UA76117C2 - A process for a stable producing ethanol - Google Patents

Description

12. Спосіб за п.8, який включає зниження швидко- 20. Спосіб за п.1, в якому при згаданій кількості сті подачі згаданого газоподібного субстрату для пантотенату кальцію підтримується переважне ослаблення інгібування субстратом і підтримання вироблення етанолу відносно вироблення ацета- згаданої продуктивності. ту. 13. Спосіб за п.8, який включає зниження згаданої 21. Спосіб за п.1, в якому згадана кількість панто- швидкості перемішування для ослаблення інгібу- тенату кальцію складає від 1 до 25 мкг пантотена- вання субстратом і підтримання згаданої продук- ту кальцію/г сухих клітин вироблених бактерій. тивності. 22. Спосіб за п.1, в якому згадана кількість панто- 14. Спосіб за п.3, що включає подачу в згаданий тенату кальцію складає від 2 до 25 мкг пантотена- біореактор згаданого газоподібного субстрату при ту кальцію/г сухих клітин вироблених бактерій. швидкості від 0,3 до 2 ммоль СО/г сухих клітин 23. Спосіб за п.17, який додатково включає етап бактерій в згаданому біореакторі за хвилину. запобігання акліматизації згаданих бактерій в зга- 15. Спосіб за п.14, в якому кількість СО, присутня в даному біореакторі до згаданої кількості пантоте- згаданому біореакторі, перевищує кількість, що нату кальцію шляхом регулювання параметрів, потрібна для підтримання стабільної концентрації вибраних з групи, що включає швидкість газу, згаданих бактерій, при якій буде повністю викорис- швидкість рідини та швидкість перемішування. таний присутній СО. 24. Спосіб за п.8, в якому згадане поживне сере- 16. Спосіб за п.14, в якому згадана кількість СО, довище додатково містить кобальт в кількості від 5 присутня в згаданому біореакторі, підтримує пере- до 100 мкг/г сухих клітин бактерій, вироблених в важне вироблення етанолу в порівнянні з ацета- згаданому біореакторі. том. 25. Спосіб за п.24, в якому згадана кількість коба- 17. Спосіб за п.14, в якому згадана швидкість льту менше, ніж потрібно для підтримання стабі- складає від 0,5 до 1,5 ммоль СО/г сухих клітин льної концентрації згаданих бактерій, при якій бу- бактерій в згаданому біореакторі за хвилину. де повністю використаний присутній кобальт. 18. Спосіб за п.б, в якому згаданий газоподібний 26. Спосіб за п.24, в якому при згаданій кількості субстрат містить монооксид вуглецю, діоксид вуг- кобальту підтримується переважне вироблення лецю та водень, причому присутній надлишок во- етанолу в порівнянні з ацетатом. дню по відношенню до зазначених монооксиду 27. Спосіб за п.24, в якому згадана кількість коба- вуглецю та діоксиду вуглецю, і де зазначений над- льту складає від 20 до 50 мкг кобальту/г сухих клі- лишок водню викликає вироблення згаданими ба- тин вироблених бактерій. ктеріями в згаданому ферментаційному бульйоні 28. Спосіб за п.24, який додатково включає етап високого відношення етанолу до ацетату. запобігання акліматизації згаданих бактерій в зга- 19. Спосіб за п.1, в якому згадана кількість панто- даному біореакторі до згаданої кількості кобальту тенату кальцію є меншою, ніж це потрібно для шляхом підтримання постійної концентрації коба- підтримання стабільної концентрації згаданих бак- льту і регулювання параметрів, вибраних з групи, терій, при якій буде повністю використаний прису- що включає швидкість газу, швидкість рідини, тній пантотенат кальцію. швидкість перемішування і парціальний тиск газо- подібного водню.

Даний винахід стосується вдосконалених спо- сяться, наприклад, екстракція, дистиляція або їх собів мікробної ферментації для отримання ета- комбінації, а також інші ефективні способи виді- нолу з газоподібного субстрату, що містить що- лення. Бактерії можна видаляти з водної фази і найменше один відновний газ, з використанням повертати в біореактор для підтримання високих анаеробних (або факультативних) ацетогенних концентрацій клітин і максимально високої продук- бактерій. тивності. Клітини відділяють, якщо це бажано,

Авторами цього винаходу попередньо були центрифугуванням, шляхом мембранної фільтра- описані способи виробництва етанолу, в числі ін- ції або іншими способами. |Див., наприклад, між- ших органічних кислот, спиртів, водню і солей ор- народну патентну заявку МоМуО98/00558, публ. 8 ганічних кислот, шляхом мікробної ферментації січня 1988; патент США Ме5,807,722; патент США газоподібних субстратів у середовищі, яке містить Ме5,593,886 і патент США Ме5,821,1111. поживні речовини і мікроелементи, з використан- Крім основного продукту, яким є оцтова кисло- ням певних анаеробних бактерій. Наприклад, ав- та, штами анаеробної бактерії Сіовілашт тори описували введення розбавлених газових Ципдаданіїї здатні також виробляти етанол у якості сумішей у біореактор, що містить один або декіль- продукту перетворення монооксиду вуглецю (СО), ка штамів анаеробних бактерій, які прямим шля- водню (Нг) і діоксиду вуглецю (СО2). Вироблення хом використовують компоненти відпрацьованого оцтової кислоти (СНЗСООН) і етанолу (СеН5ОНн) з газу з отриманням бажаної сполуки. Цю сполуку СО, Со» і Не відбувається згідно з такими загаль- виділяють з водної фази в окремому резервуарі ними стехіометричними рівняннями: або резервуарах відповідним способом виділення 460О12Н20-»хСНнНЗІСООНІі200» (1) цільового продукту. До способів виділення відно- АН» -2005-»СНУСООнНА2НгО (2)

6бСОЗнНгОо-»СоНоОнНнаСо» (3) У.Васіегіо!., 770(6):2809; Тапегладейп еї аї., 1996 бНоя 2002-»С2Н»ОнНяЗНгО (4) Аррі. Місгобіо!. Віотесппо)., 46:17 6).

До штамів С |иподапйії відносяться, наприклад, Таким чином, в даній області техніки залиша- штам РЕТС |патент США Ме5,173,429|, штам ЕКІ2 ється актуальною задача вирішення проблеми

Іпатент США Ме5,593,886)| і штами С-01 і 0-52 Іпа- використання промислових газоподібних субстра- тент США Меб,136,577|. Все ці штами депоновані в тів, можливості отримання істотної вигоди від ви-

Атегісап Туре Сиіште СоПесіоп, 10801 Опімегейу користання таких газів, зокрема, таких відпрацьо-

Вошемага, Мапаввзав, МА 20110-2209 під інвентар- ваних газів, як Не, СО і СО». Існує також задача ними номерами 55383 (раніше АТСС Ме49587), збільшення вироблення і етанолу відносно вироб- 55380, 55988 і 55989, відповідно. Кожний з штамів лення інших продуктів, які звичайно отримуються

С. Ципдадапії є анаеробною грам-позитивною бак- ферментацією таких газів ацетогенними бакте- терією з гуаніновим і цитозиновим (3) нуклеоти- ріями. дним вмістом близько 22мольнихов. Для росту ці Відповідно до вказаної вище задачі, цей вина- бактерії використовують різноманітні субстрати, за хід стосується нових способів безперервної дії, які винятком метанолу або лактату. Ці штами відріз- є стійкими і забезпечують отримання етанолу з няються один від одного СО-толерантністю, пито- концентрацією більше 10г/л при концентрації аце- мими швидкостями поглинання газу і питомою тату менше «У8-10г/л, з одночасним підтриманням продуктивністю. У "диких" штамах, що зустріча- росту культури і її доброї стабільності. ються в природі, відмічений надто низький рівень У першому аспекті винахід стосується стабіль- вироблення етанолу. Штами С. |иподдапйії в "дико- ного способу безперервного вироблення етанолу му" стані відмінно функціонують при 372С і зви- шляхом анаеробної бактеріальної ферментації чайно виробляють етанол і ацетил (що включає і газоподібного субстрату. Спосіб включає етапи вільну, або молекулярну, оцтову кислоту, і її солі) культивування в ферментаційному біореакторі у співвідношенні близько 1:20 (1 частина етанолу анаеробних, ацетогенних бактерій в рідкому живи- на 20 частин ацетилу). Концентрації етанолу зви- льному середовищі і подачу в біореактор газопо- чайно становлять лише 1-2г/л. Хоча ця здатність дібного субстрату, який містить щонайменше один виробляти етанол і представляє інтерес, однак відновний газ, вибраний з групи, що включає СО і через низьку продуктивність "дикі" бактерії не мо- Н». Бактерії в біореакторі піддаються впливу шля- жуть бути використані для економічного виробниц- хом зниження окисно-відновного потенціалу або тва етанолу в промисловому масштабі. збільшення відношення МАД(Р)Н до МАОД(Р) в фе-

При невеликих удосконаленнях живильного рментаційному бульйоні після досягнення бактері- середовища вищезазначені штами С Пипдааніїї ями сталого стану, наприклад, стабільної концент- були використані для виробництва етанолу і аце- рації клітин в біореакторі. Концентрацію вільної тилу зі співвідношенням продуктів 1:1 (рівні части- оцтової кислоти в біореакторі підтримують на рівні ни етанолу і ацетилу), однак концентрація етанолу менше 5г/л. Етапи культивування і впливу забез- складала менш 10г/л, внаслідок чого продуктив- печують вироблення бактеріями в біореакторі ета- ність не перевищувала 10г/л в день. Крім того, нолу в ферментаційному бульйоні з продуктивніс- існують проблеми зі стабільністю культури, голов- тю більше 10Ог/л на день. Етанол і ацетат ним чином через відносно високу (8-10г/л) концен- виробляються в ферментаційному бульйоні в спів- трацію ацетилу (2,5-З3г/л молекулярної оцтової відношенні від 11 до 20:1. кислоти) в присутності етанолу. Більш того, оскіль- У одному з варіантів здійснення цього способу ки для збільшення вироблення етанолу збільшу- вплив включає один або декілька наступних ета- ється вміст газу, то відбувається інгібування куль- пів: зміна щонайменше одного параметра, вибра- тури, спочатку молекулярною оцтовою кислотою, а ного з групи, що включає склад живильного сере- потім СО. В результаті культура стає нестабіль- довища, швидкість подачі поживних речовин, ною, втрачає здатність поглинати газ і виробляти швидкість подачі води, робочий тиск, робоча рн, додатковий продукт. Далі, в попередній роботі склад газоподібного субстрату, швидкість подачі авторів показана складність вироблення етанолу і газу, швидкість перемішування ферментаційного ацетилу в співвідношенні більше 2:1 при роботі бульйону, інгібування продуктом, щільність клітин і бактерій в сталому стані. (Див., наприклад, Кіаззоп інгібування субстратом. еї а!., 1990 Арріїєд Віоспетіву апа Віоїесппоіоду, У іншому варіанті здійснення цього способу

Ргосеєдіпдз ої (Ше 1117 Зутровіт оп Віоїесппоіоду вплив включає подачу в згаданий біореактор зга- тог Риєїв апа Спетісаїів, 24/25: 857; РПйЇїрзе еї аї., даного газоподібного субстрату, що містить відно- 1993 Арріїєй Віоспетівігу апа Віогеснпоіоду, вний газ СО, при заданій швидкості поглинання.

Ргосеєаіпдв ої (пе 14? бутровіцт оп Віоїесппоіоду Ця швидкість переважно складає від 0,3 до тюг Ре апа Спетісаї!5, 39/40: 559, та ін). 2ммоль СО/грам сухих клітин бактерій в згаданому

У багатьох джерелах описана ферментація біореакторі за хвилину. цукру анаеробними бактеріями, які відрізняються У наступному варіанті здійснення цього спосо- від С Циподаанйії і не споживають СО, СО? і Не для бу вплив включає подачу в згаданий фермента- вироблення розчинників. Були зроблені спроби ційний біореактор згаданого живильного середо- отримати високий вихід етанолу шляхом зміни вища, що містить обмежену кількість пантотенату таких різноманітних параметрів, як типи поживних кальцію. Пантотенат кальцію переважно міститься речовин, мікроорганізми, специфічне додання від- в кількості від 0,5 до 50мкг/г сухих клітин бактерій, новних агентів, варіювання рН і додання екзоген- що виробляються в біореакторі. них газів. (Див., наприклад, Боїбпвівїп еї а!., 1986 У наступному варіанті здійснення способу ви-

У.ВасіегіоІ.,, 165(1 ):319-320; Іомій еї аї., 1988 користовують подачу надлишку відновного газу Нг2 в згаданий біореактор до подачі обмеженої кілько- робництва, в якому виробляється основна частина сті пантотенату кальцію. етанолу.

У наступному аспекті винахід стосується спо- У наступному аспекті винаходу спосіб, описа- собу, в якому етап впливу включає подачу в зга- ний вище, включає необов'язкові етапи виділення даний ферментаційний біореактор згаданого жи- етанолу шляхом видалення ферментаційного бу- вильного середовища, що містить обмежену льйону з біореактора, дистиляції етанолу з буль- кількість кобальту. Кобальт переважно міститься в йону і відбір етанолу. Додатково або переважно, кількості від 5 до 100мкг/г сухих клітин бактерій, зразок бульйону піддають центрифугуванню для що виробляються в згаданому біореакторі. видалення клітин і за допомогою газової хромато-

У наступному варіанті здійснення спосіб за ви- графії контролюють підтримання співвідношення. находом включає запобігання акліматизації згада- У наступному аспекті спосіб за винаходом мо- них бактерій в згаданому біореакторі до згаданої же додатково включати етап рециркуляції води кількості кобальту шляхом підтримання постійної (що містить до 5г/л ацетилу) з реактора дистиляції концентрації кобальту і регулювання одного або етанолу назад в реактор для того, щоб в реакторі декількох параметрів, таких як швидкість газу, встановилася рівновага між етанолом і ацетилом. швидкість рідини, швидкість перемішування і пар- Внаслідок цього для вироблення етанолу викорис- ціальний тиск газоподібного Н». товується більша кількість СО, СОзг і Но, що пода-

Додаткові необов'язкові етапи цих способів ються в реактор і перетворюються в продукти. включають центрифугування зразка бульйону для Інші аспекти і переваги цього винаходу описані видалення клітин і контролю підтримання співвід- нижче в докладному описі переважних варіантів ношення і/або продуктивності методом газової його здійснення. хроматографії. На Фіг.1 представлена принципова схема спо-

У наступному варіанті здійснення спосіб вклю- собу безперервної ферментації з виділенням про- чає подачу у якості газоподібного субстрату деякої дукту за винаходом. Газоподібний субстрат 1 і кількості Нг при невеликому перевищенні стехіо- рідку живильне середовище 2 подають в біореак- метричної кількості, що потрібна для вироблення тор 3, в якому міститься відповідна бактеріальна етанолу. культура. Перетворення газоподібного субстрату в

У наступному варіанті здійснення газоподібний етанол і оцтову кислоту здійснюється в біореакторі субстрат додатково містить СО при невеликому 3. Відхідний газ 4, що містить такі гази, як непере- перевищенні кількості, потрібної бактеріям, при творені СО, СО» і Не та інші гази, виводиться з цьому поглинання бактеріями водню інгібується, і біореактора 3, і його використовують у якості па- відношення МАС(Р)Н до МАФД(Р) в бульйоні збіль- лива або спалюють в факелі. Якщо застосовується шується. Рециркуляція клітин, тоді рідкий ефлюент 5 напра-

У наступному варіанті здійснення способу пе- вляють у сепаратор клітин 6, де клітини 7 відділя- редбачено етап, на якому інгібування молекуляр- ють від пермеату 8. Клітини 7 направляють назад ною оцтовою кислотою знижують шляхом збіль- в біореактор 3, а пермеат 8 направляють на виді- шення швидкості подачі води, коли молекулярна лення продукту. Етанол може бути виділений з оцтова кислота, присутня в ферментаційному бу- пермеату 8 (або, в альтернативі, з ефлюенту 5, льйоні, досягає або перевищує концентрацію 2г/л. якщо сепарація клітин не використовується). Пер-

У наступному варіанті здійснення способу етап меат 8 розділяють в дистиляційній колоні 9 з впливу може включати перемішування середови- отриманням дистилятного 95956-го етанолу 10 і ща, бактерій і газоподібного субстрату в біореак- кубової води 11, яку направляють назад в біореак- торі із заданою швидкістю перемішування. Напри- тор 3. Дистилятний 95956-ний етанол 10 пропуска- клад, зниження швидкості перемішування знижує ють через молекулярне сито 12, де цільовий кін- кількість СО, що переноситься в ферментаційний цевий продукт у вигляді безводного етанолу 13 бульйон. При такій зниженій швидкості перенесен- відокремлюють від розбавленого етанолу 14, який ня СО відбувається збільшення перетворення Не», направляють назад в дистиляційну колону 9. внаслідок чого кількість відновного газу Не в біоре- На Фіг.2 представлена принципова схема дво- акторі перевищує кількість, потрібну для росту ступеневої системи реакторів СТЕ. з безперерв- бактерій. Подібним чином, також може бути зни- ним перемішуванням (С5ТК - Сопіїписив Зйтей жена швидкість газу для зменшення кількості СО, Тапк Кеасіог) для більш високої стабільності куль- що переноситься, за рахунок чого збільшується тури. На стадію росту С5ТЕ 1 подають рідке сере- перетворення Н», внаслідок чого відновний газ Но довище 2. Неперетворений газ З зі стадії виробни- присутній в ферментаційному біореакторі в над- цтва С5ТЕ 4 подають на стадію росту СЗТ 1. На лишку порівняно з необхідною для росту бактерій стадію виробництва С5ТЕ 4 веде лінія подачі сві- кількістю. жого газу 5, лінія подачі свіжого середовища 6, а

У наступному варіанті здійснення способу кон- також лінія подачі культури 7 зі стадії росту СЗТ центрація клітин бактеріальної культури в біореак- 1. Рециркуляція клітин 8 використовується для торі на початковій стадії може бути доведена до отримання максимального вироблення від клітин бажаної перед тим, як обмежують концентрацію 9, що направляються на стадію виробництва пантотенату кальцію або кобальту в живильному С5ТВ 4. Клітини 9 не повертаються на стадію рос- середовищі. ту С5ТК 1. Рідкий продукт 10, який складається з

У наступному варіанті здійснення способу за розчину етанолу в ферментаційному бульйоні, винаходом використовують двоступеневий біореа- направляють на дистиляцію, де з нього виділяють ктор СЗТК, який включає реактор росту, з якого цільовий продукт у вигляді безводного етанолу, як ферментаційний бульйон подають в реактор ви- це показано на Ффіг.1.

Даний винахід включає способи анаеробної Не. У найбільш переважному варіанті здійснення ферментації газоподібних субстратів, що містять газоподібний субстрат містить СО, Со» і Н». Інші щонайменше один відновний газ, зокрема, газопо- субстрати за винаходом можуть включати згадані дібні компоненти промислових відходів і синтез- вище компоненти і, щонайменше, один такий газ, гази (наприклад, СО, Со? і Не), в етанол. Ці спосо- як азот, СО», етан або метан. Таким чином, ці суб- би забезпечують отримання етанолу з продуктив- страти містять те, що звичайно називають "синтез- ністю більше 10г/л в день шляхом впливу з вико- газ", який утворюється при газифікації вуглецевих ристанням біологічних процесів відповідних продуктів (включаючи метан), а також відпрацьо- бактерій. Один зі способів за винаходом спричиняє вані гази різних промислових виробництв. утворення надлишку МАС(Р)Н над МАФД(Р). Окис- Вираз "відновний газ" стосується СО або Ну», нення МАД(Р)Н в МАД(Р) приводить до відновлен- або обох цих газів. Вираз "кількість відновного газу ня оцтової кислоти, що виробляється культурою, в більша, ніж потрібно для росту бактерій" означає етанол. В альтернативі, один зі способів вироб- таку кількість відновного газу, яка перевищує кіль- лення високих концентрацій етанолу шляхом ана- кість, яку бактерії можуть використати для росту еробної ферментації за винаходом включає зни- або метаболізму при даних інгредієнтах живильно- ження окисно-відновного потенціалу го середовища. Ця кількість може бути досягнута ферментаційного бульйону і, таким чином, віднов- шляхом збільшення загальної кількості відновного лення оцтової кислоти в етанол. Способи за вина- газу, або шляхом зниження концентрації ключових ходом забезпечують високі концентрації етанолу поживних речовин, внаслідок чого надлишкова (більше -10г/л, переважно більше -«15г/л) і низькі кількість газу досягається без збільшення подачі концентрації ацетату (менше «5г/л вільної оцтової газу, або шляхом збільшення швидкості доставки кислоти в біореакторі). У цих способах також здій- газу до бактерій. Коли бактерії зазнають впливу снюється ефективне управління параметрами те- більшої кількості відновного газу, ніж потрібно для хнологічного процесу, які потрібні для безперерв- росту, вони реагують збільшенням вироблення ного вироблення етанолу і оцтової кислоти, і етанолу. забезпечується швидке відновлення системи при Вираз "відповідні бактерії" означає ацетогенні збоях технологічного процесу. Крім того, способи анаеробні (або факультативні) бактерії, які здатні за винаходом допомагають запобігти акліматизації перетворювати СО і воду або Н»5 і СО» в етанол і культури до низької концентрації поживних речо- оцтову кислоту. Корисні бактерії за винаходом вин, згубної для продуктивності культури. Даним включають, але не обмежені, штами Асеюдепійт винаходом забезпечується надійний промисловий Кімиі, Асеюрасієйт моодії, Асеїоапаєгобійт спосіб виробництва етанолу. поїегає, Сіовігідіпт асеїйсит, Вшугпрасіейит

Ї. Визначення теїпуіоїорнпісит, б. асеюршу!їїсит, с

Якщо не вказано інше, то перелічені нижче те- Іептоасеїїсит, Еирасієгішт Пйтозит, С. Ципдаанії рміни, що використовуються в даному описі, ма- РЕТС, б. Циподанії ЕВІ2, С. Ципдаанії С-01, б. ють такі визначення. Циподааніїї О-52 і Реріозігеріососсив ргодисіив5. Фа-

Вираз "спосіб безперервної дії" стосується хівцями в цій області можуть бути вибрані інші способу ферментації, який включає безперервні ацетогенні анаеробні бактерії для використання в процеси подачі живильного середовища, подачі цих способах. субстрату, продукування клітин в біореакторі, ви- Під "змішаними штамами" слід розуміти змі- далення клітин (або очищення) з біореактора і шану культуру з двох або більш відповідних бак- видалення продукту. Ці безперервні процеси по- терій. Такі "змішані штами" перелічених вище бак- дачі, видалення або продукування клітин можуть терій можуть бути використані в способах за здійснюватися в одному або в різних потоках. Без- винаходом. перервний процес забезпечує досягнення сталого Терміни "біореактор", "реактор" або "фермен- стану всередині біореактора. Під "сталим станом" таційний біореактор" означають ферментаційний слід розуміти, що всі ці змінні величини, які можуть пристрій, який складається з одного або більше бути виміряні (швидкості подачі, концентрації суб- резервуарів і/або колон або системи трубопрово- страту і живильного середовища, що підтримують- дів, який включає бак-реактор з безперервним ся в біореакторі, концентрація клітин в біореакторі перемішуванням СТІК (Сопііїпиои5 стей Тапк і швидкість видалення клітин з біореактора, швид- Кеасіог), реактор для іммобілізованих клітин ІС кість видалення продукту з біореактора, а також (Ітторбії:еа Сеї! Кеасіог), реактор з шаром струй- параметри середовища типу температури і тиску) ної течії рідини ТВЕ (Ттгісіє Вей Кеасіог), барбота- залишаються постійними у часі. жну колону, газліфтний ферментер, статичну мі-

Вираз "газоподібний субстрат" означає тільки шалку або інший пристрій, придатний для

СО, або суміш СО і Н», або суміш СоОзх і Н», або створення газорідинного контакту. У способі за суміш СО, СО» і Не, можливо, змішані з іншими винаходом переважно, щоб ферментаційний біо- елементами або сполуками, включаючи азот і ме- реактор містив реактор росту, з якого фермента- тан в газоподібному стані. Такі газоподібні субст- ційний бульйон поступає у другий ферментаційний рати містять гази або потоки, які звичайно випус- біореактор, в якому виробляється основна частина кають або викидають безпосередньо в атмосферу продукту - етанолу. або спалюють. У деяких варіантах здійснення цьо- Вираз "живильне середовище" тут використо- го способу газоподібний субстрат містить СО. У вується загалом для позначення звичайного сере- інших варіантах здійснення цього способу газопо- довища для бактеріального росту, яке містить ві- дібний субстрат містить СО» і Не. У деяких варіан- таміни і мінерали в достатній для росту вибраних тах здійснення газоподібний субстрат містить СО і відповідних бактерій кількості. Цукор в це середо-

вище не входить. Компоненти різноманітних живи- етанолу і ацетату 5:1 або більше. льних середовищ, придатні для використання в "Надлишок Нг" присутній в стадії виробництва цьому винаході, відомі і описані в попередніх пуб- етанолу, коли відношення молей Не» в газі, що по- лікаціях, включаючи публікації авторів цього вина- дається, до суми подвоєної кількості молей перет- ходу. Див., наприклад, склади живильних середо- вореного СО і потроєної кількості молей перетво- вищ, описані (в міжнародній патентній заявці реного СО» перевищує 1,0. Якщо це відношення

МеуУуО98/00558, патенті США Мое5,807,722, патенті менше 1,0, то надлишок Н» відсутній, і етанол мо-

США Ме5,593,886 і патенті США Ме5,821,111ї, а же бути вироблений тільки за допомогою іншого також в перелічених вище публікаціях. Типове ла- регулюючого механізму. бораторне живильне середовище для виробницт- ІІ. Біологічні процеси, що використовуються в ва ацетату з СО, СО» і Но за винаходом містить способі за винаходом

О,9мг/л пантотенату кальцію, тоді як відоме типове Не претендуючи на створення теорії, автори лабораторне живильне середовище для виробни- зробили припущення, що способи збільшення цтва етанолу з СО, СО» і Нео містить 0,02мг/л пан- анаеробного вироблення етанолу в технологічних тотенату кальцію. процесах, описаних тут, засновані на біологічних

Вираз "обмежуючий субстрат" або "обмежую- процесах, що включають перетворення МАС(Р)Н в ча поживна речовина" означає речовину живиль- МАД(Р) в основних циклах ацетогенного процесу ного середовища або газоподібного субстрату, яка автотрофного росту. Винахід включає такий вплив під час росту бактеріальної культури в біореакторі на ці процеси, який забезпечує можливість безпе- вичерпується культурою до рівня, при якому вже рервного виробництва і підтримання високих кон- не підтримується сталий стан або стабільний бак- центрацій етанолу при низьких концентраціях аце- теріальний ріст в біореакторі. Таким чином, всі інші тату в стабільних робочих умовах, що дозволяє речовини в живильному середовищі або газоподі- реалізувати ефективне в промислових масштабах бному субстраті присутні в надлишку і є "необме- виробництво етанолу з промислових газів. жуючими". Ознака обмеження полягає в тому, що Суть перетворення МАБ(Р)Н в МАФД(Р) в біоло- збільшення швидкості додання в культуру обме- гічних процесах описується таким чином. Вироб- жуючого субстрату, тобто, швидкості подачі пожи- лення етанолу з газоподібних компонентів, таких вної речовини або швидкості подачі газу, спричи- як СО, Со» і Не, здійснюється біологічним шляхом няє відповідне збільшення швидкості поглинання в три етапи. На першому етапі субстрати СО і Но газу (ммоль газу в хвилину) внаслідок збільшення окиснюються, і при цьому вивільняється МАС(Р)Н: щільності клітин. МАД(Р)- МАД(Р)Н

Якщо не вказано інше, то вираз "ацетат" вико- СОННА НгО-»СО»-4 ня ристовується для позначення суміші молекулярної Продукти етапу 1 потім перетворюються в оц- або вільної оцтової кислоти і її солей, присутньої в тову кислоту на етапі, який потребує МАД(Р)Н: ферментаційному бульйоні. Співвідношення моле- МАД(Р)Н-»МАВД(Р) кулярної оцтової кислоти і ацетату залежить від СОзСО2-6Н"-УСсНнЗУСООнНАНгО

РН системи: що нижче рН при постійній концент- Нарешті, якщо реакція етапу 1 здійснюється зі рації "ацетату", то вище концентрація молекуляр- швидкістю більшою, ніж швидкість реакції етапу 2, ної оцтової кислоти відносно її солей. і утворюється надлишок МАФ(Р)Н, то оцтова кис-

Вираз "концентрація клітин" в даному описі лота відновлюється в етанол: означає кількість бактерій в сухій вазі на літр зраз- МАО(Р)Н-»МАОД(Р) ка. Концентрація клітин вимірюється прямим вимі- снСООнНАН" хСоНООонНаеНО рюванням або шляхом обчислення з вимірювань Таким чином, наявність надлишку МАД(Р)Н оптично густини , внаслідок окиснення субстрату приводить до ви-

Вираз "природний стан" означає будь-яку спо- роблення етанолу з оцтової кислоти. луку, елемент або середовище, де не містяться Відомі два основні цикли в ацетогенному про- додаткові електрони або протони до присутніх цесі: (1) цикл ацетил-СоА і (2) цикл ТНЕ, в якому звичайно. | навпаки, вираз "відновлений стан СО» відновлюється в метильну групу. Послідов- означає будь-яку сполуку, елемент або середови- ність подальшого вироблення етанолу і оцтової ще, де є один або декілька електронів у надлишку. кислоти показана у .). В. Рпійірз еї аї, 1994 Арріїєй

Відновлений стан досягається шляхом додання Віоспетізіу апа Віоїесппоіоду, 45/46:145. Цикл одного або більше електронів до природного ста- ацетил-СоА має внутрішній цикл, що називається ну Іі зниження окисно-відновного потенціалу фер- тут СО-циклом. Оскільки СО-цикл звичайно відбу- ментаційного бульйону. , вається за годинниковою стрілкою, то фередоксин ' Продуктивність вироблення етанолу означає відновлюється. Фередоксин, по мірі того як він об'ємну продуктивність, розраховану як відношен- окиснюється в реакції, що каталізується фермен- ня концентрації етанолу в сталому стані до трива- том гідрогеназою, також може відновлюватися за лості утримання рідини (ІКТ) в системах безпере- допомогою Не. У результаті цикл ацетил-СоА та- рвної дії, або відношення концентрації етанолу до кож відбувається за годинниковою стрілкою, і від- часу, потрібного для отримання цієї концентрації в бувається окиснення фередоксину. Якщо внутріш- системах періодично! дії. Вираз висока продукти- ній СО-цикл і цикл ацетил-СоА здійснюються з вність вироблення етанолу" означає об'ємну про- однаковою швидкістю, фередоксин знаходиться в дуктивність понад 1ог/л в день. , окисно-відновній рівновазі. Однак, якщо ці два й Вираз "висока концентрація етанолу означає цикли здійснюються з різними швидкостями, тобто, більше "Ог/л, переважно більше 15г/лп етанолу в якщо СО-цикл відбувається з більшою швидкістю, ферментаційному бульйоні, або співвідношення ніж цикл ацетил-СоА, то накопичується відновле-

ний фередоксин. Крім того, при надлишку Н» від- методом. Наприклад, клітини виділяють із зразка, новлений фередоксин також може вироблятися в зокрема, шляхом центрифугування, і потім аналі- надлишку. Цей надлишок відновленого фере- зують вільний від клітин зразок, переважно мето- доксину викликає регенерацію (відновлення) дом газової хроматографії. Проте досвідченими

МАД(Р) в МАД(Р)Н, надлишок якого, який накопи- фахівцями в цій області можуть бути вибрані і інші чується, повинен бути знижений до рівноваги, в аналітичні методики. Додаткові необов'язкові ета- процесі чого оцтова кислота відновлюється в ета- пи способу можуть бути введені для досягнення нол. мМабо підтримання потрібного співвідношення. У

Цикл ТНЕ має певне значення для клітинного Прикладі 2 показаний такий метод аналізу. росту і потрібний для процесу безперервного ку- Процес впливу на компоненти системи і підт- льтивування, тому він не може бути повністю зу- римання і/або досягнення заданої продуктивності пинений. Зниження швидкості циклу ТНЕ також вироблення етанолу або співвідношення етанолу і підвищує відношення МА(Р)Н до /МАФ(Р). ацетату включає щонайменше один, а переважно -

МАФ(Р)Н окиснюється в двох місцях. Шляхом об- комбінацію таких етапів: зміна складу живильного меження цього окиснення, яке буде підтримувати середовища, швидкості подачі живильного сере- загальне клітинне відношення МАД(Р)Н до МАС(Р) довища, швидкості подачі води, робочого тиску, в рівновазі, МАД(Р)Н використовується для відно- робочої рН, складу газоподібного субстрату, шви- влення оцтової кислоти в етанол. дкості подачі газу, швидкості перемішування фер-

Другий основний спосіб відновлення оцтової ментаційного бульйону, етап запобігання |інгібу- кислоти в етанол складається в прямому зниженні ванню продуктом, зниження щільності клітин в окисно-відновного потенціалу ферментаційного біореакторі або запобігання інгібуванню субстра- бульйону. Відновлений стан, коли окисно- том. Деякі переважні впливи включають подачу в відновний потенціал істотно нижче, ніж в природ- біореактор рідкофазної обмежуючої поживної ре- ному стані культури, зумовлює надлишок МАД(Р)Н човини (пантотенату або кобальту), створення і сприяє відновленню оцтової кислоти в етанол. невеликого надлишку СО і Н»5 в газі, що подається,

ПШ. Способи за винаходом мінімізацію концентрації ацетату, запобігання

Основні етапи способу викладені далі. Спосіб акліматизації культури до низьких концентрацій безперервної ферментації з виділенням продукту поживних речовин в рідкій фазі, доведення куль- описаний з посиланням на фіг.1 і на основі приве- тури до потрібної концентрації клітин з відносно деного нижче Прикладу 1. Безперервний потік га- високою швидкістю, підйом рН культури вище 4,5, зоподібного субстрату 1, що містить щонайменше очищення біореактора від бактеріальних клітин до один відновний газ, наприклад, СО або Ну, із зада- отримання концентрації клітин нижче концентрації ною швидкістю і безперервний потік рідкого живи- сталого стану, при якій використовується весь від- льного середовища 2 із заданою швидкістю пода- новний газ або поживні субстрати в біореакторі, і ються в ферментаційний біореактор 3, що містить збільшення швидкості подачі води в той момент, відповідні бактерії. У біореакторі З середовище і коли частина вільної оцтової кислоти в ацетаті, газоподібний субстрат ферментуються бактеріями присутньому в ферментаційному бульйоні, пере- з утворенням етанолу і оцтової кислоти. Коли до- вищує 2г/л, за рахунок чого відвертається небажа- сягається стабільна концентрація клітин в умовах не збільшення концентрації вільної оцтової кисло- сталого стану, компоненти безперервного процесу ти. Всі ці етапи детально описані нижче. піддають впливу, який знижує окисно-відновний Відхідний газ 4, що містить не перероблені в потенціал або підвищує відношення МАС(Р)Н до реакторі СО, СО» і Н?5 і інші гази, відводять з реак-

МАД(Р) в ферментаційному бульйоні. При цьому тора через вентиляційні канали і використовують концентрація вільної оцтової кислоти в біореакторі відповідно до їх теплотворної здатності. Якщо у підтримується на рівні менше 5г/л. Способи за якості контрольного показника використовують винаходом забезпечують і підтримують вироблен- надлишок Нг, то параметрами контролю співвід- ня етанолу і ацетату в ферментаційному бульйоні ношення етанолу і ацетату на цьому етапі є парці- таким чином, щоб продуктивність вироблення ета- альний тиск Не у відхідному газі і відношення пар- нолу складала більше 10г/л в день при співвідно- ціального тиску Нг до парціального тиску СОг у шенні етанолу і ацетату від 1:1 до 20:1. В одному з відхідному газі. Для збільшення концентрації клі- варіантів здійснення це співвідношення складає тин всередині біореактора і, таким чином, поси- більше 3:1. У іншому варіанті здійснення це спів- лення біокаталізатора для перетворення СО, СОг і відношення складає більше 5:1. У третьому варіа- Не, може бути використана (але не обов'язково) нті здійснення це співвідношення складає більше рециркуляція клітин. У цьому випадку рідкий 10:11. У наступному варіанті здійснення це співвід- ефлюент з реактора 5 направляють у сепаратор ношення складає більше 15:1. Спосіб за винахо- клітин 6, де відбувається його розділення на кліти- дом ефективний для забезпечення стабільного ни 7 і пермеат (рідину, що не містить клітин) 8. безперервного (здійснюваного в сталому стані) Клітини 7 направляють назад в біореактор 3, а отримання з СО, СО» і Но високих концентрацій пермеат 8 направляють на виділення продукту. етанолу (15-35г/л етанолу) і низьких концентрацій Клітини відокремлюють за допомогою ацетату (0-5г/л ацетату), а саме, при співвідно- центрифуги безперервної дії, фільтраційної сис- шенні етанолу і ацетату 3:1 або більше, при добрій теми на основі порожнистих волокон або спіраль- стабільності технологічного процесу. них фільтруючих елементів, керамічної фільтру-

Періодично в ході технологічного процесу за вальної системи або іншого сепаратора винаходом відбирають зразки бульйону для ви- рідин/твердих речовин. Етанол може бути виділе- значення співвідношення звичайним аналітичним ний з пермеату (або, в альтернативі, ефлюенту з реактора 5, якщо сепарація клітин не використову- МАД(Р)Н, а отже, збільшує вироблення етанолу у ється) різними способами, включаючи дистиляцію і якості кінцевого продукту. адсорбцію. Пермеат 8 розділяють в дистиляційній Дефіцит пантотенату існує тоді, коли кількість колоні з отриманням дистилятного 9595-го етанолу пантотенату кальцію вмкг, яка подається в реактор ї води 11, яку направляють назад в біореактор на 1г клітин (суха вага), що виробляються в реак- 3. Оборотна вода 11 містить поживні речовини, які торі, знаходиться в діапазоні від 0,5 до 100. Більш не були використані при ферментації. Вітаміни, переважна дефіцитна кількість пантотенату ле- якщо вони були присутні після ферментації або жить в діапазоні від 2 до 75мкг пантотенату каль- клітинного лізису, в процесі термічної дистиляції цію на грам сухих клітин, що виробляються в реак- руйнуються. Дистилятний 9595-й етанол 10 пропу- торі У іншому варіанті ця кількість складає скають через молекулярне сито 12, де безводний близько 1-25мкг пантотенату кальцію на грам клі- етанол 13 - цільовий кінцевий продукт - відокрем- тин, що виробляються в реакторі. У наступному люють від розбавленого етанолу 14, який направ- варіанті ця кількість складає близько 10-3Омкг пан- ляють назад в дистиляційну колону 9. тотенату кальцію на грам клітин, що виробляються

Безперервні і одночасні процеси росту, заги- в реакторі. При такій кількості поживної речовини белі і видалення клітин забезпечують підтримання підтримується переважне вироблення етанолу в постійної концентрації клітин, внаслідок чого спо- порівнянні з ацетатом. Один з варіантів цього спо- сіб безперервної дії, що використовується у виро- собу показаний в Прикладі 4. бництві етанолу (і малих кількостей оцтової кисло- У іншому аспекті даного способу відвертається ти), може здійснюватися протягом багатьох місяців акліматизація бактерій в ферментаційному біореа- при подачі СО, СО?» і Не і поживних речовин без кторі до низької обмежуючої концентрації пантоте- поповнення культури. У способах за винаходом нату кальцію за рахунок регулювання параметрів підтримуються і контролюються умови для безпе- ферментації таким чином, що концентрація панто- рервного виробництва етанолу і оцтової кислоти і тенату кальцію залишається постійною, в той час відвертаються або швидко усуваються збої техно- як щонайменше один, а іноді декілька параметрів, логічного процесу. У способах за винаходом також таких як швидкість подачі газу, швидкість подачі відвертається згубна для продуктивності аклімати- рідини, швидкість перемішування або парціальний зація культури до низької концентрації поживних тиск Н», регулюється. Істотних змін концентрацій речовин. У приведеному нижче описі і в прикла- поживних речовин не відбувається, навпаки, збері- дах, якщо не вказано інше, тиск дорівнює 1 атмо- гається відносно постійна концентрація живильно- сфері, а значення температури становить 36-41". го середовища. Якщо дозволити культурі акліма-

Температури і тиски можуть бути задані досвідче- тизуватися до низького вмісту рідкофазних ним фахівцем в цій області в залежності від мікро- обмежуючих поживних речовин, то утворюються організму, вибраного для використання в біореак- несприятливі значення співвідношення продуктів - торі. 1,0г етанолу/г ацетату або менше, і технологічний

Різноманітні впливи, детально описані нижче, процес стає необоротним. У цьому випадку реак- які здійснюються в доповнення до основних етапів тор припиняє роботу і потрібна реінокуляція. Пе- за винаходом, дозволяють збільшити вироблення реважно, біологічний процес контролюють з метою етанолу. Переважно, обмеження рідкофазної по- збільшення вироблення етанолу і обмеження ви- живної речовини (пантотенату або кобальту) або роблення оцтової кислоти так, щоб спочатку газ, використання надлишку Не або СО є етапами спо- що подається в біореактор, містив надлишок Н», а собу за винаходом, які детально описані і які вико- потім обмежують вміст пантотенату кальцію в жи- ристовуються для досягнення і підтримання зада- вильному середовищі, як описано вище. ної продуктивності вироблення етанолу («| Фактично, при запуску системи обмежуюча забезпечення стабільних концентрацій і співвід- рідкофазна поживна речовина пантотенат кальцію ношень етанолу і ацетату в ферментаційному бу- звичайно міститься в надлишку, що запобігає льйоні. У переважному варіанті здійснення відно- акліматизації до його низьких концентрацій, яка шення продуктів етанолу і ацетату, що може привести до дуже низької продуктивності виробляються в ферментаційному бульйоні, скла- культури і втрати культурою здатності забезпечу- дає більше 10:1, а концентрація етанолу - більше вати високу продуктивність вироблення етанолу 15г/л. на рівні більше 10г/л в день, якщо надлишок Не не

А. Обмеження пантотенатом кальцію використовується. Приклад такого регулювання

В одному з окремих варіантів здійснення дано- параметрів ферментації для конкретної бактеріа- го винаходу вплив на біологічні процеси, який льної культури показаний в Прикладі 17. сприяє виробленню етанолу і обмежує вироблен- В. Обмеження кобальтом ня оцтової кислоти, включає обмеження кількості У іншому варіанті здійснення цього винаходу пантотенату кальцію в поживному середовищі до вплив на біологічні процеси, який сприяє вироб- величини, яка є меншою, ніж це потрібно для підт- ленню етанолу і обмежує вироблення оцтової кис- римання стабільної і сталої концентрації бактерій, лоти, полягає в обмеженні кількості кобальту в при якій може бути повністю використаний присут- живильному середовищі до величини, яка є мен- ній пантотенат кальцію. Пантотенат є компонен- шою, ніж це потрібно для підтримання стабільної і том циклу ацетил-СоА, і тому за рахунок дефіциту сталої концентрації бактерій, при якій може бути пантотенату кальцію в поживному середовищі повністю використаний присутній кобальт. Дефіцит швидкість циклу ацетил-СоА знижується відносно кобальту існує тоді, коли кількість кобальту, що швидкості циклу СО. Це спричиняє накопичення подається в реактор в мкг, на 1 грам клітин (суха відновленого фередоксина і відновлення МАФД(Р) в вага), що виробляються в реакторі, знаходиться в діапазоні від 5 до 100. Переважно, кількість коба- СО» перевищує 0,1атм., то, швидше за все, ріст льту обмежують значеннями від -20 до 50мкг ко- був обмежений іншим впливом. Див. Приклад 20, бальту в реакторі на грам клітин, що виробляють- що ілюструє цей етап способу. ся в реакторі При цій кількості кобальту Під час запуску використання надлишку Но є підтримується переважне вироблення етанолу в більш сприятливим, ніж обмеження поживними порівнянні з ацетатом. У Прикладі 18 показаний речовинами, головним чином тому, що його легше варіант способу обмеження кобальтом в реакторі контролювати. Переваги використання надлишку відповідно до винаходу. Нг полягають у тому, що це дозволяє запобігти

Дефіцит кобальту в ферментаційному бульйо- надлишковому виробленню оцтової кислоти, що ні також може знижувати швидкість циклу ацетил- може привести до небажаних співвідношень про-

СоА. Оскільки кобальт використовується для пе- дуктів і потенційного інгібування оцтовою кисло- ренесення метильної групи з циклу ТНЕ в цикл тою, а також до акліматизації до низьких концент- ацетил-СоА, то дефіцит кобальту в ферментацій- рацій поживних речовин. ному бульйоні також знижує функціонування циклу О. Надлишкова подача монооксиду вуглецю

ТНЕ за рахунок обмеження перенесення. Дефіцит Інший спосіб впливу на компоненти способу кобальту знижує швидкість циклу ТНЕ, що також полягає в надлишковій подачі відновного газу СО спричиняє збільшення відношення МАС(Р)Н до в складі газоподібного субстрату з метою викорис-

МАФ(Р) і, отже, збільшення вироблення етанолу. тання в процесі, який служить для прямого зни-

Спосіб додатково включає вплив, що запобігає ження окисно-відновного потенціалу фермента- акліматизації до низької обмежуючої концентрації ційного бульйону. Відповідно до цього варіанту в кобальту. Найчастіше таким же чином, як у разі біореактор подають газоподібний субстрат, що запобігання акліматизації до низької концентрації містить СО, при цьому кількість СО, присутнього в пантотенату кальцію, підтримується постійна кон- біореакторі, перевищує кількість, потрібну для під- центрація кобальту при регулюванні одного або тримання сталої, стабільної концентрації бактерій, декількох параметрів ферментації (швидкості газу, при якій може бути повністю використаний присут- швидкості рідини, швидкості перемішування, вміс- ній СО. Подача СО є надлишковою і служить для ту СО»; і парціального тиску газоподібного Не). Іс- збільшення вироблення етанолу в порівнянні з тотних змін концентрацій поживних речовин не виробленням оцтової кислоти тоді, коли питома відбувається, навпаки, підтримується відносно швидкість поглинання СО (мілімолей СО на грам постійна концентрація живильного середовища. сухих клітин в реакторі за хвилину, або ммоль/г

Приклад такого регулювання параметрів фермен- клітин-хв.) складає більше 0,3. Більш переважною тації для конкретної бактеріальної культури пока- є питома швидкість поглинання СО більше 0,5. Це заний в Прикладі 19. означає, що в середньому кожна клітина викорис-

Переважно, для збільшення вироблення ета- товує СО в своєму метаболізмі зі швидкістю що- нолу і обмеження вироблення оцтової кислоти, в найменше 0,Зммоль/г клітин-хв., бажано зі швидкі- біореактор спочатку подають надлишок Наь, а потім стю щонайменше 0,5ммоль/г клітин-хв. обмежують кобальт в живильному середовищі, як Переважно, СО вводять зі швидкістю, при якій по- описано вище. При запуску системи обмежуючу глинання СО складає від 0,3 до 2ммоль СО/г сухих рідкофазну поживну речовину кобальт підтриму- клітин бактерій за хвилину. Приклад 24 показує ють в надлишку для запобігання акліматизації до один з варіантів здійснення цього етапу способу. його низьких концентрацій, яка може привести до Така швидкість поглинання СО підтримує пе- дуже низької продуктивності культури і втрати зда- реважне вироблення етанолу в порівнянні з оцто- тності культури забезпечувати співвідношення вою кислотою. Якщо СО подається таким чином, продуктів вище, ніж 11. що кількість розчиненого СО в ферментаційному

С. Надлишкова подача водню бульйоні буде значним за рахунок тиску газу або

У іншому варіанті здійснення винаходу вплив дуже доброго масопереносу, то ферментаційний на біологічні процеси, що сприяє виробленню ета- бульйон буде відновлюватися сильніше. Надлиш- нолу і обмежує вироблення оцтової кислоти, поля- кова подача СО забезпечує дві додаткові перева- гає в надлишковому вмісті Не в газі, що подається, ги. Надлишок СО може обумовити функціонування або обмеження газоподібного вуглецю, що приво- СО-циклу в прискореному режимі, і, якщо цикл дить до надлишку Не», який потім використовується ацетил-СоА обмежений іншим способом і не може в біологічному процесі. Переважно, відновний газ бути втриманий в рівновазі з циклом СО, то буде

Не міститься в надлишку відносно СО, і цей над- накопичуватися відновлений фередоксин. СО мо- лишок зумовлює вироблення бактеріями продуктів же також сповільнювати етап 2 (вироблення про- з високим відношенням етанолу до ацетату в фе- міжної оцтової кислоти) в загальному триступене- рментаційному бульйоні. Якщо відношення Не (в вому процесі за рахунок інгібування субстратом. молях газу, що подається ) до суми подвоєної кі- Ця знижена швидкість етапу 2 відносно етапу 1 лькості перетвореного СО (в молях газу) і потроє- обумовлює утворення надлишку МАОБ(Р)Н, що ної кількості молей перетвореного СО» більше 1, приводить до переважного вироблення етанолу то ферментація буде обмежуватися вуглецем. порівняно з виробленням оцтової кислоти.

Парціальний тиск Не у відхідному газі переважно Хоч надлишок СО може привести до підвище- складає більше 0,4атм. У кінцевому рахунку від- ного вироблення етанолу за рахунок прямого зни- ношення парціального тиску Нг до парціального ження окисно-відновного потенціалу фермента- тиску СО» повинно бути більше 3,0 для того, щоб ційного бульйону, однак присутність надлишку СО кількість Нг2 була гарантовано достатньою для ви- також інгібує ріст культури шляхом інгібування СО- користання всього СОг. Якщо парціальний тиск дегідрогенази і, отже, поглинання Нео. Присутність надлишку СО, на жаль, також приводить до погір- 2. Надлишкова подача СО і Но шення перетворення Не, що може бути економічно У іншому варіанті здійснення даного винаходу несприятливим чинником. Наслідком тривалої ро- стабільно висока концентрація етанолу і обмежене боти в умовах інгібування субстратом є погіршен- вироблення оцтової кислоти досягається тоді, ко- ня поглинання Нео. Зрештою це викликає лізис клі- ли обмежені кобальт або пантотенат кальцію або тин і необхідність перезапуску реактора. Якщо забезпечений надлишок Не або СО. Відповідно до відбувається ненавмисне інгібування субстратом цього, оскільки культура використовує субстрат (присутність дуже великої для клітин, що є кількос- СО, Не і СО» У якості джерела вуглецю і енергії, ті СО) під час первинного росту культури або після СО їі Не подають з невеликим надлишком. Невели- нього, то знижують швидкість подачі газу і/або пе- кий надлишок СО і Но створюють шляхом встано- ремішування, доки інгібування субстратом не влення сталого стану, а потім поступово підвищу- ослабляється. Ілюстрація того, як регулюється ють швидкість подачі газу і/або швидкість швидкість газу або швидкість перемішування для перемішування (з 1095 або меншими приростами), здійснення цього ефекту, дана в Прикладі 21. доки перетворення СО і Но не почне падати. Це

Е. Додаткові етапи впливу дозволяє уникнути обмеження масопереносу, яке

На додаток до основних етапів поліпшення сприяє виробленню оцтової кислоти, і забезпечити способу, описаних вище, спосіб виробництва ета- надлишок відновленого фередоксина для віднов- нолу містить ще декілька додаткових прийомів. лення МАС(Р) в МАБ(Р)Н і вироблення етанолу. 1. Збільшення масопереносу Якщо СО і Но не подаються з невеликим надлиш-

Один з додаткових варіантів здійснення вклю- ком, відбувається обмеження масопереносу, і біо- чає забезпечення більш швидкого масопереносу логічний процес урівноважується. Це приводить до

СО або Не» з лінії подачі газу в рідкий фермента- небажаних співвідношень етанолу і ацетату (висо- ційний бульйон у порівнянні зі здатністю бактерій ких концентрацій ацетату). Високі концентрації використовувати розчинений газ. Наприклад, якщо ацетату можуть у кінцевому рахунку привести до в біореактор, що містить С Ципдаапйії, подається інгібування оцтовою кислотою, яке обмежує здат-

СО, Со» і Н», і біореактор працює без обмежень ність бактерії поглинати Нео і зрештою приводить поживними речовинами (такими як пантотенат і до загибелі культури. кобальт) або без надлишку Не», ріст клітин обмеже- Запобігання обмеженню масопереносу скла- ний кількістю газу, що переноситься в рідку фазу, і дається в збільшенні швидкості перемішування система виробляє у якості продукту оцтову кисло- або швидкості газу для перенесення більшої кіль- ту. Якщо в культуру подається незначний надли- кості СО і Не в рідку фазу і, таким чином, знов ви- шок СО або Нг» у порівнянні з необхідною для рос- никає невеликий надлишок СО і Нео. Якщо виникає ту культури кількістю, то вона виробляє етанол. інгібування продуктом внаслідок обмеження масо-

Проте, якщо в рідку фазу переноситься набагато переносу, необхідно збільшити швидкість подачі більше газу, ніж може використати культура, від- рідини, щоб припинити інгібування оцтовою кисло- бувається інгібування субстратом, яке може при- тою за рахунок розбавлення до більш низької кон- вести до пошкодження культури і до загибелі клі- центрації ацетату. Оскільки при збільшенні швид- тин. Таким чином, існує дуже вузький діапазон, в кості подачі середовища буде збільшуватися якому можлива робота з надлишковим масопере- кількістьмкг пантотенату або кобальту на 1 г клі- носом. Приклад 22 ілюструє цей варіант. тин, що виробляються, це треба робити коротко-

Розглянемо знову цикл ацетил-СоА. Для того, часно або потрібно видаляти надлишок пантоте- щоб вироблявся надлишковий відновлений фере- нату або кобальту за рахунок регулювання доксин, СО-цикл або відновлення фередоксина концентрації середовища або збільшення швидко- гідрогеназою повинно здійснюватися з більшою сті подачі води. швидкістю, ніж цикл ацетил-СоА. В описаних тут 3. Контроль інгібування оцтовою кислотою, що способах обмежують швидкість, з якою мікроорга- виробляється нізми можуть використовувати розчинені гази, У описаних вище способах, якщо в біореакторі шляхом обмеження швидкості, з якою незамінні накопичується надто багато молекулярної оцтової поживні речовини, наприклад, пантотенат кальцію кислоти (22г/л), яка перешкоджає подальшому або кобальт, або інші субстрати, такі як газоподіб- зростанню клітин і виробленню етанолу, то може ний СО», подаються до бактерій, або шляхом по- статися інгібування оцтовою кислотою, що вироб- дачі в культуру надлишку субстрату, Но або СО. ляється. Для запобігання пошкодженню культури

Може бути обчислена теоретична швидкість використовують ще один вид впливу. Одна з мо- масопереносу, більша, ніж швидкість використан- дифікацій включає короткочасне збільшення шви- ня субстрату бактеріями, навіть без інших обме- дкості подачі рідини або води для того, щоб знизи- жень. Коли ця швидкість досягається, вона обме- ти концентрацію інгібуючої оцтової кислоти в рідкій жується природною швидкістю росту організму. фазі до величини менше 2г/л. Опис цих варіантів

Тому найбільш продуктивним буде такий варіант для конкретної культури в реакторі приведений в здійснення, в якому масоперенос (швидкість течії Прикладі 23. газу або швидкість перемішування) перевищує 4. Рециркуляція води швидкість, з якою максимально можлива концент- Наступний необов'язковий прийом підтриман- рація клітин може використовувати субстрат без ня стабільної культури, яка виробляє етанол у обмежень. Робочий діапазон буде дуже вузьким, якості єдиного продукту, без кінцевого вироблення оскільки інгібування субстратом може швидко ви- оцтової кислоти, способи за винаходом включають кликати загибель клітин і утворення токсичної для додання оборотної води з процесу дистиляції на- культури концентрації побічного продукту. зад в ферментаційний реактор (див., зокрема,

Приклад 5). Як зазначалося вище, рециркуляція реакторі росту не застосовуються обмеження по- води (що містить до 5г/л ацетату) забезпечує ту живних речовин, описані вище, внаслідок чого ку- перевагу, що утворений ацетат повертається на- льтура не схильна до акліматизації до обмеженого зад в реактор, і оцтова кислота у якості кінцевого стану. продукту не виробляється. Таким чином, в реакто- Принципова схема такої двоступеневої систе- рі встановлюється рівновага між етанолом і ацета- ми С5ТК показана на Фіг.2, і далі опис містить том. У результаті весь газ СО, СО» і Н», який пода- посилання на цю фігуру. Відповідно до цього варі- ється в реактор і який перетворюється в продукти, анту здійснення стадія росту відбувається при використовується для вироблення етанолу, крім тривалості утримання рідини (ЕТ) близько 24 тієї частини, яка використовується для підтриман- годин. Стадія росту С5ТЕ 1 забезпечується доста- ня культури. тньою кількістю пантотенату або кобальту в сере- 5. Зменшення щільності клітин довищі 2 з отриманням здорової культури (а також

Наступний метод впливу, корисний в даному з можливим утворенням оцтової кислоти). Таким способі, складається в здійсненні періодичного чином, в реакторі виробляється надлишок оцтової або безперервного очищення біореактора від бак- кислоти, але підвищується стабільність. Ця конце- теріальних клітин для зниження концентрації клі- нтрація пантотенату або кобальту перевищує кон- тин в біореакторі. Цей вплив спрямований на зме- центрацію, яка подавалася б в одиночний СЗТ ншення концентрації клітин до величини, меншої, для виробництва етанолу. Газ, що подається в цей ніж концентрація сталого стану, при якій викорис- реактор, являє собою неперетворений газ З зі ста- товується весь відновний газ або поживні субстра- дії виробництва 4, а рідина, що подається, являє ти в біореакторі. Таким чином, при зміні щільності собою свіже середовище 2. Стадія росту С5ТЕ 1 клітин вироблення етанолу переважає над вироб- працює без рециркуляції клітин. У реакторі стадії ленням ацетату в біореакторі. Див., зокрема, При- росту вирішується задача отримання свіжої куль- клад 25. тури для наступного виробництва етанолу, яка не 6. Двоступенева система СЗТК акліматизується до низьких концентрацій пантоте-

Одна з проблем, пов'язаних з виробленням нату. етанолу за допомогою обмеження середовища, Реактор стадії виробництва 4 працює при но- полягає в здатності або схильності культури зреш- мінальній ГКТ менше 20 годин. Цей С5ТК з реци- тою пристосовуватися до обмежуючих умов і при- ркуляцією клітин отримує живлення через лінію пиняти вироблення етанолу через кілька місяців подачі свіжого газу 5 і може мати низькі ступені роботи. Замість етанолу домінуючим продуктом перетворення. Він також отримує живлення через стає ацетат. Така акліматизація до низьких обме- лінію подачі свіжого середовища 6 і лінію подачі жуючих концентрацій поживної речовини приво- культури 7 зі стадії росту. У цей реактор подається дить до розвитку культури, яка виробляє більше мінімум пантотенату або кобальту, оскільки є над- оцтової кислоти, ніж етанолу (співвідношення ета- лишок зі стадії росту. Рециркуляція клітин 8 вико- нолу і ацетату 1,0 або менше) і в результаті дає ристовується в цьому реакторі для отримання ма- низькі концентрації етанолу (іноді всього лише ксимального вироблення від клітин, що 1г/л). Адаптація, найвірогідніше, відбувається у направляються назад в реактор 4. Кінцева концен- випадку, коли культура не отримує достатньої кі- трація етанолу в рідкому продукті 10 повинна пе- лькості поживних речовин під час запуску, при ревищувати 20г/л. Особливості двоступеневих якому швидкість росту має важливіше значення, систем С5ТК складаються в невеликих змінах, що ніж швидкість вироблення етанолу. Крім того, існує стосуються акліматизації до низьких концентрацій небезпека, що культура може акліматизуватися до пантотенату або кобальту, загальної І КТ 30 годин, низьких обмежуючих концентрацій при роботі в очікуваної підвищеної продуктивності вироблення сталому стані, зокрема, коли концентрації обме- етанолу і підвищеної концентрації етанолу в порі- жуючої поживної речовини знижуються для вида- внянні з одиночним С5ТЕ того ж розміру. лення ацетату з реакційної системи. 7. Модифікації при запуску

Для запобігання такій адаптації при викорис- Інші етапи способу, які переважно використо- танні обмеження пантотенатом або кобальтом, вуються при практичному застосуванні даного ви- описаного вище, може бути застосована інша мо- находу, включають продукування клітин під час дифікація способу. Двоступенева система С5ТЕ, в первинного запуску ферментаційної культури. За- якій на першій стадії здійснюється активний пер- пуск біореактора, що живиться СО, СО» і Но для винний ріст культури при невеликому надлишку вироблення етанолу і оцтової кислоти, виконують обмежуючих поживних речовин (який, можливо, шляхом періодичної інокуляції з маточної культури супроводжується виробленням оцтової кислоти), а (Приклад 11) або шляхом безперервної подачі на наступній стадії виробництва культура з першої посівного матеріалу з існуючого реактора у вигляді стадії обмежується обмежуючою поживною речо- лінії подачі культури (Приклад 12). Як було зазна- виною і використовується для вироблення високих чено вище в описі запобігання акліматизації куль- концентрацій етанолу, являє собою таку модифі- тури до низьких концентрацій пантотенату або кацію способу. Ця модифікація дає можливість кобальту, найбільш переважно культуру доводять підтримувати стабільність культури, яка не акліма- до високої концентрації клітин перед обмеженням тизується до знижених концентрацій пантотенату поживних речовин і подачею в культуру надлишку або кобальту. Така модифікація включає роботу Не. Такий швидкий запуск запобігає акліматизації двоступеневої системи СЗТКЕ, в якій реактор росту культури і забезпечує добрі співвідношення проду- (стадія 1) живить реактор виробництва (стадія 2), ктів (високі концентрації етанолу і низькі концент- де відбувається основне вироблення етанолу. У рації оцтової кислоти). Якщо швидкий запуск не застосовується, то можуть виникати небажані Після досягнення цільової швидкості перемі- співвідношення продуктів, і культура може акліма- шування (800-100о06./хв. в лабораторному реакторі тизуватися до низьких концентрацій рідкофазної Меж Вгипеміск Зсієпіййс Віойо-) культуру залиша- поживної речовини, що приведе до необхідності ють рости до сталого стану для того, щоб збільши- реінокуляції реактора. ти поглинання Но. Запуск переходить в режим, в

Реактор запускають шляхом завантаження якому важливою стає швидкість вироблення. Ба- порції рідкої фази (рідке середовище спочатку не жано отримати перетворення СО більше 8095 і подається в реактор безперервно) при низьких високий парціальний тиск Не у відхідному газі що- швидкостях перемішування (можливо, 400- найменше 0,55атм. для того, щоб забезпечити 6бОбоб/хв в лабораторному реакторі Мем Вгип5м/скК вироблення етанолу при обмеженій концентрації

Зсієпіййс Віойо?) і при заданій рН. Таким чином, ацетату і вільної молекулярної оцтової кислоти. рідка фаза в реакторі містить порцію живильного Потім включають подачу рідкого середовища (для середовища з вітамінами і солями, при номіналь- систем з однократною інокуляцією з маточної ку- ній концентрації обмежуючої поживної речовини, льтури) для ініціювання безперервної подачі ріди- пантотенату кальцію або кобальту (наприклад, ни, а швидкість подачі газу збільшують з 1095-ми 20мкг/л пантотенату або 75млн" кобальту). При приростами до досягнення цільової швидкості те- використанні безперервної інокуляції з існуючого чії. Н»г залишається в надлишку для запобігання реактора завантаження порції рідкої фази може надлишковому виробленню оцтової кислоти. По бути необов'язковим. В цьому випадку газ безпе- мірі збільшення швидкості газу рідкофазні поживні рервно подають в реактор при первинному запуску речовини обмежують (пантотенат кальцію або з низькою швидкістю. В ідеалі газова фаза при кобальт), внаслідок чого відбувається невеликий запуску не повинна містити СО», повинна містити спад в перетворенні Но» при цільовій продуктивнос- надлишок Не», а швидкість газу і швидкість перемі- ті. шування повинні бути невеликими для запобігання При роботі в сталому стані досягається виро- інгібуванню субстратом СО. блення 15-35г/л етанолу і 0-5г/л ацетату. На цьому

Типовий загальний протокол вироблення і під- етапі необхідні невеликі коректування стосовно тримання ефективних в промисловому масштабі обмежуючих поживних речовин, швидкостей пода- концентрацій етанолу з СО, СоОб і Но складається з чі рідини і швидкостей подачі газу, які вибираються трьох окремих фаз: (а) первинний запуск, при яко- досвідченим фахівцем на основі теоретичних до- му найважливішим чинником є продукування клі- сягнень в цій області і принципів цього винаходу. тин; (Б) запуск, при якому найважливішим чинни- Якщо спосіб виробництва етанолу повинен бути ком стає швидкість вироблення; і (с) робота в доповнений рециркуляцією клітин, то вона вво- сталому стані. Первинний запуск по суті відрізня- диться на цьому етапі одночасно з регулюванням ється інокуляцією порції рідини, що містить номі- швидкості газу (збільшенням) і концентрації пожи- нальну кількість обмежуючої поживної речовини, вної речовини (зменшенням). вибраної з кобальту (75 млн") або пантотенату Описані вище способи безперервного вироб- кальцію (20мкг/л), при заданій рН (звичайно 4,5- лення і підтримання високих концентрацій етанолу 5,5). Для полегшення запуску швидкість подачі при низьких концентраціях побічного ацетату в газу і швидкість перемішування переважно підт- стабільних робочих умовах покращують викорис- римують низькими, а Но подають в надлишку. Чин- тання відповідних бактерій для промислового ви- ником вироблення етанолу під час запуску є над- робництва етанолу з СО, СО» і Н». У способі пере- лишок Нг; поживну речовину обмежують пізніше. важним є використання біореактора безперервної

Таким чином, під час запуску фактично присутній дії, хоч періодична ферментація і ферментація з надлишок рідких поживних речовин, що запобігає підживленням також придатні, але навряд чи бу- небажаній акліматизації культури до низького вмі- дуть економічно ефективними для великомасшта- сту поживних речовин. По мірі продовження фер- бного виробництва етанолу. ментації протягом декількох годин після інокуляції, Наступні приклади ілюструють різні аспекти, відбувається вироблення СО» і споживання Н». способи і етапи способів за винаходом. Ці прикла-

Зміни в цих швидкостях означають, що швидкість ди не обмежують винахід, область якого викладе- перемішування слід повільно підвищувати до но- на в формулі винаходу, що додається. мінальної (можливо, на 200-300об./хв. в лаборато- ПРИКЛАД 1. ІЛЮСТРАТИВНИЙ СПОСІБ ЗА- рному реакторі протягом 2-3 днів) для запобігання ДАНИМ ВИНАХОДОМ обмеженню масопереносу. Синтез-газ або відпрацьований газ, що містить

Початок вироблення СО» відбувається набага- СО і/або СО»2/Но2, безперервно вводять в бак- то швидше в системах, в яких використана безпе- реактор з безперервним перемішуванням, що міс- рервна інокуляція, в протилежність від однократ- тить штам С. Ципдаанйії, разом із звичайним рідким ної інокуляції з маточної культури. Проте, якщо середовищем, що містить вітаміни, мікроелементи швидкість перемішування збільшується дуже шви- і солі. Склад одного з переважних живильних се- дко, відбувається інгібування субстратом СО. редовищ приведений нижче в Таблиці 1.

Швидкість перемішування збільшують відносно При запуску з використанням інокуляту куль- швидко під контролем перетворення Нг (або виро- тури 1095 або менше реактор працює при заван- блення СО») доти, доки не буде досягнута цільова таженні порції рідкої фази, тобто, рідке середови- швидкість перемішування. Протягом цього часу ще не подають в реактор безперервно. Таким збільшення швидкості перемішування в порції рід- чином, рідка фаза в реакторі складається з порції кої культури найважливіше значення має процес поживної середовища з номінальною концентраці- продукування клітин, а не вироблення продукту. єю обмежуючої поживної речовини, пантотенату кальцію або кобальту. У альтернативі також може 125мл/хв. бути використане збагачене середовище, що міс- Важливо забезпечити надлишок Не» в газі, що тить дріжджовий екстракт, триптиказу або інші подається, для запобігання надлишковому вироб- комплексні поживні речовини. ленню оцтової кислоти. По мірі збільшення швид-

В ідеалі, газова фаза під час запуску не міс- кості газу збільшується продукування клітин, поки тить СО» і містить надлишок Но. Швидкість газу і не виникне обмеження в рідкофазних поживних швидкість перемішування підтримують на низько- речовинах (пантотенат кальцію або кобальт), що му рівні (нижче 500об./хв. в ферментаційному біо- буде помітно через невелике падіння перетво- реакторі Мем Вгипем/ск Осіепійс Віойо?) з отри- рення Нг при цільовій продуктивності. У СТЕК Мем манням СО і Но з невеликим надлишком, але, в Вгипем/іск Зсіепіййс Віойо? це можна помітити че- той же час, із запобіганням інгібуванню СО- рез 1095-не падіння перетворення Не при цільовій субстратом. В однолітровому лабораторному фе- продуктивності 20г/л в день. рментаційному біореакторі Мем /Вгипзміск Потім технологічний процес і систему реакто-

Зсієпіййс Віойо?, наприклад, в якому до складу рів підтримують в сталому стані при виробленні газу, що подається, входить 63905 Но, 3295 СО і 590 15-35г/л етанолу і 0-5г/л ацетату у якості продуктів,

СНа, швидкість перемішування для первинного лише з невеликими коректуваннями в обмежуючих запуску становить 400об./хв., а швидкість газу поживних речовинах, швидкостях рідини і газу. 20мл/хв. Чинником вироблення етанолу під час Типові умови сталого стану в лабораторному фе- запуску є надлишок Нг; обмеження поживної речо- рментаційному біореакторі Мем /Вгип5м/скК вини здійснюється пізніше. Таким чином, під час Зсіепійіс Віойо? без рециркуляції клітин включають запуску фактично присутній надлишок рідких по- тривалість утримання газу (рідинний об'єм реакто- живних речовин (пантотенату, кобальту), що запо- ра/швидкість течії газу) 20 хвилин, тривалість ут- бігає небажаній акліматизації культури до низького римання рідини (рідинний об'єм реакто- вмісту поживних речовин. ра/швидкість течії рідини) 30 годин і швидкість

По мірі продовження ферментації протягом кі- перемішування 900об./хв., з перетворенням СО лькох годин після інокуляції, СО2 виробляється 9295 і перетворенням Нео 6095 при обмеженні пан- шляхом перетворення СО, а Но споживається ра- тотенатом. зом з СО», що є сигналом до підвищення швидкос- В одному з варіантів здійснення цього способу ті перемішування до номінальної величини, щоб система реакторів доповнена рециркуляцією клі- уникнути обмеження масопереносу. У СОТ Мем тин, і рециркуляцію вводять на цьому етапі одно-

Вгипем/іск Зсієпійс Віойо? відхідний газ включає часно з регулюванням швидкості газу (збільшен- 2590 СО, 6795 Не, 295 СО» і 695 СНаи. Якщо швид- ням) і концентрації поживної речовини кість перемішування збільшується дуже швидко, (зменшенням). При рециркуляції клітин в СЗТ відбувається інгібування субстратом СО, що від- Мем Вгипвуйск Зсієпіййс Віойо? тривалість утри- значається зниженням концентрації метану після мання газу звичайно становить 8 хвилин, трива- прискорення перемішування. Таким чином, швид- лість утримання рідини 40 годин, а швидкість пе- кість перемішування, як правило, підвищується на ремішування 900об./хв. Ці умови звичайно 200 об/хв. за 24 години. Ця операція підвищення забезпечують перетворення 9295 СО і 5095 Нео при швидкості перемішування під контролем вироб- обмеженні пантотенатом. лення СО» (або перетворення Нг) здійснюється ПРИКЛАД 2. АНАЛІЗ ЗРАЗКІВ ШЛЯХОМ ГА- доти, доки не буде досягнута цільова швидкість ЗОВОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ перемішування. Типова цільова швидкість пере- Для досягнення і/або підтримання потрібної мішування в ферментаційному біореакторі Мем продуктивності і співвідношення, періодично по-

Вгипвуіск Зсіепійіс Віойо? становить 900об./хв. Під винні відбиратися зразки ферментаційного буль- час цього підвищення швидкості перемішування в йону з ферментаційного біореактора. Зразок біль- порції рідкої культури найважливіше значення має ше, ніж 1,5мл культури відбирають з культури в продукування клітин, а не вироблення продукту. біореакторі. Зразок вміщують в мікроцентрифужну

Таким чином, досягається концентрація клітин пробірку, а пробірку вміщують в центрифугу Різпег близько 1,5г/л, при цьому типові концентрації про- Зсіепійс Місго 14 з необхідним баластом для рів- дуктів становлять 10г/л етанолу і 2г/л ацетату з новаги. Зразок центрифугують при 8000об./хв. порції культури. протягом 1,5хв. 0,500-мл зразок супернатанта

Після досягнення цільової швидкості перемі- вміщують в 1,5-мл ампулу, призначену для вико- шування культуру залишають рости доти, доки ристання в автодозаторі газового хроматографа. поглинання Нео не досягне максимального значен- 0,500-мл зразок внутрішнього еталонного розчину ня. Бажано отримати дуже високі концентрації Не в містить 5г/л п-пропанолу і 595 (06./06.) 8595-ної відхідному газі (звичайно 26095), щоб забезпечити фосфорної кислоти в деіонізованій воді. Наявність вироблення етанолу при обмеженому виробленні фосфорної кислоти гарантує, що весь ацетат пе- оцтової кислоти. Потім включають подачу рідкого ретвориться на оцтову кислоту і буде виявлений середовища (для систем з однократною інокуляці- газовою хроматографією. єю з маточної культури) для ініціювання безперер- 1мкл підготовленого зразка вводять за допо- вної подачі рідини, а швидкість газу підвищують до могою автодозатора в Неулей-Раскага 5890 бепев цільової. У лабораторному ферментаційному біо- ІЇ ваз Сготаїйодгарі, оснащений капілярною коло- реакторі Мему Вгипзугіск Зсієепійіс Віойо? швидкість нкою 007 ЕРА Оцайгех 25мх0,5З3мм (внутрішній подачі рідини звичайно становить 0,5мл/хв., а діаметр) з плавленим кварцом. Аналіз проводять з швидкість течії газу збільшують на 10-1595 кожні використанням гелію у якості газу-носія у двопото- 24 години до досягнення цільової швидкості в чному режимі зі швидкістю ббмл/хв. розділеного потоку і 7,93мл/хв. інжекторної продувки. Тиск на чих рівнів пантотенату або кобальту. Щоб показа- виході з колонки встановлюють на 27кПа (4 рвід), ти це, однолітровий лабораторний ферментацій- що забезпечує швидкість течії носія в колонці ний біореактор Мем" Вгипзугіск бсіепійіс Віойо? мо- 7мл/хв. Температурна програма включає витримку дифікували таким чином, щоб істотно знизити при 757С протягом 2 хвилин, підйом до 190" зі подачу кобальту до рівня трохи вище концентрації швидкістю З0"С/хв. і витримку при 1907С протягом обмеження кобальтом. Реактор знову містив С. 5,17 хвилин. Загальний час прогону становить 8 Циподаанйіїї, штам ЕКІ2, для вироблення оцтової хвилин. Прилад калібрують для етанолу (0-25г/л), кислоти з СО, СО» і Не». Газ, що подавався, містив оцтової кислоти (0-25г/л), п-бутанолу (0-5г/л) і ма- 5595 Н», 2595 СО і 595 СНа, а тривалість утримання сляної кислоти (0-5г/л). П'ять еталонів, приготова- газу становила 7,5-8,0 хвилин. Рідке середовище, них з матеріалів з різним вмістом реагенту, вико- що містить вітаміни, солі і мікроелементи, подава- ристовують для калібрування. Якщо зразок не ли при тривалості утримання рідини від 3,0 до 3,5 попадає в калібрувальний діапазон концентрацій годин, а тривалість утримання клітин становила 40 (наприклад, 225г/л етанолу), 0,250мл зразка і годин. рН становила 5,0-5,3, а швидкість перемі- 0, 250мл деїонізованої води вміщують в ампулу з шування 900-1000об./хв. У цих умовах перетво- 0,500мл внутрішнього еталона і факт розбавлення рення СО склало 95-9995, а перетворення Нг» - 94- враховують при аналізі. 9895. Концентрація клітин склала 2,5-4г/л, а ацетат

ПРИКЛАД 3: ВИРОБЛЕННЯ КИСЛОТИ В ЛА- був єдиним продуктом, що вироблявся з концент-

БОРАТОРНОМУ С5ТК З РЕЦИРКУЛЯЦІЄЮ КЛІ- рацією 10-14г/л. тин Кількість Са-д-пантотенату, яка подавалася на

У лабораторному ферментаційному біореак- грам клітин, що виробляються, становила 2250- торі Мем Вгипом/іск Зсіепійс ВіойоФ, працюючому 360Омкг пантотенату/г вироблених клітин. Кількість з рециркуляцією клітин, використовували С кобальту, що подавалася на одиницю клітин, що

Циподданіїї, штам ЕКІ2, АТСС 55380, для вироблен- виробляються, була знижена до діапазону 62,0- ня оцтової кислоти з СО, СО» і Не. Газ, що подава- 99,2мкг кобальту/г вироблених клітин. Питома вся, містив 4095 Но, 5095 СО і 10905 М», а тривалість швидкість поглинання СО склала 0,325-0,4ммоль/г утримання газу в однолітровому реакторі станови- клітин-хв. Відношення молей Н», що подається, до ла 7,7-8,6 хвилин. Рідке середовище, що містить суми подвоєної кількості молей перетвореного СО вітаміни, солі і мікроелементи, подавали при три- і потроєної кількості молей перетвореного СО» валості утримання рідини від 2,6 до 2,9 годин. рН склало 0,875. становила 5,1-522, швидкість перемішування ПРИКЛАД 4. ВИРОБЛЕННЯ ЕТАНОЛУ В ЛА- 1000о06./хв., а тривалість утримання клітин - близь- БОРАТОРНИХ С5ТК5 З ОБМЕЖЕННЯМ ПАНТО- ко 40 годин. У цих умовах обмеження масоперено- ТЕНАТУ су (але не обмеження поживної речовини) перет- Лабораторний ферментаційний біореактор ворення СО склало 94-9895, а перетворення Н» - Мем Вгипвулск Зсіепійіс ВіойоФ І працював як 80-9795. Концентрація клітин склала 4-8г/л, а аце- прямоточний СТЕК (без рециркуляції клітин) з тат вироблявся з концентрацією 10-13Зг/л. Етанол використанням С Циподданіїї, штам С-01, АТтоС не вироблявся. Хоча реактор працював в умовах 55988, для вироблення етанолу з СО, СО:5 і Нг при обмеження масопереносу (обмеження можливості обмеженні пантотенатом. Газ, що подавався, міс- перенесення газу в культуру) і, таким чином, виро- тив 63,395 Не, 31,495 СО і 5,395 С2Нвб (газ порівнян- бляв у якості продукту тільки оцтову кислоту, конт- ня); тривалість утримання газу при подачі стано- ролювалися параметри, важливі для вироблення вила 27 хвилин. Рідке середовище, що містить етанолу шляхом обмеження пантотенатом, обме- надлишок солей і мікроелементів і обмежену кіль- ження кобальтом або при надлишку Нео або СО, які кість пантотенату, подавали в 1,55-літровий реак- служили порівнянням для визначення моменту, тор при тривалості утримання рідини 31,4 години. коли етанол починає вироблятися як домінуючий рН становила 4,6-4,7, а швидкість перемішування продукт. 650об./хв. В цих умовах перетворення СО склало

Як показано в Таблиці. 2, кількість Са-а- 9895, перетворення Н»е - 8395, а концентрація клі- пантотенату, яка подавалася на одиницю клітин, тин 1,5-2,0г/л. Етанол вироблявся з концентрацією що виробляються, становила 1575-3150мкг/г ви- 15-19г/л, ацетат - з концентрацією 1,5г/л. Продук- роблених клітин. Подібним чином, кількість коба- тивність вироблення етанолу знаходилася в діапа- льту на грам вироблених клітин становила 1734- зоні від 11,5 до 14,5г/л.-день. 3468мкг/г вироблених клітин. Питома швидкість При аналізі параметрів вироблення етанолу поглинання СО склала 0,35-0,61ммоль/г клітин-хв. обмеження пантотенатом спостерігалося при по-

Відношення молей Н»г, що подається, до суми под- дачі пантотенату до клітин, що виробляються, у воєної кількості молей перетвореного СО і потроє- кількості 17,7-23,6мкг пантотенату/г вироблених ної кількості молей перетвореного СО» склало клітин. Порівняйте цей коефіцієнт з 2250-3600мкг менше 0,46. Таким чином, жоден з параметрів не пантотенату/г вироблених клітин, і 1575-3150мкг попадав в бажаний робочий діапазон для вироб- пантотенату/г вироблених клітин у Прикладі 3, де лення етанолу культурою. вироблялася оцтова кислота. Кількість кобальту,

Зрозуміло, що пантотенат і кобальт подавали- що подається на одиницю вироблених клітин, ся у вказаний реактор у великому надлишку під склала 5000-6000мкг кобальту/г вироблених клі- час вироблення оцтової кислоти у якості продукту тин, значно більш високий рівень, ніж в Прикладі 3, в умовах обмеження масопереносу. Тобто, рівні в якому було гарантовано відсутнє обмеження пантотенату і/або кобальту могли бути істотно кобальтом. Питома швидкість поглинання СО знижені, і все одно залишалися б вище обмежую- склала 0,23-0,30ммоль/г клітин«хв. Відношення Не»,

що подається, до суми подвоєної кількості перет- обмеженні кобальтом. Газ, що подавався, містив вореного СО і потроєної кількості перетвореного 6090 Не, 3595 СО і 595 СНа (газ порівняння); трива-

Со» склало 1,03, а парціальний тиск Нг у відхідно- лість утримання газу при подачі становила 14 хви- му газі склав 0,55-0,64атм. Певно, або надлишок лин. Рідке середовище, що містить надлишок со-

Н», або обмежена кількість пантотенату зумовила лей, вітамінів і мікроелементів і обмежуючу вироблення етанолу. кількість кобальту, подавали в 2,5-літровий реак-

Обмеження пантотенату для вироблення ета- тор при тривалості утримання рідини 40 годин. рН нолу було також продемонстроване в іншому ла- становила 4,9, а швидкість перемішування 650 бораторному реакторі Мем Вгип5м/скК Зсіепійс об/хв. В цих умовах перетворення СО становило

Віойо? ІІ, працюючому з рециркуляцією клітин при 9195, перетворення Не змінювалося від 20 до 8095, використанні С. Циподаанії, штам С-01 АТОС 55988. але номінально становило 5595. Етанол виробляв-

У цей реактор подавали газ, що містить 61,795 Н», ся з концентрацією 2б6г/л, ацетат - з концентрацією 30,695 СО і 5,295 С2Нбв (газ порівняння) при трива- 4г/л, а концентрація клітин становила 2,5г/л. Про- лості утримання газу 12,3 хвилини. Рідке середо- дуктивність вироблення етанолу склала вище, що містить обмежену кількість пантотенату і 15 бг/л.день. надлишок солей і мікроелементів, подавали в 2,4- При аналізі параметрів вироблення етанолу літровий реактор при тривалості утримання рідини подача пантотенату до клітин, що виробляються, 24,8 години. Рециркуляцію клітин проводили з ви- становила 15,2мкг пантотенату/г вироблених клі- користанням мембрани з порожнистих волокон, і тин. Цей рівень настільки низький, що обмеження тривалість утримання клітин становила 69 годин. кобальтом може не мати переваги перед обме- рН становила 4,6, а швидкість перемішування 650 женням пантотенатом. Обмеження кобальтом спо- об/хв. У цих умовах перетворення СО склало 9095, стерігалося при роботі з кількістю кобальту 33,З3мкг перетворення Но - 5395, а концентрація клітин кобальту/г вироблених клітин, тобто, при рівні, 2,5г/л. Етанол вироблявся з концентрацією 18Гг/л, який в 100 раз менше, ніж використовується в реа- ацетат - з концентрацією Зг/л. Продуктивність ви- кторах без обмеження кобальтом. Відношення Не, роблення етанолу склала 17,4г/л.день. що подається, до суми подвоєної кількості перет-

При аналізі параметрів вироблення етанолу вореного СО і потроєної кількості перетвореного (Таблиця 2) подача пантотенату на одиницю клі- СО» склало 0,94. Питома швидкість поглинання тин, що виробляються, становила 8,08мкг панто- СО склала 0,37ммоль/г клітин.хв. тенату/г вироблених клітин. Знов-таки, обмеження Обмеження кобальтом для вироблення етано- пантотенату було забезпечене шляхом роботи лу було також продемонстровано в СТЕ з рецир- системи при рівні пантотенату набагато меншому, куляцією клітин, що використовував С Ципдааніїї, ніж це потрібно для вироблення ацетату. Кількість штам С-01 АТС 55988. Цей дослід був проведе- кобальту, що подається на одиницю клітин, що ний для демонстрації обмеження кобальтом в виробляються, склала 3960мкг кобальту/г вироб- присутності надлишку пантотенату, в протилеж- лених клітин. Питома швидкість поглинання СО ність попередньому досліду в цьому прикладі. У склала 0,3Зммоль/г клітин-хв. Відношення Н?г, що лабораторний ферментаційний біореактор Мем подається, до суми подвоєної кількості перетворе- Вгипем/іск Зсієпійіс Віойо? 2000 з 0,2-мкм мембра- ного СО і потроєної кількості перетвореного СО» ною з порожнистих волокон для рециркуляції клі- склало 1,14, а парціальний тиск Нео у відхідному тин подавався газ, що містить 6095 Но, 35905 СО і газі склав 0,60-0,65атм. Надлишок Не міг би бути 595 СНа (газ порівняння) при тривалості утримання причиною вироблення етанолу, проте високий газу 5 хвилин. Рідке середовище, що містить над- вміст СОг у відхідному газі (0,14атм.) показує, що лишок солей, вітамінів і мікроелементів і, знов- ріст був обмежений пантотенатом. таки, обмежуючу кількість кобальту, подавали в

В іншому досліді в культуру С Ципдаанпйії, штам 1,2-літровий реактор при тривалості утримання

ЕКІ2, подавали 1500-3600мкг пантотенату/г виро- рідини 16 годин. рН становила 5,1, а швидкість блених клітин під час вироблення оцтової кислоти перемішування 825о0об./хв. Тривалість утримання з СО, СО» і Но, що являє собою умову, при якій клітин в цьому СЗТК з порожнистими волокнами система не обмежена пантотенатом (або будь- для рециркуляції клітин становила 40 годин. У цих яким іншим обмежуючим чинником, крім можливо- умовах перетворення СО склало 8395, перетво- сті перенесення газу в культуру), і етанол не був рення Не - 5095, а концентрація клітин 4,2г/л. Ета- виявлений в потоку продукту. нол вироблявся з концентрацією 18г/л, ацетат - з

Під час обмеження пантотенатом для вироб- концентрацією 4г/л. Продуктивність вироблення лення етанолу з СО, СО» і Не в С. |иподаапії, штам етанолу склала 27г/л.день.

С-01 подавали 8-24мкг пантотенату/г вироблених При аналізі параметрів вироблення етанолу в клітин, при підтриманні всіх інших поживних речо- цьому реакторі (Таблиця 2) подача пантотенату на вин у надлишку. В цих умовах штам С-01 вироб- одиницю клітин, що виробляються, становила ляв 15-19г/л етанолу і 1,5-3,0г/л ацетату. 85,7мкг пантотенату/г вироблених клітин, тобто, в

ПРИКЛАД 5. ВИРОБЛЕННЯ ЕТАНОЛУ В ЛА- 5,5 разів більше, ніж в попередньому досліді в

БОРАТОРНИХ С5ТК5 3 ОБМЕЖЕННЯМ КОБА- цьому прикладі. Обмеження кобальтом спостері- льтомМ галося при роботі з 47 бмкг кобальту/г вироблених

Лабораторний ферментаційний біореактор клітин. Відношення Не, що подається, до суми по-

Мем Вгипзулск Зсіепійс ВіойоФ | працював як двоєної кількості перетвореного СО і потроєної прямоточний СТЕК (без рециркуляції клітин) з кількості перетвореного СО» склало 1,03, а парціа- використанням С. Ципдааніїї, штам С-01, АТО льний тиск Но у відхідному газі склав 0,ббатм. 55988, для вироблення етанолу з СО, СО5 і Но при Знов-таки, надлишок Не міг би бути причиною ви-

роблення етанолу, проте високий вміст СОг у від- шування 1000об./хв., а швидкість рециркуляції хідному газі (0,1-0,15атм.) показує, що ріст був рідини 0,4-0,5 галонів на хвилину. У цих умовах обмежений кобальтом. Питоме поглинання СО перетворення СО склало 71,695, а перетворення склало 0,50ммоль/г клітин:-хв. Не склало 11,895. Концентрація клітин була 7,1г/л,

ПРИКЛАД 6. ВИРОБЛЕННЯ ЕТАНОЛУ В ЛА- етанол вироблявся з концентрацією 12,О0г/л, а аце-

БОРАТОРНИХ С5ТК5 ПРИ РОБОТІ З НАДЛИШ- тат - з концентрацією 2,7г/л. Продуктивність виро-

КОМ со блення етанолу склала боОг/л.день.

Реактор високого тиску АОТОСІ ДАМ Мм (Виспі) При аналізі параметрів вироблення етанолу працював як С5ТЕ з циркуляцією культури і реци- (Таблиця 2) подача пантотенату на одиницю клі- ркуляцією клітин при використанні С Циподааніїї, тин, що виробляються, становила 294мкг пантоте- штам С-01, для вироблення етанолу з СО, СО? і Но нату/г вироблених клітин. Цей рівень набагато в присутності надлишку СО протягом періоду 50 вище мінімального рівня, який викликає вироблен- годин. Реактор працював при 170кПа (25 рзід), а ня етанолу внаслідок обмеження пантотенатом. газ, що подавався, містив 5795 Но, 3695 СО і 690 Кількість кобальту, яка подається на одиницю клі-

СоНв. Тривалість утримання газу була змінною, тин, що виробляються, становила 735мкг кобаль- але номінально становила 3,Охв. Рідке середови- ту/г вироблених клітин, також на рівні, який забез- ще, що містить надлишок солей, вітамінів (вклю- печує надлишок кобальту. Відношення НН», що чаючи пантотенат) і мікроелементів, подавали в подається, до суми подвоєної кількості перетворе- 600-мл реактор при тривалості утримання рідини ного СО і потроєної кількості перетвореного СО» 8,2 години. Тривалість утримання клітин, отримана склало 0,3. Швидкість поглинання СО склала шляхом пропускання ефлюента з реактора через 0,67ммоль/г клітин-хв., тобто, рівень, який знову керамічний фільтр з порожнистими волокнами, забезпечує надлишок СО як чинник вироблення становила 18,5 годин. рН становила 4,5, швидкість етанолу. перемішування 450об./хв., а швидкість рециркуля- ПРИКЛАД 7. ВИРОБЛЕННЯ ЕТАНОЛУ В ції рідини 0,4-0,5дрт (галонів на хвилину). У цих ПРИСУТНОСТІ НАДЛИШКУ Не умовах перетворення газів було змінним, але пе- Лабораторний ферментаційний біореактор ретворення СО номінально склало 7295, а перет- Мем Вгипзміск Зсіепійіс Віоїо працював як прямо- ворення Не номінально склало 12905. Концентрація точний С5ТЕ (без рециркуляції клітин) з викорис- клітин була 2,7г/л. Етанол вироблявся з концент- танням С Циподаапйії, штам С-01, АТСС 55988, для рацією 9,9г/л, а ацетат - з концентрацією 2,бг/л. вироблення етанолу з СО, СО» і Не в присутності

Продуктивність вироблення етанолу склала надлишку Н». Газ, що подавався в реактор, містив 29,О0г/л.день. 779 Не, 1995 СО і 495 СНае (газ порівняння); трива-

При аналізі параметрів вироблення етанолу лість утримання газу при подачі становила 30 хви- подача пантотенату на одиницю клітин, що вироб- лин. Рідке середовище, що містить надлишок со- ляються, становила 978мкг пантотенату/г вироб- лей, вітамінів і мікроелементів, подавали в лених клітин. Цей рівень досить високий для гара- реактор при тривалості утримання рідини 36 го- нтії того, щоб концентрація пантотенату не була дин. рН становила 5,0, а швидкість перемішування обмежуючою. Кількість кобальту, що подається на 1000об./хв. У цих робочих умовах перетворення одиницю клітин, що виробляються - 836бмкг коба- СО склало 97-9995, перетворення Но 60-8095. Кон- льту/г вироблених клітин - також показує, що кон- центрація клітин склала 0,8-1,0г/л, етанол вироб- центрація кобальту не була обмежуючою. Відно- лявся з концентрацією 10г/л, а ацетат - з концент- шення Нео, що подається, до суми подвоєної рацією 3,Зг/л. Продуктивність вироблення етанолу кількості перетвореного СО і потроєної кількості склала 6, 7г/л.день. перетвореного СО» склало 1,09, а парціальний При аналізі параметрів вироблення етанолу тиск Но склав 1,батм. Високий вміст СОг у відхід- подача пантотенату на одиницю клітин, що вироб- ному газі (0,5атм.) показує, що надлишок Не не ляються, становила 900-1125мкг пантотенату/г викликав вироблення етанолу. Питома швидкість вироблених клітин, що гарантує надлишок панто- поглинання СО становила 1,34ммоль/г клітин-хв., тенату. Подібним чином, кількість кобальту, яка тобто, рівень, який забезпечує надлишок СО як подається на одиницю клітин, що виробляються, спосіб вироблення етанолу. становила 991-1239мкг кобальту/г вироблених

Технологія використання надлишку СО для клітин, що також гарантує надлишок кобальту. вироблення етанолу також була продемонстрова- Питома швидкість поглинання СО склала 0,28- на в іншому досліді з С Ципдаапйіїї, штам С-01, в 0О,З5ммоль/г клітин.хв., тобто, такий рівень СО, реакторі АЛОТОСІ ДУМ (Виспї), також з рециркуля- який не викликає вироблення етанолу. Відношен- цією клітин і з циркуляцією культури, протягом ня молей Но, що подається, до суми подвоєної періоду 24 годин. У цьому досліді в 600-мл реак- кількості молей перетвореного СО і потроєної кіль- тор подавався газ, що містить 15,895 Не», 36,590 кості молей перетвореного СО» склало 1,96, тобто,

СО, 38,46 М» і 9,395 СО» при тривалості утримання коефіцієнт вище 1,0, що означає присутність над- газу 1,4хв. Тиск в реакторі підтримувався при лишку Но, який може контролювати вироблення 2175кПа (40рзід). Рідке середовище, що містить етанолу. Парціальний тиск Но у відхідному газі надлишок солей, вітамінів і мікроелементів, пода- склав 0,70-0,87атм., а відношення парціального вали при тривалості утримання рідини 4,8 години, тиску Нг до парціального тиску СО» у відхідному а тривалість утримання клітин, отримана шляхом газі склало 65. Таким чином, реактор виробляв пропускання ефлюенту з реактора через кераміч- етанол завдяки присутності надлишку Н». ний фільтр з порожнистими волокнами, становила У другому досліді реактор високого тиску 19,2 години. рН становила 4,5, швидкість перемі- АТО АМ "м (Виспі) працював як СТЕ. з цирку-

ляцією культури і рециркуляцією клітин при вико- Реактор працював як прямоточний С5ТЕ (без ристанні С Ципдаапйії, штам С-01, для вироблення рециркуляції клітин) в кожному досліді для різних етанолу з СО, СОб5 і Нео в присутності надлишку Не». культур. Тривалість утримання газу була номіна-

Газ, що подавався в реактор, містив 81905 Но, 1695 льно встановлена на 50 хвилин, тривалість утри-

СО і 395 СНа (газ порівняння); тривалість утриман- мання рідини була номінально встановлена на 40 ня газу при подачі становила 2,21 хвилин. Рідке годин, а швидкість перемішування була номіналь- середовище, що містить надлишок солей, вітамінів но встановлена на 1000об6./хв. Ці умови були виб- і мікроелементів, подавали в реактор при трива- рані для можливості порівняння штамів, а не для лості утримання рідини 8,97 годин. Тривалість ут- досягнення високої продуктивності. римання клітин становила 22,7 годин, рНЯА,5 і шви- Як зазначено в Таблиці 3, штам ЕКІ2 був під- дкість перемішування 800об./хв. У цих робочих даний п'яти змінам в середовищі, які зсували спів- умовах перетворення СО склало 91,595, а перет- відношення продуктів вперед і назад від оцтової ворення Не 43,495. Концентрація клітин склала кислоти у якості домінуючого продукту до етанолу 5,5г/л, а концентрація ацетату 2,85г/л. Продуктив- у якості домінуючого продукту. Було продемон- ність вироблення етанолу в реакторі склала 215- строване обмеження пантотенату і обмеження 240г/л.день. кобальту для вироблення етанолу цим штамом.

При аналізі параметрів вироблення етанолу Вироблення штаму С-01 зсували тричі, використо- подача пантотенату на одиницю вироблення клі- вуючи зміни середовища, також продемонструва- тин становила 46бмкг пантотенату/г вироблених вши обмеження пантотенату і обмеження кобальту клітин, що може означати обмеження пантотена- у якості механізму для вироблення етанолу. Виро- том. Кількість кобальту, яка подавалася на одини- блення штаму РЕТС зсували тільки один раз, у цю клітин, що виробляються, становила 46б0мкг вигляді вироблення етанолу за рахунок обмежен- кобальту/г вироблених клітин, що гарантує надли- ня кобальтом. Кожний з штамів показав більш ви- шок кобальту. Питома швидкість поглинання СО соке перетворення Нг при виробленні оцтової кис- становила 1,68 ммоль/г клітин-хв., тобто, рівень, лоти, ніж при виробленні етанолу у якості який міг би означати присутність надлишку СО, домінуючого продукту. Це зумовлене тим, що оц- якби не висока швидкість поглинання Нео това кислота виробляється в умовах обмеження 4 14ммоль/г клітин-хв., яка означає, що інгібування масопереносу (обмеження кількості газу, що пода- субстратом, яке впливає на поглинання На», не від- ється в культуру), в той час як етанол виробляєть- бувалося. Відношення молей Н»г, що подається, до ся при обмеженні поживних речовин і, отже, над- суми подвоєної кількості молей перетвореного СО лишку газу, що може негативно вплинути на і потроєної кількості молей перетвореного СО2 перетворення газу. Малі кількості ацетату завжди становило 5,67, тобто, набагато вище за коефіці- присутні в потоку продукту, коли домінуючим про- єнт 1,0, що означає присутність надлишку Н». Па- дуктом є етанол. Однак, коли домінуючим продук- рціальний тиск Н»5 у відхідному газі склав 2,61атм., том є оцтова кислота, етанол звичайно не присут- а відношення парціального тиску Нг до парціаль- ній у концентраціях, що вимірюються. При зсуві ного тиску СО?» у відхідному газі склало 10,9. Таким домінуючих продуктів від етанолу до оцтової кис- чином, реактор виробляв етанол завдяки присут- лоті шляхом зміни поживних речовин було показа- ності надлишку Н». но, що дуже важко усунути всі сліди етанолу. Пов-

Сумарне порівняння параметрів способу і ре- не усунення етанолу відбувається лише через зультати Прикладів 3-7 показані в Таблиці 2, при- кілька тижнів безперервної роботи в середовищі, веденій нижче. яке покращує вироблення оцтової кислоти.

ПРИКЛАД 8. ЗСУВ У СПІВВІДНОШЕННІ ПРО- ПРИКЛАД 9. РОБОТА В СТАЛОМУ СТАНІ

ДУКТІВ У ШТАМАХ С ИМООАНИЇ ЕВІ2, С-01 1 З/БЕЗ РЕЦИРКУЛЯЦІЇ КЛІТИН

РЕТС ПРИ ВИКОРИСТАННІ РІЗНИХ СКЛАДІВ Кінцевою метою промислового вироблення

СЕРЕДОВИЩА етанолу з СО, Со» і Но є досягнення високих ста-

Способи за винаходом можуть бути викорис- лих концентрацій етанолу і одночасно - отримання тані для будь-якого з штамів С. |иподаапйії. Резуль- високих співвідношень етанолу і ацетату в кінце- тати дослідів стосовно зміни середовища, в яких вому продукті і високої продуктивності. Дані стало- використовувалися штами ЕРІ2, С-01 і РЕТС, по- го стану для вироблення етанолу з СО- казані в Таблиці 3, приведеній нижче. Метою цих збагаченого газу, що містить 2095 Нг2, 6595 СО, 1095 дослідів була демонстрація того, що Кожний З Со» і 595 СНуе, з використанням штаму б. Циподданії штамів може бути підданий впливу, який забезпе- С-01 в прямоточному (без рециркуляції клітин) чує зсув від вироблення оцтової кислоти до виро- С5ТК приведені в Таблиці 4. У цій таблиці СКТ блення етанолу лише за рахунок зміни середови- означає тривалість утримання газу (рідинний об'- ща. Так, в культуру подавали надлишок поживних єм/швидкість течії вхідного газу), ІКТ означає три- речовин (включаючи пантотенат і кобальт) для валість утримання рідини (рідинний /-об'- вироблення оцтової кислоти у якості домінуючого єм/швидкість течії рідини) і ХКТ означає продукту, а потім обмежували пантотенат або ко- тривалість утримання клітин (середній час, який бальт для вироблення етанолу у якості домінуючо- клітини проводять в реакторі). Як зазначено в го продукту. Слід підкреслити, що єдиною метою Таблиці 4, були отримані концентрації етанолу від цих дослідів було показати, що зміна середовища 17,5 до ЗЗг/л і продуктивність вироблення етанолу може привести до зсуву в співвідношенні продуктів в діапазоні від 14,4 до 21,1г/л.день. для кожного з штамів. Таким чином, досягнення Подібні результати показані для вироблення високих концентрацій продуктів і продуктивності не етанолу з газу, не настільки збагаченого СО. Газ, було метою цих дослідів. що використовується в досліді з С. Ципдаайії С-01 без рециркуляції, результати якого представлені в Для отримання маточних культур для інокуляції

Таблиці 5, містить 1695 Нео, 2795 СО, 695 СО і 5195 реактора вирощували культури С Ішипдаанпйії, штам

М». За допомогою цього газу були отримані конце- С-01 (інвентарний номер АТСС 55988) в 150-мл нтрації етанолу в діапазоні від 11 до 26бг/л, з 2,0- сироваткових колбах на СО, Со» і Нео в збагачено- 5,Ог/л ацетату у якості вторинного продукту. Про- му середовищі, що містить 1г/л дріжджового екст- дуктивність вироблення етанолу склала від 11,1 ракту і 1г/л триптикази, солі і вітаміни. Концентра- до 20,1г/л.день. "Концентрація клітин приведена в ція вітамінів становила 0,4мл/л середовища

Таблиці 5 на основі сухої ваги клітин. водного розчину, що містить 50,5мг/л пантотенату

Нарешті, дані сталого стану для перетворення кальцію, 20,б6мг/л а-біотину і 50,вмг/л тіаміну-НСЇІ. газу, що містить 5095 Н»о, 45905 СО і 595 СНи, в С5ТК Колби інкубували при 37"С у вібраційному інкуба- з рециркуляцією клітин при використанні С торі. Культури вирощували до експонентної фази

Циподанйії 0-52 (інвентарний номер АТСС 55989) росту, що визначається візуально. При кожній іно- показані в Таблиці 6. Були отримані концентрації куляції близько 9Омл маточної культури переноси- етанолу 18-23,5г/л і концентрації ацетату 3,0- ли з сироваткових колб в 1 літр середовища, 5,7г/л. Продуктивність вироблення етанолу склала отримуючи 995-ну інокуляцію (за об'ємом). Успішна від 21,1 до 39,0г/л.-день. інокуляція описана нижче. Вказана процедура мо-

ПРИКЛАД 10. ВИСОКА ПРОДУКТИВНІСТЬ же повторюватися декілька разів до отримання

ВИРОБЛЕННЯ ЕТАНОЛУ В С5ТЕ З РЕЦИРКУЛЯ- успішної інокуляції.

ЦІЄЮ КЛІТИН І ПІД ТИСКОМ Для отримання успішної інокуляції 9Омл/л іно-

Реактор високого тиску АОТОСІГАМ М (Виспі) куляту додавали в 1-літрову порцію основного працював як СТЕ. з циркуляцією культури і реци- живильного середовища (показаного в Таблиці 1), ркуляцією клітин при використанні С Іипдаанії, що містило 0,4мл/л вітамінів і солей (1-0). Швид- штам С-01, для вироблення етанолу з СО, СО»: і кість перемішування становила 240об./хв., рН5,3,

Не. Реактор працював при 207кПа (30 рвід), а газ, температура 38,57С і тривалість утримання газу що подавався, містив 6295 Нг, 3195 СО і 2965 СеНв. (при постійному потоку газу) 110 хвилин. Газ, що

Тривалість утримання газу становила 1,14хв. (на подавався, містив 6295 Нео, 3195 СО і 795 Се2Нв. Че- основі атмосферного тиску), при дійсній тривалості рез 13 годин (-1Згод.) було відзначене деяке пе- утримання газу 3,5хв. Рідке середовище, що міс- ретворення СО, а при ї-23год. швидкість перемі- тить надлишок солей, вітамінів і мікроелементів, шування збільшили від 240об./хв. до З0Обоб./хв. подавали в 600-мл реактор при тривалості утри- Тривалість утримання газу знижували до 100 хви- мання рідини 3,6 години. рН становила 4,5, а шви- лин при Ї-27год., а подальше зниження тривалості дкість перемішування 825о0б./хв. У цих умовах кон- утримання газу виконали при і1-46год. Швидкість центрація клітин склала 8г/л, перетворення СО перемішування також підвищували з приростами 9095, а перетворення Не 4095. Потік продукту міс- 100о6./хв. при 1-28год., 59год., 72год. і 85год. тив 20г/л етанолу і 2,75г/л ацетату. Продуктивність При 1-1710год. система працювала при трива- вироблення етанолу склала 150г/л-день. лості утримання газу 80 хвилин і швидкості пере-

Інший реактор високого тиску. АОТОСІ ДМТМ мішування 60боб./хв. Концентрація клітин склала (Виспї), працюючий як С5ТВ. з циркуляцією куль- О,5г/л, а перетворення СО - 3595. Перетворення Нго тури і рециркуляцією клітин при використанні С все ще не відбувалося, але малі кількості етанолу і

Циподаніїї, штам С-01, працював при батм. (75 ацетату ("г/л кожного) накопичилися в цій порції рід), а синтез-газ, що подавався в нього, містив культурального бульйону. Всі зусилля до цього 5595 Но, 30956 СО, 595 СНа і 1095 СО». Тривалість часу були направлені на ріст культури в реакторі. утримання газу становила 1хв. (на основі атмос- Течію середовища з використанням тих же ферного тиску), при дійсній тривалості утримання концентрацій, що І в основному живильному сере- газу 6б,Охв. Рідке середовище, що містить надли- довищі, почали зі швидкістю 0,4мл/хв. при шок солей, вітамінів і мікроелементів, подавали в 1-120год. Потім запустили програму номінальних 600-мл реактор при тривалості утримання рідини приростів швидкості газу, швидкості перемішуван- 1,62 години. Тривалість утримання клітин стано- ня і швидкості середовища при обережному під- вила 24 години, рНА,5, а швидкість перемішування триманні надлишку Но в системі. При 1-210год. 800об./хв. У цих умовах концентрація клітин скла- концентрація етанолу склала 17г/л, концентрація ла 2,0г/л, перетворення СО 9595, а перетворення ацетату г/л, концентрація клітин 1,6г/л, перетво-

Не 6095. Потік продукту містив 25г/л етанолу і Зг/л рення СО - близько 10095, і перетворення Не скла- ацетату. Продуктивність вироблення етанолу ста- ло 90905. Продуктивність вироблення етанолу дося- новила 369г/л.день. гла 11,4г/л.день.

ПРИКЛАД 11. ЗАПУСК З МАТОЧНОЇ КУЛЬТУ- Програма поступового збільшення швидкості

РИ ПРИ НАДЛИШКУ Не» газу була знов запущена. Були спільно збільшені

Запуск з використанням однократної інокуляції кількості вітамінів (див. Таблиці 1) з доведенням з маточної культури забезпечує здоровий інокулят, швидкості введення вітамінів до 0,7мл/л середо- що не містить домішок, але не завжди буває успі- вища. При (1-610год. реактор виробляв 20г/л ета- шною сама процедура інокуляції через досить ни- нолу і близько 2г/л ацетату. Перетворення СО зьку щільність клітин, що використовується, особ- склало близько 10095, а перетворення Не - 8575. ливо, якщо параметри технологічного процесу, такі Продуктивність вироблення етанолу досягла як швидкість газу і швидкість перемішування, під- 14г/л.день. вищуються дуже швидко відразу після інокуляції. ПРИКЛАД 12. ЗАПУСК З ВИКОРИСТАННЯМ

Запуск з використанням однократної інокуляції ІНОКУЛЯТУ З ІСНУЮЧОГО С5ТК з маточної культури описаний в цьому прикладі. Запуск С5ТЕ з використанням безперервної подачі інокуляту з існуючого С5ТЕ більш швидкий тривалого інгібування субстратом, надлишкової і надійний, чим запуск з порційних колб маточної подачі поживних речовин, накопичення СО» або культури. С5ТК, що містить ізолят С ипдаанпіїї, механічних пошкоджень різного характеру, насам- штам С-01 (інвентарний номер АТСС 55988), який перед повинна бути усунена проблема, яка приве- майже припинив вироблення етанолу і продукував ла до надлишкового вироблення оцтової кислоти. 2-3Зг/л етанолу, 7-8г/л ацетату і близько 0,Зг/л бу- Потім надлишок оцтової кислоти, який швидко танолу у вигляді рідкофазних продуктів, заново приводить до інгібування продуктом, видаляють з запустили з використанням безперервної подачі системи шляхом збільшення швидкості рідини для інокуляту з існуючого СЗТ. вимивання оцтової кислоти (але, на жаль, і етано-

С5ТЕ, з якого отримували інокулят, виробляв лу) з системи. Коли рівень ацетату становитиме 3- близько 17г/л етанолу і 1-2г/л ацетату, працюючи 5г/л, швидкість рідини відновлюють і повертають при тривалості утримання газу 25 хвилин, трива- реактор в умови надлишкової подачі Но або обме- лості утримання рідини 32 години, швидкості пе- ження вітамінами або кобальтом (з рециркуляцією ремішування 650об./хв. температурі 38,57С і або без рециркуляції клітин). Повернення реактора рнаі,66. Концентрація клітин становила 1,7г/л, пе- в попередній стан включає зниження швидкості ретворення СО склало по суті 10095, а перетво- газу для запобігання інгібуванню субстратом і/або рення Но 8595. швидкості перемішування до того, як почнеться

Коли почали безперервну подачу інокуляту вимивання клітин і лізис. Потім збільшують швид- (1-0), в цей же час знизили швидкість перемішу- кість перемішування або швидкість газу, як описа- вання до 500об./хв., а тривалість утримання газу но в Прикладі 1. встановили на 38 хвилин. Ефлюент з реактора У даному прикладі СЗТК з рециркуляцією клі- виробництва (0,5мл/хв.) служив у якості інокуляту тин, що містить С Циподаапйіїї, штам С-01, який ви- для С5ТЕК, що інокулююється, при безперервній робляв етанол і оцтову кислоту з СО, СО» і Н», інокуляції протягом декількох годин. Через (-5год. почав виробляти оцтову кислоту у відповідь на (5 годин після початку безперервної інокуляції) механічну несправність. У 2100-мл реактор пода- було відзначене перетворення газу, і швидкість вали газ, що містить 6295 Но, 31956 СО і 795 С»2Нв, перемішування збільшили до 700об./хв. Безпере- при тривалості утримання газу 15 хвилин. Реактор рвну подачу інокуляту припинили через І-28год. працював при швидкості перемішування бОбоб./хв.

Перетворення газів рівномірно покращувалося, і рн4і,86. Тривалість утримання рідини становила дозволяючи здійснювати рівномірні підвищення 23 години, а тривалість утримання клітин 68 годин. швидкості газу (знижуючи тривалість утримання Розчин вітаміну В (водна суміш 50,5мг/л пантоте- газу) і підвищити швидкість перемішування до нату кальцію, 20,бмг/л а-біотину і 50,бмг/л тіаміну- 750об./хв. Через 1-30год. перетворення СО склало НОСІ) був присутнім в рідкому живильному середо- 9595, а перетворення Не 8095. Концентрація етано- вищі, що містить солі і вітаміни, при концентрації лу склала 13г/л, концентрація ацетату 1,5г/л, і ці О4мл вітамінного розчину на літр середовища кількості були сталими значно довше 100 годин. (див. Таблицю 2). Концентрація етанолу впала до

За цей час продуктивність вироблення етанолу 7г/л, в той час як концентрація ацетату виросла до склала 10-15г/л.день. 7г/л, створивши умови, які не є ні стабільними для

ПРИКЛАД 13. ВІДНОВЛЕННЯ ПРИ СЕРИЙОЗ- роботи реактора, ні економічними для виробницт-

НОМУ ПОРУШЕННІ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРО- ва етанолу. Концентрація клітин становила 2,4г/л,

ЦЕСУ перетворення СО 8595 і перетворення Но 2595.

У СТЕК з рециркуляцією клітин, що містить С Стратегія, що використовується для віднов-

Циподанії, штам С-01, в який безперервно подава- лення реактора, включала спочатку різке знижен- ли газ і рідкі поживні речовини і який виробляв 15- ня швидкості подачі газу в реактор, а потім посту-

З5г/л етанолу і 0-5г/л ацетату в сталому стані пове відновлення реактора в присутності (див., зокрема, Приклад 1), стався збій через не- надлишку Но. Швидкість подачі рідини в реактор передбачені зміни в умовах технологічного проце- для запобігання інгібуванню продуктом в даному су, наприклад, механічні пошкодження в реакторі. прикладі не знижували, оскільки концентрація аце-

Збій в реакторній системі може бути незначним, тату не була дуже великою. Замість цього концен- таким як короткочасне збільшення швидкості газу, трації ацетату дозволили поступово знижуватися яке викликає короткочасне інгібування субстратом, до неінгібуючого рівня при зниженні швидкості те- або значним, таким як тривале збільшення швид- чи газу і подальшій роботі в присутності надлишку кості газу, яке зрештою приводить до підвищеного Не. Докладна процедура відновлення реактора вироблення оцтової кислоти і серйознішого інгібу- описана нижче. вання молекулярною оцтовою кислотою, що виро- Рециркуляцію клітин припинили і різко знизили бляється. швидкість газу на 7095 до тривалості утримання

Короткочасні збої легко виправляються шля- газу 62 хвилини, при цьому лише трохи змінивши хом простого регулювання порушених параметрів тривалість утримання рідини з 23 до 30 годин (наприклад, зниження швидкості газу до початко- (1-0). Концентрацію вітамінів в середовищі не змі- вого рівня) і спостереження за прогресом реакто- нювали. При цій зміні в швидкості газу перетво- ра, щоб пересвідчитися, що збій не привів до дов- рення СО збільшилося до 9895, а перетворення Но готривалих проблем. до 8095. Більш важливе те, що в системі з'явився

Однак інгібування молекулярною оцтовою ки- надлишок Нео, про що свідчило зниження вмісту слотою, що виробляється, являє собою серйозні- Со» у відхідному газі з 19 до 595. При появі над- шу проблему. Якщо культурою виробляється над- лишку Нео концентрація ацетату впала, а концент- лишок молекулярної оцтової кислоти в результаті рація етанолу збільшилася.

Наприклад, через ї1-6бгод. (66 годин після перетворення СО з 9195 до 7195. При зменшенні припинення рециркуляції клітин) концентрація швидкості циркуляції культури з О04дрт до ацетату впала до 4г/л, а концентрація етанолу О5дрт рн в реакторі впала, але концентрації дещо піднялася до 7,5г/л. етанолу і ацетату зберігалися.

Присутність надлишку Не» (і зниження концент- Через 50 хвилин після введення СО концент- рації ацетату) дозволила здійснити подальше збі- рація етанолу становила 11,29г/л, а концентрація льшення швидкості газу, спочатку повільно, а по- ацетату 1,75г/л. В цей час подачу надлишкового тім швидше. Через 1-215год. тривалість утримання СО припинили, і концентрація етанолу і рН почали газу становила 29хв., концентрація етанолу 12г/л і падати, а концентрація ацетату - рости. Зниження концентрація ацетату Зг/л. Продуктивність вироб- рН було зумовлене перетворенням етанолу в мо- лення етанолу становила д8г/л.день. СО» був при- лекулярну оцтову кислоту. Таким чином, зсув ета- сутнім у відхідному газі з концентрацією 695, пере- нол-оцтова кислота за рахунок подачі СО є оборо- творення СО становило 9895 і перетворення Но тним. 80905. Через 1-315год. концентрація етанолу стано- ПРИКЛАД 15. РЕЦИРКУЛЯЦІЯ ВОДИ ДЛЯ МІ- вила 16г/л, а концентрація ацетату 4г/л, також при НІМІЗАЦІЇ ВИРОБЛЕННЯ АЦЕТАТУ задовільному ступеню перетворення газу і трива- Рециркуляція води, що використовується, на- лості утримання газу 20 хвилин. Продуктивність зад в ферментаційний біореактор після дистиляції вироблення етанолу становила 11г/л.день. Через з метою виділення етанолу важлива для мініміза- 1-315год. концентрація етанолу досягла 20г/л, при ції вироблення ефлюента і для максимізації вихо- вмісті ацетату 3,5-4г/л. Продуктивність вироблення ду етанолу, що утворюється в реакторі, а також етанолу становила 16г/л.день. Тривалість утри- для обмеження вироблення оцтової кислоти. Дис- мання газу впала до 16 хвилин, а перетворення тиляція виявилася найбільш економічним спосо-

СО і Не становило 9595 і 7395, відповідно. Ці умови бом для концентрування 15-35г/л етанолу, отри- підтримувалися майже 200 годин безперервної маного з реактора, до 9590-го етанолу. Потім роботи, що показало відновлення здатності реак- використовується адсорбція за допомогою моле- торної системи виробляти етанол і, по суті, утри- кулярних сит для подальшого концентрування мання колишніх робочих умов. етанолу до бажаної концентрації. При проведенні

ПРИКЛАД 14. СПОСІБ ВИРОБНИЦТВА ЕТА- дистиляції 9596-й етанол у воді утворюється у ви-

НОЛУ З НАДЛИШКОВОЮ ПОДАЧЕЮ СО гляді дистиляту. Вода під час дистиляції виробля-

Простий дослід був проведений в реакторі- ється у якості кубового продукту. Кубовий продукт баку високого тиску, безперервної дії, з перемішу- містить оцтову кислоту з реактора, вироблену під ванням, використовуючим рециркуляцію клітин, час ферментації (3-5г/л ацетату), ії поживні речо- для демонстрації зсуву від вироблення оцтової вини, невикористані під час ферментації або зруй- кислоти до вироблення етанолу завдяки присутно- новані впливом тепла при дистиляції, такі як мік- сті високих концентрацій СО. Перед проведенням роелементи та інші мінерали. Рециркуляція досліду реактор, що містить С Ц|ипоаанйії, штам сС- поживних речовин мінімізує кількість ефлюента, 01, працював під тиском 140-170кПа (20-25 рвід), що повинен бути оброблений, а також кількість де газ, що подавався, містив 5795 Но, 3695 СО і 790 поживних речовин, яка згодом повинна додавати-

СоНв. Тривалість утримання газу становила менше ся в ферментаційний біореактор. Рециркуляція 2 хвилин, тривалість утримання рідини 38 годин, ацетату запобігає утворенню додаткової оцтової тривалість утримання клітин 28 годин, швидкість кислоти шляхом встановлення рівноваги між ета- перемішування 60Ооб./хв. і температура 38"С. У нолом і оцтовою кислотою. Таким чином, при ви- цих умовах перетворення СО було змінним і в се- користанні рециркуляції води оцтова кислота на редньому становило 8595; перетворення Но було виході не утворюється. Рециркуляція більше ніж 3- змінним і в середньому становило 2095. Концент- 5г/л ацетату може привести до інгібування реакто- рація клітин складала близько 2,5г/л, а потік про- ра оцтовою кислотою. Таким чином, внаслідок дукту містив 9г/л етанолу і Зг/л ацетату. рециркуляції води разом з ацетатом субстрат СО,

На першому етапі для підготовки досліду збі- СО» І Нг може перетворюватися на етанол у ви- льшили тривалість утримання газу для забезпе- гляді єдиного продукту. чення відсутності надлишку СО. Тиск підтримува- Таблиця 8 показує результати ферментації га- ли при 158-165кПа (23-24 рід). рН контролювали зу, що містить 5095 СО, 4595 Нг і 595 СНа при вико- досить довго, щоб пересвідчитися в її стабільності ристанні С. Ципдаанії, штам 0-52, з рециркуляцією в нормальному робочому діапазоні 4,5-4,6. Потім з води. У цих дослідах пермеат після фільтрації че- газом, що регулярно подавався, змішали чистий рез порожнисті волокна, яка використовується для

СО для отримання складу газу 4795 Н», 4795 СО і рециркуляції клітин, направляли на дистиляцію. 696 СоНв, при тривалості утримання газу 2,3хв. Після видалення етанолу воду фільтрували через

Потім рН в реакторі, склад відхідного газу і потік 0,2-мкм фільтр для видалення осаджених побічних продуктів спостерігали у часі. продуктів. Фракція оборотної води в загальній кі-

Таблиця 7 показує зміни рН і склад продуктів у лькості води (у якості середовища), що подається часі після додання надлишку СО в систему. Через в реактор, в цих дослідах складала від 25 до хвилин після додання СО рН в реакторі підня- 10096. Дослід зі 10090 оборотної води тривав май- лася до 5,25 і співвідношення в культурі здвинуло- же 500 годин або близько 20 тривалостей утри- ся до 1,54г/ (0,0257моль/л) ацетату до 1,12г/л мання рідини. З результатів зі 10095 оборотної (0,0243моль/л) етанолу. Підвищення рН сталося води видно, що оцтова кислота на виході не виро- внаслідок перетворення вільної оцтової кислоти в бляється. Фактично, у кінцевому рахунку була ви- етанол. Ця зміна супроводжувалася зниженням трачена невелика кількість оцтової кислоти. Про-

дуктивність вироблення етанолу склала від 12 до зьке вироблення клітин в біореакторі. Подібним 27г/л.день. чином, концентрація кобальту в середовищі ста-

ПРИКЛАД 16. ДВОСТУПЕНЕВА СИСТЕМА новила Імлн'!, яка також забезпечує надлишок

Сс5ТК З ПОДАЧЕЮ ПАНТОТЕНАТУ НА СТАДІЮ кобальту. Однак парціальний тиск Не у відхідному

РОСТУ газі підтримувався у надлишку величиною 0,55атм.

Правильна подача пантотенату на стадію рос- шляхом подачі газу, який не містить СО» і містить ту являє собою змінну величину, яка повинна оп- 63,395 Не, 31,495 СО і 5,395 Са2Нвє, що забезпечило тимізуватися. Типові результати для реактора відношення Нео, що / подається/(/2СОперетв."7ЗС Огперетв.) стадії росту з використанням С ІЦиподаанйіїї, штам С- більше 1, і шляхом обережного регулювання шви- 01, були описані в Прикладах 11 і 12, за винятком дкості подачі газу їі швидкостей перемішування, того, що в цьому реакторі буде вироблятися дещо для досягнення ступеня перетворення СО більше більше оцтової кислоти, оскільки на стадію росту ніж 9595 і перетворення Но більше ніж 8095. По мірі подається додаткова кількість пантотенату або досягнення цих високих ступенів перетворення кобальту для забезпечення вироблення здорової і концентрація клітин збільшується від початкового стабільної культури. Концентрація вітамінів, що рівня близько Ог/л до «1,5г/л. використовуються, становила 0,7-0,д8мл/л середо- Оскільки концентрація пантотенату під час за- вища у вигляді водного розчину, що містить пуску підтримується постійною, кількість мкг пан- 50,5мг/л пантотенату кальцію, 20,бмг/л а-біотину і тотенату на грам клітин, що виробляються, посту- 50,бмг/л тіаміну-НСІ. СТЕ стадії виробництва з пово знижується до концентрації менше 15мкг рециркуляцією клітин отримує ефлюент з реактора пантотенату/г вироблених клітин, що є умовою стадії росту і виробляє етанол у якості домінуючо- обмеження пантотенатом. Таким чином, в процесі го продукту. Концентрація пантотенату, що пода- росту система переходить в умови обмеження ється в цей реактор, набагато нижче, ніж на стадії пантотенатом. Високі співвідношення етанолу і росту, всього 0,1-0,2мл всіх вітамінів/л середови- ацетату досягаються шляхом запуску з надлишком ща у вигляді водного розчину, що містить 50,5мг/л Н». В альтернативі, на ранніх стадіях запуску реак- пантотенату кальцію, 20,бмг/л а-біотину і 50,бмг/л тору дають можливість виробляти оцтову кислоту, тіаміну-НСІ. Тривалість утримання газу на стадії а потім регулюють співвідношення продуктів шля- виробництва становила 11-30 хвилин, тривалість хом обмеження пантотенату. утримання рідини складала близько 20 годин, три- ПРИКЛАД 18. ОБМЕЖЕННЯ КОБАЛЬТУ В валість утримання клітин 30-50 годин, а швидкість РЕАКТОРІ перемішування 800-900о06./хв. рН становила 5,0, а Культура С Ципоааніїї, штам ЕКІ2, отримувала температура 38"С. Після досягнення реактором 62-3500мкг кобальту/г клітин, що виробляються, сталого стану тривалість утримання газу підтри- під час вироблення оцтової кислоти з СО, СО? і Не, мувалася постійною при 11хв., тривалість утри- тобто, реактор не був обмежений кобальтом (або мання рідини була встановлена на 19 годин, три- будь-яким іншим обмежуючим чинником, крім мо- валість утримання клітин була постійною - 37 жливості перенесення газу в культуру), і етанол не годин, а швидкість перемішування становила був виявлений в потоку продукту. Під час обме- 900об./хв. Перетворення СО в середньому стано- ження кобальтом для вироблення етанолу з СО, вило 9695, а перетворення Не» - в середньому 6095. СО» і Не в С Циподаанії, штам С-01 подавали 33-

Концентрація етанолу встановилася на 25-30г/л, 48мкг кобальту/г вироблених клітин, при підтри- при цьому також було присутньо Зг/л ацетату. манні всіх інших поживних речовин в надлишку. У

Продуктивність вироблення етанолу становила цих умовах штам С-01 виробляв 18-26г/л етанолу і 31,6-37,9г/л.день. близько 4г/л ацетату.

ПРИКЛАД 17. РЕГУЛЮВАННЯ ПАРАМЕТРІВ ПРИКЛАД 19. ЗАПОБІГАННЯ АКЛІМАТИЗАЦІЇ

ФЕРМЕНТАЦІЇ ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ АКЛІМАТИЗА- ДО НИЗЬКОЇ ОБМЕЖУЮЧОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КО-

ЦІЇ ДО НИЗЬКОЇ ОБМЕЖУЮЧОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ БАЛЬТУ

ПАНТОТЕНАТУ КАЛЬЦІЮ Акліматизації до низької обмежуючої концент-

Акліматизації культури в ферментаційному рації кобальту запобігають шляхом регулювання бульйоні до низької обмежуючої концентрації пан- параметрів ферментації (швидкість газу, швидкість тотенату кальцію запобігають шляхом регулюван- рідини, швидкість перемішування, вміст Со»), ня параметрів ферментації (швидкість газу, швид- уникаючи істотних змін в поживних речовинах, кість рідини, швидкість перемішування, замість цього підтримуючи порівняно постійну кон- парціальний тиск Нег), уникаючи істотних змін в центрацію поживних речовин, що подаються. Це поживних речовинах, замість цього підтримуючи здійснюють таким чином. порівняно постійну концентрацію поживних речо- Під час запуску лабораторний С5ТК Мем вин, що подаються. Це здійснюють таким чином. Вгопем/іск Зсієпіййс Віойо? з С. Циподданії, штам С-

Під час запуску лабораторний С5ТВ Мем 01, отримував потік рідкого середовища, що міс-

Вгипем/іск Зсієпійс Віойо? з С. Ципдаанйії, штам с- тить вітаміни, мікроелементи і солі, необхідні для 01, отримував потік рідкого середовища, що міс- живлення культури. Концентрація кобальту в жи- тить вітаміни, мікроелементи і солі, необхідні для вильному середовищі становила 75 млн". Це кон- живлення культури. Концентрація пантотенату в центрація, яка в поєднанні з повільною швидкістю живильному середовищі становила 20мкг/л. Це подачі середовища забезпечує подачу більше концентрація, яка в поєднанні з повільною швидкі- 5Омкг кобальту на грам клітин, що виробляються стю подачі середовища забезпечує подачу більше (надлишок кобальту), через низьке вироблення 100мкг пантотенату кальцію на грам клітин, що клітин в біореакторі. Подібним чином, концентра- виробляються (надлишок пантотенату), через ни- ція пантотенату в середовищі становила 20мкг/л,

яка також забезпечує надлишок пантотенату. Од- ПРИКЛАД 22. МАСОПЕРЕНОС нак парціальний тиск Не у відхідному газі підтри- Приклад надлишкового масопереносу, ведучо- мувався у надлишку величиною 0,55атм. шляхом го до вироблення етанолу, представляє лаборато- подачі газу, що містить великі кількості Не і не міс- рний С5ТЕ з рециркуляцією клітин, що містить С. тить СО», і шляхом обережного регулювання шви- Циподаданйіїї, штам ЕКІ2, і працює без обмеження дкості подачі газу і швидкостей перемішування, поживними речовинами або надлишку Нг або СО в для досягнення ступеня перетворення СО більше газі, що подається. Тобто, пантотенат подається зі ніж 9595 і ступеня перетворення Но більше ніж швидкістю більше ніж 100мкг пантотенату кальцію 8095. По мірі досягнення цих високих ступенів пе- на г клітин, що виробляються, і кобальт подається ретворення концентрація клітин збільшується від з швидкістю більше за 100мкг на г клітин, що ви- початкового рівня близько Ог/л до -1,5г/л. Оскільки робляються. Но присутній у відхідному газі при концентрація кобальту під час запуску підтриму- О,2атм., а питома швидкість поглинання СО скла- ється постійною, кількість мкг кобальту на грам дає менше 0,Зммоль СО/г клітин-хв. Швидкість клітин, що виробляються, поступово знижується перемішування складає 800об./хв. У цих умовах до концентрації менше 50мкг кобальту/г виробле- культура виробляє тільки оцтову кислоту (в потоку них клітин, що є умовою обмеження кобальтом. продукту етанол відсутній). Якщо швидко збільши-

Таким чином, в процесі росту система переходить ти швидкість перемішування до 90боб./хв. або в умови обмеження кобальтом. Високий вихід ета- збільшити швидкість газу приблизно на 1095, тоді нолу досягається шляхом запуску з надлишком Нг етанол виявляється в потоку продукту, доти, доки в газі, що подається. В альтернативі, на ранніх концентрація клітин не збільшиться, поглинаючи стадіях запуску реактору дають можливість виро- газ, або доти, доки культура не загине через інгі- бляти оцтову кислоту, а потім регулюють співвід- бування субстратом. ношення продуктів шляхом обмеження кобальтом. ПРИКЛАД 23. КОНТРОЛЬ ІНГІБУВАННЯ ОЦ-

ПРИКЛАД 20. ПОДАЧА НАДЛИШКУ ВОДНЮ ТтОвОюЮ КИСЛОТОЮ, що ВИРОБЛЯЄТЬСЯ

Під час роботи лабораторного реактора У лабораторному С5ТЕ, що виробляє 8г/л оц-

АЦТОСІ АМ М (Виспї), працюючого як С5ТЕ. з ре- тової кислоти і 10г/л етанолу, тривалість утриман- циркуляцією рідини і рециркуляцією клітин, куль- ня рідини знизили з 24 годин до 12 годин на період тура С Ципдаанії отримувала надлишок вітамінів, 36 годин у спробі вимити з реактора оцтову кисло- мікроелементів і солей, необхідних для живлення ту, яка обмежує здатність культури виробляти бі- культури. Реактор працював з надлишком Но в льше етанолу. Всі інші робочі умови реактора і газі, що подається, таким чином, що відношення живильне середовище залишилися незмінними. молей Не в газі, що подається, до суми подвоєної По закінченні цього періоду тривалість утримання кількості молей перетвореного СО і потроєної кіль- рідини повернули до 24год. і отримали потік про- кості молей перетвореного СО» становило 5,67. дукту, що містив Зг/л ацетату і 15-25г/л етанолу.

Якщо це відношення не більше 1,0, надлишок Но Для усунення інгібування продуктом було потрібно не може бути присутнім в реакторі, і вироблення декілька спроб. В альтернативі можна додати Не в етанолу не може відбуватися. Крім того, парціаль- газ, що подається, для регулювання надлишком ний тиск Не у відхідному газі становив 2,61атм., Не, оскільки надлишок СО» також може привести тобто, рівень, що перевищує необхідну умову до переважання вироблення оцтової кислоти над

О,4атм. для вироблення етанолу за рахунок над- виробленням етанолу. Ці модифікації запобігають лишку Не. Нарешті, співвідношення парціального надлишковому виробленню оцтової кислоти і, от- тиску Но і парціального тиску СО» у відхідному газі же, запобігають небажаному співвідношенню про- становило 10,88, тобто, рівень, який перевищує дуктів і низькій продуктивності вироблення етано- 3,0 і який забезпечує присутність достатньої кіль- лу. Потім поновлюють використання надлишку Но кості Нг для використання усього присутнього вуг- в газі, що подається, або обмежуючої концентрації лецю. У цих умовах реактор виробляв майже 26бг/л рідкофазної поживної речовини. етанолу і менше Зг/л ацетату. Продуктивність ви- ПРИКЛАД 24. НАДЛИШКОВА ПОДАЧА МО- роблення етанолу склала більше ніж 200г/л.день. НООКСИДУ ВУГЛЕЦЮ

Якщо будь-який з вищезазначених критеріїв не Культура С. Ципдаапіїї, штам ЕКІ2, що одержу- виконується, реактор не може виробляти етанол вала надлишок поживних речовин (надлишок пан- за рахунок надлишку Но. Другий аспект надлишко- тотенату і кобальту) і не одержувала надлишку Но вої подачі Но полягає в тому, що вона приводить в газі, що подається, мала питому швидкість пог- до додаткового відновлення фередоксина, що линання СО 0,23-0,48ммоль/г-хв., і етанол не був окиснюється гідрогеназою. виявлений в потоку продукту. Проте коли культура

ПРИКЛАД 21. ОСЛАБЛЕННЯ ІНГІБУВАННЯ С Циподаанії, штам С-01 подібним чином отримува-

СУБСТРАТОМ ла надлишок поживних речовин і не отримувала

Лабораторний СЗТ Мем/ Вгипзулск Зсієепійс надлишку Не в газі, що подається, але знаходила-

ВіопоФ, працюючий при швидкості перемішування ся в умовах, коли надлишкова подача СО викли- 800об./хв. показав на виході концентрацію СО кала вироблення етанолу, питома швидкість пог- 1095, хоч до цього він працював лише з 595 СО у линання СО становила 0,67-1,34ммоль/г-хв. У цих відхідному газі. Шляхом зниження швидкості пе- умовах культура виробляла 9,9-12,0г/л етанолу і ремішування до б0боб./хв. інгібування СО було 2,6-2,7 г/л ацетату. усунено, і концентрація СО на виході повернулася ПРИКЛАД 25. КОНТРОЛЬ СПІВВІДНОШЕНЬ до 5905. Це привело до підвищення поглинання Нг, ПРОДУКТІВ ШЛЯХОМ ВИДАЛЕННЯ КЛІТИН необхідної умови ефективного використання всьо- Ферментація газоподібного субстрату (3090 го газу, що подається в реактор. СО, 15 Не, 1095 СО», 4595 Мг2) здійснюється в СЗТ

(рН 5,0, температура 38"С, тиск 138кПа (20 рзід)) з використанням С. І|иподдапії, штам С-01, з рецир- Середовище для вироблення етанолу куляцією клітин (тривалість утримання клітин 40 годин і тривалість утримання рідини 6 годин); ріст 2г/п геСі:4НО культури не обмежувався кобальтом, пантотена- 8596 Нерог . . 1 а том кальцію або будь-якою іншою поживною речо- (Мікроелементи МЕН МРЕМ З-З -кях0 - -ж- виною. В процесі росту культури досягається така МНС щільність клітин, що питоме поглинання (ммоль

СО на грам сухих клітин за хвилину) становить 0,5, і вироблення оцтової кислоти переважає над ви- Мосіг вно робленням етанолу. Щоб запобігти такій можливо- пасіаНею. то сті, збільшують швидкість видалення клітин, щоб запобігти збільшенню щільності клітин, так, щоб стала концентрація клітин зберігалася досить ни- " Мікроелементи МРЕМ містять (на літр розчину): 1О0мл 8595 зькою для підтримання питомого поглинання вище чинни по Ме сив оо

Н оСі2вп2О, 00 Оег пСінгО, баг моно, 0 б,9г б,зммоль СО на грам сухих клітин за хвилину. За МамоОго2НЬО, 2,00г Ресін4АНеО, 001г МаббеОз і ОМог рахунок цього тривалість утримання клітин знижу- МагууО:2Но2О 5 Розчин вітамінів містить 20,бмг/л а-біотину, ється до 6-25 годин. 50,бмг/л тіаміну-НСІ і 50,5мг/л кальцієвої солі а-пантотенової кислоти З Істотно змінюється: від 0,3-0,5мл під час інокуляції до 0,7-0,вмл при високих швидкостях газу

Таблиця 1

Таблиця 2

Сумарне порівняння параметрів технологічного процесу і результати прикладів контролюючих механізмів

Поик- Концентрації | Продуктив- | Подача пантоте- | Подача кобаль- Парціальний |Питоме погли- ла Контрол. меха- продукт ність вироб- |Інату (мкг пантове-Іту (мкг кобальту/ ся тиск Нг у нання СО

Ме. нізм Етанол | Ацетат | лення етано- | нату/гвиробле- | гвироблених | (2сСОперетв ж |відхідному газі| (ммоль/г клі-

Ш г/л г/л пу (г/л:день) них клітин) клітин) ЗзСОгперетв (атм.) тин'хв.)

З |Масопереносї | 0 | 1073 0 | 1575-3150 1734-3468 0,06-0,07 | 0,275-0,48

З |Масопереносї | 0 | 10-44 | (ФО | 2250-3600 62-99 0,875 0,11-0,20 0,33-0,40 15-19 11,5-14,5 18-24 5000-6660 0,55-0,64 0.23-0.30 3960 0,60-0.65 |Кобальт// | 18 | 4 | 270 | 857 | 476 | 103 | 060 | 050 6 |НадлишокСО | 99 | 26 | 290 | 97 | 836 | ї09 | 16 | 134 ( 6 |НадлишокСО | 120 | 27 | 600 | 294 2 | 735 | 030 | 06 | 067 ( 900-1125 9591-1239 0,7-0,87 0.28-0.35 25,96 215-240

Таблиця З

Результати зсуву співвідношення продуктів штамів Сіовігідішт |подааніїї

С. Іоподанії

ЕВІ2 |Збільшенняоцтовоїкислоти.д | її | 790 | 80 | 0 | ло

ЕНІ2 |Обмеженняпантотенатуї /-: | -: 03 | 88 | 20 | 25 | 0

ЕВІ2 |Збільшенняоцтовоїкислоти.д | 055 | 90 | 85 | 10 | 55

ЕНІ2 |Обмеженняпантотенатуї /-: | 05 | 90 | 20 | 0 | 0

ЕНІ2 |Збільшенняоцтовоїкислоти.д | 08 2 | 100 | 9 | 1 | 7

ЕВІ2 |Обмеженнякобальтуї /-: | 13 | 780 | 20 | 9 | з ро-01 00 |Збільшенняоцтовоїзкислоти.їд | 12 | 96 | 9 | 7 | 8 2 жзРБ« (сої 00 |Обмеженняпантотвнатуї/-:/ | 08 | 60 | 3 | 4 |! 0 2 ( (С-01 00 | Збільшенняоцтовоїкислоти.д//-///| 12 | 96 | 90 2 | « | 9 ( рої 00 |Обмеженнякобальту.//-:/ /..-/ | 77/25 | 80 | 20 | 77 | 2 2 К(

РЕТС |Збільшенняоцтовоїкислоти.ї | 08 | 65 | 55 2 | 2 | 0 ф(

РЕТС |Обмеженнякобальтуї /-: | 10 | 95 | 55 | 8 | 1 х На основі сухої ваги клітин

Таблиця 4

Дані сталого стану для перетворення

СО-збагаченого газу в етанол з використанням С І|шподаанії, штам С-01 11,93 12,67

Продовження таблиці 4 738 | 238 | 750 2 Щщ | 270 | 90 | 25 | 18 | 25 | 182169. | 31 | 750 2 2 ЩщЦ | 360 | 90 | 18 | 23 | з30 | 78 жруфл(( х На основі сухої ваги клітин

Таблиця 5

Дані сталого стану для перетворення газу, що містить 2795 СО, 1696 Не, 5195 М», в етанол з використанням С Іипдаанпйії, штам С-01. Без рециркуляції клітин 83 | 238 | 90 4 щ | 26 | 89 | 55 | 72 | 20 | 21 ж83 | 277 | 90 5 Ющю В 27 | 89 | 47 | 715 | з0 | зо Ж71 | 333 | 90 | 30 | 86 | 37 | 79 | 30 | 13774 | 333 | 90 | 30 | 87 | 40 | 195 | 30 | мі щ634 | 333 | 90 | 30 | 86 | 37 | 21 | 35 | ї51 КжрКух68 | 333 | 90 4 щ | 30 | 86 | 4 | 209 | зи | 5572 | 343 | 90 | 30 | 85 | 40 | 22 | 38 | 15552 | 33 | 90 2 5 Юющю У! 37 | 85 | 40 | 250 | 40 | 182459 | 33 | 90 | 41 | 83 | з | 25 | 35 | 82459 | 29 | 90 | 40 | 80 | 35 | 23 | 40 | 190476 | 29 | 90 | 39 | 90 | 35 | 79 | 50 | 157 Зфу425 | 28 | 90 | 42 | 80 | 30 | 23 | з30 | 9755 | 37 | 90 | 34 | 81 | 40 | 23 | з30 | 49526 | 31 | 90 | 38 | 84 | 50 | 23 | 30 | 178 Ж («51 | 31 | ющркяю 3 | 80 | 28 | 26 | 35 | 21625 | 31 | 90 2 5ЮщюКюмеВ | 3/5 | 82 | 30 | 255 | 30 | 197євв | з | 90 | 36 | 86 | 61 | 22 | 40 | то х На основі сухої ваги клітин

Таблиця 6

Дані сталого стану для перетворення газу, що містить 50905 Не, 4595 СО і 595 СНа, в етанол з використанням ізоляту 0-52 в С5ТК з рециркуляцією клітин 68 | 543 | 163 | 47 | в | 577 | 234 | 57 | 345 б60 | 416 | 1745 | 60 | 825 | 500 | 215 | 30 | 35660 | за | 7120 | 5 | 80 | 560 | 195 | 45 | 390 х На основі сухої ваги клітин

Таблиця 7 рН і склад рідких зразків при зсуві співвідношення ацетату і етанолу в присутності надлишку СО 0 | 469 | Р... Ї7.7ДИ771000лов117111117111з3м1117 11111103 71 , | 528 | Ж: ЇЇ (Кц 4 Ї 777777717/7л15 7 77171710 71 2 | 498 | (Ж: к: ЇЇ щ(М МЗ8 | 7 /716 | 77777703 71 во | 473 | щ(рР2гяі 7 |77777171717с7ср7лов 17771712 11111103 1.1 х На основі сухої ваги клітин

Таблиця 8

Дані ферментації газу ізолятом 0-52 з рециркуляцією клітин і води

Фо оборот- | Конц. клітин 7 Продуктивність вироб-

Час (год.) ної води г/п Перетворення газу Продукти лення етанол 71177771 сою Нео) | Етанол (гл) | Ацетат (г/л) Чистий ацетат (г/л) 075 | 25 | 21 | 95 | 68 | 12 | 4 | 4 ! 2: 75193. | 50 | щ21 | 95 | 75 | 15 | 6 | 5 / 15 193-462, | 75 | 21 2 | 92 | 60 | 7 | 5 | 44 | ЧФ 462-554 1713 12-16 554-669 1319 12-18 6б9-943 | 700 | 30 | 92 | 70 | 23 | 6 | з | 2 Ж 94341087 | 100 | 30 | 92 | 60 | 23 | 6 | 0 | з 1087-1232 | 100 | 27 | 92 | 60 | 23 | 6 |! 0 / з 1232-1375 | 100 | 30 | 9 | 60 | 27 | 6 | 7 / 2» 1375-1534 | 7100 | 35 | 88 | 35 | 23 | 5 ! 0 !/! з / х На основі сухої ваги клітин

Всі опубліковані документи приводяться тут у фахівцеві в цій області. Такі модифікації і пере- вигляді посилань. Різноманітні модифікації і варі- роблення композицій і способів за винаходом ації даного винаходу включаються у вищевикла- входять в область винаходу, викладену в приве- дений опис і повинні бути очевидні досвідченому деній нижче формулі винаходу. ях «ідківний газ ня паливо КІЗ 95 ней етан БО пожикої речовини ї

С ли «т й з

В приват. 13 неперетвореной те 3 Й й в і | бозводіні ставал. миши й й 5 середавюце НД ля

Ки | й - х че рідкий продукт ще -е ще сантез-таз я МОЛЕКУЛЯРНЕ СИТО

ЦІ обороти кодо - ; 5,

ФЕРМЕНТЕР СЕПАРАТОР КЛІТИН ДИСТИЛЯЯ тВнія подані тазу

Фіс. 1 Фі.

Комп'ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601