン（約 0 . 4 # g)を加えると凝集したが、トロンビンを加える前にその加えるトロンビンと等モル以上の本発明の卜ロンボモジュリンを加えておくと，血小板の凝集が起きなかった。

応用例 1

本発明の生理活性物質 10 ng

精製ゼラチン 20 og マンニ I ル 100 mg

塩化ナトリウム 7.8 mg

リン酸ナトリウム lo.4 mg

上記成分を注射用蒸留水 2_Β β に溶解し、無菌バイアルに入れ、一 35 で 2時間予備凍結し、一 35 真空度 0.075 Torrで 35時間一次乾燥し、次いで 30 、真空度 0.03 Torrで 5時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。

得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液 500m β に溶解して点滴静注するのに用いられる。

応用例 2

本発明の生理活性物質 2.5 mg

アルブミン 5 mg

マンニ！ル 25 mg 塩化ナトリウム 1.95 rag リン酸ナトリウム 3.85 ng 上記成分にて、応用例 1 と実質的に同様の方法にょリ注射用バイアルを製造した。

図面の簡単な説明

第 1図は実施例 1 において第 3回目の DIP— トロンビンーァガロースカラムクロマ卜グラフィ一の溶雜のパターンを示すグラフである。

第 2図は実施例 1 において第 4回目の DIP— トロンビンーァガロースカラムクロマトグラフィ一の溶雜のパターンを示すグラフである。

第 3図はトロンボモジュリン存在下及び非存在下における活性型プロティン Cの生成経過を示すグラフである。第 4図はトロンボモジュリン量と血液凝固時間の関係を示すグラフである。

産業上の利用可能性

本発明の生理活性物質は、抗血液凝固作用、血小板凝集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の少ない . 循環器系疾患治療用薬として極めて有用な物質である。また、このような医薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工朦器等の材料に結合させて、血栓の形成を防止する薬剤として用いることができる。

Claims

請求の範囲 1 · 下記の性質を有することを特墩とする血液凝固制御作用を有する生理活性物質。 (a)分子量 105,000 ± 10,000(還元後の SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定値として） (b)安定性

(1) 60ΐ 、 30分で安定

(2) 100¾、 10分で失活せず

(3)ρΗ2~10で安定

(4) l (v/v)SDS処理で安定

(5) 6 M尿素処理で安定

(6) 6 M塩酸グァニジン処理で失活せず

(7) 3 M KSCN処理で失活せず

(8)l (v/v) 2-メトルカプトエタノール処理で失活する

( 活性

(2) 卜ロンビンによるフイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に阻害する。

(3)卜ロンビンの血小板凝集作用を実質的に阻害する。

(d)化学的構造

ァミノ末端より 2番目のアミノ酸からのァミノ酸配列が

Pro一 Ala— Glu— Pro一 Gin - Pro -Gly-Gly- Ser - Gin であるペプチドを含有する。

(但し、 Proはプロリン残基、 Alaはァラニン残基、 Gluはグルタミン酸残基、 Ginはグルタミン残基、 Glyはグリシン残基及び Serはセリン残基を表わす）。