CN105777906B - 抗pd-l1全人抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗PD‑L1全人抗体及其应用，具体地，本发明通过酵母展示技术筛选到能够特异性结合PD‑L1的全人抗体，并通过亲和力成熟进一步改善了抗体的亲和力。本发明的抗PD‑L1全人抗体特异性好，亲和力高，稳定性好，可以通过和活化的T细胞结合增强T细胞的活化作用，并对肿瘤生长具有显著的抑制作用。本发明还涉及该抗PD‑L1全人抗体用于诊断、治疗与PD‑L1相关的肿瘤的用途。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，涉及抗PD-L1全人抗体及其医药用途。
背景技术
T细胞在对外源抗原做出应答时需要抗原递呈细胞APC向静止的T淋巴细胞提供两个信号：第一个信号是：T细胞借助TCR识别与MHC分子结合的抗原肽，通过TCR/CD3复合体传递抗原识别信号；第二信号是：由一系列的协同刺激分子提供；这样T细胞才能正常的活化，从而产生正常的免疫应答。根据第二信号产生效应不同，可将协同刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子，正性和负性协同刺激信号的调节及两者之间的平衡在机体免疫应答的整个过程中起着重要的调节作用。
PD-1是CD28受体家族的一员，该家族还包括CTLA4,CD28,ICOS和BTLA。该家族的最初成员CD28和ICOS是通过添加单克隆抗体后可以增加T细胞增殖的功能而发现的(Hutloff等(1999)Nature 397:263-266；Hansen等(1980)Immunogenics 10:247-260)。PD-1的配体包括PD-L1和PD-L2，已有的研究结果表明，受体和配体结合后会下调T细胞的活化和相关细胞因子的分泌(Freeman等(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等(2001)Nat Immunol2:261-8；Carter等(2002)Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等(2005)Clin cancer Res11:2947-53)。
PD-L1(B7-H1)是细胞表面糖蛋白，属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部。该基因于1999年首次被发现并克隆(Dong H等(1999)Nat Med 5:1365-1369)，它与T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。PD-L1除了和T细胞上表达的PD-1作用外，在T细胞上表达的PD-L1可以和APC上的CD80相互作用传导负向信号，抑制T细胞的功能。PD-L1除了在巨噬细胞谱系的细胞上表达外，在人类正常的组织中表达量较低，但是在一些肿瘤细胞系上有却有着较高的表达，例如：肺癌，卵巢癌，结肠癌和黑色素瘤(Iwai等(2002)PNAS 99:12293-7；Ohigashi等(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。已有的结果显示，肿瘤细胞高表达的PD-L1通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。研究者发现，转染PD-L1基因的P815肿瘤细胞系在体外可抵制特异性CTL的裂解，将其接种小鼠体内后具有更强的致瘤性和侵袭性。这些生物学特性均可通过阻断PD-L1而逆转。敲除PD1基因的小鼠，阻断PD-L1/PD-1通路，则接种肿瘤细胞不能形成肿瘤(Dong H等(2002)Nat Med 8:793-800)。
本领域仍需要能够与PD-L1高亲和性结合、并且能够阻断PD-1与PD-L1结合的抗PD-L1抗体。
发明内容
本发明的发明人利用酵母展示技术，通过筛选和亲和力成熟得到了具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的抗PD-L1全人抗体，由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括选自于如下一组的CDR区：
(1)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4-6所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列；
(2)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：7-9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：10-12所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列；
(3)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：13-15所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：16-18所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列；
(4)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1、2、19所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4-6所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列；
(5)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：7、20、9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：10-12所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列；
(6)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：13-15所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：21、17、18所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％的序列。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其还包括选自于如下一组的重链可变区框架区：
1)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：22-25所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
2)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：30-33所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
3)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：38-41所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
4)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：30-33所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其还包括选自于如下一组的轻链可变区框架区：
1)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：26-29所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
2)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：30-33所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
3)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：38-41所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
4)FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：30-33所示，或分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括选自于如下一组的重链可变区：
其序列如SEQ ID NO：47、49、51、53、54所示，或者分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括选自于如下一组的轻链可变区：
其序列如SEQ ID NO：48、50、52、55、56所示，或者分别与上述序列的同一性大于70％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
在本发明的一个实施方案中，当其为scFv时，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区之间还含有连接肽。
在本发明的具体实施方案中，所述连接肽的序列如SEQ ID NO：67所示。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其为全抗体。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的实施方案中，其重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明的具体实施方案中，其重链恒定区为IgG1。
在本发明的具体实施方案中，IgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
根据本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其轻链恒定区为κ型或λ型。
在本发明的具体实施方案中，κ型轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示。
在本发明的具体实施方案中，λ型轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：72所示。
本发明第二方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，所述的抗体重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-3；
(ii)SEQ ID NO：7-9；
(iii)SEQ ID NO：13-15；
(iv)SEQ ID NO：1、2、19；
(v)SEQ ID NO：7、20、9。
根据本发明第二方面任一项的核酸分子，所述的抗体重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或上述序列框架区中含有一个到几个氨基酸的替换。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子包含选自如SEQ ID NO：57-61所示的序列。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子还包含能够编码抗体重链恒定区的核酸序列；所述重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的实施方案中，其重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明的具体实施方案中，其重链恒定区为IgG1。
在本发明的具体实施方案中，IgG1的核酸序列如SEQ ID NO：69所示。
本发明第三方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，所述的抗体轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：4-6；
(ii)SEQ ID NO：10-12；
(iii)SEQ ID NO：16-18；
(iv)SEQ ID NO：21、17、18。
根据本发明第三方面任一项的核酸分子，所述的抗体轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56或上述序列框架区中含有一个到几个氨基酸的替换。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子包含选自如SEQ ID NO：62-66所示的序列。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子还包含能够编码抗体轻链恒定区的核酸序列；所述轻链恒定区为κ型或λ型。
在本发明的具体实施方案中，κ型轻链恒定区的核酸序列如SEQ ID NO：70所示。
在本发明的具体实施方案中，λ型轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：72所示。
本发明第四方面涉及载体，其含有本发明第二或第三方面任一项的核酸分子。
根据本发明第四方面任一项的载体，其含有本发明第二方面任一项的核酸分子和第三方面任一项的核酸分子。
本发明第五方面涉及宿主细胞，其含有本发明第二或第三方面任一项的核酸分子或本发明第四方面任一项的载体。
本发明第六方面涉及偶联物，其含有本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，以及其它生物活性物质，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分直接或通过连接片段与其它生物活性物质偶联。
在本发明的实施方案中，所述其它生物活性物质选自可直接或间接抑制细胞生长或杀灭细胞、或通过激活机体免疫反应从而抑制或杀灭细胞，从而达到治疗肿瘤的化学物质、毒素、多肽、酶、同位素、细胞因子或其他具有生物活性的单一物质或混合物质，例如Auristatin MMAE、Auristatin MMAF、Maytansine DM1、Maytansine DM4、卡奇霉素(calicheamicin)、duocarmycin MGBA、阿霉素(doxorubicin)、蓖麻毒素、白喉毒素等毒素、I131、白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒等。
本发明第七方面涉及组合物(例如药物组合物)，其含有本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面任一项的核酸分子、第四方面任一项的载体、第五方面任一项的宿主细胞、或者本发明第六方面任一项的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
根据本发明第七方面任一项的组合物(例如药物组合物)，所述其它生物活性物质包括但不限于其它抗体、融合蛋白或药物(例如抗肿瘤药物，如放、化疗药物)。
本发明还涉及试剂或试剂盒，其含有本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，所述检测试剂或试剂盒用于检测PD-L1蛋白或其衍生物是否存在。
本发明还涉及诊断试剂或试剂盒，其含有本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，所述诊断试剂或试剂盒用于在体外(例如细胞或组织)或体内(例如人或动物模型)诊断与PD-L1相关的疾病(例如肿瘤或病毒感染，例如PD-L1高表达的病毒感染或PD-L1高表达的肿瘤)。
在本发明的实施方案中，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分还偶联有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌。
在本发明的实施方案中，所述病毒感染包括但不限于急性，亚急性或慢性HBV，HCV，HIV感染。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面任一项的核酸分子、第四方面任一项的载体、第五方面任一项的宿主细胞、第六方面任一项的偶联物或第七方面任一项组合物用于制备预防或治疗与PD-L1相关的疾病(例如肿瘤或病毒感染，例如PD-L1高表达的肿瘤或PD-L1高表达的病毒感染)的药物的用途。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤是指与PD-L1相关的肿瘤，例如是指高表达PD-L1的肿瘤。
在本发明的具体实施方案中，其中所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌。
在本发明的实施方案中，所述病毒感染包括但不限于急性，亚急性或慢性HBV，HCV，HIV感染。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分用于制备诊断与PD-L1相关的疾病(例如肿瘤或病毒感染，例如PD-L1高表达的肿瘤或PD-L1高表达的病毒感染)的试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤是指与PD-L1相关的肿瘤，例如是指高表达PD-L1的肿瘤。
在本发明的具体实施方案中，其中所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌。
在本发明的实施方案中，所述病毒感染包括但不限于急性，亚急性或慢性HBV，HCV，HIV感染。
在本发明的实施方案中，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分还偶联有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分用于制备预防或治疗与CD80相关的疾病的药物的用途。
在本发明中，所述CD80相关的疾病例如为与CD80高表达相关的疾病。
本发明还涉及预防或治疗与PD-L1相关的疾病(例如肿瘤或病毒感染，例如PD-L1高表达的肿瘤或PD-L1高表达的病毒感染)的方法，所述方法包括给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面任一项的核酸分子、第四方面任一项的载体、第五方面任一项的宿主细胞、第六方面任一项的偶联物或第七方面任一项组合物，以及任选的与辐射治疗(例如X线照射)方法联用。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤是指与PD-L1相关的肿瘤，例如是指高表达PD-L1的肿瘤。
在本发明的具体实施方案中，其中所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌。
在本发明的实施方案中，所述病毒感染包括但不限于急性，亚急性或慢性HBV，HCV，HIV感染。
本发明还涉及预防或治疗与CD80相关的疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明第一方面任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分。
在本发明中，所述与CD80相关的疾病例如为与CD80高表达相关的疾病。
以下对本发明做进一步描述：
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，PD-L1)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在本发明中，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头(连接肽)由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在本发明的实施方案中，所述连接肽的序列为(GGGGS)3。
在一些情况下，抗体是双特异性抗体，其能够分别和两种抗原或抗原表位结合，其包括特异性结合第一抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分，以及特异性结合第二抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分。在本发明的实施方案中，所述双特异性抗体中结合第一抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分可以为本发明任一项的抗体或其抗原结合部分，所述特异性结合第二抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分可以为其它抗PD-L1抗体或其抗原结合部分或者针对其它抗原的抗体或其抗原结合部分。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
在本发明中，所述抗原结合部分包括单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、scFv-Fc二价分子、dAb和互补决定区(CDR)片段、Fab片段、Fd片段、Fab'片段、Fv和F(ab')2片段。
在本发明中，所述IgG1重链恒定区包括各种同种异型，如G1m(f)、G1m(z)、G1m(z,a)或G1m(z,a,x)。在本发明的实施方案中，所述IgG1重链恒定区为G1m(f)型。
在本发明中，所述κ轻链恒定区包括各种同种异型，如Km1、Km1,2或Km3。在本发明的的实施方案中，所述κ轻链恒定区为Km3型。
在本发明中，所述λ轻链恒定区包括各种同种异型，如λⅠ、λⅡ、λⅢ、λⅥ。在本发明的的实施方案中，所述λ轻链恒定区为λⅡ型。
本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗PD-L1抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗PD-L1抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的CDR序列。互补决定区(complementary determinant region，CDR)是与抗原表位结合的部位，本发明中的CDR序列通过IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)进行确定。但是不同的划分方法得到的CDR序列稍有不同。
本发明的一方面涉及编码抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链和轻链可变区序列的核酸分子。抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID N0:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61和SEQ ID N0:59。抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50轻链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID N0:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:62、SEQID NO:65和SEQ ID NO:66。本发明还涉及包含了抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链和轻链可变区序列的核酸分子变异体或类似体。
另一方面，本发明还涉及各种分离的核酸分子的变异体，具体地，核酸变异体的序列与如下核酸序列SEQ ID N0:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:65和SEQ ID NO:66的相同性至少达70％、优选至少达75％、更优选至少达80％、更优选至少达85％、更优选至少达90％、最优选至少达95％。
本发明更进一步还涉及编码抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链可变区为氨基酸序列SEQ ID NO:47、49、51、53、54、51的所对应被分离的核酸分子。本发明还涉及编码抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO:48、50、52、48、55、56的所对应的核酸分子。
本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。
抗体氨基酸序列
单抗B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链和轻链可变区氨基酸序列可以从对应的核酸序列中推导得到。抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50重链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO:47、49、51、53、54、51。抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO:48、50、52、48、55、56。
另一方面，本发明提供的抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:47、49、51、53、54或51的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。
另一方面，本发明提供的抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:48、50、52、48、55或56的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。
抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50的重链和轻链可变区的CDR的氨基酸序列确定如下：
抗体B60-55重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-3。抗体B60-55轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别SEQ ID NO：4-6。
抗体BⅡ61-62重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7-9。抗体BⅡ61-62轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：10-12。
抗体B50-6重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：13-15。抗体B50-6轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：16-18。
另一方面，抗PD-L1抗体的重链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNO：1-3、7-9、13-15、19、20上出现一个或多个氨基酸的突变或增添或缺失。优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
另一方面，抗PD-L1抗体的轻链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNO：4-6,10-12、16-18、21上出现一个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
抗体B60-55、BⅡ61-62、B50-6、B60、BⅡ61和B50的重链和轻链可变区的FR的氨基酸序列确定如下：
抗体B60-55、B60重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：22-25。轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：26-29。
抗体BⅡ61-62重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：30-33。轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：34-37。
抗体B50-6、B50重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：38-41。轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：42-45。
抗体BⅡ61重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：30-33。轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别为SEQ ID NO：34、46、36、37。
另一方面，抗PD-L1抗体的重链或轻链可变区FR的氨基酸序列可能是在SEQ IDNO：22-46上出现一个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
上述抗体或CDR区或框架区的氨基酸发生突变、添加或缺失之后的变异体仍然保留特异性结合人PD-L1的能力。本发明也包含这样的抗原结合部分的变异体。
本发明的单抗变异体可以通过传统的基因工程方法获得。本领域的技术人员完全知晓利用核酸突变改造DNA分子的方法。另外，编码重链和轻链变异体的核酸分子也可以通过化学合成获得。
在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的氨基酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在本发明中，所述与氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列包括与所述氨基酸序列基本同一的多肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多肽序列相比含有至少70％序列同一性、优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的那些序列。
在本发明中，术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab'片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。再如，F(ab')2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab')2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。
在本发明中，“特异性结合”指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10- 6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
在本发明的实施方案中，本发明的抗PD-L1抗体能够特异性地与人PD-L1或同时和小鼠PD-L1结合，而不与PD-L2和B7H3结合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗PD-L1抗体能够与hPD-1竞争结合hPD-L1。
在本发明中，与PD-L1相关的疾病例如包括与PD-L1相关的肿瘤或病毒感染，特别是与PD-L1高表达相关的肿瘤或病毒感染。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌。
在本发明的实施方案中，所述病毒感染包括但不限于急性，亚急性或慢性HBV，HCV，HIV感染。
在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并入本文。
发明的有益效果
本发明利用酵母展示技术，通过筛选和进一步亲和力成熟得到了具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的抗PD-L1全人抗体，该抗体能够特异性地与人PD-L1或同时和鼠PD-L1结合，并且不与B7H3和PD-L2结合，其可以通过和活化的T细胞结合进而增强T细胞的活化作用，对肿瘤生长具有显著的抑制作用。
附图说明
图1：纯化的anti-hPD-L1scFv对hPD-L1/hPD-1配体-受体结合的抑制。
X-轴表示EGFP的荧光强度，Y-轴表示SA-PE的荧光强度。A为空白对照，B为阴性对照，C为B50scFv，D为B60scFv，E为BⅡ61scFv。
图2亲和力成熟筛选后得到与hPD-L1亲和力提高的酵母
其中X-轴表示myc的荧光强度(myc阳性表示表达完整抗体片断的酵母)，Y-轴表示结合抗原能力的SA-APC的荧光强度。
图3亲和力成熟后得到的抗体与hPD-1竞争结合hPD-L1的能力的比较
其中横坐标为抗体浓度(单位：ng/ml)，纵坐标为OD值。
其中A为BⅡ61与BⅡ61-62的比较，B为B50和B50-6的比较，C为B60和B60-55的比较。
图4ELISA法检测anti-hPD-L1抗体与hPD-L1结合能力
其中横坐标为抗体浓度(单位：ng/ml)，纵坐标为OD值。
图5竞争ELISA检测anti-hPD-L1抗体与hPD-1竞争结合hPD-L1的能力
其中横坐标为抗体浓度(单位：ng/ml)，纵坐标为OD值。
其中Graph#5为BⅡ61-62mAb，Graph#2为B50-6mAb，Graph#3为B60-55mAb。
图6通过竞争ELISA方法检测anti-hPD-L1抗体与CD80竞争结合hPD-L1的能力
图7anti-hPD-L1抗体特异性检测
其中X-轴为EGFP荧光强度，Y-轴为相对应的抗体结合的荧光强度，A为空白对照，B为阴性对照，C为BⅡ61-62mAb，D为B60-55mAb，E为B50-6mAb；
(1)为hPD-L1-EGFP蛋白，(2)为hB7H3-EGFP，(3)为hPD-L2-EGFP蛋白。
图8anti-hPD-L1抗体与mPD-L1结合的能力
其中X-轴为EGFP荧光强度，Y-轴为相对应的抗体结合的荧光强度，A为空白对照，B为阴性对照，C为B60-55mAb，D为BⅡ61-62mAb，E为B50-6mAb；
(1)为hPD-L1-EGFP蛋白，(2)为mPD-L1-EGFP蛋白。
图9anti-hPD-L1抗体与食蟹猴PD-L1结合的能力
图10anti-hPD-L1抗体对CD4+T细胞的激活作用
图11anti-hPD-L1抗体B50-6对肿瘤生长的抑制活性
图12anti-hPD-L1抗体B60-55，BⅡ61-62对肿瘤生长的抑制活性
其中A为用药剂量为3mg/kg时，BⅡ61-62mAb和B60-55对肿瘤生长的抑制作用；B为不同用药剂量的BⅡ61-62mAb对肿瘤生长的抑制作用。
图13B60-55与抗体2.41H90P的稳定性比较
其中A为B60-55与抗体2.41H90P随时间变化的IC50值；
B为抗体二聚体随时间变化的比例；
C为B60-55加速稳定实验的竞争ELISA结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1重组人PD-L1、PD-1的表达和相关EGFP细胞制备
根据蛋白数据库Uniprot上人PD-L1的氨基酸序列(Q9NZQ7)，得到人PD-L1胞外结构域的氨基酸序列(即Q9NZQ7中第1位残基至238位残基)；根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)；根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01868)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01868中第98位残基至324位残基)。利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列得到hPD-L1-Fc，hPD-L1-muFc融合蛋白的基因，按照同样的方法得到hPD-1-Fc的基因。根据蛋白数据库Uniprot上信息得到增强型绿色荧光蛋白EGFP氨基酸序列(C5MKY7)，人PD-L1的氨基酸序列(Q9NZQ7)，鼠PD-L1的氨基酸序列(Q9EP73)，人PD1的氨基酸序列(Q15116)。利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列得到PD-L1-EGFP融合蛋白的基因，按照同样的方法得到hPD-1-EGFP和mPD-L1-EGFP的基因。通过人工合成的方式得到其DNA片段。合成好的基因序列分别经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4-hPD-L1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-muFc、pcDNA4-hPD1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-EGFP、pcDNA4-hPD1-EGFP、pcDNA4-mPD-L1-EGFP。
利用反转录-聚合酶链式反应RT-PCR技术从实验室培养的树突状细胞(DC细胞)(该DC细胞由PBMC中分离的单核细胞经过TNF-α成熟而来)中扩增人的PD-L2、B7H3基因，扩增引物如下：PDL2-FHindIII：
GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG(SEQ ID NO：74)，PDL2-R EcoI：
GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC(SEQ ID NO：75)；hB7H3-F HindIII：
GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC(SEQ ID NO：76)，hB7H3-R BamHI：
GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC(SEQ ID NO：77)；得到的PCR产物经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到已构建好的pcDNA4-hPD-L1-EGFP中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4-hPD-L2-EGFP、pcDNA4-hB7H3-EGFP。
将相关的EGFP重组质粒转染到HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞中，转染48h后通过荧光激活信号分选(FACS)确认hPD1、hPD-L1、mPD-L1、hPD-L2、hB7H3的表达。
将pcDNA4-hPD-L1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-muFc、pcDNA4-hPD1-Fc瞬时转染至HEK293中细胞用于蛋白生产。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)。四小时后再补加EX293培养基，2mM Glutamine和50μg/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM丙戊酸钠(VPA)。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过Protein A亲和层析法，初步纯化得到hPD-L1-Fc、hPD-L1-muFc和hPD-1-Fc蛋白样品，用于以下各实施例。得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测，可以清晰的看到目的条带。
实施例2：从酵母展示文库中筛选anti-hPD-L1抗体，克隆表达和鉴定
采用酵母展示技术筛选针对PD-L1的全人抗体。通过克隆来自21个健康人的脾脏和淋巴结IgM，IgG cDNA中的VH和VL基因到特定载体，构建scFV酵母展示文库(VH和VL中间的连接序列是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：67)连接肽)，库容为5×108。将10倍库容的酵母库复苏，诱导酵母表面表达抗体，用100nM生物素化的hPD-L1抗原利用磁珠分选的方式富集二次，然后用anti-myc抗体和生物素化的hPD-L1做流式分选再富集两次。得到的酵母涂板，挑取单克隆。单克隆酵母经扩增和诱导表达后用anti-myc抗体和生物素化的hPD-L1或对照抗原hPD-1染色分析，抗原阳性/对照酵母阴性的酵母为阳性酵母。
将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序，PCR引物为：pNL6-F：GTACGAGCTAAAAGTACAGTG(SEQ ID NO：78)；pNL6-R：TAGATACCCATACGACGTTC(SEQ ID NO：79)；测序的引物为pNL6-R。得到测序结果后用BioEdit软件对序列进行比对分析。
将上述得到的单链抗体scFv基因及之前提到的人IgG1-Fc基因融合后经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切克隆到商业化载体pEE6.4(Lonza)中，按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在HEK293细胞中瞬时表达，并通过protein A柱纯化。
取hPD-L1-EGFP细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入上述纯化后的anti-hPD-L1scFv抗体，同时设置相关对照，阴性对照为2μg的hIgG1蛋白，阳性对照加入hPD-1-Fc。二抗为eBioscience的anti-hIg-PE。染色完毕后流式细胞仪进行检测。以此方法鉴定能结合细胞表面PD-L1抗原的抗体。
取hPD-L1-EGFP细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入上述纯化后anti-hPD-L1scFv抗体，同时设置阴性对照，阴性对照为2μg的hIgG1蛋白，所有样本加入0.3μg hPD-1-Fc-biotin，二抗为eBioscience的SA-PE，染色完毕后流式细胞仪进行检测，结果见图1。以此方法鉴定能阻断细胞表面PD-L1抗原和PD-1结合的抗体。
经过筛选和鉴定后得到三株特性较好的抗体分别是B50，B60，BⅡ61。通过结果可以看出，三株抗hPD-L1的抗体均能够阻断其与受体hPD-1的结合。
上述抗体重链和轻链可变区之间含有连接肽序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：67)。
其中B50的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：51)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：13-15；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：38-41；
其对应的DNA序列为：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAACTTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO：59)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(SEQ ID NO：56)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：21、17、18；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：42-45；
其对应的DNA序列为：
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC(SEQ ID NO：66)。
B60的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：53)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：1、2、19；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：22-25；
其对应的DNA序列为：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：60)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：48)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：4-6；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：26-29；
其对应的DNA序列为：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：62)。
BⅡ61的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVK SRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：54)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：7、20、9；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：30-33；
其对应的DNA序列为：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：61)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：55)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：10-12；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：34、46、36、37；
其对应的DNA序列为：
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA(SEQ ID NO：65)。
实施例3：anti-hPD-L1scFv亲和力改善的酵母文库构建
分别以pEE6.4-B50-Fc，pEE6.4-B60-Fc，pEE6.4-BⅡ61-Fc质粒为模板，pEE6.4-F:TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC(SEQ ID NO：80)和cMyc-BBXhoI:GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG(SEQ ID NO：81)为引物进行标准PCR反应。得到的PCR产物经Fermentas公司的NheI和BglII克隆至商业化载体pCT302(addgene：#41845)中，得到pCT302-B50，pCT302-B60，pCT302-BII61重组质粒。接下来参考文献Ginger等(2006)Nat Protoc 1(2):755-68的方法，利用error prone PCR的方法获得scFv随机突变的PCR产物。所用的引物为T7proshort：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：82)和Splice4/L:GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT(SEQ ID NO：83)。得到的PCR产物经Fermentas公司GeneJETDNA purification Kit纯化后再乙醇沉淀浓缩至浓度大于1μg/μl。利用Fermentas公司NheI和BamHI双酶切商业化载体pCT302，同时用Fermentas公司FastAP去磷酸化酶对酶切后载体去磷酸化，再用Fermentas公司GeneJET DNA purification Kit纯化后，乙醇沉淀浓缩至浓度大于1μg/μl。参考文献Ginger等(2006)Nat Protoc 1(2):755-68的方法，利用酵母电转化和体内重组的方法获得亲和力成熟的酵母库。
实施例4：产生亲和力改善的酵母anti-hPD-L1scFv筛选
将上述得到的亲和力成熟后的酵母库用10nM和1nM的hPD-L1-Fc蛋白经过两轮流式分选，分选得到的酵母产物涂板，挑取单克隆鉴定。利用低浓度抗原染色的方法，以之前得到的野生型酵母作为对照，流式染色确定亲和力提高的酵母单克隆。
将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序，方法同上。将亲和力成熟后的scFv基因及之前的人IgG1-Fc基因融合后经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切克隆到商业化载体pEE6.4中，按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在HEK293细胞中瞬时表达，并通过protein A柱纯化。
按照实施例2中的方法对抗体进行结合(binding)能力和阻断(blocking)能力的检测。
结合能力的实验结果见图2，可以看出经过亲和力成熟后得到的三株抗体的亲和力明显提高。
阻断能力的实验结果见图3，可以看出，经过亲和力成熟后得到的三株抗体竞争PD-1结合PD-L1的IC50分别为：BⅡ61-62为0.837μg/ml(BⅡ61为0.884μg/ml)，B50-6为4.56μg/ml(B50为5.63μg/ml)，B60-55为1.14μg/ml(B60为16.8μg/ml)
经过亲和力成熟后得到B50-6，B60-55，BⅡ61-62三株亲和力提高的anti-hPD-L1scFv抗体序列。与B50相比，B50-6在VL的CDR1区发生了氨基酸D到N的突变；与B60相比，B60-55在VH的CDR3区发生了氨基酸S到N的突变；与BII61相比，BII61-62在VH的CDR2区发生了氨基酸S到G的突变，在VL FR2区发生了氨基酸I到V的突变。上述抗体重链和轻链可变区之间含有连接肽序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：67)。
其中B50-6的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：51)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：13-15；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：38-41；
其对应的DNA序列为：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAACTTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO：59)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(SEQ ID NO：52)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：16-18；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：42-45；
其对应的DNA序列为：
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC(SEQ ID NO：64)；
B60-55的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：47)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：1-3；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：22-25；
其对应的DNA序列为：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：57)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：48)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：4-6；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：26-29；
其对应的DNA序列为：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：62)；
BⅡ61-62的重链可变区氨基酸序列为：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVK GRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQID NO：49)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：7-9；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：30-33；
其对应的DNA序列为：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：58)；
其轻链可变区氨基酸序列为：
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：50)；
其中横线部分分别为CDR1、2、3，其序列编号分别为SEQ ID NO：10-12；未划横线部分分别为FR1、2、3、4，其序列编号分别为SEQ ID NO：34-37；
其对应的DNA序列为：
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA(SEQ ID NO：63)。
实施例5：scFv型抗体格式化为IgG型抗体
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1恒定区氨基酸序列。利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列得到人IgG1恒定区基因，将筛选得到的B50-6，B60-55，BII61-62的重链可变区VH序列与人IgG1恒定区基因序列拼接在一起，同时在VH的5’端添加信号肽序列：ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ ID NO：84)；将拼接好的基因合成，经Fermentas公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pEE6.4中得到pEE6.4-B50-6HC；pEE6.4-B60-55HC；pEE6.4-BⅡ61-62HC。根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白Kappa的恒定区氨基酸序列(P01834)，得到人Kappa轻链恒定区氨基酸序列。利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列得到人Kappa轻链恒定区基因，将筛选得到的B60-55，BⅡ61-62的轻链可变区VL序列与人Kappa轻链恒定区基因序列拼接在一起，同时在VL的5’端添加信号肽序列：ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ ID NO：84)；利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列得到人lambda(λ)轻链恒定区基因，将筛选得到的B50-6的轻链可变区VL序列与人lambda轻链恒定区基因序列拼接在一起，同时在VL的5’端添加信号肽序列：ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ ID NO：84)；将拼接好的基因合成，经Fermentas公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pEE12.4(Lonza)中得到pEE12.4-B50-6LC；pEE12.4-B60-55LC；pEE12.4-BⅡ61-62LC。
利用AidLab公司提供的质粒大提试剂盒(PL14)对上述得到的重链和轻链质粒进行质粒大提。将重组构建的轻链和重链质粒共转染HEK293细胞进行抗体表达。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/LIGF-1。四小时后再补加EX293培养基，2mM Glutamine和50ug/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过Protein A亲和层析法，纯化得到anti-hPD-L1B50-6、B60-55、BⅡ61-62mAb抗体。
其中IgG1链恒定区氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：68)；
IgG1链恒定区核酸序列为：
GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA(SEQ ID NO：69)；
Kappa链恒定区氨基酸序列为：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：70)；
Kappa链恒定区核酸序列为：
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACGCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAATGC(SEQ ID NO：71)；
B50-6轻链(lambda)恒定区氨基酸序列为：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO：72)；
B50-6轻链(lambda)恒定区核酸序列为：
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT(SEQ ID NO：73)。
实施例6：anti-hPD-L1mAb特性鉴定
纯化的anti-hPD-L1抗体与hPD-L1结合能力检测(ELISA法)：
以包被缓冲液(50mM Na2CO3，NaHCO3pH9.6)稀释hPD-L1-muFc至2μg/ml，100μL/well，4℃过夜。甩掉板中液体，PBST(pH7.4，0.05％Tween-20，V/V)洗板后，3％BSA-PBS封闭1h。将抗体B50-6mAb、B60-55mAb和Bμ61-62mAb分别从2000ng/ml开始，进行2倍梯度稀释，共11个浓度，稀释液(1％BSA-PBS)作对照，37℃孵育2h。加入羊抗人IgG-HRP(Goat anti-human IgG-HRP conjugated)，孵育1h。加可溶性单组分TMB底物显色液，室温避光显色5-10min。2N H2SO450μL/well，终止显色反应。置MD SpectraMax Plus384酶标仪上读OD450nm-650nm值，应用软件SotfMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，结果见图4。
通过此方法确定三株抗体的结合抗原EC50分别为40μg/ml(B60-55mAb),18.3μg/ml(BⅡ61-62mAb),和28.1μg/ml(B50-6mAb)。
纯化的anti-hPD-L1抗体与hPD-L1结合动力学检测(SPR)：
anti-PD-L1抗体B50-6mAb、BII61-62mAb和B60-55mAb针对重组的人PD-L1的结合动力学通过表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)方法，使用BIAcoreX100仪器测量。重组的hPD-L1-Fc直接包被于CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将抗体用HBS-EP+1×(GE，cat#BR-1006-69)缓冲液三倍连续稀释(1.37nm至1000nm)，在25℃进样120s，解离时间为30min，10mM glycine-HCl(pH2.0)再生120s。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcoreEvaluation Software version 3.2))计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(kD)以比率koff/kon计算。
测量的抗-PD-L1抗体的结合亲合力见表1。
表1anti-hPD-L1抗体与hPD-L1结合动力学检测
| 名称 | Kon(1/Ms) | Koff(1/s) | KD(M) |
| B50-6mAb | 1.672E+5 | 1.370E-2 | 8.193E-8 |
| B60-55mAb | 1.295E+6 | 2.222E-4 | 1.716E-10 |
| BⅡ61-62mAb | 9.795E+4 | 4.264E-4 | 4.353E-9 |
纯化的anti-hPD-L1抗体与hPD-1竞争结合hPD-L1能力检测：
以包被缓冲液(50mM Na2CO3，NaHCO3pH9.6)稀释hPD-L1-hIgG至5μg/ml，4℃过夜。PBST(pH7.4，0.05％Tween-20，V/V)洗板后3％BSA-PBS封闭1h。将待测anti-hPD-L1mAb的浓度稀释为100μg/ml,1％BSA-PBST-0.05％Tween-20(含有10μg/ml的hPD-1-hIgG-biotin)1:6梯度稀释，共9个稀释度，37℃2h。洗板后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRPconjugated)室温孵育1.5h。加可溶性单组分TMB底物显色液室温避光显色5-10min，2NH2SO4终止显色反应。置MD SpectraMax Plus384酶标仪上读OD450nm-650nm值，应用软件SotfMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，根据检测数据及IC50值分析抗体竞争能力强弱，结果见图5。
通过此方法确定三株抗体竞争PD-1结合PD-L1的IC50分别为0.255μg/ml 1.7nM(B60-55),0.24μg/ml 1.6nM(BⅡ61-62),和1.76μg/ml11.7nM(B50-6)。
纯化的anti-hPD-L1抗体与CD80竞争结合hPD-L1能力检测：
取筛选得到的三株抗体B60-55、BⅡ61-62和B50-6，通过竞争ELISA的方法，评价其是否可以阻断PD-L1和CD80的结合。具体方法如下：以包被缓冲液(50mM Na2CO3，NaHCO3pH9.6)稀释hPD-L1-hFc至5μg/ml，4℃过夜。PBST(pH7.4，0.05％Tween-20，V/V)洗板后3％BSA-PBS封闭1h。将待测anti-hPD-L1mAb的浓度稀释为100μg/ml,1％BSA-PBST-0.05％Tween-20(含有100μg/ml的hCD80-hFc-biotin，R&D：140-B1-100)1:6梯度稀释，共9个稀释度，37℃2h。洗板后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRPconjugated)室温孵育1.5h。加可溶性单组分TMB底物显色液室温避光显色5-10min，2N H2SO4终止显色反应。置MD SpectraMax Plus384酶标仪上读OD450nm-650nm值，应用软件SotfMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，根据检测数据及IC50值分析抗体竞争能力强弱，结果见图6。
通过此方法确定三株抗体竞争CD80结合PD-L1的IC50分别为0.543μg/ml(B60-55),0.709μg/ml(BⅡ61-62),和0.553μg/ml(B50-6)。
抗体是否特异性识别PD-L1的鉴定：纯化的anti-hPD-L1与hPD-L1、hPD-L2、hB7H3
的结合
取实施例1构建的含hPD-L1-EGFP、hB7H3-EGFP、hPD-L2-EGFP的HEK293细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入anti-hPD-L1mAb蛋白，阴性对照为hIgG Fc蛋白，冰上孵育20min。洗涤后加入eBioscience二抗anti-hIg-PE，冰上20min。洗涤后将细胞重悬于500μl0.5％PBS-BSA Buffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图6所示。由结果可以看出，我们三株抗体均能与hPD-L1-EGFP细胞结合不能与hB7H3-EGFP、hPD-L2-EGFP细胞结合，展示出很好的特异性。
纯化的anti-hPD-L1与小鼠PD-L1(mPD-L1)的结合：
取实施例1构建的含hPD-L1-EGFP、mPD-L1-EGFP的HEK293细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入待检测的anti-hPD-L1mAb，阴性对照为hIgG Fc蛋白，冰上孵育20min，洗涤后加入eBioscience二抗anti-hIg-PE，冰上孵育20min。洗涤后将细胞重悬于0.5％PBS-BSABuffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图7所示。由结果可以看出B50-6mAb可以与小鼠的PD-L1(mPD-L1)结合，而B60-55和BII61-62不能与mPD-L1结合。
纯化的anti-hPD-L1与食蟹猴PD-L1的结合：
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)分离食蟹猴外周血PBMC，重悬细胞于RPMI完全培养基中，调整细胞浓度为100万/毫升，然后在24孔板中加入200万细胞食蟹猴PBMC细胞，同时加入植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)，终浓度为2μg/ml刺激细胞48小时，然后收集细胞，在FACS缓冲液中洗涤细胞后加入抗体染色。以Isotype ctrl(anti-KLH)作为阴性对照，商业化PE标记的抗人PD-L1抗体(Biolegend：329705)作为阳性对照。我们的抗体作为一抗，经洗涤后加入anti-hIg-PE作为二抗进行染色。每一步染色4℃孵育三十分钟，染色结束后用FACS缓冲液离心洗涤细胞两次，再加入二抗或直接用2％多聚甲醛固定后用Guava分析。结果如图8所示。结果表明食蟹猴T细胞经PHA刺激表达PD-L1，我们的三株抗体可以和活化的食蟹猴T细胞结合。
实施例7：在树突细胞-T细胞混合淋巴反应中测定PD-L1抗体对CD4+T细胞的激活作用
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC。然后将其重悬于无血清的RPMI1640中，在10cm培养皿中培养1-2小时，除去未贴壁的细胞，并将细胞培养于含10％FBS的RPMI中。以250ng/ml GM-CSF(上海普欣：102-03)和100ng/ml IL-4(上海普欣：101-04)的终浓度添加细胞因子，每2-3天添加含细胞因子的新鲜培养基。在培养的第6天，用50ng/ml的TNF-alpha(上海普欣：103-01)使细胞成熟并使其孵育24小时。收获成熟的树突细胞，用HLA-DR抗体染色确定其成熟。将其重悬于RPMI完全培养基中，20万/ml.然后在96孔U形底板(Costar:3799)中每孔加入50μl，放培养箱中培养。
利用磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec：130-096-533)按照说明书方法从另一个供体PBMC中分离CD4+T细胞。计数重悬到RPMI完全培养基中，浓度为200万/ml,然后加入到含有树突细胞的96孔U形底板，每孔加入50μl。每孔加入梯度稀释于RPMI完全培养基中的PD-L1抗体100μl，抗体终浓度分别为100,10,1,0.1,0.01,0.001,0μg/ml。培养五天后取上清，利用IFN-r ELISA检测试剂盒(ebioscience)检测上清中IFN-r的水平。结果见图9。可见PD-L1抗体可以增强混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞分泌γ-干扰素，也就是说，PD-L1抗体增强了T细胞的活化。BⅡ61-62的EC50值为0.078μg/ml(相当于0.5nM)，B60-55的EC50值为0.189μg/ml(相当于1.2nM。
实施例7：anti-hPD-L1抗体对肿瘤生长的抑制活性
现在已经清楚很多肿瘤利用表达PD-1配体作为减弱抗-肿瘤T细胞应答的方法。已在数种人的肿瘤和肿瘤浸润白细胞中发现特征性地表达升高水平的PD-L1，并且这种升高的PD-L1表达经常与更差的预后相关联。小鼠肿瘤模型表明肿瘤内PD-L1表达具有类似的增加，并且表明PD-1/PD-L1途径在抑制肿瘤免疫中的作用。
此处我们提供实验表明阻断PD-L1对同系基因型C57B6小鼠中MC38细胞(鼠结直肠癌细胞)的肿瘤生长的影响。
在第0天时用100万MC38细胞(芝加哥大学傅阳心教授赠送)皮下接种C57B6小鼠，第0，3，7，10天用10mg/kg anti-PD-L1(B50-6)或PBS腹腔注射小鼠。每三天测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线图(参见图10)，可以看出anti-PD-L1(B50-6)可以显著抑制肿瘤生长。
对于不能识别小鼠PD-L1的抗体B60-55和BII61-62，采用免疫缺陷NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠研究其体内活性。通过对NOD/SCID小鼠皮下移植表达人PD-L1的黑色素瘤细胞系A375(ATCC，CRL-1619TM)和人的外周血单个核细胞PBMC的实验来实现此研究目的。A375和PBMC按5：1的比例在注射前混合，总体积100μl皮下注射(含500万A375，100万PBMC)，抗体在肿瘤接种第0，7，14，21，28天腹腔注射给药(图11A抗体剂量为3mg/kg；图11B抗体剂量见图11)，PBS作为阴性对照。每个实验组4-6只小鼠。每周两次观察肿瘤的形成，并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线图(参见图11)，可以看出抗体B60-55和BII-61-62可以显著抑制肿瘤生长。
实施例8B60-55与抗体2.41H90P(Medimmune LLC公司)稳定性比较
对抗PD-L1抗体B60-55和MedImmune LLC的抗体2.41H90P进行了45℃加速稳定性实验，具体实验方法为：将抗PD-L1抗体B60-55以及MedImmune LLC公司的抗PD-L1抗体2.41H90P(按照专利US20130034559中2.14H9的方法制备，并将其重新命名为2.41H90P)浓缩至10mg/ml，取100μg抗体放入200μlPCR管中，45℃水浴，于第0天，第10天，第20天，第30天收样进行竞争ELISA和SEC-HPLC分析实验，竞争ELISA方法同前述实施例6所述，求得IC50。SEC-HPLC采用岛津LC20AT HPLC液相色谱仪进行分析实验，将样品浓缩至1mg/ml，流速为0.5ml/min上样，总上样量为50ug，上样后进行等度洗脱30min，结果见图12。
其中A为B60-55与抗体2.41H90P随时间变化的IC50值比较图，可以看出不同时间点收得的样品竞争力没有显著变化；B为抗体二聚体随时间变化的比例，可以看出随着时间的增加，B60-55和2.41H90P都会呈现出二聚体比例下降的情况，但是2.41H90P下降的速度比B60-55快，表明B60-55的稳定性更好；C为B60-55加速稳定实验的竞争ELISA曲线，可以看出B60-55能够保持较好的活性和稳定性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (19)
1.抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括选自于如下一组的CDR区：
(1)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4-6所示；
(2)重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1、2、19所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4-6所示。
2.权利要求1的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括序列如SEQ ID NO：47或53所示的重链可变区。
3.权利要求1的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区。
4.权利要求1的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
5.权利要求4的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，所述scFv的重链和轻链可变区之间含有连接肽。
6.权利要求5的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，所述连接肽的序列如SEQ ID NO：67所示。
7.权利要求1-6中任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其重链恒定区选自IgG、IgM。
8.权利要求7的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
9.权利要求1-6中任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其轻链恒定区为κ或λ。
10.核酸分子，其包含能够编码权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核酸序列。
11.载体，其含有权利要求10所述的核酸分子。
12.宿主细胞，其含有权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的载体。
13.偶联物，其含有权利要求1-9任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其还包含选自下组的部分：毒素、酶、同位素和细胞因子。
14.偶联物，其含有权利要求1-9任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其还包含选自下组的部分：Auristatin MMAE、Auristatin MMAF、Maytansine DM1、Maytansine DM4、卡奇霉素、duocarmycin MGBA、阿霉素、蓖麻毒素、白喉毒素、I131、白介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒。
15.药物组合物，其含有权利要求1-9任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分或者权利要求13-14任一项的偶联物，以及任选地药学上可接受的载体或赋形剂。
16.检测试剂或试剂盒，其含有权利要求1-9任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，所述检测试剂或试剂盒用于检测PD-L1蛋白是否存在。
17.权利要求1-9任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分或者权利要求13-14任一项的偶联物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤或慢性HBV、HCV和HIV感染。
18.权利要求17的用途，所述肿瘤为PD-L1高表达的肿瘤。
19.权利要求17或18的用途，其中所述肿瘤选自：肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌和骨肉瘤。
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