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KR100879577B1 - 미생물 발효로부터 에탄올의 생산을 증가시키기 위한 방법 - Google Patents

미생물 발효로부터 에탄올의 생산을 증가시키기 위한 방법 Download PDF

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KR100879577B1 KR1020037001116A KR20037001116A KR100879577B1 KR 100879577 B1 KR100879577 B1 KR 100879577B1 KR 1020037001116 A KR1020037001116 A KR 1020037001116A KR 20037001116 A KR20037001116 A KR 20037001116A KR 100879577 B1 KR100879577 B1 KR 100879577B1
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Abstract

한가지 이상의 환원 가스를 함유하는 가스 기질의 혐기성 세균 발효로부터 에탄올을 제조하기 위한 안정되고 연속적인 방법은 액체 영양분 배지에서 발효 바이오리액터 혐기성, 아세토제닉 세균을 배양하는 단계; 가스 기질을 바이오리액터로 공급하는 단계; 세균이 바이오리액터에서 정상 상태 및 안정된 세포 농도를 달성한 후에, 발효육즙에서 산화 환원 포텐샬을 줄이거나, NAD(P)H 대 NAD(P) 비를 증가시킴으로써, 바이오리액터의 세균을 조작하는 단계를 포함한다. 바이오리액터에서 유리 아세트산 농도는 5 g/L 유리 산 이하로 유지된다. 이 방법은 바이오리액터내 발효육즙에서 하루에 lOg/L 이상의 생산율로 에탄올이 생산되도록 한다. 에탄올과 아세테이트 모두 1:1 내지 20:1의 범위의 에탄올 대 아세테이트의 비로 생산된다.
환원 가스, 혐기성 세균, 발효, 에탄올, 바이오리액터, 아세테이트, 아세토제닉

Description

미생물 발효로부터 에탄올의 생산을 증가시키기 위한 방법{METHODS FOR INCREASING THE PRODUCTION OF ETHANOL FROM MICROBIAL FERMENTATION}
본 발명은 혐기성(또는 통성혐기성) 아세토제닉 세균을 사용하여 하나 이상의 환원 가스를 함유하는 가스 기질로부터 에탄올의 제조를 위한 미생물 발효 방법에서의 개선을 지시한다.
본 발명은 미국 에너지부(Department of Energy) 허가 번호 DE-FC04-94AL98770, 85X-TA046V 및 85X-SX613V, 미국 농무부(Department of Agriculture) 허가 번호 96-AARC-1-0077 하에 정부지원으로 이루어진 것이다. 미국정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
특정 혐기성 세균을 사용하여 적절한 영양분과 미량 미네랄을 함유하는 배지에서 가스 기질의 미생물 발효로부터, 다른 유기 산, 알코올, 수소 및 유기 산 염 중에서, 에탄올을 제조하기 위한 방법이 본 발명자들에 의해 개시되었다. 예를 들어, 본 발명자들은 희석 가스 혼합물이 직접적인 경로에 의해 폐가스 성분을 이용하는 혐기성 세균의 하나 이상의 균주를 함유하는 바이오리액터 안으로 도입되어 원하는 화합물을 제조하는 것을 이전에 개시하였다. 그 화합물은 제조된 화합물을 위한 적절한 회수 방법을 이용하여, 개별적인 용기 또는 용기들에서의 수성 상으로부터 회수된다. 회수 방법의 예는 추출, 증류 또는 그들의 조합, 또는 다른 효율적인 회수 방법들을 포함한다. 세균은 수성 상으로부터 제거될 수 있고 바이오리액터로 재순환되어 높은 세포 농도를 유지하여, 따라서 생산율을 최대화할 수 있다. 세포 분리는, 만일 원한다면, 원심분리, 막질 여과, 또는 다른 기술에 의해 수행된 다. 예를 들어, International Patent Application No. W098/00558, published January 8,1998; U. S. Patent No. 5,807,722; U. S. Patent No. 5,593, 886 and U. S. Patent No. 5,821,111를 참고하라.
그것의 주요 생산물인 아세트산에 더하여, 혐기성 세균의 균주 Clostridium ljungdahlii는 일산화탄소(CO), 수소(H2) 및 이산화탄소(CO2)의 변환에서 생산물로서 에탄올을 또한 제조할 수 있다. CO, CO2, 및 H2 로부터 아세트산(CH3COOH) 및 에탄올(C2H5OH)의 제조는 하기의 전반적인 화학양론식으로 나타낸다.
4 CO + 2 H20 → CH3COOH + 2 CO2 (1)
4 H2 + 2 CO2 → CH3COOH + 2 H2O (2)
6 CO + 3 H2O → C2H5OH + 4 CO2 (3)
6 H2 + 2 CO2 → C2H5OH + 3 H20 (4)
C. ljungdahlii의 균주의 몇가지 예는 균주 PETC (U. S. Patent No. 5,173,429); 균주 ERI2 (U. S. Patent No. 5,593,886) 및 균주 C-01 및 O-52 (U. S. Patent No. 6,136,577)을 포함한다. 이들 균주는 각각 American Type Culture Collection(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 Accession No: 55383(원래는 ATCC No. 49587), 55380, 55988, 및 55989로 각각 예치된다. C. ljungdahlii의 각각의 균주는 약 22몰%의 구아닌과 시토신(G+C) 뉴클레오티드 함량을 갖는 혐기성, 그램-포티지브 세균이다. 이들 세균은 성장을 위해 다양한 기질을 사용하지만, 메탄올 또는 락테이트는 아니다. 이들 균주는 그들의 CO 내성, 특정 가스 흡수 속도 및 특정 생산율에서 다르다. 자연에서 발견되는 "야생" 균주에서, 매우 작은 에탄올 제조가 나타난다. C. ljungdahlii의 균주는 37℃에서 이상적으로 움직이고 전형적으로 "야생" 상태에서 약 1:20의(20부 아세틸 당 1부 에탄올) 에탄올 대 아세틸(즉, 유리 또는 분자 아세트산과 아세테이트 염 모두를 언급한다) 생산물 비를 생성한다. 에탄올 농도는 전형적으로 오직 1-2 g/L이다. 에탄올을 제조하는 이러한 능력은 중요하지만, 낮은 에탄올 생산율 때문에 "야생" 세균은 상업적인 기반에서 에탄올을 경제적으로 제조하는데 사용될 수 없다.
미소한 영양분 조작과 함께 상기 C. ljungdahlii 균주는 1:1의 생산물 비로(동일 부분 에탄올과 아세틸) 에탄올과 아세틸을 제조하는데 사용되어 왔지만, 에탄올 농도는 1일 당 10g/L 이하의 낮은 생산율을 초래하는 수준인 10g/L 미만이다. 게다가 주로 에탄올의 존재와 조합할 때 상대적으로 높은(8-10g/L) 농도의 아세틸(2.5-3 g/L 분자 아세트산) 때문에, 배양 안정성이 문제점이다. 게다가, 더많은 에탄올을 제조하려는 노력에서 가스 속도가 증가될수록, 배양물은 먼저 분자 아세트산에 의해 그후는 CO에 의해 억제된다. 그 결과, 배양물은 불안정해지고 가스 흡수에 실패하고 부가적인 생산물을 제조한다. 게다가, 발명자들에 의한 초기 작업은 안정된 상태 작동에서 2:1 이상의 에탄올 대 아세틸 비로 제조하는데 어려움을 보였다. 예를 들어, 다른 것들 중에서 Klasson et al., 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 11th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25 : 857; Phillips et al., 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 39/40 : 559 참조.
수많은 문서들은 용매를 제조하기 위해 CO, CO2 및 H2 을 소비하지 않는 설탕의 발효에서, C. ljungdahlii 를 제외한 혐기성 세균의 사용을 기술한다. 에탄올의 높은 수율을 제공하려는 시도에 있어서, 영양분 타입, 미생물, 환원제의 일정한 첨가, pH 변화, 외인성 가스의 첨가를 포함하는 다양한 매개 변수들이 변경되었다. 예를 들어, Rothstein et al, 1986 J. Bacteriol., 165(1) : 319-320; Lovitt et al, 1988 J. Bactetriol., 170 (6): 2809; Taherzadeh et al, 1996 Appl Microbiol. Biotechnol., 46 : 176 참조.
산업상 가스의 기질을 취급하는 업계에서 CO, CO2 및 H2 와 같은 그러한 가스들, 특히 폐가스로부터 가치있는 산물을 추출하는 능력의 필요성이 남아있다. 아세토제닉 박레리아에 의해 그러한 가스의 발효에 의해 보통 발생되는 다른 생산물의 제조에 비하여 에탄올의 제조를 높이기 위한 필요성이 있다.
발명의 개요
당업계의 요구에 대응하여, 본 발명은 연속, 정상 상태 방법이고, 배양 성장 및 우수한 배양 안정성을 계속적으로 허용하면서, 10 g/L 이상의 에탄올 농도와 약 8-10 g/L 이하의 아세테이트 농도를 초래하는 신규 방법을 제공한다.
한가지 양태에서, 본 발명은 가스 기질의 혐기성 세균 발효로부터 에탄올을 제조하기 위한 안정되고 연속적인 방법을 제공한다. 이 방법은 발효 바이오리액터에서, 액체 영양분 배지에서 혐기성, 아세토제닉 세균을 배양하는 단계 및 CO와 H2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원 가스를 포함하는 가스 기질을 바이오리액터로 공급하는 단계를 포함한다. 바이오리액터 내의 세균은 세균이 바이오리액터 내에서 정상 상태, 예를 들어 안정한 세포 농도를 달성한 후에, 발효육즙의 산화 환원 포텐샬을 줄이거나, NAD(P)H 대 NAD(P) 비를 증가시킴으로써 조작된다. 바이오리액터에서 유리 아세트산 농도는 5 g/유리 산 L 이하로 유지된다. 배양 및 조작 단계는 바이오리액터에서 세균이 발효육즙에서 하루에 10g/L 이상의 생산율로 에탄올을 제조하도록 만든다. 에탄올과 아세테이트 모두 1: 1 내지 20: 1의 범위의 에탄올 대 아세테이트의 비로 발효육즙에서 제조된다.
이 방법의 한가지 구체예에서, 조작 단계는 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 영양분 배지 함유물, 영양분 공급 속도, 물 공급 속도, 작동 압력, 작동 pH, 가스 기질 함량, 가스 공급 속도, 발효육즙 교반 속도, 생산물 억제 단계, 세포 밀도 및 기질 억제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 매개 변수들을 바꾸는 단계.
이 방법의 또다른 구체예에서, 조작 단계는 상기 바이오리액터에, 원하는 흡수 속도로 환원 가스, CO를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다. 이 속도는 바람직하게는 분당 상기 바이오리액터내 세균의 건조 세포 그램당 0.3 내지 2 mmol CO이다.
이 방법의 여전히 또다른 구체예에서, 조작 단계는 상기 발효 바이오리액터 안으로 제한하는 양의 칼슘 판토테네이트를 포함하는 상기 영양분 배지를 공급하는 것을 포함한다. 칼슘 판토테네이트는 바람직하게는 바이오리액터에서 생성된 세균의 건조 세포의 그램당 0.5 내지 50 μg의 범위이다.
그위에 또다른 양태에서, 본 발명은 또다른 구체예를 제공하는데, 이는 제한하는 양의 칼슘 판토테네이트를 제공하기에 앞서 과량의 H2 환원 가스를 바이오리액터로 공급하는 것을 포함한다.
그위에 더나아간 양태에서, 본 발명은 그 방법의 조작 단계가 상기 발효 바이오리액터로 제한하는 양의 코발트를 포함하는 상기 영양분 배지를 공급하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 코발트의 양은 상기 바이오리액터에서 생성되는 세균의 건조 세포의 그램당 5 내지 100 μg 코발트의 범위에 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 일정한 코발트 농도를 유지시키고, 가스 속도, 액체 속도, 교반 속도 및 H2 가스 부분 압력과 같은 한가지 이상의 매개 변수들을 조절함으로써, 상기 바이오리액터에서 상기 양의 코발트에 대해 상기 세균의 순응을 예방하는 것을 포함한다.
이들 방법들의 추가적인 선택적인 단계는 육즙의 샘플을, 세포를 제거하기 위해 원심 분리시키고, 비율 및/또는 생산율 값의 유지를 모니터하기 위해 가스 크로마토그래피시키는 것을 포함한다.
또다른 구체예에서, 방법은 에탄올 제조를 위한 화학양론적 양을 약간 초과하는 양의 H2을 가스 기질로서 공급하는 것을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서, 가스 기질은 세균에 의해 요구되는 양을 약간 초과하는 양의 CO를 더 포함하는데, 여기서 세균에 의한 H2의 흡수는 억제되고 육즙에서 NAD(P)H 대 NAD(P) 비는 증가된다.
여전히 또다른 방법의 구체예에서, 발효육즙에 존재하는 분자 아세트산이 2 g/L에 접근하거나 초과할 때, 분자 아세트산에 의한 억제는 물 공급 속도를 증가시킴으로써 감소되는 단계를 제공한다.
방법의 또다른 구체예에서, 조작 단계는 선택된 교반 속도로 바이오리액터에서 배지, 세균 및 가스 기질을 교반하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 교반 속도의 감소는 발효육즙으로 이동되는 CO의 양을 감소시킨다. CO 이동의 속도에서의 이러한 감소는 H2 변환에서의 증가를 초래하고, 그래서 환원 가스, H2 는 세균의 성장 요구조건을 초과하여 바이오리액터에 존재한다. 가스 속도는 또한 유사하게 감소되어 이동된 CO의 양을 증가시킬 수 있고, 그로써 H2 변환을 증가시켜, 환원 가스, H2 는 세균의 성장 요구조건을 초과하여 발효 리액터에 존재한다.
여전히 또다른 방법의 구체예에서, 영양분 배지의 칼슘 판토테네이트 또는 코발트 농도를 제한하기 전의 세균 배양은 바이오리액터에서 초기에 원하는 세포 농도를 가져올 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 구체예에서, 에탄올의 대부분이 제조되는 제조 리액터로 발효육즙을 공급하는 성장 리액터로 구성된 두 단계 CSTR (바이오리액터)가 사용된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 상기 방법은 선택적인 단계를 포함한다:바이오리액터로부터 발효육즙을 제거함으로써 에탄올을 회수하는 단계; 육즙으로부터 에탄올을 증류하는 단계; 및 에탄올을 회수하는 단계. 추가적으로 또는 바람직하게, 육즙의 샘플이 세포를 제거하는 원심분리를 받고; 및 속도의 유지는 가스 크로마토그래피를 사용하여 모니터된다.
여전히 또다른 양태에서, 본 발명의 방법은 리액터에서 에탄올과 아세틸 사이에 평형이 형성되도록, 리액터로 되돌아가는 에탄올 생산물로부터 물(5 g/L 이하의 아세틸을 함유한다)을 재순환시키는 추가 단계를 더욱 채용할 수 있다. 결과적으로, 더 많은 CO, CO2 및 H2 가 리액터로 공급되고 생산물로 변환되어 에탄올 제조를 초래한다.
본 발명의 다른 양태 및 잇점들은 그것의 바람직한 구체예의 하기 상세한 설명에서 더욱 기술된다.
도 1은 본 발명에 따라 생산물 회수와 함께 연속 발효 방법을 도시하는 개략도이다. 가스 기질(1) 및 액상 영양분 배지(2)는 주제 세균 배양물을 함유하는 바이오리액터(3)로 공급된다. 가스 기질의 에탄올 및 아세트산으로의 변환은 바이오 리액터(3)에서 일어난다. CO, CO2 및 H2 이외의 가스를 함유하는 배출 가스(4)와 바이오리액터(3)으로부터 변환되지 않은 CO, CO2 및 H2는 배출되고, 연료로 연소되거나 타오른다. 세포 재순환과 함께, 유출액(5)는 세포(7)와 무세포 투과액(8)가 분리되는 세포 분리기(6)로 보내진다. 세포(7)은 바이오리액터(3)로 되돌려 보내지고 투과액(8)는 생산물 회수로 보내진다. 에탄올은 투과액(8)으로부터 (또는 대안으로서 세포 분리가 채용되지 않으면 유출액(5)로부터) 회수될 수 있다. 투과액(8)은 증류 컬럼(9)에서 분리되어, 95% 에탄올 오버헤드(10)를 제조하고, 물(11)은 재순환을 위해 바이오리액터(3)로 되돌아 간다. 95% 에탄올 오버헤드(10)는 분자체(12)로 보내지고 여기서 원하는 최종 생산물인 무수 에탄올(13)이 증류 칼럼(9)로 되돌려 보내지는 희석 에탄올(14)로부터 분리된다.
도 2는 두 단계의, 향상된 배양 안정성을 위해 연속적으로 교반되는 리액터(CSTR) 시스템의 개략도이다. 성장 단계 CSTR(1)은 액체 배지(2)가 공급된다. 제조 단계 CSTR로부터 미변환 가스(3)은 성장 단계 CSTR(1)로 공급된다. 제조 단계 CSTR(4)는 신선한 가스 원료(5) 및, 성장 단계 CSTR(1)로부터 배양 원료(7)는 물론이고 신선한 배지 원료(6)가 공급된다. 제조 단계 CSTR(4)로 보내지는 세포들(9)중에서 최상의 제조를 얻는데 세포 재순환(8)이 사용된다. 세포들(9)는 성장 단계 CSTR로 재순환되지 않는다. 발효육즙에서 희석 에탄올로 구성되는 액체 생산물(10)은 최종 증류 생산물로서 제조되고, 도 1에서와 같이 무수 에탄올로서 회수된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상의 환원 가스, 특히 산업 페기물 및 합성 가스의 가스 성분(예를 들어, CO, CO2 및 H2)를 함유하는 가스 기질을 에탄올로 혐기성 발효하기 위한 방법을 포함한다. 이들 방법은 주제 세균의 생물학적 경로를 조작함으로써 10 g/Lㆍ일 이상의 에탄올 생산율을 수득한다. 본 발명의 한가지 방법은 NAD (P)이상의 다량의 NAD(P)H을 유발한다. NAD(P)로의 NAD(P)H의 산화는 배양에 의해 제조된 아세트산을 에탄올로 환원시킨다. 대안으로서, 본 발명의 혐기성 발효에서 고농도의 에탄올의 제조를 위한 다른 방법들은 발효육즙의 산화환원 포텐샬을 낮추고, 그로써 아세트산을 에탄올로 환원하는 것을 수반한다. 본 발명의 방법은 높은 에탄올 농도(즉, 약 10 g/L 이상, 바람직하게는 15 g/L 이상) 및 낮은 아세테이트 농도(바이오리액터에서 약 5 g/L 미만의 유리 아세트산)를 제조한다. 이들 방법은 또한 연속 에탄올 및 아세트산 제조를 위한 방법 조건들을 유지하고 제어하여 시스템이 방법 전복으로부터 신속하게 회복되도록 돕는다. 더욱이, 본 발명의 방법은 배양 순응이 영양분 농도를 낮추는 것을 예방하는 것을 돕고, 이는 배양 수행에 해로울 수 있다. 본 발명은 에탄올 제조를 위한 실행가능한 상업적인 방법을 제공한다.
1. 정의
달리 정의되지 않으면, 본 명세서 전체에 사용된 하기 용어들은 하기와 같이 정의된다.
여기서 사용된 바와 같은 용어 "연속 방법"은 바이오리액터에서 연속적인 영양분 공급, 기질 공급, 세포 제조를 포함하는 발효 방법을 말한다. 이 연속 공급, 제거 또는 세포 제조는 동일한 또는 다른 스트림에서 발생할 수 있다. 연속 공정은 바이오리액터 내에서 정상 상태의 달성을 초래한다. "정상 상태"란 이들 측정가능한 변수들 모두(즉, 공급 속도, 바이오리액터에서 유지되는 기질 및 영양분 농도, 바이오리액터에서 세포 농도 및 바이오리액터로부터 세포 제거, 바이오리액터로부터 생산물 제거는 물론이고, 온도와 압력과 같은 조건 변수들)가 시간에 걸쳐 일정하다는 것을 의미한다.
여기서 사용된 바와 같은 용어 "가스 기질"은 CO 단독, CO와 H2, CO2와 H 2 또는 가스 상태의 질소 및 메탄을 포함하여, 선택적으로 다른 원소들이나 화합물과 혼합된, CO, CO2와 H2을 의미한다. 그러한 가스 기질은 가스 또는 스트림을 포함하고, 이는 전형적으로 직접적으로 또는 연소를 통해 대기중으로 방출되거나 배출된다. 본 방법의 일부 구체예에서, 가스 기질은 CO를 포함한다. 본 방법의 다른 구체예에서, 가스 기질은 CO2 및 H2 를 포함한다. 여전히 다른 구체예에서, 가스 기질은 CO 및 H2 를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 가스 기질은 CO, CO2 및 H 2를 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 기질은 상기한 성분들과 질소, CO2, 에탄 및 메탄 중의 한가지 이상의 가스를 포함할 수 있다. 따라서, 그러한 기질은 관습적으로 다양한 산업 방법으로부터 폐가스는 물론이고, 탄소 생산물(메탄 포함)의 가 스화로부터 "syngas" 또는 합성 가스로 언급되는 것을 포함한다.
용어 "환원 가스"는 CO 또는 H2 둘 중의 하나 또는 모두를 의미한다. "세균의 성장을 위해 필요한 것 이상의 환원 가스의 양" 이라는 말은 영양분 배지 성분으로 주어지는, 성장 또는 대사를 위해 세균이 사용할 수 있는 양을 초과하는 환원 가스의 양을 의미한다. 이러한 양은 환원 가스의 순량을 증가시킴으로써, 또는 주요 영양분 성분들을 줄임으로써 달성될 수 있고, 따라서 과도한 양의 가스는 가스를 증가시키지 않거나, 또는 세균으로 가스 운송의 속도를 증가시킴으로써 달성된다. 세균이 성장에 필요한 것보다 더 많은 환원 가스에 노출될 때, 세균은 에탄올의 제조를 증가시킴으로써 반응한다.
"주제 세균"는 아세토제닉 혐기성(또는 통기성) 세균이고, 이는 CO와 물 또는 H2 와 CO2를 에탄올과 아세트산 생산물로 변환할 수 있다. 본 발명에 따르는 유용한 세균은 제한없이, Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, acetoanaerobium noterae, Clostridium Aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, C. acetobutylicum, C. thermoaceticum, Eubacterium limosum, C. ljungdahlii PETC, C. ljungdahlii ERI2, C. ljungdahlii C-01, C. ljungdahlii O-52, 및 Peptostreptococcus productus을 포함한다. 다른 아세토제닉 혐기성 세균은 당업자들에 의해 이들 방법에 사용하기 위해 선택된다.
용어 "혼합된 균주"는, 둘 이상의 주제 세균의 혼합된 배양을 의미한다. 여기서 상기된 세균의 그러한 "혼합된 균주"는 본 발명의 방법에서 이용된다.
용어 "바이오리액터" "리액터" "발효 리액터"는 하나 이상의 용기 및/또는 타워 또는 배관 설비로 구성되는 발효 장치를 포함하고, 이는 Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR), Immobilized Cell Reactor (ICR), Trickle Bed Reactor (TBR), Bubble Column, Gas lift Fermenter, Static Mixer, 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 장치를 포함한다. 본 발명의 방법을 위해 바람직하게는, 발효 바이오리액터는 발효육즙을 두번째 발효 바이오리액터에 공급하는 성장 리액터를 포함하고, 거기서 대부분의 생산물인, 에탄올이 제조된다.
"영양분 배지"는 선택되는 주제 세균의 성장을 허용하는데 충분한 비타민과 미테랄을 함유하는 종래의 세균 성장 배지를 기술하는데 일반적으로 사용된다. 설탕은 이들 배지에 포함되지 않는다. 본 발명의 사용에 적합한 다양한 영양분 배지의 성분들은 공지되고 본 발명자들의 것들을 포함하여, 이전 공보들에 보고되어 있다. 예를 들어, 상기 확인된 공보들에서는 물론이고, International Patent Application No. W098/00558 ; U. S. Patent No. 5,807,722; U. S. Patent No. 5,593,886, 및 U. S. Patent No. 5,821,111에 기술된 영양분 배지 제법을 참고하라. 본 발명에 따르면, CO, CO2 및 H2 로부터의 아세테이트 제조를 위한 전형적인 실험실 영양분 배지는 0.9mg/L 칼슘 판토테네이트를 함유한다. 그러나, CO, CO2 및 H2 로부터의 아세테이트 제조를 위한 전형적인 실험실 영양분 배지는 0.02 mg/L 칼슘 판토테네이트를 함유한다.
용어 "제한하는 기질" 또는 "제한하는 영양분" 는 바이오리액터에서 세균 배 양 성장하는 동안에, 바이오리액터에서 정상 상태 또는 안정한 세균 성장을 더이상 지지하지 않는 수준까지 배양에 의해 고갈되는, 영양분 배지 또는 가스 기질에서의 물질을 정의한다. 영양분 배지 또는 가스 기질에서의 모든 다른 물질들은 따라서 과도하게 존재하고, "제한적이지 않다". 제한을 위한 증거는 제한하는 기질을 배양에 첨가하는 속도, 즉, 영양분 공급 속도 또는 가스 공급 속도의 증가가 세포 밀도의 증가때문에 대응하는 가스 흡수(가스의 mmol/min)의 속도의 증가를 초래한다는 것이다.
달리 언급되지 않으면, 용어 "아세테이트"는 발효육즙에 존재하는 분자 또는 유리 아세트산 및 아세테이트 염의 혼합물을 기술하는데 사용된다. 아세테이트에 대한 분자 아세트산의 비율은 시스템의 pH에 의존하고, 즉, 일정한 "아세테이트" 농도에서, pH가 더 낮을수록, 아세테이트 염에 비례하여 분자 아세트산 농도가 더 높아진다.
본 명세서에서 "세포 농도" 는 샘플의 리터당 세균의 건조 중량에 기반한다. 세포 농도는 직접적으로 또는 켈리브레이션에 의해 광학 밀도와 상호 관련하여 측정된다.
용어 "자연 상태" 는 보통 존재하는 어떠한 부가적인 전자 또는 양성자를 갖지 않는 어떠한 화합물, 원소 또는 경로를 기술한다. 반대로, 용어 "환원 상태"는 하나 이상의 과잉 전자를 갖는 어떠한 화합물, 원소 또는 경로를 기술한다. " 환원 상태"는 하나 이상의 전자를 "자연 상태"에 첨가함으로써 즉, 발효육즙의 산화환원 포텐샬을 낮춤으로써 달성된다.
"에탄올 생산율" 은 연속 시스템에서 정상 상태 에탄올 농도와 액체 보유 시간(LRT)의 비, 또는 에탄올 농도와 배치 시스템에서 그 농도를 제조하는데 필요한 시간의 비율로서 계산되는, 에탄올의 체적 생산율이다. "높은 에탄올 생산율" 이라는 말은 약 10g/L·일 이상의 체적 에탄올 생산율을 설명한다.
"고농도의 에탄올" 이라는 말은 발효육즙에서 약 10g/L·일 이상, 바람직하게는 15g/L 이상 에탄올 또는 5:1 이상의 에탄올 대 아세테이트의 생산물 비를 의미한다.
"과도한 H2"는 변환된 CO의 몰수의 2배와 변환된 CO2의 몰수의 3배의 합계에 대한 공급 가스에서 H2 의 몰수의 비가 1.0보다 클때, 에탄올 제조에 이용가능하다. 만일 이 비가 1.0 미만이면, 과도한 H2 는 유용하지 않고 에탄올은 오직 다른 제어 메카니즘을 통해서만 제조될 수 있다.
II. 본 발명의 방법에서 이용되는 생물학적 경로
이론에 의해 구속되기를 바라지 않고, 본 발명자들은 여기에 기술된 방법으로부터 에탄올의 혐기성 제조를 증가시키기 위한 방법은 자가 영양의 성장을 위한 아세토제닉 경로의 기본 성장 사이클에서 NAD(P)H을 NAD(P)으로의 변환을 수반하는 생물학적 경로에 기반한다. 본 발명은 그러한 경로들을 조작하여, 연속적인 제조 및 안정된 작동 조건하에서 낮은 아세테이트 농도와 함께 고농도의 에탄올의 유지를 가능하게 하고, 그로써 산업 가스로부터 에탄올 제조를 위해 상업적으로 유용한 방법들을 제공하는 것을 수반한다.
생물학적 경로에서 NAD(P)H의 NAD(P)로의 본질적인 관련은 하기와 같이 기술된다. CO, CO2 및 H2 와 같은 가스 성분으로부터 에탄올의 제조는 3단계 생물학적 방법으로 발생한다. 첫번째 단계에서, 기질 CO 및 H2 는 산화되고, 그렇게 하는데 있어서, NAD(P)H를 방출한다:
NAD(P)→ NAD(P)H
CO + H 2 + H 2 0 → CO 2 + 4H +
단계 1의 생산물은 그후 아세트산으로 변환되고, 필요로하는 단계
NAD (P) H:
NAD(P)H → NAD(P)
CO + CO 2 + 6 H + → CH 3 COOH + H 2 O
최종적으로, 만일 단계 1의 반응은 단계 2의 반응보다 더욱 빠른 속도로 진행하기 때문에, 과도한 NAD(P)H 가 이용가능하다면, 아세트산은 에탄올로 환원된다.
NAD(P)H → NAD(P)
CH 3 COOH + 4 H + → C 2 H 5 OH + H 2 0
따라서, 기질 산화로부터 과도한 NAD(P)H의 유용성은 아세트산으로부터 에탄올의 제조를 이끈다.
아세토제닉 경로에서 두가지 공지된 기본 경로 사이클이 있다:(1)아세틸-CoA 사이클 및 (2) TFT 사이클, 여기서 CO2 는 메틸기로 환원된다. 그것으로부터 에탄올 및 아세트산의 발생을 위한 순서는 J. R. Phillips et al., 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145에 설명되어 있다. 아세틸-CoA 사이클은 여기서 CO 사이클이라 부르는, 내부 사이클을 가진다. CO 사이클이 통상 오른쪽방향으로 반응하므로, 페레독신은 환원된다. 페레독신은 또한 효소 히드로게나제에서 산화될 때, H2에 의해 환원될 수 있다. 결과적으로, 아세틸-CoA 사이클은 또한 오른쪽으로 돌아 반응하고, 페레독신은 산화된다. 만일 내부 CO 사이클과 아세틸-CoA 사이클이 동일한 속도로 반응한다면, 페레독신은 산화환원-상태 평형에 있다. 만일 그러나, 이들 두 사이클이 동일한 속도로 일어나지 않으면, 즉, CO 사이클이 아세틸-CoA 사이클보다 더 빠른 속도로 반응하면, 환원된 페레독신이 형성된다. 또한 과도한 H2 와 함께, 환원된 페레독신은 또한 과도하게 제조될 수 있다. 이렇게 과도하게 환원된 페레독신은 NAD(P)가 NAD(P)H로 재생(환원)되는 원인이 되고, 이것은 평형으로 줄여져야 하는 초과량을 만들고 그렇게 하는데 있어서, 아세트산을 에탄올로 환원한다.
세포 성장을 위한 TFT 사이클 기능 및 연속 배양을 위해 필요하다; 따라서 그것은 완전히 정지될 수 없다. TFT 사이클 속도를 감소시키는 것은 또한 더 높은 NAD(P)에 대한 NAD(P)H 비율을 초래하는 역할을 한다. NAD(P)H는 두 군데에서 산화된다. 총 세포 NAD(P)에 대한 NAD(P)H 비율을 균형있게 유지할, 이러한 산화를 제 한함으로써, NAD(P)H는 아세트산을 에탄올로 환원하는데 사용된다.
아세트산이 에탄올로 환원되도록 하는 두번째 기본 방법은 직접적으로 발효육즙의 산화환원 포텐샬을 낮추는 것이다. 배양의 자연 상태보다 충분히 더 낮은 환원 상태는 NAD(P)H가 다량으로 되게 만들고 아세트산이 에탄올로 환원되는 것을 촉진한다.
III. 본 발명의 방법
방법의 기본 단계들은 하기를 포함한다: 생산물 회수와 함께 연속 발효 방법은 도 1을 참고하여 기술되고 하기 실시예 1에 예증된다. 하나 이상의 환원 가스 예를 들어, CO 또는 H2를 포함하는 가스 기질(1)의 연속 흐름은 선택된 가스 공급 속도로 공급되고 선택된 영양분 공급 속도로 액상 영양분 배지(2)의 연속 흐름은 주제 세균을 함유하는 발효 바이오리액터(3)으로 공급된다. 바이오리액터(3)에서, 배지와 가스 기질은 세균에 의해 발효되어 에탄올과 아세트산을 제조한다. 일단 안정된 세포 농도가 정상 상태 조건하에서 얻어지면, 바이오리액터에서 유리 아세트산 농도를 5g/L 미만으로 유지하면서, 발효육즙에서 연속 시스템의 성분들은 조정되어 산화환원 포텐샬을 환원하거나, 또는 NAD(P)에 대한 NAD(P)H 비율을 증가시킨다. 본 발명의 방법은 1:1과 20:1 사이의 에탄올 대 아세테이트의 비에서 에탄올 생산율이 10 g/L·일보다 더 크도록, 발효육즙에서 에탄올과 아세테이트의 제조를 허용하고 유지하도록 계획된다. 한가지 구체예에서, 비율은 3:1 이상이다. 또다른 구체에에서, 비율은 5:1 이상이다. 여전히 또다른 구체예에서, 비율은 10:1 이상이다. 여전히 또다른 구체예에서 그 비율은 15:1 이상이다. 본 발명의 방법은 우수한 방법 안정성을 가지고 CO, CO2 및 H2 으로부터 높은 에탄올 농도(15-35 g/L 에탄올) 및 낮은 아세테이트 농도(0-5 g/L 아세테이트), 즉, 3:1 이상의 에탄올 대 아세테이트 생산물 비율로, 안정된 연속(정상 상태) 제조를 강화하는데 대안으로서 효과적이다.
정기적으로, 본 발명의 방법들의 진행 동안에, 종래의 분석 방법에 의해 비율을 결정하기 위해 육즙의 샘플을 제거한다. 예를 들어, 세포를 예를 들어, 원심분리에 의해 샘플로부터 분리하고, 그후 무세포 샘플에 가스 크로마토그래피의 바람직한 방법과 같은 분석 방법을 행한다. 그러나, 다른 종래 평가 방법은 당업자들에 의해 선택된다. 비율을 달성하고/또는 유지하도록 방법의 추가적인 선택 단계들이 추가된다. 실시예 2는 그러한 분석 방법을 증명한다.
시스템 성분들을 조종하고 유지하고 /또는 원하는 에탄올 생산율 또는 아세테이트에 대한 에탄올 비를 달성하는데 사용된 단계들은 하기 단계들중 한가지 이상, 바람직하게는 하기 단계들의 조합을 포함한다 : 영양분 배지 함량, 영양분 공급 속도, 물 공급 속도, 작동 압력, 작동 pH, 가스 기질 함량, 가스 공급 속도, 발효육즙 교반 속도를 바꾸는 단계, 생산물 억제 단계를 피하는 단계, 바이오리액터에서 세포 밀도를 낮추는 단계, 또는 기질 억제를 예방하는 단계. 일부 바람직한 조작은 바이오리액터에 액상 영양분(판토테네이트 또는 코발트) 제한, 공급 가스에서 CO와 H2 의 약간의 초과량을 공급하는 것, 아세테이트 농도를 최소화하는 것, 액상 영양분 농도를 낮추는 배양 순응을 피하는 것, 배양균을 상대적으로 빠른 속도에서 적절한 세포 농도로 가져가는것, 배양균의 pH를 4.5 이상으로 높이는 것, 박테이아 세포를 바이오리액터로부터 퍼지하여 바이오리액터에서 모든 환원 가스 또는 영양분 기질을 이용하는 안정된 정상 상태 농도 미만의 세포 농도로 하는 것 그리고 발효 바이오리액터에 존재하는 아세테이트의 유리 아세트산 몫이 2g/L을 초과할때, 물 공급 속도를 증가시키고, 그럼으로써 유리 아세트산의 농도의 어떠한 원치찮는 증가를 억제하는 것을 포함한다. 이들 단계의 모두는 하기에서 상세히 설명된다.
CO, CO2 및 H2 이외의 가스를 함유하는 배출 가스(4) 및 리액터로부터 변환되지 않은 CO, CO2 및 H2 가 리액터로부터 배출되고 그들의 연료 가치를 위해 사용된다. 제어 메카니즘으로서 과도한 H2 가 채용되면, 배출구 가스에서 H2 배분 압력 및 출구 가스에서 CO2 부분 압력에 대한 H2 부분 압력의 비율을 사용하여, 그 단계에 의해 아세테이트 비율에 대해 에탄올의 조절을 확인한다. 바이오리액터 안에 세포의 농도를 증가시키는데 세포 사이클이 사용되고(그러나 요구되지 않는다), 따라서 CO, CO2 및 H2 변환을 위한 더 많은 생촉매를 제공한다. 세포 재순환과 함께, 리액터(5)로부터의 유출액은 세포 분리기(6)로 보내지고 여기서 세포(7)과 투과액(무세포 액체)(8)을 분리한다. 세포(7)은 바이오리액터로 되돌려보내지고 투과액(8)은 생산물 회수로 보내진다.
세포 분리는 연속 원심분리, 중공의 섬유 또는 나선으로 휘감긴 여과 시스템, 세라믹 필터 시스템 또는 다른 고체/액체 분리기를 사용하여 수행된다. 에탄올은 증류 및 흡착을 포함하는 다양한 기술에 의해 투과액(또는 만일 세포 분리가 채용되지 않으면, 대안으로서 리액터(5)로부터의 유출액)으로부터 회수될 수 있다. 투과액(8)은 증류 칼럼에서 분리되어 95% 에탄올 오버헤드(10)을 생산하고, 재생을 위해 물(11)은 리액터(3)으로 되돌아간다. 재생수(11)는 발효에 사용되지 않는 과도한 영양분을 함유하지만, 발효나 세포 용해로부터의 어떠한 과도한 비타민은 열 증류에 의해 파괴된다. 95% 에탄올 오버헤드(10)은 분자체(12)로 보내지고 여기서 무수 에탄올(13), 원하는 최종 생산물은 증류 칼럼(9)로 되돌려보내지는 희석 에탄올(14)로부터 분리된다.
성장, 죽음 및 세포 퍼지의 연속 조합은 일정한 세포 농도를 유지하고, 그러므로 에탄올을 제조하는데 사용되는 연속 방법(및 소량의 아세트산)은 추가 배양 보충없이 영양분과 함께 CO, CO2 및 H2 를 공급함으로써 수개월동안 작동할 수있다. 본 발명의 방법들은 연속 에탄올 및 아세트산 제조를 위한 조건들을 유지하고 제어하고 방법 전복을 위해 신속하게 예방 또는 수정한다. 본 발명의 방법들은 또한 배양 순응이 배양 성능에 해로울 수 있는 영양분 농도를 낮추는 것을 막도록 도와준다. 하기 설명 및 실시예에서, 달리 지시되지 않으면, 사용되는 압력은 1 기압이고 사용되는 온도는 36-41℃ 사이이다. 바람직한 온도 및 압력은 바이오리액터에서 사용하기 위해 선택되는 미생물에 의존하여, 당업자들에 의해 결정될 수 있 다.
본 발명의 기본 단계에 첨가된, 하기에 특별히 기술된 다양한 조작들은 에탄올의 강화된 제조를 허용한다. 바람직하게는, 액상 영양분 제한(판토테네이트 또는 코발트) 또는 과도한 H2 또는 CO의 사용은 하기에 상세하게 기술된, 원하는 에탄올 생산율을 달성 및 유지하고 안정적인 농도의 제조 및 발효육즙에서 아세테이트에 대한 에탄올의 비율을 허용하는데 사용되는, 본 발명의 방법 단계들이다. 이들 조건들은 발효육즙에서 안정적인 농도의 에탄올과 아세테이트의 제조를 허용한다. 바람직한 구체예에서, 발효육즙에서 제조된 에탄올 대 아세테이트 생산물 비율은 10:1 이상이고 에탄올 농도는 15 g/L 이상이다.
A. 칼슘 판토테네이트 제한
본 발명의 한가지 특정 구체예에서, 생물학적 경로를 에탄올 제조를 지지하고 아세트산 제조를 제한하도록 생물학적 경로를 조작하기 위한 방법은 영양분 배지에서 칼슘 판토테네이트의 양을 제공되는 칼슘 판토테네이트를 완전히 이용하는 안정한, 정상 상태 농도에서 세균을 유지하는데 필요한 것 이하의 양으로 제한하는 것을 수반한다. 판토테네이트는 아세틸-CoA의 성분이고 따라서, 영양분 배지에서 칼슘 판토테네이트를 제한함으로써, 아세틸-CoA 사이클 속도는 CO 사이클 속도에 비하여 감소된다. 이는 감소된 페레독신의 축적 및 NAD(P)의 NAD(P)H로의 환원의 원인이 되고, 그로써 최종 생산물로서 에탄올의 제조를 증가시킨다.
판토테네이트 제한은 리액터에서 제조되는 세포의 그램(g)당 (건조 중량) 리 액터로 공급되는 칼슘 판토테네이트의 마이크로그램(μg)이 0.5 내지 100의 범위에 있을 때, 관찰된다. 보다 바람직한 판토테네이트 제한은 리액터에서 제조된 건조 세포의 그램(g)당 2 내지 75 μg 범위의 칼슘 판토테네이트이다. 여전히 바람직한 판토테네이트 제한은 리액터에서 제조되는 세포의 그램(g)당 0.5 내지 50μg 범위의 칼슘 판토테네이트이다. 이러한 제한의 또다른 구체예는 리액터에서 제조되는 세포의 그램(g)당 약 1-25μg의 칼슘 판토테네이트에 있다. 이러한 제한의 또다른 구체예는 리액터에서 제조되는 세포의 그램(g)당 약 10-30μg의 칼슘 판토테네이트에 있다. 영양분의 이러한 양은 아세테이트 제조보다 우선하여, 에탄올 제조를 유지한다. 이 방법의 한가지 구체예는 실시예 4에서 예증된다.
본 방법의 또다른 양태에서, 제한하는 칼슘 판토테네이트 농도를 낮추기 위한 발효 바이오리액터에서 세균의 순응은 발효 매개 변수들을 규제하거나 조절함으로써 피할 수 있고, 그러므로 적어도 하나의, 때때로 하나 이상의, 가스 공급 속도, 액체 공급 속도, 교반 속도 또는 H2 부분 압력의 매개 변수가 조절되면서, 일정한 칼슘 판토테네이트가 유지된다. 영양분에서 주요한 변화를 피하지만, 비교적 일정한 영양분 공급 농도는 유지된다. 배양이 낮은 액체 상 제한 영양분에 순응시키도록 허용되면, 0.1 g 에탄올/g 아세테이트 이하의 부족한 생산물 비율이 불가역 방법에서 발생한다. 그러므로, 리액터는 폐쇄하고 재주입이 필요하다. 바람직하게는, 생물학적 경로는 먼저 원료공급 가스에서 과량의 H2를 바이오리액터로 공급하고, 그후 상기한 바와 같이 영양분 배지에서 칼슘 판토테네이트를 제한함으로써, 에탄올 제조를 지지하고 아세트산 제조를 제한하도록 제어된다.
사실, 개시할때, 통상 제한하는 액상 영양분 칼슘 판토테네이트는 영양분 농도를 낮추는 순응을 피하기 위해 초과하여 유지되고, 매우 부족한 성능 및 배양의 제조 능력의 손실을 초래할 수 있는 조건은 만일 과도한 H2가 채용되지 않으면, 10g/Lㆍ일 이상의 높은 에탄올 생산율을 달성한다. 특정 세균 배양을 위한 발효 매개 변수들의 그러한 규제의 예는 실시예 17에서 설명된다.
B. 코발트 제한
본 발명의 또다른 구체예에서, 에탄올 제조를 지지하고 아세트산 제조는 제한하는 생물학적 경로를 조작하기 위한 방법은 영양분 배지에서 코발트의 양을, 제공된 코발트를 완전히 이용하는 안정한 정상 상태 농도로 세균을 유지하는데 요구되는 것 미만의 양으로 제한하는 것을 포함한다. 코발트 제한은 리액터에서 제조되는 세포의 그램(g)당(건조 중량) 리액터로 공급되는 코발트의 마이크로그램(μg)이 5 내지 100의 범위에 있을 때, 관찰된다. 바람직하게는, 코발트 제한은 리액터에서 제조되는 세포의 그램 당 약 20 내지 50μg 사이의 코발트를 리액터로 제공하는 것을 포함한다. 코발트의 이러한 양은 공정에서 아세테이트보다 우선하여 에탄올 제조를 유지한다. 실시예 18은 본 방법에 따라 리액터로 코발트를 제한하는 방법의 구체예를 예증한다.
발효육즙에서 코발트를 제한하는 것은 또한 아세틸-CoA 사이클 속도를 감소시킬 수 있다. 코발트가 TFT 사이클로부터 아세틸-CoA 사이클로 메틸기를 이동하는 데 사용되기 때문에, 발효육즙에서 코발트의 양을 제한하는 것은 또한 이동을 허용하지 않음으로써 TFT 사이클 기능을 감소시킨다. 코발트 제한은 TFT 사이클 속도를 줄이고, 이는 또한 더 높은 NAD(P)에 대한 NAD(P)H 비율을 초래하고 그로써 에탄올을 제조한다.
방법은 낮은 제한 코발트 농도에 순응을 예방함으로써 더욱 조작된다. 더욱 동일한 방식으로 낮은 판토테네이트 농도에 순응이 피해질때, 하나 이상의 발효 매개 변수들(가스 속도, 액체 속도, 교반 속도, CO2 함량, 및 H2 가스 부분 압력)중 한가지 이상을 조절하면서 일정한 코발트 농도가 유지된다. 영양분에서 주된 변화는 피해지나, 대신 상대적으로 일정한 영양분 공급 농도는 유지된다. 특정한 세균 배양에 대한 발효 매개 변수들의 그러한 규제의 예는 실시예 19에서 설명된다.
바람직하게는, 생물학적 경로는 먼저 초과량 H2를 리액터에 공급하고 그후 상기한 바와 같이 영양분 배지에서 코발트를 제한함으로써 에탄올 제조를 지지하고 아세트산 제조를 제한하도록 제어된다. 개시할때, 제한하는 액상 영양분 코발트는 낮은 영양분 농도에 순응, 즉, 매우 부족한 배양 성능 및 1:1 이상의 생산물 비율을 제조할 수 있는 배양의 능력의 손실을 초래할 수 있는 상태를 피하기 위해 초과하여 유지된다.
C. 수소의 과잉공급
여전히 또다른 구체예에서, 에탄올 제조를 지지하고 아세트산 제조를 제한하는 생물학적 경로를 조절하기 위한 방법은 원료공급 가스에서 초과량의 H2를 공급하 거나 과잉의 H2 를 초래하는 가스 탄소를 제한하는 것을 포함하고, 그것은 생물학적 경로에 의해 그후 사용된다. 바람직하게는, H2 환원 가스는 CO에 비하여 과잉이며, 과잉의 H2 는 발효육즙에서 세균이 아세테이트 비율에 대해 높은 에탄올을 제조하도록 만든다. 만일 변환되는 CO 2배(가스의 몰수)와 변환되는 CO2 (가스의 몰수)의 총합에 대한 H2 의 비율(공급된 가스의 몰수)이 1보다 더 크면, 발효조는 탄소 제한된다. 배출 가스에 존재하는 H2 부분 압력은 바람직하게는 0.4 atm 보다 더 크다. 최종적으로 모든 CO2를 사용하는데 충분한 H2 가 확실히 이용가능하도록, CO2 부분 압력에 대한 H2 부분 압력은 3.0 이상이 되어야만 한다. 만일 CO2 부분 압력이 0.1 기압보다 더 크다면, 그것은 성장이 다르게 제한되어 왔을 것이다. 이 방법 단계의 예증으로서 실시예 20을 참고하다.
개시하는 동안, 과도한 H2의 사용은 주로 그것이 제어하기 더 쉽기 때문에, 영양분 제한보다 유리하다. 과도한 H2의 채용의 잇점은 그것이 과도한 아세트산 제조를 피하고, 그것이 낮은 영양물 농도에 순응은 물론이고, 부족한 생산물 비율 및 잠재적인 아세트산 억제를 이끌 수 있다는 것이다.
D. 일산화탄소의 과잉공급
방법의 구성요소들을 조작하는 또다른 방법은 경로에서 사용하기 위해 가스상 기질에서, 환원 가스, CO를 과잉공급하는 것을 포함하고, 이것은 발효육즙에서 직접적으로 산화환원 포텐샬을 낮추는 역할을 한다. 따라서, 이 구체예에 따라서, 바이오리액터에는 CO를 포함하는 가스 기질이 공급되는데, 여기서 바이오리액터에 존재하는 CO의 양은 공급되는 CO를 완전히 이용하는 안정된 정상 상태 농도에서 세균을 유지하는데 필요한 양보다 더 크다. CO 흡수의 특정 속도가 (분 당 리액터에서 세포의 그램(건조 중량) 당 CO의 밀리몰, 또는 mmol/g 세포·분) 0.3 보다 더 클때, 아세트산 제조보다 우선으로 에탄올 제조를 지지하는 방법으로서 CO가 과잉공급한다. 보다 바람직하게는, 이 단계는 0.5 이상의 특정 속도의 CO 흡수를 포함한다. 이것은 각각의 세포가 그것의 대사에 있어서 평균적으로 0.3 mmol/g·분 이상의 속도로, 또는 보다 이상적으로는 0.5 mmol/g·분 이상의 속도로 CO를 이용하고 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, CO는 CO 흡수가 0.3 내지 2 mmol CO/그램 세포(건조 중량)의 세균/분인 속도로 제공된다. 또다른 구체예에서, CO는 0.5 내지 1.5 mmol CO/그램 세포(건조 중량)의 세균/분의 속도로 제공된다. 또다른 구체예에서, CO는 약 1 mmol CO/그램 세포(건조 중량)의 세균/분의 속도로 제공된다. 실시예 24에서 이 방법 단계의 한가지 구체예의 실례를 제공한다.
이러한 속도의 CO 흡수는 아세테이트 제조보다 우선하여 에탄올 제조를 유지한다. 만일 CO가 발효육즙에서 용해된 CO가 가스 압력 또는 매우 우수한 질량 이동에 의해 상당하도록 공급된다면, 발효육즙은 더욱 환원된다. CO의 과잉공급은 두가지 추가적인 잇점들을 가진다. 과도한 CO는 CO 사이클이 더 빠른 속도로 작동하도록 할 것이고, 만일 아세틸-CoA 사이클이 다른 방법으로 제한되고 CO 사이클을 따라갈 수 없다면, 환원된 페레독신이 쌓인다. CO는 또한 전체 3 단계 방법에 있 어서 기질 억제를 통해 단계 2(개재물 아세트산의 제조)를 늦출 수 있다. 단계 1에 대해 이렇게 증가된 속도의 단계 2는 과잉의 NAD(P)를 유발하고, 이는 아세트산에 유리하게 에탄올 제조를 이끈다.
과잉의 CO가 직접적으로 발효육즙의 산화환원 포텐샬을 줄임으로써 증가된 에탄올 제조를 초래할 수 있지만, 과잉 CO의 존재는 또한 CO-히드로게나아제를 억제하고 따라서 H2의 흡수를 억제함으로써 성장을 억제한다. 과잉 CO의 존재는 불행하게도 또한 부족한 H2 변환을 초래하고, 이는 경제적으로 이롭지 않을 수 있다. 기질 억제하에서 연장된 작동의 결과는 부족한 H2 흡수이다. 이는 결국 세포 용해 및 리액터의 불가피한 재시작을 초래한다. 이 방법이 CO 기질 억제의 의도하지 않은 결과(유용한 세포를 위한 너무 많은 CO의 존재)를 가지고, 기질 억제가 완화될 때까지 가스 공급 속도 및/또는 교반 속도는 감소된다. 이 영향을 수행하는 가스 속도 또는 교반 속도를 조절하는 방법의 예증은 실시예 21에 나타나있다.
E. 추가적인 조작 단계
상기 단계들을 강화하는 주된 방법에 더하여, 몇가지 방법 단계들이 에탄올 제조 방법에 바람직하게 포함된다.
1. 질량 이동을 증가시킴
그러한 한가지 추가 구체예는 가스 공급원료로부터 액체 발효육즙으로의 CO 또는 H2의 질량 이동이 용해된 가스를 이용하는 세균의 능력보다 더 빠르도록 확보하는 것을 포함한다. 예를 들어, 만일 C. ljungdahlii를 함유하는 바이오리액터에 CO, CO2 및 H2 공급되고 영양분 또는 과잉 H2 의 존재에 대해 제한없이 작동되면, 세포 성장은 액상안으로 이동되는 가스의 양에 의해 제한되고, 시스템은 생산물로서 아세트산을 제조한다. 만일 배양균에 배양 성장에 필요한 양을 초과하여 약간의 양의 CO 또는 H2이 공급되면, 그것은 에탄올을 제조한다. 그러나, 만일 배양이 사용하기 위해 너무 많은 가스가 액상안으로 이동되면, 기질 억제가 발생하고, 이는 배양물 이상 및 세포 죽음을 초래할 수 있다. 따라서, 과도한 질량 이동과 함께 매우 좁은 범위의 작동이 존재한다. 실시예 22는 이 방법의 예증을 제공한다.
아세틸-CoA 사이클에 관하여, 과잉의 환원된 페레독신이 제조되기 위해, CO 사이클 또는 히드로게나아제를 통한 페레독신의 환원은 아세틸-CoA 사이클보다 더 빨리 일어나야 한다. 여기에 기술된 방법은 예를 들어, 칼슘 판토테네이트 또는 코발트의 필수 영양분 또는 CO2 가스와 같은 다른 기질을 세균이 이용할 수 있는 속도를 제한함으로써, 또는 배양균에 과도한 기질, H2 또는 CO를 제공함으로써, 유기체가 용해된 가스를 이용할 수 있는 속도를 제한한다.
세균이 기질을 사용할 수 있는 속도보다 더 빠른, 질량 이동의 이론적인 속도는, 다른 제한 조차없이, 계산될 수 있다. 그 속도는 달성될 때, 유기체의 자연 성장 속도에 의해 제한된다. 따라서, 가장 생산적인 구체예는 질량 이동(가스 흐름 속도 또는 교반 속도)가 가장 높은 가능한 농도의 세포가 어떠한 제한없이 기질을 이용할 수 있는 속도보다 더 빠른 것이다. 기질 억제가 신속하게 세포 죽음의 원인이 되고 배양균에 독성인 부산물 농도를 초래하는 매우 좁은 작동 범위가 있을 것이다.
2. 과잉의 CO 및 H 2 를 공급
본 발명의 방법의 또다른 구체예에서, 높은 에탄올 농도/제한된 아세트산 제조에 있어서 안정성은 코발트 또는 칼슘 판토테네이트를 제한하거나, 다량의 H2 또는 CO를 제공하는 방법들에서 달성된다. 이 단계에 따라서, 배양균이 탄소 및 에너지 공급원으로서 가스 기질 CO, H2 및 CO2 을 사용하기 때문에, CO 및 H2는 약간 과잉량으로 공급된다. 약간의 초과량의 CO 및 H2은 안정된 작동을 달성하고 그후 CO 및 H2 변환이 막 낮아지기 시작할 때까지 점차적으로 가스 공급 속도 및/또는 교반 속도를 증가시킴(10% 미만 증가)으로써 얻어진다. 이것은 아세트산 제조를 지지하는 질량 이동 제한을 피하고, NAD(P)를 NAD(P)H 로 환원하고 에탄올을 제조하기 위해서 초과량의 환원된 페레독신을 제공하는 한가지 수단이다. 만일 CO와 H2 가 약간 초과해서 공급되지 않으면, 질량 이동 제한이 일어나고, 경로가 균형을 이룬다. 이는 부족한 아세테이트 생산물에 대한 에탄올 비율(높은 아세테이트 농도)을 초래한다. 높은 아세테이트 농도는 결국 아세트산 억제를 초래할 수 있고, 이는 세균들이 H2를 흡수하는 능력을 제한하고 결국 배양 실패를 이끌 수 있다.
질량 이동 제한을 피하는 단계들은 보다 많은 CO와 H2를 액체 상안으로 이동하는 교반 속도 또는 가스 속도에서의 증가를 포함하고, 따라서 약간 초과량의 CO 와 H2 의 존재로 되돌아간다. 만일 질량 이동 제한의 결과로서 생산물 억제가 일어나면, 더 낮은 생산되는 아세테이트 농도로 희석함으로써, 아세트산 억제를 처리하는 액체 공급 속도를 증가시키는 것이 필요하다. 배지 공급 속도를 증가시키는 것이 제조된 μg 판토테네이트 또는 코발트/g-세포를 증가시키기 때문에, 이는 오직 일시적으로 행해져야 하거나 또는 과도한 판토테네이트 또는 코발트는 배지 농도를 조절하거나 물 공급 속도를 증가시킴으로써 제거되어야 한다.
3. 아세트산 생산물 억제를 조절
상기 방법들에서, 만일 너무 많은 분자 아세트산, 즉, >2 g/L이 바이오리액터에 축적되어, 세포 성장 및 더나아간 에탄올 제조를 허용하면, 아세트산 생산물 억제가 일어날 수 있다. 또다른 조작 단계는 배양 실패를 피하는데 사용된다. 한가지 변경은 일시적으로 액체 또는 물 공급 속도를 증가시켜 아세트산을 2 g/L 보다 낮게 억제하는 액체 상 농도를 줄이는 것을 수반한다. 바이오리액터에서 특정한 배양을 위한 이 단계의 예증은 실시예 23에서 증명된다.
4. 물 재순환 단계
본 발명의 방법에 있어서 순 아세트산 제조를 갖지 않고 유일한 생산물로서 에탄올을 제조하는 안정한 배양을 유지하기 위한 여전히 또다른 선택적 방법 단계는 증류로부터 물 재순환을 발효 리액터로 되돌려 추가하는 것을 포함한다(예를 들어, 실시예 15). 일찍이 주목한 바와 같이, 물(5 g/L 이하의 아세테이트를 함유하는) 재생은 순 아세트산이 제조되지 않도록, 제조된 아세테이트를 리액터로 되돌려 재생하는 잇점을 가진다. 따라서 리액터에서 에탄올과 아세테이트 사이에 평형이 성립된다. 결과적으로, 리액터로 공급되고 생산물로 변환되는 모든 CO, CO2 및 H2는 배양 지속을 위해 사용된 것을 제외하고, 에탄올 제조를 초래한다.
5. 세포 밀도를 줄임
방법에서 유용한 여전히 또다른 조작 단계는 바이오리액터에서 세포 농도를 줄이기 위해 바이오리액터로부터 세균 세포의 주기적 또는 연속적 퍼징(purging)을 시작하는 것이다. 이러한 조작은 세포 농도를 바이오리액터에서 모든 환원 가스 또는 영양분을 이용하는 안정된, 정상 상태 세포 농도 이하로 줄이는 역할을 한다. 따라서, 세포 밀도를 바꿈으로써, 바이오리액터에서 에탄올의 제조는 아세테이트의 제조보다 유리하다. 예를 들어 실시예 25를 참조하라.
6. 두 단계 CSTR
배지 제한과 함께 에탄올 제조와 관련된 문제들중의 하나는 결국 제한하는 조건들에 적응하고 몇개월의 작동 후에 계속해서 에탄올을 제조하지 않는 배양의 능력 또는 경향이다. 대신에 아세테이트가 결국 지배적인 생산물이 된다. 낮은 제한 영양분 농도에 대한 이러한 순응은 에탄올보다 많은 아세트산을 제조하는 배양균을 초래하고(아세테이트 생산물에 대한 에탄올 비율이 1.0 이하), 낮은 에탄올 농도를 산출한다(때때로 1 g/L만큼 낮다). 순응은 성장 속도가 에탄올 제조 속도보다 더 중요한, 개시하는 동안에 배양균이 충분한 영양분이 제공되지 않을때 십중팔구 발생한다. 추가적으로, 정상 상태 작동 동안에 특히 제한하는 영양분 농도가 아세테이트의 반응 시스템을 제거하기 위해 아래쪽으로 조절될때, 배양균이 낮은 제한 영양분 농도에 순응될 수 있다는 위험이 있다.
배양균을 이용가능한 영양분로 성장시키게 하는 대신에, 상기 판토테네이트 또는 코발트 제한 단계들을 사용할때의 이러한 순응 및 상기 언급한 위험을 피하기 위해, 방법의 또다른 변경이 채용될 수 있다. 첫번째 단계에서는 약간 초과량의 제한 영양분에서 주로 우수한 배양 성장이 일어나고(아마도 아세트산 제조를 함께 수반하며), 이어서 첫번째 단계로부터의 배양균이 이제 제한 영양분에 의해 제한되고 높은 농도의 에탄올을 제조하는데 사용되는 제조 단계가 뒤따르는, 2-단계 CSTR 시스템이 본 방법의 또다른 변형이다. 이러한 변형은 안정한 배양의 유지를 가능하게 하고, 그것은 감소된 판토테네이트 또는 코발트 농도에 순응하지 않는다. 이러한 변형은 2-단계 CSTR을 작동하는 것을 포함하고, 여기서 성장 리액터(단계 1) 는 에탄올 제조의 대부분이 발생하는 제조 리액터(단계 2)에 영양공급한다. 성장 리액터는 상기한 영양분 제한 단계로 작동되지 않고, 그래서 배양은 제한된 조건으로의 순응에 민감하지 않다.
2-단계 CSTR 시스템의 개략도가 도 2에 나와있고, 하기의 설명은 그 도면을 참고한다. 이 구체예에 따르면, 성장 단계는 약 24시간의 액체 보유 시간(LRT)에 작동된다. 성장 단계 CSTR(1)은 배지(2)에서 충분한 판토테네이트 또는 코발트 가 공급되어 건강한 배양균을 만든다(그리고 일부 아세트산을 또한 함께 제조할 수 있다). 따라서, 초과량 아세트산은 리액터에서 제조되지만, 증가된 안정성을 갖는다. 이 판토테네이트 또는 코발트 농도는 보통 에탄올을 제조하는데 사용되는 단일 CSTR로 공급되는 양을 초과한다. 이 리액터로 공급되는 가스는 제조 단계(4)로부터의 변환되지 않는 가스(3)이고 액체 원료는 신선한 배지(2)이다. 성장 단계 CSTR은 세포 재순환없이 작동된다. 이 성장 단계 리액터의 목적은 판토테네이트 농도를 낮추기 위해 순응하지 않는 이후의 에탄올 제조를 위해 건강한 배양균을 제공하는 것이다.
제조 단계 리액터(4)는 20시간 이하의 명목상의 LRT에서 작동된다. 세포 재순환과 함께 이러한 CSRT에는 신선한 가스 원료(5)가 공급되고, 낮은 변환을 가질 수 있다. 그것은 성장 단계로부터 배양 원료(7)는 물론이고 신선한 배지 원료(6)가 공급된다. 성장 단계로부터의 초과량이 이용가능하기 때문에 최소의 판토테네이트 또는 코발트는 이 리액터로 공급된다. 세포 주기(8)은 리액터(9)로 되돌려보내진 세포 중에서 가장 많은 제조를 얻기 위해 이 리액터에서 사용된다. 액체 생산물(10)에서 배출 에탄올 농도는 20g/L보다 더 커야만 한다. 2-단계 CSTR 시스템의 특징은 낮은 판토테네이트 또는 코발트 농도에 순응을 위한 작은 변화; 30시간 이하 또는 30시간과 동일한 전체 LRT; 동일한 크기의 단일 CSTR로부터 생긴것보다 더 큰 에탄올 생산율 및 더높은 에탄올 농도가 기대되는 것을 포함한다.
7. 시작 변형
본 발명의 실행에 바람직하게 이용되는 여전히 다른 방법 단계들은, 발효 배양의 초기 시작에서 세포 제조를 포함한다. 에탄올 및 아세트산을 제조하기 위해 CO, CO2 및 H2가 공급되는 바이오리액터의 시작은 스톡 배양으로부터 배치 주입에 의해(실시예 11) 또는 배양 원료로서 존재하는 리액터로부터 연속 접종물을 채용함으로써(실시예 12) 수행된다. 낮은 판토테네이트 또는 코발트 농도에 배양 순응을 피하는 논의에서 일찍이 주목한 바와 같이, 영양분을 제한하지만, 배양균에 과잉의 H2를 공급하기에 앞서, 배양은 가장 바람직하게는 높은 세포 농도까지 가져가진다. 이 신속한 개시는 배양 순응을 피하고 우수한 생산물 비율(높은 에탄올 및 낮은 아세테이트 농도)을 수득한다. 만일 신속한 개시가 채용되지 않으면, 부족한 생산물 비율이 일어날 수 있고 배양균은 낮은 액상 영양분 농도에 순응하고 리액터 재주입을 필요로 할 수 있다.
리액터는 낮은 교반 속도(실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00001
리액터에서 아마도 400-600 rpm)와 원하는 pH에서, 배치 액상(액체 배지는 초기에는 연속적으로 리액터에 공급되지 않는다)으로 시작된다. 따라서 리액터에서 액상은 아주 작은 농도의 제한하는 영양분, 칼슘 판토테네이트 또는 코발트 중의 한가지(예로서 20μg/L 판토테네이트 또는 75 ppb 코발트)와 함께, 비타민과 염을 함유하는 영양분 배지의 배치로 구성된다. 만일 존재하는 리액터로부터 연속 접종물이 채용되면, 가능성있는 배치 액상 작동은 필요하지 않다. 이러한 경우, 가스는 초기 개시동안에 연속적으로 느린 속도로 리액터로 공급된다. 이상적으로, 개시할때 가스상은 CO2-없고, H2-풍부한 것이 될 것이고 가스 속도 및 교반 속도는 CO 기질 억제를 피하기 위한 낮은 수준으로 유지될 것이다.
CO, CO2 및 H2 로부터 상업적으로 실행가능한 에탄올 농도를 생산하고 유지하 기 위한 일반적인 개시 프로토콜의 예는 3가지 별개의 상들로 구성된다 : (a) 초기 개시, 여기서 세포 생산가 중요하다; 생산 속도가 중요해지는 개시; 및 (c)정상 상태 작동. 본질적으로, 초기 개시는 원하는 pH에서(전형적으로 4.5-5.5) 코발트(75ppb) 또는 칼슘 판토테네이트(20μg/L)로부터 선택된, 아주 적은 제한 영양분과 함께, 배치 액체의 주입이 특징이다. 개시를 촉진하기 위해서, H2 가 과도하게 공급되는 반면, 가스 공급 속도 및 교반 속도는 우선적으로 낮게 유지된다. 개시 도중에 에탄올 생산의 원인은 과도한 H2 이고; 영양분 제한이 나중에 일어난다. 따라서, 개시도중에 낮은 영양분에의 원치않는 배양 순응을 피하기 위해 과도한 액체 영양분이 실제적으로 존재한다. 주입후에 몇 시간의 기간에 걸쳐 발효가 진행됨에 따라, CO2가 생산되고 H2는 소비된다. 이들 속도에서 변화는 교반 속도가 질량 이동 제한을 피하기 위해 명목상으로 천천히 증가(아마도 실험실 리액터에서 2-3 일의 기간에 걸쳐, 200-300 rpm까지)되어야 한다는 것을 지시하였다.
CO2 생산의 이러한 개시는 스톡 배양물로부터 배치 주입에 반대로 연속 주입을 채용하는 시스템에서 훨씬 더 신속하게 일어난다. 그러나, 만일 교반 속도가 너무 빨리 증가되면, CO 기질 억제가 발생한다. 명목상으로 교반 속도를 증가시키면서, H2 변환(또는 CO2 제조)을 지켜보는 이 과정은 타겟 교반 속도에 도달할 때까지 상대적으로 빠른 속도로 발생한다. 배치 액체 배양물에서 교반 속도를 증가시키는 이 시간 동안, 생산물 형성 대신에 세포 생산이 최고로 중요하다.
일단 타겟 교반 속도에 도달하면(실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00002
리액터에서 800-1000 rpm), 배양균은 H2 흡수를 확인하도록 안정화가 허용된다. 개시는 생산 속도가 중요해지는 모드로 이동한다. 아세테이트 및 유리 분자 아세트산 농도를 제한하면서 에탄올 생산을 보증하도록 80%를 초과하는 CO 변환 및 배출 가스에서 높은 H2 부분 압력(적어도 0.55 atm)을 갖는 것이 바람직하다. 액체 배지 공급 속도는 그후 가동되어(스톡 배양물로부터 배치 주입을 갖는 시스템에 대해) 연속 액체 원료공급을 개시하고 가스 속도는 표적 흐름 속도를 향해 10% 증분으로 증가된다. H2 는 초과량의 아세트산 생산을 피하도록 과도하게 남아있다. 가스 속도가 증가될수록, 액상 영양분은 제한되고(칼슘 판토테네이트 또는 코발트), 그러한 제한의 효과는 타겟 제조에서, H2 변환에 있어서 작은 하락이다.
정상 상태 작동에서, 15-35 g/L 에탄올 및 0-5 g/L 아세테이트의 생산에 도달된다. 이 단계에서, 제한 영양분, 액체 공급 속도 및 가스 공급 속도에 있어서 작은 조정이 필요하고, 본 발명의 교시는 물론이고, 현존 지식에 의존하여 당업계에서 당업자들에 의해 선택된다. 만일 세포 재순환이 에탄올 생산의 방법에 첨가되어야 한다면, 그것은 이 시간에 가스 속도(증가) 및 영양분 농도(감소)에서의 조정과 함께 첨가된다.
안정적인 작동 조건하에서 낮은 부산물 아세테이트 농도와 함께 높은 농도의 에탄올을 연속적으로 생산하고 유지하는 상기 방법들은 상업적 규모로 에탄올 생산 을 위한 주제 세균의 사용을 강화한다. 상기 방법들에서 약술된 단계들은 CO, CO2 및 H2 로부터 상업적 에탄올 생산을 위해 주제 세균을 이용하는 것의 제한 조건들을 극복한다. 바람직하게는 방법은 연속 바이오리액터를 채용하고, 비록 배치 및 공급-배치 발효 방법이 또한 사용되기는 하지만, 경제적으로 대규모 에탄올 생산에 대해서는 실행가능할 것 같지 않다.
하기 실시예들은 본 발명에 따르는 다양한 양태, 방법 및 방법 단계를 설명한다. 이들 실시예들은 본 발명, 첨부된 청구항에서 구체화되는 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 본 발명의 방법의 예
합성 또는 CO 및/또는 CO2/H2 를 함유하는 폐가스는 비타민, 미량 금속 및 염을 함유하는 종래의 액체 배지와 함께, C.ljungdahlii의 균주를 함유하는 교반된 탱크안으로 연속적으로 도입된다. 한가지 바람직한 영양분 배지는 하기의 표 1에 보고된다.
10% 이하의 배양 접종물을 사용하는 방법 개시동안에 리액터는 배치 액체 상으로 작동되고, 여기서 액체 배지는 연속적으로 리액터로 공급되지 않는다. 리액터의 액체 상은 따라서 칼슘 판토테네이트 또는 코발트 중의 하나인, 아주 작은 농도의 제한 영양분과 함께, 영양분 배지의 배치로 구성된다. 대안으로서, 효모 추출물, 트립티카제 또는 다른 복합 영양분을 함유하는 풍부한 배지가 또한 채용될 수 있다.
이상적으로, 개시할때의 가스 상은 CO2-없고 과도한 H2를 함유한다. 가스 속도 및 교반 속도는 낮은 수준으로 유지되어(New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00003
리액터에서 500rpm 미만) 약간 초과량으로 CO 및 H2 를 수득하지만, 동시에, CO 기질 억제를 피한다. 1-리터 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00004
발효 리액터에서, 예로서, 여기서 원료공급 가스 조성물은 63% H2, 32% CO 및 5% CH4 이고, 개시를 시작하기 위한 교반 속도는 400 rpm이고 가스 속도는 20ml/분이다. 개시하는 동안에 에탄올 생산의 원인은 과도한 H2 이고; 영양분에 대한 제한이 나중에 발생한다. 따라서, 과도한 액체 영양분(판토테네이트, 코발트)는 개시하는 동안에 실제로 존재하여 낮은 영양분에 원치않는 배양 순응을 피한다.
주입 후 몇 시간에 걸쳐 발효가 진행됨에 따라, CO2는 CO의 변환으로부터 생산되고, H2는 CO2와 함께 소비되고, 이것은 가스 질량 이동 제한을 피하는 교반 속도를 명목상으로 증가하기 위한 신호이다. New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00005
CSTR에서, 배출 가스는 25% CO, 67% H2, 2% CO2 및 6% CH4 이다. 만일 교반 속도가 너무 빨리 증가되면, 교반의 증가후에 메탄 농도의 감소에 의해 증거가 되는 것으로, CO 기질 억제가 발생한다. 따라서 교반 속도는 전형적으로 24시간에 200rpm까지 증가될 수 있다. 교반 속도를 명목상으로 증가하면서, CO2 생산을 모니터하는 이러한 과정(또는 H2 변환)은 타겟 교반 속도에 도달할 때까지 상대적으로 빠른 속도로 일어난다. New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00006
발효 리액터에서 전형적인 타겟 교반 속도는 900 rpm이다. 배치 액체 배양에서 교반 속도를 증가하는 이 시간 동안에, 생산 형성을 대신하는 세포 생산은 최대로 중요하다. 따라서, 전형적인 생산물 농도가 배치 배양으로부터 10 g/L 에탄올 및 2 g/L 아세테이트인 반면, 약 1.5 g/L의 세포 농도가 얻어진다.
일단 타겟 교반 속도에 도달하면, 시스템은 최고의 H2 흡수로 성장하도록 허용된다. 아세트산 생산을 제한하면서 에탄올 생산을 보증하는 높은 H2 배출 농도(전형적으로 >60%)를 가지는 것이 바람직하다. 액체 배지 원료공급은 그후 연속 액체 원료공급을 개시하기 위해 작동되고(스톡 배양으로부터 배치 주입을 갖는 시스템을 위해) 타겟 흐름 속도를 향해 가스 공급 속도는 증가된다. 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00007
발효 리액터에서 가스 흐름 속도가 125 ml/min의 타겟 속도를 향해서 매 24시간 10 내지 15%까지 증가되는 동안, 액체 공급 속도는 전형적으로 0.5 ml/min이다.
과도한 아세트산 생산을 피하기 위해 원료공급 가스에서 과도한 H2 를 제공하는 것이 중요하다. 가스 흐름 속도가 증가됨에 따라, 타겟 생산율에서, H2 변환에 있어서 작은 드롭에 의해 명시되는 바와 같이, 리액터가 결국 액체 상 영양분(칼슘 판토테네이트 또는 코발트)에 대해 제한될 때까지 세포 생산은 증가한다. New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00008
CSTR에서, 이것은 20 g/L·일의 타겟 생산성에서 H2 변환에 있어서 10% 드롭에 의해 인지된다.
생산 방법 및 리액터 시스템은 그후 영양분, 액체 속도 및 가스 속도를 제한하는데 있어서 오직 때때로의 작은 조정과 함께, 생산물으로서 15 내지 35 g/L 에탄올과 0 내지 5 g/L 아세테이트를 생산하는 정상 상태에서 유지된다. 세포 재순환없이 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00009
발효 리액터에서 전형적인 정상 상태 조건은 20분의 가스 보유 시간(가스 흐름 속도/리액터 액체 부피), 30시간의 액체 보유 시간(액체 흐름 속도/리액터 액체 부피) 및 900 rpm의 교반 속도이고, 판토테네이트 제한과 함께 92%의 CO 변환 및 60%의 H2 변환을 산출한다.
세포 재순환은 리액터 시스템에 첨가되는 이 방법의 구체예에서, 그것은 가스 속도(증가) 및 영양분 농도(감소)에서의 조절과 함께 이 시간에 첨가된다. New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00010
CSRT 에서 세포 재순환과 함께, 가스 보유 시간은 전형적으로 8분이고, 액체 보유 시간은 12시간이고, 세포 보유 시간은 40 시간이고 교반 속도는 900 rpm이다. 이들 조건은 전형적으로 판토테네이트 제한과 함께 92%의 CO 변환 및 50%의 H2 을 수득한다.
실시예 2. 가스 크로마토그래피를 통한 샘플 분석
적절한 생산율 및 비율을 달성하고/또는 유지하기 위해서, 발효 바이오리액터에서 발효육즙의 샘플은 주기적으로 샘플링되어야 한다. 1.5ml보다 더 큰 배양균의 샘플은 바이오리액터에서 배양으로부터 취해진다. 샘플을 마이크로원심분리기 튜브에 놓고 튜브는 균형을 위해 필요한 밸러스트를 갖는 Fisher Scientific Micro 14 원심분리기에 놓는다. 샘플은 1.5 분동안 8000 rpm에 놓인다. 0.500 ml 샘플의 상청액을 가스 크로마토그래피 오토샘플러에서 사용하기위해 설계된 1.5ml 약병에 넣는다. 내부 표준 용액의 0.500 ml 샘플은 5 g/L의 n-프로판올 및 탈이온수중의 5% v/v, 85% 인산을 함유한다. 인산은 모든 아세테이트가 아세트산으로 변환되고 가스 크로마토그래피에 의해 검출되는 것을 보증한다.
제조된 샘플의 1μl는 그후 오토샘플러에 의해 007 FFA Quadrex 25m × 0.53mm ID 융합 실리카 모세관 칼럼이 장착된 Hewlett-Packard 5890 Series II Gas Chromatograph 안으로 주입된다. 분석은 66 ml/분 분할-흐름 및 7.93 ml/분 주입기 퍼지와 함께 분할-흐름 모드로 헬륨 운반체 가스로 수행된다. 칼럼 헤드 압력은 7ml/분의 칼럼 운반체 흐름을 수득하는 4 psig로 세팅된다. 온도 프로그램은 2분동안 75℃, 30℃/분의 속도에서 190℃로 상승, 5.17분동안 190℃에서 유지 시간이다. 결과적인 실행 시간은 8분이다. 기구는 에탄올(0-25 g/L), 아세트산(0-25 g/L), n-부탄올(0-5 g/L) 및 부티르산(0-5 g/L)에 대해 눈금 보정(칼리브레이션)한다. 시약 등급 물질로부터 제조된 5개 표준이 눈금 보정에 사용된다. 만일 샘플이 농도의 눈금보정 범위 밖에 있으면(예를 들어, >25 g/L 에탄올), 0.250 ml의 샘플 및 0.250 ml의 탈이온수를 0.500 ml의 내부 표준를 갖는 약병에 넣고 희석 인자가 분석에 포함된다.
실시예 3: 세포 재순환을 갖는 실험실 CSTR에서 산 제조
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Figure 112003002679944-pct00011
실험실 발효 바이오리액터는 CO, CO2 및 H2 로부터 아세트산을 생산하기 위해 Clostridium Ijungdahlii, 균주 ERI2, ATCC 55380을 사용하는 세포 재순환으로 작동되었다. 가스 원료는 40% H2, 50% CO 및 10% N2 를 함유하였고, 1리터 리액터에 대한 가스 보유 시간은 7.7 내지 8.6 분이었다. 비타민, 염 및 미량 원소들을 함유하는 액체 배지는 2.6 내지 2.9 시간의 액체 보유 시간으로 공급되었다. pH는 5.1 내지 5.2 였고, 교반 속도는 1000 rpm이었고 세포 보유 시간은 약 40시간이었다. 질량 이동 제한(및 영양분 제한은 아니고)의 이들 조건하에서, CO 변환은 94 내지 98%였고 H2 변환은 80 내지 97%였다. 세포 농도는 4 내지 8 g/L 이었고, 아세테이트는 10 내지 13 g/L에서 생산되었다. 에탄올은 생산되지 않았다. 리액터가 질량 이동 제한 하에서 작동되고(가스를 배양균으로 이동하는 능력에 의해 제한됨) 따라서 생산물로서 오직 아세트산만 생산하였지만, 판토테네이트 제한, 코발트 제한 또는 과도한 H2 또는 CO의 존재를 통해 에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 모니터링하여 에탄올이 지배적인 생산물로서 생산될 때와의 비교로서 역할을 하였다.
표 2에서 나타낸 바와 같이, 생산된 세포의 유닛 당 공급된 Ca-d-판토테네이트는 생산된 세포(μg/g-생산된 세포)의 그램 당 1575 내지 3150 마이크로그램이었다. 유사하게도 생산된 세포(μg/g-생산된 세포)의 그램당 공급된 코발트는 1734 내지 3468이었다. 특정 CO 흡수 속도는 0.35 내지 0.61 mmol/g-세포·분이었다. 변환된 CO의 몰수 2배와 변환된 CO2의 몰수 3배의 합에 대한 공급된 H2의 몰수의 비율은 0.46 이하였다. 따라서, 매개 변수들중의 어떤 것도 배양에 의한 에탄올 제조를 위한 원하는 작동 범위에 없었다.
질량 이동 제한하에서 생산물로서 아세트산을 만들때, 상기 리액터로 판토테네이트 및 코발트가 크게 초과량으로 공급되었다는 것이 이해된다. 즉, 판토테네이트 및/또는 코발트 수준은 상당히 증가될 수 있고 여전히 판토테네이트 또는 코발트 제한을 위한 수준 이상이 될 수 있다. 이것을 예증하기 위해서, 1-리터 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00012
발효 리액터로 공급되는 배지는 코발트 첨가를 코발트 제한을 위한 코발트의 농도 바로 이상인 수준으로 상당히 감소하도록 수정되었다. 리액터는 CO, CO2 및 H2 로부터 아세트산을 생산하기 위해 다시 C. ljungdahlii 균주 ERI2을 함유하였다. 가스 원료는 55% H2, 25% CO, 15% CO2 및 5% CH4 (기준 가스)을 함유하였고, 가스 보유 시간은 7.5 내지 8.0 분이었다. 3.0 내지 3.5 시간의 액체 보유 시간에서 염, 비타민 및 미량 금속을 함유하는 액체 배지를 공급하였다. pH는 5.0 내지 5.3이었고 교반 속도는 900 내지 1000 rpm이었다. 이들 조건하에서 CO 변환은 95 내지 99%였고 H2 변환은 94 내지 98%였다. 세포 농도는 2.5 내지 4.0 g/L이었고 아세테이트는 10 내지 14 g/L에서 유일한 생산물이었다.
세포의 그램 당 리액터로 공급된 Ca-d-판토테네이트는 2250 내지 3600 μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 생산된 세포의 유닛당 공급된 코발트는 62.0 내지 99.2 μg 코발트/g-생산된 세포의 범위로 환원되었다. 특정 CO 흡수 속도는 0.325 내지 0.4 mmole/g-세포·분이었다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 합계에 대한 공급된 H2 의 비율은 0.875였다.
실시예 4. 판토테네이트 제한과 함께 실험실 CSRTs에서 에탄올 생산
New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112006051233510-pct00013
실험실 발효 바이오리액터는 CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올을 생산하기 위해 C. ljungdahlii 균주 C-01 ATCC 55988을 사용하여 CSTR을 통해(세포 재순환없이) 스트레이트로서 작동되었다. 리액터로 가스 공급은 27분의 가스 보유 시간에서 공급되었고; 63.3% H2, 31.4% CO 및 5.3% C2H6 (기준 가스)를 함유하였다. 과도한 염 및 미량 원소 및 판토테네이트의 제한하는 공급을 함유하는 액체 배지는 31.4 시간의 액체 보유 시간에서 1.55 리터 리액터로 공급되었다. pH는 4.6 내지 4.7이었고, 교반 속도는 650 rpm이었다. 이들 작동 조건들하에서 CO 변환은 98%였고, H2 변환은 83%였고, 세포 농도는 1.5 내지 2.0 g/L이었다. 에탄올은 15 내지 19 g/L의 농도로 생산되었고, 아세테이트는 1.5 g/L로 생산되었다. 에탄올 생산율은 11.5 내지 14.5 g/L·일의 범위였다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서, 판토테네이트 제한은 17.7 내지 23.6μg 판토테네이트/g-생산된 세포의 비율의 세포 생산에 대한 판토테네이트 원료로 작동되는 것으로 보여졌다. 이 비율을 산 생산을 위한 실시예 3에서의 2250 내지 3600 μg 판토테네이트/g-생산된 세포에 비교하라. 생산된 세포의 유닛 당 공급된 코발트는 5000 내지 6000 μg 코발트/g-생산된 세포였고, 수준은 실시예 3에서 보다 더욱 큰 수준이고, 어떠한 코발트 제한을 보증하지 않는다. 특정 CO 흡수 속도는 0.23 내지 0.30 mmole/g-세포·분이었다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비율은 1.03이었고, 배출 가스에서 H2 부분 압력은 0.55-0.64 atm이었다. 과도한 H2 또는 제한하는 판토테네이트 중의 하나가 에탄올 생산을 유발하였다는 것이 가능하다.
에탄올 생산을 위한 판토테네이트 제한은 또한 C. ljungdahlii 균주 C-01 ATCC 55988을 사용하여 세포 재순환으로 작동되는 또다른 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00014
실험실 리액터에서 강조되었다. 이 리액터에 12.3분의 가스 보유 시간에 61.7% H2, 30.6% CO 및 5.2% C2H6 (기준 가스)를 함유하는 가스가 공급되었다. 과도한 염 및 미량 원소와 함께 판토테네이트의 제한된 공급을 함유하는 액체 배지는 24.8 시간의 액체 보유 시간에 2.4 리터 리액터로 공급된다. 세포 재순환은 0.2μm 중공 섬유막을 사용함으로써 제공되고, 세포 보유 시간은 69시간이었다. pH는 4.6이었고, 교반 속도는 650 rpm이었다. 이들 조건하에서 CO 변환은 90%이었고, H2 변환은 53%이었고 세포 농도는 2.5 g/L이었다. 에탄올 농도는 18 g/L이었고 아세테이트 농도는 3 g/L이었다. 에탄올 생산율은 17.4 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서(표 2), 생산된 세포의 유닛 당 공급된 판토테네이트의 비율은 8.08 μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 다시, 판토테네이트 제한은 아세테이트 생산을 위해 필요한 것보다 훨씬 적은 수준으로 작동함으로써 확보되었다. 생산된 세포의 유닛 당 공급된 코발트는 3960 μg 코발트/g-생산된 세포였다. 특정 CO 흡수 속도는 0.33 mmol/g-세포·분이었다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비율은 1.14 였고, 배출 가스에서 H2 부분 압력은 0.60-0.65 atm이었다. 과도한 H2 는 에탄올 생산을 위한 잠재적인 이유가 될 수 있다; 그러나, 배출 가스에서 높은 CO2 함량(0.14 atm)은 성장이 판토테네이트에 의해 제한되었다는 것을 보여준다.
또다른 실시예에서, 리액터가 판토테네이트(또는 가스를 배양균으로 이동하는 능력을 제외하고 어떤 다른 제한)에 대해 제한되지 않는 조건의, CO, CO2 및 H2 로부터 아세트산 생산 동안에, C. ljungdahlii 균주 ERI2에 1500 내지 3600 μg 판토테네이트/g 생산된 세포가 공급되었고 생산물 스트림에서 어떠한 에탄올도 발견되지 않았다.
CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올 생산을 위한 판토테네이트에 대해 제한하는 동안, 모든 다른 영양분을 초과량으로 유지하면서, C. ljungdahlii 균주 C-01에 8 내지 24 μg 판토테네이트/g 생산된 세포가 공급되었다. 이들 조건하에서, 균주 C-01는 15 내지 19 g/L 에탄올 및 1.5 내지 3.0 g/L 아세테이트를 생산하였다.
실시예 5. 코발트 제한과 함께 실험실 CSTRS에서 에탄올 생산
New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00015
II 실험실 발효 바이오리액터는 코발트 제한과 함께 CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올 생산를 위해, C. ljungdahlii, 균주 C-01, ATCC 55988을 사용하여 스트레이트로 CSTR을 통해 (어떠한 세포 재순환없이) 작동되었다. 리액터로 공급된 가스는 60% H2, 35% CO 및 5% CH4 (기준 가스)를 함유하였고, 14분의 가스 보유 시간에 공급되었다. 과도한 염, 비타민 및 미량 금속(제한되고 있는 코발트를 제외하고)을 함유하는 액체 배지는 40시간의 액체 보유 시간에 2.5 L 리액터로 공급되었다. pH는 4.9였고 교반 속도는 650 rpm이었다. 이들 조건 하에서 CO 변환은 91%였던 반면, H2 변환은 20 내지 80% 에서 변화하였지만, 명목상으로는 55%였다. 에탄올은 26 g/L에서 생산되었다. 아세테이트는 4 g/L에서 생산되었고 세포 농도는 2.5 g/L였다. 에탄올 생산율은 15.6 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서, 세포 생산에 대한 공급된 판토테네이트의 비율은 15.2 μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 이 수준은 매우 낮아서, 코발트 제한이 판토테네이트 제한을 확실하게 지지하지 않을 수 있다. 코발트 제한은 코발트 제한없이 리액터에서 사용된 것보다 100배 더 작은 수준인, 33.3 μg 코발트/g-생산된 세포로 작동됨으로써 나타났다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비율은 0.94였다. 특정 CO 흡수 속도는 0.37 mmol/g-세포·분이었다.
에탄올 제조을 위한 코발트 제한은 C. ljungdahlii, 균주 C-01, ATCC 55988을 사용하는 세포 재순환과 함께 CSTR에서 또한 증명되었다. 이 실험은 이 실시예에서 예전의 리액터와 대조하여, 과도한 판토테네이트의 존재하에서 코발트 제한을 증명하기 위해 수행되었다. 세포 재순환을 위한 2.0 μm 중공 섬유 막을 갖는 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00016
2000 실험실 발효 바이오리액터는 5분의 가스 보유 시간에서 60% H2, 35% CO 및 5% CH4(기준 가스)를 함유하는 가스가 공급되었다. 과도한 염, 비타민 및 미량 금속(다시, 제한하고 있는 코발트는 제외)을 함유하는 액체 배지는 16시간의 액체 보유 시간에서 1.2 리터 리액터로 공급된다. pH는 5.1이었고 교반 속도는 825 rpm이었다. 세포 재순환을 위한 중공 섬유를 갖는 이러한 CSRT에서 세포 보유 시간은 40시간이었다. 이들 조건하에서 CO 변환은 83%였고, H2 변환은 50%였고 세포 농도는 4.2 g/L 였다. 에탄올 농도는 18 g/L 이었고 아세테이트 농도는 4 g/L이었다. 에탄올 생산율은 27 g/L·일이었다.
이 리액터에서 에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 강조하는데 있어서(표 2), 세포 생산에 대한 공급된 판토테네이트의 비율은 이러한 예에서 앞선 리액터에서보다 5.5 배 더 큰 수준인, 85.7μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 코발트 제한은 47.6μg 코발트/g-생산된 세포로 작동됨으로써 나타났다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비율은 1.03이었고, 배출 가스에 있어서 H2 부분 압력은 0.60 atm 이었다. 다시, 과도한 H2는 에탄올 생산을 위한 잠재적인 이유가 될 수 있지만; 그러나, 배출 가스에서 높은 CO2 함량(0.1-0.15 atm)은 성장이 코발트에 의해 제한되었다는 것을 보여준다. 특정 CO 흡수는 0.50 mmol/g-세포·분이었다.
실시예 6. 존재하는 과도한 CO로 작동할 때 실험실 CSTRs에서 에탄올 생산
높은 압력 AUTOKLAVTM 리액터(Buchi)는 50시간의 기간동안 과도한 CO의 존재하에서 CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올의 생산을 위해 C. ljungdahlii, 균주 C-01을 사용하여 배양 순환 및 세포 재순환과 함께 CSTR로서 작동되었다. 리액터는 25 psig에서 작동되고 가스 57% H2, 36% CO 및 6% C2H6을 함유하는 가스가 공급되었다. 가스 보유 시간은 변경가능하지만, 명목상으로 3.0 분이었다. 과도한 염, 비타민(판토테네이트를 포함) 및 미량 금속을 함유하는 액체 배지는 8.2시간의 액체 보유 시간에서 600ml 리액터로 공급되었다. 세라믹 중공 섬유 막을 통해 리액터 유출액를 통과시킴으로써 얻어진, 세포 보유 시간은 18.5 시간이었다. pH는 4.5였고, 교반 속도는 450 rpm이었고 액체 재순환 속도는 0.4 내지 0.5 gpm이었다. 이들 조건하에서, 가스 변환은 가변적이었지만, CO 변환은 명목상으로 72%이고 H2 변환은 명목상으로 12% 였다. 세포 농도는 2.7 g/L 이었다. 에탄올은 9.9g/L로 생산되었고 아세테이트는 2.6 g/L로 생산되었다. 에탄올 생산율은 29.0 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석함에 있어서, 세포 생산에 대한 공급된 판토테네이트의 비율은 97μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 이 수준은 확실하게 판토테네이트가 제한하지 않도록 충분히 높다. 세포 생산에 대한 공급된 코발트의 수준은 836 μg 코발트/g 생산된 세포, 다시 확실하게 코발트가 제한하지 않는 수준이었다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비 율은 1.09였고, H2 부분 압력은 1.6atm이었다. 배출 가스에서 높은 CO2 함량(0.5 atm)은 과도한 H2 가 에탄올 생산을 유발하지 않았다는 것을 보증한다. 특정 CO 흡수 속도는 과도한 CO를 에탄올을 생산하는 방법으로서 확실시하는 수준인, 1.34 mmol/g-세포·분이었다.
에탄올 생산을 위해 과도한 CO를 사용하는 기술은 또한 AUTOKLAVTM 리액터 (Buchi) 시스템에서 24시간의 기간동안 C. ljungdahlii, 균주 C-01를 가지고, 다시 세포 재순환 및 배양 순환과 함께 한, 또다른 실험에서 입증되었다. 이 실험에서 600ml 리액터에 1.4분 가스 보유 시간에 15.8% H2, 36.5% CO, 38.4% N2, 및 9.3% CO2 를 함유하는 가스가 공급되었다. 리액터 압력은 40 psig에서 유지되었다. 과도한 염, 비타민 및 미량 금속을 함유하는 액체 배지가 4.8 시간의 액체 보유 시간에 공급되었고, 세라믹 중공 섬유 필터를 통해 유출액을 통과시킴으로써 얻어진, 세포 보유 시간은 19.2 시간이었다. pH는 4.5였고, 교반 속도는 1000 rpm이었고 액체 재순환 속도는 0.4 내지 0.5 gpm이었다. 이들 조건하에서, CO 변환은 71.6%였고 H2 변환은 11.8% 였다. 세포 농도는 7.1 g/L이었고, 에탄올은 12.0 g/L로 생산되었고 아세테이트는 2.7 g/L로 생산되었다. 에탄올 생산율은 60 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서(표 2), 세포 생산에 대한 공급된 판토테네이트의 비율은 294 μg 판토테네이트/g-생산된 세포였다. 이 수준은 에탄올 생산을 유발하는데 필요한 최소 수준을 훨씬 초과한다. 세포 생산 에 대한 공급된 코발트의 비율은 735 μg 코발트/g 생산된 세포였고, 다시 코발트가 과도하게 공급되도록 확실하게 하는 수준이다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 비율은 0.3이었다. CO 흡수 속도는 과도한 CO가 에탄올이 생산되는 원인이 되는 방법으로서 이용할 수 있게 다시 확보하는 수준인, 0,67 mmol/g 세포·분이었다.
실시예 7. 과도한 H 2 존재하는 에탄올 생산
New Brunswick Scientific Bioflo 실험실 발효 바이오리액터는 과도한 H2의 존재하에서 CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올을 생산하기 위해 C.ljungdahlii, 균주 C-01 ATCC 55988을 사용하여, CSTR을 통해(세포 재순환없이) 스트레이트로서 작동되었다. 리액터에 가스 공급원료는 30분의 가스 보유 시간에 공급된 77% H2, 19% CO 및 4% CH4(기준 가스)를 함유하였다. 과도한 염, 비타민 및 미량 금속을 함유하는 액체 배지는 36시간의 액체 보유 시간에 리액터로 공급되었다. pH는 5.0이었고 교반 속도는 1000 rpm이었다. 이들 작동 조건하에서 CO 변환은 97-99%였고 H2 변환은 60-80%였다. 세포 농도는 0.8-1.0 g/L이었고, 에탄올 농도는 10 g/L이었고 아세테이트 농도는 3.3 g/L이었다. 에탄올 생산율은 6.7 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서, 세포 생산에 대한 공급된 판토테네이트 원료 비율은 900-1125μg 판토테네이트/g 생산된 세포였고, 따라서 과도한 판토테네이트가 존재하는 것을 확보한다. 유사하게, 세포 생산에 대 한 공급된 코발트 원료 비율은 991-1239 μg 코발트/g 생산된 세포였고, 다시 과도한 코발트가 존재하였다는 것을 확실시한다. 특정 CO 흡수 속도는 0.28-0.35 mmol/g 세포 분이었고, 과도한 CO가 에탄올 생산을 유발하지 않도록 하는 수준이었다. 변환된 CO 2배와 변환된 CO2 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 몰수의 비율은 1.96이었고, 1.0을 넘는 비율이고, 과도한 H2가 존재하고 따라서 에탄올 생산을 제어할 수 있는 수준이다. 배출 가스에서 H2 부분 압력은 0.70-0.87 atm이었고, 배출 가스에서 CO2 부분 압력에 대한 H2 부분 압력의 비율은 65였다. 따라서, 리액터는 과도한 H2 의 존재로 인해 에탄올을 생산하였다.
두번째 실시예에서, 높은 압력 AUTOKLAVTM 리액터 (Buchi)는 과도한 H2의 존재하에서, CO, CO2 및 H2 로부터 에탄올의 생산을 위해 C. ljungdahlii, 균주 C-01을 사용하여 배양 순환 및 세포 재순환과 함께 CSRT로서 작동되었다. 리액터에 공급되는 가스는 2.21분의 가스 보유 시간에 공급된, 81% H2, 16% CO 및 3% CH4 (기준 가스)를 함유하였다. 과도한 염, 비타민 및 미량 원소들을 함유하는 액체 배지는 8.97 시간의 액체 보유 시간에 리액터로 공급된다. 세포 보유 시간은 22.7 시간이었고, pH는 4.5 였고 교반 속도는 800rpm이었다. 이들 작동 조건하에서 CO 변환은 91.5%였고 H2 변환은 43.4%였다. 세포 농도는 5.5 g/L 이었고 아세테이트 농도는 2.85 g/L 이었다. 리액터에서 에탄올 생산율은 215-240 g/L·일이었다.
에탄올 생산을 위한 매개 변수들을 분석하는데 있어서, 판토테네이트 공급 비율은 46μg 판토테네이트/g 생산된 세포였고, 판토테네이트 제한을 지시할 수 있는 수준이다. 세포 생산에 대한 코발트 원료 비율은 460 μg 코발트/g 생산된 세포였고, 코발트가 제한하지 않는다는 것을 보증하는 수준이다. 특정 CO 흡수 속도는 1.68 mmol/g·세포·분이었고, 만일 H2 변환에 대한 기질 억제가 일어나지 않는다는 것을 지시하는, 4.14 mmol/g·세포·분의 높은 H2 흡수 속도가 없다면, 과도한 CO가 존재하였다는 것을 나타낼 수 있는 수준이다. 변환된 CO 몰수 2배와 변환된 CO2 몰수 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 몰수의 비율은 5.67이었고, 과도한 H2 가 존재하기 위해 요구되는 1.0의 비율보다 훨씬 더 높은 비율이다. 배출 가스에서 H2 부분 압력 2.61 atm, 그리고 배출 가스에서 CO2 부분 압력에 대한 H2 부분 압력의 비율은 10.9였다. 리액터는 따라서 과도한 H2의 존재의 결과로서 에탄올을 생산하고 있었다.
방법 매개변수들의 개략적인 비교 및 실시예 3에 대한 결과가 하기 표 2에 나와있다.
실시예 8. 배지 조제물을 사용한 C. LJUNGDAHLII 균주 ERI2, C-01 및 PETC 에서의 생산물 이동
본 발명의 방법들은 어떠한 C. ljungdahlii 균주에 적용될 수 있다. 균주 ERI2, C-01 및 PETC를 채용하는 배지 조작 실험으로부터의 결과가 하기 표 3에 나 와있다. 이들 실험의 목적은 단순히 배지를 조작함으로써 각각의 균주들이 아세트산 생산로부터 에탄올 생산로 이동될 수 있다는 것을 증명하는 것이었다. 따라서, 지배적인 생산물로서 아세트산을 생산하기 위해서 배양균에 과도한 영양분(판토테네이트 및 코발트)이 공급되었고, 그후 지배적인 생산물로서 에탄올을 생산하기 위해 판토테네이트 또는 코발트에 대해 제한되었다. 오직 이들 실험의 목적은 배지 조작이 각각의 균주에 대한 생산물 이동을 초래할 수 있다는 것을 증명하기 위한 것이었다는 점이 강조되어야 한다. 따라서, 높은 생산물 농도 및 생산율을 얻는 것은 이들 실험의 목표가 아니었다.
리액터는 배양 실험의 각각에 대해 CSTR을 통해(세포 재순환 없음) 스트레이트로서 작동되었다. 가스 보유 시간은 명목상으로는 50분으로 세팅되었고, 액체 보유 시간은 명목상으로는 40 시간에 세팅되었고 교반 속도는 명목상으로 1000 rpm에 세팅되었다. 이들 조건은 균주의 비교를 허용하도록 선택되었지만, 높은 생산율을 달성하지 못했다.
표 3에서 알수 있듯이, 균주 ERI2는 생산물을 지배적인 생산물로서 아세트산으로부터 지배적인 생산물로서 에탄올로 앞뒤로 이동시킨 배지에서의 5가지 변화를 겪었다. 판토테네이트 제한 및 코발트 제한 모두는 이 균주에 의한 에탄올 생산에 대해 증명되었다. 균주 C-01은 배지 조작을 사용하여, 다시 에탄올 생산을 위한 메카니즘으로 증명된 판토테네이트 제한 및 코발트 제한 모두로, 3배 이동되었다. 균주 PETC는 코발트 제한으로 인한 에탄올 생산와 함께, 오직 한번 이동되었다. 각각의 균주들은 지배적인 생산물로서 에탄올이라기 보다는 아세트산을 생산할때, 더 높은 H2 변환을 나타내었다. 이것은 영양분을 제한할때 에탄올이 생산되는 반면, 질량 이동 제한(배양균으로 가스의 양을 제한함)하에서는 아세트산이 생산되고, 따라서 가스 변환에 부정적인 영향을 줄 수 있는 과도한 가스가 공급되기 때문에 발생한다. 지배적인 생산물이 에탄올일때 소량의 아세테이트는 생산물 스트림에 언제나 존재한다. 그러나, 아세트산이 지배적인 생산물일때, 에탄올은 보통 측정가능한 농도로 존재하지 않는다. 영양분 조작에 의해 에탄올로부터 아세트산으로 지배적인 생산물을 이동하는데 있어서, 모든 미량의 에탄올을 제거하는것이 매우 어렵다는 것이 나타났다. 에탄올의 완전한 제거는 오직 아세트산 강화 배지에서 몇주의 계속되는 작동후에만 발생하였다.
실시예 9. 세포 재순환이 있고 없는 정상 상태 작동
CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생산하는 궁극적인 상업적 목적은 높은 아세테이트 생산물에 대한 에탄올 비와 높은 생산율을 얻으면서, 동시에, 높은 정상 상태 농도의 에탄올을 달성하는 것이다. CSTR을 통해(세포 재순환 없음) 스트레이트로 C. ljungdahlii, 균주 C-01를 사용하여 20% H2, 65% CO, 10% CO2 및 5% CH4 를 함유하는 CO-풍부 가스로부터 에탄올의 생산에 대한 정상 상태 데이터는 표 4에 나와있다. 표에서, GRT는 가스 보유 시간(입구 흐름 속도에 대한 액체 부피의 비율)을 말하고, LRT는 액체 보유 시간(액체 흐름 속도에 대한 액체 부피의 비)을 말하고, XRT는 세포 보유 시간을 말한다(리액터에서 세포가 소비하는 시간의 평균 양). 표 4에서 알수 있듯이, 17.5 내지 33 g/L의 에탄올 농도가 얻어졌고, 에탄올 생산선은 14.4 내지 21.1 g/L·일의 범위에 있다.
CO가 풍부하지 않은 가스로부터의 에탄올 생산에 대해 유사한 결과가 나타나있다. 재순환없이 C. ljungdahlii, 균주 C-01를 사용하는 실험에서 사용된 가스는 표 5에 나와있고, 16% H2, 27% CO, 6% CO2, 및 51% N2를 함유한다. 11 내지 26 g/L 범위의 에탄올 농도가 2차 생산물로서 존재하는 2.0 내지 5.0 g/L 아세테이트와 함께, 이 가스와 함께 얻어졌다. 에탄올 생산율은 11.1 - 20.1 g/L·일의 범위였다. *표 5에서 세포 농도는 건조 세포 중량에 근거한다.
최종적으로, 정상 상태 데이타는 C. ljungdahlii O-52 (ATCC Accession No. 55989)를 사용하여 세포 재순환과 함께 CSTR에서 50% H2 , 45% CO 및 5% CH4 을 함유하는 가스의 변환에 대한 정상 상태 데이타가 하기 표 6에 나타나있다. 18 내지 23.5 g/L의 에탄올 농도 및 3.0 내지 5.7 g/L의 아세테이트 농도가 얻어졌다. 에탄올 생산율은 21.1 내지 39.0 g/L·일의 범위였다.
실시예 10. 세포 재순환 및 압력을 갖는 CSTR에서 높은 에탄올 생산율
CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생산하기 위해 C. ljungdahlii,균주 C-01을 사용하여 배양 순환 및 세포 재순환과 함께 CSTR로서 높은 압력 AUTOKLAVTM 리액터(Buchi)가 작동되었다. 리액터는 30 psig에서 작동되었고 62% H2, 31% CO 및 5% C2H6을 함유하는 가스가 공급되었다. 가스 보유 시간은 3.5분의 실제 가스 보유 시간과 함께, 1.14분(대기압 기반)이었다. 과도한 염, 비타민 및 미량 금속을 함 유하는 액체 배지는 3.6 시간의 액체 보유 시간에서 600ml 리액터로 공급되었다. pH는 4.5였고 교반 속도는 825 rpm이었다. 이들 조건하에서, 세포 농도는 8 g/L이었고, CO 변환은 90%였고 H2 변환은 40% 였다. 생산물 스트림은 20 g/L 에탄올 및 2.75 g/L 아세테이트를 함유하였다. 에탄올 생산율은 150 g/L·일이었다.
C. ljungdahlii, 균주 C-01을 사용하여 배양 순환 및 세포 재순환과 함께 CSTR로서 작동되는 또다른 높은 압력 AUTOKLAVTM 리액터(Buchi)에서, 리액터는 6 atm(75 psig)에서 작동되었고 55% H2, 30% CO, 5% CH4 및 10% CO2 를 함유하는 합성 가스가 공급되었다. 6.0분의 실제 가스 보유 시간과 함께, 가스 보유 시간은 1분이었다(대기압 기준). 과도한 염, 비타민 및 미량 금속을 함유하는 액체 배지는 1.62시간의 액체 보유 시간에 리액터에 공급되었다. 세포 보유 시간은 24시간이었고, pH는 4.5였고, 교반 속도는 800 rpm이었다. 이들 조건하에서, 세포 농도는 2.0 g/L 이었고, CO 변환은 95%였고 H2 변환은 60%였다. 생산물 스트림은 25 g/L 에탄올과 3g/L 아세테이트를 함유하였다. 에탄올 생산율은 369 g/L·d 였다.
실시예 11. 과도한 H 2 의가 존재하는 스톡 배양으로부터의 개시
스톡 배양으로부터 배치 접종물을 사용하는 개시는 오염물없는 건강한 접종물을 확보하지만, 다소 낮은 세포 농도가 채용되기 때문에, 특히 만일 가스 속도 및 교반 속도와 같은 방법 매개변수들이 주입 바로 후에 너무 빠르게 위쪽으로 푸쉬되면, 주입 과정으로서 언제나 성공적인 것은 아니다.
스톡 배양으로부터 배치 접종물을 사용하는 개시는 이 예에서 논의된다. 리액터의 주입을 위한 스톡 배양을 생산하기 위해, C. ljungdahlii, 균주 C-01(ATCC Accession No. 55989)의 배양균은 1 g/L 효모 추출물과 1 g/L 트립티카제를 함유하는 풍부한 배지에서 CO, CO2 및 H2 상의 150 ml 세럼 병에서 성장되었다. 채용된 비타민 농도는 50.5 mg/L 칼슘 판토테네이트, 20.6 mg/L d-비오틴 및 50.6 mg/L 티아민 HCI을 함유하는 수용액의 0.4 ml/L 배지였다. 병을 셰이커 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 배양균은 시각 검사에 의해 결정된 바와 같이, 지수 성장 상태로 성장되었다. 각각의 주입과 함께, 대략 90mL의 스톡 배양균은 세럼 병으로부터 9체적% 주입으로 나타내는 1리터의 배지로 이동시켰다. 성공적인 주입은 하기에 기술된다. 약술된 과정은 성공적인 주입을 얻기 위해 여러번 반복될 수 있다.
성공적인 주입을 얻는데 있어서, 90 ml/L의 접종물을 0.4 ml/L 비타민과 염을 함유하는 1 리터 배치의 기초 배지에 첨가하였다(표 1에 나타냄)(t=0). 교반 속도는 240 rpm이었고, pH는 5.3이었고, 온도는 38.5 ℃였고 가스 보유 시간(연속 가스 흐름)은 110분이었다. 가스 원료는 62% H2, 31% CO 및 7% C2H6를 함유하였다. 13시간후에(t=13시간) 일부 CO 변환은 뚜렷했고, t=23시간 때 교반 속도는 240 rpm 에서 300 rpm으로 증가되었다. 가스 보유 시간은 t = 27시간에 100분으로 감소되었고, 가스 보유 시간에서의 더욱 감소는 t = 46 시간에 이루어졌다. 교반 속도는 또한 t = 28 시간, 59 시간, 72 시간 및 85 시간에서 100 rpm 증가량으로 증가되었다.
t = 110 시간까지, 시스템은 80분의 가스 보유 시간 및 600 rpm의 교반 속도로 작동되었다. 세포 농도는 0.5 g/L이었고 CO 변환은 35%였다. 여전히 H2 변환이 없었지만, 소량의 에탄올과 아세테이트(~1 g/L 각각)가 배치 배양액에서 축적되었다. 이 시간까지 노력은 리액터에서 세포 성장을 강조하였다.
기초 배지와 동일한 농도를 사용하는 배지 흐름은 t=120 시간에서 0.4 ml/분의 속도로 시작되었다. 가스 속도, 교반 속도 및 배지 속도에서 아주 작은 증가의 프로그램은 그후 과도한 H2 하에서 시스템을 조심스럽게 유지하면서 개시되었다. t=210 시간까지, 에탄올 농도는 17 g/L 이었고, 아세테이트 농도는 1 g/L였고, 세포 농도는 1.6 g/L 이었고, CO 변환은 거의 100%였고 H2 변환은 90%였다. 에탄올 생산율은 11.4 g/L·일에 도달하였다.
점차적인 가스 속도 증가의 프로그램은 다시 시작되었다. 공존하는 비타민(표 1 참조) 증가는 비타민 첨가 속도를 0.7 ml/L 배지로 가져가도록 이루어졌다. t=610 시간까지, 리액터는 20 g/L 에탄올과 약 2 g/L 아세테이트를 생산하고 있었다. CO 변환은 거의 100%였고 H2 변환은 85%였다. 에탄올 생산율은 14 g/L·일에 도달하였다.
실시예 12. 현재의 CSTR 로부터 접종물을 사용하는 개시
현재의 CSTR로부터 연속 접종물을 사용하는 CSTR의 개시는 더욱 빠르고 스톡 배양의 배치 병들로부터의 개시보다 더욱 신뢰할 만하다. 에탄올 생산을 거의 중지하였고 액상 생산물로서 2-3 g/L 에탄올, 7-8 g/L 아세테이트 및 약 0.3 g/L 부 탄올을 생산하고 있는, Isolate C. Ijungdahlii, 균주 C-01 (ATCC Accession No. 55988)를 함유하는 CSTR은 현재의 CSTR로부터 연속 접종물을 사용하여 재시작되었다.
접종물을 제거한 CSTR은 25분의 가스 보유 시간, 32시간의 액체 보유 시간, 650 rpm의 교반 속도, 38.5℃의 온도 및 pH 4.66에서 작동하면서, 약 17 g/L 에탄올 및 1-2 g/L 아세테이트을 생산하고 있었다. 세포 농도는 1.7 g/L이고, CO 변환은 본질적으로 100%였고 H2 변환은 85%였다.
연속 접종물 첨가가 시작되었고(t=0), 이 시간에, 교반 속도는 500 rpm으로 감소되었고 가스 보유 시간은 38분으로 세팅되었다. 생산 리액터로부터의 유출액(0.5 ml/min)은 몇 시간에 걸쳐 발생했는 연속 주입과 함께, CSTR이 주입되기 위한 연속 접종물으로서 역할을 하였다. t=5 시간까지(연속 주입의 개시후 5시간), 가스 변환이 뚜렷했고, 교반 속도는 700 rpm으로 증가되었다. 연속 접종물은 t=28 시간에 중지되었다. 가스 변환은 가스 속도(가스 보유 시간을 낮추었다)에서의 일정한 증가 및 750 rpm 까지 교반 속도 증가를 허용하며, 꾸준히 향상되었다. t=30 시간까지, CO 변환은 95%였고 H2 변환은 80%였다. 에탄올 농도는 13 g/L이었고 아세테이트 농도는 1.5 g/L이었고, 그것은 100시간을 훨씬 넘는 시간동안 1.4 g/L에서 고정되었다. 이시간 동안, 에탄올 생산율은 10 내지 15 g/L·일이었다.
실시예 13. 엄격한 방법 전복으로부터 회복
연속적으로 가스 및 액체 영양분이 공급되고 정상 상태(예를 들어, 실시예 1)에서 15-35 g/L 에탄올 및 0-5 g/L 아세테이트를 생산하는 C. Ijungdahlii, 균주 C-01을 함유하는 세포 재순환을 갖는 CSTR은 방법 조건들에서의 뜻밖의 변화, 예를 들어, 리액터에서 기계적인 문제들 때문에 전복된다. 리액터 시스템에 대한 전복은 단기간 기질 억제를 유발하는 가스 속도에서 잠시의 증가와 같이 미미하거나, 또는 결국 증가된 아세트산 생산와 보다 심각한 분자 아세트산 생산물 억제를 이끄는 가스 속도에서의 보다 장기간의 증가와 같이 중요할 수 있다.
단기간 전복은 단지 전복 매개 변수를 재조정하고(예를 들어, 가스 속도를 그것의 원래 수준으로 낮춤으로써) 리액터의 진행을 모니터링하여 전복이 장기간의 문제를 유발하지 않았다는 것을 확실하게함으로써 쉽게 수정된다.
그러나, 아세트산 생산물 억제는 더욱 심각한 문제이다. 만일 장기간 기질 억제, 과도한 영양분 첨가, CO2 축적 또는 많은 타입의 기계적인 문제들의 결과로서 배양균에 의해 과도한 분자 아세트산이 생산되면, 과도한 아세트산을 초래한 문제들은 먼저 수정되어야만 한다. 생산물 억제를 빨리 초래하는 과도한 아세트 산은 그후 액체 속도를 증가시켜 시스템으로부터 아세트산(불행하게도 에탄올)을 세척하도록함으로써 시스템으로부터 제거된다. 일단 아세테이트 수준이 3-5 g/L 아래이면, 액체 속도는 재세팅되고 리액터는 과도한 H2 원료, 또는 비타민 또는 코발트 제한 중의 한가지 하에 (세포 재순환과 함께 또는 없이) 다시 놓인다. 리액터를 다시 가져가는 것은 가스 속도를 줄여서 세포 세척과 용해가 일어나기 전에 기질 억 제 및/또는 교반 속도를 피하는 것을 포함한다. 교반 속도 또는 가스 속도는 그후 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 증가된다.
하나의 특정 실시예에서, CO, CO2 및 H2 으로부터 에탄올과 아세트산을 생산하고 있는 C. Ijungdahlii, 균주 C-01을 함유하는 세포 재순환을 갖는 CSTR은 기계적인 문제에 응답하여 아세트산을 생산하기 시작하였다. 2100 ml 리액터는 15분의 가스 보유 시간에 62% H2, 31% CO 및 7% C2H6 를 함유하는 가스가 공급되었고, 600 rpm의 교반 속도와 4.86의 pH로 작동되고 있었다. 액체 보유 시간은 23시간이었고 세포 보유 시간은 68시간이었다. B-비타민 용액(50.5 mg/1 칼슘 판토테네이트, 20.6 mg/L d-비오틴 및 50.6 mg/L 티아민 HCl의 수성 혼합물)이 배지 1리터당 0.4 ml 비타민 용액의 농도로 염과 비타민을 함유하는 액체 영양분 배지에 존재하였다 (표 2 참조). 아세테이트 농도는 7 g/L로 상승하는 동안, 에탄올 농도는 7 g/L로 떨어졌고, 조건들은 리액터를 작동하는데 안정하지도 않고 에탄올 생산에 경제적이지도 않았다. 세포 농도는 2.4 g/L이었고, CO 변환은 85%였고 H2 변환은 25%였다.
리액터를 회복하는데 사용되는 방책은 먼저 리액터로 가스 원료 속도를 극적으로 줄이고, 이어서 과도한 H2의 존재하에서 점차적인 리액터의 회복으로 구성되었다. 리액터로의 액체 속도는 이 실시예에서 생산물 억제를 제거하도록 감소되지 않았는데 이는 아세테이트 농도가 대단히 높지 않았기 때문이다. 대신에, 아세테이트 농도는 가스 유속의 감소 및 과도한 H2 의 존재하에서 이어지는 작동과 함께 좀 더 점차적으로 제한하지 않는 수준까지 떨어지도록 허용되었다. 리액터를 회복하는데 있어서 특정한 과정이 하기에 기술된다.
세포 재순환이 중지되었고 오직 액체 보유 시간을 23에서 30 시간(t=0)으로 약간 조정하면서, 가스 속도는 62분의 가스 보유 시간으로 70%까지 극적으로 감소되었다. 배지에서 비타민 농도는 변하지 않았다. 가스 속도의 이러한 변화와 함께 CO 변환은 98%로 증가하였고 H2 변환은 80%로 증가하였다. 보다 중요하게는 배출 가스에서 19 에서 5%로 CO2 감소에 의해 증명된 바와 같이, 시스템은 과도한 H2 이 존재하였다. 과도한 H2 의 개시와 함께, 에탄올 농도는 증가한 반면, 아세테이트 농도는 떨어졌다. t=66시간에서(세포 재순환의 중지 후 66시간) 예를 들어, 아세테이트 농도가 4 g/L로 떨어졌고 에탄올 농도는 7.5 g/L로 약간 증가하였다.
과도한 H2 의 존재(및 낮아진 아세테이트 농도)는 처음에는 천천히 그리고 그후에는 더욱 빠른 속도로, 이어지는 가스 속도의 증가를 허용하였다. t=215 시간까지 가스 보유는 29분이었고, 에탄올 농도는 12 g/L이었고 아세테이트 농도는 3 g/L이었다. 에탄올 생산율은 8 g/L·일이었다. 배출 가스에 CO2가 6%로 존재하였고, CO 변환은 98% 였고 H2 변환은 80%였다. t=315 시간까지, 에탄올 농도는 16 g/L이었고, 아세테이트 농도는 4 g/L였고, 다시 우수한 가스 변환과 함께, 20분의 가스 보유 시간이었다. 에탄올 생산율은 11 g/L·일이었다. t=465 시간까지, 에탄올 농도는 20 g/L에 도달하였고, 또한 3.5-4 g/L 아세테이트가 함께 존재하였다. 에탄올 생산율은 16 g/L·일이었다. 가스 보유 시간은 각각 95 및 73%의 CO 및 H2 변환와 함께, 16분으로 떨어졌다. 이들 조건들은 리액터 시스템이 에탄올을 생산할 수 있는 그것의 능력을 회복하였고 이전의 작동 조건을 본래 보유했었다는 것을 증명하면서, 거의 200시간의 연속 작동 동안 유지되었다.
실시예 14. CO의 과잉공급과 함께 에탄올 생산 방법
높은 CO 농도의 존재로 인해 아세트산 생산로부터 에탄올 생산까지의 이동을 증명하기 위해 세포 재순환을 갖는 연속 고압 교반 탱크 리액터에서 간단한 실험이 수행되었다. 이 실험에 앞서, C. ljungdahlii, 균주 C-01을 함유하는 리액터는 20-25 psig의 압력에서 작동되었고 57% H2, 36% CO 및 7% C2H6 을 함유하는 가스를 공급하였다. 가스 보유 시간은 2분 이내였고, 액체 보유 시간은 38시간이었고, 세포 보존 시간은 28 시간이었고, 교반 속도는 600 rpm이고 온도는 38℃였다. 이들 조건하에서 CO 변환은 가변적이었고 평균 85%였고, H2 변환은 가변적이었고 평균 20%였다. 세포 농도는 약 2.5 g/L이고, 생산물 스트림은 9 g/L 에탄올과 3 g/L 아세테이트를 함유하였다.
실험을 준비하는데 있어서 첫번째 단계로서, 과도한 CO가 존재하지 않게 확실하게 하기 위해서 가스 보유 시간을 증가시켰다. 압력을 23-24 psig로 유지하였다. pH는 4.5-4.6의 정상 작동 범위에서 확실히 안정적이도록 충분히 길게 뒤따랐다. 순수한 CO는 그후 표준 원료 가스와 혼합되어 2.3분의 가스 보유 시간에서 47% H2, 47% CO 및 6% C2H6분 가스 원료를 수득하였다. 리액터 pH, 배출 가스 조성물, 및 생산물 스트림은 그후 시간에 따라 모니터링되었다.
표 7은 시스템에 여분의 CO를 첨가한 후에 시간에 따른 pH 변화 및 생산물 조성을 보여준다. CO 첨가후에 30분에, 리액터 pH는 5.25까지 증가하였고 배양은 1.54 g/L (0.0257 mole/L) 아세테이트에서 1.12 g/L (0.0243 mole/L) 에탄올로 이동하였다. 유리 아세트산이 에탄올로 변환되는 결과로서 pH 증가가 일어났다. 이러한 변화와 함께 일어나는 것은 91% 에서 71%로 CO 변환의 감소였다. 0.4 gpm 에서 0.15 gpm으로 배양 순환을 감소시키는데 있어서, 리액터 pH가 떨어지지만, 에탄올과 아세테이트 농도는 유지하였다.
CO 도입후에 50분, 에탄올 농도는 11.29 g/L 이었고 아세테이트 농도는 1.75 g/L이었다. 이 시간에, 과도한 CO는 중지되었고 에탄올 농도 및 pH는 떨어지기 시작하였고, 아세테이트 농도는 상승하기 시작하였다. pH에서의 감소는 에탄올의 분자 아세트산으로의 변환 때문이었다. CO의 과잉공급을 통한 에탄올-아세트 산 이동은 따라서 가역적이다.
실시예 15. 아세테이트 생산을 최소화하기위한 물 재순환
증류후에 에탄올을 회수하기 위해 물을 발효 바이오리액터로 되돌리는 물의 재순환 방법은 유출액 생산을 최소화하고, 리액터로부터 에탄올의 수득을 최소화하고, 아세트산 생산을 제한하는데 필수적이다. 증류는 리액터로부터 얻어진 15-35 g/L 에탄올을 95% 에탄올로 농축시키기 위한 가장 경제적인 방법으로 밝혀졌다. 분자 체로 흡착하는 것은 그후 에탄올을 원하는 농도로 더욱 농축시키는데 사용된다. 증류를 수행하는데 있어서, 물중의 95% 에탄올이 오버헤드 생산물로서 생산된다. 물은 증류하는 동안 바닥 생산물로 발생된다. 바닥 생산물은 발효하는 동안 리액터로부터 생산된 아세트산(3-5 g/L 아세테이트) 및 발효하는 동안 사용되지 않거나 증류의 열에 의해 파괴되지 않은 미량 금속 및 다른 미네랄과 같은, 어떠한 영양분을 함유한다. 영양분의 재순환은 발효 바이오리액터에 이어서 첨가되어야 하는 영양분의 양은 물론이고 처리되어야 하는 유출액의 양을 최소화한다. 아세테이트의 재순환은 에탄올과 아세트산 사이에 평형을 성립시킴으로써 아세트산이 더 형성되는 것을 예방한다. 따라서, 물 재순환과 함께 어떤 순 아세트산도 생산되지 않는다. 3-5 g/L 이상의 아세테이트의 재순환은 리액터에서 아세트산 억제를 초래할 수 있다. 따라서, 아세테이트를 함유하는 물 재순환의 결과로서, 기질 CO, CO2 및 H2 은 유일한 생산물로서 에탄올로 변환될 수 있다.
표 8은 물 재순환과 함께 C. ljungdahlii, 균주 0-52를 사용하여; 50% CO, 45% H2 및 5% CH4를 함유하는 가스의 발효에 대한 결과를 보여준다. 의들 실험에서, 세포 재순환을 위해 사용되는 중공 섬유 여과로부터의 투과액은 증류로 보내졌다. 에탄올을 제거한 후에, 물을 0.2 미크론 필터로 여과하여 침전된 모든 부산물을 제거하였다. 이들 실험에서 재순환된 물의 분율은 리액터에 공급되는 전체 물과 비교하여 (배지로서) 25-100% 범위였다. 100% 물 재순환으로 한 실험은 거의 500 시간 또는 약 20 액체 보유 시간동안 지속되었다. 100% 물 재순환으로의 결과에서 나타난 바와 같이, 순 아세트산은 생산되지 않았다. 사실상, 소량의 아세트산은 결국 소비되었다. 에탄올 생산율은 12 내지 27 g/L·일의 범위였다.
실시예 16. 성장 단계로 판토테네이트 원료공급을 갖는 2-단계 CSTR 시스템
성장 단계에 대한 적절한 판토테네이트 원료공급은 최적화되어야 하는 변수이다. 추가 판토테네이트 또는 코발트가 건강하고 안정한 배양을 확보하기 위해 성장 단계에 공급되기 때문에 약간 더 많은 아세트산이 이 리액터에서 생산될 것이라는 것을 제외하고는, C. ljungdahlii C-01을 사용하는 성장 단계 리액터로부터의 전형적인 결과가 실시예 11 및 12에 기술되어 있다. 채용된 비타민 농도는 50.5 mg/L을 함유하는 50.5 mg/L 칼슘 판토테네이트, 20.6 mg/L d-비오틴 및 50.6 mg/L 티아민 HCl을 함유하는 수용액의 0.7-0.8 ml/L 배지였다. 세포 재순환과 함께 생산 단계 CSTR은 성장 단계 리액터로부터 유출액이 공급되고 우세한 생산물로서 에탄올을 생산한다. 이 리액터로 공급되는 판토테네이트 농도는 성장 단계에서보다 훨씬 더 낮고, 50.5 mg/L 칼슘 판토테네이트, 20.6 mg/L d-비오틴 및 50.6 mg/L 티아민 HCl을 함유하는 수용액의 오직 0.1-0.2 ml 전체 비타민/L 배지이다. 이 생산 단계에서 가스 보유 시간은 11-30 분이었고, 액체 보유 시간은 약 20시간이었고, 세포 보유 시간은 30-50 시간이었고, 교반 속도는 800-900 rpm였다. pH는 5.0이었고 온도는 38℃였다. 일단 리액터가 정상 상태에 도달하면, 가스 보유 시간은 11분에 서 일정하게 유지되었고, 액체 보유 시간은 19 시간에 세팅되었고, 세포 보유 시간은 37시간에서 일정하였고 교반 속도는 900 rpm였다. CO 변환은 평균 96% 였고 H2 변환은 평균 60%였다. 에탄올 농도는 25-30 g/L에 고정되었고, 약 3 g/L 아세테 이트가 또한 함께 존재하였다. 에탄올 생산율은 31.6-37.9 g/L·일이었다.
실시예 17. 낮은 제한하는 칼슘 판토테네이트에 순응을 피하기 위한 발효 매개변수를 규제
발효 리액터에서 낮은 제한 칼슘 판토테네이트 농도에 대한 배양의 순응은 하기와 같이, 영양분에서의 주된 변화들을 피하면서, 그러나 대신에 상대적으로 일정한 영양분 원료 농도를 유지하면서, 발효 매개변수들(가스 속도, 액체 속도, 교반 속도, H2 부분 압력)을 규제함으로써 피할 수 있다.
실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00017
CSTR의 개시 동안에, C.ljungdahlii, 균주 C-01에 배양에 영양을 제공하는데 필요한 비타민, 미량 미네랄 및 염을 함유하는 액체 영양분 스트림이 공급된다. 영양분 배지에서 판토테네이트 농도는 20 μg/L이었고, 이 농도는 낮은 속도의 배지와 결합할때의 농도는 바이오리액터에서 낮은 세포 생산 때문에 생산된 세포의 그램 당 공급된 100μg 이상의 칼슘 판토테네이트가 있다는 것을 확보한다. 유사하게는 배지에서 코발트 농도는 1 ppm이었고, 코발트가 또한 과도하게 존재하도록 확보하는 농도이다. 대신에, CO2는 없고, 63.3% H2, 31.4% CO 및 5.3% C2H6를 함유하는 가스를 공급함으로써, 따라서 1 이상의 H2 공급된의 비율 / ( 2 CO변형된 및 3 C02변형된)을 수득하고 가스 공급 속도 및 교반 속도를 조심스럽게 제어하여 95% 이상의 CO과 80% 이상의 H2 변환을 달성함으로써, 배출 가스에서 H2 부분 압력은 0.55 기압보다 초과하여 유지되었다. 이들 높은 변환이 시간에 따라 얻어짐에 따라, 세포 농도는 거의 0 g/L의 초기 수준으로부터 약 1.5 g/L까지 형성한다.
이러한 개시중에 판토테네이트 농도는 일정하기 유지되므로, 생산된 세포의 그램 당 μg 판토테네이트는 그것이 그후 판토테네이트가 제한되는 조건인, 15 μg 판토테네이트/g 생산된 세포 미만이 될때까지 점차적으로 감소된다. 시스템은 따라서 판토테네이트 제한으로 성장한다. 높은 에탄올:아세테이트 생산물 비율은 과도한 H2에 의한 재시를 통해 얻어진다. 대안으로서 개시의 초기 단계중에 리액터는 판토테네이트 제한을 통한 제어하에서 이후에 가져온 생산물 비율과 함께, 아세트산을 생산하도록 허용된다.
실시예 18. 코발트를 리액터로 제한하는 것
리액터가 코발트에 대해 제한되지 않은 조건(또는 가스를 배양균으로 이동하는 능력을 제외하고 어떠한 다른 제한)인, CO, CO2 및 H2로부터 아세트산을 생산하는 동안에 C. ljundahlii, 균주 ER12에 62 내지 3500 μg 코발트/g 생산된 세포가 공급되었고, 어떠한 에탄올도 생산물 스트림에서 발견되지 않았다. CO, CO2 및 H2로부터 아세트산 생산을 위해 코발트에 제한하는 동안, 모든 다른 영양분을 초과량으로 유지하면서, C. ljundahlii, 균주 C-01에 33 내지 48 μg 코발트/g 생산된 세포가 공급되었다. 이들 조건하에서, 균주 C-01는 18 내지 26 g/L 에탄올 및 약 4 g/L 아세테이트를 생산하였다.
실시예 19. 낮은 제한 코발트 농도에 대한 순응을 피하는 것
낮은 제한 코발트 농도에 순응은 하기와 같이 영양분에서의 주된 변화를 피하면서, 그러나 대신에 상대적으로 일정한 영양분 공급 농도를 유지하면서, 발효 매개변수(가스 속도, 액체 속도, 교반 속도, CO2 함량)를 규제함으로써 피해진다.
실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00018
CSTR의 개시중에, C. ljungdahlii, 균주 C-01에 배양균에 영양을 제공하기 위해 필요한 비타민, 미량 미네랄 및 염을 함유하는 액체 영양분 스트림을 공급하였다. 영양분 배지에서 코발트 농도는 느린 속도의 배지 공급과 결합될때, 바이오리액터에서 낮은 세포 생산때문에, 생산된 세포의 g 당 공급된 50 μg 이상의 코발트(과도한 코발트)가 있다는 것을 확보하는 농도인, 75 ppb였다.
유사하게는 배지에서 판토테네이트 농도는 20 μg/L 이었고, 코발트가 또한 과도하게 존재하도록 확보하는 농도이다. 대신에, 다량의 H2를 함유하고 CO2는 없는 가스를 공급하고, 95% 이상의 CO 변환과 80% 이상의 H2를 달성하도록 조심스럽게 가스 제공 속도 및 교반 속도를 제어함으로써, 배출 가스에서 H2 부분 압력은 0.55 기압을 초과하여 유지되었다. 이들 높은 변환이 시간에 따라 얻어짐에 따라, 세포 농도는 거의 0 g/L의 초기 수준에서 약 1.5 g/L 까지 형성한다. 이 개시 동안에 코발트 농도가 일정하게 유지되기 때문에, g 생산된 세포 당 μg 코발트는 그것이 그후 코발트 제한되는 조건인, 50 μg 코발트/g 생산된 세포 미만이 될때까지 점차적으로 감소한다. 시스템은 따라서 코발트 제한으로 성장한다. 원료에서 과도한 H2 를 채용함으로써 개시를 통해 높은 에탄올 수율이 얻어진다. 대안으로서 제어 하에서 코발트 제한을 통해 나중에 가져온 생산물 비율과 함께, 리액터는 개시의 초기 단계동안에 아세트산을 생산하도록 허용된다.
실시예 20. 수소 과잉공급
세포 재순환 및 액체 재순환과 함께 CSTR으로서 작동되는 실험실 AUTOKLAV 리액터 (Buchi)의 작동중에, C. ljungdahlii 는 배양균에 영양을 제공하기 위해 필요한 비타민, 미량 미네랄 및 염과 함께 작동되었다. 리액터는 변환된 CO 몰수 2배와 변환된 CO2 몰수 3배의 총합에 대한 공급된 H2의 몰수의 비율은 5.67이 되도록, 공급 가스에 존재하는 과도한 H2 로 작동되었다. 만일 이 비율이 1.0보다 더 크지 않다면, 과도한 H2가 리액터에 존재할 수 없고 과도한 H2 의 존재로 인한 에탄올 생산이 일어날 수 없다. 게다가, 배출 가스에서 H2 부분 압력은 2.61 atm이었고, 과도한 H2 의 존재로 인한 에탄올 생산을 위한 0.4 atm의 요구조건을 초과하는 수준이었다. 최종적으로, 배출 가스에서 CO2 부분 압력에 대한 H2 부분 압력의 비율은 10.88이었고, 3.0 보다 더 큰 수준이고 충분한 H2가 존재하여 이용가능한 모든 탄소를 이용하도록 확보하는 수준이다. 이들 조건하에서 리액터는 거의 26 g/L 에탄올과 3g/L 이하의 아세테이트를 생산하였다. 에탄올 생산율은 200 g/L·일 이상이었다. 이들 상기 기준들 중 어떠한 것이 만족되지 않으면, 리액터는 과도한 H2 가 존재하기 때문에 에탄올을 생산할 수 없다. H2 다량의 또다른 양태는 그것이 히드로게나제를 통한 산화에 의해 추가의 환원된 페레독신을 초래한다는 것이다.
실시예 21. CO 기질 억제를 경감하는 것
800 rpm의 교반 속도에서 작동하는 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo
Figure 112003002679944-pct00019
CSTR은 그것이 이전에 가스 출구에서 오직 5% CO로 작동되고 있었을때 10%의 출구 CO 농도를 나타낸다. 교반 속도를 600 rpm으로 감소시킴으로써, CO 억제가 제거되었고 출구 CO 농도는 5%로 되돌아갔다. 이것은 증가된 H2 흡수, 리억터로 공급되는 모든 가스를 효율적으로 이용하기 위해 필요한 조건을 가져온다.
실시예 22. 질량 이동
에탄올 생산을 이끄는 과도한 질량 이동의 예로서, C. ljungdahlii, 균주 ERI2를 함유하는 세포 재순환과 함께 영양분 제한이나 원료 가스에서 과도한 H2 또는 CO 없이 작동하는 실험실 CSTR을 고려하라. 즉, 판토테네이트는 생산된 세포의 그램 당 100 μg 이상의 칼슘 판토테네이트의 비율로 공급되고 코발트는 생산된 세포의 그램 당 100 μg 이상의 비율로 공급된다. H2는 배출 가스에 약 0.2 atm으로 존재하고 특정 CO 흡수 속도는 0.3 mmol CO/g 세포·분 이하이다. 교반 속도는 800rpm이다. 이들 조건하에서 배양균은 오직 아세트산을 생산한다(생산물 스트림에 에탄올은 존재하지 않음). 만일 교반 속도가 900 rpm으로 빠르게 증가되거나 가스 속도가 약 10%까지 증가되면, 에탄올은 가스를 흡수하기 위해 세포 농도가 증가할때까지 또는 기질 억제로 인해 배양균이 죽을때까지 생산물 스트림에서 관찰된다.
실시예 23. 아세트산 생산물 억제를 조절
8 g/L 아세트산과 10 g/L 에탄올을 생산하는 실험실 CSTR에서, 액체 보유 시간은 보다 많은 에탄올을 생산하는 배양균의 능력을 제한하고 있는 리액터로부터 과도한 아세트산을 세척하려는 시도로 36시간동안 24시간에서 12시간으로 감소된다. 작동하는 모든 다른 리액터 및 영양분 조건은 일정하게 유지된다. 이 시간 후에, 액체 보유 시간은 24시간으로 되돌아가고 3 g/L 아세테이트 및 15 내지 25 g/L 에탄올을 함유하는 생산물 스트림이 생긴다. 액체 보유 시간을 줄이는데 몇가지 시도들은 생산물 억제를 제거하는 것이 필요하다. 대안으로서, 과도한 CO2 는 또한 에탄올보다 우선하여 아세트산을 이끌어낼 수 있으므로, H2 는 가스 원료에 첨가되어 과도한 H2 조절을 허용한다. 이들 변형은 과도한 아세트산 생산을 막고, 따라서 부족한 생산물 비율을 예방하고, 낮은 에탄올 생산율을 예방한다. 그후, 공급 가스에서 과도한 H2의 사용 또한 제한하는 액상 영양분 농도가 재개된다.
실시예 24. 일산화탄소 공급과잉
과잉 영양분(초과량의 판토테네이트 및 코발트)이 공급되고 원료공급 가스에서 다량의 H2 가 없을때 C. ljungdahlii, 균주 ERI2는 0.23 내지 0.48 mmol/g·분의 특정 CO 흡수 속도를 가졌고, 생산물 스트림에서 어떠한 에탄올도 발견되지 않았다. 그러나, C. ljungdahlii, 균주 C-01가 공급 가스에서, 다량의 H2없이 과도한 영양분이 유사하게 공급되고, 그러나 CO의 과잉공급이 에탄올 생산을 유발하고 있 는 조건하에 있었을때, 특정 CO 흡수 속도는 0.67 내지 1.34 mmol/g·분이었다. 이들 조건하에서, 배양균은 9.9 내지 12.0 g/L 에탄올과 2.6 내지 2.7 g/L 아세테이트를 생산하였다.
실시예 25. 세포 퍼지로 생산물 비율 조절
가스 기질(30% CO, 15% H2, 10% CO2, 45% N2) 발효는 세포 재순환과 함께(세포 보유 시간=40 및 액체 보유 시간=6시간) C. ljungdahlii, 균주 C-01를 이용하여 CSTR(pH= 5.0, 온도= 38 ℃, 압력 = 20 psig)에서 일어나고 배양은 코발트, 칼슘 판토테네이트, 또는 어떠한 다른 영양분에 의한 성장에서 제한되지 않는다. 배양균이 성장할수록, 특정 흡수(분당 건조 세포의 그램당 mmol CO)가 0.5 미만이고 아세트산은 에탄올보다 우선적으로 생산되도록 세포 밀도가 얻어진다. 이러한 발생을 막기위해서, 세포 퍼지 속도는 세포 밀도의 증가를 예방할 수 있게 증가되고, 그러므로 세포의 안정된 농도는 분당 그램 건조 세포 당 0.5 mmol CO 보다 더 높은 특정 흡수를 유지하기에 충분히 낮게 유지된다. 이렇게 하는데 있어서, 세포 보유 시간은 6 내지 25 시간 사이로 감소된다.
Figure 112003002679944-pct00020
a MPFN 미량 금속은 함유한다(용액의 리터당): 10 ml의 85% H3P04, 0.10 g 의 ZnSO4·7H20, 0.03g의 MnCl2·4H2O 0.3g의 H3B0 3, 0.20g의 CoCl2·6H20, 0.02g의 CuCl2·H2O, 0.04g의 NiCl2·6H2O, 0.03g의 NaMoO4 2H2 O, 2.00g의 FeCl2·4H2O, 0.01g의 Na2SeO3, 및 0.10 g의 Na2WO4·2H2O
b 비타민 용액은 20.6 mg/L d-비오틴, 50.6 mg/L 티아민 HCl 및 50.5 mg/L d-판토펜산, 칼슘 염을 함유한다.
c 주입에서 0.3-0.5 ml로부터 높은 가스 속도에서 0.7-0.8 ml만큼까지 상당히 변한다.
Figure 112003002679944-pct00021
Figure 112003002679944-pct00022
Figure 112003002679944-pct00023
Figure 112003002679944-pct00024
Figure 112003002679944-pct00025
Figure 112003002679944-pct00026
Figure 112003002679944-pct00027
모든 공보 문서는 여기에 참고 문헌에 의해 포함된다. 본 발명의 수많은 변형과 수정이 상기 확인된 명세서에 포함되고 당업자들에게 명백할 것으로 기대된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 그러한 변형 및 변경은 여기에 첨부된 청구항의 범위에 포함되는 것으로 믿어진다.

Claims (31)

  1. 가스 기질의 혐기성 세균 발효로부터 에탄올을 제조하기 위한 안정되고 연속적인 방법으로서,
    액체 영양분 배지 중에서 에탄올을 생성할 수 있는 혐기성의 아세토제닉 세균인, 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii)를 바이오리액터 내에서 배양하는 단계;
    일산화탄소를 포함하는 상기 가스 기질을 상기 바이오리액터에 공급하는 단계;
    상기 바이오리액터 내에 생성된 세균의 건조 세포 그램 당 2 내지 50㎍의 양으로 상기 바이오리액터로 칼슘 판토테네이트를 공급하는 단계; 및
    분 당 세균의 세포 건조 중량 그램 당 0.3 내지 2mmol CO의 양으로 상기 바이오리액터 내에서 CO 흡수의 특정 속도를 유지하는 단계
    를 포함하며, 여기서 유리 아세트산은 5g/L 유리산 미만의 농도로 상기 바이오리액터 내에서 생성되고, 상기 에탄올은 1일 당 10g/L 이상의 생산율로 생성되며, 에탄올과 아세테이트는 모두 1:1 내지 20:1의 범위의 에탄올 대 아세테이트의 비로 상기 바이오리액터 내의 발효 육즙에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오리액터는 상기 에탄올의 대부분이 생성되는 제 2 바이오리액터로 상기 발효 육즙을 공급하는 성장 리액터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오리액터로부터 상기 발효 육즙을 제거하는 단계, 상기 육즙으로부터 에탄올을 증류하는 단계, 및 상기 에탄올을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 증류 단계로부터의 아세테이트를 함유하는 물을 상기 바이오리액터로 다시 재순환시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 클로스트리디움 융달리는, 클로스트리디움 융달리 PETC, 클로스트리디움 융달리 ERI-2, 클로스트리디움 융달리 O-52 및 클로스트리디움 융달리 C-01로 구성되는 균주로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 가스 기질은 (a) 일산화탄소, (b) 일산화탄소 및 수소, 또는 (c) 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 가스 기질은 질소 또는 메탄을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 영양분 배지 함량, 영양분 공급 속도, 물 공급 속도, 작동 압력, 작동 pH, 가스 기질 함량, 가스 공급 속도, 발효 육즙 교반 속도, 세포 밀도 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 매개 변수를 변경시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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  13. 제 1 항에 있어서, pH는 4.5 내지 5.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 바이오리액터로부터 세균 세포를 주기적으로 퍼징하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 발효 육즙에 존재하는 아세테이트의 유리 아세트산 부분이 2g/L을 초과할 때 물 공급 속도를 증가시킴으로써 상기 유리 아세트산 농도의 어떤 원치 않는 증가를 줄이는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 가스 공급 속도를 감소시켜서 기질 억제를 완화하고 상기 생산율을 유지하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 발효 육즙 교반 속도를 감소시켜서 기질 억제를 완화하고 상기 생산율을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 삭제
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  20. 제 1 항에 있어서, CO 흡수의 상기 특정 속도는 분 당 상기 바이오리액터 내의 세균의 건조 세포 그램 당 0.5 내지 1.5mmol CO인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 8 항에 있어서, 상기 가스 기질은 과잉의 수소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 칼슘 판토테네이트의 상기 양은 생성된 세균의 건조 세포 그램 당 2 내지 25㎍의 칼슘 판토테네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 칼슘 판토테네이트의 상기 양은 생성된 세균의 건조 세포 그램 당 10 내지 30㎍의 칼슘 판토테네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 가스 공급 속도, 영양분 공급 속도 및 발효 육즙 교반 속도로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 매개 변수를 조정함으로써, 상기 바이오리액터 내의 상기 세균이 상기 칼슘 판토테네이트 양에 순응하는 것을 방지하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 영양분 배지는 상기 바이오리액터 내에 생성된 세균의 건조 세포 그램 당 5 내지 100㎍ 코발트의 양으로 코발트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 코발트의 상기 양은 생성된 세균의 건조 세포 그램 당 20 내지 50㎍ 코발트인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 일정한 코발트 농도를 유지하고, 가스 공급 속도, 영양분 공급 속도, 발효 육즙 교반 속도 및 수소 가스 부분압력으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 매개변수를 조정함으로써, 상기 바이오리액터 내의 상기 세균이 상기 코발트 양에 순응하는 것을 방지하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 3 항에 있어서, 상기 발효 육즙으로부터 상기 세균을 분리하고, 상기 분리된 세균을 상기 바이오리액터로 되돌려 보내는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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