[go: up one dir, main page]

UA128383C2 - Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування - Google Patents

Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA128383C2
UA128383C2 UAA201907321A UAA201907321A UA128383C2 UA 128383 C2 UA128383 C2 UA 128383C2 UA A201907321 A UAA201907321 A UA A201907321A UA A201907321 A UAA201907321 A UA A201907321A UA 128383 C2 UA128383 C2 UA 128383C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sho
antibody
tau protein
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
UAA201907321A
Other languages
English (en)
Inventor
Оскар АДОЛЬФССОН
Ісідро Хоцел
Исидро Хоцел
Даніелль Дікара
Даниелль Дикара
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Дженентек, Инк.
Ац Іммуне Са
Ац Иммуне Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Інк., Дженентек, Инк., Ац Іммуне Са, Ац Иммуне Са filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA128383C2 publication Critical patent/UA128383C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла до тау-білка та способу його застосування.

Description

Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США Мо 62/431,180, поданою 7 грудня 2016 року, яка включена у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті для будь-яких цілей.
Область техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до антитіл проти тау-білка та способів їх застосування.
Рівень техніки
Нейрофібрилярні клубки і нейропільні нитки (МТ) є основними нейропатологічними ознаками хвороби Альцгеймера (АБ). МТ складаються з асоційованого з мікротрубочками тау-білка (Та), який підданий посттрансляційним модифікаціям, у тому числі фосфорилюванню, і утвореному за рахунок агрегації гіплерфосфорилованих конформерів тау-білка. Дана патологія є загальною для хвороби Альцгеймера та багатьох нейродегенеративних таупатій, зокрема, для деяких типів лобово-скроневої деменції (ЕТО). Тау-білок, очевидно, відіграє найважливішу роль у вгасанні когнітивних здатностей при ХА та подібних нейродегенеративних таупатіях.
Терапевтичні підходи, спрямовані на тау-білок, нечисленні та в основному включають застосування інгібіторів кіназ, які, як вважається, підсилюють фосфорилювання тау-білка до патологічних рівнів, і сполук, що блокують агрегацію гіперфосфорилованого тау-білка у цитоплазмі. Ці підходи характеризуються різними недоліками з погляду специфічності й ефективності. Існує потреба в додаткових терапевтичних агентах, що впливають на патологічні конформери тау-білка, які свідомо або приблизно викликають нейродегенеративні розлади.
Сутність винаходу
Відповідно до даного винаходу запропоновані антитіла проти тау-білка та способи їх застосування. У деяких варіантах реалізації запропоновані антитіла з високою спорідненістю для тау-білька людини або яванського макака. У деяких варіантах реалізації антитіла мають спорідненість для тау-білка людини, що становить менше 1 нМ або менше 0,5 нМ, або менше 0,3 нМ, як виміряно, наприклад, за допомогою поверхневого плазмонного резонансу.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло зв'язується з мономерним тау-білком, олігомерним тау- білком, нефосфорилованим тау-білююм і фосфорилованим тау-білююм. У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язує епітоп у межах амінокислот 2-24 зрілого тау-білка людини. У деяких варіантах реалізації антитіло являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах реалізації антитіло є антитілом людини, гуманізованим або химерним антитілом. У деяких варіантах реалізації антитіло являє собою фрагмент антитіла, що зв'язує тау-білок людини. У деяких варіантах реалізації тау-білок людини містить послідовність 5ЕО ІЮ МО 2.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:605; НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:606; і НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:607.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:608; НМВ-12, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:609; і НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:610.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить НМНА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:605; НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:606; і НУМВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5БЕО 10 МО:607; НМУВ-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:608; НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО:6059; ії НУВ-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЖЕО 10 МО:610.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:603;
Ю) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:604; с) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:614; е) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:615;
І) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (є); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:619;
Р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:620; 60 ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (ПН).
У деяких варіантах реалізації антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить 5ЕО І МО:603; р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить 5ЕО ІЮ МО:б04; с) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність 5ЕО 10 МО:614; є) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність 5ЕО 10 МО:615;
І) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (є); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність 5ЕО ІЮ МО:619;
Р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність ЖЕО 10 МО:620; ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (ПН).
У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО:603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ МО:604, 615 і 620. У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з БЕО ІЮ МО:340, 603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО:604, 615 і 620. У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ
МО:603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІО МО:341, 604, 615 і 620.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:603, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:604; (5) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:614, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:615; або (с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО:619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:620.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:611 або 5ЕО ІЮ МО:612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:613; (5) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО
Зо ІО МО:616 або 5ЕО ІО МО:617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО:618; або (с) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:621 або
ЗЕО ІО МО:622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:б23.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:611 або 5ЕО ІЮ МО:612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:611, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотої послідовності 5ЕО ІЮО МО:611 або 5ЕО ІО МО:612, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності зФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююом людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО І
МО:611, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:612, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮО МО:613.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:616 або 617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:616, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, 60 яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:616 або 5ЕО ІЮО МО:617, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 560) ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО
ІО МО:616, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5260 ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:617, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮО МО:618.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО І МО:621 або 5ЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:621, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:621 або 5ЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 56203 ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО
ІО МО:621, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності «ЖЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:622, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮ МО:623.
У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може бути антитілом СІ або ІдСса4. У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може бути антитілом ІД24. У деяких із таких варіантів реалізації антитіло містить мутації М252У, 52541 і Т256Е. У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може містити мутацію 5228Р. У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може містити мутації 5228Р, М252У, 52541 і Т256Е. У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може бути антитілом Ідся4, що містить мутації
З228Р, М252У, 52541 і Т256Е. У деяких варіантах реалізації антитіло являє собою фрагмент антитіла. У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, антитіло може бути антитілом ІДС4, що містить мутації 5228Р, М252У, 52541 і Т256Е і не містить С-кінцевого залишку лізину (де5-К) константної області важкого ланцюга. Даний С-кінцевий лізин константної області важкого ланцюга може бути вилучений, наприклад, під час очищення антитіла або за допомогою рекомбінантного конструювання нуклеїнової кислоти, що кодує дане антитіло таким чином, що С-кінцевий лізин не кодується.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло зв'язується з мономерним тау-білком, фосфорилованим тау-білююом, нефосфорилованим тау-білком й олігомерним тау-білюом з Ко менше 100 нМ, менше 75 НМ, менше 50 НМ, менше 10 нМ, менше 5 нМ або менше 1 нМ. У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язує тау-білок яванського макака. У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язується з мономерним тау-білюом людини і/або мономерним тау-білком яванського макака з
Ко менше 1 нм.
У деяких варіантах реалізації запропонована виділена нуклеїнова кислота, причому зазначена виділена нуклеїнова кислота кодує антитіло, описане у даному документі. У деяких варіантах реалізації запропонована клітина-хазяїн, що містить виділену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, описане у даному документі. У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб одержання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна в умовах, що підходять для продукування зазначеного антитіла.
У деяких варіантах реалізації запропонований імунокон'югат, що містить виділене антитіло, описане у даному документі, і терапевтичний агент. У деяких варіантах реалізації запропонований імунокон'югат, що містить антитіло, описане у даному документі, і мітку, що виявляється.
У деяких варіантах реалізації запропонована фармацевтична композиція, що містить виділене антитіло, описане у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій.
У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб лікування захворювання, асоційованого з тау-білком, який включає введення індивіду із захворюванням, асоційованим з тау-білком, антитіла, описаного у даному документі, або фармацевтичної композиції, що містить антитіло, описане у даному документі. У деяких варіантах реалізації захворювання, асоційоване з тау-білююм, являє собою таупатію. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію. У деяких варіантах реалізації таупатія вибрана з хвороби
Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцифельда-
Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреуслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу
Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово-скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч. У деяких варіантах реалізації захворювання, яке асоційоване з тау-білююм, вибране з ПВТ (первинної вікової таупатії), деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгострої склерозуючої паненцефалопатії, хронічної травматичної енцефалопатії (ХТЕ), таупатії білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменції з тільцями Леві (ДТЛ), легкого когнітивного порушення (ЛКП), глаукоми, сімейної британської деменції, сімейної датської деменції, гваделупського паркінсонізму, нейродегенерації з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язаної розумової відсталості, множинного склерозу, ВІЛ-пов'язаної деменції, старечого амілоїдозу серця та хвороби Гантінгтона.
У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб збереження або підвищення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті в індивіда, який включає введення антитіла, описаного у даному документі, або фармацевтичної композиції, що містить антитіло, описане у даному документі.
У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб зниження рівня тау-білка, нефосфорилованого тау-білка, фосфорилованого тау-білка або гіперфосфорилованого тау- білка в індивіда, який включає введення антитіла, описаного у даному документі, або фармацевтичної композиції, що містить антитіло, описане у даному документі.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, описане у даному документі, для застосування як лікарський засіб. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, описане у даному документі, для застосування при лікуванні таупатії в індивіда. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію. У деяких варіантах реалізації таупатія вибрана з хвороби Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцифельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому
Дауна, хвороби Герстманна-Штреуслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон- протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово-скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби
Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо- понто-нігральної дегенерації хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч. У деяких варіантах реалізації захворювання, яке 60 асоційоване з тау-білюом, вибране з ПВТ (первинної вікової таупатії), деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгострої склерозуючої паненцефалопатії, хронічної травматичної енцефалопатії (ХТЕ), таупатії білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменції з тільцями Леві (ДТЛ), легкого когнітивного порушення (ЛКП), глаукоми, сімейної британської деменції, сімейної датської деменції, гваделупського паркінсонізму, нейродегенерації з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язаної розумової відсталості, множинного склерозу, ВІЛ-пов'язаної деменції, старечого амілоїдозу серця та хвороби Гантінгтона.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, описане у даному документі, для застосування при збереженні або підвищенні ємності когнітивної пам'яті або вповільненні втрати пам'яті в індивіда. У деяких варіантах реалізації антитіло, описане у даному документі, запропоноване для застосування при зниженні рівня тау-білка, нефосфорилованого тау-білка, фосфорилованого тау-білка або гіперфосфорилованого тау-білка в індивіда.
У деяких варіантах реалізації виділене антитіло, описане у даному документі, запропоноване для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, асоційованого з тау-білком, в індивіда. У деяких варіантах реалізації захворювання, асоційоване з тау-білком, являє собою таупатію. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію. У деяких варіантах реалізації таупатію вибирають з хвороби Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцфельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреуслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово- скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії. У деяких варіантах реалізації таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч. У деяких варіантах реалізації захворювання, яке асоційоване з тау-білюом, вибране з ПВТ (первинної вікової таупатії), деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгострої склерозуючої паненцефалопатії, хронічної травматичної енцефалопатії (ХТЕ), таупатії білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменції з тільцями Леві (ДТЛ), легкого когнітивного порушення (ЛКП), глаукоми, сімейної британської деменції, сімейної датської деменції, гваделупського паркінсонізму, нейродегенерації з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язаної розумової відсталості, множинного склерозу, ВІЛ-пов'язаної деменції, старечого амілоїдозу серця та хвороби Гантінгтона.
У деяких варіантах реалізації запропоноване застосування антитіла, описаного у даному документі, для одержання лікарського засобу для збереження або підвищення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті в індивіда.
У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб виявлення нейрофібрилярних клубків, нейропільних ниток або дистрофічних нейритів, що включає контакт зразка з антитілом, описаним у даному документі. У деяких варіантах реалізації зразок може являти собою зразок головного мозку, зразок цереброспинальної рідини або зразок крові.
У будь-якому з варіантів реалізації, описаних у даному документі, спосіб або застосування може включати введення антитіла, описаного у даному документі, у комбінації з щонайменше одним додатковим терапевтичним засобом. Необмежуючі приклади інших терапевтичних засобів включають неврологічні лікарські засоби, кортикостероїди, антибіотики, противірусні засоби та інші терапевтичні агенти. Такі інші терапевтичні агенти включають інші антитіла проти тау-білка, антитіла проти бета-амілоїду, антитіла проти бета-секретази 1 ("ВАСЕЇ") й інгібітори бета-секретази 1, але не обмежуються ними.
Короткий опис креслень
Фігура 1А-Р. Зв'язування антитіл з гіперфосфорилованим тау-білком (рТацй) порівнювали з нефосфорилованим тау-білююм за допомогою твердофазного ІФА. Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.).
Фігура 2А-Е. Зв'язування антитіл з олігомерним тау-білком оцінювали за допомогою твердофазного ІФА оліго- і мономерного бау-білка (топоТац). Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.).
Фігура 3. Три протестовані антитіла проти будь-якої форми тау-білка продемонстрували зв'язування розчинного тау-білка в лізатах головного мозку донорів із хворобою Альцгеймера 60 (ХА) та відповідних контрольних донорів за допомогою аналізу на основі вестерн-блоттингу
(ВБ). Білкові екстракти лізатів головного мозку при ХА та контрольних лізатів, і шість ізоформ рекомбінантного тау-білка людини аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і піддавали мембрани блоттингу з трьома антитілами проти будь-якої форми тау-білка (3703-НО, 9482-С1 і 125811-НЗ). Доріжки зі зразками при ХА позначені як АО18, АО24 і АО27, а доріжки з контрольними зразками позначені як С25 і С21. Доріжки з шістьма ізоформами рекомбінантного тау-білка людини позначені як леддер птТаи.
Фігура 4А-С. Антитіла проти будь-якої форми тау-білка продемонстрували зв'язування з розчинним тау-білком у лізатах головного мозку при ХА й у відповідних контрольних донорів за допомогою твердофазного ІФА із захопленням тау-білка. Представлені дані для трьох антитіл проти будь-якої форми тау-білка (3703-НО, 9482-С1 ії 125811-НЗ). Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.) у вигляді "середні значення хх СО", М-2.
Фігура 5. На сенсограмах показане зв'язування 3703-НУ у формі Раб (лівий графік) і дО (правий графік) з мономерним тау-білком людини, ковалентно зв'язаним із поверхнею чипа
Віасоге. Використовували модель зв'язування 1:1, показану у вигляді накладення. По осі х позначений час (у секундах). По осі у позначені резонансні одиниці (РЕ).
Фігура 6. На накладених сенсограмах показане зв'язування зразків пиЗ703-НО.м5 1-0 (лівий графік) і 1-2 тижня (правий графік) з мономерним тау-білком людини в концентраціях 3,1, 6,3, 12,5, 25, 25, 50 ії 100 нМ. Використовували модель зв'язування 1:1, також показану на цій фігурі.
По осі х позначений час (у секундах). По осі у позначені резонансні одиниці (РЕ).
Фігура 7. Зв'язування пи3703-НО.м5 і пи3703-НУ.м5 М280 з мономерним тау-білком окремо (на лівому графіку показаний пи3703-НО.м5, а на середньому - пи3703-НУ.м5 М280) і в суміші при співвідношенні 1:1 (правий графік). По осі х позначений час (у секундах). По осі у позначені резонансні одиниці (РЕ).
Фігура 8А-О. Спорідненість, показник стабільності та послідовності дев'яноста варіантів 3703-НУ, що зазнали скринінгу на предмет можливого поліпшення стабільності. Для ясності значення, отримані з використанням контрольного антитіла, що не зазнав стресу (пи3703-НО.м5 пПІДС1), проаналізовані на початку, середині та кінці кожного експерименту, наведені в обох секціях таблиці.
Фігура 9. Структурна модель Еу-області 3703-НУ з показаними положеннями залишків 28-33 (мотив МЕОМТ УРЕ) легкого ланцюга та відносними положеннями залишків 28 і 33. Зверніть увагу, що залишок 33, змутований в пи37О03 м28.А4 в І єи, не знаходиться поблизу від нестабільного залишку А5п-28. Точковою лінією показаний водневий зв'язок між залишками Авп-28 і Туг-32.
Фігура отримана за допомогою пакета програмного забезпечення МОЕ (СпНетіса! Сотриїйпу
Стор).
На Фігурі 10 показана фармакокінетика антитіла 3703-НУ проти тау-білка в мишей після однократної внутрішньовенної або внутрішньочеревинної ін'єкції в дозуванні 10 мг/кг.
На Фігурі 11 показана фармакокінетика пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р і пи37О03 .м28.А4 пІдСсі4- 5228Р.УТЕ в яванських макак після однократної в/в болюсної ін'єкції в дозі 1 мг/кг.
Фігура 12А-С. Зв'язування деяких антитіл проти тау-білка з фрагментами тау-білка. (А)
Показане зв'язування деяких антитіл проти тау-білка з фрагментами тау-білка 1-15, 10-24, 19- 33, 28-42, 37-51 і 46-60. (В) Зв'язування антитіла 3703-НО тідсга з фрагментами тау-білка 10- 44, 10-24, 2-24, 2-34 і повнорозмірним тау-білком. (С) Зв'язування антитіла пи3703-НО.м5 НІдДСІ з фрагментами тау-білка 10-44, 10-24, 2-24, 2-34 і повнорозмірним тау-білком.
Фігура 13А-В. Вплив ефекторної функції на токсичність тау-білка в спільних культурах нейронів і мікроглії. (А) Відсоток фрагментації МАР2 у спільних культурах, що контактували з різними антитілами й олігомерним тау-білюком. (В) Зображення нейронів (верхні графіки) і спільних культур нейронів і мікроглії (нижні графіки), які контактували з різними антитілами й олігомерним тау-білком.
Фігура 14. Рівні рТай212/214 у гіппокампі мишей після введення ІдСга проти тау-білка 3703-
НУ дикого типу або ОАМО Ідс2 3703-НО проти тау-білка.
Фігура 15. Порівняння послідовностей тау-білка людини й яванського макака. Показаний епітоп антитіла 37 03-НО.
На Фігурі 16 показана фармакокінетика антитіла 9482-С1 проти тау-білка в мишей після однократної внутрішньовенної або внутрішньочеревинної ін'єкції в дозуванні 10 мг/кг.
На Фігурі 17 показана фармакокінетика антитіла 125811-НЗ проти тау-білка в мишей після однократної внутрішньовенної або внутрішньочеревинної ін'єкції в дозуванні 10 мг/кг.
На Фігурі 18 показане вирівнювання варіабельних областей легких каппа 1-ланцюгів пи3703-НУ.м1, пи3703-НУ.м39, пи3703-НУ.м40 ї пи3703-НО.ма1.
На Фігурі 19А-В показана концентрація антитіла у плазмі (А) ії ЦСР (В) в яванських макак 60 після однократної в/в ін'єкції зазначеного антитіла в дозуванні 50 мг/кг.
На Фігурі 20 показана концентрація загального тау-білка у плазмі та концентрація антитіла у плазмі яванських макак після однократної в/в ін'єкції зазначеного антитіла в дозуванні 50 мг/кг.
На Фігурах 21А-О показана концентрація антитіла в різних областях головного мозку яванського макака через 2 дня та 10 днів після однократної в/в ін'єкції пи3703.м28.А4 пІдСЯ-
З228Р (А) і пи3703.м28.А4 підс4-5228Р.УТЕ (В) в дозуванні 50 мг/кг; середня концентрація антитіла в головному мозку (С); 95 концентрація антитіла в головному мозку:плазмі (0).
На Фігурі 22А-В показана концентрація антитіла в головному мозку яванського макака в різні моменти часу після однократної в/в ін'єкції зазначеного антитіла в дозуванні 50 мг/кг, представлена на графіку з логарифмічною (А) та лінійною (В) шкалою.
На Фігурі 23А-Е показана концентрація антитіла в гіппокампі (А), мозочку (В), фронтальній корі (С), ЦСР (0) і плазмі (Е) яванських макак у різні моменти часу після однократної в/в ін'єкції зазначеного антитіла в дозуванні 50 мг/кг.
На Фігурі 24А-В показані середня (А) й окремі (В) концентрації загального тау-білка у плазмі яванських макак залежно від часу після однократної в/в ін'єкції зазначеного антитіла в дозуванні 50 мг/кг.
На Фігурах 25А-В показане вирівнювання послідовностей між антитілами пи3703-НУ.м76, пи3703-НУ.м83 і пи3703-НО.м93 із дозрілою афінністю та батьківським антитілом пи3703-
НЗма8.А4. Відмінності між амінокислотами позначені чорним затіненням.
На Фігурах 26ДА-В показані вимірювання спорідненості пи3703-НУ9.м76 для мономеру тау- білка людини (А) і мономеру тау-білка яванського макака (В).
Докладний опис варіантів реалізації винаходу
І. Визначення "Акцепторний каркас людини" для цілей даного винаходу являє собою каркас, що містить амінокислотну послідовність каркаса варіабельного домена легкого ланцюга (МІ) або каркаса варіабельного домена важкого ланцюга (УН), виділений з каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини, як визначено нижче. Акцепторний каркас людини, "отриманий з" каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини, може містити співпадаючу з ними амінокислотну послідовність або може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах реалізації кількість змін амінокислотної
Зо послідовності становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше або 2 або менше. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність МІ -акцепторного каркаса людини ідентична послідовності Мі -каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини. "Спорідненість" відноситься до сили суми нековалентних взаємодій між одиночним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) та її партнера зі зв'язування (наприклад, антигена).
Якщо не зазначено інше, у даному документі "спорідненість зв'язування" відноситься до властивої молекулі спорідненості зв'язування, що відображає взаємодію між членами пари компонентів, що зв'язуються (наприклад, антитілом й антигеном) при їхньому співвідношенні 171. Спорідненість молекули Х до її партнера У у цілому можна виразити константою дисоціації (Ко). Спорідненість можна вимірювати за допомогою відомих в даній області техніки способів, у тому числі описаних у даному документі. Конкретні ілюстративні та типові варіанти реалізації вимірювання спорідненості зв'язування описані нижче.
Антитіло з "дозрілою афінністю" відноситься до антитіла з однією або більше змінами в одній або більше гіперваріабельних областях (НМР) у порівнянні з вихідним антитілом, яке не містить таких змін, причому такі зміни призводять до підвищення спорідненості антитіла до антигена.
Терміни "антитіло проти тау-білка" або "антитіло, що зв'язується з тау-білком" відносяться до антитіла, здатного зв'язувати тау-білок з достатньою спорідненістю, так що зазначене антитіло можна використовувати в якості діагностичного та/"або терапевтичного агента при адресному впливі на тау-білок. У деяких варіантах реалізації ступінь зв'язування антитіла проти тау-білка з неспецифічним білком, що не є тау-білююом, становить менше приблизно 10 95 зв'язування антитіла з тау-білком при вимірюванні, наприклад, за допомогою радіоіїмуноаналізу (РІА). У деяких варіантах реалізації антитіло, що зв'язується з тау-білюом, має константу дисоціації (Ко), що становить «х 1 мкМ, «х 100 НМ, 1О0 НМ, «1 НМ, «0,1 нМ, «х 0,01 нМ або « 0,001
НМ, (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 102 М до 10-33 М, наприклад, від 107 М до 10- 13 М). У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка специфічно зв'язується з епітопом тау-білка, який є консервативним серед тау-білків різних видів тварин. Терміни "антитіло проти тау-білка" й "антитіло, що зв'язується з тау-білююм" використовуються у даному документі взаємозамінно та відносяться до антитіла, що зв'язує мономерний тау-білок, олігомерний тау- 60 білок і/або фосфорилований тау-білок якщо інше не зазначено явно. У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка зв'язується з мономерним тау-білком, олігомерним тау- білком, нефосфорилованим тау-білююм і фосфорилованим тау-білююом з порівнянною спорідненістю, наприклад, як при використанні антитіл, що відрізняються одне від одного не більше ніж у 50 разів. У деяких варіантах реалізації антитіло, що зв'язує мономерний тау-білок, олігомерний тау-білок, нефосфорилований тау-білок і фосфорилований тау-білок, називають "антитілом проти будь-якої форми тау-білка".
Термін "антитіло" у даному документі застосовується в самому широкому сенсі та включає різні структури антитіл, включаючи моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, за умови, що вони проявляють бажану антигензв'язуючу активність, але не обмежується ними.
Термін "фрагмент антитіла" відноситься до молекули, яка не є інтактним антитілом, але містить фрагмент інтактного антитіла, що зв'язує антиген, з яким зв'язується інтактне антитіло.
Приклади фрагментів антитіл включають Ем, Раф, Раб Раб-5Н, Р(аб)26--фрагменти; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕм); і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл, але не обмежуються ними. "Антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом", що й еталонне антитіло, відноситься до антитіла, яке блокує зв'язування еталонного антитіла з його антигеном при конкурентному аналізі на 50 95 або більше, і, навпаки, еталонне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном при конкурентному аналізі на 5095 або більше. Типовий конкурентний аналіз наведений у даному документі.
Термін "химерне" антитіло відноситься до антитіла, в якому фрагмент важкого та/або легкого ланцюга походить з конкретного джерела або виду, у той час як інша частина важкого та/або легкого ланцюга походить з іншого джерела або виду. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домена або константної області, що міститься в його важкому ланцюзі. Існує п'ять основних класів антитіл: ДА, дО, ІдЧЕ, да і дм, ї деякі з них додатково діляться на підкласи (ізотипи), наприклад, Іде, сг, ІдОз, ІДС, ІА: і ІдА».
Константні домени важкого ланцюга, що відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються с, 6, є, у і м, відповідно.
У даному контексті термін "цитотоксичний агент" відноситься до речовини, яка інгібує або запобігає функціонування клітин і/або призводить до загибелі або руйнування клітин.
Цитостатичні агенти включають радіоактивні ізотопи (наприклад, А! 1191, 125, узо, Де!86 Де!88,
От! Віг12, рз2, ррг!г і радіоактивні ізотопи Ци), хіміотерапевтичні агенти або лікарські речовини (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); інгібітори росту; ферменти та їх фрагменти, наприклад, нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, наприклад, низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти; і варіанти та різні протипухлинні або протиракові агенти, описані нижче, але не обмежуються ними.
Термін "ефекторні функції" відноситься до тих видів біологічної активності, що властиві Ес- області антитіла, які змінюються залежно від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають: зв'язування С14 і комплемент-залежну цитотоксичність (СОС); зв'язування з рецептором Ес; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮСС); фагоцитоз; придушення рецепторів поверхні клітини (наприклад, рецептора В-клітин); і активацію В-клітин. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичного складу, відноситься до кількості, ефективної в дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату.
У даному контексті термін "Рс-область" застосовується для позначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, який містить щонайменше фрагмент константної області.
Термін включає Ес-області з нативними послідовностями і варіантні Ес-області. У деяких варіантах реалізації Ес-область важкого ланцюга ІДС людини продовжується від Суз226 або від
Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак Ес-область може містити або не містити С-кінцевий лізин (І уз447). Якщо не зазначено інше, нумерація амінокислотних залишків у Ес-області або константній області відповідає системі нумерації, прийнятій в ЄС, яку також називають ЕС-індексом, як описано у Кабаї єї а)., Зедоепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іптегеві,
БП Еа. Рибіїс Неайй 5егмісе, Маїййопаї Іпзійшез ої Неанйй, ВеїШезаа, МО, 1991.
Термін "каркас" або "БВ" відноситься до залишків варіабельного домена, за винятком залишків гіперваріабельної області (НМА). ЕВ варіабельного домена зазвичай складається з чотирьох ЕВ-доменів: ЕН, ЕБ2, ЕВЗ і ЕН4. Відповідно, послідовності НМА і ЕВ у складі МН (або
МУ), як правило, визначаються в наступній послідовності: ЕН1-НІ1 (І 1)-ЕН2-НІ(І 2)-ЕНЗ-НЗІІ 3)-
ЕВА.
У даному контексті терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" та "ціле антитіло" є взаємозамінними і відносяться до антитіла, структура якого по суті аналогічна структурі нативного антитіла, або яке включає важкі ланцюги, що містять Ес-область, описану у даному документі.
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" і "культура клітин-хазяїнів" застосовуються як взаємозамінні та відносяться до клітин, у які введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають первинно трансформовані клітини й отримане від них потомство, незалежно від кількості пересіювань. Потомство може не бути повністю ідентичним вихідній клітці за вмістом нуклеїнових кислот, і може містити мутації. Даний опис включає мутантне потомство, що має ту саму функцію або біологічну активність, яку спостерігали під час скринінгу або відбору з первинно трансформованих клітин. "Антитіло людини" являє собою антитіло, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності антитіла, що продукується в організмі людини або клітині людини або має походження з нелюдського джерела, яке використовує репертуар антитіл людини або інші послідовності, що кодують антитіло людини. З цього визначення антитіла людини, зокрема, виключене гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язуючі залишки нелюдського походження.
Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домена важкого або легкого ланцюга антитіла, що бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН і МІ, відповідно) нативного антитіла зазвичай мають аналогічну структуру, причому кожний домен містить чотири консервативні каркасні області (ЕР) і три гіперваріабельні області (НМА). (Див., наприклад, Кіпаї єї а). Кибу Іттипоіоау, б ей., М. Н. Егеетап апа Со., стор. 91 (2007). Одного МН- або Мі -домена може бути досить для надання антигензв'язуючої специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язуються з конкретним антигеном, можна виділити, використовуючи МН- або МіІ-домен антитіла, що зв'язується з антигеном, для скринінгу бібліотеки послідовностей, комплементарних МІ- або МН-доменам,
Зо відповідно. Див., наприклад, Ропоїапо еї аї., У. Іттипої. 150:880-887 (1993); Сіагкзоп еї аї.,
Маїшге 352:624-628 (1991). "Консенсусний каркас людини" є каркасом, що являє найпоширеніші амінокислотні залишки при відборі МІ- або МН-каркасних послідовностей імуноглобуліну людини. Як правило, відбір
МІ- або МН-послідовностей імуноглобуліну людини здійснюють з підгрупи послідовностей варіабельного домена. Як правило, підгрупа послідовностей являє собою підгрупу за Кабаї єї а!., Зеднепсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, ГІ Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, Веїйпезаа
МО (1991), моів. 1-3. В одному варіанті реалізації винаходу МІ підгрупа являє собою підгрупу каппа І за Кабаї єї а!І., вище. В одному з варіантів реалізації винаходу МН підгрупа являє собою підгрупу ПІ за Кабаї єї а!., вище. "Гуманізоване" антитіло відноситься до химерного антитіла, що містить амінокислотні залишки з НМА нелюдського походження й амінокислотні залишки з РФ людини. У деяких варіантах реалізації гуманізоване антитіло містить практично все з щонайменше одного, а зазвичай - двох варіабельних доменів, у яких усі або практично всі НУВ (наприклад, СОР) відповідають аналогічним ділянкам з антитіла нелюдського походження, і всі або практично всі
ЕВ-області відповідають послідовності антитіла людини. У деяких випадках гуманізоване антитіло може містити щонайменше фрагмент константної області антитіла, що має походження з антитіла людини. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, антитіла нелюдського походження, відноситься до антитіла, яке піддане гуманізації.
У даному контексті термін "гіперваріабельна область" або "НМА" відноситься до кожної з областей варіабельного домена антитіла, що мають гіперваріабельні послідовності ("області, що визначають комплементарність" або "СОВ") й/"або утворюють структурно певні петлі
Стіперваріабельні петлі") талабо містять залишки, що контактують з антигеном ("антигенні контакти"). Як правило, антитіла містять шість НМЕ: три у МН (НІ, Н2, НЗ)ітриу М (І 1,12, 1 3).
Типові НМУВ, описані у даному документі, включають: (а) гіперваріабельні петлі, що знаходяться в області амінокислотних залишків 26-32 (І 1), 50- 52 (І2), 91-96 (13), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Споїтіа апа І ез5К, 9. Мої. Вісі. 196:901- 917(1987)); (5) СОЕ, що знаходяться в області амінокислотних залишків 24-34 (І 1), 50-56 (12), 89-97 (3), 31-356 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (Кабаї евї аї!., Зедиепсез ої Ргоївіпз ої Іттипоіодісаї бо Іптегезі, Бій Ей. Рибіїс Неацй 5егуісе, Маїйопаї! Іпзійшез ої Неайй, Веїйпезаа, МО (1991));
(с) антигенні контакти, що знаходяться в області амінокислотних залишків 27 с-36 (І 1), 46-55 (12), 89-96 (І 3), 30-35Б5 (НІ), 47-58 (Н2) і 93-101 (НЗ) (МассСаїшт еї аї. 9. Мої. Віо!. 262:732-745 (1996)); а також (а) комбінації (а), (Б) і/або (с), включаючи амінокислотні залишки НМА 46-56 (І 2), 47-56 (І 2), 48-56 (І 2), 49-56 (І 2), 26-35 (НІ), 26-35Б (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).
Якщо не зазначено інше, залишки НМЕ й інші залишки у варіабельному домені (наприклад,
ЕВ-залишки) у даному документі нумерують за КарБбаї еї а!., вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юговане з однією або більше гетерологічними молекулами, включаючи цитотоксичний агент, але не обмежуючись ним. "Індивід" або "суб'єкт" являє собою ссавця. Ссавці включають одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак і коней), приматів (наприклад, людей та приматів, що не є людьми, наприклад, мавп), кроликів і гризунів (наприклад, мишей та пацюків), але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації індивід або суб'єкт є людиною. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, відділене від компонента свого природного оточення. У деяких варіантах реалізації антитіло є очищеним до більше ніж 95 95 або 99 95 чистоти, обумовленої, наприклад, за допомогою електрофорезу (наприклад, електрофорезу в
ДСН-ПААГ, ізоєлектричного фокусування (ІЕФ), капілярного електрофорезу) або хроматографії (наприклад, іонообмінної або звернено-фазної ВЕРХ). Огляд способів оцінки чистоти антитіл див., наприклад, у роботі Ріаїтап еї а!., У. Спготаїйодг. В 848:79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, відділену від компонентів свого природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять зазначену молекулу нуклеїнової кислоти, однак зазначена молекула нуклеїнової кислоти присутня поза хромосомою або в області хромосоми, яка відрізняється від її природнього місця розташування в хромосомі. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло проти тау-білка" відноситься до однієї або більше молекул нуклеїнової кислоти, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла (або їх фрагменти), включаючи таку(ї) молекулу(и) нуклеїнової кислоти в складі одного вектора або окремих векторів і таку(ї) молекулу(и) нуклеїнової кислоти, що присутня(ї) в одному або більше місцях розташування в клітині-хазяїні.
У даному документі термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманого з популяції практично однорідних антитіл, тобто, окремих антитіл, що становлять популяцію, які є ідентичними і/або зв'язують той самий епітоп, за винятком можливих варіантних антитіл, наприклад природні мутації, що містять або виникають під час продукування моноклонального антитіла, причому такі варіанти присутні в незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай містять різні антитіла проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло з препарату моноклонального антитіла спрямоване проти однієї детермінанти антигена. Таким чином, модифікатор "моноклональне" вказує на те, що антитіло одержують з практично однорідної популяції антитіл; його не слід інтерпретувати як вимогу щодо продукції антитіла за допомогою якого-небудь конкретного способу. Наприклад, моноклональні антитіла для застосування згідно з даним винаходом можна одержати за допомогою різних способів, включаючи гібридомний спосіб, методики рекомбінантних ДНК, методики фагового дисплея та способи з використанням трансгенних тварин, повністю або частково утримуючих локуси імуноглобуліну людини, але не обмежуючись ними, причому такі способи та інші типові способи одержання моноклональних антитіл описані у даному документі.
Термін "вільне антитіло" відноситься до антитіла, яке не кон'юговане з гетерологічною групою (наприклад, цитотоксичною групою) або радіоактивною міткою. Вільне антитіло може бути присутнім у фармацевтичному складі. "Нативні антитіла" відносяться до природних молекул імуноглобуліну з різною структурою.
Наприклад, нативні ІдСб-антитіла зазвичай являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною масою близько 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, які зв'язані дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг від М-кінця до С-кінця містить варіабельну область (УН), яку також називають варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, а потім три константні домена (СНІ, СНЕ2 ї СНЗ). Аналогічно, кожний легкий ланцюг від М-кінця до С-кінця містить варіабельну область (М), яку також називають варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, а потім константний легкий домен (СІ). Залежно від амінокислотної послідовності константного домена легкий ланцюг антитіла можна віднести до одного з двох типів, які називають каппа (к) і лямбда (А).
Термін "вкладиш в упакування" відноситься до інструкцій, які у звичайному порядку бо вкладаються в упакування терапевтичних продуктів для продажу, що містять інформацію про показання, застосування, дози, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або застереження, що стосуються застосування таких терапевтичних продуктів. "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" стосовно послідовностей еталонних поліпептидів визначають як процентний вміст амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, ідентичних амінокислотним залишкам у послідовності еталонного поліпептиду після вирівнювання послідовностей та, при необхідності, введення розривів для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовностей без урахування яких-небудь консервативних замін як частини ідентичності послідовностей. Вирівнювання для цілей визначення процентної ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснити різними способами, відомими фахівцям ов даній області техніки, наприклад, використовуючи загальнодоступне комп'ютерне програмне забезпечення, наприклад, програмне забезпечення
ВІА5ЄТ, ВІ АБТ-2, АГПІОМ або Медаїїдп (ОМАБТАН). Фахівці в даній області техніки можуть визначити відповідні параметри вирівнювання послідовностей, включаючи алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання за всією довжиною порівнюваних послідовностей.
У той самий час усі використовувані для цілей даного документа процентні значення ідентичності амінокислотних послідовностей отримані із застосуванням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей АЇ 2-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей
АЦОМ-2 розроблена компанією Сепепіесиі, Іпс., а вихідний код представлений у документації користувача у Бюро з охорони авторських прав США, Вашингтон, округ Колумбія, 20559, де зареєстрований під номером реєстрації авторського права США ТХИ510087. Програма АП'ОМ-2 знаходиться у вільному доступі в Сепепіеси, Іпс., Саут-Сан-Франциско, Каліфорнія, або може бути скомпільована з вихідного коду. Програму АГ І2М-2 слід компілювати для застосування в операційній системі ЮОМІХ, включаючи цифрову версію ОМІХ М4.00. Всі параметри порівняння послідовностей встановлюються програмою АЇ ІС2-2 і залишаються незмінними.
У випадках, коли АГ ІСМ-2 використовують для порівняння амінокислотних послідовностей,
Фо ідентичності амінокислотної послідовності даної амінокислотної послідовності А з, у порівнянні з або щодо даної амінокислотної послідовності В (що можна переформулювати так, що дана амінокислотна послідовність А характеризується або включає певний 95 ідентичності амінокислотної послідовності з, у порівнянні з або щодо даної амінокислотної послідовності В) розраховують у такий спосіб: 100-кратне відношення Х/У де Х означає кількість амінокислотних залишків, що вважаються ідентичними збігами при вирівнюванні А і В за допомогою програми вирівнювання послідовностей АЇЇСМ-2, і де У означає загальну кількість амінокислотних залишків у В. Слід приймати до уваги, що якщо довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 90 ідентичності амінокислотної послідовності А стосовно В не дорівнює 95 ідентичності амінокислотної послідовності В стосовно А. Якщо не зазначено інше, всі використовувані у даному документі процентні значення ідентичності амінокислотних послідовностей отримані, як описано безпосередньо у попередньому абзаці із застосуванням комп'ютерної програми АГ ІСМ- 2.
Термін "фармацевтичний склад" відноситься до препарату, який знаходиться у формі, що забезпечує ефективну біологічну активність активного інгредієнта, що міститься в ньому, і не містить додаткових компонентів, що є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому повинен бути введений склад. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта у фармацевтичному складі, який відрізняється від активного інгредієнта й є нетоксичним для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає буфер, допоміжну речовину, стабілізатор або консервант, але не обмежується ними.
У даному контексті термін "тау-білок" відноситься до будь-якого нативного тау-білка з будь- якого джерела, що відноситься до хребетних, включаючи ссавців, наприклад, приматів (наприклад, людей) і гризунів (наприклад, мишей та пацюків), якщо не зазначено інше. Цей термін включає "повнорозмірний" непроцесований тау-білок, а також будь-яку форму тау-білка, отриману в результаті процесингу в клітині. Даний термін також охоплює природні варіанти тау- білка, наприклад, сплайс-варіанти або алельні варіанти.
Термін "рТаи", що використовується у даному документі, відноситься до тау-білка, в якому залишки серину, треоніну або тирозину фосфориловані протеїнкіназою шляхом додавання ковалентно зв'язаної фосфатної групи. У деяких варіантах реалізації рГаш фосфорилований за залишком серину або треоніну. У деяких варіантах реалізації рташ фосфорилований за залишком серину у положенні 409 та/або за залишком серину у положенні 404. У деяких 60 варіантах реалізації рГаш фосфорилований за залишком серину у положенні 409.
Термін "розчинний тау-білок" у даному документі відноситься до білків, що складаються з обох повністю розчинених мономерів тау-білка/улептиду або тауподібних пептидів/білків, або модифікованих або вкорочених тау-пептидів/білків або інших похідних мономерів тау- білка/пептиду й олігомерів тау-білка. "Розчинний тау-білок" виключає, зокрема, нейрофібрилярні клубки (МЕТ).
Термін "нерозчинний тау-білок" у даному документі відноситься до множинних агрегованих мономерів тау-пептиду або білка, або тауподібних пептидів/білків, або модифікованих або вкорочених тау-пептидів/білків, або інших похідних тау-пептидів/білків, що утворюють олігомерні або полімерні структури, які є нерозчинними як іп мйго у водному середовищі, так й іп мімо в організмі ссавця або людини, особливо - у головному мозку, але, зокрема, відноситься до множинних агрегованих мономерів тау-білка або модифікованих або вкорочених тау- пептидів/білків або їх похідних, нерозчинних в організмі ссавця або людини, особливо - у головному мозку, відповідно. "Нерозчинний тау-білок' включає, зокрема, нейрофібрилярні клубки (МЕТ).
Термін "мономерний тау-білок" або "мономер тау-білка" у даному документі відноситься до повністю солюбілізованих тау-білків, що не містять агрегованих комплексів у водному середовищі.
Терміни "агрегований тау-білок", "олігомерний тау-білок" й "олігомер тау-білка" у даному документі відносяться до множинних агрегованих мономерів тау-пептидів або білків, або тауподібних пептидів/білків, або модифікованих або вкорочених тау-пептидів/білків, або інших похідних тау-пептидів/білків, що утворюють олігомерні або полімерні структури, нерозчинні або розчинні як іп міго у водному середовищі, так й іп мімо в організмі ссавця або людини, особливо - у головному мозку, але, зокрема, відносяться до множинних агрегованих мономерів тау-білка або модифікованих або вкорочених тау-пептидів/білків або їх похідних, нерозчинних або розчинних в організмі ссавця або людини, особливо - у головному мозку, відповідно.
Терміни "РТаий РНЕ", "РНЕ" ї "парні спіральні філаменти" у даному описі використовують як синоніми, і вони відносяться до пар філаментів, звитих у спіралі з видимою при електронній мікроскопії періодичністю, рівною 160 нм. Ширина варіюється в діапазоні 10-22 нм. РНЕ являють собою переважні структури в нейрофібрилярних клубках при хворобі Альцгеймера (ХА) та нейропільних нитках. РНЕ також можна спостерігати у деяких, але не всіх дистрофічних нейритах, пов'язаних з нейритичними бляшками. Основним компонентом РНЕ є гіперфосфорилована форма асоційованого з мікротрубочками тау-білка. РНЕ може частково складатися з антипаралельних гіперфосфорилованих тау-білків, зв'язаних дисульфідними зв'язками. Тау-білок РНЕ може бути вкорочений за С-кінцем на 20 амінокислотних залишків.
Механізми, що лежать в основі утворення РНЕ, неясні, однак гіперфосфорилювання тау-білка може відокремлювати його від мікротрубочок, збільшуючи розчинний пул тау-білка, з якого всередині нейронів можуть утворюватися РНЕ.
У даному документі термін "лікування" (та його граматичні варіанти, такі як "лікувати" або "впливати") відноситься до клінічного втручання в спробі змінити природню динаміку стану індивідуума, що підданий лікуванню, і може застосовуватися як для профілактики, так і для впливу на хід клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають запобігання виникнення або поновлення захворювання, полегшення симптомів, зменшення прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазування, зниження швидкості прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення патологічного стану, а також ремісію або поліпшення прогнозу, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації антитіла згідно з даним винаходом застосовують для затримки розвитку захворювання або вповільнення прогресування захворювання.
Термін "рання хвороба Альцгеймера" або "рання ХА" у контексті даного документа (наприклад, "пацієнт з діагнозом ранньої ХА" або "пацієнт, що страждає ранньою ХА") включає пацієнтів з легким когнітивним порушенням, наприклад, дефіцитом пам'яті через ХА, і пацієнтів з наявністю біомаркерів ХА, наприклад, амілоїд-позитивних пацієнтів.
Термін "хвороба Альцгеймера легкого ступеня тяжкості" або "ХА легкого ступеня тяжкості" у даному документі (наприклад, "пацієнт з діагнозом ХА легкого ступеня тяжкості") відноситься до стадії ХА, що характеризується оцінкою від 20 до 26 балів за шкалою ММ5Е.
Термін "хвороба Альцгеймера легкого або помірного ступеня тяжкості" або "ХА легкого або помірного ступеня тяжкості" у даному документі відноситься як до легкої, так і до помірної ХА, і характеризується оцінкою від 18 до 26 балів за шкалою ММ5Е.
Термін "хвороба Альцгеймера помірного ступеня тяжкості" або "ХА помірного ступеня тяжкості" у контексті даного документа (наприклад, "пацієнт з діагнозом ХА помірного ступеня тяжкості") відноситься до стадії ХА, яка характеризується оцінкою від 18 до 19 балів за шкалою
ММ5Е.
Термін "ММ5Е" відноситься до короткої шкали оцінки психічного статусу, яка забезпечує оцінку в діапазоні від 1 до 30 балів. Див. ЕРоївіеїп, еї а!., 1975, У. Рзусніаїг. Без. 12:189-98. Оцінки 26 балів і нижче, як правило, вважаються ознакою дефіциту. Чим нижче бальна оцінка за шкалою ММ5Е, тим більше в обстеженого пацієнта виражений дефіцит або погіршення у порівнянні з іншим індивідом з більше низькою оцінкою. Збільшення оцінки за шкалою ММ5Е свідчить про поліпшення стану пацієнта, у той час як зниження оцінки за шкалою ММ5Е може означати погіршення стану пацієнта.
У даному документі термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної забезпечувати репродукцію іншої, пов'язаної з нею нуклеїнової кислоти. Зазначений термін включає вектор, що знаходиться у вигляді самореплікуючої нуклеїнової кислоти, а також вектор, здатний впроваджуватися в геном клітини-хазяїна, в яку його вводять. Деякі вектори здатні керувати експресією нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори у даному документі називають "експресійними векторами".
ІІ. Композиції та способи
У даному винаході запропоновані антитіла, що зв'язують тау-білок. У деяких варіантах реалізації антитіло, яке запропоноване у даному документі, зв'язує мономерний тау-білок людини з Ко менше 1 нМ або менше 0,5 НМ. У деяких варіантах реалізації антитіло, яке запропоноване у даному документі, зв'язує тау-білок яванського макака з Ко менше 1 нМ або менше 0,5 НМ. У деяких варіантах реалізації Ко визначають за допомогою поверхневого плазмонного резонансу при 37 "С. У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом, що зв'язує тау-білок, зв'язує мономерний тау-білок, олігомерний тау-білок, нефосфорилований тау-білок і фосфорилований тау-білок. У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом зв'язується з епітопом у межах амінокислот 2-24 зрілого тау- білка людини. У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом зв'язується з епітопом у межах амінокислот 2-24 тау-білка та зв'язує мономерний тау-білок, олігомерний тау- білок, нефосфорилований тау-білок і фосфорилований тау-білок. У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язує епітоп тау-білка людини, що містить або складається з послідовності
АЕРВОЕРЕММЕОСНАСТМОІ СОАК (5ЕО ІО МО 2). У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язує епітоп тау-білка яванського макака, що містить або складається з послідовності
АЕРВОЕРОУММЕОРНАСТУИІ СОВК (5ЕО ІЮ МО 4). У деяких варіантах реалізації антитіло зв'язує епітоп тау-білка людини, що містить або складається З послідовності
АЕРВОЕРЕММЕОСНАСТМОСГ ЯОАК (5ЕО ІО МО:2) й епітоп тау-білка яванського макака, що містить або складається з послідовності АЕРЕОЄРОУММЕОСНАСТУИІ СОВК (5ЕО ІО МО:4).
У деяких варіантах реалізації антитіло, яке запропоноване у даному документі, зв'язується з епітопом у межах 19-33, 19-42, 37-51, 100-114, 118-132 або 172-177 амінокислот зрілого тау- білка людини. У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом зв'язується з епітопом у межах 19-33, 19-42, 37-51, 100-114, 118-132 або 172-177 амінокислот тау-білка та зв'язує мономерний тау-білок, олігомерний тау-білокю нефосфорилований тау-білок і фосфорилований тау-білок.
Антитіла згідно з даним винаходом можна використовувати, наприклад, для діагностики або лікування нейродегенеративних захворювань.
А. Приклади антитіл проти тау-білка
У деяких варіантах реалізації антитіло містить НМНА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:605; НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:606; і НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:607.
У деяких варіантах реалізації зазначене антитіло містить НМВ-І 1, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:608; НМВ-12, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:609;
БО і НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:610.
У деяких варіантах реалізації зазначене антитіло містить НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:605; НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:606;
НМУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:607; НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:608; НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО:6059; ії НУВ-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЖЕО 10 МО:610.
У будь-якому з вищевказаних варіантів реалізації антитіло проти тау-білка є гуманізованим.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить НМА згідно з будь-яким із вищевказаних варіантів реалізації та додатково містить акцепторний каркас людини, наприклад, каркас імуноглобуліну людини або консенсусний каркас людини.
В ще одному аспекті антитіло проти тау-білка містить послідовність варіабельного домена важкого ланцюга (УН), що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 Ую, 93 Уо, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності стосовно амінокислотної послідовності 5ХЕО ІЮ
МО: 340, 603, 614 або 619. У деяких варіантах реалізації МН-послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), інсерції або делеції у порівнянні з еталонною послідовністю, однак антитіло проти тау-білка, що містить зазначену послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з тау-білюком. У деяких варіантах реалізації замінені, вставлені та/або вилучені в цілому від 1 до 10 амінокислот з БЕО ІЮ МО:340, 603, 614 або 619. У деяких варіантах реалізації винаходу заміни, інсерції або делеції присутні в областях, розташованих поза НУВ (тобто у ЕВ).
Антитіло проти тау-білка необов'язково містить послідовність МН з 5ЕО ІО МО: 340, 603, 614 або 619, у тому числі посттрансляційні модифікації зазначеної послідовності. У конкретному варіанті реалізації винаходу МН містить одну, дві або три НМА, вибрані з: (а) НУМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:605, (р) НМУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО:606, і (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10
МО:607.
В ще одному аспекті антитіло проти тау-білка містить послідовність варіабельного домена легкого ланцюга (МІ), що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 о, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності стосовно амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ
МО:341, 604, 615 або 620. У деяких варіантах реалізації МІ - послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичність, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), інсерції або делеції у порівнянні з еталонною послідовністю, однак антитіло проти тау-білка, що містить зазначену послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з тау-білюком. У деяких варіантах реалізації замінені, вставлені та/або вилучені в цілому від 1 до 10 амінокислот з 5ЕО ІЮ МО:341, 604, 615 або 620. У деяких варіантах реалізації винаходу заміни, інсерції або делеції присутні в областях, розташованих поза НУВ (тобто у ЕВ).
Антитіло проти тау-білка необов'язково містить послідовність МІ з 5ЕО ІЮО МО: 341, 604, 615 або 620, у тому числі посттрансляційні модифікації зазначеної послідовності. У конкретному варіанті реалізації винаходу МІ містить одну, дві або три НМЕ, вибрані з: (а) НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:608, (Б) НМУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮ МО:609, і (с) НМВ-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО:610.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:603;
Ю) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:604; с) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:614; е) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:615;
І) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (є); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:619;
І) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІО МО:620; ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (ПН).
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить 5ЕО І МО:603; р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить 5ЕО ІЮ МО:б04; с) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить 5ЕО 10 МО:614; є) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить 5ЕО ІО МО:615;
І) МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (є); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить БЕО ІЮ МО:619;
Р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить 5ЕО ІЮ МО:620; ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (ПН).
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить варіабельну область важкого бо ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО І МО:603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО:604, 615 і 620. У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО І МО:340, 603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ МО:604, 615 і 620. У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ МО:603, 614 і 619; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО:341,604, 615 і 620.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 603, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 604; (Б) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 614, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 615; або (с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЕС
ІО МО: 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 620.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка містить (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:611 або 5ЕО ІО МО:612, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:613; (Б) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО:616 або 5ЕО І МО:617, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:618; або (с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зФЕО ІЮ МО:621 або 5ЕО ІОЮ МО:622, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:623.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:611 або 5ЕО ІЮ МО:612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:611, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО І МО:611 або 5ЕО ІЮО МО:612, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 560) ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО
ІО МО:611, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5260 ІЮ МО:613. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:612, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮО МО:613.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:616 або 5ЕО ІЮ МО:617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО:616, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:616 або 5ЕО ІЮО МО:617, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 560) ІЮ МО:618. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО
ІО МО:616, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5260 ІЮ МО:618. У 60 деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:617, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮО МО:618.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО І МО:621 або 5ЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:621, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:621 або 5ЕО ІЮО МО:622, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 560) ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білююм людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО
ІО МО:621, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5260 ІЮ МО:623. У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, причому зазначене антитіло містить важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:622, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності
ЗЕО ІЮ МО:623.
У додатковому аспекті даного винаходу запропоноване антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом, що й антитіло проти тау-білка, запропоноване у даному документі. Наприклад, у деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом, що й антитіло, вибране з 3703-НУ, пи3703-НЗ.м28.А4,. пи3703-НУ.м76, пи3703-НО.м83 і пи3703-
НУ.м93. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 2-24 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау- білка, що складається з амінокислот 7-24 5ЕО ІЮ МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 7-20 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 10-24 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 7-21 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 8-22 5ЕО ІЮО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента тау-білка, що складається з амінокислот 11-25 5ЕО ІО МО:2. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з одним або більше або всіма з наступних фрагментів тау-білка: 2-24, 7-24, 7-20, 10-24, 7-21, 8-22 і 11-25. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло, що зв'язується з пептидом, що містить послідовність 5ЕСО І МО:593, однак не зв'язується з пептидом, що містить послідовність 5ЕО ІЮ МО:596 або 5ЕО І МО:597.
У додатковому аспекті даного винаходу антитіло проти тау-білка згідно з будь-яким із вищезгаданих варіантів реалізації є моноклональним антитілом, включаючи химерне, гуманізоване антитіло або антитіло людини. В одному варіанті реалізації антитіло проти тау- білка являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Раб, Раб, всЕм, діатіло або Р(ар»2- фрагмент. В ще одному варіанті реалізації антитіло являє собою повнорозмірне антитіло,
БО наприклад, інтактне антитіло Ід або Ідс4, або антитіло, що відноситься до іншого класу або ізотипу, як визначено у даному документі.
У додатковому аспекті антитіло проти тау-білка згідно з будь-яким із вищезгаданих варіантів реалізації може мати будь-яку з характеристик окремо або в комбінації, як описано в розділах 1- 7 нижче. 1. Спорідненість антитіла
У деяких варіантах реалізації антитіло, запропоноване у даному документі, має константу дисоціації (Ко), що становить «х 1 мкМ, х 100 НМ, ТО НМ, «1 НМ, 0,1 НМ, «х 0,01 нМ або « 0,001
НМ (наприклад, 109М або менше, наприклад, від 109М до 10-7З3М, наприклад, від 109М до 10-
ЗМ).
У деяких варіантах реалізації Ко вимірюють за допомогою аналізу зв'язування антигена, міченого радіоактивною міткою (РІА). У деяких варіантах реалізації РІА виконують з використанням Рар-версії досліджуваного антитіла та його антигена. Спорідненість зв'язування
Бар з антигеном у розчині вимірюють шляхом врівноважування Бар з мінімальною концентрацією (125І)-міченого антигена у присутності серії розведень неміченого антигена, з наступним захопленням зв'язаного антигена за допомогою планшета з іммобілізованим антитілом проти Раб (див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881(1999)). Для визначення умов аналізу багатолункові планшети МІСВОТІТЕНО (Тнепто 5сієпійіс) покривали протягом ночі 5 мкг/мл антитіла для захоплення Раб (Сарре! Гарз) в 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокували 2 95 (мас./об.) розчином бичачого сироваткового альбуміну в
РВО протягом двох - п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 2370). У неадсорбуючому планшеті (Мипс 2269620) змішували 100 пМ або 26 пм Г25ІЦ-антигена з послідовно розведеними розчинами досліджуваних ар (наприклад, відповідно до оцінки антитіл Бар-12 проти ФРЕС у роботі Ргезіа єї аЇ., Сапсег Ве5. 57:4593-4599 (1997)). Потім досліджуваний Раб інкубували протягом ночі; у той самий час, інкубування могло тривати протягом більше тривалого періоду (наприклад, приблизно 65 годин) для гарантії досягнення рівноваги. Потім суміш переносили на планшет для захоплення й інкубували при кімнатній температурі (наприклад, протягом години). Потім видаляли розчин і вісім разів промивали планшет 0,1 95 полісорбатом-20 (ТМ/ЕЕМ-208)) у РВ5. Після висушування планшетів додавали 150 мкл сцинтилятора (МІСВО5СІМТ-20; РаскКага) на лунку та робили підрахунок планшетів на гамма-лічильнику ТОРСОШМТ"М (РаскКага) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Раб, що забезпечували зв'язування, менше або рівне 2095 від максимального, відбирають для застосування в конкурентному аналізі зв'язування.
Згідно з ще одним варіантом реалізації, Ко вимірюють з використанням аналізу ВІАСОНЕ? на основі поверхневого плазмонного резонансу. Наприклад, аналіз із використанням
ВІАСОНЕЗУ-2000 або ВІАСОНЕЄ-3000 (ВІАсоге, Іпс., Піскатауей, штат Нью-Джерсі, США) виконують при 25"С або 37С з чипами СМ5 з іммобілізованим антигеном при - 10 резонансних одиницях (РУ). У деяких варіантах реалізації біосенсорні чипи на основі карбоксиметилованого декстрану (СМ5, ВІАСОНЕ, Іпс.) активують гідрохлоридом М-етил-М'-(3- диметиламінопропіл)карбодіїміду (ЕЮС) ії М-гідроксисукцинімідом (МН) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ розчином ацетату натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (-0,2
МКМ) і вводять при швидкості потоку 5 мкл/хвилину, до досягнення приблизно 10 резонансних одиниць (РУ) зв'язаного білка. Після введення антигена вводять 1 М розчин етаноламіну для блокування непрореагувавших груп. Для вимірювань кінетики дворазові серійні розведення Бар (від 0,78 нМ до 500 нМ) вводять у РВ5 з 0,05 95 поверхнево-активною речовиною полісорбатом- 20 (ТМ/ЕЕМ-207М) (РВЗТ) при 25"С при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Коп) і дисоціації (Коє) розраховували за допомогою найпростішої моделі зв'язування
Ленгмюра при співвідношенні один до одного (програмне забезпечення ВІАСОВЕ ? Емаїчаїййоп
ЗоїПмаге версії 3.2) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації та дисоціації.
Рівноважну константу дисоціації (Ко) обчислюють як відношення Конк/Коп. Див., наприклад, Спеп еї аї., у. Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації згідно з вищеописаним аналізом поверхневого плазмонного резонансу перевищує 109 М' с", то її можна визначити за допомогою методики гасіння флуоресценції що вимірює збільшення або зниження інтенсивності випущення флуоресценції (порушення - 295 нм; випущення - 340 нм, смуга пропущення 16 нм) при «25 "С для 20 нМ розчину антитіл проти антигена (у формі Раб) у РВ5, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигена, вимірюваних на спектрометрі, наприклад, на спектрофотометрі з пристроєм зупинки потоку (Амім Іпзігитепів) або спектрофотометрі БІ М-АМІМСО "м 8000 серії (Тнептозресігопіс) з коветою, що перемішується. 2. Фрагменти антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у даному документі, являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіла включають Раб, Раб", Габ'-ЗН, Е(аб)», Ем і зсгм- фрагменти та інші фрагменти, описані нижче, але не обмежуються ними. Огляд деяких фрагментів антитіл див. у статті Нидзоп еї а. Маї. Меа. 9:129-134 (2003). Огляд фрагментів 5сЕм див., наприклад, у роботі Рішскіййп, ій Те РНаптасоіоду ої Мопосіопа! Апііроадієв5, мої. 113,
Возеприга апа Мооге еав., (Зргіпдег--Мепад, Мем МоїКк), рр. 269-315 (1994); див. також МО 93/16185; і патенти США Мо 5571894 і 5587458. Обговорення Раб і Р(аб)2-фрагментів, що містять залишки епітопу зв'язування рецептора реутилізації та мають збільшений період напівжиття іп мімо, див. у патенті США Мо 5869046.
Діатіла являють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язуючими сайтами, які можуть бо бути двовалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 404,097; М/О 1993/01161; Ниазоп еї аї., Маї. Мей. 9:1129-134 (2003); і НоїПпдег еї а!., Ргос. Маї)!. Асай. сі. ОБА 90:6444-6448 (1993).
Триатіла та тетратіла також описані у публікації Ниазоп еї а!., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, що повністю або частково містять варіабельний домен важкого ланцюга або повністю або частково містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах реалізації однодоменне антитіло являє собою однодоменне антитіло людини (ЮОЮотапії5, Іпс., Уолтем, штат Массачусетс, США; див., наприклад, патент США Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можна одержати різними способами, включаючи протеолітичний гідроліз інтактного антитіла, а також продукцію рекомбінантними клітинами-хазяїнами (наприклад, Е. сої або фагом), як описано у даному документі, але не обмежуючись ними. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
У деяких варіантах реалізації антитіло, запропоноване у даному документі, являє собою химерне антитіло. Деякі химерні антитіла описані, наприклад, у патенті США Мо 4816567; і
Могтізоп еї аї., Ргос. Май. Асай. Осі. ОБА, 81:6851-6855 (1984)). В одному прикладі химерне антитіло містить варіабельну область нелюдського походження (наприклад, варіабельну область, що має походження від антитіла миші, пацюка, хом'яка, кролика або примата, що не є людиною, наприклад, мавпи) і константну область людини. В ще одному прикладі химерне антитіло являє собою антитіло з "переключеним класом", в якому змінений клас або підклас у порівнянні з батьківським антитілом. Термін "химерні антитіла" включає антигензв'язуючі фрагменти таких антитіл.
У деяких варіантах реалізації химерне антитіло є гуманізованим антитілом. Як правило, антитіло нелюдського походження гуманізують з метою зниження імуногенності для людини, зберігаючи при цьому специфічність та спорідненість вихідного антитіла нелюдського походження. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або більше варіабельних доменів, у яких НМА, наприклад, СОМ (або їх фрагменти) походять від антитіла нелюдського походження, а ЕВ (або їх фрагменти) походять від послідовностей антитіла людини. У деяких випадках гуманізоване антитіло також може містити щонайменше фрагмент константної області антитіла людини. У деяких варіантах реалізації деякі ЕВ-залишки в гуманізованому антитілі заміняють відповідними залишками антитіла нелюдського походження (наприклад, антитіла, з якого отримані залишки НУРВ), наприклад, з метою відновлення або поліпшення специфічності або спорідненості антитіла.
Гуманізовані антитіла та способи їх виготовлення розглянуті, наприклад, у публікації
АІтадго апа Егапеобоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008), і додатково описані, наприклад, у статтях Віесптапп еї аї., Майте 332:323-329 (1988); Оцееп еї аї., Ргос. Маг! Асай. 5сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патентах США Мо 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 і 7,087,409; Казптіткі єї а!І., Меїноадз 36:25-34 (2005) (де описане пересадження областей, що визначають специфічність (5ОВ)); Радіап, Мої. Іттипої. 28:489-498 (1991) (де описана "зміна поверхні"); БаІгАсдпа е6ї аї.,
Меїпоаз 36:43-60 (2005) (де описане "перетасування ЕВ"); й О5Брошт еї аї., Меїноаз 36:61-68 (2005) і Кіїтка еї а!., Вг. У. Сапсег, 83:252-260 (2000) (де описаний підхід "спрямованого відбору" до перетасування ЕВ).
Каркасні області людини, які можна використовувати для гуманізації, включають: каркасні області, вибрані за допомогою методики "найкращої відповідності" (див., наприклад, 5ітв5 еї аї.
У. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні області що мають походження від консенсусної послідовності антитіл людини конкретної підгрупи варіабельних областей легкого або важкого ланцюга (див., наприклад, Сапег еї аї. Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА, 89:4285 (1992); і Ргезіа еї аї. у.
Іттипої!., 151:2623 (1993)); зрілі (що містять соматичні мутації) каркасні області людини або ембріональні каркасні області людини (див., наприклад, АІтадго апа Егапе55оп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008)); і каркасні області, отримані при скринінгу бібліотек ЕВ (див., наприклад,
Васа еї аї., 9. Віої. Снет. 272:10678-10684 (1997) і Бозок еї аї., 9. Віої. Спет. 271:22611-22618 (1996)), але не обмежуються ними. 4. Антитіла людини
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у даному документі, являє собою антитіло людини. Антитіла людини можна одержати, використовуючи різні методики, відомі в даній області техніки. Антитіла людини загалом описані в статтях мап ріїкК апа мап де
ММіпКеї, Ситт. Оріп. Рнаптасої. 5:368-74 (2001) і Її опрегу, Ситт. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Антитіла людини можна одержати шляхом введення імуногена трансгенній тварині, модифікованій з метою продукції інтактних людських антитіл або інтактних антитіл з людськими варіабельними областями у відповідь на антигенну стимуляцію. Такі тварини, як правило, цілком або частково містять локуси імуноглобулінів людини, що заміщають ендогенні локуси 60 імуноглобулінів або локалізовані поза хромосомами або випадковим чином інтегровані в хромосоми тварини. Як правило, у таких трансгенних мишей інактивовані ендогенні локуси імуноглобулінів. Огляд способів одержання антитіл людини з трансгенних тварин див. в
Гопрего, Маї. Віотесп. 23:1117-1125 (2005). Крім того, див., наприклад, патенти США Мо 6075181 і 6150584, у яких описана технологія ХЕМОМОИБ5БЕ "М; патент США Мо 5770429, у якому описана технологія НитарФ; патент США Мо 7041870, у якому описана технологія К-М МОИШ5ЕФ, і публікації заявки на патент США Мо 5 2007/0061900, у якій описана технологія
МЕГОСІМОИШ5ЕФ). Варіабельні області людини з інтактних антитіл, які генеруються такими тваринами, можна додатково модифікувати, наприклад, шляхом об'єднання з іншою константною областю людини.
Антитіла людини можна одержати за допомогою способів на основі гібридом. Описані лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миші-людини для продукції моноклональних антитіл людини, (див., наприклад, Когбог у). Іттипої, 133:3001 (1984); Вгодеиг еї а)., Мопосіопа! Апіїроду
Ргодисіюп Тесппіднез апа Арріїсаїіоп5, рр. 51-63 (Магсе! Оеккег", Іпс., Мем/ МогК, 1987); і Воегпег еї аї., У. Іттипої, 147:86 (1991).) Антитіла людини, отримані за допомогою технології на основі
В-клітинної гібридоми людини, також описані в І і єї аї!., Ргос. Маї). Асай. осі. ОБА, 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи включають, наприклад, способи, описані у патенті США Ме 7189826 (де описана продукція моноклональних ІдМ-антитіл людини гібридомною клітинною лінією) і статті Мі, Хіапааії Міапуїхие, 26(4):265-268 (2006) (де описані гібридоми людини-людини).
Технологія на основі гібридоми людини (Тгіота іесппоіоду) також описана в статтях МоїЇтег5 апа Вгапаїеїп, Нізіоіоду апа Нізіораїйпоіоду, 20(3):927-937 (2005) і Мо тег» апа Вгапаїеєїнп, Меїноа5 апа Ріпаїпдз іп Ехрегітепіа! апа Сіїпіса! Рнаппасоїіоду, 27(3): 185-91 (2005).
Антитіла людини також можна одержати шляхом виділення Ему-клону послідовностей варіабельного домена, вибраних із бібліотек фагового дисплея людського походження. Такі послідовності варіабельного домена потім можна поєднувати з бажаними константними доменами людини. Методики відбору антитіл людини з бібліотек антитіл описані нижче. 5. Антитіла, отримані з бібліотек
Антитіла згідно з даним винаходом можна виділити шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек на предмет антитіл з бажаною активністю або активностями. Наприклад, в даній області техніки відомі різні способи одержання бібліотек фагового дисплея та скринінг таких бібліотек на предмет антитіл, що мають бажані характеристики зв'язування. Такі способи розглянуті, наприклад, у публікації Ноодепроот еї аї. їй Меїнодз іп Моїіесшаг Віоіоду 178:1-37 (О'Втієп еї аї!., єа., Нитап Ргез5, Тоїоула, МУ, 2001) і додатково описані, наприклад, у статтях
МеСапепу еї аї., Маїште 348:552-554; Сіаск5оп еї аї!., Мате 352:624-628 (1991); Магкз еї аї.,».
Мої. Віої. 222:581-597 (1992); Маїк5 апа Вгадригу, іп Меїноа5 іп Моїіесшіаг Віооду 248:161-175 (Го, єд., Нитап Ргев5, Тоїожа, МУ, 2003); 5ідни еї аї., У. Мої. Віо!. 338(2):299-310 (2004); І ее єї аї., У. Мої. Вісі. 340(5):1073-1093 (2004); РеїІПоизе, Ргос. Маї!. Асай 5сі. ОБА 101 (34): 12467-12472 (2004); і І ее евї аї., У. Іттипої. Меїтоаз 284(1-2):119-132 (2004).
У деяких способах на основі фагового дисплея репертуари МН- і МіІ-генів окремо клонують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і випадковим чином рекомбінують у фагових бібліотеках, які потім можна піддавати скринінгу на предмет антиген-сполучного фага, як описано в статті М/іпієг єї аї!., Апп. Неу. Іттипої, 12:433-455 (1994). Фаг зазвичай відображає фрагменти антитіла у вигляді одноланцюгових Ем-фрагментів (з3сЕм) або Рар-фрагментів.
Бібліотеки з імунізованих джерел дозволяють одержати антитіла з високою спорідненістю до імуногена без необхідності конструювання гібридом. В якості альтернативи, можна клонувати наївний репертуар (наприклад, людини) для одержання єдиного джерела антитіл до широкого спектра чужорідних антигенів й аутоантигенів без імунізації, як описано в статті Стінйне еї аї.,
ЕМВО У, 12:725-734 (1993). Нарешті, наївні бібліотеки можна також одержати шляхом синтезу, клонувати сегменти М-генів стовбурових клітин, що не зазнали реаранжування, (4 використовуючи ПЛР-праймери, що містять випадкові послідовності, для кодування гіперваріабельної області СОВЗ і здійснення реаранжування іп мйго, як описано в статті
Ноодепроот апа Уміпіег, 9. Мої. Віоі., 227:381-388 (1992). Патентні публікації, в яких описані фагові бібліотеки антитіл людини, включають, наприклад: патент США Мо 5750373 і патентні публікації США Мо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 і 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек антитіл людини, у даному документі вважаються антитілами людини або фрагментами антитіл людини. 6. Поліспецифічні антитіла
У деяких варіантах реалізації антитіло, запропоноване у даному документі, являє собою поліспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Поліспецифічні антитіла являють 60 собою моноклональні антитіла, які містять щонайменше два різні сайти специфічного зв'язування. У деяких варіантах реалізації винаходу один із сайтів специфічного зв'язування відноситься до тау-білка, а інший - до будь-якого іншого антигена. У деяких варіантах реалізації один із сайтів специфічного зв'язування відноситься до тау-білка, а інший - до бета-амілоїду. У деяких варіантах реалізації біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами тау-білка. Крім того, для локалізації цитотоксичних агентів в області клітин, які експресують тау-білок, можна застосовувати біспецифічні антитіла. Біспецифічні антитіла можна одержати у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.
Способи виготовлення поліспецифічних антитіл включають рекомбінантну спільну експресію двох пар важкий ланцюг - легкий ланцюг імуноглобуліну з різною специфічністю (див. МіЇвівїп апа Сиеїо, Маїшге 305:537 (1983)), УУО 93/08829, і ТташпескКег єї аІ., ЕМВО 4). 10:3655 (1991), й інженерію згідно зі стратегією "виступ-в-западину" (див., наприклад, патент США Мо 5731168).
Поліспецифічні антитіла також можна одержати за допомогою конструювання електростатичних напрямних ефектів для створення Ес-гетеродимерних молекул антитіл (М/О 2009/089004А1); перехресного зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (див., наприклад, патент США
Мо 4676980, і Вгеппап еї аї., бсівепсеє, 229:81 (1985)); використання лейцинових блискавок для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад, Ковзів!пу еї аї., у. Іттипої!., 148(5):1547-1553 (1992)); використання технології "діатіл" для виготовлення біспецифічних фрагментів антитіл (див. наприклад, НоїЇїпдег еї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 90:6444-6448 (1993)); і використання одноланцюгових Ем (5Ем)-диммерів (див., наприклад, Стпибег еї аї., у. Іттипої., 152:5368 (1994)); й одержання триспецифічних антитіл, описане, наприклад, в Тиїй еї аї. У. Іттипої. 147:60 (1991).
Сконструйовані антитіла, що містять три або більше функціональних антигензв'язуючих сайтів, включаючи "антитіла-восьминоги", також включені у даний документ (див., наприклад, 5 2006/0025576А1).
У даному документі антитіло або фрагмент також включає "РАБ подвійної дії" або "САЕ" що містить антигензв'язуючий сайт, що зв'язується з тау-білком, а також з ще одним, який відрізняється від нього, антигеном (див., наприклад, 05 2008/0069820). 7. Варіанти антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу розглядаються варіанти амінокислотних послідовностей антитіл, запропонованих у даному документі. Наприклад, може бути бажаним поліпшення спорідненості та/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можна одержати шляхом внесення відповідних модифікацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу.
Такі модифікації включають, наприклад, делеції й/або інсерції талабо заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Для одержання кінцевого конструкта можна внести будь-яку комбінацію делецій, інсерцій та замін за умови, що кінцевий конструкт має бажані характеристики, наприклад, зв'язування з антигеном. а) Варіанти замін, інсерцій та делецій
У деяких варіантах реалізації пропонуються варіанти антитіл, що містять одну або більше амінокислотні заміни. Сайти, що представляють інтерес для замісного мутагенезу, включають
НМВ і ЕВ. Консервативні заміни наведені в таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Більше істотні зміни наведені в таблиці 1 під заголовком "типові заміни" і докладно описані нижче щодо класів бічного ланцюга амінокислот. У досліджуване антитіло можна впровадити амінокислотні заміни і досліджувати продукти за допомогою скринінгу на предмет бажаної активності, наприклад, збереження/поліпшення зв'язування антигена, зниження імуногенності або поліпшення АЮСС або СОС.
Таблиця 1
Таблиця 1
Амінокислоти можна згрупувати за загальними властивостями бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, І еи, Не; (2) нейтральні гідрофільні: Сув, 5ег, ТНг, Авп, іп; (3) кислі: А5р, Си; (4) основні: Нів, І ув, Агу; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: СіІу, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Гуг, РНе.
Неконсервативні заміни призводять до заміни представника одного з цих класів на представника іншого класу.
Один тип варіантів, отриманих шляхом заміни, включає заміну одного або більше залишків гіперваріабельної області вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Як правило, отриманий(і) варіант(и), відібрані для подальшого дослідження, характеризуються модифікаціями (наприклад, поліпшенням) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищеною спорідненістю, зниженою імуногенністю) у порівнянні з вихідним антитілом і/або в значній мірі зберігають певні біологічні властивості вихідного антитіла.
Типовий варіант, отриманий шляхом заміни, являє собою антитіло з дозрілою спорідненістю, яке легко одержати, наприклад, з використанням методик дозрівання спорідненості на основі фагового дисплея, наприклад, описаних у даному документі. Коротенько, один або декілька залишків НМА мутують та варіантні антитіла піддають фаговому дисплею та скринінгу на предмет конкретної біологічної активності (наприклад, спорідненості зв'язування).
Модифікації (наприклад, заміни) можна внести в НМА, наприклад, для поліпшення спорідненості антитіла. Такі модифікації можна внести в "гарячі точки" НМЕ, тобто залишки, які кодуються кодонами, з високою частотою, що зазнають мутацій під час соматичного дозрівання (див., наприклад, Спожанигу, МеїШоайв5 Мої. ВіоІї. 207:179-196 (2008)), і/або залишки, які контактують з антигеном, при цьому отриманий варіант УН або МІ тестують на спорідненість зв'язування. Дозрівання спорідненості шляхом конструювання та повторного відбору з вторинних бібліотек описане, наприклад, в Ноодепроот еї аї. іп Меїпоаз іп Моїесшіаг Віоіоду 178:1-37 (О'Вгтієп еї аї., ед., Нитап Ргез5, Тоїоула, МУ, (2001)). У деяких варіантах реалізації дозрівання спорідненості вносять різноманітність у варіабельні гени, вибрані для дозрівання, будь-яким із різних способів (наприклад, ПЛР зниженої точності, перетасування ланцюгів або олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу). Потім створюють вторинну бібліотеку. Після цього бібліотеку піддають скринінгу з метою ідентифікації будь-яких варіантів антитіл, що мають бажану спорідненість. Ще один спосіб внесення різноманітності включає НМЕ-спрямовані підходи, в яких рандомізують декілька залишків НУК (наприклад, 4-6 залишків одночасно).
Залишки НУВ, що беруть участь у зв'язуванні антигена, можна специфічно визначити, наприклад, за допомогою мутагенезу з аланіновим скануванням або моделювання. Зокрема, мішенями часто є СОВ-НЗ і СОВ-Ї 3.
У деяких варіантах реалізації винаходу заміни, інсерції або делеції можуть виникати в одній або більше НМА за умови, що такі модифікації по суті не знижують здатність антитіла до зв'язування антигена. Наприклад, в НМА можна ввести консервативні модифікації (наприклад, консервативні заміни, як запропоновано у даному документі), які не знижують спорідненість у значній мірі. Такі зміни можуть бути, наприклад, за межами контактуючих з антигеном залишків в НМА. У деяких варіантах реалізації варіантів УН- і МІ - послідовностей, запропонованих вище, кожна НМВ є немодифікованою або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
Підходящий спосіб для ідентифікації залишків або областей антитіла, які можуть бути мішенями для мутагенезу, називається "аланін-скануючим мутагенезом", як описано в статті
Сиппіпднат апа Умеїїз (1989) бсіепсе, 244:1081-1085. У даному способі виявляють залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, наприклад, аго, азр, Пів, Туз і діш) і заміщають їх нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами (наприклад, аланіном або поліаланіном) з метою визначити, чи впливає це на взаємодію антитіла з антигеном. В амінокислотні положення, що демонструють функціональну чутливість до первісної заміни, можна ввести подальші заміни. В альтернативному або додатковому варіанті формують кристалічну структуру антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом й антигеном. Такі контактні залишки і сусідні залишки можна піддавати спрямованому впливу або виключати з кандидатів для заміни. Варіанти можна піддавати скринінгу з метою визначення наявності в них бажаних властивостей.
Інсерції в амінокислотну послідовність включають М- і/або С-кінцеві гібриди довжиною від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції одного або множини амінокислотних залишків усередині послідовності. Приклади кінцевих інсерцій включають антитіло з М-кінцевим залишком метіоніну. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають приєднання до М- або С-кінця антитіла ферменту (наприклад, для АОЕРТ) або поліпептиду, що збільшує період напівжиття антитіла в сироватці.
Б) Варіанти глікозилювання
У деяких варіантах реалізації антитіло, запропоноване у даному документі, модифікують з метою збільшення або зменшення ступеня глікозилювання антитіла. Додавання або делецію сайтів глікозилювання в антитілі легко здійснити шляхом модифікації амінокислотної послідовності, що призводить до створення або видалення одного або більше сайтів глікозилювання.
Якщо антитіло містить Ес-область, то можна модифікувати вуглевод, приєднаний до неї.
Нативні антитіла, які продукуються клітинами ссавців, зазвичай містять розгалужений двохантенарний олігосахарид, зазвичай приєднаний за допомогою М-зв'язку до А5зп297 у СН2- домені Ес-області. Див., наприклад, МУУгідні еї аі. ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Зазначений олігосахарид може містити різні вуглеводи, наприклад, маннозу, М-ацетилглюкозамін (С1іІСМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до СісМАс в "стеблі" двохантенарної олігосахаридної структури. У деяких варіантах реалізації можна виконати модифікації олігосахариду в антитілі згідно з даним винаходом з метою створення варіантів антитіл з певними поліпшеними властивостями.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані варіанти антитіл, що містять вуглеводну структуру з недостатньою кількістю фукози, приєднаної (безпосередньо або побічно) до Ес-області. Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може становити від 1 95 до 8095, від 195 до 65 95, від 5 95 до 65 95 або від 20 95 до 40 95. Кількість фукози визначають шляхом розрахунку середньої кількості фукози у вуглеводному ланцюзі при Азп297 щодо суми всіх вуглеводних структур, приєднаних до Азп 297 (наприклад, складних гібридних структур з високим вмістом маннози), виміряної за допомогою МАГ! 0І-ТОЕ-мас-спектрометрії, як описано, наприклад, у УУХО 2008/077546. Азп297 відноситься до залишку аспарагіну, розташованого приблизно у положенні 297 в Ес-області (ЕС-нумерація залишків Ес-області); проте, Азп297 також може бути розташований на відстані приблизно «х З амінокислот до або після положення 297, тобто, між положеннями 294 і 300, враховуючи незначні варіації послідовності в антитілах.
Такі варіанти фукозилювання можуть мати поліпшену АЮОСС-функцію. Див., наприклад, патентні публікації США Мо 05 2003/0157108 (Ргезіа, І.); 05 2004/0093621 (Куома НакКккКо Кодуо Со., (а).
Приклади публікацій, пов'язаних з "дефукозилованими" або "фукозодефіцитними" варіантами антитіла, включають: О5 2003/0157108; МО 2000/61739; МО 2001/29246; 005 2003/0115614; 05 2002/0164328; 05 2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 005 2004/0110282; 05
Бо 2004/0109865; УУО 2003/085119; М/о 2003/084570; МО 2005/035586; УМО 2005/035778;
МО2005/053742; МО2002/031140; ОкКалакі еї аї. У. Мої. ВіоІ. 336:1239-1249 (2004); Матапе-
Оппикі еї аїЇ. Віоїесп. Віоепуд. 87:614 (2004). Приклади ліній клітин, здатних продукувати дефукозиловані антитіла, включають клітини Гес13 СНО, дефектні за фукозилюванням білків (Вірка єї аї. Ап. Віоспет. Віорпуз. 249:533-545 (1986); патентна заявка США Мо 05 2003/0157108 АТ, Ргевіа. І; ії М/О 2004/056312 АТ, Адатз есеї аЇ., особливо Приклад 11), і лінії клітин з нокаутом, наприклад, клітини СНО з нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферази
ЕОТВ, (див., наприклад, Матапе-ОНпикі еї аї. Віоїесп. Віоепа. 87:614 (2004); Капаа, У. еї аї.,
Віоїеснпо!. Віоепо., 94(4):680-688 (2006); і М/О2003/085107).
Крім того, запропоновані варіанти антитіл з олігосахаридами, розділеними навпіл, 60 наприклад, у яких двохантенарний олігосахарид, приєднаний до Ес-області антитіла, розділений за сСісМАс. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися зниженим фукозилюванням і/або поліпшеною АЮСС-функцією. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, у УМО 2003/011878 (Уеап-Маїгеї єї а!.); патент США Мо 6602684 (тапа еї а); ії 05 2005/0123546 (Штапа еї аї.). Крім того, запропоновані варіанти антитіл із щонайменше одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до Ес-області. Такі варіанти антитіл можуть мати поліпшену СОС-функцію. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, у М/О 1997/30087 (Раїе! єї аІ.); УМО 1998/58964 (Раїси, 5.); і МО 1999/22764 (Ва/|с, 5.). с) Варіанти Ес-області
У деяких варіантах реалізації винаходу в Ес-область антитіла, запропонованого у даному документі, можна ввести одну або більше з амінокислотних модифікацій, тим самим одержуючи варіант Ес-області. Варіант Ес-області може містити послідовність Ес-області людини (наприклад, Ес-області Ідс1, Іде, ДСЗ або ІдД24 людини) амінокислотну модифікацію, що містить (наприклад, заміну) в одному або більше амінокислотних положеннях.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу розглянутий варіант антитіла, що має деякі, але не всі ефекторні функції, що робить його бажаним кандидатом для варіантів застосування, при яких важливий період напівжиття антитіла іп мімо, а деякі ефекторні функції (наприклад, комплемент й АОСС) не потрібні або шкідливі. Для підтвердження зниження/ослаблення СОС- й/або АОСсС-активності можна виконати аналіз цитотоксичності іп міго й/або іп мімо. Наприклад, щоб переконатися у відсутності зв'язування антитіла з Есуй (і, отже, відсутності АЮСО- активності) при збереженні здатності зв'язування з ЕсВп можна виконати аналіз зв'язування Ес- рецептора (Ес). Основні опосередковуючі АЮСС клітини - МК-клітини - експресують тільки
ЕсуВіШ, у той час як моноцити експресують ЕсуНі, ЕсуВі!І ії ЕсуВіІїї. Зведена інформація про експресію ЕС! на кровотворних клітинах наведена в Таблиці З на сторінці 464 статті Намеїсн апа Кіпеї, Аппи. Веу. Іттипої. 9:457-492 (1991)). Необмежуючі приклади аналізу іп міто для оцінки АЮСсС-активності досліджуваної молекули описані у патенті США Мо 5500362 (див., наприклад, Неївігот, І. єї а). Ргос. Маї! Асай. 5сі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) і НеїІвігот, І еї аї.,
Ргос. Маї"! Асай. Зсі. ОБА 82:1499-1502 (1985); 5821337 (див. Вгиддетапп, М. еї аї., У. Ехр. Мед. 166:1351-1361 (1987)). В альтернативному варіанті можна використовувати аналізи, не пов'язані з використанням радіоактивних речовин (див., наприклад, аналіз цитотоксичності АСТІ"М для проточної цитометрії без використання радіоактивних речовин (СеїІГесппоіоду, Іпс. Маунтін-в'ю, штат Каліфорнія, США; й аналіз цитотоксичності СуїоТох9бФ без використання радіоактивних речовин (Рготеда, Медісон, штат Вісконсін, США). Ефекторні клітини, придатні для такого аналізу, включають мононуклеари периферичної крові (МКПК) і природні кілери (МК). В альтернативному або додатковому варіанті АЮСбС-активність речовини, що представляє інтерес, можна оцінити іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, наприклад, описаній у публікації
Сіупе5 еї а). Ргос. Маї! Асай. 5сі. ОБА 95:652-656 (1998). Крім того, можна виконати аналіз зв'язування С14 з метою підтвердження нездатності антитіла зв'язувати Са і, отже, відсутності
СОб-активності. Див., наприклад, твердофазний ІФА зв'язування Сід і СЗс у УУ/О 2006/029879 і
МО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу можна виконати аналіз СОС (див., наприклад, Салапо-Запіого еї аї. У. Іттипої. Меїпоаз 202:163 (1996); Стадо, М.5. еї аї., Віоса 101:1045-1052 (2003); ії Стада, М.5. апа М. 9. Сіеппівє, Віоса 103:2738-2743 (2004)). Крім того, можна визначити зв'язування та виведення/період напівжиття ЕсАп іп мімо з використанням способів, відомих в даній області техніки (див., наприклад, Реїкома, 5. В. єї аї., ІпгІ. Іттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла із заміною одного або більше залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 Рс-області (патент США Мо 6737056). Такі Ес- мутанти включають Ес-мутантів із замінами у двох або більше амінокислотних положеннях 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так звані Ес-мутанти "САМА" із заміною залишків 265 і 297 на аланін (патент США Мо 7332581).
Описані деякі варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням з ЕсВ. (див., наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312, і ЗНівіаз еї аї., 9. Вісі. Снет. 9(2):6591- 6604 (2001).)
У деяких варіантах реалізації варіант антитіла містить Ес-область з однією або більше амінокислотними замінами, що поліпшують АОСС, наприклад, замінами у положеннях 298, 333 і 334 Ес-області (ЕС-нумерація залишків).
У деяких варіантах реалізації вносять зміни в Рс-область, що призводить до зміни (тобто поліпшення або зниження) зв'язування Сід і/або комплемент-залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано у патенті США Мо 6194551, МО 99/51642 й Ідивзодіє еї аї. У. Іттипої. 164:4178-4184 (2000).
Антитіла зі збільшеним періодом напівжиття та поліпшеним зв'язуванням з неонатальним
Ес-рецептором (ЕсВп), який відповідає за передачу Ід матері плоду (Спуег еї аї., у. Іттипої. 117:587 (1976) і Кіт еї аї., у. Іттипої!. 24:249 (1994)), описані в О52005/0014934А1 (Ніпіоп еї аї!.).
Зазначені антитіла містять Ес-область з однією або більше замінами, які поліпшують зв'язування Ес-області з ЕсАп. Такі варіанти Ес включають варіанти із замінами одного або більше залишків Ес-області:238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 або 434, наприклад, заміною залишку 434 Ес-області (патент США Мо 7371826).
Інші приклади варіантів Ес-області див. також в Юипсап 5 М/іпівег, Майте 322:738-40 (1988); патенті США Мо 5648260; патенті США Мо 5624821; і заявці МО 94/29351, що стосується інших прикладів варіантів Ес-області. а) Варіанти антитіл, створені шляхом введення цистеїну
У деяких варіантах реалізації може бути бажаним створення антитіл, сконструйованих з використанням залишків цистеїну, наприклад, "(іомМАБ", у яких один або більше залишків антитіла заміщені залишками цистеїну. У конкретних варіантах реалізації винаходу заміщені залишки розташовані в доступних сайтах антитіла. У результаті заміщення зазначених залишків цистеїном у доступних ділянках антитіла розташовуються реакційноздатні тіольні групи, які можна використовувати для кон'югування антитіла з іншими групами, наприклад, лікарськими речовинами або групами "лінкер-лікарська речовина" з одержанням імунокон'югату, як додатково описано у даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу можна замінити на цистеїн один або більше з наступних залишків: У205 (нумерація за Кабраї) легкого ланцюга;
А118 (ЕС-нумерація) важкого ланцюга; і 5400 (ЕС-нумерація) Ес-області важкого ланцюга.
Антитіла, сконструйовані з використанням залишків цистеїну, можна одержати, як описано, наприклад, у патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване у даному документі, можна додатково модифікувати шляхом введення додаткових небілкових фрагментів, відомих в даній області техніки і легко доступних. Фрагменти, придатні для одержання похідних антитіла, включають водорозчинні полімери, але не обмежуються ними. Необмежуючі приклади водорозчинних полімерів включають поліетиленгліколь (ПЕГ), співполімери етиленгліколя та пропіленгліколя, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (гомополімери або випадкові співполімери) і декстран або полі(п- вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколя, співполімери пропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетиловані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт й їх суміші, але не обмежуються ними. Пропіоновий альдегід поліетиленгліколя може мати переваги при виробництві через його стабільність у воді. Зазначений полімер може мати будь-яку молекулярну масу та бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість молекул полімеру, приєднаних до антитіла, може мінятися, і при приєднанні більше ніж одного полімеру вони можуть являти собою однакові або різні молекули. У цілому, кількість та/або тип полімерів, які застосовують для одержання похідних, можна визначити з урахуванням факторів, що включають конкретні властивості або функції антитіл, що підлягають поліпшенню, можливість застосування похідних антитіла в терапії за певних умов і т. п., але не обмежуваних цим.
В ще одному варіанті реалізації винаходу пропонуються кон'югати антитіла та небілкового фрагмента, які можна селективно нагрівати за допомогою опромінення. В одному варіанті реалізації небілюовий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї а!., Ргос. Маї!. Асай. зЗсі. ОБА 102:11600-11605 (2005)). Довжина хвилі випромінювання може бути будь-якою та включає довжини хвиль, що не ушкоджують звичайні клітини, але нагрівають небілковий фрагмент до температури, що викликає загибель клітин, розташованих поблизу від антитіла з небілковим фрагментом.
В. Рекомбінантні методики і композиції
Антитіла можна одержати з використанням рекомбінантних методик і композицій, наприклад, як описано у патенті США Мо 4816567. У деяких варіантах реалізації запропонована виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло проти тау-білка, описане у даному документі.
Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить МІ, і/або амінокислотну послідовність, що містить УН антитіла (наприклад, легкий та/або важкий ланцюги антитіла). У додатковому варіанті реалізації запропоновані один або більше векторів (наприклад, експресійних векторів), що містять таку нуклеїнову кислоту. У додатковому варіанті реалізації запропонована клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту. В одному з таких 60 варіантів реалізації клітина-хазяїн містить (наприклад, трансформована): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить Мі антитіла, і амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла, або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить Мі антитіла, і другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла. У деяких варіантах реалізації винаходу клітина-хазяїн є еукаріотичною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'яка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, клітиною МО,
М50, 5ра20). У деяких варіантах реалізації запропонований спосіб одержання антитіла проти тау- білка, причому зазначений спосіб включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, запропоноване вище, в умовах, придатних для експресії антитіла, і, у деяких випадках, виділення антитіла з клітини-хазяїна (або середовища, в якому культивують клітину-хазяїна).
Для рекомбінантної продукції антитіла проти тау-білка нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, наприклад, як описано вище, є виділеною та вставлена в один або більше векторів для подальшого клонування й/або експресії в клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту легко виділити і секвенувати з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, здатних специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла).
Клітини-хазяїни, придатні для клонування або експресії векторів, які кодують антитіло, включають прокаріотичні або єукаріотичні клітини, описані у даному документі. Наприклад, антитіла можна продукувати у бактеріях, зокрема, якщо глікозилювання та Ес-ефекторні функції не є необхідними. Експресію фрагментів антитіла та поліпептидів у бактеріях див., наприклад, у патентах США Мо 5648237, 5789199 і 5840523. (Див. також Спапоп, Меїйосдз іп Моїіесшіаг
Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. Го, еєд., Нитапа Ргевз5, Тоїоула, МУ, 2003), рр. 245-254, де описана експресія фрагментів антитіла в Е. соїї). Після експресії антитіла можна виділити з бактеріальної біомаси в розчинну фракцію та піддавати подальшому очищенню.
На додаток до прокаріотів, хазяїнами, придатними для клонування або експресії векторів, які кодують антитіло, є еукаріотичні мікроорганізми, наприклад, міцеліальні гриби або дріжджі, у тому числі штами грибів і дріжджів з "гуманізованими" шляхами глікозилювання, які дозволяють одержувати антитіло з частково або повністю людською моделлю глікозилювання. Див.
Сегпдгоз5, Маї. Віоїесн. 22:1409-1414 (2004) і | ї еї а!., Маї. Віотесі. 24:210-215 (2006).
Придатні для експресії глікозилованого антитіла клітини-хазяїни також можна одержати з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Виявлені численні штами бакуловірусів, які можна використовувати в комбінації з клітинами комах, особливо для трансфекції клітин 5родорієга
З5 Мидірегаа.
Крім того, в якості хазяїнів можна використовувати культури клітин рослин. Див., наприклад, патенти США Мо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (де описана технологія
РІГ АМТІВООІЕ5 "М для продукції антитіл у трансгенних рослинах).
Крім того, в якості хазяїнів можна використовувати клітини хребетних. Наприклад, можна використовувати лінії клітин ссавців, адаптовані до росту в суспензії. Інші приклади підходящих ліній клітин-хазяїнів ссавців являють собою лінію клітин нирки мавпи СМУ1, трансформованих
ЗУ40 (СО5-7); ембріональну лінію клітин нирки людини (клітини 293 або 293, як описано, наприклад, у статті Станат еї аї., )У. Сеп Міго!ї. 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (клітини ТМ4, як описано, наприклад, у статті Маїнег, Віої. Нергоа. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕНО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки пацюка лінії биїаю (ВА ЗА); клітини легенів людини (М/138); клітини печінки людини (Нер С2); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТВІ, як описано, наприклад, у статті МаїНег єї а. Аппаї!5 М. У. Асай. 5сі. 383:44-68 (1982); клітини МАО 5; і клітини
Е54. Інші підходящі лінії клітин-хазяїнів ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), у тому числі клітини ОНЕВ: СНО (пашь еї а!., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 77:4216 (1980)); і лінії мієломних клітин, наприклад, МО, М5О ї 5р2/0. Огляд деяких ліній клітин-хазяїнів ссавців, придатних для продукції антитіл, див., наприклад, в Магакі апа Уми, Меїнод іп МоїІесшіаг Віоіоду,
Мої. 248 (В.К.С. 1 о, єда., Нитапа Ргевз5, Тоїоумла, МУ), рр. 255-268 (2003).
С. Аналізи
Антитіла проти тау-білка, запропоновані у даному документі, можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або дослідженню їх фізичних/хімічних властивостей та/або біологічної активності за допомогою різних аналізів, відомих в даній області техніки. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
В одному аспекті досліджують антигензв'язуючу активність антитіла згідно з даним винаходом, наприклад, за допомогою відомих способів, наприклад, твердофазного ІФА, вестерн-блоттингу та т. п.
В ще одному аспекті для виявлення антитіла, що конкурує з антитілом, описаним у даному документі, за зв'язування з тау-білююом, можна використовувати конкурентні аналізи. У деяких варіантах реалізації таке конкуруюче антитіло зв'язується з тим самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), який зв'язує антитіла 3703-НОУ, пи3703-НО.м28.А4, пи3703-НУ.м76, пи3703-НУ.м83 або пи3703-НО.м93. Докладні типові способи картування епітопу, з яким зв'язується антитіло, представлені в Моїтіх (1996) "Еріоре Марріпу Ргоїосо!5", іп Мешоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргезз, Тоїоула, МУ).
У типовому конкурентному аналізі іммобілізований тау-білок (наприклад, мономерний тау- білок) інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з тау-білком (наприклад, будь-яке з антитіл, описаних у даному документі, таких як пи3703-НО.м28.АХ4), і друге немічене антитіло, яке тестоване на предмет здатності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з тау-білюком. Друге антитіло може бути присутнім у супернатанті гібридоми. В якості контролю іммобілізований тау-білок інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, але не містить друге немічене антитіло. Після інкубування в умовах, що допускають зв'язування першого антитіла з тау-білюом, видаляють надлишок незв'язаного антитіла та вимірюють кількість мітки, пов'язаної з іммобілізованим тау-білком. Якщо кількість мітки, пов'язаної з іммобілізованим тау-білком, суттєво знижена в аналізованому зразку у порівнянні з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з тау-білком. Див. Нагпом апа Іапе (1988) Апіїрбодієв: А І арогаїюгу Мапиаї сн. 14 (Соїа 5ргіпд Нагбог І арогаїогу, Соїа 5ргіпуд Нагброг, МУ). 2. Аналізи активності
В одному аспекті запропоновані аналізи для ідентифікації антитіл проти тау-білка (наприклад, проти будь-якої форми тау-білка), що мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, зв'язування таких антитіл з множинними формами тау- білка (наприклад, мономерним тау-білюком, олігомерним тау-білююм, нефосфорилованим тау- білком і фосфорилованим тау-білком) та зниження рівня тау-білка (наприклад, загального тау- білка, загального розчинного тау-білка, розчинного нефосфорилованого тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного нефосфорилованого тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок, у головному мозку, например, у корі головного мозку та/або гіппокампі). У даному винаході також запропоновані антитіла, що мають таку біологічну активність іп мімо й/або іп мійго.
У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом тестують на предмет такої біологічної активності. Наприклад, для виявлення зв'язування антитіл проти тау-білка у відділах головного мозку та, наприклад, з нейрофібрилярними клубками у головному мозку трансгенних мишей можна використовувати тваринну модель таупатії, наприклад, тау-трансгенних мишей (наприклад, РЗОТ1І). Крім того, тваринну модель таупатії, наприклад, тау-трансгенних мишей (наприклад, РЗОТІ), можна обробити антитілами проти тау-білка, і для оцінки здатності такої обробки знижувати рівень тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, розчинного нефосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, нерозчинного нефосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) у головному мозку миші (наприклад, в корі головного мозку та/або гіппокампі) можна використовувати експериментальні методики, відомі в даній області техніки.
Юр. Імунокон'югати
У даному винаході також запропоновані імунокон'югати, що містять антитіло проти тау-білка, описане у даному документі, кон'юговане з одним або більше терапевтичними агентами або радіоактивними ізотопами.
У деяких варіантах реалізації винаходу імунокон'югат містить антитіло, описане у даному документі та кон'юговане з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'югату. Для одержання радіокон'югатів доступні різноманітні радіоактивні ізотопи. Приклади включають А", 1191, | 125,
У2о Ве!86 Ве88, т! Віг12, рзг, ррги2 і радіоактивні ізотопи І и. У випадку, якщо імунокон'югат застосовують для виявлення, він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад, їс99т або 1123, або спінову мітку для візуалізації за допомогою 60 ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відомої як магнітно-резонансна візуалізація, МРВ),
наприклад, йод-123, йод-131, індій-ІШ, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати антитіла можна виготовити, використовуючи різноманітні біфункціональні білок- зв'язуючі агенти, наприклад, М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), сукцинімідил- 4-(М-малеімідометил)циклогексан-і-карбоксилат (5МСОС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (наприклад, диметиладипімідат НС), активні ефіри (наприклад, дисукцинімідилсуберат), альдегіди (наприклад, глутаральдегід), біс-азидосполуки (наприклад, біс-(р-азидобензоїл) гександіамін), похідні біс-діазонія (наприклад, біс-(р-діазонійбензоїл)- етилендіамін), діззоціанати (наприклад, толуол-2,6б-діїззоціанат) і біс-активні сполуки фтору (наприклад, 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин можна одержати, як описано в роботі Мена еї аї!., Зсіепсе 238:1098 (1987). 1-Ізотіоціанатбензил-3- метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ЮОТРА), мічена вуглецем-14, являє собою типовий хелатуючий агент для кон'югування радіонуклеотиду з антитілом. Див. УУО94/11026.
Лінкер може являти собою "відщеплюваний лінкер", що полегшує вивільнення цитотоксичної лікарської речовини в клітині. Наприклад, можна використовувати кислоточутливий лінкер, пептидазочутливий лінкер, фоточутливий лінкер, диметильний лінкер або дисульфід-вмісний лінкер (СГаїгі еїаі!., Сапсег Без. 52:127-131 (1992); патент США Мо 5208020).
Під імунокон'югатами або АОС у даному документі безпосередньо розуміють такі кон'югати, отримані за допомогою перехресно зшиваючих реагентів, включаючи ВМР5, ЕМО5, СМВ5,
НВУ5, І 0-5МОС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, БІАВ, 5МОС, 5МРВ, З5МРН, сульфо-ЕМСО5, сульфо-
СМВ5, сульфо-КМО5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-5МОС і сульфо-ЗМРВ і 5У5В (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), які доступні для придбання (наприклад, у Рієгсе
ВіоїесНнпоіоду, Іпс., Рокфорд, штат Іллінойс, США), але не обмежуючись ними.
Е. Способи та композиції для діагностики і виявлення
У деяких варіантах реалізації винаходу будь-яке з антитіл проти тау-білка, запропонованих у даному керівництві, можна застосовувати для виявлення наявності тау-білка у біологічному зразку. У даному документі термін "виявлення" ("детекція") охоплює кількісне або якісне виявлення. У деяких варіантах реалізації біологічний зразок містить клітину або тканину, наприклад, цереброспинальну рідину, клітину або тканину головного мозку (наприклад, кори головного мозку або гіппокампа) або кров. У деяких варіантах реалізації біологічний зразок являє собою цереброспинальну рідину.
У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування в способі діагностики або виявлення. У додатковому аспекті запропонований спосіб виявлення наявності тау-білка у біологічному зразку. У деяких варіантах реалізації спосіб включає приведення біологічного зразка в контакт з антитілом проти тау-білка, як описано у даному документі, в умовах, що забезпечують зв'язування антитіла проти тау-білка з тау-білком, і виявлення утворення комплексу антитіла проти тау-білка з тау-білком. Такий спосіб можна здійснювати іп міо або іп мімо. Потім комплекс, утворений антитілом проти тау-білка та тау- білком у тестованому біологічному зразку, можна порівняти з комплексом, утвореним у контрольному біологічному зразку (наприклад, біологічному зразку здоровішого суб'єкта або суб'єктів). Кількість комплексу, утвореного антитілом проти тау-білка та тау-білком у тестованому біологічному зразку, також можна кількісно оцінити і порівняти з кількістю комплексу, утвореного у контрольному біологічному зразку (наприклад, біологічному зразку здоровішого суб'єкта або суб'єктіву або з середньою кількістю комплексу, що свідомо утворюється у здоровіших суб'єктів.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка застосовують для вибору суб'єктів, що підходять для лікування за допомогою антитіла проти тау-білка, наприклад, коли тау-білок є біомаркером для відбору пацієнтів. Наприклад, у деяких варіантах реалізації антитіло проти тау-білка (наприклад, проти будь-яких форм тау-білка) використовується для виявлення наявності захворювання або розладу, пов'язаного з тау-білком, у суб'єкта, або наявності високого ризику (або схильності) до захворювання або розладу, пов'язаного з тау-білком, у суб'єкта.
Типові захворювання або розлади, які можна діагностувати за допомогою антитіла згідно з даним винаходом, включають захворювання або розлади, асоційовані з тау-білком, і захворювання або розлади, викликані або асоційовані з утворенням нейрофібрилярних клубків або нейропільних ниток. У деяких варіантах реалізації захворювання або розлади, які можна діагностувати за допомогою антитіла згідно з даним винаходом, включають захворювання або розлади, асоційовані з тау-білююм, які проявляються порушенням або втратою когнітивних функцій, у тому числі логічного мислення, здатності до прийняття ситуаційних розв'язків, ємності 60 пам'яті, навченості та/або специфічної навігації. Зокрема, захворювання або розлади, які можна діагностувати за допомогою антитіла згідно з даним винаходом, включають таупатії, наприклад, нейродегенеративні таупатії. У деяких варіантах реалізації захворювання або розлади, які можна діагностувати за допомогою антитіла згідно з даним винаходом, включають хворобу
Альцгеймера, хворобу Крейтцфельда-Якоба, деменцію боксерів, синдром Дауна, хворобу
Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозит з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральну амілоїдну ангіопатію, черепно-мозкову травму, бічний аміотрофічний склероз/комбінацію паркінсонізму та деменції (комплекс Гуама), негуамську хворобу рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменцію аргірофільних зерен, кортикобазальну дегенерацію, дифузійні нейрофібрилярні клубки з кальцифікацією, лобово-скроневу деменцію, лобово- скроневу деменцію з паркінсонізмом, зчеплену з 17 хромосомою, хворобу Галервордена-
Шпатца, множинну системну атрофію, хворобу Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральну дегенерацію, хворобу Піка, прогресуючий субкортикальний гліоз, прогресуючий над'ядерний параліч, підгострий склерозуючий паненцефаліт, деменцію з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичний паркінсонізм і міотонічну дистрофію, але не обмежуються ними.
Додаткові необмежуючі типові захворювання та розлади, які можна діагностувати за допомогою антитіла згідно з даним винаходом, включають ПВТ (первинну вікову таупатію), деменцію з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгостру склерозуючу паненцефалопатію, хронічну травматичну енцефалопатію (ХТЕ), таупатію білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменцію з тільцями Леві (ДТЛ), легке когнітивне порушення (ЛКП), глаукому, сімейну британську деменцію, сімейну датську деменцію, гваделупський паркінсонізм, нейродегенерацію з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язану розумову відсталість, множинний склероз, ВІЛ-пов'язану деменцію, старечий амілоїдоз серця та хворобу
Гантінгтона. У деяких варіантах реалізації розлад, який можна діагностувати із застосуванням антитіла згідно з даним винаходом, являє собою хворобу Альцгеймера (ХА).
У деяких варіантах реалізації запропоновані мічені антитіла проти тау-білка. Мітки включають мітки або групи, що виявляються прямим способом (наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електронно-щільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також такі групи, як ферменти або ліганди, що виявляються непрямим способом, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярних взаємодій, але не обмежуються ними. Типові мітки включають радіоіїзотопи З2Р, С, 1251, ЗН ї 191ї, флуорофори, такі як хелати рідкісноземельних елементів або флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світлячка та бактеріальну люциферазу (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, пероксидазу хрону (ПХ), лужну фосфатазу, р- галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази вуглеводів, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу та глюкозо-б-фосфатдегідрогеназу, оксидази гетероциклічних сполук, таких як уриказа та ксантиноксидаза, у комбінації з ферментом, який використовує пероксид водню для окиснення попередника барвника, наприклад, ПХ, лактопероксидазу або мікропероксидазу, біотин/авідин, спінові мітки, мітки-бактеріофаги, стабільні вільні радикали та т. п., але не обмежуються ними.
Е. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади антитіла проти тау-білка, описані у даному документі, отримують шляхом змішування такого антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з одним або більше необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами і/або допоміжними речовинами (Нетіпдіоп'є Ріпаптасешіса! Зсіепсез 16їй еайіоп, О5ої, А. Ей. (1980)), у вигляді ліофілізованих складів або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії, розріджувачі та допоміжні речовини зазвичай є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозуваннях і концентраціях, і включають: стерильну воду, буферні речовини, наприклад, фосфат, цитрат й інші органічні солі; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (наприклад, хлорид октадецилдиметилбензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид
БО бензалконію; хлорид бензетонію; фенол; бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, наприклад, метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; і т- крезол); низькомолекулярні (що містять менше 10 залишків) поліпептиди; білки, наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад, полівінілпіролідон; амінокислоти, наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, маннозу або декстрини; хелатуючі агенти, наприклад, ЕДТА; вуглеводи, наприклад, сахарозу, манніт, трегалозу або сорбіт; солеутворюючі протиіони, наприклад, натрію; металовмісні комплекси (наприклад, комплекси 2п-білок) і/або неіоногенні ПАР, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), але не обмежуються ними. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв у даному документі 60 додатково включають агенти, що забезпечують внутрішньотканинний розподіл лікарських засобів, наприклад, розчинні нейтрально-активні глікопротеїни, що містять гіалуронідазу (ЗНАБЕОСР), наприклад, розчинні глікопротеїни РН-20 людини, що містять гіалуронідазу, наприклад, "НиРН2О (НМУ ЕМЕХУ, Вахіег ІпіегпаїйопаїЇ, Іпс.). Деякі типові ЗНАБ5ЕСР, у тому числі
ІНиРНІ2О, ії способи їх застосування описані у патентних публікаціях США Мо 2005/0260186 і 2006/0104968. В одному з аспектів ЗНАБЕСОР поєднують з одним або більше додатковими глікозаміногліканазами, наприклад, хондроїтиназами.
Типові ліофілізовані склади антитіл описані у патенті США Мо 6267958. Водні склади антитіла включають склади, описані у патенті США Мо 6171586 і М/О2006/044908, причому останні склади містять гістидин-ацетатний буфер.
Склад, описаний у даному документі, також може містити більше одного активного інгредієнта, якщо це необхідно для лікування за конкретними показниками, переважно, інгредієнти з взаємодоповнюючими активностями, що не виявляють небажаної дії один на одного. Такі активні інгредієнти присутні в комбінації в кількостях, ефективних для поставленої мети.
Активні інгредієнти можна включити в мікрокапсули, отримані, наприклад, за допомогою методик коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад, мікрокапсули гідроксиметилцелюлози або желатину та поліметилметакрилату, відповідно, у колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методики описані в Ветіпдіоп'є Рнаптасешіса! 5сіепсе 161 еайіоп, Оз5ої, А. Еа. (1980).
Можна одержувати препарати з уповільненим вивільненням. Підходящі приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, причому зазначені матриці знаходяться у формі формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул.
Композиції, призначені для застосування іп мімо, зазвичай є стерильними. Стерильності легко досягти, наприклад, шляхом фільтрації через мембрани для стерильної фільтрації. а. Терапевтичні способи та композиції
Будь-яке з антитіл проти тау-білка, запропонованих у даному документі, можна застосовувати в терапевтичних способах.
В одному аспекті запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування як лікарський засіб. У додаткових аспектах запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при лікуванні захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при лікуванні захворювань або розладів, викликаних або асоційованих з утворенням нейрофібрилярних клубків або нейропільних ниток. У конкретних варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при лікуванні таупатії, наприклад, нейродегенеративної таупатії. Типові захворювання або розлади, асоційовані з тау-білюом, які можна лікувати із застосуванням антитіл проти тау-білка, включають, без обмеження, хворобу Альцгеймера, бічний аміотрофічний склероз, хворобу Паркінсона, хворобу Крейтцфельда-Якоба, деменцію боксерів, синдром Дауна, хворобу Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозит з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральну амілоїдну ангіопатію, черепно-мозкову травму, бічний аміотрофічний склероз/комбінацію паркінсонізму та деменції (комплекс Гуама), негуамську хворобу рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменцію аргірофільних зерен, кортикобазальну дегенерацію, дифузійні нейрофібрилярні клубки з кальцифікацією, лобово-скроневу деменцію, лобово-скроневу деменцію з паркінсонізмом, зчеплену з 17 хромосомою, хворобу
Галервордена-Шпатца, множинну системну атрофію, хворобу Німанна-Піка типу С, палідо- понто-нігральну дегенерацію, хворобу Піка, прогресуючий субкортикальний гліоз, прогресуючий над'ядерний параліч, підгострий склерозуючий паненцефаліт, деменцію з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичний паркінсонізм і міотонічну дистрофію. Додаткові типові захворювання та розлади, що асоційовані з тау-білком, які можна лікувати за допомогою антитіл проти тау-білка, включають, без обмеження, ПВТ (первинну вікову таупатію), деменцію з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгостру склерозуючу паненцефалопатію, хронічну травматичну енцефалопатію (ХТЕ), таупатію білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменцію з тільцями Леві (ДТЛ), легке когнітивне порушення (ЛКП), глаукому, сімейну британську деменцію, сімейну датську деменцію, гваделупський паркінсонізм, нейродегенерацію з відкладенням заліза в головному мозку, 5ІС9Аб-пов'язану розумову відсталість, множинний склероз, ВІЛ-пов'язану деменцію, старечий амілоїдоз серця та хворобу
Гантінгтона. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при лікуванні хвороби Альцгеймера (ХА). У деяких варіантах реалізації 60 запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при лікуванні помірної ХА, легкої або помірної ХА, ранніх стадій ХА або продромальної ХА. Крім того, захворювання або розлади, які можна лікувати за допомогою антитіла проти тау-білка, включають захворювання або розлади, які проявляються порушенням або втратою когнітивних функцій, у тому числі логічного мислення, здатності до прийняття ситуаційних розв'язків, ємності пам'яті, навченості та/або специфічної навігації. У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування в способі лікування. У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування в способі лікування індивіда з одним із вищеописаних захворювань або розладів, асоційованих з тау-білюом, що включає введення індивіду ефективної кількості антитіла проти тау-білка. В одному з таких варіантів реалізації спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче.
У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом застосовують для лікування індивіда з бальною оцінкою ММ5ОЕ від 20 до 30, від 20 до 26, від 24 до 30, від 21 до 26, від 22 до 26, від 22 до 28, від 23 до 26, від 24 до 26 або від 25 до 26 балів. У деяких варіантах реалізації бальна оцінка ММ5Е у пацієнта становить від 22 до 26 балів. У даному документі бальна оцінка ММ5ОЕ між двома числами включає числа, що знаходяться на кожному кінці зазначеного діапазону. Наприклад, бальна оцінка ММ5Е між 22 і 26 балами включає бальні оцінки ММ5Е, рівні 22 і 26 балам.
У деяких варіантах реалізації антитіла згідно з даним винаходом застосовують для лікування індивіда, що є "амілоїд-позитивним", наприклад, пацієнта з відкладаннями тау-білка у головному мозку, типовими для розладів, асоційованих з тау-білком, наприклад, пацієнта з тау- позитивним результатом ПЕТ.
У додаткових варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при зниженні рівня тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау- білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) в індивіда. Наприклад, таке зниження може відбутися у головному мозку (наприклад, корі головного мозку та/або гіппокампі). У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при зниженні рівня фосфорилованого тау-білка. У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при зниженні рівня тау- білка (наприклад, нерозчинного фосфорилованого тау-білка). У деяких варіантах реалізації запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при зниженні рівня гіперфосфорилованого тау-білка У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при зниженні рівня парних спіральних філаментів (наприклад, парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) у тканині головного мозку (наприклад, у корі головного мозку та/або гіппокампі). У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування в способі зниження рівня тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау- білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) у головному мозку (наприклад, корі головного мозку та/або гіппокампі) в індивіда що включає введення індивіду ефективної кількості антитіла проти тау-білка з метою зниження рівня тау-білка. "Індивід" згідно з будь-яким із вищеописаних варіантів реалізації є ссавцем, переважно людиною.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропоноване антитіло проти тау-білка для застосування при модуляції рівня тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау- білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок), наприклад, у головному мозку (наприклад, у корі головного мозку та/або гіппокампі) індивіда.
У додатковому аспекті даного винаходу запропоноване застосування антитіла проти тау- білка при виробництві або виготовленні лікарського засобу. У деяких варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування захворювання або розладу, асоційованого з тау- білком. Захворювання або розлад, асоційований з тау-білююом, може являти собою захворювання або розлад, викликаний або асоційований з утворенням нейрофібрилярних клубків або нейропільних ниток. У конкретних варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування таупатії, наприклад, нейродегенеративної таупатії. У конкретних варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування захворювань або розладів, вибраних із 60 групи, що складається з: хвороби Альцгеймера (ХА), хвороби Крейтцифельда-Якоба, деменції
Зо боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово- скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії. У деяких варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування захворювань та розладів, які вибрані з ПВТ (первинної вікової таупатії), деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгострої склерозуючої паненцефалопатії, хронічної травматичної енцефалопатії (ХТЕ), таупатії білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменції з тільцями Леві (ДТЛ), легкого когнітивного порушення (ЛКП), глаукоми, сімейної британської деменції, сімейної датської деменції, гваделупського паркінсонізму, нейродегенерації з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язаної розумової відсталості, множинного склерозу, ВІЛ-пов'язаної деменції, старечого амілоїдозу серця та хвороби Гантінгтона. У деяких варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування ХА. У деяких варіантах реалізації лікарський засіб призначений для лікування захворювання або розладу, асоційованого з тау-білюом, яке проявляється порушенням або втратою когнітивної функції, наприклад, логічного мислення, здатності до прийняття ситуаційних розв'язків, ємності пам'яті, навченості та/або специфічної навігації. У додатковому варіанті реалізації лікарський засіб призначений для застосування в способі лікування одного з перерахованих вище захворювань (наприклад, таупатії, наприклад, ХА), що включає введення індивіду з таким захворюванням ефективної кількості лікарського засобу. В одному з таких варіантів реалізації спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче.
У додатковому варіанті реалізації лікарський засіб призначений для зниження рівня тау- білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного нефосфорилованого тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, нерозчинного нефосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок). Наприклад, таке зниження рівня тау- білка можна спостерігати у головному мозку (наприклад, корі головного мозку та/або гіппокампі) або цереброспинальної рідини індивіда. У деяких варіантах реалізації лікарський засіб призначений для зниження рівня парних спіральних філаментів. У додатковому варіанті реалізації лікарський засіб призначений для застосування в способі зниження рівня тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) в індивіда, що включає введення індивіду ефективної кількості лікарського засобу з метою зниження рівня тау-білка. "Індивід" згідно з будь-яким із вищеописаних варіантів реалізації є ссавцем, переважно людиною.
У додатковому аспекті даного винаходу запропонований спосіб для лікування захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком. Захворювання або розлад, асоційований з тау-білком, яке можна лікувати у відповідності зі способами, запропонованими у даному документі, включає захворювання або розлади, викликані або асоційовані з утворенням нейрофібрилярних клубків або нейропільних ниток. У конкретних варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб лікування таупатії, наприклад, нейродегенеративної таупатії. У специфічних варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб лікування захворювання або розладу, вибраного з групи, що складається з: хвороби Альцгеймера, хвороби Крейтцфельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово- скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, 60 палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу,
прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії. У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані способи лікування захворювань та розладів, які вибрані з ПВТ (первинної вікової таупатії), деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, підгострої склерозуючої паненцефалопатгії, хронічної травматичної енцефалопатії (ХТЕ), таупатії білої речовини з включеннями кулькоподібних гліалів, деменції з тільцями Леві (ДТЛ), легкого когнітивного порушення (ЛКП), глаукоми, сімейної британської деменції, сімейної датської деменції, гваделупського паркінсонізму, нейродегенерації з відкладенням заліза в головному мозку, 5І С9Аб-пов'язаної розумової відсталості, множинного склерозу, ВІЛ-пов'язаної деменції, старечого амілоїдозу серця та хвороби Гантінгтона. У деяких варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб лікування хвороби Альцгеймера (ХА). У конкретних варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб лікування захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, яке проявляється порушенням або втратою когнітивної функції, наприклад, логічного мислення, здатності до прийняття ситуаційних розв'язків, ємності пам'яті, навченості та/або специфічної навігації. У деяких варіантах реалізації зазначений спосіб включає введення індивіду з одним із вищеописаних захворювань або розладів ефективної кількості антитіла проти тау-білка. В одному з таких варіантів реалізації спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче. У деяких варіантах реалізації зазначений спосіб включає введення суб'єкту з одним із захворювань, описаних у даному документі, ефективної кількості антитіла проти тау-білка. В одному з таких варіантів реалізації спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче. "Індивід" відповідно до будь-якого з вищеописаних варіантів реалізації може бути людиною.
У додатковому аспекті винаходу запропонований спосіб зниження рівня тау-білка (наприклад, загального тау-білка, загального розчинного тау-білка, розчинного фосфорилованого тау-білка, загального нерозчинного тау-білка, нерозчинного фосфорилованого тау-білка, гіперфосфорилованого тау-білка або парних спіральних філаментів, що містять гіперфосфорилований тау-білок) в індивіда. Наприклад, таке зниження рівня тау-білка можна спостерігати у головному мозку (наприклад, корі головного мозку та/або гіппокампі) або цереброспинальної рідини індивіда. У деяких варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб зниження рівня парних спіральних філаментів. У деяких варіантах реалізації зазначений спосіб включає введення індивіду ефективної кількості антитіла проти тау-білка з метою зниження рівня тау-білка. У деяких варіантах реалізації "індивід" є людиною.
У деяких аспектах винаходу запропонований спосіб полегшення одного або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для полегшення одного або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком (наприклад, будь-якого із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад, ХА). У деяких аспектах винаходу запропонований спосіб зниження кількості симптомів або тяжкості одного або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для зниження кількості симптомів або тяжкості одного або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком (наприклад, будь-якого із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад,
ХА). У конкретному варіанті реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау- білком, являє собою порушення когнітивної функції. У конкретному варіанті реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, являє собою порушення навченості та/або пам'яті У конкретному варіанті реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, являє собою втрату довгочасної пам'яті. У конкретному варіанті реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, являє собою деменцію. У деяких варіантах реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, являє собою сплутаність свідомості, подразливість, агресію, емоційну лабільність або порушення мови. У деяких варіантах реалізації симптом захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком, являє собою порушення або втрату однієї або більше з когнітивних функцій, наприклад, логічного мислення, здатності до прийняття ситуаційних розв'язків, ємності пам'яті та/або навченості. Способи, запропоновані у даному документі, включають введення деякої кількості (наприклад, терапевтично ефективної кількості) антитіла проти тау-білка індивіду (наприклад, в якого проявляються один або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком).
У конкретних аспектах винаходу запропонований спосіб збереження або збільшення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті, асоційованої із захворюванням або розладом, асоційованим з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для збереження або збільшення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті, асоційованої із захворюванням або розладом, асоційованим з тау-білком (наприклад, будь-яким із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад, ХА). Способи, запропоновані у даному документі, включають введення деякої кількості (наприклад, терапевтично ефективної кількості) антитіла проти тау-білка індивіду (наприклад, в якого проявляються один або більше з симптомів втрати пам'яті або зниження ємності пам'яті).
У деяких аспектах винаходу запропонований спосіб зниження швидкості прогресування захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для зниження швидкості прогресування захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком (наприклад, будь-якого із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад, ХА). Способи, запропоновані у даному документі, включають введення деякої кількості (наприклад, терапевтично ефективної кількості) антитіла проти тау-білка індивіду (наприклад, в якого проявляються один або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком).
У деяких аспектах винаходу запропонований спосіб профілактики розвитку захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для профілактики розвитку захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком (наприклад, будь-якого із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад, ХА). Способи, запропоновані у даному документі, включають введення деякої кількості (наприклад, терапевтично ефективної кількості) антитіла проти тау- білка індивіду (наприклад, що зазнає ризику захворювання або розладу, асоційованого з тау- білком).
У деяких аспектах винаходу запропонований спосіб затримки розвитку захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком; або антитіло проти тау-білка або лікарський засіб, що містить антитіло проти тау-білка, для затримки розвитку захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком (наприклад, будь-якого із захворювань або розладів, описаних у даному документі, наприклад, ХА). Способи, запропоновані у даному документі, включають введення деякої кількості (наприклад, терапевтично ефективної кількості) антитіла проти тау- білка індивіду (наприклад, в якого проявляються один або більше з симптомів захворювання або розладу, асоційованого з тау-білком).
У додатковому аспекті даного винаходу запропоновані фармацевтичні склади, які містять будь-яке з антитіл проти тау-білка, запропонованих у даному документі, наприклад, для застосування у будь-якому з вищевказаних терапевтичних способів. У деяких варіантах реалізації фармацевтичний склад містить будь-яке з антитіл проти тау-білка, запропонованих у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. В ще одному варіанті реалізації фармацевтичний склад містить будь-яке з антитіл проти тау-білка, запропонованих у даному документі, і щонайменше один додатковий терапевтичний агент, наприклад, як описано нижче.
Антитіла згідно з даним винаходом можна застосовувати при лікуванні окремо або в комбінації з іншими агентами. Наприклад, антитіло згідно з даним винаходом можна вводити спільно щонайменше з одним додатковим терапевтичним агентом.
Наприклад, композицію відповідно до даного винаходу можна вводити в комбінації з іншими композиціями, що містять додатковий терапевтичний агент, наприклад, біологічно активну речовину або сполуку, наприклад, відому сполуку, яку застосовують при медикаментозному лікуванні таупатій і/або амілоїдозів, групи захворювань та розладів, асоційованих з амілоїдом або амілоїдоподібним білком, наприклад, білком р-амілоїду, залученим у хворобу Альцгеймера.
Як правило, інша біологічно активна сполука може включати підсилювачі переносу сигналу між нейронами, психотерапевтичні лікарські засоби, інгібітори ацетилхолінестерази, блокатори кальцієвих каналів, біогенні аміни, транквілізатори на основі бензодіазепінів, підсилювачі синтезу, накопичення або вивільнення ацетилхоліну, агоністи постсинаптичного рецептора ацетилхоліну, інгібітори моноаміноксидази-А або -В, антагоністи рецептора М-метил-О- аспартатглутамату, нестероїдні протизапальні лікарські засоби, антиоксиданти й антагоністи серотонергічного рецептора або інші терапевтичні агенти. Зокрема, біологічно активний агент або сполука може містити щонайменше одну сполуку, вибрану з антагоністів окисного стресу, антиапоптозних сполук, хелаторів металів, інгібіторів репарації ДНК, наприклад, пірензепіну та його метаболітів, З-аміно-1-пропансульфонової кислоти (ЗАРБ), 1,3-пропандисульфонату 60 (1,9РО5), активаторів секретаз, інгібіторів бета- і гамма-секретаз, тау-білків, антитіл проти тау-
білків (включаючи антитіла, описані у У/О2012049570, М/О2014028777, МО2014165271,
МО2014100600, УМ/О2015200806, 058980270 і 58980271, але не обмежуючись ними), нейромедіатор, руйнівники р-складчастої структури, протизапальні речовини, атипові нейролептики, наприклад, клозапін, зипрасидон, рисперидон, арипіпразол або оланзапін, або інгібітори холінестерази (СПЕЇ5), наприклад, такрин, ривастигмін, донепезил і/або галантамін, і інші лікарські засоби та харчові добавки, наприклад, вітамін В12, цистеїн, попередник ацетилхоліну, лецитин, холін, препарат гінкго, ацетил-і -карнітин, ідебенон, пропентофілін або похідну ксантину, спільно з єднальним пептидом відповідно до даного винаходу, у тому числі з антитілами, зокрема, з моноклональними антитілами та їх активними фрагментами, і, необов'язково, з фармацевтично прийнятним носієм і/або розріджувачем, і/або допоміжною речовиною, а також інструкціями для лікування захворювань.
У деяких варіантах реалізації антитіло згідно з даним винаходом можна вводити в комбінації з неврологічним лікарським засобом. Такі неврологічні лікарські засоби включають антитіло або іншу сполуку, що зв'язується (у тому числі низькомолекулярну сполуку, пептид, аптамер або іншу сполуку, здатну зв'язуватися з білком, але не обмежуючись ними), що специфічно зв'язується з мішенню, вибраною з: бета-секретази, пресеніліну, білка-попередника амілоїду або їх фрагментів, пептиду бета-амілоїду або його олігомерів або фібрил, рецептора загибелі клітин 6 (ОВ6), рецептора кінцевих продуктів розширеного глікозилювання (ВАС), паркіну та хантингтину; антагоніста рецептора ММОА (тобто мемантину), засобу, що виснажує запаси моноамінів (тобто тетрабеназину); ерголоїду мезилату; протипаркінсонічного антихолінергічного засобу (тобто проциклідину, дифенгідраміну, тригексилфенідилу, бензтропіну, біперидену та тригексифенідилу); протипаркінсонічного дофамінергічного засобу (тобто ентакапону, селегіліну, праміпексолу, бромокриптину, ротиготину, селегіліну, ропініролу, разагіліну, апоморфіну, карбідопи, леводопи, перголіду, толкапону й амантадину); тетрабеназину; протизапального засобу (включаючи нестероїдний протизапальний лікарський засіб (тобто індометацин й інші сполуки, перераховані вище), але не обмежуючись ними; гормону (тобто естрогена, прогестерона та лейпроліду); вітаміну (тобто фолату та нікотинаміду); димеболіну; гомотаурину (тобто З3-амінопропансульфонової кислоти; ЗАРБ5); модулятора активності рецептора серотоніну (тобто ксаліпродену); інтерферону та глюкокортикоїда або кортикостероїда, але не обмежуються ними. Термін "кортикостероїд" включає флутиказон (включаючи флутиказону пропіонат (ЕР)), беклометазон, будесонід, циклезонід, мометазон, флунізолід, бетаметазон і триамцинолон, але не обмежується ними. "Інгаляційний кортикостероїд" означає кортикостероїд, який придатний для доставки за допомогою інгаляції.
Прикладами інгаляційних кортикостероїдів є флутиказон, беклометазону дипропіонат, буденозид, мометазону фуроат, циклезонід, флунізолід і триамцинолону ацетонід.
У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити одне або більше з антитіл проти бета-амілоїду. Необмежуючі приклади таких антитіл до проти бета-амілоїду включають соланезумаб, бапінейзумаб, адуканумаб і ВАМ-2401 (Віодеп, Еізаї Со., Ца.)). У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити один або більше з інгібіторів агрегації бета-амілоїду. Необмежуючі типові інгібітори агрегації бета-амілоїду включають ЕЇ МО- 005 (також відомий за назвою А2О-103 або сцило-інозит), траміпросат і РТІ-80 (ЕхергуІ-19);
Ргоїеоїесі). У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити один або більше з інгібіторів ВАСЕ. Необмежуючі приклади таких інгібіторів ВАСЕ включають Е-2609 (Віодеп, Еізаі Со., а), А2О3293 (також відомий як
І У3314814; Авзіга/епеса, Ей І Шу а Со.), МК-8931 (верубецестат) і 9МО-54861911 (апв5зеп,
ЗПпіоподі Рнапта). У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити один або більше з інгібіторів тау-білка. Необмежуючі приклади таких інгібіторів тау-білка включають метилтіоніній, | МТХ (також відомий як лейко- метилтіоніній або Тіх-0237; ТашАх ТПНегарешісв Іїа.), НетбрегМ (метиленовий синій або метилтіонінію хлорид МТС); Ттх-0014; Ташех Тнегарешісв Па), РВТ2 (Ргапа Віоїтесппоіоду) і РТІ- 51-СНЗ (ТашРго"Мм; РгоїеоТесі). У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити одне або більше з інших антитіл проти тау- білка. Необмежуючі приклади таких інших антитіл проти тау-білка включають ВМ5-986168 (ВгізісІ-Муєгз бапірь) і С2М-8Е12 (АББМіє, С2М Оіадпозвіїйсв, ГІ С). У деяких варіантах реалізації з антитілом проти тау-білка, запропонованим у даному документі, можна вводити інгібітор загального неправильного фолдинга, наприклад, МРТ088 (МешгоРпаде Рпаптасецшіса!5).
У деяких варіантах реалізації композиція відповідно до даного винаходу може містити ніацин або мемантин разом з химерним антитілом або гуманізованим антитілом відповідно до даного бо винаходу, у тому числі з антитілами, зокрема, з моноклональними антитілами та їх активними фрагментами, і, необов'язково, з фармацевтично прийнятним носієм і/або розріджувачем, і/або допоміжною речовиною.
У деяких варіантах реалізації запропоновані композиції, які містять "атипові нейролептики", наприклад, клозапін, зипрасидон, рисперидон, арипіпразол або оланзапін для лікування позитивних і негативних психотичних симптомів, у тому числі галюцинацій, марення, розладів мислення (що проявляються у вираженій непогодженості дій, порушенні планів, тангенціальності мислення), й ексцентричної або неорганізованої поведінки, а також ангедонії, притупленого афекту, апатії та соціального відчуження, разом з химерним антитілом або гуманізованим антитілом відповідно до даного винаходу або його активних фрагментів, і, необов'язково, з фармацевтично прийнятним носієм і/або розріджувачем, і/або допоміжною речовиною.
Іншими сполуками, які можна належним чином застосовувати в композиціях на додаток до химерного антитіла або гуманізованого антитіла відповідно до даного винаходу, є сполуки, які описані, наприклад, у заявці УУО 2004/058258 (див., насамперед, сторінки 16 і 17), у тому числі мішені терапевтичних лікарських засобів (сторінки 36-39), алкансульфонові кислоти й алкансерні кислоти (сторінки 39-51), інгібітори холінестерази (сторінки 51-56), антагоністи рецептора ММОА (сторінки 56-58), естрогени (сторінки 58-59), нестероїдні протизапальні лікарські засоби (сторінки 60-61), антиоксиданти (сторінки 61-62), агоністи рецепторів, що активуються пероксисомальними проліфераторами (РРАН) (сторінки 63-67), агенти, що знижують рівень холестерину (сторінки 68-75); інгібітори амілоїду (сторінки 75-77), інгібітори утворення амілоїду (сторінки 77-78), хелатори металів (сторінки 78-79), нейролептики й антидепресанти (сторінки 80-82), харчові добавки (сторінки 83-89) і сполуки, що підвищують доступність біологічно активних речовин у головному мозку (дивися сторінки 89-93) і пролікарські препарати (сторінки 93 і 94); зазначений документ включений у даний опис за допомогою посилання, особливо сполуки, згадані на вищевказаних сторінках.
Такі комбіновані терапевтичні засоби, відзначені вище, охоплюють комбіноване введення (при включенні двох або більше терапевтичних агентів в один і той самий або окремі склади), а також роздільне введення; в останньому випадку введення антитіла згідно з даним винаходом може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного агента або агентів. У деяких варіантах реалізації введення антитіла проти тау-білка та введення додаткового терапевтичного агента відбувається з інтервалом приблизно один місяць, або приблизно один, два або три тижні, або приблизно один, два, три, чотири, п'ять або шість днів.
Антитіло згідно з даним винаходом (і будь-який додатковий терапевтичний засіб) можна вводити будь-яким підходящим способом, що включає парентеральне, внутрішньолегеневе, інтраназальне введення та, при необхідності місцевого лікування, введення у вогнище захворювання. Парентеральні вливання включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревинне або підшкірне введення. Введення дози можна здійснювати будь-яким підходящим способом, наприклад, за допомогою ін'єкцій, наприклад, внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, частково залежно від того, чи є введення коротким або хронічним. У даному документі розглянуті різні схеми застосування, включаючи одне- або багаторазові введення в різні моменти часу, болюсне введення й імпульсну ін'єкцію, але не обмежуючись ними.
Антитіла згідно з винаходом слід складати, дозувати і вводити відповідно до належної медичної практики. Фактори, які слід ураховувати у даному контексті, включають конкретний розлад, що підлягає лікуванню, конкретний ссавець, що зазнає лікування, клінічний стан окремо взятого пацієнта, причину розладу, область доставки агента, спосіб введення, схему введення та інші фактори, відомі практикуючим лікарям. Комбінування антитіла з одним або більше агентами, які застосовують у даний час для профілактики або лікування розглянутого порушення, є необов'язковим, але можливим. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, що присутній в складі, виду розладу або лікування, й інших факторів, що обговорювалися вище. Як правило, інші агенти застосовують у тих самих дозах і за допомогою того самого шляху введення, як описано у даному документі, або в дозах, що становлять від приблизно 1 до 9995 дозувань, описаних у даному документі, або у будь-якій дозі та за допомогою будь-якого шляху введення, емпірично/клінічно вважаються придатними.
Доза антитіла згідно з винаходом, придатна для профілактики або лікування захворювання (при застосуванні в якості монотерапії або в комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними агентами), залежить від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіла, тяжкості та протікання захворювання, введення антитіла у профілактичних або терапевтичних цілях, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта та його реакції на антитіло, і 60 розсуду лікаря. Антитіло придатне для введення пацієнту однократно або у декілька приймань.
Залежно від виду та тяжкості захворювання, первісне передбачуване дозування антитіла для введення пацієнту, наприклад, за допомогою одного або більше роздільних введень або безперервного вливання, становить від приблизно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг). Типова щоденна доза може знаходитися в діапазоні від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше залежно від вищезгаданих факторів. При повторному введенні протягом декількох днів або довше, залежно від стану, лікування зазвичай слід продовжувати до бажаного придушення симптомів захворювання. Одна типова доза антитіла повинна становити від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Так, пацієнту можна ввести одну або більше з доз, що становлять приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яку їхню комбінацію). Такі дози можна вводити з перервами, наприклад, щотижня або кожні три тижні (наприклад, таким чином, що пацієнт одержує від приблизно двох до приблизно двадцяти, або, наприклад, приблизно шість доз антитіла). Можна вводити початкову підвищену навантажувальну дозу, а потім - одну або більше знижені дози. У той самий час можна застосовувати інші схеми лікування. Хід лікування можна контролювати за допомогою звичайних методик й аналізів.
Слід розуміти, що будь-який з вищевказаних складів або терапевтичних способів можна реалізувати із застосуванням імунокон'югату згідно з даним винаходом замість або на додаток до антитіла проти тау-білка.
Н. Вироби
В ще одному аспекті винаходу запропонований виріб, що містить матеріали, придатні для лікування, профілактики і/або діагностики розладів, описаних вище. Виріб включає контейнер й етикетку або вкладиш в упакування, вкладений або пов'язаний з контейнером. Підходя щі контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони, шприци, пакети з розчинами для внутрішньовенного введення та т. п.
Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, наприклад, скла або пластмаси.
Контейнер містить композицію, яку ефективно застосовують при лікуванні, профілактиці та/або діагностиці патологічного стану окремо або в комбінації з іншою композицією, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою пакет з розчином для внутрішньовенного введення або флакон з пробкою, що проколюється голкою для підшкірної ін'єкції). ЩЩонайменше один активний агент у композиції є антитілом згідно з даним винаходом.
На етикетці або на вкладиші в упакування зазначено, що композиція використовується для лікування вибраного патологічного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, що міститься в ньому, причому композиція містить антитіло згідно з даним винаходом; і (б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, причому композиція включає додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний засіб. У даному варіанті реалізації винаходу виріб може додатково містити вкладиш в упакування, в якому зазначено, що композиції можна застосовувати для лікування конкретного патологічного стану. В якості альтернативи або доповнення, виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, наприклад, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (ВУУРІ), фізіологічний розчин з фосфатним буфером, розчин Рінгера та розчин декстрози. Він може додатково містити інші матеріали, бажані з комерційної та споживчої точки зору, у тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.
Слід розуміти, що будь-який із зазначених вище виробів може містити імунокон'югат згідно з даним винаходом замість антитіла проти тау-білка або на додаток до нього.
І. ПРИКЛАДИ
Нижче наведені приклади способів і композицій згідно з даним винаходом. Слід розуміти, що враховуючи загальний опис, представлений вище, можна здійснити різні інші варіанти реалізації даного винаходу.
Приклад 1: Одержання тау-білка для імунізації
Одержання мономерного рекомбінантного тау-білка
Рекомбінантний конструкт ізоформи 2М4Е тау-білка людини (амінокислоти 2-441) об'єднали з М-кінцевим Ніз-маркером для полегшення очищення й оцінки характеристик. Див., наприклад,
Фігуру 15. Гібридний конструкт клонували у векторі РЕТ52Ь (Момадеп) й експресували в Е. соїї.
Клітини збирали і лізували в денатуруючих умовах з використанням 7 М хлориду гуанідинія протягом ночі при 4 "С і перемішуванні. Залишки клітин осаджували при 40000 об./хв. протягом 1 години. Рекомбінатний білок з Ніз-маркером виділяли за допомогою нікель-афінної хроматографії (афінна смола Мі-Зернагозе ехсеі, СЕ Неайнсаге І Ше 5сіепсе5) з наступною ексклюзійною хроматографією (смола БЗирегдех 200, СЕ Неайнсаге Ійе Зсіепсе5) при денатуруючих умовах. Хлорид гуанідинія видаляли діалізом виділеного білка в 20 мМ МЕ5, 50 60 ММ Масі і 1 мМ ТСЕР при рнН 6,8. Потім видаляли Ніз-маркер за допомогою протеази ТЕУ, після чого виконували остаточне очищення за допомогою катіоннообмінної хроматографії (колонка
Мопо 5, СЕ Неайнсаге І Те бсіепсе5) з метою видалення відщепленого Ніз-маркера. Буфер для очищення містив 0,1 95 тритон х-114 (об./06.) для видалення ендотоксинів. Очищений протеїн діалізували у РВ5 з 1 мМ ТСЕР. Чистоту та мономірність аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і 5ЕС-МАЇ І 5. Ідентичність підтверджували мас-спектрометрією.
Концентрацію білка визначали за УФ-поглинанням при довжині хвилі 280 нм. Кінцевий продукт не містив ендотоксинів (« 0,5 ЕЕ/мл), згідно з кінетичним аналізом з лізатом амебоцитів І іти (ІА).
Одержання фосфоризованого тау-білка
Фосфорилований тау-білок одержали з використанням конструкта 2-441 тау-білка, отриманого з використанням способу, описаного вище. Білковий конструкт фосфорилювали за допомогою 0,5 мкМ кінази РКА (Ше ТесПппоіодіез), що фосфорилює, серед інших залишків, серин-409. Реакційну суміш інкубували з 1ї7 мМ АТФ, 5 мМ Масі» при кімнатній температурі протягом 72 годин. Фосфорилювання підтверджували мас-спектрометрією. Для видалення кінази використовували ексклюзійну хроматографію (Зирегаєх 75, СЕ Неайнсаге І Ше 5сіепсев).
Чистоту, мономірність та рівень ендотоксинів у препараті фосфорилованого білка аналізували в основному відповідно до вищенаведеного опису. Олігомерюація мономерного тау-білка іп міо
Олігомерний тау-білок одержали з використанням конструкта 2-441 мономерного тау-білка.
Мономерний білок спочатку діалізували в г20 ММ М,М-біс-(2-гідроксіетил)-2- аміноетансульфонову кислоту (ВЕ5), 25 мМ Масі, рН 7,4, з наступною олігомеризацією з використанням 75 мкМ арахідонової кислоти (Саутап СНептіса!в5) і 18 кДа гепарину (бідта
Аїдгісн) в еквімолярній концентрації з білком при 37 "С протягом З діб. Олігомеризацію підтверджували аналізом флуоресценції з тіофлавіном Т, динамічним світлорозсіюванням (01 5) й аналітичною ексклюзійною хроматографією. Олігомерний тау-білок у деяких випадках називали "оліго-тау-білком".
Приклад 2:
Одержання антитіл проти тау-білка
Способи
Одержання гібридом
Самок мишей С57ВІ /5)дОїІанза (С57ВІ /6) і ВАЇ В/с ОЇІанза (ВаїБ/с) дикого типу (Напап, США) одержали у віці 9 тижнів. Мишей з нокаутом гена тау-білка (86.129-тпарштіНпа/у; Тне Уаскзоп
І арогаїогу, США) одержали у віці б їі 9 тижнів. Вакцинацію почали у віці 12-15 тижнів. Мишей вакцинували олігомеризованим тау-білюом людини. Перед вакцинацією оліго-тау-білок змішували з одним із двох ад'ювантів, використаних у даному дослідженні: системою ад'ювантів
ВіБі Аафимапі Бузієт (Вірі; бідта-АїЇагсн, Швейцарія) у концентрації 5095 (об./06.), або комбінацією одноланцюгових синтетичних ДНК-олігодезоксинуклеотидів Сра (Сра; Містозупій,
Швейцарія) і гідроксиду алюмінію (А!; Вгеппіаяй, Швейцарія). Ад'ювант Вірі являв собою 2 95 емульсію сквалена типу "масло у воді", що містить монофосфорилліпід А (виділений з зЗаітопейа тіппезоїа) і синтетичний трегалозодикариноміколат (виділений з фактора джгутикоутворення туберкульозної палички) у скваленовому маслі, 0,2 У5 Гуееп-80 і воду.
Мишей вакцинували шляхом підшкірної (п/ш) ін'єкції, за винятком груп О і с, які одержали комбінацію внутрішньоочеревинного (в/ч) введення та введення в область скакального суглоба.
Мишам у групі ОО вводили 50 мкг оліго-тау-білка в/ч і 10 мкг оліго-тау-білка в область скакального суглоба. Мишам у групі С вводили 8 мкг оліго-тау-білка в/ч і 2 мкг оліго-тау-білка в область скакального суглоба. Див. таблицю 2.
Для вакцинації із застосуванням Сра і АІ (Сра/АЇ) в якості ад'юванта кожна 200-мкл ін'єкція містила 60 мкл (30 нмоль) Сра, 1 мг АЇ і 50 мкг оліго-тау-белка. Мишам усіх досліджуваних груп виконували ін'єкції в 0, 14, 35 і 56 добу. Мишей, використаних для злиття з мієломними клітинами (Мапоїооі5, Німеччина), додатково вакцичували трьома щоденними вторинними ін'єкціями оліго-тау-білка (50 мкг на в/ч ін'єкцію) без додавання ад'юванта.
Таблиця 2
Миші та протоколи вакцинації . не - | Загальна доза оліго- , - 77711118 7 105786 | 50 |В 77 пш С область
Ва!р/с Сра)/А| скакального суглоба «т в/ч 11126771 Ф|Вавис//// | 7777/7507 |ІВБ//////7/7/7/ піш С область
Нокаут гена
МС суглоба « в/ч
Мишей знекровлювали й умертвляли через день після останньої з трьох вторинних ін'єкцій, спленоцити зливали з мієломними клітинами, одержуючи гібридоми, які продукують антитіла.
Вибір гібридом для субюіонування
Для злиття клітин мишей розділили на три групи, виконавши у цілому 10 експериментів зі злиття (2 в одній групі, чотири в другій групі та чотири - у третій групі) й одержавши 299 гіоридом. Життєздатні гібридоми культивували в селективному середовищі із сироваткою, кращі гіоридоми селектували для субклонування, застосовуючи твердофазний ІФА для виявлення зв'язування повнорозмірного тау-білка людини й оліго-тау-білка, як описано нижче. Після обмежуючого розведення остаточні гібридоми культивували у безсироватковому середовищі; середовище стабільних колоній збирали для скринінгу та відбору антитіл. Скринінговий твердофазний ІФА
Виконували збір безсироваткової надосадової рідини стабільних гібридом. Надосадову рідину, яка містить антитіла, що представляють інтерес, піддавали скринінгу із застосуванням твердофазного ІФА з метою дослідження властивостей антитіл і відбору антитіл для подальшої розробки. Твердофазний ІФА використовували для визначення наступних властивостей: зв'язування з повнорозмірним тау-білюоом людини (їТаи; бідпаі(спет, Канада), зв'язування з гіперфосфорилованим ПГаш (Сепепіес!й, США), порівняння зв'язування з олігомерним і мономерним препаратами їТай та зв'язування з епітопом(ами) тау-білка для деяких антитіл.
Коротенько, 9б-ямкові планшети Махібогр для твердофазного ІФА (Мипс, Данія) покривали однією з мішеней, зазначених у таблиці 3.
Таблиця З
Мішені, які використані для скринінгового твердофазного ІФА.
Схема
Аналіз твердофазного Мішень
ІФА
Зв'язування з ПТГаи твердофазний Повнорозмірний тау-білок людини (там),
ІФА іммобілізований у концентрації 1 мкг/мл
Прямий Повнорозмірний тау-білок людини, фосфорилований іп
Зв'язування з рТаи | твердофазний Уго З використанням 4 кіназ (с9кЗр, Сак, РКА та СК15;
ІФА гіперфосфорилований тау-білок, або рТац), очищений та іммобілізований у концентрації 1 мкг/мл
Біотинільовані 15-ч-ленні пептиди, що перекривають
Прямий область з 441 амінокислоти (АК) тау-білка людини зі
Картування епітопу| твердофазний зрушенням 9 АК і перекриванням 6 АК, іммобілізовані в
ІФА концентрації 10 мкг/мл на 96б-ямковий планшет зі стрептавідином захопленням іммобілізованими антитілами проти ЇДдО
Іммобілізацію виконували протягом ночі у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВ5) при 4 "С. Планшети ретельно промивали 0,05 95 Гуееп-20/РВ5 і блокували 1 95 бичачим сироватковим альбуміном (БСА) в 0,05 95 Гуиееп-20/РВ5 протягом 1 год. при 37 "С. Антитіло, що міститься в надосадовій рідині гібридоми, додавали до зазначених розведень й інкубували протягом 2 год. при 37 "С, після чого планшети промивали, як описано раніше.
Для прямого твердофазного ІФА додавали вторинні антитіла проти ІДС миші, кон'юговані зі
ЩФ (дасКзоп Іттипогезеаг!сі І абогайгіех, Великобританія), при розведенні 1/6000 в 0,05 95
Тмжееп-20/РВ5 на 2 год. при 37 "С. Після останнього промивання планшети інкубували з розчином гексагідрату р-нітрофенілфосфату динатрія (рМРР; бБідпта-Аїагіси, Швейцарія) (субстрату фосфатази) і зчитували при 405 нм з використанням планшет-рідера для твердофазного ІФА (Тесап, Швейцарія). Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.).
Для твердофазного ІФА із захопленням оліго- і моно-тау-білка антитіла, що містилися у безсироватковій стерильній надосадовій рідині гібридом, іммобілізували на планшетах з іммобілізованим антитілом проти ДС при 500-кратному розведенні, а потім інкубували з оліго- або моно-тау-білюком, сайт-специфічно біотинільованим через АМІ-маркер. Інкубування мішені почали при концентрації 5 мкг/мл, а потім розбавили у 8 або 16 разів. Для кількісної оцінки сигналу на планшет-рідері (Тесап, Швейцарія) використовували стрептавідин-ПХ і субстрат
АВТ5. Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.).
Оцінки спорідненості
Спорідненість неочищених антитіл у безсироватковій надосадовій рідині гібридом оцінювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу з використанням приладу Віасоге Т-100 (СЕ Неайсаге, Великобританія). Антитіла іммобілізували на чип біосенсора з антитілами проти
ІДС і використовували Та (ЗідпаІснет, Канада) в якості аналізованої речовини-мішені. Аналіз кінетики виконували з використанням моделі Ленгмюра 1:1.
Аналіз на основі електрофорезу в ДСН-ПААГ і вестерн-блоттингу
Зв'язування відібраних антитіл проти будь-яких форм тау-білка з тау-білюом у головному мозку людини аналізували шляхом вестерн-блоттингу (М/В), використовуючи лізати головного мозку трьох донорів із ХА та трьох контрольних донорів відповідного віку без ХА (Тівзвцеє зЗоЇшіоп5, Великобританія). Лізати обробили, одержавши розчинну фракцію тау-білка, що не містила детергенту. Оброблені лізати завантажили в гелі з 4-12 95 біс-трисом (Момех, І їе
Тесппоіодіех, Швейцарія), перенесли на ПВДФ-мембрани Іттобіп і виконали блоттинг із тестованими антитілами і з вторинним антитілом кози ІНЮСує 800СМУ проти антитіл миші (І і-Сог,
США).
Твердофазньій ІФА з використанням лізатів головного мозку людини
Для оцінки зв'язування вибраних антитіл з неденатурованим тау-білюом людини в лізатах головного мозку при ХА та контрольних лізатах головного мозку антитіла з надосадової рідини гіоридом, а також негативні та позитивні контрольні антитіла іммобілізували на 9б6-ямковому планшеті, як описано вище. Потім виконували захоплення та виявлення тау-білка в розчинних лізатах головного мозку людини від суб'єктів при ХА або контрольних суб'єктів відповідного віку (400 мкг/мл білка, всі зразки отримані з Тізвце боіІшіопе, Великобританія) з використанням поліклонального антитіла кролика проти будь-яких форм тау-білка (Абеат, Великобританія), а потім - кон'югату "антитіло проти Ес-у-фрагмента Ід кролика-ЩФ" (дасКкзоп Іттипогезеагси,
США). Лізати головного мозку миші з нокаутом гена тау-білка використовували в якості негативного контрольного зразка. Планшети інкубували з розчином субстрату фосфатази РМР Р (бБідта-Аїагісти) і зчитували при довжині хвилі 405 нм з використанням планшет-рідера для твердофазного ІФА (Тесап, Швейцарія). Результати виражали в одиницях оптичної щільності (0.0.).
Секвенування антитіл гібридом
Лізати клітин гібридом відправили в Апійоре (Апійоре, Великобританія) для секвенування генів варіабельної області. Коротенько, ЗТ-ПЛР проводили з використанням пулів вироджених праймерів для сигнальних послідовностей миші разом із праймерами константної області для кожного гена варіабельної області важкого ланцюга (МН) ІдС, УН І9М, варіабельної області легкого каппа- (КМІ) і А-МІ ланцюгів ЇД. мРНК М-області важкого ланцюга ампліфікували з використанням набору з шести пулів вироджених праймерів (НА-НЕ), специфічних стосовно сигнальних послідовностей УН, разом з ІМ або ІдСі-специфічними праймерами константної області. мРНК М-області легкого ланцюга ампліфікували з використанням набору з восьми пулів вироджених праймерів, специфічних стосовно сигнальних послідовностей, сім з яких були специфічні стосовно каппа-кластера (КА-КСО) й один - до А-кластера (І А), разом з праймерами константної області К- або Л, -ланцюга. ПЛР-продукти, отримані в результаті успішної ампліфікації очищали, клонували в клонуючому векторі "ТА" (раєМ-Т Еавзу, Рготеада), трансформованому в ЕЕ. соїї, і секвенували окремі колонії. Нуклеотидні й амінокислотні послідовності МІН- і Мі -областей антитіл визначили у послідовностях 27 гібридом, які продукують антитіла.
Результати
Вибір гібридом для субклонування
Гібридоми, отримані в кожному з трьох циклів злиття (у цілому 299 гібридом, отриманих з десяти злиттів), спочатку аналізували на предмет зв'язування з Па, причому відібрані гібридоми додатково аналізували на предмет зв'язування з рГай й олігомеризованим тау- білком. Мета дослідження полягала у відборі антитіл, рівною мірою добре зв'язуючих тау-білок і тау-білок з посттрансляційними модифікаціями, наприклад, фосфорилований або олігомерний тау-білок. Для цього гібридоми аналізували з метою відбору кращих властивостей стосовно будь-яких форм тау-білка. Для визначення області зв'язування антитіла та конкретного епітопу тау-білка спочатку визначали область зв'язування з використанням різних фрагментів тау-білка, а потім - бібліотеки 15-членних пептидів тау-білка, що перекриваються, які охоплюють повну послідовність самої довгої ізоформи тау-білка людини, що містить 441 амінокислоту (АК). Групу антитіл, що зв'язуються із заздалегідь певними областями тау-білка, навмисно виключили з експерименту з метою максимізації зв'язування з різними формами тау-білка, що містять посттрансляційні модифікації, і всіма шістьма різними ізоформами тау-білка людини, що присутні в людей.
Три серії злиття дозволили одержати 133 субклонованих стабільних гібридом, які піддали скринінгу для виявлення кращих властивостей стосовно будь-яких форм тау-білка. Комбінацію різних скринінгових аналізів використовували для зниження кількості гібридом, які продукують антитіла, що мають властивості, переважні для антитіл проти будь-яких форм тау-білка. Для порівняння зв'язування з їІТаий та рТаи проаналізували 90 гібридом і відібрали 24 гібридоми, показані на Фігурі 1А-Е. Оскільки початковий скринінг виконували з використанням фрагментів тау-білка з метою уникнути відбору антитіл, що зв'язуються з областями тау-білка, які свідомо характеризуються високою щільністю залишків, що зазнають фосфорилювання при хворобі
Альцгеймера (ХА) та інших таупатіях, більшість протестованих антитіл зв'язувалися як з їІТаи, так ії з рГаи з аналогічними властивостями зв'язування, відповідно до даного твердофазного
ІФА.
У деяких варіантах реалізації бажано, щоб антитіло проти будь-яких форм тау-білка зв'язувало мономерні й олігомерні форми тау-білка без явної переваги стосовно якого-небудь з них. Схему твердофазного ІФА із захопленням розробили з метою визначення зв'язування антитіл як з мономерними, так і з олігомерними формами їїТай. Твердофазний ІФА в режимі захоплення зберігав олігомерну конформацію заздалегідь олігомеризованого тау-білка та мономерний стан моно-тау-білка краще, ніж у режимі прямого твердофазного ІФА з іммобілізацією мішеней на планшеті для твердофазного ІФА.
Виконали кожний варіант аналізу, безпосередньо порівнюючи зв'язування двох форм тау- білка з усіма 90 тестованими антитілами. Антитіла, які свідомо характеризуються переважним зв'язуванням з оліго-тау-білюом або не розрізняють зазначені дві форми тау-білка, використовували в якості контрольних антитіл при кожному варіанті аналізу. Результати для 18 гіоридом показані на Фігурі 2А-Е.
Картування епітопів має важливе значення для відбору антитіл з гарними властивостями стосовно будь-яких форм тау-білка, оскільки дозволяє виключити антитіла, що зв'язуються з областями з високою щільністю потенційних залишків рТац (5ег, ТНг і Туг). Зв'язування з усіма шістьма ізоформами тау-білка людини також використовували в якості критерію відбору антитіл проти будь-яких форм тау-білка. Епітопи, що забезпечують зв'язування спочатку відібраних антитіл з будь-якими формами тау-білка, перевіряли і визначали з підвищеною точністю, використовуючи бібліотеку з 49 пептидів, довжина кожного з яких становила 15 амінокислот (АК), що охоплюють повнорозмірний тау-білок людини з перекриттям 6 АК залишків і зсувом 9
АК. Нумерація залишків була заснована на найдовшій ізоформі тау-білка людини (441 АК).
Неочищені антитіла використовували при високому розведенні (1/10) для перевірки зв'язування або відсутності зв'язування з усіма пептидами. Скринінг антитіл 112 гібридом, раніше відібраних за допомогою твердофазного ІФА, продемонстрував зв'язування з 20 різними епітопами тау- білка (таблиця 4). 60
Таблиця 4
Епітопи тау-білка для антитіл
Таблиця 4
Епітопи тау-білка для антитіл
Таблиця 4
Епітопи тау-білка для антитіл
Вимірювання спорідненості до їІТаий виконали для 46 антитіл за допомогою ППР на приладі
Віасоге з визначенням Ко. Вимірювання спорідненості на Віасоге виконували шляхом іммобілізації антитіл на чипі з антитілами проти ІдСї і використовуючи їТацй в якості цільової аналізованої сполуки. Результати для 32 антитіл наведені в таблиці 5, причому антитіла відсортовані за спорідненістю до їТай. Серед досліджених на предмет спорідненості до ПТаи антитіл 22 антитіла мали спорідненість краще 20 нМ, з них 14 антитіл мали Ко нижче 5 нМ, а антитіло 37О03-НОУ мало Ко (спорідненість), рівну 1 нМ.
Таблиця 5
Спорідненість до Та 0 ла5ВвИнІ11171Ї111111111111111111116 1 5асТе3111171Ї1111111111111111111116811сссСс21 00011 МНАВІО 7 Ї77777171717111111111171691сссСсСсСсИс2
Для перевірки зв'язування вибраних антитіл до всіх шести ізоформ тау-білка людини виконали електрофорез у ДСН-ПААГ з леддером на основі рекомбінантного тау-білка, що містить всі шість ізоформ, і вестерн-блоттинг (М/В) з використанням трьох вибраних антитіл проти тау-білка. Всі три антитіла проти будь-яких форм тау-білка зв'язували всі шість ізоформ тау-білка (Фігура 3). Крім того, гомогенати головного мозку трьох суб'єктів з ХА та двох контрольних суб'єктів відповідного віку одночасно аналізували з метою порівняння. Як і очікувалося на основі картованих епітопів, усі три антитіла, протестовані в даному аналізі, продемонстрували зв'язування з усіма шістьма ізоформами тау-білка. Відмінність, що спостерігалася в картині смуг у суб'єктів-людей з ХА та контрольних донорів, може відображати більший ступінь фосфорилювання та/або ДСН-стабільні агрегати тау-білка, які, як очікується, повинні бути присутніми у суб'єктів з ХА.
Зразки від людей з хворобою Альцгеймера (ХА) та контрольні зразки додатково аналізували за допомогою твердофазного ІФА із захопленням у не денатуруючих умовах з метою перевірки зв'язування з тау-білюом у головному мозку людей. Зразки лізатів двох суб'єктів з ХА та двох контрольних суб'єктів відповідного віку без ХА, оброблені для виділення розчинного тау-білка, аналізували в 8 розведеннях, тестуючи три антитіла (Фігура 4А-С).
Послідовності варіабельного ланцюга антитіла визначили для 27 гібридом (Апійоре,
Великобританія). Білкові послідовності деяких варіабельних доменів і гіперваріабельних областей (НУЕ) важких і легких ланцюгів показані в таблиці послідовностей.
Приклад 3: Дослідження характеристик антитіл проти тау-білка
Важкі та легкі ланцюги антитіла конструювали за допомогою синтезу генів і субклонування отриманої ДНК в експресійних векторах ссавців для дСеага миші (важкий ланцюг) та каппа- ланцюга (легкого ланцюга) миші. Антитіла експресували в клітинах СНО або 2937 шляхом часової спільної трансфекції плазмід для важкого ланцюга та легкого ланцюга й очищали з використанням афінної смоли Мабзеїієесізите (СЕ Неаййсаге Їйе Зсіепсе5). Очищені рекомбінантні антитіла піддавали скринінгу на предмет зв'язування з мономерним тау-білком на приладі Віасоге 1200 для поверхневого плазмонного резонансу з використанням набору для захоплення ІДС. миші та чипа бегіє5х 5 СМ5. Антитіла у форматі тідСга, розведені 10 мМ
НЕРЕБ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05595 Гмуеєеп 20 (буфером для аналізу, НВОР) захоплювали протягом 30 або 45 секунд у концентрації 1 мкг/мл (антитіла 26С1, 9482-С1, 52Е6-Е11.м1, 52Е6-
Е11.м2, 11Е10-88, 55Е7-Е11, 125811-НЗ3, 123Е9-АТ, 3001-82, 66Е5-АТ, 89Е4-АТ, 93АВ8-02 і 126Е11-С11) або протягом 70 або 150 секунд у концентрації 0,1 мкг/мл (антитіла 19Н6-Е7, ЗА4-
Н4, 54С1-Н11 ї 3703-НОЯ) при швидкості потоку 10 мкл/хв. Зв'язування мономера тау-білка в
НВ5Р відслідковували при 25 "С, швидкості потоку 30 мкл/хв. і концентраціях 16, 31, 63, 125, 125, 250 і 500 НМ для антитіл 26С1 і 9482; 16, 31, 63, 125, 125, 250, 500 ї 1000 нМ для антитіл
Б2Е6-Е11.м1 ії 52Е6-Е11 м2; 6, 19, 56, 56, 167 і 500 нМ для антитіл 11Е10-88, 55Е7-Е11 ії 125811-
НЗ; 5, 16, 49, 148, 148, 444, 1333 ії 4000 нМ для антитіл 123Е9-А1, 3021-82, 66Е5-А1, 89Е4-А1, 9ЗАВ8-02 і 126Е11-С11; 0,4, 1,6, 6,3, 2,5, 100 ї 400 нМ для 19Н6-Е7;10,2, 0,8, 4,4, 201ї 100 нМ для
ЗА4-Н4, 54С1-Н11 ї 3703-НУ. Час асоціації та дисоціації відслідковували протягом 180-480 секунд і 300-600 секунд, відповідно. Антитіло 3703-НО відібрали для подальшого аналізу через високу спорідненість (таблиця б) та відсутність мотивів глікозилювання МХ5/1 в СОВ.
Таблиця 6
Ко (НМ) антитіл миші до мономера тау-білка людини. Дані являють собою результат використання моделі зв'язування 1:1. 94217776 5хлм1 711111 зхлом
БасіНни ////Ї7777771717171067777777171 17717171 З3хлої |777717171ахлом
Таблиця 6
Ко (НМ) антитіл миші до мономера тау-білка людини. Дані являють собою результат використання моделі зв'язування 1:1.
ЯЗАВра777СЇ7777771717117161111717171711171117171713хло |7771717171ахло 3703-НУ демонструвало авідність при зв'язуванні з тау-білком
Мономерний тау-білок людини ковалентно приєднували до чипа Віасоге бепез 5 СМ5 з використанням набору Віасоге Атіпе Соиріїпу Кі (СЕ Ме Зсієпсе5), що призводило до іммобілізації до рівня приблизно 128 РЕ. Пряме зв'язування 3703-НО з Раб й Іїдс форматами відслідковували з використанням експериментального формату кінетики протягом одиночного циклу з п'ятьма періодами асоціації по 300 с і концентрацій антитіла 1, 2, 4, 8 і 16 нМ (ІдС) або 5, 10, 20, 40 ї 80 нм (Раб). Дисоціацію відслідковували протягом 7200 секунд (Раб) або 14400 секунд (405). Значення швидкості дисоціації розраховували шляхом апроксимації моделі зв'язування 1:1 стосовно даних. Розраховані швидкості дисоціації становили 5,0 х 107 для ЕРар 3703-НУ ії 1,1 х 105 для Ід 3703-Н9 (45-кратна відмінність). На Фігурі 5 показана відмінність швидкостей дисоціації Раб (лівий графік) й Їдс (правий графік), що вказувало на демонстрацію авідности ІДИ 3703-НО.
Приклад 4: Гуманізація антитіл проти тау-білка
Антитіло 370 3-НУ гуманізували шляхом пересадження СОВ антитіла та вибраних каркасних залишків варіабельної області на консенсусний каркас антитіла людини (Оеєеппіх, М.5. (2010).
СО гераїг: А поме! арргоасі о апіїрбоду питапігаїййоп. іп Ситепі Тгтепав5 іп Мопосіопа! Апіїбоду
РемеІортепі апа Мапигасішигіпу, 5. У. Зпіге, МУ. Сботброїг, К. Веспіоїіа-Реїегз5 апа у). Апауа, еав. (5ргіпдег, Мем МогК), рр. 9-28). Оцінювали пересадження на консенсусний каркас МНЗ, МК і МК1.
Пересадження важкого ланцюга включало залишок антитіла миші у положенні 49 (система нумерації за Кара). Пересадження МК2 включало залишки антитіла миші у положеннях 2 і 4 каркаса. Пересадження УК1І включало залишки антитіла миші у положеннях 2, 4 і 43 каркаса.
Гуманізовані варіанти сконструювали шляхом синтезу генів і субклонування в експресійних векторах ссавців для ІДС1 або Ід4 і каппа-ланцюга людини. Антитіла експресували шляхом спільної трансфекції плазмід важкого та легкого ланцюга в клітини СНО й очищали з використанням афінної смоли Мабрзеїесі бите. Гуманізовані варіанти піддали скринінгу на предмет спорідненості до мономера тау-білка людини з використанням набору Віасоге для захоплення ІДС людини, чипа бегіез 5 СМ5 і приладу Віасоге 1200. Антитіла розбавляли до 2 мкг/мл і захоплювали протягом 15 секунд при швидкості 10 мкл/хв. Асоціацію та дисоціацію 100, 33, 11 ї 3,7 НМ мономера тау-білка людини в 10 мМ НЕРЕЗ рН 7,4, 150 мМ масі, 0,05 95, Гуееп- 20 (буфер для аналізу, НВОР) відслідковували протягом 180 і 600 секунд, відповідно, при швидкості потоку 30 мкл/хв. До результатів застосували модель зв'язування 1:1 (таблиця 7).
Таблиця 7
Скринінг спорідненості гуманізованих варіантів мономерного тау-білка людини
Таблиця 7
Скринінг спорідненості гуманізованих варіантів мономерного тау-білка людини пи3703-НЯМІЗ 77771111 (Калла? |777717171711190С21С
Варіанти антитіла пи3703-НО.м1, пи3703-НУ.м2, пи3703-НУО.м5 і пи3703-НОУ.м6 надалі досліджували за допомогою поверхневого плазмонного резонансу з додатковими концентраціями антитіла та більше тривалим часом асоціації/дисоціації. Ці варіанти аналізували в розширеному діапазоні концентрацій мономера тау-білка людини (1,2, 3,7, 11.1, 33,3, 100 нМ) і при збільшеній тривалості асоціації (300 секунд) та дисоціації (1200 секунд). До результатів застосували модель зв'язування 1:1 (таблиця 8).
Таблиця 8
Докладний аналіз кінетики зв'язування відібраних варіантів із тау-білком людини за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
У деякі антитіла ДС4 включали мутацію УТЕ (М252у/5254Т/Т256Е). Описано, що мутації домена зв'язування рецептора Ес немовлят (ЕсВп), наприклад, М252У, 52541 і Т256Е (УТЕ) збільшували зв'язування з ЕсАп і тим самим збільшували час напівжиття антитіл. Див.
Опубліковану патентну заявку США Мо 2003/0190311 і раІгАсдпа еї а!ї.). Віої. Спет. 281:23514- 23524 (2006).
Антитіло 125811-НЗ3 гуманізували з використанням консенсусних каркасів УМНЗ і МК.
Пересадження важкого ланцюга включало залишки антитіла миші у положенні 78 (система нумерації за Кабраї). Пересадження Ук1 включало залишки антитіла миші у положеннях 43 і 87 каркаса. Легкий ланцюг 113Е5-Е7 також гуманізували з використанням каркаса МК! і додаткових залишків антитіла миші у положеннях 43 і 87.
Гуманізовані варіанти важких ланцюгів (125811) і легких ланцюгів (125811 і 1135-Е7) спільно трансфікували в декількох комбінаціях й очищали в 96-ямковому форматі, як описано вище. Потім гуманізовані варіанти піддали скринінгу на предмет спорідненості до мономера тау- білка людини з використанням набору Віасоге для захоплення ІДС людини, чипа 5егіе5 5 СМ5 і приладу Віасоге Т200. Антитіла розбавляли до 2 мкг/мл і захоплювали протягом 15 секунд при швидкості 10 мкл/хв. Асоціацію та дисоціацію 0, 100 ії 500 нМ мономера тау-білка людини в
НВ5Р відслідковували протягом 180 і 300 секунд, відповідно, при швидкості потоку 40 мкл/хв. До результатів застосували модель зв'язування 1:1 (таблиця 9).
Таблиця 9
Скринінг гуманізованих варіантів 125811-Н3 і 113Е5-Е7 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Ко при скринінгу (НМ) Гуманізований варіант важкого ланцюга 125811 о ПРИ ПРЛИТУ ; 16219 | 18 | 718 | 15 | 85 | - гуманіз ОРЯНИИ одеюто (02 1 20 120 | 19 74 | - | м ланцюга 125811 оз | 21 | 23 | 20 | 15 | - | - гумані ; і ьст | 57 | 61 | 5 | 4 | - | - варіант о пекою. 02 167 | 68 55 | 47 | - | - ланцюга ім13гб-г7ї 103 | 61 | 64 | 54 | 47 | мо | - 4 | 7 | 7 | 6 | | - | - " Мінімальне зв'язування з мономером тау-білка
МТ « не тестували
Варіанти пи125ВН.м17 (НСЗАЇ С1), пит125811.м26 (НС44 02) ії пи125811.м28 (НОСА Са) відібрали для аналізу кінетики з високим дозволом на підставі скринінгу спорідненості (таблиця 10). Антитіло 9482-С1 гуманізували з використанням каркасів УНІ їі МК2. Пересадження важкого ланцюга також включало залишки антитіла миші у положенні 28, 29, 67, 69, 71 і 73 (система нумерації за Кара). Пересадження УК2 включало залишки антитіла миші у положеннях 2, З6 і 46 каркаса. Комбінації восьми важких ланцюгів і восьми легких ланцюгів експресували, очищали і піддали скринінгу за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР), як описано вище для 125811. Результати ППР-скринінгу представлені в таблиці 11. Варіант пи9482.м105 (варіант важкого ланцюга 9482.НС1, варіант легкого ланцюга 9482.1С13) відібрали для докладного
ППР-дослідження (таблиця 11).
Таблиця 10
Кінетичні дані для відібраних гуманізованих варіантів антитіл проти тау-білка пи125811.м17 пІдСІ 0,8 х 105 0,8 х 103 пи125811.м26 пІдСІ 0,7 х 105 0,7 х 103 пи125811.м28 пІдСІ 0,7 х 105 0,7 х 103 пи9482.х105 пдС 0,8 х 105 0,3 х 103
Таблиця 11
Скринінг гуманізованих варіантів 9482 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Ко при скринінгу (НМ) Гуманізований варіант легкого ланцюга 9482: о при скринінгу істо ГТ 1с11 ГТ 1с12 | 1с13 1114 1115 1 116 нс 38 | 5 | 9151 5 | 4117 | 85 |тл040| 85 нсг | 57 | 5 | 896 | 5 | 74 | м | 9961 5 гуманізований ССЗ 1720718 16981 8 1 381 5 | 861 5 ланшюгасіво 1 НС51 27 15 | 6261 540 517261 8 нов. 09 | 5 | 701 | 5 | 30 | 5 | 741 | 5 нс7| 529 | 5 | 8 | 5 | 578| 5 | 8 | 5 нев то | 5 | 443| 5 | 24 | 5 | 15| 5 / " Середнє по п-З повторностям.
тпи9482.м105.
Спостерігали мінімальне зв'язування з мономером тау-білка.
МТ « не тестували
Приклад 5: Аналіз стабільності гуманізованих антитіл проти тау-білка Ідентифікація хімічної нестабільності
Зразки антитіл зазнавали термічної стресової обробки, щоб імітувати стабільність протягом 5 строку придатності продукту. Зразки діалізували із заміною буфера в 20 мМ ацетатний буфер, рН 5,5 або фосфатний буфер, рН 7,4, і розбавляли до концентрації 1 мг/мл. Один мл зразка піддавали стресовій обробці при 40 "С протягом 2 тижнів, а другий зберігали при -70 "С в якості контролю. Потім обидва зразка гідролізували з використанням трипсину для одержання пептидів, які можна було аналізувати з використанням рідинної хроматографії (РХ) - мас- спектрометрії (МС). Для кожного пептиду зі зразка були отримані час утримання (за допомогою
РХ), а також точна маса з високим дозволом й інформація про іонну фрагментацію пептиду (інформація про амінокислотну послідовність) (за допомогою МС). Для пептидів, що представляють інтерес (нативних і модифікованих пептидних іонів), одержали хроматограми екстрагованих іонів (ХІС) з наборів даних у вікні -10 м. Д.; піки інтегрували для визначення площі. Відносний відсоток модифікації розраховували для кожного зразка за формулою "(площа модифікованого пептиду) розділити на (площа модифікованого пептиду плюс площа нативного пептиду) помножити на 100". Потім ці відносні процентні показники порівнювали в контрольному (1-0) та підданому стресу (1-2 тижня) зразках. Показані процентні показники відображали результат вирахування контрольного (1-0) значення зі значення після стресу (1-2 тижня). Аналіз дезамідування антитіл ПпиЗ7О0З3-НО.мі ії НпиЗ3З703-НЗО.м5 призвів до спостереження, що послідовність М28(329М30 (нумерація за Кара) в межах СОВ-1 легкого ланцюга була піддана дезамідуванню. Збільшення для дезамідованої послідовності Ме8(329М30 склало 16,5 95 для пи3703-НО.м1 і 11 95 для пи3703-НУ м.
Вплив дезамідування антитіла на зв'язування з антигеном
Для оцінки впливу дезамідування М на спорідненість до тау-білка людини було бажано одержати два зразки з чітко різним статусом дезамідування М28. Ни3703-НОУ.м5 пІдСс4. 5228Р інкубували при температурі 40 "С протягом двох тижнів у концентрації 1 мг/мл у фізіологічному розчині з фосфатним буфером, рН 7,4. Дезамідування мотиву М289(2329 вимірювали за допомогою
РХ-МС/МОС. Посилення дезамідування в зразку після стресу (1-2 тижня) склало 43,1 95 у порівнянні зі зразком, що не зазнали стресу (1-0). Антитіла, які зазнали і не зазнали стресу, аналізували на предмет зв'язування з тау-білююом за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (Віасоге) з використанням набору СЕ Віасоге для захоплення Ід людини і чипа зЗепе5 5 СМ5. пПІда розбавляли до 2 мкг/мл 10 мМ НЕРЕЗ рН 7,4, 150 мм Масі, 0,05 95 Гиуееп 20 (буфер для аналізу, НВ5Р) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 15 секунд (зразок Ю) або 17 секунд (зразок 12). Дані про кінетику збирали для мономера тау- білка людини, введеного в концентрації 0, 3,1, 6,3, 12,5, 25, 25, 50 і 100 нМ в НВ5Р при швидкості потоку ЗО мкл/хв., тривалості фази асоціації 300 с ії фази дисоціації - 1800 с. Між циклами поверхня регенерували з використанням З0-секундної ін'єкції З М хлориду магнію при швидкості 10 мкл/хв. Модель зв'язування 1:11 апроксимували з використанням настроювань приладу за замовчуванням, включаючи локальну апроксимацію параметра "ВІ". Результати, показані на Фігурі б і в таблиці 12, демонструють, що хоча в даному експерименті рівень іммобілізації антитіла після стресу вище, ніж для антитіла, що не зазнав стресу, амплітуда сигналу зв'язування тау-білка (представлена величиною параметра Етах) була помітно нижче.
Після нормування значення Ніптах за відмінностями у рівні захоплення виявилося, що зразок після стресу (1-2 тижня) демонстрував приблизно половинну зв'язуючу здатність стосовно загального тау-білка у порівнянні зі зразком, що не зазнали стресу (на що вказувало 56 95 зниження нормованого Нтах). Розрахована спорідненість, мабуть, не змінилося: в даному аналізі різниця Ко між зразками "-0" ії ї-2 тижня" склала менше 2 95 (Ко - 0,7 нМ для 1-0 і 1-2 тижня). Ці результати узгоджувалися з тим, що зразок "ї-2 тижня" містив значно зменшену популяцію антитіла з високою спорідненістю.
Таблиця 12
Відносне зв'язування зразків пи 3703-НОУ.м5, що зазнали і не знали стресу, з мономерним тау- білком, виміряне за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Зразок пи37О3- Нормований АНтах Зміна нормованого
НУм5 пІда4.5228 |Рівень ліганду (РЕ) Атах (РЕ) (-Атах / рівень Втах
Р ліганд тижня
З урахуванням очікувань, що дезамідування аспарагіну призводить до утворення аспарагінової кислоти й ізоаспарагінової кислоти (Візспоїї В. КоїЇре Н.М.. (1994). ). Спготаї. 5, 662, р. 261-278), аналізували вплив заміни Ме8 на 028 (варіант пи3703-НО.м5 М280) на спорідненість до мономера тау-білка людини. Спорідненість оцінювали при 25" С за допомогою приладу Віасоге 1200, набору СЕ Віасоге для захоплення Ід людини і чипа СМ5 5егієз 5. ПІДО розбавляли до 2 мкг/мл 10 мМ НЕРЕБ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05 95 Тмеєп 20 (буфер для аналізу, НВ5Р) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 22 секунд.
Дані про кінетику збирали для мономера тау-білка людини, введеного в концентрації 0, 6,3, 12,5, 25, 25, 50, 100, 200 і 400 нМ в НВ5ОР при швидкості потоку 30 мкл/хв., тривалості фази асоціації 300 с ії фази дисоціації - 600 с. Між циклами поверхня регенерували з використанням
ЗО0-секундної ін'єкції З М хлориду магнію при швидкості 10 мкл/хв. При аналізі кінетики за отриманими даними апроксимували модель зв'язування 1:11 і розраховували спорідненість пи3703-НУ.м5 ї пи3703-НУ.м5.3 (також називаного у даному документі пи3703-НУ.м5 Ма280).
Параметри, які використані для апроксимації моделі зв'язування 1:1, включали настроювання приладу за замовчуванням для локальної апроксимації параметра "ВІ". Результати показані на
Фігурі 7 і в таблиці 13.
Розрахована Ко для варіанта пи3703-НУ.м5 М280 склала 160 х 103 М у порівнянні з 1,5 х 10- 9 М (середнє, п - 4, визначення в рамках одного експерименту) для пи3703-НОм5, проаналізованого в тих самих умовах. Таким чином, перетворення М? в 028 призводить до » 100-кратного зниження спорідненості. Враховуючи порівняно низьку спорідненість та порівняно швидку кінетику варіанта М280 пи3703-НУ.м5, автори винаходу вирішили, що при аналізі кінетики суміші варіантів Ме8 ї 028 буде домінувати популяція з більше високою спорідненістю, і що на присутність варіантів зі зниженою спорідненістю може вказувати зниження нормованого
Атах. Для перевірки цього міркування профілі зв'язування варіантів антитіла пи3703-НО.м5 і пи3703-НУ.м5 М280 з тау-білком порівняли з профілем зв'язування суміші двох даних антитіл у рівних кількостях. У порівнянні з чистим пи3703-НУ.м5 суміш пи3703-НО.м5 ї пи3703-НУ.м5 М280 11 призвела до 4595 зниження нормованого НКтах (таблиця 13). Автори винаходу дійшли висновку, що зміни нормованого РЕтах після теплового стресу можуть вказувати на скорочення популяції антитіла з високою спорідненістю в зразку після стресу. Автори винаходу вважали, що зміни нормованого Нітах можна використовувати для скринінгу варіантів пи3703-НУО на предмет поліпшеної стабільності.
Таблиця 13
Зміни нормованого Нтах, спостережувані при тепловому стресі пи37О3-НО.У5 і після змішування пи3703-НУ.м5 з очікуваним продуктом дезамідування пи3703-НУ.м5 М280
Зниження нормованого
Зразок Ко (НМ) Атах (РЕ) | Етах у порівнянні з Коментарі еталоном
Середнє -/-стандартне відхилення для п 1,5:02 76,1-0,4 | Еталон чотирьох аналізів. у межах одного експерименту пи3703-НУм5 о шен | 6115011
Таблиця 13
Зміни нормованого Нтах, спостережувані при тепловому стресі пи37О3-НО.У5 і після змішування пи3703-НУ.м5 з очікуваним продуктом дезамідування пи3703-НУ.м5 М280
Зниження нормованого
Зразок Ко (НМ) Атах (РЕ) | Етах у порівнянні з Коментарі еталоном пав СТ пи3703-НО.м5 і пи3703-НУ.м5 20 464 45 9, Два антитіла змішали в м2гво співвідношенні 1:1 пІДС пи3703-НУм5 о Контроль для зразка пи3703-НУм5 підсяі.5228Р, 1,5 33,4 54 95 зразка після стресу
Її-2 тижня " Нормований Нтах-Нітах (РЕ) / рівень ліганду (РЕ). Нормований НАКтах для еталонного антитіла - 0,33 (середнє значення по чотирьом визначенням у рамках одного експерименту, стандартне відхилення «0,01).
Оптимізація та відбір антитіл
За допомогою Віасоге виконали оцінку дев'яноста варіантів 3703-НУ з метою порівняння їх функціональної стабільності при наявності двотижневого періоду теплового стресу (40 "С) або без нього. Ці варіанти включали більшість одиночних мутацій мотиву М28(329М30Т31, подвійних мутантів, що містять мутацію С29А, подвійні мутації Авп-28 і Туг-32, здатні функціонально замінити їх на залишки, з'єднані водневими зв'язками, а також усі можливі перестановки залишків 2, 4, 33 і 93, а також залишків, які присутні у вихідному антитілі 3703-НО або відповідних залишків ембріонального варіанта. Крім того, протестували мутації в контексті залишку 1 (Азр або Сі), який не виявляв впливу на спорідненість або стабільність залишку
Авп-28.
Антитіла експресували шляхом тимчасової трансфекції клітин Ехрі293 в 96-ямковому форматі й автоматизованого очищення на рідинній системі Тесап їтєвдот ЕМО 200 з 500-мкл голівкою МСА9Уб. Коротенько, ІДС в 1 мл культури захоплювали, використовуючи користувацькі колонки-наконечники, що містили 20 мкл смоли Марзбеїесі 5иВе (Сіудеп Согр « СЕ Неаїїйсагвє).
Після промивання 1 Х РВ5 (рН 7,4) Ід елюювали в 160 мкл 50 мМ фосфорної кислоти (рН 3) нейтралізували 12 мкл 20 Х РВ5 (рН 11). Колонки-наконечники Марбеїесі Бийе наконечник колони очищали 0,1 М Масон і регенерували 1 Х РВ5 (рН 7,4), що дозволяло використовувати їх до 15 разів підряд. Очищені антитіла в 9б-ямковому форматі нормували до концентрації 0,1 мг/мл з використанням роботизованої рідинної системи Натійоп 5їаг. Зразки "до стресу" зберігалися при температурі приблизно 4 "С, а зразки "після стресу" інкубували при 40 С протягом двох тижнів в апарату для ПЛР. Функціональну стабільність варіантів порівнювали за допомогою кінетичних експериментів з використанням поверхневого плазмонного резонансу та препаратів антитіл "до стресу" та "після стресу". Оцінку антитіл виконували з використанням чипа СМ5 бепйе5з 5 для захоплення антитіл людини, набору СЕ Віасоге для захоплення да людини і приладу Віасоге Т200. Антитіла, розведені до 2 мкг/мл, іммобілізували при часі ін'єкції 15 секунд і швидкості потоку 10 мкл/хв. Зв'язування з мономером тау-білка в концентрації 0 нМ, 26,5 нМ їі 265 нМ при 25"С і швидкості потоку 40 мкл/хв. відслідковували протягом фази асоціації тривалістю 180 секунд з наступною фазою дисоціації тривалістю 300 секунд. Зразки аналізували в 10 мМ НЕРЕ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05 95 Тжееп 20 (НВ5Р) з використанням формату кінетики з множинними циклами. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення ВіАемаЇІайоп, виконуючи апроксимацію моделі зв'язування 1:1. Отримані значення спорідненості (Ко) наведені на Фігурі 8А-ЮО. Крім того, розраховували індекс стабільності, виходячи з міркування, що антитіла з погіршеною спорідненістю (внаслідок, наприклад дезамідування ключових залишків), повинні вносити рівний вклад в рівень захоплення да ("рівень ліганду"), але менший внесок у вимірюване зв'язування тау-білка, і що це повинно відображатися в експериментально отриманому значенні Етах. Для врахування змін кількості кожного захопленого антитіла Нтах нормували за рівнем захоплення антитіл 5О0
(вимірюваному як "рівень ліганду", кількість одиниць відповіді при захопленні антитіла). Таким чином, нормований АНтах розраховували як відношення експериментального значення Нтах (одиниці - РЕ) до "рівня ліганду" (показнику оцінки, що являє собою кількість РЕ, зареєстровану на етапі захоплення Підс, одиниці - РЕ), а індекс стабільності у цьому випадку розраховували як відношення нормованого Нтах (після стресу) до нормованого Нтах (до стресу).
Відібрані антитіла експресували шляхом тимчасової трансфекції клітин СНО й очищали. Ці антитіла потім піддавали стресу протягом двох тижнів у концентрації 1 мг/мл й аналізували дезамідування за допомогою РХ-МС/МС з використанням НАСМ-триптичного пептидного картування з відновленням ОТТ, кепуванням ІАА та гідролізом при рН 8,2. Результати (таблиця 14) показали, що варіант пи3703-НЗ9.м28.А4 мав знижену схильність дезамідуванню мотиву мг8(329м3о, Зниження дезамідування пи3703-НО.м28.А4 було несподіваним, оскільки залишки не знаходяться у безпосередній близькості від залишка Авп-28 (Фігура 9), і неясно, яким чином мутація ЕЗЗІ могла стабілізувати Авп-28.
Таблиця 14
Стабільність варіантів пи3703-НОУ.м28.А4 у стрес-тестах щодо дезамідування
Посилення
Антитіло Умови теплового стресу дезамідування М28 (329
Мо легкого ланцюга пи3703-НОУ.мі | ніде он 5 в ацетатному буфері, 16,5 95 40"С в ацетатному буфері, М28:2,8 9 30.0) 2 9, носи о Ме я пиз703- 37 су РВ5, рН 74 мо: Н/В
Но м28.АХ 402С в ацетатному Буфер 30.0) 9 під04.5228Р. ТЕ ГРН Кр: о То 37 "С у РВ5, рН 74 М30-о 0 9
Приклад 6: Відбір і дослідження характеристик гуманізованого антитіла проти тау-білка
Відбір і дослідження характеристик антитіла: зв'язування з тау-білюом людини
Спорідненість відібраних антитіл оцінювали при 257 С за допомогою приладу Віасоге Т200, набору СЕ Віасоге для захоплення ІС людини і чипа СМ5 беїпевз 5. під розбавляли до 0,25 мкг/мл 10 мМ НЕРЕБ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05 95 ПГмеєп 20 (буфер для аналізу, НВ5Р) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 150 секунд. Дані про кінетику збирали для мономера тау-білка людини, введеного в концентрації 0, 0,4, 1,2, 3,7, 11,11, 33 100 НМ в НВР при швидкості потоку 30 мкл/хв., тривалості фази асоціації 300 с ії фази дисоціації - 600 с. Між циклами поверхню регенерували з використанням двох послідовних 30- секундних ін'єкцій З М МОСіІ при швидкості 10 мкл/хв. Дані апроксимували згідно з моделлю зв'язування 1:1 (таблиця 15).
Таблиця 15
Кінетичні дані для відібраних гуманізованих варіантів антитіл проти тау-білка
Коп (1/Ме пи3703-НО.м28.АЗІ підС 6,9 х 105 1,1 х 103 пи3703-НУ.м5 пІдСї 7,5 х 105 0,8 х 103 пи3703-НУ.м5 піда4.5228Р 7,1 х 105 0,9 х 103 пи3703-НО.м1 підс4.5228Р 6,7 х 105 1,3 х 103
Дослідження характеристик антитіл: зв "'язування з тау-білююм людини у форматі
Зо Масі.5228Р.МТЕ
Спорідненість оцінювали при 25 "С за допомогою приладу Віасоге 1200, набору СЕ Віасоге для захоплення ЕАБб людини і чипа СМ5 5беїгіевз 5. Під розбавляли до 0,5 мкг/мл 10 мМ НЕРЕ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05 95 Гуееп 20 (буфер для аналізу, НВ5Р) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 180 секунд. Дані про кінетику збирали для мономера тау- білка людини, введеного в концентрації 0, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 11, 33 і 100 нМ в НВ5Р при швидкості потоку 30 мкл/хв., тривалості фази асоціації 300 с і фази дисоціації - 600 с. Між циклами поверхню регенерували з використанням двох послідовних 60-секундних ін'єкцій 10 мМ гліцину (рН 21). Дані апроксимували згідно з моделлю зв'язування 1:1. Дані про кінетику представлені в таблиці 16.
Таблиця 16
Кінетика зв'язування пи3703-НО.м28.А4 пІдс4.5228Р.УТЕ з мономерним тау-білком людини при аналізі з використанням поверхневого плазмонного резонансу
Дослідження характеристик антитіл: зв'язування з тау-білком яванського макака
Спорідненість оцінювали при 25 "С за допомогою приладу Віасоге 1200, набору СЕ Віасоге для захоплення Ід людини і чипа СМ5 5егієз 5. Під розбавляли до 2 мкг/мл 10 мМ НЕРЕ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,05 95 Гуееп 20 (буфер для аналізу, НВ5Р) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 15 секунд. Дані про кінетику збирали для мономера тау- білка людини, введеного в як мінімум п'яти різних ненульових концентраціях від 1,2 і 100 нМ в одній повторності з концентрації. Кінетику оцінювали при швидкості потоку 30 мкл/хв., тривалості фази асоціації 300 секунд і тривалості фази дисоціації 600 секунд. Між циклами виконували 30-секундну регенеруючу ін'єсцію З М хлориду магнію при швидкості 10 мкл/хв.
Результати апроксимували згідно з моделлю зв'язування 1:1. Дані про кінетику представлені в таблиці 17.
Таблиця 17
Спорідненість гуманізованих антитіл проти тау-білка до мономерного тау-білку яванського макака пи3703-НЯМ5 | 125 177555 | 06 | 15х7105 | 1хт10з пиз7р3-НЯМІ | 1302 | 5 | 08 | 20хт105 | 1хт1оз
Гуманізовані антитіла пиЗ7О03.м28.А4 ії пи3З703.м28.Е1 також зв'яязувалися з фосфорилованим тау-білком (ртТаи).
Приклад 7: Фармакокінетика антитіла проти тау-білка.
Для оцінки фармакокінетики антитіла 3703-НО тідсбга проти тау-білка іп мімо мишам
С57ВІ/6, що знаходяться у свідомості, однократно вводили внутрішньовенну (в/в) або внутрішньочеревинну (в/ч) болюсну ін'єкцію в дозі 10 мг/кг. У різні моменти часу аж до 28 днів після введення дози збирали зразки плазми з метою визначення концентрації антитіла проти тау-білка.
Концентрації введеного антитіла у плазмі миші вимірювали за допомогою універсального твердофазного ІФА, використовуючи іммобілізоване антитіло миші проти тиЇдс2а з наступним додаванням зразків плазми, починаючи з розведення 1:100, і закінчуючи додаванням кон'югату "антитіло миші проти тидсага-біотин", а потім стрептавідину, кон'югованого з пероксидазою хрону, з метою виявлення. Аналіз характеризувався каліброваною кривою у діапазоні 1,56-200 нг/мл і межею виявлення 0,16 мкг/мл. Результати менше зазначеної межі виявлення реєстрували як "менше реєстрованого значення (І ТА)".
Б2
На Фігурі 10 показані результати фармакокінетичного аналізу антитіла 3703-НЗУ тідсга проти тау-білка. Вплив і виведення антитіла 3703-НО тідсСга проти тау-білка в мишей С57ВІ /6 дикого типу були аналогічні зазначеним параметрам ізотипового контрольного антитіла, причому виведення становило 6,31 мл/доба/кг.
Для оцінки фармакокінетики антитіла 9482-С1 тідсга проти тау-білка й антитіла 125811-НЗ3 тідСга проти тау-білка іп мімо мишам С57ВІ/6б, що знаходяться у свідомості, однократно вводили в/ч болюсну ін'єкцію антитіла в дозі 10 мг/кг. У різні моменти часу аж до 28 днів після введення дози збирали зразки плазми з метою визначення концентрації антитіла проти тау- білка.
Концентрації введеного антитіла у плазмі миші вимірювали за допомогою універсального твердофазного ІФА, використовуючи іммобілізоване антитіло миші проти тиЇдс2а з наступним додаванням зразків плазми, починаючи з розведення 1:100, і закінчуючи додаванням кон'югату "антитіло миші проти тидсага-біотин", а потім стрептавідину, кон'югованого з пероксидазою хрону, з метою виявлення. Аналіз характеризувався каліброваною кривою у діапазоні 0,78-100 нг/мл і межею виявлення 0,078 мкг/мл. Концентрації також вимірювали за допомогою специфічного твердофазного ІФА, використовуючи іммобілізований рекомбінантний тау-білок з наступним додаванням зразків плазми, починаючи з розведення 1:10, і закінчуючи додаванням антитіла кози проти тідСга, кон'югованого з пероксидазою хрону, з метою виявлення. Аналіз характеризувався каліброваною кривою у діапазоні 0,078-10 нг/мл і межею виявлення 0,0008 мкг/мл. Результати менше зазначеної межі виявлення реєстрували як "менше реєстрованого значення (І. ТА)".
Результати цих експериментів наведені на Фігурах 16 і 17. Вплив і виведення антитіла 9482 тідСсга проти тау-білка в мишей С57ВІ /6 дикого типу були аналогічні відповідним параметрам ізотипового контрольного антитіла при стандартному аналізі концентрацій, однак при використанні специфічного аналізу вплив був більше низьким, а виведення більше швидким.
Див. Фігуру 16. Виведення, обумовлене при стандартному аналізі, становило 4,06 мл/доба/кг, а при специфічному аналізі - 7,53 мл/доба/кг. Ці результати показують, що антитіло може згодом зазнати змін іп мімо, які порушують його здатність розпізнавати свою мішень. Вплив і виведення антитіла 125811-Н3 тідсб2га проти тау-білка в мишей С57ВІ/6Є дикого типу були аналогічні відповідним параметрам ізотипового контрольного антитіла, незалежно від виду аналізу, який використовували для одержання концентрацій. Див. Фігуру 17. Виведення, обумовлене при стандартному аналізі, становило 4,96 мл/доба/кг, а при специфічному аналізі - 4,90 мл/доба/кг.
У таблиці 18 показані фармакокінетичні параметри для антитіл 37 Ю3-НеО, 9482-С1 і 125811-
НЗ проти тау-білка в мишей.
Таблиця 18
Фармакокінетичні параметри антитіл проти тау-білка . . ППКІп СІ або СУБ 00000 фпосбнводення Анало Смакс(иютии) пуил'доба) | Финідовау. в/в Стандартний 185 1590 6,31 в/ч Стандартний 151 2460 4,06 в/ч Стандартний 127 2020 4,96
Для оцінки фармакокінетики антитіл пи3703.м28.А4 пІдса4.5228Р і пи3703.м28.А4 пІдСсі-
З228Р.УТЕ іп мімо, яванским макакам (Масаса Газсісціагів), що знаходяться у свідомості, вводили однократну в/в болюсну ін'єкцію в дозі 1 мг/кг. У різні моменти часу аж до 49 днів після введення дози збирали зразки плазми з метою визначення концентрації антитіла проти тау- білка.
Концентрації введеного антитіла у плазмі мавпи вимірювали за допомогою стандартного твердофазного ІФА, використовуючи іммобілізоване антитіло вівці проти ІДС людини з наступним додаванням зразків плазми, починаючи з розведення 1:100, і закінчуючи додаванням антитіла кози проти ДСї людини, кон'югованого з пероксидазою хрону, з метою виявлення.
Аналіз характеризувався каліброваною кривою у діапазоні 0,156-20 нг/мл і межею виявлення 0,02 мкг/мл. Результати менше зазначеної межі виявлення реєстрували як "менше реєстрованого значення (І. ТА)".
На Фігурі 11 показані результати фармакокінетичного аналізу пи3703.м28.А4 пІдСс4.5228Р і пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ. На фігурі 11 кожний набір даних являє собою дані для однієї тварини; лінії являють собою середні значення для всіх тварин у групі антитіла й аналізу. У таблиці 19 показані фармакокінетичні параметри пи3703.м28.А4 пІдсі4.5228Р і пи3703.м28.А4 піда4-5228Р.УТЕ в яванських макак.
Таблиця 19
Фармакокінетичні параметри пи3703.м28.А4 пІдсі4.5228Р і пи3703.м28.А4 пІда4-5228Р.УТЕ в яванських макак . . Смакс ППКІЙІ С проти 340 пІдс4.5228Р Специфічний 35,451,37 419-89,9 2,4750,581 60,83,49 піяс4.5228Р.МТЕ |Специфічний 33,5:2,72 520539,0 1,9320,139 56,5:4,90
Приклад 8: Подальше дослідження епітопів антитіла проти тау-білка
Після порівняння зв'язування 3703-НУО з біотинільованим мономерним тау-білком і біотинільованим пептидом (МАРТ10-24) також виконали оцінку зв'язування 3703-НУ з додатковими біотинільованими пептидами. 9б-ямкові планшети Мипс тахізогр покривали нейтравідином, розведеним до 2 мкг/мл 50 мМ натрій-карбонатним буфером, рН 9,6, при 4 7С протягом » 12 годин. Усі подальші етапи інкубування виконували при кімнатній температурі.
Після покриття планшети блокували блокувальним буфером Зирегбіоск "м (РВ5) (Тнепто Різнег зЗсіепійіс) протягом двох годин, потім ретельно промивали РВ5 з 0,05 95 полісорбатом 20. Потім лунки піддавали впливу біотинільованих пептидів тау-білка (таблиця 20) або біотинільованого мономерного тау-білка з Амі-маркером у концентрації 1 мкг/мл протягом однієї години і промивали, як на попередніх етапах. Пептиди синтезували з використанням стандартних Етос- реакцій твердофазного синтезу (див., наприклад, Рітос 50їїа рпазе реріїде зупіпевів: А ргасіїіса арргоаси; СНнап, МУ.С., МУніїе, Р.О, Еавз.; Охтога Опімегейу Ргезв: Мем Моїк, 2000). Антитіла 3703-
НУ тідсга і пи3703-НУ.м5 пІдс1, послідовно розведені з концентрації 500 нМ до 50 пМ 90 95 блокувальним буфером Бирегпбіоск"м (РВ5), піддавали зв'язуванню з лунками, покритими біотинільованим тау-білюом, протягом 90 хвилин. Лунки промивали, як описано раніше, і виявляли зв'язане антитіло з використанням вторинного антитіла, кон'югованого з пероксидазою (Іпуйтодеп / Ше Тесппоіодіез), розведеного 111000 блокувальним буфером зирегтіоск"мМ (антитіла кролика проти ІДС миші або антитілом кози проти Ід людини (Н - І), відповідно). Через двадцять хвилин лунки промивали, як описано раніше, і за рахунок двокомпонентного субстрату ТМВ МісгомеїЇ 2-сотропепі Бибзігаїє (КРІ) розвивався сигнал.
Реакцію зупиняли шляхом додавання 1 М фосфорної кислоти і вимірювали поглинання при довжині хвилі 450 нм за допомогою планшет-рідера б5ресігаМах М2.
Таблиця 20
Послідовності пептидів
Результати описаного експерименту представлені на Фігурі 12. На Фігурі 12А показане зв'язування кожного із зазначених антитіл із зазначеними пептидами. Антитіла 37 03-НО і 9482-
С1 продемонстрували сильне зв'язування з фрагментом 10-24 у зазначеному експерименті, а антитіло 94Щ82-С1 також продемонструвало сильне зв'язування з фрагментом 1-15. Антитіла 19Е8-С11 ї 123Е9-АТ продемонстрували сильне зв'язування з фрагментом 19-33, а антитіло
89Е4-А1Т продемонструвало сильне зв'язування з фрагментами 28-42 і 37-51. Див. Фігуру 12А.
Антитіла 3703-НО тідСга і пи37О03-НУ.м5 НпІдДСТ продемонстрували сильне зв'язування з фрагментами 2-24 і 2-34 тау-білка та більше слабке зв'язування з фрагментом 10-24. Див.
Фігури 128 і 12С. Ці результати показують, що антитіла 3703-НО тідСга і пи3703-НУ.м5 пІдДС1 зв'язують епітоп тау-білка в межах амінокислот 2-24 зрілого білка.
В експерименті із заміщення за допомогою сканування аланіном виявили, що мутації У184А і
ІГ20А порушували зв'язування антитіла миші 3703-НО з фрагментом тау-білка (фрагмент 2-21), що вказувало на те, що дане антитіло контактує з цими залишками тау-білка. З використанням серії 15-членних пептидів зі зсувом виявили, що антитіло миші 3703-НО демонструвало аналогічне зв'язування з фрагментом 9-23 і фрагментом 10-24, а також помірне зв'язування з фрагментами 7-21, 8-22 і 11-25. Приклад 9: Дослідження характеристик гуманізованих антитіл 3703-НУ на основі клітин
Способи
Первинні культури гіппокампа та мікроглії, і спільна культура гіппокампа та мікроглії
Дисоційовані первинні нейрони гіппокампа одержали з 16-17-денних ембріонів мишей
С57ВІ/6Н дикого типу. Клітини висіювали на 8-ямкові стекла, покриті РОЇ /ламініном (Віосаоаї, 354688 Сотіпо), з розрахунку 25000 клітин/ямку. Клітини покривали і підтримували в МЬБАсіїма4. (ВгаіпВіїз), половину середовища заміняли два рази на тиждень. Рекомбінатний тау-білок й антитіла наносили на культуру після 18 розподілів клітин.
Для одержання культури мікроглії відокремлювали кору та гіппокамп мишей С57ВІ /6Н через 1-2 дня після народження та культивували в 10 95 ЕВ5 у середовищі ОМЕМ у культуральньх колбах площею 225 мм протягом 10-12 днів. Культуральні колби акуратно струшували для дисоціації мікроглії; клітини в 10 95 ЕВ5 у середовищі ОМЕМ пересіювали на 8-ямкові стекла, покриті РОЇ /ламініном, з розрахунку 30000 клітин/ямку для візуалізації або 48-ямкові планшети без покриття (3548, Сотіпа) з розрахунку 100000 клітин/ямку для аналізу цитокінів. Через 4-5 годин після покриття клітини перемикали на безсироваткове середовище ЮОМЕМ з низьким вмістом глюкози і підтримували протягом ночі до обробки рекомбінантним тау-білком й антитілами. Спільні культури клітин гіппокампа та мікроглії повторно одержували шляхом пересіювання мікроглії, дисоційованої з 225 мм? культуральних колб, на 8-ямкові стекла з 18- рІМ первинними нейронами гіппокампа (12500 клітин мікроглії та 25000 нейронів на лунку).
Спільні культури обробляли рекомбінантним тау-білком й антитілом через 4 години після посіву мікроглії.
Обробка рекомбінантним тау-білком й антитілами іп мйго
Для 18-0ІМ культур нейронів гіппокампа або спільних культур гіппокамп та мікроглії рекомбінантний олігомерний тау-білок людини й антитіла (по 500 нМ у співвідношенні 1:1) або контрольні матеріали попередньо інкубували в середовищі для культивування нейронів (кондиціоноване середовище 18-ОІМ культури гіппокампа: свіжа МрАсіїма4 1:1) протягом 1 години при 37 "С, а потім їх додавали до клітин. Клітини інкубували із сумішшю тау-білка й антитіла або контрольного матеріалу в середовищі протягом 72 годин (культура гіппокампа) або 48 годин (спільна культура гіппокампа та мікроглії). Клітини тричі промивали РВ5 перед фіксацією.
Для культур мікроглії рекомбінантний олігомерний тау-білок людини й антитіла або контрольні матеріали попередньо інкубували в концентрації по 125 НМ (імуногістохімія/візуалізація) або по 250 нМ (аналіз цитокінів) у середовищі ОМЕМ з низьким вмістом глюкози під час відсутності сироватки протягом 1 години при 37 "С перед додаванням до клітин. Для імуногістохімії/візуалізації клітини інкубували із сумішшю тау-білка й антитіла або контрольного матеріалу протягом 10 хвилин і тричі промивали РВ5 перед фіксацією. Для аналізу цитокінів клітини інкубували із сумішшю тау-білка й антитіла або контрольного матеріалу протягом 24 годин, і середовище з кожної лунки збирали для аналізу цитокінів.
Імуногістохімія, візуалізація та кількісне визначення
Клітини фіксували 4 95 параформальдегідом у РВ5 протягом 15 хв. і пермеабілізували 0,1 95 тритоном Х-100 у РВ5 протягом 10 хвилин. 10 95 сироватку віслюка використовували для блокування; клітини інкубували з первинними антитілами у РВ5 протягом ночі при 4 "С, а потім з вторинними антитілами проти відповідних видів антитіл, отриманих у віслюка, міченими флуорофором Аїеха (Іпийгодеп). Використані первинні антитіла являли собою антитіла проти тау-білка (БАКО), антитіла кролика проти М-кінцевої області тау-білка людини, що охоплює амінокислоти 11-24, антитіло проти МАР2 (ар5392. Арсат) й антитіло проти Іра-1 (ар5076,
Арсат). На стекла наносили Ргоїопа Соїа САРІ (РЗ6935, Іпмігодеп) та покривні стекла Мо 1.
Конфокальну флуоресцентну візуалізацію виконували за допомогою І5М780 (Сагі 7еїівв,
Іпс.) та програмного забезпечення 7еп 2010 (Са! 7еів5, Іпс.). Для візуалізації культур гіппокампа 60 та спільних культур гіппокампа та мікроглії одержували зображення серії з 5 зрізів по осі 7 з інтервалом 0,98 мкм з використанням об'єктива Ріап Ароспготаї 20х/0,Щ8 М27. Для аналізу фрагментації МАР2 сформували проекцію серії зображень з максимальною інтенсивністю по осі 7 й аналізували зображення з використанням Меїатогріи (Моіесшаг Оемісе5, Саннівейл, штат
Каліфорнія, США). Для зниження рівня шуму використовували медіанний фільтр і зворотну фільтрацію за найближчим сусіднім елементом. Довжину нейритів і тіла клітини аналізували за допомогою модуля розростання нейритів з наступною морфологічною обробкою. Фрагменти менше 15 пікселів (6,225 мкм) нормували за загальною довжиною сигналу для оцінки ступеня фрагментації МАР2.
Мікроглію візуалізували за допомогою об'єктива а-Ріап Ароспготаї 100х/1,46 М27. Кількісне визначення поглинання рекомбінантного тау-білка в клітинах виконували за допомогою Ітаде (1.43и, 64-розрядна версія, Маїййопаї! Іпзійше ої Неайй). ВОЇ області клітин відображали вручну, використовуючи сигнал іра-ї в якості еталона. Площу та комплексну інтенсивність імунореактивності тау-білка в ВОЇ вимірювали з метою одержання імунореактивності тау-білка, нормованої за площею. Всі аналізи виконували без урахування умов експерименту.
Результати
Результати експерименту представлені на Фігурі 13. Як показано на Фігурі 13А, антитіла з повноцінною ефекторною функцією не мали протективні засоби проти токсичної дії тау-білка в спільній культурі нейронів і мікроглії. На Фігурі 138 показані зображення спільних культур нейронів і мікроглії, що контактували з олігомерним тау-білком й антитілами (нижній графік).
Антитіло 3703-НЗ підса ії пи3703-НО Нідсї (М2970), що не має ефекторну функцію, мало захисні властивості проти токсичної дії тау-білка, у той час як 3703-НУ9 пПІДдС1 не мало їх.
Приклад 10: Дозозалежне зниження патологічної дії тау-білка в мишей Тай Т9 після введення 3703-НО ІдСс2а або 3703-НО ІдДсга ОАМОа
Трансгенних мишей, які експресують тау-білок РЗОТЇ людини під контролем промотору ТНу! (Тан РЗО1І-Т9), підтримували на фоні С57ВІ/6Н (Спапез Віме). Мишей Тай РЗОТІ-Та й однопослідних мишей дикого типу розподіляли в експериментальні групи і раз на тиждень внутрішньочеревинно (в/ч) вводили їм ІдСбга-контроль (антитіло проти ар120) у дозі 30 мг/кг, антитіло 3703-НО М/1Т Ідсга проти тау-білка в дозі З, 10 або 30 мг/кг, антитіло 3703-НО САМО
ІдсС2га у дозі 3. 10 або 30 мг/кг БАМО відноситься до мутацій Ю265А/М2972 в ІдСга, що порушують ефекторні функції. Всі розчини для введення антитіл одержували на основі 10 мМ гістидину (рН 5,8), 6 9о сахарози, 0,02 ую Гмееп 20 у концентрації 10 мг/мл. Лікування почали у віці 13 тижнів. Групи мишей у дослідженні іп мімо містили самців, розподілених на З когорти.
Крім того, тканини З мишей ТашРЗО11І-Т9 збирали у віці З місяців, не піддаючи цих мишей лікуванню, з метою визначення вихідного рівня патології на момент початку лікування.
Для збору тканин мишей анестезували 2,5 95 триброметанолом (0,5 мл на 25 г маси тіла) і виконували транскардіальну перфузію РВ5. У тварин витягали головний мозок і розрізали його навпіл. Праві півкулі фіксували в 4 95 параформальдегіді протягом ночі при 4 "С, а потім переносили у фізіологічний розчин з фосфатним буфером перед імуногістохімічною обробкою.
Ліві півкулі додатково розрізали на льоді, а потім заморожували при -80 "С для біохімічного аналізу. У всіх мишей з хвостів зрізали шерсть для підтвердження генотипів.
Півкулі головного мозку багаторазово включали в желатиновий матрикс, використовуючи блоки МийіВгаійпФ (Мейгобсієпсе Авзосіаїез, Ноксвілл, штат Теннессі, США) й одержували корональні зрізи товщиною 25 мкм. У межах кожного блоку положення головного мозку рандомізували щодо генотипу та лікування. Вільно плаваючі зрізи півкуль головного мозку окремих мишей або блоків МиїіВгаіїпФ офарблювали, як описано раніше (І е Рісноп еї аї!., 2013,
РГо5 Опе, 8(4): еб2342), але з промиванням у РВ5 замість фізіологічного розчину з трис- буфером й інкубуванням основного антитіла при 4 "С замість кімнатної температури. Первинне антитіло являло собою антитіло кролика проти рТаш212/214 (отримане власними силами; 0,01 мкг/мл). Щоб уникнути інтенсивного фарбування фона у випадку первинних антитіл миші, специфічних стосовно підтипу, автори винаходу використовували відповідне вторинне антитіло, специфічне стосовно даного підтипу (наприклад, біотинільоване антитіло проти ДСЗ миші,
Веїпу! АЗ90-1118).
Імунохімічно пофарбовані препарати візуалізували за допомогою системи сканування всього препарату І віса 5С2М400 (І віса Містозузіет5; Буффало-Гров, штат Іллінойс, США) при 200-кратному збільшенні з дозволом 0,5 мкм/піксель. Області, що представляли інтерес (БОЇ), відображали вручну на 4 відповідних рівнях гіппокампа на кожну тварину, і виконували автоматизовану кількісну оцінку фарбування на цих НОЇ5 за допомогою двох кінцевих показників, описаних нижче. Всі види аналізу зображень виконували без урахування генотипу й експериментальної групи. Для аналізу областей позитивних пікселів з метою кількісного 60 визначення ІГХ-офарбовування аналізували цифрові зображення ділянок мозку, мічених антитілами, як описано раніше (їе Ріспоп еї аї., 2013). Відсоток пофарбованої області розраховували шляхом нормування загальної кількості позитивних пікселів до загальної області пікселів в НОЇ. Комплексну інтенсивність розраховували з використанням закону Бугера-
Ламберта-Бера (поглинання - -Іод(інтенсивність пропущеного світла/нтенсивність падаючого світла)) тільки для площі позитивних пікселів.
Результати цього експерименту показані на Фігурі 14. Введення антитіла 37 03-НО М/1Т Ідсга проти тау-білка або антитіла 3703-НЗ САМО Ідсга проти тау-білка призвело до дозозалежного зниження рТацй212/214 у гіппокампі.
Приклад 11: Варіанти 3703-НУ з гуманізованою каппа-1 областю
Гуманізовані варіанти антитіла на основі пиЗ3703-НОУ.мМ1, що містять легкий каппа-1 ланцюг, одержали і перевірили на предмет стабільності М. Вирівнювання варіабельної області легкого ланцюга трьох протестованих варіантів з пиЗ3703-НО.м1 показане на Фігурі 18. Три варіанти відрізнялися один від одного за варіабельною областю легкого ланцюга: пи3703.и39 містило мутацію ЕЗЗІ, пи3703.м440 містило мутацію 329Т, а пи3703.м41 містило мутацію МЗ3З0О.
Зразки антитіл зазнавали термічної стресової обробки в такий спосіб. Зразки діалізували із заміною буфера на 20 мМ ацетат гістидину, 240 мМ сахарозу (рН 5,5) і розбавляли до концентрації 1 мг/мл. Один мл зразка піддавали стресовій обробці при 40 "С протягом 2 тижнів, а другий зберігали при -70 С в якості контролю. Потім обидва зразка гідролізували з використанням трипсину для одержання пептидів, які можна було аналізувати з використанням рідинної хроматографії (РХ) - мас-спектрометрії (МС). Для кожного пептиду зі зразка були отримані час утримання (за допомогою РХ), а також точна маса з високим дозволом й інформація про іонну фрагментацію пептиду (інформація про амінокислотну послідовність) (за допомогою МС). Для пептидів, що представляють інтерес (нативних і модифікованих пептидних іонів), одержали хроматограми екстрагованих іонів (ХІС) з наборів даних у вікні 4-10 м. Д.; піки інтегрували для визначення площі. Відносний відсоток модифікації розраховували для кожного зразка за формулою (площа модифікованого пептиду) розділити на (площа модифікованого пептиду плюс площа нативного пептиду) помножити на 100. Потім ці відносні процентні показники порівнювали в контрольному (1-0) та підданому стресу (1-2 тижня) зразках. Показані процентні показники відображали результат вирахування контрольного (Ї-0) значення зі значення після стресу (1-2 тижня). Результати представлені в таблиці 21. Результати продемонстрували, що мутація ЕЗЗІ ефективно знижувала дезамідування в гуманізованому легкому каппа-1 ланцюзі.
Таблиця 21
Стабільність варіантів пи3703-НУ.м1 у стрес-тестах щодо дезамідування
Антитіло ланцюга 28. о
Істотного посилення не виявлено
І І І М30:3,9 96 28. о "Залишок заміщений на глутамін
Спорідненість гуманізованого антитіла вимірювали при 25 "С за допомогою приладу Віасоге
Т200, набору СЕ Віасоге для захоплення ЕГАБб людини і чипа СМ5 5егієз 5. Антитіла розбавляли до 1 мкг/мл НВОР (10 мМ НЕРЕБ5 рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,0595 Тмеєп 20) і виконували захоплення при швидкості потоку 10 мкл/хв. протягом 180 секунд. Дані про кінетику збирали для мономера тау-білка людини, введеного в концентрації 1,2, 3,7, 11, 33 і 100 нМ в НВ5БР з використанням технології кінетики одиночного циклу при швидкості потоку 30 мкл/хв. Кожну концентрацію мономера тау-білка вводили на З хвилини, дисоціацію відслідковували протягом десяти хвилин. Між циклами поверхню регенерували з використанням двох послідовних хвилинних ін'єкцій 10 мМ гліцину (рН 2,1). Дані апроксимували згідно з моделлю зв'язування 1:1 за допомогою програмного забезпечення ВІіАЕмаїЇШайоп. Кожне антитіло двічі проаналізували протягом експерименту; дані в таблиці 22 наведені у форматі середнє значення « діапазон.
Таблиця 22
Спорідненість варіантів пи37О03:НОУ.м1 щодо мономерного тау-білка 11111111 Ко(фмМ) | Кои(/ме)// | Кос) З:
Приклад 12: Фармакокінетика та фармакодинаміка пи37О03.м28.А4 НІдС4.5228Р і пи3703.м28.А4 пІда4-5228Р.УТЕ в яванських макак
Для оцінки фармакокінетики і фармакодинаміки антитіл пи3703.м28.А4 НПІдсі.5228Р і пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ іп мімо п'яти яванських макак (Масаса Гавзсісціагів), що знаходяться у свідомості, на групу вводили однократну в/в болюсну ін'єкцію в дозі 50 мг/кг у першій фазі. В якості контролю використовували пІдс4 проти дО у такій самій дозі 50 мг/кг. У різні моменти часу аж до 35 днів після введення дози збирали зразки плазми і ЦСР з метою визначення концентрацій антитіл проти тау-білка.
Після останнього відбору проб тварин залишали відновлюватися протягом 63-64 днів до початку другої фази. У другій фазі 15 тварин після першої фази, а також З додаткових тварини розділили на дві групи; першій групі (п - 9) вводили антитіло пи3703.м28.А4 НпІдСсі.5228Р, а другій групі (п - 9) - антитіло пи3703.м28.А4 НпІда4-5228Р.УТЕ; дозування обох антитіл становило 50 мг/кг. Головний мозок 4 або 5 тварин у кожній групі збирали через 2 дня та 10 днів після введення.
Концентрацію антитіл ІО4 людини у плазмі, ЦСР їі гомогенаті головного мозку яванського макака (описано нижче) вимірювали за допомогою твердофазного ІФА з використанням іммобілізованого антитіла вівці проти ІДС людини з адсорбованим антитілом мавпи, з наступним додаванням зразків плазми, починаючи з розведення 1:100, зразків ЦСР, починаючи з розведення 1:20, або зразків гомогенату головного мозку, починаючи з розведення 1:10, і закінчуючи додаванням антитіла кози проти (ДС людини з адсорбованим антитілом мавпи, кон'югованого з пероксидазою хрону, з метою виявлення. Фарбування розвивалося при використанні 3,35,5'--етраметилбензидину та нейтралізовувалося при використанні 1 М фосфорної кислоти. Зразки зчитували при довжині хвилі 450/620 нм. Аналіз характеризувався каліброваною кривою у діапазоні 0,156-20 нг/мл і межею виявлення 0,02 мкг/мл для плазми, 0,003 мкг/мл для ЦСР ії 0,002 мкг/мл для гомогенату головного мозку. Результати менше зазначеної концентрації реєстрували як "менше реєстрованого значення (І ТВ)".
Результати фармакокінетичного аналізу наведені на Фігурі 19А (плазма) та 198 (ЦеСР) і в таблицях 23 і 24. Тварин з підозрою на наявність антитіл проти терапевтичного антитіла (АТА»х) виключали з аналізу. Ці дані показують, що впровадження мутацій МТЕ в Ес-область пи3703.м28.А4 пІдс4.5228Р сповільнювало швидкість виведення антитіла з периферичної крові та ЦСР приблизно у два рази.
Таблиця 23
Розрахункові значення виведення з плазми і Смакс У ВИГЛЯДІ "середнє значення (х СП)" після однократного болюсного в/в введення
Таблиця 24
Розрахункові значення Смак У ЦСР у вигляді "середнє значення (х СП)" після однократного болюсного в/в введення
Концентрації антитіл у головному мозку на 2 і 10 день після ін'єкції визначали в такий спосіб.
Тканини головного мозку зважували і потім гомогенізували в 1 5 МР-40 у фізіологічному розчині з фосфатним буфером, що містить таблетки суміші інгібіторів протеаз сОтрієїе "М, Міпі без
ЕДТА. Потім гомогенізовані зразки головного мозку струшували при 4 "С протягом 1 години перед центрифугуванням при 14000 об./хв. протягом 20 хвилин. Надосадову рідину відокремлювали для вимірювання концентрації антитіла в головному мозку за допомогою твердофазного ІФА. як описано вище. Результати цього експерименту наведені на Фігурах 21А- р. Концентрація антитіла пи37О3.м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ у головному мозку та співвідношення концентрацій антитіла пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р.МУТЕ у головному мозку та плазмі були вище, ніж для антитіла пи3703.м28.А4 пІдсаі.5228Р.
Крім того, визначали фармакодинамічну відповідь у плазмі. Концентрацію загального тау- білка у плазмі з К»ЕДТА визначали за допомогою електрохемілюмінесцентного (ЕСЛ) імуноаналізу (Косне Ргоїеззіопа! Оіадповіїсз (ВРО), Пенцберг, Німеччина). Імуноаналіз ЕІесзузФО пройшов валідацію для кількісного визначення загального тау-білка в ЦСР людини, і через подібність між тау-білком людини й яванського макака вважався прийнятним для вимірювання тау-білка яванського макака в ЦеР і плазмі. Даний аналіз дозволяв захоплювати і визначати амінокислоти 159-224 тау-білка людини й яванського макака (ця область присутня у всіх відомих ізоформах, незалежно від стану фосфорилювання). Нижня межа виявлення (НМВ) даного аналізу становила 1,01 пг/мл. Аналіз допускає присутність до 15,0 мг/мл пи3703.м28.А4 пІіда4-5228Р.УТЕ.
Результати фармакодинамічного аналізу наведені на Фігурі 20. Після виключення тварин з підозрою на АТА» і ще однієї тварини без вихідних значень кожна група містила З тварин. Як не дивно, у перший день введення рівень тау-білка у плазмі більшою мірою підвищувався у тварин, що одержували варіант УТЕ у порівнянні з варіантом без УТЕ. Крім того, цей результат не піддавався прогнозуванню на підставі фармакокінетичної відповіді (фігура 20), оскільки ФК була аналогічна між цими варіантами в ранні моменти часу. Більше надійна відповідь підтримувалася у тварин, що одержували варіант УТЕ протягом усього періоду пробовідбору.
Приклад 13: Фармакокінетика та фармакодинаміка пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р.МТЕ у головному мозку яванських макак
Для оцінки фармакокінетики антитіла у головному мозку дванадцяти яванських макак (Масаса Газсісціагіз), що знаходяться у свідомості, на групу вводили однократну в/в болюсну ін'єкцію пи37О03.м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ у дозі 50 мг/кг. В якості контролю використовували
МпаС4 проти дО у такій самій дозі 50 мг/кг. У різні моменти часу аж до 42 днів після введення дози збирали зразки плазми з метою визначення концентрацій антитіла проти тау-білка. Крім того, у різний час аж до 42 днів умертвили 2 мавп і визначили концентрації антитіла в головному мозку та ЦСР. Концентрацію антитіла в основному визначали, як описано у прикладі 12.
На Фігурі 22А-В показана концентрація антитіла у головному мозку яванського макака в різні моменти часу після введення, представлена на графіку з логарифмічною (А) та лінійною (В) шкалою. У таблиці 25 показані параметри концентрації у головному мозку.
Таблиця 25
Розрахункові значення ФК-параметрів у головному мозку у вигляді "середнє значення (7 СП)" після однократного болюсного в/в введення (мкг/мл) (доба"мкг/мл)
Антитіло пи3703.м28.А4. пІда4-5228Р.УТЕ продемонструвало збільшення концентрації у головному мозку в кінцевий момент часу у порівнянні з антитілом проти 90.
Крім того, визначили концентрацію антитіл в різних областях головного мозку, включаючи гіппокамп, мозочок і лобову кору. Результати даного аналізу представлені на Фігурі 23А-С і в таблицях 26-28.
Таблиця 26
Розрахункові середні значення ФК-параметрів у гіппокампі після однократного болюсного в/в введення
Група Смакс ппПкаї!
РУ (мкг/мл) (доба"мкг/мл)
Антитіло пІдаЯ4 проти 90 пи3703.м28.А4 Ппідса- 0,159 3,95 5228Р.УТЕ 0,087 2.87
Таблиця 27
Розрахункові середні значення ФК-параметрів у мозочку після однократного болюсного в/в введення
Група Смакс ппПкаї! рУ (мкг/мл) (доба"мкг/мл)
Антитіло підСаі проти 90 пи3703.м28.А4 підаа- 0,196 4,30 5228Р.УТЕ 0,139 4,56
Таблиця 28
Розрахункові середні значення ФК-параметрів у фронтальній корі після однократного болюсного в/в введення
Група Смакс ппкаї!
РУ (мкг/мл) (доба"мкг/мл)
Антитіло пПІдС4 проти 90 пи3703.м28.А4 Ппідаа- 0,17 4,65 5228Р.УТЕ 0,138 4,22
Результати цього експерименту продемонстрували вплив антитіла пи3703.м28.А4 пІдсі-
З228Р.УТЕ у різних областях головного мозку після однократної в/в ін'єкції. Загальний вплив у головному мозку було порівнянний у двох даних групах, однак аналогічно спостереженням у плазмі, спостерігали дворазове збільшення концентрації антитіл у головному мозку в останній момент часу у тварин, що одержували антитіло пи3703.м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ, у порівнянні з антитілом проти 90. Див. Фігуру 23. Ці результати вказують на підтримку (термінальних) концентрацій вище мінімуму в головному мозку після введення антитіла УТЕ.
Крім того, визначали концентрацію антитіл у ЦСР і плазмі з плином часу.
Результати даного аналізу представлені на Фігурах 230 (ЦСР) і 23Е (плазма) і в таблицях 29 130.
Таблиця 29
Розрахункові середні значення ФК-параметрів у ЦСР після однократного болюсного в/в введення
Група Смакс ппПкаї!
РУ (мкг/мл) (доба"мкг/мл)
Антитіло пІдшба4 проти 90 Ппи3703м28.А4 ПпІдаса- 5228Р.УТЕ 1,270 3,980 18,400 21,100
Таблиця 30
Розрахункові середні значення ФК-параметрів у плазмі після однократного болюсного в/в введення (мкг/мл) День (доба" мкг/мл) день 43) мкг/мл
Аналогічно фармакокінетиці у плазмі та головному мозку, в останній момент часу у тварин, що одержували антитіло пи3703.м28.А4 пІда4-5228Р.УТЕ, у порівнянні з антитілом проти дО мало місце дворазове збільшення концентрації антитіла в ЦСР. Див. Фігуру 23.
Оцінку фармакодинаміки антитіла пи3703 м28.А4 пІдс4-5228Р.УТЕ і контрольного антитіла у плазмі після однократного в/в введення в дозі 50 мг/кг виконали, використовуючи зібрані зразки плазми яванських макак. Кількісну оцінку рівня тау-білка у плазмі виконали за допомогою імуноаналізу ЕіесзузФ), що обговорювався у прикладі 12.
Результати фармакодинамічного аналізу наведені на Фігурі 24А-В. На Фігурі 24А показана середня концентрація загального тау-білка у плазмі, нормована за вихідним рівнем. На Фігурі 248 показана концентрація загального тау-білка у плазмі окремих мавп, використаних у даному дослідженні, нормована за вихідним рівнем.
Аналогічно результатам, отриманим у прикладі 12, введення антитіла пи3703 м28.А4 пІдСсі4-
З228Р.УТЕ призвело до значного підвищення рівня тау-білка у плазмі. Безвідносно до яких- небудь конкретних теоретичних представлень, ці дані показують, що пи3703.м28.А4 НпІдСі-
З228Р.УТЕ зв'язується з тау-білююм у головному мозку, і, отже, відбувається виведення тау- білка з головного мозку на периферію. Ці результати узгоджуються з впливом пи3703.м28.А4 піас4-5228Р.УТЕ на мішені у головному мозку.
Приклад 14: Дозрівання спорідненості антитіла пи3703.м28.А4
Дозрівання спорідненості 3703.м28.А4 здійснювали за допомогою глибокого секвенування бібліотеки скануючого мутагенезу. Було розроблено дві бібліотеки, по одній для кожного ланцюга антитіла, в яких вибрані положення у варіабельних областях важкого або легкого ланцюга рандомізували з ММК (код згідно з ІШРАС) кодоном, який кодує будь-яку амінокислоту або амбер стоп-кодон. Розробка дозволяє забезпечувати лише одну зміну амінокислоти у варіабельних областях антитіла на клон. Положення вибирали з СОВ і положень каркасу у безпосередньому контакті або біля СОВ. Положення легкого ланцюга за Кабаї 1-5, 24-27, 29-36, 38, 43, 44, 46-58, 60, 63-71, 87 і 89-97 і положення важкого ланцюга за Кабаї 1, 2, 4, 24-39, 43, 45-81, 82а, 826, 83, 85, 86, 91 і 93-103 рандомізували з ММК-кодонами. Клони легкого ланцюга, які не рандомізували положення 28, мали бег у положенні 28 замість Азп дикого типу. Два різних фрагмента ДНК використовували для рандомізації положення 28 легкого ланцюга. Один клон мав кодон УМК, а інший - кодон МУК, що уможливило будь-яку амінокислоту за винятком
Туг, Сув, Тр і стоп-кодонів. Бібліотеки створювали шляхом синтезу ДНК (Сепемуі7), одержуючи 60 незалежних фрагментів лінійної ДНК для легкого ланцюга та 75 для важкого ланцюга, при цьому одне положення у кожному фрагменті було рандомізоване з ММК-кодоном або сумішшю
МУМК/МУК. Фрагменти лінійної ДНК об'єднували для кожного ланцюга та клонували у вектор фагового дисплею моновалентного Раб-фрагмента (див. ее СУ еї аї., У. Іттипої. Мешоа5 284:119-132 (2004)). Клони з бібліотеки легсого ланцюга мали варіабельну область важкого ланцюга дикого типу, тоді як клони з бібліотеки важкого ланцюга мали варіабельну область легкого ланцюга з мутацією М285. Продукти лігування електропорували в ЕзсНегісніа соїї ХІ-1, суперінфікували хеллерним фагом М1З3 КО7 (Мем Епдіапа Віоїаб5) і зрощували, як описано (див. Коепід Р еї аї., у. Віої. Спет. 290:21773-21786 (2015)).
Здійснювали три послідовні кола сортування, використовуючи мономер тау-білка, що адсорбований на планшеті ЕГІ5А (Коло 1), або розчин біотинільованого на М-кінці пептиду, що включає залишки 2-24 (біостин-ПЕГ-АЕРВОЕРЕММЕОНАСТУСІ ОВК; 5ЕО ІО МО: 624) тау- білка людини(Кола 2 і 3). У першому колі фаг (1 ОЮгвв/мл) інкубували у планшеті ЕГІБА, покритому тау-білком, протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища. У другому та третьому колах фаг (5 ОЮгвв/мл) інкубували зі 100 нМ біотинільованого пептиду тау-білка протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища, потім розбавляли уп'ятеро та захоплювали на планшетах ЕЇІБА, покритих нейтравідином (Рієгсе), протягом 10 хвилин.
Жорсткі умови реакції посилювали на Колі З шляхом інкубування лунок, що містять захоплений фаг із буфером зв'язування (ФСБ, 0,5 95 альбуміну бичачої сироватки) протягом додаткових 20 хвилин після захоплення фагу та промивання. Етап промивання потім повторювали. Фаг потім вимивали з планшетів ЕГІЗА шляхом інкубування з 0,1 М хлористо-водневої кислоти і в ньому розповсюджували інфекцію ЕзсПпепспіа соїї з подальшим суперінфікуванням хелперним фагом
М1З3К.О7 (Мем Епдіапа Віоіар5). Для полегшення аналізу шляхом секвенування наступного покоління, у Колі З здійснювали "імітаційну" селекцію паралельно із селекцією, що тільки-но була описана. "Імітаційну" селекцію, призначену для забезпечення негативного контролю або еталонного зразка, здійснювали з використанням того ж способу, що і тільки-но був описаний у
Колі 3, але без додавання біотинільованого пептиду.
Початкові результати одержували за допомогою секвенування індивідуальних колоній за
Сенгером.
На додаток, плазмідну ДНК екстрагували з популяцій Е5спПегісніа соїї ХІ-1, використаних для фагової ампліфікації. Інсерції ампліфікували за допомогою ПЛР -ампліфікації у 18 циклів з використанням ДНК-полімерази РНПизіоп (Мем Епдіапа Віоїар5) З подальшим очищенням ампліконів арагозним гелем. Амплікони секвенували за допомогою секвенування ППитіпа, як описано раніше (Коепід Р., еї аЇ. (2015). У. Віої. Спет. 290, 21773-21786). Послідовності фільтрували з використанням послідовностей праймерів для ПЛР і шляхом видалення послідовностей, які були більше довгими або більше короткими, ніж батьківська послідовність, або містили більше ніж одну кодуючу мутацію у варіабельній області. Коефіцієнти збагачення обчислювали шляхом розділення частоти заданої мутації у заданому положенні в одній популяції на частоту точно такої ж мутації у другій популяції. Популяції називали, використовуючи наступні абревіатури:
ВО - Несортована бібліотека
В2 - Фаг із селекції у Колі 2 з використанням 100 нМ біотинільованого пептиду
ВЗ - Фаг із селекції у Колі З з використанням 100 нМ біотинільованого пептиду
ВЗМ - Фаг із "імітаційної" селекції у Колі 3.
Вибрані мутації переносили окремо або в комбінації на варіабельні домени пи3703.м28.А4, що синтезовані та клоновані у вектор експресії ІДс-клітини ссавця. У деяких випадках вибрані мутації переносили на варіабельні домени, які були гуманізовані іншим чином у порівнянні з пи3703.м28.А4. Приклади альтернативно гуманізованих антитіл, що містять мутації, які ідентифіковані процедурами фагового дисплею, що описані вище, включають пи3703-НОУ.м76, пи3703-НУ.м83 ї пи3703-НУО м93.
Плазміди важкого ланцюга та легкого ланцюга експресували у клітинах Ехрі293 шляхом транзієнтної інфекції й (ДС, що очищений від супернатантів із використанням хроматографії спорідненості за допомогою смоли МаббеІесі ие (СЕ ІПйе бсієпсе5). Очищений Ід аналізували на зв'язування з мономером тау-білка людини з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Стисло, використовували інструмент Віасоге 1200 для захоплення антитіл на чипі для захоплення ІдСї людини, який був згенерований з використанням сенсорного чипу бегів5 5 СМ5, і набір для захоплення ІДС людини (СЕ І їе бсіепсев5). Захоплені антитіла піддавали впливу мономеру тау-білка людини у розчині та здійснювали моніторинг фаз асоціації та дисоціації. Споріднення обчислювали шляхом підгонки моделі зв'язування 1:1 до кінетичних даних з використанням програмного забезпечення Віасоге Емаїчаїйоп.
Порівняння варіабельних областей важкого та легкого ланцюга для пи3703-НОУ.м76, пи3703-
Н9м83 ії пи3703-НОм93 з батьківським пи3703-НОУ.м28.А4 показане на Фігурах 25А-В. Чорним затіненням позначені амінокислоти, якими відрізняються антитіло з дозрілою спорідненістю та батьківське антитіло.
Антитіла пи3703-НУ.м76, пи3703-НО.м83 і пиЗ3703-НО.м93 із дозрілою спорідненістю оцінювали на їх моновалентну взаємодію з мономером рекомбінантного тау-білка людини й яванського макака.
Спорідненість для тау-білюа людини й яванського макака вимірювали при 37 "С за допомогою інструмента Віасоге 1200, набору для захоплення Ід людини СЕ Віасоге та сенсорного чипу бегієз 5 СМ5. Антитіла розбавляли до 1 мкг/мл у рухомому буфері НВ5-ЕР (10
ММ НЕРЕБ рН 7,4, 150 мМ Масі, 1 мМ ЕОТА, 0,05 95 Тмжеєеп 20) і захоплювали при витраті потоку 10 мкл/хв. протягом 15 секунд. Збирали дані щодо зв'язування мономеру тау-білка людини й яванського макака, кожний з яких вводили при 0, 0,1, 0,4,1,2, 3,7, 11,1 ї 33,3 НМ, використовуючи витрату потоку 30 мкл/хв. час контакту 300 с і час дисоціації 900 с. Між циклами поверхню регенерували за допомогою ЗМ хлориду магнію. Дані підгоняли під модель зв'язування 1:1 з використанням програмного забезпечення ВІАЕмаїчаїоп.
На Фігурі 26А представлені дані про спорідненість для антитіла пи3703-НО.м76 для мономеру тау-білка людини, причому кожна крива являє собою іншу концентрацію антитіла. На
Фігурі 268 представлені ці дані для мономеру тау-білка яванського макака (супо). Кожне зі споріднено-очищених антитіл пи3703-НУ.м76, пи3703-НУ.м83 ії пи3703-НУ.м93 мало Ко 0,1 нм при 37 "С для мономерів тау-білка як людини, так й яванського макака, як показано в Таблиці 31. У паралельних експериментах батьківське антитіло пи3703-НО.м28.А4 мало Ко 5-8 нМ (дані не показані).
Таблиця 31
Вимірювання спорідненості антитіл пиЗ3703 із дозрілою спорідненістю . Мономер тау-білка яванського
Мономер тау-білка людини макака
КО (нм) Ка (1/Мс) ка (1/с) КО (нм) Ка (1/Мс) ка (1/с) пи3703-НУ.м76 6,94Х105 | 8,92Х1074 9,27Х106 | 1,14Х103 пи3703-НУ9.У83 влоХ105 | 8,18Х107 9,55Х106 | 1,14Х103 пи3703-НУ.м93 в,89х105 | 1,02Х103 1,29Х10- | 1,78Х103
Хоча даний винахід докладно описаний за допомогою ілюстрації та прикладу для ясності розуміння, не слід вважати, що опис і приклади обмежують рамки винаходу. Описи всіх патентів і наукової літератури, наведені у даному документі, явно повністю включені у даний документ за допомогою посилання.
Таблиця послідовностей
ЗЕО ІЮ . . 2 Епітоп тау-білка людини юки Уу ТВ 2-24 АХА А Біжи М Тл М АК ААТЮ Й А АСК МІУ
Епітоп тау-білка 4 |яванського макака (2-4 ДЕРЕ рУМИЕОНАСТ УСП 24
Варіабельна область - Ум пити спе А ря о кт тишпеатут ух
Т0 важкого ланцюга (МН) окт свомдкнттх гомовткоек 3703-Не саме слиною пи пОБОТИТвих 0 БЕУБІЛЬВАЄ 00 ІВОДЕНОВТО
Варіабельна область| ех страв тут ткОоВМИВе 11 |легкого ланцюга (МІ); .схееготлис плечові т діютти им 3703-Не нн ши 12 |НМВ-НІ3703-НУ | сом 02000000 піп
НУВ-Нг 3703-НУ
НУВ-НЗ 3703-Н9
НУВ-Ї1 3703-НУ
НУВ-.2 3703-НУ
НУВ-ІЗ 3703-НУ
Варіабельна область зов вокВІКИУАт тидостутух |важкого ланцюга (МН) с спомин У тематика
З703-нНЗУЬ што підмея мдечіви 0
ТЕМ Тем зе М ох з У А ММК с 21 |легсого ланцюга (М) зесррвго пиштретркт чести
НУВ-НІ 3703-НО9р
НУВ-Нг 3703-НО9р
НУВ-НЗ 3703-НОр
УС У Коси БИКОВ ОК ОАЕ ТЕВ «іде
ЗО | важкого ланцюга) схо ють план ку я кит шт (МНИТЕт1О-ВВ ткмечскуву ревмеунсо тати 00000
АМСУ ЗАВ УЖУІМ 1 КЬх
ОУБМТОСЮРиЮ вух Все гУ де 31 |легкого ланцюга (МІ) стат подрентиня я пік ія і 11Е10-В8 пк нти Он хтсгопнУв МТЕОССТКЬЕ їК
Варіабельна область сусхстове сок НИоАт ткдкомутух
ТРАТ У ЕХ Ми ККк УЕ КОМИ І їх |важкого ланцюга (МН) соскою сЕОМАКЕТЕУ томи дІклЕт 54С1-НІТІ61Е7-64 00 пи ати
РАМ Д Блок ІХС Ж ХМ КМ рт ПОМ ТАХ МЕМ СНУтх
Варіабельна область 25525000 41 |легкого ланцюга (МІ) се пошли пон 5АСІ-НІТІ61Е7-С4 0) рлноцев птрипоячов тво М 61Е7-С4 61Е7-С4 61Е7-С4 61Е7-С4 7 ов 46 ГУБА 61Е7-С4 61Е7-С4
Варіабельна область 5 е смацувот вах ЩІ ЕМУАТ г пелет ут Ух |важкого ланцюга (МН) рготуксвкк КОМАКЕТЬУ поМІНЬКоКО
Варіабельна област хо 00000001 51 |легкого ланцюга (МІ) ана пенсон тні т што зда-на ооноднті оо шенню ПТ
ІКЦ УГА пами ОХ
Варіабельна область сет 00 сокАотИУАТ 00 тоолотттту важкого ланцюга (МН) 55 пи шу Спдші шн
Тане вину нреу пдмоуишоем вн 0 и НН т, ВК ІН ТАМ ТІ . б МАЛ У ТАК МОМ ЮА МИЙКИ АНУ ім
Варіабельна область халат г тами хогот м ІТІИ
МЕЧА М КОХ Ух АГА АХ МІ ЕК 61 |легкого ланцюга (Мі) юю ит у те корут ую чт ху 19Не-Е7 пон о штуки 1 ПМ
НУВ-НІ 19Н6-Е7
НУВ-Н2г 19Н6-Е7
НУВ-НЗ 19Н6-Е7
НУВ-Т Т9Нб-Е7 66 (нНУВ-2 19Н6-Р7
НУВ-З19НЄсЕ7 . шУМЬМСИНаЮ СУКРОАСМКІ ПОсКАпотОІ
Варіабельна область юр МЕМ тавткмлотих 70 важкого ланцюга ММ ш ккд х т плоти А У ММ Ер лю (МН)9482-С1 п поки ко ді іно ток пи клю ОКОМ ТМХОМо М КМ МІУ , ПУУМІ РТ ЗК АЄ ІЛИК ОшОЬ
Варіабельна /область| зсгютути сІпвЕрРОСоЧвЕ шкотлуз ср
МІВ КУМ ХА ОХ ХА УХ маки у г ТхА А КМТ 71 |легкого ланцюга (МІ) ти теіденртвня яу піміушекарічж ту кОм си КО
НУВ-НІ 9482-С1
НУВ:Н2 9482-СІ
НУВ-НЗ 9482-С1
НУВАІ 9482-С1
НУВ-2 9482-С1
НУВ-ІЗ 9482-С1
ММ М ТАК Я, ЩА МЕТ
Ха ж ум КИ МИ мс ХОМ у АХ мими МИ ТАК МО
Варіабельна область Кк А тлі МК Т 1 їх с ТІ КУ вч М ше МУ пф
Уж студ ух М ТМ КАБ ху АК Кі У важкого ланцюга (МН) 5 ех сит порох утри гри ечАЯКМІВТТ гІХ
Ті М Ба ГРОМ Іа МІЦНО МА 125811-НЗ п і і і маяки" шишстхоюа со МТУ ВЕ . ОІУМтТОоБоКЕ КУПІ НУТ ТАС
Варіабельна область пу УК пила т су ло дише
УА УТ Х а НЕ Н ТМ ТА Ж І У КО 81 |легкого ланцюга (Мі); 5 рекет стих тиху кор тд вет Ко ге тиечичия 12581 1 -НЗ3 ї ї т и М и т 7 7 т п ї х Мова мА Ме НИ МО
КАХ Кома КК
НУВ-НІ 125811-Н3
НУВ-Н2 125811-Н3
НУВ-НЗ 125811-Н3
НУВ--1 125811-НЗ 786. |НУВІ2 125811-Н3
НУВ-ІЗ 125811-НЗ . У Маля БУС МЕ, МОЗАВЕЕТЕБ
Варіабельна область хм ВЕК АЛ ТІМ важкого ланцюга (МН) тд г уко тІдшЕИПДЯМЕ в соч сМмМ Ед 113г5-Е7 шкі ім пт хоптя пи
БТІ СТО суші ІУБЕ . зЕУМІСоИКІ МЕТ ЗУСИКУЄ ТІ КАБОМУЄ
Варіабельна область чим мі ми пилу лоту Фо хх М ох
ТММ МІХ ТУ ХХ КОКО А ТК Хв мМ М 91 |легкого ланцюга (МІ) лох. ши ви сю кісти хто гу клич
ВЕТО К М КТ ІБУЮИ КОСА
1135-Е7 ай М ЗА КОКО
БТ рУТЕСУ СІКЬКІК
НУВ-НІ ТІЗЕ5-Е7 93 (НУв не ттаєБ'єт
НУВ-НЗ ТІ1ЗЕ5-Е7 796 |НУВІ2 113ЕБ-Е7
НУВАЗ ТІЗЕ5-Е7 . ЕМО сВЕ УКОСУ КИ, ОТАК МІН
Варіабельна область беумуДУКОВ ЕСЕ ТС тОРЕМООТЕХ 100 |важкого ланцюга, отиту днм яжктунк смт ту спктсвившИ (Мндгвст-В1ї саоотши хека во шов
ТтАЗУХСМАВН АКАТМИДЛОЮУ ОСС У ши 101 |легкого ланцюга (МІ) (5 стутия ген вух г вазі мч хо А Кама МО
Варіабельна область Зехкою Ес шитеи теремонтеї
ПО | важкого ланцюга! сорт шклтипутих птаство, (Ун)евот ов переви худну пкт 5
ТАшУЖСМАВВ АБАТМІАБОУ Меню ТУМ В
ТОМИ тот тека.
Варіабельна область сего прокони шітут и 111 легкого ланцюга (МІ) оматляе сдктча о попплюнен
Усі НК МЕ гін
Варіабельна область! (о виття сі щи : п м вржеиУккУ |важкютю 0оланцюв РУНОБЕНІВА 000 ТОРЕТОВТАХ (МН)ЗО01-В2 ін шу ИУ шк МО КО КшІЧ В ун КАМ Ам КЕ ЕУ пат ТЕИчІ ОАЕ тав ши я 121 |легкого ланцюга (МІ) (сел пдв иочні пит шкі у 3001-В2 пшнвстіі репо О
ХВ КІМ М КА Клод А ДМ путі Нв Е ТОВРОАВОТІ ЧОСКДОШтТЕКІ
Варіабельна область богинею юенпсштх тпермствно 130 |важкого ланцюга (МН) ереиот витка мі нлм ббЕ5-А! одутучевиви роУмнОлЯь тує нини
ЕМ Х Ток КІ КА ХУ
Варіабельна область сотокмуюа дуескраеєе кто 131 |легкого ланцюга (МІ) зо лом упсінчх юну вБЕБ- А! оте БбУсАНН пексСоснеУштТ вегесотКО Її
. ші СУКРОАБУКМ СШКАЙОХТЕТ
Варіабельна область зетмрючков нка ЕщІ тОеММОостях 140 |важкого ланцюга (МН) сохтлкхо тивипсотих матмсітеКи 123Е9-А пін енвех проглеття теж 0
Ї пУСМІсТег БЕУБІС КАЄ ТОКІО у
Варіабельна область ЗИМИ в «текіла тт кт еМми
ХМ УучІМ А МКУ Мамі ММ хх ММ доку КІ КЗІЛ, 141 |легкого ланцюга (Мі) піч: уічут тихих хви нут тат епох г ко зх тт ех
ПУ КІ Му ІЛ НК ЦО пок МАХ 123Е9-А1 Сонет пет у хво оМНУЮ КБУ ЕЕ
НУВСНІ 123ЕвсА!
НУВ-Н2 123Е9-А!
НУВ:НЗ 123Е9:А!
НУВл 12 СА!
НУВ-І2 123Е9-А1
НУВЗ 123Е9-А!
МУ Е БУКРОАБУМУ ТтОКАшОТЕТ
Варіабельна область, сеумкасвих мивстівте тлеУТИЛВМ У
ВА БУТИ УЮУ М ТУЯ УЖ МІХ АЛІ ан М КА УЛУЛЯМІХ А 150 важкого ланцюга (ун) мим ша тк Мід т ом Тс г 1 5Сб6-А7 УР Кк БІО ХУ УЮ АЖ МЕ АТХ КІГ да ках М шАУТЖСАВИВ СстОспоеАЖКО ОСТОУТУЄА , ПЧІАСТТОКВ БУХ ТБШАБООМА Є
Варіабельна область чпеМчстмтвутими Кто ДИ КУ тотот умі тіхУі УЛ А М Кз ухих Багмут уи М Кк АЮ А ХУ мМ лі ух 151 |легкого ланцюга (МІ) пектини стеку т тв у ти ше вт ие 15С6-А7 ша птилян т мутанти
ЕсСстосНиМЕ горосі їК
НУВ-НІ 15С6-А7 153 |НУАгНа 1БОЄА?
НУВ-НЗ 15С62А7
НУВ-І2 1506-А7
НУВ--3 1506-А7 . кУСТЮИВЕ УКквОодаУКМ БСКАшОЖТКИ
Варіабельна область кератит зеети сік мед тих орто
МАО ОКІІЮМУЮ М КоОци ТР УВА УВС ММК ІМ лют Ух 160 |важкого ланцюга (МН) пити неістот в ху дж пткріч піт тя
МОКЕКСНМГІ ТУКА МОоКМОЗТЕКИ 1928-81 дао рухати син грн :
ПАКТ САКсА УСИКА СТУ ТУЮА
ПоБМТОТеО ПРО ТБСВОНБОМ г
Варіабельна область искнІм сту т ючи тттпмтєтвиОк кістою мое
ХІЕЗУЖ ЗЛАМ В А ДаКУХХ АК К У КК мам А Му ІКТ 161 |легкого ланцюга (МІ) спУводеких мекв ит сим вт ої
Т9ЕВ-ВІ нс втрдинтото т т
ЦЕСУ ТЕН ІК
НУВ-НІ 19Е8-ВІ1
ГИ.ОМЕМЕННІТІ, ТОК КОУ
НУВ-нг 19Е8-ВІ
НУВ-НЗ 19Е8-ВІ1
НУВа 19ЕВ-Ві
НУВ-2 19Е8-ВІ1
НУВЗ 19ЕВ-ВІ
ТАК ІТИ Ен а Аа пи вті р . шою МК Мем ду КА М С «ТКА В АК
Варіабельна область БЗемуюУукОВ накоїв ТивЕМмосІте 170 | важкого ланцюга сітки ння екз ту ноу кат він и моТАК М М АОУ Мт к Міда тяаа МОЗ (МН)24А11-05 шуму ми і у но
ЗАУБЖУЦАВІМКУ п АХВ ОНУКУ КУА
ОУДМТОТВЬо СЕУМІСОСАХ ІВсваБОоМгУ
Варіабельна область ме меМмту їКя ттокКроошрЕ пк «м 171 легкого ланцюга (М) пана но М. пУУ МІК ВУ саун ШК ОА АХ ЗЕОХ ШМК ЛАК 24А11-05 іти принт то І
НУВ-НІ 24А11-05
НУВ-Н2 24А11-05
НУВ-НЗ 24АТТ
НУВАТ 2411-05
176 |(нМвіасгдАТТОВ | КУЄМККЮ СС 177 |нувіЗадАТІОБ | болвнУуєЕВ СС
ПУСК ЮСАВ ПУВРОАОЗУКІ, ОТАК МІК
Варіабельна область (есе ми ков рюгнМ шию то Те ЕМс УВК тавет оті Ко ет
ВАМ ЛЮБА ДО ІМую А ДІ
Варібельна блю я, 181 |легкого ланцюга (МІ) (се сслс дл влив те
ТавЕт1-е11 рр ПТ тхСЕшеВнУЄ РАБСОСОТКОВ Її ол18а |нМмв-нізавбеті-етї | сома 83 |(нмв-налаветі-е11 | ІоеЕМостТЕ ТАТКО СС
ММ ЕК ПУЕ КСНЗ МК, ШОВК ТЕМ
Варіабельна область у хикхувоА СОКОТЕКУАВ ТЕоКУММУАК 190 |важкого ланцюга| ух сито пт причи гук ев (УН)В9Ра-Аї пила пимонорня селеротовк 000 п ЕВУВЬТ ОСА СЗАДІХ У КОПОММА ХУ зл, М КУ
МІММТОВРЯХ ПАСИВУ МаСКаНОВУЄ
Варіабельна область й сКЕОДМУА кУсОКВООВе кВЬІеМАКТЕ 191 легкого ланцюга (МІ) сеоогюи пгт пік 192 |НМв-НІВеРААТ | ТАММО СС 2193 |нМмв-навеРА-Аї | БОвоКоМмух лугАОВУЮЮЄ ЇХ СС 7194 |НМв-НЗВЯРА-АТ | сомеУувАЇ СС л95 (НУ 8огаАї 00 | КосоБУЄУМУ БодмуУє ОО 2196 (нумвчаевогаАї | АШТВЕН ССС 197 |нувіЗВеРААТ | поїьоБкТ
БУСБОЮВИВУ ПУКРОВЧУКМ ЗСКАБОТТЕ
Варіабельна область Ге УХУИДА ТКУ мокко То КМ 200 |важкого ланцюга (МН) /емеелт шиттю мк мето 201 |легкого ланцюга (МІ) деле по шт в поет, с с ох кер її;
ЗЗАВре ЕСЕ Кун КВ х 202 |НуМв-НТеЗАВАО2 | бу СС 204 |НуМв-нЗУЗАВОг | Бостої С 205 |НУМВІЛеЗАВ-О2 000 | копольсОВОСктТУуЄ 206 |НУВІ29ЗАВО2 | УБКООВ 207 |НУВІЗУЗАВО2 000 | Мости РкТ СС
Варіабельна область БУКОУКОСНИХ ВУЕН ОТО ТК 210 |важкого ланцюга ПпЕУМЕЖУВИВ РОКБВЕКНТАХ ЗКМКАМІ ТТ сотТАТУЖСАВ ПДІЄТУЮАУИ ЗОСТЬУТУВА , ПУТ БЕУшисе АХ ЇБСошОомиУ
Варіабельна область пемемтуУТНЕ зискрооавЕ І теКУуЄКИЕ 211 |лепого ланцюга (МІ) сор оептокк сиокАКоНоМ 14г5-09 пило ти пан шк векселі ЦЕ шх 212 |нмв-нттаг-ря.дГ | БУМ 213 |нМмв-натаг»-р9 | АоКМкКАМОЮТ ТЕУМАЛУЮЄВ СС 214 |(нумв-нзтЯає-ОЯЇГ | батукА С
НУВЯ Т4Р5-09
НУВ-2 14Е5-09
НУВ-ІЗ 14Е5-09
От КОМ ТОДІ тер пЕ . жі Ж у А ТАМИ МИ Ж КА АЙ пі А ох МКМ я Ж
Варіабельна область сих КІЗ УХ ХНИ шу хіх кім гро
ХУ Ал У ТІК М КУМ У пз ААУ ХУ МАВ ХО 220 |важкого ланцюга (МН) рою гетто хх рання км т чере
БІК КІЗ пиМмаИакмлуУВ КЕМІЗілює МЛ 73не-в8 Я ю і ще їмУУСВАНКНМмІ штТттАЖАМГ жим ищати пх пл і АХ ОМ ТК ХАТІ Ки хи ьо шана Мом ях
ОЕМ БАУшШАСККУ МБОКостшиМ
Варіабельна область мпютримУти пити тити ції тота ситу
ХВ ЖХ ТЯ ХК МХ ж юним У ТАК ДЕ КУ 221 |легкого ланцюга (Мі) пан с вт пекти кт в
УхУскивиМ ТОК ІК
НУВ-НІ 73Нб-В8
НУВ-наг 73Нб-В8
НУВ-НЗ 73Нб-В8
НУВа 73Не-Ве
НУВ-2 7З3Нб-В8
НУВАЗ 73Не: В сінна вЕ БЕКВОБТоКІ ЗОсКАЗИЖТЕТ
Варіабельна область ти тім тів пиття мими тт ту
Ме А ГРУ У ТУ Мила г Вуд У Дала ки ї 230 |важкого ланцюга (МН) дотягує тя шоп дог т фот віку гучна дАиоЕКкоКгтЕ маку аМУЇ ле АЙ КМІМ АЛІ 2207-63 ші т ін
ТАБУ А ВУСА Со ТОМУ ї пІУСтТОпеАЄХ ПАУБІКНННАТ і5БСсКАНОБУК
Варіабельна область пет у міною чи ІНТЕ КІ тоже ха
Мхляз ха ДУГКМ ОО зм КО МОХ КМ КО 231 |легкого ланцюга (МІ) (С оевхтюстякт скевІічшКит Мо вот 22с7-С9 сепиаштрви тросетківі ко пи
ХК сі КА
НУВ-НІ 2207-С9
НУВ-Нг 2207-С9
НУВ-НЗ 2207-С9
НУВ--1 2207-69
НУВ-2 2207-09
НУВЗ 2279 іш ПЕКРОЕТУКТ ЗИКАВО КГ
Варіабельна область М гІмМАНК КОХ тт КЛИМ тм
АОУЗУЇКУЮ М ЮА ті чи Ух уї МИ Ж КІТ УТА ТМ ХМ 240 |важкого ланцюга доні ту тк допис де гоиекІчАРЕ УМХ
ЛЕБІРОЗРЕТЬЕ Зал м МАН (УН)7АТ11-С12 шен Іштар !
АЕС ОІ УСЕ КІУмиЗІ БУМ
ПУУМЕКК КІВ пЕУшШТСЮНАЄ СКМ У
Варіабельна область пгт ут МИ оте мтс тсрсгхуу ут коле хх кіп ю КК МАЗУТ 241 |легкого ланцюга (Мі) сих: туту хе есе ке скуті ко ру ох «ММ КІМ К Кк лю МО КМ АТХ «САМ МЕ Іза М 7А11-С12 Пи нн І
НУВ-НІ 7А11-С12
НУВ-Н2 7А11-С12
НУВ-НЗ 7А11-С12
НУВ--1 7А11-С12
НУВ-2 7А11-С12
НУВІЗ 7АТ1-СТ2 . мм оУцое ТМ УК ШОК
Варіабельна область МмУТММОрВ ТІК Клода тупа у ти
МІ АДІЗАМУУ Є ІЄМГІ ПАЗЛІВ УХ Мі М НІХ 250 |важкого ланцюга (МН) сет тт у кг жом криття конф ківет пет
МС КулІмг пюМшА 1 ТАМ и А КН. 12А10-ЕВ дет и пен мА 7
ТАТЕКСАКСЮВ КеОУСНН УГТУДУ
УМО ее цпіясюмАх ТІВ БОІу
Варіабельна область матами тут тами тлотКтеКме
ТІХЛУРОЛАМ М Хо скло я Ха КО Ку іо А ЛУ ПОБІГ 251 легкого лан цю га (УУ) ТЕЗЕ Це тут ТАТИ К ВІВ ДО ГАТТ 12А10-ЕВ отктовсною черрі нин сосну ТЕ А МЕ ЕК
НУВ-НІ 12А10-ЕВ
НУВ-Н2 12АТО-ЕВ ум ЕХ тан мч ум ЧАТ Х (УНІББЕТ-РТІ ВТАЕВУКОКР ТІБЖПООЖКЕЕ 0 УУРОМКМІВА
ША А Км ХВАТ УМ МКУ ши ОоВЕг МАВКИ ВКА
Варіабельна область зм нишЖОК оспичрк У пштомі дув ен леми КК ХАІ АХ , меті САКрСАБУКІ. ПОЕТ
Варіабельна область нухмиюткок во ЕЖІС ІтвТМБУТКУ 270 |важкого ланцюга мети пт пит скихУ ак т пом ши я
ТЕМУ ХАКІ І ВООЗ ОО АМКУ х 271 |легкого ланцюга (МІ) 7755 питна пк ки ши и
КДЖ ХІІ Юа ВАХ МК
Варабельна область 55000000 дво важкою ланцета (НІ 00000
НизТоз' Не влутУєдмях пидмоуєшисо ретуш 0000 мя КМ вис УМ І Мои КУ ДУ хх
БІТ ния павауствит ттевалОшТе
Варіабельна область хто о мк век й з бе у оувошюн 281 |легкого ланцюга (МІ) (с сслосие Споти чої лі тно м сС2 кумі тА кЕї Ах
Мк чих «У шо аж щїх Б І
Н кий ОБУ пови 37 и В ЗУ Ко МІЙ са б ЯКЕ рз т УМ ВЕЖ х у -нНО КП КВ КТ ІЧ
М л - ЗК АМЕ т -- М че 11 ан КЕ ші М РИ ГНЕ да цю шКУ КР Що КО НО. с У о т, ге ме хх З оо ТтУВ А кі своки у п зу МОМ «М Щ г ги КУ Ід Та
КЕ ЗУ М п МАК В пек СХ - . Ам УМ, А - шт М що 7 та сх Ом т. Ж ше г, ЕК І й ЩЕ г ік ПА ре БЕК као гу пт же ЇМ АЛЕ шує КЕ о АТ зппета ОМ ЗК г з МЕМ КЕ кт пе М Ку п КЕ х ї - ту ТК п
Ач ЕМщ У М УМ ХА МА ЗГТ Ж - На м ху ЦЕХ т - І тк я шт хе іх ММЗ се ї На .
Ю те ше гів Хх 5 ІЗ пут с тет ' ї ДІ їх її пп ЗК їх 7 Є Щ 2 х ЕХ Фо ік. х сн 1 я 7 -- І АВ 7 89 л ї шт Кк тя . дк ЩА х що пет мі - Но до Її. с м с «Х ег їх «в Х -т Ех о У ШУ як ї ях с . веж жи ох т - х ях ІЗ ТТ її СЯ Кеш ках І що ТР но КИЙ л МУ що ВЕ : чн ЩО Якдь шт МАМІ ни т-е їЩ т шо УТ щи - І МАК " - ЯМИ ОН ж анц СТ ОА ТО пої ТО КТК А шо КБУ ЗМ дат юг й ТК УМ я - ЗЕ КК їх 7 ІЙ ВИМ г
Н Ме мі пз г у туг зи т. о м пк; її их ТЕ ве 37 Мито АК шт Ящ. ІЕЕ КОХ хх ПА РМ ле АХ рЗ МІ . ще ВІ Зк НУ 4 т г КЕ я х Я щи т ях КН 7 е сх - тА І їх т ЗК ОН ВХ зе НсЬЇ ШЕ х 7 М м ех По т «й НУ . ХМ пе її ще ши НМ См тк РІ ді ї г З ше вк . 2 ж вище МЕ НЕТ КЕ ЩІ У не о . ТБ и я х 2 хх - ЕН Ук Гі ся ЛА . НК Їх и МЕ - 90 Варі пі щих чод т шток кі г які ЕІ р г тн : ТЕ хї кі МЕ МК Нщк іа тт ОХ, ІЙ АК У їх МЕ КА ; ва бе х2 ЕЕ ТА чес АБУ щі сте МТК У. и37 Го а ш ККУ б ст пе Кв пт вок 0 Моє ЕМВ «а ст ТК хм : в ре ОВНІК Є її ВІ НЕ й і г ТЕ г р лан об . тут МА в . шЕрЕГ чищшЕ 4 ТК М о її -Н цю ла тЕ Оті т г ТЕ ЯК кл КИМ! 2 в М га ст ВЕ ої ж ТЕ ЕТ їх В т 91 а мо (М ь Б ЕМ «КА 7 х ЕН ТРИ пот щи і т Мих КА КН у и Х Тл ЗК пл ріаб Н Ох п и -е ії МН 5 - 1 Б чи А ег ел ша вл я ші Уд: ТК шк вих
Ко ь КУ КЗ ся ше ДІ СУК ТТ п 2 из го на ЕМ ЕВОЄ зи Ух ї БІ що
Ж ПТ па м МНИХ МЕ НА ГАМУ АЖ нт - сет з У У М ЗА БУВ АК - ет ЗУ шк ЗД т їх че си и х м ІА Ук Ії тт; 93 НМУ 9 цюг. ас гу УКВ МА ОКА ТЕ тЕк Спо МКК 94 НУВ 1 н (М. БУ - УА ЕТ ТИМ АСК їх ТУВ с ТАТ 23 : кн су 5 ше Що т їх АВ м
З УВ 2н 70 НІМ - т ЕК БЕ ги УРЕ ват
З МІ ми ЯН хх Ах ЗІ - БВ р : Ж 23 Н -НЗ иЗ -Н Фе ГИ НИ ДІ шх ТІВ МІ. Кі « ШК Ми 6 Ув Н 70 9 ща ку о МІД ваг МОКІЯ «М ст шІКХ АК - ув я ло З
УВ Низ ОЗ 9.5 щ У а паї жи МЕ ся пох Сх А тру -- Тр Не 00 Ва Низ З-Н 5 пт Ми т оф - НЕ ПИВА г З й щх я ТІ кког т з ва е 3- мо те ЩІ Щ КСО ши т йо ее ЕЕ їх (М Ког ьна 9 у5 без х ЗАМ РУ СУТ віч ЛЕ 151.8 БЖ нн о Ко в с дт ТК У МЕ тт х т дк: 94 обл МЕ тУН ОБЛ отко І ТЕ о пт ММ Ми УК ТК ши Кі ї 301 в Вам лан асть т СЕ ТЕ П5МОт Ко Не их ди арі м пи І У" БУТуК т л аб га ПУ У Ух Щі КУ А е е -- 4 т ТУ ЖК Ук ЗАМ т т х хх І - 1 2 ІЗ су ІК ї- 302 9АВ п а кг і п ст уЕгК Щ «ї
МУ ЯКИХ ІЗ КА ї - - М СУЩЕ . тя ОК їх Ох, їх : у й і у ЕР КВ ОА чех пі т їх ж -- МО т 05 УВ 2 48 ПЕ ТК сах С шо ЕЕ
З Н 2 ЗИ Я ЕЕ пої зе УК 06 НУ -НЗ За -м1 п пакт КА по Ах т м УК
В Н В 0 ПУ КТУуТ які СХ вч РИ: МУ 30 Н -І1 и9 2.М 5 м ЗУ Ко хі М; ЩІ гр КІ ще 7 9 у гля ЗО те г я Б А т УН Я Уе -ІЗ 9 У т Гм КЗ - У АК го МІ КО
З Н 48 -м10 т: м МЕ тт ГЕ; ще шк АК 10 в и 2 5 ев ке тож пе КЗ шк ст арі 94 м ТпЖ пу ОК се КЕ Мар ьо; ТП ОХ в іаб вВ2 05 СА щ-ї М; ГЕ СЕ оКЕас: Ах кт "МЕ я аж е т АХ МІ Ко ПУТ п хх РИМІ Му З (М Ко льн .м105 КЕ їх пи ГЕ БЕ З ОАЕ м КТ, Х НИ 3
Г - шл, НН МА А ТЕ п ОБ т - ов ці 2 об - г щ КК НЕ і ЕЕ шої КІ ТЕ Ех ла ЩІ КІ Не КК їх У -- КА я МЕ
В11 лан сть Іва пн НЕ БеННЕ СК В шт. КК Ї г ЗМР - їж МІК ї ТЕ міх м цю й я, ЕЕ КТ ке ТЕ г тт а Б мА і т М с и ЕЕ - 45 В й ША їх хх, ах -З УТ тех ха Б М ул: о тт - ї ТІ КЕ 4 їх п. ц У сх
ІБ В Злі ТІК їм - МЕ З щу
ГА кої х -
КД ПІК Т
ТУ Б БУС
7! СЕ їх т ТКУ -
Тх г ЗО
БО ; ПК ГІ, В х У -ч НО з КМ т 7 НЕ і то ях де КІ
ОЇ я . А рі я щХ ті 3
Мк и ЯМ хх но ї 7 ха А кт х сус т ЗІЗ т
ТВ вік шиї хі т БА КІТ
СС ШТИТУ г
Кк я НОЯ - хи ЯМ У
МЕ і щі - ке ПОЇ
А пзІісмтТОоЗВоЕ Ед тем ск . КАСУ М КИ дит ЮК МИ К М АНІ АМАВ І ХІ
Варіабельна область -сусдиуУєСКр ПЕЛРЕІХВ зцівУтсУувЕ 311 |легкого ланцюга (МІ) дою тх т тіні соті ше світ далута и
ТЛ ХВУумуаиьа МІ КАК УКХ Х КАМ пит25811.м17 поки липи 7 й кт
КТ УТЮ ЗІКУБІК
НУВ-НІ пи125811 .м17 віз. | НУН-Н2 ОТВІЖЛОМУАТНУАЕВУКО пи125811.м17
НУВ-НЗ охоте 314 А пи125811.м17
НУВАА пит25ВІ1 17
НУВ-І2 пи125В11м17 317. | НМТ З ООогатТУвут пи125811.м17 п . КУ ЕМО ма шИЯМАМВАКАКЖК
Варіабельна область, м менюитй сет рев тт сту ДЯ
І Х КТУІН Ух У Аме шмат М г КОБЗА УА ТЛЬМ Х ЕХ 4 320 |важкого ланцюга (МН) пт хх я жтактМмехке конт ту
ГРЕМ хг дока ІК МІХ БАД НМ ДАК пит2г5В11 м26 шле вузу вяикт ниви лит шо
БОКАХ ОКТІМОомоЬ МІУ рішМтоиеО ММА ОКУ Є ОТО АХОМУТ
Варіабельна область пед гне тут т тю дети тий шах В дя М МАО ХО АКА В ХМ КУ Я
Зг1 легкого ланцюга (Му) ТУ гу ди жи т ФА їх А их
ЕВТТВУТЕОо СКУ КІК
НУВ-НІ пит25811 м26
НУВсНо питаБВТТ у26
НУВ-НЗ пи125811.м26
УВА потоБВІТ хо
НУВ-І2 пи125811 ма6
НУВЗ питоБВТТ хЄ . шеУдеУесимх ПАОВОМИ ТВ, ЗОАВБАКІКИО
Варіабельна область виитиМам их ан тки ду сту рути то
ОКУ КЦМУуЮУ КОНЯМ ХхаКадооиВ У лу ЕКО ХВ
З30 важкого ланцюга цесу еерелугУМм см ви т ит еУдава т І Х (Унупита5вВт т мав фетиш 0
ВІНКС БІК МКУ птозмтииме ТОДІ пече сг , ПАЗИ КР КК з А У а МЛКК М У АК паАК М У
Варіабельна область тА ТК ПЕТ тю поету 331 |легкого ланцюга (МІ) ет кет тет іт нагло пи 2581 1 м28 пе ІМК Ба ЕН | Щ г х що ок Мао ше АМОВОЮ
ЕВГуругис ТКУ
НУВ-НІ пи125811 ма8
НУАеНо потоБВТт ув
НУВ-НЗ пи125811 м28
НУ пито5Вт т хг
НУВ-І2 пи125811 ма8
НУВ-ІЗ пи125811 ма8
І БУССУКЛСМХ ВУСА БОААВОВЦЕ
Варіабельна область пп щиЮ А вок ІмЕсиугуткух 340 |важкого ланцюга (МН) ес союсенно емо
Ни3703-Не 28. п днк я ЕН 2 ІЗ ші шанс УА пат т и КО торг Ту тези: ши А КА Оижінсухгк флоті
Варіабельна область поквомтУТИ УтОокрОСВВО пліт твчеМм 341 |легкого ланцюга (МІ) (Хеумучиче іти ти сте
Ни8703-Не мав. я оодедвиіо вер т АУБ
УпЕсрКіУв ТЕО ТКУє ТК 342 НУВ-НІ1 Низ3703- пехуичка ту
НЗм28.А4 я
НУВв-На2 Низ3703- сок хід ие т рих 343 ІМЕНІ ТУ гу КУ
НЗм28.А4 з44 НУВ-НЗ Низ3703- сот дме
НО м28. 4 шОМАММ І
НУВ-1 1 Ни37034 5. тіут я 345 у Ч вдлОоБІУнНЕМшМтЖЕ
НУ м28.АХ м
НУВ-12 Ни3703- ши 346. | На ув да " КУХМАГЕ
НУВ-І З Ни3703- 5 347 НО м28. АК Ко ша»
БУС Пуск, САС «УупМЕмУКОВ кока ЕМУдт ІМЕгНУг ТУ У
РОшУКОВЕТІ ЗІ КМтіІ ом
ТАУтТУСАМНОХ ЗОМ УЖ тімтУуВадиТ
КОРБУКРЕАР пЕВатТВЕБтТА МссЬУкоХе вБРУТУКИУМИ САБТЕБСУВТЕ ВАТОЮ
Важкий ланцюі ЗОЗ 2УУТУуво ЗВІТ ЖЕТС вУПиЕВБЕМиК 348. | Ни3з703-НО.м28.АХ УсквУКЛЕ ТО РРОРЕОБАРЕ квапРаУЬК
Ідс4-5228Р.УТЕ вЕКЕКОоТЬхї ТВЕВЕУТСУУ типове Ку
СМАКУ УБМАКТЕРвКЕ ОЕМ гІКУ т вуптУрноїх ПМОКЕТКСОКУ шикКОоТехщ у;
КТІВКАКСОЕ МЕрОУТЬКЕ дев мТкМОу ши. ЕП ме ВМ АК тва ЕКртаВІ У кляМОовОоМує пІдУМНЕВЦН МНУТОКОТОЇ ШІ
Важкий ланцюг МУСЗБУБЦОНМІ Усик. ВІДАННЯ ЕК 602 | НиЗз703-НУ.м28.А4 зтсМанУвов вакствиулує ІМошетУрУ
ІЧ24-5228Р.УТЕ дез-к
Пот тТео прутів вАВ ІСІ намомтжрку іш рО ПЬіТКУВМцЕ з5УуроОвВЕКОов сао ЕТІКї ІВУБАБІМЛУХЄ
Легкий цюг Ни3703- оте шен спини тунік пи егкии ланцюг пи УУсЕОСЕБУЄ ФРЕСОК ІКдтУДАрЕУ 349 | Н9м28.А4 Іда4- з є
ВВР ТЕ ЕІЕВРИОЕКОЇ, кА, ОММЕЖРВЕДЕ ' МКУ ЮМАТО поМаОовдуте ОИшкпатУ І,
ЗВЕТЕТЕБКАЙ УК АСЕ УГТ У тиМЕМЕпКс пІСМТОоеЕ ПеАЙУСОЛВУТ ТТОСКАВБОКУК твидихоюко склі адінУтТІМЕ 442. | пи125811-НЗ.І С Й шо их й
Ч ' ВЕЛО ТО ктів БОБАЖТЖ ТО
КкаттвттТЕс СТЕУуЖІК пІМмтОчеа ПЕДЕУШОВУТ ТТСКАОМАИ
ТУДИ ПЕдеКЕІІХ З АІвВЕтТпУурК 443 | пи125811-НЗІ С2 мм
Ч ' ЕВОДИНОТО жтІТтІпсІоВ ЕПЕАТУКОСЮ витжУрЕТЕОО ЗТЕУКЛК птОиМтОочеие ПОДИХ ТТОКАБОМУ Є
ТА УПОКЕ КЕ Іжа шІКУГОСУКе 444 | пи125811-НЗІ СЗ3 пи пі я и і
М ! ДЕМО ЕТО КИБАТЖ СК шчеапзінтучіннинии гепліухтух т пКкІТКгІх мм МТУ ДОМ пІСМТОпраВ падиУСОВУут ТТОКАБОМУЄ тасашж ке пЕДВКІЛ.Т ХУ анІіБуТЗУр 445. | пи125811-НЗ.І СА ' м я М й 7
Ч ' пдепОдОКОтТО ктІтІпшТОов ЕПРАТУЖСС витУуВутритт сук
ТІ МОВО Ко М мя КМ ма юю
ВУСИКИ ПУСК сСААНКІКЕ кт ММКУВОВ ЗОКОСЕНУАЮ ТІЛОМ УАЕ 446 | пи125811-НЗ.НСІ1 є я их
У : нхдЕЦУКОВЕ тІдВИПИКМ УЖТОМЕВТВА
ЕОПТАМУтТИТО СтТТУМССЮТІ. УТУВА
ВУСШОУБИМО БУШЕССОСК ОСААБКЕТЕВ
МУнММеУВОВ РОКОІЕНУВО ІВТКЕОНУАТ 447 | пи125811-НЗ.НС2 щ ш ч Ї нхЕБУКОВЕ жуком у УМ МОЖ
ПОБАЧУ сисних УЗ пУШЬУКНОСИ ПУОРОСВСНЬ ООААЗВКІВВ
МУМКММА КОМ вОоксЬЕМУАЮ ТК БОМУАТ 448 | пи125811-НЗ.НОЗ 5 У ч ' НтАЕВУКОВЕ тІшВООеКМт ПХТОММВСВА
Біг АУЖтТИтТоО пт УВОоКатТ УТУВЕ
Ус УЮВя ВУудЕтОВИКі. ДАЕ КІКИ
МІнММАУКОВ вОоКОоБЕВУ ТО ТБ КЗОМУАТ 449. | пи125811-НЗ.НСА понти пт пшона вх
ХК ЕМдькИ М ГАЛУ Х ОАЕ МОМ ЗАМ я МАКЕТУ
БЕ АУХС ТОЇ тм УГТУХУ
Мур ТК тупі шик хе ум МІ МИЛИ шо КИ АКА ма АТМ АМКУ чМуУХхМУКиА сш БЕ УА чТВОКВОоМУлТ 450 |пит25811-НЗ.НО5 нУДКЛУКОВЕ тІдитодЕКт тт БОоММИеА
ПТУ ТЕМИ СИ ТТИ УТ МА жк и хи
Ал АЯЖАМ І ха ЗАВОД ЖИ ММ ОМ ОМ Кут
У УИОСТ Бери шОАЗКРКІ КО
МІ вММяУКоА шоКОБЕА АЮ БЕК АТ 451. | Ни125811-НЗ.НОб хто т т туту дет туги іт гад ті ч ЯТАБВУКОСКУ ТУБАХ Ух А
ОТО ср МУ
Усе ОоАк кдРОовОУКУ БОКАХ ММ
ОМ рос еЕМ ої. ТЕЖ МОУКЕх п52 |Низава Но МОКЕКОКАТЬ ТУуКЕТЕТАУ Есе
ТдУуттСАКОЮ ЛЕСЮ НУТ УШЕ
УСБУ УкКрОАЛУКУ СКАТ ОТ
ОЕМ УКОАХ КСО ЕМ Кі ТЕХНО МТТг 453 | Низ4В2.НСг ; б та дсни 5 пок:
М Ї МОКЕКшАУТІ ТУОКЕТЕТАХ Бош ееОЕ
ТІВУхУсАНОЮВ АТС УЮ УВО шУшиУОСАЮ УкКроаУКУ ЗУКАВОХОШІ
СУММУ ВОВ, КІ ОМА КС, сет 454 | Нниз482.НОЗ в пит -
МеОКІАСКАТЕ УСБУ АХ возом ов;
ТАУтТУСАЦО АКОТ КОЦУЮ УШЕ
БУмеУОСАВ УККЕБАВУКУ ОЛЕНІ
ЗЕМ У ОА оре с. ІБееМмОУТВЕ 455 | Низ482.НСЯ4 тому вх . ; . сш
М | МОБЕКОКАТ ТЕБКОТУГАУ вЕБББИВОКИ хАУТІСАДО ДЕІЖНОВИТЬУЮХ УщО
УМ УдтИА зТкввОЗАБУКУ ОКА ОТ
ОХГМННУКОоА ОСОБ ІшКхМОУТО 456 | Низ482.НО5 . че у «чех гуєхт " | ВОКЕКОВАТІ, ТУВБТУТУКАХ ЕСЕ
ТУ АКОВ АТО УТ МУ
ВУ УЦЮєАх УККЕиСАВУКЮУ ОК
СтТТМчеУКОА ро Ес, хВРЕМОУТИЇ 457 | Низ482.НОб ща к се Щ й І МОКЕКОоВУ ТІ ТУрКатТитАХ ВВЕ;
ТАТУ ОАВО АСУ У
БУ УскИзАМЕ УКЕКОАТУ МУ БИКА ХБТ ше БТиМиУКОХ ОО ІБРУМОУТВУ 458 | Низ482.НС7 ш ;
М Ї МаКЕКОСКУТІ ТАКТ ТАХ Бек иКІ
ТА САКОС ДЕС КМУ МЕ
Умов УККЕСАБУКУ Ук ошї ехТММУМОХ ДО ВИХ КК. ІБеЕВУТОЇ 459 | Низ482.НСОВ тужити я із че іт свт ут
М МОМЕКСКУ ТІ ТУГА ЕТ тАУтТУСЛАМОк АЕС УпУ
0
Н из
А ві во їс 9
Н
З у
Ав А 46 2 1 и ГНЗ У З 94 - тю ги ТЕГ во спо ТУг с 46 і й Кт ТР 2 1 і тА їз в г 7 І но 948 й 5 щік о й 4 6 2 | У я се КЕ м г т Кр т " То т «с сс ще о С
Н 2 с що зшНя мя тт и Ну - МЕ оо х т т З Х е її а т зх га Х що З сг їх Ох і 94 мой г Му Іти се хх по ке М в хм 2 му с вт Н й їх з її що т Ко У и 46 гІ о У о кт Те КЕ т не о с НН А 9 СІ їїсу їх що ще т я МЕ СУК Кт 5 ще
З н з ві ТМ в АТ т. У п НИ мі
Н Ні як ох М я т т КЕ м за о шк ще й Кок 5 п Кк ті ї 4 во 5 М ; ве В о я т во ШЕ тт 66 1с хх м с Г є ті г те ку о й - АВ ці, се 1 4 т с т Не 7 і ї 7 їх щ м ха; К х що К т Шу Ш Е х ЩІ М т Ко 7 то Но К утжи В КН ВН м Ті щи МЕ Х і ТІ
Ни ге ет КЕ М ВК ща тм пок ПУ ТІ й ЕТ 9 І М 7 пи : че ЗЕ ЗК г Її ї З ПУ З 4 2 ТІЇ і хЬ ТИ ІЗ З 2 ї- го ЛЬ - М; я З в де І г Ве 1 ік У г ЩІ по т 7 з . Хе їй
А 2 Що га се х шо т ї Ж М о ях У 7 - п ; ї ре т - «їх х Кк у НЯ 6 І Ка Я т Кк х К її 4 йо їх й ТП ха - З К щі ОКХ т,
Ме т м г й сх ГІ ах ще ит м й г т . її зі їх - ї е 46 ц94 ОБ: пост все но се ще о вух ох
Ш В В З в 15 ще виде ; : сх щ спе | | | | | т КУ Х п ш 7 т 7 Е Кк що Кк У х я НУ -І. 6 г 1 -к З - ня . і Ш г пт а ІЙ м ш БЕ о т щі ї В п ГЕ щі ВЕ . ги т ті м хх я г ; 2 і . ков ЕТ щ Кк БЕ К а У - годе ! х т в щі шо шт и що г Ко! пк І г я : | | г ї ОТ ТІ по А к ще пе т К г т 4 Н В 1 иЗ рз т г РЕ ТЕ : т ; с Що о Я - 121 СК НУ тар 74 | | с го з З с о н Щ і з с І Ко Мк 16 ІІ ниЗ ротом ото щі що на с ща 0 , що щі 7 ну ; ЕЕ - : : - не ї т т с ї йо З ко го - у ї їх: зом
Н в 1 7 З т т щ хх - 1 З її їі т: з 4. . я о М щк їх т - ув: низ оо з. 7 Н в і и 70 -Но 4 зБня кот й ТО, 5 ОК стен Кк ще У її п с, . ох - - пе З С НЕ В. КЕ ТІ по МИ 15 Кх : ях 7 яти ї . - п 180 т с ої г У: п ще с Я Е ТІ Ве г ТЕ Щі тя 7 - з 482 тт са спа 5.8 п із з ре 5 мо Еое Ша спе: ї схе я ; ва
Мо р С ах 7 т НЕ Не х ко ї т ї т З 5 у в т Р Й , з - 5 як їх - 1 С Мі КЕ УК Кк ЗК - Її Щі І ЕХ 84 сут но рз 370 х Е я хо т Уне т т с Е В РІ о «В їх я У хо ге їх п их т х ТИ з Кт Х У ій 48 МЕ поло; ма З3- т щ ш ся З у У па ні НО т й с Кк ї М ху У Щп МУ н Е КУ 8 ви пе ТУ Є як їх ст о - КА ув ві о ие т я ето те о Ес: ІВ их і зв Й т т оз я в Но: З 73 тт к5 во пе Ух те рі ка сх нує пе змо А я 7 хо ле і : т і м х тт х Кк щі я о: з ся т я со т сл і і г НІ У до п; ї ї г Її Ух т М я 7 1 28 8 пе ща - йз ПЕТ 7 тк МЕ око
З А І: 2 «Фт М- с їх "ї І 1 х У 7 Кл й м? 12 во ї с ї З це М У Я І 8 В 0 зі ТХ ПОМ гі ТЕ ї
А ие РО г Кі п КЗ У І 14 в пу М я ЗЕ М ХЕ ем кі не ге що ие М п п-о Й 7 4 У х 2 хо 7 п п це ЗК ТЕ о чт Х пк ТУ " сис т СЕ що М «Мо МЕ хі ХУ т2 м в не Не На СЕ пах з т й З Її КЕ
У НЕ їгу пл ї гу їн . - в - Ї т г б на пе ЕЕ їУ Мо їЕ 7
І с ЕЕ
Не ст ух г мк хх з. г пає У ех т.
М 7
У 7 7 і її їз
НУВ-І спис нютити
НУВА плиті
НУВ-І пог тпм
НУВ-І о
НУВ-І 1 пиши талии
НУНАЛ вишлемо Мт
НУВ- ппплпліптлияцтиооо
НУВАЇ пп
НУНА шшишстш тім ит АТ Є
НУВ-І1 Ни37034. 55
00 0НемяЮг 77711711
НУ.м30.10 560 |важкого ланцюга (МН) пути гу п стос мит у Рем мст Уют
1 іаб 1 ле ел 28 ь 38
НиЗ7О: ла об З сг тОо3 анцю ласт КК 2 о 563 УВ (Му) ух КС 564 | Ув-Н и37 до питу по
НУН Не нн УЗ шу ПН ББЖ 5бв | НУВ-І пт - КУ Ні Ти СЕ УМХ її ЗІЗ Лв ЩО х КвоК5 Що в-І. 370 39 дя Маг шеЕч АХ чик що 33 3703 9 т т во ци М т З г У те х КУ АК т У й В М ши х39
Хе 2 ко т - хх ми хх Мох Се ев ТУ
МУ Ж Ж ех ГА п «о же м
КОНІ МК ММ а ТК
Ен те ее ЯКБИ КІ 7
МА зу т АК М Мк М ж я не Кх ТК мя В хи йй ТАКО х т СМ пси 56 Ва бо УКС КА : ет ГА це. мо "ху, в ІН жкий ту ЧІВЕтІ ПУТве и37 пло КЕТІ В 522 ОЗ коки ТОМ! се КІ ЗО 8 39 л пі пУКЕХ Пк Б перех
Р.МТ анцю КЕК це АЮ щих Й БУК
Е І П ху ТК хх я ше! Ах хг да Ім МЕ ІД ЗК ОА 4- шу ОН т ІА ОМ ЗА ту У НЕ ж : " що т ГуУУ: Ах чок а т яву - туру - чиашж й хни М тЕщее 1: веЕРКг ШТ Що мух п ТА ОМ т м сну ЕЕГ я МК СУМІ І Пежо КН ї
ЗК мя т ОЇ ІЗ ЕК ТЕ я У ЗКАЄ з
ЩЕ ММ х річ ТКУ МІД з ший т
М ТТН ЛЕТИ гг ТАКІ, хЕНЕ -х тт НН ме др СМТ ОН з ТЕКА я ГИ «т ЕТ хЕ с нене п т ди дк сиМй поря Мун КІ
НН йо З ї- . МДж: гло о пк: Не
ТЕН ам й 7 ТИН, КТК ЕВ , Те КЕБМЕЇ
ІН КОКУ . ВНЗКК ОВК Фе «ЗЕ ЕТ си МИ ст Ох шиї і тт -л те їх ум 59 Легкий дит пог: вЕртн че Оп КІ и ТЕ що СМ їмат т Км САТ ХУ ухе М А
М Ми «и п У А тт Я КЕ и ІН Ммикді вдтУт гшш ОокМ ЦЕ 7 т хх : К - с
ОЗ ц я Ех А ІА Ер - КОМ п Мох м'я КІ ОМ ші Іду хх кА НН т 228Р 33 ла ше меру вт Ми ЖКГ й ЕЕ: ЗИ ХУ
АТ ню т НО в А ех Да ї їх С 5 24 Тл я
Е | г ого ве ТОК щі У ко шене мл х
С ше ХА. ші лиже то ЛК г я км с ТО
Чда4 що еще «ВУХ тк пак У шк КМТ Ах - УУЄт ВИЗ 5 до . ЩІ що М МКК
ТКеЕ ПОМ як хіх їх пи ВМ МКК КЛ 57 Варі оту ЕІ х пло ВОК 7 ПК я
ГИ І ВЕН КБЕЄ я ІхЕ
О |ва ріабел СЕ КУТ БМ шт - ер ГЕ тт ЗМУ ь ЩОМгІ ТОМА но З ЩЕ НН ФІОТ 7
Н жкОго на ИгИгі іАЇ у Ку не т СО а мо об пет: -о хе ХютТКУВ Тл тоб сКщЕ кдд а І КУ Бі хо У
ОЗ ма нцю ласть пах МЕ: КА похе ЩІ ет шт Км що м40 га (УН Осі Мкоко " пом Оле ЕІ ЕВ ве
ПМ се ше в ер: ші т шко ша 57 Варі ) шує ТК УК КЕ й 1ККЕ пк ОКА 1 ріаб У СХ кН КЕ - ГУД КАТ пегк ельн во: мир іх нка М мМ лег М і
НиЗ ого л а о т ук Не тА Мо т то ПЕ - б то ВК 7 ТА 7 ЦО ВА 572 793.м анцю ласт У су дЕТІ Ох ЕІ м кто АК 73 в-Н І їх хі ле ЕК щу п С зга НИ хелах
Н 1 НМ Б т У БИ) ше УМХ що ше 57 У Н МЕ Вик пидм ВИМ: я ЗаеУ 4 в-н 37 пл МТУ ПЕ пАМІУ ПМК КЕ пе АК У . о Ух де пегЗ ТТ ТАК ЕЕ я ях Мих - іа ет 7 п ще А М Км я 57 ув 137 40 576 |Н Ї о ГеСКОСВІ з АСВ м Мету : 5 М Н З Те Мох їх х ОК КАЛІ ЗІ ТиУуМ жу 77 В иЗ мі4 т М с: ЗУ т ххх Мощ ОХ їй Її МаКА Ми хх С У -І-2 7р ях 15 я в вок х ЯМ ТК
НУВ Низ 3.у40 т І о ЦЕ не т гг МК м - ЯКА Е
ІЗ Н 703 4 щу КЕ КУ ТГутрІ ХК те В
Зо. я щ- п от Ту я різ т т мі сКАя кА ш на -- ВЕУ - паУКІ І ях КУ ЗАТ
І КИ т Ок Ам 135 КЕ
НЕ Ел СЕ МІУ КО с я
М ях МАУ У щі
ЕЕ ГУ КЕ ПЕ
МЕ тім: КОЮ Су к НИ
А
БУСТУБОТОЮ БУСРОСЧІК, КОВАНІ КВ ачопманнод раКоБЕнУВт ІМацптеЕеу
ВОЗУКОВЕТІ звоМмиКМтІе ОММЗОнВЕо тдУХУСаМЕХ ІАМОЖЩОО трУутУуадАаТт кОпвОБУкК А СВБ АТО УКИЕ еБЕУгУпКМо шАБТІЦОЧНТЕ ВАУБОСОСЬУ
Важкий ланцюг зООпшУУТУКИ ЗЕ ТУ МУК 578 | Ни3703.м40 Іда4- УПБ Есе едАЕЕ ісп УЕ
З228Р.УТЕ РВЕРКОТОХІ ТВЕРЕУТСУУ УстУувОКовЕУ
ЕХ УГТНЗУ УНМАКТЕвНЕ шОЕМИТІвУ
ВУБЕУБНОгя Ми ККукоКУ МАСОВІ
КТІВЕАКОВЕ ВЕРОУТТЬРЕ ЗОКЕМТЕМОМ
КІТ КО КУ ері АУБИЕО МоОБЕММЖКТ : НІ
ТтРЕУДОВОСЕ ккд тУ каВиОКОоМУ чзсБумнЕДІМ ММНУТОКАВЬЦІ. ЩІК
І ТОеко тадкУєовУу ТТОКаВОоцІУ ниМмтМтУкеи чижрсЕВЕК ВьіткУЯМЕЕ шопУвиВЕшОо ОО шашок Ю егкий панцюг о отусвосяпув ятиоОстТкУВ ІКЕТУвАРЗУ 579 |НиЗ3703.м40 Іда4- гот уечемом меті шк во УТЕ ІЕЕ, КІСТ АВУМСІ. ПхМЕтТеВКАК
ОЕМ АТО «омпОоБаУТЕ СОКУ,
ЗЕ риКАЄ ЕК АС УтТнОосиЗеУ
КМ
ШУМ ОНВя УСЕ ЗАЛІК
Варіаб б панни попи ен арасельна ооласть еусМмлущтв вОаКОПЕнУМт ІМшоЄтТУТУХ 580 ц (ун) т
Низ703 УА ? нцюга КУКИ ККТ І шим мОоММчнАКр і таутУсаАмах зпАМОоЖМОосСо ТтоУТУВА кт вах ПЕдОоСиКУт ттеата то малю Мік У ми дахи м МКМ М ОА хе у АХ аріаоєльна ооласть МИМО них СОКИ леК ІК і ц (Му о ек 58 НА здУвавЕвлв оВстоЕТЬтІ ЗВКОРЕОБАТ
Ни3703.м41 щі тУПЕССВІМЕ МТЕОКНУТКУЮ ІК
НУВ-НІ Ни3703.м41
НУВ-Н2 Ни3703.м41
НУВ-НЗ Ни3703.м41
НУВ-й1 Ни3703 ма
НУВ-І2 Ни3703 ма ши т х т що хіх
НУВ-ІЗ Ни3703 ма
БУТ АЛІ ПУБ пиві Ке вУсМмижУКИВ ОКО зма Туу
Купа Ну Ту я тах І ХГ го У ТЛ УМК ОХ АН ВАК ЧА ЕМ КК ації
ТАУтУУСАМУ пзвшаМОУКсих ТУ тУВЕАЕ кош ОАК сте ТА АНІ УК
ВЕВУТУцУМО САБТБОУНТЕ КАУЦО І ОХ ях их м свя жстую ух п єкю ту вигук ги хІх вті СУТ ТИ
Важкий ланцюг ЕН М М ЖИ сю КК КУ ЖОМУ 588 | Ни3703.м41 Іда4- Укус вп педеК КідшРБУКОЕ 5228Р.УТЕ вриРКОТЕХЇ тТЕЕВЕУТСЩУ УПУЧОКОВЕУ
ОКМшЖУТТУЮ СНЕАКТЕВНЕ шотеМмЕтТтвує
ЗУСТУБНОВИ ПМОКЕУКТЕУ а2МкосБеаяТЕ
КТІШКАКОЮР вЕРОСУТІВР ЗОКЕМТЕМОМ
ІТС УКОКХ ВЕОІДУКИКВ МмосгЕМЕУКТ тееУТИшЕнІЗ кЕБУВБВЕТУ Є кпвисоосМУЄ
УМА КАЦН МНУТОКООВО ох пт Кот пот ти БАК У АТА Я вміти рч хх : Іти ГЛ п МИ КК Аз МТМО КО ме цю у у теку и МУ дики им ти ко з вскхухехтетві хх у
МІМІКУ чім ІМ ММ ТИС МАКІВ тіМАІт КА ВОМОКУТХ ММ ТК М ХУ ХМК о Те ка Гу джут ж му мим их межу у гом т МИС пуху пут ух Ум с
ІЙ КЕ МЕ ФІ ТУТНит літію АЧ
ІД ОМ ОТ МТК КИМ чули и а и маси М КК КА еглкии ланцюг мя Ох іти ех ЛІДА ЛА с КАК ук ОККО КАМ Цу МИ ММ ких 589 |НиЗ3703.м41 Іда4- шт тт тих вки их т врххуус ху
МС ТУТ Ту КИ т ОВІМ ХМ ТЕТ У воовдр УТЕ пОЖКИкН Ах ГО АЖ М ММ МЕЖ ККУ . лити ТЕТ тхтеі и уд ех тут их х
Ім иМмУгУуМм У ГІ КО Олущ М и У ж МЕ С Кт, РОМА ЛУКИ КК ХК хі А ОКХ
ТУ Ж хх и АН и АНА НА
М г У мІ о Ку ЕМ Кім; мон фл М УА КОМУ ТЮ М КАК МОТИВ КК КМ спи тими ТИ
СОКИ М УХА Шия ви ЕЕ У и КВ ит ки
ХХ МАУ хо ХА пихи МЖК МАМ КА БУ. КАТІ МИ КА МО ши у жтзгнхмрУг кути ут Ух жо е чих гі АЧХ тиж ВО АУ Мі и т у
Й УЛ ХЖ Ж УКХ шу АЧХ М КАХ у я АХ
ЖІ Ітутух ФІ ТАВІЩеТДІТХ Х токхди кій тА Ух
КІМ АК І ЕКО о пику Кі о
Ж мМ Ас МА : Я КЕ МАХ ЗК М До УКХ З кох тив ювоя ши м Ми три тек ох отем ж хе км ст
ПІ умІоМх ІА ТАК
ТАЖ А МОХ ТАКІ БУЄ АКА МУ Как |, тесту у щит М Мх Зо МТЗ у су щоки зу ет ци
МЕДІА М ІЙ ТК АТ ПТО АКТ
Музм У МОХ СКК Ат к АКХ ЖухзупМи М ТМ Х Я
ЗІ ІЗД КНУ УсЮУУМІ едОУсустизі зи уУх іх іху хижих и
КАЛ пд ЗАТ
ВЕУ КОМ г РІЧ МТУ КУ укла с обіти г «т Ж ух ТУ их Ми серцтьс ми ди мя М НК ІА ТАЛУ кт М
Важкий ланцюг дім МАМ КТ пава КІ КК мем А КІ Ж ст ТУ КИ УРІЗАИ МІ ІЗ цю ІТИ шу ги уусух УК 590 | Низ703-НУ.м1 Іда4- Ока все АКЕ осв ше куки ву ті ми хутрі ур уч У дор и дк ті 22 Р ПТМ ОК ут т ОТГ УА ТМ тт М
З 8 МАТОМ КІМ КУА АХ У Ма м АХ Мам КУ М М Ки кукі ци хи ті У студе цу и уж птаха вісти Ухх ІМ пу гм МДУ ІІТ шу у щу зх МяхУгУю МАМА МОГО КІ КОМ хх ху хіт зд пок ту ж дж им ву пи у тки сг пт ри бохНІМ МОУ пк: МАЙКИ ОК таці Мат КИ АСУ МІ ад хи пттуЄ рел фу Мотути хх грі остлитух ти ії ту уки мити г кпогмЕашиЦцУую МКК іме МН УК
ТОЮ ДАХ ки шМ г сю У пк кис дует уе сус юю м, х кт тити их потаткиту т т ки
ЕТ АК МІМІКУ Ми ММ Мт сах МАМ МОЇ КОМИ КОТУ М МА УХ Піч КИМ МІ о Я пе: Ул ум У їх: ма У УмуУгу што миши тих
ГЕ ВІКІ ІЗ кома
АК ОК ха их ши и ЕН ХАУС ІМ У Ї слі щит ло БІД ут Кт т ско мюма Му МБТІ Ь МТРХ ГТМ У ки Ко КУКИ пет: среоо м 7осоуих и гуд из посох шал А КИСЕЛІ мем У КОТИ У
МЕМ КК Уа ІноК мл Тл и КАМ
ТІЛІ ЛЬ А ОМ ОМ МУ ТММ ЛІ М юю Али оМ З ДК Ж лігу бета сг ета тх у КУ сля ау
І М ТІМ втТуртитт мМ АТ
СМ М ІВАКК Тл Ха КК ЛІ КТК г
Зими их от ау ти уури их спосмотзгтУт м т г м коми у и п ЖИ мА А
БО Легкий ланцюг Ни3703- котки Мокій ТІ. ТЕКАРУААВО
ЖАТОК ОСІ ЕТЦ ФАТА ти ту ту дере и пов КУ м М ше и ШІ ІЛ ММ о М
НУм1 Ідс4 под ОМ АМПЛУА. псих МВ МАХ м ХХ Ку ХУ
Учити рю тя ан и и кут ж ух туя я хи ТК ви пузкісвиУт ник тещу мух
СМ МАТ збі У самі хо у,
УАЙУТА МК и спУлІУа М МькІ я АХ Маю ги А ХО: пато гра іх чими чу Кк пр як КА ДК ТИ МОЮ М у Хот кИ КОо сти де шати ти пМмри гі
ОМ ДУ У УМ Ук тУКл т и АТХ сметімАт і УгліІ І К 592 |МАРТ (10-24 «МЕМ ил
А - ОТО УМ ло І ОТ У ЦИ 593 МАРТ(2-24 туш ІС ОО МОГ і хз ТЕМ подіти и п Укл гід в и и т Ти УК ТКА
Ум и І ІІ ЕР Н 2-й пт - ОКА КОМІ АК Ті КІМ а ТІ 5О4 | МАРТ/(2-34 АКРЕОКБЕБУМЕСНАСТУСІСОЕКООООУ ГМО ут их и ки я тн КАНАВ КК
УТА ВІТРИ; ГІгУушОМ ГУ УТ М ТАЙ ИН, т УТ см ІЗ у ЗІ ммКг ни у ума тугі АТХ 595 |МАРТ (10-44 МЕНА УС АК МНОЮ хр пута та жк А ТАК хм ІшТ М МАТУСІ ІК и ЕІ ух
МАРТ(2-22)Х18А ЕРВОЕКЕУМЕОНАСТАСТВК
ХИТ МІС АНИ Т К КТ д д АЖ М кими АІ У ІЛ 597 М РП2-24)120 тп М Хіт Ме У МІХ ТІ АКУЮА М ОД УИУМЕ МТ юю
АК КИ С А ТОК и КАТІ зими ки А КАВИ
ПТМ у ОМА СМТ піт КД КИ
МАК А УВІ К БА Ка МАЛІЙ МО А ОДА ІМ хх турах миле ЗТ УзІТ у У ИХ Го ух Іру х шмат ма ат Кіа щу лим і УВК ХА хе У ЖАХ лих М 598 |пши113Е5-Е7.1 С1 пилинки пити пиши
Мрію КІ кумі БОКАХ шу Ж НТ их КИЙ
ПЛАВКИ ХІМ З АУ ЩІК жи АКА І шк ти ти т шт А
ТРАК С Од КІ ЕТ А щу,
МАК СИМ КОМИ МІК АКЛ М КІМ М а жо М г
Кт хожс ит дити жерти у их зош Дрю КД ВТ
АДМ пЕщищІ м дол щу пи в КИ КОХ аа ки ЖхМРІЛЖКТ хаМи У М, т же ди ри у Феерсророж г еко ит у Кг в сті Клея - БЕ, Тег ЗНМ В ВН 599 пи 135 Е7ІсС2 Момот ка. и по А КИМ У и МИ ко М
МИ туту тупик ю шХАМ МК КА Кі АКОТ пд их шк поки пот пп хх
ТТ Ки Топ тт МТ
МАША У М М Мі МАТ М ХО Кі х М варимо пкЕпиом'чутУк Дт
Ам иУх хх ММ УВІ КОЛІ МА КО лада юІмІх У Ку ом АТМ МОБ ММ ке У гу ух тоб ой хх А КІ ха лах пе М яЛОА КОХ МАТ пек Муха трі уи МКУ АСК аа в В не ИН ВАНН кетоз АТЗ А ут хат тт ЖАТИ трек ж кіт
Тіт гуми Ку ТОМІЮ ІТ иУули ТЗ А ІІ
МК юс поза лА У ТМ і АГ р зе хотех ук ит сх як пуд КО хуя жо гуту чех:
ЧА НН ТАКІ. пк 1 хайЯАФ ТІ АХ Хо АПА МОУ У
НІМ г ту ЕМ ІА У У
МОМ Олю Ми 1 ХО: УВК МУК У БМК У ще щу ува КТ дк АД ем ТАМ ху
УС УЕАССНУ БУСЕЛ, ЗПААБСЬІВЕВ
Варіабельна область пси кттуя пох иту ючиту ке дерти нити 603 |важкого ланцюга (МН) - и ша о кон г їх НВ с о о
НиЗ3703-НО.у76 г ПЕ ЗАСАКІТХ шеОМОКМУМІ | ТУКА
ТАХУХОСАВМНЦУ САМІТ ОССМЯ ТУГО
МОТО ПЕСТрООрАЧ ВСУ
Варіабельна область нЕВОМІтЬЕш тіОоКрРОВРО БІ УКУБМАЄ 604 |легкого ланцюга (МІ) ПОСУД У ПОЕТ ІК ШЕУ БАБОУЄУ
Низ703-НУ м76 хо ЬУВ МЕС ТК
Ни3703-НУ.м76 НУВ-НІ
Ни3703-НУ.м93 НУВ-НІ
Ни3703-НУ.м76 НУВ-Н2 00 и -НУ м -
Ни3703-НУ.м76 НУВ- нЗ 607 |Низ3703-НЗ.м83 НУВ-НЗ шУВСАМІОУХ еШшеЕмн я 0000000
Ни3703-НУ.м76 НУВ-Ї 1
Ни3703-НУ.м93 НУВ-І1 сем не
Низ3703-НУЗ.м83 НУВ-І 2 кчудМмвЕч
Ни3703-НУ.м93 НУВ-І 2
Ни3703-НУ.м76 НУВ-І З
Ни3703-НУ.м93 НУВ-І З
ЕМО БУ КЛ УСЕ ПОЗІ Ж пУсМишУ НИХ КПК ячЗАТ ІМЕПОТВУу
КОошУКОМЕ ГТ СВИВОАМТУ АННИ ЗОКАКИ
ТАУТЕСАМОХ ОЛАМОХОХ БеБУКУ ЕХ
Кп АЄ ПЕВИТЕЕКТА ісп К
КЕВУТУЕУМЕ СсАБТСУНТЕ ВА СОВЕММ
Важкий ланцюї СОЗСУЄТУРЕ ЗЕ тТкТето МУМрНЕРЕМІЖ 611 |Низ703-НО.м76 Ідб44 ОКУ КОКУЄ ес ОссАСЕ кіс з2г28Р.УТЕ Еко ТКЕВЕУТОУУ УпУВБОКБОККУ
ОМ УУгН УМиВЕтТЕеКЕ КОМУ КУЄ
УБТУЮНОГИЄ ВМсКЕУКОКУ дМкКОоеРОШІ
ЕТТІКАКОСЕ дво тТЬее МОМ КМоу пОТИБУКОТУ БЕБІ АУЕВКО Моск и УНН ЕКО ШКИКУЄ кла мУ ж
ВсІБУМНЕАСЯ МНУуУТОКОЗИЕО пі
БУССУКИСОС БУ сонОВ, ЗСАЛБСБТЕ
ТОМУ КИА ОКО ЗАТ ІМС
МОУ ПЕХНМЗКВМ ТЦ СОМАЛІ
ТАМУЧСТАМЕУ ЕМО ТОМ РУВКА КТ
Важкий ланцю КОРОУКРІАЕ пасе штТА АОС 612 ІНи3703-НОм76 - е4- ЖЕ ТУЯ АВТ ШУВТЕ АТО зЗгг8Р.УТЕ де5-К прадуттурви пЕТСТКТЖТо МУЮНЕРЕМТЕ
ЗЛАК ВЕРБА ВЕ Кс ВУКЬУ
ЕЕКЕКОТОХІ ТВЕБЕБУТОУУ УпУБОВБеКУу
СЕМИ УІниМК тУунивитТКвкЕ БОКІВ УХ ші МНМА МОСК У зно
КТІЧКАКЦО МЕРОУУТЕЕ ОБКМТКМО пЕТсЛУКОКУ ВЕПІДУЮЩЕКХ МО БЕММУК
ТеВУТІННМОВ ЕБДТЕаВІТУО кЕЕщОВОМУ зсплУМНЕДЬН МНУТОКЕКЯЕ ШІ
ПРЕ ПБеУТрІАК тан нЕМОМтТтІя тікав О ПІКУ ПМВЕ паУрОошЕноВ спотреткІ оВУКАЕПУЄУ
Легкий ланцюг Ни3703- УСЕ Уг ятТРОССТКУЄ ікКЕТУДАВцУ
НУм769дс4-5228Р.МТЕЇ кІБВРЕОБОЇ, КЕСТАВУУС, ММЕУРВКАК
УЖЕ ОМАТО паМмлОокаУТЕ, спала едії.
ПЕТТІ ВКАЙ ТЕКНКУХАСЕ Тесс цаБРУ
ТЕМИ шУСТОЕС ПрУпрОСВІВ, ВСАВІСЬІКВ
В рі б б стуку М клоун ситі Ук клич чис аріаоельна /ооласть зусМомУКОоХ кекси А МІТКУ 614 ц (Мн) пня вия тити важно м чі КОдУКОВЕТІ двома КМті пОоММаБЕдЕю
Низ3703-НУ.м83 х тдУухжсвмІх посАМможКвосє ТоУТУВЕ гами ПЕТ еАЙ тасвицеМіо . чи кити В я ОХ ж мМ юки ис и
Варіабельна область о невомтре чор ІЗ КУКМЕЕ 615 |легкого ланцюга (МІ) сотррисвов ПЕСТОЕТІКІ ЗВУКАЕВУЄИ
Низ3703-НУ.м83 . : .
М тХсЕСЄтТІУЮ МТЕсОСнУТКУЮ Її
ВУСИКИ УСТ В. ОААВСОІКВ
ЕХхОМлвУВИВ ВК ЕМУ АТ ІМС тТВТУу вошУкОсВЕтіІ вВоМаКМтІя пОММЛЬЕАКе
ТАЧТУСАМНУ ПОМІРНОЮ тЕУтУвЕде
КИРОУЕБІДЕ ПЕВЕТаКЕТА М пЬУКОХЕ
РЕРУТУВИМО ОсАБТЕШУуНТЕ ВАУГОВОХ
Важкий ланцюг ЗОЗ КУУТУЮо шЕІЛТЕТЕТе МмуцсикваВтЕ 616 |Ни3703-НУО.м83 їде 0 УпКВУЮБОКХо врОовеовАеЕ КІР УКЬЕ 5228Р.УТЕ вВКРКОТІТІ ТВЕРЕУТСЧУ УпУОВОРЕУ
ОЕМ ТУ ТнМАЕТКРИЕ ЕОКМОТУНУУ шт я ПМС ткКСКу змити дяти ях АКА М ДМ АТХ ау КАМ «РІ ЖТАМЕ ЦІК К ж Мх
КТІПКАКЦОЕ ДЕР УЖТОре ПпОБЕМТЕМОМ зотсБУКОКУ РЕПІдДУВНКе МОЛеЕММУКТ
ТВВБУТОВІКЛЕ КтЬУКВОТУ кавшОоКаМУує пІпшУМНЕВЛіЬН МИиУТОКВІВІ док
МОВ ВМО, ЗСДАВОСІВВ пЕОМИЖ УВО ОКО ЕНУАТ ІМлОСТАТУт вІБУКЦЕКТІ пвоМаКМтТІ ПСРММВІ ВАВ пкт уИМО Я спдМмізУЩНОгНО тЕитохиди Р
МАМ А Меч АМ А УП ИМлРШ ЮК Ку лих ЖК М ох мою Х квоУКріде совАТЕЕшТА діпсіУкКеУє
ЕРУТУЧИМ ПАМТНОУИТЕ АБО
Важкий панцюі ССЗ УУТУКЕ ЗІКу МУПНЕРЕМТК 617 |Ни3703-НУм83 дея 0 УСКЕУБИКУЄ веОБоесеАРВЕ кіссвЕМЕгЕ 5228Р.УТЕ дев-К еРКРКОТІХЇ ТЕЕРЕЗТСУЄ тпУудДШоВЕУ пЕМЕЖУТЮ Є знМАкТКеВо КОКМЕТтВУЄ шУБТУБНОУ ІМОКЕХКОКУ МЕССІ
КЕТІКАКОО вЕРООУУТЕВе ЗешЕМТиМОУ всі скОоКу васІДУЮИКИ ма вЕММУКТ твЕУБОолІСся ЕК ТУЮ кнвМОовБОМує пЕУМНЕВІН МНУТСКО МІ, КІИХ ти т грот МУ Тотал гм г ухилу уста
Міо лін МИ КОьКи мох А А М ХК уми ОМ
НЕМОВ УЕВ чінщронеи ета МЕЕ епиРІги у пишу сти ВАГУ «хи МУ ШОВКУ К СІЛ хх д КК У ОКУ ПІ М
Легкий ланцюг Ни3703- тс ОстЬУє яТРООСТНУВ ЇКЕТУДаВБУ 618 А є
НУ.м83 ІД04-5228Р.МТЕ|Ї БІР ОБОЇ, КВПТАВУУС, ММК ВВЕАК
ОС МАЛУ АТ У ша туга гут у с хе УТ м КК мом Я М Мо зм и и мяч патЕтоакА ХЕКНЕУХАСЕ етно анУ
ТКаЕМВОЕС
БУТІК Уоррен. ВВЕ Іі КИ
Варіабельна область о зусмсфуров ВОКОСЕИУАТ ІМлсстТЕТеу 619 Ц (Мн) й
Низ703 нед РО2УКОВЕТІ ЧчарчаКМтЬу ІОММЕБВАЕ 703-НОм93 х таутУсаАМмих ВсдМижвосс тоУтоВЕ
КІОТО РЕВ ПЕД КУТ ТОКІО БІМ
Варіабельна область несу УООКРОКоРК ОтУКУЄМИЕ в2о Ц (МО . я і де хокею
НиЗ7о- ву чі щура ЕнОВ пато чаговЕОеАр
Ни3703-НУ.м93 х
УЖСЕСЦРОМЕ МТЕСОСТКУВ ІК
УС УБИСНІОЯ ТРОСА, пОААНОТІКК
ЗУсМаКУВОД РОКОЦЕИ УЖЕ ІМЗССсТЕЖУХ воБУКОВЕТ І, швОоМБЕМТЕХ ОМА ВО
ТАУЖХСАМИ пОАМоУЖс трУутУувидинт могу миши А па а ма на я ТЦ ТУ Є
АТ А м КМ ких тини тини чи Мк Ка Ак я вЕБУТУВЩМИА ОАСТВСУНТЕ ВдУТОВБОУ
Важкий ланцю дідвУучтУви ВІК тТЕТо мУрикеамеЕ б21 |Ни3703-НУм93 їІдСеАЯ 0 УСКВБУКВЕХО ВесееосвдеЕ вісн вач КЕ 5228Р.МТЕ шРКеКоТТяї ТВЕРЕУТСУМ УупевБОоБОеКУ
ОСЕМЕЖУТСУЕ УНМАКТЕРВЕ БОКЕМОТУВУХУ
ЗУБ УТНОГИЮ ІШКЕЖКСКУ чМкЕсванІ
КТІБКАКОСР вВЕБОУУТІВЕ дшОКЕМТКМОУ
ЗСУ КСОКУ ВаПІАЧЕШЕВ МООРЕММУКТ твЕмі Бош тре тТУЮ Ка МУЄ шсеУМнНЕВеВ о МН жТО Кого Бі
ЕМО УКЕО БУСРОСВСКЬ ПСААБОСІКВ пУусМмаяУвов, ВІЗКОМ УдТ тМмаСИТВТхУ воБУКОВЕТІ ЗАОшаКМтх ГОМ МИСВАЕО
ТтАУЖЖСАМІ Я БОАМОЖНОСМЗ туту кОоваУЕвІ де подати КотА МІС УКИХЕ
ТЕВБУТУЧИМЕ пато УНтТе гАТОдВОГУ
Важкий ланцю пІшпучтУуви ПЕТ ТКТЕТИ МУСНКРЕМТЕ б22 |Ни3703-НОм93 ІдСе- 0 оскКвУуКЕК у вроввВовАВЕ РІО РВОУКЕ з2г28Р.УТЕ аев-К ЕРЕКРКОТІХЇ ТВЕРЕУТОСУУ чршжвОовоеКУу
ОЕМЕЖУТНУУВ УНМдЕТКРВЕ кОКМатТУвуУу
УГТ БМСКЕЯКОКУ аМксгецитЕ,
КТІШЕКАКСОг вЕвОоУЖжтТОве ПОБЕМТЕМОУ сОТОССУКОГУ РООІАУКТКО МОРЕМ Ку тЕвУБошОсВ ЕКО ВІЛТУЄ кадисоБеМУє зишвУМнНЕДЬН МИТО КМ
Тов Хх ОАЕ ЕТО мамам КХ тоОквОоКаРЕ ОІхКУМВЕ поУравЕБОх ПастТоЕтт ЗЕОВЕОКАТ
Легкий ланцюг Ни3703-. У хсвенУБУє ТЕО ТКУ; ІКЕТтУдАвчУ в23 7 є ном Ідс4-5228Р.УТЕ КІЕРРЕБВКОЇ, ЕпПТАВУМСЇ, ІМЕЕУРЕВЕДК
ЗОМКУВМАТО силова сОочкпатеНі
ЕТО КА ТЕКОКУХАТЕ УтиОосьсарУ рн
ВІЗКОМ
Залишки 2-24 тау-білка лЕККОККЕУМКОМАСТЕОВСОВК 777777

Claims (67)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюом людини, де антитіло містить НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 605; НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 606; ії НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 607; НМУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮ МО: 608; НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність 5260 10 МО: 609; ії НМЕА-І-3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 610.
2. Антитіло за п. 1, де антитіло зв'язується з мономерним тау-білком, олігомерним тау-білком, нефосфорилованим тау-білком і фосфорилованим тау-білком.
3. Антитіло за п. 1 або 2, де антитіло зв'язується з епітопом в області амінокислот 2-24 зрілого тау-білка людини.
4. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-3, яке являє собою моноклональне антитіло.
5. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, яке являє собою гуманізоване або химерне антитіло.
6. Антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, яке являє собою фрагмент антитіла, що зв'язує тау-білок людини.
7. Антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де тау-білок людини містить послідовність «ХЕО ІО МО: 2.
8. Антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 603; Б) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 604; с) МН згідно з варіантом да) і МІ. згідно з варіантом (Б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 614; е) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 615; У МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (е); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 619; І) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 620; Ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (й).
9. Антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить 5ЕО ІЮО МО: 603; р) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить ЗЕО ІЮО МО: 604; с) МН згідно з варіантом да) і МІ. згідно з варіантом (Б); а) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність зЕО ІЮ МО: 614; е) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність БЕО ІЮ МО: 615; У МН згідно з варіантом (а) і МІ. згідно з варіантом (е); 9) варіабельну область важкого ланцюга (УН), що містить послідовність 5ЕО ІЮ МО: 619; І) варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність зЕО ІЮ МО: 620; Ї) МН згідно з варіантом (9) і МІ. згідно з варіантом (й).
10. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 603, 614 і 619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 604, 615 і 620.
11. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 603, 6141619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 604, 6151620.
12. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 603, 6141619; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 604, 615 і 620.
13. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 603, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з ЗЕО ІЮ МО: 604, 615 і 620; р) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 614, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з ЗЕО ІЮ МО: 604, 615 і 620; с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з ЗЕО ІЮ МО: 604, 615 і 620; а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 603, 614 і 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 604; е) варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ МО: 603, 614 і 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗБОЮ МО: 615; і І) варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовність, яка вибрана з 5ЕО ІЮ МО: 603, 614 і 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 620.
14. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 603, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 604; р) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 614, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 615; або с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 620.
15. Виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білком людини, де антитіло містить: а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 603, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 604; р) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 614, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 615; або с) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗХЕО ІЮ МО: 619, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 620.
16. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить: а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 96, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності зЗЕО ІЮ МО: 611 або 5ЕО ІЮО МО: 612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності 5ЕО ІЮ МО: 613; або р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЗЕО ІЮ МО: 611 або 5ЕО ІО МО: 612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 613; або с) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 96, щонайменше 97 У або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності БЕО ІЮ МО: 616 або 5ЕО ІЮ МО: 617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 95, щонайменше на БО 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності зЗЕО ІЮ МО: 618; або а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 616 або 5ЕО І МО: 617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 618; або е) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 96, щонайменше 97 У або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності ЗЕО ІЮ МО: 621 або 5ЕО ІЮО МО: 622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 956, щонайменше на 97 956 або щонайменше на 99 95 ідентичну послідовності зЗЕО ІЮО МО: 623; або І) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 621 або 5ЕО ІО МО: 622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 52Е0О ІЮО МО: 623.
17. Виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюом людини, де антитіло містить:
а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЗЕО ІЮ МО: 611 або 5ЕО ІЮ МО: 612, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮО МО: 613; р) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 616 або 5ЕО І МО: 617, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 618; або с) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 621 або 5ЕО ІО МО: 622, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮО МО: 623.
18. Виділене антитіло, яке зв'язується з тау-білюом людини, де антитіло містить: а) важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮО МО: 611 або 5ЕО ІЮ МО: 612, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5260 ІЮ МО: 613; р) важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 616 або 5ЕО ІЮ МО: 617, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО: 618; або с) важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 621 або 5ЕО ІО МО: 622, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 560 ІЮО МО: 623.
19. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло являє собою антитіло Їдс1 або Ід.
20. Виділене антитіло за п. 19, де антитіло являє собою антитіло Ід.
21. Виділене антитіло за п. 20, де антитіло містить мутації М252У, 52541 і Т256БЕ.
22. Виділене антитіло за п. 20 або 21, де антитіло містить мутацію 5228Р.
23. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-15 і 19-22, яке являє собою фрагмент антитіла.
24. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло зв'язується з кожним з мономерного тау-білка, фосфорилованого тау-білка, нефосфорилованого тау-білка й олігомерного тау-білка з Ко менше ніж 100 нМ, менше ніж 75 нМ, менше ніж 50 нМ, менше ніж 10 нМ, менше ніж 5 нМ або менше ніж 1 нМ.
25. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло зв'язується з мономерним тау-білком людини з Ко менше ніж 1 нМ.
26. Виділене антитіло за п. 24 або 25, де Ко визначений поверхневим плазмонним резонансом при 37 70.
27. Виділене антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, яке зв'язує тау-білок яванського макака.
28. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за будь-яким із попередніх пунктів.
29. Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за п. 28.
30. Спосіб одержання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 29 в умовах, що підходять для продукування зазначеного антитіла.
31. Імунокон'югат, що містить виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 і другий терапевтичний агент.
32. Мічене антитіло, що містить антитіло за будь-яким із пп. 1-27 і детектовану мітку.
33. Фармацевтична композиція, яка містить виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 і фармацевтично прийнятний носій.
34. Спосіб лікування захворювання, асоційованого з тау-білком, який включає введення індивіду із захворюванням, пов'язаним з тау-білюком, антитіла за будь-яким із пп. 1-27 або фармацевтичної композиції за п. 33.
35. Спосіб за п. 34, де захворювання, асоційоване з тау-білком, являє собою таупатію.
36. Спосіб за п. 35, де таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію.
37. Спосіб за п. 34 або 35, де таупатія вибрана з хвороби Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцфельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон- протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово-скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо- понто-нігральної дегенерації хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії.
38. Спосіб за будь-яким із пп. 35-37, де таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч.
39. Спосіб збереження або підвищення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті в індивіда, який включає введення антитіла за будь-яким із пп. 1-27 або фармацевтичної композиції за п. 33.
40. Спосіб зниження рівня тау-білка, нефосфорилованого тау-білка, фосфорилованого тау-білка або гіперфосфорилованого тау-білка в індивіда, який включає введення антитіла за будь-яким із пп. 1-27 або фармацевтичної композиції за п. 33.
41. Спосіб за будь-яким із пп. 34-40, де спосіб включає введення щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу.
42. Спосіб за п. 41, де додатковий терапевтичний засіб вибраний з неврологічних лікарських засобів, кортикостероїдів, антибіотиків, противірусних агентів, антитіл проти тау-білка, інгібіторів тау-білка, антитіл проти бета-амілоїду, інгібіторів агрегації бета-амілоїду, антитіл проти ВАСЕ1, інгібіторів ВАСЕЇТ, інгібіторів холінестерази (СПЕЇ), антагоніста рецептора МОМА і харчової добавки.
43. Спосіб за п. 42, де СНЕЇ являє собою такрин, ривастигмін, донепезил або галантамін; і де антагоніст рецептора ММОА являє собою мемантин.
44. Спосіб за п. 43, де антитіло проти бета-амілоїду являє собою кренезумаб.
45. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 для застосування як лікарського засобу.
46. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 для застосування при лікуванні таупатії в індивіда.
47. Виділене антитіло за п. 46, де таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію.
48. Виділене антитіло за п. 46 або 47, де таупатія вибрана з хвороби Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцфельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово- скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії.
49. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 46-48, де таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч.
50. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 для застосування при збереженні або підвищенні ємності когнітивної пам'яті або вповільненні втрати пам'яті в індивіда.
51. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 1-27 для застосування при зниженні рівня тау-білка, фосфорилованого тау-білка, нефосфорилованого тау-білка або гіперфосфорилованого тау- білка в індивіда.
52. Виділене антитіло за будь-яким із пп. 46-51, де антитіло призначене для застосування з щонайменше одним додатковим терапевтичним засобом.
53. Виділене антитіло за п. 52, де додатковий терапевтичний засіб вибраний з неврологічних лікарських засобів, кортикостероїдів, антибіотиків, противірусних агентів, антитіл проти тау- білка, антитіл проти бета-амілоїду, антитіл проти ВАСЕЇ, інгібіторів ВАСЕЇТ, інгібіторів холінестерази (СПЕЇ), антагоніста рецептора МОМА і харчової добавки.
54. Виділене антитіло за п. 53, де СПЕЇ являє собою такрин, ривастигмін, донепезил або галантамін; і де антагоніст рецептора ММОА являє собою мемантин.
55. Виділене антитіло за п. 53, де антитіло проти бета-амілоїду являє собою кренезумаб.
56. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-27 для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, асоційованого з тау-білком, в індивіда.
57. Застосування за п. 56, де захворювання, асоційоване з тау-білком, являє собою таупатію.
58. Застосування за п. 57, де таупатія являє собою нейродегенеративну таупатію.
59. Застосування за п. 57 або 58, де таупатія вибрана з хвороби Альцгеймера, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона, хвороби Крейтцфельда-Якоба, деменції боксерів, синдрому Дауна, хвороби Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, міозиту з включеними тільцями, пріон-протеїнцеребральної амілоїдної ангіопатії, черепно-мозкової травми, бічного аміотрофічного склерозу/комбінації паркінсонізму та деменції (комплексу Гуама), негуамської хвороби рухового нейрона з нейрофібрилярними клубками, деменції аргірофільних зерен, 60 кортикобазальної дегенерації, дифузійних нейрофібрилярних клубків з кальцифікацією, лобово-
скроневої деменції, лобово-скроневої деменції з паркінсонізмом, зчепленої з 17 хромосомою, хвороби Галервордена-Шпатца, множинної системної атрофії, хвороби Німанна-Піка типу С, палідо-понто-нігральної дегенерації, хвороби Піка, прогресуючого субкортикального гліозу, прогресуючого над'ядерного паралічу, підгострого склерозуючого паненцефаліту, деменції з перевагою нейрофібрилярних клубків, постенцефалітичного паркінсонізму та міотонічної дистрофії.
60. Застосування за будь-яким із пп. 57-59, де таупатія являє собою хворобу Альцгеймера або прогресуючий над'ядерний параліч.
61. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-27 для одержання лікарського засобу для збереження або підвищення ємності когнітивної пам'яті або вповільнення втрати пам'яті в індивіда.
62. Застосування за будь-яким із пп. 56-61, де лікарський засіб призначений для введення з щонайменше одним додатковим терапевтичним засобом.
63. Застосування за п. 62, де зазначений додатковий терапевтичний засіб вибраний з неврологічних лікарських засобів, кортикостероїдів, антибіотиків, противірусних агентів, антитіл проти тау-білка, антитіл проти бета-амілоїду, антитіл проти ВАСЕТ, інгібіторів ВАСЕТ, інгібіторів холінестерази (СПЕЇ), антагоніста рецептора МОМА і харчової добавки.
64. Застосування за п. 63, де СПЕЇ являє собою такрин, ривастигмін, донепезил або галантамін; і де антагоніст рецептора ММОА являє собою мемантин.
65. Застосування за п. 63, де антитіло проти бета-амілоїду являє собою кренезумаб.
6б. Спосіб виявлення нейрофібрилярних клубків, нейропільних ниток або дистрофічних нейритів, який включає приведення в контакт зразка з антитілом за будь-яким із пп. 1-27.
67. Спосіб за п. 66, де зразок являє собою зразок головного мозку, зразок цереброспинальної рідини або зразок крові. Звее заве : ї й я МОВ що я ОМ : 7 з Ж 7 ЩЕ ж : Ме ЗОВ БО ЕВ: МКЕУВЕЕ Ж З БВ же во: до а КО ох З і ї д ! симютю я Хоеоеєки у : Е ї пкт Кк, М Хжеєюхекио шк х ще х Ж ЗА БЖ НЕК зкене М ЗНО Ве КУжЕЕ ВУЖ ТАКЕ КАК КЕ КАК КК КК Кк Е. і ТОБІ КНЕКИ В й
Фіг. ТА
ЗМУ ЛЕК 4 п дже дк я ї Б Гн щі Вл. Камю ММК І З 1 х ОСММЕ х Ї ше їх Її ккнекК : Ка ще ще ї пий ї ї р. вся тн КК ПВХ їж ХК юю В ИЕ ї кдд я в МЛМ ї х Канни ї З х що 7бж ї т Х ї Я ся ех ном: ї хо З Тл БЯ ї Б я пх ; ї 3 що ї х. ї ї хх. св с ї ї Ж ПЕ : Її вщі я ї ї Мля я Ще Б ї 2 Я ПІК Я їх ї жому т З ї 0-2 Коко нд ххжнжжжхх : ПД кулак Кум у м ки ку я а и ї Ж МИ О ОСТНИЖИ ОИМІКЖАІ ЗИМА М ТИЖ ОСБРМЖЩО ЖЧЯКВЕ АК : мої тої ОХ ї 2-Х її: її ї фен дод ї УЩКЕ КВ ЯМ ї Ток ДИТИ Ж Долини ї ЇЖУ 0 зе Пхкммм щи ОХ ох Шххею 1 І ї ї ОВ ї ПОТ їх ких ї ох ї Н хе : М ї дк зх ї ї ї 1 Я ї м КО, ї плтя ї 3 А Ікони п КИ : шо х Шоу ПЕКІН х : с ік КВК 5 Пох в ПІК КАК Її «й Я ПД й хх Мних ї ТЕ З Тх чХ х ї х т Ху : : : ї Ж ї Н ; 3 х ї тла З. Тех х ї Ї й ї Зх
Ї х. ї ї 3 х ж ї вх ї пок ду мож Ж ще х. мож з з ща З ЕК Ж ї ї Б ї За ї 1 я шок ї ко ї они я кро комах х в ВК СЕК, куму у А юм ЛИХ МАК БМИНИ ОМИЩЖЕ МЖК МЕ ООЖЖУМО ОСМ'ЛХЖАЮ ОСМОЛЕУМ ИБИКИУ, МЕ ЦНУМХЕ ВНИХ ВІКИ і є ша АФК скл
ЕК. ЖЕК х; ХЕ тою п А ЯОЖЕ Кон Кшї х бачене ЗХЖИКОХ Ж пою МИМО М : дек, ї ях х І М ї ї жу з дю пт ї до нн х ї ок виюю у Ще ТОМ М УТ ЩО дж ШУ ЖЕ ї шо ех ко Боеететтніния шок ЖИ ЖЕ М Кен Ї кре х ТДЬЖ Ок ; : ЕЛИХ с ЛК ї ї КЕ їх я ї ї З Е ї ї й х в Ї -ї Б «ої с ї тя " то з ї : Ж Е ж. : шої т шо ук їх ТЕО, х. ЩЕ 7 ТОЖ х х ро ; і о ї З І ВУ ЖКкнмх шої вон ї нн и и и ї ПИЖІХ ЗЕМЕ ЗЕМНЕ ОНЖЕ МеВ с ТЕЖ МЕ ОМ ЗІ ккх, ї хек ї 5 щих х МЕЖ СКМ її ще МЕ ї ї вод деккнжюкккккник де докккнкк дики, х ку Пуженнню ТД кож Пенн ТЛО ї ї ї Е ї ї ї ї Ж дкохки я я х Шок хек : : Шик ШЕ Е Шик хек ТК: Її зи Конт с Жооденняйнннния Ї тла пня тех " кн ї ї Е ї ї Е І ї х ї ї Е Е ї х ї ТЕХ х. Я Її ІДЕ ЕЛЕ : т х ї : ї з ї Ї ї че Е х ї с х Й Ж Тк Бе 7 мо т ї жх ж ЖЖ ОВ ї : с х ру, їх док Км юю кути. ще ї КАК з ДЕД ку ук Дн У ням, ПЕДЕ удумкюуюююуу у уКУ Уж иху МК ЗИМІ ОЗНАК ЗИМИ МЖК я Мч ОБ ЗЕ поему КК ККУ КУКА УКХ МУКУ КК КК КМУ ККУ КК ХХХ УК КАК КК ЩЕ Поза нах МИ КК Мо ТК КАК КАК КК ХК КУ ХК КК ду КАК КК А КАК КК Кк Кк Кк
Фіг. 1С зак кашах МАО ЗЕ х стру ня зва достоту К-Я вия Пе КК Ку Шохечуххм ТШШ Ї ї ї ї шо ї хх ї ші : т Бк ДЖ МКМ : С де МКК ї «жо У Шийеємитчи пої Ж, Хоиємуєуу тити ВУ ЗК. 7 Іл З ї я 1 : З ї ї ї ї ї З Н ї Мч ї і: : «ле й: «ж З. ї ТІК ТШХ о ї х я ї у х з ІЗ жк. У Е хе Ї Ж т а о ща дк : ЖЕ с КА хо. : ї а 5 вжи х ї ххх ї кхжжх ї ХЕ МКК : прин З ПЕД ук уиум у у у у ху У у УК Км умру ул у руку ух, ї КО ТЕ ТЕЖ, ЖЖ ИИЖЕ ІК: ТИЖ ЖЕК -ї хг й ї зи х ВОНА ТВЕН ї : вл дит дня дулю ї у Хом 1 у Шемена 1ШЕНОЇ ї х ї ої ож ї ж: : х Хух люд ї я Ху хм м МЕ КнКсї Ву Ж бежу А ЕК : сх Шхую МЕ КШКЇ ї хо ох Шуккеююоюк и шій Ж У ї Еш у. ї х 3 ї Я ї Х ї ї З Її ; ї ї з ї З х ї ї - ї що 3. шин с ї. пли п я : х Ко ї Я. : х Ж. ї Я 1 ї ї З Ї ї У ї ж ї ї ; ї ох ї щої сої хх ї ВЕ жк Я - : : с ! ок ї Е Й мк ї Й хх ся І х ххх, ї схкжж. З ТУ Др сюєюєстуюєюєю екю ук ую ккд кю Дом оюосеюдюююює ую ук дою юю ет юю юю МЕЖ ЖЕ МЕЖІ ЖК ЕВ СІШЕ МИМЖХ КАК ХХХХККАК КК КАК КК КК КК ХК КККК КК КК ХХХ КАК КК КАХ КК КК КК КК АК К КК КК ХК КАК ХХХ ХК АААКК КК АХ ХХХ К КК КК ККУ К КК КК Кук хх ххх КК ЮК ЕКУХЕТУКНХ ХК х : Уклін КК КАК КК КАК КК КАК КВК КК КАК З КК КК КК кл ал Ж ут КК вл кт АК АРК КК кА КК КК як Кк Кк
Фіг. 10
ІГ. ах декеж ех КВ ЖЕЕТУ с. ХОлеж. ни ии и Ук, ин ТИЖ ї ок ШИ ї слав ж Теежжкк ТІМ тех Ден КЖЕКІОЇ Ж х ї ї я ї ш ї дк ї кодек й ї 3 іх ї пкк ек КЕ ї еще, Тени вк. Хжжжююннних х ЗА ТИЖ З, х у хх хо, - х ї х, ї Ко ї 3 й і ух Ех х а Ко т я ї ї й ї чих ї 1 ї Ах ї 3 . : Ж : 3 Ж ї ж. ї 3 ч ї ою, х ОА ок ТОЖй хх їх ТЕЛ сх ПОВ. Бо їх ї о ї х 3 хх ї з с ї ї км, ї Рекк ї ї УМ ї Кок, ї о Др едмююєєюю реє КК Кук нює ї М МК ЛИМЖЯЕ ТК ТЕМИ ЛЕКИМІ ЖК. ЖЕК ик КОХ ОЇ ї чашок «ехо Кк ї УМХ ЗЕ їх полу у вання М ДМ од, Е м 3 п ПДК ї вв ее ТЕО, ї ї ї : ї х 3 в кн її бек Ж в ї Х же ТІ ТІК Кок х ШО ЕЕ ХМ їх х хх х хх Хан шій ж з Лю юююю я, ї у кову КУ З. ї х я 1 Ж. ї 3 теку ї ОХ. х ї ть НУ Кох ї Ул Ху ТЛЕЗ ЖК Ї А Б З у ї ї й що ї З КУ ї Моя ї ОХ. ї ї ож, ї Ж ї теж ЗК, п- ох. Е о ке Я Жах х ї в ї вх Е 3 ОК вом Ї Б ї щої Яке пли з х ПЕД оф уу руху у ук куту у КУ, СИ Хуууу ту у у тку У куту Ум ПИ ПМЖ КУ ПК ШИМИ МИ ТТШЖИКИ ПК мен нн нн п С зкхх Я кім мус ІОН МАВ х щу охеооое екю о КК юю Кок ооо Де Ко оююоКККхК юю кк КК ккююк юю неон
Фіг. ЛЕ
ІГ.
схе дм КМ ши деюуютня ї пд З ЗБК ве ДУМУ. КЕ ЗМК: пикектєяю шо у дж т ня ше печу Бех МУ ї МОХИ МЛК ї МЕЧ ї ххх ех В ї есе ДЛ То т ї нення і х З х ї Б З х : х : ї ї х : х п Ж х їх их х З жо Н Ж ї ЛЕ Тк : М і Е х Ї . жуки ке : ї о Ї ве хх с КК і Е й ; і ї М ї охккккхукккккєкукккккккККикккккку ї ї хх хх ї соку кущ С 1 ї см Кк. МЕД уюююю ЕХ а 1 Ж слжмежмохе ою лою чн ці Одне о я пд З х КК Кк ку хе Ху спр ПК ХОМ лет КАК ХК Кк, так КІВ Ї ОК К о ЗЕ ЗЕ, Ї ТК Вя МЖК і і : хо З ЩЕ сах сеї : : футкундрннт З ЗК Ж сЕжтх дю З І З дже МК х Я : ло, пхежкюхюю КЕ ї : ми М 1 ТЕ ї полки І і х жк кю ДЕК УК бо З КЕ Доки Ка М ї ШЕ хх ї - ХА век, ж. Її Ох і 1 ї Мая «й Зк і: МЕ х і - і Е дк. : : ЖЕ БИ : ко і ШЕ од с : с : ЖЕ Ж. щи оо 3 КК ЖК Я аку 1 їх о ї НО і ї й: х с. лихим 1 ТЕ кума с : я У ЖЕ Ох, Ему кВ дк м 1 х дою, ХИЖИХ м кпк ЗЕМ ВМ УЛУ : х Тек ккк пом нн ПИТАМХ ї пон пев тн ик дк Кк роту МК вах ї ПІКТК до Золжих ІЕЕ о ТБ ТК ще пот сх жеютттстн оф УК Ю юки кюк и СК пеоккете ск юю кюк сккххук куки я . ккхжкк екю жеккиких я дик ЩЕ т ЕЕ ХДЖИНМНИЯ ВУЖ ЕК ксенон АК КК АН ХХХ КА КА КАК х СКМАААААААК КК КК КАК АКАКККЮЮЮЮТЯ
Ме. КдАКАККАКККЮК ЮА . АЕ
Фіг. сок 2 жк - Енн Кол ї ха полатечеістесюют зба ТЯ Ван г х дення й ще г Б го тва ї х : ДК КК І 0-Х хе Есе ВК ; т ї Хххпоміхом З ПЛЕЖ ЖК. Шити : ЗА Кок Ве МЕ зак ї х . т сежюиия ик х х у хх за Ключ длх х. ї ДЖ ен сх ІЛЕЖ З ї тх сук. яхту Ку ї ти Бе ві 0 їж с У І ШО ок Х ї х Б. я ЖЖ ОО їж шиї о ЕІ х В ож ЖЖ х ж, ж ЩЕ Ж Ж с їж Її Км ЗЛ З о ОК пд Б дк, Же - са ря В. Ж х Жде ї ї т Ж шо Ж 0 с Як болхфе Ж бе в Вевваввнвя ї ПК елокед кв . 7 ї ах З ї щей шої екв те 3 ШЕ с ОК пучок, хо ОО жк ЩЕ З МЕ ен я щу сих ОО КУ шо т їх шим у КЕ МК тик хх хх ж розу Щї ШУ ЕЕ ой ї ПИЛИ юр Ко БИШЕ ЩО м БОЩЕО Жо ЩЕ п ЩЕ ви КЕ. Тх в З ПЕЖО ВОК Ж ВЖК ВВ Во ОО шКОООБКО ЄЕС З те шо ОО ї й я
3 . Б сом е ї Жак Км мак ЗА к 3 не в ПЕЕАКАММА шо хсжчкскнй ох ЕОКОВАКН КВК КК 2 . дрон бекон ї ХКГ КВ Інк увВ вок Ку ик ПИВ МОМ ВХ х З ї ой КЗ 5 У З ВУ ин ї дяки їх ї З Я ї ср ї ДАЖЕ нку хе ПеОЯХ Кун Її шюнтююникню ї ІЛЖ том 3 : ї сх ск ї : ХОККМЕЕА 3 лк Шик МКУ т їх о Ва З т : на І па е риття т Хек Я І 3 ої КВК кВ Ї В Жов. Кз З КО. УМ ї ше ї пд тах з ї х Б «о, роя ав жа Ох Ж 3 У з що Ж же , ї ШЕЖИХ т до ї Ж 3 ПЛКЖх сх У и Її 5Я ч 1 ще х ж о Ж У Ж УЖЕ «54 не щої шк
З. БУ ЗИ Я ОО ЗДХ -х. ІТИ са, ЖЕ Я У ох х М ї ХУ хм х ЖК. ї МКУ з «КЕ Ж шої Б і т Ме ЛДКЕ па - ; : Б щі о ЗБеева. ї ох Та ї хе КК і ж ск ; ; ий ОКУ КК КК я 3 ле і Я с: З ПІДЕже ук юеКее й пкт ЖК ВЕ ще С КЕ МЕ Ж 1 ї с МЕЧЕМ, пд пе КЕ ех Ж ЩЕ ЗЕ Во ще ї х ЕК ШКО дв и Ск ще ЖЕО ЖЕО ж ЩО Щ З ДВ окосту ЩО МК ту ОК ВУ ДЕ ВЕ о ПЕН ВЕ ВОК ОСЕ і ПЕ ОВЕЗВ ЕВ ВЕ В Тк В СК як ЖЕО ЖК МК ВХ ЕЕ ОС СОКИ в МК й 3 ВК ОК В Же В ЖЕ ВИ МЕМ МЕ Сй ШЕ ЛЕТЕ СЕМ по ше КИ лк МОЖ ДЖАКОМО ї ДК КЕ ДИНИ Ук. ЩО ШЕ ЛШ КОМЕТИ ЕТО ЗЕ то ЛИМОЛОЕ. Су ї ШЕ МЕ ЖИ СЯ Ж МН Я ЛЕО М ЩИХ ШВИ КЕ ЕЕ ї ШОЩИ до мою с ФПК ОПИЕОИМО П. МИ ОМЕО ОК щі тенти ї ДОВ ек КМОХИК ет Щі сен кн фіхи іже : хх ВЕЖ ВВЕ ту КВ ї спи ох ек УМА х ї с уки МКК ВЕ х о ВЕБ
" ї т пкжжнтю, і ення ко Зах ях ші зок З шо сек Ж юю хв Подкеввжх щу Ї рхюкюкюкукн се, Же ! : т З х Тож феофю с МОВАМ ! Во, св, в | У тк тва йо Хюжуккют кю ї Боб КН ВКРКЕКК : ще і ії ї ; . щ В - ої ; . : З ЛОЖЕ Як. к х ох ВОТЯ Ж ї ЕХ 5 г. Ж оУх, І м я що я ОО ше і. мот Б Щ їж Од я СЕ Ж - Жов я : ж Е ї ки, їж Х Б с : во Тк і. 78 шок Же ех ї Я З то ПОТ Же 1 ї х Ж / й І з т ! Е не 1 ПЕЛЕХ Мох їх ск. 0 Й ха : ск ї Мк бе хх В: ж АК ге ДЕ ко у ук сере по ее ї : сему ВК, "7 дев зх з ЕЕ ЗБЕ: ВН: ДВ дже ов : ПОКеКОО Не ДЕ ВК ще ще М ПЕН КОКО У КЖЕ ВО ї ик КЕ ЖЖ ШЕЛЖ. ЛЕО МОМ ЕД Її шишок ШИ ше кед ї ШИК КО ШКО Ше Е МОНЕ ОВ ОЖО УЖЕ ЛО ОЛЕОВЕ шо шк паля ; м До х. шо ск ково Кт ДКККАТУКАІ 1 а а о пою Ж ДК ВОВК: ВО УК 3 -к й п де ПОЛЯК ЛУК ОД ЖЕ ЛЖОШЕ ЛИ ЛЕ ТЕ кидку :
ї . . : : «т, сфе ї . оо Ан вки г ї поновив ІМК Її ПеМНН в оВ С ДЕК ! МКУ шк ї тка КЕ . дим ркюн пикот п м В Ко ох дощ їх ї дитя Ме як я АК ї їйЩе ТОК ТЛУВ ї есе : ї СКМ: ї Шепєкеєіюетн ї : о яд во ї Ж Дрєєєектеєюижютююю тю І В бод . ї хх пек. ї Я З ЕТ Жесв ї Я й : я дос Осо шк ке ї х ЖК, ще «ЖЕ ж Й ч Її - ех ши М хо | | .
її. ті я ее я МЛ ЖК се ск Ж. що сш З од щЕ ї вх і Око З в ще Ї воша ї І КС ї Жжни ко : хо І їх Ка хо с : а її Я бохо Ж з . / хх ШИК ї х «к / : ї : Щ : ххх. й ї жХККККККК, ш хе СоуХ КК ук « ї Ї хх ПЕПуфм екю ую куки х ня ї ї ее ПК ЖЕК СУКОВЖ до ке пунк Ж що Вокн ї М х же м омана ви у ДЕД ек Кк ук ху КК мя зве Мо ошЕяН Що свезле сов е МАВ МІХ Шо Її КВ ЕК З ЕЕ МКК ВОК ЕВ ї ЮШКА ТОК ї ста зх інш Й Му вам я СКУ Х МАКИ КК ї - Гезулч КОМУН КВК ХЕ і ХЕ Ух. МКК Кс пі Ж С їх ВЕХКУТВЕ КОВО ТАК КВК Фіг 28 - " «вк ши Кок З МломодіжнІ З Її ЕЕ песжееюееюютєтєтх Таж Ку «КоЖООВ ї р Ч БО ї ЧИН В ще. ря тех ї жд Тек Ай я ; ГЕККЕК г ся ї ЗУ ї хи Яке мн Меси ї с шо Пі КЕ Но : хі Я З їй ї ХВ Б гщо не я т МЕ сок ї 4 Я роя ШО Щ с НК зак: РЕ свв шк їн о ОВ В свв оф фо ц т 0 тк хе ЕЙ Ж їж дае х - . ЖЖ хх ялини Я. че 5, -і мае о Ж З ЗКЖижефх ж ШЕ ж її екю ї ШІ ту х МЕ ні ї ї лак ом ов : ще ххх БИЙ вх о » Ши Я То ї посох ото ї том 7 ЕЕ ююююю То Кн со у «м от хе Уе п ПИ и й пе ШОЕ ЕК ПОНВК ТКоВ Її З То юю о - ку Ов: 5 ДЕД Ше сш о ско ще зх дя пон МО : ПЕКИ ШЖЕЩИ Ж Е ПЕД КК В ВЕЖ КИНЕ ПЕН Ще ї ЕК КОТ ЖК ПЕН ЗИСИИКИ пе с векж мем х МОТО СУК і . с сука МТВ і Ж кур ЕК : 5 СОКОМ УМО МКМ : КК МВВ МКМ МК Є ї ї
:
7. К дах ое поч кокс : ВЕЖА пстстотттттх Б теле До Е ї Ки ї І шх і : - жах їх вки вх Я : шо МКК: ЗВ фонах КВК ї СТУ Ж КК см ЕХ Дефо - ре ВХ З ї Ше ес м, Ме НВ ї сш з Я - ї ХХ пою, кВ пні ше ЧИ о і ; 7 ох ПИ ХХ г . ї ї ще мВ о ех їх У х ше : я х ФОМИ х х ї тд М ТЕХ «к Б : не Ї же ШЕ Ки чо ї НЕ с шк ЖЕ с що : НЯ зве - БЕ Ж, зЕ. Ся ее, Бач р ОО Б ТК, т 7 ВЕ туру. В БУ Е т я ї Же Ж од - о з їх т шк шкі ! : ся А МКК : ПА Ж, Тож ї ЛУ ве сао в Що шк у УК ж, ї Бе Й пов Дюк юю юн умер ем пвуюю хумих щеня ЗБК а ї пс нших не шок но ДЕЖИ КОКИЖЕ В ВЕЛО ІТАСНК ДЕК ВОМ : Бена тжннн : ие ЗК ШКВО З МЕ М ОК ї ДЕД ОК доще зх ит х ще вк ЖЕК ї ПН У ТІК ЕЛІІВ | Ще ї ОО І дики Ше х ОМВК ЗМУ КМ руно ПеИКУВ НК ВВ УВУ ОК і сх так ак Ім х х у КК І КО 5 Тконаново нан па ОНКО б КАНАВ ТВ
Фіг. 26
АГ. г
ШК пеки ЖОВ ВАК ї х Ех Клум ї ТШХ, по АК ї ї КОКОС: «3 КОЖ ХХ ї ов: ому ТК пика: 1 ПА ух КВК І Хо о а ії: «МУ Б щ ТШиєєиєт нює те у Фиииииююиєююни ний З 1 Б: В. ТК о З ке т хай я а А Хо их З З кс шле В Ж хо плід му шли ї КОЖ ї ПО БЕХ з І сш в чо З ШК о в Іі хо хо Х : че Ж ж Я . ї : «О теп й «хх я ї злий о пу ом Зб ї пла Й ї ке п ВО ках Не макс 3 х Б а я ПТК хо З х УК де жк. К. т п я ї сеї у Я. Я ее шої я щх. Е ПЕД у у КУМ УК КУ ККУ МКХ УК УМ МКК ПЕДА у ок КК КК КК УА КК Кук ї ПЕ ВЕ ШКО ДЕ де М Ж МОЖ МУЛЕ ЕЕ ПИ ЛЕМ ПНІ ЗМИВ МОЖЕ ВОМ МОЖ СИХ - ЖК ДМ ШКО пж ЖИМ ПК ЖИ ЖОШИМОМЕ ХО ЖЕ МО, ШТОШИО ЯК ПУХ йМООйТ МК ЛИКОЛИМ МУ ПИЛИ ПИ ЛОТ, : ДЛЬОИЩИ Є. ЩЕ ПЕЬОИЩе НО ДОК ОНКО КИК ЦК ЩЕООШЕ ПЕОЩЕ - й с хі х пк 1 ОККО ЗМК МАНІ ВЕИ Ж ХЕ МВМХ М М МК ЕМ ії ї ї х х СУМ хе. ОМВК. ї. З г фл ту : ГОМ І З кі Мем шк ї сах кої 3 пох ї ПЕЖО Її «ОХ ок. ї Я З БИ її МК вся еВ: х их отв, х. пух їх т ев ч и 3 КО ЗМ ї ВЕ не ї с КАК "о, ХУ УМХ ї В. ї АТ Б пої буму. ї ЖЖ сх : зх я ї ху Ж КА Ко : 3 ЗК ож З ку їх. шк «3 "ях. Ж х оте те Ху ОК шх 1 сх с дош. ЛИЖ С и 3 Ж - ї ВЕ щЕ МУ ещ тх М ЩЕ: Х ЩО 3 т з ї ха Же ї лев КУ
Ж В. Е Жов " З З що ша МИ Ї вееея Б. т Як пожщ ї ї ях дров ї ТЕ 5 ої А хх КК хх 3 З ДИ хро рр Я ВЕС о 3 ПЕОЛМОНЕ ЛО ЛМЖЕ Ху МО ПЕОВ О КОЖЕ ЛО ЖЖ ЛИЦеК ПОСЛИ КЛИМ ФКИЕ КК КЛКЕ ІНК КЕ ї ПЕОМ ЖУ ХО ОК ЖИ МК Ж ОКОМ КОЖ ЩО о ї ЛМИОЩИВ СПЕ ЯХДОМК бМОМИЬОСМ ЗОВ ОПУЬОЩИК ММК МЕ ОВ ОПО ї хиб МОЖЕ ЗЕ МО МЖК ЛИ Ж ОККО ОО . . . ї МО Ж Ж ЖЖ УЖ Ж ЗК УЖ ХХ ЖЖ Ж Ком по ск С одюх ї ХЕ ЕМАВНВ ВК КУ КВ ПКТ - ен з ПОЗЕВВКТ НВ Тек К СеКЕ
Фіг. 20
НГ. ЗК я ШЕ КК зе КОЖ МЕТІ ЗМК т. Хо ДУМУ УЖ, х ММК, ШЕ ху т х ТД жо те ї ЖК Зайка Мб х М Хо засос х іо же Мови: хі З же ик : ПК НК і ПК НО ї 8. ї ся ї «8 Ї ко х Оу їх . 1: АЖ Во ВВ хи ОВ док ож. бе УЖМКТИХ ї Мт З ооо . . веб МОЖ ї ТЯ -к, Її ї «З ОК о ї лих 5 Я ХК КК З Щек с жк в Ї ІД Ж ка : : я КК Ж а зх ї вх 3 Ж ; ї а х 3 А з ї з «3 х х БА : ІМ й . НЯ й Ох І в о ЕЗШУ Жах ж т ще Ко їх, їх я ЗШ у з щ- ї 5 Ку жо 3. ож х т Її жк З КОД Б К що І 5. жк я ЖЖ З х д х я З Її т « їх 2 жі хх хх ЕЕ З хх з от хх хо Ж ді ня : ТЖ ОХ Ж М о Зк пох З Б х хх, З Ж їх ИЙ ї Х. у Б х ї Же щ- 3 ко я А жу, х ПпОЖХ шої ха ШИ Ж ПО ЖЕ. 3 хх г Ж ох а ! я що ї їх Ех ї 3 с 3 КОБЕХ. А ПОВ К КК КУ К КУ Кдк Ку кхк ПКДЕК КК КК КК КК КК КК Кк КК Кк ХХ З Ух У х З х З х ЛЕРЖСУ 7 У Х х х х їх х с. с. хи пр инИ З ЕК Еш АЖОІ Ж й ЖЕ КОДИ ПОВИ жовт М йо, ко ОН Кр по КОД пок МК В І НК І ІВ І АК ІК КЕ ПЕТЕШИОЖ ВЕЖЕ МО ВІН МЖК ТЕ ВВ, ЕК ДИ, ПЛ ФІ ТИ МЛМ МЕ КЕ БМ МЛ Я ДКЛИММЕ ДЖЕМИ ЛИЖ СУХЛКИЮ ЛИЖ МЖ МЕКММО СВИТИ ШЕ СМ ЖИМ ЛОШОМЕ ЗЛИМ ДЖЕК ЛОТИ ПМК МИМО й . - я Ж КН сах: се жижкх дк ок т пакх ххх Кома Є рих Пе Во НВК ТК ЕК ХУКОН ВН я Мила ВКА ОО З В МОТО ТОК КЕ КО А ОО Ех 5 ї. ї "ек ККУ ККУ КУ КУ КН КУ ККУ КУ УК, КУ КОНКУ ККУ КУ КУ КУ уК КК Ку Кк я
ВЖИ еВ ЗМЕН ПЕНЯ ЗД ІК ТЕЩА ЕЕ ПУБ КК КК Ку КАК КК КК КК китюю с жк лики к я ш їх «З їх її хх шко Бе щи я Ат їх х - я Ж -х же х хе Б хек Ж Ж ооше ЗВ ІЗ Же Ж ЖЕ ш Ж ко Же Ж Жохлек З 8 МО ОС ЖЕ ЖЕ ЖЖ ще Ж - Що дБ МО с жо Х З Ж шо Ж ЩА ОЕМ що Ж ОО Мо шо х КЗ Ве ; щі що з шх сс ЩЕ Я ке : ПЛМІК СМ. я п ПИШИ ПТ т ПИШИ ит . ІІ ПЕ спи сек о ПЕК НН ше ШЕ ШМК ки нити сток ПИООИНИ п п ИН СНИ. ХМ ШИ. ПОЖЕЖ ШИ ОСП, ПИ ПІШИХ ПИ ПЕК, ЕЕ ї ПШОШЕЕ ке ш ТЕ ще ПИ: ежищк Топини ПИ ПИШЛИПИЦИИИИ спини, ще ПОИЦИИ: секти ПЕВ ПІШТИТИКШИЙ ДИКУ. ШЕ сийпю ЛИПИ ПИПШИИКИИИХ: МЖК. ПЕК под ПИШИ ШІ ФМ ШЕ Ди ПЕ ННКО ЗИМ ПЕШННК ДО НК НИ ВНС СЕК КЕ ЯМИ ЕШНК сек сш ШЕ УК ПМ се ЕН пло, НЕ пи0ОМНЖ ПИВ НН НА СЯ ПИВ ПШШ ШЕ ЕНН КЕ ХХ ПЕК ВАННІ ЕЕ ШОЕ ПИ З КЕ ШОЕ МО о КО си МАША ДАН ВК НЕ КУ | ТЕ 2 ВЕ АКНЕ НЕ НК КОЮ, І ЩЕ ПЕ ЛИН ПВ З ЯКЕ М ОО ШИНИ БОЙКО ЩЕ ІК ТІ ММК СПИШ ВИШНЕ С2ИШИ СПЩИМО ФС ОП ЛИКи ШИ ШИНИ СПИНИ ПИШЕ У ШЕ, ТЯМИ ПИШИ СПЕ ЩИТ НИ ШЕ М ДТ ТИХЕ СИШИМО СИ СПЕ ПЕ я ТЕХ ПИШЕ ПИЙ ПЕН ЛИНЕ ЕЕ БУ ТЕ ПИЩИК ОСПЕИС СИШДИ ШІ ще ТЕ ши Ж В ве В ЛИХО сддждш ШИ СПИИШЕ СПР СПИШ. ПИШЕ ПИШИ СЕХМИ СИМ ПИЛИ СИМ ПЕММИ СПИИХ:О СЕУ ОПО ЛО ОЛИЙ ТО сш Ем ШЕ Пе ЗНО МИС ШОН ВЕ ж ПОЖЕЖ Ж ще Ж тк ЩЕ ЗКНЕ
Фіг. 5 я ШОЕ ХЕ о В ооо КОХ вові ква в і ї т МП КЕКВ КК ї їх . х 7 ї ї . Мосс в кВ оодхки я ї їх , ки сю КК КВ ке км ; ки, ї б ши : о х ТеК, Х - 7 У х же Бек «к и Я х Я Я ПН куми: МЕ НЯ : Оз Очі 5. Ж х їх їх х ок Ж Мо сухо. ща ат, Е ШО и и ЖК Х ХИЖАКИ ИН Ох х З й Ку - ї 5 х ОХ осо 5 Е БО ще М ж Кя х жо Пе ШОЕ я 5 - Х ше ї х Ох ж х Х. Б Х я Б ї їж ї КУН ї 7 У «ЕЕ Б Ко ТЕ У т Я . х ОС х ОК Х Пк. ке р. - У, о прп нини В и и В х КУКИ топи ооо ши Б Б
ЩІК. КОКО АХ КК КК КК КУ КК мк ЖИ, ТІМЕтиИ шо я п. ШМД С МЕЖ. тя ще ША ЗО ше З БК СКК Ме Вих Вик КК ка ХК ЗК КАК ЕХ КК МІ
Фіг. 4А
СЕК : ВК КЗ ДІСККК КК КК КК КК КК КМ ж Жов ПЛ жк В х х Ех п ї ХЕ хе -к Х 7 - ї х Ку. Ж ся ПДК кока се З ХК ЖЖ. х ЖОВ з КК У ОКУ СКК КВ ї х ВВ ЩЕ х . жу 3 ОО ЦИ Жов су ск Ме ЖК І и ша : ОЕ ДО СКУ, Б і х х 3 т х т Б Е и и ння . сом жк 3 ш ж оо КВК М КК ОВК КЕ ВХ : х я х Сини КК НКТ ни х Ж - х М СоеЯ ша 0 Х хт Ж жо ЖК п МО шок ще ШИ ЩІ ск ЩЕ х ОХ й яЯ з Я їх Я х КЕ х ко Х Ку х МК с ЖК их ЕОМ КЕ х МЕ ї ок Ж з ; х . о К хх Х Зо кокккукк кВ ех: Дек ок фс се ВЕ спи сх хх х с КК ЖЕ од до ку Кк кв ЖИщИИКО ОЛИМИЕИХ, сх, ЩІ ЕК ТОВ ДЕО ЗЛНКК, ЖІ В У ОО я СТЖМЕ СМОЖУ ОЛЕ Жкшхщея Око екон квниккх кокх КрЕНЕНК ВЕН ЗВУКУ КОНЕВ ЕХ За ВЕК ЕВ ЛЕО ЖЕ си. ШИ НКООЖЕ мккхккікі МТ х х ДЕКО КК КК КК КК КК ЕК А КМ хх Б Хо у иЖУ ВК ку ї х що а с ВУ ВМ зви ї Ж ж Зх. х У : г ОО я Хе иим КОККВЖИ КИ кто око ик г Ех ОБОХ ї и КК У НВ СЕЗ о х х ПЕЖЕМКЕ ВЕ ж ї їх х ОВ х х Й ше ї ХХ х Ка хх Жов, сх ї пк КИ. ї з ж Ж ПИВ - ХК зе ок нн ї КОРЕЮ ОО Хе жк, ї й що ї х їх Я : Флииин щи с Ж ку У х КК Ух х ї ОКХ т БО ОКО ОХ ОВ ВЕ В х ї хе ОКУ ЖЕ ТИМИ МИ ИнЕ ї Х ш Ж ко ШОК ще х х ТК Х Ж пе ХЕ 3 "7 лих ЖЖ ї Б З жа х її Мао ї хо х х ШК В х я ХЕ х Я Ж х ж. «ке З ОХ, КУ хо а ЗНШНКУ ШЕОКК ОКО ПИЛ х Б-я х х х КЗ х Ж. Ж х 7 Ж х х. ЗБ 5 Ж я Е кох Во В око Вс сосок ВЕ т ДК Кука КК КК КК КК КК КК КК КК де Кн " З ННЯ ДЕ ЖЕО ж дк Ж ЗБ ле ОМ ОБО жо КСВ Жук ми ех кто как КВК, Брока сома ком: зику і 27 Те ЕТ Ї З З Кк їх зх х Як. т. їх лик ПОДИХ, я ї КІКшекХ ву ДУкмкмккк, ї ох ВШ ооо ї хи Ел ї ПУХ. ї хх ТММ г ї ПОБИВ ї ї ї З Ж: ї "х ті Її ще М і : Я С: : щ по Х ше МК х Уго Ж 5 х ЕЕ: ЕН: ї Жде г щи 4 х Ж В як ї х Ф 5 ї ше ж жд ї и х о «ЩЕ х а в ре МЕН ї ЗЕ ее шк ї ши Тк же їх ре Кох х ЗК Ж Е КО - х в Уе і: т 0 пою УУХХУХСМУМУЮТ УЮ КУ, ї «КМУ Ку К УКВ У ТУ ЗКр ур у у у ТУ у ТУЮ х п А і АНЯ ше Мф: Укоре Хушм фани пе пкт х «ЖУК ЩО ОИКЕ ОЖЩННО УК ШК ТЕ «ММ Ж ЗЕ ЖК ТЕХ ЗЕБО ЗМЖ
Фіг. 5 г.
ик ке о о щи КАК МЕ хи ДЕ деле ук ІОАН ЕХ ЗК ВЕН я ВЕК Кг ти хх хе пот Е Є Ма до їх и т : шо сх х Ще Мжех їх ШК Сх ї пої шо З : ще МЖК : ях х Е шк де ї Пп ЛИЦЕ, ПЕДВ ї я ША, З ї х ШЖОВ 5 х шиї ШЕ м З ї ех Я дже Її Ти МО, ет пити, СУ 0 Х ОО п В ОСИКИ, Б дк І по пото КУ дея М Же Сх ї Ще ОК 0-0 ШЕ 5 ДЕ.
ЖЕ Зорі Ж я шо В ї ХО Ж пк ЕХ ДЕ ит Ж З х КЕ пою ЖЖ : ї ШЕ ж ВК : ЩО 5 Мн ки сх М ре ук їх пе Ж ня же Ки не ї Я Е ИМЯ ХВ ЖЕ Де З ит х не Ми 5 ТК 5 КУ х ке х сЖХа ї пої У М -Х В Ї пе «З По х КЕ ї : є З х в «Кр дус ку ку ду у у ду ї КЮВЕТ КК х «ХК БУ ТЕЖ ООСНИЖЖХ МОЖ ЕЖЖИ ШИНКИ «ТЕКИ її ЖЖ: ОБУЖЬ МЕ ФО ОШЕНЯ
ЩЕ подані ЕК ВОК ВЕ Х ПИ. х ЖК, х ШИ х х
У. х Ко ; х хх КО Е х х ОС х х м от х Ел щи Ж КН х МИлклк ФК ОДИН. х ПЕ т КУ Ж КЕЙ Ох с х х М сей Ж Х Х КО ж, х ск х хх М ой Зккмио КК Х х ЖЖ ОХ щи стадо ММ х пост . МЕ ж х дк х пудиюо ЗХ МК В о Мкшки ох х КЕ М ЩЕ Син Же х КИТ ЖЕ КЗ КЗ я Хек В х Х ЖЖ ск пок х -Е ХООВИСЯ осн дн, Зно 3 СЕ ЗМО «й жи КК с ї ВО ВВ є й кн х А СОЯ ОО ПМЖ Оки х Вк М ШЕ М х ВЕ Е ше юн Х х КОКО ие х х ПК - х х ЕІ х ЕЕ КЗ х ВХ Б х ї Кя х хХ ж х х х дов Ж х по КУ Де Кер Кф дн ду ДЕ дк дк у х Ж х. х х У. ХЕ Ох х Ох х т 5 х «кити Же ЖИ ЖЕ ЖЕК ПЕЖО, ши. х ЖЖ Ж ОО ВЕУ ПЕ МЕЖ я х ХЕ х х х х х х х х Же ОК ВХ ка ВО х ВЕ КВ ЕЕ ВІ х кіш, х І х М х х х Х їх їх х Ти СКК и х ЗХ ШЕ ї х Е ї х х Е БУ х сек х Ж т. х Мих ЛЕ БУ х ЩІ ЩО ки х м ХЕ Ж Х У х З : Ж ШЕ х з З ЩЕ хх х. ших по ЩЕ пити, х ПЕК в о КО Б їх ПК М КУ Х с Ж ооженнккт ВЕК х х БК М Х шию М око х Ел ЦО од. х їх АХ коник си. Х Х ОКХ не х Хо УМОВ КК КК х х х Хх х х х ЖИ Ве с ї я ЖЕ еВ Еф Од о о КК Ку фр х х З х х З х х Х х х х У їх одлнти ШКО до, пф дити пе, «КВ, 3 ЩЕ Ж ОСА ВИХ ШУ МЕ ве х х Х х х Ух х х х їх ї Хо КК ІК де Її Каф ЕК ЖК ді ЖК жк стокиаує ту ї ЗИ о не КК х суку ки ии х ІЕЕ ВІ ХХ хетх х х ХК х ШИШТХ х ме х х ЕЕ х х МЖК х де ЩІ ТЕ. х ШИ Х я їЕ ї ДОХДЕТМУ КУ . З х ДЕ ОЖИНИ х х ех Х ; ХХ ЩЕ х х БУ д ПДККО КК, їх З ДК І: х под я еккккікмк кт х Вам АХ ожини х ТММ. М о Х хх ЦЕ І х Я ОО ин о х Ж МК Ен ку х х М о» М х седдити 1 КЕ п М х ПН ВАК ие нн х я ММ ЖК Ж Кн х х ОК ке КК Кто х - доки ПУХ ик А х те ДЖ их Ен. ЖК ХХ х ах ЗК ЩО Мини ММК х о. х АКТ ПММ Хх ех З х ШИХ ПАК х Х я х х Бо х «Ж ле х ї х У х з шк ОХ ї «ТЕ ок а с не и и и и 3 х У х х х ОО Ж х Х Ж х х хан ШЕ кожи п НЕ ЖЖ ДИЛИ х кю же Ки М МОЗ МОХ МНВК с . шк док ВМО УК КЕ ВКА КН ж їхох пЕрКМ НВ . ши вен МОМ тупо : к докт МОХ ХКТМОУКАИНА МУК г х зочокх пИВК ПЕКИ КИТ " ех сикїх СУВВИ ОМВК М ВИ ТЕ хх я ї Ж дО СЖНИСЖИЖ. ОТО ЖЕО ЛЕ ЖИ Од ЩЕ ДУХУ МУ ик Ж ХХ, по ШК. ШИ ШИК МО ЛИВО ЦИ ЛИШ ОМ. ОБ штани м и КАЗКА Її МОМ ХО ПЕЖО, ї ІК ЕКУКЕУУ КК УК УКУУМ У КМУ ПТ КК ККУ У КК КУ КК ЕК КК КУ УМ М 2-Х. ХХХ, чо. ОК по ЕОМ МОВО жах В джено ИН НН ТК спякакннк к кнк ХЕ КХХХ ХМК ХК КК КК КК КК КК ХК хх КК ММ те КК КК МИ КК КК КК КК Кох ТЕШММОВ ЕХ ШОЕ МИТЬ. ук шо шої що ОО От тк тепеу ФІ Уш с. шої мо шо МІ м сх шо Мох ПюЛ ХИЖАК Ся ТАТ ба МОЮ хо жЖІЩІ М ОО пь я ПО ИДея ди шо: - шо пом МЕТИ щокою піни МЕЖМЕТЕК Ж МПК ЖИТЬ їх ШО мо ОБО Ж ІШОВ МОЖЕ МЕМ НЯ дІЕ М Зх МОХ ОО БофМІЛІ МО т От Мої ОжЕ КТК КДЖ х з Те МО ІМІОЯ : ї ММА ЩХ Тк : ХО Ж дЖІШІІ М т Ої ж Ох ЖЕ вики КМ юю ща ПпоЕИМ, дже хо до ІІТ лю мох ко Ж ро МДУ МИ ЕТХ ПК ЩИТ З Ом 372 ло ЩО ФІШОК «М осли пом т. ми ше пжк ше ща о І жк що мо ди пи: МЕПКИНИ ЖЖ Я ЖЕ. - МО ВЕ шОФЖІ І Ж 5 КОЖ зику ак штют МЖК, сх ШО же тощо Ж Ж ФК ОМ Ж жо о: ПЕК. ХИОКІ ММЖ КИ ИШ ЛИКлХ. З МО ДЕ У ЖЕ ЩЕ ОЛю АПК ї СУ ї ПЕ дитини ни пит Бе що уко шо Ж МО ШЕУ мо оч ск, пЕСТЕКНКН ЖК се СК їж її мої Ол М о тІши її х ОЩЕ пит нини Ж при -К. шо дело до 4 ОО де ЛІ ДО жо ОО пи КЕНЕ КЕНЕ МО п. їх ОО ОБО Б сот КОХ ху ШЕ МЕН КИ шо Зх, За шОжь їо що її: що ІІ ХО дО Ох ЗЕ ПЕЖХ ВИШНЯМИ М ЖІ ТЕЛ Їх шо МОЖ шо лк ОХ ООМоО ХМ ПК ІНШЕ Кан п Кк ОО шко ш2 0: сш ЛОЛОСКО шо ЩО ОК ПЕШММ АНІ ЖІ МЕТУ ВСЯ де ОБ ж ЕІ У БУ кн К уки ин колу ям. с ШК ооо ож хо МО жом Ох ик ЕЕУКАЕ ЩЕ ТЛ В ПІШОВ Б що ОТО ол ШМК НК КХ Бон рено -х мож її ща щЕОООЩО й що МОЖ пу МММ ОВК ОЖЕ ТЕ Тк іл МОЖ МО Оу я жк МИ НК Х яли: ПК, пе іщт г її мож М в ЖОЖ ОО Ж ТЕЛ НЕК. МЕШМКАЖИ НІХ ЕЕ Зх ТЕ І ОшО ОМ Б ОО оту ТЕ мкм опи Ме ек ДИИЩЕ -ї Іо ую ох ох алу ДЮ ШЕ щкщх ТЕ МИЦИК КК, п МИ їн ІДОЛ Ж Олю МОЇ тот І ЛЕ МИШКИ Е шт Ххе Іф ОдУ ТД КО що ща Ж ЕКО ЯКЕ ре МА соте КЕ мим им Км кін я ТАТ жо ШЕ шк пед кош ЖЕ осмлнко ЕК МК ДК ПОВ оо Іл У пад ЩЕ шої Оу х МОЖЕ ЖЖ ЖИМ КО ЖВИК А ЖЕ ЕКО ТЕЖ ТШЕ ЛО ЖЖ пОУЖУХ Ж Оп ТхОха Ж т ОО ДЛТЕ ше я КО Ох жити ИН ду КИЖк ппй коЕть хк до що тю о шодо док пи ЖЕК ОЇ «мм МЕНЕ ШК хх ФК, -е ПІ ЩІ ОО Ое ОО жо ТО Х МТМ ЖЕ В 1 КТ ба ІЕМ ЛШ ЖЖ ЩОО07Я ще Ж ТОВ ох ЕЕ ши со о до ше скожи ЗЖЖ Таж хе Ла шо же жде дж що бкоще Ж 5 ХЕ люд Ес В ЩЕ МКК, : ст: БО ЩО що МО: ЩЕ ПИШИ МАК ЖИМ М ХЕ Пт. ТЕ ТМЕ ОД ІМ УЖ що ОМ Олх БУ т хо ди ПИ икіюкя ни що нн ; ; МИДІКККннни зи нив ВВ С ЩКщ жо виші вВошж Бош моя Ж Ж ще МЕДОМ ЖЕК ЛЕ М ЖЕ ШЕ МОСТОМ Ех ОО їх Ж і; шлю ян пи КК В ВЖИ КН до ТЕЖ г що шо моє що ко ОО ШТ ЖЕ МІШЕНІ її КУ хх ТІВ шоОшо що к ї х УООШЖШ ОСЖУХ МЕНА АТ КАХ ШОЕ, ах ВЕЖІ М МОЖ БО Ох хОО ЕІ щІЕ пипкики со зи с, : ЩО: . . с с шоюющи - ши КЕ о ух ск. пи я туї жо шо до о жо жо що ЖЕО Ж МЕБЕЛИ МЕ ЕЕ то ШКТ хх ІТКІІ ЛВ ОО що ОО ж Ті: ХЕ МЕКЖЕ НИВИ ЖоОт ПЕКТИ, ЗЕ ІЩОшЕ МО ЖЖ ШО ОО Ох ВК комер нвік ще сютю ду кпк - и ОО Ж шок «їх г ск ЗЕ ЩІ ЖИТО МЕ щі що от МОЇ їоІБ ЖІ 0 ийинкию Жид до кі поеу. - Р.В хг - тощо щу ВЕНИ Де п Я до та: СМ шо о жо о ще ек пут мим М ШИК, ТЕ ПНО ВЛ ВЖК ЩО ж що ЖЖ ЖЕ що с р її с г ве ЖІУЄ по КМ шим пуд пк хх тах жа о о ймо й що ою щ ЖІ дж ЗК в Ж СЯ ТЕ ух па ВО що З шт ОО т ОЖжоІмІ МЕЖА МЕМ ВО ШЛЕ Кая ЩЕ ІЩЕ Я ЩЕ ЖЖО ЩО Ж шк Ж ОО ЕЕ ОЛИВ І нин ИЙ ши ВЕЖ МЕ КЕ хх Ки хх ІЖЖЛі ЖЖ ще ОО 5 то ж т м тт: Ж ВЕДЕ КК ЕЖоХ ЖЕ ТЕ сша М хо ху ЕІ МКК КИ Ох ЕКО Ту ІЖЕЛії: Ж От х о щі У Ж МІ ОЖЖЕ МЕТ ЕК х КЕ с ІЕМШІ СЮ ОСЖУ Ж ОО ЩО хОї І ОХ иижеюннь 0 пепилин : ситі ХО ВШИТИ пер НИЙ по ШМК ди КЕКВ КК ЖЕ ШЕ т ТЕФІ СЕ Ж що щОг ші Ж ІІ ОО пк МЕККА Ж ШЖОХ ТЕ І ІІ МО МОЖ ші М ТІК Ух ЩЕ Же ВЕК НК пк щщ ТШЕЕ ШЕ що Ж БЖ ж ОО ІІ КО: в ТЕКИ ВЕ й ШОШХ а ІЩЕ ЗО ОЖЖ ЖІ І С Х ЕКІ У з ке пот УЖЕ ме КУ А пики ИН ЩЕ под ЕК п ої ЩО ОШО ЗІ шо жшо жо фу ЩО под ше КИ ЕК В КО ще ПК . ІІ 3 ЩО МЖ ОЗ ж ЖЖ ЖІ ОЗ щ МЕМ ММ ПМ ЕЕ - ШО Ж ож Ж Ір З хо шЖЖІ У х Б ве и кЕ ТЕЖ, т ої шо сш У жо Ж шщі : СД ЖЕК ЕОЕ ЖИМ ІТ С - Б 0 Б БІ М ТІК Ж що пфижее ок ох подо Я - Та ох возі шк о Ж Іі ж ої хащі МЕНЕ ЖЕ ДЕ ТК ПІ МО МО БІ М МІХ ХХ кн ЩЕ Я КУ - ПЕЖО Її Мо Ощ ЗЩщІ ЕЕ ОС ІК ОО: Що, МКК ЛИККАИ ЖИТ? 2. МСЕ т пМООМО МО УЖ ж ЗМІ Ж ОО сЖ т І те СЖУХ
Фо. ММК ПМД КК кш ХХ. ТИЖ Ух с що шо ЗОВ шко же с ШІ : Б МЕЖ МЕ ВА В т ЕК - Іа ОО БІК М ІМ МЕ нн . н ШОЇ що А шо МО с пи КК ЕХ Х, Б КЕ ТЕ тІЖИ Ж її ж ЩЕ тт М Її З їх І АК МЕ ВХ ЖАХ їж ТЕ ІШОВ ОО ОЗЖ шт ТВЕ Ж то М ЖЕ пи КИ КМ с МЕ к. Я Уч УКХ що 200 Її: хх ЕЛЕ МК В ЕЕ в ЕК дж ІЖЖ Ох Ж ОБО ОХ х їх ї реа ЖІ ВЕ С СЛНХ. ПО ЖТЕТЕ ЩЕ пМЖОЕ їх ХО. ТЛ З х т У те ТМЖХ диво сля с що " Еш Ж с МК Моя : , пи ММК НИ КТ, МЕ КО, ІЖЖЖ ЛУ ї Ж ОТ Ва Ж т: З ї: ї КЕ МЕ ЩО ТВ Тк ПОМ ВІВ Ж КО ОО см суки КК суху СЕМИ ХХ ОК ММ хх Ку М сука КМ ідлюти Жак З МИХ КИ: Ву МЕНЕ КИ 7 с. МУМЛУХМ х ві пк дою Ж ПМК КК МК с ке и НК шк свт ля що : ї-х СУЖККУЮМТХ СЕ де ж Же а ЛК ЩЕ дя 0 ди ех кА нУх полки ща ШО ЖЕЛЕ. ЩО ЛЕ еко па дик, «СУМУ ЇХ: іа пу ВК жо «ПУТ кре тюк ШЕ : УМХ ОМЖИМУХ сюбжюєєт якіх сок оКк Кук КК ук Кк Ки ту "ЖК. Кок Кук КК Ек : К пани ня нн ХХХ УК км х Ж Ж їх Кая Я ня не : ххАххкКкн ЕТ Я СХ укхонкк ки кі яки: І кожен пемхевас оку днк дор і ке ко чек ЯМ СІМ: ЖМЛЕЖХ МУУУХУКУУХУ Тїх Хо о ХХ п НН х т ТЕ фо ДЕ 0 Мер З МЕ по М шо Вот : " пом Ух, Ж СЕ ОО АК БЕ. ВЕ. ж ЗК М ще . кн ОБОВ 3 ХО юоюсюююях ШІ ЖЕО БО БМ ОВ хо жо ща Ї лю пов ко ШИЛО Дт с жо що са ї: КЕ хе Хекеровртртєккскню ну ПЕК СІ ЖК Ії М 5 ЩО ш В що що пок КИЕТКІ МОВ МО ІМ В Ор ТО шко шо во Ох МЕ ЗИМИ ЖИПИО ЖИТ Ми склу, м. Ай сід ж Мі моз ї я М М хх Кен ІК. І ТІ ШУ о ЗЕ3І ЗК 152 с ї пише «ке ие пут ФЖЕ те ЕІМІ МО МОРЮ МЕ ЕЕ до око ї ЕК ТШХ сок з ШІ їх М Ж ІТ Щ т тах шо ТАКИМ у дик, : по х Ж ІІ ; й пикю г Ж ДММТИ ЛЮ ОО Во ше ЯК м Я пив КВ МО і жи. їшІ ШКО «ку СТ до х мо У ї. С КЕ ММА ЖЖ ; пит їх ше МІ: ж м ох ї шо пиши 7 их м ІІ й БІТ: ХК ЗОН кох ПЕК КЕНЕ КУ, КУ Я ех Й «Ж МОЖ ОЇ ШОК кути МО ї ПУХУ МИХ МИНЕ УКХ п А ха їх Ж охо МІЗІ ЩІК М 7 пики пишну сл тов я яко ВО ОЗ КУ око Жов 0ОшЖ КОЖ КМ КИ ше З, ТЕ кое ОО ІІ От ї. я Ще пошу ан КЕ я Желе с: МОЖ ОІщЩІлЕ - : зе пен ВЕК КК, ПЛ їх КОЛ 7 ши їде що їж т ПМЖ: МЕТ, ЖЖТИИКя г. СИ. я т й У ЩІ щ їх х У но 7 сивих п ЕК. ОО х МООдк їі ще ш Я МЛ но ет т ооо Іі шк мо Ко у Ох «МК ЖЕК ЖЖМТЕТ ще пив з й а ОО ІЩВі шк ж ї т. т денно хщж ЕЕ ях Їж ЕЕ ш Б М БІК: со шощої Б ВДЕ КК -х ня ж шої хх Ж РЕ я т Ж Ж: т що пили ЕЛЕ ЖХТТХ. ТХХ. шї ТУ ї ЖК ЛЕ ПОКИ т . щ : ДИ ШЦПОМЕ КИ лим АОКИЛ ЕЕ ще т. УК шЕЕ «2 ч- жо т. ЕК ПМЖ ВИМ ХИТ Й с Це о ЕЦю Її - шо ЗО х її х ї МИХ ія що з ще Кк То х що мо ле КОТХ о зх МЕТА КА З шк Фі ЖЕ В в ЖЕ ЩМІЖІ В Її У Ж х - Си пон пе МИ. КЗ ші ж мо до Ж . : ит ЕЕ НК ве У ша ШО ОЛь У Пи тх жо т ТЕ ПЕИТ ЛВ КК М сити р ШЕ ї що БО х ї Би т я кий хх У ЖЕ ЕІ ЛЕ жо що ТК ОПО К В 8 ах сих сиве Ж їх ЕЕ ЛІВО КЕ дещо «ЕЕ ПЕТ ЕМВ нт но К ПИШНИХ Я -- ОМС ШОМУ З; х х т. ие ПЕКИ о ВИН да ЕК. ХЕ Ж 8 її Б й ЩЕ ІМ: в ад ша МКК Ки Ким - як шої 7 хо ше ШЕУ Ж оф т ФМ МИШЖ ЛИ ЖИТ с Ки, ЖЕ що МО ще ШЕ З Оз т Й я п УЛ, ІШИТЕ. в шо йо во щ Ж Ооду ЛІ с што о ЕЕ «Ж х ПИКЕ - к. Ж тя Зх що с ЕІ Ск шо Ш за ЖК ЕЕ КА ЖЕ т 7 сиди а йох З 5 В ІІ хх ЕЕ: ТІКИОКХ ї хо В. ЇХ її й ої в'я В В ШО ія щи ЕЕ вх ШЛЕ ие Е. У п Ох Жде о жеоодюоде ї. ЖЕ БКДИИ КИМ ее хе як, ВОж х с. тою ЩО Ку хх п Шо ММЖЕЖИМЕКМХ Не Ж, ТхЕ ие ОО о ІК Оз з й 7 жен кЕ йЖх ЖЕ Ж ОА ОВБож В ОщАК мшощо 4 що ВИТ В хх о -. шо СМО " а їж ІІ ЖЖ їх Б МЕТО щи ПЕН З шо Бо Бош Б ІІ ХУ т р сук ик в М й - ЖОВ У ОЕ ш ші ж ж жо «ЖЕ ПЕШЛЮКЖКЯ Я ХЕ тт о що ше ЕК ЖЖ ох ТКА МОЯ ж ке ка Б Б 5 БЕ МБ ІК . ке пік ие т. ЯК шо ОО Ох ж щої МК ЕЕ КЕ мен о ї а В і: ха х Ти с ще ЖИТЬ У шщ їх во В шої на Кк МЕПИВИМ шик шк Ай ск ОМ Жю се Е юю ко ОО ЗИ ТИКИ ВАМЛЕХКИХ . ск З ї о шо ВІК ХУ її пики Ох ЛЕ ХАЖТВ ЩО що ОО АЖ Ж жо Ох КІ МОУ пек Ж. з ОО ї що БЕН ХО . до совейх ХЕ Ілю ОБО т МОЇ ПЛОСКИМ г .. с МЕ оку ни ЖЕ ? ЖЕО З КЛІ ш К о шоодоої Ех КЕ К ЖЕ пкощ, ЖК пед - во й БЕ КВІТ ОХ ОЗ ко КІ пу сижею М ТІ ЖЖ. ХК ш Бої Б. Еш м ОТАК ПВХ хек хе ? шо М пак ПДМ ВЕК Й ММ, ж ТАЖЕК У шк Ук "ИН ЕЕ СИЖУЖХ шко ти ТИ ит Ух МЕЖ Ж ТІШИТИ М Шорти УТОМИ пики ж : КК МІК ЩІ ж ю ї Кк п МЕ Ві КІ Ох ще - Ж ОО З Ві; Тео у Щхд. сли, х маш а щі ВІ Ж ої . Пежо Ж : ш о А БІВ ОК: ше Ех ЕКЕКИЕ дек их ШОВ МРОлих ху ж що ї шої лю сю щої КЕ. МК, я ЕКО, ї її В ш БІ МІ - шк т при жи та ДТ в шої В ях І: Тео ше ЩЕ ПОТ К ВК хол ких МОМ х 7 рі щі ж о ово Ж ПЕДА ЖИ М сшиж ї: ЩЕ щі хіт ї : " й сх щот ТЕ Кк хвоя я ВІК й ках Ор К ВИДИ ТК ЩІ би - Ж ОБО ше МТМИУтя ек ол, ОЇ ПЕТ ЕМІЛЯТЕТИ КЕ, їх в з ОЕМ ж - . А ВЛКЛЕЕ ТЯ суті ЖИ хо ТЕТ 3. 5, во БОС ШО В шо де. Кук КВК ше ШЕУ М . АТО МОЗ Ім що жо о У ЖЕ МЕШЕТИИ Ж см Та КЕ - ІІ ЩО 2. ПИТИ пижж Де що іі їі що и ; ОД ХХ ве ІЩЕ МОЖ: що ої НЕ КИЕВ З КАША 7 чо Тит ОМ ї. Петі ою оо І МЕТ УМЕМКСКХ но си їх ЕЕ м жі фІш мох хз т я з ут що ЩО Ж ПІ 1 М ші 7 дод ДР рю ЩЕ ЖИВ ТІ 3 ож ше що ско до: Ж МАШІ Те о суч КОТОМ ши ою я г ОО т: КЕ ТЕТУ УВК, дик, те Я З ші ЩО хз п те пили ти Я ЖЕ К ПІІ її ВО тел ков: дих По КОТ же ні. МЖК ОККО Мо с НН НН НН ї Ж МЕШЕ ТЛО МКМ ЛИ пн, Тх КВК що Ж ШшліЕомоОх т їх з ТМЖВ ЕХ п срклх Еш і Тк З ЩО шо ї . їх ІІ КІВ ХИЖИХ я ВшЖОМО Ох от ТА ОО оо ЕХ ІЕЕ КВК ЖК М пи, їж ХКОя ЩЕ ші: М Її хі їх си КК ЕК ЕХ Я Б Й ПВ ОЗ В БІВ: ом воду до Ко ВТ КК Же дж г ІХТІ ОМ 7 ОФІС ОМ жо УЖЕ ТЕЖ МИХ Юм й шк МЖК й їх ох с ВО Іо З мм. См ий ЩЕ МИХ ЛО МО Ех КО шоу ЩЕ ес ВККК А п З МІ ЕХ ЕЕ жо Ох Б МЕККА шк, - Ж ї шо МЕМ МИ З Ба ек, їж: 2 4. о жо їх щої ке нн ши А Ко ІТКШ ОТ ї КО Е АТ ОТ : я ше: ЯМОК, ПЕК Я ФИЖОТЕ их ІМ ОМ г по ТЕТ о хол о Е М ВХ ВКМ ще я Ж по ож що ЕК: ОТ сих, МЕТУ ЕВ В МА йо п ОО х що от ох Ж ої ЖК ЕК кис - й х щІшош Б О Ж Хі їх я Ти шоп ЩЕ Ж ЖІ ОЇ МО ІІ О А дк ЛКК КИ ДЖЕ ї -е ШШКОК ЖЖ її шо дю мо ї- Ж МЕЕИМРІВИИ ВХ КИМ - дит. Тх, КЕ ж В ІЩІ й ої ОО: Є й ПОВНО щої Б. їж гг Її о щІ ТК доня Фо Ж: Я ІЕЕ Ії т хх ТЕО х. КО Ди доих дх дош г ЗИ ПЛІВИ ї кам тах А ш В ше ото : ї Шо і лук тю, ОЖТЛЕ МИТ " ВІ їх В КО У «БЕ ІК КЕ КВ ВХ ЖЕ - ОМ вів ІВ м МЕ ТЕКИ ЖК ее ЕМ, ї ЕЕ, що що м ОЇ т ї р о и ПТ х зво ПЕ дж Мо м 7 їх її жо щ ї. кю МЕККА ХМК их шо М, ХК ПО . щ м ЩІК пт т й й се т си коми Ж т пилЕ ЛЮБИТИ ї ІІ хо ї Ощ оо: же ЕДЕМ КК ПЛЕСТИ, м Ук ШЕ Ох 7 й ще і шк що М ТМ ТММ КМТ тя - пев. З я ші а ої що МОЇМ МЕ 7 с щх ПюСЕИМХ ВИВИХ ЦП лоХтя ТЕО їх т ї ші оо х : ся и Ки К и М ЩО ОЇ ші Ж сво жо Бея ПЕКИ КОХ пепицие - КИ хо ще ще Іф ще ї 5 хх їх: енд що кю ПК САДИ за БІ Її Я Б 3 Вод: КК МЕРЕ й ших Ук ІЕМ ШО Ів ші Ку Бої Мих СИХ . свої те Ж - ЕХ ах ої Мо ом З ї не - КУ с що я ТК, ; ЗІ Х х : : я ся КЕ ккнр ик КЕ, ТІК те тах ЛІТ ОЩХ ОХ з СЯ шок шкоди 1 ПЕЛКХ МЕШКО Я т ІМ Я Ж щі щі ж шоу ? Елла шк жк ев в Ж ів В Їй ко: я ІДЕ КІ КЕ ТІ ї ІЛЕ КО Ех х и ЧЕК ЕЖОлюОООЩх пе чи МЕЕШТМКИНММК У ХХ - ях Уж ЕМ що ол ща їй м ШІ ко Те Я ит сік «ит: ЖК ян їжі о жйюх МО Одю тю їі М х ї де : ХО: шин вн МЕ ЛМя щ ща м її а и Не ЖЕ ІЕЕ КК ВЖЕ Я укде Зк ЕОМ Еш МІВ ВІВ м ЮК 7 ТИМКО сім м ко ІК Ух пої В ет ІЧ ХО т. про. ЖЕ КЕКВ В. ТИ пд М КО Ж що: БУ ПЕЖО КК НА сш І: . її БІБ МІК: п 7 ЖЕКи ту дики, їщї пі щої во шо ОЇ: ЗЕ ке пк, хх ДЛЕТЕ ях пл От ї В ПЕОООТ її ї х в КТ МЕМ КК Же ТЛ МЕ ЕІ ЛИ 1.0 Е г Кая є Зх ЕД ХЕ ДЕ я - Ех, в івІі ІВ ж о МЕЕЖЕ МОЖНО МЕ ЖИТ 7 ох пи, - Ж ду що щі я шт, ож ки ж МК. ши й кох Том шої ОЗ ОО НЯ : у лк - У ї з й Місії М КРИК КАХ сш кт МИ ав 5 В Б Бк 175 й да ОККО МЖЯ Ме МОМ Мою її щу гм хм ї У МЕХІКО ї док - ПМ Ох з ш ів щі ж 5 З т. Ти, садок пох до Ох пат її Во Ох ЗІ ХЕ щодо, Яд пе КК КК Ж ТЖХ МІ ОМ ОКО хх щі щі хх ї ОХ МЕЖІ ТЕ ж . ЕЕ ї В Еш ІІ ЩІК ТТН ери, ЖК ПУТ. ТО кох ом МУ ХОЛ Ежен. «ПМ МКУ ДОЩ З хх Мих ли ІЕЕ ТЕЛЕ К п я о ПДК ТВЕЕЕМУК УК й пише же В МЕЖ МН МЕ я ТЕТ КАК сх й з ТЕ. селен че су ЩЕ х соми ІЧ ши йев тане МКМ СЯ "Бо ч. я ши г. КЕ ОО Бонн Ж Б КА о НК Б ОВ ОХ СОН УКХ, У Ж че ОО Ж С ОО Б ВО ЧО о беж я Ж "ПО й з НН й» Я 5. з В о. я п. я ь» її ї . . а С ш-О НМ . Зх. х ЩЕ » ж я они Є К 5 ЗМ ЖЕ о я ів | КК, Ка ОК Я Б п с в. Б з З к - її й ж З са Я Ж п ЦО ОК ХО; Зак. 5 я з ШЕ й ше З З к- ОМ . що 5 МО 7 КК "Як ЗВ о нн Й Х й КУ Ку ОН С В, З М кове ЩЕ КК НВ Я З ОМ « і. хх ЩОБ ОК Ж. з щи го: 5 і ші я Б ші. Сея Я За З : Б У - о " ЗК ТК х Ж ХНН ЗЕ Кей я х КК ж ХЕ т Я о ЕТО Ж ооо їх кн і З ан
Фіг. З яке ї ДТ ТТ У тт ут кут Я ї - х, т УМ Фкоски КМ ю сю, сшж жжежжню гне тж о тж я і дики ЗМ ВО ноекн та но МЕ Я ре» дивак: МУКУ нику ло така - БУ У хін ШОЕ ОН. ооо во ЕХ м щк З я ОК ВВ КК : Мох ж й ЩО у т ко Б я аа і. о У ке З яко Б Ї Бе М ЗУ СМ ї кохання с сх шЕ КУ То МКК З ях ї Ж тя З хе х ЗМ що че с 5 А й І: хх ХЕ УЖ х я Я 5 су о в й їй то а
Фіг. 10
ОКОМ КК о УК МКК КК Кок Кк ї х їх ск м пак як Ех ПЛ ж Х. пет у І ПШ с ни и пн Ж шо ВТК - хе їЕ Жде ше КК по В КВН ОХ сек лкя х Дн ВК се МНК М КВК ТВО ВК ОВ КН ВД ї ! т Е ЕХ п У не МК і КХ, ЖЖ ке ВИ «КІ Х ЩІ ЖК Хе Ж МК Ж КЕНЕ М до хх х Ж Її КОЖ МЕТ НН ВК ВЕК кн п й ї ї їе м УМО ВОМ З ОКХ МКК еоК ЧНО ї Ж ш жо ден КМ, ТЕ Же оо УКВ ПАК - : я : ди КК ВИК ВК и Ім ЕЕ М ч ск Х ї скккквния МЕ В Ж ЕХ КЕ МК ХТО ТК З Ж з. но НН НН НН . ; Ж : Дос ВІК ТЕ ВИ и Б по ЕВ ЖЕ дк й БУ їх : коня МО и В М М и У ун аних ЖЕ ж ЗХ джек КА УЮ ок жі М КУ т Кох я Ж в ї КС, ; В о НЕ о з НН їх ХЕ о КК . З Х ех о В МК КК - - Х її о мк : Же КУ же с Ж М М аю п ситно З І Бу БУ УК ко м и КЕ с, с : ї -е М, м ки ЖК ВК ик КУ хх ем. Мом МО СЕЕ ОВК - їх Спок КО хх щу Х ск Ух КОЛ Мк М ХХ їх ЖЖ Кох кож, я х У хххххм ХК кох. Ж. чх х х сх ХоххккаиХ МАМУ ХМ моих її х сх с У ж ВЕ ж Я ж М Мо - х ЖЕ ех Б; ЖЕ Ех Кох шк їх х щк З пок, х т х ЖХ Ох СХ я Шо ХХ. хх хх З дк: в ЖЕ їх Ж й КУ х с хх ХЕ шк ще З МУ х Е Е ск х де х Ко г. їх ж І о ї ОД КОКО Ко КК КК КЕ КК ХК КК КК КК КК кох ск с дод жд шк ще шк «ех ш У В ж Ж СХ Б я дж х дк Ки їх іх нео х ЗК
Фіг. 11 я : шо ї Ї «ММЗ М МИ КН ї З т - ї Е ДУМКИ Я ї ЖЕ МЕ Ж 1 Ще її ї Ж МЕ її ЖЕ 1 Шо: їх ї ЕЕ ЕЕ ЖЕО її щ--е- : сита ЇХ ї М У МЕ ОК 1 З МАН її ї КК КА М ЕХ 13 хх рус ТЕ ЕК, Ж МЕ. ШКО, її КУ КУ пости ПО ПЕ ХЕ ЗКУ ШОЕ т: її МІСТ КХ ї В х 5 МАХ Ма ЩЕ т: ОО ЕХ Е хх З ЩЕ ТЕ 11 її М ск ї ща БЖ МЖК і КО ДУМА ТЕ Ж шої Х МК КЕ ОБЕ 1: ОО їх Ех хх У ЖИ ШХ її 5 МИХ ЖЕ ї КУ М ЖЖ ЩО 1: хх ЩО М? ТЕ ї БУ МА МЕ ТЕ 11 її ге її х Бо МОХ Ми КО її ЕН ДЖ дн его т ї хх МЕ МОЖЕ хї 0 ОХ КАК х ще ї КУ щХ МЕ КЕ 1: ХОБІ ту ФЕМ ДУ ОК КЕ їх: М уж я хи Ж х М ОКУ ЖЕО їх: 5 МОЖНО т ї ЖЕ ЩО ОКА 1: 1 ІАЕ НИК її ї ХЕ ЩІ ОХ т. 5 же т що ї ЩЕ МА з 2 ХЕ Дефо ЕЕ їх х М ШЕУ Ж КЕ ІЗ ХЕ КК ІОНИ ох цу Е У щ-Х Мт ОКХ її Зх х їх КХ ще Ма Ох І: 11 Ї х ЖЕ ОКУ МЕ ОКА їх 11 ї ї Я КЕ ЩО х її 31 ї т х КО хи Ох її ї со М я. МОЖ їх се - НН: мли ХХ ІЕЕ КОЛИ їх х т ї - х ЕК ж ЖАХ т: у ї ї ХЕ ЗО ВО. 1 5 3 ї ї - ВИК Ж їх їх їх ї М Що АХ КЕ ТЕ її хх х ї М ї- ЕХ СУ ХО її хх ї ї - М МЕ ОК її: їх ї ї МА ск Ме КЕ хо їх х Е І Ж БАК КОЖ ї о х ї х МИ ВХ МЕ - КУ її х ї У жа ЩА МОЖ ОКХ Зх х ї х ЖОВ МІ ОТАК ЖЕ У їх х ел З ХЕ хх КУЖОХ МЛК ОО хх х ї Ха МК ОМ МОЖЕ ЩО ЗХ ї ї ХХ Ма НМ МОХ жа КХ їх ї : Б Ка шо ЖОВ З. ка ТЕ вх ї ї ХВ. МОВ пек КК п Ж очно Шу Сх ї в НН ЗИ СВБ ВУ се Я У ЕОНсви же Ж 0 МОХ ха ВО М С В ВВ С СОВИ ВУС я ї х ї х ї х 1 ї ї ї ї ї х 5 ї г. ї пох їх НА х. що . 1 тик. сг. х х Фо : пк ї хпрцец, х ищо ох, х пед : ши ЩО ї ї ее З МЕ ї МОЖЕ ї ШЛЕ ї ДУХ : ЯКЕ х ї З ї ї В : ї 5 ї ї ї ї : х х Її х ї ї ї х ї ї ї х ї ї ї ї ї і ї х ї їх
Фіг. 12А ІС,
чно ПЕД 5 ія Зх шосту сій КУ КВЕ ПИТ ку х ІШЛИ ТЕ УК сек Ве Дис вв 7 р я ож шок ша г. ОК же і ж дока В и ЮК ЖЕ Коня хх ж З Ж пока КЕ а Зх Ж ШИПИЦЦИМ В, МОЮ ЖК до сх Ех му ї Лют , Т х Ме Я ХУ с. де т Ж ННЯ дек ОА х х мне мн М кн НЯ Ж хе В С 7 У пит пр шо ау ОХ в п ЖЕО ще о Же як. З Хо, й ОО Ж х Хе ши ЗК о вк Ж пре ї ке Ох Я ВАХ ЗКУ ЗКУ ЮЕУ АХ и їх З ї щ пк ш У КК оком мокко КК Кк км ДН ШИ ЖЕ. ККЯ КНУ. шх. ЩА ОО 0000 Ю 00О ЩЕ ще ще Ч НС «у - оце А м А АХ озиму М в п ОС У Еко дю че я Ж, М судха тою сих і БОБИ ЗВ хи х й Кос
Фіг. 125 " х Ока 3 яких жи ї с с У п ско ооо Тарлнлоює ПЕ СТ ВО сек йо с ма: що. їх хв ї ЖЖ 3 т хе її Мк п ж ле В ЗЕ У Же хе 5 КЗ ско пк Те о - З ду ДИМ ЖК ЕКО т ЕС З ки люк Б Я де ОМООМИТУ ОКО КХ ЖЕ - ї щи ТТ В ТК Її - ХХ ; КУ ХК оошоще Х Ех ВО я я ЗМОЖЕ ща т ; як Кк Ж Ж, ї ок ж Ж т 3 Ш7Х пк, Ж ож ве «хх Ж ЛОЛИ ЕК ЩЕ. х і дО КК ЖК щ. о х 00000 конвнву у пт ще КК пох ря вв ш ШО ж ши ї х соди Х М нн ПК жен ша ОО шк М ОТ яко КУ ПЕ ТЕ ХОХЕ ХЕ ХЕ НК Ко че НЯ х - Я З ох т У БК що Ва ЩО ВО вБ' ощ хи Ах ук В: Вам наНчо Д
Фіг. 12
ПЕКИ ХХ КК ХХХ КК КК КК М 0 КАК т ка КО ЗХ Хашік ників си екв КУ «ВІДМОВ КІМ Е Теж КЗ пожию В КИ Коко ков повукоя ї ПЕК КИ АХ МКК КАВИ КЕ 3 ОК КК : й ї 3 ХОККОКК КУМ КК КиМУ КК КУМ х Ї : х ї х ще спр Ж ї в ОХ КЗ ККУ я ї ї КК, Кк І: ї РЗК - ї «г х Ж У З ск дині ХЕ Ж ї х ех ко с МЕДИКО т ї х ОКХ "хх ШОВ ї їх Х МОЩЕЕ сок - х х х х х ї З Х ї и ї Е Я ХЕ ЖОМИТК х п Е 5 М х кн ї УЗ Я - и : МК х ре ї ЖК ВЕК Х ГКУ ї х СЕ ЖЕК ХЕ хх М ккх хх Я х- МИ У Х хх 3 ех МщЕ ЖОЖОщИ я Я ке ї З 3 М ЗО Ж Ж ОК ЗК ГУ ї ЕХ Км т хх ЗКУ щ- ї х х Те Ви ЩО ща ех я х Ж ке м ЖЕ ях Ех МОДОЮ щ дк Є їх хи ща Ох шо М ОК хх МКК ВО Ж ОК В Ех ОИЛКК ОТ х ЗИМ СКЗ хх ж Ж З Е х МАХ ОЗ КЕ МЕ ще у ї х ЗА хх дю й Ж Х Хо Ко ЗХ х х Бе ще «Ж о МЕ щи р «шиї ЕК ши ОО Ж чн Ка М к ай КОД Х ЩО ДИ К З х МОЖ ОХ ще ЖЕ Ж Ж ХОЛ ТУ х ши Ж дебеми Ж Мах ши х іа Ж ще ХО щи А Я її ОБ и ще ж Ж Їде х ВХ хх їх т хх жа хх ЖК яко МЖК п ЕХ ня Мих ши Сх КК МОЖ Мах ЖК ОХ, Ще хо Ве Ж Зо ЖЖ ХХ КЕ ТЕ В Ух ше с пиу пи КОХ ККУ ха хх ща п Ох ТЕМ и КК ШОК хх М их АХ их цито ЖК Ж Ж Ж Жити М КК МКОКИЧЕ ТЕ В Мах М Кк щих МОХ МОЖ В ЖЕ їх жк Мих ша Ж х зала У Ма Ми їх ши ЕЗ У х ВОК Х шшю ОК ННЕЯ мк М МЕ Х А ГУ т с с нн Я ї оп К Я ся ОХ вик Я код 0 Я ОН т Ко їж її Бе МОБ оХ пек В Ж КК Кк ШК кн в т м м кн С Ох «Е С ЖК ок ще ко дК - о що Ж я Б їй ЩЕ В ВВ - Же ях хи МЖ Тед ЕЕ по ЕЕ Здеит па МА кдо ВЕ ху КК КУ м Ж МВ я КЕ ОА щ щ В о ШУ як МО м ЖЕ МЕ ЗКУ ОМ, тож тк ж пЕя М Пе ПО 5 ТЕ - Кк ТОК ОА КОДАХ Ов МО їх Ще 3 хх х : АЖ йеОЖе КООБЕ ЖОЗОщЕ
3. я о ОКО я ЖЕ Я А ОЩЕ шк Б ща МЕЖ м Ж ЩО КОХ БУ ЩЕ ЕсЗ ЩЕ Ж У ШЕ «МЕ я КЗ ХУ мок джу ЩЕ, : с псом ви -Е ІЕМ ВК МК ЕХ КЕКВ я КЕКВ Є й . о - зрлву хо ккККких щ щи УЖЕ Ві ІТК ен ож помах Що джу сх деосвх З ПУ ТЕЖ ЛЖКУЮТЮМЕ ке Ще ТКУ Ме " я МЕЖ КК ТЕКУ МКУ МОМ щ ОН: МК Кс Я Ще; КОН ОВК З ОК УК Хв Ви с Ах В ИК ш ММ М ОМ М М М А А М І І М М М М -ТЕ ІНН М НК НН НН и ГУ ООН С ЖК ВОК с Б ОО З ОО ОНВНН ОН ОК А НН А М КК ш- ВВ В ОВ СО В НН М МОМО ПС В В ЕВ ВХ хк По ВВ В, ох МОХ ОКА СО як НК Я Хо с ООН Но НК НН НН В КК В М МК щ Ме ОК НО ОХ до во М В - У ВХ ЗО УБООСХ В МК о о СО СХ хх Мн І п М В І В и - З ОО ВК СК М У о о х ЗБОВК х ВХ ПСО В М НН КВ с В ОО Я МО С Зк: ОБ М ОК ОО НН НО М В А М В ОПН В В М В В В ЗХ ОК ОК ОН ММ І МО МК В КОН ОМ С : УМ КОМ В В ОВ М ОК ОК : ЗОН ОО В о іно; ЗК ПА о осо Ко во ЗО: у ОО Ов М с ПОМ В КН НН В ВХ З БЖ В М ЗНО КОН М В В В МН п мМ р МН, НН МО М М НВ ОН: их КВ ОБ ВО В В о Мі В КО ОК В ОК ОО ОО ВО ППП с: ВАВ І, М М и ПН М А М І М І НН В и В с ПУ ОК В и КО В В М ОН В НН НН мМ ВО ОН КК КВ В НК КВ С КК КО ВВ НН БА ВК В В КК В З КК КК ВК З НК Кк вою МКУ КОХ хх хе АН В ОН ХВ ОМ МК ВХ. ШУ ПМК ОКХ ОК я ОК нн ЗХ ОН ОО : С ВК в В НК В З ХО ОН КМ Кі ОО Ве ООН в КК З ОО С ОК пе ЕНН Ве В ОН ОН М " НОМ МЕ НН НН ВМ М ОН в нн З ПУ ах ИН х ОБУМОВ УМО ЗК ОВ ОН х Е я їх "ее ок кр о око ік бю во КК Ки о Ко окон ВХ
Фіг. 13
ІГ.
ДУХУ АКА УК КК УКККУУККМКМУКУУУММУХУККУКУММУУ УК КУМ УУУ КК УУМ М ККУ КК УКУКМК КК УКАХУ УК КК. х х х : Х х х ; х ї х ЗЕ З ї ї Х ї х ї 5 х їх х х їх їх х ї «Ж : З х х : х х їх ї х їх х ї х ї 5 Х х їх х
; . ше 5 ; я їх : їх Кох Х ЩЕ З ще схемних М х х ЗЕ х Мк КЕН що с хе - ї щ їз о УАНМ НТАХ «МН ї Хе х КО В їх ї5 х т КЕЖКЕ КН ЕЕ КК ї дк х ДЕМОНИ Я ІМЯ х ха 3 УХКАКК ККУ КК Ки кююиКих ний х КУ х - їх БУ З є ЕС як х В «о ж йй ї її ох їх х ка і СЯ до ї ЖЕ х х ЕХ ї ЩЕ 5 х їх ї їх Як я х ще З де Ж з х а ХО Ж Ах т СКУ х -ї х ЖИМ І їх х. ЖООЖО Я ЖЕ їх х ди шк «вих щк й ї МУ МОМ Ж 7 ХЕ " ї а В з я т се З КЕ ЗЕВьей БЯВ Ж ї ЕЗ З х М х : ОшК Б о КК Щек щх ще М х х що хо ех щ ок то ї Ка я КЕ М Же но Жов Ме їх ще хи ЖАЄ СЕ хх їж ших КЗ їх х То щи 0 БОБ У он зако жах З жо жа У ххх МОХ дк в їх те хх МК 3 ХХ шо КЕ Жде Ха х ї у ХО ДТ ох ЖЖ их МК ? ХВ ЖК ОН х НЕ х жи ОМ КОН ши дит З пе І Об БЖ Ії ХО ВХ Б их я щи КК Вико З Я В Ж ЖЕ Жан ЩЕ Жде ВО З Ех сеї х жа ХХ Ж ЗІ ХХ ЖК ННЯ хх ї їх сеї х ж ех Я В п жи х х Ки 5 ЖЕ о й Ж А сх Ж че У ЗК Ж а її ех З що СХ ї оч я ях дО СЕ т Жах КК 3 З я М ща МО З як КИ Ми 5 : ШЕ пи ДИ Ж СЯ Ж ши ши п МИТИ - днищ НЯ Ж МОЮ хо ЩО . ДЕ СОЯ дит х ме ОО хатах хх Ж шк Хе З 5 х Же їх З хи Же ду ЩО м Мод шо х ж хи М ЩЕ Жак Ха да ха Ж Ж Ж ЖЕ М МВ. Дт ще К ах МЕ А ї З Ж Мен Жук жи дик ЗКУ шо ї З ке Ух я У Ка сш де - м У М ех що ща 5 хх и Ха Мати Жах ши КН Ха х ВО МК ж КУ дику Ме У ж ве Ж КЗ що с ш х х до ХК г шх дише Жди Ха НУ Жах «ОО Жшиитх ЖЕ ЖК Ж Жде Ж хи У ше х Хо ох ЖК КУ ОДИСВИЯ кА и Жити А Жах жит ї Мк жах Ку ЦЕ щи ЕХ КУ дня ДК у Мих Шо х ВОМ ту ККУ пох ХК ДЯ шо Х т ОМ Ж и ще З ОХ ОК М З 5 шо х хх жи НЯ Ж жи Хати й М жи х по КО Х ОК ООН ДНК ди КО хи КО х х щи Ме В х КОХ дн ще КИ що ЖОЖжааиЕ Ж, Ж ШОЕ жо ах А ХЕ З оку ди КЕ де АХ дит У ще я щк сш ОХ ДВК Кк к КК Кк КК КК КК КК АК АК КК КК КАК КК нн хх Я їх КЕ К сх хі з В В х В Ко З я я 5 в ши їй о М м хх Ку. їх 5 Х 5 х щ я п з. СЖ що пох я ших Ку ПЕ я ше дх щх дЕ ох с ще ШЕ В ку п зх ШИ х їх п ї. т от, у ДИ У п. Ж ДП Кт, по НИ СХ ТП лох шк Хо ЕТ: ШИК, ЖУХ Лю ТК хх Ж х ох ще що ж т я жк Ж не пе КЗ їн КІ ше хх р х вх п ше с ЩО У Ж. ЕЕ ЖтХ ХП ех. ШО ЩЕ ТЕ пк, ж -еК КЕ Ж дк ке ДА ЩЕ
Ох. Пп щеж
ПК. дм Шо ЛЕ ЯКЕ
Фіг. 14 хх к х Хіти кно коки пиономх ЛІЗУВМНИ ЗМК КОКО ЗК У З джу КТК КК ж, ї МИМО ЗІ ІВ АТО КК Кк КК КК КК КК Кк ЮК кКкКкК КК . Що пкпикев ов кг « кішки де ЖЕ ЩЕОК Чо до и КН Ж ди ие В КК ен б Ше М Ка КИ не Ватт Щох ЖЕО ТОЖ ВМ ОК КО МЕ ЛЕВ ВЖЕ КЕКВ Ж В ЖЕН КОКО ШК ВИ У ТК ВО КИМ я ШІ ШИХ УкИКИИИИ ММ ик и. с Ки ДУ МЖК Ж Мю и ІМ М М Ме УК КВ МКМ ВК ЕМ М МОУ Ме ОКО КОМИ МО КИМ и КК МЖК ММ КОМИ їікнЕвиниси ис УК ми В пис мих мо дуже юм к дМ м че лу дк п В ло хм ИЙ ходу вне о в ЩО пово Ко М пу вх до кю тр В о вк в В ВН х ШЕ М УКХ, МІХ ТЕ СЕК ХА АЖ Ж МО Ж СЮ ДЮ БООЖОМХ МКМ ОКХ ШИК 0 ж ЖЕ лолеиЕКОКУ ШОМУ ЖК Ю ФИМ У МК ККУ и Ж ВК ВЖИ ДИ ШКО ЖК ЖИ т, Я КО МИЖК В Ж ЩО ПМООМИ ЖК Ж ОД Ж СВК ЖЕ КОВІ ЖЬ Ж, Інн ями ЖЕ рон КЕ МОМ ВО ПРЕ МВт І МОЖЕ ВИН ВК ЖЕК ДСК Ж ЖОМУ УВК В МОЖ КИ до ЖЕ В БОКОВІ ХО БІО, ХЛЕММИММЕ МИ ЩИХ ВИЖОМ Ж МИ МІ МЕ ЖЕ ТОК а а В в в пики пт Жир ЕНН КО Щит п ЖИМ: т Ше ВИНА ЩО ШЕ ВЕ ВЕК КК І ВЕ ЕОМ Ж ЩО КК КН В МКК БИ БОННІ НИ ВОШІ СОКІВ ІВ ВиКВВКВТУ зи итикиинию. т г. ЯК и. пох. Он теж гу ле пе СТУП сею кі ий ик А на м секти ск. ок, сили лює кити ки. ЄС Ки КОМІ коон ких ВИЩ ОМОНМИШ М оон Ух КАН С п ШМК Як о ЩЕ ЩО, ЖОМУ ПАСМ Мр Ск Вот ЗК Ж ДК СЦКК КО ДК МИ пк ЦИ ШКО ЕК ИКОЬ МОЖ ВИК ОКО и КІ ЖЕ КІВ АВВУКМЕ КМ МЕ МЕ ОХ дофукую ве и ЖЕ ЕЖ Де ЖК ек Од Оси и ВИ ЖЕ ЩЕ Ж.О Ж Хе ОВ КК Нд В ОК ЕК КО Же ВО ОК Во Же КО МЕ КВ ЖК КОЛО ВИ МОН БИ ше А АКВА КЕ ММ ЛЕ У Душ сим ви си етики ГО Ж ОМ У Я доми до У ко Ж пи Кеди КОМ ШИ ЖК МОДИ СВОЮ дж Ме щу пі ДИНИ ММ Той В ск есе щи пси Іди Вса ск ВОК ЕиК ЕМ МИ Жи Ви пи: Ше Фр ЛЕ ВОМ МО Ти МК ФВ Ж Ж ПОКИ ДИ МК Ж КОЖ ШИ КО ХВО ВЕ ШО МОМ ВН ШОК В ВИДУ ВИ ВЕС ММ ЛО М А Ву а ен и м а п п о р о Я оон и в и в и НИ й шинок що ЕК Сб ОБОХ жо ЩО ЖОВ Ж дк КК КЕ КК т Ж КФК ох осо о ДЕ ЕМ ДМК ДОД КУТ У ХК Ж Ж ЩЕ В ОО мех. ШК ау а НВ КН НК НН В НН ХМК Ме сим ВИВО І СНА ЦЛ Ол МО ЩИХ ОК ДО КК КИ У ХК ВШ ЦИ КО ДИ ДК СТ КИ АОТО ИО Ь В ЛП ШК ВИК Ж ВЕЖ Ж У й КИКИ, МЕМ ШОЕ ШОЕ КМ Еш ХК ДЕ ЖЕ пиши хи еф ДИКІ ЩО ТЕ ЩОКУ КИ ОТ СКУ ДОЩОК ШИ и и ВЖИ, ЗОВНІ ДК ОЦрО НИ ТО ФО ЕОР ОМК І ПИСК ЩЕ ШО МИСТОЛЕ ЩО ДФ ИН РИ ХО СКИД, кеш Ж ХК ев КК гово т ДК ДИКЕ Демо ю ую ДЕК З КО ЩЕ Еш Ж. ЕК ПИСК ЩЕ ти Ж т КОШЕ ШК В ДФ лісу КВ МУ и ОВО ВИ ЕІ КО ОХ КОШІ Ж ОО КОЖ ЖК ЖЕ ВІ МУ ШІ ЛО МИ МЕ В КД ОО Ж ВО ЕЕ ВО КЕ шим уми: СУК пупком вод ОМ Шо Кт ще ВИХ І Ж Мои У ПО дупу Ти п КОЖ МК ОК пд ЕК Ж Ох ЕМЕМНУММНИИ ОШУК ЩИЖЛЮЮ ЖОЖОВІ Ж БЕ Ж НЛЕ КОЖ КІВ ХО ЕЕ ІС Х МОЖУ МК Ж КОКО ОК ВОК ЖК ЩА Мих он и в МОМ щи СУК ЕКВиКвЕУ ЕВ М УК ЕК І ЕЕиКЕКК ее рН р а У и в и и и р р и БМК ШІ шкі КЕНЕ ЕХ шия КВ ММ Ки жи ЖК МК хи Ж ДК СОКИ М МОТО те ВК ум тииМх МК У МЕ ХЕ КО Ви М ЖК м ВЕ о МА Ве МЖК. п ВОК МОЖ 0 КК ПМК тнж вок КЕ Ми Ж В ОВОКК М ЖОМИ ДЕК КК МВВ КУБИ ХО ВМ ЕЕ Ж КУ Ти ДО В ВМ Ж. В ПІ КЕ МО В ВК ММС КАМ КИМИ ЖАЖЖ ЕК ВК ВА ВО КО А МК ШК КЕ КК НИ ДЕ ЖЕ ДЖНИ ФУ ШКЖСЖ КОДИ КАК КО ДМ КО КК ЖЖ ВИБУХ дими Ж в: ки ДЕН жене ее В ЕКО я МАМ В БУВ но Нниеи КимикинтЬ ЖИЖООЖО ож лу у ШК дея ЕФ ОДУ СТЬ ЖІН ЕВМИ МЖ леЕЩи Я СВ. МЕ ВИ МК СХ ЛИНЕ х ще Ух ДВ МИКИТИН их с. г с З ЕН ВИК ру омхортк хе х То КК ОК кока - х ШОК ЛИН, МОМ Ева У Ж щ дже ух я т х «Ж. ож щ- Ж - К сх о. Ж Ж ОК их, вк СОЯ хх - КЕ сн - Кк З З щу пн Б Ж 7 Ж сок щ х оо Е уник о Ж 4 - В Ка хек ВК сх ї оту 7 ЛЕ х ХК ж КУ х Може юх У : ах І пох Мк : Ма о со х Ху Ж Х пов, хе, ї ЕК те г зу Кк х ТЕ х Ко В хе у що днк Хе ек де ук ук Кк Кк укк ук сне хек щ «ж сх пох ТЕ ря «Я Бен ож я УМ, УВІ МК
Фіг. 5 ІК, ш Х хх мм КУКИ умо кумі КО УКМ ки. х Щ 8 І УКУПІ КМУ М, ІК хх З ї еко: ДК ее ковпак ж а З «ВК ЕКРАН КАМИ пед Кона, ТНК М НВ : п ххх, т Бе КУ я
В. І Б й . : х х. ж З ЧЕК как и г ОКО МВКоюя я її ЕС Кк - Ж Ше З З ххх м ї мк, Еш х З ХО - 3 БУ вас з х се хх ї М ккхххмюкюютхки х г ї ЩЕ жимі -й я 5 ; р З З БУ ї хх пло й У пт С у хх Х Ж З Б ї В 5 Ж З Сея З БУ ї 3 Х 1 і і ї нн и в м я ЗА жук ЗК ОЦІ
МЕЖ КО КАЖЕ ЯКЕ КАМЯ ЛУКАХ вит СУ Ходи МЕМ О То кове СІТКА ЖЮЮ КК КК Ан ї ВАЖКЕ : Кт ПИЩИК Ж ї джек мо Ве Плиуидии ти тА КК КК КАААКААИИ Ин МОВНЕ БЕК с: ото: о 5 ОБО ше 0: 15 сх пф ОЇ ФВ Їж ШЕ ФЕ ШТОТЬ ФО ДІ ШЛЕ ШОЕ ПЕ ТЕ ШО ШКО ШЕ ЩО ПОМ ЖЕ ЕКО ОО и ШИК о от пох 1о ОО Жо лоо Ол у лю о лю ж ие о дО дО Ж ОО п: Ор лю Оле жо Ж Ок кп зак шаа В в шо її Х ш в її ж її В з хх І с Ех їх шля ї МИ Ве В Ж шо ХО Ж Б ОЖО БОБ Жов ХО хо Ж ОЖ ОБО Ж 2 Б ОХ БО я Ж ОЖ Ж ж З лож ОВ Ох Ж ОЖОЖ х ФЕТА КН ОК Ж ОЖОх ї ож їж ОО Ж ОО шо йо ож Бош ж Ж тож ж Отож Ж БО Ж я ОХ їх о МО М Х ОО ПЕОМ Ж ОЖОШО ОЇ 3 5 ОБ ОЖ Ж ОО ОО ЖО Ж ОЇ Ж ож Ой Ох хх я їх Ж ОЖ ОВ Ж ж її Ж Ж ЗІ Ж ж пох ЕШЛІ ЕК Ж оо Ж о ш ОХ ж Б й що дош Ж Ош що ОО 5 Ох лош Ж БОШ ОО Ж Ж ОО Ж щі ох МОЖ ЖК ш ШИК орудує ит : ША ВАЖКЕ КЕ : ня КЕКВ Коло а еВ Хі нний КВ ЗВ В юс шию у мб ході що ВА ШК ФО ШІ дю ФІТО Ос Фе ол ДЖ ОШ ДЖО ДО ДІ, ОР фр т СК дО Хот, ХЕ Пил ше лі ДІ БІ ВХ ЕФ Ж ШЕ ЕОМ МО Ли СОТ ОТ ЗОЖЖ шт ті лі ЛОЖІ ЛИ ШЕ ОЙ ТИ СЕ ЛІ ЛЕ ЛЕ ОТЖЕ ОСЛО ОВ Ви и ш Ж в В дж в її 5 ЕЕ хх її В 5 Ух Еш А ТІВ МУ В Ж жо Ж шт Ж БОЇ Ж Ж Ж ОО ж Ж ОО Ж Ж 2 5 5 БОШ шо Ж Б Ж Ж Б ОЖ З ОТ ОБОВ х МЕМ ж ВОЖОО О Ж ОЖ ОБО ЕФ ОЇ Ж Ж Ж Ж ЩО Ж їх Ж Ж ох ОБЖ ОЖ Ж ОЇ Ж ОО БОШ Я ШО КОХ БО ОБ Ж ох плен решт ПЕ я о жо о Ли Кок п ж ЖЖ и о по шо Ой що Лю що й пп оо дл ель хо жо що Же тощо ОО пот ЕШЛІ МЕН МИ ОХ Ж ОШ ЕОЖ ОО ДО ОТО ОКО ЖЖ Ж ОК ЖЖ Ох шо шо Ж О Ж О Ж Ж шо ОХ ОТ лою тот Ох ОО Ви ож о жо ж шо Ж Ох 201 5 ОБО З ОО Ж БОЖ шодо ж Б ОБ Б Її БОШ ОшЖ шо Ж Б Ж 5 Б 5 5 З їх дО Е ЕМО МКК ДУЖКАХ УК уМ М У У ук м ї ШИМИ ВИ ї КК КК КК ЕЕ КК ї ПИШЕ Ле КЛ ї зе ик ле ВАК Тит КИ ХУ ЗХ КЖЄУММУ хи оФт о шт ОЩа до ж ще т МКОЖНЕ МО ЖИ ШЕ КУ СО Ж дО Ж ОСЩЕ СЕК ОКО ЗУ ОЙ ОД ТЕО СПИ РЕ НИЖ пи шою ооо м жо кох ох з шо ох ше Кун щи: окт пшК ВЕН ННІ Ж ВО Ж о З т 8 шо У дош Ж ОО Ж Ж ОЖ т Ж Еш От й їх їх Же ВАЖКУ хх ЕЛЕ ж шо жо о Жжо шо ж Ж ох Шож шо ш дО Шо шо ж ОшО ж жо шо до З Ж ж Ж ої ж ВЕ ВО І ШИНИ ов ОХ 22 Ж шо В БОЖЕ ОБЖ ОЇ ОЇ ОЇ шо шО Ж ОТО Бо хх ОН ЕК СЕ попи пкт ШИМИ с, ото . шо оо жо що ж оо жк й хх шок ох ох им ДК ВИМ МЖК ВЕН ХВ ОБО ОБОХ Зо я ШО ШО 5 ОВ Ж О Ж З ОК шо ОТ Ж о КО ВО ВІК КЕШ КК Ж.О ЖЕО Ж т ШО ОО 0К сю ХО Ж ТО Ото Ох ї шо Кто ШЕ ЩІ ВОК Ж "МОМ. ї нн п п п в п -е
Фіг. 18 КМАКИМ МКК КА А АК КК КАК КК КАК КК КАК КК КК КК КК КИ КК КК КК коли Коко кет КК пк УКВ. КК мамсодум ї ЗОВ я ов коми Ви НЕ ми х ПДМ ї КУ : хе - х ше КУ око В В КК ВК ДЖ КК НК В ВЕ днк. ї т х КЕ КК КИ КК ЕХ КВ ОКО Ж х т БУ ї : : : шонк : х ж щ окон, Ви ЕН ни М АК нн ЕВ ЕВ КВК х ОК КЗ тк ШЕШОНЕ ВЕ В НК КК МЖК ШЕ ЕИЖХ х ее Ки пе п ТЕ, : КЕ Ух Я ХЕ КК КК КН МКМ мкм щ ж. - ЕЕ є
Ж. пошеоджии. М : пежих ЗЕ ЕК. : - - ТО Я х ко чо я Бу Х Я Ко ОХ їх. ах. ; хх хх Х ххх НС КОХ Кн В Я ж є Ж "Х. СКК МЖК й НК -х со, жк. г Б З ; щк дн ХК ко кн се Ех і. в З ОК ххх Км ххх кни В ; КІ х 7 о ж: 7 ох 3 З с Бе хо пет. З У . дк ї 7 Й я пд з ЕІ Зк З -Е ї КІВ що Б м їх Я шк ХХ - Я є 5 в а ЕК я ГО КУ х т В р ї г З во х ж що се З Б ЖЕО М х -к хЗ Х щ х МЕ ВУ їх х Кох) ко ще : с. За х с х Хо ї хе Ох їх ї КК КК КУМ КК КК КК КК КК КИ УК у КК УК ук ук кун. я лю т т х й й те З х х ку ЖЕ х З я ЕСЕ Ки че - дж я Ви й ух ще АЗК
ДИМ КК КК КК КК КК КМ, Покеофвннх пох ту Кк вх З Хжккккх КО ххх пу конк. ї МИМО ку НО З ме : . НН я х ее НЕО ОО НО В НО ВК ТЕО : ко ї ЩЕ ик з и ТУ 5 МЕТЕ х с ША НН 5 ї М тк х аж, КВК ДК Ж ДИ АК МВ НИКИ КЕ У М х х п У ЖЕ щу в хх х ща х Я Гу ВСЯ Ж - Ж Ма К -Е ще тую х я. Її й; пк Ох х Ще Ж що Е ок р БЕЗ х х Ен Ка х ; х х ї З Е Бозі Ж ще сх ХО у Ж ще 8 у шок шо ро Б Ко 5 хх 8 В Ж х Вк вк. с. КЕ ОЗ че ек з КЕ я ж ех ЩЕ ХХ й ОЗ їх КК що в є ж Ж ОЗ Я й Я КО те Б ков ЗИ То Що Б щк З З. - Ом . як з кХ «Ж 5 ох ВИ щеко ок ЕЕ шк 7. Я: о їЕ с ОК о Бу б х З ЕОЗЯ ех. ВВ х: Як; ок ЯК. оо ки ок с о БУ В г З З КОКнКннн КК ОМ сх я 7 ЕЕ МА, В ХА КК КЗ ух ШК 7 ох. в ня сх В З Бо я ще ще ї кх М под оро о ре ц ро очовкес УХОДУ УМ УМХ Ку КЕ КК Х ДЕ ЗК. п КО Кк «ЖЖ ще ї М Ж ЯКЕ ДИКЕ
Зх. яко до Жах й ккик Мах ВК З ООН ІхУ ї кафе МІН сл ко ВК кс тя сої Я ї ї В БО КМ ДЕН Ка ке м дос : З ТОЖ що КК шир ипутиции о ЖК іони ма миша може ВКЕХ В ї жк ВИНІ ПЕКИ Ся Мо А ВЕН Х ФЕ : Но КЕ, Її " х - : КА ШИК Хо ІЛИК ди Вин КИ ТВ ОЖИВИТИ п ВИК ВИК КЕ оси й ії ї око ПЕЛЕХ КИ ІК о еф ВЕК ЕВ КК ТК ЯМ ї Б їх соте й ежжююювеююєююююнкн и жжжюкккх 5 й : Хамеоо ооо оо ОК ЮК ЮККХ КК КК КК ЮК КК КК КК Кк КК Кк кн юн У ж ї Ж х її я і ЖЕ і З із ї . х М с ї КО, : х Ж є ї таж АК хе ї - Еш Н ОК ЖК : ХЕ т і: Ж Он схе ї ХЕ ж щі КОЯ Ка з КК покрила. КЗ ї «ї хх ЕК З т Кк. ; ї х Х ІМК З вх хх Ж З Е як В Н І 5 ії В Ж ук ї т х їжи ЖЕ ХО ї т В їх хх. ВТМ Ж Ж ї ї Ж Ії ВМ Ж х ї ЖЖ У е іх Ї хо ї х Що ї щу ох Хе х Ж «М ї ОКО о ї М: що ї К 5 ЦЯХ ж х М М ї ще х А ЖК ОХ х - 3 5 ї а їх х х Мох спокої о Ж ЗК КК. с х м МОТЬ ші Жий з ї МОМ КК їх КЕ Моя Я ся Ж ВК х ї - о Її Же її ВІ З - -- у ї х Кк ї 3 1 І хм їх Б КУ Її як ще Я ІК нак Її З М ї -к х ще їх Як її: Б. Е їх з М ї 3 х й са Же Ся Х КУ т ЗО ї ЩЕ ВЕУ : : ї я уж ОІВ : КЕ БУ : : ї дик те 1 В 5 З хо. ї х Х пд І Я З Її ех ЩЕ х х БУВ ї ще Кк х хв 5 ї Бош Мк шим ї Х на ї І І: ОХ ї жк кош ЗЕХ а ОО Ї у Ку ПО до Ка х КУ жк : ї їх їх вх ї З ї 5 В х х со хай х Же хо З з З їх ще ї 3 х 33 55: ОО ї ше ж - Н хе -к б ВХ х З ї Я що І се, йку З І : Зх р У : х : 5: : к ї ї лаки В ї 3 ТОЖ щи : ть хх ї . Зоши КВ ще» ЖЖ кхх ж В оон ї са ї с як ох Бо ех УКХ Вже «КМ х ре ї х 1 х т жк ско МК, со 0 ї Ії ї КХ Я КУ Ж: ВК В ТЯ я: Я Ж х х -1 Ж ОК Квио В ЗЯ КЕ х. ж М М КИ «її г ш п пе ше ках Са сх Ж ах сх з де ще я Ох ще ще МЕ ще їй що 0ОЖеОО0ОЮ х З 2х хх Жеао нь х МКК Кя т Ж Я М ЖЕ 7 Фіг. 20 хи их ЕВ ОМ пт мя диня ї Жах З Бал З Важ 1 Духу ві ї ї З В я ї шк х ї Ж Зх М Н Со: 4 У 1 Ех 1 ке В х ха ї ї в опа Бе осщо ня - Н х У ва З хе ЩО я о х ї ж БЯ КУ Ж У З ж ТА У З у; ОО т Щ х В її Ж 5 т 1 Ж жк. : я ---к хх Ж -- Ж їй М ххх 3-х : ЖК їх : Ж ї щох їж г кг у щ -к х. Ж хе . Ж вх ЖК жи Ж хо У М ж «ща З хх КЖАИ Я У з ох ах ще ре пк. СО їх ж ЗУ З Ти ОА хх їй жи ж В т М ше С я ген ІН бай ж З шк" х ї ВЕ ТІ, її ско фу КК кр щи і. М по ЖІ щоО Ву Оу сну Ж Ж КЕ гей з ж НО ОО У 5 т КУ т ї Є ОХ йо МОМ о х хх т С х х х шо У В - м ВО В а х х КУ пошу В МО Ех Ки ї В с З Ж 7 Вих У мох Чл х ЩЕ У 5 Ж ЖЕ МО - их я КЕ ш х Я х Е щ що от хв ОКХ В а х 5 В х о що хо БІ В Ж Б х х що ХЕ Ж хх п Ох 5 х 7 хх х ОХ Ж во 5 ХВО їх х Ж ЕЕ МОВО М. ДЕ Ме ХЕ й ЩО т х шо жо с с У щ. х дО хХ шо Ж Ол ЕЕ м ся ї З ке
З. хх це Ж шо ЖЕ х ї ту ХО Во 7 - Ж ошо Ж и 5 х У М хх ОМ ОКО 5 Б. Ох й ВО Б ї ОО че ноу КО Кк хх х Ж М У «Ж їх Б хі х І Жех ВОЖИ п Ж Поже т -х Зо хщЕ Ж А З ВЕ ее
ОБ. МТ ною З х ї Х Ж У ЕУ ЖИ М мк ї де х х Її Х З ї гу
Ж. - ХХ х ж - ї х Х ВЗ х ех М пощої х Що ке З с х їв г З ЗУ х х. - х ї ж з х ш їх КУ ЩЕ я п Т ех Х ш 4 - хе х їх ї Я їх 5 к. Е З а | хххх й а «3 т к х. х. ях ЕЕ ШК жо 5 с Я - Зх Ж ж с В : «ох Ж ; зе Ж. ї їх В а к КЗ ши Б Моя В з х ї я - а Я ак Ж КО ка їх дк Ж й М Ж ке Як з У ЕХ ож Ж ж з ЖЕ з КК. Х їж жа чу КЕ Ж З їх Зк Ж " я ї Ж ду З Ж х м. ї УК КД ДК ДЕК КК ДК КК С КК М Кук юки ак х ОМ мо ем щоби ЖІ М де хи їх хо що як ЕЕ ШО БЕ Ж у ш - дк хе ЩО - ЩО М що ж т х ск щу Ж Ще ц що Ж х В я Б М Ж Б Ж КЗ гу ОО КЯ «З х Ж ОБОХ ХЕ. г ря хх Я сх х 8 ЕЕ 5 ВО Ко х Е х й З м ш- ЕВ її хи Ж хш ї Ж Е ц МО п 55 хх Я ЩЕ КУ р КУ Ж х НЯ ХЕ Ж х Е ЖЖ хх Е х п ХЕ ш Ж ХОСЕ т ше В ЩЕ Х х х х ХЕ Ох х шах З шо х хх й х Ех МО х. Ж: хх Ж У Х, Ж : ЩО ОО ЖОВ ВО хк ХЕ ЩУОТЕ Е Ж Є а КЗ КУ х що ОХ ХЕ їх оо Е ш с ЩІ Щ хе що ох ж ОщоООх хх х хх хо х й ОО х ЗК її х "т їх я п Од У о ЗМО Б М то ох В Ж Ж Я Ку хх си. щі Б КУ М Ж х А хх ХЕ хх й ХЕ ї ос ї х. що ї " ї хо
Фіг. 218
Ж Ек ШО МИТ ЖЕ х « сеюююддюююхя се. х х дижях, ї 5 Ох полину Я ї Ех ТЕ Х Кк ЖДЕ 8 - х ї ЕЕ Б ккхххдкккки х ОКХ, Ж З кхкрекк и шхк х 3 У х х х -Е Я ї х х 3 х її ї ї х х х х Кк КУ 3 У х х х КАХ Ех х : х ту сх Уж ї х х х х КЗ ШВОВАЕЕ ї КОКО 3 х : ОС Ва о с Я ї кххудкккх ж М В Я Е КК У ях. їх ї х Ми ще не х 35 З ї ї ХМ шт я т їх х с есе коки М КМ и х го х КК до и т ї о ХХ ОККО ДЕ АК х хх х СКК до в ї Ж Х ДЕН ВК КЕН м ши Ж ши ЕХ х х М, Ж ХОМ КВ и ЩО и и х Ж поскідн Х СКК ШИТИ НИК дж и т їх х ІОВ ВН еВ Шо т Х х ОК ПМК КН ИН З С їх КЕ х ДОН ПИШИ ИН КН ВН х се БУ КЕНЕ ин М В. ї га х ДЕН Ми т ї г Ж ОО Кв ВОК Щек и о ще в х Кх х ОХ Ви ШЛЕ Ж ди и шт АХ х до ХХ ОН НН Ж х Ж х ДОК КАК КВК К К о да и Х. х Ж Я п І ЕЕ а х МЕ ШЕ дл ОК ПИ ШК КЗ ай и АК х їх ХДОЖЖИ ТЕ ПЕК НЕНШИИМИ ПЕИ ЕН до в вд в х КМ мм. ДОК ПЕН М и ОХ ї що ХЕ КОХ Ж и : хе х ПАН нн Ха ит а и шт ї Ж ВМ ВЕ Лю Ж о ї В ОБО НВ 00 де ен ї Б КОКО В Ж и ит, Я х їх ДОН Ка Нв В и Ку х ДЕК о Дод о х по жииту. ХЕ М ЕК ПКОШННОНННОМ зак ше Мао дв З х ї ІЕЕ ДК КК КОЖ її ВИК хх Кк ха КА ккужккнкчихннии ЗК хкхук Кан пиКОКЕТК х МОЖ ХО 5 ЖЖ де ск. Ж Ж ЖК с Ж ОВК, КО ЩЕ СН «КО МКК ОО ЖЕ Од ЖЕ п ЕМО СК шок ПЕКОСБЮ паю жо КО шо ще ШЕ НО о ЩЕ ЖИ КЕ ОО ЩО ЕК КО ЕКО ОНИ ЗЕ Ех МИ о ОО пк МЕ Я ОО ищКО ЩО КОХ ОКХ ПО СМИЕ ЖЕ Б ШКО СНМЕ ЩОКУ ПУ ШЕ Шу ШОК Ши ВЖЕ ле ЖЕ СЖИМЕООСИКЕ, МИШКИ ООЖ КО еще. ШК я Ж ОЗ МОУ ДИ ПИШИ Фіг 216 хУх. щ МЗЖЕ че Га МИШКУ ких х т х щ х ї ї ж ЩЕ х ЖЕ - х х Ж зе як Х Ж хх Ж МУХУУУУУМииУиУУииииииМиниииииии. МОУ п сш Ж - шлю хх
Ск. ШЕ Е ща х У МЕЖ ек ї. ще : КК ОК . щ КЗ що х Х ООН хх - ке Х щ шо КЕ Ох Х ще М ж х з як Мк ЗУ Ж же. М ЕЕ х їх кою по УКХ ж х ХЕ КК КК. щу Х А : го х 5 ік -к ЗУ шо ооо Хо 00 ом» Кз ОО ШЕЛЖ ЕЕ К Ще КО кВА ж ж що ї ще ХО х Бк У Още хх КОХ х ВК ї - їх Ж Ко ха Х що Х х КУ Х ке їх КЗ КОЖ х м Х т У ГУ пи Х . ще ШЕ ШИЦИЛхухкхккххкххккххххккххких Ж хохххокхкккхккхккккккхкоккхкикх 0 Ж хкххоххкоккк ок ккккикх Кк Кк ккккКиК. ЗК скккккюкк ШО УХ ВИХ ОК МКУ. тка ОО «ко ж пе ОЗ хх яко шо ОХ се «Шо 0 пай В
7 З. В ще Ж Ж СК У с я В ЩО ШКО ЕХ ЯМ ЖЖ ХЛ, ХМ ЖУМ КЕ «УЖ ОМЖию. пп ПИЩОО СЕ. ниж СЕМШЕОСЛИК ваш ашк СХ Ви ке ЛИЖ ЖК ПМК ОЗНА СЕ ЯЗ і ПК ПЕ КОНТ о Оу. т. ШК ОТ ПО СКИ ПО КОХ ПЕОЗЖЕ ХО ОО ОО ОХ, ЛИШ ЩИХ КОС, ШКО МОЛ ДЕКО Ж ФО ОПЕК Жили ОКШЕ пили ЖИ дО МЕ ОСЯХ МОСК у Я п ШЕ ШК ШЩЕМООТЕ От «КЕ ШТ МОХ «БО ДЕ Е ЖЕ ЖЕ
ДИ ЕК КК КК КК КК КК Ж КК КК КК КК КК, ЖЕО хо ск - ї по х х зиоан ях Хакери тре коєви Я Е СКУ ОО ЕЕ ХА ЖККНХ МОМ ї Ж З ях І КЗЗ зем оо пк КК в де Ви В КЕ КЗ х же МИШКИ ВО ХО х ХЕ Ху АНУ АКА У ОКУ КТ КАК ККУ х КЗ х х х х х Х х ї ї хі х -Е сх 5 Ж хх сх о КЗ од «кн. Се хх Ж ак ЖЕ М З Б ОН Мк ве хх З Ко в хх х шток КА ОВУ НК. а Ох х І ІДЕ КО ОО ня кох К. пе ОК ох В. КУ - З «о ех ВК Кн ї що ЕК З с КЗ У Х Б КООЗЯ ЗК Х Кк х КЕ ї й ХЕ Ку : сх Х х ХЕ : я» ОК х МЕ кох Ж КК х х х х х х х х х «еко х ПО нн в нн в БОМ шт. др оищот. Б шт. ди, ХЕ ЩЕ ШЕ и «І ЩЕ ж «ке хлеує ок ок ТЕещх шу АЕН КОЮ я МК МОЯ МОНЕ
Фіг. 22А «КИ КН ШИМИ ко х х -к х ВМО ТК СЕ КВК ккикнк Харк: вки ї КАЮТЬ ХЕ зання ІНВ по Я ї її х Х МЕ ї Е їх ; КИ и х. с Ки син ЗХ оквукю се п Ку и ЖК пон ВНИПИКИИКИИВЬ ПЕКИИО ЖЕ зах МЕ МК ВХ хх ше Е ЖК КК КК КИ КК КИ КК КК КК юююююи х по пише М ше ох і ЩО фе хх ; м щі Ух хх х т Б. х яв В ше ж деошес М Х х Кк шлю М нн х х КЕ ЕЕ а Ж ; Б ХК З о. М З М с Мне ХЕ о. ее по х-К ЖЕ х п Е "Ж МОХ Х Кк схкокх. Х С ІК Хо я а - Хх М Я у хх Ко сі ших МЕ БОНН. Во МКС ж ХО ШК Ж В щ ВВ хх ХЕ ОХ 5 Кн М в - хЗ ж х пох МО В ОКО УМеооХ 55 кА 5 Ж я хе ро ЩО 5. Б с ї ок. х ЩА ї З їх я . х вя їх.
Х. я х ЕЕ ЕК сон упо оф ЕК КК ДОК КО КК но КМ КК КК КК Кок конк, ВОК ОВД КЕ КК КК ДОК МКК ЕК КК МК КК ДЕК КК КК КК КК Кк У «БИ Бе ххух. ок, щит ЖЕ Беж ШЕ ФМ І Не бек феогцх вом МУКАХ ВИХ МКК КАВУ я КК КК КК КИ КОМИ ИН М М МКМ пк х о х "ізн дитин кон вії уза ї понеееннех уаУуМе Ме МІК ВЕ я ТІВВЖаМ ї ша шиї їх дини ю Пи КЕ АН ШК ШК В МОЖЕ МЕ КНЕКО у х ЕЕ х ї т З ОО У Ми Ж ВК З чх КЗ Ху КК КК КК КИ КК КК КК же х хх, х Ж Х щХ Х ех х ше З ДЕ Х й хе я ХВ. І М се ; ОВ ОТ ї : з ПЕ ОЗ КК, сах ШО по х З. НЄ он З -- ще Б а Ба - но х В сен, о Ж х М зх ів Ж ве З З о они в КЕ З у ОО ВХ й Ж БУК ОЙ - дек о Кк с ВК Же ДЕ КВ Й я ОКХ Ох хх : ох Ки пЖї Е. з с Й ПЕ х де З я х Зо З Хм х Ка ще х ж М їх ШЕ ї БО ПК Х КУ Ж и їх ї ї ї х х ї ї шпем дж ОХ
ДЕ. ШЕ УДК УКХ ККУ КУКА К КК КК КККХУ КК ШОК КОХ х Х З ХЕ У п Ж Жах. ЖЕ ОКХ я ХЕ ЖЕ ЖЕ СХ ЖЕ ХХ ТЖкЕ жк ге БИК КВ Я Ж МЕБС МК ОБУ ДОМОМ УМ УМ УМ КУ У У УМ ККУ УМ Ух Та кажани фоток тв В пек Х МК» КОВІ КМК МУКУ МКУ е МІКОКМК у я т й х БУ ї С по пох КОВКИ В КОЖ пив КИТ МКК ПИ В - З Ж ев ВЕ СК В в В А ХК ЗО СОСНУ » ПО, -- З ЖЕ БУ Мои о о КУ КИМ КН КН НН КК КК ШК З ще З. Же З
ЛИЖ. Ся ЩЕ х Ще Хх г ТАКАХ ХО. З ЕЕ т Хо ОК а де с . ЕК Я Ж р. Шовний КЗ Ж Тож Бе Кн ох ЕЕ ОН Ж щої ЗЕ "З вх КТ ЩЕ З "Б Є ОХ Б ж оо под» Х З Бех я й Б Он. пити х КО. ЖЕ ї Я ДЕ х щкк й 3 я
КВ. 8 їк ї ск : ПхХ х г 3 Же х тки їх ЖЕ х я х ПИ С.
Ж 5. ХХ ї У З У х по дк КЕ ДУ КК С УК КК КК КК ДЕК КК КК КК КК КК КК КК му ЖЕ КЕ тк ПЕ ОКА щу ЩЕ І ЖЕ ХМ КЕ ШЕ ТТ тва ка ЖУК ХЖКИАМЮ МЕМ К КВК
Фіг. 238 кн п в й КЗ ї : - . х їх с: КК Мекки Я корка ан х КК КИЕВ КК «- ТРК ЕК х щої зн ВКМ КК ОО МАК М ВЕК. х й з я з х ХО сш «Клим КК Ж НЕ КК Машин ВИК ВВ КИ 2 п КЕ и ВК Каши и ОВК : «І ВОМ ВЕК ЕК КК КАК КК ЕК ЕХ коту Кук 8 З ОК КК В ОМА В ка Вр В КН пог Х ве и и и ОХ ЖЕ З ит х КО 3 що Б ЩЕ КЗ ПИ х ТЕ З ПЕК, Хх о КХ БУ щк с т Х. я жк. «М х я. щОХ З Ж НК о Кв ШЕ ХНН У ОК. КВ в шо З ов ас я З ке ЗЕ сти. ХХ Уся, - -х З с дл БО Я те Х я ЕК х же АХ Кт З Тон ї ще х ж я Я ї Х їх х х х 3 їх Х и Я ЕЕ й ту Х НУ х М Ж п ли. ОХ КИ, ще т Я БИ ях Ми ЗБ лнла кан
УК. ЖУК МК ЖК КВ Фіг ОС Ізки ПИЛАМИ ЛАК КК МКК КК АК ХК КИ КК КАК КК КК сек х хЕ ЖЖ ОХ ооо В ннннник хм ве Кк ХЕ ПИТ В Х НН С ку кхсжох Ук а 0 МЕТ їх Ж Х я ФК МЕЖЕЧКЕ ІЕЕ я тях ХХ Е ХХ "з Ж ї Оз в В ОН а В В З и і ен п НВ В ВО КГ ЕК шжЕ Ж ХооохкоК КККККККК К Ко ки КЕ ї кн З що їх я З У Ж пох ї ЩА х ТЕ, х ЖЕ х п. КН пе ШТ Кох ХО
«Ж. Мод. ЖЕ Я сін. Б де хх х ШЕ Х й К хх 5: ТЛ Х іх С ОД С т дк х ЗК.
Я Ж. я ХО Ж Я Зовее пий ок о З. Я ЖЕ х нн кв: ЗЕ т п ЩЕ В Зх шк Ж За а СЕ "ЖОЛЮ У Ж; дн, п У ОМ З. З. ня Шо хз о М ень ОК. ЯКЕ ХО ск ВХ Ок ви жк СЕ ЖЕ Хе " Я я й я В х Мн п; я ГОД КК КК КК ХХХ КК КАК КК ДК КК КК кА КК КК КК КК КК КАК ях я МОЮ їх т З Е Х Ех КЕ ТЕЖ ВО КЕ ОК М щі «М «В я У Се: вику ке е «КВ ЗАКО МУК
ПУЛУ КИ КИ КК КИ КИ КК квдтованио: Х Х Еш - Х ВЕСТИ Х вона Ка сн Ех КО х Ми ж ЖК Я КК ЖК УК ХК сю М х Ж ДОПИТ МЕ ХОМ ше МЕЗО х Ж и я, Х
БЕ. ; Е ОХ с сек , КК: «ЕК що ощ пеши ЦИМИ К ОДИН І ВКА ПОКИ - с о МК ом КЕ пи М МНН ВЕК МВ М не о КЕ У х Зник я НИ ЖЖ ЖИ ЖИ КК ЖЖ ЖИ ЖИМ ЖЖ. - є х Х х З х х х х хх ХК деко. ХЕ . ПОН ях ою п КОМ ож х С МО їх з хв, а ву вс ИЙ з ТЯ КЗ Й М ЩІ нн п З В в овнх У, З КК З. ж хх т Ск, т ха х Кн. щк У 5 она КЗ 3 СК: її пк т Ух ЕК СЯ ЛОЖЕ Я ж щ--- хх Ж ех Ку ву х хх ї У х х Х х їх Х х х Х х х х 3 ї Х похо й и МЕМ х У Х 5 Х їх ск хокок: Я СОЯ п х КК КЕ І КЗ БУ Хе: тегом век ям АЕКМХ ХЕ МЕ ОЗОНУ ДМК КК тик тки ЖЖ жк, Ххфхх фло вок В : Ех Як пи ХОМ Зх щ ї шиї ОН ; . ко ПИИМ Косово ин ЩО доводи пЕеКИСВНИЮ щеКИИ ДК з Зх МеВ В НЕ -БХ ру х Ж д і: 7 Тк ще а ЩІ ШО ї шо З ЩО Ї че - ж ї Кс: ЯКА й кох ї хх я й ї ве те. нАОКю ї ш. сов КОМ Же Ж ; в дккееенея її Ян о М : Е ши» хх: : М х Ж ненні хи що виш ня ХОДІ Ме че де ЕЕ ОО пи сх ЖЕ х шх МОЖ З Та ЖЕ МАХ х з ї ї хх ї ЗКУ їх ХЕ З З де ї МО їх її Ку ОКХ КЗ Ж Ка що : СО З БУ ее ї а фе ах МО ще 5 ЩО (1 ж холку оасккжтккхктиха ХК, ше ї Б: х МКУ аЕЕЖККе Кк ха ке у ОТУЖ к с Її Ж а ї кх шк : її ТК . дк «Ж мож ї : х ХОЖМХ бю У кл 5 : її Е хе х Ж ШО пої Я З Х х ЖІ Ж ж ШО Ж ж де БИ: я Ж ЖЕК ко шк дООЖ ПИТ. ях хх : МК ОКІОЖжЖ жа їх щ ї М Та 1 ОХ У М і хх 3 її ня хх шок 4 я ах ЖЕ У ї пу МОМ х ї хі ро Кз ї ї ХК п а : Хо МО : З Кз ФАХ 4 ї " ях ї ї м : х що х х ЩО Е ї ОО х ї У ї ї ЩЕ ОМ ї як ш Ї Ж шої 5. 2 5 ЗЕ ККУ ук Мекку юку и дк ю Кк КК КК КК КК КК ДК КК дик дк ШК КК КК КК дк ук ук дик х т що ше нт ке р ся дк в К
Б. КО МЕ ТЕ їй ше Т М М Ж Ху дк УЗ
Фіг. 24А нн ЩІ хМЖ док нн ї фе ТКУ ХХ «В ЗК. ї Хелен х ; ж ДИКИМ Х я дО ЕН ОПИМО Фолс КК т хх Ку МЖК Ж юю и М КЕ ПЕ В КВТ. КЕ Бо х ЕМ М МЕТ КИНМК т Ж МЕ х КУ ж и М Вк У « -Х -. Ж Б ї що хх о їх х ї жк я я Зк Е дике Са: В» х ши Ж. ЗО ї ож -. Ж що с КН ЗИ, хх що ї з о ЗХ зак Бе : бно ве с Ж Ж се ня х Хдхжеео ВК о вок ок й 3 Овни о се я 7 ванни Ох ї М пн ж о мо Її еф о ЛК хх ЗХ хх МОЖЕ по КО а В МО КД Я Ж й о УМ шк их ТЕ КО а х 5 7 КО ООН я т цик й ше. ТТ МО КН - х Е ОК ОО в ков т МОХУ х У КО спо ов щт с ХВ Же сем ке я КВ вки - МО Ж "ОХ КХ МИ ЖЖ - мок ОККО ше ВЕЖ ТК мокро в У В ПК ХЕ ПМК КТК ц ї Ва сш КК Ж Ж до Зх х ОО кни кі - Жак Мих З ОБУ оку пато ссккюх вики іа КУ М ї ЗМ ххх ежккци Ск как х М х хі лк жк х шо Же Х ЗК СЕУ жу, СУК х ТО ї - ЖК Же кю м ККД хо: БЖ - ж 3 я ВХ ОВК КК КК КК КВ КК ЖЕК ОКУ хх с КЗ ТО 3 ЩЕ. ЗБ КЕ ТК Кв ково одн фа ях ОТЖж ож ж х сф що 3 т МКК ХК КК Вк дюни ЖЕКи по їх ках Ж ї МОХ сок КК же ек Жк КОТ ве х х Не МОХ ЗК хакі их КЕКВ пк мекв М о Ох чи з БУ МОН ЕЕ ТК Ж Ж сх хх ЩІ ТЕМ МО З 7 КЕ хх аж їх. х З теЖЕЖЕ У ХО кА х з З т ХЕ хе БУ Ех ож що Ку З Ж уд з Ж СЯ ї КА "я Я г МОХ ї "ж КК ее М Зх Ж у «КО 3 їй т Оу 8 х м їх я ВЕ ї Ж ка 3 х З В 3 СУ 3 ке сх ї кох 5 з роя пІднбеко КК ВЕК КК КК КК. в я а її соя ЕЕ ж ХИШЕ ще Ко ПЕ с МЕ ОО ЛЕ шАХ ТОХЕ ХЛ о ХА ПММ лу их хи ЗВО
Фіг. 246 ЖЕпахожф фе уактак КВУ КОСУ. ач жтк мк ха ККУ юки яку КЕМЦУНИ МНЕ НЮ ВКА М ОБО ЖК ВВЕ Ж ПЕ ше З ВИ Лем : ШЕ І С лю Н ї ВА і Хуста М АК ник внанняаннний Ї ОК им 3 о п. ї ХиФИМ лю ЗОНУ З Нимем ха Ж хх хошосх оф хол тА ОКУ пф Кох ха му у КИМ ЕК КИМ ди ТЕЖ КуМ ЗАТ рої о Б ОБ Сх шОЖОВО ЖЕ 12 БР їЇ5 ЩОТУ ХЕ СТО ШЕ ХЕ ШК ОК ЕК ЖЖ Б ТИХО ЦЕ КІВ АЖ ОДУ ДЖ КО МЕ А ЗІ ЗИ УВУ ХІМІК МО БОЮ жо УО ВОЮ Ок КО ОО Ж ВО БО КО Ж КОМ ї т ОО шО МОЯ МшОШОТО ОО х ЖІН ЕТ МІК, Ж мо ож ек У - пе М хх оч ж п мо Мою м ж пи се, ЩЕ ле Б їм нн шо М шІОИЖ Кк ОМ Мо . Ми МЕТ ВА Ж жо ж ож ШКО ТО Ж МОХ БО МО ОХ ХО що м Ж х Х т. х ОО Ж ОлОЖжОтО ХО ОВ оОхХ Ох ЖМЕНЮ вм МОм ВУ тлом дм. ОО ОМ оо дж мо дол, шо Ж ТАБ КАВУ. Є мо жо ях СК ж ШИЮ ОО ЖЖ Ж ЩО хост ж. МОХ сп КО МОХ х х ож ЖЖ Ж ххх вкла з Ах іт слу маже шої УМ АЖ МОЮ дО ок о - У х й посох Ст о ХЕ ІЕМ т жЕБЕх х ХІІ КОЖ ОХ хх ї шЕОЖ МОЯ ОО кю й кОм МО У ком МО Мох жо кох ОО АІКЕ ККУ В и м «Її кА жав я хз шо їх т оз ож що я ж мот ко хо мо ХВ ВОПЛІ НМ х пе т щі я 5 ОЗ ОМ ож З ю їх З 105 Ж 5 ж їх ОО ЖОтОЗ ЩО ЖОВ тм пр ваню мик ЩШКо ОВшЕ шо ДН К Х ММУЖ М - шеодко икоожио ях оо Дко пу Х МЕП КМ ІЕЕ у МЕТУ. МЕЖ В т УВУ хОЖ ЛК МОСК ОХ ї т ЖоЖ ож жо Коло У КО тт сита дк мі у ші осв ж ко шо ша є У п ож ле доб Ко ж ло есть КО ох що Щ оо жо Ж сх хх що ша да вин МН и в он в п, нн о В В КИ Ю Ко ооо сом ооо о ов ев ово. ор ро В ї БЕЖ Меч ї Хек АКВА Кекк иа и КОМИ КЕКВ КОМУ Ж ОС МОМК ї Щек спайки дими Ат пром ж Ми Ж ожини ТЕКИ в м ско я мн Ко й ик а ач о в НК В КН НК НК НА Не ОЗ мок мих аа код пох ше дою ох 003 ЖК юс до ро шодо ек кож м до Ой шо жо фо око у хо МЕМ п Ж Ж ВО С ОК ОО Ж ОО ТО ЩО шодо ОВО т. х х шо Ж Мою М М ОКХ ПЕ Ки Ж ще й ро Ж я їж М МО мМ пос р МО мож мо мо п х МОм ок жо моду Зх же МО пох І ТК ЩФОБОЖ оо Б жо л щО 1 ОКО ОБОХ ж Ох ОО БО КОКО ОВО Тк Кт Б ху МЕМ І ох п шо В ОО В І ОКО ЖОВ ЖОВ я шої Ж ОД КОЖ КОЖ Я ОБО ШОВ З ЛОЖ КОЖ ОО Х вки т, т с КЕ і ТЕХ. 5. м їх - г. - г. їх св ния АЖ о шо в Ж ок м ко с же йо о ко ж о ОО що що йо жо олуту фо дохо то МЕМТМХ ПУХКИХ ХЕ ІЗ шАООмОМОСХОХ їх фах ЖК МО ХО МОЖ КОЮ Ж ОМ ШО жо Ом О Ж о тож Мох Оу Кох лики: дель т Км з кА ж Мжмкх М ММ МОХ Фо У х мо шк ко мем жо жк КО МОВИВ НЯ Бі 1 ОКО ОВО Ж Ж ож Ко ж Ох ОЛИВ ЖЖ. ЖОВ ОЖ ОХ я ЖОВ Ко пиівнищ пок ом МЕЖ жЕжі хо хо о шо оо хо Ом ЖЕО сю ви ж ум М: В БЕТА МИСТ МОМ ОХ БЕК БЕ 3 т КОЖ МОЯ ТО Ух З І ОО ОО мох хі МК 5 рожі шоу ко жосмовшю дшю Мм. шою ди жо й м Еф С Ж й кох ту ко ота В о міх тк МИРНА УВІМК Ох Ж БЕБКК ТР БО МО ОХ сх ХО щО КОХ Ж М Ж М х МО МО ФМ ою 153 ко дик ооо ее, СКК СЛАНІ 1 ї ВОШИМ ою МОШКТВЕИ 1 плину у у ї Ем пи З и АВ УК х ї ОКА. КК. т кн В сн філе за Кая ЩО Вл шу ку жо пе шт ВЕ МУКА ЩІ МУ М ЖК ПК о ймр о зш уАї Ол спо 2Жа ід йо Зах ІЗпмк ам МОВІ Ме БЖ ЖЖ БО ЛЕ ЖОМУ СТ ХЕ ОО ВІ ЗХ СБК ТИ ста Же ОТЖЕ У ІМ У ТЕ У АЖЯ ЗХ ЗЖБ ОБОХ МЕ и мо м юю сх охо ух х ко м. п - «ех - шо пря зЖ Ват подтМХу КИ АЖ ОО ОО Ж МОЖ с БОЖКО ХО Ж ОКО Ох їх Ох ЕХ АМКУ Мих и м що М КО мою йо ОЛИВОК мо мем мо гу с Фе ш х У с ЩИХ МК в: ВИ, МЕД ННЛЕМЕ АООЖОЖОЖО КОУ ТОЖ КОХ ЖЕУВВ ЖОВ ОК ОХ КОЖ. хОЖО Е хх ЩЕ ХМК ОХ. зма не М КІ мо ОО мок ск жо ЖИ ЖЕК шою шо мо шо п и й - х п Я л КЕ МК ква: ВК ЕММА З Же Ж шу ОО о ш пр їх ЖЕ Бо що Ж їх ЕЕ БУК ВК НЕОН В КОВО ОО ОК о БОоВРО Ж ше Ох З 4 БОЖІ х М БЕ ВХ лем ки вм мм м Мом ВК шо шо мою сг Ку Х х х ту у де В КК ВЕБ ЖУК В ОО Ж Ж ХК жі я ОК КОВО Ох: х хх хх ТУ МЕ МЕМ ЛУ ЗХ пе шик ЕХ ІОВ мої ммс вч дош ж ов ФИИ «ЕЛ ШКТ о, ОМ В Ж БІТ У жо шо Ж о ОК що Ж ЖОВ ОО шов ОЗ Ж лох ОК ЕК и , МЕТКИ ТІ важ ЖЕ Ж ОМ ж ЖЕК ОКО у хо х оо ТЕЖІ МК УК Мк вили т им и Ак в ж вд Же М. о М кю х т х ї т х ФК ІК Вт ВІК МЕ ТЕ І Ж Бі ЕТ їх в ОБО ЕХ Ох ХО Ж ОХ ОЖ ВО ТОК ж І КК
У. НІ оо о кн юю вва: Я 7 Мега с ЕН пт о Тео с АКОТ О То АКА ОТ р а у я плоті вологі рптот пот Ну с : УК яння око се вух ЩЕ Кри чу кодек ія Ло. мч ТУТ т Педіаельна ХУБЛІЕЕ ВМІКІХАВЕ І УЛ ИКТЬ ІТК НК уд мих І ЕАМНК ІЗ КМ МАМИНА жк вени или МОМ МИ КК Ми фев КУ йкню Ооо до о доя йооїи фроУК Ід. ЮК ЩЕ А У чоти шал я. болиу Шосе, зас м ІМК ТІ ди з здодкови ле іме дв ам 4 хо Ж ях 5 ОХ ОО МОМ БЖ ФВ ФХ ХУ МР 0 У ЖК ХР ШО ВК ОТ де с ШЕ ЖК ОБО МІВ ОВ І ОО БОЇВ ОЗ 2 ФУ там КЕ АДАМ оо т во що ДО ЩО ЩО т МО кю до тт мох що й жо шо ом Мох Мур ЕМ І м МОЖ ЮК КУ ЩО ВОВК ж Дол ХО КК ВО Ох ж я ХХ шо пет вимі око у толюоу йОБО Фе роя Зм ик о мок жом Ж шов ХО жо ж ою х ЕМО ЖАБ ЖК Ж о ХО Ж ДВ ОО Ж МОВ ОВС дош Бл ж Я хх ЕВ Ж хи по віж ни; ЗА Шо ле точок ях хх шою ож жо мо мох шо шо МО жо жк кО ж А оо ц Фо я чк пл Ж ЖОВ МОЮ ШВОМ ОКО В ОС ХЕ ОХ й ВХ ХК БОБ З КО Ж Во ХО МЕМ я ОЖ шовк я Ж ОМ З ШО ЖО ШО БО ОМ ОО МОХ ВОМОБ ходом Ох тОВО МОХ З Ж В Ж З в хх зи ВК по Ву ик их кю сю уж юю ж ко м жи Ж хх й ох ЛЕМ Ки Ж ЖД КЕ ЖОЖОМ ОВО Ж т Ж М хх БОЇ В ж хх й хх її їх КОХ шк ких яко ВшМих Вузи мок о М УМ кут Км жи ж та мо кою ж в мок В мок МА МОХ иа а ЖОМ од ої ЖОВ ОВО я шо Ж ОО 5 ОО ВО ЩО КО й я що ло т Ж 8 ЩА їх Ж В ХО З дощ ЗМК КК ВВ У ок жо ху. їх КОКО Ж мож см С МО мм СХ до ЖЖ КО Ко кю Ох мо ох М що Ж М ю ПЕКІН Ж ОС МО ОХ КОВО ОК ОО ШО ОКО КО ТОХ КОЮ ОТО ТО х х КМ: ОО МО 1 ВО дження жук тл и Кутя жк юююююююю кт нн ї ФЕВ ук ї і ХМК про ОВНА ї оон ЕК КК рн КАК ддетеиямя КОН МК ими реве мя с 1 М ме Ма і с. гу мишах да и ХК МИ Мі ЗМ ошИх ЗШ ОМИОЦК ЩЖО В пом КІ ШТ ХО ТІ ШО КО МОВО ТОМІ В тот ПІ УТ ШШО ЛФ ОВЕО КоОИ МО Мемжи а клини ЗЛЕ Ж ЕЕ В ЛЬ ОК ЖЕ ТК КОХ ЗОЛИ МЕ лІСЖК МУ АК Ж ЖОМУ БЕОЛЕ ЩО ТІСТх ТЗ ТОМУ УЖ ТЛО ТК ТЕСЖЕ ЖЕО В УДК М осмос ж зв ко МОЖ о км ж шо зх с зу юю ШСЗ УТ жо шо ук ох ЛЮ же хо док жо МО ом що М ПІНКА хом ЕК Ж Я ВХ ЖОВ ОХ Ох У ВК Ж ХХ Вт ху появи ж ож швом що що дО жо ож ВМ шо шок о ж МО дО ЩО о жу о и т ме ОХ Ми ВЕ ЖЖ АТ Ж хар жо в ВКМ Ж тв г ЕЕ ЕК Ж ТВ кош в ша М мо о мож мок жо мок АЗК ому о нок кОм Юм ско мо жк мо мл ую ж МИХ ХУТАТДЕМТІЙ Ха ж М ВО ХО ІЕЕ тож жо Ж Ж КОЖ. ж В КМ їх хх пе их ЕВ нимтя мово ж ту Зк шок ос мом 1 що ме яю шок хо що ко юю МО со охо до шо хож У Мо що її, Ух хх кох ОЕМ КММНЕМИ ОЕОшОЮ Ж МОЖ ОТ ОВОМОБ З о ХЕ ТО ХО ож Ж Ж ОВО їх 5 Б ХВ ХХ ВХ ВОК ВК х питома МК шо ес ж ем ОО ОВУ якому у шк уп дол ж Ох у хх що ВО ток: ЗНМ Х КД КОЖ ВО В ТОВ Ж шо ще ШО ХВ ОВ ОХ Ж ОО ОКО КОВОЯ ТО ОК ОВ Ж Я ОК охо ОВО ха ин жом охо мсМсУ хх ря ок ОМА лезу з ямою ях х х М т Кошжоскомх х жМх жо х - к сх. вач пал Вих ОО ЖК ож ЖЖ жо От У ож Ж ОМ жо КОХ лох ОО От їх : ВИЖЛМУММНУ ЖЕоО ЖОМО ВО ЖОВ Ж У УЖ КОХ ВОМУ ОХ М Кох В ОХ ВХ хх В МАХ феном КН М мо кош ЩІ ож ЖОМУ ВЕ ж хто м КО й м ЖЖ хо кох що В ко мк Мк пи ІМ ВО В я ВК В в ті у хх х ш хх В їх ххх ххх 7 МЕДИ МИ ИИУ МОХ МО КММЕК ООН ї КК кттетутн МОЖ Белая ЗИМ МО ОВК Фіжня я Мою М ло ЩІВІ ШИ ВЕ ШІ КО ШО а м Ом тт БЕЖ МЕТКИ ЩИТ Ж ПТО МИ са гріло са зп дк 1ЩА ме пз: ді Зіосликня за Мона ВЕЖ ІВ ЗОМ ЖЕ І ВК ОБО ЗООІО ЗІ ЗК Ж БЕ ЖЕ МКМ ЦЕ ПЕ І В КО ЗЕ ВЕ ВХ БЕ ЗІ ЛІ ел КН ШО кох хоКож мож ж моя мо 4 хо лом шо мо до хоп т оо мо хто зх ї кою як «п р жи КИ МИД ПОМ ТЕ шо ЩО Кох ОоЖ ОХ ВО туш КЕ їж х й ЩО КОМ т Ж У х ЖоОх ХАІ А ях У Мами ех пе ОКО ОО у ще о лю ЩО Ж Ж дом її п хо яром ох що х ї : п ФМ НА ва КУ пад ди ИН ЖЕО МОМ ОМ ХО ТЕ АЖ Ж ХОМ ВО ЩЕ ОО ЖЖ ВОВК КК ЧО ОК ЗХ вині а ІК я їх кВт В ЕВ Ж ЕЕ ВО В В Ох Ж Бо х БНО ЦК щИ ММК ЖМЛ КК ОО ЩО КОМ КО ХХ ВО ЖЖ ВОК Ж Я Ж хм ХО Ж ЕХ МЖК мату ин ом же ди дя мом що ж кю АВМ хх п рі как Зп ж хх їхав шт а І НВ ххх шов ВО ххх ВІ НМЛ дих ІК ВЕ ММ т. жу М м лю сх т шо ох ох м ММ мм: ши Не х ше ВН ЩЕ У. ЗНООЕ КК ТЕЖ Ж о ЖОВ ШО ОХ фо ХХ ВО О КОВО Ох Ж ОМ ях Ой Б МО ВЕБ шими ан хх шож ото шо шо ошой о що уж до шожо тод шою Ом шо ох дич кр ша ки, МЕН Ж МмоО Бофо В От ож х У ЖОВ ОЖ ДО Фо ДО Ж МОХ Я ОО до ОМ лох шЕОН ВК БІВ веж пами ши кс що жо Фо оож ю щоск ой ск КО ки щ шох х ом ко Божок ЖЕТИ ІК ших МФ пДМОш Уа ціх Ж Її ОБЖ Ж ШО КОЖ ж В по Ж т Ж й шк Я 5 ШО ЖЖ М МІЯ В БИ Кл
5. " Хо кК юю х 7 ч нн нн нн і КН В НН НН НН; и
Фіг. 258 ІГ, Мат ца хх ВЕУ М х ї Я ; : Її -е х ВТК о - : ЖЖ ХО. седощежоух ях т УК МАХ пе і ї я Ох Кр хх х їх Сх. С С Га : ї ХЕ ас піжм - 5 М Ж ох КОТ ди ї Ж око АК х кю шт я М УК ще БО ї ЗО Уж Ух. ЖімноМмев Ж ї ОК ОО ддухі ие ЖМу : БЕ с Оки зер ш ях ЕКО ТЕКСТ КО Кк сим, ї моде ЕНЯ т : МОХ й хх: : ХО п ожжк Ї х «У ОХ щу ЩО ГМИТ К КК ки, - Е т ОУН ТУ тт у з ти Ж х х с же т Е. в ЗУДЖМХ - Ще Во КОМ еге ем мес: ТЯ 0 3 «МА ДЕ па КУТ УК КУ КК КАК Ж кві кн єєнвкиі хх гу кт ліга м пен, ке сн сх «КАК У п ху ОЗ ду ТАК ТЕО ССТАЦК Жов шк ЗВ єю ЖДлете ох Кожну ї го як ї Її ух пити ї ще ер М Мо пу. В дух. Е 7 ШК, їх с: КО хх паж т ї КОХ Ж МОХ ОТМХ Кх ї їх: кб. Кк З у Ек ї її Б. схої ї Ж. ЕХ ї і два БУ : З дя НИ хелінкани ї ЕКЗ дл оон ММА 3 о Ей Мк З бе б щої ЖК й діа ЖЖ МИ ОТ оут: : й УКВ жтня ЗНО СЕ ЗК а Хе внУи і Б У МЗЕЦЕЖХ Шо СК кто, ВО а кю КА ж со й мо х й я т ! Кон КУ ї еко ПОМ т ї я КМ КК КМУ У УМ е-Х АККК її ке е ЛУ ель єнхучіктт ку ееткнк дккккчкннк ке кхнккненх кт кк ке ккжекккуКккнжекннї уже, -т ситу сухе мух Фох хтуухо «УМ холах «МО ХЕ ШИ я Б ЖЖ ЗО Цю Чака
Фіг. 958
UAA201907321A 2016-12-07 2017-12-06 Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування UA128383C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662431180P 2016-12-07 2016-12-07
PCT/US2017/064869 WO2018106781A1 (en) 2016-12-07 2017-12-06 Anti-tau antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128383C2 true UA128383C2 (uk) 2024-07-03

Family

ID=60703236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201907321A UA128383C2 (uk) 2016-12-07 2017-12-06 Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування

Country Status (20)

Country Link
US (3) US10711058B2 (uk)
EP (1) EP3551220B1 (uk)
JP (2) JP7193457B2 (uk)
KR (2) KR102587130B1 (uk)
CN (2) CN118165104A (uk)
AR (1) AR110321A1 (uk)
AU (1) AU2017373889B2 (uk)
CA (1) CA3044679A1 (uk)
CR (2) CR20230163A (uk)
ES (1) ES3021263T3 (uk)
IL (1) IL266911B2 (uk)
MA (1) MA48595A (uk)
MX (2) MX2019006334A (uk)
MY (1) MY198942A (uk)
PE (2) PE20191135A1 (uk)
SG (1) SG10201911351SA (uk)
TW (2) TWI787219B (uk)
UA (1) UA128383C2 (uk)
WO (1) WO2018106781A1 (uk)
ZA (1) ZA201903578B (uk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2970453B1 (en) 2013-03-13 2019-12-04 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
JP6793134B2 (ja) 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
PT3452507T (pt) 2016-05-02 2022-12-20 Prothena Biosciences Ltd Imunoterapia anti-tau
SG11201808434WA (en) 2016-05-02 2018-10-30 Prothena Biosciences Ltd Antibodies recognizing tau
MY198942A (en) 2016-12-07 2023-10-03 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
CN110248959B (zh) 2016-12-07 2023-06-30 基因泰克公司 抗tau抗体和使用方法
MA47499A (fr) 2017-02-17 2019-12-25 Denali Therapeutics Inc Anticorps anti-tau et leurs procédés d'utilisation
CN110881274B (zh) 2017-05-02 2024-11-15 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
TWI827557B (zh) 2017-10-25 2024-01-01 美商健生醫藥公司 Ｔａｕ胜肽之組成物及其用途
EP3920966A2 (en) 2019-02-08 2021-12-15 AC Immune S.A. Method of safe administration of phosphorylated tau peptide vaccine
CA3131531A1 (en) 2019-03-03 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
BR112021021213A2 (pt) 2019-04-24 2021-12-21 Ac Immune Sa Administração heteróloga de vacinas de tau
EP4146702A4 (en) * 2020-05-07 2024-07-10 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-tumor associated antigen antibodies and uses thereof
GB202010652D0 (en) * 2020-07-10 2020-08-26 Wista Lab Ltd Anti-tau antibodies
CN112694532B (zh) * 2021-01-12 2023-04-18 倍而达药业（苏州）有限公司 抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段及应用
WO2023079485A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-tau antibody compositions, dosage forms, and methods
US20250034559A1 (en) 2021-11-17 2025-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
AU2023342086A1 (en) 2022-09-15 2025-03-13 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2025085971A1 (en) * 2023-10-27 2025-05-01 The University Of Queensland Anti-tau therapeutic antibody for ad and tauopathies
WO2025122634A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2025134068A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Ac Immune Sa Antibody drug conjugates targeting proteinopathies, and uses thereof

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5811310A (en) 1986-09-30 1998-09-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva Univ. The Alz-50 monoclonal antibody and diagnostic assay for alzheimer's disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH08500962A (ja) 1992-02-06 1996-02-06 クリエイティブ バイオモレキュルズ，インコーポレイテッド 癌マーカー用生物合成結合蛋白質
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT2180007E (pt) 1998-04-20 2013-11-25 Roche Glycart Ag Engenharia de glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2568899T3 (es) 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
SI2857516T1 (sl) 2000-04-11 2017-09-29 Genentech, Inc. Multivalentna protitelesa in njihove uporabe
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1331266B1 (en) 2000-10-06 2017-01-04 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
NZ603111A (en) 2001-08-03 2014-05-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
EA012325B1 (ru) 2002-12-24 2009-08-28 Беллус Хелс (Интернэшнл) Лимитед Терапевтические составы для лечения болезней, связанных с наличием бета-амилоида
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk COMPOSITION OF CONDENSED PROTEINS
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
JP4653109B2 (ja) 2003-11-05 2011-03-16 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 高められたＦｃレセプター結合親和性及びエフェクター機能をもつＣＤ２０抗体
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
KR101245983B1 (ko) 2004-03-31 2013-06-28 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｔｇｆ-베타 항체
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PL1737891T3 (pl) 2004-04-13 2013-08-30 Hoffmann La Roche Przeciwciała przeciw selektynie p
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8679490B2 (en) 2005-11-07 2014-03-25 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
ES2399075T3 (es) 2006-08-30 2013-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos multiespecíficos
GB0624500D0 (en) 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
UA107571C2 (xx) 2009-04-03 2015-01-26 Фармацевтична композиція
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
CA3250882A1 (en) 2010-08-02 2025-11-29 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that Make Binding Proteins Comprising VL Domains
HUE027649T2 (en) * 2010-10-07 2016-10-28 Ac Immune Sa Antibodies recognising phospho-tau
EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2019-02-28 Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх Человеческие анти-тау антитела
AU2011349049B2 (en) 2010-12-22 2016-08-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
GB201112056D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Univ Leuven Kath Antibodies
SMT201800109T1 (it) 2011-09-19 2018-05-02 Axon Neuroscience Se Terapia a base di proteine e diagnosi di una patologia mediata da tau nella malattia di alzheimer
BR112014008202B1 (pt) * 2011-10-07 2022-01-04 Ac Immune S.A. Anticorpo, polinucleotídeo, composição farmacêutica, usos de um anticorpo, método in vitro, método de detecção da formação de um complexo imunológico, método de detecção post­mortem de multimêros do fosfo-tau, kits de teste, linhagem celular isolada e método de detecção de multimêros de fosfo-tau
MY178142A (en) * 2011-12-20 2020-10-05 Janssen Biotech Inc Anti-phf-tau antibodies and their uses
KR102132041B1 (ko) * 2012-04-05 2020-07-09 에이씨 이뮨 에스.에이. 인간화된 타우 항체
MY171473A (en) 2012-07-03 2019-10-15 Univ Washington Antibodies to tau
US9567395B2 (en) 2012-08-16 2017-02-14 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
WO2014031697A2 (en) 2012-08-21 2014-02-27 The Institute Of Molecular Medicine COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO DISEASES ASSOCIATED WITH DEPOSITS OF AMYLOID, TAU, AND α-SYNUCLEIN
US20140056901A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 The Institute For Molecular Medicine Anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
WO2014059442A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Arizona Board Agents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Antibody based reagents that specifically recognize toxic oligomeric forms of tau
SG10201705104UA (en) * 2012-12-21 2017-07-28 Biogen Int Neuroscience Gmbh Human anti-tau antibodies
US9039633B2 (en) 2012-12-24 2015-05-26 Transmed7, Llc Automated, selectable, soft tissue excision biopsy devices and methods
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
EP2970453B1 (en) 2013-03-13 2019-12-04 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
JP6568514B2 (ja) 2013-03-15 2019-08-28 エーシー イミューン エス．エー． 抗タウ抗体及び使用方法
MX370723B (es) 2013-06-10 2019-12-20 Ipierian Inc Anticuerpos anti-tau y usos de los mismos en el tratamiento de una tauopatía.
CN111569063A (zh) 2013-11-27 2020-08-25 伊皮埃里安股份有限公司 治疗tau病变的方法
LT3083680T (lt) 2013-12-20 2020-04-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanizuoti anti-tau(ps422) antikūnai ir jų naudojimo būdai
NZ630610A (en) 2014-02-14 2019-05-31 Ipierian Inc Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
TW202136296A (zh) 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
US10098973B2 (en) 2014-10-10 2018-10-16 National Research Council Of Canada Anti-tau antibody and uses thereof
US10323082B2 (en) 2014-10-14 2019-06-18 The Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Treatment of tauopathies by passive immunization targeting the N-terminal projection domain of tau
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2016137950A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Rpeptide, Llc Anti-tau antibodies
TWI669314B (zh) 2015-02-26 2019-08-21 美國禮來大藥廠 針對ｔａｕ之抗體及其用途
JP6793134B2 (ja) * 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
EP3307320A4 (en) 2015-06-12 2019-03-06 C2N Diagnostics LLC Stable formulations of humanized anti-tau antibodies
MA42377A (fr) 2015-07-06 2018-05-16 Ucb Biopharma Sprl Anticorps se liant à tau
US10344081B2 (en) 2015-07-06 2019-07-09 Ucb Biopharma Sprl Tau-binding antibodies
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
US20190224339A1 (en) * 2016-04-29 2019-07-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
SG11201808434WA (en) 2016-05-02 2018-10-30 Prothena Biosciences Ltd Antibodies recognizing tau
GEP20217222B (en) 2016-07-12 2021-02-10 Lundbeck A/S H Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
CN110248959B (zh) * 2016-12-07 2023-06-30 基因泰克公司 抗tau抗体和使用方法
MY198942A (en) 2016-12-07 2023-10-03 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
EP3601337A1 (en) 2017-03-28 2020-02-05 Genentech, Inc. Methods of treating neurodegenerative diseases

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230146126A (ko) 2023-10-18
CR20230163A (es) 2023-07-06
TW201821438A (zh) 2018-06-16
US11427629B2 (en) 2022-08-30
MY198942A (en) 2023-10-03
US20230043289A1 (en) 2023-02-09
JP2020511938A (ja) 2020-04-23
CR20190271A (es) 2019-09-03
JP7193457B2 (ja) 2022-12-20
MA48595A (fr) 2020-03-18
KR20190091274A (ko) 2019-08-05
CA3044679A1 (en) 2018-06-14
MX2019006334A (es) 2019-08-01
US10711058B2 (en) 2020-07-14
CN110290801B (zh) 2024-01-26
EP3551220A1 (en) 2019-10-16
PE20201186A1 (es) 2020-11-03
JP2023051929A (ja) 2023-04-11
PE20191135A1 (es) 2019-09-02
TW202328181A (zh) 2023-07-16
IL266911A (en) 2019-07-31
MX2024000300A (es) 2024-02-02
US20210122811A1 (en) 2021-04-29
ZA201903578B (en) 2020-12-23
CN110290801A (zh) 2019-09-27
SG10201911351SA (en) 2020-02-27
AR110321A1 (es) 2019-03-20
EP3551220B1 (en) 2025-01-29
KR102587130B1 (ko) 2023-10-11
AU2017373889B2 (en) 2025-01-02
JP7594574B2 (ja) 2024-12-04
ES3021263T3 (en) 2025-05-26
WO2018106781A1 (en) 2018-06-14
TWI787219B (zh) 2022-12-21
CN118165104A (zh) 2024-06-11
AU2017373889A1 (en) 2019-06-06
IL266911B2 (en) 2024-10-01
US20200017579A1 (en) 2020-01-16
IL266911B1 (en) 2024-06-01
EP3551220C0 (en) 2025-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128383C2 (uk) Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування
UA126272C2 (uk) Антитіло проти тау-білка та спосіб його застосування
JP6864763B2 (ja) アルツハイマー病におけるヒト化タウ抗体
RU2760334C2 (ru) Моноклональные антитела к альфа-синуклеину для предотвращения агрегации тау-белка
AU2017295608B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
TWI729992B (zh) 用於治療共核蛋白病的藥劑、用途及方法
KR102596852B1 (ko) 항-프로/잠재성-미오스타틴 항체 및 그의 용도
US11359021B2 (en) PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
EP3662931B1 (en) Therapeutic agent or prophylactic agent for dementia
KR101468397B1 (ko) 유방암을 치료하는 방법
ES2717908T3 (es) Anticuerpos S100A4 y usos terapéuticos de los mismos
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
UA126269C2 (uk) АНТИТІЛОПОДІБНИЙ ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИЙ БІЛОК, ЯКИЙ СПЕЦИФІЧНО ЗВ’ЯЗУЄТЬСЯ З ПОЗАКЛІТИННИМ ДОМЕНОМ CD3<font face="Symbol">e</font> ЛЮДИНИ І З CD123<font face="Symbol">e</font>
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
UA123053C2 (uk) Антитіло до рецептора трансферину зі спеціально підібраною афінністю
BR112021000353A2 (pt) inibidores de tgfb1 de alta afinidade, isoforma-seletivos, e seus usos
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA117608C2 (uk) Спосіб лікування еозинофільного захворювання у пацієнта шляхом застосування біспецифічного анти-il-13/il-17 антитіла
TW201716436A (zh) 特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法
EP4019046A1 (en) Isoform selective tgfbeta1 inhibitors and use thereof
EA012835B1 (ru) Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения
CN105143263A (zh) Bcma抗原结合蛋白
JP6913077B2 (ja) タウの｛ｐ｝Ｓｅｒ４０４エピトープに対し選択的な、抗体を基にした分子、ならびにタウ異常症の診断および治療におけるそれらの使用
UA123257C2 (uk) Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1