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WO1986004353A1 - Procede de regeneration intrasequentielle du co-facteur lors de syntheses enzymatiques, en particulier lors de la production de vitamine c - Google Patents

Procede de regeneration intrasequentielle du co-facteur lors de syntheses enzymatiques, en particulier lors de la production de vitamine c Download PDF

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WO1986004353A1
WO1986004353A1 PCT/EP1986/000024 EP8600024W WO8604353A1 WO 1986004353 A1 WO1986004353 A1 WO 1986004353A1 EP 8600024 W EP8600024 W EP 8600024W WO 8604353 A1 WO8604353 A1 WO 8604353A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
enzymatically
dehydrogenase
oxidation
lactone
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP1986/000024
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus D. Kulbe
Gisela Knopki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of WO1986004353A1 publication Critical patent/WO1986004353A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to a method for intrasequen. tial cofactor regeneration in two- or multi-stage enzymatic syntheses.
  • the invention relates in particular to processes for the production of vitamin C or L-ascorbic acid and for the production of intermediate products which can be used for the production of vitamin C.
  • DE-OS 33 26 546.1-42 (1983) describes for the first time a technically interesting process in which two mixtures of glucose and fructose, as are also produced on an industrial scale from sucrose on an industrial scale, are simultaneously economical interesting products can be obtained. While glucose is oxidized to gluconic acid by glucose dehydrogenase, fructose in one of sorbitol or
  • L-ascorbic acid (vitamin C) is still produced on an industrial scale using the chemical synthesis method developed by T. Reichstein and A. Grüssner (Helv. Chi. Acta V7, 311 (1934)), starting from D-glucose.
  • US Pat. No. 2,681,858 describes the enzymatic cleavage of lactose by 3-galactosidase in D-galactose and D-glucose.
  • the conversion of glucose and galactose into the corresponding uronic acid or uronic acid derivatives using protective groups is also known: (US Pat. No. 4,259,443 1981; CL Mehltretter et al. J. Amer. Chem. Soc. 73_, 2424 (1951)).
  • the yields of uronic acids obtained in this known process are too low for an economical one US Pat. No. 4,259,443 describes a process for the production of L-ascorbic acid from lactose
  • the object 5 f Jer present invention is based on a comparison fanren for the production of vitamin C to provide, in the cecni ⁇ cneii. and can be carried out on a technical scale, with ⁇ er enzymes used as catalysts and which enables the regeneration of the required * - * 1 cofactors.
  • the process according to the invention, in which enzymes are used, should be able to be carried out in an economical manner without incurring unacceptable losses. It should give the desired product in high yields. b
  • a purely enzymatic process for the production of L-ascorbic acid from D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or mixtures of D-glucuronic acid and D-galacturonic acid is to be made available.
  • a method is to be made available according to which these uronic acids from lactose or other easily accessible starting materials, e.g. Glucose, pectin, alginic acid or gluconic acid can be obtained economically.
  • inventive method in particular the process for the production of vitamin C or step his Vor ⁇ or intermediate products, shall be characterized by the following advantages:
  • the invention relates to a method for intrasequen ⁇ tial cofactor regeneration in enzymatic syntheses, which is characterized in that a substrate is enzymatically reduced in the same reactor or in separate stages (D) and the reduction product obtained is converted enzymatically into an oxidation product or (2 ) enzymatically oxidizes a Sunstrat and " enzymatically converts the oxidation product obtained into a reduction product and isolates the desired end product in a manner known per se, where two enzymes are used for the coupled oxidation and reduction, which have the same cofactor specificity. (This process is illustrated in Figures 1 and 3 to 8 using some examples.)
  • the following reaction scheme shows the enzymatic production process for L-sorbose from D-glucose with intra-sequential cofactor (here NAD / NADH 2 > regeneration).
  • FIGS. 6 and 8 show the enzymatic reactions in more detail.
  • the process according to the invention has the great advantage that it can be carried out continuously and on a semi-technical as well as on an industrial scale.
  • the process according to the invention has the essential advantage that the co-actuators can be regenerated in a simple manner, that inexpensive substrates can be used and that the substrates are fully utilized.
  • the end product obtained has a high degree of purity, so that little or no by-products are formed and the environmental impact is very low. The investment east is also low.
  • the oxidation-reduction reactions are carried out under the reaction conditions normally used for carrying out enzymatic reactions, for example the pH is generally between 5 and 9, preferably between 6 and 8.
  • L-hexonate dehydrogenase, aldose reductase, mannuronate dehydrogenase or lactate dehydrogenase can be used as the reducing enzyme, and L-galactonic acid (L-gulonic acid) -lactone dehydrogenase and L-galactonic acid (L -Gulonic acid) - lactonase and inositol-1-phosphate synthase, fructuronate dehydrogenase or malate dehydrogenases can be used.
  • the cofactor is only used in the process according to the invention in catalytic amounts and it can be used in * free form or bound to soluble polymers or to enzymes.
  • the enzymes can be used in free or in immobilized form.
  • Fe + / Fe + complexes such as K Fe (CN) g / K 4 Fe (CN) 6 or cytochlorne c,
  • T-naphthoquinone ß-naphthoquinone, naturally occurring or synthetic redox dyes, such as 2, 6-dichlorophenolindophenol, o-chlorophenolindo-2,6-dichlorophenol, methylene blue, Wurster's blue, triphenyl-tetrazolium chloride, phenzin methosulfate,
  • Coenzymes such as NAD NADH 2 , NADP / DPH 2 , Q0, Q2, Q6, Q7,
  • the redox systems nicotinamide adenine dinucleotide (NAD / NADH-) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + / NADPH 2 ), Fe + / Fe-cyto-chromium c, 2, 6-dichlorophenol-indophenol or are preferred Phenazine ethosulfate used.
  • the method according to the invention is particularly well suited for the enzymatic production of vitamin C. As shown in FIG. 2, the following starting materials can be used.
  • FIG. 7 shows a further synthetic route, which starts from D-gluconic acid.
  • the homo- or heteropolyglycans containing galacturonic acid or D-galacturonic acid or mannuronic acid are hydrolyzed chemically or enzymatically (cf. FIG. 1).
  • the homopolymers or heteropolymers containing D-galactose or D-glucose or D-mannose are oxidized chemically, microbiologically or enzymatically to the corresponding compounds containing D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or D-mannuronic acid and then hydrolyzed.
  • pectin As an advantageous raw material for the production of L-ascorbic acid, pectin comes into question, which is found to 15 to 30% in the middle lamella of plant cell walls.
  • This pectin (for example from sugar beet chips) is used to produce D-galacturonic acid by attacking pectin methyl esterases, endo- and exo-polygalacturonases, preferably in the pH range 4 to 6.
  • the Enzymlessnesspara- used 'te need to achieve a high yield of D-Ga ⁇ lacturonklaire necessarily be lyaseok, otherwise ⁇ -4-5-unsaturated D-galacturonic acid-derivatives are formed which are not reacted further to L-ascorbic acid NEN kön ⁇ .
  • Hexuronate reductase (EC 1.1.1.19) gives L-galactone acid, the ⁇ -lactose of which can preferably be further reacted enzymatically-oxidatively to give 2-keto-L-galactonic acid (or its ⁇ -lactone). In a known, non-enzymatically catalyzed manner, this compound gives L-ascorbic acid by rearrangement (cf. FIG. 1).
  • the disaccharides are chemically, enzymatically or microbiologically oxidized and then enzymatically following 'table or chemically hydrolyzed or they are enzymatically or chemically cleaved into their monomeric constituents.
  • the monosaccharides are oxidized enzymatically or chemically to the corresponding uronic acids.
  • the chemical process requires the introduction and later removal of protective groups.
  • Starch, maltose, cellobiose or sucrose are enzymatically converted into myo-inositol and then enzymatically oxidized to D-glucuronic acid via glucose-1-phosphate.
  • the invention further relates to a process for the preparation of L-ascorbic acid, in which D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or a mixture of these two acids is used as the substrate.
  • a mixture of these two acids is obtained, for example, by chemical or enzymatic oxidation together with hydrolysis from lactose.
  • the two acids mentioned or the mixture of the acids are enzymatically reduced to L-galactonic acid or L-gulonic acid or a mixture of these acids, and these are optionally converted into their lactones or a mixture of the lactones.
  • the acids or a mixture of the acids or the lactones or a mixture of the lactones are then oxidized enzymatically to the corresponding 2-keto acids and rearranged to ascorbic acid, which is isolated in a manner known per se.
  • a mixture of D-galacturonic acid and D-glucuronic acid is obtained from lactose by chemical or enzymatic oxidation in combination with a hydrolysis step.
  • a mixture of L-galactonic acid and L-gulonic acid is generated from these two D-uronic acids with configuration reversal (inversion).
  • the 2-keto-L-galactonic acid and 2-keto-L-gulonic acid or their y-lactones (stage 3) obtainable therefrom by enzymatic oxidation go uncatalyzed into L-ascorbic acid (vitamin C).
  • the reduction step (step 2, E., ) and the oxidation step (step 3, E ' 2 ) can be linked together to form a continuous process.
  • a continuous regeneration of the in -E or E-, catalyzed individual steps each required coenzymes (redox systems), so that they only need to be used in catalytic amounts.
  • the end products obtained in the process according to the invention can be separated off in a manner known per se and must be removed from the equilibrium. They can be separated or isolated, for example, by absorption chromatography, distribution chromatography, ion exchange chromatography, fractional crystallization, electrodialysis or electrodialytic focusing.
  • the D-glucuronic acid used in the process for the production of vitamin C described above can also be added according to the invention by enzymatic reduction of D-mannuronic acid to D-mannonic acid and subsequent oxidation of the D-mannonic acid to D-fructuronic acid and isomerization of the D-fructuronic acid D-glucuronic acid can be produced.
  • alginic acid can also be used as an inexpensive starting material (cf. FIG. 3).
  • L-sorbose is an intermediate for the production of vitamin C, and this compound can be made from D-glucose or from D-fructose. D-glucose or D-fructose are enzymatically reduced to D-sorbitol, and D-sorbitol is enzymatically oxidized to L-sorbose (see FIG. 6.8).
  • the D-forms can be converted into the desired L-form in an enzymatic manner. Such conversions are otherwise difficult to achieve and are therefore carried out microbiologically in the Reichstein synthesis (cf. the reaction schemes above).
  • the oxidation-reduction reactions according to the invention can be carried out, for example, in a reactor with an ultrafiltration membrane, using a cofactor system which is bound to a water-soluble polymer with an average molecular weight between 5000 and 30,000 daltons. A pressure difference is generated across the membrane of the reactor, and a product stream is continuously removed behind the membrane.
  • hollow fibers can be used as membranes whose structure is asymmetrical, the selective layer of the membrane impermeable to enzymes and polymer-bound coenzymes lying on the outside of the hollow fiber, while the inside of the fiber contains pores which are also suitable for the Enzymes and coenzymes are permeable.
  • the substrate solution is then introduced on the inside of the hollow fiber membrane, a hydrostatic pressure difference is generated between the inner and outer wall of the fiber, so that the substrate solution passes through the inner fiber wall and the enzymatic reactions preferably take place in the porous support material between the inner wall and the outer wall.
  • the throughput of the substrates can be adjusted so that their residence time in the hollow fiber wall is sufficient to achieve the most complete possible implementation.
  • the actual un twist ⁇ permeable to enzymes and polymer-bound cofactors selective layer of the membrane can lie on the inside of the hollow fiber and effect the enzymatic reaction in ⁇ lumen of the hollow fiber.
  • a protective protein can be added to the reaction solution in an amount
  • the mixture of residual substrate, product, enzyme and cofactor can also be flowed through a membrane module 5, the membrane pores of which are designed in such a way that they only allow the product and residual substrate to pass through, but retain the remaining components, the latter being returned to the reactor .
  • the enzymes present together in the reactor can have different half-lives of their inactivation. In order to keep the reactor functional over a longer period of time, the enzymes are kept in an activity ratio between the reactor
  • the substrate turnover rates per unit of time can also be changed from forward and backward through additional dosing of individual dissolved enzymes or the cofactor during the production process.
  • Some of the enzymes required are, as in the case of sorbitol dehydrogenase (EC 1.1.1.14) from sheep's liver or Candida utilis, or lactate dehydrogenase
  • the other enzymes can be e.g. Isolate from the following sources:
  • Sorbitol DH EC 1. 1 . 1 . 1 4 Lactobacillus brevis, (Iditol-DH) Zymomonas mobilis, Gluconobacter xylinum Acetobacter suboxydans
  • L-hexonate dehydrogenase 1. 1 . 1 .20 Erwinia carotevora, Euglenia gracilis, Erb sen, S. cerevisiae, Saccharomyces lipolytic Lipomyces starkeyi, Schwanniomyces oc ⁇ iden talis, Aspergillus nige and others.
  • Yeast Yeast
  • Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis, E. coli
  • Aerobacter Aerobacter, Aeromonas, Bacterium, Bacteroides Klebsiella, Vibrio

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Description

Verfahren zur intrasequentiellen Cof'aktor-Regeneration b enzymatischen Synthesen, insbesondere bei der Herstellun von Vitamin C
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen- . tiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehr¬ stufigen enzymatischen Synthesen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Vitamin C oder L-Ascorbinsäure und zur Herstellung von Zwischen¬ produkten, die für die Herstellung von Vitamin C ver¬ wendet werden können.
Chemische Reaktionen, die unter der Einwirkung von Enzymen als Katalysatoren ablaufen, besitzen unter anderem den großen Vorteil, daß die Reaktionen bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, meist stereospezifisch verlaufen und der Bedarf an Hilfs¬ chemikalien minimal gehalten werden kann. Die Verwendung von Enzymen bei technischen oder halbtechnischen Syn¬ thesen hat jedoch, abgesehen "von Hydrolysereaktionen, bis jetzt nur beschränkte Anwendung 'gefunden. Dafür gibt es eine Anzahl von Gründen. Einer der Gründe ist, daß zahlreiche Enzyme nur in Gegenwart eines Cofaktors oder Coenzyms wirksam sind. Dies gilt z.B. für die Gruppe der Dehydrogenasen. Die Regeneration der Cofaktoren, insbesondere der Coenzyme, wie beispielsweise NAD oder FAD ist vor allem bei einer technischen Durchführung mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. Es besteht daher Bedarf an enzymkatalysierten Verfahren, die auch halbtechnisch oder technisch durchgeführt werden können und bei denen Cofaktoren benötigt werden.
Je umgesetztes Mol Substrat wird normalerweise auch 1 Mol des Cofaktors benötigt, welcher oftmals wesent¬ lich teurer ist als das zu gewinnende Produkt. Diese theoretisch unüberwindliche ökonomische Barriere kann nur dadurch genommen werden, indem man analog zu den in der lebenden Zelle ablaufenden Prozessen versucht - wie bei Enzymen üblich -/auch beim Cofaktor mit kata- lytischen Mengen auszukommen. Dazu benötigt man Cofaktor- Regenerationssysteme, deren Entwicklung in den letzten Jahren intensiv betrieben worden ist. Die Ergebnisse sind bisher jedoch noch bei weitem nicht optimal._ Die besten Resultate wurden bei enzymatischer Coenzym- Regeneration erhalten. Das einzige kurz vor einer größeren industriellen Anwendung stehende Verfahren be¬ trifft die Herstellung von L-Aminosäuren aus ent¬ sprechenden Ketosäuren durch reduktive enzymatische Transaminierung (M. . Kula, C.Wandrey Bioengineering 23_, S. 1341
(1981)). Für die Eegeneration des im übrigen an ein lösliches Polymere gebundenen Coenzyms wird dort ein zweites Enzym verwendet, welches während seiner Reaktion aus Ameisensäure ledig¬ lich nicht störendes CO- produziert, ein jedoch letzt- lieh nicht nutzbares Produkt.
In der DE-OS 33 26 546.1-42 (1983) wird dem¬ gegenüber erstmals ein technisch interessantes Ver¬ fahren beschrieben, bei welchem aus Gemischen von Glucose und Fructose, wie sie auch bei enzymtechnischer Hydrolyse aus Saccharose großtechnisch hergestellt werden, gleichzeitig zwei ökonomisch interessante Produkte erhalten werden. Während dabei Glucose durch Glucose-Dehydrogenase zu Gluconsäure oxidiert wird, ent- steht aus der Fructose in einer von Sorbitol- oder
Mannitol-Dehydrogenase katalysierten Reduktionsreaktion D-Sorbitol bzw. D-Mannitol. Das in der Oxidations- reaktion reduzierte Coenzym (NAD ^ NADH _-__,.) wird parallel mit der Fructose-Reduktion reoxidiert (NADH- <_-_• NAD ) , so daß es für einen weiteren Cyclus zur Verfügung steht und dieser Prozeß kontinuierlich _r.**_iProdukte bei Gegenwart nur katalytischer Mengen von Enzym und Coenzym liefern kann: D-Gluconsäure
D-Fructose
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D-Sorbitol
Figure imgf000005_0002
D-Fructose
In der Literaturstelle "Vitamin C" von U. Wintermeyer et al, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1981, werden verschiedene Synthesen von Vitamin C beschrieben. Es finden sich jedoch keine Hinweise zur großtechnischen Herstellung von Vitamin C unter Verwendung von Enzymen als Katalysatoren.
L-Ascorbinsäure (Vitamin C) wird großtechnisch nach wie vor nach dem von T. Reichstein und A. Grüssner (Helv. Chi . Acta V7, 311 (1934)) entwickelten chemischen Syntheseverfahren, ausgehend von D-Glucose, hergestellt.
In dem folgenden Reaktionsschema sind die Einzelschritte der von Reichstein und Mitarbeitern entwickelten industriellen Synthese von L-Ascorbinsäure aus D- Glucose dargestellt.
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
1 _) Dabei werden folgende Stufen durchlaufen: D-Sorbit, L-Sorbose, 2-Keto-L-gulonsäure, L-Ascorbinsäure. Nicht berücksichtigt wurden hierbei zwei Zwischenstufen, welche die Einführung von zwei Isopropyliden-Schutz- gruppen in L-Sorbose und ihre Abspaltung aus dem Oxi¬
2 Ü dationsprodukt dieses Derivates betreffen. Auch die chemische Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure erfordert diese Derivatisierung.
Jeder dieser Schritte ist mit erheblichen Ausbeutever-
..5 lusten infolge der Bildung von Nebenprodukten verbunden. Insbesondere wird ein kontinuierlicher Verfahrensablauf durch die bis heute aus stereochemischen Gründen er¬ forderliche mikrobiologische Oxidation von D-Sorbit zu L-≤orbose unterbrochen. Auch nach nunmehr jahrzehnte¬
3 U langer Produktionserfahrung mit der entsprechenden Fermentation durch z.B. Gluconobacter suboxydans oder Acetobacter xylinus treten bis heute erhebliche Schwierig¬ keiten bei der Durchführung dieses Schrittes auf (vgl. K. Dannhäuser, Chem. Rdsch. 27, 40 (1974)). Rein ^ chemische Reaktionsschritte führen jedoch bei weitem nicht zu vergl ichbaren Ergebnissen in Bezug auf die Stereospezifität dieser Oxidation und somit auf die Reinheit des Produkts. Die Gesamtausbeute bezogen auf eingesetzte Glucose beträgt ca. 60%.
In verschiedenen Laboratorien wurde in den letzten Jahren versucht, eine kontinuierliche Produktion von L-Sorbose mit Hilfe immobilisierter Mikroorganismen zu erreichen. Bisher ist jedoch kein hinreichend be¬ friedigendes Ergebnis erzielt worden. Außerdem muß auch hier mit ausbeutevermindernden Nebenprodukten und den daraus resultierenden Aufarbeitungsproblemen ge¬ rechnet werden.
Es ist eine Reihe rein chemischer Synthesen von L-Ascor- binsäuren entwickelt worden, die aber aus wirtschaft- liehen Gründen ebenfalls keine Anwendung gefunden haben (T.C. Crawford, S.A. Crawford, Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 21_, 79 (1980)).
Rein enzymatische Syntheseverfahren für Vitamin C sind bisher nicht beschrieben worden. J.P. Danehy (US-Patent 4,259,443, 1981) verwendet einen Extrakt aus keimenden Erbsensamen zur Umwandlung von Galactono-y-lacton in L-Ascorbinsäure. Dieser Schritt würde aber stöchio- metrische Mengen an Coenzym erfordern, was für ein Produktionsverfahren wirtschaftlich völlig untragbar wäre. Ganz davon abgesehen könnte dieser Prozeß in keinem Falle kontinuierlich geführt werden. Das bei der Verwen¬ dung einer Oxidase entstehende Nebenprodukt H-O-, würde zudem das Enzym sehr rasch inaktivieren.
In der US-PS 2,681,858 wird die enzymatische Spaltung der Lactose durch 3-Galactosidase in D-Galactose und D-Glucose beschrieben. Die Überführung der Glucose und Galactose in die entsprechenden Uronsäure bzw. Uron- säurederivate unter Verwendung von Schutzgruppen ist ebenfalls bekannt: (US-Patent 4,259,443 1981; C.L. Mehltretter et al J. Amer. Chem. Soc. 73_, 2424 (1951)) . Jedoch sind bei diesem bekannten Verfahren die erziel¬ ten Ausbeuten an Uronsäuren zu gering für eine ökonomische In der US-PS 4,259,443 wird ein Verfahren zur Herstel¬ lung von L-Ascorbinsäure aus Lactose
1) durch Hydrolyse der Lactose in D-Galactose und 5 D-Glucose;
2) Oxidation der D-Galactose und D-Glucose zu D-Galactu- ronsäure und D-Glucuronsäure;
3) Reduktion der D-Galacturonsäure und D-Glucuronsäure zu der L-Galactonsäure und L-Gulonsäure; 0 4) Überführung der letztgenannten Säuren in die ent¬ sprechenden y-Lactone und 5) enzymatische Oxidation der y-Lac one zu L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses bekannte Verfahren besitzt den Nachteil, daß es nicht kontinuierlich durchgeführt werden •- kann und daß die Ausbeuten sehr -niedrig sind.
Die Welt ahresproduktion an Vitamin C betrug im .Jahre 1981 ca. 35.000 Tonnen.- Davon wurde ein Großteil in er' Bundesrepublik Deutschland hergestellt. ü bύ bis 70% der Weltproüuktion an L-Ascorbinsäure gehen in die Lebensmittelindustrie. Es besteht daher ein steigender Bedarf an Vitamin C.
5 fjer vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- fanren zur Herstellung von Vitamin C zur Verfügung zu stellen, das in cecni≤cneii. und lalbtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann, bei αer Enzyme als Katalysatoren eingesetzt weruen unu welches die Regeneration der erforderlichen *-*1 cofaktoren ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren, b i dem Enzyme verwendet werden, soll auf wirtschaftliche Weise durchgeführt werden können, ohne daß untragbare Ver¬ luste entstehen. Es soll das gewünschte Produkt in hohen Ausbeuten ergeben. b
Insbesondere soll erfindungsgemäß ein einfaches Verfahren zur Hersteϊlunc von Vitamin C oder seinen Vorstufen bzw. Zwischenprodukten zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem Vitamin C bzw. seine Vorstufen oder Zwischenprodukte auf einfachere Weise und mit höheren Ausbeuten oder kosten¬ günstiger als bei den bekannten Verfahren hergestellt werden können. 5
Insbesondere soll ein rein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure bzw. Gemischen von D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure zur Verfügung gestellt werden. Es 10 soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem durch enzymatische/chemische Verfahren diese Uron- säuren aus Lactose oder anderen leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien, ie z.B. Glucose, Pectin, Alginsäure oder Gluconsäure, wirtschaftlich gewonnen werden können.
15
Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere das Ver¬ fahren zur Herstellung von Vitamin C oder seinen Vor¬ stufen oder Zwischenprodukten, soll, sich durch folgende Vorteile auszeichnen:
20
1. Verwendung von preiswerten Substraten, beispielsweise für die Vitamin-C-Herstellung Lactose, Glucose;
2. vollständige Verwertung der Substrate, beispielsweise der-Lactose;
25 - 3. keine Nebenprodukte bei den enzymatischen Schritten;
4. hoher Reinheitsgrad des gewünschten Endprodukts;
5. geringere Umwel belastung als bei chemischer Synthese;
6. das Verfahren soll kontinuierlich durchgeführt werden können;
30 7. es sollen kleinere Anlagen als bei einem chemischen Syntheseverfahren erforderlich sein und damit o. σeπn ere Investitionskosten benötigt werden.
_.3 Während gemäß DS-OS 33 26 546.1-42 (1983) eine - wenn auch produktive - Hilfsreaktion zur Cofaktor-Regeneration benutzt wurde, wird nun erfindungsgemäß ein Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration insbesondere am Beispiel der Synthese von L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für mehr¬ stufige enzymatische Synthesen, welche Oxidations- und Reduktionsschritte innerhalb der gleichen Synthese¬ kette enthalten.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen¬ tiellen Cofaktor-Regeneration bei enzymatischen Synthesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man im gleichen Reaktor oder in getrennten Stufen (D ein Substrat enzymatisch reduziert und das erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidations¬ produkt überführt oder (2) ein Sunstrat enzymatisch oxidiert und "das erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktions- produkt überführt und das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise isoliert, wooei für die gekoppelte Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktorspezifität besitzen. (Dieses Verfahren ist in den Figuren 1 und 3 bis 8 an einigen Beispielen erläutert. )
In dem folgenden Reaktionsschema ist der enzymatische Herstellungsprozeß für L-Sorbose aus D-Glucose mit intra¬ sequentieller Cofaktor- (hier NAD /NADH2> Regeneration darσestellt.
Figure imgf000011_0001
In den beigefügten Figuren 6 und 8 sind die enzymati¬ schen Reaktionen detaillierter dargestellt.
Mit dem erfindungsgemäßen- Verfahren ist es möglich, die Überführung eines primären Reaktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung eines primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere cofaktorunabhänge Zwischenstufen ab¬ laufen zu lassen, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder getrennt durchgeführt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den großen Vor¬ teil, daß es kontinuierlich und sowohl im halbtechni¬ schen als auch im technischen Maßstab durchgeführt wer¬ den kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den wesentlichen Vorteil, daß die Co aktoren auf einfache Weise regene¬ riert werden kennen, daß preiswerte Substrate eingesetzt werden können und die Substrate vollständig verwertet werden. Das erhaltene Endprodukt besitzt einen hohen Reinheitsgrad, so daß kaum oder keine Nebenprodukte ent¬ stehen, und die Umwel b lastung sehr gering ist. Die Investitions osten sind ebenfalls niedriσ. Die Oxidations-Reduktions-Reaktionen werden bei den Reaktionsbedingungen durchgeführt, wie sie normaler¬ weise für die Durchführung enzymatischer Reaktionen angewandt werden, beispielsweise liegt der pH-Wert im allgemeinen zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8.
Als Reduktionsenzym können beispielsweise L-Hexonat- Dehydrogenase, Äldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydro- genäse oder Lactat-Dehydrogenase, und als Oxidations- enzyme können L-Galactonsäure-(L-Gulonsäuire) -Lacton- Dehydrogenase und L-Galactonsäure-(L-Gulonsäure) - Lactonase und Inositol-1-phosphat-Synthase, Fructuronat- Dehydrogenase oder Malat-Dehydrogenasen verwendet werden.
Der Cofaktor wird bei dem.erfindungsgemäßen Verfahren nur in katalytischen Mengen verwendet und er kann in* freier Form oder an lösliche Polymere oder an Enzyme gebunden eingesetzt werden. Die Enzyme können in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.
Beispiele für Cofaktoren sind:
2+ 1 + Cu /Cu in freier oder komplexierter Form, Fe + /Fe +-Komplexe, wie K Fe(CN) g/K4Fe(CN)6 oder Cyto- chrorne c,
Riboflavin,
Benzochinon-Hydrochinon,
^T-Naphthochinon, ß-Naphthochinon, natürlich vorkommende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2 ,6-Dichlorphenolindophenol, o-Chlorophenolindo-2,6- dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyl- tetrazoliumchlorid, Phenzinmethosulfat,
Coenzyme, wie NAD NADH2, NADP / DPH2, Q0, Q2, Q6, Q7,
FAD/FADH-. und FMN. Bevorzugt werden die Redoxsysteme Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid (NAD /NADH-,) oder Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat (NADP+/NADPH2) , Fe +/Fe -Cyto- chrom c, 2 ,6-Dichlorphenol-indophenol oder Phenazin- ethosulfat eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut für die enzymatische Herstellung von Vitamin C geeignet. Dabei können, wie in Figur 2 dargestellt, die folgenden Ausgangsmaterialien verwendet werden.
(1) D-Galacturonsäure oder D-Galacturonsäure ent¬ haltenden natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
(2) D-Glucuronsäure oder D-Glucuronsäure enthaltende natürlich -vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
(3) D-Mannuronsäure oder D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
(4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D- Fructose enthaltende Dissaccharide;
(5) D-Galatose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;
( 6 ) D-Glucose , L-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo-* oder ύeteropolyglycane (vgl. das in Figur 4 dargestellte
Feakt ions schemn )
( 7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure ) oder myo- Inosιt_ol- 1 -phospha . (8) Pectine;
(9) Alginsäure (vgl. das in Figur 3 dargestellte Reak¬ tionsschema) ;
(10) Stärke, Maltose, Cellulose, Cellobiose oder Saccha¬ rose.
In Figur 7 ist ein weiterer Syntheseweg, •der von D-Glu- consäure ausgeht, dargestellt.
Die Galacturonsäure bzw. D-Galacturonsäure bzw. Mannuron- säure enthaltenden Homo- oder Heteropolyglycane werden chemisch oder enzymatisch hydrolysiert (vgl. Figur 1) . Die D-Galactose bzw. D-Glucose bzw. D-Mannose enthalten¬ den Homo- oder Heteropolymeren werden chemisch, mikro¬ biologisch oder enzymatisch zu den entsprechenden D-Ga¬ lacturonsäure bzw. D-Glucuronsäure bzw. D-Mannuronsäure enthaltenden Verbindungen oxidiert und dann hydrolysiert.
Als vorteilhafter Rohstoff zur Gewinnung von L-Ascorbin¬ säure kommt Pectin in Frage, welches sich zu 15 bis 30% in der Mittellamelle von Pflanzenzellwänden findet. Aus diesem Pectin (zum Beispiel aus Zuckerrübenschnitzeln) wird durch Angriff von Pectinmethylesterasen, Endo- und Exo-Polygalacturonasen, bevorzugt im pH-Bereich 4 bis 6, D-Galacturonsäure erzeugt. Die verwendeten Enzympräpara- ' te müssen zur Erzielung einer hohen Ausbeute an D-Ga¬ lacturonsäure unbedingt lyasefrei sein, da andernfalls Δ-4-5-ungesättigte D-Galacturonsäure-Derivate entstehen, die nicht zu L-Ascorbinsäure weiterumgesetzt werden kön¬ nen.
Durch Reduktion von D-Galacturonsäure zu L-Galactonsäu- re mittels L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) bzw.
Hexuronat-Reductase (EC 1.1.1.19) erhält man L-Galacton- säure, deren γ-Lactose bevorzugt enzymatisch-oxidativ weiter umgesetzt werden kann zu 2-Keto-L-galactonsäure (bzw. deren γ-Lacton) . In bekannter, nicht enzymatisch zu katalysierender Weise erhält man aus dieser Verbin- düng durch Umlagerung L-Ascorbinsäure (vgl. Figur 1) .
Die Disaccharide werden chemisch, mikrobiologisch oder enzymatisch oxidiert und darauf folgend enzyma'tisch oder chemisch hydrolysiert, oder sie werden enzymatisch oder chemisch in ihre monomeren Bestandteile gespalten.
Die Monosaccharide werden enzymatisch oder chemisch zu den entsprechenden Uronsäuren oxidiert. Das chemische Verfahren erfordert die Einführung und spätere Entfer- nung von Schutzgruppen.
Stärke, Maltose, Cellobiose oder Saccharose werden enzy¬ matisch in myo-Inositol umgewandelt und dann enzymatisch über Glucose-1-phosphat zu D-Glucuronsäure oxidiert.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, bei dem als Substrat D- Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet wird. Ein Gemisch dieser beiden Säuren erhält man beispielsweise durch chemische oder enzymatischeOxidation zusammen mit einer Hydrolyse aus Lactose.
Die beiden genannten Säuren oder das Gemisch der Säuren werden enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert, und diese werden gegebenenfalls in ihre Lactone oder ein Gemisch der Lactone überführt. Die Säuren oder ein Gemisch der Säuren bzw. die Lactone oder ein Gemisch der Lactone werden dann enzymatisch zu den entsprechenden 2-Keto- Säuren oxidiert und zu Ascorbinsäure umgelagert, welche in an sich bekannter Weise isoliert wird.
Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß im gleichen Reaktor nicht nur die Oxidations- und Reduktions-Reaktionen, sondern auch Zwischenreaktionen, wie beispielsweise die Lactonisierung oder Überführung der Säuren in andere Derivate durchgeführt werden kann. Anhand der beigefügten Figur 5 wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Lactose näher erläutert.
In einer ersten Verfahrensstufe wird dazu aus Lactose durch chemische oder enzymatische Oxidation in Kombina¬ tion mit einem Hydrolyseschritt ein Gemisch von D-Galactu¬ ronsäure und D-Glucuronsäure gewonnen. In einem zweiten enzymkatalysierten Reduktionsprozeß wird aus diesen beiden D-Uronsäuren unter Konfigurationsumkehr (Inversion) ein Gemisch von L-Galactonsäure und L-Gulonsäure erzeugt. Die daraus durch enzymatische Oxidation erhältlichen 2-Keto- L-Galactonsäure und 2-Keto-L-Gulonsäure bzw. deren y - Lactone (Stufe 3) gehen unkatalysiert in L-Ascorbinsäure (Vitamin C) über.
Durch Auswahl geeigneter Enzyme (E1 , E,) mit kompatiblen Cofaktoren lassen sich der Reduktionsschritt (Stufe 2, E.,) und der Oxidationsschritt (Stufe 3, E' 2) miteinander zu einem kontinuierlichen Prozeß verknüpfen. Mit diesen konjugierten Redoxreaktionen wird gleichzeitig für eine kontinuierliche Regeneration der in den von -E bzw. E-, katalysierten Einzelschritten jeweils benötigten Coenzyme (Redoxsysteme) gesorgt, so daß diese nur in katal tischen Mengen eingesetzt zu werden brauchen.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anfallenden End¬ produkte können in an sich bekannter Weise abgetrennt werden und müssen aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Sie können beispielsweise durch Absorptionschromatogra¬ phie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromato- graphie, fraktionierte Kristallisation, Elektrodialyse oder elektrodialytische Fokussierung abgetrennt bzw. isoliert werden.
Die bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Vitamin C verwendete D-Glucuronsäure kann ebenfalls -erfindungsgemäß durch enzymatische Reduktion von D- Mannuronsäure zu D-Mannonsäure und anschließende Oxi¬ dation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure hergestellt werden. Damit kommt auch Alginsäure als preis- wertes Ausgangsmaterial in Frage (vgl. Figur 3) .
L-Sorbose ist ein Zwischenprodukt zur Herstellung von Vitamin C, und diese Verbindung kann aus D-Glucose oder aus D-Fructose hergestellt werden. D-Glucose oder D-Fructo- se werden enzymatisch zu D-Sorbitol reduziert, und D-Sor¬ bitol wird enzymatisch zu L-Sorbose oxidiert (vgl. Fig. 6,8)
Es ist ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß eine Umwandlung der D-Formen in die ge- wünschte L-Form auf enzymatische Weise erfolgen kann. Derartige Umwandlungen sind sonst nur schwer zu errei¬ chen und werden in der Reichstein-Synthese deshalb mikro¬ biologisch vorgenommen (vgl. die obigen Reaktionsschemata). Die erfindungsgemäßen Oxidations-Reduktionsreaktionen können beispielsweise in einem Reaktor mit Ultrafiltra¬ tionsmembran durchgeführt werden, wobei ein Cofaktor- system verwendet wird, das an ein wasserlösliches Polymeres mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 5000 und 30.000 Dalton gebunden ist. über die Membran des Reaktors wird eine Druckdifferenz erzeugt, und hinter der Membran wird kontinuierlich ein Produkt¬ strom abgeführt.
Erfindungsgemäß kann man als Membranen Hohlfasern ver ¬ wenden, .die in ihrer Struktur asymmetrisch aufgebaut sind, wobei die für Enzyme und polymergebundene Coenzyme undurchlässige selektive Schicht der Membran auf der Außenseite der Hohlfaser liegt, während die Innenseite der Faser Poren enthält, die auch für die Enzyme und Coenzyme durchlässig sind.
Die Substratlösung wird dann auf der Innenseite der Hohlfasermembran eingeführt, zwischen der Innen- und Außenwand der Faser wird eine hydrostatische Druck¬ differenz erzeugt, so daß die Substratlösung durch die innere Faserwand hindurchgeht und die enzymatischen Reaktionen bevorzugt im porösen Stützmaterial zwischen Innenwand und Außenwand ablaufen.
Durch geeignete Wahl der hydrostatischen Druckdifferenz kann man den Durchsatz der Substrate so einstellen, daß ihre Aufenthaltszeit in der Hohlfaserwand ausreicht, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die eigentliche für Enzyme und polymergebundene Cofaktoren undurch¬ lässige selektive Schicht der Membran auf der Innenseite der Hohlfaser liegen und die enzymatische Reaktion im ■ Lumen der Hohlfaser ablaufen. Zu der Reaktionslösung kann man gegebenenfalls ein Schutzprotein in einer Menge,
4 die dem 1- bis 10 fachen der Menge der beteiligten Enzyme entspricht, zusetzen.
Das Gemisch aus Restsubstrat, Produkt, Enzym und Co- faktor kann auch durch ein Membranmodul durchgeströmt 5 werden, dessen Membranporen so ausgestaltet sind, daß sie nur das Produkt sowie Restsubstrat hindurchlassen, die übrigen Komponenten jedoch zurückhalten, wobei letztere wieder in den Reaktor zurückgeführt werden.
10. Die im Reaktor gemeinsam vorliegenden Enzyme können verschiedene Halbwertszeiten ihrer Inaktivierung auf¬ weisen. Um über einen längeren Zeitraum hinweg den Reaktor funktionsfähig zu halten, werden die Enzyme dem Reaktor in einem Aktivitätsverhältnis zwischen
15 10:1 und 1:10 zugefügt, wobei das Enzym mit der schnelleren Inaktivierung anfangs im Überschuß vorliegt. Auch durch Nachdosierung einzelner gelöster Enzyme oder des Cofaktors während des Produktionsprozesses können die Substrat- umsatzraten je Zeiteinheit von Vorwärts- und Rückwärts-
20 reaktion wieder aufeinander abgestimmt werden.
Einige-der benötigten Enzyme sind wie im Falle der Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) aus Schafsleber oder Candida utilis,_oder der Lactat-Dehydrogenase
25 (EC 1.1.1.27) aus verschiedenen tierischen Geweben oder der Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.38) aus Schweineherz oder der Pectinasen (als Pectinol K oder rohament P) im Handel erhältlich. letztere Quellen können auch zur Reindarstellung pectinolytischer Enzyme verwendet
30 werden.
Die weiteren Enzyme lassen sich z.B. aus folgenden Quellen isolieren:
35 Sorbitol-DH EC 1 . 1 . 1 . 1 4 Lactobacillus brevis , ( Iditol-DH) Zymomonas mobilis , Gluconobacter xylinum Acetobacter suboxydans
Glucuronat-Peduktase 1 . 1 . 1 . 1 9 Leber, Hefen
L-Hexonat-Dehydrogenase 1 . 1 . 1 .20 Erwinia carotevora, Euglenia gracilis, Erb sen, S. cerevisiae, Saccharomyces lipolytic Lipomyces starkeyi, Schwanniomyces ocσiden talis, Aspergillus nige u.a. Hefen
Aldose-Reduktase 1.1.1.21 Leber, Zymomonas mobil Pichia stipidis, B. ma cerans
Lactat-DH 1.1.1.27 Bacillus subtilis,
Schweinemuskel, B. ste rothermophilus
Malat-DH 1.1.1.37 Neurospora crassa, Sch neherz, B.subtilis, B. stearσt mophilus, Thermus. ther philus
Malat-DH, 1.1.1.38 Bakterien decarboxylierend 1.1.1.39 Streptococcus faecalis
Fructuronat-Reduktase 1.1.1.57 Bakterien
Mannitol-DH (NAD) 1.1.1.67 Bakterien, Hefen
5-Ketogluconat-Reduk- 1.1.1.69 Gluconobacter, Kleb- tase AD (P) siella, E. coli
L-Sorbose-DH 1.1.1.123 Gluconobacter sp. ,
Lactobacillus brevis, E.coli
Fructose-b-DH 1.1.1.124 Gluconobacter cerinus
Mannuronat-DH 1.1.1.131 Aeromonas Mannitol-DH (NADP) 1.1.1.138 lactobacillus brevis, Penicillium chrysogenum
Polyol-DH 1.1.1.139 Saccharomyce s
L-Aldono-_.-lacton- 1.1.3.8 Serratia, Saccharo- Oxidase myces cerevisiae, Pseudomonas, Grün¬ algen, Leber
Mannitol-DH 1.1.2.2 Aerobacter sub-
(Fe-Cytochrom c) oxidans, Bac. poly- myxa
Mannonat-DH 1.2.1.34 Bakterien
L-Aldono-. -lacton-DH 1.3.2.3 Erbsen, Blumenkohl, Hefen
myo-Inositol-Oxi- 1.13.99.1 Rattenhiere, Pflan¬ genäse zen
Phosphorylase 2.4.1.1 Kartoffeln, Tomaten
Saccharose-Phos- 2.4.1.7 Pseudomonas saccha- phorylase rophilia
Maltose-Phosphory- 2.4.1.8 Leuconostoc läse mesenteroides
Cellobiose-Phos- 2.4.1.20 Bakterien phoryla≤e
Phosphoglucose utase 2.7.5.5 Bakterien
Pectinrrethvlesterase 3.1.1.11 Aspergillus niger
L -Aldonolac tonase 3.1.1.18 Leber, Grünalgen Phytin-3-phos- 3.1.3.8 Bakterien phatase
myo-Inositol-1* 3.1.3.25 Aspergillus sp., phosphatase Hefe
Phytin-6-phos¬ 3.1.3.26 Pflanzen phatase
Endo-Polygalac- 3.2.1.15 Aspergillus niger turonase
Exo-Polygalacturo- 3.2.1.67 Pectinol K, Rohament nase P, Äpfel, Zitrus- früchte
Exo-Poly-^- 3.2.1.82 dto , Erwin ia
Galacturonosidase
Glucuronat- Isomerase 5 . 3 . 1 . 1 2 E.coli
myo-Inositol-1- 5.5.1.8 Schwanniomyces phosphat-Synthase occidentalis, Can- dida utilis
L-Sorbose-DH Bacillus, Hefen, Gluconobacter mela- noαenum
L-Sorboson-DH Acetobacter suboxi- dans, Gluconobacter melanogenum
L-Sorboson-Oxidase Pseudomonas putida,
Gluconobacter melanogenum Älginasen ' Alginobacter, Algino- monas, Alginovibrio Actinomyces Pseudomonas maltophi- lia, Pseudomonas pu- tida
Aerobacter, Aeromonas, Bacterium, Bacteroides Klebsiella, Vibrio

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehrstufigen enzymatischen Synthesen, dadurch ge ¬ k e n n z e i c h n e t , daß man im gleichen Reaktor oder auch einzeln (1) ein Substrat enzymatisch reduziert und das dabei erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidationspro¬ dukt überführt oder
(2) ein Substrat enzymatisch oxidiert und das dabei erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktionspro¬ dukt überführt und
das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise iso¬ liert, wobei für die gekoppelten Vorgänge der Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktor- Spezifität besitzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Überführung des primären Reduktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung des primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere von dem jeweils betroffenen Cofaktor unabhängige Zwischenstufen abläuft, die im gleichen Reaktor oder auch einzeln durch¬ geführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß es kontinuierlich durch¬ geführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß bei der Oxi- dations-Reduktions-Reaktion der pH-Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, gehalten wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als
Reduktionsenzyme beispielsweise L-Hexonat-Dehydrogenase, Aldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydrogenase oder Lactat- Dehydrogenase, als Oxidationsenzyme L-Galactonsäure-(L- Gulonsäure)-Lacton-Dehydrogenase, Inositol-1-phosphat- Synthase, Fructuronat-Dehydrogenase oder Malat-Dehydro- genasen verwendet werden.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch- g e k e n n z e i c h n e t , daß der Cofaktor in katalytischen Mengen verwendet wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als Cofaktor Cu /Cu in freier oder komplexierter Form oder Fe /Fe -Komplexe, wie K Fe (CN) g/K Fe (CN) - oder Cytochrome c, Riboflavin, Benzochinon/Hydrochinon, «.-Naphthochinon, ß-Naphthochinon oder natürlich vorkom- mende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2,6-Dichlor- phenolindophenol, o-Chlorphenolindo-2,6-dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyltetrazolium- chlorid, Phenazinmethosulfat, oder Coenzy systeme, wie NAD+/NADH2, NADP+/NADPH2, Q0, Q2, Q6, Q7, FAD/FADH und FMN, verwendet werden, bevorzugt jedoch die Redox¬ systeme Nicotin_.mid-Adenin-Dinucleotid (NAD+/NADH2) oder
Nicotinamid-Adenin-Dinucleo_tid-Phosphat (NADP' /NADPH-) ,
2+ 3+ ^
Fe /Fe -Cytochrome c, 2,6-Dichlorphenol-Indophenol oder Phenazinmethosulfat eingesetzt werden.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch g e k e n n z-e l e h n e t , daß der Cofaktor in freier Form oder an Partikel oder an lös- liehe Polymere oder an Enzyme gebunden und die Enzyme in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur enzymatischen Herstellung von L-Ascorbin- säure , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Substrat D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet, das jeweilige Substrat enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulon¬ säure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert und L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder ein Gemisch dieser Säuren in die entsprechenden y-Lactone oder das Gemisch der y-Lactone enzymatisch oder chemisch in an sich bekannter Weise überführt, das erhaltene '-Lacton oder das Gemisch aus den ;--'-Lactonen enzymatisch zu 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-L-galactonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren bzw. zu den .'-Lactonen oder einem Gemisch der '--Lactone oxidiert und in an sich bekannter Weise zu L-Ascorbinsäure umlagert und das Produkt gewinnt, wobei alle enzymatischen Reaktio- nen im gleichen Reaktor oder auch getrennt durchgeführt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß bei der Reduktion als Enzyme L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) oder Glucuronat- Reduktase (EC 1.1.1.19), bei der Oxidation L-Aldono- - lacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) oder L-Aldonsäure-^-lacton- Dehydrogenase (EC 1.3.2.3) verwendet werden und daß die Überführung der -onsäuren in die y-Lactone durch eine L-Aldonolactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure erfolgt.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von D-Glucuronsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
i. D-Mannuronsäure enzymatisch zu D-Mannonsäure reduziert wird;
ii. die D-Mannonsäure anschließend enzymatisch zu D-Fructuronsäure oxidiert wird und
iii. die Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure isomeri- siert wird,
wobei'alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- zeln durchgeführt werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus Glucose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
i. D-Glucose zu D-Sorbitol unter Verwendung einer Aldose-Reduktase (EC 1.1.1.21) enzymatisch re¬ duziert wird und
ü. D-Sorbitol zu L-Sorbose enzymatisch unter Ver¬ wendung einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol- Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) oder L-Sorbose-De- hydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,
wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder aber sepa¬ rat durchgeführt werden.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
i. . D-Fructose zu D-Sorbitol enzymatisch unter Ver¬ wendung von Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) bzw. iner Polyoldehydrogenase (EC 1.1.1.139) reduziert wird.
ii. D-Sorbitol zu L-Sorbose unter Verwendung von einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol-Dehydro- genase oder L-Sorbo≤e-Dehydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,
wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
i. D-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose-Reduktase aus Gluconobacter cerinus (EC 1.1.1.124) zu 5-Keto-Fructose enzymatisch oxidiert wird und
ii. 5-Keto-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose- Reduktase aus Hefe (EC 1.1.1.124) enzymatisch zu L-Sorbose reduziert wird,
wobei die beiden komplementären Reaktionen jeweils im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden .
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
5 i. L-Sorbose zu L-Sorboson unter Verwendung von
L-Sorbose-Dehydrogenase ls Enzym oxidiert wird und
ii. L-Sorboson unter Verwendung von L-Sorboson-Oxi- 0 dase oder L-Sorboson-Dehydrogenase zu 2-Keto-L- gulonsäure oxidiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n - 5 z e i c h n e t , daß die beiden oxidativen Dehydrcgenase-ϊteak- tionen, die zur Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sor¬ bose führen, mit der reduktiven Umsetzung von D-Fructose zu Mannitol mittels Mannitol-Dehydrogenase' gekoppelt wird, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- Q zeln durchgeführt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Ausgangsmaterialien
5 ( 1 ) D-Galacturonsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohle¬ hydrate ;
(2) D-Glucuronsäure enthaltende natürlich vorkommende 0 oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;
(3) D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;
5 (4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose enthaltende Disaccharide; (5) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;
(6) D-Glucose, D-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo- oder Heteropolyglykane;
(7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure) oder myo-Inositol-1-phosphat;
(8) Pectine;
(9) Alginsäure;
(10) Stärke, Maltose, Cellobiose, Lactose oder Saccharose verwendet werden.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von L-Ascorbinsäure -aus Pectinen durch
(1) . enzymatische Hydrolyse des Pectins zu Pectinsäure bei pH 4-9;
(2) enzymatische Hydrolyse der Pectinsäure zu D-Galacturon¬ säure bei pH 4-6; (3) Lactonisierung der D-Galacturonsäure zu ihrem -Lacton;
(4) Reduktion der Galacturonsäure bzw. ihres -Lactons zu L-Galactonsäure bzw. dessen ι -Lacton;
(5) Oxidation des L-Galactonsäure-; -lactons zu 2-Keto- L-Galactonsäure-. -lacton sowie Umlagerung zu L-Ascorbinsäure,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
a) die Stufen (1) und (2) getrennt oder in einem ge¬ meinsamen Reaktor durchgeführt werden; b) die Stufen (3) , (4) und (5) gemeinsam in einem Reaktor durchgeführt werden;
c) die Hydrolyse-Reaktionen (1) und (2) enzymatisch ablaufen;
d) die Bildung des L-Galactonsäure- -lactons (3) enzymatisch oder chemisch vorgenommen wird;
e) die Reduktion der D-Galacturonsäure bzw. ihres )i-Lactons zu L-Galactonsäure (4) bzw. ihres y- Lactons enzymatisch erfolgt;
f) die Oxidation des L-Galactonsäure-,}-lactons zu 2-Keto-L-galactonsäure-γ-lacton enzymkatalysiert abläuft und
g) die Reaktionen (4) und (5) über ein gemeinsames Redoxsystem (Cof aktor System) miteinander verknüpft sind.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß der gekoppelte Reduktions- (7) und Oxidationsprozeß (5) mit Hilfe des intersequentiellen Regenerationssystems g) kontinuierlich durchgeführt werden kann.
20. Verfahren nach Anspruch 10 oder 19, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Hydrolyseenzym (1) Pectinmethylesterase (EC 3.1.1.11) , als Hydrolyseenzym (e) (2) ein Komplex oder ein Gemisch aus Endo-Polygalacturonase
(EC 3.2.1.15) und Exo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.67) sowie Exo-Poly-Λ-D-Galacturonosidase (EC 3.2.1.82) , als Reduktionsenzym (4) eine L-Hexonat-Dehydrogenase oder eine D-Glucuronat-Reduktase (EC 1.1.1.19), zur Bildung des entsprechenden -Lactons (3) eine L-Aldono-
Lactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure, und als Oxidationsenzym eine L-Galactonsäure-^'-lacton Dehydrogenase verwendet werden.
21." Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von Ascorbinsäure aus Alginsäure durch
(1) Hydrolyse der Alginsäure zu D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure;
(2) Reduktion der D-Mannuronsäure zu D-Mannonsäure;
(3) Oxidation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und
(4) Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuron¬ säure;
(5) Umwandlung von D-Glucuronsäure in L-Ascorbin¬ säure gemäß Anspruch 9,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
a) die Stufen (2) , (3) und (4) gemeinsam in einem Reaktor- durchgeführt werden;
b) die Hydrolysereaktion (1) enzymatisch oder chemisch abläuft;
c) die Reduktion von D-Mannuronsäure zu D-Mannon¬ säure (2) enzymatisch erfolgt;
d) die Oxidation von D-Mannonsäure zu D-Fructuron¬ säure (3) enzymatisch katalysiert wird;
e) die Isomerisierung von D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure (4) sowohl chemisch als auch enzymatisch durchgeführt werden kann, und
f) die Reaktionen (2) und (3) über ein gemeinsames Redoxs stem (Cofaktorsyste ) miteinander verknüpft sind.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß der gekoppelte Reduktions- (2) und Oxidationsprozeß (3) mit Hilfe des intrasequentiel¬ len Cofaktor-Regenerationssystems kontinuierlich durch- führbar ist.
23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, 21 oder 22, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß die hydrolytische Spaltung der Alginsäure (1) mit verdünnten Säuren oder enzymatisch durch alginolytische Enzyme, wie
Polyuronasen (Alginasen), erfolgt, für den Reduktions¬ schritt (2) eine D-Mannuronat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.131) oder eine I ^___nnonat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.34) , für den Oxidationsschritt (3) eine Fructuronat-Reduktase
(EC 1.1.1.57) und für die Isomerisierung zu D-Glucuron- säure (4) eine Glucuronat-iso erase (EC 5.3.1.12) oder eine verdünnte Säure verwendet werden.'
24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur enzymatischen Herstellung von D-Glucuronsäure aus -stärke, Saccharose, Maltose, Cellobiose oder Phytinsäure durch
(1) phosphorolytische Spaltung der betreffenden Poly- oder Disaccharide zu Glucose- 1 -phosphat;
(2) Umwandlung zu Glucose-6-phosphat ;
(3) oxidative Cyclisierung zu Inositol-1 -phosphat ;
(4) Hydrolyse des Phosphatrests in 1 -Stellung;
(5) Oxidation des myo-Inositols zu D-Glucuronsäure oder
(6) Hydrolyse der Phosphatreste von Phytinsäure (myo- Inositol-hexaphosphat ) und anschließende Oxida¬ tion gemäß (3) , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
a) die phosphorolytische Spaltung (1) enzymatisch erfolgt;
b) die Umwandlung (2) enzymatisch durchgeführt wird;
c) die oxidative Bildung des Cyclitols (3) enzyma- tisch erfolgt;
d) die Abspaltung der Phosphatreste (4) , (6) durch enzymatischen Angriff oder chemisch erfolgt und
e) die Oxidationsreaktion (5) enzymatisch durchge¬ führt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24 zusammen mit dem Ver¬ fahren der Ansprüche 9 oder 10, dadurch g e k e n n - z e i c h n e t , daß die oxidative Cyclisierung von Glucose-6-phosphat zu myo-Inositol-1-phosphat (3) mit der Reduktion von D-Glucuronsäure (bzw. ihrem y-Lacton) zu Gulonsäure (bzw.1 ihrem •.' -Lacton) über einen gemein¬ samen Cofaktor (Redoxsystem) miteinander verknüpft ist und diese beiden Reaktionen gemeinsam mit (4) und (5) im gleichen Reaktor kontinuierlich ablaufen und in diesem Fall die weitere Oxidation von L-Gulonsäure-y- lacton zu 2-Keto-L-gulonsäure- -lacton durch eine Oxidase (EC 1.1.3.8) katalysiert wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die phosphorolytische Spaltung von Stärke oder Saccharose (1) mit Phosphory- lasen (EC 2.4.1.1; EC 4.2.1.7, EC 2.4.1.8) erfolgt-und die Umwandlung (2) eine Phosphoglucomutase (EC 2.7.5.5) , für den Prozeß der oxidativen Cyclisierung (3) eine myo- Inositol-1-phosphat-Synthase (EC 5.5.1.8) , für die hydrolytische Abspaltung der Phosphatreste (4), (6) spezifische Phosphatasen (EC 3.1.3.8; EC 3.1.3.25; EC 3.1.3.26), für die Oxidationsreaktionen zu D- Glucuronsäure (5) eine myo-Inositol-Oxygenase (EC 1.13.99.1) und für die Oxidation von L-Gulonsäure- y-lacton eine L-Gulonolacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) ver¬ wendet werden.
27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D- Gluconsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
i. D-Gluconsäure zu 5-Keto-D-gluconsäure durch 5-Keto- gluconat-Reduktase (EC 1.1.1.69) oxidiert wird und
ii. 5-Ketogluconat durch eine Idonat-Dehydrogenase aus Brevibacterium oder Fusarium zu L-Idonsäure redu¬ ziert wird und nachfolgend
iii. L-Idonsäure durch Enzyme aus Pseudomonas, Aceto¬ bacter oder Micrococcen zu 2-Keto-L-gulonsäure oxi¬ diert wird und
iv. gleichzeitig D-Fructose durch Sorbitol-Dehydrogena¬ se (z.B. EC 1.1.1.14) zu D-Sorbitol oder durch Man¬ nitol-Dehydrogenase (z.B. EC 1.1.1.67) zu Mannitol reduziert wird.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß
i. die enzymatische Oxidation von D-Gluconsäure zu 5- Keto-D-gluconsäure mit der enzymatischen Reduktion von D-Fructose zu D-Sorbitol oder D-Mannitol gekop¬ pelt wird und dadurch der gemeinsame Cofaktor rege- neriert wird und damit kontinuierlich gearbeitet werden kann und
die nachfolgende Reduktion von 5-Keto-D-gluconsäu- re zu L-Idonsäure mit der vom gleichen Cofaktor ab¬ hängigen enzymatischen Oxidation von L-Idonsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure zu einem intrasequentiellen Co- faktorregenerationssystem verknüpft wird.
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