UA122673C2

UA122673C2 - Антитіло, що специфічно зв'язується з людським il-6

Info

Publication number: UA122673C2
Application number: UAA201705592A
Authority: UA
Inventors: Майкл Марч Шмідт; Майкл Марч Шмидт; Елісон Тісдейл; Элисон Тисдейл; Ерік Стівен Ферфайн; Эрик Стивен ФЕРФАЙН; Грігоріос Зарбіс-Папастойтсіс; Григориос Зарбис-Папастойсис
Original assignee: Елевен Байотерапьютікс, Інк.; Елевен Байотерапьютикс, Инк.
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2020-12-28
Also published as: EA201791005A1; MX2017005992A; FI4268843T3; KR20240023450A; HRP20251312T1; EP3215530B9; CO2017005404A2; EP4268843A2; CN107249631A; AU2015342882A1; PH12017500809A1; PL3215530T3; MA51554A; HRP20191945T1; EP3215530B1; AU2015342882B2; HUE046181T2; EP4268843A3; ZA201702985B; ES2756275T3

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що специфічно зв'язується з людським IL-6. Також винахід стосується композиції для лікування очної хвороби, застосування терапевтично ефективної кількості антитіла IL-6 у виготовленні лікарського засобу, нуклеїнової кислоти, вектора та клітини.

Description

Винахід стосується виділеного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що специфічно зв'язується з людським ІІ -6. Також винахід стосується композиції для лікування очної хвороби, застосування терапевтично ефективної кількості антитіла ІЇ/-6 у виготовленні лікарського засобу, нуклеїнової кислоти, вектора та клітини.

Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки США Мо 62/077105, поданої 7 листопада 2014 р.; попередньої заявки США Мо 62/087448, поданої 4 грудня 2014 р.; та попередньої заявки США Мо 62/247705, поданої 28 жовтня 2015 р. Зміст кожної з цих заявок в повному обсязі включений до даного документу шляхом посилання.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід стосується 1-6. Більш конкретно, винахід стосується модуляторів 1-6 та їх застосування у лікуванні хвороби, такої як хвороби ока.

ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

І/-б6 є плейотропним цитокіном з описаними ролями у запаленні, гемопоезі, ангіогенезі, клітинній диференціації та нейрональному виживанні. Даний винахід стосується удосконалених антитіл ІІ -6 та їх застосування.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Винахід стосується антитіл ІІ -6 та їх фрагментів (наприклад, антигензв'язуючих фрагментів) або похідних, а також нуклеїнових кислот, що кодують антитіла ІЇ-б6 та фрагменти. Винахід також стосується застосування таких антитіл, фрагментів або похідних. Антитіла та їх фрагменти або похідні можуть бути використані, наприклад, у лікуванні хвороби, асоційованої з

ІЇ-6. У варіантах реалізації, антитіло, його фрагмент або похідне може зв'язуватися (наприклад, специфічно зв'язуватися) з І-6, наприклад, з людським ІІ -6. У варіантах реалізації, антитіло, його фрагмент або похідне може зв'язуватися (наприклад, специфічно зв'язуватися) із сайтом ЇЇ

І/-6 (наприклад, сайтом ІІ людського ЇЇ -6).

В одному аспекті, передбачуваному в даному документі, пропонується виділене антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає () МН СОКТ, що включає послідовність (3УХЇ Х2ММПЕ (ЗЕО ІО МО:45), (ї) МН СОК2, що включає послідовність УХзТРаАХАСТІМ (ЗЕО ІЮ МО 46), та (її) МН СОКЗ, причому виконуються одна чи декілька (наприклад, 1, 2, 3, або усі) з таких умов: Х: не є А, Х2 неє 5, Хзне є І, і Ха не є 5. У варіантах реалізації, Х: не є А, Хг неє 5, ХзнеєїЇ,і Ха не є 5.

У варіантах реалізації Хі позначає М або консервативне заміщення М. У варіантах реалізації, Х2 позначає Р або консервативне заміщення Р. У варіантах реалізації, Хз позначає Т

Зо або консервативне заміщення Т. У варіантах реалізації, Хі. позначає З або консервативне заміщення б. У варіантах реалізації, виконуються одна, дві, три або усі з таких умов: Хі позначає М або консервативне заміщення У, Хг2 позначає Р або консервативне заміщення Р, Хз позначає Т або консервативне заміщення Т, і Х- позначає С або консервативне заміщення 6. У варіантах реалізації, Хі позначає М або консервативне заміщення М, Хг позначає Р або консервативне заміщення Р, Хз позначає Т або консервативне заміщення Т, і Х. позначає Сб або консервативне заміщення 0.

У варіантах реалізації, Хі вибирають з М, І, Ї та М. У варіантах реалізації, Хі: вибирають з М, та І. У варіантах реалізації, Хг вибирають з Р, б, та А. У варіантах реалізації, Х2 вибирають з Р та 6. У варіантах реалізації, Хз вибирають з Т та 5. У варіантах реалізації, Ха. вибирають з б та

Р.

У варіантах реалізації, виконуються одна чи декілька (наприклад, 1, 2, З або усі) з таких умов: Хі: позначає У, Х2 позначає Р, Хз позначає Т, і Х. позначає 0. У варіантах реалізації, Хі позначає У, Х» позначає Р, Хз позначає Т, і Ха позначає 0.

У варіантах реалізації, МН СОКЗ включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:33.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1ІЇ/-б і/або підвищену ефективність. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1І/-б6 і/або підвищену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом (наприклад, ідентичним в інших відношеннях антитілом або антигензв'язуючим фрагментом), що включає послідовність, причому виконуються одна чи декілька (наприклад, 1, 2, 3, або усі) з таких умов:

Хі: позначає А, Х» позначає 5, Хз позначає І і Х4 позначає 5.

В деяких варіантах реалізації, виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містить МН СОКІ!, що включає послідовність 5ЕБЕО ІЮО МО:31, МН СОК2, що включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:32, та необов'язково МН СОКЗ, що включає послідовність ЗЕО ІЮ

МО:33.

У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга включає послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну з 5БЕО ІЮ МО:17. У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга складається з послідовності, яка принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентична з БЕО ІЮО МО:17 або відрізняється від ЗЕО ІЮ 60 МО:17 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:17 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:17 на 1- амінокислот.

У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга включає послідовність, 5 принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:37. У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга складається з послідовності, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентичної БЕО ІЮ МО:37. У варіантах реалізації, варіабельна ділянка важкого ланцюга відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:37 не більш ніж на 5, 4, 3,2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО:37. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що складається з 5ЕО ІЮ МО:37.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:39. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність, яка відрізняється від БЕО ІЮ МО:39 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає ЗЕО ІЮ МО:39. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Еар.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:54. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність, яка відрізняється від БЕО ІЮ МО:54 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає ЗЕО ІЮ МО:54. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Еар.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є 5сЕм. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий (фрагмент) включає або складається з послідовності

СЕМ

ОМОЇ МОБСІАЕУККРИаЗБЗУКУЗСКАБИМУМІ РММ ТЕМ УВОАРОСИІ ЕуМОаМТтРОСИТІММАОК

ЕОСАМТІТАОЕЗТОТАМУМЕЇ 551 В5ЕОТАУУМСАВЗАУОРІ УУМАГ ЕМ СОСТТУТУЗЗСВБИС

Зо сазасасеріММтТО5РОБІ АМБІ СЕВАТІМСВАЗЕЗМОМУСІТРЕМММУМУООКРИОРРКОИ ІМААЗМА сзамРовЕБазазатореЕт ті ОАЕОМАМУМУСООЗЕЕМРГТЕРСОСТКІ БІКАТМ (5ЕО І МО:52) або

РІММТО5РОБІ АУ5БІ ЧЕВАТІМСВАЗЕЗМОМУСІТРЕММУМУООКРЕООРРКОИ ІМААЗМНазамМРов

ЕзазавБатТоОвЕТІ ТЗІ ОАЕОМАМУУСОО5ЕЕМУРІ ТЕИОСТКІ ЕІіКАа ТИССсООаЗаСс,СОаЗасаавОМ

ОГМО5БОАЕУККРИаЗЗУКУЗСКАБИМУМІ РММ ТЕМУ УВОАРСССІ ЕУМОаМТТРОССИТІММАОКЕеОСВ

МТІТАОЕЗТЗТАММЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВЗАМ/ ОРІ ММА ЕМ СОСТТУТМУ55 (5ЕО ІЮ МО:53).

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮО МО:52 або 5ЕО ІО

МО:53. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає ЗЕО ІЮ МО:52 або 5ЕО ІО МО:53. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є 5сгЕм.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:41. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, яка відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:41 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить послідовність важкого ланцюга, що включає ЗЕО ІЮО МО 41. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, що складається з БЕО ІЮ

МО:41.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1-6 і/або підвищену ефективність порівняно з ЕВІ-029 або його фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1-6 і/або підвищену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, який містить МН СОКІ1, що включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:4, МН СОК2, що включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:5, та необов'язково МН СОМКЗ, що включає послідовність зЗЕО

ІЮ МО:6. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського ІЇ/-б і/або підвищену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, який містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка включає або складається з ЗЕО ІЮО МО:17. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1-6 і/або підвищену бо ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, який містить 5ЕО ІЮ

МО:24. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського ІЇ/-б та/(або підвищену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, який містить послідовність важкого ланцюга, що включає або складається з БЕО ІЮ МО:11.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає одну чи декілька послідовністей ЕВІ-030 або ЕВІ-031, наведених у Таблиці 4. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить один чи декілька доменів ЕВІ-030 або ЕВІ-0ОЗ1, представлених на Фіг. 15 (наприклад, один чи декілька з ЕК1, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ,

ЕК4, СНІ, шарнірного, СН2 та СНЗ послідовності важкого ланцюга, і/або ЕК1, СОБІ, ЕІ,

СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА та СК послідовності легкого ланцюга). У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає важкий ланцюг та легкий ланцюг. У варіантах реалізації, важкий та легкий ланцюги з'єднані одним чи декількома дисульфідними зв'язками. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Рар. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є 5сЕм. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є фрагментом Раб, Раб", Е(аб)2, зсЕм або Ем.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського ІЇІ--6 і/або підвищену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, які містять одну чи декілька відповідних послідовністей ЕВІ-029, або послідовністей антитіла, описаного у УМО2014/074905, який цим включений до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1--6 і/або підвищену ефективність порівняно з тоцилізумабом.

Таблиця 4

Загальний опис послідовністей ЕВІ-029, ЕВІ-О30 та ЕВІ-0О31

Амінокис-лотна ЗЕОІО МО ЮМОІ МОБОАЕ УМККРОББЗУКМ ЗСКАБИаМАГ 5 ММ ЕМУВОА послідов-ність РООСІЕМУМОаМ ІРОБОТІММ АОКРОСАМТІ ТАОЕЗТОТА

ЕВІ-029 НС (Ідаг) МЕ! 55І85ЕО ТАМУМСАНЗА МОРІ МУМАГЕ УМУСОСТТМТМ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАОТ ЗЕБТААГОЯСІ УКОМЕРЕРМТ

ЗМУМЗаА 5 ОУМНТЕРАМІІО 5501и51555 УМГУРЗБМЕИТ

ОТМТСОМУМОНК РОМТКУМОКТМ ЕВКССУМЕСРР СРАРРУДОаРБО

ЕЕРРКРКО ТІМІЗВТРЕМ ТОУМУММОУМ5НЕ ОРЕМОЕЄМУМ УМ

РОМЕМНМАКТ КРАЕЄОЄМ5Т ЕВМУБМІТУМ НОБУЛ МОКЕ

КСКУ5МКаїР АРІЕКТІЗКТ КООРАВЕРОМУ ТІ РРЗАЕЕМТ

КМОУБІ СІМ КагМРБЗОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІ 0

ЗзразЕг ек ГТУОК5АУМОО ЯММЕЗСЗММН ЕАГНМНУТОК)

І БІ гак

ЕВІ-029 НО - ЗЕОІЮО МОЛО ЮМОІ МОБОАЕ УМККРОББЗУКМ ЗСКАБИаМАГ 5 ММ ЕМУВОА

НЗІТА РООСІЕМУМОаМ ІРОБОТІММ АОКРОСАМТІ ТАОЕЗТОТА

МЕ! 55І85ЕО ТАМУМСАВЗА МОРІ УММАГЕ МУУСсСОСТТУТМ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАЗТІ 5ЕЗТААГОЯСІ УМКОМЕРЕРМТ

ЗМУМЗаА 5 ОУМНТЕРАМІІО 5501и51555 УМГУРЗБМЕИТ

РОМЕМНМАКТ КРАЕЄОЄМОТ ЕВМУБМІ ТММ АООМІ МакЕ

КСКУ5МКаїР АРІЕКТІЗКТ КООРАВЕРОМУ ТІ РРЗВЕЕМТ

І БІ гак

Амінокис-лотна ЗЕОІЮ МОЛ2 ЮІММТО5РОБЗ ГАМ5І СЕВАТ ІМСВАБЗЕЗМО МУаіРЕММУУ послідов-ність ООКРООРРКІ ПІМААЗМВНаЗ СМРОВЕБаБОа атоЕТІТІЗ

ЕВІ-0291 С ОЗ ОАЕОМАМУ УСООБЕЕМРІ ТРаОСТКІЄЇ КАТУААРБМУБ

ІЕРРБОЕОЇК 5аТАБУМУСІЇ ММЕМРАЕАКМ ОМКМОМАГО5

СМЗОЕЗМТЕО О5КОБТУБІ 5 5ТІТІЗКАОУ ЕКНКУМАСЕМ носа 55РМТ К5ЕМАСЕС

Таблиця 4

Амінокис-лотна ЗЕОІЮО МО24 ЮМОІЇ МОБОАЕ УМККРОБОУКМ 5СКАБОМАЇ 5 ММПЕММУАВОА послідов-ність РООСІЕМУМОаМ ІТРОБОТІММ АОКРОСАМТІ ТАБЕБТ5ТА

ЕВІ-029 (Ід) МЕ! 55І85ЕО ТАМУМСАНЗА МОРІ МУМАГЕ УМУСОСТТМТМ

Еаб НС ЗЗАБІКОРБОМ ЕРІАРБОКОТ 5ОаСТААГОаСІ МКОМЕРЕРМТ

ЗМУМ5ООСАЇ 5 ОМНТЕРАМІО 55015155 МТМРБББІ СТ

ОТ МІСМУМНК РОМТКМОККМ ЕРКЗСОКТНТ

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:17 ЮМОЇ МОБСОАЕУККРИББУКУЗСКАБаМАСЗММЕ послідов-ність МАОАРООСС ЕМ МОМ ТРОБОТІММАОКЕеОСВМТІТ

ЕВІ-0О29 УН АПРЕЗБТОТАММЕЇ 55І Н5БЕОТАУМУСАНЗНАУ/ ОРІ УУМАЇ ЕМ аОоаттУТУ55

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:18 ІФЛІММТО5РОБІ АМ5І ЧаЕВАТІМСВАЗЕВБМОММСа РЕММУУМОО послідов-ність КРООРРКИ ІМААЗМНаваТмРОВЕЗавБаватТОгТтІ ТЗІ ОАЕ

ЕВІ-0О029 МІ. ОМАМУМСОО5ЕЕМРІ ТЕСОСТКІ ЕІКА ТУ но СОВІ1 но сов2 но СОовЗ

ІС Сов

ІС СсОов2 щодо)

Амінокис-лотна ЗЕОІЮО МО41 ЮМОІЇ МОБОАЕ УККРОБОУКМ 5СКАБОММІ Р. ММ ЕМ МУАВОА послідов-ність РООСІ ЕУМОаМУтТТРаССОТІММ АОКЕеОСАМТІ ТАОЕБТОТАМ

ЕВІ-0О30 НС (Ідаг) МЕ! 55ІА5ЕО ТАМУМСАВЗАМ ОРІ МММАСГЕ УМСсОСТТМТМ

ЗЗАБІКОРОМ ЕРІГАРСЗАБОТ 5ЕБТААГОЯСІ МКОМЕРЕРМТ

ЗМУМ5ООСАЇ 5 СМНТЕРАМО 55015155 МТУРББОМЕИат

ОТМТСМУОНК РОМТКМОКТМ ЕВКССМЕСРР СРАРРУДОаРБ

ЕЕРРКРКО ТІ МІЗВТРЕМ ТСОУММОМ5НЕ ОРЕМОЄММММ

РОМЕМНМАКТ КРВЕЄОЄМ5ОТ ЕВМУБМІ ТМ НОВУ МОКЕ

КСКУБ5МКОЇР АРІЕКТІБКТ КООРВЕРОМУ ТІ РРОВЕЕМТ

КМОМ5І ТС М КОЕМРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІ О

ЗравЕРІ МК ГТМОК5АУМСО аММЕ5С5УМН ЕАЇНМНУТОК, о 5І 5РаКк

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:42 І(ІЙІММТО5РОБ ГАМ5ІЯЕВАТ ІМСВАбБЕВМО МУаІРЕМММУ послідов-ність ООКРООРРКІ ГІМААЗМНОВ СУМРОВЕБОБОа ато ТІ

ЕВІ-ОЗ0О1 С о ОАЕєЕОМАМУ МСОО5БЕЕМРІ ТЕСОСТКІ ЕІ / КАТУМААРБМЕ

ІЕРРООЕБОЇК БаТАБМУСІЇ ММЕМРАЕАКМ ОМ/КМОМАГО

СМООЕБМТЕО О5КОБТУ5І 5 5ТІ1ТІ5КАбМ ЕКНКУМАСЕМ

НОСІ 55РМТ К5ЕМАСЕС

Амінокис-лотна ЗЕОІЮО МО:39 ЮМОІЇ МОБОАЕ УМККРОБОУКМ 5СКАБОММІ Р. ММ ЕМ МУАВОА послідов-ність РООСІ ЕУМОаМТТРаСсаТтІММ АОКЕеОСАМТІ ТАОЕБТОТАМ

ЕВІ-0З3О (Ід) МЕ! 55ІА5ЕО ТАМУМСАВОЗА МОРІ МУМАГЕ УМсСОСТТМТМ

Еаб НС ЗЗАБІКОРБОМ ЕРІАРББОКОТ 5БОаСТААГОаСІ МКОМЕРЕРМТ

ЗМУМ5ООСАЇ 5 ОМНТЕРАМІО 55015155 МТМРБББІ СТ

ОТ МІСМУМНК РОМТКМОККМ ЕРКЗСОКТНТ

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:54 ЮМОЇ МОБОАЕМККРОББЗУКУЗСКАБОММІ РМУМЕМУУВОАРИ послідов-ність ОСІ ЕУУМОаМУТТРОССТІММАОКЕОСАМТІТАОЕЗТОЗТАММЕЇ 5

ЕВІ-0ОЗ3О (Ідаг) о А5БЕОТАУМУСАВОБАМ ОРІ МУМА ЕМ ОСТ МТУ5БАЗТК

Еаб НС СРОМЕРІ АРСЗАОТ5ЕЗТААГ аСІ МКОМЕРЕРУТУБМУМ5ОА Т

ОСМНТЕРАМІ 05501 5І 55 МГ УРОБМЕатОТУТсММоОнКкРБ

МТКМОКТМЕВК

Таблиця 4

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:37 ЮМОІ! МОБСОАЕ УМККРОББЗУКМ 5СКАБаМУМІ Р. ММ ЕМ УВОА послідов-ність РООСІ ЕМУМОаМ ТТРОССТІММ АОКЕРОСАМТІ ТАОЕЗТОЗТАМ

ЕВІ-О30О МН МЕ! 55І85ЕО ТАМУМСАНЗА МОРІ МУМАГЕ УМУСОСТТМТМ 55

Амінокис-лотна ЗЕО І МО:38 ІПЛІММТО5РОБІ АУ5І СЕВАТІМСВАЗЕЗМОМУа РЕММУМООК послідов-ність РООРРК МААЗМН!)абЗаУРОовВЕЗаЗавзаТОЕТІ ТІ ОАЕО

ЕВІ-0ОЗО МІ. АУМУУСООЗЕЕМРІ ТРИОСТКІ ЕІКА!А ТУ не СОВІ1 не сорв2

СсОовЗ с СОВ1 с сов2 с сОовЗ

Амінокис-лотна ЗЕО ОО МО:47 ЮМОІ! МОБСОАЕ УМККРОББЗУКМ 5СКАБаМУМІ Р. ММ ЧЕМ УВОА послідов-ність РОСС ЕМУМОаМ ТТРОССТІММ АОКЕРОСАМТІ ТАОЕЗТОЗТАМ

ЕВІ-0391 Іде НС МЕ! 55І85ЕО ТАМУМСАНЗА МОРІ МУМАГЕ УМУСОСТТМТМ

ЗМУМЗаА! 5 ОУМНТЕРАМІІО 5501и51555 УГУРЗЗМЕС

І БІ гак

Амінокис-лотна ЗЕО ІЮ МО:52 ЮМОЇ МО5БСАЕУККРИЗБЗУКУЗСКАБИМУМІ РМУ ТЕМ УВОАРаА послідов-ність дагєЕУмМмамТтРєРОаСааИтІММАОКеОСАМТІТАРЕЗТЗТАМУМЕЇ 5 5сЕм МН-МІ. ЗІ А5ЕОТАМУУСАВЗАУОРІ УУМАЇ ЕМ СаОСТТУТУЗЗИсс свзасасзасааеріММтТО5РОБІАМБІ СЕВАТІМСВАЗЕЗМО

МУа!РЕМММУМООКРООРРК ІМААЗМА!АаЗаУРОВЕЗОВИаБОИ

РЕТТІЗ5І ОАЕОМАМУМСООЗЕЕМРІ ТРаОСТКІ ЕІКАТМ

Амінокис-лотна ЗЕО І МО:53 ЮІММТО5РОБІ АУ5І СЕВАТІМСВАЗЕЗМОММИа РЕММУ МОЮК послідов-ність РООРРК ПМААЗМАаЗаУРєРОВЕЗОаЗаБаТОгЕТІ ТІВ ОАЕ

СЕМ МІ-МН АУУУСОО5ЕЄЕМРІ ТЕРОСТКІ ЕІКА ТУССсОСОСЗвааИасосас аБОМОЇ МОЗБСАЕУМККРИаБЗУКУЗСКАБИачхМІ РММ ТЕМ УВОА

РОСС ЕУМОаУТТРОаИСОИТтІММАОКеОСАМТІТАОЕЗТЗТАММЕ

І 551 В5ЗЕОТАУМУМСАВЗАУ ОРІ МУМАГЕУМСОСТТУТУЗ аа-амінокислота; па-нуклеїнова кислота; НС-важкий ланцюг; іС-легкий ланцюг;

МНеваріабельна ділянка важкого ланцюга; МІ «варіабельна ділянка легкого ланцюга

Підвищену афінність і/або підвищену ефективність можна оцінити з використанням способів, описаних в даному документі, і/або способів, відомих фахівцям.

У варіантах реалізації, афінність оцінюють з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ППР).

У варіантах реалізації, афінність підвищується принаймні у 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, З або 4 рази.

У варіантах реалізації, ефективність підвищується. У варіантах реалізації, ефективність підвищується, про що свідчить зниження ІС50 і/або зниження ІС90. У варіантах реалізації, ІС5О0 знижується принаймні у 5, 10, 20, 30, 40 або 50 разів. У варіантах реалізації, ІС50 знижується принаймні у приблизно 50 разів. У варіантах реалізації, ІС90 знижується принаймні у 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 або 500 разів. У варіантах реалізації, ІС90 знижується принаймні у приблизно 100 разів.

У варіантах реалізації, ефективність оцінюють, наприклад, за допомогою аналізу НЕК-Віе"М або аналізу проліферації Т1165.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує цис-сигналінг 1-6, наприклад, за результатами оцінки на основі значення ІС5О або ІС90, одержаного з використанням аналізу НЕК-Війе М, описаного в даному документі, наприклад, з 20 пМ вільного

ІС -6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має ІС50 менше 47 пМ іабо ІС90 менш ніж 4350 пМ. У варіантах реалізації, ІС5О є меншим ніж 47 пМ, наприклад, меншим ніж 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 або 1 пМ. У варіантах реалізації, ІС90О є меншим ніж 4350

ПМ, наприклад, меншим ніж 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 або 5 пМ. У варіантах реалізації, ІС50 та/або ІС90 оцінюють шляхом проведення аналізу НЕК-ВіІше"М з 20 пМ 1-6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент блокує вільний І//-6 з більшою ефективністю, ніж тоцилізумаб, наприклад, за результатами оцінки на основі значень

ІС5О, одержаних з використанням аналізу НЕК-Віше"М з 20 пМ 1-6. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує 1//-6 з ефективністю, що перевищує ефективність тоцилізумабу у більш ніж 900 разів. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є ЕВІ-О31 або його антигензв'язуючим фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має ІС5О менше 15 пМ, наприклад, ІС5О становить 14,2 пМ, при інгібуванні ІІ -6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент блокує транс-сигналінг І-- 6, наприклад, за результатами аналізу методом НЕК-Війе"М, описаним в даному документі, наприклад, з 200 пМ гіпер-П-б (нуреї-І/-6). У варіантах реалізації антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує сигналінг гіпер-ІЇ/-6. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує сигналінг гіпер-І-б з більшою ефективністю, ніж тоцилізумаб, наприклад, з ефективністю, що перевищує тоцилізумаб у більш ніж 900 разів. У

Зо варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує сигналінг гіпер-ІЇ!-6 з величиною ІС5О менше 1 мкМ. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує сигналінг гіпер-ІЇ-6 з величиною ІС50О менше 1 нМ. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує сигналінг гіпер-ІЇ,-6 з величиною ІС5О менше 100 пМ або менше 50 пМ, наприклад, з ІС50 приблизно 14-15 пМ. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є ЕВІ-031 або його антигензв'язуючим фрагментом.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент інгібує цис-сигналінг ІІ -6 та транс-сигналінг 1-6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент ефективно блокує сигналінг І--6 в оці протягом щонайменше 1 місяця, 2 місяців, З місяців, 4 місяців, 5 місяців, або 6 місяців, наприклад, після інтравітреального введення. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент блокує 95 95 сигналінгу І--6 в оці протягом щонайменше 1 місяця, 2 місяців, З місяців, 4 місяців, 5 місяців, або 6 місяців, наприклад, після інтравітреального введення. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент блокує 95 95 сигналінгу 1-6 в оці протягом приблизно 150 днів.

В іншому аспекті, запропонованому в даному винаході, виділяють антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:37, де зазначена послідовність важкого ланцюга включає одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 555 (нумерація амінокислот згідно із ЗЕО ІЮ МО:41).

В додатковому аспекті, запропонованому в даному документі, виділяють антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містить послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:39, де зазначена послідовність містить одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 555 (нумерація амінокислот згідно із ФЕО ІЮ МО:41).

В додатковому аспекті, запропонованому в даному документі виділяють антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містить послідовність, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:54, де зазначена послідовність містить одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 555 (нумерація амінокислот згідно із ФЕО ІЮ МО:41). 60 Також в даному документі передбачається виділене антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містить послідовність важкого ланцюга, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО:41, де зазначена послідовність важкого ланцюга включає одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 55 (нумерація амінокислот згідно із ФЕО ІЮ МО:41).

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1ІІ--6 порівняно з контрольним антитілом, наприклад, порівняно з ЕВІ-029 або його фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену афінність до людського 1-6 порівняно з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, які в інших відношеннях є ідентичними, за винятком того, що не містять зазначені одну чи декілька амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 55, і замість цього містять одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з А28, 530, І51 та 555. У варіантах реалізації, афінність підвищується принаймні в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, З або 4 рази. У варіантах реалізації, афінність оцінюють з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ППР).

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену ефективність порівняно з контрольним антитілом, наприклад, наприклад, порівняно з ЕВІ-029 або його фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має підвищену ефективність порівняно з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, які в інших відношеннях є ідентичними, за винятком того, що не містять зазначені одну чи декілька амінокислот, вибраних з М28, РЗО, Т51 та 55, і замість цього містять одну чи декілька (наприклад, 1, 2, З або 4) амінокислот, вибраних з А28, 530, І51 та 555.

У варіантах реалізації, ефективність підвищується, про що свідчить зниження ІС50 і/або зниження ІС90. У варіантах реалізації, ІС50 знижується принаймні у 5, 10, 20, 30, 40 або 50 разів. У варіантах реалізації, ІС5О знижується принаймні у приблизно 50 разів. У варіантах реалізації, ІС90О знижується принаймні у 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 або 500 разів. У варіантах реалізації, ІС90 знижується принаймні у приблизно 100 разів.

У варіантах реалізації, ефективність оцінюють з використанням аналізу НЕК-Віе"М або аналізу проліферації Т1165.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має ІС5О менше 47 пМ та/або ІС9О менш ніж 4350 пМ. У варіантах реалізації, ІС50 є меншим ніж 47 пМ, наприклад, меншим ніж 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 або 1 пМ. У варіантах реалізації, ІС90О є меншим ніж 4350

ПМ, наприклад, меншим ніж 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 або 5 пМ. У варіантах реалізації, ІС50 та/або ІС90 оцінюють шляхом проведення аналізу НЕК-Війе"М з 20 пМ 1І--6.

В деяких варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить М28, РЗО,

Т51 та О55, і антитіло або антигензв'язуючий фрагмент демонструє покращену афінність по відношенню до людського ІЇ-б і/або покращену ефективність у порівнянні з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, які в інших відношеннях є ідентичними, за винятком того, що містять А28, 530, І51 та 555.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі, додатково включає варіабельну ділянку легкого ланцюга або її антигензв'язуючий фрагмент, включаючи МІ СОКІ1, МІ СОКа2, і МІ СОКЗ.

У варіантах реалізації, М. СОКІ включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:34, М СОК2 включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:35, і МІ СОКЗ включає послідовність ФЕО ІЮ МО:36.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:38.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮО МО:38 або яка відрізняється від 5ЕО ІЮ МО:38 не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить

БО послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮ МО:38. У варіантах реалізації, послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга складається з ЗЕО ІЮ МО:38.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність легкого ланцюга, принаймні на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичну

ЗЕО ІЮ МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність легкого ланцюга, яка відрізняється не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту від ЗЕО ІО МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮ МО:42. бо У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент додатково містить послідовність легкого ланцюга, яка включає ЗЕО ІЮ МО:42 або послідовність, яка відрізняється не більш ніж на 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислоту від 5ЗЕО ІЮ МО:42. У варіантах реалізації, послідовність легкого ланцюга складається з ЗЕО ІО МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить () МН СОК1, що включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:31, МН СОК2, що включає послідовність зЕО ІЮ МО:32, і МН

СОКЗ, що включає послідовність БЕО ІО МО:33, та (і) М. СОК'І, що включає послідовність «ЕО

ІЮ МО:34, МІ СОКт, що включає послідовність ЗЕБЕО ІЮО МО:35, і М СОМКЗ, що включає послідовність зЗЕО ІЮО МО:36. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить вищезазначені СОК, за винятком того, що він має мутацію, наприклад, загалом, не більше 1, 2 або З мутацій в усіх шести СОМ. У варіантах реалізації, мутація (мутації) не знижують афінність і/або ефективність антитіла або антигензв'язуючого фрагмента.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є антитілом Ідс1, Ідс2,

ІЗ або Ідс4 або його фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є антитілом Ідс1 або Ідс2 або його фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є дДС1 Раб або Ідс2 Бар. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є антитілом або антигензв'язуючим фрагментом Ідс2.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є генетично модифікованим з метою зниження або усунення активності АОСС.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є моноклональним антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є гуманізованим або людським моноклональним антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає або складається з 5ЕО ІО МО:37, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає або складається з ЗЕО ІО МО:38. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить вищевказані варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, за винятком того, що воно має мутацію, наприклад, загалом не більш ніж 1, 2 або З мутації. У варіантах реалізації, мутація (мутації) не знижують афінність і/або ефективність антитіла або антигензв'язуючого фрагмента.

Зо У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить послідовність важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО:41 та, необов'язково, послідовність легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІО МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, що складається з 5ЕО ІЮ МО:41 та, необов'язково, послідовність легкого ланцюга, що складається з ЗЕО ІЮ МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить послідовність важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО:47 та, необов'язково, послідовність легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІО МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ МО:41, та послідовність легкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:42, за винятком того, що антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить мутацію (наприклад, загалом 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій у порівнянні з зЗЕО ІЮ МО:41 та/або ЗЕО ІЮ МО:42).

У варіантах реалізації, мутація (мутації) розташована у каркасній ділянці (ділянках). У варіантах реалізації, мутація не знижує афінність та/або ефективність антитіла або антигензв'язуючого фрагмента порівняно з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що не містить зазначеної мутації.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ МО:47, та послідовність легкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:42, за винятком того, що антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить мутацію (наприклад, загалом 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій у порівнянні з 5ЕО ІЮ МО:47 і/або 5ЕО ІЮ МО:42). У варіантах реалізації, мутація (мутації) розташована у каркасній ділянці (ділянках). У варіантах реалізації, мутація не знижує афінність і/або ефективність антитіла або антигензв'язуючого фрагмента порівняно з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що не містить зазначеної мутації

В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Еар.

В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Раб Ідс1.

В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є виділеним Бар, що містить послідовність важкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮО МО:39, та послідовність легкого ланцюга, яка включає 5ЕБО ІО МО:42. В одному варіанті реалізації, антитіло або бо антигензв'язуючий фрагмент є виділеним Рар, що містить послідовність важкого ланцюга, що складається з 5ЕО ІО МО:39, та послідовність легкого ланцюга, що складається з ЗЕО ІО

МО:42.

В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є Раб Ідса2.

В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є виділеним Бар, що містить послідовність важкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮО МО:54, та послідовність легкого ланцюга, яка включає 5ЕБО ІО МО:42. В одному варіанті реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є виділеним Еарб, що містить послідовність важкого ланцюга, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:54, та послідовність легкого ланцюга, яка складається з 5ЕО ІО

МО:42.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ МО:39, та послідовність легкого ланцюга, ідентичну 5ЕО ІЮ

МО:42, за винятком того, що антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить мутацію (наприклад, загалом 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій у порівнянні з 5ЕО ІЮ МО:39 і/або 5ЕО ІЮ МО:42). У варіантах реалізації, мутація (мутації) розташована у каркасній ділянці (ділянках). У варіантах реалізації, мутація не знижує афінність і/або ефективність антитіла або антигензв'язуючого фрагмента порівняно з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що не містить зазначеної мутації.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент включає послідовність важкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ МО:54, та послідовність легкого ланцюга, ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:42, за винятком того, що антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить мутацію (наприклад, загалом 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО:54 та/або ЗЕО ІЮ МО:42).

В деяких варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент можуть зв'язуватися щонайменше з одним із К24, К27, 31, 034, 5118 або М121 людського 1-6. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент можуть зв'язуватися о К24, К27,

У31, 034, 5118 та М121 людського 1І--6. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий

Зо фрагмент можуть зв'язуватися з щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, або щонайменше 5 із К24, К27, 31, 034, 5118 та М121 людського ЇЇ -6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент можуть зв'язуватися (наприклад, можуть специфічно зв'язуватися) із сайтом ІЇ людського ЇЇ -6.

У варіантах реалізації, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент може зв'язуватися з

І--6 з Тю 70 "С чи вище.

І/-6 з Тя 80 "С чи вище.

У варіантах реалізації, антитіло або його фрагмент (наприклад, його антигензв'язуючий фрагмент) зв'язується із щонайменше одним з К24, К27, 31, 034, 5118 та М121 людського ІІ. -6.

У варіантах реалізації, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язується із щонайменше двома з К24, К27, 31, 034, 5118 та М121 людського ІІ -6. У варіантах реалізації, антитіло (або) його антигензв'язуючий фрагмент зв'язується із щонайменше трьома з К24, К27,

У31, 034, 5118 та М121 людського І//-6. У варіантах реалізації, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язується із щонайменше чотирма з К24, К27, У31, 034, 5118 та

М121 людського І! -6. У варіантах реалізації, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язується із щонайменше п'ятьма з К24, К27, 31, 034, 5118 та М121 людського 1-6. У варіантах реалізації, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язується з К24, К27, 31, 034, 5118 та М121 людського ІІ -6.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є моноклональним антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент є гуманізованим моноклональним антитілом. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент (є) людським моноклональним антитілом.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент демонструє «10 95 агрегації при концентрації 100-150 мг/мл, наприклад, при концентрації близько 142 мг/мл, у фосфатно-сольовому буфері (РВ5), рН 7,4. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має удосконалені фармакокінетичні властивості порівняно з іншим терапевтичним агентом, наприклад, порівняно з тоцилізумабом, бевацизумабом, ранібізумабом іМабо Ейлеа (Еуіеа?Ф). У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має покращене утримування в оці при введенні в око, наприклад, інтравітреально, наприклад, бо шляхом інтравітреальної ін'єкції. У варіантах реалізації про покращене утримування в оці свідчить збільшений період напіввиведення в оці, наприклад, у склистому тілі, сітківці, водянистій волозі, судинній оболонці і/або склері.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент має період напіввиведення у склистому тілі щонайменше 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 днів. У варіантах реалізації, період напіввиведення у склистому тілі становить щонайменше 10 днів. У варіантах реалізації, період напіввиведення (Ше паю) у склистому тілі оцінюють у тварини, наприклад, у кроля або мавпи. У варіантах реалізації, період напіввиведення у склистому тілі оцінюють у людини.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі, має зменшений системний період напіввиведення (наприклад, меншу величину 1 1/г2в) і/або покращений системний кліренс, наприклад, зменшений системний період напіввиведення або прискорений системний кліренс порівняно з показниками для іншого терапевтичного агента, наприклад, тоцилізумабу, бевацизумабу, ранібізумабу та/або афліберцепту (ЕуїеафФ). У варіантах реалізації, системний період напіввиведення (наприклад, Т1/»27в) є меншим, ніж у тоцилізумабу та/або афліберцепту (ЕуіеафФ). У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить Ес-домен, що включає мутацію (наприклад, 1, 2, З або 4 мутації) в одному чи декількох положеннях, що відповідають НЗ11, 0313, 1254 або Назб (нумерація як у 5БЕО ІО МО:41). У варіантах реалізації, мутацію вибирають з однієї чи декількох з

НЗІ1ТА, НЗІТЕ, НЗІТ1М, 0313Т, І254А, І254К та Н4ІЗбА. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент містить Ес-домен, що включає мутацію, яка відповідає НЗ11ТА (нумерація як у ЗЕО ІЮ МО:41). У варіантах реалізації, Ес-домен є Ес-доменом Ідс1. У варіантах реалізації, Ес-домен є Ес-доменом Ідса2.

У варіантах реалізації, Ес-домен є Ес-доменом людського ЇДС1, що має послідовність 5хЕЮ

ІО МО:50 та необов'язково включає мутацію в одному чи декількох з підкреслених положень: (Нео, 092, ІЗЗ та Н215):

ОКТНТСРРОРАРЕЇ І ФаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМУ МУрамЕМ

НМАКТКРАЕЕЕОУМЗТУВУУБМІ ТМ НОМ МСКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОММТІ

РРБІЬАВОЕСТКМОМБІТС УКагєМРБОІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТТРРМИ О5БООЗЕРІ КІ ТУОКАМО

ОСММЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКОІ 51 РОК (5ЕО ІЮ МО:50).

Зо У варіантах реалізації, Ес-домен ІдДО1 включає мутацію, що відповідає одному чи декільком з НООА, НООЕ, НООМ, 092, ІЗЗА, ІЗЗЕ та Н215А (нумерація згідно з ФЕО ІЮ МО:50).

У варіантах реалізації, Ес-домен є Ес-доменом людського Іде2, що має послідовність 5хЕЮ

ІО МО:51 та необов'язково включає мутацію в одному чи декількох з підкреслених положень (нев, 088, 129 та Н211):

МЕСРРСОРАРРМАСРБЗУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСМУМОУЗНЕОРЕМОЕЄМИУ УМО МЕМНМАК

ТКРАЕЕОЕЄМЗТЕВУМЗУ ТУМНОВМІ МЕКЕУКСКУЗМКИаї РАРІЕКТІЗКТКЕООРАЕЕРОММТІ РРЗА

ЕЕМТКМОМУБІ ТОЇ МКОЕМРБОІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5БраЗЕРІ МК ТУКА; МУООСМ

МЕЗБСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОК (5ЕО ІЮ МО:51).

У варіантах реалізації, Ес-домен ІдО2 включає мутацію, що відповідає одному чи декільком з НВбА, НВЗбЕ, НМ, О88Т, 129А, 129Е та Н211А (нумерація згідно з БЕО ІЮ МО:51).

У варіантах реалізації, мутація Ес зменшує системне накопичення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента (наприклад, підвищує кліренс або знижує період напіввиведення, наприклад, Тв) антитіла або антигензв'язуючого фрагмента. У варіантах реалізації, системне накопичення зменшується порівняно з показниками для іншого терапевтичного агента (наприклад, тоцилізумабу, бевацизумабу, ранібізумабу і/або афліберцепту) У варіантах реалізації, системне накопичення зменшується порівняно з тоцилізумабом і/або афліберцептом.

У варіантах реалізації системне накопичення зменшується порівняно 3 системним накопиченням відповідного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що не містить мутації.

У варіантах реалізації, системне накопичення оцінюють після інтравітреального введення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента.

В іншому аспекті, даний винахід пропонує спосіб зменшення системних ефектів інгібування

І/-б у суб'єкта, який включає введення суб'єкту антитіла або його фрагмента, що містить мутований Ес-домен, як описано в даному документі. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент може інгібувати активність І/-б та має знижену Ес-активність (наприклад, знижене зв'язування з ЕсКп) у порівнянні з відповідним антитілом або його фрагментом, що має Есо-домен дикого типу. В деяких випадках, спосіб зменшення системних ефектів інгібування ІЇ/-б у суб'єкта включає введення суб'єкту антагоніст ІЇ/-6, що включає мутований Ес-домен, як описано в даному документі.

В додатковому аспекті, в даному документі пропонується нуклеїнова кислота, яка включає бо послідовність, що кодує антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі. У варіантах реалізації, нуклеїнова кислота кодує амінокислотну послідовність, розкриту в даному документі. У варіантах реалізації, нуклеїнова кислота включає 5ЕО ІЮ МО:40,

ЗБО ІЮ МО43 або 5ЕО І МО:48. У варіантах реалізації, нуклеїнова кислота кодує послідовність, розкриту в Таблиці 4.

Також в даному документі передбачається вектор, який містить нуклеїнову кислоту. Також в даному документі пропонується клітина, яка включає нуклеїнову кислоту або вектор.

У варіантах реалізації, антитіло І/-6 або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі, призначені для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з хворобою, асоційованою з ІЇ/-6. У варіантах реалізації, хвороба є очною хворобою, наприклад, очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем ІІ -6, наприклад, у склистому тілі.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент призначені для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, глаукомою, сухими очами (наприклад, хворобою сухих очей або сухим кератокон'юнктивітом), алергічним кон'юнктивітом, очним болем, регматогенним відшаруванням сітківки (РВС), віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), оклюзії вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент призначені для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з ДМН.

У варіантах реалізації, антитіло І/-б6 або антигензв'язуючий фрагмент, описані в даному документі, призначені для застосування у виготовленні лікарського засобу для лікування хвороби, асоційованої з ІЇ/-6. У варіантах реалізації, хвороба є очною хворобою, наприклад, очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем 1-6 у склистому тілі. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з 1/-6б, є діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухими очами (наприклад, хворобою сухих очей або сухим кератокон'юнктивітом), віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), регматогенним відшаруванням сітківки (РВС), оклюзією вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з ІІ -6, є

Зо діабетичним макулярним набряком. У варіантах реалізації, лікарський засіб складається для доставки у склисте тіло ока суб'єкта (наприклад, для інтравітреальної ін'єкції).

Також в даному документі передбачається композиція, що містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі. У варіантах реалізації, композиція додатково містить фармацевтично прийнятний носій та один чи декілька фармацевтично прийнятних ексципієнтів.

У варіантах реалізації, композиція призначена для застосування у лікуванні хвороби, асоційованої з І/-6. У варіантах реалізації, хвороба є очною хворобою, наприклад, очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем ІІ--6 у склистому тілі. У варіантах реалізації, композиція призначена для застосування у лікуванні діабетичного макулярного набряку (ДМН), діабетичної ретинопатії, увеїту, сухих очей (наприклад, хвороби сухих очей або сухого кератокон'юнктивіту), вікової макулярної дегенерації (ВМД), проліферативної діабетичної ретинопатії (ПДР), регматогенного відшарування сітківки (РВС), оклюзії вен сітківки (ОВС), нейромієліту зорового нерва (НЗН), пересадження рогівки, подряпини рогівки, або фізичного ушкодження ока.

Також в даному документі передбачається спосіб лікування хвороби, асоційованої з ІІ -6, який включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості антитіла 1/-6 або фрагмента, описаних в даному документі. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з 1-6, є очною хворобою, наприклад, очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем 1-6 у склистому тілі. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з ІІ -6, є діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухими очами (наприклад, хворобою сухих очей або сухим кератокон'юнктивітом), віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), регматогенним відшаруванням сітківки (РВС), оклюзією вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з ІІ -6, є діабетичним макулярним набряком.

У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, або композиція, що містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, доставляється у склисте тіло ока суб'єкта (наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції). У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, або композиція, що містить антитіло або антигензв'язуючий бо фрагмент, призначені для інтравітреальної ін'єкції.

У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з ІІ -6, є діабетичним макулярним набряком, і антитіло або фрагмент, або композиція, що містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, доставляється у склисте тіло ока суб'єкта.

Також в даному документі передбачається антитіло або його фрагмент (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент) (наприклад, антитіло ІІ -6 або його фрагмент, як описано в даному документі), або композиція, що містить таке антитіло або його фрагмент, для застосування у лікуванні хвороби, асоційованої з ІЇ/-б6 (наприклад, для застосування у лікуванні суб'єкта, наприклад, людини, що має хворобу, асоційовану з ІІ -6).

У варіантах реалізації, зазначена хвороба є очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем 1-6, наприклад, у склистому тілі. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухими очами (наприклад, розладом сухих очей або хворобою сухих очей), алергічним кон'юнктивітом, віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), регматогенним відшаруванням сітківки (РВС), оклюзією вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є ДМН. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є хворобою сухих очей. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є сухим кератокон'юнктивітом. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є увеїтом. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є ВМД. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є ПДР. У варіантах реалізації, зазначена хвороба є пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока. У варіантах реалізації, антитіло або його фрагмент (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент) є придатними для доставки у склисте тіло ока. У варіантах реалізації антитіло або його фрагмент (наприклад, антигензв'язуючий фрагмент) доставляється у склисте тіло ока.

Також в даному документі передбачається спосіб лікування хвороби, асоційованої з ІІ -6, який включає введення суб'єкту антитіла І/-б6 або його фрагмента (наприклад, його антигензв'язуючого фрагмента), наприклад, антитіла І/-б6 або його фрагмента, як описано в даному документі. У варіантах реалізації, антитіло І/-б6 або його фрагмент (наприклад, його антигензв'язуючий фрагмент), вводять в терапевтично ефективній кількості. У варіантах

Зо реалізації, хвороба, асоційована з ІЇ/-6, є очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем 1-6 у склистому тілі. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з І-6, є діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухим кератокон'юнктивітом, хворобою сухих очей, віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), оклюзією вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки, або фізичним ушкодженням ока.

У варіантах реалізації, антитіло або його фрагмент (наприклад, його антигензв'язуючий фрагмент), є придатними для доставки у склисте тіло ока. У варіантах реалізації, антитіло або його фрагмент (наприклад, його антигензв'язуючий Фрагмент), доставляється у склисте тіло ока суб'єкта. У варіантах реалізації, хвороба, асоційована з І/-б6, є діабетичним макулярним набряком, і антитіло або його фрагмент доставляється у склисте тіло ока суб'єкта.

Також в даному документі передбачається набір, що містить антитіло ІЇ-б6 або композицію, розкриті в даному документі, та, необов'язково, інструкції із застосування.

Також в даному документі передбачається контейнер або пристрій, наприклад, пристрій для доставки ліків, що містять антитіло І/-б6 або композицію, розкриту в даному документі. У варіантах реалізації, зазначений пристрій призначений для доставки антитіла або композиції в око, наприклад, в склисте тіло. Також в даному документі пропонується набір, який включає зазначений контейнер або пристрій.

У використовуваному в даному документі значенні, термін "антитіло" є синонімічним з імуноглобуліном і повинен мати значення, загальновідоме в цій галузі техніки. Термін антитіло не обмежений будь-яким конкретним способом одержання антитіла. Наприклад, термін антитіло включає, серед іншого, рекомбінантні антитіла, моноклональні антитіла та поліклональні антитіла. У використовуваному в даному документі значенні, антитіло є тетрамером ії, якщо не зазначено інше, складається кожне з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара включає один легкий ланцюг та один важкий ланцюг. Амінотермінальний кінець кожного ланцюга включає варіабельну ділянку з приблизно 100-120 чи більше амінокислот, яка відіграє основну роль у розпізнаванні антигену. Карбокситермінальна ділянка кожного ланцюга включає константну область, що має основну роль в ефекторній функції антитіла. Класи легких ланцюгів людини називаються каппа- та лямбда-легкими ланцюгами. Класами важких ланцюгів є мю, дельта, гамма, альфа або епсілон, які визначають ізотип антитіла. Ізотипами антитіл є 60 ІЗ9М, дО, дос, ДА та ІЗЕ, відповідно. У легких та важких ланцюгах, варіабельні та константні області з'єднані за допомогою ділянки "У", що складається з приблизно 12 чи більше амінокислот, причому важкий ланцюг також включає ділянку "ОО", що складається з приблизно трьох чи більше амінокислот.

Варіабельні ділянки кожної пари важкого/легкого ланцюгів (МН та М), відповідно, утворюють антигензв'язуючий сайт. Відповідно, інтактне антитіло (дсС, наприклад, має два зв'язуючих сайти. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язуючі сайти є однаковими.

Варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів антитіла демонструють однакову загальну структуру відносно консервативних каркасних ділянок (ЕК), з'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, які також називаються ділянками, що визначають комплементарність, або СОК. Термін "варіабельний" стосується того факту, що певні частини варіабельних доменів істотно відрізняються за послідовностями у різних антитіл та задіяні у зв'язуванні та специфічності кожного конкретного антитіла до його конкретного антигену.

Варіабельність визначають переважно СО, які розділені більш висококонсервативними каркасними ділянками (ЕК). Віднесення амінокислот до кожного домену роблять відповідно до визначень, наведених у Кабаї Зедиепсез ої Ргоїеїпз5 ої Іттипо|одісаї Іпіегеві (Маїйопаї! Іпвійшев ої Неакп, Веїйпезаа, Ма. (1987 та 1991)), або Споївіа апа І ез5К, У) Мої Віо! 196:901-917 (1987);

Спопіа єї аї., Маїштге 342:878-883 (1989), де описані способи, відомі фахівцям. "Дикий тип" може стосуватися найбільш поширеного алеля або виду, присутнього у популяції, або антитіла, одержаного від тварини, яка не була піддана маніпуляціям, у порівнянні з алелем чи поліморфізмом, або варіантом чи похідним, одержаним в результаті якої-небудь маніпуляції, такої як мутагенез, використання рекомбінантних методів тощо, для заміни амінокислоти в молекулі, що зв'язується з антигеном.

Термін "фрагмент антитіла" стосується частини інтактного або повнорозмірного ланцюга або антитіла, звичайно цільової зв'язуючої або варіабельної ділянки. Приклади фрагментів антитіл включають, без обмеження, фрагменти Раб, Раб", Е(аб)2 та Ем. "Функціональний фрагмент" або "аналог антитіло проти сайта ІІ 1-6" є фрагментом, який може запобігати або значно знижувати здатність 1-6 зв'язуватися з рецептором, знижувати здатність комплексу 1І--6/І -6К зв'язуватися з адр1!30, або знижувати здатність ліганду зв'язуватися з др130 або ініціювати сигналінг. У

Зо використовуваному в даному документі значенні, "антигензв'язуючий фрагмент" або "функціональний фрагмент" загалом є синонімічними з "фрагментом антитіла" та можуть стосуватися фрагментів, таких як Ем, Бар, Е(абБ)2 тощо, які можуть запобігати або значно знижувати здатність ІІ -б6 зв'язуватися з рецептором, знижувати здатність комплексу 1 -6/ЛІ-68 зв'язуватися з др130, або ініціювати сигналінг. "Похідне" антитіла є поліпептидом, який включає щонайменше одну СОК антитіла, розкритого в даному документі. Типово, похідне може зв'язуватися із сайтом ПІ 1-6. "Конкурувати" означає, що перше антитіло або його фрагмент може конкурувати за зв'язування з другми антитілои або його фрагментом, внаслідок чого зв'язування першого антитіла з його епітопом детектовано знижується у присутності другого антитіла у порівнянні зі зв'язуванням першого антитіла за відсутності другого антитіла. В деяких випадках, термін може також стосуватися зв'язування другого антитіла з його епітопом, яке детектовано знижується у присутності першого антитіла. Механізмом такої конкуренції може бути, в необмежувальних прикладах, стерічне ускладнення, конформаційна зміна, зв'язування зі спільним епітопом.

Термін "процент ідентичності послідовностей" в контексті послідовністей нуклеїнових кислот означає залишки в двох послідовністях, які є однаковими при вирівнюванні з максимальною відповідністю. Довжина порівняння ідентичності послідовностей може бути більше щонайменше приблизно дев'яти нуклеотидів, наприклад, щонайменше приблизно 18 нуклеотидів, щонайменше приблизно 24 нуклеотидів, щонайменше приблизно 28 нуклеотидів, щонайменше приблизно 32 нуклеотидів, щонайменше приблизно 3б нуклеотидів, або щонайменше приблизно 48 чи більше нуклеотидів. Алгоритми, відомі фахівцям, можуть бути використані для вимірювання ідентичності нуклеотидних послідовностей. Наприклад, полінуклеотидні послідовністі можуть бути порівняні з використанням ЕАЗТА, Сар або Везій (М/і5сопвіп Раскаде

Мегвіоп 10.0, Сепеїйс5 Сотршег Сгопр (500), Мадізоп, УМ). ЕАЗТА, включає, наприклад, програми БАБТА2 та БАБТАЗ, забезпечує вирівнювання та проценти ідентичності послідовностей ділянок найкращого перекривання між досліджуваною та шуканою послідовністями (Реагзоп, Меїпоаз Епгутої! 183:63-98 (1990); Реагхоп, Мештод5 Мої! Віої! 132:185- 219 (2000); Реагзоп, МешШшоа5 Епгутої! 266:227-258 (1996); Реагзоп, У Мої! Віо! 276:71-84 (1998); включені до даного документу шляхом посилання). Типово використовують параметри за замовчуванням для конкретної програми або алгоритму. Наприклад, процент ідентичності бо послідовностей між послідовністями нуклеїнових кислот може бути визначений з використанням

ЕА5ТА з її параметрами за замовчуванням (розмір слова 6 та МОРАМ-фактор для оцінювальної матриці) або з використанням Сар з її параметрами за замовчуванням, яка входить до СО

Мегвіоп 6.1, що включені до даного документу шляхом посилання.

Термін "процент ідентичності послідовностей" в контексті амінокислотних послідовністей означає залишки в двох послідовністях, які є однаковими при вирівнюванні з максимальною відповідністю. Довжина порівняння ідентичності послідовностей може бути більше щонайменше приблизно п'яти амінокислотних залишків, наприклад, щонайменше приблизно 20 амінокислотних залишків, щонайменше приблизно 30 амінокислотних залишків, щонайменше приблизно 50 амінокислотних залишків, щонайменше приблизно 100 амінокислотних залишків, щонайменше приблизно 150 амінокислотних залишків, або щонайменше приблизно 200 чи більше амінокислотних залишків. Ідентичності послідовностей для поліпептидів типово вимірюють з використанням прикладних програм для аналізу послідовностей. Алгоритми визначення процента ідентичності послідовностей відомі фахівцям. Наприклад, амінокислотні послідовністі можуть бути порівняні з використанням ЕБА5ТА, Сар або Везйнії (УмМізсопзіп Раскаде

Мегзіоп 10.0, Сепеїйс5 Сотршиїег Сгоир (500), Мадізоп, УМ). Прикладні програми для аналізу білків порівнюють послідовністі з використанням мір подібності, привласнюваних різним заміщенням, делеціям та іншим модифікаціям, включаючи консервативні амінокислотні заміщення. Наприклад, СО включає такі програми, як "СЗар" та "Вей", що можуть бути використані з параметрами за замовчуванням, визначеними у програмах, для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близько спорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди від різних видів організмів, або між білком дикого типу та його аналогом. Див., наприклад, СО Мегбзіоп 6.1 (Опімегейу ої УмМі5сопвіп,

Маадізоп, УМІ). Поліпептидні послідовністі також можуть бути порівняні з використанням ЕРА5ТА з параметрами за замовчуванням або рекомендованими параметрами, див. Со Мегвіоп 6.1.

ЕАЗТА (наприклад, ЕАЗТА2 та РА5ТАЗ) забезпечує вирівнювання та проценти ідентичності послідовностей ділянок найкращого перекривання між досліджуваною та шуканою послідовністями (Реагзоп, Меїпоаз Епгутої! 183:63-98 (1990); Реагхоп, Мештод5 Мої! Віої! 132:185- 219 (2000)). Іншим алгоритмом, який може бути використаний при порівнянні послідовності з базою даних, що містить велику кількість послідовністей від різних організмів, є комп'ютерна

Зо програма ВІ А5Т, наприклад, Біавзір або (ріавзіп, з використанням параметрів за замовчуванням, передбачених у програмі. Див., наприклад, Айбспиі еї аї., у) Мої Віо! 215:403-410 (1990); АнвсНиЇї еї а!., Мисівїс Асіах Не5 25:3389-402 (1997).

Білок або поліпептид є "по суті чистим", "по суті гомогенним", або "по суті очищеним", якщо зразок щонайменше на приблизно від 60 до 7595 складається з одного виду поліпептиду.

Поліпептид або білок може бути мономерним або мультимерним. По суті чистий поліпептид або білок може бути чистим на приблизно 50 95, 6095, 7095, 80 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95; наприклад, по суті чистий поліпептид або білок є чистим на 50 95, 60 9», 70 95, 80 ФУ, 90 9, 95 9, 9895 або 9995. Чистоту або гомогенність більа можна оцінювати будь-якими придатними засобами, такими як електрофорез зразка білка на поліакриламідному гелі з подальшою візуалізацією однієї чи декількох смуг, асоційованих з білком або поліпептидом (наприклад, шляхом фарбування геля), гель-проникна ВЕРХ, катіонообмінна ВЕРХ, капілярний електрофорез у відновних умовах в присутності ДСН, пептидне картування або картування гліканів. Вища роздільна здатність може бути досягнена, наприклад, з використанням способів, відомих фахівцям, або інших методів очищення.

Термін "значний ступінь подібності" по відношенню до нуклеїнової кислоти або її фрагмента, означає, що при оптимальному вирівнюванні з відповідними інсерціями або делеціями нуклеотидів з іншою нуклестовою кислотою (або її комплементарним ланцюгом), спостерігається ідентичність нуклеотидних послідовностей у щонайменше приблизно 85 95, щонайменше приблизно 90 95, та щонайменше приблизно 95 95, 96 95, 97 95, 98 96 або 99 95 нуклеотидних основ, наприклад, 8595, 9095, 9595, 9695, 9895 або 9995 ідентичності послідовностей при вимірюванні за допомогою будь-якого відомого алгоритму (визначення) ідентичності послідовностей, такої як ЕА5ТА, ВІ А5Т або Сар.

По відношенню до поліпептидів, термін "значний ступінь ідентичності" або "значний ступінь подібності" означає, що дві амінокислотні послідовністі, при оптимальному вирівнюванні, такому як за допомогою програм САР або ВЕЗ5ТРЇТ з використанням заданих за замовчуванням ваг гепів, визначених к програмах, мають щонайменше приблизно 70 95, 75 95, 80 95, 90 У, 95 бо, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовностей; наприклад, 70 ЗУ», 75 90, 80 Зо, 90 9, 95 95, 96 95, 97 90, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовностей. В певних варіантах реалізації, залишки в неідентичних положеннях відрізняються консервативними амінокислотними бо заміщеннями.

"Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості терапевтичного агента, яка при введенні буде полегшувати щонайменше одну ознаку або симптом хвороби, лікування якої проводиться, або підсилювати чи поліпшувати профілактичний та або терапевтичний ефект (ефекти) іншої терапії (наприклад, іншого терапевтичного агента), придатного для лікування хвороби, асоційованої з ІЇ-6. Слід розуміти, що терапевтично ефективна кількість може бути введена у вигляді множини доз за обмежений період часу або шляхом довготривалого лікування. "Лікувати", "лікування" та "курс лікування" стосуються способу полегшення одного чи декількох ознак або симптомів хвороби.

У використовуваному в даному документі значенні, термін "хвороба" включає хвороби та розлади.

Опис кожного патентного документа та наукової статті, згадуваних в даному документі, та патентні документи і наукові статті, на які в них робляться посилання, прямо включені до даного документу шляхом посилання в усіх відношеннях.

Додаткові ознаки та переваги винаходу більш конкретно описані нижче.

СТИСЛИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

Фіг. 1 є графіком, що ілюструє результати експерименту, в якому антитіло проти 1-6 вводили інтравітреально (ІМТ) у щурячій моделі хоріоїдальної неоваскуляризації (ХНВ).

Антитіло проти МЕСЕ (судинний ендотеліальний фактор росту) вводили як позитивний контроль, а негативним контролем був носій. р-0,0054 в День 15 і р-0,0005 в День 22 для антитіла проти 1-6 порівняно з контрольним носієм.

Фіг. 2 є графіком, що ілюструє результати експерименту на зв'язування у випробуваннях здатності мишачого антитіла 64 інгібувати зв'язування ІІ -6/ЛІ -6ЕК з др130.

Фіг. ЗА є графіком, що ілюструє експеримент, у якому 020 тестували на здатність блокувати сигналінг 1-6 за відсутності надлишку розчинного І-6Ка. Експерименти проводили на клітинах

НЕК-ВІниве-1Ї -6 з 0,2 нг/мл 1І--6 та 2 мкг/мл ІІ бКа.

Фіг. ЗВ є графіком, що ілюструє експеримент, у якому 020 тестували на здатність блокувати сигналінг І--6 у присутності надлишку розчинного ІІ -6Ка. Експерименти проводили на клітинах

Зо Фіг. 4 є графіком, що ілюструє результати експерименту, у якому моноклональне антитіло проти І--6 ("Блокада 1-6") вводили інтравітреально у мишачій моделі ХНВ. Контролями були відсутність лікування (протилежне око), інтравітреальна ін'єкція антитіла проти МЕСЕ ("Блокада

МЕСЕ") або інтравітреальна ін'єкція ізотипового контрольного антитіла проти пероксидази хрону (НЕР) СКонтрольне антитіло").

Фіг. 5 показує зв'язування з ІІ -6, порівняно з антитілом дикого типу (ЕВІ-029), в антитілах з такими мутаціями (1) ІБ17/555055, (2) А28М/511/55505, (3) 5ЗОР/Л51Т, /5550, та (4)

А28М/530Р/Л511Т/5555 (також називається ЕВІ-О30).

Фіг. б показує відносний сигналінг (їасіопа! зідпайпо) в НЕК-Віне"М 1/6 репортерних клітинах, оброблених ІЇ/-6 та одним з таких Бар: (1) УМТ (ЕВІ-029), (2) А2г8М/517Т/5552, (3)

ЗЗОР/Б1Т/555С2, (4) А28М/530Р/ЛБ1 Т/555С2 (ЕВІ-030).

Фіг. 7 показує люмінесценцію (міра І--6-індукованої проліферації) в клітинах Т1165.85.2.1, оброблених ІЇ-б6 та одним з таких Раб у зазначеній концентрації: (1) МТ (ЕВІ-029), (2) д2г8МлЬ17/555И, (3) 5ЗОР/Б1Т/5550, (4) А28М/530Р/ЛБ1Т/5550 (ЕВІ-030).

Фіг. 8 показує відносний сигналінг в репортерних клітинах НЕК-Війе"М ІІ 6, оброблених 20 пмМ

І--6 та різними концентраціями (1) ЕВІ-029 Ід02 (ЕВІО29), продукованого у клітинах НЕК-6Е, (2)

ЕВІ-0О30 Ідс2 (ЕВІОЗО), продукованого у клітинах НЕК-6Е, та (3) ЕВІ-О30 Ідс2-НЗ11А (ЕВІОЗО

НЗІ1А), продукованого у клітинах НЕК-6Е; (4) тоцилізумабу (ТОСІ), і (53 ЕВІ-О30 Ідсг, продукованого у стабільному пулі клітин яєчнику китайського хом'ячка (СНО) (ЕВІ-О30 СНО).

Фіг. 9 зображує фармакокінетичну модель, описану у Прикладі 20.

Фіг. 10 зображує ефект зростаючої ефективності антитіла на тривалість інгібування 1-6 в оці, імітованого з використанням фармакокінетичної моделі, описаної у Прикладі 20.

Фіг. 11 показує зміни концентрації лікарських засобів ЕВІ-029, ЕВІ-029-НЗІ11ТА, ЕВІ-0О30, ЕВІ- 030-НЗІ11А, ЕуїеафФ, та тоцилізумабу (ТС7) в склистому тілі у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 12 показує зміни концентрації лікарських засобів ЕВІ-029, ЕВІ-0О30, ЕВІ-О30-НЗ1ТА,

ЕуїІєаФ), та тоцилізумабу (ТС2) в сітківці у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 13 показує зміни концентрації лікарських засобів ЕВІ-029, ЕВІ-0О30, ЕВІ-О30-НЗ1ТА,

ЕуїІєаФ), та тоцилізумабу (ТС2) у водянистій волозі у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 14 показує зміни концентрації лікарських засобів ЕВІ-029, ЕВІ-0О30, ЕВІ-О30-НЗ1ТА, бо ЕуієаФ), та тоцилізумабу (ТС) у судинній оболонці у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 15А зображує положення ЕК1, СОКІ, ЕК2, СОМК2, ЕКЗ, СОРЗ, ЕК4, СНІ, шарнір, СН2, та СНЗ у послідовності важких ланцюгів ЕВІ-029 (5ЕО ІО МО: 11), ЕВІ-О30 (ЗЕО ІЮ МО: 41), та

ЕВІ-031 (ЕВІ-031 також називається в даному документі ЕВІ-030-НЗ11А) (ЗЕО ІО МО: 47).

Фіг. 158 зображує положення ЕКІ, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4, та СК у послідовності легкого ланцюга (ЕВІ-0О29, ЕВІ-О30 та ЕВІ-О31 мають однакові послідовності легкого ланцюга) (ЗЕО ІЮ МО: 12).

Фіг. 16А показує відносний сигналінг у НЕК-Віне М ІІ -6 репортерних клітинах, оброблених 20

ПМ 1-6 та різними концентраціями ЕВІ-031 або тоцилізумабу.

Фіг. 168 показує відносний сигналінг у НЕК-Вісе"М Ії -6 репортерних клітинах, оброблених 200 пМ гіпер-ІІ-6 та різними концентраціями ЕВІ-031 або тоцилізумабу.

Фіг. 17 показує результати математичного моделювання, описаного у Прикладі 24.

Фіг. 18 є схематичним зображеннням трьох різних структурних ізоформ антитіл Ідс2, утворюваних зсувом дисульфідного (зв'язку).

Фіг. 19 показує хроматограми ОФ-ВЕРХ зразків ЕВІ-031: необроблені (верхня панель), 5 мМ дитіотреїтолу (ОТ) (середня панель), 10 мм цистеїну (нижня панель).

Фіг. 20 показує ОФ-ВЕРХ хроматограми зразків ЕВІ-О31, одержаних для різних клітинних ліній ЕВІ-0О31: 200-литрової культури клональної клітинної лінії (верхня панель), 10-литрової культури батьківської клітинної лінії (середня панель), та стабільно трансфекованого пулу клітин (нижня панель).

Фі. 21 показує ОФ-ВЕРХ хроматограму ЕВІ-О31, одержану для 200-литрової культури клональної клітинної лінії, і вказує та визначає кількості ізоформ, що відповідають кожному піку хроматограми.

Фіг. 22А є графіком, що показує фармакокінетичні дані для африканської зеленої мавпи (К797), як описано у Прикладі 26.

Фіг. 228 є графіком, що показує фармакокінетичні дані для африканської зеленої мавпи (Кб79), як описано у Прикладі 26.

Фіг. 23 є графіком, на якому показані фармакокінетичні дані для обох африканських зелених мавп (К797 або Кб79) та апроксимовані криві.

Фіг. 24А показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-0О31 в рідині склистого тіла у часі після

Зо інтравітреального введення.

Фіг. 24В показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-0О31 у водянистій волозі у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 24С показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-0О31 в судинній оболонці у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 2400 показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-О31 в кон'юнктиві у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 24ЄЕ показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-0О31 в рогівці у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 24Е показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-031 у війковому тілі райдужки у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 240 показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-О31 в кришталику у часі після інтравітреального введення.

Фіг. 24Н показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-0О31 в сітківці у часі після інтравітреального введення.

Фіг 24! показує концентрацію лікарського засобу ЕВІ-О31 у склері у часі після інтравітреального введення.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

Вважається, що 1-6 відіграє певну роль у ряді хвороб, таких як ревматоїдний артрит, і повідомлялося про його значну підвищувальну регуляцію у ряді хвороб, включаючи очні хвороби. ІІ -6 може діяти як за цис-, так і за транс-механізмами. В цис-механізмі вважається, що вільний 1-6 зв'язується з мембраннозв'язаним рецептором 1-6 (ІІ -6К також називається ІІ -6Ка та СО126), і комплекс 1 -6/І -6К потім взаємодіє з др130 (також називається СО130, рецептором онкостатину М, І--6Кбета, та трансдуктором сигналу ІІ -6), з активацією сигналінгу у клітині, що містить комплекс. У транс-механізмі, вільний 1-6 зв'язується з розчинним рецептором ІІ--6 (51 - 6). Комплекс ІІ -6/5ІЇ-6К може потім зв'язуватися з др130, присутнім у клітинній мембрані.

Ключова різниця між цими механізмами полягає в тому, що др130 експресують більше типів клітин, ніж І--6К, експресія якого є більш обмеженою. Отже, при хворобах, для яких бажано інгібувати сигналінг І--6, наприклад при хворобах, для яких бажано інгібувати сигналінг 1-6 в широкому розумінні, корисно інгібувати як цис-, так і транс-сигналінг 1І/-б6. Заявники бо сконструювали антагоністи 1-6, наприклад, антитіла проти І1І-6, (їх) фрагменти та похідні, що можуть інгібувати як цис-, так і трансо-сигналінг І/-б. Крім того, заявники сконструювали такі антагоністи І/-6, що дозволяють досягти більш швидкого системного кліренсу. Антагоністи 1-6, наприклад, антитіла І -6 та їх фрагменти або похідні, описані у М/О2014/074905, повний зміст якого цим включений до даного документу шляхом посилання. Даний винахід стосується удосконалених антитіл ІІ. -6 та їх застосування.

У використовуваному в даному документі значенні, терміни в однині, включаючи, без обмеження, терміни, використовувані в англійському тексті з артиклями "а", "ап" або "Ве", включають множину, якщо у контексті чітко не вказано інше.

Ознаки антагоністів 1І--6 (ІІ -ба)

Заглом, антагоніст І--6 (ПІ -ба), описаний в даному документі специфічно зв'язується із сайтом І! (сайт 2) І--6 та є придатним для лікування пов'язаної з ІЇ-б6 хвороби очей та певних інших хвороб. Пов'язаною з І/-б6 хворобою очей є така, при якій небажаний симптом або біологічна активність хвороби асоційовані з експресією або присутністю ІІ -6. В деяких варіантах реалізації, ІЇ-ба має високу афінність по відношенню як до вільного, так і до зв'язаного 1-6, є відносно стабільним в організмі, може інгібувати зв'язування з др130 Ії -6, зв'язаного з І -6К (що називається в даному документі комплексом 1 -6/І/-6К або 1/-6/ЛІ-6К), і може виявляти терапевтичний ефект. Загалом, ІІ -ба є антитілом або його одержують з антитіла. Наприклад, ІЇ-- ба є високоафінним гуманізованим Раб, який може специфічно зв'язуватися із сайтом ІІ 1-6 та сильно блокує як цис-, так і трансо-сигналінг І/-6. В іншому прикладі, І--ба є повнорозмірним антитілом, наприклад, антитілом Їдсе1 або Ідс2.

В деяких варіантах реалізації Бар також має вигляд генетично модифікованої Ес- послідовності або входить до складу повнорозмірного антитіла. В деяких варіантах реалізації,

ІЇ-ба з генетично модифікованим Ес-фрагментом (наприклад, Бар з генетично модифікованим

Ес-фрагментом) має більш швидкий системний кліренс порівняно з відповідним контролем, наприклад, порівняно з відповідним антитілом, його фрагментом або похідним, що не містять генетично модифікованого Ес. Ці та інші ознаки ІЇ-ба додатково описані в даному документі.

Заявники розробили антагоністи І/-б, які селективно зв'язуються із сайтом І 1-6, забезпечуючи широке інгібування сигналінгу І/-б, тому що такі молекули можуть інгібувати зв'язування др130 з ІІ -6, незалежно від того, чи є 1-6 вільним або зв'язаним з мембранним І/--

Зо бЕ або 51,/-6К. Більш того, націлювання на ліганд (ІЇ/-6), а не на рецептор 1ІІ/-6б, дозволяє уникнути рецептор-медійованого кліренсу та токсичності внаслідок АОСС (опосередкованої антитілами клітинної цитотоксичності).

Оскільки 1-6 відіграє як патологічну, так і захисну роль при хворобі, використання антагоніста І/-6 (П/-ба) для лікування хвороби, асоційованої з підвищеним 1-6, може поліпшувати певні аспекти стану, але може також спричинювати значні небажані ефекти, наприклад, системні ефекти. Ця подвійність шляхів ІІ/-6 (тобто, здатність мати бажані та/або небажані ефекти) може зробити небажаним лікування асоційованого з ІЇ-б6 розладу системним інгібітором. Відповідно, композиції та способи, запропоновані в даному документі, можуть бути придатними для лікування, що інгібує щонайменше одну активність ІІ -6, але не має надмірного впливу на позитивні активності ІЇ-6, частково тому, що композиції можуть бути складені для місцевої доставки, наприклад, для місцевої доставки в око. Наприклад, в певних аспектах, ІІ -ба розроблений таким чином, щоб за розміром він був придатним для доставки у певне місце. В деяких варіантах реалізації, ІЇ-ба є повнорозмірним антитілом. В деяких варіантах реалізації, ІІ - ба одержаний з антитіла та має формат, який може довше перебувати у склистому тілі ока та має обмежений системний витік В деяких варіантах реалізації, П/-ба є модифікованим антитілом (наприклад, антитілом з модифікованим Ес-доменом), яке має довший час перебування у склистому тілі ока та/або більш обмеженми системний витік порівняно з відповідним немодифікованим антитілом. В деяких варіантах реалізації, ІІ -ба є антитілом Ідс2.

В деяких аспектах, ІЇ-ба є відносно малим ІІ-ба, таким як фрагмент антитіла або інше похідне антитіла, яке є меншим, ніж повнорозмірне антитіло, наприклад, Бар, одержаний з антитіла І/-6. В деяких випадках, ІЇ-ба має формат, який може переходити з однієї частини тканини в іншу з підвищеною кінетикою у порівнянні з відповідним повнорозмірнми антитілом ІЇ-- 6. В деяких варіантах реалізації, ІІ -ба є Бар, який був створений як молекула більшого розміру, що ймовірно матиме збільшений час перебування у ділянці доставки у порівнянні із самим лише

Еаб, наприклад, І -ба димеризують через Ес-домен. В певних варіантах реалізації, Ес-домен модифікований таким чином, щоб Ес-фрагмент мав редуковане або знижене зв'язування з

ЕсКп, що може зменшувати системне накопичення у порівнянні з таким самим фрагментом зв'язування 1-6, що включає Ес дикого типу. Модифікований Ес-домен може бути, наприклад, доменом Ідс1 або доменом Ідса2. 60 Типово, антагоністи 1-6, описані в даному документі, мають достатньо високу афінність по відношенню до їх мішені, ІЇ/-б6, для забезпечення ефективного полегшення ними щонайменше одного небажаного ефекту ІІ-6, та є достатньо стабільними для застосування як терапевтичні засоби.

Загалом, фармакокінетика (РК) ІІ -ба, наприклад, ІІ-ба, придатного для застосування в оці, має достатньо довгий період напіввиведення у місці доставки, наприклад, склистому тілі, для забезпечення терапевтичного ефекту. У необмежувальних прикладах, фармакокінетика може передбачати період напіввиведення щонайменше 8 днів, 10 днів, 14 днів, 21 день, 28 днів, або 30 днів.

Ідентифікація антагоністів ІІ--6, які зв'язуються із сайтом ЇЇ

Загалом, будь-який спосіб, відомий фахівцям, може бути використаний для створення молекули, яка може зв'язуватися з ІІ-6, наприклад, поліпептидні бібліотеки або молекулярні бібліотеки можуть бути піддані скринінгу для пошуку сполук-кандидатів шляхом проведення аналізу здатності поліпептиду або сполуки зв'язуватися з ІІ -6. після ідентифікації такої сполуки- кандидата, зв'язуючий сайт сполуки може бути визначений з використанням способів, відомих фахівцям. Наприклад, молекула може бути протестована на здатність зв'язуватися з ІЇ -6 дикого типу і зв'язування порівнюють зі здатністю сполуки зв'язуватися з ІЇ -6, мутованим у сайті І, сайті

ІЇ, або сайті І. У варіантах реалізації, ІЇ-ба, описаний в даному документі, зберігає здатність зв'язуватися з комплексом ІІ -6/І-6Ка та з ІІ-6, і запобігає зв'язуванню ІІ -6/ЛІ-6Ка з др130. У варіантах реалізації, І -ба, описаний в даному документі, може конкурувати з ор130 за зв'язування з комплексом 1ІС-6/ЛІ-6бКа, наприклад, шляхом зв'язування із сайтом ІІ І/-6. Такі активності зв'язування можуть бути оцінені з використанням способів, відомих фахівцям.

Кандидати ІІ -ба можуть бути протестовані, наприклад, з використанням системи НЕК-Віце "м для проведення аналізу ІЇ/-6 (Іпмімосбеп, Зап Оіедо). Клітини НЕК-Віне"мМм ||-6б є клітинами

НЕК293, стабільно трансфекованими людським ІЇ-6К та ЗТАТЗ-індукованим репортерним геном ЗЕАР. У присутності І/-6, 5ТАТЗ активується і секретується ЗЕАР. ЗЕАР оцінюють з ввикористанням, наприклад, ОШШАМТІ-ВіІце "м (Іпмімосеп, Зап Оіедо). Додавання антагоніста 1-6 до клітин запобігає секреції або знижує рівень ЗЕАР в результаті інгібування як вільного, так і зв'язаного з розчинним рецептором ІІ -6.

Ко стосується константи рівноваги афінності зв'язування конкретної взаємодії антитіло-

Зо антиген або взаємодії фрагмент антитіла-антиген. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, описаний в даному документі, зв'язується з антигеном (наприклад, 1-6) з Ко, меншим ніж або рівним 250 пМ, наприклад, меншим ніж або рівним 225

ПМ, 220 пМ, 210 пМ, 205 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 20 пМ, 10 пМ, або 1 пМ. Ко може бути визначений з використанням способів, відомих фахівцям, наприклад з використанням поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, з використанням системи ВіаСоге "М,

Кої стосується константи швидкості дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген або комплексу фрагмент антитіла-антиген. Константа швидкості дисоціації може бути визначена з використанням поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, з використанням системи

ВіаСогегм, Відносно повільна Кої може підсилювати бажані ознаки лікарського засобу, наприклад, дозволяючи рідкіші введення інгібітора суб'єкту, що потребує такого лікування.

Специфічність

В деяких варіантах реалізації, ІІ -ба, описаний в даному документі, специфічно зв'язується з мішенню, наприклад, ІЇ/-6. Загалом, "специфічне зв'язування" у використовуваному в даному документі значенні вказує, що молекула переважно зв'язується з вибраною молекулою та виявляє набагато нижчу афінність зв'язування по відношенню до однієї чи декількох інших молекул. У варіантах реалізації, афінність зв'язування по відношенню до іншої молекули на 1, 2,

З чи більше порядків величини нижче афінності зв'язування з мішенню.

Як було описано вище, 1-6 може бути присутнім у вигляді вільного ІІ -6б та у вигляді ІІ -6, зв'язаного з розчинним 1І-6Ка. Заявники ідентифікували сайт ІІ 1-6 як оптимальну мішень для антагоніста ІІ -6 у порівнянні з інгібітором, який зв'язується із сайтом І ІІ -6. Інгібітор сайта І може інгібувати зв'язування вільного ІЇ/-б з ІЇ-бКа. Однак, такий інгібітор не може перешкоджати активності, ініційованій попередньо існувавшими комплексами 1 -6/ЛІ-бКев5, за винятком заміщення, яке обмежене величиною Кої комплексу. Як інша альтернативп, інгібітор, який зв'язується з І/-бКа, є менш придатним, тому що він може мати обмежену здатність перешкоджати активності ІЇ/-б6, якщо він присутній не в насичувальній концентрації. Оскільки кількість рецептора 1І--6 є звичайно досить високою у порівнянні з кількістю ІІ -6, цей підхід може потребувати введення небажано великої кількості композиції, що інгібує активність ІЇ-6 шляхом зв'язування з рецептором. У варіантах реалізації, антагоністи ІІ -6, описані в даному документі (наприклад, антитіла та їх фрагменти та похідні, описані в даному документі) можуть блокувати 60 активність ІЇ/-б, навіть коли ІЇ/-б зв'язаний з І/-6К. Відповідно, перевага ІЇ-ба, описаного в даному документі, полягає в тому, що може бути треба ввести відносно меншу кількість композиції для досягнення терапевтичного ефекту в порівнянні з інгібітором, націленим на рецептор І/-6. Повідомлялося, що антитіла проти рецептора швидко виводяться шляхом рецептор-медійованого кліренсу, що значно обмежує їх фармакокінетику (РК), і тому потребують більш високих доз, частішого введення доз, або обох. Додатково, антитіла як проти рецептора, так і проти сайта І І/-6, створюють проблему, яка полягає в тому, що вони значно підвищують концентрацію 1-6 у тканині, порушуючи нормальний шлях рецептор-медійованого кліренсу ліганду, тим самим створюючи у суб'єкта потенційно небажані рівні ІЇ/-б у тканині.

Більш того, використання інгібітора, націленого на І/-бКа, може спричинити присутність інгібітора як там, де інгібування потрібне, так і там, де воно є небажаним, наприклад, (внаслідок) системного лікування. Використання ІІ/-ба, який зв'язує сайт ІІ, з яким зв'язується одр130, забезпечує можливість інгібування вільного ІІ -6, а також ІІ -6, який зв'язаний з ІІ -6К, але ще не активував шлях 1-6 через др130. Відповідно, не бажаючи обмежуватися теорією, зазначимо, що антагоністи ІІ-6, описані в даному документі, призначені для зв'язування з обома формами

І--6 (розчинною та зв'язаною з рецептором), конкретніше, антагоністи 1І-6 зв'язуються із сайтом

І 1С-б, який є доступним в обох формах. Композиції, що містять ІЇ-ба, описаний в даному документі, можуть інгібувати як цис-, так і транс-сигналінг ІІ -6.

В деяких випадках, сполуки та способи, запропоновані в даному документі, призначені для забезпечення ефективної блокади 1-6, достатньої для лікування щонайменше однієї ознаки або симптому розладу, асоційованого з ІІ -6, наприклад, інгібуючи ангіогенез і/або запалення.

Сполуки, описані в даному документі, є придатними для лікування хвороб ока, які характеризуються небажано високим рівнем 1-6, наприклад, у склистому тілі (див. Уишкі еї аї., у ріабеїез Сотрі 15:257 (2001); Рипаїзи єї аї., ОрпіНаІтоіоду 110:1690 (2003); ОН еї а!., Сит Еуе

Вез 35:1116 (2010); Мота еї аї., Еуе 22:42 (2008); Кажавпіта есеї аї., Урп У Орпійа!тої 51:100 (2007); Кашйтап єї аї., Іпме5і ОрпіїйаІтої Міз Зсі 35:900 (1994); Міао єї аїЇ., Моїес Міб 18:574(2012)).

Загалом, І/-ба, описаний в даному документі, є сильним антагоністом сигналінгу І -6. В деяких варіантах реалізації, І -ба, описаний в даному документі, має високу афінність по відношенню до ІІ-6, наприклад, з ІС50 меншою ніж або рівною 100 пМ за результатами аналізу

Зо І/-6 методом НЕК-Віне з використанням 10 пМ 1-6. Висока афінність ІІ -ба може бути визначена на основі величини Коб ІІ -ба, наприклад, при Ко, меншому ніж або рівному 1 нМ, меншому ніж чи рівному 500 пМ, меншому ніж чи рівному 400 пМ, меншому ніж чи рівному 300 пМ, меншому ніж чи рівному 240 пМ, або меншому ніж чи рівному 200 пМ.

Для одержання біологічного ІІЇ-ба (наприклад, білка або поліпептиду, такого як антитіло, його фрагмент або похідне), придатного для лікування розладу, асоційованого з підвищеною експресією або активністю 1-6, типово бажано, щоб біологічний //-ба мав високу продуктивність. Наприклад, придатна продуктивність є більшою ніж чи рівною 1 г/л (наприклад, більшою ніж чи рівною 2 г/л, більшою ніж чи рівною 5 г/л, або більшою ніж чи рівною 10 г/л).

Для ефективного введення антагоністу ІЇ/-б6, необхідно, щоб інгібітор мав розчинність, порівняну з концентрацією, в якій він буде вводитися. Наприклад, у випадку повнорозмірного антитіла І--ба, розчинність є більшою ніж чи рівною 20 мг/мл, більшою ніж чи рівною 10 мг/мл, більшою ніж чи рівною 5 мг/мл, або більшою ніж чи рівною 1 мг/мл.

Більш того, для забезпечення ефективного лікування, інгібітор повинен мати високу стабільність при температурі тіла на ділянках доставки та виявлення активності, а також стабільність при зберіганні. У варіантах реалізації, інгібітор має Тт більшу ніж чи рівну 60 С (наприклад, більшу ніж чи рівну 60 "С, більшу ніж чи рівну 62,5 "С, більшу ніж чи рівну 65 "С, більшу ніж чи рівну 70 "С, більшу ніж чи рівну 73 "С, або більшу ніж чи рівну 75 "С). У варіантах реалізації, інгібітор має Точату більшу ніж чи рівну 45 "С, наприклад, більшу ніж чи рівну 50 "С, більшу ніж чи рівну 51 "С, більшу ніж чи рівну 55 "С, або більшу ніж чи рівну 60 "С. Способи визначення Тт та Тпоочату Є ВІДОМИМИ фахівцям.

Антагоністи, що мають бажані ознаки, можуть бути вибрані з придатних типів молекул, відомих фахівцям, наприклад, антитіл, включаючи фрагменти та похідні антитіла проти сайта ІЇ

І/-6, які загалом зберігають або підтримують достатні ознаки батьківського антитіла 1-6 (наприклад, бажані властивості зв'язування). Такі антагоністи включають фрагменти Раь, зсЕмв5, фрагменти ЕРаь, модифіковані шляхом включення фрагмента Ес, та повнорозмірні антитіла з модифікованим каркасом, що відрізняється від батьківського антитіла проти сайта ІП ІІ -6.

В деяких аспектах, ІІ -ба, розкритий в даному документі, містить антигензв'язуючий сайт людського антитіла, який може конкурувати або перехресно конкурувати з антитілом або його фрагментом, що можуть зв'язуватися із сайтом ІІ І/-6. Наприклад, антитіло або його фрагмент 60 можуть складатися з домену МН та домену М/., розкритих в даному документі, і домени МН та М.

включають набір СОК антитіла, яке зв'язує ІІ -б/сайт ІЇ, розкритого в даному документі.

Будь-який придатний спосіб може бути використаний для визначення домену та/або епітопу, зв'язуваного ІЇ-ба, наприклад, шляхом мутування різних сайтів ІЇ/-б. Сайти, мутації у яких запобігають або знижують зв'язування ІЇ -ба та ліганду 1-6, або безпосередньо беруть участь в зв'язуванні з ІЇ-ба, або опосередковано впливають на зв'язуючий сайт, наприклад, впливаючи на конформацію 1-6. Інші способи можуть бути використані для визначення амінокислот, зв'язуваних ІЇ-ба. Наприклад, може бути використане сканування по зв'язуванню пептидів (рерііде-ріпаїпу зсап), таке як твердофазовий імуноферментний аналіз (ЕГІ5А) на основі методу

РЕРБЗСАМ. При пептидному скануванні такого типу, короткі перекривні пептиди, одержані з антигену, піддають систематичному скринінгу на зв'язування зі зв'язувальним компонентом.

Пептиди можуть бути ковалентно зв'язані з поверхнею носія для утворення пептидної матриці.

Пептиди можуть бути в лінійній або напруженій конформації. Напружена конформація може бути одержана з використанням пептидів, що мають термінальні залишки цистеїну (су5) на кінцях пептидної послідовності. Залишки сух5 можуть бути ковалентно приєднані безпосередньо чи опосередковано до поверхні носія таким чином, щоб пептид утримувався в конформації петлі. Відповідно, пептид, використовуваний у способі, може мати залишки су, додані до кожного кінця пептидної послідовності, що відповідає фрагменту антигену. Можуть бути використані також пептиди з подвійними петлями, у яких залишок су5 додатково розташований у середній частині пептидної послідовності чи поблизу до неї. Залишки сузх можуть бути ковалентно з'єднані безпосередньо чи опосередковано з поверхнею носія, так щоб пептиди утворювали конформацію з подвійними петлями, по одній петлі з кожного боку від центрального залишку су5. Пептиди можуть бути одержані методами синтезу, і тому залишки су5 можуть бути введені в бажані положення, незважаючи на те, що в природі вони відсутні у послідовності сайта ІІ І--6. Необов'язково, як лінійні, так і напружені пептиди можуть бути використані для скринінгу в аналізі пептидного зв'язування. Пептидне сканування може передбачати ідентифікацію (наприклад, з використанням ЕГІЗА) набору пептидів, з якими зв'язується зв'язувальний компонент, у якому пептиди мають амінокислотні послідовністі, що відповідають фрагментам І--ба (наприклад, пептиди, що включають приблизно 5, 10 або 15 послідовно розташованих залишків ІІ-ба), і вирівнювання пептидів з метою визначення "сліду" (Тооїргіпі) залишків, зв'язуваних зв'язувальним компонентом, причому "слід" включає залишки, які є спільними для перекривних пептидів. Альтернативно або додатково, спосіб пептидного сканування може бути використаний для ідентифікації пептидів, з якими зв'язується ІІ -ба, щонайменше, з вибраним співвідношенням сигнал:шум.

Інші способи, відомі фахівцям, можуть бути використані для визначення залишків, зв'язуваних антитілом, та/або для підтвердження результатів пептидного сканування, включаючи наприклад, сайт-спрямований мутагенез (наприклад, як описано в даному документі), воднево-дейтерієвий обмін, мас-спектрометрію, ЯМР та рентгенівську кристалографію.

Типово, ІЇ-ба, придатний для застосування, як описано в даному документі, є молекулою людського антитіла, молекулою гуманізованого антитіла, або їх зв'язуючим фрагментом.

Загалом, антитіло є моноклональним антитілом. Таке антитіло може мати людське, мишаче, щуряче, верблюдяче, кроляче, овече, свине або бичаче походження і може бути одержане способами, відомими фахівцям.

Загалом, І -ба містить щонайменше СОК антитіла, яке може специфічно зв'язуватися з ІІ -6 (наприклад, людським ІІ--6), наприклад, із сайтом ІІ І -6. Структурою, що несе СОК або набір

СОК за винаходом, може бути послідовність важкого або легкого ланцюга антитіла або значна її частина, у якій СОМ або набір СОК розташовані у положеннях, що відповідають СОК або набору СОК природних варіабельних доменів УН та Мі антитіла, кодованих реаранжованими імуноглобуліновими генами. Структури та положення варіабельних доменів імуноглобуліну можуть бути визначені з посиланням на роботу КарБбаї, еї аї., 1983 (Маїййопаї! Іпозійшез ої Неа), та її оновлені редакції, які можна знайти за допомогою будь-яких засобів інтернет-пошуку по слову "Кабаї".

ІЇ-ба, розкритий в даному документі, типово є антитілом, яке звичайно включає домен УН і/або домен Мі. антитіла. Домен МН включає набір СОК важкого ланцюга (УНСОК), і домен МІ. включає набір СОМ легкого ланцюга (МІСОК). Приклади таких СОК наведені в даному документі у прикладах. Молекула антитіла може включати домен МН антитіла, який включає

МНСОКІ, МНСОМКО2 та МНСОМКЗ та каркасну ділянку. Він може альтернативно або також включати домен Мі. антитіла, який включає МІ СОКІ1, МІ СОК2 та МІ СОКЗ та каркасну ділянку.

В даному документі розкриті антагоністи І/-6, що містять МНСОКІ1 і/або МНСОКІ2 і/або 60 УМНОоОК, такі як розкриті в даному документі, і/або М СОКІ1 і/або М СОР2 і/або МІ СОКУ, такі як розкриті в даному документі. ІЇ-ба може включати один чи декілька СОМ будь-чого з антитіл, фрагментів або похідних, описаних в даному документі. І/-ба може включати набір УНСО (наприклад, МНСОКІ, МНСОК2, та МУНСОНМЗ), та необов'язково він може також включати набір

МіСОЕ (наприклад, МЕ СОКІ, М СОК2, та МЕСОКІЗ). СОК можуть бути одержані з одного чи декількох антитіл, фрагментів або похідних, описаних в даному документі. Наприклад, МЕСО можуть бути одержані з того самого антитіла, що й МНСООК, або з іншого.

Звичайно, домен МН спарюється з доменом МІ з утворенням антигензв'язуючого сайта антитіла. Наприклад, домен важкого ланцюга (НС) ЗЕО ІО МО1 або 5ЗЕО ІЮ МО:З3 спарюється з доменом легкого ланцюга (С) 5ЕО ІО МО:2. В деяких випадках, як ІЇ-ба може бути використаний один домен УН або Мі.

В деяких аспектах, ІІ-ба є молекулою антитіла, її фрагментом або похідним, що включає (і) послідовність домену УН, яка має щонайменше 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 або 99 95 ідентичності амінокислотних послідовностей з доменом МН, описаним в даному документі (наприклад, ЗЕО

ІО МО:37), або (ії) набір МНСОК (наприклад, УНСОКІ, УНСОКЗ2 і/або МНСОКЗ) з послідовності домену МН. У варіантах реалізації, молекула антитіла, її фрагмент або похідне включає

МНСОКІ, МНСОК2 та МНСОКЗ 5ЕО ІО МО:37. У варіантах реалізації, молекула антитіла, її фрагмент або похідне включає УНСОКІ, МНСОК2 та УНСОКЗ, які колективно відрізняються від

МНСОМ1, МНСОК2 та МНСОКЗ 5ЕО ІО МО:37 не більш ніж на 1, не більш ніж 2, не більш ніж 3, не більш ніж 4, або не більш ніж 5 амінокислот.

Молекула антитіла, її фрагмент або похідне можуть також необов'язково включати (і) послідовність домену МІ, яка має щонайменше 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 або 99 95 ідентичності амінокислотних послідовностей з доменом Мі, описаним в даному документі, наприклад, доменом МІ ЗЕО ІО МО: 38, або (ії) набір М.СОР (наприклад, МЕСОМКІ1, МІ СОК2 і/або МІ СОКЗ) з домену МІ. У варіантах реалізації, молекула антитіла, її фрагмент або похідне включає

МІСОКІ, МЕСОКО та МІСОКЗ 5БО ІО МО: 38. У варіантах реалізації, молекула антитіла, фрагмент, або похідне включає М СОКІ1, МІ СОК2, та МІ СОКУ, які колективно відрізняються від

МІ СОР1, М СОВ2 та М СОР 5ЕО ІЮО МО:38 не більш ніж на 1, не більш ніж 2, не більш ніж 3, не більш ніж 4, або не більш ніж 5 амінокислот. Алгоритми, які можуть бути використані для обчислення процента ідентичності двох амінокислотних послідовністей, включають наприклад,

Зо ВІ А5Т, ЕАЗТА, або алгоритм Сміта-Уотермана (Зтййп-У/агептап), наприклад, з використанням параметрів за замовчуванням.

І/-ба, описаний в даному документі, може включати константні області антитіла або їх частини, наприклад, константні області людського антитіла або їх частини. Наприклад, домен

МІ. може бути з'єднаним своїм карбоксильним кінцем з константними доменами легкого ланцюга антитіла, включаючи людські ланцюги СК або Сі. Аналогічно, І -ба, оснований на домені УН, може бути з'єднаним своїм карбоксильним кінцем з усім або частиною (наприклад, доменом

СНІ) важкого ланцюга імуноглобуліну, одержаного з будь-якого ізотипу антитіла, наприклад,

ІЧ, ІДА, ЧЕ та І9М та будь-яких підкласів ізотипу, зокрема Ідс1, Ідс2, ІдОЗ та Ідс4. У варіантах реалізації, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент модифікують з метою зниження або усунення активності АОСОС.

У варіанті реалізації, антитіло за винаходом є антитілом Ідса2. У варіанті реалізації, антитіло за винаходом включає каркасну ділянку Ідс2, константну область Ідс2, або Ес-фрагмент Ідсг2, як описано в даному документі.

Антитіла Ідо2 можуть існувати у вигляді трьох основних структурних ізоформ: Ідс2-А, Ідс2-

В та Ідс2-А/В (УУуруси 4). єї аІ. доцтта! ої Віоіодісаї Спетівігу. 2008, 283:16194-16205).. Ця структурна неоднорідність спричинена різними конфігураціями дисульфідних зв'язків, які з'єднують Еаб-плечі з шарнірною областю важкого ланцюга. В ізоформі ІдсС2-А немає дисульфідних зв'язків, що з'єднують Рар-плечі з шарнірною областю. В ізоформі Іде2-В, обидва

Еаб-плеча мають дисульфідні зв'язки, які з'єднують важкий та легкий ланцюг з шарнірною областю. Ізоформа Ідс2-А/В є гібридом між ізоформами Ідшб2-А та Ід0б2-В, і лише одно Еаб- плече має дисульфідні зв'язки, що з'єднують важкий та легкий ланцюг одного Рар-плеча з шарнірною областю. Перетворення антитіла Їд52 між двома або усіма різними структурними ізоформами, яке також називається зсувом дисульфідного (зв'язку), відбувається природньо іп мімо та іп міго як для природніх, так і для рекомбінантних антитіл. В результаті, композиції антитіл ї(ДдС2 у відомому рівні техніки містять гетерогенну суміш ізоформ Ідс2-А, Ідс2-В, та

Ідсі2-А/В. Різні ізоформи Ідс2 можуть мати унікальні та різні функціональні властивості, такі як відмінності у стабільності, агрегації, в'язкості, зв'язуванні Ес-рецепторів, або активності.

Присутність численних ізоформ або підвищені рівні конкретної ізоформи в композиції антитіла

Ід902 можуть негативно впливати на стабільність, агрегацію або ефективність. бо Даний винахід пропонує антитіло, перевагою якого є те, що воно існує переважно у вигляді ізоформ Ідс2-А або Ідс2-А/В. Антитіло за даним винаходом не існує у вигляді ізоформи Ідс2-В, або не існує у вигляді ізоформи Ід52-В протягом значного періоду часу. Таким чином, композиції та рецептури, що включають антитіло за винаходом, є в меншому ступені гетерогенними, ніж інші антитіла Ідс2, відомі фахівцям, і тому кращими для застосування у терапії.

Композиції, що містять антитіло за винаходом, включають переважно ізоформи Ідс2-А і/або

Ідсі2-А/В антитіла. У варіанті реалізації, композиція, що містить антитіло, описане в даному документі, включає щонайменше 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ізоформ Ідс2-А або

Ідсі2-А/В антитіла. У варіанті реалізації, композиція, що містить антитіло, описане в даному документі, включає щонайменше 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ізоформ Ідс2-А та ІдС2-

А/В колективно. В таких варіантах реалізації, композиція, що містить антитіло, описане в даному документі, не містить значної кількості ізоформи Ідс2-В антитіла. Наприклад, композиція включає менш ніж 10 95, 5 Фо, 2 У, 1 У, 0,5 95 або 0,1 95 ізоформи Ідс2-В антитіла.

В деяких випадках, антитіло за винаходом додатково модифіковане з використанням способів, відомих фахівцям, з утворенням послідовності, що має специфічний алотип, наприклад, алотип, який домінує в популяції, що має конкретне географічне походження. В деяких випадках, для цього модифікують константну область людського важкого ланцюга.

ІЇ-ба може бути молекулою антитіла, її зв'язуючим фрагментом або варіантом, що має одну чи декілька СОК, наприклад, набір СОК, в каркасній ділянці антитіла. Наприклад, одна чи декілька СОК або набір СОК антитіла (наприклад, антитіла або його фрагмента або похідного, як описано в даному документі) можуть бути прищеплені на каркасну ділянку (наприклад, каркасну ділянку людини) для створення молекули антитіла. Каркасні ділянки можуть бути одержані з послідовністей гена зародкової лінії людини, або походити не від зародкової лінії.

Залишки каркасної ділянки МН та/або Мі можуть бути модифіковані, як описано та проілюстровано в даному документі, наприклад, з використанням сайт-спрямованого мутагенезу.

Заміни амінокислот можуть бути зроблені в одній чи декількох каркасних ділянках і/або одній чи декількох СОК, одержаних з антитіла ІІ-ба, націленого на сайт ІІ І/-6 (називаного в даному документі "референсним антитілом 1-6") з використанням способів та параметрів, відомих

Зо фахівцям. Також до обсягу даного документу входить одержаний антагоніст ІІ -6, який зберігає здатність до зв'язування із сайтом ІІ 1-6 (наприклад, сайтом Ії людського 1-6) і типово має принаймні таке саме зв'язування або підвищену афінність у порівнянні з референсним антитілом ІЇ/-6. В деяких випадках, для поліпшення параметра, такого як стабільність, може бути введена заміна, яка приводить до зниження афінності зв'язування одержуваного ІІ -ба у порівнянні з референсним І--ба (наприклад, референсним антитілом) для створення корисного

ІЇ-ба. В деяких варіантах реалізації, наприклад, в деяких випадках, коли порівняння стосується зв'язування з ЕсКп або фармакокінетичного (РК) параметра, такого як період напіввиведення у склистому тілі або системний період напіввиведення (наприклад, у крові, плазмі, сироватці, лімфі, печінці, нирці, іншій тканині, або рідині організму), референсне антитіло може бути антитілом, яке не зв'язується специфічно з 1! -6.

Заміна в амінокислотній послідовності ІЇ-ба поліпептиду може включати заміщення одного чи декількох амінокислотних залишків на неприродну або нестандартну амінокислоту, модифікацію одного чи декількох амінокислотних залишків в неприродну або нестандартну форму, або вставку однієї чи декількох неприродних або нестандартних амінокислот в послідовність. Приклади числа та положень змін у послідовністях за винаходом описані в інших розділах даного документу. Природні амінокислоти включають 20 "стандартних" І -амінокислот, позначуваних їх стандартними однобуквеними кодами б, А, М, Г., І, М, Р, Е, М, 5, Т.М, 0, М, С, К,

Е, Н, р, Е. Нестандартні амінокислоти включають будь-який інший залишок, що може бути включений в поліпептидний скелет або утворюється в результаті модифікації існуючого амінокислотного залишку. Нестандартні амінокислоти можуть бути природними або неприродними. Декілька природних нестандартних амінокислот є відомими фахівцям, такі як 4- гідроксипролін, 5-гідроксилізин, З-метилгістидин та М-ацетилсерин. Ці амінокислотні залишки, дериватизовані в їх М-альфа-положенні, будуть розташовані тільки на М-кінці амінокислотної послідовності. Амінокислота типово є І-амінокислотою. В деяких випадках, амінокислота є О- амінокислотою. Заміна може, таким чином, включати модифікацію Іі-амінокислоти з її перетворенням на, або її заміщення на О-амінокислоту. Метильовані, ацетильовані та/або фосфорильовані форми амінокислот також є відомими, і амінокислоти в даному винаході можуть бути піддані такій модифікації.

Амінокислотні послідовністі в доменах та зв'язувальних компонентах антитіла за винаходом 60 може включати неприродні або нестандартні амінокислоти, як описано в даному документі.

Нестандартні амінокислоти (наприклад, ЮО-амінокислоти) можуть бути включені в амінокислотну послідовність з використанням способів, відомих фахівцям, наприклад, при синтезі молекули або шляхом подальшої модифікації чи заміни амінокислоти. В деяких випадках, О-амінокислота використовується для підвищення фармакокінетики (РК) ІІ--ба.

Нові МН- або Мі -ділянки, що несуть одержані з СОМ. послідовністі за винаходом, можуть бути одержані з використанням неспецифічного мутагенезу однієї чи декількох вибраних УН- та/або Мі -послідовністей нуклеїнових кислот для створення мутацій в усьому варіабельному домені. Наприклад, може бути використана помилково-спрямована ПЛР (Спао еї аї., Маїшиге

Ргоїосоїв, 1:755-768 (2006)). В деяких варіантах реалізації, роблять одне чи два амінокислотних заміщення в усьому варіабельному домені або наборі СОК. Інші способи, відомі фахівцям, можуть бути використані для створення мутацій, наприклад, сайт-спрямований мутагенез, типово, в одній чи декількох СОБ.

Один спосіб одержання антитіла ІЇ-ба полягає в зміні домену МН, такого як розкритий в даному документі, шляхом додавання, делеції, заміщення або вставки однієї чи декількох амінокислот. Змінений домен МН може бути об'єднаний з доменом МІ. (наприклад, доменом МІ, розкритим в даному документі), який також може бути змінений, як описано в даному документі, та з використанням способів, відомих фахівцям. Такі змінені молекули тестують на їх здатність зв'язуватися із сайтом ІІ І--6 та, необов'язково, на інші бажані властивості, такі як підвищена афінність у порівнянні з референсной молекулой. В деяких випадках, варіант домену УН або МІ. може мати 1, 2, 3, 4 або 5 таких змін (наприклад, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних заміщень).

У варіантах реалізації, ІЇ-ба за винаходом є фрагментом антитіла, який зв'язується із сайтом

ІП 1-6 та включає антигензв'язуючий сайт, наприклад, може зв'язуватися із сайтом І 1-6.

Фрагменти антитіл за винаходом звичайно одержують починаючи з референсної (батьківської) молекули антитіла, такої як молекула антитіла, що включає 5БЕО ІЮ МО:41 та 5ЕО ІЮО МО:42.

Фрагменти антитіл можуть бути одержані з використанням способів, відомих фахівцям, таких як методи рекомбінантної ДНК, ферментативне розщеплення (наприклад, з використанням пепсину або папаїну), хімічне розщеплення антитіла (наприклад, хімічне відновлення дисульфідних місточків). Фрагменти антитіл, що містять антигензв'язуючий сайт антитіла, включають, без обмеження, такі молекули, як Раб, Раб, Рар'-5Н, 5сЕм, Ем, аАБ, Ей, та

Зо варіабельну ділянку, стабілізовану дисульфідними зв'язками (й5Ем). Можуть бути сконструйовані різні інші молекули антитіл, що містять один чи декілька антигензв'язуючих сайтів антитіла, включаючи, наприклад, Е(аб")2, Е(абр)З, діатіла, триатіла, тетратіла та мінітіла.

Приклади молекул антитіл та способи їх побудови та застосування описані у Ноїїдег апа

Нидзоп, 2005, Маї ВіоїеснппоЇї 23:1126-1136. Необмежувальними прикладами зв'язуючих фрагментів є фрагмент Раф, що складається з доменів МІ, УН, константного домену легкого ланцюга (СІ) та константного домену 1 важкого ланцюга (СНІ); фрагмент Ей, що складається з доменів МН та СНІ; фрагмент Ем, що складається з доменів Мі та МН одного антитіла; фрагмент ДАБ що складається з домену МН або Мі; виділені ділянки СОК; фрагмент К(ар)2, бівалентний фрагмент, що включає два з'єднані Гар-фрагменти; одноланцюгова молекула Ем (5СЕм), у якій домен МН та домен МГ. з'єднані пептидним лінкером, що дозволяє двом доменам асоціюватися з утворенням антигензв'язуючого сайта; біспецифічний одноланцюговий Ем-димер (наприклад, розкритий у МО 1993/011161), та діатіло, яке є мультивалентним або мультиспецифічним фрагментом, сконструйованим шляхом злиття генів (наприклад, як розкрито в УУО94/13804). Молекули Ем, 5сЕм або діатіла можуть бути стабілізовані шляхом включення дисульфідних місточков, що з'єднують домени МН та Мі. Мінітіла, що включають 5СЕм, з'єднаний з доменом СНЗ, також можуть бути використані як ІІ -ба. Інші фрагменти та похідні антитіла, що можуть бути використані як ІЇ-ба, включають Раб", який відрізняється від фрагмента Рар доданням декількох амінокислотних залишків на карбоксильному кінці домену

СНІ важкого ланцюга, включаючи один чи декілька цистеїнів з шарнірної області антитіла, та

Еабі-5Н, що є фрагментом Рар', у якому цистеїновий залишок (залишки) константних доменів несе вільну тіольну групу.

В деяких випадках, І/-ба, який є фрагментом антитіла, був хімічно модифікованим для поліпшення або створення бажаної властивості, наприклад, шляхом пегілювання для збільшення періоду напіввиведення або включення. аАБ (доменне антитіло) є малим мономерним антигензв'язуючим фрагментом антитіла (варіабельною ділянкою важкого або легкого ланцюга антитіла). МН аАБ зустрічаються в природі у верблюдячих (наприклад, верблюдів та лам) і можуть бути одержані шляхом імунізації тварини родини верблюдячих цільовим антигеном, виділення антиген-специфічних В клітин та прямого клонування генів аАБ з індивідуальних В-клітин. ІЇ-ба за даним винаходом може бути 60 аАБ, що містить домен УН або МІ, по суті як описано в даному документі, або доменом МН або

МІ, що містить набір СОК, по суті як описано в даному документі.

Антитіла за винаходом включають біспецифічні антитіла, у яких дві різні варіабельні ділянки об'єднані в одній молекулі. І -ба можуть бути включені як частина біспецифічного антитіла, одержаного з використанням способів, відомих фахівцям, наприклад, одержаного хімічними методами або з гібридних гібридом. Така молекула може бути біспецифічним фрагментом антитіла описаного вище типу. Одним з необмежувальних прикладів способу одержання біспецифічного антитіла є технологія ВІТЕ М, у якій можуть бути використані зв'язуючі домени двох антитіл з різною специфічністю, з'єднані та через короткі гнучкі пептиди. Це поєднує два антитіла на одному короткому поліпептидному ланцюзі. Діатіла та 5сЕм можуть бути сконструйовані без ділянки Ес, з використанням лише варіабельних доменів, потенційно зменшуючи ефекти антиідіотипової реакції. Біспецифічні антитіла можуть бути сконструйовані як цілий їдсС, як біспецифічний Рабр'2, як Гар'РЕС, як діатіла або ж як біспецифічний 5сгЕм.

Додатково, два біспецифічні антитіла можуть бути з'єднані з використанням звичайних способів створення тетравалентних антитіл, відомих фахівцям.

Біспецифічні діатіла, на відміну від біспецифічних цільних антитіл, є корисними, частково тому, що вони можуть бути сконструйовані та експресовані у Е. сої. Діатіла (і багато інших поліпептидів, таких як фрагменти антитіл) з придатними специфічностями зв'язування можуть бути легко вибрані з використанням фагового дисплея (МО 1994/1 3804) з бібліотеки. Якщо одно плече діатіла залишається постійним, наприклад, зі специфічністю, спрямованою проти сайта ЇЇ

І/-6, то можна підготувати бібліотеку, у якій друге плече змінюється, та вибрати антитіло з придатною специфічністю.

Біспецифічні цільні антитіла можуть бути одержані альтернативними методами генної інженерії, як описано у УМО 1996/27011, УУО 1998/50431 та УМО 2006/028936.

В деяких випадках, ІІ-ба за винаходом містить антигензв'язуючий сайт, розташований не в молекулі антитіла, наприклад, шляхом включення однієї чи декількох СОК, наприклад, набору

СОК, в білковий каркас, що не належить антитілу, як додатково описано нижче. В деяких випадках, СОК включені в каркас, що не належить антитілу. Сайт, що зв'язується із сайтом ПІ ІІ - б, може бути створений шляхом розташування СОМ на білкових каркасах, що не належить антитілу, таких як фібронектин або цитохром В, або шляхом рандомізації або мутування

Зо амінокислотних залишків петлі у білююовому каркасі для надання специфічності зв'язування по відношенню до сайта ІІ ІІ-6. Каркаси для створення нових зв'язуючих сайтів в білках є відомими фахівцям. Наприклад, білкові каркаси для міміків антитіл розкриті в У/ЛО200034784, який описує білки (міміки антитіла), що включають домен фібронектину типу Ії, який має щонайменше одну рандомізовану петлю. Придатний каркас, на який прививають одну чи декілька СОК, наприклад, набір НСОК, може бути одержаний з будь-якого доменного компонента суперсімейства гена імуноглобуліну. Каркас може бути людським або не-людським білком. Перевага білкового каркаса, що не належить оантитілу, полягає в тому, що він може забезпечувати антигензв'язуючий сайт в каркасній молекулі, яка є меншою і/або може бути легше одержана, ніж принаймні деякі молекули антитіл. Малий розмір зв'язувального компонента може надавати корисні фізіологічні властивості, такі як здатність заходити усередину клітин, проникати глибоко в тканини або досягати мішеней в інших структурах, або зв'язуватися усередині білкових "кишень" антигена-мішені. Типовими є білки, що мають стабільний основний ланцюг та одну чи декілька варіабельних петель, у яких амінокислотна послідовність петлі або петель є специфічно або випадково мутованою для створення антигензв'язуючого сайта, що зв'язує антиген-мішень. Такі білки включають Ідс-зв'язуючі домени білка А 5. айгеи5, трансферин, тетранектин, фібронектин (наприклад, з використанням 10-го домену фібронектину тип ІІ), ліпокаліни, а також гамма-кристалін та інші каркаси АйЙйіп'м (5сі! Ргоїеїіп5, НаїйІе, Сегптапу).

Приклади інших підходів включають синтетичні мікротіла на основі циклотидів - малих білків, що мають інтрамолекулярні дисульфідні зв'язки, мікропротеїни (наприклад, Мегзароаіев "мМ,

Атипіх Іпс., Моипіаійп Міем,, СА) та білки з анкіриновими повторами (дарпіни (ОАКРІПп5), наприклад, фірми Моїіесціаг Рагіпег5 Ас, 2игісп-5сНієтеп, Зм/йїгепапа). Такі білки також включають малі генетично модифіковані білкові домени, такі як, наприклад, імунодомени (див. наприклад, публікації патентів США МоМо 2003/082630 та 2003/157561). Імунодомени містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) антитіла.

ІЇ-ба може включати додаткові амінокислоти, наприклад, для надання молекулі інших функціональних характеристик крім здатності зв'язуватися з антигеном.

В деяких випадках, ІЇ-ба несе детектовану мітку, або є кон'югованим з токсином або націлювальним фрагментом або ферментом (наприклад, через пептидильний зв'язок або лінкер). Наприклад, ІЇ-ба може включати каталітичний сайт (наприклад, у ферментному домені), бо а також антигензв'язуючий сайт (наприклад, сайт, що зв'язується із сайтом ІІ І -6), так щоб антигензв'язуючий сайт зв'язувався з антигеном і, таким чином, націлював каталітичний сайт на

І/-6 або комплекс 1ІІ--6/І -6Е. Каталітичний сайт може, в деяких випадках, додатково інгібувати біологічну функцію ІЇ-б6, наприклад, шляхом розщеплення /І/-6б, П/-6К або інщої молекули, асоційованої з комплексом І--балЛі -6.

В деяких аспектах, винахід включає антитіло ІІЇ-ба, яке було модифіковане у порівнянні з референсним антитілом з метою зміни, наприклад, підвищення, зниження або усунення, функції біологічного ефекту І-ба. В одному прикладі, Ес-ділянка є модифікованою або батьківський Ес- домен заміщений на модифікований Ес-домен для зміни фармакокінетики модифікованого ІІ -ба у порівнянні з немодифікованим батьківським. В деяких варіантах реалізації, І -ба модифікований таким чином, щоб він мав каркасну ділянку Ід02. В інших варіантах реалізації,

ІЇ-ба розташований в каркасній ділянці Ідс1 або Ідс2 та має модифікований Ес, що підвищує афінність зв'язування ІІ-ба при рн 6,0 та істотно не змінює афінність зв'язування при рН 7,0 у порівнянні з батьківським або іншим референсним ІІ/-ба. У варіантах реалізації, Ес-домен є модифікованим і ІЇ-ба має знижене системне накопичення, зменшений період напіввиведення, і або підвищений системний кліренс у порівнянні з батьківським або іншим референсним ІІ -ба.

В деяких варіантах реалізації, антитіло І/-ба модифіковане для збільшення фіксації комплемента та комплемент-залежної цитотоксичності. В інших аспектах, антитіло І -ба модифіковане для збільшення здатності антитіла у порівнянні з референсним антитілом активувати ефекторні клітини та брати участь у антитіло-залежній цитотоксичності (АОСС). В деяких випадках, антитіла, розкриті в даному документі, можуть бути модифіковані як для підвищення їх здатності активувати ефекторні клітини та участі в антитіло-залежній цитотоксичності (АОСС), так і для підсилення їх здатності до фіксації комплемента та участі в комплемент-залежній цитотоксичності (СОС).

В деяких варіантах реалізації, антитіла, розкриті в даному документі, модифіковані для зниження їх здатності фіксувати комплемент та брати участь в комплемент-залежній цитотоксичності (СОС). В інших варіантах реалізації, антитіла модифіковані для зниження їх здатності активувати ефекторні клітини та брати участь в антитіло-залежній цитотоксичності (АОСС). В ще інших варіантах реалізації, антитіло, розкрите в даному документі, може бути модифікованим як для зниження його здатності активувати ефекторні клітини та брати участь в

Зо антитіло-залежній цитотоксичності (А0ОСС), так і для зниження його здатності фіксувати комплемент та брати участь в комплемент-залежній цитотоксичності (СОС).

Звичайно є кращим уникати частого введення доз ІЇ-ба, наприклад, при доставці шляхом ін'єкції в око. Для сприяння цьому, в певних варіантах реалізації, період напіввиведення Ії -ба, розкритого в даному документі, в місці доставки, наприклад, склистому тілі, становить щонайменше 4 дня, наприклад, щонайменше 7 днів, щонайменше 9 днів, щонайменше 11 днів, або щонайменше 14 днів. В певних варіантах реалізації, середній період напіввиведення ІІ -ба становить щонайменше 2 дня, З дня, 4 дня, 5 днів, Є днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів, 10 днів, 11 днів, 12 днів, 13 днів, 14 днів, 15 днів, 16 днів, 17 днів, 18 днів, 19 днів, 20 днів, 25 днів, 30 днів, 40 днів, 50 днів, або 60 днів. Способи збільшення періоду напіввиведення антитіла відомі фахівцям, наприклад, як описано у патенті США Мо 6277375 та міжнародних публікаціях МоМо

УМО 1998/23289 та МО 1997/3461. В деяких варіантах реалізації, період напіввиведення ІІ -ва в місці доставки до мішені, наприклад, склистому тілі, є більшим, ніж системний період напіввиведення, наприклад, період напіввиведення з крові, сироватки, плазми, лімфи, печінки, нирки, або іншої тканини або рідини організму.

В іншому варіанті реалізації, винахід пропонує виріб, що включає контейнер. Контейнер містить композицію, що містить ІІ-ба, розкритий в даному документі, та вкладиш до упаковки або ярлик, де зазначено, що композиція може бути використана для лікування розладу, пов'язаного з 1/-6. Типово, композиція є І/-ба в композиції, яка містить фармацевтично прийнятний ексципієнт.

В деяких випадках, винахід пропонує набір, що містить композицію, яка містить І--ба, розкритий в даному документі, та інструкції щодо введення композиції суб'єкту, що потребує лікування.

У варіантах реалізації в яких бажаним є великий за розміром ІІ -ба, наприклад, для підвищення утримування І/-ба у місці доставки або поблизу до нього, з І -ба може бути асоційований фрагмент, який збільшує розмір, але не має значного негативного впливу на функцію І-ба (наприклад, афінність зв'язування ІЇ/-6б з І/-6б або комплексом 1 -6/ІІ-6В).

Наприклад, Бар може бути генетично модифікованим для експресії у вигляді одного поліпептиду, що містить Раб та Ес-фрагмент.

У варіантах реалізації в яких бажаним є відносно малий розмір І/-ба, можуть бути бо використані фрагменти антитіла ІЇ/-6, наприклад, фрагмент 5сЕм або Раб. Антитіло дО має розмір близько 150 кДа, Раб - близько 50 кДа, і 5сЕм - близько 25 кДа. В деяких варіантах реалізації, ІЇ-ба, описаний в даному документі, має розмір менш ніж приблизно 50 кДа. Такий антагоніст може бути, наприклад, меншим ніж або рівним 50 кДа та більшим ніж 10 кДа, меншим ніж або рівним 50 кДа та більшим ніж 20 кДа, або меншим ніж чи рівним 50 кДа та більшим ніж чи рівним 25 кДа.

В деяких випадках, стабільність антагоніста ІІ -6, наприклад, антитіла або іншого інгібітора, що має дисульфідні зв'язки, поліпшують шляхом створення варіанта, в якому один чи декілька з дисульфідних місточков є більш стабільними, ніж у батьківській молекулі.

Іншою перевагою певних молекул І/-ба, описаних в даному документі, може бути доступність ефективних молекул, що мають розмір, придатний для їх способу доставки, місця доставки, або способу виявлення активності. Наприклад, -ба у форматі Бар може бути використаний для місцевого застосування. Способи конструювання таких молекул описані в даному документі та відомі фахівцям.

Показання/Хвороба, асоційована з 1-6

Хвороби, які можна лікувати ІІ -ба за винаходом, включають хвороби, при яких підвищений

І/-6 асоційований з хворобливим станом або є передумовою хворобливого стану. Такі хвороби включають ті, у яких ангіогенез та запалення, спричинювані І/-6, роблять свій внесок в патологію хвороби. Сюди входять хвороби, при яких І/-б6 є підвищеним у порівнянні з нормальними рівнями, наприклад, хвороби, при яких ІІ -6 є підвищеним у склистому тілі (такі як, наприклад, діабетичний макулярний набряк, діабетична ретинопатія та увеїт) або тканинах ока.

Приклади включають певні хвороби ока, включаючи, без обмеження, сухі очі (наприклад, хворобу сухих очей або сухий кератокон'юнктивіт), алергічний кон'юнктивіт, увеїт, вікову макулярну дегенерацію (ВМД), проліферативну діабетичну ретинопатію (ПДР), діабетичний макулярний набряк (ДМН), регматогенне відшарування сітківки (РВС), оклюзії вен сітківки (ОВС), нейромієліт зорового нерва (НЗН). Інші очні розлади, лікування яких може проводитись, включають спричинені травмою, такою як пересадження рогівки, подряпина рогівки, або іншим таким фізичним ушкодженням ока. Відповідно, винахід включає лікування суб'єкта з хворобою, пов'язаною з ІІ -6, за допомогою ІІ--ба, описаного в даному документі.

В деяких варіантах реалізації, хвороба, асоційована з І -6, є запальною хворобою. В деяких

Зо варіантах реалізації, хвороба є глаукомою.

В деяких варіантах реалізації, хвороба є очним болем.

В деяких варіантах реалізації, лікування суб'єкта також включає визначення того, чи має суб'єкт хворобу, асоційовану з ІІ-6, та, необов'язково, чи є суб'єкт несприйнятливим до інших видів лікування, не пов'язаних з інгібуванням ІІ -6, таких як стероїди або лікарські засоби проти судинного ендотеліального фактора росту (МЕСБ).

Однією проблемою певних лікарських засобів на основі антитіл, ефективних для застосування в конкретному місці, такому як око, наприклад, у склистому тілі, є небажані ефекти, що виникають при системному введенні. Одним з рішень є створення лікарських засобів, що можуть бути доставлені місцево, а не системно, прикладами яких є молекули, описані в даному документі. Оскільки деякі лікарські засоби для місцевої доставки, наприклад, в склисте тіло, будуть, в певному ступені, потрапляти в системний кровообіг, було б бажано сконструювати молекулу, яка б мала відносно швидкий системний кругообіг. Заявники сконструювали приклади антитіла ІЇ/-б6, призначені для швидкого системного кругообігу, наприклад, у порівнянні з батьківською молекулою або референсним антитілом. Це було здійснено шляхом мутації Ес-домену для модифікації зв'язування молекули з ЕсКп, наприклад, для зниження медійованого ЕсКп рециклінга ІІ -ба.

Діабетичний макулярний набряк (ДМН). Діабетичний макулярний набряк (ДМН) включає оклюзію та просочування кровоносних судин сітківки, спричинюючи зниження гостроти зору і, потенційно, сліпоту. Стандартне лікування ДМН включає місцеве введення стероїдів або антитіл проти МЕСЕ. Однак, багато пацієнтів є несприйнятливими до цих терапій. Патогенез діабетичного макулярного набряку включає компоненти ангіогенезу, запалення та окисного стрессу. 1-6 індукується гіпоксією та гіперглікемією і може підсилювати судинне запалення, судинну проникність та патологічний ангіогенез. ІЇ-6 може напряму індукувати експресію МЕСЕ та може промотувати хоріоїдальну неоваскуляризацію в тваринних моделях. У пацієнтів з ДМН, очні рівні І/-б6 позитивно корелюють з товщиною жовтої плями та тяжкістю хвороби.

Повідомлялося, що рівні І/-6 є підвищеними у пацієнтів з невдалою анти-МЕСЕ терапією, але знижуються у пацієнтів, сприйнятливих до засобів проти МЕСРЕ. Відповідно, введення ІЇ-ба, описаного в даному документі, є придатним для лікування діабетиків в комбінації з анти-МЕСЕ лікарським засобом або як альтернатива анти-МЕСЕ лікуванню, в тому числі для пацієнтів, бо несприйнятливих до анти-МЕСЕ терапії. Лікування макулярного набряку за долпомогою ІІ -ба може також підвищувати безпеку за рахунок усунення необхідності повного інгібування одного з механізмів для інгібування патології, таким чином зберігаючи певну частку бажаної фізіологічної ролі кожного цитокіну. Відповідно, місцеве лікування за допомогою І/-ба в комбінації з інібуванням МЕСЕ може зменшити частоту введення доз та знизити небажані ефекти лікування.

При ДМН спостерігається позитивна кореляція між рівнями ІЇ/-б6 у склистому тілі та як тяжкістю хвороби, так і суб'єктами, несприйнятливими до МЕСЕ. Відповідно, ІЇ-ба, описаний в даному документі, може бути використаний для лікування суб'єктів з ДМН, несприйнятливих до стероїдної терапії, анти-МЕСЕ терапії, чи обох. В деяких випадках, ІЇ-ба використовують в комбінації з анти-МЕСЕ терапією або стероїдною терапією, наприклад, для лікування ДМН.

ІЇ-ба, описаний в даному документі, може бути використаний також для лікування розладів, таких як рак, наприклад, рак простати, лейкоз, множинна мієлома, запальні (такі як хронічні запальні проліферативні хвороби) та аутоїмунні хвороби, наприклад, ревматоїдний артрит, хвороба Кастлемана (гігантська або ангіофолікулярна гіперплазія лімфатичних вузлів, лімфоїдна гамартома, ангіофолікулярна гіперплазія лімфатичних вузлів), ювенільний ідіопатичний артрит (включаючи багатосуставний ювенільний ідіопатичний артрит та системний ювенільний ідіопатичний артрит), хвороба Стілла (включаючи ювенільний ідіопатичний артрит та хворобу Стілла дорослих), хвороба Стілла дорослих, АА-амілоїдоз, ревматична поліміалгія, ремітивний серонегативний симетричний синовіт з ямковим набряком, спондилоартрит, хвороба

Бехчета (включаючи лікування очних проявів), атеросклероз, псоріаз, системний червоний вовчак, поліміозит (запальна міопатія), хронічний атрофічний поліхондрит, набута гемофілія А, множинний склероз, анемія запалення, та хвороба Крона.

Антагоністи І/-б6 є також придатними для лікування певних неврологічних хвороб, наприклад, депресії, та хвороби Альцгеймера.

Інші хвороби, які можна лікувати ІЇ-ба, описаним в даному документі, включають, без обмеження, системний склероз, синдром Такаясу, гігантоклітинний артеріїт, хворобу "трансплантат проти хазяїна", та періодичний синдром, асоційований з мутацією гена рецептора фактора некрозу пухлини (ТКАР5Б).

Дозування

Зо Антитіло ІЇ-6 або його фрагмент може бути введене суб'єкту (наприклад, пацієнту) який експресує, наприклад, аномально високі рівні І/-б6. Антитіло або його фрагмент може бути введене однократно, або може бути введене багаторазово. Антитіло може вводитися, наприклад, від трьох разів на день до одного разу на шість місяців чи більше. Введення можуть робитися за графіком, таким як тричі на день, двічі на день, один раз в день, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз на тиждень, раз на два тижня, один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці та один раз на шість місяців. Антитіло або його фрагмент можуть вводитися безперервно за допомогою мініпомпи або іншим шляхом, таким як імплантована капсула з уповільненим вивільненням, або за допомогою інкапсульована клітина, що продукує антитіло або його фрагмент. Антитіло або його фрагмент можуть бути введені мукозальним, букальним, інтраназальним, інгаляцією, внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньом'язовим, парентеральним, інтраокулярним або інтратуморальним шляхом. Антитіло або його фрагмент можуть бути введені один раз, щонайменше двічі або протягом щонайменше період часу проведення лікування, полегшення або зцілення стану. Антитіло або його фрагмент звичайно будуть вводитися доки існує стан. Антитіло або його фрагмент будуть звичайно вводитися як складова фармацевтичної композиції, як описано в даному документі. Дозування антитіла звичайно буде мати значення в діапазоні від 0,1 до 100 мг/кг, від 0,5 до 50 мг/кг, від 1 до 20 мг/кг, та від 1 до 10 мг/кг. Концентрацію у сироватці антитіла або його фрагмента можна виміряти будь-яким придатним способом. Однією ознакою певних сполук, описаних в даному документі, є те, що вони потребують відносно нечастого введення доз, наприклад, один раз на тиждень, два рази на тиждень, три рази на тиждень, один раз на чотири тижня, один раз на два тижня, один раз на 8 тижнів, один раз на 12 тижнів, один раз на 16 тижнів, один раз на 32 тижня, один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці, або один раз на шість місяців. В деяких випадках, сполуку вводять за потребою, що визначається, наприклад, за станом суб'єкта. Ознакою антагоністів І/-б, описаних в даному документі, що дозволяє проводити відносно нечасте введення доз, є комбінація високої ефективності, яка забезпечується, щонайменше частково, низькою швидкістю дисоціації після зв'язування з ЇЇ -6, та можливості доставки відносно високої концентрації сполуки.

В деяких випадках, ІЇ-ба вводять як монотерапію. В інших варіантах реалізації, ІІ -ба вводять разом з метотрексатом або іншим протиартритним лікарським засобом, що впливає на 60 хворобу.

Одержання антитіл

Антитіло ІІ -ба або його похідне чи фрагмент може бути одержане з використанням способів, відомих фахівцям, таких як методи моноклональних антитіл (наприклад, див. Копіег апа міїєтеїп (1975) Маїште 256: 495). Можуть бути використан також інші методики одержання моноклональних антитіл, такі як вірусна або онкогенна трансформація В-лімфоцитів.

Химерні або гуманізовані антитіла можуть бути одержані на основі послідовності мишачого моноклонального антитіла, одержаної з використанням способів, відомих фахівцям. ДНК, що кодує важкий та легкий ланцюги імуноглобуліну, може бути одержана з мишачої гібридоми, що представляє інтерес, та піддана генетичній модифікації для введення не-мишачих (наприклад, людських) послідовністей імуноглобуліну з використанням стандартих методик молекулярної біології. Наприклад, для створення химерного антитіла, мишачі варіабельні ділянки можуть бути з'єднані з людськими константними областями з використанням способів, відомих фахівцям (див. наприклад, патент США Мо 4816567). Для створення гуманізованого антитіла, мишачі ділянки СОК можуть бути вставлені в людську каркасну ділянку з використанням способів, відомих фахівцям (див. наприклад, патент США Мо 5225539, та патенти США МоМо 5530101; 5585089; 5693762; і 6180370).

У варіантах реалізації, І--ба, описаний в даному документі (наприклад, антитіло проти 1-6 або його похідне чи фрагмент), може специфічно зв'язувати людський ІЇ/-6. У варіантах реалізації, І -ба може специфічно зв'язуватися із сайтом І! І -6 (наприклад, сайтом ІЇ людського

І -6).

В деяких варіантах реалізації, І -ба антитіло є людським моноклональним антитілом. Такі антитіла можуть бути одержані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, які містять частини імунної системи людини, а не систему миші. Такі трансгенні та трансхромосомні миші включають "мишей з людським Ід", таких НИМАБ Моизеб та КМ Моизеф (див., наприклад, патенти США МоМо 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; та 5770429; патент США Мо 5545807; публікації РСТ МоМо: УМО 92/03918, УУО 93/12227,

УМО 94/25585, МО 97/13852, МО 98/24884 та МО 99/45962; і публікацію РСТ Мо УМО 01/14424).

В іншому аспекті, людські антитіла проти 1-6 можуть бути одержані з використанням миші, яка несе послідовністі людського імуноглобуліну в трансгенах та трансхромосомах, такої як

Зо миша, що несе трансген людського важкого ланцюга та трансхромосому людського легкого ланцюга. Такі миші описані детально в публікації РСТ Мо МО 02/43478.

Інші системи трансгенних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, є доступними для фахівців і можуть бути використані для одержання антитіла ІІ -ба. Наприклад, може бути використана альтернативна трансгенна система, називана Хепотоизе"м (Ардепіх,

Іпс.); такі миші описані, наприклад, у патентах США МоМо 5939598; 6075181; 6114598; 6150584; та 6162963. Крім того, системи трансхромосомних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, є доступними для фахівців і можуть бути використані для одержання антитіла

І -ба. Наприклад, миші, що несуть як трансхромосому людського важкого ланцюга, так і трансхромосому людського легкого ланцюга, описані у Тоті?ика еї аї. (2000, Ргос Маї! Асайд 5сі

ИБА 97:722-727). Людські моноклональні антитіла також можуть бути одержані з використанням мишей 5СІЮ, яким були введені людські імунні клітини, так щоб при імунізації можна було одержати людську гуморальну імунну відповідь. Такі миші описані, наприклад, у патентах США

МоМо 5476996 та 5698767.

Бібліотеки фагового дисплея

В деяких випадках, антитіло І -ба антитіло або його похідне чи фрагмент продукують способом, який включає синтез бібліотеки людських антитіл з використанням фага, скринінг бібліотеки з використанням 1-6, наприклад, людського ІЇ/-б6 або його фрагмента, виділення фага, що зв'язує ІІ -6, та одержання антитіла з фага.

Рекомбінантне людське антитіло ІЇ-ба також може бути виділене шляхом скринінгу бібліотеки рекомбінантних комбінаторних антитіл. Загалом, бібліотека є бібліотекою фагового дисплея 5сЕм, одержаною з використанням людських кКДНК Мі та МН, одержаних з мРНК, виділеної з В-клітин. Способи одержання та скринінг таких бібліотек є відомими фахівцям.

Набори для створення бібліотек фагового дисплея є комерційно доступними (наприклад,

РПпагтасіа Кесотбіпапі Рпаде Апіїбоду бузіет, Мо за каталогом 27-9400-01; та набір фагового дисплея 5бігаїадепе 5игп2АР'М, Мо за каталогом 240612). Інші способи та реагенти, що можуть бути використані для створення та скринінгу бібліотек дисплея антитіл, є відомими фахівцям (див., наприклад, патент США Мо 5223409; публікації РСТ МоМо УМО 92/18619, УМО 91/17271, МО 92/20791, МО 92/15679, МО 93/01288, УМО 92/01047, МО 92/09690; Риснз еї аї., Віо/Тесппоіоду 9:1370-1372 (1991); Нау еї аЇ., Нит Апіїбод Нубргідотав 3:81-85 (1992); Низе еї аї., Зсієпсе 60 246:1275-1281 (1989); МеСапйенпу вї а!., Маште 348:552-554 (1990); Спінйнз еї аІ., ЕМВО у 12:725-

734 (1993); Намжкіпв еї аї., / Мої! Віо!ї 226:889-896 (1992); Сіаскзоп еї аї., Майте 352:624-628 (1991); Стат єї аї., Ргос Маїї Асай 5сі ОБА 89:3576-3580 (1992); Сатаай еї а!., Віо/Гесппоіоду 9:1373-1377 (1991); Ноодепроот еї аї., Мис Асіа Нез 19:4133-4137 (1991); та Вагбраз еї аї., Ргос

Маї! Асад 5сі ОБА 88:7978-7982 (1991), які усі включені до даного документу шляхом посилання.

У прикладі виділення та продукування людського антитіла /1//-б6 з бажаними характеристиками, людське антитіло І/-б6 спочатку використовують для вибору людських послідовністей важкого та легкого ланцюгів, які мають схожу активність зв'язування по відношенню до ІЇІ--6, з використанням методів імпринтингу епітопа, описаних в публікації РСТ Мо

МО 93/06213, включеній до даного документу шляхом посилання. Бібліотеки антитіл, використовувані в цьому способі, є звичайно бібліотеками 5сЕм, які готують та піддають скринінгу, як описано у публікації РСТ Мо УМО 92/01047; МсСайепу еї аї., Мате 348:552-554 (1990); та сгіййН5 еї аІ., ЕМВО У 12:725-734 (1993), які усі включені до даного документу шляхом посилання.

Після вибору вихідних людських доменів Мі. та УН, проводять експерименти "змішування та комбінування" (птіх апа таїсі), в яких різні пари початково вибраних сегментів Мі та МН піддають скринінгу на зв'язування І/-б6 з вибраними кращими комбінаціями пар МІ Л/Н. Для вибору бажаної ознаки ІЇ-ба, сегменти МІ та/або МН вибраної пари можуть бути випадково мутовані. Таке іп мйго дозрівання афінності може здійснюватися, наприклад, шляхом ампліфікації доменів МН та Мі з використанням ПЛР-праймерів, комплементарних (сотріїтепіагуу до СОК одного чи обох вибраних доменів МН та Мі, де праймери містять випадкову суміш чотирьох нуклеотидних основ в певних положеннях, так щоб одержані продукти ПЛР кодували сегменти УН та МІ з випадковими мутаціями, введеними в МН та/або

МІ. Такі випадково мутовані сегменти МН та МІ можуть бути піддані повторному скринінгу на зв'язування з ІІ-6, наприклад, із сайтом І! ІІ -6.

Після скринінгу та виділення антитіла ІІ -ба з бібліотеки рекомбінантного імуноглобулінового дисплея, нуклеїнові кислоти, що кодують вибране антитіло, можуть бути виділені з набору дисплея (наприклад, з фагового геному) та субклоновані в інші експресійні вектори з використанням методів рекомбінантних ДНК, відомих фахівцям. Такі антитіла можуть бути додатково піддані маніпуляціям з метою одержання фрагмента антитіла, такого як описаний в даному документі.

Фармакокінетика (РК)

Тестування з метою визначення фармакокінетики (РК) може бути проведене з використанням способів, описаних в даному документі, і/або способів, відомих фахівцям.

Однією з перешкод при визначеннях, що потребують використання тварин, наприклад, при визначенні фармакокінетики (РК), є те, що людський ІЇ/-б має менше 50 95 гомології з 1-6 деяких тварин, звичайно використовуваних для такого тестування. Тому один спосіб тестування фармакокінетики полягає у використанні трансгенних мишей, що експресують людський 1-6. В деяких варіантах реалізації, для визначення фармакокінетики використовують примата, який не є людиною.

В деяких варіантах реалізації антитіло проти І/б є мутованим для зміни його фармакокінетики, наприклад, шляхом зміни чутливості зв'язування з ЕсКп до рН. Спосіб одержання таких мутацій описаний у прикладах. Відповідно, в деяких варіантах реалізації, ІІ -ба має змінену системну фармакодинаміку у порівнянні з батьківським І-ба або референсною молекулою. В деяких випадках, фармакодинаміка у склистому тілі не є зміненою або поліпшеною. В деяких варіантах реалізації, І/-ба має знижені показники системной фармакодинаміки (наприклад, зменшений період напіввиведення і/або підвищений кліренс, наприклад, за результатами визначення у циркулюючої рідини, такої як кров, плазма, лімфа або сироватка) у порівнянні з батьківським ІІ-ба або референсною молекулою.

Моделі для тестування антагоніста ІІ -6

Антагоністи ІІ -6 можуть бути протестовані на моделях хвороби на доставку, асоційовану з

І/-6, зокрема, на ефективність лікування та обмежені шкідливі ефекти на кращі властивості ІІ -6.

Наприклад, тестування для увеїту може бути проведене на експериментальній аутоіїмунній моделі увеїту на щурах або мишах (Сабвхрі, Іпме5ї Орпїваїтої Мі5 Зсі 52:1873; Адагмаї еї аї., 900:443-69, 2012) з використанням міжфоторецепторного ретиноїдзв'язуючого білка (ІКВР) для імунізації в повному ад'юванті Фрейнда (СЕА). Інші моделі включають відомі фахівцям моделі індукованого дендритними клітинами увеїту, адоптивного перенесення культивованих ефекторних Т-клітин, спонтанного експериментального аутоімунного увеїту (ЕАМ) у ІКВР ТОК

Тд-мишей, ендотоксин-індукованого увеїту, аутоїмунного увеоретиніту (Нагша еї аї., Іпмеві

Орпійаїтої Мів 5сі 53:3264 (2011); Мовпітига еї а!., Впешитайю!іоду 48:347-354 (2009)). бо Іншими модельними системами, що можуть бути використані для вивчення ефектів ІІ -ба при лікуванні хвороби, асоційованої з 1-6, є, наприклад, модель хоріоїдальної неоваскуляризації (ХНВ) (Ігиті-Мадаї еї аі., Ат ) РаїШйо! 170:6 (2007); КугувіоїїК еї аї., Агсп

Орпннаїтої 120:338 (2002)) та діабетичні моделі, такі як описані у Кегп еї аї. (Апіта! МодеїЇ5 ОЇ ріареїіс Сотріїсайопе Сопзопішт (РОЇ ОК57733), Ордаїє Вероп (Зеріетрег 2001 - дапиагу 2004)). Тваринні моделі, придатні для тестування ІІ--ба при ревматоїдному артриті, є відомими фахівцям, наприклад, див. Аздийй еї аї. (Еиг У Іттипої 39:2040-4 (2009)) та Коїав еї аї. (Апп

Апет бів 70:1357-62 (2011).

ХНВ-моделі є репрезентативними, наприклад, для людських станів ВМД та ДМН. Моделі неоваскуляризації сітківки є корисними, наприклад, для вивчення ішемічних ретинопатій, наприклад, діабетичної ретинопатії або ретинопатії недоношених. Різні моделі хоріоїдальної та ретинальної неоваскуляризації є відомими фахівцям (див., наприклад, сого55пікіаив, Н.Е. еї аї.

Ргод Неїїп Еує Невз. 2010 Мом; 29(6):500-19. дої: 10,1016/).ргеїєуеєегез5, 2010,05,003. Ериб 2010 Мау 19; Заївіп, М єї аї. (2003) Чдоштаї ої Сеїшіаг Рнузіоіоду, 195:241-248; ТаКанавзні, К. еї аї. (2003)

Іпуезіїдайме ОрпіНаІтоїоду є Мівца! бсіепсе, 44(1):409-415; І іта є 5іма, В. єї аї. (2007) ЕАБЕВ 15. ЧУЧоитаї, 21:3219-3230; Тобе еї а. (1998) Атетгісап Уоишгпаї ої Раїйо!іоду, 153(5):1641-1646; бопод, А еї а). (2011) РМАБ, 108(35): 14614-14619; бопо еї а!. (2009) у Сеї! Рнузіо! 219:544-552; Зтійй, І Е еї а. 1994 Іплезі ОрпіїйаІто!ї Мі5 Зсі 1994; 35:101-111; неп, у). єї аїЇ. (2007) Іпмевіїдайме

ОрпійаІтоіоду є Мівца! Зсієпсе, 48(9):4335-4341) і можуть бути використані для дослідження ефективності І-ба. Хоріоїдальная неоваскуляризація (ХНВ) може бути індукована, наприклад, лазерами, світлом, хірургічно, або шляхом генетичної модифікації. Моделі індукованої киснем ретинальної неоваскуляризації є відомими фахівцям та описані, наприклад, у Зтійй, ГЕ еї аї. 1994 Іпуезі Орпійаїтої Мі 5сі 1994; 35:101-111; 5Неп, У. єї аї. (2007) Іпмезіїдайме ОрпінаІтоЇоду в Мізца! бсієпсе, 48(9):4335-4341.

Може бути використана також модель ішемії/реперфузії. Див., наприклад, 7пепод, І. еї аї.

Іпуезіїдайме ОрпіпаІтоїЇоду є мМізца! Зсіепсе, мої. 48 Мо 1 рр. 361-367, 2007. Наприклад, в День 1, голку калібру 30, приєднану до пакету з рідиною, вводять в рогівку анестезованих мишей та внутрішньоочний тиск (ВОТ) підвищують до приблизно 120 мм рт.ст. для створення ішемії.

Через 30-90 хвилин, голку видаляють, ВОТ нормалізується, і відбувається зворотна ретинальна циркуляція. Експресія запальних маркерів, включаючи ТМЕ-йа та ІСАМ-1, може бути оцінена

Зо методом вестерн-блотинга та кількісної ПЛР (кКПЛР) в День 2-6. Додатково, втрату гангліозних клітин можна оцінити шляхом гістології в День 3-14, а дегенерацію капілярів вимірюють методом гідролізу трипсином в День 10-14. Для терапевтичних досліджень, досліджуваний препарат (наприклад, 1 мкл ІЇба з придатною концентрацією, наприклад, 20 мг/мл) вводять ін'єкцією інтравітреально незадовго до або після індукування ішемії.

Комбіновані терапії

В деяких варіантах реалізації, ІІ -ба вводять в комбінації з другим терапевтичним засобом.

Наприклад, ІЇ-ба вводять у схемі лікування, що включає інгібітор МЕСЕ, такий як, наприклад, ранібізумаб. В деяких варіантах реалізації, ІЇ-ба вводять у схемі лікування, що включає інгібітор

РОСЕ, такий як, наприклад, антитіло проти РОСЕ або антитіло проти рецептора РОСЕ (наприклад, іматиніб). В деяких варіантах реалізації, І -ба вводять в комбінації з інгібітором шляху комплементу, наприклад, лампалізумабом (інгібітор фактора 0) або інгібітором С5.

Доставка антагоніста 1-6

Антагоніст І/-б6 або композиція, описані в даному документі, можуть бути доставлені місцево, з прямим контактом з, або поблизу до, клітин або тканини, призначених для інгібування

І/-6. Необмежувальні приклади таких способів доставки включають ін'єкцію, інфузію або імплантацію речовини, що містить антагоніст ІІ--6.

У варіантах реалізації, ІП /-ба або композицію вводять внутрішньоочно, наприклад, інтравітреально, наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції, офтальмологічної вкладки, або генетичної доставки.

В деяких варіантах реалізації, композицію ІЇ/-ба вводять у вигляді офтальмологічної композиції. Способи можуть включати введення композиції І/-ба та офтальмологічно прийнятного носія. В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція є рідиною, напівтвердою речовиною, вкладкою, плівкою, мікрочастинками або наночастинками. Композиція

ІЇ-ба може бути введена, наприклад, місцево або шляхом ін'єкції (наприклад, інтравітреальної ін'єкції).

В деяких варіантах реалізації, композицію ІІ -ба складають для інтравітреального введення.

В деяких варіантах реалізації, композицію І/-ба складають для місцевого введення, наприклад, в око. Композиція для місцевого введення може бути рідкою композицією або напівтвердою, наприклад, композиція для місцевого введення може включати водний розчин, бо водну суспензію, рідку мазь або гель. Офтальмологічна композиція ІІ -ба можуть бути місцево

Зо нанесена на передню частину ока, під верхнє віко, на нижнє віко та в сліпий мешок (си/-де-5асбс).

Типово, офтальмологічна композиція є стерильною. Офтальмологічна композиція ІЇ-ба може містити один чи декілька фармацевтичних ексципієнтів, придатних для приготування офтальмологічних композицій. Прикладами таких ексципієнтів є консерванти, буферні агенти, хелатуючі агенти, антиоксиданти та солі для регулювання осмотичного тиску. Офтальмологічні композиції, включаючи як рідкі мазі, так і суспензії, типово мають в'язкість, придатну для вибраного шляху введення. В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція має в'язкість від приблизно 1000 до приблизно 30000 сантипуаз.

В деяких варіантах реалізації, композиція є рідкою композицією, що містить полімер. Такий полімер може бути використаний для поліпшення біодоступності, підвищення в'язкості, або зниження відтоку з ока рідкої композиції. Придатні полімери включають, без обмеження, описані у УМаднп еї аїЇ. (Авіап У РІіапт, 2:12-17, 2008). В необмежувальних прикладах, полімер є гіалуроназою натрію, хітозаном, циклодекстрином (наприклад, гідроксипропіл-р- циклодекстрином), полігалактуроновою (роїудаїіасіогопіс) кислотою, ксилоглюканом, ксантановою камеддю, гелановою камеддю, тіомером (ІПіотег), полі(ортоефіром) (наприклад,

Еіптанйі, Адм Огид Оеєїїм Вем 53:45-73, 2001), або полісахаридом насіння тамаринду (наприклад,

Спеїагаі єї аї., Апіїтістоб Адепі5 СпетоїНег 48:3396-3401, 2004).

В деяких варіантах реалізації композиція, що містить композицію І -ба для офтальмологічної доставки, може включати один чи декілька з поверхнево-активних речовин, ад'ювантів, буферів, антиоксидантів, регуляторів тонічності, консервантів (наприклад, ЕДТА,

БАХ (бензалконію хлорид), хлорит натрію, перборат натрію, полікватерній-1), загусників або модифікаторів в'язкості (наприклад, карбоксиметилцелюлоза, гідроксиметилцелюлоза, полівініловий спирт, поліетиленгліколь, гліколь 400, пропіленгліколь гідроксиметилцелюлоза, гідроксипропілгуар, гіалуронова кислота, та гідроксипропілделюлоза) тощо. Домішки до композиції можуть включати, без обмеження, хлорид натрію, бікарбонат натрію, сорбінова кислота, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, касторова олія, та перборат натрію.

В деяких варіантах реалізації, в композиції використовують очищену або деїіонізовану воду. рН може бути встановлена шляхом додавання будь-яких фізіологічно та офтальмологічно прийнятних придатних для регулювання рН кислот, основ або буферів в діапазоні значень

Ко) приблизно від 5,0 до 8,5, наприклад, рН 7,0, рН 7,3, рН 7,4, або рН 7,5. Офтальмологічно прийнятні приклади кислот включають оцтову, борну, лимонну, молочну, фосфорну, хлористоводневу тощо, і приклади основ включають гідроксид натрію, фосфат натрію, борат натрію, цитрат натрію, ацетат натрію, лактат натрію, трометамін, трисгідроксиметиламінометан тощо. Приклади солей та буферів, що можуть бути використані в композиції, включають цитрат/декстрозу, бікарбонат натрію, хлорид амонію та суміші вищевказаних кислот та основ.

В деяких варіантах реалізації, осмотичний тиск офтальмологічної композиції може складати від приблизно 10 міліосмоль (мОсм) до приблизно 400 мОсм, наприклад, от 200 до 400 моОсм, або від 220 до 370 мОсм. Звичайно, осмотичний тиск можна відрегулювати за допомогою фізіологічно та офтальмологічно прийнятних солей або ексципієнтів. В деяких варіантах реалізації, композиція включає хлорид натрію, наприклад, хлорид натрію є присутнім в композиції в діапазоні концентрацій від 0,01 95 до 1 95 мас., або від 0,05 95 до 0,45 95 мас., від загальної ваги композиції. Для досягнення осмолярності в бажаному діапазоні значень на додаток до або замість хлориду натрію можуть бути використані також еквівалентні кількісті однієї чи декількох солей, що складаються з катіонів, таких як калій, амоній тощо, та аніонів, таких як хлорид, цитрат, аскорбат, борат, фосфат, бікарбонат, сульфат, тіосульфат, бісульфат, бісульфат натрію, сульфат амонію тощо. В деяких варіантах реалізації, для встановлення осмоляльності також використовують цукор, такий як маніт, декстроза, сорбіт, глюкоза тощо.

В деяких варіантах реалізації, способи передбачають створення або введення депо агента, яке перебуває в контакті із зовнішньою поверхнею ока. Депо стосується джерела агента, яке не видаляється швидко сльозами або іншими механізмами кліренсу ока. Це дозволяє забезпечувати безперервно підтримувані високі концентрації агента, присутнього в рідині на зовнішній поверхні ока при разовому застосуванні. В деяких варіантах реалізації, депо може залишатися протягом періоду до восьми годин чи більше. В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція депо включає, без обмеження, водні полімерні суспензії, рідкі мазі та тверді вкладки.

В деяких варіантах реалізації, напівтверда композиція є рідкою композицією, в'язкість якої зростає після застосування в оці, типово через присутність у рідкій композиції полімеру, для якого зростання в'язкості відбувається при зміні температури, рН або концентрації електроліту.

Полімер може бути, наприклад, ацетофталат целюлози, поліакрилова кислота, геланова 60 камедь, гіалуроназа, хітозан, солі альгінової кислоти (наприклад, альгінат натрію), або блок-

співполімер етиленоксиду та пропіленоксиду (наприклад, плюронік (РійигопісФт), ВАЗЕ; полоксамер). В деяких варіантах реалізації, поліакрилова кислота є зшитою акриловою кислотою (наприклад, карбопол (Сагророк5)). В деяких варіантах реалізації, напівтверда композиція містить суміш карбополу та блок-співполімеру етиленоксиду та пропіленоксиду; суміш метилцелюлози та гідроксіегилцелюлози; або суміш поліетиленгліколю та блок- співполімеру етиленоксиду та пропіленоксиду.

В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція, що містить ІЇ-ба, є рідкою маззю або гелем. В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція є засобом доставки на масляній основі. Наприклад, композиція може включати вуглеводневу (реїгоїеит) або ланолінову основу, до якої додають композицію ІЇ -ба (наприклад, в кількості від 0,1 до 2 Об), та ексципієнти. Звичайні основи можуть включати, без обмеження, мінеральне масло, вазелін та їх комбінації. В деяких варіантах реалізації, рідку мазь наносять у вигляді смужки на нижнє віко.

В деяких випадках, офтальмологічна композиція є офтальмологічною вкладкою. У варіантах реалізації, композицію вводять інтравітреально за допомогою офтальмологічної вкладки.

Наприклад, офтальмологічна вкладка є біологічно інертною, м'якою, біоеродованою, в'язкопружною, стабільною при стерилізації після обробки терапевтичними агентами, стійкою до інфекцій бактеріями, переносимими у повітрі, біоеродованою, біосумісною та/або в'язкопружною. В деяких варіантах реалізації, вкладка включає офтальмологічно прийнятну матрицю, наприклад, полімерну матрицю. Матриця типово є полімером і композиція ІІ -ба диспергується усередині матриці або зв'язується з полімерною матрицею. В деяких варіантах реалізації агент повільно вивільняється з матриці шляхом розчинення або гідролізу ковалентного зв'язку. В деяких варіантах реалізації, полімер є біоеродованим (розчинним) і його швидкість розчинення може контролювати швидкість вивільнення диспергованого в ньому агента. В іншій формі, полімерна матриця є біодеградованим полімером, який руйнується, наприклад, гідролізом, тим самим вивільняючи зв'язаний з ним або диспергований в ньому агент. В додаткових варіантах реалізації, матриця та агент можуть бути оточені додатковим полімерним покриттям для додаткового контролю вивільнення. В деяких варіантах реалізації, вкладка включає біодеградований полімер, такий як полікапролактон (ПКЛ), співполімер

Зо етилену/вінілацетату (ЕМА), поліалкілціаноакрилат, поліуретан, найлон або полі(аІ-лактид-ко- гліколід) (РІСА), або співполімер будь-чого із зазначеного. В деяких випадках, агент диспергують в матеріалі матриці, або диспергують в мономерній композиції, використовуваній для виготовлення матеріалу матриці, до полімеризації. В деяких варіантах реалізації, кількість агента складає від приблизно 0,1 до приблизно 50 95, або від приблизно 2 до приблизно 20 95.

Біодеградована або біоеродована полімерна матриця може бути використана так, щоб відпрацьовану вкладку не треба було видаляти з ока. По мірі деградації або розчинення біодеградованого або біоеродованого полімеру, агент вивільняється.

В додаткових варіантах реалізації, офтальмологічна вкладка включає полімер, включаючи, без обмеження, описані в УмМаді, еї аї., "РоїЇутег5 изей іп осшіаг дозаде їТогт апа агид аеїїмегу вубвівт5", Авіап у). РНапт., раде5 12-17 (Шапиагу 2008), яка включена до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. В деяких варіантах реалізації, вкладка включає полімер, вибраний з полівінілпліролідону (РМР), акрилатного або метакрилатного полімеру або співполімеру (наприклад, сімейство полімерів Ешдгадів виробництва Копйт або Редивза), гідроксиметилцелюлози, поліакрилова кислота, полі(амідоамін) дендримери, полі(диметилсилоксан), поліетиленоксид, полі(лактид-ко-гліколід), полі(2- гідроксіетилметакрилат), полівініловий спирт), або полі(пропіленфумарат). В деяких варіантах реалізації, вкладка включає СепйоатФт». В деяких варіантах реалізації, вкладка є кон'югатом поліакрилової кислоти 450 кДа-цистеїну.

Вкладка може включати серцевину, яка містить композицію І/-ба та зовнішню трубку (наприклад, як описано в публікації патенту США Мо 20040009222). В деяких випадках, зовнішня трубка може бути проникною, напівпроникною, або непроникною для лікарського засобу. В деяких варіантах реалізації, серцевина включає полімерну матрицю, яка не має значного ефекту на швидкість вивільнення композиції ІЇ-ба. В деяких випадках, зовнішня трубка, полімерна матриця серцевини, або обидві, є біоеродованими. Коекструдований продукт може бути сегментованим на засоби доставки ліків. В деяких варіантах реалізації, засіб не має покриття, так щоб його відповідні кінці були відкритими, або засіб покритий, наприклад, шаром, що є проникним для композиції ІІ -ба, напівпроникним для композиції ІІ -ба, або біоеродованим.

В певних варіантах реалізації, композиція І -ба та щонайменше один полімер змішуються в порошкоподібній формі. бо В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція є офтальмологічною плівкою.

Полімери, придатні для таких плівок, включають, без обмеження, описані в Умадн, еї аї. (зирга).

В деяких варіантах реалізації, плівка є м'якою контактною (сопігасі) лінзою, наприклад, лінзою, що складається з співполімерів М, М-діетилакриламіду та метакрилової кислоти, зшитих етиленглікольдиметакрилатом.

В певних варіантах реалізації, І -ба розташований у вкладці, яка має трубчасту форму, і може бути сегментованою.

В деяких варіантах реалізації, композиція ІЇ-ба складається з терапевтично ефективної кількості, з покриттям з, або диспергованої в, полімерній матриці, так щоб композиція ІІ -ба мала гранульовану або дисперсну форму. В деяких варіантах реалізації, композиція ІІ -ба вивільняється з лікарського засобу по мірі того, як лікарська речовина з гранул розчиняється в або усередині матриці, дифундує через матрицю, та вивільняється в навколишню фізіологічну рідину. В деяких варіантах реалізації, швидкість вивільнення обмежена переважно швидкістю розчинення композиції І -ба з гранул/частинок в матриці; стадії дифузії через матрицю та диспергування у навколишній рідині переважно не обмежують швидкість вивільнення. В певних варіантах реалізації, полімерна матриця є не-біоеродованою, у той час як в інших варіантах реалізації вона є біоеродованою. Типові приклади не-біоеродованих полімерних матриць можуть бути сформовані з поліуретану, полісилікону, полі(етилен-ко-вінілацетату) (ЕМА), полівінілового спирту та їх похідних та співполімерів. Типові приклади біоеродованих полімерних матриць можуть бути сформовані з поліангідриду, полімолочної кислоти, роїугліколевої кислоти, поліортоефіру, поліалкілціаноакрилату, та їх похідних і співполімерів.

В деяких випадках, композиція ІЇ-ба виготовлена з колагенового матеріалу. Наприклад, вкладка може бути розчинною вкладкою з офтальмологічним лікарським засобом (наприклад, овальною полімерною плівкою, яка може бути введена в верхній кон'юнктивальний мішок для доставки лікарського засобу; еліптичною вкладкою, такою як ОСОБЕКТФ (очна терапевтична система з пілокарпіном, розроблена АїІла Согрогаййоп), виготовлена з етилену-вінілацетату;

Ї асгізеп(, вкладка у формі стрижня, виготовлена з целюлози; нові системи доставки офтальмологічних лікарських засобів (МОЮ5), виготовлені з полі(вінілового спирту); або вкладки, такі як описані у Рабгіліо (Адм Огид Оеїїм Кем 16: 95-106, 1998). В деяких випадках, вкладка включає колаген, желатин або полімер, причому полімер вибирають з полікапролактону

Зо (ПКЛ), співполімеру етилену/вінілацетату (ЕМА), поліалкілціаноакрилату, поліуретану, найлону, полі-(аІ-лактиду-ко-гліколіду) (РІ СА), або співполімеру будь-чого із зазначеного. В деяких випадках, вкладка імплантується під верхнє віко. В деяких випадках, вкладка імплантується в задній сегмент ока, в хоріоїдальний простір, або в склеру. В деяких варіантах реалізації, вкладка імплантується інтравітреально або субретинально. В деяких варіантах реалізації, вкладку вводять ін'єкцією субретинально. Способи введення та методики їх одержання викладені в Кетіпдіоп'є: Тпе Ргасіїсе ої Зсіепсе ої Рпагтасу, 207 еайіоп (Іірріпсой УУ/Шіатв 5

УМІКіп5, 2006), яка включена до даного документу шляхом посилання в повному обсязі.

В інших варіантах реалізації, вкладка, що містить композицію ІІ -ба, забезпечує уповільнене вивільнення агента в склисте тіло ока. У використовуваному в даному документі значенні, "уповільнене вивільнення" означає, що композиція вивільняє агент контрольовано протягом тривалого періоду часу. В деяких варіантах реалізації, вкладка вивільняє агент з такою швидкістю, щоб водна концентрація агента залишалася менше концентрації агента у склистому тілі в процесі вивільнення. В деяких варіантах реалізації, водна концентрація агента становить від приблизно 0,002 мкг/мл до приблизно 0,01 мкг/мл або від приблизно 0,01 мкг/мл, до приблизно 0,05 мкг/мл, або менш ніж приблизно 0,05 мкг/мл. В деяких варіантах реалізації, агент вивільняється зі швидкістю від приблизно 1 мкг/день до приблизно 50 мкг/день, або від приблизно 1 мкг/день до приблизно 10 мкг/день. В деяких варіантах реалізації, вкладка додатково містить додатковий терапевтичний агент, як описано вище, наприклад, флуосцинолон ацетонід (такий як використовуваний в офтальмологічній вкладці КеїїзегіФ)).

В деяких варіантах реалізації, офтальмологічна композиція включає мікросфери або наночастинки. В деяких варіант реалізації, мікросфери включають желатин. В деяких варіантах реалізації, мікросфери вводять ін'єкцією в задній сегмент ока, у хоріоїдальний простір, в склеру, інтравітреально або субретинально. В деяких варіантах реалізації, мікросфери або наночастинки містять полімер, включаючи, без обмеження, описані в Умадн, еї аї. (Авіап У Рпагт 2:12-17, 2008). В деяких варіантах реалізації, полімер є хітозаном, полікарбоновою кислотою, такою як поліакрилова кислота, альбумінові частинки, складні ефіри гіалуронової кислоти, поліїтаконова кислота, полі(бутил)ціаноакрилат, полікапролактон, полі(ізобутил)капролактон, полі(молочна кислота-ко-гліколева кислота), або полі(імолочна кислота). В деяких варіантах реалізації, мікросфери або наночастинки включають тверді ліпідні частинки. бо В деяких варіантах реалізації, композиція І -ба включає іонообмінну смолу. В деяких варіантах реалізації, іонообмінн смола є неорганічним цеолітом або синтетичною органічною смолою. В деяких варіантах реалізації, іонообмінна смола включає, без обмеження, описані в

Умаздн, еї аї., зирга, яка включена до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. В деяких варіантах реалізації, іонообмінна смола є частково нейтралізованою поліакриловою кислотою.

Композиція ІЇ-ба може бути одержана у вигляді водної полімерної суспензії. В деяких варіантах реалізації, композицію ІЇ-ба або полімерний суспендувальний агент суспендують у водному середовищі (наприклад, з властивостями, описаними вище). Приклади полімерних суспендувальних агентів включають, без обмеження, декстрани, поліетиленгліколі, полівінілпіролідон, полісахаридні гелі, СеїшетФф, целюлозні полімери, такі як гідроксипропілметилцелюлоза, та карбоксилвмісні полімери, такі як полімери або співполімери акрилової кислоти, а також інші полімерні речовини, що знижують подразнення. В деяких варіантах реалізації, полімернми суспендувальний агент є нерозчинним у воді полімером який, набухає у воді, особливо, зшитим карбоксилвмісним полімером. В деяких варіантах реалізації, полімерний суспендувальний агент включає від щонайменше приблизно 90 95 до приблизно 99,9 95, або від приблизно 9595 до приблизно 99,9 95 мас., від загальної ваги присутніх мономеров, одного чи декількох карбоксилвмісних моноетиленненасичених мономерів. В деяких варіантах реалізації, карбоксилвмісний моноетиленненасичений мономер включає акрилову кислоту, метакрилову кислоту, етакрилову кислоту, метилакрилову кислоту (кротонову кислоту), цис-альфа-метилкротонову кислота (ангелікову кислоту), трано-а-метилкротонову кислоту (тиглінову кислоту), а-бутилюротонову кислоту, альфа-фенілакрилову кислоту, а- бензилакрилову кислоту, а-циклогексилакрилову кислоту, фенілакрилову кислоту (коричну кислоту), кумарову кислоту (о-гідроксикоричну кислоту) та умбелову кислоту (п- гідроксикумарову кислоту). В деяких варіантах реалізації полімер є зшитим за допомогою поліфункціонального зшивального агента (наприклад, дифункціонального зшивального агента).

В деяких варіантах реалізації, вміст зшивального агента становить від приблизно 0,01 95 до приблизно 5 95, або від приблизно 0,1 95 до приблизно 5,095, або від приблизно 0,2 95 до приблизно 195, від загальної ваги присутніх мономерів. В деяких варіантах реалізації, зшивальні агенти є не-поліалюеенільними поліефірними дифункціональними зшивальними мономерами, такими як дивінілгліколь, 2,3-дигідроксигекса-1,5-дієн, 2,5-диметил-1,5-гексадієн, дивінілбензол, М, М-діалілакриламід, М, М-діалілметакриламід; поліалкенільними поліефірними зшивальними агентами, що містять дві чи більше алкенільні прості ефірні групи на молекулу, наприклад, алкенільні прості ефірні групи, які містять кінцеві групи НеС-С, одержаними шляхом етерифікації багатоатомного спирту, що містить щонайменше чотири атоми вуглецю та щонайменше три гідроксильні групи, алкенілгалогенідом, таким як алілбромід тощо, наприклад, поліалілсахарозою, поліаліллентаеритритом тощо; діолефіновими не-гідрофільними макромерніми зшивальними агентами, що мають молекулярну вагу від приблизно 400 до приблизно 8000, такими як нерозчинні діакрилати та поліакрилати і метакрилати діолів та поліолів, діїзоціанатгідроксіалкілакрилатні або -метакрилатні продукти реакції преполімерів з кінцевими ізоціанатними групами, похідними від складних поліефірдіолів, простих поліефірдіолів або полісилоксандіолів, з гідроксіалкілметакрилатами тощо.

В деяких варіантах реалізації зшиті полімери одержують з карбоксилвмісного моноетиленненасиченого мономера або мономерів як єдиного присутнього моноетиленненасиченого мономера, разом із зшивальним агентом або агентами. В деяких варіантах реалізації, полімери є такими, у яких до приблизно 40 95, і краще, від приблизно 0 95 до приблизно 20 95 мас., карбоксилвмісного моноетиленненасиченого мономера або мономерів було заміщено на один чи декілька не-карбоксилвмісних моноетиленненасичених мономерів, що містять тільки фізіологічно та офтальмологічно нешкідливі замісники, включаючи складні ефіри акрилової та метакрилової кислот, такі як метилметакрилат, етилакрилат, бутилакрилат, 2-етилгексилакрилат, октилметакрилат, 2-гідроксіетилметакрилат, З-гідроксипропілакрилат тощо, вінілацетат, М-вінілпіролідон тощо (наприклад, МиеПег еї аЇ., патент США Мо 4548990). В деяких варіантах реалізації, полімери включають полікарбофіл (Момеоп АА-1), карбопол (Сагророке), та ОЮигазпйе?т?. В деяких варіантах реалізації, зшиті полімери одержують суспензійною або емульсійною полімеризацією мономерів, з використанням звичайних каталізаторів вільнорадикальної полімеризації, з розміром частинок у сухому стані не більш ніж приблизно 50 мкм за еквівалентним сферичним діаметром. В деяких варіантах реалізації, середній розмір частинок у сухому стані становить від приблизно 1 до приблизно 30 мкм, або від приблизно З до приблизно 20 мкм за еквівалентним сферичним діаметром. В деяких варіантах реалізації, полімерні частинки одержують шляхом механічного помелу більших за бо розміром полімерних частинок. В додаткових варіантах реалізації, такі полімери будуть мати молекулярну вагу від приблизно 250000 до приблизно 4000000, і від 3000000000 до 4000000000. В інших варіантах реалізації, частинки зшитого полімеру є монодисперсними, тобто, вони мають такий розподіл частинок за розміром, щоб щонайменше приблизно 80 95, приблизно 9095 або приблизно 9595, частинок потрапляли до мікронної смуги широкого розподілу частинок за розміром. В додаткових варіантах реалізації, монодисперсний розмір частинок означає, що не більш ніж приблизно 20 95, приблизно 10 95, або приблизно 5 95 частинок мають розмір менше 1 мкм. В деяких варіантах реалізації, водна полімерна суспензія включає від приблизно 0,05 до приблизно 1 95, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5 95, або від приблизно 0,1 до приблизно 0,595, агента, та від приблизно 0,1 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 до приблизно 6,5 95, від приблизно 0,5 до приблизно 2,0 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 1,2 95, від приблизно 0,6 до приблизно 0,9 95, або від приблизно 0,6 до приблизно 0,8 96, полімерного суспендувального агента. Хоча він згадується в однині, слід розуміти, що один чи декілька видів полімерного суспендувального агента можуть бути використані, причому їх загальна кількість відповідає вказаним діапазонам значень. В одному варіанті реалізації, кількість нерозчинних слабозшитих полімерних частинок, величина рН, та осмотичний тиск можуть корелювати між собою та зі ступенем зшивання, для одержання композиції, яка має в'язкість в діапазоні від приблизно 500 до приблизно 100000 сантипуаз, і краще від приблизно 1000 до приблизно 30000, або від приблизно 1000 до приблизно 10000 сантипуаз, вимірювану при кімнатній температурі (близько 25 "С) з використанням віскозиметра ВгоокіїєїЯ Оідна! ІМТ, обладнаного шпінделем Ме 25 та адаптором для малих зразків 1З3К, при 12 об/хв. В деяких варіантах реалізації, в'язкість становить від приблизно 10 до приблизно 400 сантипуаз, від приблизно 10 до приблизно 200 сантипуаз, або від приблизно 10 до приблизно 25 сантипуаз.

В деяких варіантах реалізації, водні полімерні суспензії можуть бути складені таким чином, щоб вони зберігали таку саме або по суті таку саме в'язкість в оці, як та, що вони мали до введення в око. В деяких варіантах реалізації, вони можуть бути складені таким чином, щоб при контакті зі слізною рідиною відбувалося посилене гелеутворення. Наприклад, коли композицію, що містить Юигазйеф або інший подібний полімер типу поліакрилової кислоти, вводять в око при рН менш ніж приблизно 6,7, полімер може набухати при контакті зі слізною рідиною, оскільки він має більш високий рН (близько 7). Це гелеутворення або посилення гелеутворення може приводити до захоплення суспендованих частинок, тим самим збільшуючи час перебування композиції в оці. В деяких варіантах реалізації, агент повільно вивільняється по мірі розчинення суспендованих частинок протягом тривалого часу. В деяких варіантах реалізації, цей шлях доставки підвищує відчуття комфорту у пацієнта та збільшує час контакту агента з тканинами ока, тим самим підвищуючи ступінь абсорбції лікарського засобу та тривалість дії композиції в оці. Агенти, які містять ці системи доставки лікарського засобу, будуть вивільнятися з гелів зі швидкостями, що залежать від таких факторів, як власне лікарський засіб та його фізична форма, вміст активної речовини в препараті та величина рн системи, а також від будь-яких ад'ювантів, використовуваних для доставки лікарського засобу, таких як іонообмінні смоли, сумісні з поверхнею ока, які також можуть бути присутніми.

В деяких варіантах реалізації, антагоніст ІІ -6 надається суб'єкту з використанням генетичної доставки, наприклад, місцевої генетичної доставки. Така доставка може здійснюватися за допомогою транзієнтної експресійної системи, стабільної (наприклад, інтегрованої) експресійної системи, такої як лентивірусна система доставки виробництва фірми Вішнебіга Віо (Сатьгідде,

МА), або доставки в клітинній фабриці, такій як ті, що виробляються фірмою Меигоїесйп (Ситрепапа, Аподе ІвІапа).

Усі технічні ознаки можуть бути індивідуально поєднані в усіх можливих комбінаціях таких ознак.

ЕКВІВАЛЕНТИ

Винахід може бути втілений в інших конкретних формах без виходу за межі його суті або суттєвих характеристик. Вищевказані варіанти реалізації тому мають вважатися в усіх відношеннях ілюстративними, а не обмежуючими винахід, описаний в даному документі.

ПРИКЛАДИ

Наведені далі необмежувальні приклади додатково ілюструють варіанти реалізації винахідів, описаних в даному документі.

Приклад 1: Підтвердження місцевої блокади ІІ -6 у моделі хоріоїдальної неоваскуляризації (ХНВ)

Для визначення того, чи може місцева блокада 1-6 бути ефективною для лікування хвороби ока, наприклад, діабетичного макулярного набряку (ДМН) або вологоь ВМД, антитіло проти ІІ -6 було місцево введене з використанням модельної системи хоріоїдальної неоваскуляризації. 60 Індукована лазером модель ХНВ (еуесго.соп/іп-мімоЛазег-іпдисед-спогоїдаІ-пеомазсціагігайоп-

спм/) відтворює багато патологічних процесів, що лежать в основі ДМН, включаючи запалення та ангіогенез. Дослідження проводили на щурах в ЕуеСКО (ОКіайота Сйу, ОК). Шести тваринам в кожній групі проводили двобічну лазерну обробку в День 0 для створення трьох уражень на око. В дні З та 10, З мкг поліклонального антищурячого антитіла 1-6 (ВО бузіет5

АР506; Міппеароїї5, ММ) вводили тестованій групі інтравітреальною (ІМТ) ін'єкцією, у той час як фосфатно-сольовий буфер (ФСБ) або поліклональне антитіло проти МЕСЕ (КО Бу«ет5

АР5Ьб4) вводили групам носія та позитивного контролю, відповідно. Іп мімо ангіографію проводили в дні 15 та 22 з метою вимірювання площі ураження. В дні 15 та 22, група, що отримувала засіб проти І//-6, мала значно знижену неоваскуляризацію у порівнянні з контрольним носієм. Не спостерігали значної різниці у відповіді між групою, що отримувала засіб проти 1І/-6, та позитивним контролем із засобом проти МЕОБ. Фіг. 1 показує результати такого експерименту. Ці дані демонструють, що І-ба, наприклад, антитіло проти І6, введений інтравітреально (ІМТ), може знижувати неоваскуляризацію в щурячій моделі ХНВ до рівнів, близьких до позитивного контролю із засобом проти МЕСЕ (р-0,0054 в День 15 та р-00005 в

День 22 для засобу проти ІІ -6 порівняно з контрольним носієм).

Ці дані показують, що місцева блокада 1-6 може бути придатною для лікування хвороб ока, таких як хвороби, пов'язані із судинним просочуванням, наприклад, макулярного набряку.

Приклад 2: Кандидати-антагоністи антитіла 1-6

Кандидати-антагоністи антитіла І/-6 були розроблені з використанням процесу, який починається з імунізації. Імунізації проводила за вказівками авторів винаходу контрактна дослідницька організація (СКО). П'яти мишам ВАГВ/С вводили ін'єкцією підшкірно 80 мкг людського 1-6 (КО Зузіетв5, Мо за каталогом 206-П/СЕ, Міппеароїї5, ММ) в ФСБ, що містить 1

М Масі з ад'ювантом Фрейнда (Егеца). Робили дві бустерні ін'єкції 80 мкг та 50 мкг І-6. У мишей з найвищим титром брали клітини селезінки та зливали з клітинами мієломи РЗ х 763А98.653 для утворення гібридом.

Супернатанти гібридом піддавали скринінгу на зв'язування //-б та антагонізм. Для проведення аналізу зв'язування методом ЕГІЗА (твердофазового імуноферментного аналізу), планшети Созіаг 9018 покривали 1 мкг/мл людського 1-6 в ФОБ протягом ночі при 4 "С. Лунки блокували за допомогою ФСБ, що містить 2 95 бичачого сироваточного альбуміну (БСА),

Зо промивали, і потім інкубували з 50 мкл супернатанта кожної гібридоми, розведеного 1:2 ФСБ, що містить 2 95 БСА. Через 60 хвилин, лунки промивали три рази 300 мкл ФСБ, що містить 0,195 Глуееп-20. Потім додавали в кожну лунку антимишачу пероксидазу (апіі-тоизе-НАР), розведену 1:3000 в ФОБ-БСА та інкубували протягом 30 хвилин. Лунки промивали, як описано вище, а потім додавали субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) та вимірювали сигнал при 450 та 550 нм. Для досліджень антагонізму, репортерні клітини НЕК-Віце "м-І| 6 (Іпмімосеп, Зап рієедо, СА) інкубували зі зростаючими концентраціями людського ІІ -6 у присутності розведеного 1:10 супернатанта гібридоми. Через 20-24 годин, 20 мкл супернатанта змішували з 180 мкл

ОцапііВіне "м (Іпмімосеп) та вимірювали поглинання при 655 нм.

На основі досліджень зв'язування та антагонізму, гібридома 64 була вибрана заявниками як як найбільш перспективна та субклонована в СКО. Гібридома 64 (мишача моноклональна) була додатково протестована на здатність інгібувати зв'язування комплексу ІІ -6/І/-6бКа з др130 методом твердофазового імуноферментного аналізу (ЕГІ5А). Гібридома 64 при концентрації 1,5 мкг/мл значно знижувала зв'язування комплексу ІІ-6/ЛІ/-бКа з іммобілізованим одр130 за результатами аналізу ЕГІЗА (Фіг. 2).

Субклони були піддані повторному скринінгу і варіабельні домени субклону 64.58 були ампліфіковані шляхом 5" КАСЕ ПЛР та секвеновані. Послідовністі мишачих варіабельних доменів (позначені як Ітб4) є такими:

МН тва (варіабельний домен важкого ланцюга)

ОМОГ ОО5САЕЇ МАРОТЗУКУЗСКАБИаМАЄЗМУ ТЕМ УКОВРИаСаї ЕМІСМІТРИБОТІМММЕКЕ

КаТкаАМІ ТАОК55ЗТУММОЇ 55 Т5ВОБАММЕСАКЗАМОРІ МУМАГ ЕМУСОСТОЗУТУО (5ЕБО І

МО:13)

МІ. тба4і (варіабельний домен легкого ланцюга)

РІМГТОЗРАБІ АМ5І Чад ВАТІЗСВАЗЕЗМОММСІЗЕММУУ ЕООКРИООРРК ППМААЗМОСЗИаМРАВ

ЕЗзаБавБатоЕ5І МІНРМЕЕООТАМУЕЄСОО5КЕМУРІ ТЕСАСТКІ ЕІ К (5ЕО 10 МО:14)

Для створення гуманізованих послідовністей, гіперваріабельні ділянки пб4 (СОК) переносили на каркасну область зародкової лінії людини, вибрану за ступенем подібності до мишачої послідовності за допомогою обчислювального алгоритму. Гуманізовані послідовністі (позначені пб4) були такими (змінені залишки у порівнянні з послідовністями Ітб64 підкреслені) та мали приблизно 79,595 ідентичності (МН) та 84,495 ідентичності (М) з мишачими 60 послідовністями:

МН нбва

ОМОЇ МОБСАЕУККРОБЗУКУЗСКАБаИахАєЗММ ТЕМУ ВОАРООСІ ЕМ МОаМмІТРОБИаИТтТІММАОКЕ

ОСВМПІТАСЕЗТЗТАМУМЕЇ 551 ВБЕДТАУУУСАВЗАУМОРІ УУМАГ ЕУМУСОСТТМТУ55 (ЗЕБЕО І

МО:15)

МІ пба

РІММТО5РОБІ АУБІ ЕВАТІМСВАЗЕЗМОММСИаЗЕММУ ХООКРООРРКІ ПМААЗМОСОУПД

РЕЗБОБОЗСОТОНЕТІ ТІЗБІ ОДЕОМАМУМСОО5КЕМУРІ ТЕСОСТКІ ЕК (ЗЕО І МО:16)

Гуманізовані послідовністі були синтезовані фірмою ОМА2.0 (Мепіо РагК, СА), потім клоновані в експресійні вектори, одержані з рсОМАЗ.1 як вбудовуване злиття (іпіїпе Ти5іоп5) з константними доменами людського ІдсС1. дб експресували транзієнтною трансфекцією в клітини ЕгеевіуЇе "М-293 (Іпийгодеп, Сстапа Івзіапа, МУ) та очищали хроматографією на білку А. В дослідженнях як зв'язування, так і антагонізму, пб4 дб демонстрували значно знижену ефективність у порівнянні зі своїм попередником тб4. Тому використовували дріжджовий дисплей для відновлення втраченої афінності.

Для проведення дозрівання афінності, призначеного для відновлення або поліпшення афінності гуманізованого пб41ІдО, послідовністі антитіла пб4 повторно клонували в дріжджових векторах на основі руС2/СТ для одержання молекули Раб, у якій ланцюг РарН був злитий з анти-РІТС 5сЕм 4т5.3 через лінкер (545)3 (ЗЕО І МО: 29). Потім генерували бібліотеку варіантів п64 шляхом помилково спрямованої ПЛР згідно з протоколом Спао еї аї. (2006, Маїиге

Ргоїосо!5, 1:755-768). Варіанти Нб4 експресували та захоплювали на поверхні дріжджів, мічених

ЕІТО-РЕС-МНВ, потім інкубували з біотинільованим людським 1-6. Зв'язаний 1-6 детектували стрептавідином-АРС, і клітини з найбільшою кількістю зв'язаного ІЇ-б6 порівняно з кількістю виставлених Барх5 вибирають на клітинному сортері ВО РГАСсСЗАГгіа "М. Після чотирьох раундів селекції відбирають та секвенують популяцію варіантів з більш високою афінністю.

Послідовність клона, вибраного шляхом дозрівання афінності (позначений пб4-1.4) наведена далі, причому вибрані мутації (тобто, мутовані у порівнянні з послідовностями МН та МІ. пб4) виділені жирним шрифтом і СОР. підкреслені. Представлені варіабельні домени 018 (а також молекул 020 та 029 ІЇ -ва, описані нижче). Зазначимо, що повні Гар5 включають домени СК та

СНІ ІдС1. В контексті даної заявки, посилання на амінокислотну послідовність важкого ланцюга

Зо або легкого ланцюга "Бар" означає, що послідовність може бути частиною функціюнуючого Раб, що складається з послідовності, одержаної з легкого ланцюга, та послідовності, одержаної з важкого ланцюга.

МН Нба-1.4 (018УН) (варіабельний домен)

ОМОЇ МОБСАЕУККРИЗБЗУКУЗСКАБИахАСЗММ ТЕМ УАВОАРОССІ ЕУ Мам РОБЗСТІММАОКЕ

ОСЕМТІТАРЕ5ЗТЗТАММЕЇ 551 ЕЗЕДТАМУУСАКЗАМОРІ УМА ЕМУСОСТТМТУ55 (ЗБОЮ

МО:17)

МІ. нба-1.4 (018М1) (варіабельний домен)

РІММТО5РОБІ АУ5БІ ЧЕВАТІМСВАЗЕБМОММИаї! Р ЕММУ МУООКРИООРРК ІМААЗМНИавОМУПДР

Езававатов ТЗІ ОАЕОМАМУУСООЗЕЕМРІ ТРООСТКІ ЕІКАТМ (З5ЕО ІЮ МО:18)

Варіабельні домени п64-1.4 повторно клонували у вектор реОМАЗ.1 людського ДС1 та експресували у вигляді повнорозмірного Їдс1 в клітинах Егеезіуе "М-НЕК293 (І Ше Тесппо!одієв).

Одержаний очищений ІдС був значно активнішим, ніж вихідне антитіло п64 за результатами досліджень як зв'язування, так і клітинного антагонізму. За результатами тестування афінності з використанням системи дріжджів, афінність зростала з 343 пМ для вихідної гуманізованої молекули до 43 пМ. Ефективність антагоніста зросла приблизно у десять разів за результатами визначення з використанням системи клітин НЕК-Віше. пб4-1.4 Дб переформатували у вигляді Бар для застосування в очах та за іншими показаннями. Додатково, був проведений ще один раунд генерування бібліотеки та селекції на основі дріжджів для додаткового підвищення афінності. Після чотирьох раундів селекції, у варіанті МН спостерігалося значне збагачення мутацією А79М. Антитіла, їх варіанти та фрагменти, що включають варіант А79М, позначені як 019 антитіла ІІ -ба, їх варіанти та фрагменти.

Приклад 3: Вибір формату

Для дослідження придатних форматів для антагоніста 1-6 на основі антитіл, антитіла 1-6, вибрані, як описано вище, тестують на транзієнтну експресію, стабільність, здатність до агрегації, афінність зв'язування, та ІС50, з використанням Рабр, зсЕм(Мн-мМі) та зсЕм(Мі-Мн) форм послідовністей 018.

Результати цих досліджень для одного з кандидатів молекули ІІ -ба (послідовністі, що містять варіабельну ділянку 018), представлені у Таблиці 1. (510)

Таблиця 1

Агрегаця (ЗЕС, МА) | 77 Ні | 7777 так | 7777 нд

Ці дані демонструють спосіб ідентифікації ключових ознак різних форматів антагоніста 1-6 на основі антитіла та показують, що для антагоністів ІІ -6, які містять варіабельні ділянки 018, формат 018Бар має найкращі ознаки в більшості ключових категорій, тобто, експресії, стабільності, агрегації та афінності зв'язування у порівнянні з конфігурацією 5сЕм. Величина

ІС5О для 018 Рар потрапляє до діапазону, прийнятного для терапевтичного застосування.

Приклад 4: Приклади антитіл ІІ -ба, фрагментів та похідних

Заявники ідентифікували наступні послідовністі з використанням способів, описаних в даному документі. Підкреслені послідовністі позначають СОК важкого та легкого ланцюгів. Інші послідовністі наведені в інших розділах опису винаходу.

Поліпептидна послідовність важкого ланцюга 018 (повнорозмірний; ПО18НС) в каркасі Ідес1

ОМОЇ МОБСАЕУККРИаББЗУКУЗСКАБаИхмА!І ММ ІТЕМУАОАРООСІ ЕМ Мам ТРОБОТІММАОКЕ

ОСЕМТІТАРЕ5ЗТЗТАММЕЇ 551 ЕЗЕДТАУУУСАКЗАМОРІ УУМАГЕУМУСОСТТУТУЗЗАВТКаРОЗМЕ

РГАРБ5ЗКЗТЗИааТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаУНТЕРАМІ О5БИЇ М5І 55 ТУРІ

СТО ГМІХНВМЯМНКРОЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ ГООРБМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗКТРЕМТС

МУУМВУЗНЕОРЕУМКЕМУУУрамМЕМНМАКТКРАЕЄОММЗ ТИВ ТМ НОБУЛ МЕКЕУКСКУЗМК

АЇ РАРІЕКТІЗКАКЕОРАЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОУБІ ТОЇ УКЕМРЗВІАМЕМЕЗМИООРЕММУКТТ

РРМ'ОБОравзЕРІ МК ТМОКЗАМООСММУЕЗСЗУММНЕАЇІ НМНУТОК5БІ 5І ЗРК (ЗЕО ІЮ МО:19)

Послідовність нуклеїнової кислоти важкого ланцюга 018 (повнорозмірний; ПО1Т8НС) в каркасі да

САДдатасааСстаастасаатсАасасассаАватТААаАдАдасСсАаасассАа,САаСатСААаатАТ

СстатАААлаСсаТСсТааТТАСасссСстТТтСсАААСТАССТаАТССААТаСОТтвАсасСАаа,вастососва

СсСААвсасстапйААтТасАатавиАаТТАТСАССССТаСОвбАа,аСайСАССАТТААТТАСаСССАСААДА

ПІІ тсСАСасАСсАа,атТаАСаАТтТАСсСсасСа,аАСаАдаТСсСАССАаТтТАСТаСсСТАСАТОСЬССТатостТ

САСТОСОаСАааСаАдапАСАСсаасСАсаТТТАСТАСТОСЯСсСсСсОваАаатоаАдтаваАССсСтТСТТтТАСТА тТАТИаСТоТасСААТАСТОСССОаССАсСапААСаАССаТТТАСсАаТатСАТСТасСстАаСАСААДААааА

ССАТСАСТСТТоССАСТТаСТоСТТСсАТСТААСАаСАСААДатТаатасСАастасала,асссттааста сСстТаатТаАААСАТТАТТ ТОСССОСААССТаттАСАСТТСоттасААСстТоСастасСАСТОаАСАТОССОА вАаТтТАСАСАСТІ ТОССАСОСТОа ТаСтТаСАСАССТоАсааАСстТатАтТАаа,асСстаТатстсватастТсСАС

Зо тат ссСАТСЯтТоСАаТСтТТайСАСАСАСАСАТАТАТТ ТаСААСаТСААТСАСААДаСССТОСААСА

САДАдАатТасАтТААаААа,аатоаАасССАААТСТТатаАСААпАСССАТАСЯ ТИ ТОСТОоССТатос са,асссСтТаААстТаставаАлас!сосостютИТтат стат гСССАССТААаССААДАаСпСАСАСТСТО

АтТаАТСАССССОСОСАСТоСсСсОСАСе7тАССТОТОТОСТОСТааАТатТатСсТтоАТЧААЧаАССоСстТадас;

ТтТААаТТСААТТОСТАСОЯТасАТасСсатоиаАа,ааТасСАТААСаСАААААССААда,асСаАдаАаАсасА аСАСсСТАСаагдаСАССТАТАСАСТАС,ТОАСС,аТоСТаАСТаТатстТАСАТСАС,аАТТааСТСААТОС

ТАДАСААТАТААСТИСААИаИаТААаСААСААаассСстТАСССасСАССААТАЧАСПСААСАССАТСТОСА

АдаспААдАватоАаасоСА,васАаССССАсаОа ТТАТАСАСТаАССТОоССТСАСасСаАСС,ААТТААС

АААСААТСАСЯТТИТОТСТоАССТОТСстТоатосААдааасСТПТАСССТТССаАСАТСОСССОЯТОасАСТ аапААТССААТааССАасСсСтТаАсААСААТТАТААСАСААСТОССССА,атТоСтасАТТСАпАТОаС атат ст ТстТАТАТАСТААаТттаАдсСатасАтТААлатотастааСААСАасаапААСаТтаттст стт,астотТатТАТаСАТаАдАаСастасСАСААТСАТТАТАСССАСААЛОТОССТОаТОоСсСТаАлаСССС сасасдАс (ЗЕО І МО:20)

Поліпептидна послідовність важкого ланцюга 018 Рар (018Барнс) в каркасі Ідсе1. СОК підкреслені

РГАРБ5ЗКЗТЗаИасСТААІ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗСИАІ Т5СУНТЕРАМІ О55(Д2І 51 55УМТУРБББІ

СТОТМІХНВЯМНКРЗМТКМОККМЕРКЗС (ЗЕО ІО МО:1)

Поліпептидна послідовність повнорозмірного легкого ланцюга 018 (ПО181С). СОК підкреслені

РІММТО5РОБ ГАУМБІ СЕВАТ ІМСВАБЕЗУМО МУСІРЕММУУМ ООКРООРРКІ ПІМААЗМНа5

СМПДРЕБОБО ЗОТОЕТІТІ5 БІОАЕОМАМУ МСООБЕЕМРІ ТРОаОСТКІЄЇ КАТУААРБМУЕ

ІЕРРБОЕБОЇК БИатТАБММУСІЇ ММЕМРАВЕАКМ ОМКМОМАГОБ СМБОЕБМТЕО ОБКОБТУБІ 5

ЗТ ЗКАОМ ЕКНКУМАСЕМ ТНОаЇІ 55РМТ КЗЕМАСЕС (5ЕО І МО:2)

Ця послідовність належить також легким ланцюгам антагоністів ІІ -6 020 та 029.

Послідовність нуклеїнової кислоти повнорозмірного легкого ланцюга 018 (0181 С) в каркасі

Іа

САСАТАСИТад ТаАСТСААДС тоСаспАСА,С стассасатат СсАСТСОСИЯаСИаА

АсСапаСААСТ АТСААСТаССо сАдасСАаСаА садаСатсспАТ ААТТАСОааСА ТОСССТТСАТ

СААСТОаСаТАТ САДаСАпААсаС САапАСАаСо абобАДаСТа СТТАТСТАСа сСастТоСАА ссссадпАТСА СССОИаТаСОбОа АТОСАТТТАаа ТтасСАда,аСс,ат датапаАССОа АТТТСАСАСТ пАССАТСАСС ТОССТТСАсСОа сб,Ад,сАтТаТ авасСтТатсТтАТ ТАТТаТтСАСС ААТССаАСааА датассасто дса,аттта,аато даспаААССАА АСтТаспАСаАТО АДаСасАССос тлабаабабо

ТтТАаТатсТто АТСТТСССАС ССТоСОАСаА АСсАДасСтТаААа тотаасСАСТа сттосСатсат атасстасСто ААСААСТТТТ АСССТАСАСА пСИаСАдДААсСТІ СААТасСАдДАС ТАпАСААТтаС стта,аслаатоо аспсААСтТоСС дапАаТоТаТ САСАпАсСАс пАТАИТААСс АСТСААССТА

САаССсТаТоС АаСАСАСТаА СССТСТОСАА ДаССОпаАСТАС сАСпАдДаСАСА ААдатТатАСас тассАдатІ АСасСАТСАСОС паСТатосСто АСССОИТТАСА АААдДаИтТТТТА АСсАпАа,ааацА атас (5ЕО ІЮ МО:С26)

Важкий ланцюг 019 Рар (019гарнс, така сама послідовність, як і 018гарнс, за винятком

АТ9М (жирний шрифт/курсив)

ОМОГМОБОАЕ УККРОББЗУКМ ЗСКАБИаМАГ 5 МУ ЕМУУВОА РОСС ЕУМОаМ ІТРОБОТІМУ

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБЗТОТУМ МЕ! 55ІА5ЕО ТАМУУСАВЗА МОРІМУМАГЕ УУсОоатТТУТУ

ЗБЗАБІКОаРОМ ЕБЕРІАРББЗКОТ БОаСТААГОаСІ МКкОМЕРЕРМТ УБМУМЗОаАІ!Т5 СаУНТЕРАМ'О

ЗОЇ 51 554 МТМРБЗЗБІ ОТ ОТХІХНВМНК РЗМТКМОККМ ЕРКЗС (5ЕО ІЮО МОЗ) 019 МН (варіабельна ділянка/19НС)

ОМОГМОБОАЕ УККРОББЗУКМ ЗСКАБИаМАГ 5 МУ ЕМУУВОА РОСС ЕУМОаМ ІТРОЗОТІМУ

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБТОТУМ МЕ! 551850 ТАМУУСАНЗА МОРІ УММАГЕ УУуСсОСТТМТМ 55 (ЗЕО ІЮ МО:27)

Послідовність (поліпептида та нуклеїнової кислоти) легкого ланцюга антитіла 019 (0191 С) є такою саме, як 0181 С

Коо) СОовІ о18НС (МН СОВІ1 018): аОМАІЇ 5ММЕ (5ЕО 10 МО:4)

Сов2г о18НС (МН Сов 018): МІТРаБОИТІМ (ЗЕО ІО МО:5)

СОовЗ 018НС (МН СОВЗ 018): БВУУОРІ МУМАЇ ЕМ (5ЕО 10 МО:6)

Сов От8І С (МІ СОВІ1): ВАБЕЗМОМУСІРЕММ (ЗЕО І МО:7)

СОовг о18І С (МІ СОВ2): ААЗМНав (5ЕО ІЮ МО:8)

СОовЗ 0181 С (МІ СОВЗ): ООБЕЕМРІ Т (5ЕО ІЮ МО:9)

СОовВІ О19НС (МН СОВІ1 019): ОМА 5ММЕ (ЗЕО ІЮ МО 4)

Сов2г о19НС (МН Сов 019): МІТРаБОИТІМ (ЗЕО ІО МО:5)

СОовЗ 019НС (МН СОВЗ 019): БВУУОРІ МУМАЇ ЕМ (5ЕО 10 МО:6)

Приклад 5: Картування епітопу та структури

Картування епітопу

Картування функціонального епітопу проводили для вибраного кандидата антагоністів ІІ -6.

Було знайдено, що антитіло-кандидат (мишаче антитіло 64) не знижує зв'язування 1 -6бКа з 11-6 за результатами ЕГІЗА, що означає, що антитіло-кандидат не зв'язується із сайтом І. Були проведені додаткові експерименти, які продемонстрували, що химерне мишаче антитіло 64 знижує зв'язування комплексу 1І--6/І -6Ка з др130 за даними ЕГІЗА, що свідчить про те, що сайт

ЇЇ або сайт ПІ 1-6 містить зв'язуючий сайт антитіла. Було також знайдено, що мишаче антитіло 64 не блокує в значному ступені зв'язування відомого сайта І зв'язування антитіла АН-65 (Ітітипоїесі, Маггзхейе, Егапсе) з ІЇ/-б, що вказує на те, що антитіло-кандидат зв'язується із сайтом ЇЇ І/-6. Ці дані демонструють, що можуть бути одержані антитіла проти сайта І, та демонструють спосіб ідентифікації таких антитіл.

Для додаткового визначення епітопу, були згенеровані мутації І/-6 в дріжджах як злиття з

А4т5.3 (Водег вї а!., 2000, Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 97, 10701-10705; Снао єї а!., 2006, Маї Ргоюс 1, 755-768). Експресовані мутації знаходилися в людському ІЇ-б6 з такими одиничними або подвійними мутаціями: К24Е/027Е, КЗОЕ, УЗ1єЕ, 034, 5118Е/М/121Е, УМ157Е, О159Е/1162Р,

К1І71Е та К179ЄЕ. Експресовані мутовані молекули ІЇ/-6 використовували для досліджень зв'язування з 018 (Бар). Знижена афінність по відношенню до 018 (Раб) спостерігалась для

К2АЕ/К27Е, УЗ1Е, ОЗАК та 5118К//121БК, які усі розташовані в сайті ІІ ІІ -6. Відповідно, винахід, описаний в даному документі, включає антитіло, яке зв'язується із щонайменше однією, двома, трьома, чотирма, п'ятьма або шістьма амінокислотами в положеннях 24, 27, 31, 34, 118, та 121 60 людського 1І--6 або еквівалентного сайта ІІ -6.

Структурне визначення епітопу сайта І!

Для структурного визначення сайта І були обчислені наступні розміри. Розрахунки проводили на основі гексамерної кристалічної структури ІС-6ЛІ -ба/др130, РОВ 1РОМ (Вошапдег еї аї.,, 2003, сіепсе 300: 2101-2104). Спіраль 1 1І/-6 знаходиться між сайтом І та сайтом ЇЇ, приводячи до того, що певні залишки розташовані близько до сайта ІІ, але мають бічні ланцюги, спрямовані до сайта І, наприклад, КЗ30. 002 та ОЗ стосуються позаклітинних доменів ІІ.-6Ка.

Було визначено, що наступні амінокислоти 1-6 розташовані на відстані не більше 5 А від др130-02-03:119, 824, К27, 028, 830, 31, 034, Е110, 0111, 8113, А114, М117, 5118, М121, 0124, 125 та К128

Було визначено, що наступні амінокислоти розташовані на відстані не більше 7 А від др130- рге-03: 119, Е23, 824, 125, К27, 028, І29, 830, м31, 034, К41, 0102, Е109, Е110, 0111, А112,

В113, А114, М115, 0116, М117, 5118, К120, М121, 1122, 0124, Е125 та К128.

Відповідно, молекула, наприклад, антитіло або його фрагмент, яка може зв'язуватися з однією чи декількома з амінокислот ІІ-6, розташованих на відстані не більше 5 А або 7 А від сайта ІІ, може бути ІІ -ба.

Послідовність людського 1ІІ-6 наведена нижче для інформації (підкреслена послідовність є лідерною послідовністю). Амінокислоти на відстані до 7 А від др130-02-О3 виділені курсивом.

Нумерація амінокислот, наприклад, мутацій, використовувана для визначення епітопів, не враховує лідерну послідовність:

Людський 1 -6

МЯЗЕБТЗАГОРМАЕБ СП М РАДЕРАРУРРЕЕОЗКОМААРНАВОР/ Т55 ЕІ КОТАМІ РОІЗАЇ

АКЕТСМКОЗММСЕБ5КЕАЇ АЕММІ МІ РКЕМАЕКРИасСтгОБИРМЕЕТСІ МКПИТО І ЕРЕММГ ЕМ ОМАБЕЗ

ЗЕЕОАНАУОМОТ КУПОН ОККАКМІ ВАІТТРОРТТМАБЗИ ТК ОДОМОУЛ ООМТТНИЇ АЗЕКЕН О

З5І ВАГАОМ (5ЕО І МО:21)

Були проведені експерименти з тестування фрагмента Раб гуманізованого антитіла пб4-1.4, які продемонстрували, що він був здатним блокувати як цис-, так і транс-сигналінг ІІ -6, спричинюваний націлюванням на сайт ІІ. Ефективність фрагмента Бар залишалася незмінною в присутності розчинного рецептора 1-6 (511 -6К). Це відрізняється від Їдо проти ІІ-6К, який має знижену ефективність у присутності 51І -6К, і який блокує тільки цис-сигналінг.

Зо Ці експерименти демонструють, що антитіло або фрагмент антитіла, такий як фрагмент Раб, націлений на сайт ІІ, можуть бути використані для інгібування як цис-, так і транс-сигналінгу ІІ -6.

Приклад 6: Дослідження на приматах

Оскільки активності у тварин, які не є приматами, можуть сильно відрізнятися від показників у приматів, антагоністи-кандидати ІІ -6 типово додатково оцінюють на фармакокінетичні (РК) та інші параметри з використанням приматів, які не є людиною. Людський 1-6 відрізняється від ІІ - б яванського макака та макака-резуса в семи місцях, одне з яких розташоване в сайті ЇЇ (амінокислота 28) і співпадає з сайтом ІІ І/-6 африканської зеленої мавпи. Воно, очевидно, знижує зв'язування антитіла, що містить послідовністі 018, лише в приблизно 3-4 рази.

Здатність зв'язуватися з ІІ -6 примата, що не є людиною, є корисною ознакою антагоніста ІІ--6, сприяючи розробці з кандидата лікарського засобу, наприклад, забезпечуючи можливість тестування, такого як токсикологічного тестування, на приматах, що не є людиною.

Які більшість антитіл І-6, антитіла проти 1-6, описані в даному документі, не є перехресно реактивними з ІІ-6 гризунів, кроля або собачих через низьку гомологію послідовностей. Однак, в дослідженнях афінності було знайдено, що 018 Рар зв'язує ІЇ/-б6 яванського макака та африканської зеленої мавпи з афінністю, близькою до людської (Таблиця 2).

Таблиця 2

Моновалентна афінність (018 Раб) до різних 1І--6 різних видів нЕнлпш ли інн пиши

Ці дані додатково демонструють здатність ІІ -вба, описаного в даному документі, специфічно зв'язуватися, та можливість розробки молекули, що має ознаки, які дозволяють проводити тестування, наприклад, для досліджень токсикології та репродуктивної системи, на придатній тварині.

Приклад 7: Підвищення експресії І -ба

Для підвищення експресії поліпептидів 018 Бар та 019 Раб, були зроблені конструкти з додаванням п'яти додаткових амінокислот (ЮКТНТ (5ЕБО ІЮ МО: 30)) у важкий ланцюг в

СН/іІ/шарнірній області з використанням способів, відомих фахівцям. Послідовність важкого ланцюга зміненого 018Бар наведена нижче як ЗЕО ІЮ МО:24. Змінена послідовність 018 називається в даному документі 020, і змінена послідовність 019 називається в даному документі 021. Молекула 020 (важкий ланцюг 020Рар та легкий ланцюг 018ГРаб) має покращену експресію у порівнянні з батьківським Бар, який має важкий 018Еаб та легкий 018ГРар ланцюги.

Молекула 019 не виявляє значної різниці в афінності у порівнянні з молекулою 020. Експресія як 020, так і 019 зростає приблизно удвічі, відповідно, і зміна не впливала на афінності.

Важкий ланцюг 020 (Рар з ОКТНТ (ЗЕО ІО МО: 30) на карбоксильному кінці))

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБЗТЗТАМ МЕ! 55ІВА5ЕО ТАМУУСАВЗА М/ОРІМУМАЕ УмсОоатТТУТУ

ЗБОЇ У5І 55М МТУРББЗБІ ОТ ОТМІХНВМНК РЗМТКУОККМ ЕРКЗСОКТНТ (5ЕО ІЮ МО:24)

Антагонізм до 1І--6 з використанням 020Рар вимірювали в репортерних клітинах НЕК-Віце "м

І/-6 (Іпмімосеп, Зап Оіедо, СА). Клітини інкубували в суміші 10 пМ 1-6 та різних концентрацій 020 або антитіла ІІ -6бКа (СеїЇ Зсіепсе5, Сапіоп, МА), з 50 нМ 1І--6Ка або без нього. Через 20-24 годин інкубації, 20 мкл супернатанта клітинної культури змішували з 180 мкл субстрату

ОмцапііВіІце "м (Іпмімосеп) та інкубували протягом однієї години; потім вимірювали поглинання при 655 нм. Фіг. ЗА та Фіг. ЗВ показують результати цих експериментів, які демонструють здатність 020 інгібувати активність ІІ -6 в присутності ІІ -6Е. або без нього.

Приклад 8: Антитіла Ідса 1І-6 018 був переформатований в ізотиповий каркас людського ЇдДС2 для зниження зв'язування

Есук та зниження АОСС у порівнянні з антитілом, сформатованим в Ідс1, з використанням способів, відомих фахівцям. Крім того, очікується, що переформатування 018 в повнорозмірний

Зо формат, наприклад, Ід052, буде знижувати швидкість кліренсу зі склистого тіла внаслідок великого розміру молекули.

Конструювання/очистка антитіла Ідс2 проти ІІ 6

Для конструювання людськорго антитіла Ідс2 з використанням послідовністей проти 1-6, описаних вище, константний домен людського Ідо2 був ампліфікований методом ПЛР з кДНК із сайтами рестрикції Ме! та Міші на М- та карбоксильному кінцях, відповідно. Продукт ПЛР очищали, гідролізували рестрикційними ферментами Ме! та Міні, ії потім лігували в вектор ртТтТ5, що містить варіабельний домен проти ІІ6, тобто, ЗЕО ІЮ МО:1 (див. вище). Це давало послідовність важкого ланцюга повнорозмірного Ідс2. Плазміди, що містять повнорозмірний легкий ланцюг, який містить послідовність 018, використовували для одержання легкого ланцюга.

Для додаткового зниження зв'язування з ЕсКп і, тим самим, зниження рециклінгу І--ба, у важкому ланцюзі були зроблені точкові мутації. Мутації робили методом мутагенезу

ОцікСспапдеф (Адіїепі Тесппоїодіе5, запіа Сіага, СА). Плазміди важкого та легкого ланцюгів ко- трансфекували з використанням полі(етиленіміну) (РЕ!) в 100 мл транзієнтних культур клітин

НЕК293-6Е та культивували для забезпечення експресії протягом приблизно п'яти днів. Такі згенеровані антитіла містили зв'язуючий фрагмент проти сайта ІІ 1-6 та мали структуру Ідос2.

Такі структури, що містять СОМ. 018, називаються в даному документі 018І92 або 029. Точкові мутації робили у залишках І253

Молекула Ідс2 гарно експресувалася та блокує 1-6 за результатами клітинних аналізів з трохи покращеною ефективністю у порівнянні з 020Рар.

Зрілі послідовністі 029 (СОК підкреслені)

Важкий ланцюг 029

АОКЕРОСАМТІ ТАСЕБЗТЗТАМ МЕ! 55ІВА5ЕО ТАМУУСАВЗА М/ОРІМУМАЕ УмсОоатТТУТУ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАЗТІ ЗЕБТАА ОСІ МКОМЕРЕРМТ УБМУМ5ЗОА! 5 СаУНТЕРАМ'О 55615 55М МТМРЗЗМЕОТ ОТУТХНВОнНК РЗМТКУМОКТМ ЕККССМЕСРР СРАРРМАСРЗ

МЕГЕРРКРКО ТІМІЗАВТРЕМ ТСММУОУ5НЕ ОРЕМОЕМУМУМУМ ОаМЕМНМАКТ КРАЕЄОБЕМ5ЗТ

ЕВМУБЗМІТУМ НООУІМОКЕМ КСКУЗМКОІР АРІЕКТІЗКТІ КООРАВЕРОММ ТІ РРОВЕЕМТ

КМОМ5ІТСІМ КагмРБЗОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІО 5ООЗЕРІ УК І ТУОКЗАМОО (510) СММЕБСОСЗУМН ЕАЇ НМНУТОК 51 5І ЗРК (5ЕО 10 МО-11)

Легкий ланцюг 029

СМПДРЕБОБО 5ОТОБТІТІЗ БІОАЕОМАМУ МСООБЕЕМРІ ТРаОСсСТКІєЇ КАТУМААРБМЕ

ЗТ ТІ ЗКАОМ ЕКНКУМАСЕМ ТНОЇІ 55РМТ К5ЕМАСЕС (5ЕО ІО МО-12)

Змінене зв'язування з ЕсКп

І/-6 може мати певні позитивні системні ефекти. Тому краще сконструювати ІІ -ба, який би гарно утримувався у склистому тілі, але мав обмежений системний період напіввиведення.

Зниження або усунення зв'язування з ЕсКп повинно зменшити системне накопичення, якщо якась кількість лікарського засобу потрапить до кровообігу, тим самим покращуючи безпеку ЇЇ - ба.

Відповідно, оскільки медійований ЕсКп транспорт може збільшувати витік антитіл з ока, Ї(дс2 020 був додатково модифікований з метою усунення зв'язування з ЕсКп шляхом введення мутацій Ес у залишки 1254, НЗ11 або Н4іЗ36 (див. ЗЕО ІЮ МО:23), нумерація згідно з Магіїйп еї аї.,

Моїіесціаг Сеїї, 7:4, 867-877 (2001)). Мутовані сайти виділені жирним шрифтом в ЗЕО ІЮО МО:23;

І254 був мутований на А або К, НЗ11 був мутований на А або Е, НЗ11 був мутований на М з р313, мутованим на Т, і Ні43б6 був мутований на А (нумерація починається після лідерної послідовності, яка підкреслена в 5ЕО ІЮ МО:23. Антагоністи 1-6, що містять такі послідовністі, були названі 018952 т.

Важкий ланцюг (антитіла) проти ІЇ/-6 (952) (нормальний шрифт: МН; курсив: СН) (без лідерної послідовності) з виділеними сайтами мутацій (жирний шрифт)

ОМОГМОБОАЕ УККРОББЗУКМ ЗСКАБИаМАЇ 5 МУ ПЕМУУВОА РОСС ЕМУМИаМ ІТРОБаИТІМУ

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБЗТОЗТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАВОА МОРІ УУМАГЕ мУусоаттУтУ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАбОТ ЗЕБТААГОСІ МКОМЕРЕРМТ УБМУМ5ЗОА! 5 СУНТЕРАМ'О 55615 55М МТМРЗЗМЕОТ ОТУТХНВОнНК РЗМТКУМОКТМ ЕККССМЕСРР СРАРРМАСРЗ

КМОМ5ІТСІМ КагмРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІ'О 5ООЗЕРІ ЗК ТУКА МОО

СММЕБСОСЗУМН ЕАЇ НМНУТОК 51 5І 5РОК (5ЕО І МО:23)

Зо Важкий ланцюг (антитіла) проти 1-6 (452) (нормальний шрифт: МН; курсив: СН) з лідерною послідовністю (підкреслена) з виділеними сайтами мутацій (жирний шрифт)

МОМ/ПМУВІ РІ МАААТаАНЗОМОЇ МОБСОАЕ УККРОББЗУКМ ЗСКАБОаМА! 5 ММ ПЕМУМУВОА

РООСІЕМУМОаМ ІТРОаБОТІММ АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБТОТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУМСАВЗА

МОРІМУМАГЕ ММУСОСТТУТМ 5БЗАБТКОРОМ ЕРІАРСЗНАЗТІ 5ЕБТААГОСІ УКОМЕРЕРМТ

УМЗУУМ5ОСАЇ ТЗ ОУНТЕРАМО 55015155 МТМРЗЗМЕСТ ОТУТХНВОНК РЗМТКМОКТУ

ЕВКССМЕСРР СРАРРМАСРО МЕГЕРРКРКО ТІМІЗАТРЕМ ТСУУММОУМ5НЕ ОРЕМОЕММ/ УМ

РОМЕМНМАКТ КРАЕЕОРМОТ ЕВУУБМІТУМ НОУІМОаКЕМ КСКУБМКОІЇ Р АРІЕКТІЗКТ

КОаОРВЕРОМУ ТІРРО5ВЕЕМТ КМОУБІ СІМ КОагМРБЗОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІО зравЕгімк! ТтУоКкЗАМОО МУМЕЗСЗМУМН ЕАІНМНУТОК 51 5І РОК (5ЕО ІЮ МО С28)

Відповідно, деякі варіанти реалізації включають антитіло, що має послідовність важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮО МО:23 з мутаціяи в І254 (наприклад, А або К), НЗ11 (мутований на А або Е), Н4і36 (мутований на А), або 0313 (мутований на Т) з НЗ11, мутованим на М.

Таким чином, ЗЕО ІЮ МО:25 показує послідовність, яка, з мутаціями в положеннях 1133 (наприклад, І13З3А або І133К), НІ190 (наприклад, НІ190А або НІТ90Е), НЗ15 (наприклад, НЗ15А), або 0192 з НІ190 (наприклад, 0192 з НІ90ОМ) може бути використана в антитілі, його фрагменті або похідному, для одержання поліпептиду, що має знижене зв'язування Ес при низьких рн, наприклад, рН 5,5, або лізосомальному рнН, та/або поліпептиду, що має знижений системний період напіввиведення у порівнянні з батьківською або іншою референсною молекулою, яка не містить послідовності.

ЗАБІКОРОМ ЕРІЕАРСЗАЗТІ ЗЕЗТАА ОСІ УМКОМЕРЕРМТ УБМУМ5ЗОаА! 5 СМНТЕРАМО 55615 55М МТМРЗЗМЕОТ ОТУТХНВОнНК РЗМТКУМОКТМ ЕККССМЕСРР СРАРРМАСРЗ

МЕГЕРРКРКО ТІМІЗАВТРЕМ ТСММУОУ5НЕ ОРЕМОЕРМУМУМУМ ОаМЕМНМАКТ КРАЕЕОЕМ5ЗТ

КМОМ5ІТСІМ КагмРБЗОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІО 5ООЗЕРІ УК І ТУОКЗАМОО

СММЕБСОСЗУМН ЕАЇ НМНУТОК 51 5І 5РОК (5ЕО 10 МО:С25)

Легкий ланцюг (антитіла) проти 1-6 (1452) (нормальний шрифт: МК; курсив: СК)

РІММТОЗРОБІ АУМ5І СЕКАТІМСКАЗЕЗМО МУ ОІРЕМММУМУООКРООРРКІ ПІМААЗМА:АОБОМПДРЕЗ саБОаБатТОгТІ ТЗІ ОАЕОМАМУУСООБЕЄЕМРІ ТРЕОСТКІ ЕІКАТМААРЗМЕ ІЕРРБОЕОЇІ К (510) ЗаТАБМУСІЇ ММЕМРАЕАКМ ОМУКМОМАГОБ СМБОЕБМТЕО О5КОБТУБІ 5 5 ТІ 5КАСУ

ЕКНКУМАСЕМ ТНОІ 55РМТ КЗЕМАСЕС (5ЕО І МО 22)

Приклад 9: Стабільність композиції

Стабільність фрагмента Раб проти ІС-6/Лде1 (що містить домен І(ІДС1СНІ) тестували шляхом визначення Тт спочатку в ФСБ, а потім в ряді буферів та ексципієнтів з використанням диференціальної скануючої флуориметрії. Було знайдено, що цитратний буфер, рН 5,5, підвищував Тїт до більш ніж 80С. Відповідно, в деяких варіантах реалізації, І -ба передбачається в цитратному буфері, і в деяких випадках має Тт щонайменше 80 "с.

Агрегацію тестували методом ексклюзійної хроматографії з багатокутовим розсіюванням лазерного світла (ЗЕС-МАЇ 5), і агрегацію не спостерігали при 20 мг/мл в фосфатно-сольовому буфері (ФСБ).

Приклад 10: рН-чутливі антитіла для поліпшення фармакодинаміки (РК)

І/-6 може мати певні позитивні системні ефекти. Тому краще сконструювати ІІ -ба, який би мав гарне утримання у склистому тілі але обмежений системний період напіввиведення.

Зниження або усунення зв'язування з ЕсКп повинно зменшити системне накопичення, якщо певна кількість лікарського засобу потрапить до кровообігу, тим самим покращуючи безпеку ІІ - ба. Відповідно, оскільки медійований ЕсКп транспорт може збільшувати витік антитіл з ока, Їд2 020 був додатково модифікований для усунення зв'язування з ЕсСКп шляхом введення мутацій

Ес у залишки 1253, НЗ10 або Н4З35 (нумерація згідно з Магійп еї а. (МоіІесшціаг Сеї, 7:4,867-877 (2001))). Такі антитіла називаються в даному документі антитілами ІІ -6рН або антитілами проти

І. -6рнН і додатково описані нижче.

Одержання антитіл з рН-чутливим зв'язуванням

Величина ркКа гістидину становить приблизно 6,0 і гістидини, введені в поверхні зв'язування, можуть перешкоджати зв'язуванню при протонуванні бічних ланцюгів при низькому рН. З використанням антитіла проти сайта ІІ І/-6, описаного в даному документі, була згенерована бібліотека, що містить варіанти СОК 018 з високим вмістом гістидину, і бібліотека була піддана скринінгу на рН-чутливе зв'язування з використанням дріжджового дисплея. Згенерована бібліотека була комбінаторною бібліотекою з СОК, кодованими виродженими кодонами, так щоб кожен залишок був або залишком дикого типу (тобто, таким самим, як у батьківському антитілі), або гістидиновим залишком. Скринінг проводили шляхом сортування по черзі з

Зо високим зв'язуванням при фізіологічному рН (7,4), та з низьким зв'язуванням при ендосомальному рН (5,5).

Селектований на дріжджах мутант був ідентифікований як такий, що має відносно високе зв'язування при рН 7,4 (моновалентна Ка 407 пМ для мутанта у порівнянні з 192 пМ для батьківської молекули) та відносно низьке зв'язування при рН 5,5 (моновалентна Ка 2,362 нм для мутанта у порівнянні з 195 пМ для батьківської (молекули)). Це відповідає приблизно 5,8- кратній зміні афінності при рН 5,5. Цей мутант містив численні гістидинові мутації в легкому ланцюзі СОКІ. Таким чином, мутант демонстрував зв'язування, близьке до батьківської молекули при рН 7,4, і значну втрату афінності при рН 5,5. Це спостереження було підтверджене шляхом аналізу методами ЕГІЗА, ЕАС5 та ППР, відомими фахівцям.

Ці дані демонструють можливість створення на основі антитіла ІІ -ба з ознаками активності проти 1-6, націленої на сайт ІІ І/-6, який може бути використаний для інгібування як цис-, так і транс-активності І/-б6, та має покращену фармакокінетику (РК) у порівнянні з батьківським антитілом або іншим антитілом, що має Ес-домен дикого типу, спричинену щонайменше частково зміненим зв'язуванням при рн 5,5.

Приклад 11: Ефективність місцевої блокади ІЇ-б6 у мишачій моделі лазерної хоріоїдальної неоваскуляризації (ХНВ)

Для визначення того, чи може місцева блокада 1-6 бути ефективною при лікуванні хвороби ока, наприклад, діабетичного макулярного набряку (ДМН) або вологої ВМД, моноклональне антитіло проти І/-6 місцево вводили в модельній системі хоріоїдальної неоваскуляризації. В цьому Прикладі використовували модель лазер-індукованої ХНВ, описану у Заїзпіп еї аї., доитаї ої Сеї! Рпузіоіоду, 195:241-248 (2003). Модель лазер-індукованої ХНВ відтворює багато патологічних процесів, що лежать в основі діабетичного макулярного набряку (ДМН), включаючи запалення та ангіогенез.

Моноклональне антимишаче антитіло І/-6 (МРО-20Е3, яке є щурячим антитілом ізотипу

ІДС1, придбаним у фірми Віо Х СеїІ, Мо за каталогом ВЕО0046) вводили тестованій групі шляхом інтравітреальної (ІМТ) ін'єкції. Контролі отримували інтравітреальну ін'єкцію пастки МЕСЕ або інтравітреальну ін'єкцію ізотипового контрольного антитіла проти пероксидази хрону (НЕР) (щурячий ІДС1 проти пероксидази хрону, клон НКРМ, придбаний у фірми ВіоХСеї!; Ме за каталогом ВЕ00О88). Для усіх груп антитіла, 20 мкг білка в об'ємі 1 мкл вводили ін'єкцією в 60 тестове око, в той час як протилежне око залишали без обробки як додатковий контроль.

Мишей піддавали евтаназії в день 7 після лазерної обробки і хоріоїдальні плоскі гістологічні препарати фарбували лектином Сгійопіа 5ітріїсітоїйа (ЗА) для вимірювання площі ураження.

Фіг. 4 зображує результати. Група, яка отримувала антитіло проти І--6, продемонструвала статистично значуще зниження неоваскуляризації у порівнянні з групою, що отримувала контрольне антитіло (р«0,05). В середньому, група, що отримувала антитіло проти 1-6, також продемонструвала знижену неоваскуляризацію порівняно з позитивним контролем проти МЕСЕ.

Ці дані демонструють, що І-ба, наприклад, моноклональне антитіло проти І/-6, введене інтравітреально (ІМТ), може значно знижувати неоваскуляризацію у мишачій моделі ХНВ.

Результати додатково долзволяють припустити, що антитіло проти І/-6 може спричинювати зниження неоваскуляризаці, яке є щонайменше таким саме великим, і можливо більшим, ніж для антитіла проти МЕСРЕ. Ці дані показують, що місцеве інгібування І/-б6 є придатним для лікування хвороби ока, такої як хвороби, пов'язаної із судинним просочуванням, наприклад, вологої ВМД або макулярного набряку, наприклад, діабетичного макулярного набряку.

Приклад 12: Розробка удосконаленого антитіла ІІ -6

Були згенеровані варіанти антитіла ЕВІ-029. Для того, щоб краще охарактеризувати внесок мутацій А28М, 5ЗОР, І51Т та 55505, конкретні комбінації вводили в вектор Гар-дисплея ЕВІ-029 дикого типу та вимірювали зв'язування. Результати представлені на Фіг. 5. Після конкуренції з 2

МКМ 1ІС-6 протягом ночі, усі мутанти мали значно вищі рівні біотинільованого 1-6, що залишився на їх клітинній поверхні по відношенню до дисплея у порівнянні з Гар ЕВІ-029 дикого типу.

Ранговий порядок зв'язування від найвищої до найнижчої афінності був таким

А28М/530Р/Л511/55505 » А28М/511/55555 » 5ЗОР/51Т/55505 » І51Т/5550 » дикий тип (м/|).

Четверна мутація А28М/530Р/51Т/5550 також називається в даному документі ЕВІ-0О30.

Послідовністі ЕВІ-030 наведені нижче.

Послідовністі СОВ 030:

Сов озОоне (МН Сов 030): ЧОУМІ РММПЕ (5ЕО 10 МО:31)

Сов2г озоне (ун Совг 030): МГІТРОСИИТІМ (5ЕО 10 МО:32)

СовЗ озОно (УН СОвВЗ 030): БВУУОРІ МУМАЇ ЕМ (5ЕО 10 МО:33)

СОВ1 ОЗ0І С (МІ СОВІ1 030): ВАБЕЗМОМУСИІРЕММ (ЗЕО 10 МО:З34)

СОов2 0301 С (МІ СОВ2 030): АА5МНавз (5ЕО ІЮ МО:35)

Зо СОВЗ ОЗОІ С (МІ СОВЗ 030): ООБЕЕМРІ Т (5ЕО ІО МО:З6)

Послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга 030 (мутації порівняно з 029 виділені жирним шрифтом):

ОМОГМОБОАЕ УККРОБЗБЗУКМ 5СКАБОММІ РЕ ММ ЕМУУВОА РОСС ЕУМОаМ ТТРОССТІМУ

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕЗТОЗТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАНЗА МОРІ УММАГЕ УУуСсЄОСТТМТМ 55 (ЗЕО ІО МО:37)

Послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 030:

РІММТО5РОБІ АУ5БІ ЧЕВАТІМСВАЗЕБУМОММаіРЕММУ ХООКРИООРРК ІМААЗМАаЗОСМУПДР

Езававатов т ТІ ОАЕОМАМУУСООЗЕЕМРІ ТРООСТКІ ЕІКАТМ (ЗЕО ІЮ МО:З38)

Поліпептидна послідовність важкого ланцюга Бар (41) 030 (СОК підкреслені, мутації порівняно з 029 виділені жирним шрифтом):

АОКЕРОСАМТІ ТАОЕБЗТОЗТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАВНЗА М/ОРІМУМАЕ УмсОоатТТУТУ

ЗОЇ 51 55М МТМРБЗЗБІ ОТ ОТХІХНВМНК РЗІМТКМОККМ ЕРКЗСОКТНТ (5ЕО ІЮО МО:39)

У варіантах реалізації, послідовність ОКТНТ (ЗЕО ІЮ МО:30) на карбоксильному кінці ЗЕО ІЮ

МО:39 не включена до послідовності Раб.

Послідовність нуклеїнової кислоти важкого ланцюга Раб 030:

СстатАААлаСсатстааТТАСаТтостТТСсСАААСТАССТаАТСЧААТОСОЯСТаАсСасАа,аастоссас

СсСААвсасстапйААтТасАаАтавиаАаТТАССАсосСстасапсасааСАССАТТААТТАСасСсССАССАА

АТТТСсАсСасАСаАаТаАСаАТТАСсСасСсаАСаАаТССАССАаТтАСТаСсСтТАСАТасАастатос тТсАСТоСОаСАааСаАдапАСАСсвасАатТТАСТАСТОаСОЯСССОССсСАсСтоаАтТапйаАСССтТСТТТАСТ

АТТАТаСТОТасСААТАСТОСИаССАсСацвсААСсАССаТТАСАаТатСАТСТасСтТАаСАСАДААСса

АССАТСАСТСТТСССАСТТастТоОСТтТСсАТСТААДадасСАСААССТОСТОвИОСАСТаСАСсСооСсттааст аостаатТаАААСаАТТАТ ТОСССОСААССТатТтТАСАСТ сот асвААСТОССОСЯТасСАСТОаАСАТОС ааАаТАСАСАСТТІТоСсСсАааста7атастасСсАасвА,асСтсАа,ааАСстаТатАтТАааССТатстосвсатаатсСА стат сСсАТССстТоаАатсттаайСАСАСАСАСАТАТАТТТаСААСИаТСААТСАСААаСССтТоСААС

АСААДАаТасАТтТААаААаасТоаАаСССАААТСТТатаАСАААДАСАСАСАСА(ЗЕО ІЮ МО:40) 030 може бути також одержаний як поліпептидна послідовність важкого ланцюга Раб Ідса2: бо ОМОЇ МОБСІАЕУККРИаЗБЗУКУЗСКАБИМУМІ РММ ТЕМ УВОАРОСИІ ЕуМОаМТтРОСИТІММАОК

ЕОСЕМТІТАОСЕЗТЗТАММЕЇ 551 Е5ЕДТАУУУСАКЗЕМОРІ УУМАГЕУУМОСТТУТУ55АЗТКОРЗМ

ЕРГАРСЗАЗТЗЕБЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О55(Д1І 51 55 ГУРББМ

ЕСТОТУТХНВОНКРОЬМТКМОКТМЕКК

(ЗЕО ІЮ МО:54)

Приклад 13: Експресія та очистка фрагментів варіанта ар

Вставки в домен МН, що містять наступні комбінації мутантів - А28М/51Т/5550,

ЗЗОР/51Т/55505 та А28М/530Р/Л51Т/55565 (ЕВІ-0О30), були згенеровані з векторів дріжджового дисплея подвійним гідролізом ВатнНі-НЕ/МНеІ-НЕ. Вставки очищали шляхом електрофорезу на 1 95 агарозному гелі та лігували в експресійний вектор ссавців, одержаний з ртТТ5, який містив лідерну послідовність, домен СНІ людського ІДС, та С-кінцеву Нібз-мітку. Трансформанти піддавали селекції на І В-Атр (середовище Ленгмюра-Блоджетт з ампіциліном), виділяли ДНК за допомогою набору Міпіргер, та вставки підтверджували шляхом секвенування. Транзієнтну трансфекцію проводили в клітинах НЕК-6Е (Сападіап Кезеагсп Соипсії) для кожного важкого ланцюга мутантного Бар, спареного з легсим ланцюгом ЕВІ-029 дикого типу (розкритий в даному документі як ЗЕО ІЮ МО:12) з використанням РЕЇ як реагента трансфекції. Гар ЕВІ-029 дикого типу також експресували як контроль (важкий ланцюг Бар дикого типу розкритий в даному документі як БЕО ІЮ МО:24). Супернатанти збирали через 5 днів та експресовані Бар очищали афінною хроматографією з використанням агарози Мі-МТА (Ге Тесппоіодіеє5). Для очищеного білка буфер заміняли на ФСБ, рн 7,4, за допомогою декількох раундів концентрування/розведення і концентрацію білка та чистоту визначали за поглинанням на довжині хвилі 280 нм та методом електрофорезу на поліакриламідному гелі в присутності ДСН (ДСН-ПААГ).

Приклад 14: Варіант антитіла продемонстрував покращене зв'язування за результатами аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу

Афінності молекул Бар варіанта 029 по відношенню до 1/-6 вимірювали методом поверхневого плазмонного резонансу (ППР) на спектрометре Кеїспег 5К7О0000с.

Іммобілізували людський ІІ--6 в кількості 20 мкг/мл в 10 мМ ацетату натрію, рН 4,5, на чипі 500 кДа карбоксиметилдекстрану шляхом стандартного амінного сполучення. Серійні розведення кожної молекули Раб в 10 мМ НЕРЕЗ5, 150 мм Масі, рН 7,3, вприскували при 25 "С зі швидкістю

Зо 25 мкл/хв. Через 4 хвилини навантаження припиняли і дисоціацію вимірювали шляхом пропускання потоку рухомого буфера (10 мМ НЕРЕ5, 150 мМ масі, рн 7,3) протягом 5 хвилин.

Криві сенсограм погано погоджуються з моделлю зв'язування 1:1, потенційно через змішану орієнтацію 1/-6 на чипі або неспецифічне зв'язування антитіла. Замість цього, криві апроксимували моделлю з 2 видами молекул (з низькою афінністю та високою афінністю, помічені "низька афінність" та "висока афінність" у Таблиці 3) з використанням прикладної програми ТгасеОгауег, де Кат, кат! та КО1 позначають швидкість асоціації, швидкість дисоціації, та рівноважну константу зв'язування для молекул з низькою афінністю, і Ка2, Ка2 та КО2 позначають швидкість асоціації, швидкість дисоціації та рівноважну константу зв'язування для молекул з високою афінністю. Усі мутантні Гар мали значно повільнішу дисоціацію у порівнянні з Ба ЕВІ-029 дикого типу (Ум/) в такому порядку від найвищої до найнижчої афінності -

А2г8М/530Р/ЛБ51Т/5550 (ЕВІ-О30) » 5ЗОР/Л51Т/55505 » А28М/51Т/55505 » дикий тип (М/Т) (ЕВІ- 029).

Таблиця З

Результати ППР для мутантних антитіл те" те (НМ) те" те (НМ) о АгВМ/5ЗОРЛЬТТ/ВЬБО | 7,95 | 270 | 339 | 325 | 066 | 020 11111111 низькаафінність//// | високаафінність.//З

Приклад 15: Варіанти антитіл продемонстрували покращену антагоністичну ефективність в репортерних клітинах НЕК-Віше"М || 6

Лінія репортерних клітин НЕК-Віше"М І/6б (Іпмімодеп) була використана для порівняння ефективності інгібування сигналінгу б між різними мутантними фрагменти Раб ЕВІ-029.

Клітини НЕК-Віше"М ІІ 6 є модифікованою лінією НЕК293, яка стабільно експресує ген ІІ -6Е. та містить секретований репортерний ген лужної фосфатази під контролем мінімального промотора ІЕМВ, злитого з чотирма зв'язуючими сайтами 5ТАТЗ. Для вимірювання антагонізму

І.6, 10 мкл 400 пМ людського І/-6 (ВО бЗузіветв 206-ІЇ-010/СЕ) змішували з 10 мкл кожного варіанта Раб в діапазоні концентрацій на 9б-лунковому планшеті та інкубували при кімнатній температурі (ЕТ) протягом 30 хвилин. Клітини НЕК-Віне"М І/б на логарифмічній фазі росту трипсинізували та ресуспендували в середовищі для аналізу (ДМНМ, 4,5 г/л глюкози, 10 Фо термоінактивованої сироватки плоду корови (СПК), 2 мМ І-глутаміну, пеніцилін-стрептоміцин (Реп-5іер)) при 280000 клітин/мл. Додавали 180 мкл суспензії клітин в кожну лунку із сумішами

І/-6/габ для доведення кінцевої концентрації ІЇ-6 до 20 пМ. Клітини інкубували при 37 "С/5 95

Со» протягом 20 годин. Потім змішували 20 мкл супернатанта з кожної лунки з 180 мкл реагенту

Омапіі-Віне"М (Іпмімодеп) та інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин перед вимірюванням поглинання при 650 нМ на планшет-ридері 5ресігаМах М5. Віднімали фоновий сигнал для лунок без 1-6 і потім ділили на (величину поглинання) для клітин, оброблених 1І--6 без інгібітора для одержання відносного значення сигналінгу. Усі мутанти продемонстрували значно вищу ефективність у порівнянні з Раб ЕВІ-029 дикого типу (ул), з наступним порядком величини антагоністичної ефективності: А28М/530Р/511/55555 (ЕВІ-О30) з» А28М/511/5550Д У »

ЗЗОР/Л51Т/5550 » дикий тип (МТ) (ЕВІ-029). Ці результати представлені на Фіг. 6.

Приклад 16: Варіанти антитіл продемонстрували покращену антагоністичну ефективність за результатами аналізу проліферації Т1165

Клітини 11165.85.2.1 (КО Бувіет5) є клітинною лінією мишачої плазмацитоми, яка проліферує у відповідь на мишачий, щуриний або людський ІІ -6. Для вимірювання антагонізму до мутантного Бар ЕВІ-029, 25 мкл 2 нг/мл людського І/-6 (820 бЗузівт5 206-ІІ-010/СЕ) змішували з 25 мкл кожного варіанта Раб в діапазоні концентрацій на 96-лунковому планшеті та інкубували при кімнатній температурі (КТ) протягом 30 хвилин. Клітини Т1165 на логарифмічній фазі росту збирали центрифугуванням та ресуспендували в середовищі для аналізу (90 95 ВРМІ 1640, 10 95 СПК, 2 мМ ГІ-глутаміну, пеніцилін-стрептоміцин (Реп-Зігер)) при 2х105 клітин/мл.

Додавали 50 мкл суспензії клітин в кожну лунку сумішей ІЇ-6б/Бар для доведення кінцевої концентрації І/-б до 0,5 нг/мл. Клітини інкубували при 37 "С/595 СО» протягом 72 годин.

Додавали в кожну лунку 100 мкл реагенту СеїІ-Тйег СіоФ (Рготеда) та інкубували при кімнатній

Зо температурі (КТ) протягом 10 хвилин. Вимірювали люмінесценцію на планшет-ридері

ЗресігаМах М5. Усі мутанти демонстрували значно більшу ефективність у порівнянні з Раб ЕВІ- 029 дикого типу (м/) без вимірного сигналінгу І--6 в протестованому діапазоні концентрацій Бар (див. Фіг. 7).

Приклад 17: Порівняння подібних до лікарських засобів властивостей варіантів антитіл

Теплостійкість кожного варіанта Бар визначали методом диференційної скануючої флуориметрії (О5Е). Змішували 2 мкл білка з концентрацією 2,5 або 5 мг/мл з 18 мкл ФСБ та 2 мкл 50х Бурго Огапде на 96-лунковому планшеті Віокай для ПЛР. Планшет аналізували за допомогою системи ПЛР зі зворотною транскриптазою ВіоКай СЕХ9Уб КТ-РСК з лінійним підвищенням температури від 25"С до 95"С та вимірювали зміну флуоресценції у чавбі.

Обчислювали Тт як нижню точку першої похідної кривої плавлення. Усі варіанти мали виміряні значення Тт від 76 до 78 "С, що погоджується з виміряним Тт для Бар ЕВІ-029 дикого типу (м/)), рівним 76 С.

Для вимірювання агрегації, зразки оцінювали методом ексклюзійної хроматографії з багатокутовим розсіюванням лазерного світла (ЗЕС-МАЇ 5) з використанням системи ВЕРХ

Адіїепі 1260, поєднаної з інструментом для вимірювання світлорозсіювання Уууай тіпідбам/п

ТКЕО5 та інструментом для вимірювання показника заломлення Уууай Орійар гЕХ. Вводили ін'єкцією 20-100 мкг білка та аналіз проводили при швидкості подачі 1 мл/хв. Усі варіанти мали молекулярну вагу від 45000 до 52000 Да при вимірюванні методом світлорозсіювання, що узгоджується з баб ЕВІ-029 дикого типу (м).

Ці результати показують, що ЕВІ-030 має досить гарні характеристики порівняно з ЕВІ-029 з погляду властивостей, подібних до лікарських засобів.

Приклад 18: Продукування повнорозмірних антитіл Ід52 ЕВІ-029 та ЕВІ-О30 та антитіл Ід52 з мутантними Ес-доменами

Переформатування ЕВІ-029 та ЕВІ-0О30 на Ідса2 та Ідс2 з мутантним Ес

Варіабельні домени важкого ланцюга ЕВІ-029 та ЕВІ-О30, що включають лідерну послідовність (МОМ/ТМУКІ-Р МАААТОАНЗ5Ь; ЗЕО ІЮО МО:49), ампліфікували методом ПЛР з Рар- векторів з використанням праймерів, якими вводили М-кінцевий сайт ЕсоКІ та С-кінцевий сайт

Мпеї. Продукти ПЛР очищали на 1 95 агарозному гелі та проводили подвійний гідроліз ЕСОКІ-НЕ та МпеІ-НЕ. Вектори основного ланцюга на основі рТТ5, що містять послідовність важкого бо ланцюга Ідб52 дикого типу або варіант домену Ідб2 з мутацією НЗІ1ТА (НЗІ11 відповідає нумерації в 5ЕО ІЮ МО:41; це відповідає НЗІ10О в нумерації, використовуваній Магіїп еї аї.,

Моїесшіаг Сеїї, 74, 867-877 (2001)) аналогічно гідролізували ЕсоКІ-ЕН/МНеІ-НЕ та очищали на 195 агарозному гелі. Вставки лігували в гідролізований основний ланцюг з використанням ферменту ОпціКідазе (Мем ЄЕподіапа Віоїар5), трансформували в клітини ТОРІ10 (Ше

Тесппоодієз), та селектували на середовищі Ленгмюра-Блоджетт з ампіциліном (ІВ-Атр). З клонів виділяли ДНК за допомогою набору тіпіргер та секвенували для підтвердження вставки.

Мутація НЗ11А була вибрана для зниження афінності зв'язування Ес по відношенню до ЕсКп з метою зниження системного накопичення молекул, що залишають очну тканину.

Експресія та очистка варіантів (952 транзієнтною трансфекцією

ЕВІ-029 Ідаг2, ЕВІ-029 Іда2-НЗІ1А, ЕВІ-О30 Ід52, та ЕВІ-О30 Ідс2-НЗ11А експресували методом транзієнтної трансфекції в клітинах НЕК-6Е. Вектори ртТтТ5, що містять кожен важкий ланцюг, піддавали котрансфекції плазмідою ЕВІ-029 С з використанням РЕЇ як реагенту трансфекції. Супернатанти збирали через 5 днів та експресовані молекули ЇДб2 очищали методом афінної хроматографії з використанням агарози з білком А. Для очищеного білка проводили заміну буфера на ФСБ, рН 74, шляхом декількох циклів концентрування/розведення і концентрацію та чистоту білка визначали за поглинанням при 280 нм та методом ДСН-ПААГ.

Одержання стабільного пулу СНО

Стабільні пули клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО), що продукують ЕВІ-029 Ідс2,

ЕВІ-030 Ідс2 або ЕВІ-030 Ідс2-НЗ114А, були одержані з використанням набору Егеедот СНО-5 (Се Тесппоіодіє5) відповідно до інструкцій виробника. Стисло, кожен важкий ланцюг клонували шляхом стандартного гідролізу/лігування у вектор рСНО 1.0 в комбінації з ЕВІ-029 16.

Конструкти трансфекували в клітини СНО-5 з використанням реагенту Егеезує МАХ та стабільні пули селектували зростаючими концентраціями пуроміцину та метотрексату (МТХ).

Після двох раундів селекції, пули піддавали скринінгу на продукування антитіла методом аналітичної хроматографії на білку А і найкращі продуценти були вибрані для масштабування та субклонування.

Послідовністі представлені нижче.

Поліпептидна послідовність важкого ланцюга 030 (в каркасній ділянці дсе, СОВ підкреслені):

Коо) ОМОГМОБОАЕ УККРОБЗБЗУКМ 5СКАБОММІ РЕ ММ ЕМУУВОА РОСС ЕУМОаМ ТТРОССТІМУ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАЗТІ ЗЕБТАА ОСІ МКОМЕРЕРМТ УБМУМ5ЗОА! 5 СаУНТЕРАМ'О 55бІ 5 55М МТМРЗЗМЕОТ ОТУТХНВОНК РЗМТКУМОКТМ ЕВКССУМЕСРР СРАРРУДаРБ

СММЕБСОСЗУМН ЕАЇ НМНУТОК 51 5І 5РОК (5ЕО І МО:41)

Поліпептидна послідовність легкого ланцюга 030 (в каркасній ділянці ІдС2, СОК підкреслені):

СУМПДРЕБОБО ЗОТОРТІТІЗ 5БІОАЕОМАМУ МСООБЕЕМРІ ТРаОСТКІЄЇ КАТУААРБМУЕ

ІЕРРБОЕБОЇК БОТАБМУСІЇ ММЕМРАЕАКМ ОМКМОМАГОБ СМБОЕБЗМТЕО ОБКОБТУБІ 5

ЗТ ТІ ЗКАОМ ЕКНКУМАСЕМ ТНОЇІ 55РМТ КЗ5ЕМАСЕС (5ЕО ІО МО:42)

Послідовність нуклеїнової кислоти важкого ланцюга 030:

СААССЬТТОСАССТОСТОаСсАСТтТоАасасассцвАааТТААвАлассАаассАааСАасСоТСААааИТтАТ статАлддасатстатТАСаТтосСстТсССАААСТАССТадтоаААтТасвсИа тгадааСАа,сТосСас

СсСААСОаИсстТасААатТасАатаасАаТТАССАсоссстасвавассаасСАССАТТААТТАСОСССАСАА

АТТТСсАсасАСсадатаАСаАТАсСсасСсаАаСаАдатсСАСсСАатАСтТасстАСАТас:Аастатос тсАСТоОСОЯаСАааСОСАааАСАСсаасСАатТТАСтТАСТасасСсСс,асвА;аатсаАатаааАСссСтТсТТТАСТ

АТТАТаСТСОТаСаААТАСТОСОСОСССАсСасААаСаАасСсаттАсАдататСсАтстастАаСАССАДасся

СссСсАТССсОатотТІоСсссстаасассСстастоСАаааАдаСАсСстоСадс,сАХасАасаасСсаасостаса стасстааТСсААсаАСТАСТТССССОААСССЯСЯЯтТаАдсасатататавААСстсАас,еСсастотадс саласаассатТасСсАСсАсСсттСсСса,аСстатссСстТАСсАатосСстСАааАСсТстТАСсТоССсТАДасСсааси та стаодссатассСстоСАасААСтТСааСАСССАаАССТАСАССТасСААСатАаАТСАСААДаСССА

ССААСАССААСатапйАСААаАСАсттадаСасСААдАТатататааатассСсАассатасссАа

САССАССТаАТасаСАасАССатсАаТсТсСсТсТсСССССААААСССАДапАСАСССТСАТИалХт стоссааАсссСсталдсатоасатасатастоаставаСсатадаСсСАСаААаАдССсоСадаатосСА сТТсСААСТОСТАСОЯТОсАСсавоссатасАаааТтаСАТААТасСссСААаАСАААассСАСаасАасАласА сТТсСААСАаСсСАСссттосСататаатсааса,атостАссатсатасСсАССАСИЯАСТвасСтТадАсаа (510) САДССАСТАСААСТаСААааТСсТоСААСАААсасстосСАасссССАТСИАаААААССАТСТОС

ААДАДАССАддасасАааССССаАаААССАСАсСататАСАсоСстассссССАтосСсвацАасАаАТта

АССААСААССАасаИатоАа,асстадсстасстаатСАААавастСсТАССССАасСсоАСсАтсасса та датасадаАдасСсААтТасасдасСацАаААСААСТАСААаАССАСАССтТоССАТастасАстоса

АссСастосТсТсСсТСстТАСАаСААХастоАССатасАСААдадасСАааватааСАасСАсасадАСОа ТстсТсАТаСТоСОаТОАТаСАТадаасСтТоТасСсАСААССАСТАСАСЯаСАаАдА,адасстотсост атстоСасатАдАА 5ЕО І МО 43

Послідовність нуклеїнової кислоти легкого ланцюга 030: вАСАТАИТаАтТаАСТСААдАдатоСсацвАясАаасставсаатаТСАСТоСсасСсаААСасцасСААСТА тТСААСТОССОДСИаСсСсАааСсададасСа ТСАТААТТАСаасСАТОСССТТСАТОААСсТасатАТСАасА вААдаСсСсАсСалСсАаа,аССасСССАдастастТАТСтТАСсасСастсСААсСсосаасАТСАСТЯВСИаТасс

СаАТтСаАТтттАаатасддассвсатаатаайсАССаАТТТСАСАСТаАССАТСАССТОоССТТСАцваИасс сласАататаастатСсТтАТТАТТатТСсАасСААТОСЯСАХсСаААдатасСастсАсаттааЙтСАаацАА

ССАААСТОапАСАТСААХаСсЯвсассатаасСсааСсасстАатат СТ САТСТТСССАСССТОоСОАСаИад

АСсАаСстТадАдатотаасастасттосатсататасстастоААСААСТТТТАСССТАпАадОаТасАА

ААаТТСААтТапйАААаТАпАСААтТасстасАаатоСасааААСТоССА,саАатСТатсАСАС,АаСА ваАТАаИТААДасАСТСААССТАСАасстатсСАасСАСАСТалдСосСсСтТоТСОСАААасСссСсаАСТАСадиа

ААдССАСААдАСТатТАСсасттасСсцпААатТАСасСАТСАСсИаасСТатССТСАСССИ,ТТАСААААдАСИтТТТ

ТААСАСАССОСОСПСАСа ТИасСеЕО ІО МО 44

Поліпептидна послідовність важкого ланцюга 030 з мутацією НЗІ11А (311А виділений жирним шрифтом і СОК підкреслені), яка також називається в даному документі поліпептидною послідовністю важкого ланцюга 031:

ОМОГМОБОАЕ УККРОБЗБЗУКМ 5БСКАБОаММІ Р ММ ЕМУУАОА РОСС ЕУМОаМ ТТРОССТІМУ

ЗБАБІКОаРОМ ЕРІАРСЗАЗТІ ЗЕБТАА ОСІ МКОМЕРЕРМТ УБМУМ5ЗОА! 5 СаУНТЕРАМ'О

Зз5О0І 51558 МІМРЗБМЕОТ ОГТУТХНВОнНК РБЗМТКМОКТМ ЕККССМЕСРР СРАРРМАСРЗ

ЕВМУБЗМІТУМ АОУМІМОКЕМ КСКУЗМКОГР АРІЕКТІЗКТ КООРВЕРОММУ ТІ РРОВЕЕМТ

СММЕБСОСЗУМН ЕАЇ НМНУТОК 51 5І РОК (5ЕО 10 МО:47)

Зо Послідовність нуклеїнової кислоти важкого ланцюга 031:

СААССЬТТОСАССТОСТОИаСсАСТоАасасассцвАааТТААвАлассАаассАааСАасСоаТСААСаИТтАТ статАлддасатстатТАСаТтосСстсСсАААСТАССТаАТСаААТаса тада,ссАааастоссоас

АТТТСсАсасАСсадатаАСаАТАсСсасСсаАаСаАдатсСАСсСАатАСтТасстАСАТас:Аастатос зб тТСАСТоСОЯаСАааСадапАСАСсвасАатТТАСТАСТаСОСсСсСсаесАаатсаАтаааАССсСтТСТТтТАСТ

АТТАТаСТСТаСААТАСТОСОСО4СССАсСаслаАсаАССаТтТАСАаТатсСАТСТастАаСАССАДОса

СссСсАТССсОатотТІоСсссстаасассСстастоСАаааАдаСАсСстоСадс,сАХасАасаасСсаасостаса стасстааТСсААсаАСТАСТТССССОААСССЯСЯЯтТаАдсасатататавААСстсАас,еСсастотадс саласаассатТасАСсАсСсттСсСсасостатссСстТАСсАаатосСстСАааАСсТстТАСсТоССсТАДасСсаасСата стаодссатассСстоСАасААСсттСааСАСССАаАССТАСАССТасААСатАаАТСАСААаСССА

САССАССТаАТасаСАасАССатсАаТсТсСсТсТсСССССААААСССАДапАСАСССТСАТИалХт стоссааАсссСсталсатоасатасатастоставаСсатадаСсСАСаААаАССсоСадаатосСА сТТсСААСТОСТАСОЯТОсАСсавосатавАааатаСАТААТасСссААаАСАдАдассасасадасласА сТТсСААСАааСсСАсСсттосСататаатоааса,атостАассатсатаассСсАа,саАстаастаААСас

САДССАСТАСААСТаСААааТСсТоСААСАААсасстосСАасссССАТСИАаААААССАТСТОС

АССААСААССАасаИатоАа,асстадсстасстаатСАААаасттстТАССССА,СаАСсАтсассатас датасадаАдасСсААтТасасдасСацАаААСААСТАСААаАССАСАССтТоССАТастасАстоса

Бо АСсааСсТоСсТсТоСсТотТАСАаасСААласСтТСАСС,аТапАСААсСАааСАасатааСАсСАасвацААсСа тотстсАТаСТОСОЯатТаАтТасАТаАл,аастотасСсАСААССАСТАСАСОаСАаАлАалассСстоТосСстТ атотоСасатАдА (5ЕО ІЮ МО:48)

Приклад 19: Порівняння ефективності ЕВІ-0О30 та ЕВІ-029 Ідо2 в аналізі НЕК-ВіІше-1І-6

Лінія репортерних клітин НЕК-Віше"М І/6б (Іпмімодеп) була використана для порівняння ефективності інгібування сигналінгу ІЇ6б між антитілами ЕВІ-029 та ЕВІ-030 Ід2. Порівнювали три препарати (ргерз5) очищеного білка з клітин НЕК-6Е- ЕВІ-029 Іда2, ЕВІ-030 Ідс2 та ЕВІ-О30

Ідсі2-НЗІТА (також називається 031 або ЕВІ-0О31), разом з препаратом ЕВІ-О30 сег, продукованого в стабільному пулі клітин яєчнику китайського хом'ячка (СНО). Додатково, тоцилізумаб, який є схваленим антитілом проти ІбК, був включений як контроль. Для бо вимірювання антагонізму ІІ 6, людський 1-6 (НО бувієтв5 206-ІІ -010/СЕ) в концентрації 400 пмМ змішували з різними концентраціями кожного антитіло на 9б6-лунковому планшеті та інкубували при кімнатній температурі (ЕТ) протягом 30 хвилин. Клітини НЕК-Віше"М ІІ 6 на логарифмічній фазі росту трипсинізували та ресуспендовали в середовищі для аналізу (ДМНМ, 4,5 г/л глюкози, 1095 термоінактивованої сироватки плоду корови (СПК), 2 мМ /-глутаміну, пеніцилін- стрептоміцин (Реп-5(ер)) при 280000 клітин/мл. Додавали в кожну лунку ІІ -6/Рар сумішей 180 мкл суспензії клітин для доведення кінцевої концентрації ІІ -6 до 20 пМ. Клітини інкубували при 37 "С/5 96 СО» протягом 20 годин. Потім змішували 20 мкл супернатанта з кожної лунки з 180 мкл реагенту Оцапіі-Віпе"М (Іпмімодеп) та інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин перед вимірюванням поглинання при 650 нМ на планшет-ридері ЗресігаМах М5.

Результати представлені на Фіг. 8 та у Таблиці 5. ЕВІ-030 (включаючи ЕВІ-ОЗ0, продукований у НЕК-клітинах, з мутацією НЗІ1Т1А або без неї, та ЕВІ-0О30, продукований у клітинах СНО) показали значно покращену ефективність (зниження ІС5О у приблизно 50 разів та зниження ІС90 у »100 разів) порівняно з ЕВІ-029. Зростання ефективності було більшим, ніж зростання афінності, вимеряне методом ППР.

Таблиця 5

Значення ІС5О та ІС9О 11111111 сом) | сом)

ЕВНОВОЇ 1111111111111111111111111111110961 11111111

ЕВІОЗО-НУЯМТА Г//77777711111111111111111111111106611111Ї1111117124

ЕВІ-031 (також називаний в даному документі ЕВІ-030 ІдС22-НЗ11А) мав величину ІС50О, більш ніж у 75 разів меншу за ЕВІ-029, і ІС90, приблизно у 350 разів меншу, за ЕВІ-029. ЕВІ-ОЗ0, продукований у клітинах НЕК, мав ІС5О, більш ніж у 50 разів меншу за ЕВІ-029, ії ІСО9О, приблизно у 4000 разів меншу за ЕВІ-029.

Приклад 20: Математичне моделювання підвищеної ефективності на тривалість блокади І - 6 у склистому тілі (міїгеаї)

Вплив підвищеної ефективності на ступінь та тривалість блокади 1-6 після інтравітреального введення був змодельований з використанням фармакокінетичної моделі (Фіг. 9). Диференційні рівняння, що описують зміни вільного антитіла (А), вільного 1-6 (І), та комплексу антитіло/і -6 (АЇІЇ), мали такий вигляд: а/зцА) - -А"Кає - АЛІ"К1--АІ Ка а/лаціІ) - Крі - ПП "Ків - А7І"К1 А Ка а/ацА) - -АЇ "Каіе-АЛІ "КІ - А Ка де Каеє позначає швидкість кліренсу вільного антитіла зі склистого тіла, КІ! позначає швидкість асоціації для зв'язування антитіло/Лі!-б, К2 позначає швидкість дисоціації для комплексу антитіло/Іб6, Крі позначає швидкість продукування 1-6, Кеі позначає швидкість кліренсу вільного ІІ--6 зі склистого тіла, і Каіе позначає швидкість кліренсу комплексу антитіла/Лі - 6 зі склистого тіла. Були визначені вихідні значення параметрів та швидкості, наведені у Таблиці б.

Таблиця 6

Вихідні значення параметрів та швидкостей (Вихіднаконцентрація комплексу Айо 01111111

Або розраховували на основі припущень про дозу 50 мкл 50 мг/мл антитіла в око людини з об'ємом склистого тіла (міїгеаї) 5 мл. Іо оцінювали на основі клінічно виміряних значень 1-6 у склистому тілі пацієнтів з ДМН «200 пг/мл. К1 оцінювали на основі типових швидкостей асоціації антитіл ТЕ5 М" с", у той час як величина К2 змінювалася для імітації значень ефективності в діапазоні від 100 пМ до 1 пМ. Кає визначали з виміряних періодів напіввиведення зі склистого тіла кроля, які дорівнювали приблизно 11 днів, з коефіцієнтом 1,8, як було раніше виміряно для фармакокінетичних параметрів людини. Кіе визначали для періоду напіввиведення 24 години, і

Крі обчислювали як І о"Кіє.

Імітацію вільного антитіла та вільного ІЇ/-б здійснювали з використанням прикладної програми ВегеїЇеу Мадоппа за період дії лікарського засобу 300 днів (Фіг. 10). Для вимірювання тривалості інгібування було вибране порогове значення блокади 1-6 95 95. Модель прогнозує, що зростаюча ефективність антитіла значно збільшує тривалість інгібування 1-6 в оці з 130 днів для К2Ж1-100 пМ до 200 днів для К2/К1-10 пМ і до 225 днів для К2/К1-1 пМ.

Приклад 21: Фармакокінетика ІІ--ба

Фармакокінетичні (РК) експерименти на самцях новозеландських білих кролей проводила фірма РПпаптОрійта (Рогіаде, МІ). Усі тварини мали вік 12-13 місяців та вагу 2,61-3,42 кг.

Проводили порівняння наступних білків - ЕВІ-029-Іде2 (ЗЕО ІЮ МО:11 та ЗЕО І МО:12), ЕВІ- 029-ІдДа2-НЗ11А (5ЕО ІЮ МО:10 та 5ЕО ІО МО:12), ЕВІ-О30 (ЗЕО ІЮО МО:41 та 5ЕО ІЮ МО:42),

ЕВІ-0О30-ІдС.2-НЗ1Т1А (ЗЕО ІО МО:47 та 5ЕО ІЮ МО:42), ЕВІ-029 Раб (5ЕО ІЮ МО:24 та 5ЕО І

МО:12), ЕуієафФ (пастка МЕСРЕ), та тоцилізумаб (ТС27; антитіло проти ІІ 6К). Композиції усіх білків були складені з концентрацією 13,8 мг/мл в ФСБ, рН 7,4. ЕВІ-029-ІдДа2, ЕВІ-029-Ід(2-НЗ1ТА,

ЕВІ-О30, ЕВІ-030-Ідс2-НЗІ11А, ЕВІ-029 Раб, та тоцилізумаб не зв'язувалися з їх антигенами- мішенями у кроля, у той час як Еуїєаф зв'язувався з МЕСЕ кроля.

Для досліджень інтравітреальної фармакокінетики (РК), 9 тваринам вводили ін'єкцією 50 мкл досліджуваного препарату в кожне око. Перед ін'єкцією, на поверхню ока наносили лідокаїну гідрохлорид (для ін'єкцій, 2 95), 0,5 95 пропаракаїну, або 0,5 95 тетракаїну. Ін'єкції робили в середню частину склистого тіла інсуліновим шприцем ВО 300 мкл (голка 310 х 8 мм (5/16 дюйма)), введеним через задньоскроневий (догзоїетрогаї) квадрант ока. Для досліджень системної фармакокінетики, З тваринам робили ін'єкції 100 мкл досліджуваного препарату у

Зо вушну вену.

Серійні зразки крові брали у З тварин з гілок як інтравітреального (ІМТ), так і внутрішньовенного (ім) введення в моменти часу 0,083, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 240 та 336 годин, та розводили 1:1 цитрат-фосфат-декстрозним розчином і поміщали на лід. Плазму збирали центрифугуванням охолоджуваних зразків крові при 4000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 "С та зберігали замороженою при -80 "С.

Очні тканини брали з обох очей усіх тварин у гілці інтравітреального (ІМТ) введення в моменти часу 0,25, 24, 168 та 336 годин після введення дози. Тварин умертвляли внутрішньовенним передозуванням барбітурату. Для збирання водянистої вологи, одразу після евтаназії шприц з голкою вводили під рогівку та повільно відбирали водянисту вологу.

Водянисту вологу переносили в попередньо помічену пробірку та поміщали на сухий лід або заморожували при -80 "С. Для збирання рідини склистого тіла, робили маленький зріз у склері вилущеного ока за допомогою скальпеля і склисте тіло відбирали шприцем через отвір. (Об'єм) зразка визначали за допомогою поділок на шприці, переносили в попередньо помічену пробірку та поміщали на сухий лід або заморожували при -80 "С.

Для відбору сітківки та судинної оболонки, робили маленький зріз у склері вилущеного ока за допомогою скальпеля, паралельно та ближче до хвостової частини (сацааї) лімбу рогівки.

Використовували ножиці для продовження отвору навколо окружності ока, розділяючи його на дві половинки. Задню півкулю (діобе) поміщали внутрішньою частиною угору. За допомогою офтальмологічного ножа цдії!Ї Кпіте, обережно збирали сітківку з півкулі. Після того, як сітківка була зібрана з півкулі, аналогічно збирали з решти судинну оболонку. Обидва зразки, окремо, переносили до попередньо зважених та попередньо помічених пробірок РгесейПу5Ф, зважували, та поміщали на сухий лід або заморожували при -80 "С. Тканини сітківки та судинної оболонки розводили десятикратно фосфатно-сольовим буфером (ФСБ), гомогенізували та зберігали при -80 76.

Концентрації білка у кожній тканині оцінювали методом ЕГІЗА. Для ЕВІ-029-Іда2, ЕВІ-029-

Ідсі2-НЗІТА, ЕВІ-О30, ЕВІ-030-Ід(г2-НЗ1Т1А, та ЕВІ-029 Раб, на планшети Совіаг половинного об'єму покривали 1 мкг/мл людського 1-6 в ФОБ протягом 1 години при кімнатній температурі.

Лунки блокували за допомогою ФСБ, що містить 2 95 БСА, промивали, і потім інкубували з діапазоном розведень для кожного зразка, використовуючи ФСБ їж 5 95 плазма кроля «т 0,05 95 бо Тмееп-20 як розріджувач. Кожен планшет включав також калібрувальну криву з використанням 5О0 очищеного білка. Зразки інкубували при кімнатній температурі (КТ) протягом 60 хвилин, потім промивали три рази 300 мкл ФСБ, що містить 0,05 95 Пуееп-20. Потім додавали в кожну лунку анти-каппа-НКР (Сепугау Іпс.), розведену 1:10000 в ФСБ, 195 БСА, 0,0595 Тмееп-20, та інкубували протягом 30 хвилин. Лунки промивали, як описано вище, а потім додавали субстрат 3,3,5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) та вимірювали сигнал при 450 та 550 нм за допомогою планшет-ридера бресігатах. Концентрації білка розраховували за допомогою калібрувальної кривої з використанням прикладної програми Зойтах Рго 6. Кожен аналіз ЕГІЗА повторяли на щонайменше 3 незалежних планшетах і реєстрували середній період напіввиведення.

Для тоцилізумабу, концентрації білка визначали методом ЕЇГІЗА, як вказано вище, за винятком того, що анти-тоцилізумаб-авБ (ВіокКай НСА252) використовували як реагент захоплення і антилюдський ІдсС-Рс-НКР (Зідта А0О170) використовували як антитіло для детектування. Два різні аналізи ЕГІ5А використовували для вимірювання вільного та загального

ЕуїеаФ). Для вільного ЕуЇєаФ),, лунки покривали рекомбінантним МЕСЕ (КО Зуєіетв) і зв'язаний білок детектували за допомогою антилюдського ІДО-Ес-НЕР (бЗідта АО170). Для вимірювання загального Еуїєафбф), антилюдське Ес-антитіло (Зідта І2136) використовували для захоплення і антилюдський ІдДб-СН2-НЕКР (Віокадй МСАб47Р) використовували для детектування. Кожен аналіз ЕГІЗА повторяли на щонайменше 3 незалежних планшетах і реєстрували середній період напіввиведення.

Стислий виклад результатів

У більшості тварин, сильне утворення антитіла проти введеного білка спостерігали в моменти часу 240 та 336 годин. Оскільки це утворення антитіла може впливати на кліренс білка або перешкоджати проведенню ЕГІ5А, аналіз даних був обмежений моментами часу до 168 годин включно. Для інтравітреальної фармакодинаміки, усі білки ЕВІ-029 та ЕВІ-0О30 Ідса2 виводилися значно повільніше (Т12-9,3, 9,0, 15,7 та 9,8 днів для ЕВІ-0О29, ЕВІ-О29-НЗІ11А, ЕВІ- 030, та ЕВІ-О30-НЗ114А, відповідно) у порівнянні з Еуїєаф (Т/2-6,3 днів), тоцилізумабом (Т1»-4,8 днів), або Раб-фрагментом ЕВІ-029 (Т12-3,9 днів) (Фіг. 11, Таблиця 7). Аналогічні тенденції спостерігали у сітківці судинній оболонці, та волозі де ЕВІ-030 та ЕВІ-030-НЗІ1ТА накопичувалися в більш високих рівнях порівняно з ЕуЇеафФ та тоцилізумабом (див. Фіг. 12 та фіг. 13). Усі білки були детектовані в плазмі після інтравітреального (ІМТ) введення, причому ЕВІ-

Зо 029, ЕВІ-030 та тоцилізумаб накопичувалися зі значно вищими рівнями, ніж ЕуїеаФ або ЕВІ-О30-

НЗ11А (див. Фіг. 14). Аналогічно, ЕуїеаФ та ЕВІ-030-НЗ11А виводилися швидше з плазми після внутрішньовенного (ІМ) введення, причому період напіввиведення ЕВІ-0О30-НЗІТА складав приблизно половину від показників для Ід2 дикого типу внаслідок зниженого зв'язування з

ЕсКп (Таблиця 7).

Таблиця 7

Фармакокінетичні результати

ЕВВО2Я-НУЯМА Г//ССССССС1111111111Ї111111111111111111111190111111

ЕВНОЗО-НУМА Г///7777711111111Ї111111111111111111111981111111111111 6,1 (вільний), 6,3 (загальний)

ЕВНОЗО 11111116 37 (вільний), 42 (загальний)

Приклад 22: Розчинність ЕВІ-031 при високих концентраціях

Очищений ЕВІ-031 концентрували з З мг/мл до 142 мг/мл в ФСБ, рН 7,4, з використанням концентратора-центрифуги Атісоп ОКга-15. Препарати до та після концентрування аналізували на агрегацію шляхом пропускання через колонку Тозхоп ЗЗ0005МУУХІ 7,8х30 5ЕС, спряжену з інструмента для визначення світлорозсіювання Уууай тіпійам'п ТКЕО5 та інструмента для визначення показника заломлення Умуай Орійар гЕХ. Впорскували 20 мкг білка та елюювали при швидкості потоку 1 мл/хв в ФОБ. Масова частка піка з очікуваною молекулярною вагою близько 150 кДа була приблизно однаковою для двох концентрацій (90,9 956 для З мг/мл і 91,3 95 для препарату 142 мг/мл), вказуючи на те, що під час концентрування не відбувалося значного зростання агрегації білка. Ці результати демонструють, що ЕВІ-031 може бути сконцентрований до 142 мг/мл з незначною вимірною агрегацією (агрегація «10 Урв).

Приклад 23: ЕВІ-031 блокує цис- та транс-сигналінг ІІ 6

Лінію репортерних клітин НЕК-Вісе"М 1/6 (Іпмімодеп) використовували для порівняння ефективності ЕВІ-0О31 та тоцилізумабу у блокуванні цис- та трансо-сигналінгу ІЇ/б. Для цис- сигналінгу, вільний 1-6 (кінцева концентрація - 20 пМ) змішували з ЕВІ-031 або тоцилізумабом в діапазоні концентрацій на 9б-лунковому планшеті та інкубували при кімнатній температурі (ЕТ) протягом 30 хвилин. Клітини НЕК-Віне "М ІІ Є на логарифмічній фазі росту трипсинізували та ресуспендували в середовищі для аналізу (ДМНМ, 4,5 г/л глюкози, 10 96 термоінактивованої сироватки плоду корови (СПК), 2 мМ І-глутаміну, пеніцилін-стрептоміцин (Реп-е(ер)), і 50000 клітин додавали в кожну лунку в кінцевому об'ємі 200 мкл. Планшети інкубували при 37 "С/5 95

СО» протягом 20 годин. Потім змішували 50 мкл супернатанта з кожної лунки зі 150 мкл реагенту Омпмапіі-Віче"М (Іпмімодеп) та інкубували при 37 С протягом 40 хвилин перед вимірюванням поглинання при 650 нМ на планшет-ридері 5ресігаМах М5. Віднімали фоновий сигнал для лунки без ІІ -6 і потім ділили на (сигнал) для клітин, оброблених ІІ -6 без інгібітора, одержуючи відносне значення сигналінгу. ЕВІ-031 (1050-14,2 пМ) блокує вільний 1-6 з ефективністю, яка перевищує тоцилізумаб (ІС50-12,9 нМ) у »900 разів (Фіг. 16А).

Для вимірювання блокади транс-сигналінгу, експерименти проводили, як описано вище, за винятком використання гіпер-ІЇ -6 в кінцевій концентрації 200 пМ замість вільного 1-6. Гіпер-ІЇ -6 є (продуктом) генетичного злиття між 1І/-6 та розчинним рецептором І1І--6 (РізсНег єї аї., Маїиге

ВіоїесппоЇоду 15:142-145 (1997). ЕВІ-О31 сильно блокував гіпер-ІЇ-6 (ІС50-32 пМ), у той час як тоцилізумаб був нездатним істотно інгібувати сигналінг до концентрації 1 мкМ (Фіг. 168).

Ці результати показують, що ЕВІ-031 зв'язується з людським І1ЇІ-6 в сайті ІІ, або сайті, що

Зо контактує з др130, з пікомолярною афінністю, і блокує сигналінг І -6 та комплексу ІІ -6/51! -6Ка в клітинних аналізах в »900 разів сильніше, ніж тоцилізумаб.

Приклад 24: Математичне моделювання пригнічення сигналінгу 1-6 інтравітреальним ЕВІ- 031

Математичне моделювання проводили, як описано у Прикладі 20, для прогнозування тривалості часу, протягом якого інтравітреальне введення ЕВІ-О31 людям має пригнічувати 95 95 сигналінгу І/-6. Величина К?2 була взята рівною 0,12 день", так щоб К2Ж1-14 пМ за результатами вимірювання в аналізі ефективності. Т1/2 кліренсу був узятий рівним 18 днів на основі виміряного періоду напіввиведення при інтравітреальному кліренсі у кролів, з коефіцієнтом 1,8 для людей. Решта параметрів описані у Таблиці 6. Модель прогнозує, що ЕВІ- 031 повинен блокувати 9595 сигналінгу 1-6 протягом приблизно 150 днів після інтравітреального введення (Фіг. 17). Ці результати моделювання показують, що ЕВІ-0О31 може по суті блокувати сигналінг 1І--6 в оці протягом тривалого періоду часу, наприклад, до приблизно 6 місяців.

Приклад 25: Характеризація ізоформ ЕВІ-0О31

ЕВІ-031 є антитілом Ідс2. Як було описано раніше, антитіла Ідс2 існують у вигляді трьох різних структурних ізоформ - Ідс2-А, Ідсе-В та Ідс2-А/В (Фіг. 18). В цьому прикладі, були проведени експерименти для ідентифікації структурних ізоформ у зразках ЕВІ-0О31.

Аналіз ОФ-ВЕРХ

Обернено-фазовий високоефективний рідинний хромтаограф (ОФ-ВЕРХ) використовували для розрізнення різних структурних ізоформ ЕВІ-031. Удосконалений аналітичний метод Оф-

ВЕРХ, який був раніше використаний для розрізнення дисульфід-медійованих структурних ізоформ Ід052 (див. ЮОйШоп еї аї., доигпа! ої СПготайодгарпу А, 2006, 1120:112-120), був оптимізований для розрізнення ЕВІ-0О31.

Зразки ЕВІ-031, що містять приблизно 30 мкг, завантажували на колонку 2ограх 30058-С8 (150 мм х 2,1 мм, 5,0 мкм, 300 А). Температура колонка була задана рівною 75 "С. Рухомою фазою А була вода, що містить 0,1 95 трифтороцтової кислоти (ТЕА), і рухомою фазою В була суміш 55 95 ізопропилового спирту (ІРА), 40 до ацетонітрилу (АСМ), 4,9 9о води та 0,1 95 ТЕА.

Швидкість потоку становила 0,5 мл/хв. Колонку спочатку врівноважували сумішшю 90 95 рухомої фази А та 10 95 рухомої фази В протягом 2 хв з подальшою 2 хв стадією градієнта від 10 до бо 25905 В. Елюювання проводили лінійним градієнтом 25-32 905 В на протязі 21 хв. УФ-поглинання контролювали на 214 нм та/або 280 нм.

Для визначення того, чи було розрізнення пов'яане з дисульфідними зв'язками, зразки обробляли 5 мМ дитіотреїтолу (ОТ) та 10 мМ цистеїну при кімнатній температурі протягом 2 хв і потім аналізували методом ОФ-ВЕРХ (Фігура 19). Обробка ОТТ, який є сильним відновним агентом, спричинювала відновлення антитіла Ідс2, приводячи до елюювання в ранніх піках (Пік

О та Пік 1) (Фігура 19, середня панель). Обробка цистеїном, який є більш м'яким відновним агентом у порівнянні з ОТТ, також зсовує розподіл ізоформ в напрямку до ранніх піков (Пік 0 та

Пік 1), хоча й не в такому ступені, як у зразка, обробленого ОТТ (Фігура 19, нижня панель).

Дані демонструють, що метод ОФ-ВЕРХ розрізняє структурні ізоформи з різною дисульфідною зв'язністю. Різні структури дисульфідних зв'язків були підтверджені картуванням невідновленого пептиду та мас-спектрометричним аналізом: ранній елюйований пік (Пік 1) містить ізоформу Ідс2-А/В, а пізній елюйований пік (Реак 2) містить ізоформу Ідс2-А. Важливо відзначити, що ізоформа В Ідс2-В (Пік 0) не детектувалася в зразку ЕВІ-0О31 (Фігура 19, верхня панель).

Порівняння різних зразків ЕВІ-0О31

З використанням аналізу ОФ-ВЕРХ, описаного вище, зразки ЕВІ-0О31, зібрані від різних клітинних ліній, що експресують ЕВІ-031, були проаналізовані для порівняння розподілу ізоформ продукованих антитіл. Зразки ЕВІ-О31 збирали з 200-литрової культури клональної клітинної лінії, 10-литрової культури батьківської клітинної лінії та пулу стабільно трансфекованих клітин. ЕВІ-031 із клональної та батьківської клітинних ліній, що експресують

ЕВІ-031, очищали з використанням тристадійного хроматографічного методу. ЕВІ-0О31 із пулу стабільно трансфекованих клітин очищали методом очистки з білком А. Зразки аналізували способами, описаними вище.

Результати, представлені на Фігурі 20, показують, що усі три зразки ЕВІ-0О31 містили ізоформи Ід02-А та Ідб2-А/В, але без істотних кількостей Ід52-В. Ці дані демонструють, що антитіло ІдДсС2 ЕВІ-031 продукується в менш гетерогенній суміші, ніж інші антитіла Ідса2, незалежно від того, чи продукування відбувається в клональній клітинній лінії, що експресє ЕВІ- 031, батьківській клітинній лінії, що експресує ЕВІ-0О31, або в гетерогенній популяції клітин, що стабільно експресує ЕВІ-0О31. Фігура 21 показує розподіл ізоформ, одержаних від зразка ЕВІ-031

Зо з 200-литрової культури клональної клітинної лінії що експресує ЕВІ-0О31, тобто, з верхньої панелі Фігури 20. Були також виміряні площі під кривими, і розподіли ізоформ вказані у таблиці під Фігурою.

Приклад 26: Фармакокінетика за результатами досліджень на приматах

Фармакокінетику ЕВІ-031 вивчали шляхом проведення досліджень на приматах. Тестування проводили на двох самцях африканських зелених мавп. 50 мкл 50 мг/мл ЕВІ-0О31 вводили в око інтравітреальною ін'єкцією. Для апроксимації кривих використовували прикладну програму

Мадоппа.

Дані досліджень на приматах моделювали з використанням апроксимації кривих.

Диференційні рівняння, що описують зміни вмісту антитіла у склистому тілі (А) та антитіла поза склистим тілом, наприклад, системного, (Ар), мали такий вигляд: а/Я4КА) - -А"Кає а/чкКАр) - А"Кає(Оії) - Ар"'Каре

Вихідні значення параметрів та швидкості вказані у таблиці нижче:

Таблиця 8

Значення вихідних параметрів та швидкостей

Пий Ар --Початковий вмістантитілапозасклистимтілом.д ОЇ. 77777011

Інші міркування, що враховувалися при апроксимації, включають: ступінь розведення та обидві константи швидкості (гаїе сопвбіапі) мали змінні значення для апроксимації. Вихідне значення А біло постійним (2х50 мл 50 мг/мл в око об'ємом 5 мл). Результати моделювання, представлені на Фіг. 22А, 22В та 23, показують, що константи швидкості елімінації зі склистого тіла давали величини періодів напіввиведення 4,6 та 5,7 днів, відповідно, для двох мавп.

Середня константа швидкості елімінації зі склистого тіла була розрахована рівною 5,2 днів.

Системна елімінація за результатами моделювання становила 1,1 днів, та 0,63 днів (середнє 0,85 днів). Ці результати демонструють, що період напіввиведення ЕВІ-031 у склистому тілі був значно більшим, ніж системний період напіввиведення у приматів.

Приклад 27: Фармакокінетика ЕВІ-0О31

Був проведений інший фармакокінетичний (РК) експеримент, в якому 50 мкл 20 мг/мл розчину ЕВІ-031 вводили ін'єкцією інтравітреально в очі кролей. Аналізованими моментами часу були 1, 3, 7 та 14 днів (тобто, 24, 72, 168 та 336 годин). Дві тварини (чотири ока) аналізували для кожного моменту часу. Методи введення композиції ЕВІ-031, відбирання очної тканини, та визначення концентрації білка були такими, як описано у Прикладі 21.

Результати представлені на Фігурах 24А-24І. При аналізі концентрації білка в дні 1-14 у рідині склистого тіла, період напіввиведення ЕВІ-031 був визначений рівним 8,95 днів (Фіг. 24А).

Однак, в День 14 детектували сильну гуморальну імунну відповідь, яка може впливати на ці результати. При аналізі концентрації білка в дні 1-7 у рідині склистого тіла, період напіввиведення ЕВІ-031 був визначений рівним 18,88 днів.

ЕВІ-0О31 був також детектований в інших компартментах ока після інтравітреальної ін'єкції.

ЕВІ-О31 також проникав до водянистої вологи (Фіг. 248), судинної оболонки (фіг. 24С), кон'юнктиви (Фіг. 2403), рогівки (Фіг. 24Е), війкового тіла (Фіг. 24Е), кришталика (Фіг. 2405), сітківки (Фіг. 24Н) та склери (Фіг. 241). Концентрація лікарського засобу в цих тканинах була на один-два порядки величини нижче концентрації, детектованої у склистому тілі.

Інші варіанти реалізації входять до обсягу наведеної далі формули винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 ЕЛЕВЕН БАЙОТЕРАПЬЮТІКС, ІНК. «1205 ПОКРАЩЕНІ ІІ-6 АНТИТІЛА «1305 р2046-7061М0

Зо «1405 РСТ/052015/059532 «1415» 2015-11-06 «1505 62/247,705 «1515 2015-10-28 «1505» 62/087,448 «1515 2014-12-04 «1505 62/077,105 «1515 2014-11-07 «1605 54 «1705 РасепсІп уегзіоп 3.5 «2105 1 «2115 225 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 1 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бет б1у Тут А1ї1а Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сі1у Маї Іїе ТПг Рго СсСіу бек с1у ТПг Ії1е Авп Тут Аза сіп Гув РПе 50 зо бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Ггецп Акуд бехт бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 30 35

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 1600 195 110 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125

Зо зек Уаії Рпе Рго Гей Аїа Рго бБет бБет Пув бБег ТПт бет С1і1у с1у ТПг 130 135 140

А1їа Аїа їец сіу Сув Гец Уаї ув Авр Тут Ропе Рго біц Рго Уаї ТПг 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек СсС1у Аїа Іецш ТПх бег с1іу Уа1ї Ніз Трк Ріре Рго 165 170 175

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бет бБет Уаі1і Уаї ТПг 180 185 190 уаї Рко бБет бБет бБет Гец сіу ТПтї біп ТПїх Тут Іїе Сув Авп Уаї Авп 195 200 205

Нів пув Ркго бБет Авп ТПт пув Уа1і Авр гувз Ппув Уаї сій Рго Гуз бек 210 215 220

Сув 225 «2105 2

«2115 218 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 2

Авр Ії1е Уа1ї Мес ТПг біп бетг Рго Авр бБег Гей Аїа Ма1! Бек їец Щ1Уу 1 5 10 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг с1у Іїе Рго Рпе Мес Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 20

Туз Гецп Гец І1е Тут Аза Аза бек Авп Агуд сб1іу бБет Сіу Уаї Рго Авр бо 25

Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет с1у ТПї Авр Робе ТПтІ їец ТПтІ Іїее 5ег 65 70 75 80

Зо зет Ггец біп Аїа бій Авр Уаі Аїа Маі1ї Тут Тук Сув біп сіп бек сі1ц 85 Зо 95 сіц Маї Ркго Гец ТПт Рпе сіу сіп с1у ТПїх гув еп біц Іїе Гув Акгд 35 1600 105 110

Тпх Уаі Аїа А1їа Рго бек Уаі1і РпПе Іїе Рпе Ркго Ркго 5еїт Авр сі біп 115 120 125 40 теп Гпув бБет с1і1у ТПїІ Аїа бек Уаі1 Уаі1 Сув їец Гец Авп Авп Ропе Тук 130 135 140 45

Рго Акд бі Аза гуз Уаії біп Ткр гув Маії Авр Авп Аїа Гей сіп бек 145 150 155 160 50 сб1у Авп Бек сіп сій бБет УМа1і ТПпк сі сіп Авр бек Гув Авр бет ТПг 165 170 175

Тук бБет Ггец бет бБет ТПт Гей ТПх Ггецп бек пув Аїа Авр Тут со1цЧ Гуз 55 180 185 190

Ніз пуз Уа1ї Тут Аїа Сув біц Уа1ї ТПк Нів с1іп сС1у Пец бек бег Рго

195 200 205 уаї ТПІ пув Бек Рпе Авп Акд сіу січ Сув 210 215 «2105 З «2115 225 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 З сбіп Маі сбіп Гец Маі сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс

Зо сі1у Маї Іїе ТПг Рго Сіу бБехт сіу ТПк Іїе Авп Тут Аїа сіп Гув РПе бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПт Уаї Туг 35 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 Зо 95 40

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 45 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125 50 зек Уаії Рпе Рго Гей Аїа Рго бБет бБет Пув бБег ТПт бет С1і1у с1у ТПг 130 135 140

А1їа Аїа їец сіу Сув Гец Уаї ув Авр Тут Ропе Рго біц Рго Уаї ТПг 55 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек СсС1у Аїа Іецш ТПх бег с1іу Уа1ї Ніз Трк Ріре Рго

165 170 175

Ніз пув Рго бБет Авп ТПг пув Уа! Авзр Гуз пув Уаї біц Рго Ппув 5бег 210 215 220

Сув 225 «2105 4 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 4

Зо сі1у Тут Аїа Гец бБег Авп Тут Гей Іїе сі1ц 1 5 10 «2105 5 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 5 уаї Іїе ТПг Ркго сіу бБет с1у ТПї І1е Авп 1 5 10 «2105 6 «2115 13 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 6 зек Агд Тгр Авр Рго пецй Тут Тут Тут Аїа Гей сі Тук

1 5 10 «2105 7 «2115 15 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 7

Атуд Аза бБет сіц бБет Уаі Авр Авп Тут б1у Іїе Рго Рпе Меє Авп 1 5 10 15 «2105 8 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 8

Аза Аїа бБег Авп Агкд сіу бек 1 5 «2105 9 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 9 сіп б1п бек бі біц Уа1! Рко Теєц ТіПг 1 5 «2105 10 «2115» 448 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 10 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сі1у Маї Іїе ТПг Рго Сіу бБехт сіу ТПк Іїе Авп Тут Аїа сіп Гув РПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПтІ бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 Зо 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аїа Гец сіц Тут Ткгр 100 105 110 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125

Зо зек Уаії Рпе Рго Гей Аїа Рго Сув бБет Агуд Бег ТПт бБет бі Бек ТПг 130 135 140

Уаї Бек Ттгр Авп бек СсС1у Аїа Іецш ТПгт бБет СсС1у Уа1ї Ніз ТПк Рре Рго 165 170 175

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бет бБет Уаі1і Уаї ТПг 180 185 190 уаї Рко Бек Бет Авп Рпе сіу ТПх Сбіп ТПтІ Тут ТПг Сув Авп Уаї Авр 195 200 205

Нів пув Ркго бБет Авп ТПт пув Уа1і Авр гувз ТПт Уаї сій Агд Гуз Сув 210 215 220

Суз Уаії січ Сув Рко Рго Сув Рго Аїа Рго Ркго Уаі Аїа с1у Ркго бек 225 230 235 240 уаї Рпе Гецп Рпе Ркго Рко Ппув Ркго Гуз Авр ТПтІ Ггец Меє Іїе 5бБет Агд

245 250 255

ТБЕ Рго сі Ууаї ТрІ Сув Уаї Уа1ї Уаї Авр Уа1ї бег Ніз сб1цп Авр Рго 260 265 270

Сі Маї с1іп Рбе Авп Тгр Тук Уа1ї Авр сС1у Уа1ї с1іц Уаї Ніз Авп Аїа 275 280 285

Туз ТПт пув Рго Агкд бі бі біп Рбе Авп о бетї ТПтІ Рпе Акд Уа1ї Уаї1ї 290 295 300

Ззек Уаії гей ТПх Уа1 Уаі1і Аза сбіп Авр Тгтр Гец Авп с1у Гув сі Тук 305 310 315 320 пув Сув пув Уаії бБет Авп о Гув сіу Гец Рго Аїа Рго І1е сі пуз ТІПг 325 330 335

І1е Бек Ппув ТПтІ пув с1у сіп Рго Агд бі Рго біп Уаі Тут ТПтг Іец 340 345 350

Ркто Рго Бек Агд бі бі Меєсє ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Ге ТПкК Сув 355 360 365

Зо теп Уаії пув с1у Рпе Тухк Рго бек Авр Іїе Аїа Уаі сій ТЕр сіц бек 370 375 380

З5

Авп о б1у біп Рго сіц Авп Авп Тут Гуз ТПї ТБбтІ Рго Рго Меє Іец Авр 385 390 395 400 ет Авр біу бек РПпе Рпе Гей Тут бБет Пув Гей ТПт Уаії Авр пуз 5Бег 405 410 415

Атуд Тгр сб1іп біп с1у Азп Уа! Рібе Бех Сув Бек Уа1ї Меє Ніз сій Аї1а 420 425 430

Пец Нів Авп Нів Тут ТПг сіп Гпуз бек Гей бек Гей бет Рго СсС1у Гуз 435 440 445 «2105 11 «2115» 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації

«223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 11 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Ркго сіу бег 1 5 19 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Ге бій Тгр Ме 35 40 45 сіу Маї Іїе ТПг Рго сіу Бек сіу ТПтІ І1е Авп Тут Аїа біп гув РПе 50 55 бо

Сбіп б1у Акд Уа! ТПг І1їе ТПїІ Аїа Авр сі бек ТПгт бег ТПг Аїа Туг 65 70 75 80

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Рко Гей Тут Тут Тут Аїа їец сіц Тут Ткгр 100 105 110

Зо сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125

З5

Ззек Уаі РіПе Рго гец Аїа Рго Сув бБет Акуд бБет ТПтї Бек сі бек ТЕПкК 130 135 140

А1ї1а Аїа Гец сіу Сув Гец Ма1ї Гуз Авр Тут Рпе Рго бій Рго Уа1ї ТІПг 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек СсС1у Аїа Іеецш ТПх бег с1іу Уа1ї Ніз Трк Ріре Рго 165 170 175

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бет бБет Уаі1і Уаї ТПг 180 185 190 уаї Рко Бек Бет Авп Рпе сіу ТПтї біп ТПх Тут ТПг Сув Авп Уаї Авр 195 200 205

Ніз пузв Рго бБет Авп ТПг Пув Уа1! Авр Гуз ТПг Уаї б1п Агд Гуз Сувз 210 215 220

Суз Уаії січ Сув Ркго Рго Сув Рго Аза Рго Рго Уаі Аїа с1у Ркго бек 225 230 235 240 уаї Рпе Гецп Рпе Ркго Рко Ппув Ркго Гуз Авр ТПтІ Ггец Меє Іїе 5бБет Агд 245 250 255

ТБІ Рго сі Уа1ї ТПк Сув УМа1! Уа1 Уа1 Авр Уа1ї бек Нів Сс1цп Авр Рго 260 265 270

Туз ТПт пув Рго Агкд бі бі біп Рбе Авп о бетї ТПтІ Рпе Акд Уа1ї Уаї1ї 290 295 300 бек Уаї Пец ТрПтІ Уаї Уаї Ніз СсСіп Авр Тгр Гец Авп с1у Ппув біц Туг 305 310 315 320

Туз Сув пув Уаї бек Авп гув біу Гей Рго Аїа Рго Іїе сі Гув ТЕПкК 325 330 335

Зо Іїе Бек Гпув ТПг пув біу біп Рго Агд Сіц Рго Сбіп Маії Тук ТПтг Гей 340 345 350

Ркто Рго Бек Агд бі бі Меєсє ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Ге ТПкК Сув

З5 355 З6о0 365 теп Уаії пув с1у Рпе Тухк Рго бек Авр Іїе Аїа Уаі сій ТЕр сіц бек 370 375 380

Авп о б1у біп Рго сіц Авп Авп Тут Гуз ТПї ТБбтІ Рго Рго Меє Іец Авр 385 390 395 400 зект Авр біу бек РПе РпПе Гей Тут бет пув Ге ТПтї Уаі1і Авр Гуз бек 405 410 415

Агуд Тер с1іп сіп сС1у Авп Уа1! Ріе бек Сув бек Уа1 Меєсє Ніз сС1цп А1а 420 425 430

Пец Нів Авп Нів Тут ТПг сіп Гпуз бек Гей бек Гей бет Рго СсС1у Гуз 435 440 445 «2105 12

«2115 218 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 12

Авр Ії1е Уа1ї Мес ТПг біп бег Рго Авр бБет Гей Аїа Уаі1ї Бек Гецп ШУ 1 5 10 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг с1у Іїе Рго Рпе Месє Авп Тгр Тух сіп сбіп Гув Рго б1іу біп Рго Ркго 20

Туз Гецп Гец І1е Тут Аза Аза бек Авп Агуд сб1іу бБет с1і1у Уаі1і Рго Авр бо 25

Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бек с1у ТПї Авр Робе ТПтІ їец ТПтІ Іїее 5ег 65 70 75 80

Зо зет Ггец біп Аїа бій Авр Уаі Аїа Маі1ї Тук Тук Сув біп сбіп Бех сі1ц 85 Зо 95 сіц Маї Ркго Гец ТПт Рпе сіу сіп с1у ТПїх гув еп біц Іїе Гув Акгд 35 1600 105 110

Тпх Уаі Аїа А1їа Рго бек Уаі Рбе Іїе Рпе Рго Рго 5еї Авр сі сіп 115 120 125 40 теп Гпув бБет с1і1у ТПїІ Аїа бек Уаі1 Уаі1 Сув їец Гец Авп Авп Ропе Тук 130 135 140 45

Рго Акд бі Аза гуз Уа1 біп Тгр Гув Маі Авр Авп Аїа Гей сіп бек 145 150 155 160 50 сб1у Авп Бек сіп сій бБет УМа1і ТПпк сі сіп Авр бек Гув Авр бет ТПг 165 170 175

Тук бБет Ггец бет бет ТПтї Гей ТПх Ггецп бек пув Аїа Авр Тут со1цЧ Гуз 55 180 185 190

195 200 205 уаї ТПІ пув Бек Рпе Авп Акд сіу січ Сув 210 215 «2105 13 «2115 122 «2125 РЕТ «2135 Мив вр. «4005 13 сбіп Маі сбіп Гец сіп сіп бехт с1у Аї1а сій гей Уаі Агд Рго с1у ТПг 1 5 19 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Рпе бек Авп Тук 20 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Гуз біп Агд Рго сб1іу сбіп с1у Гей сі ТкЕр Ше 25 сіу Маї Іїе ТПг Рго сіу Бек сіу ТПтІ І1е Авп Тут Авп бі гув РІПе бо

Зо пув с1у пув Аїа Уаї їеп ТПг Аза Авр Пув бет бБет бет ТПт Уаї1ї Туг 65 70 75 80

Меє сіп Гец бБет бБет Гец ТПтІ бБет Авр Авр бБегт Аїа Уаі1! Тут РПе Сувг

З5 85 30 95

А1їа пув бБет Агд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 40 сіу біп сб1у ТПтг бБет УМаі! ТПт Уаї бек 5бег 115 120 45 «2105 14 «2115 111 «2125 РЕТ «2135 Мив вр. 50 «4005 14

Авр Іїе Маії Гец ТПт сіп бет Рго Аїа Бех гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01Уу 1 5 10 15 55 біп Агуд Аза ТПтІ Іїе бБет Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе бБет РПпе Месє Авп Тктр Рпе сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45

Туз Гечп їГец І1е Тут Аза Аза бек Авп о біп сіу бБет СсСіу Уаї Рго Аїа 50 55 бо

Акту Робе бет с1і1у бек с1і1у бек с1у ТПг Авр Рібе бег Іецй Авп І1е Нів 65 70 75 80

Ркто Меє бій бі Авр Авр ТПт Аїа Мес Тут РпПе Сув біп біп бек Гуз 85 Зо 95 біц Маі1і Ркго Гей ТПт Рпе сіу Аїа сіу ТПїІ Гуз гей бій Ггец Гуз 100 105 110 «2105 15 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 15 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

З5

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Рпе бек Авп Тук 20 25 30 40 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 45 сі1у Маї Іїе ТПг Рго Сіу бБехт сіу ТПк Іїе Авп Тут Аїа сіп Гув РПе бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 50 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 Зо 95 55

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 сіу біп сб1у ТПтг ТПтг Уаії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 16 «2115 111 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 16

Авр Іїе Маії Месє ТПтІ сіп бет Рго Авр бБеїт Гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01У 1 5 10 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Бек Рпе Месб Авп Тгр Тухк сіп сіп пув Рго б1у сіп Рго Рго

Туз Гечп їГец І1е Тут Аза Аза бек Авп о біп сіу бБет с1і1у Уаі1і Рго Авр

Зо 50 55 бо

З5

Ззек гей біп Аїа бі Авр Уаі1і Аїа Уаї Тут Тут Сув сіп сіп бек Гуз 85 Зо 95 40 сбіц Маі1і Ркго Гей ТПт Рпе сіу сіп с1іу ТПї Гуз гей біц Іїе Гуз 100 105 110 45 «2105 17 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 17

Сбіп Маі сбіп Гец Уаії Сіп бек б1у Аїа сіц Уа1ї пув Гув Рго сіу бБекг 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут А1ї1а Гецп бек Авп Тукг 20 25 30

Те Іїе сій Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сСіу сіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сіу Маї Іїе ТПг Рго сіу Бек сіу ТПкх Іїе Авп Тут Аїа біп гув РІПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Агуд бек бій Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 с1у біп б1у ТПг ТпПтї Уа1ї ТПкК Уа1ї Бек 5бег 115 120 «2105 18

Зо «2115 114 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 18

Авр Іїе Маії Меєсє ТПт сіп бек Рго Авр бБег Гей Аїа Уаі! бБет Іеєц 01У 1 5 10 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Рго Рпе Месє Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45

Туз Гецп Гец І1е Тут Аза Аза бек Авп Агуд сб1іу бБет с1і1у Уаі1і Рго Авр 50 55 бо

Ак Рпе Бек сіу бек біу бек б1у ТПг Авр Рпе ТПт ЇТей ТПтІ І1е 5ег 65 70 75 80

Ззек гей біп Аїа біш Авр Уаії Аїа Уаї Тут Тук Сув сі1іп сі1іп бек б1ц 85 Зо 95 сі Маї Рко Гецп ТПг Рпе сіу сбіп с1у ТПг пув еп біц І1е Гуз Агд 100 105 110

ТПг Уаї «2105 19 «2115 452 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 19 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30

Зо теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 сі1у Маї Іїе ТПг Рго Сіу бБехт сіу ТПк Іїе Авп Тут Аїа сіп ув РПе бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 40 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уаії Тут Тук Сув 85 Зо 95 45

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 50 сіу біп с1у ТПтг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бек бБегхт Аїа бБетг ТПт Гув С1у Ркго 115 120 125 55 зек Уаії Рпе Рго Гей Аїа Рго бБет бБет Пув бБег ТПт бет С1і1у с1у ТПг 130 135 140

А1їа Аїа їец сіу Сув Гец Уа1і Гпув Авр Тут РПпе Рго біц Ркго Уаї ТПг 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек с1у А1ї1а Іїец ТПг бБег сС1у Уа1 Нів ТПхг Ріоре Рго 165 170 175

А1їа уаії Ге сіп бек бек сіу Гецп Тут бБет Гей бет бБет Уаі1і Уаї ТПг 180 185 190 уаї Рко бБет бБет бБет Гец сіу ТПтї біп ТПїх Тут Іїе Сув Авп Уаї Авп 195 200 205

Ніз пув Рго бБет Авп ТПт Пув Уа! Авзр Гуз пув Уаї біц Рго Ппув 5бег 210 215 220

Сузв Авр Гув ТПт Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сі Іец Іец 225 230 235 240 сі1у бі1у Рко Бек Уаії РПпе Гецп Рпе Рго Рго пув Рго Гув Авр ТПт Гей 245 250 255

Меє Іїе бБег Агд ТПт Рко сіц Уа1і ТПїх Сув Уаї Уаї Уаії Авр Уаї 5ег

Зо 260 265 270

Ніз с1п Авр Рго сі Уа1! пув Рре Авп Тгр Туг Уа1і Авр сС1у Уа1ї Сс1ц 275 280 285

З5 уаї Нів Авп АТїа Гуз ТПхїх Кпув Рго Атд бі бі Сіп Тут Авп бег ТЕПг 290 295 300

Тут Агд Уа1! Уаї бек Уа1! Ге ТПх Уаї Ієц Нів біп Авр Тгр Іец Авзп 305 310 315 320 с1у пув бі Тук Гпув Сув Пув УМа1ї Бек Авп Гуз Аїа Тей Рго Аїа Рго 325 330 335

Іїе сіц пув ТПтІ І1е бБехт Гпув Аїа Гуз С1у біп Рго Агд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПкг Гец Рко Рко бБет Агуд Авр бі Гец ТПтІ пув Авп сбіп Уаї 355 360 365

Ззек Гей ТПх Сув Ггец Уа1 пув с1у Рпе Тут Рго 5еїт Авр І1е А1їа Уаї1ї 370 375 380 бі ТкЕр бій бБег Авп сіу сіп Рко бі Авп Авп Тут Гуз ТПтї ТпПг Ркго 385 390 395 400

Рко Уаії гей Авр бек Авр біу бек РПпе РпПе Гецй Тут Бек Гпув Гец ТЕПкК 405 410 415 уа1ї Авр Ггув бБет Акд Тктр сіп сіп с1у Авп Уаі РпПе бет Сув бБет Уаї 420 425 430

Меє Нів сіц Аїа Тец Нів Авп Нів Тук ТПт Сіп Гуз бБетк Іїец бекг Гец 435 440 445 бек Рго б1УуУу Гуз 450 «2105 20 «2115 1356 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 20 саадсдсадс гддсдсадес аддддссдад дЕсЕсаадаадс садддадсад садссаадчата

З5 бо гЕсСЕєЧдсааад сСЯєссСЕДдЧдсва сдсессЕЄсса аастасстда ссооаасддає даддсаддсе 120 сссддссаад дссЕддааєсуд чаєсдчодадчадес ассасссстуд ддадсоддсас саєстсааєтас 180 дсссачааає Ессаддчаса адсдасдаєсє ассдссдасд адсссассад бассдсстас 240 асддадсвдеЕ ссісассссу садсдаддас асддсадЕсс ассассдсдс ссодачссвдва 300 гдддасссос ЕссТастаєвта єдсЕсвЕддаа саседдддсес адддаасдас саЯассасадсд

З6о

Есаєсьрдсса дсасаааадд ассаєсадес сссссасссд сіссессаєс саададсаса 420 адеЕддеЕддса стрдсадссст ЄддасеЕдсстд дедааачаєє асссссссда асстдессаса 480 чЕЕЕСЕсоода асіссддсдс асесдасаєсс ддадсасаса сЕсесссадс єдсдстдсад адсеЕсаддас Едсарадссе дЕСЕсСЯодеЕдЯд деЕсассдеЕсс саєсєсдєсєсдад т ЕСсСссддсаса бо садасасаса Ессдсаасуді саассасаад сссессааса саааадсдда баадааддес бо чадсссааає сЕгєдсдасаа дасссатасу ЄдЕсссІссс дЕсссоасссс гдаастоасод 720 чдчадздссссЕс стдсдеЕссс дЕссСссасся аадссааадча асассстсдає дассадсс9ад 780 асЕсссдадад Есасстоаєсає двагддЕдчає даеЕдеЕСссаєд аадасссеєда дассаадесс 840 аагєдасасаа єдчаєдоасді сдаддеЕдсає аасдсааааа ссаадссдад ачаддадсад 900 тасаасадса сставгачачЧче адедадсудєсєс седассдеЕсс сасаєсаддча Єсддсесаає 960 ддсааадаає асаадсдсаа ддсаадсаас ааддссстас ссдсассаає ададаадчасс 19020 ассеЕссаадд сдаааддсса дсссадддад ссссаддссс асасассдсс ЕсСссусас9с 1980

Зо часчдаастаа сааадаасса ддсдЕсСЕсСЕсС ассЕдсссісуд ссаадддсеес єсасссссс 1140 часаєссдсся гдчадсдодда аєссааєсддс садсссдада асаасєсаєаа дасаассссс

З5 1200 ссадессстдч асссадчасуд чдяЕСЧЯСЕСЕЄЕ сставгасадса адсеєдассяє дчасаадссяс 1260 сдстгддсаас аддддаасчє чЯчЕСссСЕсСЕсудс ЕСТтДЕтТаєсодс асдаадсдсесс дсасааєсає 1320 гаєасссада адсссстідеЕсС ссеЕдадсссс дддаад 1355 «2105 21 «2115 212 «2125 РЕТ «213» Хомо сапієнс «4005 21

Меє Авп о бБет РПе бБет ТПтІ бет Аїа Рпе Сіу Рго Уаі Аза РпПе бет Іец 1 5 19 15 с1у Гей Гей Гец Маі Гец Рго Аїа Аїа Рбе Рго Аза Рго Уаі1і Рго Ркго 20 25 30 сСі1іу б1ц Авр бек Гув Авр Уаї Аїа АТїа Рго Ніз Агд Сіп Рго Ієц ТЕГ 35 40 45

Зек Бек бій Агд Іїе Авр пув Сбіп Іїе Агу Тут Іїе Гей Авр с1у Ше 50 55 бо зек А1ї1а гей Агд гув бі Тк Сув Авп оГув бБет Авп Меє Сув сіц бек 65 70 75 80 зект гув біц Аза Гей Аїа сій Авп Авп Гей Авп о Гец Рго Гуз Меєс Аїа 85 Зо 95 січ гув Авр с1у Сув Рпе сіп бет с1у Рпе Авп біц біц ТПт Сув Гец 1600 105 110 маї пув Іїе Іїе ТПт сіу Гец Ге сі Рпбе біц Уаї Туг їеч сбіцЧ Туг 115 120 125 теп сіп Авп Акуд Робе бі бек бек бі бі біп Аїа Агуд Аїа Уаї сіп 130 135 140

Зо

Меє бБет ТПтІ Гпув УМаії Гецп І1е сіп Рпбе Гей біп ув пув Аїа Гув Авп 145 150 155 160 теп Авр Аїа І1ї1е ТПтї ТПх Рго Авр Рго ТПтІ ТіПг Авп Аїа бБет Іец Гец 165 170 175

ТЕ гузв Гец б1п АТїа СсСіп Авп Сбіп Тгр Гїецш Сб1іп Азр Меє ТПг ТіПг Ніз 180 185 190 теп І1ї1е гец Акд бек РпПе гув бі Рпе Гей Сбіп бБет бБеїт Гей Агд Аїа 195 200 205 теп Акд сіп Меє 210 «2105 22 «2115 218 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 22

Авр Іїе Маії Месє ТПтІ сіп бет Рго Авр бБеїт Гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01У 1 5 19 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Рго Рпе Мес Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45

Ззек гей біп Аїа біш Авр Уаії Аїа Уаї Тут Тук Сув сі1іп сі1іп бек б1ц 85 90 95 сіц Маї Ркго Гец ТПт Рпе сіу сіп с1у ТПїх гув еп біц Іїе Гув Акгд 100 105 110

Зо

Тпх Уаі Аїа А1їа Рго бек Уаі Рбе Іїе Рпе Рго Рго 5еї Авр сі сіп 115 120 125

З5 теп Гпув бБет с1і1у ТПїІ Аїа бек Уаі1 Уаі1 Сув їец Гец Авп Авп Ропе Тук 130 135 140

Рго Акд бі Аза Гуз Уаії сіп Ткр ув Маі Авр Авп Аїа Гецй Сіп 5ег 145 150 155 160 сб1у Авп бБет біп сіц бБет Уа! ТПтї сі біп Авр бет пув Авр бБет ТПг 165 170 175

Тук бБет Ггец бет бет ТПтї Гей ТПх Ггецп бек пув Аїа Авр Тут со1цЧ Гуз 180 185 190

Ніз пуз Уа1ї Тут Аїа Сув біц Уа1ї ТПк Нів с1іп сС1у Пец бек бег Рго 195 200 205 уаї ТПІ пув Бек Рпе Авп Акд сіу січ Сув 210 215

«2105 23 «2115» 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 23 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 25 сі1у Маї Іїе ТПг Рго Сіу бБехт сіу ТПк Іїе Авп Тут Аїа сіп Гув РПе бо біп б1у Аткуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бБетг ТПт Аїа Туг

Зо 65 70 75 80

З5

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аїа Гец сіц Тут Ткгр 100 105 110 40 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125 45 зек Уаії Рпе Рго Гей Аїа Рго Сув Бек Агуд бБетг ТПт бБет бі бек ТІПг 130 135 140

А1їа Аїа їец сіу Сув Гец Уаї ув Авр Тут Ропе Рго біц Рго Уаї ТПг 50 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек СсС1у Аїа їец ТПгт бБехт СсС1у Уаї Ніз ТрПк Рре Рго 165 170 175 55

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бет бБет Уаі1і Уаї ТПг 180 185 190 уаї Рко Бек Бек Авп Ропе с1іу ТПтї біп ТПх Тут ТПг Сув Авп Уаї Авр 195 200 205

Суз Уа1 січ Сув Ркго Рго Сув Рго Аза Рго Рго Уаі Аїа с1у Ркго бек 225 230 235 240

Ууа1ї Рпе Гецп Рпе Ркго Рго Пув Рго Гув Авр ТПтї Гец Мес І1ї1е 5ег Агд 245 250 255

Зо бек Уаї Пец ТрПтІ Уаї Уаї Ніз СсСіп Авр Тгр Гец Авп с1у Ппув біц Туг 305 310 315 320 пув Сув пув Уаії бБет Авп о Гув сіу Гец Рго Аїа Рго І1е сі пуз ТІПг 325 330 335

Ркто Рго Бек Агд бі бі Меєсє ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Ге ТПкК Сув 355 360 365 теп Уаії пув с1у Рпе Тухк Рго бек Авр Іїе Аїа Уаі сій ТЕр сіц бек 370 375 380

Атуд Тгр сб1іп біп с1у Азп Уа! Рібе Бех Сув Бек Уа1ї Меє Ніз сій Аї1а 420 425 430 їец Нів Авп Нів Тук ТПт сіп Гпув бек Іец бет Іец бБет Рго сС1у Гув 435 440 445 «2105 24 «2115 230 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 24 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сі Маї Ппув Гпув Ркго сіу бег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго біу сіп с1у Гец сій Тгр Меєс

Зо сіу Маї Іїе ТПг Рго сіу Бек сіу ТПтІ І1е Авп Тут Аїа біп гув РПе бо 35 Сбіп б1у Акд Уа! ТПг І1їе ТПг Аза Авр сі бек ТПг бБег ТПг Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 40 85 Зо 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Рго Гей Тут Тут Тут Аїа їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 45 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125 50

Ззек Уаі РіПе Рго гец Аїа Рго бет бет пув бБетї ТПтї Бек сі1у с1у ТЕПкК 130 135 140 55 А1ї1а Аїа Гец сіу Сув Гец Ма1ї Гуз Авр Тут Рпе Рго бій Рго Уа1ї ТІПг 145 150 155 160

Аїа Маї Гец сіп бек бБет Сіу Гей Тук бБет Ггецп бек бБег Уаі Уаї ТЕГ 180 185 190 уаї Рко бБет бБет бБет Гец сіу ТПтї біп ТПїх Тут Іїе Сув Авп Уаї Авп 195 200 205

Сув Авр Гув ТПт Ніз ТіК 225 230 «2105 25 «2115 327 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид"

Зо «4005 25 зек А1ї1а бек ТПх Кгув біу Рго бБет Маії РпПе Ркго Гей Аїа Рго Сув бек 1 5 10 15

Ак бБет ТПт бег біц бБет ТПїІ Аїа Аїа Іїецй Сс1у Сув Гей Уаії Гпув Авр 20 25 30

Тук Рпе Рко сіц Ркго Уаї ТПтІ Уаі1і бек Тгр Авп бБет с1у Аїа Гец Тік 35 40 45 бек сі1у Маї Ніз ТП Рібе Рго Аїа Уаї їєц Сіп бет бек С1у Гец Туг 50 55 бо

Зек Гецп бек бек Уаі1 Уа1 ТПг Маї Рго бБет бек Авп Рпе сС1у ТПг сбіп 65 70 75 80

ТПк Тук ТБкг Сув Авп Уа1ї Авр Ніз Кпув Рго бек Азп ТПтІ Гуз Уаї Авр 85 Зо 95 пув ТПг о Уаї сбіц Агуд Гуз Сув Сув Уаі січ Сув Рго Рго Сув Рго Аїа 100 105 110

Ркто Рго Уаі Аїа сіу Рго бек Уа1і Рпе Гец Рпе Рго Ркго Ппув Рко Гуз 115 120 125

Авр ТпПїІ Гец Мес І1ї1е 5ет Агуд ТПк Рго СсСіц Уа1і ТПг Сув Уаії Уаї Уаї 130 135 140

Авр Уаіїії бек Нів сбіцп Азр Рго сіц Уаі1ї біп Рбе Азп Ткгр Тук Уа1ї! Авр 145 150 155 160 сіу Ммаї сіц Уаї Нів Авп Аїа Пув ТртІ Кпув Рго Агд Сі б1іц с1п РБе 165 170 175

Авп о бБет ТПтї Ріе Агуд Уа1ї Уа1! Бех Уаї їецш Трх Уаї Уаі1ї Нів с1іп Авр 180 185 190

ТЕр гец Авп с1у пузв бі Тук гув Сув пПув Уаії бБет Авп Гуз с1УуУ Гец 195 200 205

Рго Аїа Рго Іїе сбіп Гпув ТПг Іїе б5Бет Пув ТПгІ Гув сі1іу біп Рго Агд 210 215 220 біц Ркго біп Маї Тут ТПт Гец Рко Рко бБет Акд бі бі Меєсє ТПБг Гуз

Зо 225 230 235 240

Авп о біп Уаії бБет Гец ТПт Сув Гец Уа1і гуз біу Рпе Тут Рго бБетї Авр 245 250 255

З5

І1ї1е Аїа Уаії сіц Ткр сі бБегт Авп б1у біп Рго біц Авп Авп Тут Гувг 260 265 270

ТПЕ ТПт Рко Рко Меє гей Авр бек Авр сіу бБет РПе РПе Ге Тук бек 275 280 285

Тпув Гецп ТПг Уаії Авр Гуз Бек Агд Тгтр біп сбіп сб1у Авп Уаі1і РПе 5ег 290 295 300

Суз бек Уаї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПтІ с1іп Ппув бег 305 310 315 320 теп бБет Гец бет Рко с1УуУу Гуз 325 «2105 26 «2115 654

«2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 26 часасадеда єдасесааад сссодасадс сіддсояддеЕдс сасеЕсддсда асдвддсаасе бо ассаассдсс дадссадсда чадсдеЕсдає ааєтасддса ЕСсСсссЕссає даасеєдатсає; 120 садсадаадс саддасадсс дсссаадсвд сеЕтаєстасу ссудсеЕсссаа ссдддадаєса 180 чадасдсссо ассчаєєссад сдодаадсоддЕ адедддассд ассеєсасасо дассаєсадс 240 гЕсссеЕссада ссдчадчасдеі додсєдЕСТає стаєєдессадс аасссддадда адсдссдсес 300 асдЕссддЕс адддаассаа ассрддачдчаєс аадсодчассд гадсддсдес гадсдЕСстс

З6о арсеЕссссас ссіссдасда асадседаад ЕСсСЕддсасід сЕсссссдеЕ дЕДДСсССЕДЧСЕС 420

Зо аасаасЕсєее ассстадада ддсаааадес саасддааадч садасаасдс сестрдсачЧчессс 480 чадаассссс адчадсссдс сасададсад чавгадсаадд асссаасста садсстдссс 540

З5 адсасаседа сссоссссаа адссдассас дадаадсаса аадеєдстасоадс єсодасдваадцс бо асдсаєсадд додссдсссеіс асссдеЕсаса аааадсееєса асададддда дЕдс 654 «2105 27 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 27 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 19 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Аїа Гецп бек Авп Тукг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сіу Маї Іїе ТПг Рго сіу Бек сіу ТПтІ І1е Авп Тут Аїа біп гув РПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПт Уаї Туг 65 70 75 80

Меєс сій Гец бег бек Гец Агуд Бек сій Авр ТПт Аїа Уаії Тут Тук Сув 85 90 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 1600 105 110 сіу біп сб1у ТПтг ТПтг Уаії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 28 «2115 467 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид"

З5 «4005 28

Меє Авр Ттр ТПІ Тгр Акуд І1е Гецп Рпе Гей Уаі Аза Аїа Аза ТПтІ 01Уу 1 5 10 15 40

А1ї1а Нів бек біп Уаї СсСіп Гц Уаї Сіп бек б1у Аїа сСіцш Уаї Ггув Гуз 20 25 30 45 Рго Сіу бБет бек Уаі1і! Ппув Уаії бБет Сув Гув Аїа бет С1і1у Туг Аїа Гец зек Авп Тут ге Іїе біп Тгтр Уаі Агу сіп Аїа Рко с1у сіп сС1УуУу Гей 50 зо бо бі Тер Месє с1у Маії Іїе ТПтї Рко сСіу бек б1іу ТПтІ Іїе Авп Тут А1а 65 70 75 80 біп гув Рпе сбіп сіу Акд Уа! ТПІ І1е ТПїх Аза Авр біц бет ТПт 5бег 85 Зо 95

ТПх Аїа Тут Мер Сі Гей бек бек Гей Агуд бБет б1ц Авр ТПх Аїа Уаї1ї 1600 195 110

Тухк Тут Сув Аї1а Акд бек Агуд Тгр Авр Рго їец Тут Тут Тут Аїа Гец 115 120 125 біц Тук Тер с1у сіп сіу ТПт ТПт Уа1і ТПї Уаї бБет бБет Аїа бет ТПг 130 135 140

Кпув с1у Рко бБет Маі1і! Рпе Рго Гей Аза Рго Сув бБетг Агуд бБет ТПк 5Бег 145 150 155 160

Сбіц бек ТПІ АТїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уа1і гув Авр Тут РПпе Рго с1ц 165 170 175

Рго Уа1 ТіПт Уаї бек Тгр Авп бек б1у Аїа Гєц ТПтІ бек СсС1і1у Уа1ї Нів 180 185 190

ТПЕ Рпе Ркго А1їа Уаії Гей біп бек бек біу Гецп Тут бБет Гецп бек бек 195 200 205

Зо уаї Маї ТПт УМаї Рко бБет бБет Авп Рпе С1іу ТПт біп ТПтІ Тут ТПтг Сув 210 215 220

Авп оУа1 Авр Нів Кув Рго бБехт Авп ТПг Гуз Ма1 Авр Гув ТПг Уа1! СсС1ц 225 230 235 240

Атд о гув Сув Сув Уаі сіц Сув Рко Рго Сув Рго Азїа Рго Рго Уаї А1а 245 250 255 с1іу Рго бБет МУМаії РПпе Гец Рпе Рго Рго пув Рго Пув Авр ТПт Гїец Меє 260 265 270

ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уаї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї! бег Ніз 275 280 285 біЧ Авр Рго біц УМаі сіп Рбе Авп Тгр Тух Уа1 Авр сіу Уаї біц Уаї 290 295 300

Нів Авп о Атїа Ггув ТПк КГув Рго Агд сі Сі сб1п Ррбе Авп бек ТПтг РБе 305 310 315 320

Атд Уаї1ї Уа1! бек Уа1ії Гец ТБг Уаї Уаї Нів сіп Азр Тер Іец Азп 01У 325 330 335 пув сі Тук гпув Сув КГув Уа1! бБег Авп пув сіу Гей Рго Аїа Рго Іїе 340 345 350 біц пув ТПтІ Іїе бБег Гпув ТПт Гпув сіу сіп Рго Акд бій Рго біп Уаї 355 360 365

Тук ТПт Ггец Рко Рго бек Агд бі бі Меєсє ТПтІ Гув Авп сіп Уа1ї бек 370 375 380 теп ТПт Сув Гец Уаії гуз б1у Рбе Тук Рго бБет Авр Іїе Аїа Уа1 с1ц 385 390 395 400

ТЕр сіц бБет Авп сбі1у біп Рго бі Авп Авп Тут Пув ТПтї ТПкг Рго Рго 405 410 415

Меєс гей Авр бБег Авр біу бек РПпе РПпе Гей Тут бек Ппув Гец ТПт Уаї 420 425 430

Авр Гув бБет Агд Тгр сіп сіп с1у Авзп Уа1і Рібе бет Сув бБет Уаії! Меє

Зо 435 440 445

Ніз с1п АТїа Пец Нівз Авзп Нів Тут ТПг біп Гуз бет Пец бек Ієц 5бег 450 455 460

З5

Рко с1У Гувг 465 «2105 29 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 29 сіу сб1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сіу бехт сі1у сС1у сб1у с1у бБекг 1 5 10 15 «2105 30 «2115 5 «2125 РЕТ

«213» Штучна послідовність «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 30

Авр Гуз ТПх Нів Тог 1 5 «2105 31 «2115 10 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 31 сіу Тук Маї Гей Рго Авп Тут Гец Ії1е с1ц 1 5 10 «2105 32 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 32 уаї ТПг ТПкг Рго сіу сі1у с1у ТПїх І1е Авп 1 5 10 «2105 33 «2115 13 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 33 зек Агд Тгр Авр Рго пецй Тут Тут Тут Аїа Гей сі Тук 1 5 10 «2105 34

«2115 15 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 34

Атуд Аза бБет сіц бБет Уаі Авр Авп Тут б1у Іїе Рго Рпе Меє Авп 1 5 10 15 «2105 35 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 35

Аза Аїа бБегт Авп Акд сіу бег 1 5 «2105 36 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 36 сіп б1п бек бі біц Уа1! Рко Теєц ТіПг 1 5 «2105 37 «2115 122 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 37 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут МУМаії Гей Рго Авп Тук 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сі1у Маї ТПпх ТПг Рго СсСіу сСіу сіу ТПпк Іїе Авп Тут Азїа сіп Гув РПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тук Сув 85 Зо 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 100 105 110 сіу біп сб1у ТПтг ТПтг Уаії ТПт Уаї бек 5бег 115 120

Зо «2105 38 «2115 114 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність

З5 «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 38

Авр Іїе Маії Месє ТПтІ сіп бет Ркго Авр бБеїт Гей Аїа Уаі! бБет Іец с1Уу 1 5 10 15 бі Агуд Аза ТПг Іїе Авп Сув Агуд Аза бег бій бек Маії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Рго Рпе Мес Авп Тктр Тут сіп біп гув Рго с1у сіп Ркго Ркго 35 40 45

Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет с1і1у ТПї Авр Рпе ТПтІ Гец ТПтІ І1е 5ег 65 70 75 80

Ззек гей біп Аїа біш Авр Уаії Аїа Уаї Тут Тук Сув сі1іп сі1іп бек б1ц 85 Зо 95 сіц Маї Рго Ге ТПт Рпе сіу сіп сіу ТПг пув Гецп сіц Іїе Гув Акгд 100 105 110

ТПг Уаї «2105 39 «2115 230 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 39 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15

Зо зетк Уаії пув Маі1ії Бек Сув Гпув Аїа бБет сіу Тут Уаії Гецп Рго Авп Туг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс

З5 35 40 45 сіу Ма1і ТПг ТПг Рго сіу сіу сіу ТПтІ І1їе Авп Тут Аїа біп гув РПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Аза Акуд Бек Агд Тгр Авр Рго Гей Тут Тут Тут Аза їецй сіц Тукг Тгр 100 105 110 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПтІ пув С1Уу Ркго 115 120 125

Ззек Уаі РіПе Рго гец Аїа Рго бет бет пув бБетї ТПтї Бек сі1у с1у ТЕПкК

130 135 140

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бет бБет Уаі Уаї Тк 180 185 190 уаї Рко бБет бБет бБет Гец сіу ТПтї біп ТПїх Тут Іїе Сув Авп Уаї Авп 195 200 205

Нів пув Ркго бБет Авп ТПт пув Уа1і Авр гувз Ппув Маї! Сі Рко Гув 5бег 210 215 220

Сув Авр Гув ТПт Ніз ТіК 225 230 «2105 40 «2115 690

Зо «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 40 саадсдсадс гддсдсадсс аддддссдад дсгаадаадс садддадсад сдссааддаеа бо гЕсСЕєЧдсааад СсСЧЯєссСЕдЧєЄсСа сдЕсстЕссса аастасстда ЕСсдааєсддас даддсаддсе 120 сссддссаад дссеЕддааєд даєсддачадес ассасссстуд ддддсоддсас саєстсааєтас 180 чдсссачааає Ессаддчас адсдасдасе ассдссдасд адсссассад бассдсесстас 240 асддадсвЕдеЕ ссісассссу садсдаддас асддсадЕсс ассассдсдс ссодадссда 300 гдддасссос Ессастаєса сдсЕсЕддаа саседдддсес адддаасдас саяассасадед

З6о

Есаєсрдсса дсасаааадд ассаєссадес сссссасьсд сіссеЕссаєс єаададсаса 420 ачдеЕддЕддса срдсадссс сдодассдссод дсдааачаєєс ассессссда асседеЕсаса

ЧФЕЕЕСЕєЧдда асЕссддедс ассдасаєсс ддадсасаса сЕсссссадс гдЕдстьосад 540 адсеЕсаддас гЕдсавадссо чЕСЕЕСЯодЕд дЕСасСЕДдДеЕссС саєсєсдссдад ЕСЕссддсаса бо садасасаса Еєссдсаасудс саассасаад сссссааса саааадсдда ЄаадааддеЕс бо чадсссааає сесбдеЕдасаа аасасасаса 690 «2105 41 «2115 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 41 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 19 15

Зо

Ззек Уаії пув Уа1і бек Сув пув Аїа бек с1у Тут МУМаії Гей Рго Авп Тук 20 25 30

З5 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 40 сі1у Маї ТПпх ТПг Рго СсСіу сСіу сіу ТПпк Іїе Авп Тут Азїа сіп Гув РПе зо бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 45 65 70 75 80

Меє бій Гец бБет бБет Гец Акд бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 30 35 50

Ззек Уаі РіПе Рго гец Аїа Рго Сув бБегт Атуд бБетї ТПтї Бек сі бек ТЕПкК 130 135 140

Суз Уаії січ Сув Ркго Рго Сув Рго Аза Рго Рго Уаі Аїа с1у Ркго бек 225 230 235 240

Зо Ууа1ї Рпе Гецп Рпе Ркго Рго Пув Рго Гув Авр ТПтї Гец Мес І1ї1е 5ег Агд 245 250 255

ТБЕ Рго сі Ууаї ТрІ Сув Уаї Уа1ї Уаї Авр Уа1ї бег Ніз сб1цп Авр Рго

З5 260 265 270

Туз ТПт пув Рго Агкд бі бі біп Рбе Авп о бетї ТПтІ Рпе Акд Уа1ї Уаї1ї 290 295 300 бек Уаї Пец ТрПтІ Уаї Уаї Ніз СсСіп Авр Тгр Гец Авп с1у Ппув біц Туг 305 310 315 320 пув Сув пув Уаії бБет Авп о Гув сіу Гец Рго Аїа Рго І1е сі пуз ТІПг 325 330 335

Ркто Рго Бек Агд бі бі Меєсє ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Ге Тік Сув

355 360 365 теп Уаії пув с1у Рпе Тухк Рго бек Авр Іїе Аїа Уаі сій ТЕр сіц бек 370 375 380

Авп о б1у біп Рго сіц Авп Авп Тут Гуз ТПї ТБбтІ Рго Рго Меє Гец Авгр 385 390 395 400 зект Авр біу бек РПе РпПе Гей Тут бет пув Ге ТПтї Уаі1і Авр Гуз бек 405 410 415

Атд Тгр сб1іп біп с1у Азп Уа! Рібе Бех Суз бек Уаї Меє Ніз сб1п Аї1а 420 425 430 їец Нів Авп Нів Тук ТПт сіп Гпув бек Іец бет Іец бБет Рго сС1у Гув 435 440 445 «2105 42 «2115 218 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205

Зо «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 42

Авр Іїе Маії Месє ТПтІ сіп бет Рго Авр бБеїт Гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01У 1 5 10 15 біЧ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Акуд Аїа бек бій бет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Рго Рпе Мес Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45

Туз Гецп Гец І1е Тут Аза Аза бек Авп Агуд сб1іу бБет с1і1у Уаі1і Рго Авр бо 50 Ак Рпе Бек сіу бек біу бек б1у ТПг Авр Рпе ТПт ЇТей ТПтІ І1е 5ег 65 70 75 80

Ззек гей біп Аїа біш Авр Уаії Аїа Уаї Тут Тук Сув сі1іп сі1іп бек б1ц 55 85 Зо 95 сіц Маї Ркго Гец ТПт Рпе сіу сіп с1у ТПїх гув еп біц Іїе Гув Акгд

1600 105 110

Тпх Уаі Аїа А1їа Рго бек Уаі Рбе Іїе Рпе Рго Рго 5еї Авр сі сіп 115 120 125 теп Гпув бБет с1і1у ТПїІ Аїа бек Уаі1 Уаі1 Сув їец Гец Авп Авп Ропе Тук 130 135 140

Рго Акд бі Аза гуз Уа1 біп Тгр Гув Маі Авр Авп Аїа Гей сіп бек 145 150 155 160 сб1у Авп бБет біп сіц бБет Уа! ТПтї сі біп Авр бет пув Авр бБет ТПг 165 170 175

Тут Бек Гей бек бБет ТПтї Гей ТПг Гей бек Пув Аза Авр Тут січ Гув 180 185 190

Зо «2105 43 «2115 1344 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 43 саадсдсадс гддсдсадсс аддддссдад дсгаадаадс садддадсад сдссааддаеа бо гЕСЕсЧдЧвааад сдЕєсСтдддЕса сдєсстссса аастасстда ссдааєддде даддсаддсе 120 сссддссаач дссгддаасд чаєсддададее ассассссід додддсддсас сассааєссас 180 чдсссачааає Ессаддчас адсдасдасе ассдссдасд адсссассад бассдсесстас 240 асддадсвЕдеЕ ссісассссу садсдаддас асддсадЕсс ассассдсдс ссодадссда 300 гдддасссос Ессастаєса сдсЕсЕддаа саседдддсес адддаасдас саяассасадед

З6о

Есаєсрдсса дсассааддд сссассуддесс сссссссвддд содсссодсеЕсС саддадсасс

Ессдададса садсддсессІ дддсЕдссвд дЕСааддасоі асеЕсссссдда ассоддедас 480

ЧдЕДдЕСЯОсоода асісаддсдс ссрдассадс ддсдсдсаса ссЕсссддс ЕдЕсстасад 540

ЕссЕСаддас ЕСТтасссссо садсадсдєд деЕдассдердс ссіссадсаа сЕссддсасс бо садасссаса ссрдсаасус адассасаад сссадсааса ссааддсдда саадасадсе бо чадсдсааає аЯчЕсЧдЕдсЕсда деЕдсссассдя гбдсссадсас сасстрдсддс аддассаєса 720 дЕСЕсСсСсСІсСЕ сссссссааа асссааддас ассстсаєда гсЕсссуддас ссстдададес 780 асдЕдсдЕда ЕдЧадсддасді дадссасддаа дассссдадд ЕсСсадесссаа сЕддсасаед 840 часддсдєда аддсдсасаа сбдссаадаса аадссасддда аддадсадеьс саасадсасд 900 гЕЕсСсуЯєдвЯдч єсадсудсєссю сассдеЕсудєд сассаддасеі ддсеЕдаасдда сааддадсас

Зо 960 аадедсаадд ЕСсСЕсСсаасаа аддссессса дсссссаєсд адаааассає сеЕссаааасс 19020 ааадддсадс сссдадаасс асаддедстас ассстрдсссс сасєсссоддда двдачаєдчасс 1980 аадаассадд єсадсстдас сеЕдсстЕддсс аааддсеЕссоі ассссадсда сассдссдаед 1140 чадеЕдддада дсааєдддса дссододадаас аастрасаада ссасассеєсс сасдстрддвас 1200

Ессдасуддсс ссЕссеЕссс срасадсаад сссассдедда асаададсад дЕддсадсад 1260 чадаасчдеєсе ЕСЕСсСасрдсес сдєдаєдсає даддссстьдс асаассаста сасдсадаад 1320 адссеЕссссс сдЕСЄСсССсСЯда бааа 1344 «2105 44 «2115 654 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність

«221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 44 часасадеда єдасесааад сссодасадс сіддсояддеЕдс сасеЕсддсда асдвддсаасе бо ассаассдсс дадссадсда чадсдеЕсдає ааєтасддса ЕСсСсссЕссає даасеєдатсає; 120 садсадаадс саддасадсс дсссаадссд сеЕваєсєстасд ссдсЕсссаа ссоддадаєса 180 чЧдададЧдсдсссу аєсдаєєвад єддаадсдді адсдддассу арсссасасе дассаєссадс 240 гЕсссеЕссада ссдчадчасдеі додссєдЕСТає саєєдессадс аасссддадда адсдссдсес 300 асдЕссддЕс адддаассаа ассрддачдчаєс аадсодчассд гадсддсдес гадсдЕСстс

З6о арсеЕссссас ссіссдасда асадседаад СсЕддсасьд сЕсссуєсдеЕ дЕД9ДСсССЕДЧСЕС 420 аасаассеЕсс ассстадада ддсаааадсє сааєддааад гадасааєдс сеЕсдсадссс 480

Зо чддачаасессс аддадсстрдІ сасададсад дасадсаадд асссаасста садсстдесс 540 адсасаседа сссіссссаа адссдассас дадаадсаса аадеєдсасдс Еєдсдаадесе бо

З5 асдсаєсадд додссдсссеіс асссдеЕсаса аааадсееєса асададддда дЕдс 654 «2105 45 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «2205 «2215 МО ВЕ5 «2225 (3)..(3) «223» Будь-яка амінокислота, за винятком А1а «2205 «2215 МО ВЕ5 «2225 (5)..(5)

«223» Будь-яка амінокислота, за винятком бег «4005 45 сіу Тук Хаа Гей Хаа Авп Тут Іїец Ії1е с1ц 1 5 10 «2105 46 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «2205 «221» МОР ВЕ5 «2225 (2)..(2) «223» Будь-яка амінокислота, за винятком І1е «2205 «221» МОР ВЕБ5 «2225 (6)..(6) «223» Будь-яка амінокислота, за винятком бег «4005 46

Зо Уа1ї Хаа ТПг Рго сСі1у Хаа сі1у ТПкг І1е Авп 1 5 10 «2105 47 «2115» 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 47 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сі Маї Ппув Гпув Ркго сіу бег 1 5 10 15

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут МУМаії Гей Рго Авп Тук 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аїа Рго біу сіп с1у Гец сій Тгр Меєс 35 до 45 сіу Ма1і ТПг ТПг Рго сіу сіу сіу ТПтІ І1їе Авп Тут Аїа біп гув РПе 50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТБПх Аїа Авр бій бетг ТПт бБет ТПт Аїа Туг 65 70 75 80

Зо Аїа Маї Гец сіп бек бБет Сіу Гей Тук бБет Ггецп бек бБег Уаі Уаї ТЕГ 180 185 190 уаї Рко Бек Бет Авп Рпе сіу ТПтї біп ТПх Тут ТПг Сув Авп Уаї Авр

З5 195 200 205

Туз ТПт пув Рго Агкд бі бі біп Рбе Авп о бетї ТПтІ Рпе Акд Уа1ї Уаї1ї

290 295 300

Ззек Уаії гей ТПх Уа1 Уаі1і Аза сбіп Авр Тгтр Гец Авп с1у Гув сі Тук 305 310 315 320

Ркто Рго Бек Агд бі бі Меєсє ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Ге ТПкК Сув 355 З6о0 365

Тецш Ма1ї пув сі1у Рпе Тухк Рго бБег Авр Ії1е Аїа Уаі сі Ткгр сі 5ег 370 375 380

Зо

З5

Пец Нів Авп Нів Тут ТПг сіп Гпуз бек Гей бек Гей бет Рго СсС1у Гуз 435 440 445 «2105 48 «2115 1344 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005 48 саадсдсадс гддсдсадес аддддссдад дсгаадаадс садддадсад сдссааддаеа бо гЕсСЕєЧдсааад СсСЧЯєссСЕдЧєЄсСа сдЕсстЕссса аастасстда ЕСсдааєсддас даддсаддсе 120 сссддссаач дссгддаасд часддададее ассассссід доадддсддсас саєсааєсас 180 дсссачааає Ессаддчас адсдасдасе ассдссдасд адсссассад бассдсстас аєдчадстдеЕ ссесасессу садсдаддас асддсадеЕєс астасрдсдс ссдададессвда 300 гдддасссос Ессастаєса сдсЕсЕддаа саседдддсес адддаасдас саяассасадед

З6о

Есаєсрдсса дсассааддд сссассуддесс сссссссвддд содсссодсеЕсС саддадсасс 420

Ессдададса садсддсссІ ддодссдссгд дссааддасе ассессссда ассдоддеЕдасд 480

ЕсстІсаддас сстасессстІ садсадсдеєд деЕдассдєсдс ссуссадсаа сЕссддсасс бо садасссаса ссрдсаасудс адассасаад сссадсааса ссааддсдда саадасадсе бо чадсдсааає аЯчЕсЧдЕдсЕсда деЕдсссассдя гбдсссадсас сасстрдсддс аддассаєса 720 дЕСЕСсСсСЕсСЕ ЕСсСсссссааа асссааддас асссісаєда ЕСЕссссддас сссудаддЕс

Зо 780 асдЕдсЧдЕда ЕдЧдсддасді дадссасддаа дассссдадда Ессадесссаа сіддсасчатд 840 часддсдідд аддедсаєаа єдссаадаса аадссасдду аддадсадесс саасадсасд 900 гЕЕсСсуаєдвЯдч єсадсудєсст сассдеЕсудєда дсссаддасс ддсеЕдаасддд сааддадсас 960 аадедсаадд ЕСсСЕссаасаа аддссессса дсссссаєсд адаааассає сеЕссаааасс 19020 ааадддсадс сссдадаасс асаддедсас ассстдсссс саєссссдддаа ддадаєдасс 1980 аадаассадд єсадсстдас сеЕдсстЕддсс аааддсеЕссоі ассссадсда сассдссдаед 1140 чачесдддада дсаасдддса дссддадаас аассасаада ссасасстосс саєдстоддас 1200

Ессдасуддсс ссЕссеЕссс срасадсаад сЕсассдс да асаададсад деЕддсадсад 1260 чадаасчдеєсе ЕСЕСсСасрдсес сдєдаєдсає даддссстьдс асаассаста сасдсадаад 1320 адссессссс гдЕСЕССЯОд бааа «2105 49 «2115 19 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 49

Меє Авр Ттр ТПІ Тгр Акуд І1е Гецп Рпе Гей Уаі Аза Аїа Аза ТПтІ 01Уу 1 5 10 15

А1а Нів бег «2105 50 «2115 227 «2125 РЕТ «213» Хомо сапієнс «4005 50

Зо Авр Пув ТПтІ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго А1їа Рго СсС1іц Іец Ієц С1У 1 5 10 15 с1іу Рго бБет МУМаії РПпе Гец Рпе Рко Ркго Гуз Рго гув Авр ТПтІ Гец Меє

З5 20 25 30

ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уаї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї! бег Ніз 40 біЧ Авр Рго біц Маії Гпув Рпе Авзп Тктр Тут Уа1 Авр с1і1у Уаї сіц Уаї бо 45

Ніз Авп Аїа пув ТПтІ Кпув Рго Агд Сі бі б1іп Туг Авп бек ТПг Туг 65 70 75 80 50 Атуд Уа1 Уа1ї Бек Уа1і! Іец ТПг Уаї їец Нів сіп Авр Тгр Іец Авп сС1У 85 Зо 95

Туз січ Тут пув Сув Гуз Уа1і бек Авп Гув Аза Тецй Рго Аїа Рго Ше 55 1600 105 110 біц пув ТПтІ Іїе бБегт Гув Аїа Гпув сіу сіп Рго Агкд бій Рго біп Уаї

115 120 125

Тук ТПт Ггец Рко Рго бек Агуд Авр бій Гей ТПтІ Гув Авп сіп Уа1ї бек 130 135 140 теп ТПт Сув Гец Уаії гув б1у РПпе Тут Рко бБет Авр І1ї1е Аїа Уа1 с1ц 145 150 155 160

ТЕр сіц бБет Авп сбі1у біп Рго бі Авп Авп Тут Пув ТПтї ТПкг Рго Рго 165 170 175 уаї гейш Авр бБет Авр сіу бек РПе РПе Гей Тут бет пув Тїецп ТПтІ Уаї 180 185 190

Авр гув Бек Агд Ттр біп сбіп б1у Авп Уаі РПпе бек Сув Бек Уа! Меє 195 200 205

Ніз с1п АТїа Пец Нівз Авзп Нів Тут ТПг біп Гуз бет Пец бек Ієц 5бег 210 215 220

Рко с1У Гувг 225

Зо «2105 51 «2115 223 «2125 РЕТ «213» Хомо сапієнс «4005 51 уаї біцш Сув Рго Ркго Сув Ркго Аїа Рго Рго Уаі Аїа сіу Рко бБет Уаї 1 5 10 15

Рпе Гей Рібе Рго Рго пув Рго Пув Авр ТПтІ Гецп Меє І1ї1е бек Акд Тік 20 25 30

Рго Сі Уаї ТрІ Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї бБегт Ніз Сі Авр Рго Сс1ц 35 40 45 уаї сб1іп Рпе Авп Тгр Туг Уа1 Авр сС1у Уаї Сі Уа1 Нів Авп А1їа Гув 50 55 бо

ТПЕ Гпув Ркго Акд бі бі біп Рбе Азп бет ТПтІ РпПе Акд Уаі1ї Уаї1ї бек 65 70 75 80 уаї Гец Тпх Уаї Уаї Ніз сСіп Авр Тгр Гец Авп сС1у пув б1іц Тук Гув

85 Зо 95

Сузв пув Уаї бБет Авп о гув С1і1у Гецп Рго Аїа Ркго І1е сій Гуз ТПк Ше 1600 105 110 бек гуз ТПх Кгув б1у біп Рго Агуд бій Рго сбіп Уаі Тук ТПкК Гец Рго 115 120 125

Рко Бек Агд бі бі Меє ТПг Гув Авп о сіп Уа1ї бек Гецп ТПг Сув Гей 130 135 140 маї пув с1у РПе Тут Рко бБет Авр І1е Аїа Уаії біц Тгр біц бБет Авп 145 150 155 160 с1у біп Рко сій Авп Авп Тут Гуз ТПг ТПг Рго Рго Мес Гец Авр 5ег 165 170 175

Авр сб1у Бек РПе Рпе Гец Тут бет Кгув Гей ТПтІ Уаії Авр Гуз бБет Агд 180 185 190

Тегр с1п сбіп сб1у Азп Уа1 Рібе бехг Сув бБет Уа1 Меє Нів СсС1іп АїТа Іец 195 200 205

Зо

Ніз Авп Нів Тут ТПтІ Сіп Пув бег КГец бетг Гєц бег Рго с1уУу Гув 210 215 220

З5 «2105 52 «2115 251 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 52 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго б1у бБег 1 5 10 15 зетк Уаії пув Маі1ії Бек Сув Гпув Аїа бБет сіу Тут Уаії Гецп Рго Авп Туг 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс 35 40 45 сіу Ма1і ТПг ТПг Рго сіу сіу сіу ТПтІ І1їе Авп Тут Аїа біп гув РПе

50 55 бо біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут Ткгр 100 105 110 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек біу б1у біу біу бБех 01У 115 120 125 сі1у сбіу сб1у Бек сіу біу сіу сбіу Бек Авр І1е Уа1 Меєс ТПЕ Сіп 5ег 130 135 140

Ргто Авр бБеїт Ггец Аза Уа1і бек їей С1у б1ц Агуд Аїа ТПї І1е Авп Сувз 145 150 155 160

Атуд Аїа бБет сіц бБет Уаі Авр Авп Тут бі1у Іїе Рго Рпе Меє Авп Тгр 165 170 175

Зо

Тут сіп сіп пув Рго біу біп Рго Рго Пув їец їец Іїе Тухт Аїа Аїа 180 185 190

З5 зект Авп Агд біу бек біу Уа1 Рго Авр Акуд РпПе бБет біу бек сіу бек 195 200 205 сС1у ТПх Авр Рпе ТПтІ Гец ТПтІ Іїе Бек бек Гец біп Аї1а сій Авр Уаї 210 215 220

А1їа уаї Тут Тут Сув сіп сіп бек бі біц Маії Рго еп ТПтг Рпе с1Уу 225 230 235 240 біп сб1у ТПг пув Гец сіц Іїе Гув Акд ТПтх Уаї 245 250 «2105 53 «2115 251 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації

«223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 53

Авр Іїе Маії Месє ТПтІ сіп бет Рго Авр бБеїт Гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01У 1 5 19 15 січ Агуд Аза ТПтІ Іїе Авп Сув Агуд Аїа бБет бій бБет Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 с1у Іїе Рго Рпе Мес Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45

Ззек гей біп Аїа біш Авр Уаії Аїа Уаї Тут Тук Сув сі1іп сі1іп бек б1ц 85 Зо 95 сіц Маї Ркго Гец ТПт Рпе сіу сіп с1у ТПїх гув еп біц Іїе Гув Акгд 100 105 110

Зо

ТПкх Уаї сіу с1у сі1у сі1у бек бі1у біу б1у с1і1у Бех о01у с1у с1у щу 115 120 125

З5

Ззек біп Уаі біп ге Уа1і! Сіп Бех с1у Аїа сі Уа1і пуз пув Рго Щ1Уу 130 135 140 зетк Бек Уаі Ппув Уа1ї бек Сув Гув Аза Бек с1іу Тут Уаї Гец Рго Авп 145 150 155 160

Тут Гец І1е сі Ткгр Уаі Агд біп Аза Рго сб1іу сбіп с1у Гей сі Тгр 165 170 175

Меє с1у Маії ТПт ТПтІ Рко сіу сСі1у с1у ТБПх Іїе Авп Тут Аїа сіп Гуз 180 185 190

Рпе сіп б1у Агд Уаі1 ТПх Іїе ТПг Аїа Авр сі бБет ТПт бек ТПг Аїа 195 200 205

Тухк Меє сіц Гец бет бек Ггец Агуд бек бій Авр ТПІ Аїа Уа1ї Тук Тук 210 215 220

Сузв А1їа Акд бБет Агд Тгр Авр Рго Гей Тут Тут Тут Аїа Гей сі Тук 225 230 235 240

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх ТПх Уа1 ТПкх Уаі1ї! бек 5бег 245 250 «2105 54 «2115 223 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «221» Джерело інформації «223» /Примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 54

Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут МУМаії Гей Рго Авп Тук 20 25 30 теп Ії1е сіЧ Ткр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс

Зо сіу Ма1і ТПг ТПг Рго сіу сіу сіу ТПтІ І1їе Авп Тут Аїа біп гув РПе бо

З5 біп б1у Атуд УМаії ТПтІ Іїе ТПтІ Аїа Авр Сі бет ТПт бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80 40 Меєс сій Гец бег бек Гец Агуд Бек сій Авр ТПт Аїа Уаії Тут Тук Сув 85 Зо 95

Аза Атуд бБет Агуд Тгр Авр Ркго Гецп Тут Тут Тут Аза їец сбіц Тут ТкЕр 45 1600 105 110 сіу біп с1у ТПг ТПт Уаії ТПтІ Уаї бет бек Аза бет ТПт пув с1у Ркго 115 120 125 50

Ззек Уаі РіПе Рго гец Аїа Рго Сув бБегт Атуд бБетї ТПтї Бек сі бек ТЕПкК 130 135 140 55

А1їа Аїа їец сіу Сув Гец Уаї ув Авр Тут Рпе Рго сіц Рко Уаї ТПг 145 150 155 160

А1їа уаії Гец сіп бет бБет сіу Ге Тут бек Гей бБет бБет Уаі Уаї Тк 180 185 190

Уа1ї Рко Бек бБег Авп Рпе сіу ТПк сіп ТПг Тухк ТПг Сув Авп Уаії! Авр 195 200 205

Ніз пузв Рго бБет Авп ТПг Пув Уа1! Авр Пуз ТПк Уаї сі Агд Гуз

Claims

210 215 220 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з людським І/-6б, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 37, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮО МО: 38.

2. Виділене антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з людським ІЇ/-6, яке містить послідовність важкого ланцюга, що включає ЗЕО ІЮО МО: 41, та послідовність легкого ланцюга, що включає ЗЕО ІЮ МО: 42.

З. Виділений Бар, що специфічно зв'язується з людським І//-б, який містить послідовність важкого ланцюга, що включає ЗЕО ІЮО МО: 39 або 5ЕБО ІЮ МО: 54, і послідовність легкого ланцюга, що включає 5ЕО І МО: 42.

4. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів формули, яке відрізняється тим, що містить мутацію (наприклад, 1, 2, З або 4 мутації) в одному чи декількох Зо положеннях, що відповідають НЗ11, 0313, 1254 або Н4З36 (нумерація як у 5ЕО ІЮ МО: 41).

5. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за п. 4, яке відрізняється тим, що зазначену мутацію вибирають з однієї чи декількох з НЗ11А, НЗІ11Е, НЗ11М, 03137, І254А, 1254К та НіЗбА (нумерація як у БЕО ІО МО: 41).

6. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів формули, яке відрізняється тим, що містить мутацію НЗ11А (нумерація як у 5ЕО ІО МО: 41).

7. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з пп. 4-6, яке відрізняється тим, що зазначена мутація зменшує системне накопичення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента порівняно із системним накопиченням антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що не містить мутації.

8. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з пп. 4-6, яке відрізняється тим, що зазначена мутація зменшує системне накопичення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента порівняно із системним накопиченням антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що не містить мутації, причому системне накопичення оцінюють після інтравітреального введення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента.

9. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, є ізоформою Ідс2-А або ізоформою Ідсі2-А/В, але не ізоформою Ідсвса2-В.

10. Виділене антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з людським І/-6, яке містить послідовність важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮО МО: 47 та послідовність легкого ланцюга, що включає ЗЕО ІЮ МО: 42.

11. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким з попередніх пунктів, для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем І -6.

12. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за п. 11, яке відрізняється тим, що зазначена хвороба є очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем ІІ -6 у склистому тілі.

13. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за п. 11 або 12 для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухими очами (наприклад, хворобою сухих очей або сухим кератокон'юнктивітом), алергічним кон'юнктивітом, віковою макулярною дегенерацією (ВМД), бо проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), регматогенним відшаруванням сітківки

(РВС), оклюзіями вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки або фізичним ушкодженням ока.

14. Антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент, за п. 13 для застосування у лікуванні суб'єкта (наприклад, людини) з ДМН.

15. Композиція для застосування у лікуванні очної хвороби, яка характеризується підвищеним рівнем 1-6, яка містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп. 1-14 та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій.

16. Композиція за п. 15 для застосування у лікуванні діабетичного макулярного набряку (ДМН), діабетичної ретинопатії сухих очей (наприклад, хвороби сухих очей або сухого кератокон'юнктивіту), алергічного кон'юнктивіту, увеїту, вікової макулярної дегенерації (ВМД), проліферативної діабетичної ретинопатії (ПДР), регматогенного відшарування сітківки (РВС), оклюзії вен сітківки (ОВС), нейромієліту зорового нерва (НЗН), пересадження рогівки, подряпини рогівки або фізичного ушкодження ока.

17. Застосування терапевтично ефективної кількості антитіла ІЇ-6б або антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким з пп. 1-14 або композиції за будь-яким з пп. 15 або 16 у виготовленні лікарського засобу для лікування хвороби, асоційованої з ІІ -6, де хвороба, асоційована з ІІ -6, є очною хворобою, яка характеризується підвищеним рівнем 1І--6 у склистому тілі.

18. Застосування за п. 17, яке відрізняється тим, що хвороба, асоційована з 1-6, є діабетичним макулярним набряком (ДМН), діабетичною ретинопатією, увеїтом, сухими очами (наприклад, хворобою сухих очей або сухим кератокон'юнктивітом), алергічним кон'юнктивітом, віковою макулярною дегенерацією (ВМД), проліферативною діабетичною ретинопатією (ПДР), регматогенним відшаруванням сітківки (РВС), оклюзіями вен сітківки (ОВС), нейромієлітом зорового нерва (НЗН), пересадженням рогівки, подряпиною рогівки або фізичним ушкодженням ока.

19. Застосування за п. 17, яке відрізняється тим, що антитіло або антигензв'язуючий фрагмент доставляють у склисте тіло ока суб'єкта.

20. Застосування за будь-яким з пп. 17-19, яке відрізняється тим, що хвороба, асоційована з ІЇ-6, є діабетичним макулярним набряком, і антитіло або його фрагмент доставляють у склисте тіло ока суб'єкта.

21. Нуклеїнова кислота, яка включає послідовність, що кодує антитіло або антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким з пп. 1-14.

22. Нуклеїнова кислота, яка включає 5ЕО ІЮ МО: 40, 5ЕО ІЮ МО: 43 або 5ЕО ІО МО: 48.

23. Вектор, який включає нуклеїнову кислоту за п. 21 або 22.

24. Клітина, яка включає вектор за п. 23. ДЕНЬ 8 ДЕНЬ ЗХ со Зо р ХО о. ш. 5 ЗОВ що я | й - | неону 0 Носій озер но А вульовов в ш с ШШШ Сн г АНТ Я З ОБ і длядя 0 ВВ їн 5 ШИ ще 5 ШИ нн ОВ ІОВА КК ння

ЧНГ. З

В і і Ж зі І і гУ Я і їй ! і : і : і МАМА : і ' | Е Др ннннннннннняентннннннтртннннння вин а их тав

ЧНГ.2 Блокада П.В Бик ШИ я кеш ин й ! й КЗ ль ві а ГК ЯКО 08 ; п їз | "А І ві х Ж дв х їх МУ Н Ко х 5 ! к НА Н х ; ма х 2 вКя | х. х ще | ху шо 024 в. 5 з пд ОК НЕД юю білою інмоль!) Перо я грві

124 Бпокада П-бі5 ЦВК Ж Ше: ЖЕ Е Ж о їлі в п в 3 Е ЛЮ (У Її аж ик, ная а с» і мч ТД ов ці й у БУ «ШЕ х ще й па. Я ФО М Щ х зо В я | З вг нн й ль ях ЖК ж аОЖКИ 01 щі то ЇБілокі (нмоль) Сех а ЕБСОХО

ФІГ. ЗВ я ВО Пікування ока - З і коктеци пачок і : ї х ШИ вто ж : терен КК в (М й | БОТИ т. : пет При ш от Б рейоза бю і БО ше ВОД уки Ж щюОг Ше о нн КЕ ше ші ши ші 00 ши ОНКО БЕН ОО НН о - ше ше ши де ме Ко я є КУ М ж, ху К- «в СК З Ф З аку вія с м о сій Ж За А о се Ф де Ю де З се де См що ей в

ФІГ. Я с уннінякктікікннкннсннкі, і їх кн ОО оч мує В і; ЕЕ а Ам с; ОК Е б МУ ер ме що вав Ж я 0 , з йо ких по З: й іх ка тк їх ОВ Р САКЕ г ко З - оф сю У ову рення ме є КУ рило й ее 55 БІЙ 75 Жех, Я и ші ших ра хе і іх Н їм а ще їмроке жу шко 5-о а Я к У пе 7 х пе ях Я Я ех Со Тк КИ ЛУ ЯЗ ші А ши о же Су Кер ет ВХ Ме Ме лик аЯ га е Му хх Кк. ц і щЗ ТО. щи ї мес ак Нока З хо Б Кл «ех се В М. Ви ве а ЕЕ уж - БО в Ех вт кІО и ЖЕ тую Ба г м тих ШИ КУ УК С шим З ке х в че 8 У ддккусуюсе шо и Кк КО Ди Кю арени ри «а ре

Ж . ї и ж Б рт. Мч ск МЕ щі п їсте ї я х . ЛУ жм 5 х с с зх М я з. ох ун Ух Те Ки Бк що рот ме «у ПЕ Кк) Ук ому ем тв Ко ; ря м ДИМ Ї, поекехжччюнн Ух ща у хо сх ОС

"ех. У й Ук іо жо рт Ж ї і ше ще Бе ве КУ І ши ях щі СА я Боня НЯ де ко м ро Ек во в ЕЛЕ с Кк Фф Шен Ж Бе Мей БО дев поь МО шо щі о пор оо су едтуі д ї г покищо. ЕІ їз т сві ВЕЗЕЯНя її В яке ко ше МКМ З чвнйтях нн щ х мх й та УОЖК БЕ 0. у-аУ их

А пксодння ЗТ шо5 а що Ж і «и АОВУЛЬ ЗБ ж й у Е себе ОВО АВІА

5. у ще ЗДУ ЛО Б 03 Ж таж меди ОА те АЗВИКЮРАИ ТВОЄ БУ н Фа Ж їх | Б що т й їх Мк Ше ти г Фі бе В й я М Ту, ча ж но о СК сли ший СВК» вну й на о Ко с ЗК ЩО 04 Е 19 ня щу 45 ГБаіінмоль 5000 Код х о що « пноовння МАГ зо зкай! З тей АНУ ТТ ИУМ ЗАМ х й здоб. іч яейни УВОВЛУ ТОВ щ ачк я пеня ДОБУ УЗОРИ ТА м : У х 20004 Ше сн не р В НН ИН, ОС Вч ис В ово» ї Шон: ші ни ШЕ в нн и а и ВІКИ В ЦІ | їб НЕ ЇКайі інмоль!

Ат ; Ж Ж 124 ЗЕВОЇО ОО В | я я Й ЖЕВНОЗО ї -4 холін Пенні ПК озенку ї | і . К 2 Ту вЕВОЗО СНО « і ії Ох І х 08 че у зЕВОЗО НІ ТА шЕ У за х 0, ач: У УТоцилізумай з 0 І у у х ь ХЕ ІЗ М Ко х у і А й Х в 043 ше ше ЗВ А Х є Х у їх Н Х ; у їе. У ов осн ши ДВ рр ртуттю ті нон нина: зви Кй ге -х яке те - ее т - т ща 5 З З ее є оо є 5 т пом НЕ с НИ ПН о -- ши ж: шк во Ко і х - Концентрація антитіп (нмоль!) ФГ, 8 чне Б шн у М що Ши НН і я щк и ше око ней у З М БО ї ки в Е ШУ о ще сь че | Аж в ек ! я ее Бде а ; жав с ФІГ, а покине опотсттовтконсттн Пд А Гу пика 1 Початковий чат 5 пе Н 1 Й ти и ї п х - сх его яю ТРЦ Р лю КІВІ Н Кінценив здо є Кіа ї Гн ВОДНІ ТВА | АВМ : ТУ Крем ККи : Я куп й кави ЗАЗ Н рен ВІВ ТЕЯЯІ | СЯМЯАХ «1 Ка в ОМ ; Ї дян ПД ОНК Ї ду уч сад ах З і ! нос о ! ОКА о кар ОЗ . ри ВІЗ ОВЕМА Ї вад І п ск Її і Ні пазу РОлАкютЬ в ПУ кіст во Ї рол КН и Щ мож ї "тРхезу пе. мглика еп аї шин ВИНО КІН Діснумий ОВ ТА ж ЩЮВ КД ООН ОВ з стук ки т БОКОМ от : ; ши о жкю дріякеюю МОН ООН ЩУ У г 5 Н ЯН ЦЕ Мосееновнєч тес конння У Ї : З ? ї НН НН Я І 2 ї кА ї : и ле : я : хе ї- : Н ; ее : й : Її. В ЖЕ ще Н : і Ко : Ще 1 і В Пак - То : ДОК ке хо ро : Ам УМА: У їх я - че мл. м х МеВ Ох ї їв 13 ОО Ж шу : й М : Б йо ОВ аж ЩЕ : НІ ВХ : ; их їв кош АС Я х т н я В 2 ї "М ух : ПП очагх ОЗ : : КЕ ОеЕ с НН НН З ИН Я аю ІН у, : 7 з; і ща 7 Яся : В ке ї кети е . пенннноок ЖЕК нф нд нн МНК нов м Д : : м ; ож : й ні Ії : Я Н в ; 7 г -е ї НУ шесевн о НН КК п В ВО ВЗ ЗИМ й ОКА Ж 5 : Ка 7 7 г У : т по влзокатора : й й у й. І й Яен сени вет пи днини в оон пи они нн фени В о й Що в и : Я удяд 1: Кум сітніюоіх й й Х Н ІІ х зако хання ЗИПЬНИЙ ДО ї їх я ох і НКЮ Зк пін ши . Я г І: ге Ку 2 МАННЯ - 1 ї : КУ КН щу ї КІ Н Я н не ж М Кк Я ж : й

Е «.ї їх кої ща р ка ; в Но й хм ща - ша и : що Й - кт шт Тит ит : цем її- мі : хх Ко Ки ат ни ї У ЗМК Н де диту у : ЩІ І Н она ни дитини : й ВЕ Кн нин п КМИН Я й пен в ра в в МВВ ЕК НН ОД є ДУ У уи Кк у ку к ККу я К КУКа туя я у тяжку духу яку з В КУ 75 Ба ТМ 18 ха КЗ що ЧАЄ

ФГ. 30 ї кох Н 5 а 5 Х т 5 бе се ку Ух пік ж отити звуці Е уекенд Є БИНКОЗ УХУХВМ МТА й дек, МК сао Ух в її іх ж ЦИМ МК рт, ктнтумі мА ї Х сек, КУ - КЖМгухт - | чеку, ме сх есе СУМ щ-На БІК УК ї я Н й Ши Х з кдуюив. «кум т Е й ОЕВНОЮ д

ЗЕ . жо 1абЯ я п. . й ям зн ЗА т ; АЕВБИЗЬНІТТА В р а Бу Же і ага є Н ЕсЯ і в Гоцилізумай і Ж ІЗ З і - І : х кох я тк ді НО ЩО Не 15 БІ ЧАС ГОДА ФІГ

Фармакокінетика сітківки НЕ В: ни п ОКУ ХУ с : імунна відповідь ї ЕТ пунк Ж ня ще я ок си З ЖВЕОЯВ що юр о лева Ж а ННІ бе да а с ву о око НН їх І о я й ВЕВОЗВНИ ТА є : и а ще ШИНИ Я ою т А Еуна ? г? ферит уми Ки Ки о пл ИМ де . й Ще | КИМ и ноти «Тоцилізумаб Ж ий сив Ка і По ей : и ник р пл ня о пори ин ще 1 ман мин нн нн о не ще щЮ Бе чМАСГОДІ Виутрноньсочна рідина Судинна оболонка мунна відповідь: | імунна відповідь) Око ВО НК 5 о - с а ех, КЗ - та ШТОК СИ Ше З о - ення КТ яв и 1 шо но, дж поки чив, є: Б ЕК ще 3 ее па а им ран кранах Пи Янош фон о и ВШ не и Яе Ж, Но пек», Гра ово. ст - г о и и я що пр пл шо ій ПЛЕН СТИ хх "Че і поло ох І м Ко З ШВрсеєнетч тету секнетою, ие аа ИН О ше ; о ЕК кн ши о в Ки ш Шен ї Кир м пд г о І ав ЛЕК кнк,

ж. нн Ж. п ПЕЛЕТИ Е Ми Я Н о у Щ СЕТ ! ПОП ЕВ тд ха З Бе а зов ща Зо «й ЧАСТОДА рун удо ттоттттнтсттетт ЧАС ГОД. ІАСгОД) ГЕЕБСВІ 1 года о АБМва і с еТоцилізумай о м

НЕК і шим ї . той се КЕ Н і я ЕВ за | Е -щее Од і кр ж Мі Кри І і нен ВНУ ІЗ з щи -х КГ т длллю МКУ муж 33 шоООч ї пек ЕВІМУКЬНЯУ ТА : Я Н х Н К зим : Хе 7 Ве Уч Ії са ко Го ач я і Є п х о : : я пн ДОВ 4 В Н К ї 7 Ж х ї Ко Х; ЗМ; у КД Увиилізчмав «те ЩЕ й и яння ТоцигіУмаО Не ; Е ке 2 ! щи х Н роя Ж 5оаях риє « ВОЮ ри я ж : хіх о щи ху І Ка Я ще КМ ї, ЖЕ - і и ШИ. ; : ! : кОКУ : ЕН Н хи я ще : г «ЖК Ко г ом ва Н сенямнек х я 1 мит Песни ї ї ЯМ НЕ р У Н В ЕЕОАОЯООДУ днини Ї ії НИ Шу ни і ро ел Є Я і і Мт и | і т Пи ! ни : ке ке ВИ Н ТО дя Я т син м сет теєтєж жк юєкжтуєєюнююю юю тю июня п дон рем теттнтх сонну і Ц й З ; же й м Ал зда Чи МУ й ЕНН Ж: З У Я Мих із АС ОоДАа

ФІГ. 14 зе ЗУ Гея щея - м КЕ 1 То (ЕХО о й ке КУЗЯ БАК є КІ ех решения ОК умо аа р в чи ЕЕ й уч Зк Б да ЩІ и Же ід ке мед їх 7 : : Н : Ах у , у : :. Н и Кк фчасєтеатті Н | Н ї ха Їхеетісоза уча єсти муку к сХЕКа пу жа кт ків ухежлі Бл дк ркошжкю дно яти в зи и мини пит яку» песик: КЕ О и Сов он УДК УА Зі-ОйЗ ОМВО ХКО ВК КОКО оп ек их в; ок У КЕ Мод ати мому У НКИ У ОКА ЖЯТ-ЙНІ САНОК КК КАТЕ КІВ ОАРО КК Ка УМ їх і-й Її ОУН У УНУХ МчХ КА Жим. ПІМКМ ОХ Йой х си дет Квоти ти ог жит кед Кук песо окр ЕП ОВи ВЕДИ ІКІЛОКК її паї Ки в а КИ З З НК КК Лех -х пл тик сок ПКУ ЕСЕ Кр Куна й ЗМІЮ УВУ АЦТОБВІ ТЕКА ВИН кАГОуВеНВ се дя. КК - ». ХА ВІ АД г і винне мин підете ее Океан. оон м с і знамено Х т тий кома ех х Сасез її тій 13: ї1ху Ви і КМУ 1:1У хх ач ; Н ам т : ту : Я ; і Гук зурхтиий першо еног и поши В в МК ТУТ УВА ЕВ СК ЕаІ-ТИО ЖАОБЕТОТА ТИМКО АВКК ТТ АСЕТН ТУТ я КЕ м воно мий АВУкМІМІЖЕКи МИ ИхУ м соками семеро ап ХВТ-С1О так стота тин: Кот АНІ КИТ ТМ ПАТ ООАЕТЕ ЕВ АННИ ЕщЛЯЦІ пЕИХ тота УМ ЕХ А ЕК АВ І МАН Моно у ти МАМИ яжжттиу мук УИМЧЄ КІТВМТСАЕХКК ТУТ У КАК зп у ОТИТ М ВІВАТ ОАЕ ВАК ЖІН: ЗМОЖЕ ВТАТИКЬВ КАВЕРН МКУ НННМ, ЕМ ВМАТМІХ ред СК: лятя Гектор івочктн рееччюк сю ттежтчтю ее тосту Ус ХЕ іл зимно ТК моих рах 1 КЕ Й іх 13 Ах - хх Н І : і Тоталі лю ючи ин и п и на т пе Ку оду хіти : ї поет ех и о ОВУ КВІНЮУО ВКЕКТВАЦЛ АКОТ КЕКУТ УМ ВЕК ЗУЄ т ню ого вот УАТУКИ ЗИМА МЬМУ КУ пасив сему ем ЕН и НЯ ЖМІ-ІИ БКОТАДМО ОК Вдр КАВУ ТЕКА сома єнст ті кум юю ай шИиІУМЛи ОцИлідаВи уні гиОКуУХ и 1 про и а о оно леж цій мін ен ІН В НІ ПІ ВЕК КОТУ их В Ки У. ЖМАЮМ ВЕБХЛВИЦСЬч КОТУ КАРУ ТИ УЮ тм Кві Ніде ТНК утеплити е тости СМ СИ МОБ сн нене нн нні ТІ Хе проектне фени ен хх їх ЗКй з те пах ми од оо я ВИШ ; і ; ісххі ї Н Ї ї їх ВА оо м кад пн ком КН пухкі кахчіосаті кл чухиччі лак Перш міки уми и т Н ехо при р м мт ки ОСТ у БІ І ББХТАУВКТ КЕКВ ТО РАКИ КЕКВ КК о оон дише КУМ УУ От нн в нео КЕБЕТАСТЬМІВКТРКУ КУТОК У пк пл я и М Уфі гуми ВМІВ КИ Ат плкмктеня ХЩІМІМ РИМІ МУНКТУВИОУВОКЕКТА РУ Мо с мето ТВА КК КН від ОО птма проц и ЕХ МТУ КАМЕХ ТММ КИ т-П3і БЕРЕ ИУКВКССУ КАДРІВ МТК М жк ЕВІХОЇ: ВЕЖТКУСКТУКККССУ ЕВ КАСРИВО СЕ Я пвх 3 МК ддлянниттия рн Аква о сіні ЕК емемнни мнн м око УТ Ух УТ за сова пе ах Б КН хіх у кох чи Й дКх Й й : Н ; Е і Я ї ї ї і і Н : : рих мих ї ї сзесх хі» сухості езччхчіккив ет ИУ УМ а А дя ЕН ВН КВІ-НІ ПОТЕУКНАКУКРАЕКОММИТ КУТУ КОВКА ТЕО ВТІКАТИ КВК м а Іа ЗМК НВИ пен ви ХХХ УКВ ОКХ ТІ ПОХФУКНАКИ КИНУВ УДОМА НК ЕАКІККТ нн штТУХУи ОМмехоИ Інк А ЩА ие, УемипсМиМир окопу ри ши с ОО КВ КУКИ ТАТ ЕКОН К Вих дош ТЕОКИму и ТЕаККоТ о КиИ Е ТКУ их ИН ав мЗв ХІІ ПОФЕХИНАК ТЕЗЕ К НЕТУ КАМ Са пак а аа но о ун нон ою хх т т як зи р їдл ЕН пу Ух У ях ши : тут : це : і и М Я : : Н і Тех ехееєскї уж кт кам кт АД зужієсєєт ух ктєєієст ої НО пе мкм лм КО Ки х. ї хе с, сек ут, дж влла у ок Му п В

ЕВТ.ОІ5 ТОРРЕУТЕКТУНОВМ ТО ТУКОВ ЕР АЕН ЧК ТР ОЛОЕ КЕКВ ух ВД Ки ЗИ ЛА ЮА ВАМ КТ УА ЛУ АХ, коня репо МІН Е ВКА ЗАВКМКАНОХ й сети іх диня ЗК РОК КЕ КІ ТМ ВК и НН АН в В КА АН и ЗИ НК са ЖаКеМАМ БЖ ТАНОК МЯ Х ект ти мат ат аку се ЕМІТЕНТ Ср и В КАК яр Ах ДВ КВ Ов САМ кс В С ВЗН ше ЕВ: ЗБЕМЕАВЮМТКМОУВ КОРТ РОИТАУС УК ОВОСРЕНМК ск ке МАК КТК МКМ КУ КУ есте кет тн 32 йди хи ЗМ хх юю кчакіса сири юкх с Ах. Он Ан КО Я ІНВ ЦУКРОВА КТС ЕЧЕ за вл ОпипниБІсецки мин АН ВІ ПИТНА ЦО МУКИ В ЗІ пуд дихомиеМм сиро ово ЕМІ-КІ СЖУКВОКУМНЕАМИХКУ? ММиМЗМихМи ЧНГ, БА я УКВ КЕНЕ ВН З ЕВ В СЕН У ВЕ т керу тк ЖЕ КЗ Сов ЕК Ск нн п т п пи З п са я ї ТЕ цЕ за 115 тв Й ще ; КА ; я . х зх Й КУ : 1 чу Й їх секіхухюеяхміхинкіхуниіл чує кахчічкех хх іл на иєнкіютухю яких те ч ложу, нти у мана: ун у сина нн о нн ху зм Я винн зх « Й Ми , за й Ах НеІ Й АЖМ рЕхи й У Ск прнндннннх КЕКС ФІГ, 5 : х і ; м бСів-сигналпізування (Пюдський НВ ши коша я ТЬяч ЩО Н й Я 4 М У Е Шк о ЕВ м Н 5-Я ох ЩІ й п ; у 08 Їх птоципізумай Ж і ; у х к ж во 05 х Я Н т чок А; : 5 ї Це в у в | | у Ж що Я шо 024 х о і НК з | Я ще і В Тіт ПУХ х нтнм пон пи пон и нн пон ни заз Оки ЩО ОХ ! шо оню5 ню ; їбБілокі (нмоль)

ФІГ. 16А

Трансе-сигналізування (Пюдський 1-6) ШЕ 5 в-8. В снту. я о 085 "

Ж ' Яд дО Не й | 5 ЕВОМ оба , - а | ОЗТоцилізумаб що і а 024 о у пан оба Я вив ою Білою інмоль) ФВ у то дк сою 5 Ох У Ге Го ої с гооЯ в На я се Бай КРУ ща ті вет панк фунт ння ак ї - г : : Бої це ше : ! ОО ї х : : Я Я Н : 1 КО : МЕН НЕ : : : Н : : НІ р: ! ши: сини : : : нн ше | | ши ї

Ш . те р ЕНН БО : ї 3 Не НЯ 7 їх НИ у : Ї ЕХ : жк Кт : хе: х : 1 бі АК о ві/ Ку : НЯ ! : Я : й тт І Ж о Ти в А: Ше ке рої і нн ни ШЕ У: Ше ше В ши шия ї- щ ши ень п ко ШИ ВЕ ї | : о В : : ча ЕНН ї и ІЗ 7 1 сш З я нини : де І Ж що 0 : іа ШЕ шщН : ї її : : НЕШЕ: : Н ІЕЕ: МН : І ОМ : : ! ОВО р м; ще ше ши А: пиши ше 1 сш ОТ і й : ох шк НН ім тА У 2 Бе : В: 5 У Не І : х Й : жо х- рі 1 ї шин : : Е і шо С ШЕ ! Бо й : :

Ти. ши : : де : | : ці : Мі ї ЕК Ной : К. : ОКО у я ковани Мету ас ни І Не ШІ М НК ж А ДК АН Я со» ода тм а в ХЕ ке В

Х, щ к 1 ух ке їх г Ох т о АВ шк Кі Ух х ж фе ож Я ж ен ин о грннрни їй З мя ра ренні шо у соні зни нн жи Янош Ну ном я 5 5-8 м шк 54 Ще ро с Кк са о ща х Я я я тя Кк пе ч ря те К ще ке в: рі и К--К КН о ши є У дет Ї ях ТТН і ке ї їм х Ку й; КК С ій не уееіюгію хе й рені кУЮ ОЦЕ 8 У ВН пе ще У й Ж КК СА ко я Є о су ноз ГРОЗНЙ Га МУ Ку - іх вежу С не АХ, ху ж Кк У» се чу с З ее аш Ф рек нини КТК 7. ше о ХМ с. й ія стореотееютх ее мяч ех... долу ВЕ с й МУ ух У Я Кей щі А ся ж ра и 5 дк д НН Ве й ТВ до й

ОО. НК ! щи Ки і «аж ОХ ДК: Я ! ї Н я Н Об нн фДафф з ; | й маоль СТ лікування ЕВ я у і ша з Її і що і ! ою я ЦЕ ин, Е ВД тт ння кн кнннннннпнн чн ннлнньннннннилнннн, ва В ТО мисль Суб ша 3 пікувиння ВЗ тод в Ше З З і МАУ Крут рт ер тю рю у р р Ж рр ер ру тир ртут Й 500 ВО ОО Зм вх 1 Боб юю ою хвиляими

ФІГ. 15 ; моло : ; Дисульфідний зн'язок пеформи СВ-ВЕРХ - - з ще ще водівнязня ЕВ зразків нн нн г ; ; К і Мк Гу мвідотьововосюв ад ци ї кратне масштайування, їж Е 7005 Коональнакойннма г; руч Ї 2. ! оо і | хдінія) : схову дкееккккмтАнКК "Хуподлаетвтжетнн нює оодюєюєтечнннмї КАН донннннннянннтетт ння нндтнряадладаятнннют тт толалялянаттн яти течяяналинння УТ т ин я т пох Амоса о ! Ману м ще гару, ; : 1 , Р кратне масштабування, : КОЗИН дл Х батьківської клітинна а доб сени й й по ДЕ нти А я биукрінн Му. зл алого і под Я 5 кметеврівлу : Ш у До ОХ бстабільно трамофікована : В 2 ваз 4 Гм х група, попередній і ва | фрннадця ТИВ ветенеі Я З г ооончнатнтанекусттеоткікнкююннютяни Мн нн лу акне сн с НИ лк ов нн пе В вл з п о о вано хвилини ФІГ, 20

ЕВ (МБО ОВ-6, БМИ від 200 кратного масштабування біорвактовом, клональна клітинна лінія) дисульфідний зв'язок йофеорми ОФАВЕРХ І МВЕО0У1-Оовов - пл те жк ж нт п ЖЖ Те пу НВК поті піп тКНКТЕКТі КВ ЕІК ТИКИ ЕЕЕЕРЕРЕРЕРРРРЕРЕ Р я і ететч воюГ і : мі ЗА, 1 Ворон и ! ващах мі ! МАМ і Я Її і ; : - їі п ! -ї ї її х ї шеее а : 1 в ни пами я тв і М : іофюрма в : х Я ї М мі У аВНи і і Е : мини в до а 2 нуниннонттекнн отчет рктентнте Кс зминнй - зетотткнтанх ють Кк ер рт у уст кут р уст рт ВЖК 8 НОВ 1300 1 ХК 8 М ОК 08 ХВИЛИНИ НАЗВА че ОБЛАСТЬ ОБЛАСТІ Крофсорма 13285 Зи50о Ес: АВімнворма ЗБ Тов 1з387 АБкннфовма 45 ЗАЗ 94 ФІГ,

І х : : І т КН Ії 2 є х ї ї ї ї ї ї : В : ВУ З ї ї : : ї й ЩІ Н ї т : и : З ї : х - : ї Її ш нн В и : ї : : : 2 Х ву нн Інн нн нн т х : : и и ї ї Я ї : : й ух і ни нн нн нн і ши ни п п пи и ї ї й 1 : : ї: З 1 Ї : че Пе : пон и ни З Е З У ож ЯН Н ЕЗВІ в-А ВІХИ : я М КО ї ою сл чу ії : СНИ са : В ІМ м терем і и в в ОНИ Кв НИ Й КОЖ шия М г зв : мому дам ок і Н шо БАД м од кі : ОО НК сл ЩОБ по І З КИМ ж : СОДОЮ Кк дяк і: Хкхкккнкккувюєуєк кв ких к кон 3 ї 1 г і: ї : Я Н НИ Н ла : : : І ук : ! : : : : г й Не : : НЕ : Н ше нн пн « ої не ДЕ НН ОН м нин о нн т ке Я : : : ГИ й НІ х ши ши ше о : : : Оу : : ЩІ нин нн ние м У ИН: Е ; й НЕ : З Щ. нн нн п УНН ЕЕ: її ' КУ т і 1 : Ко: : : а : : хх Й І : : й : : 3 : : : се ЖИ й й п 0000 КЕї НИ ї 51 . : р ши . Н 11 й : Не : х 5 З : ї КК : : В: : Ї ре В : : : х 5 Ка : Н : : їх Кей Н : : ія : их 2 . . І : р ї й : : В В ниж : й 3 ї : : : : ж, З : й : : : х : : у х 7 : а ї Е - Но ї Я ої : : : НУ : : З : из БО: ме ПЕ ї Я Й ее : Я НУ : ї й о : ; З ши ни п о НЕ НН нн нн нн ВЕ НІ : Н : ї : ес НН : : : : : о Ко Ам У я І І з УА ЖЕ НЯ Ух хо а о м схе Е о ЗЕ З.

ЗЕ ЗЕ онов Кр ; Фу чових ппечиолоце міноолгує

Ем пеня шк НН : ше : : кі м : і І Й НН Й : 1 ! І пидеи у ня Пп ! ; МЕЖ : : НИ ИНУ ! Її НУ ї : : НЕЗНИУ і і І г : і В : : І н : | І М : : Готи Ії. шо ех нишши бен ! : з лання й : дитин що ІЗ «В хх НІ ї ПУ : ї кг се ЕХ БУВ КЕ ме КК ї т сх З Н І гей Н У Фо Кз гію я і В М У я ; ХО с дм Б : їз Жук ех ві 104 ПЗ о - тс вві Еш ж А и КУ т ш Н ху и в ї ї оц З: щ ВЕ ї Я ку гом к що В а ; її ск т Нм 5 Кі ї ОО ги вена ик ї : Бо ОБ па КАЧА й до НЕ ж : Й КО а ї й ТЕ ЕІ ї ним нн пен іч : нн яння З пня зкжжтяяннннття В Е ! : "яку І Н : о : ЕШЕШЕ | в пі Е З ЕКЗ і їв НЕ : : сш Я те ; ; : Зх сь й З Кб Її ее ї й КкЯ НН : В 5 у нн и і ; ' ї- НЕК Н З Її ши : А ; ПИ В : Тк. :

: . : і; : : ї й ТЕ ! МЕНЕ Ї о: ї ї Я НЕ: : 1 ї п. ше : ; ! вні Її х ! : КУ Й : ! й : : :

- . ї я й : х У : Е х Кія НИ наш ке ти. й !

їй . І Н : р : ій : ! : я : : м : і - : У 1 т : ї й М Її; : . : РЕМ : С : ! : -Е ! ї гх ! : ! : й ї ї : М ве ! : й її Я я в ! : о: | ! ТЕ : : " : й Ї жк ще ши 4 не ше 1: Я ; ТЕ Й : : че шини : ЕД Б Я : : : ! ї ран щі : : ї : Н В ще ее ! : : : ОСтроя з : ї ак г я, ме М ше ше З : ще щ семи нн чн се с 03 «3 км я ху! З со с к а В й У хх щ й а й а міхи йУу човМох ! чиє мовофше мій ув Її Ах Не у ппещи А

В

«ва. їх - М і х м щ ї ух крива як их у кора З «ЗО А «-- Крива в их, у а ЕВЮЗІ КЕ зу ; С й шин й б ІК) 2 3 ЧАЄ (ДНІ)

ФГ. 23 Скловидне тіпо не НЕ зкеекк і х ЕЕ | Її що тях Ж

- . га і «о? що ; і нн но о о о БІ що чАСІГОДО ФІГ, 24А Внутрішньоочна рідина теє ЛИХ г я ї Ж екон. щу ее «ай я Бах в Фо «вала щш : 0 що ла Юа час года

ФІГ. 248

Судинна оболонка р ' Є У ше У : ке ж що Ша :ІЕ : Ф же 1 Я ї а і -к Е в ректора рен й 0 100 ве; З за ЧАЄ ГОД

ФГ.

24 Кон'юнктива ш- Рогівка 5 з ! во Х захи б г : щен ше Ж ЩЕ зе ТЕХ о - ЗЮЦМІ Ж злої я соц, то І є й Це ок алхцете я ТЦК ; ГеЖ ЕН : ВО рн ВИ шин НИ в а Ма о 300 00 йо 00 ов 300 00 чАСіГОДІ час года

ФІГ. 240 ФІГ. АЕ вридо-циліарна зона кришталик с Зх Не: її зх з щ ї Не ї Е, ІН т ГУ ї М т : Т в. (а Ж ! Є : їх ! Ж Її ко й са Та он нн З НВ , книжн ун Ві пад б Зб 000 п вою ою бе а0о частеда частгода

ФІГ. 24Е ФІГ. 245 Сітківка ее Склера дк вх 5 і Є Тии і Коя ' х в я . ну : т шк т : я пики нини дана основе ЧЗАСЯГОДО ЧАЄ ГОДІ г. ан ЧА. аа