UA120748C2

UA120748C2 - Спосіб лікування суб'єкта-людини з рецидивною і/або резистентною множинною мієломою, антитілом, що специфічно зв'язує cd38

Info

Publication number: UA120748C2
Application number: UAA201605765A
Authority: UA
Inventors: Антуан Десланд; Крзизтоф Дж. Грзегорзевскі; Крзизтоф Дж. Грзегорзевски; Марі-лор Озу; Мари-Лор Озу; Блейк Томкінсон; Блэйк Томкинсон
Original assignee: Санофі; Санофи
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2020-02-10
Also published as: CL2016000999A1; PH12016500677A1; JP6914283B2; US20190284294A1; SG10201913447SA; ES2825625T3; JP2021105044A; HK1223116A1; JP2019070004A; IL281541A

Abstract

Винахід належить до способу лікування суб'єкта-людини з рецидивною і/або резистентною множинною мієломою, який передбачає введення суб'єкту-людині антитіла, що специфічно зв'язує CD38, де зазначене антитіло здатне вбивати клітини CD38+ у суб'єкта-людини шляхом індукції апоптозу, антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC) та комплемент-залежної цитотоксичності (CDC).

Description

Винахід належить до способу лікування суб'єкта-людини з рецидивною і/або резистентною множинною мієломою, який передбачає введення суб'єкту-/людині антитіла, що специфічно зв'язує СЮЗ38, де зазначене антитіло здатне вбивати клітини СОЗ8-- у суб'єкта--;юдини шляхом індукції апоптозу, антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АЮОСС) та комплемент-залежної цитотоксичності (СОС).

СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 61/898309, поданою 31 жовтня 2013 року, та заявкою на європейський патент Мо ЕР1І4306220.6, поданою 31 липня 2014 року, обидві з яких включено в дану заявку за допомогою посилання в їхній повноті та для усіх цілей.

Перелік послідовностей

Дана заявка супроводжується переліком послідовностей у машинопрочитуваній формі, який точно відтворює послідовності, описані в даному документі.

Галузь винаходу

Дане розкриття стосується лікування захворювань із застосуванням антитіл. Більш конкретно, воно пов'язане із застосуванням антитіл до СОЗ8 як лікарського препарату або в одержанні лікарського препарату для лікування форм раку, таких як множинна мієлома.

Передумови винаходу

СО38 являє собою 45 кДа трансмембранний глікопротеїн ІІ типу з довгим С-термінальним позаклітинним доменом та коротким М-термінальним цитоплазматичним доменом. Білок СОЗ8 являє собою біфункціональний ектофермент, який може каталізувати перетворення НАД» у циклічну АДФ-рибозу (ЦАДФР) та також гідролізує ЦАДФР до АДФ-рибози.

Експресія СО38 підвищена в багатьох гематологічних злоякісних новоутвореннях та в клітинних лініях, що походять від різних гематологічних злоякісних новоутворень. При цьому, найбільш примітивні плюрипотентні стовбурові клітини гематологічної системи є СО38-.

Експресія СОЗ8 у гематологічних злоякісних новоутвореннях та його зв'язок із прогресуванням захворювання при хронічному лімфоцитарному лейкозі (СІ!) робить СО38 привабливою мішенню для терапії антитілами.

Антитіла до СОЗ8, які специфічно розпізнають СОЗ38, були описані раніше, наприклад, у міжнародній патентній заявці УМО2006/099875. Проте ці антитіла не могли індукувати апоптоз, якщо їх застосовували як монотерапевтичний засіб та інкубували з клітинами, що експресують

СОЗ8».

Специфічні моноклональні антитіла до СОЗ8, такі як 385813, 3858518, 385819, 385830, 385831 та 385839, були описані раніше в міжнародній патентній заявці М/О2008/047242. В

Зо УМО2008/047242 описані три цитотоксичні активності, апоптоз, АОСС та СОС, цих специфічних антитіл до СОЗ8.

До того ж, про застосування цих специфічних антитіл до СО38: у комбінації з цитотоксичними засобами, такими як цитарабін, вінкристин, циклофосфамід та мелфалан, повідомлялося у міжнародних патентних заявках УУО2010/061357, М/О02010/061358,

ММО2010/061359 та УМО2010/061360. Проте про застосування антитіла до СО38 як монотерапевтичного засобу не повідомлялося.

Короткий опис винаходу

В одному варіанті здійснення дане розкриття пов'язане з антитілом, що специфічно зв'язує

СОЗз38, для застосування як лікарського препарату, де антитіло має вводитися суб'єкту-людині в безпечній терапевтичній дозі 20 мг/кг або менше.

В іншому варіанті здійснення безпечна терапевтична доза розкритого антитіла становить приблизно 5 мг/кг, або приблизно 10 мг/кг, або приблизно 20 мг/кг.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття також пов'язане з антитілом, що специфічно зв'язує СЮО38, або фармацевтичною композицією, яка містить антитіло, що специфічно зв'язує

СО38, де антитіло або фармацевтичну композицію можна застосовувати як лікарський препарат у лікуванні рецидивної і/або резистентної множинної мієломи, де антитіло має вводитися суб'єкту-людині в безпечній терапевтичній дозі приблизно 20 мг/кг або менше.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття також пов'язане із застосуванням антитіла до

СО38 як монотерапевтичного засобу, що зменшує призначувані пацієнту хіміотерапевтичні засоби.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття додатково пов'язане з безпечною для суб'єкта- людини терапевтичною дозою антитіла, що специфічно зв'язує СЮОЗ38, де зазначена безпечна терапевтична доза становить 20 мг/кг або менше, або приблизно 20 мг/кг або менше.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття також стосується способу лікування СОЗ38- гематологічного злоякісного новоутворення в суб'єкта-людини, що потребує цього, при цьому зазначений спосіб передбачає введення зазначеному суб'єкту-людині антитіла, що специфічно зв'язує СОЗ38 при безпечній терапевтично ефективній кількості 20 мг/кг або менше, або приблизно 20 мг/кг або менше.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття також стосується способу лікування СО38- бо множинної мієломи в суб'єкта-людини, що потребує цього, при цьому зазначений спосіб передбачає введення зазначеному суб'єктуу/людині ефективної кількості антитіла, що специфічно зв'язує СОЗ8.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття також стосується застосування зазначеного антитіла, що специфічно зв'язує СОЗ8, для виробництва лікарського препарату, де зазначене антитіло вводиться суб'єкту-людині в безпечній терапевтичній дозі 20 мг/кг або менше, або приблизно 20 мг/кг або менше.

В одному варіанті здійснення лікарський препарат призначений для лікування СО38- гематологічного злоякісного новоутворення, конкретно, множинної мієломи, найбільш конкретно, рецидивної і/або резистентної СЮОЗ38" множинної мієломи.

В іншому варіанті здійснення дане розкриття додатково стосується застосування зазначеного антитіла, що специфічно зв'язує СОЗ8, для виробництва лікарського препарату для лікування СОЗ38: множинної мієломи, конкретно, рецидивної і/або резистентної СОЗ387 множинної мієломи.

В одному варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент не запускають продукування аутоантитіл проти зазначеного антитіла або епітоп-зв'язувального фрагмента в суб'єкті-людині, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент вводяться суб'єкту-/людині з дозою приблизно 20 мг/кг або менше.

В іншому варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент здатні проявляти виявлювану зайнятість рецепторів СОЗ8 у суб'єкта-людини при введенні суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 1 мг/кг кожні два тижні.

В іншому варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент здатні проявляти щонайменше приблизно 84,1 95 зайнятість рецепторів СОЗ38 у суб'єкка-людини при введенні суб'єкту-/людині рівня дози приблизно 10 мг/кг кожні два тижні

Зо В іншому варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент здатні проявляти щонайменше приблизно 97,7 95 зайнятість рецепторів СОЗ38 у суб'єкка-людини при введенні суб'єкту-/людині рівня дози приблизно 10 мг/кг кожні два тижні.

В іншому варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент здатні до інгібування росту пухлини в суб'єкта- людини при введенні суб'єктгу-/людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 5 мг/кг до приблизно 20 мг/кг кожні два тижні або щотижня.

В іншому варіанті здійснення антитіло або його епітоп-зв'язувальний фрагмент, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, розкриті для застосування як лікарського препарату, де антитіло або епітоп-зв'язувальний фрагмент здатні до інгібування росту пухлини в суб'єкта- людини при введенні суб'єкту-/людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 10 мг/кг до приблизно 20 мг/кг кожні два тижні або щотижня.

В іншому варіанті здійснення також розкрита фармацевтична композиція, що містить будь- яке з розкритих антитіл та фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.

В іншому варіанті здійснення в даному розкритті передбачена одинична лікарська форма, що містить фармацевтичну композицію, розкриту в даному документі.

В іншому варіанті здійснення в даному розкритті також передбачений продукт виробництва, що містить фармацевтичну композицію, розкриту в даному документі, та контейнер.

В іншому варіанті здійснення розкриті способи можуть бути придатними для лікування суб'єкта-людини із захворюванням або порушенням, за яких аномально підвищена експресія

СОЗ38. Такі способи можуть включати, крім інших стадій, введення суб'єкту-людині антитіла або його епітоп-зв'язувального фрагменту, що здатні до специфічного зв'язування СОЗ8, де антитіло здатне до інгібування росту пухлини у суб'єкта-людини при введенні суб'єкту-людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг кожні два тижні або щотижня. В одному аспекті таке захворювання або порушення являє собою СО387 гематологічне злоякісне новоутворення. В іншому аспекті таке захворювання або порушення являє собою СЮЗ38" множинну мієлому. 60 КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фігура 1. Графік, що показує відповідь залежно від часу в пацієнтів із множинною мієломою (М-17), яких лікували за допомогою специфічного антитіла до СОЗ38, пи385819, з різними дозами (1, 3, 5 та 10 мг/кг). (Деяких пацієнтів було виключено після короткого періоду лікування через прогресуюче захворювання. Проте в деяких пацієнтів спостерігали стабілізацію під час лікування, а в інших за рівнів дози 1 мг/кг та 10 мг/кг спостерігали часткову відповідь. РЕК- часткова відповідь, МК- мінімальна відповідь, 5ЮО- стабільне захворювання або РО- прогресуюче захворювання).

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

У контексті даного розкриття терміном "СО38" називають білок СЮОЗ8, що являє собою 45 кДа трансмембранний глікопротеїн ІІ типу з довгим С-термінальним позаклітинним доменом та коротким М-термінальним цитоплазматичним доменом. Білок СО38 являє собою біфункціональний ектофермент, який може каталізувати перетворення НАД» у циклічну АДФ- рибозу (ЦАДФР) та також гідролізує ЦАДФР до АДФ-рибози. Протягом онтогенезу СОЗ8 з'являється на СО34- комітованих стовбурових клітинах та комітованих за лінією диференціювання клітинах-попередниках лімфоїдних, еритроїдних та мієлоїдних клітин.

Експресія СОЗ38 зберігається переважно у лімфоїдній лінії диференціювання з перемінними рівнями експресії на різних стадіях розвитку Т- та В-клітин.

Роль СО38: у передаванні сигналу була додатково описана у міжнародній патентній заявці

УМО2008/047242. Конкретно, СЮО3З8 називають трансмембранний білок Ії типу, що містить, наприклад, амінокислотну послідовність, яка розміщена під номером доступу Сепрапк

МР 001766.2 (доступну на 7 жовтня 2013 року).

Експресія СО38 підвищена в багатьох гематологічних злоякісних новоутвореннях та в клітинних лініях, що походять від різних гематологічних злоякісних новоутворень. "Гематологічні злоякісні новоутворення" являють собою типи раку, які уражають кров, кістковий мозок та лімфатичні вузли. Оскільки всі три безпосередньо пов'язані завдяки імунній системі, захворювання, що уражає одне з цих трьох, також може вражати решту. Гематологічні злоякісні новоутворення включають неходжкінську лімфому (МНІ) (у тому числі, наприклад, лімфому Беркітта (ВІ) та Т-клітинну лімфому (ТСІ)), множинну мієлому (ММ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ І) (такий як, наприклад, В-клітинний хронічний лімфоцитарний лейкоз

Зо (8В-СІУ) та волосатоклітинний лейкоз (НСІ)), В- та Т-клітинний гострий лімфоцитарний лейкоз (АГ), гострий мієлоїдний лейкоз (АМІ), лімфому Ходжкіна (НІ) та хронічний мієлоїдний лейкоз (СМ).

З іншого боку, найбільш примітивні плюрипотентні стовбурові клітини гематологічної системи є СОЗ8-. Експресія СЮОЗ8 у гематологічних злоякісних новоутвореннях та його зв'язок із прогресуванням захворювання робить СОЗ38 привабливою мішенню для терапії антитілами. "СбО38: клітина" являє собою клітину, що експресує біллк СО38. Зокрема, СО38» клітина являє собою клітину ссавця. В одному варіанті здійснення СЮО38: клітина являє собою клітину неходжкінської лімфоми (МН), множинної мієломи (ММ), хронічного лімфоцитарного лейкозу (СІ), В- та Т-клітинного гострого лімфоцитарного лейкозу (АГ), гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ), лімфоми Ходжкіна (НІ), або хронічного мієлоїдного лейкозу (СМІ), що експресує білок

СОЗз8. "СбО038: гематологічне злоякісне новоутворення", таким чином, являє собою гематологічне злоякісне новоутворення, описане вище, де ракові клітини являють собою СОЗ38: клітини або включають їх.

У контексті даного розкриття СОЗ38: гематологічне злоякісне новоутворення, зокрема, вибрано з групи, що складається з неходжкінської лімфоми (МНІ) (у тому числі, наприклад, лімфоми Беркітта (ВІ) та Т-клітинної лімфоми (ТСІ3), множинної мієломи (ММ), хронічного лімфоцитарного лейкозу (СІ І) (такого як, наприклад, В-клітинний хронічний лімфоцитарний лейкоз (В-СІ/Ї) або волосатоклітинний лейкоз (НСІ)) В- та Т-клітинного гострого лімфоцитарного лейкозу (АГ), гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ), лімфоми Ходжкіна (НІ) та хронічного мієлоїдного лейкозу (СМІ), де ракові клітини являють собою СО38: клітини або включають їх.

Конкретно, СО38: гематологічні злоякісні новоутворення являють собою В-клітинну неходжкінську лімфому (МН), множинну мієлому (ММ), гострий мієлоїдний лейкоз (АМІ), гострий лімфобластний лейкоз (В-клітинний АЇ І) і/або хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ І), більш конкретно, множинну мієлому (ММ), найбільш конкретно, рецидивну і/або резистентну множинну мієлому.

Способи виявлення гематологічного злоякісного новоутворення відомі фахівцю в даній галузі та включають як першу стадію повний аналіз крові (СВС) та дослідження мазка бо периферичної крові. Для визначення остаточного діагнозу, звичайно, потрібна задовільна пункція кісткового мозку і/або біопсія для морфологічних досліджень, які, врешті-решт, доповнюються аналізом проточної цитометрії, цитогенетикою та додатковими молекулярними методиками.

Методики для підтвердження того, що клітини, які походять 3 цього гематологічного злоякісного новоутворення, є СЮОЗ8" відомі фахівцю в даній галузі та включають стандартні методики молекулярної біології, такі як, наприклад, полімеразна ланцюгова реакція (РСЕК), і/або імунохімічні способи, такі як вестерн-блот аналіз.

У контексті даного розкриття "суб'єкт" позначає людину.

Зокрема, "суб'єкт" і/або "суб'єкт, що потребує цього" позначає в даному документі індивіда, що уражений СОЗ387 гематологічним злоякісним новоутворенням та одержує медичну допомогу або лікування. Словом "суб'єкт", таким чином, може називатися в даному документі пацієнт.

Суб'єктом згідно з даним розкриттям може бути чоловік або жінка.

У деяких варіантах здійснення суб'єкт попередньо проходив лікування за допомогою протиракової терапії. Конкретно кажучи, зазначена попередня протиракова терапія може бути вибрана з групи, яку складають хіміотерапія, засоби цілеспрямованої терапії раку, радіотерапія, трансплантація кісткового мозку і/або стовбурових клітин та імунотерапія. "Хіміотерапією" називають лікування раку за допомогою одного або декількох цитотоксичних протипухлинних лікарських засобів (хіміотерапевтичних лікарських засобів) як частини стандартних схем. Хіміотерапевтичний лікарський засіб звичайно призначають циклами, де за періодом лікування йде період відпочинку, щоб надати організму час на відновлення. "Хіміотерапевтичні лікарські засоби", які застосовують, наприклад, для лікування гематологічного злоякісного новоутворення, являють собою без виключення цитарабін (цитозин-арабінозид або ага-С) та антрациклінові лікарські засоби (такі як даунорубіцин і/або дауноміцин, доксорубіцин та ліпосомальний доксорубіцин, ідарубіцин та мітоксантрон), гемтузумаб, клофарабін, кладрибін, гідроксисечовину (пудгеаФ), етопозид, амсакрин, ЕІ Т3- інгібітори та деметилюючі засоби (5-азацитидін та децитабін), мелфалан, циклофосфамід, вінкристин, інгібітори протеасом, такі як бортезоміб, леналідомід, талідомід і/або помалідомід, конкретно, бортезоміб і/або леналідомід. "Засобами цілеспрямованої терапії раку" називають лікарські засоби або інші речовини, що

Зо блокують ріст та розповсюдження раку шляхом створення перешкод для специфічних молекул, що залучені у ріст та прогресування пухлини. "Радіаційна терапія" або "опромінення" використовує випромінювання з високою енергією для видалення ракових клітин. Радіаційну терапію слід застосовувати перед трансплантацією кісткового мозку або стовбурових клітин периферичної крові. "Трансплантацією кісткового мозку і/або стовбурових клітин" називають трансплантацію клітин для відновлення стовбурових клітин, які були знищені високими дозами хіміотерапії і/або радіаційної терапії. Джерела стовбурових клітин включають кістковий мозок, периферичну кров або пуповинну кров. Залежно від джерела стовбурових клітин, які трансплантують, процедуру можна розділяти на трансплантацію кісткового мозку (ВМТ), або трансплантацію стовбурових клітин периферичної крові (РВО5СТ), або трансплантацію пуповинної крові (ОСВТ). Крім того, трансплантацією кісткового мозку і/або стовбурових клітин може називатися аутологічна трансплантація стовбурових клітин і/або алогенна трансплантація.

У разі "аутологічної трансплантації" власні стовбурові клітини суб'єкта вилучають з його або її кісткового мозку або периферичної крові. Їх заморожують та зберігають, поки особа одержує лікування (високодозову хіміотерапію і/або опромінення). Спосіб під назвою "очищення" можна застосовувати при спробі видалити будь-які лейкозні клітини зі зразків. Стовбурові клітини потім реінфузують у кров суб'єкта після лікування. "Алогенні трансплантати" являють собою трансплантати від сумісного донора. Перевагою алогенних трансплантатів кісткового мозку є те, що трансплантовані клітини від донора можуть створювати нову імунну систему, яка зможе визначати лейкозні клітини як чужорідні та видаляти їх. Недоліком алогенних трансплантатів є обмежена кількість сумісних донорів та побічні ефекти. "Імунотерапією" називають стимулювання імунної системи суб'єкта для агресивного впливу на клітини злоякісної пухлини, які відповідальні за захворювання. Це можна здійснювати або за допомогою імунізації суб'єкта, наприклад, шляхом введення протиракової вакцини, у цьому випадку власна імунна система суб'єкта тренується для розпізнавання клітин пухлини як мішеней, що підлягають знищенню, або за допомогою введення терапевтичних антитіл як лікарських засобів, у цьому випадку імунна система суб'єкта залучається до знищення клітин пухлини за допомогою терапевтичних антитіл. бо У контексті даного розкриття суб'єкт міг попередньо проходити лікування проти гематологічного злоякісного новоутворення за допомогою стандартної протиракової терапії, як визначено вище, але в якого мав місце рецидив і/або резистентність.

Таким чином, у конкретному варіанті здійснення суб'єкт страждає на СО38: множинну мієлому, конкретно на рецидивну і/або резистентну СО387 множинну мієлому. "З рецидивом" називають суб'єкта, який вже проходив лікування щодо гематологічного злоякісного новоутворення та в якого спостерігалося поліпшення, але в якого гематологічне злоякісне новоутворення повернулося знову. "З резистентністю" називають суб'єкта, який вже проходив лікування щодо гематологічного злоякісного новоутворення без будь-якого поліпшення, та гематологічне злоякісне новоутворення, таким чином, прогресувало.

В одному варіанті здійснення суб'єкт попередньо проходив лікування бортезомібом і/або леналідомідом.

В одному варіанті здійснення суб'єкт попередньо отримав аутологогічний трансплантат стовбурових клітин (АЗСТ).

В одному варіанті здійснення суб'єкт мав рецидив не пізніше 6 місяців після аутологічної трансплантації.

З рівня техніки відомо, що в суб'єктів, що мають множинну мієлому, певні генетичні ознаки, такі як хромосомна делеція 17р, транслокації ї (4, 14), 1 (14, 16), 1 (14, 20) або ампліфікації, такі як »3 копій 1д21, асоційовані з більш несприятливим наслідком.

Отже, в одному варіанті здійснення суб'єкт має делецію 17р, 1 (4, 14), 1 (14, 16), ї (14, 20) іабо »3 копій 1421.

Останнім часом, дослідники розробили тест з геномним профілюванням для суб'єктів з множинною мієломою. Цей тест дозволяє лікарям класифікувати суб'єктів з множинною мієломою на основі їхнього геномного профілю експресії, а не лише на деяких хромосомних аномаліях.

В одному варіанті здійснення суб'єкт, таким чином, може мати сигнатуру профілювання генної експресії (СЕР) високого ризику (Зпапдппевззу 90 г., 2пап Е, Вигіпоїоп ВЕ, еї аї. (2007),

Віоса 109: 2276-2284.).

У суб'єкта можна спостерігати будь-яку комбінацію згаданих вище ознак.

Зо Множинну мієлому можна виявляти за наявністю моноклональних білків (М-білків). "М-білюом" називають парапротеїн (моноклональний білок або М білок). Цей парапротеїн являє собою імуноглобулін або легкий ланцюг імуноглобуліну, який надлишково продукується внаслідок клональної проліферації плазматичних клітин. Кількості що перевищують певний пороговий рівень, вказують на множинну мієлому. М-білок, як правило, кількісно визначають у сироватці, а також у сечі.

Рівень М-білка у сироватці вимірюють, як правило, за допомогою електрофорезу сироватки, або за допомогою, наприклад, аналізів на специфічні імуноглобуліни; проте кількісне визначення специфічних імуноглобулінів завжди переоцінює М-білок, оскільки нормальні імуноглобуліни включені в результат. Через це, вимірювання вихідного рівня та подальші вимірювання М-білка слід виконувати за допомогою одного способу (Кіспе5 РО еї аї., 1991).

В одному варіанті здійснення рівень М-білка у сироватці 20,5 г/дл вказує на множинну мієлому. В іншому варіанті здійснення рівень М-білка у сироватці більше ніж приблизно 0,5 г/дл вказує на множинну мієлому.

М-білком у сечі називають М-білок, який виводиться у сечі, що досліджують протягом 24 годин. Як правило, вимірюють загальну кількість білка, що виводиться за 24 години, та множать на значення відсотку М-білка в сечі, яку визначають за допомогою електрофорезу концентрованого білка сечі.

В одному варіанті здійснення рівень М-білка у сечі »200 мг у 24-годинній сечі вказує на множинну мієлому. В іншому варіанті здійснення рівень М-білка у сечі більше ніж приблизно 200 мг у 24-годинній сечі вказує на множинну мієлому.

Множинну мієлому можна додатково виявляти за допомогою легкого ланцюга імуноглобуліну, який виявляють у сечі, цей парапротеїн має назву білок Бенсо-Джонса та являє собою парапротеїн сечі, що складається з вільних легких ланцюгів, де ці легкі ланцюги являють собою вільні легкі ланцюги лямбда (А) і/або каппа (к). Ці вільні легкі ланцюги (БІС) можна вимірювати за допомогою комерційних тестів. Вимірюванням вільних легких ланцюгів називають вимірювання вільних легких ланцюгів РіС-каппа та РіС-лямбда, що дає співвідношення вільних легких ланцюгів (РІС) РІ С-каппа до РІ С-лямбда (співвідношення БІС к/А), де нормальне співвідношення РІ С к/А перебуває в діапазоні від 0,26 до 1,65.

У пацієнтів із множинною мієломою може переважно продукуватися один з легких ланцюгів, 60 каппа або лямбда, що веде до змін у співвідношенні РІ С к/А.

Аномальні співвідношення БІС к/А, що вказують на множинну мієлому, являють собою, таким чином, співвідношення РІ С к/А «0,26 або »1,65.

В одному варіанті здійснення підвищений рівень вільних легких ланцюгів (РІ С) у сироватці,

ЕС 210 мг/дл, та аномальне співвідношення БІС вказують на множинну мієлому. В іншому варіанті здійснення підвищений рівень вільних легких ланцюгів (РІ С) у сироватці, РІ С більше ніж приблизно 10 мг/дл, та аномальне співвідношення РІ С вказують на множинну мієлому.

Отже, в одному варіанті здійснення суб'єкт з множинною мієломою має а) вимірюваний рівень М-білка у сироватці більше ніж приблизно 0,5 г/дл, і/або Б) рівень М-білка у сечі більше ніж приблизно 200 мг (24-годинна сеча), і/або с) підвищений рівень вільних легких ланцюгів (РІ С) у сечі, РІ С більше ніж приблизно 10 мг/дл, з аномальним співвідношенням РІ С.

В одному варіанті здійснення суб'єкт є толерантним до інфузованих білкових продуктів.

У контексті даного розкриття антитіло специфічно зв'язує СЮОЗ8. Згідно з одним варіантом здійснення антитіла до СОЗ8 для застосування у рамках даного розкриття здатні знищувати

СОЗ38: клітину шляхом індукування апоптозу, антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АОСС) та комплемент-залежної цитоксичності (СОС).

Як застосовується в даному документі, "апоптозом" називають процес запрограмованої загибелі клітини. "Антитіло-залежною клітинно-опосередкованою цитотоксичністю" або "АЮСС" називають механізм клітинно-опосередкованого імунного захисту, за допомогою якого ефекторна клітина імунної системи активно лізує клітину-мішень, в якій антигени на поверхні мембрани були зв'язані специфічними антитілами. "Комплемент-залежною цитотоксичністю" або "СОС" у контексті даного розкриття називають лізис клітини-мішені у присутності білків системи комплементу.

Як застосовується в даному документі, "кон'югат", "імунокон'югат", "кон'югат антитіло- лікарський засіб" або "АХДЮС" мають однакове значення та є взаємозамінними. "Антитіло" може являти собою природне або звичайне антитіло, в якому два важких ланцюги зв'язані один з одним за допомогою дисульфідних зв'язків та кожний важкий ланцюг з'єднаний з легким ланцюгом за допомогою дисульфідного зв'язку. Існують два типи легких ланцюгів, лямбда (А) та каппа (к). Існують п'ять основних класів важких ланцюгів (або ізотипів), які

Зо визначають функціональну активність молекули антитіла: ДМ, дО, до, ІДА та ІДЕ. Кожний ланцюг містить відмінні домени послідовності. Легкий ланцюг включає два домени або ділянки, варіабельний домен (МІ) та константний домен (СІ). Важкий ланцюг включає чотири домени, варіабельний домен (МН) та три константні домени (СНІ, СНІ2 та СНУ, які разом називають СН).

Варіабельні ділянки обох легких (МІ) та важких (УН) ланцюгів визначають розпізнавання при зв'язуванні та специфічність щодо антигену. Домени константної ділянки легкого (СІ) та важкого (СН) ланцюгів надають їм важливі біологічні властивості, такі як асоціація ланцюгів антитіла, секреція, переміщення через плаценту, зв'язування комплементу та зв'язування з БЕс- рецепторами (БСК). Ем-фрагмент являє собою М-термінальну частину Рар-фрагменту імуноглобуліну та складається з варіабельних частин одного легкого ланцюга та одного важкого ланцюга. Специфічність антитіла полягає у структурній комплементарності між паратопом антитіла та антигенною детермінантою. Паратопи антитіла складаються з залишків, які переважно походять 3 гіперваріабельних ділянок або ділянок, що визначають комплементарність (СОК). Іноді залишки з негіперваріабельних або каркасних ділянок (ЕК) впливають на загальну структуру домену та, отже, на паратоп. "Ділянками, що визначають комплементарність" або "СОК" називають амінокислотні послідовності, які разом визначають афінність та специфічність зв'язування природної Ем- ділянки сайту зв'язування нативного імуноглобуліну. Кожний легкій та важкий ланцюги імуноглобуліну мають три СОК, які позначаються СОК1-ІЇ, СОВ2-І, СОВЗ3-Ї та СОК1-Н, СОН2-

Н, СОВЗ-Н, відповідно. Антиген-зв'язувальний сайт звичайного антитіла, отже, охоплює шість

СОРЕ, що включають набір СОК з кожної М-ділянки важкого та легкого ланцюгів. "Каркасними ділянками" (ЕК) називають амінокислотні послідовності розташовані між СОК, тобто ті частини варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюга імуноглобуліну, які є відносно консервативними серед різних імуноглобулінів одного виду. Кожний легкий та важкий ланцюг імуноглобуліну має чотири ЕК, які позначаються ЕК1-І, ЕВ2-Ї, ЕВЗ-Ї, ЕВА-Ї,, та ЕК1-Н, ЕР2-Н,

ЕВЗ-Н, ЕВА-Н, відповідно.

Як застосовується в даному документі, "каркасна ділянка людини" являє собою каркасну ділянку, яка є практично ідентичною (на приблизно 85 95 або більше, конкретно на 90 95, 95 Об, 97 У», 99 95 або 100 95) з каркасною ділянкою природного антитіла людини.

Визначення СОРК/РК, що стосуються легкого або важкого ланцюга імуноглобуліну, бо надаються на основі номенклатури Кебота (пер:/Лммли.Біоіпт.огу.ик/абз/).

Як застосовується в даному документі, термін "антитіло" позначає звичайні антитіла та їхні фрагменти, а також однодоменні антитіла та їхні фрагменти, конкретно, варіабельний домен важкого ланцюга ооднодоменних антитіл, та химерні, гуманізовані, біспецифічні або мультиспецифічні антитіла.

Як застосовується в даному документі, антитіло або імуноглобулін також включає "однодоменні антитіла", які були описані останнім часом та які являють собою антитіла, в яких ділянки, що визначають комплементарність, є частиною однодоменного поліпептиду. Приклади однодоменних антитіл включають антитіла з важким ланцюгом, антитіла, що природно не мають легких ланцюгів, однодоменні антитіла, що походять від звичайних чотириланцюгових антитіл, сконструйовані однодоменні антитіла. Однодоменні антитіла можуть походити від будь- якого виду, в тому числі без обмежень миші, людини, верблюда, лами, кози, кролика та великої рогатої худоби. Однодоменні антитіла можуть являти собою природні однодоменні антитіла, відомі як антитіло з важким ланцюгом, що не мають легких ланцюгів. Конкретно, у видів

Сатеїідає, наприклад, верблюда, дромедара, лами, альпаки та гуанако, продукуються антитіла з важким ланцюгом, що природно не мають легкого ланцюга. У антитіл з важким ланцюгом від верблюдових також відсутній СНІ1-домен.

Варіабельні домени важкого ланцюга цих однодоменних антитіл, що на мають легких ланцюгів, відомі у даній галузі як "УНН" або "нанотіла". Подібно до звичайних МН-доменів УНН містять чотири ЕК та три СОК. Нанотіла мають переваги над звичайними антитілами: вони приблизно в десять разів менші за молекули ІдС та, внаслідок цього, правильно згорнуті функціональні нанотіла можна одержувати за допомогою іп місто експресії, при цьому з досягненням високого виходу. Більш того, нанотіла є дуже стабільними та стійкими до дії протеаз. Властивості та одержання нанотіл були розглянуті Нагтзхеп та Ое Наага (Наптзеп апа ре Наага (2007) Аррі. Містобіо!ї. Віоїтесппої. 77:13-22).

Терміном "моноклональне антитіло" або "тАбр", як застосовується в даному документі, називають молекулу антитіла з єдиними амінокислотним складом, яка спрямована проти специфічного антигену, та він не має на увазі вимоги одержання антитіла за допомогою будь- якого конкретного способу. Моноклональне антитіло може продукуватися одним клоном В- клітин або гібридомою, але також може являти собою рекомбінантне, тобто одержане за допомогою генної інженерії білків.

Терміном "химерне антитіло" називають сконструйоване антитіло, у якому константна ділянка або її частина змінені, заміщені або замінені, так що варіабельна ділянка зв'язана з константною ділянкою іншого виду, або такої що належить до іншого класу або підкласу антитіл. Химерним антитілом також називають антитіло, у якому варіабельна ділянка або її частина змінені, заміщені або замінені, так що константна ділянка зв'язана з варіабельною ділянкою іншого виду, або такої, що належить до іншого класу або підкласу антитіл. Конкретно, химерне антитіло містить МН-домен та Мі -домен антитіла, що походять від тварини, що не є людиною, сполучені з СН-доменом та Сі -доменом іншого антитіла, зокрема, антитіла людини.

Як тварину, що не є людиною, можна використовувати будь-яку тварину, таку як миша, щур, хом'як, кролик тощо. Химерне антитіло може також позначати мультиспецифічне антитіло зі специфічністю щодо щонайменше двох різних антигенів. В одному варіанті здійснення химерне антитіло має варіабельні домени, що походять від миші, та константні домени, що походять від людини.

Терміном "гуманізоване антитіло" називають антитіло, яке спочатку було повністю або частково таким, що походить не від людини, та яке модифікували з заміщенням певних амінокислот, конкретно, у каркасних ділянках важкого та легкого ланцюгів, для того щоб уникнути або мінімізувати імунну відповідь у людини. Константні домени гуманізованого антитіла переважно являють собою СН- та Сі -домени людини. В одному варіанті здійснення гуманізоване антитіло має константні домені, що походять від людини.

Стосовно химерних антитіл, гуманізація, як правило, передбачає модифікацію каркасних ділянок послідовностей варіабельної ділянки.

Амінокислотні залишки, які є частиною СОК, як правило, не будуть змінюватися під час гуманізації, хоча, у певних випадках, може бути потрібною зміна окремих амінокислотних залишків у СОК, наприклад, для видалення сайту глікозилювання, сайту дезамідування, небажаного цистеїнового залишку, лізінового залишку у випадку АС. М-зв'язане глікозилювання відбувається шляхом приєднання олігосахаридного ланцюга до аспарагінового залишку у трипептидній послідовності Абп-Х-Зег або Ав5п-Х-ТПг, де Х може являти собою будь- яку амінокислоту за винятком Рго. Видалення сайту М-глікозилювання можна досягати шляхом здійснення мутації залишку або Абп, або Зег і/або Тйг на інший залишок, конкретно, за бо допомогою консервативної амінокислотної заміни. Дезамідування аспарагінового та глутамінового залишків може відбуватися залежно від таких факторів, як рН та розташування на поверхні. Аспарагінові залишки є особливо чутливими до дезамідування, насамперед, якщо присутні у послідовності Азп-С1у, та, меншою мірою, в інших дипептидних послідовностях, таких як А5п-АЇІа. Якщо такий сайт дезамідування, конкретно, А5п-С1у, присутній у послідовності СОК, тому може бути потрібно видалити сайт, як правило, шляхом консервативної заміни з видаленням одного з залучених залишків. У випадку АОС, прикріплення цитотоксичного засобу до тАБб може відбуватися шляхом ковалентного приєднання до бічного ланцюга лізинового залишку. Ця стерична перешкода може порушувати зв'язування тАб з антигеном. Отже, може бути потрібним видалення лізинового залишку, як правило, шляхом консервативної заміни на аргінін. Заміна у послідовності СОЖК для видалення одного з залучених залишків, як передбачено, також охоплюються даним розкриттям.

Метою гуманізації є зменшення імуногенності ксеногенного антитіла, такого як мишаче антитіло, для введення людині, при цьому із повним збереженням афінності зв'язування антигена та специфічності антитіла. Гуманізовані антитіла або антитіла інших ссавців, адаптовані для відсутності відторгнення, можна одержувати із застосуванням декількох методик, таких як змінювання поверхні та трансплантація СОК. Як застосовується в даному документі, технологія змінювання поверхні застосовує комбінацію молекулярного моделювання, статистичного аналізу та мутагенезу для зміни поверхні варіабельних ділянок антитіла, що не належать до СОК, щоб вони були схожими на поверхні відомих антитіл хазяїна-мішені.

Стратегії та способи змінювання поверхні антитіл та інші способи для зменшення імуногенності антитіл в організмі іншого хазяїна розкриті в патенті США Мо 5639641. Коротко, згідно з переважним способом, (1) створюють позиційні вирівнювання пулу з варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів антитіл з одержанням набору розташованих на поверхні положень з каркасних ділянок варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів, де положення вирівнювання для усіх варіабельних ділянок є щонайменше приблизно на 98 95 ідентичним; (2) визначають набір розташованих на поверхні амінокислотних залишків з каркасних ділянок варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів для антитіла гризуна (або його фрагмента); (3) встановлюють набір розташованих на поверхні амінокислотних залишків з каркасних ділянок варіабельної ділянки важкого та легкий ланцюгів, що є найбільш ідентичним набору

Зо розташованих на поверхні амінокислотних залишків гризуна; (4) набір розташованих на поверхні амінокислотних залишків з каркасних ділянок варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів, визначений на стадії (2), заміщують на набір розташованих на поверхні амінокислотних залишків з каркасних ділянок варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів, встановлений на стадії (3), за винятком тих амінокислот, що розташовані в межах 5 А від будь- якого атому з будь-якого залишку ділянки, що визначає комплементарність, антитіла гризуна; та (5) одержують гуманізоване антитіло гризуна зі специфічністю зв'язування. Таким чином, в одному варіанті здійснення гуманізовані антитіла також можна називати антитілами, що "піддані змінюванню поверхні".

Крім того, антитіла можна гуманізувати із застосуванням багатьох інших методик, у тому числі трансплантації СОК (ЕРО239400; М/О91/09967; патенти США МоМо 5530101 та 5,585,089), поліпшення або змінювання поверхні (ЕРО592106; ЕРОБ519596; Райдіап (1991) Моїесшіаг

Іттипоіоду 28(4/5):489-498; 5ійапіскКа єї а!. (1994) Ргоїєїп Епдіпеегіпу 7(6):805-814; ВКодивКа єї аІ. (1994) Ргос. Май). Асад. 5сі 0.5.А. 91:969-973) та перетасування ланцюгів (патент США Мо 5565332). Антитіла людини можна одержувати за допомогою багатьох способів, відомих з рівня техніки, в тому числі за допомогою способів фагового дисплею. Див. також патенти США МоМо 4444887, 4716111, 5545806 та 5814318; та міжнародні патентні заявки УУО98/46645,

УМО98/50433, УМО98/24893, ММО98/16654, УМО96/34096, ММО96/33735 та УМО91/10741. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, при якій амінокислотний залишок замінюється на інший амінокислотний залишок, що має К-групу бічного ланцюга з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю). Загалом, консервативна амінокислотна заміна не буде значною мірою змінювати функціональні властивості білка. Приклади груп амінокислот, які мають бічні ланцюги з аналогічними хімічними властивостями включають 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин; 2) аліфатично-гідроксильні бічні ланцюги: серин та треонін; 3) амідовмісни бічні ланцюги: аспарагін та глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин, та триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін та гістидин; б) кислотні бічні ланцюги: аспарагінову кислоту та глутамінову кислоту та 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн та метіонін.

Групи консервативних замін амінокислот є наступними: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін- тирозин-триптофан, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспаратат та аспарагін-глутамін. бо "Фрагменти" (звичайних) антитіл включають частину інтактного антитіла, конкретно,

антигензв'язувальну ділянку або варіабельну ділянку інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають Ем, Бар, Е(ар)г2, Раб", азем, (авЕм)2, зсЕм, зе(Ем)2, діатіла, біспецифічні та мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Фрагмент звичайного антитіла також може являти собою однодоменне антитіло, таке як антитіло з важким ланцюгом або УНН.

Термін "Бар" позначає фрагмент антитіла з молекулярною масою приблизно 50000 Да та активністю зв'язування антигену, в якому приблизно половина М-термінального боку Н-ланцюга та повний І-ланцюг, зв'язані разом за допомогою дисульфідного зв'язку, з числа фрагментів, одержаних шляхом обробки до протеазою, папаїном, .

Терміном "Е(ар)г називають фрагмент антитіла з молекулярною масою приблизно 100000

Да, та активністю зв'язування антигену, який є трохи більшим за Раб, зв'язаний за допомогою дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці, з числа фрагментів, одержаних шляхом обробки ІДС протеазою, пепсином.

Терміном "РГабр" називають фрагмент антитіла з молекулярною масою приблизно 50000 Да та активністю зв'язування антигену, який одержують за допомогою розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці Е(аб)»5-фрагменту.

Одноланцюговий Ем ("5сЕм") поліпептид являє собою ковалентно з'єднаний гетеродимер

МН, який звичайно експресується з химерного гена, який містить гени, що кодують МН та МІ, з'єднані за допомогою лінкера, що кодує пептид. 5сЕм-фрагмент за даним розкриттям включає

СОН, які підтримуються у відповідній конформації, зокрема, із застосуванням методики генної рекомбінації. Бівалентні та мультиваленті фрагменти антитіл можуть утворюватися або мимовільно шляхом об'єднання моновалентних 5сЕм, або їх можна одержувати шляхом об'єднання моновалентних 5сЕм за допомогою пептидного лінкера, як, наприклад, бівалентні 5С(ЕМ)». "а5Ру" являє собою гетеродимер МН.МЇ, стабілізований дисульфідним зв'язком. «(а5Ем)» позначає два аз5Ем, об'єднані за допомогою пептидного лінкера.

Термін "біспецифічне антитіло" або "В5АБ" позначає антитіло, яке об'єднує антиген- зв'язувальні сайти двох антитіл у межах однієї молекули. Таким чином, В5АбБ здатні зв'язувати два різні антигени одночасно. Усе частіше генну інженерію застосовують для розробки, модифікації та одержання антитіл або похідних антитіл з необхідним набором властивостей

Зо зв'язування та ефекторних функцій, як описано, наприклад, у ЕР 2050764 А1.

Термін "мультиспецифічне антитіло" позначає антитіло, яке об'єднує антиген-зв'язувальні сайти двох або більше антитіл у межах однієї молекули.

Терміном "діатіла" називають невеликі фрагменти антитіла з двома антиген-зв'язувальними сайтами, при цьому фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюга (МН), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) в один поліпептидний ланцюг (МН-МІ.).

Шляхом застосування лінкера, який є надто коротким, щоб дозволити утворення парних зв'язків між двома доменами на одному ланцюгу, домени примушують утворювати парні зв'язки з комплементарними доменами іншого ланцюга та створювати два антиген-зв'язувальні сайти.

Антитіло для застосування у рамках даного розкриття може являти собою одне з моноклональних антитіл до СОЗ8, що названі 385813, 38585818, 385819, 385830, 385831 та 385839, які описані в М/О2008/047242, або їхні похідні, одержані шляхом технології змінювання поверхні.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить СОК-НІ1 з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1, СОК-Н2 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 2 та СОК-НЗ з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 3, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5 та 6. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ

МО: 44, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з зЗЕО ІЮ МО: 38.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий

БО ланцюг, що містить СОК-НІ1 з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 7, СОК-НА2 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8 та СОВ-НЗ з послідовністю ЗЕО ІО МО: 9, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з 5ЕО ІЮО МО: 10, 11 та 12. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що містить

ЗЕО ІЮ МО: 45, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з БЕО ІЮО МО: 39.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить СОК-НІ з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 13, СОК-Н2 з послідовністю ЗЕО ІЮ

МО: 14 та СОК-НЗ з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 15, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з БЕО ІЮ МО: 16, 17 та 18. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що 60 містить БЕО ІЮ МО: 46, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з 5ЕО ІЮ

МО: 40.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить СОК-НІ з послідовністю 5ЕО ІО МО: 19, СОВ-Н2 з послідовністю ЗЕО ІЮ

МО: 20 та СОК-НЗ з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 21, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з БЕО ІЮ МО: 22, 23 та 24. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 47, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з 5ЕО ІЮ

МО: 41.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить СОК-НІ з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 25, СОК-Н2 з послідовністю ЗЕО ІЮ

МО: 26 та СОК-НЗ з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 27, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з БЕО ІЮ МО: 28, 29 та 30. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 48, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з 5ЕО ІЮ

МО: 42.

Конкретно, антитіло до СОЗ8 у контексті даного розкриття містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить СОК-НІ з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 31, СОК-Н2 з послідовністю ЗЕО ІЮ

МО: 32 та СОК-НЗ з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 33, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить три послідовні СОК з амінокислотними послідовностями, що складаються з БЕО ІЮ МО: 34, 35 та 36. Конкретно, зазначене антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга, що містить БЕО ІЮ МО: 49, та варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ланцюг з 5ЕО ІЮ

МО: 43.

Крім того, у контексті даного розкриття охоплені антитіла, що містять послідовність, яка щонайменше на 85 95, більш конкретно, щонайменше на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 9, 96 9», 97 У», 98 90, 99 95 або 100 95 ідентична послідовностям, розкритим у даному документі.

Послідовність "щонайменше на 8595 ідентична еталонній послідовності" являє собою послідовність, що характеризується, за її повною довжиною, 85 95 або більше, конкретно, 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 94 95, 95 90, 96 оо, 97 90, 98 95 або 99 95 ідентичністю послідовності з повною довжиною еталонної послідовності.

Відсоток "ідентичності послідовності" можна визначати шляхом порівняння двох послідовностей, з оптимальним вирівнюванням по всьому вікну порівняння, де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не містить додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховують шляхом визначення числа положень, у яких ідентична нуклеїнова основа або амінокислотний залишок розташовані в обох послідовностях з одержанням числа положень, що збігаються, ділення числа положень, що збігаються, на загальне число положень у вікні порівняння та множення результату на 100 з одержанням відсоткової частки ідентичності послідовності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння здійснюють за допомогою глобального попарного вирівнювання, наприклад, із застосуванням алгоритму МееаІієтап апа МУсп5сп У. Мої. Віої. 48: 443 (1970). Відсоток ідентичності послідовності можна легко визначити, наприклад, із застосуванням програми Мееаіе з матрицею ВІ О5ИОМб2 та наступними параметрами штраф за відкриття гепу-10, штраф за подовження гепу-0,5.

В одному варіанті здійснення антитіла до СОЗ38 являють собою гуманізовані антитіла до

СОз38, одержані шляхом технології змінювання поверхні. Такі антитіла також можна називати антитілами, що "піддані змінюванню поверхні".

В одному варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з

БО амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІО МО: 1, 2 та 3, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮО МО: 4, 5 та 6.

В іншому варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІО МО: 7, 8 та 9, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 10, 11 та 12.

В іншому варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія 60 антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮО МО: 13, 37 та 15, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 16, 17 та 18.

В іншому варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮО МО: 19, 20 та 21, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 22, 23 та 24.

В іншому варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в 5ЕО ІЮО МО: 25, 26 та 27, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 28, 29 та 30.

В ще одному варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла, містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮО МО: 31, 32 та 33, та де зазначений легкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 34, 35 та 36.

В одному варіанті здійснення в даному розкритті представлені піддані змінюванню поверхні і або гуманізовані антитіла, що містять Мн з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи з

ЗБЕО ІЮО МО: 50 та 51. У ще одному варіанті здійснення піддана змінюванню поверхні і/або гуманізована версія антитіла містить Мн з амінокислотною послідовністю, представленою в 5ЕО

ІЮ МО: 50. В іншому варіанті здійснення гуманізована версія антитіла містить Мн з амінокислотною послідовністю, представленою в 5ЕО ІЮ МО: 51.

В іншому варіанті здійснення в даному розкритті представлені гуманізовані антитіла, що

Ко) містять Мі з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи з ЗЕО ІО МО: 52, 53, 54 та 55. В іншому варіанті здійснення гуманізована версія антитіла містить Мі з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи з ЗЕО ІО МО: 52 та 53. В іншому варіанті здійснення гуманізована версія антитіла містить Мі з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи з

ЗЕО ІЮО МО: 54 та 55.

У специфічному варіанті здійснення антитіло згідно з даним розкриттям являє собою гуманізоване і/або піддане змінюванню поверхні антитіло під назвою пи3858В819, яке містить Мн з амінокислотною послідовністю, представленою в 5ЕО ІО МО: 50, та містить Мі з амінокислотною послідовністю, представленою в 5ЕО ІЮ МО: 52.

В іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним розкриттям являє собою даратумумаб.

У специфічному варіанті здійснення антитіло для застосування згідно з даним розкриттям являє собою "голе" антитіло, тобто не зв'язане з будь-яким лікарським засобом з утворенням кон'югата антитіло-лікарський засіб.

Антитіла для застосування згідно з даним розкриттям специфічно зв'язують СОЗ8 та здатні знищувати СО38: клітину шляхом індукування апоптозу, антитіло-залежної клітинно- опосередкованої цитотоксичності (АОСС). У специфічному варіанті здійснення антитіла для застосування згідно з даним розкриттям здатні знищувати СОЗ8: клітину іп мйго шляхом індукування апоптозу, навіть коли клітини, які обробляли антитілом, не були пов'язані з вторинним антитілом до дО людини.

Крім того, у контексті даного розкриття охоплені гуманізовані антитіла, що містять послідовність, яка щонайменше на 85 95, більш конкретно, щонайменше на 90 95, 91 9, 92 Об, 9396, 94 95, 9595, 9690, 97 95, 9895, 99 95 або 100 95 ідентична послідовностям, розкритим вище.

Антитіла згідно з даним розкриттям можна одержувати за допомогою стандартних методик імунізації тварин, одержання гібридом та добору антитіл із специфічними характеристиками.

Конкретно, 385819, антитіло до СОЗ8, одержують як описано у прикладі 4 міжнародної патентної заявки УМО2008/047242, тобто згідно з наступним протоколом клонування та секвенування легкого та важкого ланцюгів антитіл до СОЗ8: () одержання РНК з гібридомних клітин, які продукують антитіло 385819, наступним чином: препарати загальної РНК одержували з 5 х 105 гібридомних клітин, які продукують антитіло 60 385819, із застосуванням НМеазу тіпіргер Кії від Оіадеп. Коротко, 5 х 105 клітин осаджували та ресуспендували у 350 мкл буфера КІТ (містить 195 ВДВ-меркаптоетанолу). Суспензію гомогенізували шляхом проходження її крізь шприц з голкою 21,5 калібру приблизно 10-20 разів або доти, доки він більше не був в'язким. Етанол (350 мкл 70 95 водного етанолу) додавали до гомогенату, якій добре перемішували. Розчин переносили до спін-колонки, вміщали у 2-мл пробірку для збирання фільтрату та центрифугували при х8000 х д протягом 15 секунд. Колонку промивали два рази за допомогою 500 мкл буферу КРЕ, потім переносили до нової пробірки та елюювали за допомогою 30 мкл води, що не містить РНКази, та центрифугували протягом 1 хвилини. Елюат (30 мкл) повертали до колонки для другого елюювального центрифугування протягом 1 хвилини. Аліквоту з 30 мкл елюату розводили водою та застосовували для вимірювання УФ-поглинання при 260 нм для кількісної оцінки РНК. (ї) одержання кКДНК за допомогою реакції зі зворотною транскриптазою (КТ) наступним чином: кКДНК варіабельної ділянки антитіла 385819 одержували з загальної РНК із застосуванням набору Бирегзогірі ІЇ від Іпмігодеп. Точно додержувалися протоколів у наборі, використовуючи до 5 мкг загальної РНК з мініпрепів Оіапеазу. Коротко, РНК, 1 мкл випадкових праймерів та 1 мкл суміші ДНТФ доводили до 12 мкл за допомогою стерильної дистильованої води, що не містить РНКа»з, та інкубували при 652С протягом 5 хвилин. Потім суміш вміщали на лід на щонайменше 1 хвилину. Після цього додавали 4 мкл 5 х реакційного буфера, 2 мклО0,1 М

РТ та 1 мкл КМазедйИЦТт та суміш інкубували при 252С протягом 2 хвилин у термоциклері Му

Кезеагсп. Термоциклер зупиняли, щоб можна було додати 1 мкл ферменту ЗирегзоегірійІ, та потім запускали повторно протягом додаткових 10 хвилин при 2523 перед переключенням на 55"С протягом 50 хвилин. Реакцію піддавали інактивації нагріванням шляхом нагрівання до 7026 протягом 15 хвилин та РНК видаляли шляхом додавання 1 мкл РНКази Н та інкубацією при 372С протягом 20 хвилин. (ії) ПЛР-реакції з виродженими праймерами: процедура ПЛР-реакції з виродженими праймерами першого раунду за участі КкДНК, одержаної з гібридомних клітин, базувалася на способах, описаних у У/апо еї аї. (2000) та Со еї аІ.(1992). Праймери для цього раунду (таблиця 1) містять сайти рестрикції для сприяння клонуванню в плазміди рВіпезстгіріІ.

Таблиця 1:

Праймери, застосовані для ПЛР-реакції з виродженими праймерами

Ватідсі1 (ЗЕеЕО б апбАдапАТоСАТАВАСАаАтТасссатататтаас

МО. 56

ІсегАба т садапАТоССсТТаАССАпасСАТССТАСАСТСА (ЗБЕО І

МО. 57 (ЗБЕО І

МО. 58

Есомнаг (ЗЕО ІрстоСаспААТТОЗАНСТММАаСТавдавАдатосМас

МО. 59 засІіМК

МО. 60 мові) | ТС

Коо)

Праймери, застосовані для ПЛР-реакцій з виродженими праймерами, базуються на таких з

УМапд еї аїІ.,, 2000, за винятком Ніпакі, що базується на Со еї а). 1992. Змішані основи визначаються наступним чином: Н-АжТеС, 5-сС, у-С-Т, К-Т, МААвС, К-Аво, УМУ-АТ,

М-АзСба.

Компоненти ПЛР-реакції (таблиця 2) змішували на льоді в тонкостінних пробірках для ПЛР та потім переносили в ампліфікатор М. гезеагсіп, попередньо нагрітий та поставлений на паузу при 942С. Реакції проводили із застосуванням програми, що одержана з УмМапо еї аї., 2000, наступним чином:

Назва: Ууапд45 9420 3:00 хв. 9466015 с 4526 1:00 хв. 7226 2:00 хв.

Перехід на стадію 2 29 разів 7226 6:00 хв. 426 до кінця

Кінець.

Потім суміші з ПЛР-реакцій проганяли на гелі з 1 95 легкотопкої агарози, смужки розміром 300-400 п.о. вирізали, очищали із застосуванням мініколонок для очищення ДНК 2уто, та посилали в Адепсоишгі бБіозсіепсе5 для секвенування. Відповідні 5" та 3" ПЛР-праймери застосовували як праймери для секвенування з одержанням кКДНК варіабельних ділянок 385819 в обох напрямках. (м) Клонування послідовностей 5-кінця виконували наступним чином: Оскільки дегенеративні праймери, які застосовували для клонування кДНК-послідовностей варіабельної ділянки 385819 легкого ланцюга та важкого ланцюга, змінюють послідовності 5'-кінця, були необхідними додаткові роботи з секвенування для розшифровки повних послідовностей.

Попередню кДНК-послідовність зі способів, описаних вище, застосовували для пошуку на сайті

МСВІ 198аві (пр/Лумли. пебрі.піт.пій.дом/двіаві/) щодо мишачих послідовностей зародкового типу, від яких походить послідовність 385819. ПЛР-праймери розробляли (таблиця 3) для відпалювання з лідерною послідовністю мишачого антитіла, отже, нова ПЛР-реакція могла давати кКДНК повної варіабельної ділянки, не зміненої через ПЛР-праймери. ПЛР-реакції, очищення смужок та секвенування здійснювали як описано вище.

Таблиця 2:

Суміші для ПЛР-реакцій з легким та важким ланцюгом для клонування кДНК-послідовностей варіабельних ділянок 385819.

Суміш для реакції з легким ланцюгом Суміш для реакції з важким ланцюгом 5 мкл 10 Х буфера для ПЛР-реакції (Воспе) | Мкл 10 Х буфера для ПЛР реакції (Коспе) й 4 мкл 10 мМ суміші дНТФ (по 2,5 мМ кожного) 4 мкл 10 мМ суміші дНТФ (по 2,5 мМ кожного) й . 2 мкл шаблона (КТ-реакція) 2 мкл шаблона (КТ-реакція) : і й - 2,5 мкл 10 мкМ лівого праймера ЕсомМН1 5 мкл 10 мкМ лівого праймера засімк й в

М : 2,5 мкл 10 мкМ лівого праймера ЕсомМН2 5 мкл 10 мкМ правого праймера Ніпакі. м 5 мкл 10 мкМ правого праймера Ватідси1 5 мкл ОМБО . 5 мкл ОМ5О 0,5 мклТад-полімерази (Коспе) : ні їй 0,5 мкл Тад-полімерази (Коспе) 23,5 мкл стерильної дистильованої Н2О . й 23,5 мкл стерильної дистильованої НгО

Загалом 50 мкл

Загалом 50 мкл (м) Пептидний аналіз для підтвердження послідовності виконували наступним чином:

Зо Інформацію щодо кДНК-послідовності варіабельної ділянки об'єднували з послідовністю константної ділянки зародкового типу з одержанням кДНК-послідовності антитіла повної довжини. Потім обчислювали молекулярну масу важкого ланцюга і легкого ланцюга та порівнювали з молекулярною масою, одержаною за допомогою аналізів | С/М5 мишачого антитіла 385819. У таблиці 5 з патенту США Мо 8153765 наведена обчислена маса кДНК- послідовностей для С та НС 385819 разом зі значеннями, виміряними за допомогою І С/М5.

Вимірювання молекулярної маси відповідали кКДНК-послідовностям як легкого, так і важкого ланцюга 385819.

Таблиця 3:

Праймери для мишачих лідерних послідовностей 5'-кінця, застосовані для ПЛР-реакцій другого раунду з 385819.

Легкий ланцюг

Лідерна послідовність

ІС 385819 (ЗЕО ІЮО МО. 62) Важкий АТаСАаТСАСАСАТТСАСИтТо ланцюг ТТТТаААТТОСАССТААСТТСАСИЯТатоСАСТО

Лідерна послідовність 1 НО 38-19 (ЗЕО ІЮО МО. 63

У таблиці З представлені праймери для мишачих лідерних послідовностей 5'-кінця, застосовані для ПЛР-реакцій другого раунду з 385819. Праймери для 3'-кінця є ідентичними тим, що застосовували під час реакцій першого раунду, оскільки вони є праймерами для відповідних послідовностей константних ділянок.

Більш конкретно, гуманізовані антитіла 385819 можна одержувати, як описано у прикладі 5 міжнародної патентної заявки М/02008/047242, тобто згідно з наступним протоколом:

Послідовності варіабельних ділянок для Ппи385819 піддавали оптимізації кодонів та синтезували за участі Віне Негоп Віоїесппоіоду. Послідовності фланкували сайтами рестриктаз для клонування в рамку зчитування з відповідними послідовностями константних ділянок в плазміди для експресії у клітинах ссавців як одного ланцюга, так і тандемних подвійних ланцюгів. Варіабельну ділянку легкого ланцюга клонували в сайти ЕсоКіІ та В5іММІ в обох плазмідах ре385819І С7м1.0 та ре385819м1.00 (фіг. 2А та 2С у ММО2008/047242). Варіабельну ділянку важкого ланцюга клонували в сайти НіпаНІ та Ара! в обох плазмідах ре3з385819НСМм1.0 та ре385819м1.00 (фіг. 28 та 2С у М/О2008/047242). Ці плазміди можна застосовувати для експресії пи385819 під час або тимчасових, або стабільних трансфекцій клітин ссавців.

Аналогічні конструкції векторів експресії застосовували для одержання інших химерних та гуманізованих антитіл. Тимчасові трансфекції для експресії пи385819 у клітинах НЕК-2937Т здійснювали із застосуванням реагентів СаРО4 від ВО бБіозсіепсе5. Надані протоколи дещо модифікували для поліпшення виходів експресії. Коротко, 2 х 105 клітин НЕК-293Т висівали на чашки Петрі для культур тканин діаметром 10 см, вкриті поліетиленіміном (РЕЇ) за 24 год. перед трансфекцією. Трансфекцію розпочинали промиванням клітин за допомогою РВ5 та заміщенням середовища на 10 мл ОМЕМ (Іпмйгодеп) з 1 96 ЕВ5 з дуже низьким вмістом дО (Нусіопе). Розчин А (10 мкг ДНК, 86,8 мкг розчину Са?" та доведений до 500 мкл за допомогою

НгО) додавали по краплинах до розчину В під час перемішування на вортексі. Суміш інкубували при КТ протягом 1 хв. та 1 мл суміші додавали по краплинах у кожну чашку Петрі діаметром 10 см. Приблизно через 16 год. після трансфекції середовище заміщували на 10 мл свіжого ОМЕМ з 1956 ЕВ5 з дуже низьким вмістом дб. Через приблизно 24 години в кожну чашку Петрі

Зо діаметром 10 см додавали 2 мМ бутират натрію. Трансфекцію аналізували через 4 дні.

Надосадову рідину готували для афінної хроматографії з білоом А шляхом додавання 1/10 об'єму 1 М буферу Ттгіз/НеСІ, рН 8,0. Надосадову рідину з відрегульованим рН фільтрували крізь 0,22 мкм мембранний фільтр та завантажували на сефарозну колонку з білком А (НіТгар Ргоїеїп

А НР, 1 мл, Атегейпат Віозсіепсе5), врівноважену за допомогою буфера для зв'язування (РВ5, рН 7,3). Попередню колонку з О-сефарозою (10 мл) розташовували вище за колонку з білком А під час завантаження зразка для зменшення забруднення клітинним матеріалом, таким як ДНК.

Після завантаження зразка попередню колонку видаляли та орієнтацію колонки з білком А змінювали на протилежну для промивання та елюювання. Колонку промивали за допомогою буфера для зв'язування, поки не одержували стабільний вихідний рівень з відсутністю поглинання при 280 нм. Антитіло елюювали за допомогою буфера на основі 0,1 М оцтової кислоти, що містив 0,15 М Масі, рН 2,8, із застосуванням швидкості потоку, що становила 0,5 мл/хв. Збирали фракції, що становили приблизно 0,25 мл, та нейтралізували додаванням 1/10 об'єму 1М Тгтгіз/НСІ, рН 8,0. Пікову фракцію(ї) діалізували протягом ночі двічі проти РВ5 та очищене антитіло оцінювали кількісно за поглинанням при ОЮгво. Гуманізовані та химерні антитіла можна також очищувати із застосуванням колонки з білююм Сб за дещо відмінних процедур.

Усі ілюстративні химерні, гуманізовані і/або піддані змінюванню поверхні антитіла до СОЗ8 експресували та очищували із застосуванням процедур, аналогічних описаним вище.

Автори даного винаходу визначали для антитіл за даним розкриттям придатні дозу для введення та схему, щоб одержати спосіб лікування раку з доброю переносимістю, що дозволяє лікувати суб'єктів, що страждають на СО38" гематологічне злоякісне новоутворення, конкретно, на СО38:" множинну мієлому, більш конкретно, на рецидивну і/або резистентну СОЗ38" множинну мієлому.

Отже, режим з прискореним підвищенням дози застосовували для перших п'яти рівнів дози в діапазоні від 0,0001 мг/кг до 0,1 мг/кг, які вводили кожні два тижні, з одним суб'єктом, що підлягає оцінці, на рівень дози. Усі подальші рівні дози, такі як 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, З мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг та 20 мг/кг, вводили кожні 2 тижні, 10 мг/кг також вводили щотижня, з наступною класичною схемою 3-3 для підвищення дози на основі рівня дози токсичності, медіанна кількість циклів перебувала в діапазоні від 2,0 до 50,0 для введення.

У межах цього дослідження автори даного винаходу продемонстрували, що застосоване антитіло має профіль безпеки, який легко контролювати, з максимальною стерпною дозою, яка становить вище ніж 10 мг/кг.

Дослідження імуногенності, здійснені авторами даного дослідження, показали, що в суб'єкті- людині не продукуються антитіла проти антитіла до СОЗ8.

Крім того, автори даного винаходу змогли показати, що антитіло за даним розкриттям характеризується високою ефективністю зв'язування в людині, що продемонстроване високою зайнятістю рецепторів за низьких доз. Зайнятість рецепторів виявляли, наприклад, за рівня дози 1 мг/кг, та вона сягала діапазону 84,1-97,7 95 при введенні 10 мг/кг кожні два тижні.

Зайнятість рецепторів, як правило, оцінювали із застосуванням двох моноклональних антитіл (птАбБ), що зв'язуються з двома різними епітопами антигену СОЗ8. МАБІ є специфічним щодо того самого епітопу, що й, наприклад, пи385819, та, таким чином, є показником вільних сайтів СОЗ38 (не окупованих за допомогою, наприклад, пи385819). Друге моноклональне антитіло, тАб2, спрямоване на інший епітоп, ніж пи385819, забезпечує позитивний контроль щодо присутності СОЗ38- клітин та оцінку кількості антигену СЮОЗ3З8, що залишається на поверхні клітини після іп міго введення лікарського засобу. Застосування гранул як калібраторів та непряме виявлення забезпечує можливість кількісного підходу без будь-якої модифікації здатності до зв'язування в пи385819. Комбінація цих результатів надавати значення щільності і зайнятості рецепторів на клітину.

Не спостерігали значного підвищення Стах у циклі 2 порівняно з Стах у циклі 1 для діапазону доз від 0,03 до З мг/кг.

Крім того, автори даного винаходу демонструють, що антитіло досягає інгібування росту пухлини з пороговим рівнем при Стах для 1 пацієнта за рівня дози 5 мг/кг, та для 5 пацієнтів за рівня дози 10 мг/кг.

Автори даного винаходу продемонстрували, зокрема, що в суб'єкта, який страждає на

СОр38: гематологічне злоякісне новоутворення, конкретно, на СЮОЗ38" множинну мієлому, більш конкретно, на рецидивну і/або резистентну СОЗ38" множинну мієлому, спостерігали певну відповідь, якщо антитіло до СОЗ3З8 за даним розкриттям вводили з дозами 1 мг/кг, 5 мг/кг та 10 мг/кг.

Автори даного винаходу спостерігали, зокрема, що пороговий рівень інгібування росту пухлини досягався при Стах для 1 пацієнта за рівня дози 5 мг/кг, та для 5 пацієнтів за рівня дози 10 мг/кг.

Згідно з даним розкриттям антитіло призначене для застосування як лікарського препарату, де зазначене антитіло вводиться суб'єкту-/людині в безпечній терапевтичній дозі 20 мг/кг або менше.

В одному варіанті здійснення антитіло призначене для застосування в лікуванні СОЗ8" гематологічного злоякісного новоутворення, конкретно, для лікування множинної мієломи, найбільш конкретно, для лікування рецидивної і/або резистентної множинної мієломи.

СО38: гематологічні злоякісні новоутворення, що підлягають лікуванню у контексті даного розкриття, визначені у розділі "СОЗ38: гематологічні злоякісні новоутворення".

Суб'єкт-людина визначений вище у розділі "суб'єкт". бо У контексті даного розкриття термін "лікувати" або "лікування", як застосовується в даному документі, означає зворотній розвиток, полегшення, інгібування прогресування або запобігання порушенню або стану, до яких такий термін застосовують, або одному або декільком симптомам такого порушення або стану.

Під терміном "лікування СО38: гематологічного злоякісного новоутворення", як застосовується в даному документі, мається на увазі інгібування росту СЮОЗ38- злоякісних клітин пухлини і/або розвиток метастазів від зазначеної СОЗ38" пухлини. Таке лікування також може приводити до зворотного росту пухлини, тобто, зменшення розміру вимірюваної пухлини.

Зокрема, таке лікування веде до повного зворотного розвитку СО38" пухлини або СО38- метастазів.

Під "терапевтично ефективною кількістю" антитіла, в контексті даного розкриття, мають на увазі кількість антитіла, достатню для лікування зазначеного СОЗ38- гематологічного злоякісного новоутворення, як встановлено авторами даного винаходу та розкрито в даному документі.

У конкретному варіанті здійснення зазначена терапевтично ефективна кількість антитіла, яке вводять суб'єкту, являє собою дозу в діапазоні від 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг, конкретно, дозу в діапазоні від 1 мг/кг до 20 мг/кг, більш конкретно, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 7,5 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг або 20 мг/кг.

В одному варіанті здійснення антитіло за даним розкриттям можна вводити один раз на тиждень або один раз кожні два тижні.

В іншому варіанті здійснення зазначена терапевтично ефективна кількість антитіла, яке вводять суб'єкту, являє собою дозу в діапазоні від 1 мг/кг до 20 мг/кг, від З мг/кг до 20 мг/кг, від 5 мг/кг до 20 мг/кг або від 10 мг/кг до 20 мг/кг, наприклад, один раз на тиждень або один раз на два тижні. Дійсно, було показано, що ці дози є безпечними, при цьому для деяких індивідів була показана ефективність.

У ще одному варіанті здійснення зазначена терапевтично ефективна кількість антитіла, яке вводять суб'єкту, являє собою дозу 10 мг/кг один раз на тиждень або 20 мг/кг, наприклад, один раз на тиждень або один раз на два тижні.

У деяких варіантах здійснення антитіло за даним розкриттям можна вводити згідно з періодичною програмою з інтервалом між кожним введенням в 1 тиждень або 2 тижня, який може бути подовженим на 1-2 тижні залежно від стерпності попереднього введення. Проте автори даного винаходу спостерігали переважно побічні ефекти, які не були серйозними.

Згідно з цим, у конкретному варіанті здійснення введення антитіла повторюють як новий цикл безпосередньо після попереднього циклу.

Як застосовується в даному документі, "циклом" називають, у випадку введення "один раз на тиждень" один тиждень, у випадку введення "один раз на два тижні" один цикл відповідає двом тижням.

В одному варіанті здійснення кількість циклів введення може складати від 2 до 50, конкретно, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 0, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 45, 50 циклів.

Кількість циклів введення антитіла за даним розкриттям, таким чином, може бути вибрана З групи, яку складають 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 0, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 45, 50 циклів.

Антитіло за даним розкриттям вводять внутрішньовенно.

У деяких варіантах здійснення дозу можна збільшувати протягом лікування після оцінки відповіді захворювання на терапію.

Мінімальна доза у контексті даного розкриття відповідає 0,0001 мг/кг, де рівень дози 0,0001 мг/кг, представляє 10 95 теоретичної зайнятості рецепторів СОЗ8 на нормальних В- та Т- клітинах.

У деяких варіантах здійснення внутрішньовенне введення здійснюють за певної швидкості інфузії.

Конкретно, антитіло вводитимуть за початкової швидкості інфузії від 0,042 мг/год. до 250 мг/год., конкретно, початкова швидкість інфузії становить 0,042 мг/год.

У деяких варіантах здійснення початкова швидкість інфузії залежить від дози, яка має вводитися.

Згідно з цим, в одному прикладі, антитіло за даним розкриттям, як правило, вводять, наприклад, з дозою 0,0001 мг/кг за початкової швидкості 0,042 мг/год. протягом сукупно З мл, наприклад, з дозою 0,001 мг/кг за початкової швидкості 0,42 мг/год. протягом сукупно З мл, наприклад, з дозою 0,01 мг/кг за початкової швидкості 1, 4 мг/год., наприклад, з дозою 0,03 мг/кг за початкової швидкості 4,2 мг/год., наприклад, з дозою 0,1 мг/кг за початкової швидкості 7 мг/год., наприклад, з дозою 0,01 мг/кг за початкової швидкості 1,4 мг/год., наприклад, з дозою 0,3 мг/кг за початкової швидкості 10,5 мг/год., наприклад, з дозою 1 мг/кг за початкової 60 швидкості 17,5 мг/год., наприклад, з дозою З мг/кг за початкової швидкості 52,5 мг/год.,

наприклад, з дозою 5 мг/кг за початкової швидкості 87,5 мг/год., наприклад, з дозою 10 мг/кг за початкової швидкості 175 мг/год. та, наприклад, з дозою 20 мг/кг за початкової швидкості 250 мг/год.

Під час введення за суб'єктом, як правило, спостерігають щодо ознак реакцій гіперчутливості, та введення продовжують лише за відсутності реакцій гіперчутливості.

Проте буде зрозумілим, що, хоча точний час введення (один раз на тиждень або один раз кожні два тижні), кількість циклів та початкова швидкість інфузії будуть перебувати в межах діапазону значень, розкритих у даному документі, проте, точні значення вирішуватиме лікар для будь-якого конкретного суб'єкта залежно від факторів, в тому числі СЮОЗ38" гематологічного злоякісного новоутворення, що підлягає лікуванню, та тяжкості порушення; активності застосованого специфічного антитіла; застосованої специфічної композиції, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі та раціону суб'єкта.

Буде зрозумілим, що лікар може модифікувати та адаптувати схему введення, базуючись на відповіді захворювання на терапію. "Відповідь захворювання на терапію" можна визначати згідно зі стандартними критеріями для гематологічних злоякісних новоутворень та визначенням стадії.

Способи оцінки відповіді захворювання на терапію гематологічного злоякісного новоутворення, конкретно, СЮОЗ38" гематологічного злоякісного новоутворення, відомі фахівцю у даній галузі.

Як правило, способи оцінки відповіді захворювання на терапію можна вибрати з групи, яку складають оцінка загального стану за шкалою Карновського, кількісна оцінка специфічних маркерів, біопсія і/або пункція кісткового мозку, радіологічна візуалізація плазмацитоми, дослідження кісток скелету, кількісна оцінка М-білка (у сироватці і/або 24-годинній сечі) та рівні вільних легких ланцюгів у сироватці або рівні легких ланцюгів у сечі, рВ2-мікроглобулін сироватки, біопсія лімфатичних вузлів і/або радіологічна оцінка пухлини (за допомогою рентгену, сканування за допомогою комп'ютерної томографії (СТІ, РЕТ-сканування або магнітно- резонансної візуалізації (МК), аналіз крові, в тому числі визначення бластних клітин.

Найкращі способи оцінки відповіді захворювання на терапію в гематологічного злоякісного новоутворення залежать від типу СОЗ38" гематологічного злоякісного новоутворення та відомі

Зо фахівцю в даній галузі.

Базуючись на результатах, одержаних з оцінки відповіді захворювання на терапію, відповідь захворювання на терапію можна потім розділяти згідно зі стандартними критеріями для фонового захворювання та класифікувати на повну відповідь або повну ремісію (СЕК), часткову відповідь (РК), стабільне захворювання (50) або прогресуюче захворювання (РО). "Шкалою Карновського" називають шкалу від 100 до 0, де 100 являє собою "відмінне" здоров'я, а 0 являє собою смерть. "Маркери", застосовні у контексті оцінки відповіді, можуть включати, як правило, маркери у сироватці і/або плазмі, без обмеження ними, такі як Не-СКР, фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-оа), 1С-6, 1 -1-Д, ТЕМ-А та щільність і зайнятість рецепторів СОЗ8.

В одному прикладі методики для оцінки відповідь захворювання на терапію в суб'єкта, що страждає на множинну мієлому, являють собою біопсію і/або пункцію кісткового мозку, радіологічну візуалізацію плазмоцитоми, дослідження кісток скелету, кількісну оцінку М-білка, як пояснюється вище, та вимірювання р2-мікроглобуліну сироватки.

Крім того, оцінка відповіді захворювання на терапію може включати оцінку щільності рецепторів та зайнятості рецепторів на циркулюючих клітинах пухлини (у периферичній крові), щільності рецепторів та зайнятості рецепторів на бластних та плазматичних клітинах у кістковому мозку та рівня антитіл до лікарського препарату (АВА) в людини.

Антитіло за даним розкриттям можна вводити у формі фармацевтичної композиції, що включає фармацевтично прийнятний наповнювач та необов'язково матриці для уповільненого вивільнення, такі як біорозкладні полімери, для утворення терапевтичних композицій. "Фармацевтичним" або "фармацевтично прийнятним" називають хімічні речовини та композиції, які не призводять до несприятливої, алергічної або іншої небажаної відповіді при введенні ссавцю, зокрема людині, за необхідності. Фармацевтично прийнятним носієм або наповнювачем називають нетоксичний твердий, напівтвердий або рідкий заповнювач, розріджувач, матеріал для інкапсуляції або допоміжну речовину для складання будь-якого типу.

Форма фармацевтичних композицій, що включають антитіло за даним розкриттям, звичайно залежить від стану, що підлягає лікуванню, тяжкості хвороби, віку, маси та статі суб'єкта тощо.

Антитіло за даним розкриттям вводять до складу для внутрішньовенного введення.

Зокрема, фармацевтичні композиції, що включають антитіло за даним розкриттям, можуть бо містити середовища, які є фармацевтично прийнятними для складу, який можна ін'єктувати.

Вони можуть являти собою, конкретно, ізотонічні стерильні сольові розчини (однозаміщеного або двозаміщеного фосфату натрію, хлориду натрію, калію, кальцію або магнію і т.п. або сумішей таких солей) або сухі, зокрема, піддані сублімаційному сушінню композиції, які при додаванні, залежно від випадку, стерилізованої води або фізіологічного сольового розчину забезпечують утворення ін'єкційних розчинів.

Для одержання фармацевтичних композицій ефективну кількість антитіла за даним розкриттям можна розчиняти або диспергувати в фармацевтично прийнятному носії або водному середовищі.

Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкційного застосування, включають стерильні водні розчини або дисперсії та стерильні порошки для приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій для негайного прийому. В усіх випадках форма має бути стерильною та має бути плинною до такого ступеня, щоб її можна було легко вводити через шприц. Вона має бути стабільною за умов виробництва та зберігання та має зберігатися від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії та гриби.

Носій може являти собою розчинник або дисперсійне середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь та рідкий поліетиленгліколь тощо) та їх придатні суміші. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримання необхідного розміру частинки у випадку дисперсії та шляхом застосування поверхнево-активних речовин, стабілізувальних засобів або антиоксидантів. Запобігання дії мікроорганізмів може зумовлюватися протибактеріальними та протигрибковими засобами. У багатьох випадках переважним буде включення ізотонічних засобів, наприклад, цукрів або хлориду натрію.

Стерильні ін'єкційні розчини одержують шляхом включення активних сполук в необхідну кількість відповідного розчинника 3 низкою інших інгредієнтів, перелічених вище, за необхідності, з подальшою стерилізацією фільтруванням. Як правило, дисперсії одержують шляхом включення різних стерилізованих активних інгредієнтів в стерильне середовище, яке містить основне дисперсійне середовище та інші необхідні інгредієнти з наведених вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів переважними способами одержання є методики вакуумного сушіння та сублімаційного сушіння, які дають порошок з активним інгредієнтом, а також з будь-яким додатковим необхідним інгредієнтом з їх попередньо стерилізованого фільтрацією розчину.

Після складання розчини будуть вводитися способом, сумісним з дозованим складом та в такій кількості, що є терапевтично ефективною. Склади легко вводити у різних стандартних лікарських формах, таких як тип ін'єкційних розчинів, описаний вище, але також можна використовувати капсули з вивільненням лікарського засобу тощо.

Для внутрішньовенного введення у водному розчині, наприклад, розчин потрібно належним чином забуферити, за необхідності, та різкому розріджувачу, насамперед, надають ізотонічність за допомогою достатньої кількості сольового розчину або глюкози. Ці конкретні водні розчини є особливо придатними для внутрішньовенного введення. При цьому, стерильні водні середовища, які можна використовувати, будуть відомі фахівцям у даній галузі у зв'язку з даним розкриттям. Наприклад, одну дозу можна розчиняти у 1 мл ізотонічного розчину Масі та або додавати до 1000 мл рідини для гіподермоклізису, або ін'єктувати внутрішньовенно в намічене місце інфузії (див., наприклад, "Кетіпдіоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсев5" 151п Еайоп, раде5 1035- 1038 апа 1570-1580). Деяке варіювання дози буде безумовно відбуватися залежно від стану суб'єкта, що підлягає лікуванню. Особа, відповідальна за введення, у будь-якому випадку, визначатиме дозу, що підходить для окремого суб'єкта.

В одному прикладі антитіло вводять до складу для внутрішньовенного введення, отже, антитіло представлено як концентрат розчину для інфузії в ампулах, наприклад, що містять 5 мг/мл (100 мг/20 мл) антитіла за даним розкриттям.

Для введення суб'єктам відповідного об'єму склад з антитілом, як правило, розводять в інфузійному мішку за допомогою, наприклад, 0,9 95 розчину хлориду натрію. Кінцевий об'єм інфузії, що відповідає дозі антитіла за даним розкриттям, вводять протягом періоду часу, що залежить від дози, що підлягає введенню, та, таким чином, від кількості білка, що вводиться за годину.

У специфічному варіанті здійснення антитіло до СОЗ8 для застосування згідно з даним розкриттям вводять як некон'юговане антитіло. Некон'юговане антитіло до СОЗ8 можна вводити окремо або разом з дексаметазоном, або в комбінації з хіміотерапевтичним лікарським засобом, вибраним з групи, що складається з леналідоміду, карфілзомібу, бортезомібу, мелфалану, вінкристину, цитарабіну та циклофосфаміду, необов'язково разом з дексаметазоном. Якщо його 60 не вводять окремо, антитіло до СОЗ38 та інший лікарський засіб (засоби) можна вводити або одночасно, або окремо (наприклад, послідовно протягом певного періоду часу).

Антитіло за даним розкриттям можна вводити в комбінації з лікарським препаратом для запобігання або контролю втоми, нудоти, пропасниці, кашлю, блювоти, гіперкальціємії, головного болю, закрепу, болю у кістках, ознобу, діареї, пневмонії, анемії, дисгевзії, гіпокаліємії, гарячки та гіперглікемії.

В іншому варіанті здійснення лікарський препарат для запобігання або контролю втоми, нудоти, пропасниці, кашлю, блювоти, гіперкальціємії, головного болю, закрепу, болю у кістках, ознобу, діареї, пневмонії, анемії, дисгевзії, гіпокаліємії, гарячки та гіперглікемії можна вводити до лікування за допомогою антитіла.

У контексті даного розкриття лікар може оцінювати реакцію захворювання на терапію та, таким чином, адаптувати схему введення.

Усюди в даній заявці термін "що містить" слід інтерпретувати як такий, що охоплює всі спеціально згадані ознаки, а також необов'язкові, додаткові, не вказані ознаки. Як застосовується в даному документі, застосування терміну "що включає" також розкриває варіант здійснення, в якому немає ознак інших, ніж спеціально згадані (тобто "що складається 3").

Без обмеження даного розкриття, низка варіантів здійснення даного розкриття додатково показана нижче з метою ілюстрації:

Пункт 1. В одному варіанті здійснення розкритий спосіб лікування пацієнта з рецидивною або резистентною множинною мієломою, який передбачає введення пацієнту антитіла, що специфічно зв'язує СЮОЗ38, де зазначене антитіло вводять пацієнту в безпечній терапевтичній дозі 20 мг/кг або менше.

Пункт 2. В іншому варіанті здійснення розкрита фармацевтична композиція, яка містить антитіло, що специфічно зв'язує СОЗ38, для застосування як лікарського препарату в лікуванні рецидивної і/або резистентної множинної мієломи, де зазначене антитіло має вводитися суб'єкту-людині в безпечній терапевтичній дозі приблизно 20 мг/кг або менше.

Пункт 3. В іншому варіанті здійснення в даному документі розкритий спосіб або фармацевтична композиція за пунктами 1 або 2, де антитіло здатне знищувати СО38- клітину в суб'єкті-людині шляхом індукування апоптозу, антитіло-залежної клітинно-опосередкованої

Зо цитотоксичності (АОСС) та комплемент-залежної цитоксичності (СОС).

Пункт 4. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-3, де пацієнт має щонайменше один стан, вибраний з групи, що складається з (а) вимірюваного рівня М-білка у сироватці більше ніж приблизно 0,5 г/дл, (Б) рівня М-білка у сечі більше ніж приблизно 200 мг (24-годинна сеча), (с) підвищеного рівня вільних легких ланцюгів (РІ С) у сироватці більше ніж приблизно 10 мг/дл з аномальним співвідношенням РІ С, та їх комбінації.

Пункт 5. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-4, де зазначене антитіло містить щонайменше один важкий ланцюг та щонайменше один легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить три послідовні ділянки, що визначають комплементарність (СОК), з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮО МО: 13, 37 та 15, та де зазначений легкий ланцюг містить три ділянки, що визначають комплементарність (СОК), з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ МО: 16, 17 та 18.

Пункт 6. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-5, де зазначене антитіло містить щонайменше один важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену в

ЗЕО ІЮО МО: 50, та щонайменше один легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 52.

Пункт 7. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-6, де безпечна терапевтична доза становить від приблизно 1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг.

Пункт 8. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-6, де безпечна терапевтична доза становить приблизно 5 мг/кг, або приблизно 10 мг/кг, або приблизно 20 мг/кг.

Пункт 9. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-8, де безпечну терапевтичну дозу зазначеного антитіло вводять внутрішньовенно.

Пункт 10. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-9, де безпечну терапевтичну дозу 60 зазначеного антитіла вводять один раз на тиждень або один раз на кожні два тижні.

Пункт 11. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де безпечну терапевтичну дозу приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг вводять один раз на кожні два тижні.

Пункт 12. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де безпечну терапевтичну дозу приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг вводять один раз щотижня.

Пункт 13. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-12, де безпечну терапевтичну дозу зазначеного антитіла вводять за початкової швидкості інфузії в діапазоні від приблизно 0,042 мг/год. до приблизно 250 мг/год.

Пункт 14. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-13, де антитіло вводять у комбінації з дексаметазоном.

Пункт 15. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-14, де зазначене антитіло не спричиняє продукування аутоантитіл проти зазначеного антитіла при введенні суб'єкту-людині з дозою приблизно 20 мг/кг або менше.

Пункт 16. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне проявляти виявлювану зайнятість рецепторів СОЗ38 у суб'єкті-людині при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 1 мг/кг кожні два тижні.

Пункт 17. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне проявляти щонайменше приблизно 84,1 95 зайнятість рецепторів СОЗ8 у суб'єкті-людині при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг кожні два тижні.

Пункт 18. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне проявляти щонайменше приблизно 97,7 95 зайнятість рецепторів СОЗ8 у суб'єкті-людині при

Зо введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг кожні два тижні.

Пункт 19. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне інгібувати ріст пухлини у суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 5 мг/кг до приблизно 20 мг/кг кожні два тижні.

Пункт 20. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне інгібувати ріст пухлини в суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-/людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 5 мг/кг до приблизно 20 мг/кг щотижня.

Пункт 21. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне інгібувати ріст пухлини у суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 10 мг/кг до приблизно 20 мг/кг кожні два тижні.

Пункт 22. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкриті спосіб або фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-10, де зазначене антитіло здатне інгібувати ріст пухлини в суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-/людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 10 мг/кг до приблизно 20 мг/кг щотижня.

Пункт 23. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкрита одинична лікарська форма, що містить фармацевтичну композицію за будь-яким з пунктів 1-22.

Пункт 24. В іншому варіанті здійснення в даному документі також розкритий продукт виробництва, що містить фармацевтичну композицію за будь-яким з пунктів 1-22 та контейнер.

КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

У 5БЕО ІЮ МО: 1-3 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "385813".

У 5ЕО ІЮ МО: 4-6 показана послідовність СОР1-ІЇ, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "385813".

У 5ЕО ІЮ МО: 7-9 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "385818".

У 5БЕО ІЮ МО: 10-12 показана послідовність СОР1-ІЇ, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "385818".

У 5БЕО ІЮ МО: 13-15 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "385819".

У 5БЕО ІЮ МО: 16-18 показана послідовність СОР1-І, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "385819".

У 5БЕО ІЮ МО: 19-21 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "385830". 60 У 5ЕО ІЮ МО: 22-24 показана послідовність СОР1-І, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "385830".

У 5ЕО ІЮ МО: 25-27 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "3858317".

У 5БЕО ІЮ МО: 28-30 показана послідовність СОНВ1-І, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "3858317.

У 5БЕО ІЮ МО: 31-33 показана послідовність СОРБ1-Н, СОВ2-Н, СОВЗ-Н антитіла "385839".

У 5ЕО ІЮ МО: 34-36 показана послідовність СОР1-І, СОВ2-Ї, СОВЗ-Ї. антитіла "385839".

У ЗЕО ІЮ МО: 37 показана послідовність СОК2-Н гуманізованого антитіла "385819". У 5ЕО

ІО МО: 38-43 показані послідовності МІ. антитіл.

У 5ЕО ІЮ МО: 44-49 показані послідовності МН антитіл.

У 5БЕО ІЮ МО: 50-51 показані послідовності МН гуманізованих антитіл.

У 5БЕО ІЮ МО: 52-55 показані послідовності МІ. гуманізованих антитіл.

У 5ЕО ІЮО МО: 56-61 показані послідовності праймерів, які застосовували для ПЛР-реакції з виродженими праймерами першого раунду, для клонування та секвенування легкого та важкого ланцюгів антитіла до СОЗ8.

У 5ЕО ІЮ МО: 62-63 показані праймери для мишачих лідерних послідовностей 5'-кінця, застосовані для ПЛР-реакцій другого раунду з 385819 для клонування та секвенування легкого та важкого ланцюгів антитіла до СОЗ8.

Дане розкриття буде далі проілюстроване за допомогою наступним прикладів.

ПРИКЛАД 1

Автори даного винаходу визначали для антитіла пи385819 придатну для введення дозу та схему, щоб одержати лікування раку з доброю переносимістю, що дозволяє лікувати пацієнтів, які страждають на СОЗ38" гематологічне злоякісне новоутворення, конкретно, на множинну мієлому, більш конкретно, на рецидивну і/або резистентну множинну мієлому.

Таким, чином, наступний приклад розкриває результати клінічних випробувань фази 1, що демонструють безпечну терапевтичну дозу цього специфічного антитіла до СОЗ38, пи385819, для ефективного лікування СО38: гематологічного злоякісного новоутворення, такого як множинна мієлома в людини.

Пацієнти

Загалом 32 пацієнтів піддавали лікуванню в цьому дослідженні. 40,6 95 популяції були жінками; середній вік становив 64,8 (-8,8). Індекс Карновського був вищим за 60 95 в усіх пацієнтів.

Зо 32 пацієнти включали 3 пацієнтів з В-клітинною неходжкінською лімфомою (МН), 2 з хронічним лімфоцитарним лейкозом (СІ І) та 27 з множинною мієломою (ММ). 80,0 95 пацієнтів з множинною мієломою були жінками з середнім віком 63,6 (48,0). Пацієнти з множинною мієломою одержували як попередню протиракову терапію бортезоміб у 100 95, леналідомід у 92,6 95 та аутологічну трансплантацію стовбурових клітин (АЗСТ) у 81,5 95 випадків.

Способи

Некон'юговане гуманізоване ІдОе1 моноклональне антитіло (тАБ) пи385819 вводили як ІМ інфузію монотерапевтичного засобу щотижня (О0МУ) або кожні 2 тижні (92ММ) дорослим пацієнтам з вибраними СО38: гематологічними злоякісними новоутвореннями, в яких спостерігалося прогресування після стандартної терапії, або для яких не існує ефективної стандартної терапії.

Режим з прискореним підвищенням дози застосовували для перших 5 рівнів дози (01) (від 0,0001 мг/кг до 0,1 мг/кг, кожні 2 тижні), з одним пацієнтом, який підлягає оцінці, на рівень дози, поки не спостерігали рівень дози токсичності (01 Т). Усі подальші рівні дози (0,3 мг/кг, 1 мг/кг, З мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг кожні 2 тижні та 10 мг/кг щотижня) вводили за класичною схемою 3-3 для підвищення дози на основі рівня дози токсичності. 32 пацієнтів були такими, які підлягають оцінці щодо визначення кінцевої точки рівня дози токсичності, та 32 щодо визначення відповіді пухлини.

Медіанна кількість циклів була в діапазоні від 2,0 до 50,0.

Результати

Для всіх рівнів дози піддали лікуванню загалом 32 пацієнтів, у тому числі З пацієнтів з В- клітинною неходжкінською лімфомою (МНІ), 2 з хронічним лімфоцитарним лейкозом (СІ І) та 27 з множинною мієломою (ММ).

Дослідження, що стосується рівнів дози 20 мг/кг кожні 2 тижні та дози 10 мг/кг один раз на тиждень, на даний момент аналізують, та максимальної стерпної дози вони не досягли.

Токсичності, що обмежують дозу, були обмежені інфузійними реакціями 2 ступеню під час циклу 1, при цьому 1 за 0 0,3 мг/кг та 1 за ОІ 3,0 мг/кг. Вони були пом'якшені шляхом застосування традиційної попередньої обробки метилпреднізоном, дифенгідраміном, ранітидином та ацетамінофеном. бо Несприятливими явищами, що спостерігалися найчастіше (» 10 95) за всіх рівнів дози,

незалежно від зумовленості, були втома (46,9 95), нудота (31,3 95), пропасниця (28,1 95), кашель (25 95), блювання (21,9 95), гіперкальціємія (18,8 95), при цьому кожне з головного болю, закрепу, болю у кістках, ознобу та діареї спостерігалися в 15,6 95 пацієнтів. Крім того, кожне з пневмонії, анемії, дисгевзії та гіпокаліємії спостерігалися в 12,5 95 пацієнтів.

Серйозні несприятливі явища, пов'язані з терапією, включають пневмонію З ступеню (6,3 Об), асоційовану з гарячкою (3,1 95), гіперглікемією (3,1 95), та одну інфузійну реакцію 2 ступеню (3,1 Об).

З 19 пацієнтів, яких лікували за рівня дози від 1,0 мг/кг до 10 мг/кг кожні 2 тижні, 1 мав хронічний лімфоцитарний лейкоз (С/Ї), 1 мав неходжкінську лімфому (МНІ) та 17 мали множинну мієлому (ММ). 17 пацієнтів з множинною мієломою були більш старими пацієнтами та такими, які зазнали більш інтенсивного попереднього лікування; медіанний вік становив 64 роки (діапазон: 55-74); та медіанна кількість попередніх схем лікування становила сім (діапазон: 2-14). Усі пацієнти з

ММ одержували раніше леналідомід та бортезоміб. Медіанний час від встановлення діагнозу до першого дозування пи385819 складав 6, 8 року (діапазон 1,8-16,8 року).

Відповіді у цій групі (фігура 1) згідно з критеріями для множинної мієломи від Європейської групи з трансплантації кісткового мозку (ЕВМТ) включали 1 часткову відповідь (РК) за 1 мг/кг (п-3) та 5 мг/кг (п--3), та 1 мінімальну відповідь (МК) за рівня дози З мг/кг (п-6). За рівня дози 10 мг/кг продемонстровано 3 часткові відповіді (РК) та 2 випадки стабільного захворювання (50) серед 6 підданих лікуванню пацієнтів з миожинною мієломою.

Для 19 пацієнтів, підданих лікуванню, за БІ 1 мг/кг або вище медіанний час лікування становив 8 тижнів (діапазон 2-50 тижнів).

Дослідження імуногенності не продемонстрували антитіла до пи385819.

Зайнятість рецепторів можна було виявляти, починаючи з рівня дози 1 мг/кг, та вона сягала діапазону 84,1-97,7 95 за 10 мг/кг.

Фармакокінетичний аналіз (РК) показав більше ніж дозо-пропорційне збільшення впливу в діапазоні доз 0,03-10 мг/кг з кліренсом в аналогічному діапазоні від 5 мг/кг до 10 мг/кг.

Жодної кумуляції не спостерігали, виходячи з Стах при циклі 2 у діапазоні доз 0,03-3 мг/кг.

Пороговий рівень інгібування росту пухлини досягався при Стах для 1 пацієнта за 0. 5 мг/кг та для 5 пацієнтів за О. 10 мг/кг.

Антитіло до СОЗ38 пи385819 продемонструвало обнадійливу активність монотерапевтичного засобу в пацієнтів з рецидивною і/або резистентною множинною мієломою, що піддавалася інтенсивному попередньому лікуванню.

Зміст усіх процитованих посилань (у тому числі посилань на літературні джерела, патенти, патентні заявки та веб-сайти), які можуть цитуватися по всій цій заявці або наведені нижче, тим самим явно включений в дане розкриття шляхом посилання в їхній повноті для будь-якої цілі. У даному розкритті можна використовувати, якщо не вказане інше, традиційні методики імунології, молекулярної біології та клітинної біології, які добре відомі з рівня техніки.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування суб'єкта-людини з рецидивною і/або резистентною множинною мієломою, який передбачає введення суб'єкту-людині антитіла, що специфічно зв'язує СОЗ8, де зазначене антитіло містить щонайменше один важкий ланцюг та один легкий ланцюг; зазначений важкий ланцюг включає амінокислотну послідовність, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 50; зазначений легкий ланцюг включає амінокислотну послідовність, представлену у БЕО ІЮ МО: 52; зазначене антитіло здатне вбивати клітини СОЗ8-- у суб'єкта- людини шляхом індукції апоптозу, антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АОСС) та комплемент-залежної цитотоксичності (СОС); і зазначене антитіло вводять суб'єкту-людині в безпечній терапевтичній дозі 10 мг/мг або 20 мг/кг один раз кожні два тижні.

2. Спосіб за п. 1, де суб'єк-людина має щонайменше один стан, вибраний з групи, що складається з а) вимірюваного рівня М-білка у сироватці більше ніж приблизно 0,5 г/дл, р) рівня М-білка у сечі більше ніж приблизно 200 мг (24-годинна сеча), с) підвищеного рівня вільних легких ланцюгів (РІ С) у сироватці більше ніж приблизно 10 мг/дл з аномальним співвідношенням РІС, та їх комбінації.

З. Спосіб за п. 1 або 2, де безпечну терапевтичну дозу зазначеного антитіла вводять внутрішньовенно.

4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, де безпечну терапевтичну дозу зазначеного антитіла вводять з початковою швидкістю інфузії в діапазоні від приблизно 0,042 мг/год. до приблизно 250 мг/год.

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, де антитіло вводять у комбінації з дексаметазоном.

6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, де зазначене антитіло не спричиняє продукування аутоантитіл проти зазначеного антитіла при введенні суб'єкту-людині в дозі 10 мг/кг або 20 мг/кг один раз кожні два тижні.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, де зазначене антитіло здатне проявляти щонайменше приблизно 84,1 95 зайнятість рецепторів СОЗ8 у суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг один раз кожні два тижні.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, де зазначене антитіло здатне проявляти щонайменше приблизно 97,7 95 зайнятість рецепторів СОЗ8 у суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-людині з рівнем дози приблизно 10 мг/кг або приблизно 20 мг/кг один раз кожні два тижні.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, де зазначене антитіло здатне інгібувати ріст пухлини в суб'єкта-людини при введенні зазначеному суб'єкту-/людині з рівнем дози в діапазоні від приблизно 10 мг/кг до приблизно 20 мг/кг один раз кожні два тижні.

ПЕРЕЛІК ЛОСЛІДОВНОСТЕЙ «МОх санофі «120 Специфічні антитіла до СОЗ3Я для лікування йоом раку людини «130» 562503 «1605 63 «170» Ражтепсі»? версія 355 «205: 1 «її» 5 «їй» БІЛОК «213х Мих 50, «нюх 1 зак туг Я1у Меб дя 1 5 крій» 2 «ії» 7 «лах БІЛОК «213» Мах 85р, «Ах тРр о І16 дсп їйг тую тТйгобту бім его тб тує АТа с Або Або РНе гу 1 5 10 15 ау ч10х З «ех 5 «ід БІЛОК «213 Ми Бр. «00У З Ага боту вве дїа тує 1 з «210» А «вії» 45 «212» БІЛОК «213» Ми «р, «МК 4 ага Аа зебозТи бег маї пт хів туго біу деп б1у вес мет а 1 5 10 15 ха» 5 «гії» 7 жеї2з БІЛОК хе13» Ми бр, «4005 5 ав діа баг Ав тей сти 5ег !

к?і0» Б «гії» З «дїдз БІЛОК «2135 Мих 5р. «а005 5 іп сій їі дб бін дзроврго вве твг ї 5 «Ох 7 «2115 5 «12 БІЛОК -2135 Ми5 5р, «00 7 Аепозеє Ту Мет дБА ї КІ «210» В «її 37 «їй рІЛОК «213» мив ер. «4005 8 Тер хТе дп тівготує те Лу бід орко Твкотуг АТа Азродзр Ре ух 1 5 БІ 15 су «і0ж 8 «11» їх «212» БІЛОК жхгі3» Ми5 5р. «00» 9 дея піу рве с уаї тус 1 5 «2105 19 «211» 15 «22» БЕІДОК. -«213» Миз зв. «Од» о Ага Аза бай зі дек Уа? АТа її тує б1у АБИ бек РНЄ ви ру ї 5 16 15 «2105 «її 7 «217» БІЛОК «213» Ми5 5р, «400» 3 го АТа 5бг Ах іо от Бек

«210» 19 «БЕ З «212 БІЛОК х2ї13» Ми5 ар. ха0б» 4 вів -Іп"їТа дп 53и Аз овео тм п й З «ж 13 «?1їх 5 «Ко БІЛОК «213» Мми5 5р. «400 13 Азр тує тге мет ап ї 5 «фі» 14 «3» «йійм БІЛОК кеї3» Ми р «Ой 14 Твк о тіе тук бго зІу Ар о с1у Ар Те о 51уУ тук АТа бір осСме Ре бу 1 5 1 15 ЗУ «2305: 15 «2115 11 хо125 БІЛОК «Ка» Мб зр «Оп» 15 сіу А5р о тук Тут сіу 5аг АБп бег рей Ачр о туг ії 5 10 «иіО» 16 «гії» 11 «Рі?» ВІЛОК к2і132 Ми5 яр. «400»: 16 їу5 Аїа бек бТй Ар омаї чек ТВ маї аї Аза 1 5 то «ВЩ1йх 17 -115 7 «гі?х БІЛОК «2135 Ми5 50; «400 17 бек Аза бег отут дго тує ї11е 1 З «210» 18

«Мр. 9 «війх БІЛОК «13» Ми єр, «4005 16 сій боїв ніб5 Туг зеговго вго тує Тг 1 їх. «210» 19 «її 5 «212» БІЛОК «213» Мих р, «А0Обх 19 бу бег тер оМеї Аза 1 5 «гі» 20 «гію 10 «812 БІЛОК «213» Мих р. «4а00ж 20 Ага ті туг РгГОо СТУ Ар оБіу Азр о тіє Ті туг ап сіу деп РВе.

Ага 1 5 1а І5 А5р «210х 21 «К1їх 0 «212 ВІЛОК «213» Мих 5р. «4005» 21 терту тб вве тйпг о вро беб РИБ Ар отук ня 5 Кв; «2 22 хі» 1 «2122 БІЛОК «?13У Ми 50. «00 груз АТа бек біп дер ма! ма! тигоАла ха? Аа 1 5 10 «8105. 25 «21їх 7 «12» БІЛОК кг11хУ Ми5 5р, «Ой» 23 ес АТа Бек нів ага Тук тис «М» 24 «21ї1» 9

«від» БІЛОК «213» Му5 5р. «400» 94 сп сій ні5 туго твготвгб бра стат Те 1 5 «г» 95 «211х 5 «2125 БІЛОК «213» Ми зр. «МЮз 25 заг туг пк вемй бек 1 5 «2102 26 «2115 17 «2125. БІЛОК «2132 Мих зр. «400 26 Ів КТ 5ег Ме бу зіу Аса тик ТАС ту ТусорРго дер бе Не січ е1у «210» 37 «1 8 «2125 БІЛОК «213» Ми5 зр. «Ах 27 а5 РНе деп 1у тує 5егоАвр.

Рре

«іх 28 «2311х 11 «212» БІЛЖ «213» Мих р. «005 28 Гуз Аїа чек біп мат уаії аіу зве Аа уві Аа 1 5 їй «ій» 29 «г1Їїх «РійУ.

БІЛОК «2135 Муз в. «а00х 29 тероА1їа бе тк оАго нія тк ї З «10» 30 ких» З «125 БІЛОК

«13» Ми 5р. «400» 30 сій віп туф Азп зЗеко туго бго тує ТЬг 1 5 «210» 31 «вії ж 5 «їй» БІЛОК «23» Ми5 50: «4003 31 А5п вне біу Ммеї Ні 1 5 «210» 32 «її» її «125 БІЛОК «?іЗ» Ми 50. «4005 32 Тук тів Ага Заг сіу бек бу те їїв г Туг век Ар тВг Уві су ї 5 ї і 15 с1у «2105 33 «21їж 11 «2123 БІЛОК «23» Мив 5рв. «ай» 33 5ег о тТук тук одер РНе сіу діа тр Рйе АЛа туг її. 5 10 «210» 34 «11 Лі «212» БІЛОК же13» Му 5б. «00» 34 ву5 Аїа Зак бій ази Уа! біу тик Ази хі АТа 1 5 10 жЕі05 35 ка 7 «17» БІЛОК «213» мух зр. «нюх 35 5ег Аїа бек 5ег Аг тук баг 1 5 «240» 36 «гіїх З «212» БІЛОК «213» Ми5 яр

«00» 36 вто бів тив Аа Бег ту вро ве тн «210х 37 «2115 17 «212» БІЛОК «213» Ми5 зр. «4005 37 Тк оїТе тур рго Ту АБроЯ1у АЗр о Тве о а1у туго Аа бий уз Ре сі 1 5 їй 15 Оу «2105. 38 «1 І «вій БІЛОК кю Ми5 5р. «400» 38 дп ї1Те маї цен тйг бів бек о рго АТа Зек ген діа маї 5еє бец сту 1 5 10 15 біпо ага Аїа тк їіе бек су Аго Аза бЗего бій сбвг омуаї бій тів тує о) 25 30 сіу а5п сіу еле меї А5п тер обле бір бої бує Вко піу бій вко вго 35 о 45 ув сей сен ї1є тук ага АЇа бек ахп ово 10 ве Я1у Ії кро АТа 5а 55 50 Аг Ре бег біу зег сту 5ег Ага таб ої РНе тйгоцец Те ї1е Азр 65 | 70 75 80 бо Уві біб АТа АВ АВ Ома! АТа тк тує Тук Суб іп єп о ї1е дей 85 50 95 біз А5ровге вве тпкоРБе сіу зЗакобіу тпгоБу5 сей соїб І1ї8 вух дка 100 ноі 110 і «ех 39 «11» 112 «2125 БІЛОК «213» Ми5 5р, «Ой» 39 А5р о її Уа! еп те о біп озеб рго АТа о зег їв Аза мафї бе їеу у 1 5 160 15 біп Ага АТа тає о їТе его Су АгЯ АТа ес осів хе? маї А1а т16 тус

Зо сі1у Ах Зег Ре бец гу Тгрорйе с14 сіп уз Рго біу бів рго РКО 35 40 45 іух іен без ї)е туго Ако АТ бег дяп ге) біз ев сту І18 РКО АТ 50 58 5о Ага вне бек біу бег ау зег б1іу ТНгоАброРйе ТК обеу тТВе те дай 65 7а 75 Б) ко маї Бій Аза дер дер маї Аїа тпг о тує тує Су бів зів 512 А5п 85 ше: 35 ій Ар о вго Тук тт вне біу сіу сіу тТвг о бух ге) бі тів ух Ага 100 | 105 110 «ЩІ 40 киіїх 105 «йїйх БІЛОК «13У Мих 58. -00х 40 АбБр те Уа! Меб АТа бір бек нів щує РВе Меж бек тпг о5Зег Уві Ту 1 5 10 15 Ав Аго Уа! бек 16 ївг Суб Ку АТїЯа бегобій А5р ма! 5еботйг хв за Уатї Аа тсо тує бТп ота губ РгГО б1у бій беб рго су5 Ак ве та тук 5ег Аїд бег тук аку тук Те біу Уа! Рго др аг рве тв бу 60 Бек сіу зав бу те Ар РЕ ТВгОовйе тик от1іе бегобег хаї бів а1їа 55 79 75 до сім Ар ен АТа у! Туг тує Суб бій бій нія Ту бек рко рго тує 85 ЗО 95 тн вне бу ву а1їу тт вуз цец бін Ії БУ5 АГД 7 105 «2105 41 к21ї» В «212» БІЛОК «213» МИи5 5р, «ОО» 41 дер І1те ща! має твгосій бек нів рух РНе це 5вг отв Зег оуаї б1У 1 5 Шо! | 15 АЗОВ АК Маї бек їі тйг Сує бух АТа бег біп АББ ма! маї тТвг о Ата 20 25 за чаї АТа тер РНе сій ста бує ра сту віп бес со рух вец бецу те 35 «й 45 Туг заг Аїа беконі ка Тут г о сіу чаї ро дяр аго Не таб сту 50 35 50 чег бІіу 5ег біу ТЕг Азов о ВБе тик о РБе тк їТїе те ет уаї сп АТа

ІТ. 70 75 ва 51 Азроіенв ата маї тує тут бух Тл о Біп Ні тТук Твс тТнг обго Тебе ня 90 55 ТвВгоРНе біу біу 5іу Те губ їец Аб5роРйе Ага АгОо 100 195 «В 47 «11» 108 «212 БІЛОК «213» Ми5 5р. «00 Аг лЕр Тс Маї меє тНе сіп зер Ні5 гу Ре Х1і6 бег тик бег аї «1у 1 5 10 15 АБр Ага Ма! бек їі те суб КУБ Аза бе вій маї ма! сту бе Аа КІ уаї діа трротук Та сів зує вто бі бій 5акорго рух сво ев їте щй 45 туг тер АТа ек тТНе Асд нія тек обіу уаї Рго Аброаго вве тв с1у о Зек бо1у баг обі тпге др вне тн рей тиг о ї1е 5вг о А5а Уа! біт баг 65 7 75 50 сів Арон Аа Ар отує ве Суз бій бів тує одяп баг Туб ргО Туг йо 90 95 ТВ вве сі сіу Ту тиб іме цен сій І15 Куз АгО 00 105 «гіОж 43 «31» 08 «їж БІЛОК «віїх Му5 5р. «4005 43 Ар тіе маї меб так бій 5ег білобу5 РНе мес беб тик бе чаї б1у 1 5 13 15 АБродго Уа! бек уві ТНк осСує Суз'АфЯ о бвг оп Авпотаї ТУ тк о АєА

29 25 за чаі АТа тео тує біл нія Був вго біу іп 5ег Рго вух ї1е Меї її: 35 «й 45 Чук Баг Аїда его бек дго Туг 5ег бі ав орго АзроАго РНе твг о б1у 50 І 55 50 чег біу бек сім Тйг оре; о Рпе ТНгогей тВг отТе Аби Ада Уа бій 5ає 05 7 75 80 бін А5ріен Аїд Бім тує Ре Суб Б1й біп тує дп обег Ту Рго ев 85 9а 85 ТВг о РНе бтіу зег сіу ТБ Суз іви сій їїв ув Ага та 105 «Ох Ак іх 114 «2125 БІЛОК «2135 Миу5: 8р. «400» 44 Зп діє бів їез ма? сій бек біу го сії цей вує ту го с1уУ б її 5 10 15 тик омаї рм5 хів бег сСу5 Гу5 Аїд бог о біу тує ТВгК оїец тре бек отуг бу Мек ап тТго маї ух бів Аа Рго С1у (ує 0І1Ж еп вух Ткр Мет Зі ви біу тер тів Аби Тіг отут пйгояЯ1у бій бго так отТуг Аа дзр о АЗр Ре що 55 60 Гуз Ту Ага Рпе іа рРНе зег Ген бі те бек АТа бег тк Аїа вве 65 76 75 ВО мец бі І12 Абл Азлпоїейп бух дхп сій Авротик о АТа те туг вне су 85 зо І а5 чаї АРОо Ага а1у РИ АТа тук тгр бу бів біу Пк вви чаї твк маї 0 105 110 бек Аїд «240» 45 «її З1Я «2125 БІЛОК «2Тїх Ми 5. «Ох 45 Фів хів бій гев чаї сій 5ек сіу бго Та ївб о рує цу вго біу 619

1 5 10 15 тНне омаії ру їТе бек Суз пу Аїй бес біу тує тиг пе тТВе А5пПОЯег біу меж Ав тер ма! цує біп АЇа Рго с1у Бу біу їец ух тгромех 40) 55 сіу тропів Абп о тТВг тує твг о о1у бід Рго тр отук АТа д5р Абр РНе о су Б1У Ага РБе Аа РПе хек гей обі Тагобек Аа бекозег АТ Тук б5 70 75 о) ес бій їіе бек одяй Мем бує азп бів дер о ТНг о АТа твгоТук ре сСух 85 50 95 АТа Аг Аг тя Вне хаї туг Трроа1фу 10 БУ Таб о веу маф твк УВї 1 105 по 5ег АЇа «210» «6 «231» 120 «Тож БІЛОК «2135 Му р. «4005 46 бів уаї біпй бец біп бій бек 01 АТа біц тез Аза Акго го біУ те і 5 ло І 15 ек уаї їу5 ев дек сСуз зує АХ ее Су туг Тег РНе та д5ротуг Тер мес сіп Тер оуаї вуз БІ Аго вро аіу й біу бер бо тер оте 35 40 45 сіу те жі стук вро с1у А5р су АЗВ оТиК о1у тук АТа бій вує вне 50 55 69 ву о1у цу5 Аїа тпу зей тйгоАїа Ар огує баг баг гу тнг ма! ще 65 7 75 5 мМек нія сеу бек о5ек ви Аїа бек піц Азрозек Аза маї Тує Тук Суз 85 зо 95 діа АгЯ О1у АБротує тує б1у баг деп о бегогец А5р тує ттр сту о1р 100 105 119 п1у тик бек уді тйг чаї бек бар 115 170

«210» 47 кіїх 119 «2125 БІЛОК «13 Ми 5р. «ай» 47 сіпома1і бєїв сечобіп сіпоб5егобіу вго св їец Маї дя Рго біу Аїа ї 5 10 5 Бек уаї іже Іі 5епосСуб уз тйгобек с1у туго аїа пе баг сіу зег 75 З Тер меж дп о ТрРромаї су біп дра его сту б10 сту ву сім тер їТе | чо а; сіу Ага ті туго Рго біу Ар оту д5рожіє її тук Аби о біу ди Ре 50 Ага ав Був чаї тТиг сецо5ег АТа Аяр уз Звбгобесє дп о тТВг Аза тут 65 70 75. 80 мех зів сец зак 5ег о гец тт его уаї др заг АТа маї туго РНе су 85 зо 5 бег Ага тгробіу таб о РНе тТВгоРго сЗес Ре Абротує ткробіу бій е1у То 105 110 Твеотвє бен оТвг ма? 5егодег: 115 «2105 48 «115 РІ? «219» ВІНОК «13» Мих 8р. «4005 «8 А5роха! цу ей ма? бі 5ек біу б1у біу Ген омаї цуб5 рго біу віх І 5 10: 15 ей ієн іу5 єец бег суз іш АЇа Баг біу ве ТНг Рпе бак бег тут 2 25 ЩЕ твговБей бек отр оуві дго бій твВгоБго Бі тТве Ага їеой Бій тр ома! 35 30 45 АТа тн хів бБегожїТе біу бі сАго туго тбг отут о тук вго АБробег уза 50 55 бо сім сту Аг Ре твг о т1е бек Аг Ар одбло АТа туз А5п ОР Овен туг 65 70 75 80 вей біп Межб Ап бек бец уз 5ег бій Азр те Аїа Меї Туг тук Су 85 чо 95 тео Аго Азр рве Ап с1у тує бек ар РИ тер біу бій біу тв отвг що 105 15 Сеч тс чаї бер бек 155 «к10» 48 «211» 120 «2ізж БІЛОК «2135 Муз зр. «М» 49 дп Ууаї сій Бей та би бек оту сту с реш о уаі бій го су су і и ке б5ег АГ МСуя зей чеб Суз Аїа АїВв Бек о біу РВЕ тТаг РАВ 5ай Азп РНЕ 20 25 30 сту мех ніб5 Тгромаі ага Оп АТа РКО біш фу б1у сез ст отев Уаї 40 45 АТа тук їїе дка бак ооіу зве б01у тйг о т1е тук о Туг Зег А5роуВг уві 50 55 50 уз пу АгО Бе тео ІТе 5ег о Агу АЗроАзп РКО вух деп тв вейовне б 7о 75 50 іїви Бій меж Тйг обЗек ей дк Зеє сб1ін АЗротйК Аза Меї туго тує Суб 85 90 95 А1а ак Бек тує тТук д5р вве біу АТа Тгровне Аа Тує Ткробіу Ст 105 105 310 сіу тре оїви уаї Те ома1ї бек АТ 3115 120 «МюЮх 50 «тії 170 «Ф19У БІЛОК «213» Но зарієне «400» 50 віп чаї бів зеб уаї бій зак о1у АТа біб Уа Аїда сухо вра біу тн 1 5 зо і 15 бек Уві їу5 бер бек Суб Гуз Аїа бег Ф1У Туг ТК ОРЕ тТаг о йр тує тер омеїт біп ткроуа! Гу біл Аго Рго ТУ бій сТу ев біц ТеротТе сіу ти їв тТуб Рго Ту Азроб1у дротик біу тує АТа сій вух Ре 60 віп с1у уз Аза тб ве) таб Аза Ар осу5 5егозес же твВгоМаї тує то 75 80 меж ні цеци бак заг овей діа бек бів А5р зек дія уаї туго туг Су я5 Зо 95 АТа дка біу др тук тук біу Ваг аб бег їем Азр отут тор оїу с1п то 05 ї10 51у тик обеє уаї Твботаї веб Бер 115 120 «їй» з3 «ії» 117 «фаз БІЛОК «213» Ношто 5арієвпе «щюх І бір маї біп еп уаї аіц 5ег біу 51у біу їеч Уаї іх овго в1у О1У ї 5 10 15 заг ей Ага бе) Заг Суб сій Аїа бек бу Рре ТНК РАВ 5ву баг тує 2а 5 о тАигоїерв о 5Зес о тео чаї Ага бій те овго б1їми руб біу во бін ттгвв ха 35 ее) 45 Аїа тне їТ6 бак тІТе б)іу сіу дко тую те тує Тут вто дер о зег Уаї 50 55 б мув 1уУ Аг вне ТВг Ії бек Ага о Ахроавп Аа рує Ази так вец Тук 55 7 75 5о цен бій Мег дви бек оБеу уз Бег бі дер те Аза Меї Туг тує був 85 чо 95 тр оАКо АзроРйе Ап о с1у тує бек дер Ре тс обіу ст сту таг о тиг 106 105 316 їйец тнгома1ї бек беє 5 «Ох 52 «іх 108 «212» БІЛОК «13 Ното зартепе «Ай 52 Ар т1е маї Меж Тк сти Хек Нія бе 5ог Меб бег тйг б5ег беу бу ї 5 1й 15 дер рго чаї бек ІТе тКРосСух їу5 Аїа зег бій Ах ма)! Зак оте Ма? 275 З

Уа Аза тер тує сів сій см Рго с1у сій 5еговКо Ага Ага ву те 35 46 45 туг Зег АТа 506 туго Ага туУуг їі біу чаї Рго Аза Ага Рпе Твг оту 50 55 60 ек сі АтТа біу тйг о Ах вве тпгоріпе твготів зер обек уд! бів Аа 70 75 що сі А5рїецй АТа маї туго тут буз бій сія нія туго баг о вго вро стуг 85 За 95 ТнеоРВе су І с1У тТиг обу ке) бі їі гуз Аго їй 5 «2305 53 «каї1» 308 «Ле» БІЛОК «ТІ13» Нота 5зарієпь «0» 53 Ар їі Уаї мет Аза сбіп 5ек нія зеи бек Меб бак Тпб баготенооіу ній 5 10 15 А5роРго маї Бег ІТе тт Суб уз Аїа 5ег біп о Ар уаї бе тик ма за чаї АТа тер отує бТп он їу5 Ро біу бій 5егоРГе Аго Ага вен тт а 45 тує Зап А1їа Заг отуг Аг туг та С1у УЖЕ орго Ар Ага вне Тк остТу І) бек б1у А1а с1у Ти А5ровне Те Ре Тиб отів бек обеє маї Тіп АТа БЕ 70 75 5о0 бу Ар мез АТа уві тук тує Суз бій бій нів Туб Зег о вго бро тут 85 о 35 Тег вве біу бі біу тТБг уз ев сто Стів фу Аго що то5 «йо» 54 «аїї» 108 «ру БІЛОК «213» нНОото 5арівпь «ВО» 54 др тнг уаї Меж Таб бій бег ро бек тик жів бек Ти обегб Ууді бТу 1 5 10 15 дер Ага маї бек тхТе тнг о суз лу да зе св ма? Маї с1іу зак діа

2В 30 уаї Аа ткр о тук сія біп суз го б1у бів бек Рго вух се Гей ІТ туг тез АТа Бек тВйгодго нів таб обіу баї Рго дер АгРЕ рве Твк е1у 65о аг БіУ бег сп1у тне аброРНе тб о геи тне о ї1є 5егодейп Уді біп бе 655 70 75 ко дер Азов гей Аа Азр тує РПе су сій о1їп тТуб Ай Бек тує вро стук 55 90 25 тп овпе сту віу Біу тпРОоВуб вм 010 ЖІ ву АГ то 105 «2105 55 «Іі» 308 -12»5 БІЛОК «213» Мото 5арієпе «4005 55 ваза тис маї мек тс отв бе ово бак озбг тів вес тс 5ег хів ФУ ї 5 І 15 з5р Ага Мат бос ЖІ тТагоСуя уз Аіа бас сій маї маї оту бе дія 29 25 30 уаї Аїа теротує сів 51п уз го о1у сій бегоРго уз Сей їв ще 35 40 45 тує тер о АТа бек тнг о Агу віз тийгоФіу маї Рго Аза Аго ва тк Ту 50 55 50 Зек б1у щеє сіу тВг АБО РНе ТИг оте тпр ї1е б5ег айва уаї сій бек 65 Гая 75 8о ів Арсен Аза АЗо Ту вче Су сій бій тук Аа 5ег о Туг РГО СТУК 85 Б! 95 ТвВеовне сту сі б1іу Те о сує рей сти же зуб Ага «во зб. «ії» 36 «212» ДдНЕ «К13х нтучна послідовність «ах «ТЕЗ» Праймер «а00х 56 шовгодассса сарасачату дедосассої кою 36 «Ї05 57

«Щі» 32 «їй» ДНК ше х213» штучна послідовність «дж . «23» Праймер «4005 57 зпадчакссс стзассавасє зесстадает са 32 «2105 58 «2115 32 «гій» ДНК . хгї3х Штучна послідовність «Ох «23» Праймер «й202 «2715 інша ознака «дж (133. .5133 жхве3ю Б ЯнлЯєЄ собою д або. с «ах «21іж інша ознака «гам (153..0153 «23» гоявляє собою а або п «гйдх «221» інша ознака «ййй» С18.. (18) «ЕКЗ» п оявляє собою я, с, побої «ег0х «Т21» інша. ознака «вййх КМ.

СУ, . «ваї» т ояшляєЄ сббою а або с «ех «вві» інше ознака хидйж (2530053 «223» 5 являє собою уд або є «рай «871» інша ознака «вва (С283..0283 «023» 5 являє Собою б або є «4005 58 сттссодаає сссароктва оскозаззає тс 32 хе» 59 «їїх 35 «017» дик «213» Штучна послідовність «гЙх І «235 Праймер «Р0У «221» інша ознака

«й 5133..ї13)3 «223» 5 являє Собою 9 або с «их «221» інша ознака «об» 5153..0153 й «723» г являє Собою а або 4 «Ей «221їх нів ознака хиді» 1853..518) «223» п являє собою з, с, а або їх «720» «21» інша ознака «вра С1ЗУ..0193 і «Т23з пт являє собою й або с «г» «вії» інша ознака «фййж (25У.(253 «723» з являє собою пд або с «вх «ві» лнша ознака «ол (883 «223» 5 являє собою З або с «2205 «21» інша. ознака «Рад» (333,.133) «223» ж являє собою а або ї «400» 59 сетссодаає тсвагутишта дстазаавау господ 35 «210» во кРії» ЗІ «212» ДНК «23135 Штучна послідовність «2205 «ви3» праймер «220х -«в21» інша ознака «ваз СОУ.

СМ , «23» у явпяє собою а або а «ох хбаїх нша ознака кайах СИХ. .С17) «2235 тп являє собою в або є «2205 ка2гї» інша ознака «222» (193..(19). «223» 5 являє собою й або с «2 ді

«221У тнщша ознака «вай (223.22 «223» т являє собою а або. с «20» «вої» інша ознака «2йд» 253,85 . «23» г оввляє собою а або 9 «Вей «ойї» інша ознака «дййж го. х?23» м являє собою а або Є «гайх «2ї» інша ознака кад с29у.,253 жвгЗ» Мо оявляє собою а або с «4005 60 доазстсзау абтаєоюсва стеасястте а 31 «йЩї0ж бі «й11х аб «еї2» ДК . «213» Штучна послідовність «гей» «23» Праймер «400» ві таїададстс авосттодас пдсоадласа стодатасадяї своасос 46 «210 852 «вії» тА хеіїй ДНК «213» штучна п«ослідовність «Дах 5 хгеаїх праймер чай» 62 акдовакссас здасісадує с 21 «КіОж 53 «гіїх 3 «Дт2ах днк «Рї3» Штучна послідовність кг» ек23» Праймер «005 63 І тсссравстс садтавстос адотасссяс їсє 32

Тта/ка ї ж / 1605 їй 5 та/ка і 1 Ті уз товка же ї й

Я дк 5 Ж 5 то/ку во Бе р й по ана - ТО ака я 0 В З то/ко зо Е «Вб ер норов У ТТН знтнктячнеювняккинникя дон ть, КЕ. ме їй «Б Ей нерж ххюююттиттяття НУ спини пнкотетор ст ях крою Метотеву тя офутюи же о текти вв ви як ї пйиеннй З ТОКа "А та/ка РА чо не я Ше й до ; Е Е т як жк р сви сн - «оофіннано атнніуттни ов Бунйфтисмєт в аднсі дик при» се Шо ккенен зи панк піна свй З НН з ок/з/к в в жваве то/ка ее ов ман «Фіг. 1