JP3376592B2 - 生理的に活性なペプチド - Google Patents
生理的に活性なペプチドInfo
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液凝固第VIII因子の
活性を阻害し血液凝固第 V因子の活性を阻害しないペプ
チドに関する。本ペプチドはホスファチジルセリン（Ｐ
Ｓ）およびホスファチジルエタノ−ルアミン（ＰＥ）と
反応性を有する。
活性を阻害し血液凝固第 V因子の活性を阻害しないペプ
チドに関する。本ペプチドはホスファチジルセリン（Ｐ
Ｓ）およびホスファチジルエタノ−ルアミン（ＰＥ）と
反応性を有する。
【０００２】
【従来の技術】血栓症など血液凝固系の疾患の治療は現
在のところ、血栓が生じた結果に認められる各部位での
更塞などに対する治療としては血栓溶解剤などがあげら
れる。しかし、現在使われている血栓溶解剤は出血など
の副作用が問題となっており、各種疾病が発病してから
でないと投与出来ないのが現状である。現在のところ血
栓症の診断基準が明確でないためその治療は困難であ
る。しかし、最近になり血栓準備状態の基準が定められ
つつあり、その治療として血液凝固系を制御する物質の
開発が望まれている。
在のところ、血栓が生じた結果に認められる各部位での
更塞などに対する治療としては血栓溶解剤などがあげら
れる。しかし、現在使われている血栓溶解剤は出血など
の副作用が問題となっており、各種疾病が発病してから
でないと投与出来ないのが現状である。現在のところ血
栓症の診断基準が明確でないためその治療は困難であ
る。しかし、最近になり血栓準備状態の基準が定められ
つつあり、その治療として血液凝固系を制御する物質の
開発が望まれている。
【０００３】ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、細胞膜
などを構成する重要なリン脂質であり、血液凝固因子に
代表される多くの生体内蛋白質に認識され生理活性を発
揮するリン脂質である。血液凝固は活性化した血小板表
面に露出したＰＳ等酸性リン脂質表面上において起こる
反応である。従って、血小板表面上に露出したＰＳの量
を調節することによる凝固線溶系を制御する物質の開発
等のためＰＳを特異的に認識する物質の開発が望まれて
いる。ＰＳを特異的に認識する物質としてマウス由来の
モノクロ−ナル抗体が開発されている（J.Immunology 1
989,143,2273）が, 例えばヒト抗体とのキメラ抗体とし
て人に投与しても、長期投与になる場合抗イディオタイ
プ抗体により相殺される等様々副作用がな可能性が考え
られる。従って、生体中に投与する場合を考慮すると、
ペプチド等の抗原性の少ない低分子物質のＰＳ特異的認
識物質の開発が望まれている。
などを構成する重要なリン脂質であり、血液凝固因子に
代表される多くの生体内蛋白質に認識され生理活性を発
揮するリン脂質である。血液凝固は活性化した血小板表
面に露出したＰＳ等酸性リン脂質表面上において起こる
反応である。従って、血小板表面上に露出したＰＳの量
を調節することによる凝固線溶系を制御する物質の開発
等のためＰＳを特異的に認識する物質の開発が望まれて
いる。ＰＳを特異的に認識する物質としてマウス由来の
モノクロ−ナル抗体が開発されている（J.Immunology 1
989,143,2273）が, 例えばヒト抗体とのキメラ抗体とし
て人に投与しても、長期投与になる場合抗イディオタイ
プ抗体により相殺される等様々副作用がな可能性が考え
られる。従って、生体中に投与する場合を考慮すると、
ペプチド等の抗原性の少ない低分子物質のＰＳ特異的認
識物質の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、血液
凝固第VIII因子の活性を阻害するペプチドを提供しよう
とするものである。
凝固第VIII因子の活性を阻害するペプチドを提供しよう
とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、血液凝固
第VIII因子の活性を阻害するペプチドについて鋭意研究
を行った結果、これを完成させた。すなわち本発明は、
血液凝固第VIII因子の活性を阻害し、血液凝固第 V因子
の活性を阻害しないペプチドである。以下本発明を詳細
に説明する。
第VIII因子の活性を阻害するペプチドについて鋭意研究
を行った結果、これを完成させた。すなわち本発明は、
血液凝固第VIII因子の活性を阻害し、血液凝固第 V因子
の活性を阻害しないペプチドである。以下本発明を詳細
に説明する。
【０００６】本発明のペプチドは、前記の他に、例え
ば、ＰＳ及びＰＥを認識するという特徴を有している。
この特徴は、少なくともＰＳが牛脳に由来するものであ
り、ＰＥが大腸菌に由来するものである場合には観察さ
れる。
ば、ＰＳ及びＰＥを認識するという特徴を有している。
この特徴は、少なくともＰＳが牛脳に由来するものであ
り、ＰＥが大腸菌に由来するものである場合には観察さ
れる。
【０００７】本発明のペプチドとして、例えば Thr-Arg
-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-Asp-Gly-Ala-Tyrよりな
るペプチドが例示できる。
-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-Asp-Gly-Ala-Tyrよりな
るペプチドが例示できる。
【０００８】本発明のペプチドのＣ末端にシステイン残
基を付加したものは、後に説明するように他の蛋白質等
を結合させるために好ましい。結合させる物質は、蛋白
質、脂質又は高分子物質であり、前記したシステイン残
基を利用し、架橋試薬により結合すれば良い。より具体
的には、牛血清アルブミン、オブアルブミン、キ−ホ−
ル・リンペット・ヘモシアニン又は凝固線溶系に関与す
る蛋白質等が結合させる物質として例示できる。
基を付加したものは、後に説明するように他の蛋白質等
を結合させるために好ましい。結合させる物質は、蛋白
質、脂質又は高分子物質であり、前記したシステイン残
基を利用し、架橋試薬により結合すれば良い。より具体
的には、牛血清アルブミン、オブアルブミン、キ−ホ−
ル・リンペット・ヘモシアニン又は凝固線溶系に関与す
る蛋白質等が結合させる物質として例示できる。
【０００９】本発明のペプチドの調製等について、以下
に列挙する。 （１）ペプチドの合成。 ペプチドの合成は一般的方法により合成が可能である。
例えば固相表面において行う、自動合成装置を用いれば
簡便である。合成したペプチドは逆相高速液体クロマト
グラフィ−など一般的な方法にしたが精製し、アミノ酸
配列分析を行った後、サンプルとして用いることが可能
である。 （２）ペプチド末端へのシステインの付加。 ペプチド末端へのシステインの付加はペプチドを蛋白
質、脂質および高分子物質に結合させる際、システイン
の−ＳＨ基を利用して容易に結合を行うものである。ペ
プチドの蛋白質等に結合させる方法は他にも多く考えら
れるが、例えばグルタ−ルアルデヒドを用いて結合を行
うと、ペプチド中のアミノ基が蛋白質等への結合の際使
用されてしまい、ペプチドの機能を発揮できない可能性
が考えられため、好ましい方法ではない。
に列挙する。 （１）ペプチドの合成。 ペプチドの合成は一般的方法により合成が可能である。
例えば固相表面において行う、自動合成装置を用いれば
簡便である。合成したペプチドは逆相高速液体クロマト
グラフィ−など一般的な方法にしたが精製し、アミノ酸
配列分析を行った後、サンプルとして用いることが可能
である。 （２）ペプチド末端へのシステインの付加。 ペプチド末端へのシステインの付加はペプチドを蛋白
質、脂質および高分子物質に結合させる際、システイン
の−ＳＨ基を利用して容易に結合を行うものである。ペ
プチドの蛋白質等に結合させる方法は他にも多く考えら
れるが、例えばグルタ−ルアルデヒドを用いて結合を行
うと、ペプチド中のアミノ基が蛋白質等への結合の際使
用されてしまい、ペプチドの機能を発揮できない可能性
が考えられため、好ましい方法ではない。
【００１０】ペプチド末端へのシステインの付加はペプ
チド末端へ直接システインを、あるいは幾つかのアミノ
酸を介して末端へシステインを付加する。ペプチド末端
のシステインは合成の際、付加すれば良い。 （３）ペプチドの蛋白質、脂質および高分子物質への結
合の目的。 本発明によるペプチドは大きく２つの特徴を有している
ため蛋白質、脂質および高分子物質への結合させること
によりその機能を効果的に発揮できることが期待でき
る。 １）ペプチドのＰＳを特異的に認識する特徴を利用した
既存の蛋白質、酵素等に機能付加を行う場合、例えば血
液凝固因子などはその反応の場がＰＳを露出した血小板
表面などであるので、血液凝固因子にペプチドを結合さ
せることによりその機能の向上が期待できる。 ２）ペプチドの血液凝固第VIII因子の活性を阻害するこ
とより凝固線溶用系の疾患に対する予防、治療薬として
の利用が考えられる。従って、ペプチドを結合させる蛋
白質、脂質および高分子物質は人に投与する場合抗原性
の低いものが好ましい。例えば静脈内に投与するのであ
れば人血清アルブミン等の蛋白質、ドラッグデリバリ−
・システムに組み込むのであればＰＥ等、体内に局所的
に放置するのであれば生体適合性の良いアミノ基を有し
たポリマ−等が考えられる。 （４）ペプチドの蛋白質、脂質および高分子物質への結
合方法。 ペプチドと蛋白質等との結合はペプチドのアミノ基を介
して結合を行ってもペプチド機能を損なうことがない場
合は通常用いられる架橋剤であるグルタ−ルアルデヒド
等を用い、ペプチドおよび蛋白質等のアミノ基どうしを
結合させれば良い。また、上記方法によりペプチド機能
を損なう恐れがある場合カルボキシ末端にシステイン残
基を付加したペプチドを用い蛋白質等と結合する。すな
わち、ペプチド末端のシステイン残基の−ＳＨ基とペプ
チドを結合させる蛋白質等のアミノ基とを通常用いられ
るバイファンクショナルな架橋剤、例えば succinimidy
l4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate、m
-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester など
により結合させる。しかし、ペプチドの機能を阻害しな
い架橋剤を用いた結合方法であればこれに限定されるも
のではない。上記の方法で製造したペプチド結合物質は
ゲル濾過法あるいは透析により不純物や未反応物を除去
し、サンプルとして用いることが可能である。 （５）血液凝固第VIII因子および血液凝固第 V因子活性
への影響の測定。 これは合成基質を用いた系により行うことが可能であ
る。人血しょう中の血液凝固第VIII因子を血液凝固第 I
Xa因子、第 X因子およびリン脂質と混合し、塩化カルシ
ュウムを添加することにより第Xa因子を生成させる。生
じた第Xa因子の量を合成基質Ｓ−２２２２により発色検
出することにより血液凝固第VIII因子活性を測定する。
この際、ペプチドあるいはペプチド結合物質を反応系に
混合しその活性への影響を評価できる。血液凝固第 V因
子活性への影響も同様に、第 V因子、第II因子、第Xa因
子およびリン脂質と混合し、塩化カルシュウムを添加す
ることにより第 IIa因子を生成させる。生じた第 IIa因
子の量を合成基質Ｓ−２２３８により発色検出すること
により血液凝固第 v因子活性を測定する。この際、ペプ
チドあるいはペプチド結合物質を反応系に混合しその活
性への影響を評価できる。 （６）ペプチドのリン脂質に対する反応性の評価。 ペプチドのリン脂質に対する反応性の各種リン脂質を固
定化した系を用い、ＥＬＩＳＡ法を用いて行うことが可
能である。すなわち、リン脂質を直接ＥＬＩＳＡ用マイ
クロタイタ−プレ−トにコ−トしペプチド結合物質と反
応させた後、結合したペプチド結合物質を一般的な検出
法、例えば西洋ワサビペルオキシダ−ゼを用いたフェニ
レンジアミンによる発色、あるいはアルカリホスファタ
−ゼを用いたメチルウンベリフェリルホスフェイトの蛍
光発色を検出することにより反応性を評価できる。詳細
は実施例にて示す。
チド末端へ直接システインを、あるいは幾つかのアミノ
酸を介して末端へシステインを付加する。ペプチド末端
のシステインは合成の際、付加すれば良い。 （３）ペプチドの蛋白質、脂質および高分子物質への結
合の目的。 本発明によるペプチドは大きく２つの特徴を有している
ため蛋白質、脂質および高分子物質への結合させること
によりその機能を効果的に発揮できることが期待でき
る。 １）ペプチドのＰＳを特異的に認識する特徴を利用した
既存の蛋白質、酵素等に機能付加を行う場合、例えば血
液凝固因子などはその反応の場がＰＳを露出した血小板
表面などであるので、血液凝固因子にペプチドを結合さ
せることによりその機能の向上が期待できる。 ２）ペプチドの血液凝固第VIII因子の活性を阻害するこ
とより凝固線溶用系の疾患に対する予防、治療薬として
の利用が考えられる。従って、ペプチドを結合させる蛋
白質、脂質および高分子物質は人に投与する場合抗原性
の低いものが好ましい。例えば静脈内に投与するのであ
れば人血清アルブミン等の蛋白質、ドラッグデリバリ−
・システムに組み込むのであればＰＥ等、体内に局所的
に放置するのであれば生体適合性の良いアミノ基を有し
たポリマ−等が考えられる。 （４）ペプチドの蛋白質、脂質および高分子物質への結
合方法。 ペプチドと蛋白質等との結合はペプチドのアミノ基を介
して結合を行ってもペプチド機能を損なうことがない場
合は通常用いられる架橋剤であるグルタ−ルアルデヒド
等を用い、ペプチドおよび蛋白質等のアミノ基どうしを
結合させれば良い。また、上記方法によりペプチド機能
を損なう恐れがある場合カルボキシ末端にシステイン残
基を付加したペプチドを用い蛋白質等と結合する。すな
わち、ペプチド末端のシステイン残基の−ＳＨ基とペプ
チドを結合させる蛋白質等のアミノ基とを通常用いられ
るバイファンクショナルな架橋剤、例えば succinimidy
l4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate、m
-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester など
により結合させる。しかし、ペプチドの機能を阻害しな
い架橋剤を用いた結合方法であればこれに限定されるも
のではない。上記の方法で製造したペプチド結合物質は
ゲル濾過法あるいは透析により不純物や未反応物を除去
し、サンプルとして用いることが可能である。 （５）血液凝固第VIII因子および血液凝固第 V因子活性
への影響の測定。 これは合成基質を用いた系により行うことが可能であ
る。人血しょう中の血液凝固第VIII因子を血液凝固第 I
Xa因子、第 X因子およびリン脂質と混合し、塩化カルシ
ュウムを添加することにより第Xa因子を生成させる。生
じた第Xa因子の量を合成基質Ｓ−２２２２により発色検
出することにより血液凝固第VIII因子活性を測定する。
この際、ペプチドあるいはペプチド結合物質を反応系に
混合しその活性への影響を評価できる。血液凝固第 V因
子活性への影響も同様に、第 V因子、第II因子、第Xa因
子およびリン脂質と混合し、塩化カルシュウムを添加す
ることにより第 IIa因子を生成させる。生じた第 IIa因
子の量を合成基質Ｓ−２２３８により発色検出すること
により血液凝固第 v因子活性を測定する。この際、ペプ
チドあるいはペプチド結合物質を反応系に混合しその活
性への影響を評価できる。 （６）ペプチドのリン脂質に対する反応性の評価。 ペプチドのリン脂質に対する反応性の各種リン脂質を固
定化した系を用い、ＥＬＩＳＡ法を用いて行うことが可
能である。すなわち、リン脂質を直接ＥＬＩＳＡ用マイ
クロタイタ−プレ−トにコ−トしペプチド結合物質と反
応させた後、結合したペプチド結合物質を一般的な検出
法、例えば西洋ワサビペルオキシダ−ゼを用いたフェニ
レンジアミンによる発色、あるいはアルカリホスファタ
−ゼを用いたメチルウンベリフェリルホスフェイトの蛍
光発色を検出することにより反応性を評価できる。詳細
は実施例にて示す。
【００１１】
【発明の効果】本発明によれば、血液凝固第VIII因子の
活性を阻害するという特徴を有するペプチドが提供され
る。
活性を阻害するという特徴を有するペプチドが提供され
る。
【００１２】本発明により提供されるペプチドは細胞膜
にあって重要な役割を担っていると考えられるＰＳの研
究に多大の効果を有していると考えられる。さらに、血
液凝固第VIII因子の活性を阻害することは、血栓症など
血液凝固系異常疾患に対する治療薬としての利用が考え
られる。また、強いては人工膜の研究、医療用人工材料
等の研究、開発に貢献するものである。
にあって重要な役割を担っていると考えられるＰＳの研
究に多大の効果を有していると考えられる。さらに、血
液凝固第VIII因子の活性を阻害することは、血栓症など
血液凝固系異常疾患に対する治療薬としての利用が考え
られる。また、強いては人工膜の研究、医療用人工材料
等の研究、開発に貢献するものである。
【００１３】特に本発明のペプチドは他の蛋白質等と結
合させるた場合にもこのような特徴を失わないから、例
えばその安定性を高めたり、又は適当な薬剤等による治
療を細胞膜付近に運ぶ目的等をも達成できる。
合させるた場合にもこのような特徴を失わないから、例
えばその安定性を高めたり、又は適当な薬剤等による治
療を細胞膜付近に運ぶ目的等をも達成できる。
【００１４】
【実施例】以下、本願発明の実施例を記載し、本願発明
の効果を具体的に説明する。なお、本願発明は下記実施
例に限定されるものではない。
の効果を具体的に説明する。なお、本願発明は下記実施
例に限定されるものではない。
【００１５】実施例１ ペプチドの合成および牛血清ア
ルブミンへの結合 ペプチドの合成はアプライド・バイオシステム社ペプチ
ド合成装置４７０Ａを用いて行った。すなわち、4-(oxy
methyl)-phenylacetamidomethyl 単体を用い、tert-but
yloxycarbonyl アミノ保護基を有したアミノ酸を固相に
て順次結合し、Thr-Arg-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-
Asp-Gly-Ala-Tyr-Cysを合成した。合成の終了したペプ
チドは単体より切り出し、逆層高速液体クロマトグラフ
ィ−により生成回収した。回収したペプチドは凍結乾燥
の後、アミノ酸配列を確認した後サンプルとした。
ルブミンへの結合 ペプチドの合成はアプライド・バイオシステム社ペプチ
ド合成装置４７０Ａを用いて行った。すなわち、4-(oxy
methyl)-phenylacetamidomethyl 単体を用い、tert-but
yloxycarbonyl アミノ保護基を有したアミノ酸を固相に
て順次結合し、Thr-Arg-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-
Asp-Gly-Ala-Tyr-Cysを合成した。合成の終了したペプ
チドは単体より切り出し、逆層高速液体クロマトグラフ
ィ−により生成回収した。回収したペプチドは凍結乾燥
の後、アミノ酸配列を確認した後サンプルとした。
【００１６】ペプチドの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）へ
の結合はピアス社 m-maleimidobemzoyl-N-hydroxysucci
nimide ester（ＭＢＳ）を用い行った。ＢＳＡ ５ｍｇ
を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、４０倍モルの
ＭＢＳを加え室温で３０分反応させる。反応後、緩衝液
50mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いゲル濾過により未反
応のＭＢＳを分離し、ＭＢＳの付加したＢＳＡを回収す
る。つづいてカルボキシル末端にシステインを有したペ
プチド ５ｍｇを加え、室温で３０分反応させる。反応
後、緩衝液10mMトリス、150mNaCl緩衝液（ｐＨ７．４）
を用いゲル濾過により未反応のペプチドを分離し、ペプ
チド結合ＢＳＡを回収する。ペプチドの結合量はＳＤＳ
−ＰＡＧＥによりその分子量の変化により確認した。
の結合はピアス社 m-maleimidobemzoyl-N-hydroxysucci
nimide ester（ＭＢＳ）を用い行った。ＢＳＡ ５ｍｇ
を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、４０倍モルの
ＭＢＳを加え室温で３０分反応させる。反応後、緩衝液
50mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いゲル濾過により未反
応のＭＢＳを分離し、ＭＢＳの付加したＢＳＡを回収す
る。つづいてカルボキシル末端にシステインを有したペ
プチド ５ｍｇを加え、室温で３０分反応させる。反応
後、緩衝液10mMトリス、150mNaCl緩衝液（ｐＨ７．４）
を用いゲル濾過により未反応のペプチドを分離し、ペプ
チド結合ＢＳＡを回収する。ペプチドの結合量はＳＤＳ
−ＰＡＧＥによりその分子量の変化により確認した。
【００１７】実施例２ リン脂質に対する反応性
ＥＬＩＳＡ法は、梅田らの方法（J.Immunology 1989,14
3,2273）に従って行った。すなわち、マイクロタイター
プレイトに各種リン脂質（ＰＳ，ＰＡ，ＰＥ，ＰＣ，Ｃ
Ｌ）を0.5nmol/wellでコートを行う。つずいて3%- BSA
（牛血清アルブミン）にて２時間室温でブロキングを行
い、10mM-Tris,150mM-NaCl,pH=7.4 にて洗浄後、ペプチ
ド（Thr-Arg-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-Asp-Gly-Al
a-Tyr ）をビオチニル化牛血清アルブミンに結合させた
ものを 50 μl （20 μg/mlから1/2 倍づつ希釈し
た）加え、２時間室温で放置し、洗浄後アルカリホスフ
ァタ−ゼ標識ストレプトアビジンと反応させ洗浄後、４
−メチルウンベリフェリルホスフェイトを基質としてそ
の蛍光強度を測定した。その結果、図１に示すとうりペ
プチド結合物質はＰＳと特異的に反応性を示し、他のリ
ン脂質とは反応性を示さなかった。
3,2273）に従って行った。すなわち、マイクロタイター
プレイトに各種リン脂質（ＰＳ，ＰＡ，ＰＥ，ＰＣ，Ｃ
Ｌ）を0.5nmol/wellでコートを行う。つずいて3%- BSA
（牛血清アルブミン）にて２時間室温でブロキングを行
い、10mM-Tris,150mM-NaCl,pH=7.4 にて洗浄後、ペプチ
ド（Thr-Arg-Gln-Asn-Val-Glu-Gly-Ser-Tyr-Asp-Gly-Al
a-Tyr ）をビオチニル化牛血清アルブミンに結合させた
ものを 50 μl （20 μg/mlから1/2 倍づつ希釈し
た）加え、２時間室温で放置し、洗浄後アルカリホスフ
ァタ−ゼ標識ストレプトアビジンと反応させ洗浄後、４
−メチルウンベリフェリルホスフェイトを基質としてそ
の蛍光強度を測定した。その結果、図１に示すとうりペ
プチド結合物質はＰＳと特異的に反応性を示し、他のリ
ン脂質とは反応性を示さなかった。
【００１８】実施例３ 血液凝固第VIII因子活性の影響
ペプチド結合物質の血液凝固第VIII因子活性の影響はＫ
ａｂｉ社合成基質Ｓ−２２２２を用いて行った。クエン
酸採血した人血液より血しょうを分離し、２５０倍希釈
した血しょうと各濃度のペプチド結合ＢＳＡを１：１で
混合し、つずいて血液凝固第 X因子、血液凝固第 IXa因
子、豚脳由来リン脂質を加え、塩化カルシウムを添加し
１０分間３７度で反応させる。つずいて、Ｓ−２２２２
を加え生成した血液凝固第Xa因子によるＳ−２２２２の
分解により生じたp-ニトロアニリンを波長４０５にて比
色検出し、ペプチド結合ＢＳＡマイナスの値を対照にそ
の影響を調べた。その結果図２に示すとうり、ペプチド
結合ＢＳＡの濃度依存的に活性を阻害し0.05mg/ml にて
約50% の阻害活性を示した。
ａｂｉ社合成基質Ｓ−２２２２を用いて行った。クエン
酸採血した人血液より血しょうを分離し、２５０倍希釈
した血しょうと各濃度のペプチド結合ＢＳＡを１：１で
混合し、つずいて血液凝固第 X因子、血液凝固第 IXa因
子、豚脳由来リン脂質を加え、塩化カルシウムを添加し
１０分間３７度で反応させる。つずいて、Ｓ−２２２２
を加え生成した血液凝固第Xa因子によるＳ−２２２２の
分解により生じたp-ニトロアニリンを波長４０５にて比
色検出し、ペプチド結合ＢＳＡマイナスの値を対照にそ
の影響を調べた。その結果図２に示すとうり、ペプチド
結合ＢＳＡの濃度依存的に活性を阻害し0.05mg/ml にて
約50% の阻害活性を示した。
【００１９】実施例４ 血液凝固第 V因子活性の影響
ペプチド結合物質の血液凝固第 V因子活性の影響はＫａ
ｂｉ社合成基質Ｓ−２２３８を用いて行った。精製した
血液凝固第 V因子と各濃度のペプチド１および、ペプチ
ド２結合牛血清アルブミンを１：１で混合し、続いて血
液凝固第Xa因子、血液凝固第II因子、リン脂質（ＰＳ／
ＰＣ混合物）を加え、塩化カルシウムを添加し５分間３
７で反応させる。つずいて、Ｓ−２２３８を加え生成し
た血液凝固第 IIa因子によるＳ−２２３８の分解により
生じたp-ニトロアニリンを波長４０５にて比色検出し、
ペプチド結合牛血清アルブミンマイナスの値に対しその
影響を調べた。その結果図２に示すとうり、0.1mg/mlに
ておいてもほとんど活性を阻害は認められない。
ｂｉ社合成基質Ｓ−２２３８を用いて行った。精製した
血液凝固第 V因子と各濃度のペプチド１および、ペプチ
ド２結合牛血清アルブミンを１：１で混合し、続いて血
液凝固第Xa因子、血液凝固第II因子、リン脂質（ＰＳ／
ＰＣ混合物）を加え、塩化カルシウムを添加し５分間３
７で反応させる。つずいて、Ｓ−２２３８を加え生成し
た血液凝固第 IIa因子によるＳ−２２３８の分解により
生じたp-ニトロアニリンを波長４０５にて比色検出し、
ペプチド結合牛血清アルブミンマイナスの値に対しその
影響を調べた。その結果図２に示すとうり、0.1mg/mlに
ておいてもほとんど活性を阻害は認められない。
【図１】図１は、ペプチド結合ＢＳＡの各種リン脂質に
対する反応性をＥＬＩＳＡ法を用いて行った結果を示し
ている。
対する反応性をＥＬＩＳＡ法を用いて行った結果を示し
ている。
【図２】図２は、ペプチド結合ＢＳＡの血液凝固第 V、
VIII因子活性への影響を調べた結果をその阻害率で示し
たものである。
VIII因子活性への影響を調べた結果をその阻害率で示し
たものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 ＤＮＡ（1985），Ｖｏｌ．４，Ｎｏ.
５，ｐ．333−349
Ｎａｔｕｒｅ（1984），Ｖｏｌ．312,
Ｎｏ．5992，ｐ．330−337
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1991）,
Ｖｏｌ．266，Ｎｏ．２，ｐ．740−746
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（1986）,
Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．２，ｐ．505−512
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
（1987），Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．23，ｐ.
9797−9805
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 7/00
A61K 38/00
C07K 14/00
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性を阻害し、
血液凝固第Ｖ因子の活性を阻害しない、アミノ酸配列Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
よりなるペプチド。 - 【請求項２】Ｃ末端にシステイン残基を有する請求項１
に記載のペプチド。 - 【請求項３】Ｃ末端のシステイン残基と蛋白質、脂質又
は高分子物質が架橋試薬を用いて結合された請求項２に
記載のペプチド。 - 【請求項４】結合された蛋白質が牛血清アルブミン、オ
ブアルブミン、キーホール・リンペットヘモシアニンで
ある請求項３に記載のペプチド。 - 【請求項５】結合された蛋白質が凝固線溶系に関与する
蛋白質である請求項３に記載のペプチド。 - 【請求項６】ホスファチジルセリン及びホスファチジル
エタノールアミンを認識する請求項１に記載のペプチ
ド。 - 【請求項７】ホスファチジルセリンが牛脳に由来するも
のでありホスファチジルエタノールアミンが大腸菌に由
来するものである請求項６に記載のペプチド。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27613891A JP3376592B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | 生理的に活性なペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27613891A JP3376592B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | 生理的に活性なペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0592993A JPH0592993A (ja) | 1993-04-16 |
| JP3376592B2 true JP3376592B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=17565311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27613891A Expired - Fee Related JP3376592B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | 生理的に活性なペプチド |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3376592B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0021497D0 (en) * | 2000-09-01 | 2000-10-18 | Novartis Res Foundation | Compounds and their use |
-
1991
- 1991-09-30 JP JP27613891A patent/JP3376592B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６），Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，ｐ．５０５−５１２ |
| ＤＮＡ（１９８５），Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．３３３−３４９ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１），Ｖｏｌ．２６６，Ｎｏ．２，ｐ．７４０−７４６ |
| Ｎａｔｕｒｅ（１９８４），Ｖｏｌ．３１２，Ｎｏ．５９９２，ｐ．３３０−３３７ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７），Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．２３，ｐ．９７９７−９８０５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0592993A (ja) | 1993-04-16 |
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