UA126384C2 - Антитіло, яке зв'язує cd3 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується мультиспецифічного антитіла, яке зв'язує CD3ẟε-антиген людини, його отримання і застосування з метою лікування та/або діагностики різних захворювань.

Description

Ммехх

З Ку Х й х З ї БУ в ІК БУ 1. КІ пика чи а а

КЕ уки В НИ ї

ДІВКА МЕНА Ген З ВВ ВК Еко ск ВИВВН І

ВЕК АКА рол А АКА ЛА ААУ ААКААААА АНАНАС ААААААААААХ ук ААААААААНН Я ї Ї т Я ї о у а а ї т ї

З ї | І : ва ва ма: ї Н ї

Цоллннуляняуктих, екон ШИНИ о ВЕ ДУУА Ж ф А АЖ ЖАЛА КАЖУ жАж ж Аж жжижня знах уянняня 0 0 ЕКО уми : : Н ІЗ : ї ска І НОЦИЦНКЯ

В НЕ Я ідеї : Н Н ї : ж лю но ТК

ШК о уро Мо В нка по жії де аа БО Роюв ї о шю р С здав іхкикамх Мо РОМ ОКолж рОщоріху ПД НехМ МА іМенКІ

З вежу КММОМХН КОКО АХ жи раком ГА СКК АК яти МЕШКО КЕ а ОН по ОО КАК ПАМ КТК ЖК жа АВ ПО р чик ЕКО ЗОН МОЯ МКК ОН Я рОжюеМУ З ОМ ГУТЖО КиМУ ЗА о КО КК, ПАК ОКОМ, ше 005 ши ефе ККМКК Еко ок о Б КАХ и о

ПОН Та шлемлитька ОБМАНУ о КЕ в Ки у ик КОХ о о океЕмюУв БО ВЕ ти и В

Ще п нн НО Ве Б 8. ХК АК МК

Жохдсхк Б и М тех ме спеки МЕ УВК В В АЖ жа шхї

ВО Мия «БМК ПО ЕМЕЯНОКА КОЧКАЄ Б с ЕВ ОА, «ВЕ

Е ЧИ я сек М ЗВО ЦИ ІЗ фен В КО В я х ОВ ЕН и ке ов ов

Я ЖК В ВЕ НЕКОРОЕНСКА КОЖ ПЕЕКМКК Ем Ж. Му

Ко ОК и З В НВ В В М У ї ОО Я ІЗ м М А НИ М

ЗОВ ОО и МЕ ТИМИ РУЖНИМА. рив МКК ж ОККО ке ПАМ МІ птн й со о вн ЗОВ ОБ х У се КК ее он

З дана Вк ОО оо о в В оо ВИНО

ВОМ. ОЗ КК МИС Е НОВА БОКИ у ОК У НН умі Ко коло п в ОО В о ПВ

ЕМВ о КИ п КК ОВ КК КК о ЕК

ОЖНЕ КК и Х НОЖЕМ ВККВ ЕЕ МИ й УВК ХК ЗОН КІ ПК Я

ПолоеесєоВ кс зон о и п а м МЕ В КК М МВ

М КИМ х МО К со ня В о В

Перехресне посилання

Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 62/394360, поданою 14 вересня 2016 року і попередньою заявкою на патент США Мо 62/491908, поданою 28 квітня 2017 року, які включені в цей документ за допомогою посилання в повному обсязі.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Імунна система організму служить захистом від інфекцій, травм і раку. Дві окремі, але взаємопов'язані системи, гуморальна та клітинна імунні системи, працюють разом, щоб захистити організм. Дія гуморальної системи опосередковується розчинними факторами, які називаються антитілами, які нейтралізують продукти, що визнаються організмом чужорідними.

Тоді як, клітинна система включає клітини, такі як Т-клітини і макрофаги, які видаляють і нейтралізують чужорідні вторгнення.

Активація Т-клітин має вирішальне значення для стимуляції імунних реакцій. Т-клітини демонструють імунологічну специфічність і спрямовують більшість клітинних імунних відповідей.

Хоча Т-клітини не секретують антитіла, вони необхідні для секреції антитіл В-лімфоцитами.

Активація Т-клітин вимагає участі ряду молекул клітинної поверхні, таких як рецепторний комплекс Т-клітин, і молекули СО4 або СО8. Антиген-специфічний Т-клітинний рецептор (ТКР) складається з дисульфід-зв'язаного гетеродимера, мембранного глікопротеїну з ланцюгами, альфа і бета (с і ВД) або гамма і дельта (у і б). ТКР нековалентно зв'язаний з комплексом інваріантних білків, позначених СОЗ.

Відомо, що Т-клітини демонструють сильну протипухлинну дію в численних експериментальних умовах. Антитіла, здатні ефективнозалучати Т-клітини проти пухлинних клітин, були доступні у вигляді біспецифічних антитіл, наприклад, спрямованих на антигени, асоційовані з пухлиною (ТАА - Штог-аззосіаїеа апіідеп) і агоністичні мембранні білки Т-клітин, такі як комплекс ТКР/СОЗ ії СО28. Ці біспецифічні антитіла здатні активувати Т-клітини незалежно від специфічностіїх ТКР, що призводить до специфічного лізису клітин, які мають відповідні ТАА.

ІОднак, хоча біспецифічні антитіла проти СОЗ можуть оперенаправляти лізис, опосередкований Т-клітинами, на злоякісні клітини, клінічні випробування із застосуванням бсАт (біспецифічних антитіл) на основі СОЗ показали високу токсичність у пацієнтів. Неспецифічна активація Т-клітин від бсАт може відбуватисяантиген-незалежним чином через взаємодію Ес/Ес- рецептора (БСК) або антиген-залежним чином, вразі якщо антиген експресується як на нормальних, так і на пухлинних клітинах. Обидва механізми можуть бути відповідальні за токсичність, що спостерігається в попередніх клінічних дослідженнях. (Див., наприклад, ГіпК і співавт. (1998 рік) Іпі. У. Сапсег 77 (2): 251-6; Бигреп і співавт. МоІесшаг Тнегару(2015 рію;234, 648-655). Через виникнення в результаті цього синдрому вивільнення цитокінів мали місце значні обмеження в розробці цих антитіл для терапевтичних цілей.

Взаємодія Т-клітинного рецептора (ТКР) з його пептид-МНеС-лігандомвизначає активність Т- клітини. Характеристики зв'язування цієї взаємодіїбули детально вивчені і було показано, що воно контролює функціюТ-клітин. Сила і природа взаємодії ТКР-пептид/мНео визначає, чи виконують Т-клітиниефекторніфункції або інактивуються і видаляються. Антитіла проти СОЗ активують Т-клітини шляхом зміниконформації СОЗеє-ланцюга і в залежності від епітопу можуть мати агоністичну або антагоністичну дію на Т-клітини (хУооп еї аї., 1994 Іттипйу 1: 563-569). У світлі значних побічних ефектів багатьох агоністів Т-клітин може виявитися кращим підтримувати сильні протипухлинні ефекти з одночасним зменшенням вивільнення прозапальних цитокінів. Однак, частково агоністичні анти-СОЗ-антитіла можуть субоптимально змінювати ланцюг СОЗє, що призводить до неефективної передачісигналу, і більшість анти-

СбОЗ-антитіл є повними агоністами для обох шляхів. Незрозуміло, чи можуть ціефекторніфункції бути розділені. Багато існуючих анти-СОЗ-антитіл (наприклад, ЗР-34, ОСНТІ, ОКТЗ) мають спорідненістьв діапазоні 1-50 НМ КО, однак це може бути не оптимальним для терапевтичного застосування.

СОЗ-специфічні антитіла і біспецифічні антитіла, отримані з них, забезпечуються цим винаходом.

Публікації

Антитіла проти СОЗ описані, наприклад, в патентах СШАМоМо 5585097; 5929212; 5968509; 6706265; 6750325; 7381803; 7728114. Біспецифічні антитіла зі специфічністю зв'язування СОЗ описані, наприклад, в патентах США МоМо 7262276; 7635472; 7862813; і 8236308, кожний з яких явно включений в цей документ за допомогою посилання.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Композиції та способи їх застосування надані для сімейства споріднених антитіл, які бо зв'язуються і активують передачу сигналів за допомогою СОЗ, наприклад, активацією СОЗ3-Т-

клітин. Це сімейство антитіл міститьнабір послідовностей СОК, як визначено в цьому документі.

Це сімейство антитіл забезпечує ряд переваг, які сприяють його корисності якклінічного лікарського засобу(ів). Антитіла в цьому сімействі включають членів з рядом афінностей зв'язування, що дозволяють вибирати конкретну послідовність збражаноюафінністю. Здатність точно налаштовувати афінність має особливе значення для керування рівнем активації СОЗ у індивіда, якого лікують, і, таким чином, для зниження токсичності.

У деяких варіантах здійснення анти-СОЗ антитіла володіють афінністю (КО) проти СОЗ в діапазоні від близько 10Єдо близько 107. Антитіла проти СОЗ, які мають афінність (КО) 50 нм або більше, 100 нМ або більше, 500 нМ або більше або 1 мкМ, або більше, можуть бути бажаними для більш точної імітації взаємодії ТКР/ГКГС (головний комплекс гістосумісності) і мінімізації вивільнення токсичних цитокінів при підтримці ефективного лізису пухлинних клітин.

У деяких варіантах реалізації винаходу антитіла проти СОЗ характеризуються або відбираються на зниження схильності індукувати вивільнення цитокінів при зв'язуванні з компетентною Т- клітиною, наприклад, для вивільнення ІЛ-2 і ІФН. Антитіла можуть бути відібрані для терапевтичного застосування, яке оптимізує знищення пухлинних клітин і знижене вивільнення цитокінів, наприклад антитіло, в сімействі послідовностей антитіл, описаних в цьому документі, індукує вивільнення цитокінів, яке становить меншніж близько половини від максимуму, що спостерігається для члена сімейства в порівняльному аналізі, ії може бути менше, наприклад, менше і близько 25 95 від максимуму, що спостерігається для члена сімейства в порівняльному аналізі У деяких варіантах реалізації винаходу пропонуються біспецифічні або мультиспецифічні антитіла, якімістятьщонайменше варіабельну ділянку важкого ланцюга з вказаного сімейства антитіл і можуть містити варіабельну ділянку важкого і легкого ланцюга, представлену в цьому документі. Біспецифічні антитіламістятьщонайменше варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, специфічного до білка, відмінного від СОЮЗ, і можуть містити варіабельну ділянку важкого і легкого ланцюга. У деяких таких варіантах реалізації винаходу друге антитіло специфічно зв'язується з антигеном, асоційованим з пухлиною, націлюючим антигеном, наприклад, інтегринами і тому подібним, патогенним антигеном, білком контрольної точки і тому подібним. Різні формати біспецифічних антитіл знаходяться в межах обсягу цього винаходу, включаючи, без обмеження, одноланцюгові поліпептиди, дволанцюгові поліпептиди,

Зо триланцюгові поліпептиди, чотириланцюгові поліпептиди і кратні їм.

Кожне зСОЗ-специфічних антитіл містить домен МН, що містить послідовності СОКІ1, СОК2 і

СОКЗ в каркасі МН людини. Послідовності СОКсімейства 2 можуть бути розташовані, наприклад, в ділянці близько амінокислотних залишків 26-33; 51-58; і 97-112 для СОКІ, СОК2 і

СОКЗ, відповідно, наданих типових послідовностей варіабельної ділянки, викладених в ЗЕО ІЮ

МО: 1-18. Фахівцю в цій галузі техніки повинно бути зрозуміло, що послідовності СОМ можуть перебувати в іншому положенні, в разі якщо обрана інша каркасна послідовність, хоча зазвичай порядок послідовностей буде залишатися тим же.

Послідовності СОК для антитіла сімейства 2 за цим винаходомможуть мати такі формули послідовності. Х позначає варіабельну амінокислоту, яка може являти собою специфічні амінокислоти, як зазначено нижче.

Сов

Си Ег Тз Еа Х5 Хв У7 Ав при цьому:

Хо5може бути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хзхявляє собою 0, А або Н, в деяких варіантах реалізації винаходу Ххявляє собою 0.

Хв можебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хе являєсобою 0 або М; в деяких варіантах реалізації Осявляє собою 0.

У деяких варіантах реалізації послідовність СОК1І анти-СОЗ антитіла сімейства 2 містить

БО послідовність приведену в будь-який 5ЕО ІЮ МО: 1-18, залишки 26-33 сов2

І" Зи Муз: Ме З Св З Їв'

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОК2 антитіла проти СОЗ сімейства 2 містить послідовність, визначену в будь-який з ЗЕО ІЮ МО: 1-18, залишки 51-58.

СсовЗ

АгКгОзбаиНе ву Ов" Хо Х"Х1і2б13'Си2 Ат Мів" при цьому:

Хеможебути будь-якою амінокислотою, в деяких варіантах реалізації винаходу Хеявляє собою 0 або 5; в деяких варіантах реалізації винаходу Хо"являєсобою Ю;

Хі "можебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хі: "являєсобою РЕ або 5;

Хіг "можебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хіг2 "являєсобою І або г;

У деяких варіантах реалізації винаходупослідовність СОЗ анти-СОЗ антитіла сімейства 2 має формулуляя коза рмухХехХ:іг о б А У, де Хі и Хіг'є такими, як визначено вище. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОВЗ анти-СОЗ антитіла сімейства 2 містить послідовність представлену у будь-якій з 5ЕОІЮМО 1-18, залишки 97-112.У деяких варіантах реалізації винаходу СОЗ-зв'язуючий домен МН антитіла сімейства 2 пов'язаний з доменом варіабельної ділянки легкого ланцюга. У деяких таких варіантах реалізації винаходу легкий ланцюг являє собою фіксований легкий ланцюг.

У деяких варіантах реалізації винаходу легкий ланцюг містить домен МІ. з послідовностями

СОКІ1, СО2 ії СОРЗ в каркасі МІ. людини. Послідовності СОМ. можуть бути тими, якінаведені в

ЗБО І МО 19. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКІ містить амінокислотні залишки 27-32; 50-52; 89-97 для СОКІ, СОК2, СОКЗ відповідно.

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовності СОК антитіла за цим винаходом являють собою послідовність з щонайменше 8595 ідентичністю, щонайменше 90 95 ідентичністю, щонайменше 9595 ідентичністю, щонайменше 9995 ідентичністю відносно послідовності СОМ або набору послідовностей СОК в 5ЕО ІЮ МО: 1-18. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКза цим винаходом містить одну, дві, три або більше амінокислотних замін по відношенню до послідовності СОК або набору послідовностей СОЄ. в будь-якій з ФЕО ІЮ МО: 1-18. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначена амінокислотна заміна(ни) являє собою одну або більше в положенні 5 або 10 у СОКІ1, положенні 2, 6 або 7 у

СОК2, положенні 1, 8, 9 або 10 у СОКЗ відносно формул сімейства 2, наведених вище.

У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічне антитіло за цим винаходоммістить

СОЗ-зв'язуючу варіабельну ділянку, описану в цьому документі, спарену з легким ланцюгом. У деяких варіантах реалізації винаходу легкий ланцюг містить послідовність варіабельної ділянки,

Ко) викладену в 5ЕО ІЮ МО:19, або варіабельну ділянку, яка містить набір послідовностей СОР. в

ЗБО І МО 19, ї каркасні послідовності. Різні послідовності Ес знаходять застосування, включаючи, але не обмежуючись, людські Ідс1, Ідсга, Ідс26Б, ІдСЗ3, Ідс4 і тому подібні. У деяких варіантах реалізації винаходу друге плече біспецифічного антитіла містить варіабельну ділянку, яка специфічно зв'язується з антигеном, асоційованим з пухлиною. У деяких варіантах реалізації винаходу друге плече біспецифічного антитіла містить варіабельну ділянку, яка специфічно зв'язується з ВСМА. У деяких варіантах реалізації винаходу плече проти ВСМА є одноланцюговою варіабельною ділянкою, наприклад, як зображено нафіг 28. У деяких варіантах реалізації винаходу плече до ВСМА містить послідовність варіабельної ділянки, викладену в 5ЕО ІЮО МО: 20; або тандемну послідовність варіабельної ділянки, викладену в ХЕО

ІО МО 21. Послідовність Ес плеча до ВСМА може являти собою, без обмеження, Ідс1, Ідсга,

ІЧ9о26, ІдО3, ІД54 людини тощо. Послідовності СОК можуть бути тими, які містяться в ЗЕО ІЮ

МО:20. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОК містить амінокислотні залишки 26-33; 51-58; 97-108 для СОК1, СОК2, СОКЗ відповідно.

В інших варіантах реалізації винаходу пропонуються фармацевтичні композиції, що містять щонайменше СОЗ-зв'язуючий домен МН за цим винаходом, наприклад, моноспецифічне, біспецифічне тощо антитіло або антитілоподібний білок, що містить щонайменше СО3- зв'язуючий домен МН за цимвинаходом; і фармацевтично прийнятний наповнювач. Композиція може бути ліофілізована, суспендована в розчині тощо. | може бутипредставлена у вигляді стандартної дози.

У деяких варіантах реалізації винаходу пропонується спосіб лікування раку, що включає введення індивіду, що має для цього показання, ефективної дози моноспецифічного, біспецифічногої тому подібногоантитіла за цим винаходом. Коли антитіло є біспецифічним, друга антигензв'язуюча ділянка може специфічно зв'язувати пухлинний антиген, білок контрольної точки тощо. У різних варіантах реалізації винаходу рак вибраний з групи, що складається з раку яєчників, раку молочної залози, шлунково-кишкового тракту, раку головного мозку, раку голови і шиї, раку передміхурової залози, раку товстої кишки, раку легенів, лейкемії, лімфоми, саркоми, карциноми, пухлин нервових клітин, плоскоклітинного раку, ембріонально- клітинних пухлин, метастазів, недиференційованих пухлин, семіном, меланом, мієлом, нейробластом, пухлин змішаних клітин і неоплазий, викликаних інфекційними агентами. бо У деяких варіантах реалізації винаходу пропонується спосіб лікування інфекційного захворювання, що включає введення індивідууму, що має для цього показання, ефективної дози моноспецифічного, біспецифічного і тому подібного антитіла за цим винаходом. Коли антитіло є біспецифічним, друга антигензв'язуюча ділянка може специфічно зв'язувати патогенний антиген, наприклад, бактерії, віруси або паразити.

В інших варіантах реалізації винаходу спосіб отримання біспецифічного антитіла за цим винаходом, що включає експресію послідовностей антитіла, наприклад, однієї або більше кодуючих послідовностей легкого ланцюга, однієї або більше кодуючих послідовностей важкого ланцюга в одній клітині-господарі. У різних варіантах реалізації винаходу клітина-господар може являти собою прокариотичну або еукаріотичну клітину, таку як клітина ссавця.

Короткий опис графічних матеріалів

Цей винахід найкраще буде зрозумілим з подальшого докладного опису при читанні разом з доданими графічними матеріалами. Файл патенту або заявкиміститьщонайменше одне графічне зображення, виконане в кольорі. Копії цього патенту або патентної заявки з кольоровим графічним матеріалом(ми) будуть надані патентним відомством за запитом і після сплати необхідного внеску. Слід підкреслити, що відповіднодовстановленої практики відповідно до загальноприйнятої практики, різні об'єкти графічних матеріалів проілюстровані без дотримання масштабу. Навпаки, розміри різних об'єктів довільно збільшені або зменшені для чіткості. В графічні матеріали включені наступні фігури.

Фіг. 1А-160. Нафіг. 1ТАпроілюстровано вирівнювання ділянок СОКІ, 2 і З членів сімейства 2 антитіл з БЕО ІО МО: 1-18, які специфічно зв'язуються з СОЗ людини і відповідають залишкам 26-33; 51-58; і 97-112. На Фіг. 1Впроілюстровані ділянки СОКІ, 2 і З фіксованого легкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 19); і типова послідовність проти ВСМА (5ЕО ІЮ МО: 20 і 5ЕО ІЮ МО: 21).

Фіг. ІСдемонструє послідовності СОК еталонного анти-СОЗ антитіла(5ЕО ІЮ МО: 22), ІЮ 304704.

На Фіг. 2А-2Епроілюстрованісхематичні моделі біспецифічних антитіл людини. На фіг. 2Апроілюстровано біспецифічне антитіло проти СЮОЗ:пухлинного антигену з спільним легким ланцюгом (всього З унікальні ланцюги). На Фіг. 2Впроілюстровано біспецифічне антитіло проти

СОЗ:пухлинного антигену з 2 унікальними легкими ланцюгами (всього 4 унікальні ланцюги). На

Фіг. 2Спроілюстровано біспецифічне антитіло проти СОЗ:'пухлинного антигену з важким ланцюгом тільки пухлинного антигензв'язуючого домену (3 унікальні ланцюги). На Фіг.

Зо 2Опроілюстровано біспецифічне антитіло проти СОЗ:пухлинного антигену з пухлинним антигензв'язуючим доменом 5сЕм (всього З унікальні ланцюги). На Фіг. 2Епроілюстровано біспецифічне антитіло проти СОЗ:пухлинного антигену з зв'зєуючим доменом 5сЕм проти СОЗ (всього З унікальні ланцюги).

Фіг. 3. Таблиця даних по анти-СОЗ сімейства 2, узагальнює поведінку антитіл проти СОЗ в моноспецифічному і біспеціфічномуформаті. У колонці 1 показаний ідентифікатор послідовності для послідовності МН проти СОЗ3. У колонці 2 показано значення СіФ для зв'язування клітинамиуигКаївихідного моноспецифічного (антитіла) проти СОЗ3. У колонці З показано значення СіФ для зв'язування Т-клітинамияванського макакавихідного моноспецифічного (антитіла) проти СОЗ3. У колонці 4 показано назву біспецифічного антитіла абрз3авсмА. У колонці 5 показані пікограми ІЛ-2,що вивільняєтьсявсіма Т-клітинами, які були стимульованими біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. Уколонці б показані пікограми ІЛ-б, що вивільняєтьсявсіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 7 показані пікограми ІЛ-10,що вивільняєтьсявсіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 8 показані пікограми ІФН-у, що вивільняється всіма Т- клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 9 показані пікограми ФНПа, що вивільняєтьсявсіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 1ОпоказанаєгкК5о лізису пухлинних клітин 0266, опосередкованого біспеціфічними антитілами, в присутності всіх Т- клітин людини. У колонці 11 показаний відсоток лізису пухлинних клітин 0266, в присутності біспецифічного антитіла і всіх Т-клітин людини при дозі 333 нг/мл біспецифічного антитіла. У колонці 12показанаафінність білкового зв'язування плеча проти СОЗ біспецифічного антитіла, виміряна за допомогою Осіеї У колонці 13 показано значення СіФ для зв'язування клітинамиигкаї біспецифічного антитіла.

Нафіг. 4проілюстрованийопосередкований біспеціфічними антитілами лізис пухлинних клітин. Сім біспецифічних антитіл «СОЗ Тат2:авсмА, кожне з унікальним плечем проти СОЗ і загальним плечем проти ВСМА, були протестовані на здатність вбиватипухлинні клітини 0266 бо ВСМАх за допомогою перенаправлення активованих первинних Т-клітин. В цьому експерименті клітини 266, які експресують ВСМА, змішували зактивованимивсіма Т-клітинами в співвідношенні Е:Т 10:11 разом з додаванням біспецифічного антитіла. Вісьх демонструє концентрацію антитіла, що застосовується, а вісь у демонструє 95 лізису пухлинних клітин через 6 годин після додавання антитіла.

Нафіг. 5проілюстрована біспеціфічнаактивність знищення 0266, що корелює з вивільненням

ІЛ-2. Порівняння активності лізису пухлинних клітин, опосередкованої біспеціфічними антитілами, з вивільненням цитокінів ІЛ-2 зображено на діаграмі розсіювання. Кореляція між продукуванням ІЛ-2 і лізисом пухлинних клітин 0266 становить К2--0,37.

Нафіг. бпроілюстрованабіспеціфічна активність знищення 0266, що корелює з вивільненням

ІФН-у. Порівняння активності лізису пухлинних клітин, опосередкованої біспеціфічними антитілами, з вивільненням цитокінів ІФН-узображено на діаграмі розсіювання. Кореляція між продукуванням ІФН-у і лізисом пухлинних клітин 0266 становить К2-0,53.

Нафіг. 7проілюстрованабіспеціфічнаактивність знищення 0266, що корелює з афінністю зв'язування з СОЗ3. Порівняння активності лізису пухлинних клітинО2бб, опосередкованої біспеціфічними антитілами зафінністю зв'язування з СОЗ, зображено на діаграмі розсіювання.

Кореляція між ЕК5О знищення 0266 і афінністю зв'язування білка становить К2-0,93.

На Фіг. ВА-8Опроілюстрований опосередкований біспеціфічними антитілами лізис пухлинних клітин. Біспецифічні антитіла ОСОЗ Е1Р:авсмА аналізували на здатність знищувати три різних лінії пухлинних клітин ВСМАх ії одну лінію ВСМА-негативних клітин шляхом перенаправлення активованих вихідних Т-клітин. В цьому експерименті пухлинні клітини змішували зактивованимивсіма Т-клітинами в співвідношенні Е:Т 10:11 разом з додаванням біспецифічного антитіла. На Фіг. ВА проілюстровано знищення клітин КРМІ-8226, на Фіг. 88 проілюстровано знищення клітин МСІ-НО29, на Фіг. 8С проілюстровано знищення клітин О-266 і на Фіг. 80 проілюстровано знищення клітин К562, негативний контроль. Вісь х демонструє концентрацію антитіла, що застосовується, а вісь у демонструє 95 лізису пухлинних клітин через 6 годин після додавання антитіла.

На Фіг. 9А-9Опроілюстрованоопосередковане біспеціфічнимиантитілами вивільнення ІЛ-2.

Рівень вивільнення цитокінів ІЛ-2 вимірювали після культивування Т-клітин людини в спокої з різними лініями пухлинних клітин і дозамибіспецифічного антитіла аСОЗ3 ГЕТЕ: авсмА, які

Зо збільшувались. Нафіг. ЗАпроілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами КРМІ-8226, нафФіг. 9Впроілюстровано вивільнення 1ІЛ-2, стимульоване клітинами МСІ-НО29, нафіїг. 9Спроілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами О-266 і нафФіг. "Опроілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами К562, негативний контроль.

На Фіг. Т0А-10Опроілюстровано опосередковане біспеціфічними антитілами вивільнення

ІФН-у. Рівень вивільнення цитокіну І?ФН-у вимірювали після культивування Т-клітин людини в спокої з різними лініями пухлинних клітин і збільшуваними дозами біспецифічного антитіла сСОо3 ЕТ1РгавсмА. На Фіг. 10А проілюстровано вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами

АРМІ-8226, на Фіг. 108 проілюстровано вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами МСІ-НЗ2г9О, на Фіг. 10С проілюстровано вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами О-266 і на Фіг. 100 проілюстровано вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами К5Б62, негативний контроль.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Щоб полегшити розуміння цього винаходу, ряд термінів визначено нижче.

Перед описом даних активних агентів і способів, слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретною описаної методологією, продуктами, пристроями і факторами, оскільки такі способи, пристрої і склади, звичайно, можуть видозмінюватися. Слід також розуміти, що застосовується в цьому документі термінологія призначена тільки для опису конкретних варіантів реалізації винаходу і не призначена для обмеження обсягу цього винаходу, який буде обмежено лише запасною формулою винаходу.

Необхідно відзначити, що в цьому документі і в поданій формулі винаходу форми однини включають позначені об'єкти у множині, якщо інше безпосередньо не випливає з контексту.

Таким чином, наприклад, посилання на "потенційний лікарський препарат" відноситься до одного або більше таких потенційних кандидатів, а посилання на "спосіб" включає посилання на еквівалентні етапи і способи, відомі фахівцям в цій галузі техніки, і так далі.

Якщо не вказано інше, всі вжиті в цьому документі технічні та наукові терміни мають значення, які зазвичай припускаються фахівцем в цій галузі техніки, до якої належить винахід.

Всі публікації, згадані в цьому документі, включені в цей документ за допомогою посилання з метою опису і розкриття пристроїв, складів і методів, які описані в публікації і які можуть застосовуватися в зв'язку з описаним вище винаходом.

У разі, коли передбачений діапазон значень, слід розуміти, що кожне проміжне значення, до 60 десятої одиниці нижньої межі, якщо з контексту явно не випливає інше, між верхньою і нижньою межею цього діапазону і будь-яке інше вказане або проміжне значення в цьому зазначеному діапазоні охоплюються в межах винаходу. Верхня і нижня межа цих менших діапазонів можуть бути незалежно включені в менші діапазони, а також включені в цей винахід, з урахуванням будь-якої конкретно виключеної межі в зазначеному діапазоні. У тих випадках, коли зазначений діапазон включає одне або обидва з цих меж, в винахід також включені діапазони, що виключаютьбудь-який або обидва з цих включених меж.

В подальшому описі викладені численні конкретні подробиці з метою забезпечення більш повного розуміння цього винаходу. Однак для фахівця в цій галузі техніки буде очевидно, що цей винахід може застосовуватися на практиці і без однієї або більше зазначених конкретних подробиць. В інших випадках загальновідомі особливості та процедури, добре відомі фахівцям в цій галузі техніки, що не описуються з метоюуникнення труднощі розуміння винаходу.

Зазвичай в цьому винаході застосовуються загальноприйняті способи синтезу білка, культури рекомбінантних клітин і виділення білка і методи рекомбінантних ДНК, відомі фахівцям в цій галузі техніки. Такіметоди детально описані в літературі, див., наприклад, Мапіаїй5, Егіївсп б ЗатьгооК, МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї! (1982 рік); ЗатргоокК, ВиззеїЇ апа Затьгоок,

Моїіесшіаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї (2001 рік); Напом, ІГапе апа Напом/, Овіпуд Апііїродієв: А

І абогаїогу Мапиа!: Ропабіе Ргоїосої Мо. І, Соїд Зргіпуд Нагїбог І арогаїогу (1998 рік); і Напомж апа

І апе, Апіібодієв: А І арогаїгу Мапиаї, Соїа 5ргіпуд Натог І арогаїогу; (1988 рік).

Визначення термінів

Під терміном "що містить" мається на увазі, що перераховані елементи потрібні для композиції/способу/набору, однак для формування композиції/способу/набору і тому подібного в рамках формули винаходу можуть бути включені і інші елементи.

Під терміном "складається по суті з" мається на увазі обмеження рамок описаної композиції або способу зазначеними матеріалами або поетапними діями, що не мають істотного впливу на основну і нову характеристику (характеристики) об'єкта винаходу.

Під терміном "що складається з" мається на увазі виключення будь-якого елементу, поетапної дії або інгредієнта, не вказаного в формулі винаходу, з композиції, способу або набору.

Терміни "лікарський засіб", "лікування" і тому подібне використовуються в цьому документі

Зо для загального позначення бажаного фармакологічногота/або фізіологічного ефекту. Ефект може бути профілактичним в сенсі повного або часткового запобігання захворювання або його симптому, та/або терапевтичним в сенсі часткового або повного лікування захворювання та/або небажаного ефекту, що відноситься до вказаного захворювання. Термін'лікування" в цьому документі охоплює будь-яке лікування захворювання у ссавця, і включає: (а) профілактику виникнення захворювання у суб'єкта, який, можливо, схильний до цього захворювання, проте якому не поставлений діагноз цього захворювання; (Б) інгібування захворювання, тобто, зупинку його розвитку; або (с) полегшення захворювання, тобто, регресію захворювання.

Терапевтичний агент можна вводити до, під час або після початку захворювання або травми.

Лікування поточного захворювання, при якому лікування стабілізує або послаблює небажані клінічні симптоми у пацієнта, становить особливий інтерес. Таке лікування бажано виконувати до повної втрати функції уражених тканин. Лікарський засіб, що розглядається, можна вводити під час симптоматичної стадії захворювання, і, в деяких випадках, після симптоматичної стадії захворювання. "Терапевтично ефективна кількість" означає кількість активного агента, необхідну для отримання терапевтичного сприятливого ефекту у суб'єкта. Наприклад, "терапевтично ефективна кількість" являє собою кількість, яка індукує, полегшує або іншим чином викликає поліпшення патологічних симптомів, прогресування захворювання або фізіологічних станів, асоційованих із захворюванням або, або поліпшує стійкість до розладу.

Терміни "суб'єкт", "індивід" і "пацієнт" в цьомудокументі використовуються на рівних підставах і відносяться до ссавця, що проходить оцінку на предмет лікування та/або проходить лікування. В одному варіанті реалізації ссавець є людиною. Терміни'суб'єкт", "індивід" і "пацієнт" без обмежень охоплюють індивідів з раком, аутоїмунними захворюваннями, патогенними інфекціями і тому подібним. Суб'єкти можуть бути людьми, але включають і інших ссавців, особливо придатних для застосування в якості лабораторних моделей захворювань людини, наприклад, миша, щуртощо.

Терміни "рак", "новоутворення" і "пухлина" застосовуються в цьому документі як взаємозамінні для позначення клітин, які демонструють автономний нерегульований ріст таким чином, що вони демонструють аберантний фенотип зростання, що характеризується значною втратою контролю над проліферацією клітин. Клітини, що становлять інтерес для виявлення, бо аналізу або лікування в цій заявці, включаютьпередракові(наприклад, доброякісні), злоякісні,

передметастатичні, метастатичні і неметастатичні клітини. Відомий рак практично кожної тканини. Фраза "ракове навантаження" відноситься до кількості ракових клітин або об'єму раку у суб'єкта. Відповідно, зниження ракового навантаження означає зменшення кількості ракових клітин або об'єму раку у суб'єкта. В цьому контексті термін "ракова клітина" відноситься до будь- якої клітині, яка являє собою ракову клітину або отримана з ракової клітини, наприклад, клону ракової клітини. Фахівцям в цій галузі техніки відомі багато типів ракових захворювань, включаючи солідні пухлини, такі як карциноми, саркоми, гліобластоми, меланоми, лімфоми, мієломи тощо, і циркулюючі злоякісні новоутворення, такі як лейкемії, включаючи, зокрема, В- клітинні лейкемії, Т-клітинні лейкемії тощо. Приклади раку включають, але без обмежень, рак яєчників, рак молочної залози, рак товстої кишки, рак легенів, рак простати, гепатоцелюлярний рак, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, рак сечовивідних шляхів, рак щитовидної залози, рак нирки, карциному, меланому, рак голови та шиї і рак головного мозку.

Терміни "антитілозалежна клітинноопосредкована цитотоксичність" і "АЗКЦ" відносяться до реакції, опосередкованої клітинами, в якій неспецифічні цитотоксичні клітини, які експресують рецептори Ес, такі як природніклітини-кілери, нейтрофіли і макрофаги, розпізнають зв'язане антитіло на цільовій клітині і викликають лізис цільової клітини. Активність АЗКЦ може бути оцінена ззастосуванням способів, таких як описані в патенті СШАМе5821337. АЗКЦ відноситься до антитілозалежного клітинноопосредкованого фагоцитозу. "Ефекторні клітини" являють собою лейкоцити, які експресують один або більше рецепторів константної ділянки і виконують ефекторні функції. "Цитокін" являє собою білок, що вивільняється однією клітиною для впливу на іншу клітину у якості міжклітинного медіатора. Цитокіни, що становлять інтерес, включають, без обмеження, цитокіни, які вивільняються з активованих Т клітин, наприклад ІЛ-2, ІФН-у та ін.

Термін "неїммуногенний" відноситься до матеріалу, який не ініціює, не провокує і не посилює імунну відповідь, при цьому імунна відповідь включає в себе адаптивну та/або вроджену імунну відповідь.

Термін "виділений" означає, що матеріал видобутий зі свого вихідного оточення (наприклад, природного середовища, якщо він зустрічається в природних умовах). Наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній в живій тварині, не є виділеним, але той же полінуклеотид або поліпептид, відокремлений від матеріалів, спільно з ним присутніх в природній системі, є виділеним. Такі нуклеотиди можуть входити до складу вектора, та/або такі полінуклеотіди або поліпептиди можуть входити до складу композиції, і як ії раніше бути виділеними в тому сенсі, що такий вектор або композиція не є частиною їх природного оточення.

Під терміном "фармацевтично прийнятна речовина" мають на увазі допоміжну речовину, яку можна застосовувати при отриманні фармацевтичної композиції, і яка є в цілому безпечною, нетоксичною і бажаною; цей термін включає допоміжні речовини, прийнятні як для ветеринарного використання, так і для фармацевтичного використання для лікування людей.

Такі допоміжні речовини можуть бути твердими, рідкими, напіврідкими або, в разі аерозольної композиції, газоподібними.

Під терміном "фармацевтично прийнятні солі і складні ефіри'мають на увазі солі і складні ефіри, які є фармацевтично прийнятними і володіють бажаними фармакологічними властивостями. Такі солі включають солі, які можуть утворюватися при реакції кислих протонів, присутніх в сполуках, з неорганічними або органічними основами. Відповідні неорганічні солі включають солі, утворені лужними металами, наприклад, натрієм і калієм, магнієм, кальцієм і алюмінієм. Відповідні органічні солі включають солі, утворені органічними основами, наприклад, амінними основами, наприклад, етаноламіном, дієтаноламіном, триетаноламіном, трометаміном, М-метилглюкаміном і тому подібним. Такі солі також включаютькислотно- адитивні солі, утворені неорганічними кислотами (наприклад, соляною і бромистоводневої кислотою) і органічними кислотами (наприклад, оцтовою кислотою, лимонною кислотою, малеїновою кислотою і алкан-і аренсульфоновими кислотами, наприклад, метансульфоновою кислотою і бензолсульфоновою кислотою). Фармацевтично прийнятні складні ефіри включають ефіри, утворені з карбокси-, сульфонілокси- і фосфоноксигрупп, присутніх в сполуках, наприклад, С':-є алкілові ефіри. При наявності двох кислотних груп фармацевтично прийнятна сіль або складний ефір може являти собою монокислоту-моносіль або складний ефір або подвійнусіль, або складний ефір, і, аналогічним чином, при наявності більш ніж двох кислотних груп, деякі або всі з таких груп можуть перебувати в вигляді солі або етерифікованому вигляді.

Сполуки, назви яких вказані вцьому винаході, можуть бути присутніми за межами у формі солі 60 або складного ефіру, або у формі солі та/"або складного ефіру, і мається на увазі, що найменування таких сполук включають як вихідну сполуку (не сіль і не складний ефір), так і її фармацевтично прийнятні солі і складні ефіри. Крім того, деякі сполуки, назви яких вказані вцьому винаході, можуть бути присутніми в більш ніж одній стереоіїзомерной формі, і мається на увазі, що найменування таких сполук включають всі поодинокі стереоізомери і всі суміші (рацемічні або інші) таких стереоізомерів.

Терміни "фармацевтично прийнятний", "такий, що фізіологічно переноситься" і їх граматичні форми по відношенню до композицій, носіїв, розріджувачів і реагентів застосовуються на рівних підставах і означають, що зазначені матеріали можна вводити або наносити на організм людини без небажаних фізіологічних ефектів, які могли б стати на заваді введенню композиції. "Гомологію" між двома послідовностями визначають за ідентичністю послідовностей. Якщо дві послідовності, які повинні порівнюватися одна з одною, відрізняються по довжині, ідентичність послідовності переважно відноситься до відсотку нуклеотидних залишків коротшої послідовності, які ідентичні нуклеотидним залишкам довшої послідовності. Зазвичай ідентичність послідовностей можна визначати за допомогою комп'ютерних програм, таких як програма Везййї (Умізсопзіп Зедиепсе Апаїузіз РасКаде, версія 8 для Опіх, Сепеїййс5 Сотршег

Сгоир, Опімегейу Кезеагсп Рагк, 575 Зсіепсе Огіме Мадібзоп, ММі5. 53711). Програма Везнії застосовує локальний алгоритм гомології Сміта-Уотермана (тій і У/аїеттап), Адмапсез іп

Аррій МаїПпетаїййс5 2 (1981 рік), 482-489, для пошуку сегмента з найвищою ідентичністю послідовності між двома послідовностями. У разі застосування ВезнНії або іншої програми вирівнювання послідовностей з метою визначення того, чи є ідентичною конкретна послідовність, наприклад, на 95 95 еталонній послідовності, яка пропонується в цьому винаході, параметри переважно регулюють таким чином, щоб відсоток ідентичності розраховувався для всієї довжини еталонної послідовності, і при цьому, щоб допускалися проміжки в гомології аж до 5 95 від загальної кількості нуклеотидів в еталонній послідовності. У разі застосування Вей так звані необов'язкові параметри переважно залишають в своїх попередньо встановлених ("за замовчуванням") значеннях. Відхилення, що з'являються при порівнянні цієї послідовності і описаних вище послідовностей, які пропонуються в цьому винаході, можуть бути викликані, наприклад, додаванням, делецією, заміною, вставкою або рекомбинацією. Таке порівняння послідовностей можна переважно виконувати за допомогою програми "Тазіа20ибб6" (версія

Зо 2.0и66, вересень 1998 року, розроблена УмМіШат К. Реагзоп і Опімегейу ої Мігдіпіа; дивись також публікацію М/А Реагзоп (1990 рік), Меїнодвз іп Епгутоіоду 183, 63-98, приклади, що додаються, і пору/Амокрепс.5азс.еди/). Для цієї мети можуть застосовуватись налаштування параметрів "за замовчуванням".

Термін "варіант" відноситься до поліпептидів, які мають амінокислотні послідовності, які в деякій мірі відрізняються від поліпептиду з нативною послідовністю. Зазвичай варіанти амінокислотних послідовностей будуть мати, щонайменше, близько 8095 ідентичність послідовності, більш прийнятно, щонайменше, наблизько 90 95 гомологічні за послідовністю.

Варіанти амінокислотноїпослідовності можуть мати заміни, делеції та/або вставки в певних положеннях в еталонній амінокислотній послідовності.

Термін "вектор" в контексті цього документу позначає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну переносити іншу нуклеїнову кислоту, з'єднану з нею. Один тип вектора являє собою "плазміду", яка відноситься до циклічної дволанцюгової петлі ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Інший тип вектора являє собою вірусний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані в вірусний геном. Певні вектори здатні до автономної реплікації в клітині- господарі, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальну точку початку реплікації, і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, не-епісомальні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-господаря при введенні в клітину господаря і, таким чином, реплікуватись разом з геномом господаря. Більш того, деякі вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються в цьому документі як "рекомбінантніекспресійнівектори" (або просто, "рекомбінантні вектори"). Загалом, вектори експресії, що використовуються в технологіях рекомбінантної ДНК, частомають форму плазмід. В цьому описі винаходу "плазміда" і "вектор" можуть бути взаємозамінні, оскільки плазміда є формою вектору, яка використовується найбільш часто.

Термін "клітина-господар", що застосовується в цьому документі (або "рекомбінантна клітина-господар") призначений для позначення клітини, яка була генетично змінена або здатна генетично змінюватися шляхом введення екзогенного полінуклеотиду, такого як рекомбінантна плазміда або вектор. Слід розуміти, що такі терміни призначені для позначення не тільки конкретної клітини, що досліджується, але і клітин, що походять з неї. Оскільки деякі модифікації можуть відбутися в наступних поколіннях завдяки мутаціям або впливу 60 навколишнього середовища, таке потомство не може, по суті, бути ідентичним батьківській клітині, але все ще включено в термін "клітина-господар", як застосовується в цьому документі. "Афінність зв'язування" зазвичай відноситься до сили сумарної кількості нековалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитілом або іншою зв'язуючою молекулою) та її партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном або рецептором). Афінність молекули Х до її партнера У, як правило, можна представити у вигляді константи дисоціації (Ка). Афінність можна виміряти за допомогою загальноприйнятих способів, відомих в цій галузі техніки, в тому числі тих, які описані в цьому документі. Нізькосафінні антитіла слабо зв'язують антиген (або рецептор) і схильні легко дисоціювати, тоді як високоафінні антитіла зв'язують антиген (або рецептор) більш щільно і мають тенденцію залишатися зв'язаними довше.

Якщо спеціально не вказано інше, термін "кон'югат" як описано і заявлено в цьому документі, визначається як гетерогенна молекула, утворена нековалентним приєднанням одного або більше фрагментів антитіла до однієї або більше молекули(ул) полімеру, при цьому гетерогенна молекула розчиняється у воді, тобто розчинна в фізіологічних рідинах, таких як кров, і при цьому гетерогенна молекула вільна від будь-якого структурованого агрегату.

Кон'югат, що становить інтерес являє собою ПЕГ. В контексті вищенаведеного визначення термін "структурований агрегат" відноситься до (1) будь-якого агрегату молекул у водному розчині, що має структуру сфероїда або сфероїдной оболонки, таку, що гетерогенна молекула не перебуває у міцелі або інший емульсійній структурі, і не фіксована в ліпідному бішарі, везикулі або ліпосомі; і (2) будь-якого агрегату молекул у твердій або нерозчинної формі, такій як матриця хроматографічних кульок, який не вивільняє гетерогенну молекулу в розчин при контакті з водною фазою. Відповідно, термін "кон'югат", як він визначений в цьому документі, охоплюєвищезгадану гетерогенну молекулу у якості преципітату, осаду, матриці, яка піддається біоруйнації або іншої твердої речовини, здатних вивільняти гетерогенну молекулу у водний розчин при гідратації твердої речовини.

Слово "мітка" при використанні в цьому документі стосується до сполуки або композиції, які можливо детектувати, які прямо або непрямо кон'юговані з антитілом. Сама мітка може бути з можливістю виявлення сама собою (наприклад, мітки-радіоїзотопи або флуоресцентні мітки) або, у разі ферментної мітки, може каталізувати такі хімічні зміни субстратної сполуки або композиції, які можна виявити.

Зо Під "твердою фазою" мається на увазі безводна матриця, до якої може прикріплятись антитіло за цим винаходом. Приклади твердих фаз, які охоплюються цим документом, включають ті, які сформовані частково або повністю зі скла (наприклад, скла з контрольованим розміром отворів), полісахаридів (наприклад, агарози), поліакриламіду, полістиролу, полівінілового спирту та силіконів. В окремих випадках реалізації винаходу, в залежності від контексту, тверда фаза може містити лунку аналітичного планшета; в інших це колонка очищення (наприклад, колонка для афінної хроматографії). Цей термін також включає в себе переривчасту тверду фазу з дискретних частинок, таку якописана в патенті США Мо 4275149.

Антитіла, також звані імуноглобулінами, зазвичай містятьщонайменше один важкий ланцюг і один легкий ланцюг, причому амінокінцевий домен важкого і легкого ланцюгів є варіабільним за послідовністю, і тому зазвичай називається доменом варіабельної ділянки, або варіабельним доменом важкого ланцюга (МН) і варіабельним доменом легкого ланцюга (УН). Ці два домени зазвичай зв'язуються один з одним, утворюючи специфічну ділянку зв'язування, хоча в цьому документі також обговорюється, що специфічне зв'язування також можна отримати із застосуванням тільки варіабельних послідовностей важкого ланцюга, і в цій галузі техніки відомо і застосовується велика кількість неприродних конфігурацій антитіл. "Функціональне" або "біологічно активне" антитіло або антигензв'язуюча молекула (включаючи антитіла, що містять тільки важкі ланцюги, і біспецифічні триланцюгові антитілоподібні молекули (ТСА - Ійгее-сНаіп апіїроду-їїКе тоїесціе5) в цьому документі) являють собою антитіло або молекулу, здатну виявляти одну або більше з його природних активностей при структурних, регуляторних, біохімічних або біофізичних явищах. Наприклад, функціональне антитіло або інша зв'язуюча молекула, наприклад, ТСА, можемати здатність специфічно зв'язувати антиген, і це зв'язування, в свою чергу, може викликати або змінювати клітинні, або молекулярні явища, наприклад, передачу сигналу абоферментативну активність.

Функціональне антитіло або інша зв'язуюча молекула, наприклад, ТСА, також може блокувати активацію ліганду або рецептора або діяти як агоніст або антагоніст. Здатність антитіла або іншої зв'язуючої молекули, наприклад, ТСА, проявляти одну або більше своїх природних активностей, залежить від кількох факторів, включаючиправильне згортання і складання поліпептидних ланцюгів.

Термін "антитіло" в цьому документі застосовують в його найбільш широкому сенсі; він 60 специфічно охоплює моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мономери, димери,

мультимери, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), антитіла, що містять тільки важкий ланцюг, триланцюгові антитіла, одноланцюгові Ем-фрагменти, нанотіла тощо, а також включає фрагменти антитіл, за умови, що вони мають бажану біологічну активність (МіПег і співавт. (2003) доцг. ої Іттипоіоду 170: 4854-4861). Антитіла можуть бути антитілами миші, людини, гуманізованими, химерними антитілами або можуть походити від інших видів тварин.

Термін антитіло може стосуватись повнорозмірного важкого ланцюга, повнорозмірного легкого ланцюга, інтактної молекули імуноглобуліну; або імунологічно активного фрагменту будь-якого з цих поліпептидів, тобто, поліпептиду, який містить антигензв'язуючий сайт, імуноспецифічно зв'язує антиген або мішень, що становить інтерес, або їх фрагмент, причому такі мішені включають ракову клітину або клітини, що продукують аутоімунні антитіла, асоційовані з аутоїмунним захворюванням, але не обмежуються ними. Описаний в цьому документі імуноглобулін може бути будь-якого типу (наприклад, Ідс, ЧЕ, І9М, дО, ІдДА), класу (наприклад, ІдсС1, Ідс2, ІдСЗ, ІдсС4, ІДАТ їі ІдДА2) або підкласу молекул імуноглобулінів, включаючи сконструйовані підкласи зі зміненими Ес -фрагменти, що забезпечують ослаблення або посилення активностіефекторних клітин. Імуноглобуліни можуть походити від будь-якого виду тварин. В одному аспекті імуноглобулін має в основному людське походження.

Термін "варіабельний'стосується того факту, що послідовності деяких частин варіабельних доменів сильно розрізняються у різних антитіл і роблять внесок у зв'язування і специфічність кожного конкретного антитіла по відношенню до його конкретного антигену. У той же час мінливість не є рівномірно розподіленою по варіабельності доменів антитіл. Вона зосереджена в трьох сегментах варіабельних доменів як легкого, так і важкого ланцюга, які називаються гіперваріабельними ділянками. Більш консервативні фрагменти варіабельних доменів називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожен з варіабельних доменів нативних важких і легких ланцюгів містить чотири ЕК, які переважно приймають конфігураціюбета-листа, з'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, якіутворюють петлі, що з'єднують структуру бета-листа, а в деяких випадках - утворюють частину структури бета-листа. Гіперваріабельні ділянки кожного ланцюга об'єднані один з одним в безпосередній близькості від ЕК і, разом з гіперваріабельні ділянками іншого ланцюга, беруть участь в утворенні антигензв'язуючого сайту антитіл (див. Кабаї і співавт. (1991), бедиепсевз ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, 5-е вид.

Ко) Рибіїс Неайй бегмісе, Маїйопаї! Інвзійшев ої Неай, Бетесда, штат Меріленд). Константні домени не беруть безпосередньої участі у зв'язуванні антитіла з антигеном, однак виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній токсичності (АЗКЦ).

Термін "Гіперваріабельна ділянка", у разі якщо застосовується в цьому документі, відноситься до амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену.

Гіперваріабельна ділянка може містити амінокислотні залишки з "ділянки, що визначає компліментарність" або "СОВ" та/або ці залишки з "гіперваріабельної петлі". Залишки "каркасної ділянки" або "ЕК" являють собою залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельної ділянки, як визначено в цьому документі.

Варіабельні ділянки, що становлять інтерес, включають, щонайменше, одну послідовність

СОК з варіабельних ділянок сімейства 2, наведених в цьому документі, зазвичай, щонайменше, 2 послідовності СОЕ і, більш звичайно, З послідовності СОР. Типові позначення СОЕ показані в цьому документі, проте фахівець в цій галузі техніки зрозуміє, що зазвичай застосовується ряд визначень СОК, включаючи визначення за Кабатом (див. "7Нао і співавт., А дептіїпе Кпом/еддеє

Базед сотршиїайопаї! арргоасі ог дебегтіпіпа апіроду сотріетепіату аеїептіпіпу гедіоп5. " Мої

Іттипої. 2010 рік; 47: 694-700), яке засноване на мінливості послідовності і є найбільш часто вживаним. Визначення по Чотіа засноване на розташуванні ділянок структурної петлі (Споіа і співавт. "Сопіогтаїйоп5 ої іттиподіориїїп пурегмагіаріє гедіоп5. " Майиге. 1989 рік; 342: 877-883).

Альтернативні визначення СОК, що становлять інтерес, включають, без обмеження, ті, які розкриті в роботах Нопеддег, "уеї апоїтег питбегіпуд 5спете ог іттиподіориїїйп магіаріє дотаїпе: ап ашотаїййс тоавеїїпа апа апаїузів ї00!. ") Мої! Віої. 2001 рік; 309: 657-670; ОїМап і співавт. "Аціотаїєй ідепійісайоп ої сотрієтепіатпіу аєїентіпіпд тгедіопе (СОН5) гемєаїЇв ресиїаг сНагасієгівзійсв ої СОН5 апа В сеїЇ ерйорев5. " ) Іттипої. 2008 рік; 181: 6230-6235; АІтааго "ІЗепійїсайоп ої айШегтепсе5 іп Ше взресійсйу-деїегтіпіпд гезідиеб5 ої апіїродієв ІНаї гесодпіге апіїдеп5 ої айегепі 5і2е: ітріїсайнопв Тог пе гаїйопаї девідп ої апііроду герепоїігев. " ) Мої Несоопії. 2004 рік; 17: 132-143; ії Радіапеї і співавт. "ІЧепійісайоп ої 5ресіїсну-дегептіпіпд гезідиев іп апіродієв. " Разхер у). 1995 рік; 9: 133-139., кожна з яких явно включена в цей документ за допомогою посилання.

Термін "моноклональне антитіло" в цьому документі стосується антитіла, отриманого з популяції в значній мірі однорідних антитіл, тобто, окремі антитіла в складі популяції є бо ідентичними, за винятком мутацій, що відбуваються з природних причин, які можуть бути присутніми в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспеціфічнимі, оскільки вони спрямовані проти одиночного антигенного сайту. Крім того, в порівнянні з препаратами поліклональних антитіл, які містять різні антитіла проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональних антитіло направлено протиодиночноїдетермінанти антигену. Крім специфічності, моноклональні антитіла мають перевагу, що полягає в тому, що їх можна синтезувати у без забруднень іншими антитілами. Модифікатор'моноклональне" вказує на те, що антитіло отримано з практично однорідної популяції антитіл; його не слід інтерпретувати як вимогудо продукції антитіла за допомогою будь-якого конкретного способу.

Антитіла в цьому документі включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого та/або легкого ланцюга ідентична або гомологична відповідним послідовностям антитіл конкретного виду тварин або антитіл, що належать до конкретного класу або підкласу, в той час як інша частина ланцюга(ів) ідентична або гомологична відповідним послідовностям антитіл іншого виду тварин або антитіл, що належать до іншого класу або підкласу, а також фрагментам таких антитіл, за умови, що вони демонструють бажану біологічну активність (патент США Мо 4816567; і Могтізоп і співавт. (1984 рік) Ргос. Майн. Асай. сі. ОБА, 81:6851-6855). Химерні антитіла, що становлять інтерес, включають "приматизовані" антитіла, що містять антигензв'язуючі послідовності варіабельного домену, отримані від примата відмінного від людини (наприклад, мартишки Старого Світу, мавпи тощо), і людські послідовності константної ділянки. "Інтактний ланцюг антитіла" в цьому документі являє собою ланцюг, що містить повнорозмірну варіабельну ділянку і повнорозмірну константну ділянку (Ес).

Інтактне стандартне" антитіло містить інтактний легкий ланцюг та інтактний важкий ланцюг, а також константний домен легкого ланцюга (СІ) і константні домени важкого ланцюга - СНІ, шарнір, СН2 ії СНЗ (дляЇдс, яке секретується). Інші ізотипи, наприклад, ДМ або ІдА, можуть містити інші СН-домени. Константні домени можуть являти собою константні домени з нативною послідовністю (наприклад, константні домени людини з нативної послідовністю) або варіанти їх амінокислотних послідовностей. Інтактне антитіло може володіти однією або більше "ефекторними функціями", які відносяться до його біологічної активності, яка поа'язана з Ес- константною ділянкою (нативною послідовністюРс-ділянки або амінокислотною послідовністю

Зо варіантної Ес-ділянки) антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають зв'язування

Стд; комплемент-залежну цитотоксичність; зв'язування з Ес рецептором; антитіло- залежнуклітинно-опосередковану цитотоксичність(АЗКЦ); фагоцитоз; і пригнічення рецепторів поверхні клітини. Варіанти константної ділянки включають варіанти, які змінюють еффекторний профіль, зв'язування з рецепторами Ес і тому подібним.

Залежно від амінокислотних послідовностей Ес (константних доменів) важких ланцюгів, антитіла і різноманітні антиген-зв'язуючі білки можуть бути надані як різні "класи". Існує п'ять основних класівЕс ділянок важкого ланцюга: ІдА, дО, ЧЕ, дос і ІДМ, і деякі з них можуть бути додатково розділені на "підкласи" (ізотипи), наприклад, Ідс1, Ідс2, дз, Іде4, ІдА, і ІдАг. Ес константні домени, які відповідають різним класам антитіл, можуть згадуватись яка, б, є, Мід, відповідно. Добревідомі суб'одинична структура і тривимірна конфігурація різних класів імуноглобулінів. Форми Ід включають модифікації шарнірної ділянки або безшарнірні форми (Коих і співавт. (1998 рік) 9. Іттипої. 161: 4083-4090; І ипа і співавт. (2000 рік) Єиг. У. Віоспет. 267:7246-7256; США 2005/0048572; США 2004/0229310). Легкі ланцюги антитіл будь-якого виду хребетних можна віднести до одного з двох типів, які називаються к- іА-ланцюгами, на основі амінокислотної послідовності їх константних доменів. "Функціональна ділянка Ес" має "еффекторну функцію" нативної послідовності ділянки Ес.

Типові ефекторні функції включають зв'язування Сід; КЗЦ (комплементзалежну цитотоксичність); Зв'язування з Ес рецептором; АЗКЦ; АЗКФ (антитілозалежний клітинний фагоцитоз); пригнічення рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора) тощо. Такі ефекторні функції зазвичай вимагають взаємодії Ес ділянцки з рецептором, наприклад, рецепторами сук; ЕсукПА; ЕсукКІІВ1; ЕсукІІВ2; ЕсуКкІПА; ЕсукПВ, і Ес рецепторомКп, що має низьку афінність; їх оцінку можна здійснити за допомогою різних аналізів, описаних, наприклад, у визначеннях в цьому документі. "Мертва" ділянка Ес є ділянкою

Ес, мутованою з метою збереження активності по відношенню до, наприклад, збільшення тривалості періоду напівжиття сироватки, яка, проте, не активує рецептор Ес, що має високу афінність. "Нативна послідовність Ес-ділянки" містить амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Ес-ділянки, що зустрічається в природі. Нативні послідовностієс- ділянок людини включають, наприклад, нативну послідовність Ес-ділянки дсСї людини 60 (відмінних від А і А аллотипи); нативну послідовність Ес-ділянки ІД052 людини; нативну послідовність Ес-ділянки (ДОЗ людини; і нативну послідовність Ес-ділянки Ід4 людини, а також їх варіанти, що зустрічаються в природі. "Варіантна Ес-ділянка" містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від нативної послідовності Ес-ділянки за рахунок модифікаціїщонайменше однієї амінокислоти, переважно заміни однієї або більше амінокислот. переважно, варіантна Ес-ділянкаміститьщонайменше одну амінокислотну заміну в порівнянні з нативною послідовністю Ес-ділянки або Ес-ділянки вихідного поліпептиду, наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти амінокислотних замін, і переважно від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін в нативній послідовності Ес-ділянки або Ес-ділянці вихідного поліпептиду. Варіантна Ес-ділянка згідно з цим винаходом переважномає щонайменше близько 80 95 гомології по відношенню до нативної послідовності Ес-ділянки та/або з Ес-ділянки вихідного поліпептиду, і найбільш переважно, щонайменше близько 90 95 гомології по відношенню до них, більш переважно, щонайменше близько 95 95 гомології по відношенню до них.

Варіантні послідовності Ес можуть містити три амінокислотних заміни в ділянці СН2 з метою ослаблення зв'язування ЕсукіІ в положеннях 234, 235 і 237 відповідно до індексу ЕС (див.,

Випсап і співавт., (1988 рік) Маїшге 332: 563). Дві амінокислотні заміни в сайті зв'язування комплементу Сід в положеннях 330 і 331 відповідно до індексу ЕС, послаблюють фіксацію комплементу (див., Таб і співавт., У. Ехр. Мей. 178: 661 (1993 рік) і Сапієїй апа Могтізоп, у). Ехр.

Меа. 173:1483 (1991 рік)). Заміна залишків в положеннях 233-236 Ідс1 або Ідс2 людини і в положеннях 327, 330 і 331 ІдД054 значно послаблює АЗКЦ і КЗЦ (див., наприклад, Агтоиг КІ.. співавт.,1999 год. Еиг У Іттипої. 29 (8): 2613-24; і 5півЇд5 РІ. і співавт.,2001 рік. У Віої Спет. 276(9):6591-604). Можливі інші варіанти Ес-ділянки, в тому числі, без обмежень, варіант, в якому ділянку, здатну утворювати дисульфідний зв'язок, видалено, або варіант, в якому видалені деякі амінокислотні залишки на М-кінці нативної Ес-форми або до них додано залишок метионіну.

Таким чином, в одному варіанті реалізаціїцьоговинаходу один або більше з Ес-фрагментів молекули 5сЕс може містити одну або більше мутацій в шарнірній ділянці з метою усунення можливості утворення дисульфідних зв'язків. У ще одному варіанті реалізації шарнірна Ес- ділянка може бути повністю видалена. У ще одному варіанті реалізації молекула може містити варіант Ес-ділянки.

Крім того, можна сконструювати варіант Ес-ділянки, видаливши або значно послабивши ефекторні функції за допомогою заміни, делеції або додавання амінокислотних залишків для впливу на зв'язування комплементу або Ес рецептора. У якості необмежуючого прикладу, можлива делеция в сайті зв'язуваннякомплементу, наприклад, С1Тд-зв'язуючому сайті. Методи отримання таких похідних послідовностей фрагмента Ес імуноглобулінів описані в міжнародних патентних публікаціях Мо УМО 97/34631 і УМО 96/32478. Крім того, можна модифікувати Ес домен шляхом фосфорилювання, сульфатування, ацилювання, глікозилювання, метилювання, фарнезилювання, ацетилювання, амідування і тому подібного.

Ес-ділянка може перебувати у формі, що містить нативні вуглеводні ланцюги, збільшену кількість вуглеводних ланцюгів в порівнянні з нативної формою або зменшену кількість вуглеводних ланцюгів в порівнянні з нативної формою, або може перебувати в аглікозільованій або деглікозильованій формі. Збільшення, зменшення, видалення або інші модифікації вуглеводних ланцюгів можна здійснити за допомогою способів, які часто застосовуються в цій галузі техніки, наприклад, хімічного способу, ферментативного способу або за допомогою експресії вгенетично сконструйованійлінії клітин-продуцентів. Такі лінії клітин можуть включати мікроорганізми, наприклад, Ріспіа Разіогіз (дріжджі) і клітинну лінію ссавців, наприклад, клітини

СНО, які природним чином експресують глікозилюючі ферменти. Крім того, можна сконструювати мікроорганізми або клітини для експресії глікозилюючих ферментів або зробити їх нездатними до експресії ферментів глікозилювання (див., наприклад, Натійоп і співавт., зсіепсе, 313: 1 441 (2006 рік); Капаа, і співавт, У). ВіоїесппоІоду, 130: 300 (2007 рік); Кпадама і співавт., у. ВіоїЇ. Спет., 269 (27): 17872 (1994 рію; Ц/|йа-І ее і співавт., 9. Віої. Спет., 264 (23): 13848 (1989 рік); Ітаїі-Мів5піуа і співавт., ВМС Віоїесппоїоду 7:84 (2007 рію); і УМО 07/055916). Як приклад сконструйованих клітин з модифікованою активністю сіалювання, в клітини яєчника китайського хом'ячка і в клітини 519 рекомбінантно ввели ген альфа-2,6-сіалілтрансферази 1.

Антитіла, які експресуються цими рекомбінантними клітинами, піддаються сіалюванню продуктом екзогенного гену. Додатковий спосіб отримання молекул Ес з модифікованою кількістю вуглеводних залишків в порівнянні з безліччю нативних молекул включає розділення зазначеної множини молекул на глікозильовану і неглікозильовану фракції, наприклад, за допомогою афінної хроматографії з лектином (див., наприклад, УМО 07/117505). Показано, що наявність конкретних глікозилюючих функціональних груп призводить до зміни функції бо імуноглобулінів. Наприклад, видалення вуглеводневих ланцюгів з молекули Ес призводить до різкого зниження афінності зв'язування з фрагментом С14 першого компонента комплементу С1 і ослаблення або втрати антитілозалежної клітинноопосредованної цитотоксичності (АЗКЦ) або комплементзалежної цитотоксичності (КЗЦ) їі, отже, відсутності індукції непотрібних імунних реакцій іп мімо. Додаткові важливі модифікації включають сіалювання і фукозилювання: присутність сіалової кислоти в ЇДо корелювало з протизапальною активністю (див., наприклад,

Капеко, і співавт., Зсіепсе 313: 760 (2006 рік)), в той час як видалення фукози з Ї90 призводить до посилення активності АЗКЦ (див., наприклад, ЗпоЇ-Нозака, і співавт., у. Віоспет., 140:777 (2006 рію).

В альтернативних варіантах реалізації антитіла за цим винаходом можуть містити послідовність Ес з посиленими ефекторними функціями, наприклад, підвищеною здатністю до зв'язування з ЕСУКША і підвищеною активністю АЗКЦ. Наприклад, приєднання фукози доМ- зв'язаного глікану біля Аб5п-297 Ес-ділянки стерично ускладнює взаємодію Ес з ЕсукПА, а видалення фукози за допомогою глікоїнженері може посилити зв'язування з ЕСУКША, що призводить до»50-кратного збільшення активності АЗКЦ в порівнянні з контрольними /Ідос1 дикого типу. Білкова інженерія дозволяє отримати різні варіанти з підвищеною афінністю зв'язування Ес з ЕсукПА за рахунок мутацій амінокислот в Ес ділянці ЇДС1. Примітно, що потрійний мутант із заміною на аланін 5298А/ЕЗЗЗА/К334А демонструє 2-кратне посилення зв'язування з ЕСуУКША і функцію АЗКЦ. Варіанти 52390/332Е (2Х) і 52390/332Е/АЗЗОЇІ (ЗХ) характеризуються значним збільшенням спорідненості зв'язування з ЕсукША і посиленням

АЗКЦІПп міїготаїп мімо. Інші варіанти Ес-ділянки, виявлені за допомогою фагового дисплея, також демонстрували поліпшене зв'язування з Есу КІПА і посилене знищення пухлинних клітин в моделях ксенотрансплантатів у мишей. Див., наприклад, Гіи і співавт. (2014 рік) УВС 289 (6): 3571-90, явно включений в цей документ за допомогою посилання.

Термін "антитіло, що містить Ес-ділянку" відноситься до антитіла, що містить Ес-ділянку. С- кінцевийзалишок лізину (залишок 447 відповідно до ЕС-системи нумерації) в Ес-ділянці можна видалити, наприклад, при очищенні антитіла або за допомогою рекомбінантної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло. Відповідно, антитіло, що містить Ес-ділянку згідно з цим винаходом, може включати антитіло з К447 або без нього. "Ру" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, що містить повну ділянку, що розпізнає

Зо антиген і ділянку, що зв'язує антиген. Антитіла, що зв'язують СОЗза цим винаходом містять димер одного домену варіабельної ділянки важкого ланцюга і одного домену варіабельної ділянки легкого ланцюга, з'єднаних жорстким нековалентним зв'язком; однак додаткові антитіла, наприклад, для застосування в мультиспецифічній конфігурації може містити УН за відсутності послідовності МІ. Навіть один варіабельний домен (або половина Ем, що містить тільки три гіперваріабельні ділянки, специфічні для антигена) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча афінність може бути нижче, ніж афінність сайту зв'язування двох доменів.

Фрагмент Бар також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга. Фрагменти Рар' відрізняються від фрагментів Гар додатковими декількома залишками на карбоксильному кінці домену СНІ важкого ланцюга, включаючи один або більше цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. В цьому описі Бар'-ЗН є позначення Раб", в якому цістеіновий(ві) залишок(ки) константних доменів несе щонайменше одну вільну тіольну групу. Фрагменти К(аб)гантитіла спочатку отримували у вигляді пар фрагментів Раб", між якими знаходяться шарнірні залишки цистеїну. Відомі також інші варіанти хімічного зв'язування фрагментів антитіл. "Гуманізовані" форми антитіл нелюдського походження (наприклад, гризунів), включаючи одноланцюгові антитіла, являють собою химерні антитіла (включаючи одноланцюгові антитіла), що містять мінімальні послідовності, що походять від імуноглобуліну нелюдського походження.

Див., наприклад, щчопез і співавт., (1986 рік) Маїшге 321: 522-525; Споїпіа і співавт., (1989 рік)

Маїштге 342: 877; Кіесптапп і співавт., (1992 рік) У. Мої. Віо!Ї. 224, 487-499; Рооїе апа М/іпіег, (1992рік) 9. Мої. Віої. 224: 487-499; Ргевіа і співавт., (199Зрік) 9. Іттипої. 151, 2623-2632; Мепнеті співавт., (1996брік) У. Іттипої. Меїйоаз 157: 4986-4995; Ргевіа і співавт., (2001 рік) Тиготб.

Наєтовзі. 85: 379-389. Додаткову інформацію див. в патентах США Мо 5225539; 6548640; 6982321; 5585089; 5693761; 6407213; ЧУЧопев і співавт., (1986 рік) Маїште, 321: 522-525; і

Вієсптаптп і співавт., (1988 рік) Маїиге 332: 323-329.

В цьому контексті термін "одноланцюгове антитіло" означає один поліпептидний ланцюг, що містить один або більше антигензв'язуючих доменів, які зв'язують епітоп антигену, при цьому такі домени отримані з або мають ідентичністьпослідовності з варіабельною ділянкою важкого або легкого ланцюга антитіла. Частини такої варіабельної ділянки можуть кодуватися генними сегментами Мнабо Мі, генними сегментами О і Унабо генними сегментами 4. варіабельна 60 ділянка може кодуватися перебудованими генними сегментами МнЮн, М. ЮОн, Мнигабо Мі. Генні сегменти М-, 0- ї 2- можуть бути отримані від людей і різних тварин, включаючи птахів, риб, акул, ссавців, гризунів, приматів, відмінних від людини, верблюдів, лам, кроликів і тому подібних.

СОЗ-зв'язуючі антитіла за цим винаходомзнаходять конкретне застосування в мультиспецифічних конфігураціях, які включають, без обмеження, біспецифічні антитіла, трифункціональні антитіла тощо. Велика розмаїтість способів і конфігурацій білків відомо і застосовується в біспецифічних моноклональних антитілах (бсмАт) тріспецифічних антитілах і тому подібних.

БсмАтпершого покоління складалися з двох важких і двох легких ланцюгів, по одній від двох різних антитіл. Дві Раб ділянки спрямовані проти двох антигенів. Ес-ділянка складається з двох важких ланцюгів і утворює третій сайт зв'язування з Ес рецептором на імунних клітинах (див., наприклад, І іпапоїег і співавт., Пе уошттаї ої Іттипоіоду, Том 155, стор. 219-225, 1995 рік).

Антитіла можуть бути з одного або різних видів. Наприклад, клітинні лінії, які експресують антитіла щура і миші, секретуютьфункціональнебіспецифічне Ат через переважне, обмежене видом, спарювання важких і легких ланцюгів. В інших варіантах реалізації винаходу Ес-ділянки сконструйовані так, що вони підходять один одному тільки певним чином.

Інші типи біспецифічних антитіл включають хімічно зв'язані баб, що складаються тільки з ділянок Раб. Два хімічно пов'язаних фрагмента Раб або Рар2 утворюють штучне антитіло, яке зв'язується з двома різними антигенами, що робить його типом біспецифічного антитіла.

Виходять антигензв'язуючі фрагменти (Раб або ЕРарг) двох різних моноклональних антитіл зв'язані хімічними засобами, такими як тіоефір (див., Сієппіє, Му і співавт., Чопа! ої іттипоіоду 139, стор. 2367-75, 1987 рік; Реїег Вогсптаптп і співавт., Віа, Том 100, Мо 9, стор. 3101-3107, 2002 рік).

Різні інші способи отримання полівалентних штучних антитіл були розроблені шляхом рекомбінантного злиття варіабельних доменів двох антитіл. Одноланцюговий варіабельний фрагмент (зсЕм) являє собою злитий білок варіабельних ділянок важких (МН) і легких ланцюгів (МУ) імуноглобулінів, пов'язаних з коротким лінкерним пептидом з 10-25 амінокислот. Зазвичай лінкер насичений гліцином для гнучкості, а також серином або треоніном для розчинності і може з'єднувати М-кінець МН з С-кінцем МІ, або навпаки. Біспецифічні одноланцюгові варіабельні

Зо фрагменти (ди-5сЕм5, бі-зєсЕм5) можуть бути сконструйовані шляхом сполучення двох 5сЕм з різною специфічністю. Виробляється один пептидний ланцюг з двома ділянками МН і двома ділянками МІ, що призводить до отриманнядвовалентних 5сгЕм.

Біспецифічні тандемні 5сЕм також відомі як біспецифічні активатори, що залучають Т-клітини (ВІТЕ-Візресіїйс Т сеїЇ Епаадег). Біспецифічні 5сЕм можуть бути створені за допомогою лінкерних пептидів, які є занадто короткими для того, щоб дві варіабельні ділянки складалися разом (довжиною близько п'яти амінокислот), що змушує 5сЕм димеризуватись. Цей тип відомий як диатіла (Адат»5 і співавт., Вгйі5пй |оигпаі! ої сапсег 77, стор. 1405-12, 1998 рік). Технологія платформидвоафінного перенацілювання(ФАКТ-ЮцаІ-Айіпйу Ре-Тагдеїйп9у) (Масгодепісв,

Роквілл, штат Меріленд). Ця технологія злиття білків застосовує два одноланцюгових варіабельних фрагмента (5СЕм) різних антитіл на одному пептидному ланцюгу довжиноюблизько 55 кілодальтон. ЗСОКРІОМ Тпегарецшііс5 (Етегдепі ВіозоЇшіоп5, Іпс., Сіетл, штат Вашингтон) об'єднує два антигензв'язуючих домени в одноланцюговий білок. Один зв'язуючий домен знаходиться на С-кінці, а другий зв'язуючий домен знаходиться на М-кінці ефекторного домену на основі Ес ділянок імуноглобуліну.

Тетравалентні і біспецифічні подібні до антитіл білки також включають ОМО-Ід, які сконструйовані з двох моноклональних антитіл (УМи, С. і співавт., Маїиге Віотесппоїоду, 25, стр. 1290-1297, 2007 рік). Для конструювання молекули ЮОМО-ІД домени М двох мАт зливаються в тандемі з допомогою короткого лінкера (ТМААР) з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) першого антитіла на М-кінці, за яким йдуть МІ. і СК інших антитіл для утворення легкої ланцюга білка 0МО-Ід. Аналогічним чином, варіабельні ділянки важкого (МН) ланцюга двох мАт зливаються в тандемі з допомогою короткого лінкера (А5ТКОР) з першим антитілом на М-кінці, за яким слідує інше антитіло і константні домени важкого ланцюга з утворенням важкого ланцюга (МНІЛЛ1) білка ЮОМО-Ід. Всі константні домени легкого ланцюга і важкого ланцюга зберігаються в конструкції ЮМО-Ід, оскільки вони є критичними для утвореннядисульфід- зв'язаноїповної Ідс-подібної молекули. Котрансфекція клітин ссавців експресійними векторами, що кодують легкий ланцюг і важкий ланцюг ЮМО-Ід, призводить до секреції ІдОС-подібної молекули одного виду з молекулярної масою приблизно 200кДа. Ця молекула тепер має чотири сайти зв'язування, по 2 від кожного мАт.

Термін "біспеціфічна триланцюгова антитіло-подібна молекула" або "ТСА" (ІНгеве- бо сНаіпапіїбсоду) застосовується в цьому документі для позначення антитіло-подібних молекул, що включають, що складаються по суті або складаються з трьох поліпептидних субодиниць, дві з яких включають в себе, складаються по суті з або складаються з одного важкого і одного легкого ланцюга моноклонального антитіла або функціональних антигензв'язуючих фрагментів таких ланцюгів антитіла, що містять антигензв'язуючу ділянку іщонайменше один домен СН. Ця пара важкий ланцюг/легкий ланцюг має специфічність зв'язування для першого антигену. Третя поліпептидна субодиниця містить, складається по суті або складається з антитіла з тільки важким ланцюгом, що містить Ес-ділянку, що містить домени СН2та/або СНЗ, та/або СНА, за відсутності домену СНІ, і антигензв'язуючий домен, який зв'язує епітоп другого антигену або інший епітоп першого антигену, при цьому такий зв'язуючий домен походить з або має ідентичність послідовності з варіабельною ділянкою важкого або легкого ланцюга антитіла.

Частини такої варіабельної ділянки можуть кодуватися генними сегментами Мнабо Мі, генними сегментами О і УУнабо генними сегментами ді. варіабельна ділянка може кодуватись перебудованими геннимисегментами МнОн, Мі. Он, МнУгабо М.

Білок ТСА, що використовує "антитіло тільки з важким ланцюгом" або "антитіло з важким ланцюгом" або "поліпептид важкого ланцюга", в цьому контексті означає одноланцюгове антитіло, що містить константні ділянки важкого ланцюга СН2та/або СНЗ, та/або СНЯА, але не має домену СНІ. В одному варіанті реалізації винаходу антитіло з важким ланцюгом складається з антигензв'язуючого домену, щонайменше, частини шарнірної ділянки та доменів

СН2 ї СНЗ. В іншому варіанті реалізації винаходу антитіло з важким ланцюгом складається з антигензв'язуючого домену, щонайменше, частини шарнірної ділянки та домену СН2. У подальшому варіанті реалізації винаходу антитіло з важким ланцюгом складається з антигензв'язуючого домену, щонайменше, частини шарнірної ділянки та домену СНЗ. Антитіла з важким ланцюгом, в яких домен СН2та/або СНЗ укорочений, також включені в цей документ. У подальшому варіанті реалізації винаходу важкий ланцюг складається з антигензв'язуючого домену і, щонайменше, одного домену СН (СНІ, СН2, СНЗ або СНІ), але без шарнірної ділянки.

Антитіло тільки з важким ланцюгом може бути у формі димера, в якому два важкі ланцюги дисульфідні зв'язані один з одним або ковалентно або нековалентно зв'язані один з одним.

Антитіло з важким ланцюгом може належати до підкласу Ідс, але антитіла, що належать до інших підкласів, таких як підклас ІМ, ІА, Д94О і ІДЕ, також включені в цей документ. У

Зо конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло з важким ланцюгом відноситься до підтипу

І9С1, Ідс2, ІдоЗ або Ідс4, зокрема підтипу Ідс1.

Антитіла з важким ланцюгом становлять близько однієї четвертої частини антитіл Ідс, які продукуються у верблюжих, наприклад, верблюдами і ламами (Натег5-Сазіегтап С., і співавт.

Маїшге. 363, 446-448 (1993 рік)). Ці антитіла утворені двома важкими ланцюгами, але позбавлені легких ланцюгів. Як наслідок, варіабельна антигензв'язуюча частина називається доменом МНН і являє собою найменший інтактний антигензв'язуючий сайт, який зустрічається в природі, довжиною всього близько 120 амінокислот (Оеєзтуїйег А., і співавт. У). Віої. Спет. 276, 26285- 26290 (2001 рік)). Антитіла з важким ланцюгом з високою специфічністю і афінністю можуть вироблятись проти різних антигенів за допомогою імунізації (мап дег І іпдеп, К. Н., і співавт.

Віоспіт. Віорпув. Асіа. 1431, 37-46 (1999 рік), а частина МНН може бути легко клонована і експресована в дріжджах (Егепкеп, І С.), і співавт. .. Віоїесппої. 78, 11-21 (2000 рію). їх рівні експресії, розчинності і стабільності значно вище, ніж у класичних фрагментів (аб) або Ем (спапгоцаї, МА і співавт. РЕВЗ І ей. 414, 521-526 (1997 рік)). Також було показано, що акули мають один МН-подібний домен в своїх антитілах, який називається УМАК. (Мийаї!| і співавт. Еиг.

У. Віоспет. 270, 3543-3554 (2003 рію; Мипнаї! і співавт., Рипсіоп апа Віоіпгогтаїййс5 55, 187-197 (2004 рік); Оооіеу і співавт., Моїесшіаг Іттипоїіоду 40, 25-33 (2003 рію)).

Антитіло або антигензв'язуюча молекула, включаючи антитіла, що містять тільки важкий ланцюг, і біспецифічні триланцюгові антитілоподібні молекули (ТСА) в цьому документі, "які зв'язують" антиген, що становить інтерес, являють собою молекули, які зв'язують антиген з достатньою афінністю, так що антитіло або зв'язуюча молекула корисні в якості діагностичного та/або терапевтичного агента при націлювання на антиген і не мають значної перехресної взаємодії з іншими білками. У таких варіантах реалізації винаходу ступінь зв'язування антитіла або іншої зв'язуючої молекули з нецільовим антигеном становитиме не більше 10 95, як визначено аналізом протокової цитометрії (БАС5-Пиогебзсепсе асіїматєй сеїЇ 5опіпод) або радіоїммунопреціпітацією (РІП)

Білки

Цей винахід забезпечує сімейство споріднених антитіл, які зв'язуються і активують передачу сигналів СОЗ, наприклад, через активацію СОЗ-Т-клітин. Антитіла в цьому сімействі містять набір послідовностей СОЖК, як визначено в цьому документі, і прикладами яких є надані бо послідовності МН з ЗЕО ІО МО: 1-18. Це сімейство антитіл забезпечує ряд переваг, які сприяють його корисності у якості клінічного лікарського засобу(ів). Антитіла в цьому сімействі включають членів з рядом афінностей зв'язування, що дозволяють вибирати конкретну послідовність з бажаноюафінністю. Здатність точно налаштовувати афінність має особливе значення для керування рівнем активації СОЗ у індивіда, якого лікують, а отже, і для зниження токсичності.

Наприклад, якщо метою є пухлинні антигени, присутні в невеликій кількості (менше 10000 молекул на клітину), очікується, щокращими є високоафінні зв'язувачіСОЗ («30 НМ). Якщо метою є пухлинні антигени, присутні у великій кількості (понад 50000 молекул на клітину), перевагу надають низькоафінним зв'язувачам СОЗ (х 50 нМ). Окремо від афінності може визначатись здатність антитіла індукувати вивільнення цитокінів при зв'язуванні Т клітин, наприклад, вивільнення ІЛ-2, ІФН-у і ін., в умовах, в яких вивільнення цитокінів може бути бажаним.

Відповідне антитіло може бути вибрано з тих, які надані в цьому документі для розробки і застосування, включаючи без обмеження застосування в якостібіспецифічного антитіла.

Визначення афінності до білка-кандидату може бути виконано із застосуванням способів, відомих в цій галузі техніки, наприклад, вимірювання Віасоге і тому подібного. Члени сімейства антитіл можуть мати афінність до СЮОЗ з Ка від близько 10до близько 107" включаючи без обмежень: від близько 10-7до близько 1070: від близько 10-до близько 10-: від близько 106до близько 10: від близько 108до близько 10-17: від близько 10до близько 10-10; від близько 108до близько 102: від близько 10Удо близько 107: від близько 107до близько 1072: або будь-яке значення в цих діапазонах. Вибір афінності може бути підтверджений біологічною оцінкою активації Т-клітин, наприклад, іп міго або в доклінічній моделі, і оцінкою потенційної токсичності.

Вимірювання вивільнення цитокінів може здійснюватися за допомогою будь-якого зручного аналізу, включаючи, але не обмежуючись ними, аналізи описані в прикладах.

Стимуляція рецептора Т-клітини (ТКР) шляхом зв'язування комплексів МН-пептид або антитіл до ТКР/СОЗ ініціює активацію Т-клітин. Прикладами антитіл доТКР/СОЗ, які активують Т- клітини, є ОКТЗ ії ОСНТТІ. Ці антитіла проти СОЗ перехресно конкурують за зв'язування з СОЗ на

Т-клітинах і зазвичай застосовуються в аналізах активації Т-клітин. Антитіла проти СОЗ за цим винаходом перехресно конкурують з ОКТЗ за зв'язування з СОЗ людини. Залежно від афінності зв'язування СОЗ і епітопу на СОЗ антитіла проти СОЗ активували Т-клітини з різними

Зо функціональними результатами. Інкубація іп мйго Т-клітин людини з низькоаффінними антитілами проти СОЗ приводила до неповної активації Т-клітин, низької продукції ІЛ-2 та ІЛ-10.

Навпаки, високоафінні зв'язуючі СОЗ активували Т-клітини, щоб продукувати значно більше ІЛ-2 та інших цитокінів. Низькоафінні антитіла проти СЮОЗ вважаються частковими агоністами, які вибірково індукують деякі ефекторні функції, сильне знищення пухлини і активацію СОб69, але не викликають інших, таких як продукція ІЛ-2 та ІЛ-10. Високоафінні зв'язуючі за цим винаходом є повними агоністами, що активують багато імунних ефекторних функцій Т-клітин. Сила взаємодії з СОЗ і епітопом, що впізнається, призвела до якісно різної активації Т-клітин.

Максимальна продукція цитокінів Т-клітинами, які були активованими низькоафінними антитілами проти СОЗ, була нижче, ніж при максимальній активації високоаффіннимі антитілами проти СОЗ. У деяких варіантах реалізації антитіло за цим винаходом призводить до вивільнення менших кількостей одного або обох ІЛ-2 та ІЛ-10 при об'єднанні з Т-клітинами в аналізі активації в порівнянні з еталонним антитілом проти СОЗ в тому ж аналізі, при цьому еталонне антитіло може являти собою ІЮ 304703 (5ЕО ІЮ МО: 22) або антитіло з еквівалентної афінністю. Максимальне вивільнення ІЛ-2 та/або ІЛ-10 може становити менше ніж близько 75 95 вивільнення за допомогою еталонного антитіла, менш ніж близько 50 95 вивільнення за допомогою еталонного антитіла, менш ніж близько 25 95 вивільнення за допомогою еталонного антитіла, і може становити менше ніж близько 10 95 вивільнення за допомогою еталонного антитіла.

У деяких варіантах реалізації винаходу пропонуються біспецифічні або мультиспецифічні антитіла, які можуть мати будь-яку з обговорюваних в цьому документі конфігурацій, включаючи, але не обмежуючись, біспеціфічну триланцюгову конфігурацію. Біспецифічні антитіламістять щонайменшеваріабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, специфічного до білка, відмінного від СОЗ, ії можуть містити варіабельну ділянку важкого і легкого ланцюга. У деяких таких варіантах реалізації винаходу друга специфічність антитіла зв'язується з антигеном, асоційованим з пухлиною, націлюючим антигеном, наприклад, інтегринамитощо, патогенним антигеном, білком контрольної точки і тому подібним. Різні формати біспецифічних антитіл знаходяться в межах обсягу цього винаходу, включаючи, без обмеження, одноланцюгові поліпептиди, дволанцюгові поліпептиди, триланцюгові поліпептиди, чотириланцюгові поліпептиди і кратні їм. 60 Сімейство СЮОЗ-специфічних антитіл містить домен МН, що містить послідовності СОКІ,

СОК2 їі СОРЗ в каркасі МН людини. Послідовності СОК можуть бути розташовані, наприклад, в ділянці амінокислотних залишків 26-33; 51-58; і 97-112 для СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, відповідно, наданих типових послідовностей варіабельної ділянки, викладених в 5ХЕО ІЮ МО: 1-18. Фахівцю в цій галузі техніки повинно бути зрозуміло, що послідовності СОК можуть перебувати в іншому положенні, в разі якщо обрана інша каркасна послідовність, хоча зазвичай порядок послідовностей буде залишатися тим же.

Послідовності СОК для антитіла сімейства 2можуть мати наступні формули послідовності. Х позначає варіабельну амінокислоту, яка може являти собою специфічні амінокислоти, як зазначено нижче.

Сов

Си Ег Тз Еа Х5 Хв У7 Ав при цьому:

Хо5може бути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хзхявляє собою 0, А або Н; в деяких варіантах реалізації винаходу Ххявляє собою 0.

Хв можебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу Хв являєсобою 0 або М, в деяких варіантах реалізації винаходу Ює являєсобою 0.

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКІТ анти-СОЗ антитіла сімейства 2 містить послідовність визначену в будь-який з ЗЕО ІЮ МО: 1-18, залишках 26-33. сов2

Ії» ог М з" Ма" 5 Св 57 Їв'

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОВ2 антитіла проти СОЗ сімейства 2 містить послідовність, визначену в будь-який з 5ЕО ІЮ МО: 1-18, залишки 51-58.

СсовЗ

АК» Оз бе Ве Св У Сів" Хо" Міо Хі" Хі" 13" (12 Ат Мів" при цьому:

Хеможебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу

Хеявляєсобою 0 або 5; в деяких варіантах реалізації винаходу Хеявляєсобою 0;

Хі"можебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу

Коо) Хі"являєсобою Е або 5.

Хігможебути будь-якою амінокислотою; в деяких варіантах реалізації винаходу

Хігявляєсобою І. або КЕ.

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОЗ анти-СОЗ антитіла сімейства 2 має формулуАакоЗвамУсаОмМХ 1 Хіг (ЗАМ, в якій ХігіХігявляють собою визначене вище. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКЗ антитіла проти СОЗсімейства 2 містить послідовність, викладену в будь-який з ЗЕО ІЮ МО: 1-18, залишки 97-112.

У деяких варіантах реалізації винаходу СОЗ-зв'язуючий домен МН пов'язаний з доменом варіабельної ділянки легкого ланцюга. У деяких таких варіантах реалізації винаходу легкий ланцюг являє собою фіксований легкий ланцюг. У деяких варіантах реалізації винаходу легкий ланцюг містить домен Мі з послідовностями СОКІ, СОК2 і СОМКЗ в каркасі МІ людини.

Послідовності СОК можуть бути послідовностями з 5ЕО І МО 1 9. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКІ1 містить амінокислотні залишки 27-32; 50-52; 89-97 для

СОК1, СОК2, СОКЗ відповідно.

У деяких варіантах реалізації винаходу послідовності СОК антитіла сімейства 2 мають послідовність з щонайменше 85 95 ідентичністю, щонайменше 90 95 ідентичністю, щонайменше 95 95 ідентичністю, щонайменше 99 95 ідентичністю відносно послідовності СОМ або набору послідовностей СОК в будь-який з ЗЕО ІЮ МО: 1-18. У деяких варіантах реалізації винаходу послідовність СОКза цим винаходом містить одну, дві, три або більше амінокислотних замін по відношенню до послідовності СОМК. або набору послідовностей СОК в будь-який з ЗЕО ІЮ МО: 1- 18. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначена амінокислотна заміна(и) являє собою одну або більше в положенні 5 або 10 з СОМ, положенні 2, 6 або 7 з СОК2, положенні 1, 8, 9 або 10 з СОКЗ відносно формул, наведених вище.

Коли білок за цим винаходом являє собою біспецифічне антитіло, один зв'язуючий фрагмент, тобто комбінація МНЛ/Л/. або тільки УН, є специфічним до СОЗ людини, тоді як інше плече може бути специфічним до клітин-мішеней, включаючи ракові клітини, такі як клітини яєчника, молочної залози, шлунково-кишкового тракту, головного мозку, голови і шиї, передміхурової залози, товстої кишки і рак легені тощо, а також гематологічні пухлини, такі як В- клітинні пухлини, включаючи лейкемії, лімфоми, саркоми, карциноми, пухлини нервових клітин, плоскоклітинні карциноми, ембріонально-клітинні пухлини, метастази, недиференційовані пухлини, семиноми, меланоми, мієломи, нейробластоми, пухлини змішаних клітин, новоутворення, викликані інфекційними агентами, і інші злоякісні новоутворення, клітини, інфіковані патогеном, аутореактівні клітини, які викликають запалення та/або аутоімунну реакцію. Частина, яка не містить СОЗ, також може бути специфічною до імунорегуляторного білку, як буде описано в цьому документі.

Пухлиноасоційовані антигени (ТАА) відносно обмежені пухлинними клітинами, тоді як пухлиноспецифічні антигени (Т5А) є унікальними для пухлинних клітин. ТЗА і ТАА зазвичай являють собою частини внутрішньоклітинних молекул, що експресуються на поверхні клітини як частина основного комплексу гістосумісності.

Тканиноспецифічні антигени диференціації являють собою молекули, присутні на пухлинних клітинах і їх нормальних клітинних аналогах. Пухлиноасоційовані антигени, про які відомо, що вони розпізнаютьсятерапевтичнимимАт, діляться на кілька різних категорій. Гематопоетичні антигени диференціації являють собою глікопротеїни, які зазвичай зв'язані з групами кластера диференціювання (СО) і включають в себе СО20, СО30, СО33 і 2052. Антигени диференціації клітинної поверхні являють собою різноманітну групу глікопротеїнів і вуглеводів, які знаходяться на поверхні як нормальних, так і пухлинних клітин. Антигени, які беруть участь у передачі сигналів росту і диференціювання, часто є факторами росту і рецепторами факторів росту.

Фактори зростання, які є мішенями для антитіл у онкопацієнтів, включають СЕА, рецептор епідермального фактора росту (ЕСЕК (ерідепта! дгоулп Тасіог гесеріог); також відомий як

ЕКВВІ), ЕКВВ2 (також відомий як НЕК2), ЕКВВЗ, МЕТ (також відомий як НОЕК), рецептор інсуліноподібний фактор росту 1 (ІСЕ1Е-іпвзиїїп-ЇїКе дгоулй Тасіог 1 гесеріог), рецептор ефріна АЗ (ЕРНАЗ), рецептор ФНП-залежного апоптоз-індукуючого ліганда 1 (ТКАЇЇК1 (Штог песгов5ів

Тасіог (ТМЕ) -геіаїей ароріозів-іпаисіпо Ідапа гесеріог 1); такожвідомий як ТМЕКЗЕТОА), ТКАЇІСК2 (також відомий як ТМЕКЗЕ10В) і ліганд рецептора-активатора ядерного фактора кВ(КАМКІ; також відо тний як ТМЕ5Е11). Антигенами, які беруть участь в ангіогенезі, зазвичай є білки або фактори росту, які підтримують утворення нових мікроциркуляторних шляхів, включаючи фактор росту судинного ендотелію (МЕСЕ-мазсшаг епаоїпеїїа! дгоулп Тасіог), рецептор МЕСЕ (МЕСЕК), інтегрин амр3 і интегрин а5ДВ1. Строма пухлини і позаклітинний матрикс є необхідними опорними структурами для пухлини. Антигени стромального і позаклітинного матриксу, які є

Зо терапевтичними мішенями, включають білок активації фібробластів (БАР-пБгобіавзі асіїмайоп ргоїеїп) і тенасцин.

Приклади лікарських засобів на основі моноклональних антитіл, корисних в біспецифічних конфігураціях, включають, без обмеження, рітуксімаб; ІСрітумомаб; Тіуксетан; Тозітумомаб;

Брентуксімаб; ведотін; Гемтузумаб; озогаміцін; алемтузумаб; ІСМ101; адекатумумаб;

Лабетузумаб; пиАЗ3; Пемтумомаб; ореговомаб; СС49 (мінретумомаб); со250; 9591; МоОм18;

МОРАБ-003 (фарлетузумаб); ЗЕ8, сп14. 18; КМУ-2871; пи35193; І9М311; бевацизумаб; ІМ-2О6;

СОР?791; Етарацізумаб; Волоціксімаб; Цетуксимаб, панітумумаб, німотузумаб; 806; трастузумаб; пертузумаб; ММ-121; АМО 102, МЕТМАВ; 5СН 900105; АМЕ1642, ІМС-А12, МК-0646, А1507; СР 751871; КВО04; А4; Мапатумумаб (НОЗ-ЕТНІ); НОабБ-ЕТН2; 05-1008; Деносумаб;

Сибротузумаб; Е19; і 81С6.

Рецептори імунної контрольної точки, які найбільш активно вивчалися в контексті клінічної імунотерапії раку, антиген 4 ассоційованний з цитотоксичними Т-лімфоцитами (СТІ А4-суїоїохіс

Т-Іутрпосуїв-а5зосіатей апіїдеп4; також відомий як СО152) і білок 1 запрограмованої смерті клітини (РО1-ргодгаттеа сеї! аеафй ргоївїп 1; також відомий як СО279) - обидва являють собою інгібіторні рецептори. Клінічна активність антитіл, які блокують будь-який з цих рецепторів, передбачає, що протипухлинний імунітет може бути посилений на декількох рівнях і що комбінаторні стратегії можуть бути розумно розроблені, керуючись механістичними міркуваннями і доклінічними моделями.

Двома лігандами для РОТ є ліганд 1 РО1 (РОГ 1; також відомийяк В7-НІ і 20274) і РОІ2 (також відомий як В7-ОС і СО0273). РОЇ1 експресується на ракових клітинах і за допомогою зв'язування з його рецептором РО на Т-клітинах пригнічує активацію/функцію Т-клітин.

Ген З активації лімфоцитів (ГАЗ; також відомий як СО223), 284 (також відомий як СО244), послаблювач (айепиаїйог)В і Т-лімфоцитів (ВТ А; також відомий як СО272), білок З мембрани Т- клітин (ТІМ3; також відомий як НАМегг2), рецептор аденозину Ага (Агак) і сімейство рецепторів пригнічення цитотоксичності, були зв'язані з пригніченням активності лімфоцитів і в деяких випадках з індукцією анергії лімфоцитів. Націлювання антитіл на ці рецептори можна застосовувати в способахза цим винаходом.

Агенти, які є агоністичними імунній костімулюючій молекулі, також корисні в способах за цим винаходом. Такі агенти включають агоністи або СО40 і ОхХ40. СО40 являє собою бо костимулюючий білок, виявлений в антигенпрезентуючих клітинах (АПК) і необхідний для їх активації. Ці АПК включают фагоцити (макрофаги і дендритні клітини) і В-клітини. СО40 є частиною сімейства рецепторів ФНП. Первинними активуючими сигнальними молекулами для

СО40 є ІФНУуЇї ліганд СО40 (СО401І). Стимуляція через СО40 активує макрофаги.

Антитіла до ССКА, що становлять інтерес, (СО194) включають гуманізовані моноклональні антитіла, спрямовані проти С-С-хемокінового рецептора 4 (ССК4) з потенційною протизапальною і протипухлинною активностями. ССК2 експресується на вільних макрофагах, які можуть бути виявлені при різних запальних станах, наприклад, ревматоїдному артриті; і також були ідентифіковані як такі, що експресуються на макрофагах, що стимулюють пухлину.

ССт2 також експресується на регуляторних Т-клітинах, а ліганд ССК2, ССІ2, опосередковує залучення регуляторних Т-клітин у пухлині. Регуляторні Т-клітини пригнічують відповідь на протипухлинні Т-клітини, і тому бажано їх інгібування або деплетування їх популяції.

Отримання білків за цим винаходом

Хоча антитіла можуть бути отримані за допомогою хімічного синтезу, їх зазвичай отримують методами рекомбінантної ДНК, такими як коекспрессія всіх ланцюгів, що складають білок в одній рекомбінантній клітині-господарі, або коекспрессія поліпептиду важкого ланцюга і антитіла, наприклад, людського антитіла. Крім того, важкий і легкий ланцюги антитіла також можуть бути експресовані із застосуванням одного поліцистронного експресійного вектора.

Очищення окремих поліпептидів досягається із застосуванням стандартних методів очищення білків, таких як афінна (білок А) хроматографія, ексклюзійна хроматографія та/або хроматографія гідрофобної взаємодії. Біспецифіки мало відрізняються за розміром і гідрофобністю, тому очищення можна проводити із застосуванням стандартних процедур.

Кількість антитіла і поліпептиду важкого ланцюга, що продукуються в одній клітині-господарі, можна мінімізувати шляхом конструювання константних ділянок антитіла і важкого ланцюга, так що гомодімерізація є переважною за гетеродімерізацію, наприклад, шляхом введення самокомплементарних взаємодій (див., наприклад, УМО 98/50431 про можливості таких стратегій, як стратегія "опуклості-в-порожнину" (див., МО 96/27011)). Тому ще одним аспектом цього винаходу єнадання способу отримання біспецифіка в рекомбінантному господарі, способу, що включає етап експресії в рекомбінантній клітині-господарі послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше два поліпептиди важкого ланцюга, при цьому зазначені поліпептиди важкого ланцюга відрізняються своїми константними ділянками достатньою мірою, щоб зменшити або запобігти утворенню гомодимеру, але збільшити утворення біспецифіка.

Коли білок містить три ланцюги, наприклад, РіїсСАЮ, вони можуть бути отримані шляхом коекспрессії трьох ланцюгів (2 важких ланцюгів і одного легкого ланцюга), що складають молекулу в одній рекомбінантній клітині-господарі.

Для рекомбінантної продукції білків в цьому документі застосовують одну або більше нуклеїнових кислот, що кодують всі ланцюги, наприклад, 2, 3, 4 тощо, виділяють і вбудовують у вектор, що здатен реплікуватись, для подальшого клонування (ампліфікації ДНК) або для експресії. Багато векторів є доступними. Компоненти вектора, як правило, включають в себе, але не обмежуються ними, один або більше з таких елементів: сигнальну послідовність, точку початку реплікації один або більше маркерних генів і енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції.

У кращому варіанті реалізації винаходу клітина-господар у відповідності зі способом за цим винаходом здатна до експресії людського імуноглобуліну на високому рівні, тобто, щонайменше, 1 пг/клітина/день, переважно, щонайменше, 10 пг/клітина/день і навіть більш переважно щонайменше 20 пг/клітина/день або більш без необхідності ампліфікації молекул нуклеїнової кислоти, що кодують окремі ланцюги в зазначеній клітині-господарі.

ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ

Іншим аспектом цього винаходу є надання фармацевтичних композицій, що містять один або більше білків за цим винаходом в суміші з відповідним фармацевтично прийнятним носієм.

Прикладами фармацевтично прийнятних носіїв, застосовуваних у цьому документі, є, але без обмежень, ад'юванти, тверді носії, вода, буфери або інші носії, що застосовуються в цій галузі техніки для зберігання терапевтичних компонентів або їх комбінації.

Терапевтичні склади білків, що застосовуються відповідно до цього винаходу, готують для зберігання шляхом змішування білків, що мають бажану ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, наповнювачами або стабілізаторами (див., наприклад,

Ветіпдюп'в РНнаптасеціїса! бсіепсез 16-е видання, О5ої, А. ред. (1980 рік)), наприклад, у вигляді ліофілізованих складів або водних розчинів. Прийнятні носії, допоміжні речовини абостабілізатори є нетоксичними для реципієнтів в дозах і концентраціях, що використовуються, і включають буферні речовини, наприклад, фосфат, цитрат і інші органічні солі; антиоксиданти, бо включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (наприклад, хлорид октадецілдіметілбензіламмонія; хлорид гексаметоній; хлорид бензалконію; хлорид бензетонія; фенол; бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, наприклад, метил або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; і т-крезол); низькомолекулярні (містять менше 10 залишків) поліпептиди; білки, наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад, полівінілпіролідон; амінокислоти, наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, наприклад, ЕДТА; цукор, наприклад, сахарозу, маніт, трегалозу або сорбіт; солеутворюючі протиіони, наприклад, натрію; металовмістні комплекси (наприклад, комплекси 2п-білок) та/або неіоногенні ПАР, наприклад, ТМ/ЕЕМ "М, РІ ШШЕОМІСЗ "М або поліетиленгліколь (ПЕГ).

Склади антитіл проти СОЗ описані, наприклад, в патентнійпублікації США Мо 20070065437, повний опис якої включено в цей документ за допомогою посилання. Подібні склади можуть бути застосовані для білків з цього винаходу. Основними компонентами таких складів є рн- буферний засіб, ефективний в діапазоні від 3,0 до 6,2, сіль, поверхнево-активна речовина і ефективна кількість біспецифіка зі специфічністю проти СОЗ.

Способи застосування

Пропонуються способи лікування або зниження захворюваності, включаючи, але не обмежуючись ними, інфекцію, аутоїмунне захворювання, первинний або метастатичний рак тощо, в схемі прийому ліків, що включає контакт клітин-мішеней з антигензв'язуючою композицією за цим винаходом, особливо коли антигензв'язуюча композиція являє собою мультиспецифічне антитіло, що підходить для стану, що піддається лікуванню, наприклад де один зв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з антигеном, асоційованим з пухлиною, для лікування відповідних ракових клітин; зв'язуючий фрагмент, специфічний для патогена, що становить інтерес, для лікування відповідної інфекції, тощо. Такі способи включають в себе введення суб'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості або ефективної дози агентівза цим винаходом, включаючи без обмеження комбінації реагенту з хіміотерапевтичним лікарським засобом, променеву терапію або хірургічне втручання.

Ефективні дози композицій за цим винаходом для лікування захворювання варіюють в залежності від багатьох різних факторів, в тому числі способу введення, цільового сайту,

Зо фізіологічного стану пацієнта, від того, чи являє собою пацієнт людину або тварину, інших медикаментів, що вводяться, і того, чи є лікування профілактичним або терапевтичним.

Зазвичай пацієнтом є людина, але ссавці, відмінні від людини, також можуть піддаватися лікуванню, наприклад, домашні тварини, такі як собаки, кішки, коні тощо, лабораторні ссавці, такі як кролики, миші, щури тощо, тощо. Дозування для лікування можна підбирати для оптимізації безпеки та ефективності.

Рівні дозування можуть бути легко визначені кваліфікованим лікарем і можуть бути змінені при необхідності, наприклад, при необхідності зміни реакції суб'єкта на терапію. Кількість активного інгредієнта, яке можна комбінувати з речовинами-носіями для отримання разової лікарської форми, змінюється в залежності від індивіда, який отримує лікування, і конкретного способу введення. Поодинокі лікарські форми зазвичай містять від близько 1їмг до близько 500 мг активного інгредієнта.

У деяких варіантах реалізації винаходу терапевтичне дозування агента може складати від близько 0,0001 до 100 мг/кг і більше, зазвичай від 0,01 до 5 мг/кг маси тіла господаря.

Наприклад, дозування можуть становити 1 мг/кг маси тіла або 10 мг/кг маси тіла або в межах 1- 10 мг/кг. Типова схема лікування включає в себе введення один раз кожні два тижні або один раз на місяць або один раз кожні 3-6 місяців. Терапевтичні препарати за цим винаходом зазвичай вводять кілька разів. Інтервали між введенням кожної дози можуть бути щотижневими, щомісячними або щорічними. Інтервали також можуть бути нерівномірними, на що вказує вимір рівня терапевтичного препарат в крові пацієнта. В альтернативному варіанті, терапевтичні препарати за цим винаходом можуть бути введені у вигляді складу для тривалого вивільнення, в цьому випадку необхідне менше часте введення. Дозування і частота варіюють в залежності від часу напівжиття поліпептиду у пацієнта.

У профілактичних цілях відносно невелика доза може вводитися через відносно тривалі інтервали протягом тривалого періоду часу. Деякі пацієнти продовжують отримувати лікування протягом всього життя. В інших терапевтичних цілях іноді потрібно відносно високе дозування з відносно короткими інтервалами, до тих пір, поки прогресування захворювання не зменшиться або не припиниться, і прийнятніше, до тих пір, покипацієнт не покаже часткове або повне поліпшення симптомів захворювання. Після цього пацієнтові може бути призначений профілактичний режим. бо У ще інших варіантах реалізації способи за цим винаходом включають в себе лікування,

зменшення або запобігання зростанню пухлини, метастазування пухлини або інвазії онкологічних пухлин, включаючи карциноми, гематологічні злоякісні пухлини, такі як лейкемії та лімфоми, меланоми, саркоми, гліоми, тощо. Для профілактичного застосування фармацевтичні композиції або лікарські препарати вводять пацієнту, схильному до ризику захворювання або іншим чином чутливому до захворювання, в кількості, достатній для усунення або зменшення ризику, зменшення ступеня тяжкості або затримки початку захворювання, включаючи біохімічні, гістологічні та/"або поведінкові симптоми захворювання, його ускладнення і проміжні патологічні фенотипи, присутні в ході розвитку захворювання.

Композиції для лікування захворювання можуть вводитися парентеральним, місцевим, внутрішньовенним, внутрішньопухлинним, пероральним, підшкірним, внутрішньоартеріальним, внутрішньочерепним, внутрішньоочеревинним, інтраназальним або внутрішньом'язовим способом. Типовим шляхом введення євнутрішньовенний або внутрішньопухлинний, хоча інші шляхи можуть бути однаково ефективними.

Зазвичай композиції готують у вигляді ін'єкційних розчинів, або у вигляді рідких розчинів, або суспензій; також можуть бути приготовлені тверді форми, придатні для розчинення або суспендування в рідких носіях перед ін'єкцією. Препарат також може бути емульгованим або інкапсульованим в ліпосоми або мікрочастинки, такі як полілактид, полігліколід або сополімер, для посилення ад'ювантного ефекту, як обговорювалося вище. І апдег, Зсієпсе 249: 1527, 1990 год. ії Напе5, Адмапсей Огиа Оеєїїмегу Неміємжв 28: 97-119, 1997 рік. Агенти за цим винаходом можна вводити у формі ін'єкції речовин уповільненого всмоктування або імплантату препарату, який може бути складений таким чином, щоб забезпечити тривале або пульсуюче вивільнення активного інгредієнта. Фармацевтичні композиції, як правило, складені як стерильні, по суті ізотонічні і повністю відповідають усім нормам Належної Виробничої Практики (ЗМР-Сюса

Мапшигасіигіпуд Ргасіїсеу США управління з контролю якості харчових продуктів і лікарських засобів США.

Токсичність білків, описаних в цьому документі, може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами на клітинних культурах або експериментальних тваринах, наприклад, шляхом визначення ЛдД»бхо(доза, летальна для 5095 популяції) або ЛдД'оо(доза, летальна для 100 95 популяції). Співвідношення доз між токсичним і терапевтичним ефектом,

Зо являє собою терапевтичний індекс. Дані, отримані з цих аналізів клітинних культур і досліджень на тваринах, можуть бути застосовані при визначенні діапазону доз, який не токсичний для застосування у людини. Дозування білків, описаних в цьому документі, переважно знаходиться в діапазоні значень концентрацій в кровообігу, які включають ефективну дозу з невеликою токсичністю або без неї. Дозуванняможе змінюватися в цьому діапазоні в залежності від застосовуваної форми дозування і шляху введення, який використовується. Точний склад, спосіб введення та дозування можуть бути обрані окремим лікарем з урахуванням стану пацієнта.

Фармацевтичні композиції можна вводити в різних стандартних лікарських формах в залежності від способу введення. Наприклад, стандартні лікарські форми, придатні для перорального введення, включають, але без обмеження, порошок, таблетки, пігулки, капсули і пастилки для розсмоктування. Загальновизнано, що композиціїза цим винаходомпри пероральному введенні повинні бути захищені від впливу травлення. Це зазвичай досягається або шляхом утворення комплексів молекул з композицією для надання їм стійкості до кислотного і ферментативного гідролізу, або шляхом упаковки молекул в сумісний стійкий носій, такий як ліпосома або захисний бар'єр. Засоби захисту агентів від системи травлення добре відомі в цій галузі техніки.

Композиції для введення зазвичай містять антитіло або інший абляціонний агент, розчинений в фармацевтичні прийнятному носії, прийнятніше у водному носії. Можуть застосовуватися різні водні носії, наприклад, забуферений фізіологічний розчин тощо. Ці розчини є стерильними і, як правило, не містять небажаних речовин. Ці композиції можуть бути стерилізовані звичайними, добре відомими методами стерилізації. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, які необхідні для відповідності фізіологічним умовам, такі якзасоби, що регулюють рН і буферні засоби, засоби, що регулюють токсичність тощо, наприклад, ацетат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію і тому подібне. Концентрація активного агента в цих складах може варіюватися в широких межах і буде вибиратися в першу чергу на основі обсягів рідини, в'язкості, маси тіла і тому подібного відповідно до конкретного обраного шляху введення і потреб пацієнта (наприклад, Кетіпдоп'є

Ріпаптасецшііса! бсієпсе (15-е. изд., 1980 рію і боодтап 8 ЗШптап, Те РІагтасоіодіса! Вабіб ої

Тпегареціїсз (Нагатаг і співавт., ред., 1996 рік)). 60 Також в обсяг цього винаходу входять набори, що містять активні агенти і їх склади, за цим винаходомі інструкції по застосуванню. Набір може додатковомістити щонайменше один додатковий реагент, наприклад, хіміотерапевтичний лікарський засібтощо. Набори зазвичай включають в себе етикетку, яка вказує на передбачуване застосування вмісту набору. Термін "етикетка" включає в себе будь-які письмові або записані матеріали, що поставляються в комплекті або разом з ним, або іншим чином супроводжують набір.

Вказані композиції можна вводити для терапевтичного лікування. Композиції вводять пацієнтові в кількості, достатній для істотного видалення клітин-мішеней, як описано вище.

Кількість, достатня для досягнення цього, визначається як "терапевтично ефективна доза", яка може забезпечити поліпшення загального виживання. Композиції можна вводити одноразово або багаторазово в залежності від необхідного дозування і частоти, що переноситься пацієнтом. Конкретна доза, необхідна для лікування, буде залежати від медичного діагнозу і історії захворювання ссавця, а також від інших факторів, таких як вік, вага, стать, шлях введення, ефективність і тому подібного.

Тепер, коли винахід повністю описано, для фахівця в цій галузі техніки буде очевидно, що різні зміни і модифікації можуть бути зроблені без відхилення від суті або обсягу винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1

Генетично сконструйовані щури, які експресують антитіла, що містять тільки важкі ланцюги

Людський локус ІДН був сконструйований і зібраний з декількох частин, які включали модифікацію і об'єднання генів С-ділянки щура, які потім з'єднувалися по ходу транскрипції ділянки Мнб-Ю)нлюдини. Два ВАС з окремими кластерами людських генів Мнбули потім спільно введені з ВАС, що кодує зібраний (людський Унб-ЮОн-щурячий С) фрагмент.

Були отримані трансгенні щури, що несуть штучні локуси імуноглобулінів важкого ланцюга в невпорядкованій конфігурації. Включені гени константної ділянки кодують І9М, ІдО, Ідс26, І9Е,

ІДА ії 3'-еєнхансер. ЗТ-ПЛР ії аналіз сироватки (ІФА) трансгенних щурів виявили продуктивну перебудову локусів трансгенних імуноглобулінів і експресію в сироватці різних ізотипів антитіл тільки з важким ланцюгом. Трансгенні щури перехресно схрещувалися з щурами з мутованими ендогенними локусами важкого ланцюга і легкого ланцюга, раніше описаними в публікації патенту США 2009/0098134 АТ. Аналіз таких тварин продемонстрував інактивацію експресії

Зо важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну щура і високий рівень експресії антитіл важкого ланцюга з варіабельними ділянками, кодованими генами У, 0 і у людини. Імунізація трансгенних щурів приводила до отримання сироваткових відповідей з високим титром антигенспецифічних антитіл з важким ланцюгом. Ці трансгенні щури, які експресують антитіла з важким ланцюгом з ділянкою МОУ людини, були названі Опікаїв.

Приклад 2

Генетично сконструйовані щури, які експресують антитіла з фіксованим легким ланцюгом

Набори трансгенних людських антитіл були отримані з Н-ланцюгів з різноманітною (Мн-О-

Ун)пперебудовою в поєднанні з унікальним І-ланцюгом. Для цього перебудований І -ланцюг, людського УК-ОК1-СК, був інтегрований в зародкову лінію щура за допомогою мікро ін'єкції ДНК, і отримані трансгенні тварини були схрещені з раніше описаною лінією щурів, яка природним чином експресує набір людського Н-ланцюга (О5рогпі співавт., 2013 рік). Ця нова лінія щурів була названа Отпібіїс.

Імунізація щурів Отпігіїс із застосуванням безлічі різних антигенів продукувала високі рівні антигенспеціфічного їдс, схожі з іншими трансгенними щурами, що несуть той же локус ІДН.

Аналіз набору методом ЗТ-ПЛР дозволив виявити сильно варіабельні перебудови гена Мнпри високих рівнях транскрипта і білка. Крім того, був ідентифікований тільки один продукт І1- ланцюга, що також експресувався на високому рівні.

Антигенспецифічні зв'язуючі з ОтпіРіїс були отримані за допомогою сіквенування нового покоління (МОБ) і відібрані з бібліотек кКДНК (дріжджів, Е. соїї, фагів), в яких після сіквенування ідентифікували різноманітні транскрипти Н-ланцюга. Для експресії в клітинах ссавців гіпермутовані конструкції Н-ланцюга трансфікували в комбінації з вихідною трансгенною послідовністю Ідк. У цьому перебудованому УК-)К1-СК не допускалися мутаційні зміни, і завжди один і той же І-ланцюг експресувався з різними продуктами Н-ланцюга для генерації моноклонального людського Ід.

Приклад З

Отримання антигенспецифічних антитіл у трансгенних щурів.

Для отримання антигенспецифічних антитіл з важким ланцюгом у щурів, генетично сконструйованих щурів, які експресують антитіла з важкими ланцюгами, імунізували двома способами. бо Імунізація рекомбінантними позаклітинними доменами РО-Ї1 і ВСМА. Рекомбінантні позаклітинні домени РО-Ї1 ії ВСМА були придбані у КУО Зузіет5, розбавлені стерильним фізіологічним розчином і об'єднані з ад'ювантом. імуногени або комбінували з повним ад'ювантом Фрейнда (СЕА) і неповним ад'ювантом Фрейнда (ІГА), або з ад'ювантамі Тіептах і

КіБбі. Першу імунізацію (праймування) імуногеном в СЕРА або Тіегптах вводили в ліву і праву ноги. Після першої імунізації імуногеннами в СЕА в кожну ногу вводили ще дві імунізації в ІРА (бустер-ін'єкці)або ще 4 імунізації в Кірі і ще однув Тйегптах. Ця послідовність імунізацій призводить до розвитку В-клітин, що продукують високоафінні антитіла. Концентрації імуногена становили 10 мкг на ногу. Сироватку збирали у щурів при останньому кровопусканні для визначення титрів сироватки.

Для отримання антитіл проти СОЗбе людини генетично сконструйованих щурів імунізували із застосуванням протоколів імунізації на основі ДНК.

Щурів Отпікйіїс імунізували конструкціями СОЗ-Епсілон/дельта людини і яванского макака в

АІдемгоп, Іпс. (Фарго, штат Північна Дакота) із застосуванням технології антитіл ЗЕМОМАС.

Дренуючі лімфатичні вузли збирали після остаточної імунізації і виділяли РНК. Після синтезу

КДНК набір антитіл важкого ланцюга ДН був охарактеризований за допомогоюсіквенування нового покоління і нашого власного програмного забезпечення для внутрішнього використання.

Були відібрані кандидатні антигенспецифичні послідовності МН, що демонструють докази антигенспеціфічного позитивного відбору. Кілька сотень послідовностей УН, що кодують РіїсСАб, були відібрані для збірки генів і клоновані в експресійний вектор. Згодом повністю людські антитіла РіІїсАБбБ ІдсС1 експресували в клітинах НЕК для аналізу за допомогою проточної цитометрії і ІФА. Людські РІїСАБб тестували на зв'язування з первинними людськими Т-клітинами і клітинами УигКаїза допомогою проточної цитометрії. Крім того, людські РІїСАб були протестовані з застосуванням рекомбінантних білків СОЗбє в ІФА. Всі РіїсСАБ з позитивним зв'язуванням з Т- клітинами людини перераховані на Фіг. 1 і 2. Вибрані послідовності були додатково охарактеризовані в аналізах активації Т-клітин.

Приклад 4 Характерістізація антитіл.

Таблиця даних на Фіг. З узагальнює поведінку анти-СОЗ антитіл сімейства 2 в моноспецифічному і біспеціфічномуформаті. У колонці 1 показаний ідентифікатор послідовності дляпослідовності МН анти-СОЗ3. У колонці 2 показано значення СіФ для зв'язування

Зо клітинамиигКкаївихідного моноспецифічного (антитіла) проти СЮОЗ. У колонці З показано значення СіФ для зв'язування Т-клітинамияванского макака вихідного моноспецифічного (антитіла) проти СОЗ. Колонка 4 демонструє назву абрз3авсмА біспецифічного антитіла. У колонці 5 показані пікограми ІЛ-2, що вивільняється всіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі У колонці б показані пікограми ІЛ-б,що вивільняєтьсявсіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 7 показані пікограми ІЛ-10,що вивільняється всіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. В колонці 8 показані пікограми ІФН-у, що вивільняється всіма Т- клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці 9 показані пікограми ФНО, що вивільняється всіма Т-клітинами, які були стимульовані біспецифічним антитілом, що зв'язує білок ВСМА, іммобілізованим на пластику, в зазначеній дозі. У колонці їОпоказанаєкзбо лізису пухлинних клітин 0266, опосередкованого біспеціфічними антитілами, в присутності всіх Т- клітин людини. У колонці 11 показаний відсоток лізису пухлинних клітин 0266, в присутності біспецифічного антитіла і всіх Т-клітин людини при дозі 333 нг/мл біспецифічного антитіла. У колонці 12показанаафінність білкового зв'язування плеча проти СОЗ біспецифічного антитіла, виміряна за допомогою Осіем У колонці 13 показано значення СіФ для зв'язування клітинамиигкаї біспецифічного антитіла.

Приклад 5 Характеризація біспецифічних антитіл.

Сім біспецифічних антитіл аСОЗ Тат2: авсмМА, кожне з унікальним плечем проти СОЗ і загальним плечем проти ВСМА, були протестовані на здатність вбиватипухлинні клітини 0266

ВСМАч за допомогою перенаправлення активованих первинних Т-клітин. В цьому експерименті клітини Ш266, які експресують ВСМА, змішували зактивованими всіма Т-клітинами в співвідношенні Е:Т 10:11 разом з додаванням біспецифічного антитіла. На Фіг. 4 вісь х демонструє концентрацію антитіла, що застосовується, а вісь у демонструє 95 лізису пухлинних клітин через 6 годин після додавання антитіла.

Порівняння активності по лізису пухлинних клітин опосередкованої біспеціфічними антитілами з вивільненням цитокінів ІЛ-2 продемонстровано на точкової діаграмі Фіг. 5. бо Кореляція між продукуванням ІЛ-2 і лізисом пухлинних клітин 0266 становить К2-0,37.

Порівняння активності лізису пухлинних клітин опосередкованої біспеціфічними антитілами з вивільненням цитокінів ІФН-упродемонстровано на точковій діаграмі Фіг. 6. Кореляція між продукуванням ІФН-у і лізисом пухлинних клітин 0266 становить К2-0,53. Порівняння активності по лізису пухлинних клітин 0266 опосередкованої біспеціфічними антитілами з анти-СОЗ зв'язуючою афінністю продемонстровано на точковій діаграмі Фіг. 7. Кореляція між ЕК5БО знищення 266 і афінністю зв'язування білка становить 2-0,93.

Приклад 6 Лізис пухлинних клітин.

Біспецифічні антитіла «СОЗ ЕТЕ: а«ВСМА аналізували на здатність знищувати три різних лінії пухлинних клітин ВСМАх їі одну лінію ВСМА-негативних клітин шляхом перенаправлення активованих вихідних Т-клітин. В цьому експерименті пухлинні клітини змішували зактивованими всіма Т-клітинами в співвідношенні Е:Т 10:1 разом з додаванням біспецифічного антитіла. Результати продемонстровані на Фіг. 8ВА-60. Панель А демонструє знищення клітин

ВРМІ-8226, панель В демонструє знищення клітин МСІ-НО29, панель С демонструє знищення клітин 0-266 і панель ОО демонструєзнищення клітин К5б2, негативний контроль. Вісьх демонструє концентрацію антитіла, що застосовується, а вісь у демонструє 90 лізису пухлинних клітин через 6 годин після додавання антитіла.

Вимірювали рівень вивільнення цитокінів ІЛ-2 виміряний після культивування Т-клітин людини в спокої з різними лініями пухлинних клітин і зростаючими дозами біспецифічного антитіла «СО3 ЕЕ: сєВСМА. На Фіг. 9А проілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами КРМІ-8226, на Фіг. 98 проілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами МСІ1-

НУО29, на Фіг. 9С проілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами 0-266 і на Фіг. 90 проілюстровано вивільнення ІЛ-2, стимульоване клітинами К562, негативний контроль.

Рівень вивільнення цитокіну ІФН-у вимірювали після культивування Т-клітин людини в спокої з різними лініями пухлинних клітин і зростаючими дозами біспецифічного антитіла ОСОЗ ЕЕ: авсмА. Фіг. 10Адемонструє вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами КРМІ-8226, на Фіг. 108 проілюстровано вивільнення!ФН-у, стимульоване клітинами МСІ-НУО29, на Фіг. 10С проілюстровано вивільненняІ!ФН-у, стимульоване клітинами 0О-266 і на Фіг. 100 проілюстровано вивільнення ІФН-у, стимульоване клітинами К562, негативний контроль.

Приклади продемонстровані таким чином, щоб забезпечити звичайним фахівцям в цій галузі

Зо техніки повне розкриття і опис того, як виготовляти і застосовувати цей винахід, і не призначені для обмеження обсягу того, що автори винаходу вважають своїм винаходом, і вони не призначені для представлення того, що експерименти, наведені нижче, це все експерименти, які проводилися. Було вжито заходів для забезпечення точності відносно чисел, що застосовуються (наприклад, кількостей, температури і тому подібного), але деякі експериментальні помилки і відхилення повинні враховуватися. Якщо не вказано інше, частини являють собою частини по вазі, молекулярна маса являє собою середню молекулярну масу, температура представлена в градусах Цельсія, а тиск дорівнює або близькийдо атмосферного.

У той час як цей винахід було описано з посиланнями на конкретні варіанти його реалізації, фахівцям в цій галузі техніки слід розуміти, що можуть бути проведені різні зміниї еквіваленти можуть бути замінені без відходу від істинної суті і обсягу цього винаходу. Крім того, багато модифікацій можуть бути зроблені для того, щоб адаптувати конкретну ситуацію, матеріал, склад речовини, процес, технологічні стадії або стадії до завдання, суті і обсягу цього винаходу.

Передбачається, що всі зазначені модифікації знаходяться в межах обсягу формули винаходу, що додається.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 ТгіпКкКіеєїп, Маєпап уапвсПпоогеп, Мі

А1агеа, 5Пе11еу Еогсе

Наггів, Каєпегіпе

Рпат, ру «1205 Антитіла, які зв'язують СОЗ3 «1305 ТЕВО-001М02 «1505» 62/394,360 (516) «1515 2016-09-14

«150» 62/491,908 «1515 2017-04-28 «1605 22 «1705 БавЕе5ЕО для Міпдомав версія 4.0 «2105 1 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 1 сі Маї сбіп Гец Уаі Сіц бек сіу сі1у сі1у Гей Уа1і сбіп Рго с1у Агд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 20 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 25 теп сіп Месб Авзп б5ет Гей Агуд Аїа сій Авр ТПт Аїа Гей Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тут Агд їец сСіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег

Зо 115 120 «2105 2 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 2 сі Маї сб1іп Гец Маії сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаії ув Рго б1у 1У 1 5 19 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 зек біу І1е бБет Тгр Авп бег Сіу бБет Іїе с1іу Тут Аїа Авр бек Уаї1ї бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Авп бек Гей Тукг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 50 85 30 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тут Агд Гец сіу сі1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 55 «2105 З «2115 123

«212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 З сі Маї сбіп Гец Уаі Сіц бек сіу сі1у сі1у Гей Уаі1і сіп Рго с1у Агд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбіу Гуз СсС1у Гїец с1п Тгр Уаї1 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Ппув Бек Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп б5ет Гей Агуд Аїа сій Авр ТПт Аїа Гей Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт Агуд Сіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 4 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 4 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд

Зо 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 зек біу І1е бБет Тгр Авп бег Сіу бБет Іїе с1іу Тут Аїа Авр бек Уаї1ї бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агуд Рго бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 40 85 30 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт їец біу с1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Гей Уаії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 45 «2105 5 «2115 123 «212» Білок 50 «213» Ношто зарієпз «4005 5 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15 55 зет Гей Агд Гец бБег Сув Аї1а Аїа бек сіу Рпе ТПт РпПе Авр Авр Туг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45

Зек сбі1у І1їе Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе сіу Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп б5ет Гей Агуд Аїа сій Авр ТПт Аїа Гей Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт їец біу с1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 6 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 6 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 19 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Аїа Авп Тук 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 зек біу І1е бБет Тгр Авп бег Сіу бБет Іїе Авр Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув

Зо 85 30 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт Агуд Сіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120

З5 «2105 7 «2115 123 «212» Білок 40 «213» Ношто зарієпз «4005 7 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15 45 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Сіу Рпе ТПтІ Рпе Авп Авп Туг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 зо бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе Бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Авп Бек Гей Тукг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд біу бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Тут Бех Агуд сіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120

«2105 8 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 8 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу сіу с1у Гей Маі сбіп Рго сб1у «1У 1 5 19 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Аїа Авр Тук 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбіу Гуз СсС1у їец Сі Тгр Уаї1 35 40 45 зек біу І1е бБет Тгр Авп бег Сіу бБет Іїе с1іу Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 30 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт Агуд Сіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 9 «2115 123 «212» Білок

Зо «213» Ношто зарієпз «4005 9 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ Рпе Авр Авп Туг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 зо бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Ппув Бек Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Туг 5Бехт Агуд сбіу со1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Гей Уаї ТПх Уаі1їі бек 5бег 115 120 «2105 10 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 10 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авп Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 зек біу І1е бБет Тгр Авп бег Сіу Бек Іїе сіу Тут Азїа Авр бек Уаї1 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Азїа бі Авр ТПтІ Аїа Гец Тут Тук Сув 85 30 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт Агуд Сіу С1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 11 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 11 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ Рпе Авр Авр Туг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї

Зо 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 90 95 35 А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Туг 5Бехт Агуд сбіу со1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 40 «2105 12 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз 45 «4005 12 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бех Агуд Авр Авп Аїа Гуз Ап бет Іец Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агуд Рго бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тухк сіу бБет Тут бБегт Агуд Сіу сб1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 13 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 13 сі Маї сбіп Гец Уаі сі бек сіу сі1у с1у Гей Уаі біп Рго с1у Акгд 1 5 10 15 бек Тец Агд Тец бегт Сув Аїа А1їа бек сС1у Рпбе ТПтї Рпе Нів Авп Туг

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго біу Ппув бі1у Тїец Сі Тгр Уаї1 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 20 50 зо бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95 25 А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Туг бек їец сбіу с1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120

Зо «2105 14 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз

З5 «4005 14 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 40 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї бо 45 пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп Аза Гуз Авп бет Іец Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тух бБегт Агуд Сіу С1у Аїа Туг 50 1600 195 110

Сув сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 55 «2105 15 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз

Зо

«4005 15 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ Рпе Авр Авп Туг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 бек бі1у І1їе бБет Тгр Авп бет біу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 зо бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Ппув Бек Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа біц Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Туг бек їец сбіу с1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 16 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 16 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у РпПе ТПї РпПе Авр Авр Тукг

Зо 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аза Рго сбі1у Гуз СсС1у їец сб1ц Тгр Уаї1ї бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї бо 35 пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп Аїа Гуз Ппув бБет Ге Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тут Агд їец сСіу С1у Аїа Туг 40 1600 195 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 45 «2105 17 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз 50 «4005 17 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув біц Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30 55 А1а Меєс Ніз Тгр Уаі1 Агд сСіп Аза Рго сі1у Пув сС1у їец сі Ткр Уаї 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз Авп бек Гей Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гей Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа гув Авр бБег Акуд біу Тут б1у Авр Тут Агд Ге сіу с1у Аїа Туг 100 105 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120 «2105 18 «2115 123 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 18 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сі1у с1у с1у гей Уаі біп Рго б1у Акгд 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Рпе Авр Авр Тукг 20 25 30

А1ї1а Меє Ніз Ткр уаї Агд біп Аїа Рго біу Ппув СсС1у їєц с1ц Тгр Уаї1ї 35 40 45 бек сбі1у І1ї1е Бек Тгр Авп бек сбіу бБегхт Іїе с1у Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп Аза Гув Авп бет ТГІец Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агуд Рго бі Авр ТПтІ Аїа їец Тут Тут Сув 85 Зо 95

А1їа ув Авр бБет Акд сіу Тут с1у Авр Тут Агд їец сбіу сб1у Аїа Туг

Зо 1600 195 110

ТЕр сі1у сіп с1у ТПїх Ге Уа1 ТПхкх Уаі1ї! бек 5бег 115 120

З5 «2105 19 «2115 107 «212» Білок «213» Ношто зарієпз 40 «4005 19 січ Іїе Маї Мес ТПт сіп бет Ркго Аїа ТПтї Гей бегт Уаії Бех Рго с1У 1 5 10 15 січ Агуд Аза ТПт Гец бет Сув Акуд Аїа бБеїт біп бет Уаії! бет бет Авп 20 25 30 45 теп Аза Ттр Тут біп сбіп Гув Рго біу біп Аза Рго Агд Гей Іецй Іїе

Тук сі1у Аїа бет ТПїІ Агуд Аза ТПх с1іу Іїе Рго Аїа Ат9д Рпе Бех щу бо бек біу бек біу ТПкх бі Рпе ТПт ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп бек 50 65 70 75 80 біц Авр Рпе Аїа Ма! Тут Тут Сув сбіп біп Тут Авп Авп Тгр Рго Ттгр 85 Зо 95

ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105 55 «2105 20 «2115 243

«212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 20 сі Маї сбіп Гецп Гей біц бек сіу сі1у сі1у Гей Уаі1і сіп Рго сі1у щу 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ Уаі1ї бек бек Тук 20 25 30 сіу Меєсє бБег Ттр Уаі Агду сіп Аїа Ркго сі1у пув с1у Рго бій Тгр Уаї 35 40 45 бек сб1у І1ї1е Агд Ссіу бек Авр сіу бБет ТПІ Тут Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп о б5ет Гей Агд Аїа сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа пув сСіп б1у б1іш Авп Авр сіу Рго Робе Авр Нів Агд сС1у Сс1іп 01уУ 100 105 110

ТпПх Гец Уа1і! ТПтІ Уаїії бек бек біу біу б1і1у с1і1у Бех бі Уаї сіп Гец 115 120 125 теп сіц бет сіу сі1у б1у ге Уаі біп Рко сіу сіу бБет Гец Агд Іец 130 135 140

Ззек Сув Аї1а Аїа бек біу Рпе ТПт Уаії бБет бБетї Тут сіу Меє бек Тгр 145 150 155 160 уаї Акд сбіп Аза Рко сіу Пув сб1у Рго сій Тгр Уа1! бег С1у І1їе Агд 165 170 175 сіу бек Авр сб1у бБет ТПтІ Тут Тут Аїа Авр бек Уаі1і1 гув С1у Аг9д РІе 180 185 190

ТпПї Іїе бБет Акд Авр Авп бек пув Авп о ТПт Тец Тут Гецп сіп Меє Авп

Зо 195 200 205

Ззек гей Агд Аїа біцш Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув Аїа гуз сбі1іп ШУ 210 215 220

Сі Авп о Авр о сС1іу Рго Рбе Авзр Ніз Агд СсС1у біп с1у ТПт Гец Уаї ТЕГ 225 230 235 240

Уа1ї Бек 5екг «2105 21 «2115 119 «212» Білок «213» Ношто зарієпз «4005 21 сі Маї сбіп Гецп Гей біц бек сіу сі1у сі1у Гей Уаі1і сіп Рго сі1у щу 1 5 10 15

Ззек Гей Агд Гецп бет Сув Аїа Аїа бет сб1у РпПе ТПтї Уаі1ї бек бек Тук 20 25 30 сіу Меєсє бБег Ттр Уаі Агду сіп Аїа Ркго сі1у пув с1у Рго бій Тгр Уаї 35 40 45 бек сб1у І1їе Агд Ссіу бек Авр сіу бек ТПтІ Тут Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо

Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп о б5ет Гей Агуд Аїа сій Авр ТПт Аїа Уаії Тут Тук Сув 85 Зо 95

А1їа пув сСіп б1у б1іш Азп Авр сіу Рго Робе Авр Нів Агд сС1у Сс1іп 01уУ 100 105 110

ТБІ Ггец Уа1 Трг Уа1ї! бек 5бег «2105 22 «2115 128 «212» Білок «2135» Н. варієпв «4005 22 сбіп Гей біп Гец сіп сіц бет сіу Рко с1у Гей Уаії пув Рго бБет біп 1 5 10 15

ТпПЕх Гец бБет Гецп ТПтї Сузв ТПх Уа1і бек біу сіу бБет Іїе Бех Бех щу 20 25 о) сСі1у Нів Тут Тгр бет Тгр І1ї1е Агд СсСіп Нів Рго сС1у Пув сС1у Іецш СІ1ц 35 40 45

Тгр І1е сСі1у Тут І1е Нів Тут бБехт Сіу бБет ТПг Тут Тут Авп Рго 5бег 50 55 (219) теп Гпув бБет Акуд Уаії Іїе Іїе бек Уа1 Авр ТПтІ бБет Гув Авп сіп Ріе 65 70 75 80

Ззек Ггецп Гуз Ггецп Агуд бек Уа1 ТПгІ Аза Аза Авр ТПІ Аїа Уаї Тук Тук 85 930 35

Сузв Азїа Агд Тгр Агд Нів Авр І1е Робе Аза Аїа Тут Рго Тухк Туг Туг 100 105 110

Тук сі1у Месб Авр Уаі! Тгр с1у сіп с1у ТПтї Гец Уаії ТПтІ Уаї бек 5ег 115 120 125

Коо)

Claims (62)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Мультиспецифічне антитіло, яке містить: () перший зв'язуючий фрагмент, який має специфічність зв'язування для людської СОЗПєЄ, що містить: варіабельний домен важкого ланцюга, який містить: А) послідовність СОКІ, що містить ЗЕТЕОЮОМА, послідовність СОК2, що містить ІЗМУМ5ОЗ5І, і послідовність СОКЗ, що містить АКОЗБКОУСОУКІ сОАХ; В) послідовність СОКІ, що містить ЗЕТЕНМТУА, послідовність СОК2, що містить ІЗМУМ5ОЗ5І, і послідовність СОКЗ, що містить АКОЗБКОУСОУ5І СОАХ, і варіабельний домен легкого ланцюга, який містить послідовність СОМКІ, що містить О5М55М, послідовність СОК2, що містить СА, і послідовність СОКЗ, що містить ОО'УММУУРМЛ; і (її другий зв'язуючий фрагмент, який має специфічність зв'язування щодо пухлиноасоційованого антигену (ТАА) або пухлиноспецифічного антигену (Т5А).

2. Мультиспецифічне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що перший зв'язуючий фрагмент містить варіабельний домен важкого ланцюга, який містить послідовність СОМКІ, що містить СЕТЕООТА, послідовність СОК2, що містить ІЗМУМ5О5І, і послідовність СОКЗ, що містить АКОЗНамУарувіІ асдАу.

3. Мультиспецифічне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що перший зв'язуючий фрагмент містить варіабельний домен важкого ланцюга, який містить послідовність СОМКІ, що містить СЕТЕНМТУА, послідовність СОК2, що містить ІЗМУМ5О5І, і послідовність СОКЗ, що містить АКОЗНОамаруві аслАх.

4. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що: послідовності СОКІ, СОК2 і СОМКЗ у варіабельному домені важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента присутні в каркасі МН людини; і послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ у варіабельному домені легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента присутні в каркасі Мкарра людини.

5. Мультиспецифічне антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що: варіабельний домен важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності з зЗЕО ІЮ МО: 1; і варіабельний домен легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності з ФЕО ІЮ МО: 19.

6. Мультиспецифічне антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що: варіабельний домен важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності з зЗЕО ІЮО МО: 13; і варіабельний домен легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності з ФЕО ІЮ МО: 19.

7. Мультиспецифічне антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що: варіабельний домен важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність ЗЕОІЮ МО: 1; і варіабельний домен легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 19.

8. Мультиспецифічне антитіло за п. 6, яке відрізняється тим, що: варіабельний домен важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність ЗЕОІЮ МО: 13; варіабельний домен легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 19.

9. Мультиспецифічне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що другий зв'язуючий фрагмент містить одну варіабельну область важкого ланцюга в одній або тандемній конфігурації.

10. Мультиспецифічне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що перший зв'язуючий фрагмент містить поліпептидну субодиницю легкого ланцюга і поліпептидну субодиницю важкого ланцюга, і де другий зв'язуючий фрагмент містить поліпептидну субодиницю важкого ланцюга.

11. Мультиспецифічне антитіло за п. 10, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця легкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить константний домен легкого ланцюга.

12. Мультиспецифічне антитіло за п. 10, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить щонайменше один константний домен важкого ланцюга.

13. Мультиспецифічне антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить домен СНІ, домен СНІ та домен СНЗ. Зо

14. Мультиспецифічне антитіло за п. 13, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга першого зв'язуючого фрагмента містить шарнірну область, розташовану між доменом СНІ і доменом СНІ.

15. Мультиспецифічне антитіло за п. 10, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга другого зв'язуючого фрагмента містить щонайменше один константний домен.

16. Мультиспецифічне антитіло за п. 15, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга другого зв'язуючого фрагмента містить домен СНІ і домен СНЗ, але не домен

СНІ.

17. Мультиспецифічне антитіло за п. 15 або 16, яке відрізняється тим, що поліпептидна субодиниця важкого ланцюга другого зв'язуючого фрагмента містить шарнірну область, розташовану між другим зв'язуючим фрагментом та доменом СНІ.

18. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 13-17, яке відрізняється тим, що домени СН? ї СНЗ важкого ланцюга поліпептидної субодиниці першого зв'язуючого фрагмента та домени СН2 їі СНЗ важкого ланцюга поліпептидної субодиниці другого зв'язуючого фрагмента разом утворюють Ес-ділянку.

19. Мультиспецифічне антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що Ес-ділянка містить нативну послідовність Ес-ділянки ЇДО1 людини.

20. Мультиспецифічне антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що Ес-ділянка містить варіантну Ес-ділянку (91 людини.

21. Мультиспецифічне антитіло за п. 20, яке відрізняється тим, що варіантну Ес-ділянку Ідс1 людини сконструйовано для зменшення однієї або декількох ефекторних функцій.

22. Мультиспецифічне антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що Ес-ділянка містить нативну послідовність Ес-ділянки ІД4 людини.

23. Мультиспецифічне антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що Ес-ділянка містить варіантну Ес-ділянку (91 людини.

24. Мультиспецифічне антитіло за п. 23, яке відрізняється тим, що варіантну Ес-ділянку Ідс1 людини сконструйовано для зменшення однієї або декількох ефекторних функцій.

25. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 18-24, яке відрізняється тим, що Ес-ділянка була сконструйована для зменшення утворення гомодимера.

26. Фармацевтична композиція, що містить мультиспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 1-25.

27. Застосування мультиспецифічного антитіла за будь-яким з пп. 1-25 при приготуванні лікарського засобу для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує.

28. Застосування мультиспецифічного антитіла за будь-яким з пп. 1-25 в терапії у людини, яка цього потребує.

29. Застосування мультиспецифічного антитіла за будь-яким з пп. 1-25 в ефективній кількості для лікування захворювання або стану у людини, яка цього потребує.

30. Застосування за п. 29, яке відрізняється тим, що захворювання є автоіїмунним захворюванням.

31. Застосування за п. 29, яке відрізняється тим, що захворювання є раком.

32. Набір для лікування захворювання або розладу у людини, що потребує цього, який містить мультиспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 1-25 та інструкцію із застосування.

33. Набір за п. 32, який додатково містить щонайменше один додатковий реагент.

34. Набір за п. 33, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий реагент містить хіміотерапевтичний препарат.

35. Біспецифічна триланцюгова антитілоподібна молекула, що містить: першу поліпептидну субодиницю, яка містить: варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), що містить послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19; і константний домен легкого ланцюга (СІ); другу поліпептидну субодиницю, що містить: варіабельний домен важкого ланцюга (МН), що містить: () послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1; або (ії) послідовність зЕО ІЮО МО: 13; і константний домен важкого ланцюга (СН), що містить домен СНІ, шарнірну область, домен СНО, домен СНЗ; де варіабельний домен легкого ланцюга і варіабельний домен важкого ланцюга разом утворюють перший зв'язуючий фрагмент, який має специфічність зв'язування для людської СОзЗпе;і третю поліпептидну субодиницю, що містить: одиночну варіабельну область важкого ланцюга в одинарній або тандемній конфігурації, яка Зо має специфічність зв'язування для пухлиноасоційованого антигену (ТАА) або пухлиноспецифічного антигену (Т5А); і константний домен важкого ланцюга (СН), що містить шарнірну область, домен СН2 та домен СНУЗ, за відсутності домену СНІ.

36. Біспецифічна триланцюгова антитілоподібна молекула за п. 35, яка відрізняється тим, що константний домен важкого ланцюга другої поліпептидної субодиниці та константний домен важкого ланцюга третьої поліпептидної субодиниці були сконструйовані для зменшення однієї або декількох ефекторних функцій.

37. Біспецифічна триланцюгова антитілоподібна молекула за п. 35 або 36, яка відрізняється тим, що константний домен важкого ланцюга другої поліпептидної субодиниці та константний домен важкого ланцюга третьої поліпептидної субодиниці були сконструйовані для зменшення утворення гомодимера.

38. Фармацевтична композиція, що містить біспецифічну триланцюгову антитілоподібну молекулу за будь-яким з пп. 35-37.

39. Застосування біспецифічної триланцюгової антитілоподібної молекули за будь-яким з пп. 35-37 у приготуванні лікарського засобу для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує.

40. Застосування біспецифічної триланцюгової антитілоподібної молекули за будь-яким з пп. 35-37 в терапії у людини, яка цього потребує.

41. Застосування біспецифічної триланцюгової антитілоподібної молекули за будь-яким з пп. 35-37 в ефективній кількості для лікування захворювання або стану у людини, яка цього потребує.

42. Застосування за п. 41, яке відрізняється тим, що захворювання є автоіїмунним захворюванням.

43. Застосування за п. 41, яке відрізняється тим, що захворювання є раком.

44. Набір для лікування захворювання або розладу у людини, що потребує цього, який містить біспецифічну триланцюгову антитілоподібну молекулу за будь-яким з пп. 35-37 та інструкцію із застосування.

45. Набір за п. 44, який додатково містить щонайменше один додатковий реагент.

46. Набір за п. 45, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий реагент містить бо хіміотерапевтичний препарат.

47. Застосування фармацевтичної композиції за п. 26 для приготування лікарського засобу для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує.

48. Застосування фармацевтичної композиції за п. 26 в терапії у людини, яка цього потребує.

49. Застосування фармацевтичної композиції за п. 26 в ефективній дозі для лікування захворювання або стану у людини, яка цього потребує.

50. Застосування за п. 49, яке відрізняється тим, що захворювання є автоіїмунним захворюванням.

51. Застосування за п. 49, яке відрізняється тим, що захворювання є раком.

52. Набір для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує, що містить фармацевтичну композицію за п. 26 та інструкцію із застосування.

53. Набір за п. 52, який додатково містить щонайменше один додатковий реагент.

54. Набір за п. 53, в якому щонайменше один додатковий реагент містить хіміотерапевтичний препарат.

55. Застосування фармацевтичної композиції за п. 38 для приготування лікарського засобу для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує.

56. Застосування фармацевтичної композиції за п. 38 в терапії у людини, яка цього потребує.

57. Застосування фармацевтичної композиції за п. 38 в ефективній дозі для лікування захворювання або стану у людини, яка цього потребує.

58. Застосування за п. 57, де захворювання є автоїмунним захворюванням.

59. Застосування за п. 57, яке відрізняється тим, що захворювання є раком.

60. Набір для лікування захворювання або розладу у людини, яка цього потребує, що містить фармацевтичну композицію за п. 38 та інструкцію із застосування.

61. Набір за п. 60, який додатково містить щонайменше один додатковий реагент.

62. Набір за п. 61, в якому щонайменше один додатковий реагент містить хіміотерапевтичний препарат. НЕ НЕ СЕОЩВУМЛУ ЧЕК і ХОПЖЖВИКІ ІЕМ ТОМУВІУКАХ : ! ЗА Н Емо щих ЕС РОКОМ і ТЕКУ УВК: НЕ іще Ж БВ ІЗ ЗЕКЕЦИЕК. ! ІВЖИНУКІ інве ! рашжедя НЕ ІОН ЗЕКЖННЕА ОрІШИИЗИСІ і ЕМВ Е ЗВИК і й шко а ше

Фіг. ТА А ЗІ ИХ іш. ІЮ МІВ о ОЕБЕЦЕМ БЕ ІБК КО Ж, і : ї

Фіг. 1

Фіг. 1С знтисо прот втуклннннй ех а сад У ОХ Ф, й щи

Фіг. 7А зневкіа преотепукввенний шик С де ді Зо

Фіг. 2: зм Ще пЕВОТИГЕХЛлЕЗНЕ М п й Ще А

Фіг. 20 нти КМІ Првлпипухикианае «З анінгеЖ ВОК Ки С о

Фіг. 20 Геднатов мк ВНІНМЙ БУКЕТ кт км ко -

Фіг. 2Е

Коланка у сти 7 5 "і 12 АК КИСКИЖх 1 Не и Зк. Й Б І ї ЕХО ІСП ЕНИН НЕ АНТИ кетаруая ІЗ ; ВСПЕЦИНУНЕАНТИПЛО АНІС ВА - сдптлчкнилсли, 1 М! рити і їй Зп'язування п ВОМ ЩО я Я ян! 1 ПИ і їх я вк Зв'язування | ше ях Б Би В пк | і ати сра) вки о кін і ! ше. | вшни и нин ФІ супе СК і 1 і | І 1 ЕКО ї т і нання вдоіБедтнимя 357 : ану Зв'язування! дев ОД и З дозібсатномя 3 37 ЯМ нищення: зрзнищення | КО Зв'язування ша ЗК до лука свя вс, у для іш ІНЕЛеЛІ панель і й клітяно З кри А кое совно спа ЕаЕеВеМА ВИ КОХ ПМК А СК Занглят НМ) іожансюу, ЗБАВ о ї В ЛЕ МА В пен НИ от сети шана А и сх шедемА ОВ пух сення пр сов, Золя ПАК Ки Сх менш о тА ОК НКУ те о КК Бе Вр шен ОККО Сон ох воскасма Боба ВН ОО по Меси мее З х ОК и и Ма иа ча ВО ОА, и око В Сх ЕН иа ай А їй «нні ВК жо о я Си и и кв я пи Кия КДКА ОЗ БеВСМА Я Ен Б У Яке м и у зіЕоЮ о з й ж ШИ их АКЄТСЮМИМИ фот й ОД во. де Ох СО ТИМ лух ПВ о ей ЗА ра М по них УЛ ОК КН А т пт КЕ СО РІАВСМА 55 05 а. 0 5 чек МИША и ос ра и х имя ожив й. ИН х дя АК в дл вв поруку Сн «5055 о Ин КЕ о УВА - ЕК их в шви ТЯ Саня Дао ОК сито ин ВИ тися СПЕ ЕЗВ.ВОМА Бог оо ШИ у Уя яка СУ АК ЯК і Ї зіз5аа а де 0Ш.0ЕМВСМА С Ве паговн тва В я Ся ю 4 ри яку ни Кр и рухи КО иа 1 5 голи ке ие сез шевсмА Б КЕ ей ПЛОВ я ре за?о3 5 и и ол я по ДЕ, пал ннт ОММИМ МЕМ пл пек их нависла зв ТЕ ИММЕ Ки ки ся го СД Ми дп ВСМА смак ака и мет кис ПЕВ мак КС ТЕМИИУ ос люкм зва и тля У о АКА я ди ий в КК а АК КИ ак МВ Я О Кх ОА оЕмац КО й

Фіг. З ї Крива знищення 02 ї : ; ня : ПВ пря чаве ї як о пфреннтнн ння я Я Й й Й зе І ЯБИЯ : к : пи нн ни : ОВО хікинняя км І І І І "ЗБ Еш Б : нин СЮ фоні, СЯ ххх зі2585 і В З сш ше ни: Н ке Я КУ ними нн пн Н Ж ж п НИК се Н їй : пише вени ния Шо Я Н ї рих : ес са ШО : ї 10 нин НЕСИСЙ я я я ВА ВВ : : ке НН сан: ин НИ п Н пп КО о БО щі дження зжхехкх З у Н : ї т Ж осн тя й жу й УК ї : тс рев щі з «Ву оон Ток В КОЕ Н ї З сіє сов - он ге миша Ї нини -т : ши доза бБедт не/ма !