UA125285C2 - Гуманізоване антитіло до cd19 людини та спосіб його застосування для лікування в-клітинного раку - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з CD19 людини, та його застосування для лікування В-клітинного раку.

Description

ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до гуманізованих антитіл проти СО19 людини (антитіло до СЮО19 людини), способам їх одержання, фармацевтичних композицій, які містять дані антитіла, та до їх застосувань.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

СО19 людини являє собою 95 кДа трансмембранний білок (корецептор В-клітин), експресований виключно на В-клітинах та на фолікулярних дендритних клітинах. СО19 знаходиться в асоціації з СО21 та СО81. СО19 та СО21 потрібні для нормальної диференціації

В-клітин (Сапег, К.Н., еї аї., ІттипоЇ. Ке5. 26 (2002) 45-54). Антитіла проти СО019 використовували в декількох клінічних випробуваннях (див., наприклад, НеКтап, А., еї аї.,

Сапсег Іттипої!. ІттипоїНег. 32 (191) 364-372; Міавтеєїд, І.Т., єї а)І., Сапсег Іттипої!. ІттипоїНнег. 40 (1995) 37-47; Сопгу, В.М., єї аї., у. ІттипоїНег. Етрпавзів Титог Іттипої. 18 (1995) 231-241;

Мапеке, О., єї аї., Іпї. У. Сапсег 91 (2001) 516-522).

Антитіла проти СО19 згадуються, наприклад, в М/О 2004/106381, МО 2005/012493, МО 2006/089133, МО 2007/002223, МО 2006/133450, МО 2006/121852, МО 2003/048209, 5 7109304, 05 2006/0233791, 5 2006/0280738, 05 2006/0263357, 5 2006/0257398, ЕР 1648512,

ЕР 1629012, 05 2008/0138336, УМО 2008/022152 і в Вгиепке, -., еї а!., Вг. У. Нетаїйо). 130 (2005) 218-228; Маїега, О.А., єї аї!., Сапсег Віоїпег. Надіорпапт. 19 (2004) 11-23; Сіпейе, М.А., еї аї.,

Віоса 104 (2004) 178-183; І апо, Р., єї а!., Віоса 103 (2004) 3982-3985; І оейіе", А., єї а!., Віоса 95 (2000) 2098-2103; І е Саї, Р., єї аі., РЕВ5 ГІ ей. 453 (1999) 164-168; 1, О., еї аі!., Сапсег Іттипої.

Ітітипоїйег. 47 (1998) 121-130; Ебеті, сх., еї аї., Сіїп. Ехр. Іттипої. 114 (1998) 173-178; Рівїегв27,

И..А., вї а)І., Сапсег Іттипої. ІттипоїНег. 41 (1995) 53-60; Муегв, О.Е., єї аі., І ек. утрпота. 18 (1995) 93-102; Веісек, В.Е., єї аІ., Сапсег Вев. 55 (1995) 2346-2351; Надеп, І.А., єї аї, Віоса 85 (1995) 3208-3212; Міавтеїа, І..Т., еї аі., Сапсег Іттипої. ІттипоїНег. 40 (1995) 37-47; Вподез, Е.а. еі а!., Вопе Маїтом Тгапзріапі. 10 (1992) 485-489; 7оа, Н., єї а!., Іттипої. Сеї! Віої. 69 (1991) 411- 422; Маїапабре, М., єї а!., Сапсег Рез. 50 (1990) 3245-3248; ОсКип, Е.М.., єї аї., Віоса 71 (1988) 13- 29; Рег2!ийНо, А., єї аї.; У Іттипої. 138 (1987) 2793-2799. Моноклональне антитіло 59У25-С1 є в продажу (продукт Мо 4737, бідта-АїйЇдгіспй Со. США, ЗЕО І МО: 21-24). Антитіла з підвищеною афінністю до ЕСуУКША згадуються в УМО 2008/022152.

Зо Антитіло проти СО19 може мати інгібуючі або стимулюючі ефекти на активацію В-клітин.

Зв'язування антитіл до СО19 з мітогенстимульованими В-клітинами інгібує подальше збільшення Са? та виникаючу активацію і проліферацію даних клітин, та проліферація і диференціація В-клітин може або інгібуватися, або посилюватися антитілом до СО19, в залежності від використаного мітогенного стимулу та ступеня поперечного зв'язування даним антитілом.

В УМО 2004/106381 описуються фармацевтичні композиції, що містять біспецифічні конструкції антитіла до СОЗ, до СО19 для лікування розладів, пов'язаних з В-клітинами.

Антитіла до СО19 описуються в УМО 2005/012493. У МО 2006/089133 описуються антитіла до

СО19 та їх застосування в онкології. Антитіла до СО19 та їх застосування описуються в УМО 2007/002223. В ММО 2006/133450 описується терапія антитілом до СО19 для трансплантації.

У УМО 2011/147834 описуються антитіла проти СОТ19 та їх застосування.

СТИСЛИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ

В даному документі запропоновані антитіла проти СО19 (людини), що є корисними як терапевтичний агент для лікування аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки, або для лікування пухлин.

Даний винахід частково засновано на відкритті того, що для видалення численних гарячих точок дезамідування в гуманізованому антитілі до СЮО19 людини достатньою є одна мутація.

Антитіла, описані в даному документі, мають властивості, що приносять користь пацієнту, який страждає від захворювання, асоційованого з патологічним збільшенням числа В-клітин.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є антитіло, яке специфічно зв'язується з

СО19 людини, де дане антитіло містить (а) НМЕ-НІ (гіперваріабельна ділянка 1 важкого ланцюга), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (б) НМА-НаІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11, (в) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 05, (у НМК-Ї1 (гіперваріабельна ділянка 1 легкого ланцюга), що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 20 або 28, (д) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 07, і (є) НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 08. 60 В одному втіленні дане антитіло являє собою моноклональне антитіло.

В одному втіленні антитіло являє собою людське, гуманізоване або химерне антитіло.

В одному втіленні антитіло являє собою фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з

СО19 людини.

В одному втіленні антитіло містить: (а) послідовність МН (варіабельний домен важкого ланцюга), яка має щонайменше 95 Фо-ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью 5ЕО ІЮ МО: 09, і послідовність МІ. (варіабельний домен легкого ланцюга), яка має щонайменше 95 55-ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью ЗЕО ІЮО МО: 19, або (б) послідовність МН, яка має щонайменше 95 95-ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью 5ЕО ІО МО: 09, і послідовність МІ, яка має щонайменше 95 95- ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью ЗЕО ІЮ МО: 27, або (в) послідовність МН і послідовність МІ., таку ж, як в (а) або (б).

В одному втіленні антитіло являє собою біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з

СОр19 людини і другим відмінним антигеном.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є фармацевтичний препарат, що містить антитіло, як описано в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є антитіло, як описано в даному документі, для лікування злоякісних захворювань В-клітин. В одному втіленні злоякісне захворювання В- клітин вибрано з групи, що складається з СіЇ (хронічний лімфоцитарний лейкоз), МНІ. (неходжкінська лімфома) і СІ ВСІ. (дифузна В-клітинна крупноклітинна лімфома).

Одним аспектом, як описано в даному документі, є антитіло, як описано в даному документі, для застосування як лікарського засобу.

В одному втіленні даний лікарський засіб призначений для лікування В-клітинного раку, запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки. В одному втіленні даний лікарський засіб призначений для виснаження популяції В-клітин.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є антитіло, як описано в даному документі, для застосування в лікуванні В-клітинного раку, запального захворювання, аутоімунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є антитіло, як описано в даному документі, для застосування в виснаженні популяції В-клітин.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є застосування антитіла, як описано в даному документі, в виготовленні лікарського засобу. В одному втіленні даний лікарський засіб призначений для лікування В-клітинного раку, запального захворювання, аутоімунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки. В одному втіленні даний лікарський засіб призначений для виснаження популяції В-клітин.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є спосіб лікування індивіда, що має В- клітинний рак, що включає введення даному індивіду ефективної кількості антитіла, як описано в даному документі.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є спосіб виснаження популяції В-клітин у індивіда, що включає введення даному індивіду ефективної кількості антитіла, як описано в даному документі.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є спосіб виготовлення лікарського засобу для лікування захворювань, що включає антитіло, як описано в даному документі. В одному втіленні дане захворювання являє собою В-клітинний рак, запальне захворювання, аутоїмунне захворювання, ревматоїдний артрит, вовчак, псоріаз або захворювання кістки.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло, як описано в даному документі.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту, як описано в даному документі.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є спосіб продукування антитіла, що включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, таким чином, що продукується антитіло, виділення антитіла з клітини або середовища культивування і очищення антитіла.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є імунокон'югат, що містить антитіло, як описано в даному документі, і цитотоксичний агент.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Ї. ВИЗНАЧЕННЯ

Термін "акцепторна людська каркасна ділянка" для цілей даного документа являє собою бо каркасну ділянку, что містить амінокислотну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) або каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга (МН), що походить з каркасної ділянки людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної ділянки, як визначено нижче. Акцепторна людська каркасна ділянка, "що походить з" каркасної ділянки людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної ділянки, може містити таку ж амінокислотну послідовність, як і вони, або вона може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких втіленнях число змін амінокислот становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, 3 або менше, або 2 або менше. У деяких втіленнях акцепторна людська каркасна ділянка МІ. є ідентичною за послідовністю послідовності каркасної ділянки МІ. людського імуноглобуліну або послідовності людської консенсусної каркасної ділянки МІ...

Термін "афінність" відноситься до сили загальної суми нековалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) та її партнером зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо не вказано інше, термін "афінність зв'язування" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до власної афінності зв'язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом і антигеном).

Афінність молекули Х відносно її партнера У зазвичай може бути представлена константою дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна звичайними способами, відомими в даній ділянки, що включають способи, описані в даному документі.

Термін антитіло "з дозрілою афінністью" відноситься до антитіла з одною або більше ніж однією зміною в одній або більше ніж одній гіперваріабельній ділянці (НМЕК) в порівнянні з батьківським антитілом, яке не має таких змін, причому такі зміни призводять до поліпшення афінності антитіла відносно антигену.

Терміни "антитіло до СО19 людини" і "антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини" відносяться до антитіла, яке здатне зв'язуватися з СЮО19 людини з достатньою афінністью таким чином, що дане антитіло є корисним як діагностичний та/або терапевтичний агент в націлюванні на СО19 людини. В одному втіленні ступінь зв'язування антитіла до СО19 людини з неспорідненим білком, що не є СО19 білком, становить менше, ніж приблизно 10 95 зв'язування даного антитіла з СО1Т9 людини при вимірюванні поверхневим плазмонним резонансом. У деяких втіленнях антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини має константу дисоціації (КО) 109 М або менше.

Термін "антитіло" використовується в даному документі в найширшому сенсі та охоплює різні структури антитіл, включаючи моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, але не обмежуючись ними, за умови, що вони демонструють бажану активність зв'язування антигену.

Термін "антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮСС)" відноситься до функції, опосередкованої зв'язуванням з рецептором Ес, і відноситься до лізису клітин-мішеней антитілом, як описано в даному документі, в присутності ефекторних клітин. В одному втіленні

АрСС вимірюється за допомогою обробки препарату еритроїдних клітин, що експресують СО19 (наприклад, клітин К562, що експресують рекомбінантний СО19 людини), антитілом, як описано в даному документі, в присутності ефекторних клітин, таких як свіжовиділені РВМС (одноядерні клітини периферичної крові) або очищені ефекторні клітини з лейкоцитарних плівок, подібні моноцитам або МК клітин (натуральний кіллер). Клітини-мішені мітяться »'Скг і потім інкубуються з антитілом. Мічені клітини інкубуються з ефекторними клітинами, та супернатант аналізується на вивільнений Ст. Контролі включають інкубування ендотеліальних клітин-мішеней з ефекторними клітинами, але без антитіла. Здатність антитіла індукувати вихідні стадії, опосередковані АОСС, досліджується за допомогою вимірювання їх зв'язування з клітинами, експресуючими рецептори Есу, такими як клітини, рекомбінантно експресуючі Есукі та/або

ЕсуКкІА, або МК клітини (експресуючі в основному ЕСсуКПША). В одному переважному втіленні вимірюється зв'язування з ЕсуК на МК клітинах.

Термін "фрагмент антитіла" відноситься до молекули, відмінної від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла, що зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіла включають Ем, Раб, Раб Рар'-5Н, К(аб)»; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл (наприклад, 5сЕм) та мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл, але не обмежуються ними.

Термін "химерне" антитіло відноситься до антитіла, в якому частина важкого та/або легкого ланцюга походить з конкретного джерела або типу, тоді як інший важкий та/або легкий ланцюг походить з іншого джерела або типу. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домену або константної ділянки, який має його важкий ланцюг. Існують п'ять основних класів антитіл: ІА, дО, ІДЕ, дос та дм, та кілька з бо них можуть додатково поділятися на підкласи (ізотипи), наприклад, да, Ідег, ІдСз, ІДС, ІА: і

ІдАг. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються а, б, є, у і и відповідно.

Термін "цитотоксичний агент" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до речовини, яка інгібує або запобігає клітинній функції та/або викликає загибель або руйнування клітини. Цитотоксичні агенти включають радіоактивні ізотопи (наприклад, АБ", 1191, 0125, Мо ВНе86 Де88 5т/!»з, Ві, рзг, рр: і радіоактивні ізотопи І и); хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвинку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин с, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); агенти, що інгібують зростання; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти та/або варіанти; та різні протипухлинні або протиракові агенти, розкриті нижче, але не обмежуються ними.

Термін "комплементзалежна цитотоксичність (СОС)" відноситься до лізису клітин, індукованому антитілом, як описано в даному документі, в присутності комплементу. В одному втіленні СОС вимірюється за допомогою обробки людських ендотеліальних клітин, які експресують СО19, антитілом, як описано в даному документі, в присутності комплементу. В одному втіленні дані клітини мітяться кальцеїном. СОС виявляється, якщо антитіло індукує лізис 2095 або більше клітин-мішеней в концентрації 30 мкг/мл. Зв'язування з фактором С14 комплементу може бути виміряно в ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз). В такому аналізі, взагалі, планшет ЕГІЗА покривають концентраційними інтервалами антитіла, до якого додають очищений Сід людини або людську сироватку. Зв'язування С1і4д виявляється антитілом, спрямованим проти Сід, з подальшим виявленням кон'югатом, міченим пероксидазою. Виявлення зв'язування (максимальне зв'язування Втах) вимірюється як оптична щільність при 405 нм (ОІЩ405) для пероксидазного субстрату АВТЗФ (2,2'-азино-ди-|3- етилбензтіазолін-6-сульфонат (6)1).

Термін "ефекторні функції" відноситься до тих біологічних активностей, які приписуються ділянки Ес антитіла, що варіюють в залежності від класу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв'язування з С14 і комплементзалежну цитотоксичність (СОС);

Зо зв'язування з рецептором Ес; антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮОСС); фагоцитоз; знижувальну регуляцію рецепторів поверхні клітини (наприклад, рецептора В-клітин) і активацію

В-клітин.

Ефекторні функції, залежні від зв'язування з рецептором Ес, можуть бути опосередковані взаємодією ділянки Ес антитіла з рецепторами Ес (БСК), які являють собою спеціалізовані рецептори поверхні клітини на гематопоетичних клітинах. Рецептори Ес належать до надродини імуноглобулінів, і було показано те, що вони опосередковують і видалення покритих антитілами патогенів фагоцитозу імунних комплексів, і лізис еритроцитів та різних інших клітинних мішеней (наприклад, пухлинних клітин), покритих відповідним антитілом, за допомогою антитілозалежній клітинній цитотоксичності (АЮОСС) (див., наприклад, Мап де УміпКеї, У апа Апаегзоп, СІ, 9.

ІеиКос. ВіоІ. 49 (1991) 511-524). Рок визначаються за їх специфічністю відносно ізотипів імуноглобулінів: рецептори Ес відносно антитіл ІдбсС називаються ЕсукК. Зв'язування з рецептором Ес описується, наприклад, в Камеїсп, .).М. апа Кіпеї, У.Р., Аппи. Кеум. Іттипої. 9 (1991) 457-492; Сареї, Р.У., вї аі., Іттипотеїносіз 4 (1994) 25-34; де Наав, М., єї аї., У. І ар. Сіїп.

Меа. 126 (1995) 330-341 і Сеззпег, 9.Е., еї аІ., Апп. Нетагсої. 76 (1998) 231-248.

Поперечне зв'язування рецепторів відносно ділянки Ес антитіл до (Есук) запускає широкий спектр ефекторних функцій, що включають фагоцитоз, антитілозалежну клітинну цитотоксичність та вивільнення запальних медіаторів, а також кліренс імунних комплексів та реуляцію продукції антитіл. У людини було охарактеризовано три класи ЕсукК, якими є наступні: - ЕсуУкКІ (СО64) зв'язується з мономірним дО з високою афінністю та експресується на макрофагах, моноцитах, нейтрофілах та еозинофілах. Модифікація в ділянки Ес Ід щонайменше одного амінокислотного залишку Е233-5236, Р238, 0265, М297, АЗ327 та РЗ329 (нумерація відповідно до індексу ЄЮ (Європейський Союз) за Кара)ю зменшує зв'язування з

ЕСУКІ. Заміна в Ідс1 і Ід054 на залишки Ід02 в положеннях 233-236 зменшувала зв'язування з

ЕсуКІ в 103 рази та усувала відповідь людських моноцитів на сенсибілізовані антитілами еритроцити (Аптоиг, К.Г.., єї аї., Єшиг. у. Іттипої. 29 (1999) 2613-2624). - ЕсукІї (СО32) зв'язується з комплексованим дО з афінністю від середньої до низької та експресується в широкому спектрі клітин. Даний рецептор може бути розділений на два підтипи:

ЕсукПА і ЕсукіІВ. ЕсукПА знаходиться на багатьох клітинах, що беруть участь у загибелі (наприклад, макрофаги, моноцити, нейтрофіли), та, очевидно, здатний активувати процес бо умертвіння. ЕсукКіІІВ, очевидно, відіграє роль в інгібуючих процесах та знаходиться на В-

клітинах, макрофагах та на гладких клітинах та еозинофілах. На В-клітинах він, очевидно, функціонує, інгібуючи подальшу продукцію імуноглобуліну та перемикання ізотипу, наприклад, до класу ІДЕ. На макрофагах ЕсукКіІІВ діє, інгібуючи фагоцитоз, опосредкований ЕсукПА. На еозинофілах та гладких клітинах В-форма може допомагати пригнічувати активацію даних клітин через зв'язування ІДЕ з його окремим рецептором. Знижене зв'язування з ЕсукПА виявляється, наприклад, для антитіл, що містять ділянка Ес дос з мутаціями щонайменше одного з амінокислотних залишків Е233-С236, Р238, 0265, М297, АЗ27, РЗ29, 0270, 0295, АЗ27,

К292 та К4а14 (нумерація відповідно до індексу ЄЮ за Кара). - ЕсукІП (СО16) зв'язується з до з афінністю від середньої до низької та існує у вигляді двох типів. ЕСУКПША знаходиться на МК клітинах, макрофагах, еозинофілах і деяких моноцитах, і Т- клітинах і опосредковує АЮСС. ЕсСуУКІПІВ сильно експресується на нейтрофілах. Знижене зв'язування з ЕсуКПА виявляється, наприклад, для антитіл, що містять ділянка Ес Ід з мутацією щонайменше одного амінокислотного залишку Е233-С236, Р238, 0265, М297, АЗ27,

РЗ29, 0270, 0295, АЗ327, 5239, Е269, Е293, 296, М303, АЗ27, К338 та 0376 (нумерація відповідно до індексу Є за Каба)д.

Картування сайтів зв'язування на людському ІдО1 відносно рецепторів Ес, вищезгадані сайти мутацій та способи вимірювання зв'язування з ЕсСуКІ і ЕсуКкІА описуються в Зпіеєїдв, К.Г., еї а. 9. Віої. Снет. 276 (2001) 6591-6604. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичного препарату, відноситься до ефективного кількості в необхідних дозах та протягом необхідних періодів часу для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату.

Термін "рецептор Ес" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до активуючих рецепторів, що характеризуються присутністю цитоплазматичної послідовності ІТАМ, асоційованої з даними рецептором (див., наприклад, Камеїсйп, 9.М. апа

ВоПапа, 5., Аппи. Вем. Іттипої. 19 (2001) 275-290). Такими рецепторами є ЕсукіІ, ЕсукІА і

ЕсСУКПА. Термін "відсутність зв'язування з Есук" означає те, що при концентрації антитіла 10 мкг/мл зв'язування антитіла, як описано в даному документі, з клітинами МК становить 10 95 або менше відносно зв'язування, виявленого для антитіла ЇС.001 проти ОХ40І, як описано в МО 2006/029879.

Зо У той час як Ід054 демонструє знижене зв'язування з ЕсК, антитіла інших підкласів |до демонструють сильне зв'язування. Однак Рго238, Азр265, Азр270, Азп297 (втрата вуглеводу

Ес), Рго329 та 234, 235, 236 та 237, Пе253, Зег254, І уз288, Тпг307, СІп311, Азп434 та Ніз435 є залишками, які, при зміні, також зменшують зв'язування з ЕсСК. (ЗпПпієїа5, К./.., еї аї. У. ВіоЇї. Спет. 276 (2001) 6591-6604; І по), 9., єї аі., ЕАБЗЕВ У. 9 (1995) 115-119; Могоап, А., вї а!., Іттипоіоаду 86 (1995) 319-324 ії ЕР 0 307 434). В одному втіленні антитіло, як описано в даному документі, належить до підкласу ІдС1 або Ідс2 та містить мутацію РМА236, СІ РБЗБЗЗ331 та/або

І 234А/ 235А. В одному втіленні антитіло, як описано в даному документі, належить до підкласу

ІЧО4 та містить мутацію І 235Е. В одному втіленні антитіло додатково містить мутацію 5228Р.

Термін "ділянка Ес" використовується в даному документі для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної ділянки. Даний термін включає ділянки Ес з природною послідовністю і варіанти ділянки Ес. В одному втіленні ділянка Бс важкого ланцюга людського дС простягається від Субз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак С-кінцевий лізин (І уз447) ділянки Ес може бути присутнім або може бути відсутнім. Якщо в даному документі не визначено інакше, нумерація амінокислотних залишків в ділянки Ес або в константній ділянці здійснюється відповідно до системи нумерації БУ, також званої індекс ЄЮ, як описано в КаБраї, Е.А. єї аїЇ., Зедиепсе5 ої

Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпієге5і, Бій єй., Рибіїс Неанй 5егмісе, Маїййопа! Іпвійшев ої Неапнй,

Веїпезаа, МО (1991), МІН Рибіісайноп 91-3242.

Антитіла, як описано в даному документі, в одному втіленні містять як ділянки Ес ділянку Ес людського походження. В одному втіленні ділянка Ес містить всі частини людської константної ділянки. Ділянка Ес антитіла безпосередньо бере участь в активації комплементу, в зв'язуванні

Ст4д, активації СЗ і в зв'язуванні з рецептором Ес. У той час як вплив антитіла на систему комплементу залежить від визначених умов, зв'язування з С1д викликано визначеними сайтами зв'язування в ділянці Ес. Такі сайти зв'язування відомі в сучасному рівні техніки і описуються, наприклад, І Каб, Т.., еї аї., У. Іттипої. 127 (1981) 2555-2560; Вгиппоизе, В., апа Сега, 5. 4.,

Мої. Іттипої. 16 (1979) 907-917; Випоп, О.Н., єї аї., Майте 288 (1980) 338-344; Тпоттезеп, у.Е., еї аї., Мої. Іттипої. 37 (2000) 995-1004; Ідиводіє, Е.Е., єї аї., У. Іттипої. 164 (2000) 4178-4184;

Негаген, М., еї аї., 9. Мігої. 75 (2001) 12161-12168; Могаап, А., єї аї., Іттипоіоду 86 (1995) 319- 324 і ЕР 0 307 434. Такими сайтами зв'язування є, наприклад, 1 234, 1235, 0270, М297, ЕЗ318, 60 КЗ320, КЗ322, РЗ31 і РЗ29 (нумерація відповідно до індексу ЄЮ по Кабрас якщо в даному документі не визначено інакше, нумерація амінокислотних залишків в ділянці Ес або в константній ділянці здійснюється відповідно до системи нумерації ЕІ), також званої індекс ЕМ, як описано в Кабаї,

Е.А. єї аІ., ЗХедиепсев ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, Бій ед., Рибіїс Неанй Зегмісе, Маїопаї!

Іпвійшез ої Неацй, Веїпезаа, МО (1991), МІН Рибіїсайоп 91-3242). Антитіла підкласу Ідс1, Ід2 і

Ід9о3 зазвичай демонструють активацію комплементу, зв'язування з С14 і активацію С3З, тоді як

ІЧ9054 не активують систему комплементу, не зв'язуються з С14 і не активують С3. "Ділянка Ес антитіла" являє собою термін, добре відомий кваліфікованому фахівцю, і вона визначається на основі розщеплення антитіл папаїном. В одному втіленні ділянка Ес являє собою людську ділянку Ес. В одному втіленні ділянка Ес належить до людського підкласу Ідс4 і містить мутації 5228Р та/або І 235Е (нумерація відповідно до індексу ЄЮ за Кабрайб). В одному втіленні ділянка Ес належить до людського підкласу Ідс1 і містить мутації І 234А і І 235А (нумерація відповідно до індексу ЄЮ за Кабрад. "Каркасна ділянка" або "ЕК" відноситься до залишків варіабельного домену, відмінних від залишків гіперваріабельної ділянки (НМК). ЕК варіабельного домену зазвичай складається з чотирьох ЕК доменів: ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. Відповідно, послідовності НМК і ЕК зазвичай з'являються в МН (або МІ) в наступній послідовності: ЕК1-Н1 (І1)-ЕН2-На (12)-ЕВЗ-НЗ (І 3)-ЕНА.

Терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" і "повне антитіло" використовуються в даному документі як взаємозамінні для назви антитіла, що має по суті аналогічну структуру із структурою природного антитіла, або має важкі ланцюги, які містять ділянку Ес, як визначено в даному документі.

Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяївів" і "культура клітин-хазяївів" використовуються як взаємозамінні і відносяться до клітин, в які була введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяїва включають "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають первинні трансформовані клітини і потомство, отримане від них, незалежно від числа пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним батьківській клітині за змістом нуклеїнових кислот, але може містити мутації. Сюди включено мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активність, на яку здійснюється скринінг або відбір у початково трансформованої клітини. "Людська консенсусна каркасна ділянка" являє собою каркасну ділянку, яка являє собою

Зо амінокислотні залишки, що найчастіше зустрічаються, в наборі послідовностей каркасних ділянок МІ або МН людського імуноглобуліну. Загалом, набір послідовностей МІ або МН людського імуноглобуліну відбувається з підгрупи послідовностей варіабельного домену.

Зазвичай дана підгрупа послідовностей є такою ж підгрупою, що і в Кабаї, Е.А. еї аЇ.,, Зедоепсе5 ої Ргоївїіп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, БІЙ єд., ВешШйезаа МО (1991), МІН Рибіїсайоп 91-3242, Мо!в5. 1- 3. В одному втіленні для МІ. даної підгрупи є підгрупа каппа І, така ж, як і в Кабаї єї аї., вище. В одному втіленні для МН даною підгрупою є підгрупа І, така ж, як і в Кабаї єї а!., вище.

Термін "гуманізоване" антитіло відноситься до химерних антитіл, що містить амінокислотні залишки з НУК, які не є людськими, і амінокислотні залишки з людських ЕК. У деяких втіленнях гуманізоване антитіло буде містити по суті всі з щонайменше одного і типово двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі з НМК (наприклад, СОК (ділянка, яка визначає комплементарність)) відповідають НМК антитіла, що не є людським, і всі або по суті всі ЕК відповідають ЕК людського антитіла. Гуманізоване антитіло можливо може містити щонайменше частину константної ділянки антитіла, що походить з людського антитіла. Термін "гуманізована форма" антитіла, наприклад, антитіла, що не є людським, відноситься до антитіла, яке піддалося гуманізації.

Термін "гіперваріабельна ділянка" або "НМВ" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до кожної з ділянок варіабельного домену антитіла, що містить відрізки амінокислотних залишків, які є гіперваріабельними за послідовністю ("ділянки, що визначають комплементарність" або "СОВ") та/або утворюють структурно визначені петлі

Стіперваріабельні петлі"), талабо містять залишки, які контактують з антигеном ("контакти з антигеном"). Загалом, антитіла містять шість НМЕ: три в МН (НІ, Н2, НЗ) татрив М (11,12, 1 3).

НМК включають: (а) гіперваріабельні петлі, що знаходяться в амінокислотних залишках 26-32 (11), 50-52 (І 2), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Споїпіа, С. апа І е5К, А.М., у). Мої. Віої. 196 (1987) 901-917); (б) СОК, що знаходяться в амінокислотних залишках 24-34 ( 11), 50-56 (І2), 89-97 (І 3), 31-

ЗБЬ (НІ), 50-65 (Н2) ії 95-102 (НЗ) (Кабаї, Е.А. еї аїЇ., Зедиєпсев ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодісаї!

Іптегеві, Бій ей. Рибіїс Неанйй Зегуісе, Маїйопа! Іпвійшев ої Неайй, ВеїШезаа, МО (1991), МІН

Рибіїсайоп 91-3242.);

(в) контакти з антигеном, що знаходяться в амінокислотних залишках 27с-36 (І 1), 46-55 (І 2), 89-96 (13), 30-35Б6 (НІ), 47-58 (Н2) і 93-101 (НЗ) (МасСаїйшт єї аї. у). Мої. Вісі. 262: 732-745 (1996)); (г) комбінації (а), (6) та/або (в), що включають амінокислотні залишки 46-56 (І 2), 47-56 (І 2), 48-56 (12), 49-56 (І 2), 26-35 (НІ), 26-35Б (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).

Якщо не вказано інше, залишки НУК та інші залишки в варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) нумеруються в даному документі згідно Кабаї еї аї., вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юЮговане з одною або більш ніж одною гетерологічною молекулою, що включає цитотоксичний агент, але не обмежується ним. "Індивід" або "суб'єкт" є ссавцем. Ссавці включають домашніх тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак і коней), приматів (наприклад, людину і приматів, які не є людиною, таких як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і щурів), але не обмежуються ними. У деяких втіленнях індивід або суб'єкт являє собою людину. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, яке було відокремлено від компонента його природного оточення. У деяких втіленнях антитіло очищають до чистоти, більшої, ніж 95 95 або 99 95 при визначенні, наприклад, електрофоретичними (наприклад, 5О5-РАСЕ (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію), ізоелектрофокусуванням (ЕР), капілярний електрофорез) або хроматографічними (наприклад, іонообмінна ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія) або ВЕРХ з оберненою фазою) способами. Щодо огляду способів оцінки чистоти антитіл, див., наприклад, РіІаїтап, 5. еї аї., У. Спготаїйодг. В 848 (2007) 79-87.

Термін "виділена" нуклеїнова кислота відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка була відокремлена від компонента її природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять дану молекулу нуклеїнової кислоти, але дана молекула нуклеїнової кислоти присутня позахромосомно або в ділянці хромосоми, яка відрізняється від її природної хромосомної ділянки.

Фраза "виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до СЮО19 людини" означає одну або більше ніж одну молекули нуклеїнової кислоти, що кодує важкий і легкий ланцюги антитіла (або

Зо їх фрагменти), включаючи таку(кі) молекулу(ли) нуклеїнової кислоти в одному векторі в окремих векторах, і таку(кі) молекулу(ли) нуклеїнової кислоти, присутнюйі) в одній або більше ніж одній ділянці в клітині-хазяїні.

Термін "моноклональне антитіло" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними та/або зв'язуються з тим же самим епітопом, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад, що містять мутації, що зустрічаються в природі, або виникають під час одержання препарату моноклонального антитіла, причому такі варіанти зазвичай присутні в мінорних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які типово включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл направлено проти одної детермінанти на антигені. Таким чином, модифікатор "моноклональний" вказує на характер антитіла, як одержаного з по суті гомогенної популяції антитіл, і його не слід тлумачити як такий, що вимагає продукування антитіла будь-яким конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що застосовуються відповідно до даного винаходу, можна одержувати цілим рядом методик, які включають спосіб гібридоми, способи генної інженерії, способи фагового дисплея і способи з використанням трансгенних тварин, що містять всі локуси людського імуноглобуліну або їх частину, але не обмежуються ними, причому такі способи та інші типові способи для одержання моноклональних антитіл описуються в даному документі.

Термін "голе антитіло" відноситься до антитіла, яке не кон'юговано з гетерологічним угрупованням (наприклад, з цитотоксичним угрупованням) або з радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути присутнім в фармацевтичному препараті.

Термін "природні антитіла" відноситься до таких, що зустрічаються в природі молекул імуноглобулінів з структурами, що вірюють. Наприклад, природні антитіла /дс є гетеротетрамерними глікопротеїнами з молекулярної масою приблизно 150000 Дальтон, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, які пов'язані дисульфідними зв'язками. Від М- до С-кінця кожний важкий ланцюг має варіабельну ділянку (МН), також звану варіабельний важкий домен або варіабельний домен важкого ланцюга, з подальшими трьома константними доменами (СНІ, СН2 і СНЗ), при цьому між першим і другим 60 константним доменом розташовується шарнірна ділянка. Аналогічним чином, від М- до С-кінця кожний легкий ланцюг має варіабельну ділянку (М), також звану варіабельний легкий домен або варіабельний домен легкого ланцюга, з подальшим константним легким доменом (СІ).

Легкий ланцюг антитіла може бути приписаний до одного з двох типів, іменованих каппа (Кк) і лямбда (АХ), на основі амінокислотної послідовності її константного домену.

Термін "листок-вкладиш в упаковці" використовується для назви інструкцій, що традиційно включаються в наявні в продажу упаковки терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, застосування, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або попередження, що стосуються застосування таких терапевтичних продуктів. "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" по відношенню до контрольної послідовності поліпептиду визначається як процентна частка амінокслотних залишків в послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишкам в контрольній послідовності поліпептиду, після вирівнювання даних послідовностей і, якщо необхідно, введення розривів для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності, і не розглядаючи будь-які консервативні заміни як частину ідентичності послідовності. Вирівнювання для цілей визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності може досягатися різними способами, які знаходяться в межах кваліфікації в даній ділянці, наприклад, з використанням загальнодоступних комп'ютерних програм, таких як програми ВІ АЗТ, ВІ А5Т-2,

АСОМ або Медаїднп (ОМАЗТАК). Фахівці в даній галузі можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Для цілей даного документа, однак, значення 95 ідентичності амінокислотної послідовності одержуються з використанням комп'ютерної програми порівняння послідовностей АГІОМ-2. Авторство комп'ютерної програми порівняння послідовностей АГ ІОМ-2 належить Сепепіесі, Іпс., і вихідний код з призначеної для користувача документації був поданий в Бюро реєстрації авторських прав

США, УмМазпіпдіоп 0О.С., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним Мо авторського права

США ТХИ510087. Програма АГІСМ-2 є загальнодоступною від сепепіесі, Іпс., Південний Сан-

Франциско, Каліфорнія, або може бути складена з вихідного коду. Програму АГІОМ-2 слід складати для застосування в операційній системі ОМІХ, включаючи цифровий ОМІХ М4.00. Всі параметри порівняння послідовності викладаються програмою АЇ ІСМ-2 і не варіюють.

У ситуаціях, коли АГІСМ-2 застосовується для порівнянь амінокислотних послідовностей, 90 ідентичності амінокислотної послідовності даної амінокслотної послідовності А з або відносно даної амінокислотної послідовності Б (що може бути альтернативно сформульовано як дана амінокислотна послідовність А, яка має або містить визначений 95 ідентичності амінокислотної послідовності з або відносно даної амінокслотної послідовності Б) розраховується наступним чином: 100 помножити на частку Х/У де Х являє собою число амінокислотних залишків, підрахованих як ідентичні збіги, за допомогою програми вирівнювання послідовностей АГ ЗМ-2 у вирівнюванні А і Б даною програмою, і де У являє собою загальне число амінокислотних залишків в Б. Буде зрозуміло те, що коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності Б, 95 ідентичності амінокислотної послідовності А з Б не буде дорівнювати 95 ідентичності амінокислотної послідовності Б з А. Якщо конкретно не затверджується інше, всі значення 95 ідентичності амінокислотної послідовності, використовувані в даному документі, як описано в безпосередньо попередній частині, отримані з використанням комп'ютерної програми

АПИаМ-2.

Термін "фармацевтичний препарат" відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, щоб забезпечувати ефективну біологічну активність активного інгредієнта, що міститься в ньому, і який не містить додаткових компонентів, які Є неприйнятно токсичними для суб'єкта, яким вводився б препарат.

Термін "фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнту в фармацевтичному препараті, відмінного від активного інгредієнта, який є нетоксичним для суб'єкта.

Фармацевтично прийнятний носій включає буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант, але не обмежується ними.

Термін "СО19" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до антигену СО19 людських В-лімфоцитів (альтернативнни(ними) назвою(ами) є: антиген диференціації СО19, антиген поверхні В-лімфоцитів В4, антиген поверхні Т-клітин Геи-12;

ОпіРтоїкВ РІ15391-1 (зоформа 1; 5ЕО ІЮО МО: 33) ї РІ5391-2 (ізоформа 2; 5ЕО ІО МО: 34)).

Даний термін охоплює "повнорозмірний", що не піддавався процесингу людський СО19, а також будь-яку форму людського СО19, яка виникає в результаті процесингу в клітині, за умови, що 60 антитіло, як описано в даному документі, зв'язується з нею.

Термін "лікування" (та його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "здійснення лікування") в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до клінічного втручання в спробі змінити природний хід захворювання індивіда, якого лікують, і воно може здійснюватися або для профілактики, або по ходу клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають попередження появи або рецидиву захворювання, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, попередження метастазів, зменшення швидкості прогресування захворювання, зменшення інтенсивності або тимчасове ослаблення хворобливого стану і ремісія або поліпшений прогноз, але не обмежуються ними. У деяких втіленнях антитіла, як описано в даному документі, використовуються для затримки розвитку захворювання або для уповільнення прогресування захворювання.

Термін "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" відноситься до домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (МН і МІ. відповідно) природного антитіла зазвичай мають аналогічні структури, причому кожен домен містить чотири консервативні каркасні ділянки (ЕК) і три гіперваріабельні ділянки (НМК). (Див., наприклад, Кіпаї, Т.)., еї аІ. Кибу

Ітітипоіоду, бій ейд., М.Н. Ргеетап апа Со., М.У. (2007), сторінка 91). Один домен МН або МІ. може бути достатнім для додання специфічності зв'язування з антигеном. Крім того, антитіла, які зв'язуються з конкретним антигеном, можуть бути виділені з використанням домену МН або

МІ. з антитіла, яке зв'язується з антигеном, для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів

МІ або МН відповідно. Див., наприклад, Рогпіоіїапо, 5. еї аї., ). Іттипої. 150 (1993) 880-887;

Сіаскзоп, Т. еї а!., Майте 352 (1991) 624-628).

Термін "вектор" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної розмножувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою він пов'язаний. Даний термін включає вектор як структуру самореплікованої нуклеїнової кислоти, а також вектор, включений в геном клітини-хазяїна, в яку він був введений. Визначені вектори здатні керувати експресією нуклеїнових кислот, з якими вони пов'язані функціональним чином. Такі вектори називаються в даному документі "експресійними векторами".

І. КОМПОЗИЦІЇ І СПОСОБИ

В одному аспекті даний винахід частково грунтується на даних про те, що для видалення численних гарячих точок дезамідування в гуманізованому антитілі до СО19 людини достатньо однієї мутації. У деяких втіленнях запропоновані антитіла, які зв'язуються з СО19 людини.

Антитіла, як описано в даному документі, є корисними, наприклад, для діагностики або лікування.

А. Типові антитіла до СЮО19 людини

Виявили те, що гуманізоване антитіло дикого типу до СО19 людини має три гарячі точки дезамідування в НМК-І1: МЗМОМТ (ЗЕО ІО МО: 36). Додатково виявили те, що в НМК-На2 присутня додаткова гаряча точка дезамідування: КЕМС (ЗЕО ІЮ МО: 37).

В одному аспекті в даному документі запропоновано виділене гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини та має поліпшену стабільність, особливо стабільність відносно дезамідування в НУК важкого та легкого ланцюга: НМК-Н2 та НМК-11 в порівнянні з іншими гуманізованими варіантами. В даному поліпшеному гуманізованому антитілі до СО19 людини зберігається перехресна реактивність батьківського мишиного антитіла відносно антигенів людини/яванського макака.

Для направлення на гарячу точку дезамідування в НМК-Н2 була введена точкова мутація від М (Аб5п) до С) (СіІп) в положенні 64 (нумерація згідно Кара). Таким чином, антитіло, як описано в даному документі, має НМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність Т2КЕОС (ЗБЕО ІЮО МО: 38). В одному переважному втіленні гуманізоване антитіло до СО19 людини містить НМВ-Н2, що має амінокислотну послідовність ХАМРУКМОСОК УТЕККОС (5 | МО: 11).

Для направлення на гарячі точки дезамідування до легкого ланцюга та для одержання гуманізованого антитіла до СО19 людини з поліпшеною стабільністю відносно дезамідування були введені індивідуальні мутації в положення 274, 27Е, 28 та 29 за Кабаї та подвійна мутація в положення 27е та 28 (нумерація згідно Кара). Всього генерували 9 варіантів (вар. 1-вар. 9;

ЗЕО ІО МО: 60-68 та 70) гуманізованого антитіла дикого типу (вар. 0; ЗЕО ІО МО: 59 та 69).

Положення ЗУ положення Б за Караї ШУ за Кабаї й

Бо: де но: вар. біІдт ОоЗЕЕМОМОМТУ, ТЕКЕМОКАТІ, вар.1:Щ2аВН ОоББЕНОМОМТ ХУ, ТЕКВОСВУТМ вар.сІМ27а0 ОВБЕОаМОМТ ХХІ, ТЕКЕОСВУТМ вар.3З:577еА ОБЬЕМАВСМТ У, ТЕКЕОЮВУТМ вар.дІ:ІБАТеу ООЗБЕМУМОМТ ХУ, ТтЕКВОСКУТИМ вар.бБ:ІшлТар ОББЕМРЕОМТ І, ТЕКЕОСКУТИ вар.бБІМІВО шеБЕМБОСМТ І, ТЕКВКОСВУТМ вар.7:0с29А ОВБЕМБМАМТ У, ТЕКЕОСКУТМ вар.8І:ІБ5Бег9у ОББЕМАМУМТ ХУ ТЕКЕОСКУТМ вар.9:Б5Б27еРиМо8В ОББЕМРБСМТТ, ТЕККОСБУТМ варіант - 1 2 З 4 5 7 параметр

Ко (ВІАсоге о ) 1 в | 2во | 136 | 2 1 ва 4 | 16 | 45

ІнМм)

І їхві 01 1,1 105,2 | 191,5 | 43,6 4,4 51,5 17,6 4 зв'язування з

СО19 людини після інкубації| 46 75 84 85 95 91 72 83 83 при рН 7,4

Чо зв'язування з

СО19 людини після інкубації 95 95 97 97 91 87 при рН 6,0

Чо головний пік гель- фільтрації »95 | » 95 » 95 » 95 » 95 » 95 » 95 » 985 » 985 після інкубації

Чо

Виявили те, що при одній мутації в положенні 27е згідно КаБбаї - від 5 (серин) до Р (пролін) - можуть бути порушені всі гарячі точки дезамідуання в НМК-11. Це не мутація схильного до дезамідування залишку М (аспарагіну), а сусіднього залишку.

Таким чином, антитіло, як описано в даному документі, має НМЕК-1І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕМЕРМОМТ (5БО ОО МО: 39). В одному втіленні гуманізоване антитіло до СО19 людини містить НМВ-11, що має амінокислотну послідовність БЕМРЕСМТ (ЗЕБЕО ІЮО МО: 40). В одному переважному втіленні гуманізоване антитіло до СО19 людини . . . . ващоОовІМУ КУТ містить НМВ-11, що має амінокислотну послідовність РУЗОББЕМРМ СМТУБМ (Ед |Ю МО: 20).

В одному переважному втіленні гуманізоване антитіло до СО19 людини містить НМЕ-1І1, що має амінокислотну послідовність ЕЯСОСТСЕМРЕ СМТ (5ЕО ІЮ МО: 28).

Додатково у даних антитіл підтримується перехресна реактивність з СО19 яванського макака, як показано в наступній Таблиці.

ЕСО (позаклітинний

Таким чином, в одному втіленні антитіло до СО19 людини специфічно зв'язується з СЮО19 людини і СО19 яванського макака.

Гуманізоване антитіло дикого типу до СЮО19 людини (вар. 0) демонструє після очищення приблизно 7,5 Уо-не дезамідування. Після зберігання протягом двох тижнів при рнН 7,4 кількість дезамідованого антитіла збільшується до приблизно 18,5 95. Варіант антитіла з мутацією 527еР (вар. 5) демонструє приблизно 2 95о-не дезамідування і 2 У5-не утворення сукциніміду після очищення. Протягом зберігання при рН 7,4 протягом двох тижнів присутні тільки приблизно 7,5 У дезамідованого антитіла.

В одному аспекті в даному документі запропоновано виділене гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини і СО19 яванського макака, що містить НМК-Н2 5ЕО ІО

МО: 11 ї НМК-ІЇ1 5ЕО ІО МО: 20 або 28.

В одному аспекті в даному документі запропоновано антитіло до СЮО19 людини, що містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з (а) НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕСО ОО МО: 03, (6) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11, (в) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 05, (г) НМК-111, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 20, (д) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 07, і (е) НМК-ІЇЗ3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 08.

В одному аспекті в даному документі запропоновано антитіло до СЮО19 людини, що містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з (а) НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕСО ОО МО: 03, (6) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11, (в) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 05, (г) НМК-111, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 28, (д) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 07, і (є) НМК-ІЇЗ3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 08.

В одному аспекті в даному документі запропоновано антитіло до СЮО19 людини, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМА УН, вибрані з (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 03, (б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну

Ко) послідовність ХЕО ІЮО МО: 11, ї (в) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 05. В одному втіленні дане антитіло містить НМЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність

ЗБЕО ІЮ МО: 05. В іншому втіленні дане антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БХЕО ІЮ МО: 05, і НМА-1Ї. 3, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО: 08.

В іншому втіленні дане антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО

ІЮ МО: 05, НМВ-І3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 08, ії НМЕК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 11. В іншому втіленні дане антитіло містить (а)

НМУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (б) НМЕК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 11, ї (в) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 05.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМА МІ, вибрані з (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 20, (6) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 07, і (в) НМА-1І-3, що містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 08. В одному втіленні дане антитіло містить (а) НМА-11, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО: 20, (б) НМЕ-1 2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 07, ї (в) НМА-І З, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМА МІ, вибрані з (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 28, (6) НМК-І2, що містить амінокислотну

БО послідовність 5ЕО ІЮ МО: 07, і (в) НМА-1І-3, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 08. В одному втіленні дане антитіло містить (а) НМА-11, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО: 28, (б) НМЕ-1 2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 07, і (в) НМКА-І З, що містить амінокислотну послідовність ФБЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті антитіло, як описано в даному документі, містить (а) домен УН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НУК МН, вибрані з () НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11, ії (її) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з

ЗЕО ІЮ МО: 05, і (б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМК МІ, вибрані з (ї) НМЕ-1І.1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20, (і) НМА-12, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 07, і (ії) НМК-І-3, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті антитіло, як описано в даному документі, містить (а) домен УН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НУЄ. МН, вибрані з (ї) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11, ії (її) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з

ЗЕО ІЮ МО: 05, і (б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМК МІ, вибрані з (ї) НМЕ-1І.1, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 28, (ії) НМА-І2, що містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 07, і (в) НМК-1І-3, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано антитіло, що містить (а) НМАК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11, (в) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 05, (г) НМК-111, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 20, (д) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 07, і (є) НМК-ІЇЗ3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано антитіло, що містить (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 03, (б) НМЕК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11, (в) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 05, (г) НМК-111, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 28, (д) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 07, і (е) НМК-ІЇЗ3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 08.

Антитіло до СО19 людини, як описано в даному документі, являє собою гуманізоване антитіло. В одному втіленні гуманізоване антитіло до СО19 людини містить такі ж НУК, які в будь-якому з наведених вище втілень, та додатково містить акцепторну людську каркасну ділянку, наприклад, каркасну ділянку людського імуноглобуліну (зародкової лінії) або людську консенсусну каркасну ділянку.

В іншому аспекті антитіло до СЮО19 людини містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), яка має щонайменше 90 95-ну, 91 Фо-ну, 92 95-ну, 93 Уо-ну, 94 Фо-ну, 95 95- ну, 96 У5-ну, 97 965-ну, 98 5-ну, 99 95-ну або 100 95-ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью 5ЕО ІЮО МО: 09. В деяких втіленнях послідовність МН, що має щонайменше 90 Фо-ну, 91 Уо-ну, 92 Уо-ну, 93 Уо-ну, 94 Уо-ну, 95 Уо-ну, 96 бо-ну, 97 уо-ну, 98 Уо-ну або 99 95-ну ідентичність, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно встановленої послідовності, але антитілло до СО19 людини, що містить дану послідовність, зберігає здатність до зв'язування з СО19 людини. В деяких втіленнях в ЗЕО ІЮ

МО: 09 всього від 1 до 10 амінокислот було замінено, вставлено та/або піддано делеції. У деяких втіленнях заміни, вставки або делеції відбуваються в ділянках поза НМК (тобто в ЕК).

Можливо антитіло до СО19 людини містить послідовність МН ЗЕО ІЮ МО: 09, що включає посттрансляційні модифікації даної послідовності. У конкретному втіленні МН містить одну, дві або три НУК, вибрані з: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (б)

НМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 11, ї (в) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 05.

В іншому аспекті запропоновано антитіло до СО19 людини, де дане антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), що має щонайменше 90 95-ну, 91 Фо-ну, 92 Фо-ну, 93 Уо-ну, 94 9У5-ну, 95 У5-ну, 96 Уо-ну, 97 Уо-ну, 98 Уо-ну, 99 95-ну або 100 95-ну ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністью ЗЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮО МО: 27 (ЗЕО ІО МО: 19 ії 5ЕО ІЮО МО: 27 відрізняються в одному положенні амінокислоти). В деяких втіленнях послідовність МІ, що має щонайменше 90 95-ну, 91 95-ну, 92 9о-ну, 93 9Уо-ну, 94 Фо-ну, 95 Уь-ну, 96 Фо-ну, 97 У5-ну, 98 Уо-ну або 99 55-ну ідентичність, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно встановленої послідовності, але антитіло до СО19 людини, що містить дану послідовність, зберігає здатність до зв'язування з СО19 людини. В деяких втіленнях в 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮО МО: 27 всього від 1 до 10 амінокислот було замінено, вставлено та/або піддано делеції. В деяких втіленнях заміни, вставки або делеції відбуваються в ділянках поза НМК (тобто в ЕК). Можливо антитіло до СО19 людини містить послідовність МІ в 5БО ІО МО: 19, що включає посттрансляційні модифікації даної послідовності. Можливо антитіло до СО19 людини містить послідовність МІ. в хЕО ІЮ МО: 27, Що бо включає посттрансляційні модифікації даної послідовності. У конкретному втіленні МІ. містить одну, дві або три НУК, вибрані з: (а) НМЕ-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ

МО: 20, (б) НМЕА-12, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 07, і (в) НМА-І 3, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮО МО: 08. В конкретному втіленні МІ. містить одну, дві або три НУК, вибрані з: (а) НМА-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, (б)

НМНВ-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕСО ІЮ МО: 07, ї (в) НМАК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 08.

В іншому аспекті запропоновано антитіло до СО19 людини, де дане антитіло містить таку ж

МН, як і в будь-якому з втілень, наведених вище, та таку ж Мі, як і в будь-якому з втілень, наведених вище. В одному втіленні антитіло містить послідовності МН та Мі в ЗЕО ІЮО МО: 09 та

ЗБО ОО МО: 19 або 27 відповідно, включаючи псттрансляційні модифікації даних послідовностей.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано антитіло, яке зв'язується з тим же самим епітопом, що і антитіло до СО19 людини, як описано в даному документі. Наприклад, в деяких втіленнях запропоновано антитіло, яке зв'язується з тим же самим епітопом, що і антитіло до СО19 людини, що містить послідовність МН 5ЕО ІЮО МО: 09 і послідовність МІ 5ЕО

ІО МО: 19.

В одному втіленні антитіло до СО19 людини за допомогою одного з наведених вище втілень є моноклональним антитілом. В одному втіленні антитіло до СО19 людини являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Бар, Рар", 5сЕм, діатіло або фрагмент ЕК(ар)2. В іншому втіленні антитіло являє собою повнорозмірне антитіло, наприклад, інтактне антитіло Ї(ДС1 або

Ід04, або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному документі.

В одному втіленні всіх аспектів антитіло містить (всі положення згідно з індексом ЕІ за

Кава): ї) гомодимерну ділянку Ес людського підкласу ЇДС1, можливо з мутаціями РЗ296, І 234А і

І235А, або і) гомодимерну ділянку Ес людського підкласу Ідс4, можливо з мутаціями РЗ3290, 5228Р і

І 235Е, або ії) гомодимерну ділянку Ес людського підкласу їдс1 з мутаціями (РЗ296, І234А ії І1235А)

І253А, НЗ1ТОА ї Н4З5А або з мутаціями (РЗ3290, І 234А, І 235А) НЗ1ТОА, Н4АЗЗА і У4З6А, або

Зо ім) гетеродимерну ділянку Ес, в якій а) один поліпептид ділянки Ес містить мутацію ТЗ36бУМУ, та інший поліпептид ділянки Ес містить мутації 73665, І З684А і 407, або б) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ і У349С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, у407М і 5354С, або в) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ і 5354С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, У407М і у349С, або м) гетеродимерну ділянку Ес людського підкласу Ідс1, в якій обидва поліпептиди ділянки Ес містять мутації РЗ290О, І 234А і І 235А, і а) один поліпептид ділянки Ес містить мутацію ТЗ36бУМУ, та інший поліпептид ділянки Ес містить мутації 73665, І З68А і 407, або б) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ і У349С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, у407М і 5354С, або в) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ і 5354С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, У407М і у349С, або мі) гетеродимерну ділянку Ес людського підкласу Іде4, в якій обидва поліпептиди ділянки Ес містять мутації РЗ29О, 5228Р і 1235Е, і а) один поліпептид ділянки Ес містить мутацію ТЗ36бУУ, та інший поліпептид ділянки Ес містить мутації 73665, І З68А і 407, або б) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ і У349С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, у407М і 5354С, або в) один поліпептид ділянки Ес містить мутації Т36бУМ ї 5354С, та інший поліпептид ділянки

Ес містить мутації 73665, І З368А, У407М і у349С, або мії) комбинацію одної з їїї) з Одною З Їм), М) і мі).

Одним аспектом, як описано в даному документі, є двовалентне біспецифічне антитіло, що містить: а) перший легкий ланцюг та перший важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з

Гс10) першим антигеном, та б) другий легкий ланцюг та другий важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з другим антигеном, де варіабельні домени МІ. та МН другого легкого ланцюга та другого важкого ланцюга замінюють один одного, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Антитіло згідно а) не містить модифікацію, як описано згідно б), та важкий ланцюг, та легкий ланцюг згідно а) являють собою виділені ланцюги.

У антитілі згідно б) в межах легкого ланцюга варіабельний домен легкого ланцюга Мі замінюється варіабельним доменом важкого ланцюга МН зазначеного атитіла, і в межах важкого ланцюга варіабельний домен важкого ланцюга МН замінюється варіабельним доменом легкого ланцюга Мі. зазначеного атитіла.

В одному втіленні ї) в константному домені СІ першого легкого ланцюга згідно а) амінокислота в положенні 124 (нумерація згідно Кара) замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і де в константному домені СНІ першого важкого ланцюга згідно а) амінокислота в положенні 147 або амінокислота в положенні 213 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара!) замінена на негативно заряджену амінокислоту, або ії) в константному домені Сі. другого легкого ланцюга згідно б) амінокислота в положенні 124 (нумерація згідно Кабраї) замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і де в константному домені СНІ другого важкого ланцюга згідно б) амінокислота в положенні 147 або амінокислота в положенні 213 (нумерація згідно індексу БЮ за Караї) замінена на негативно заряджену амінокислоту.

В одному переважному втіленні ї) в константному домені СІ першого легкого ланцюга згідно а) амінокислота в положенні 124 незалежно замінена на лізин (К), аргінін (К) або гістидин (Н) (нумерація згідно Кабраї) (в

Зо одному переважному втіленні - незалежно на лізин (К) або аргінін (К)), ії де в константному домені СНІ першого важкого ланцюга згідно а) амінокислота в положенні 147 або амінокислота в положенні 213 незалежно замінена на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0) (нумерація згідно індексу ЄЮ за Каба), або ї) в константному домені СІ. другого легкого ланцюга згідно б) амінокислота в положенні 124 незалежно замінена на лізин «(К), аргінін (К) або гістидин (Н) (нумерація згідно Кабайб (в одному переважному втіленні - незалежно на лізин (К) або аргінін (К)), і де в константному домені СНІ другого важкого ланцюга згідно б) амінокислота в положенні 147 або амінокислота в положенні 213 незалежно замінена на глутамінову кислоту (Е) або аспарагінову кислоту (0) (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабай.

В одному втіленні в константному домені Сі другого важкого ланцюга амінокислоти в положенні 124 і 123 замінені на К (нумерація згідно індексу БОЮ за Кабай.

В одному втіленні в константному домені СНІ другого легкого ланцюга амінокислоти в положенні 147 і 213 замінені на Е (нумерація згідно індексу БОЮ за Кабай.

В одному переважному втіленні в константному домені Сі першого легкого ланцюга амінокислоти в положенні 124 і 123 замінені на К і К відповідно, і в константному домені СНІ першого важкого ланцюга амінокислоти в положенні 147 і 213 замінені на Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабрад.

В одному втіленні в константному домені Сі другого важкого ланцюга амінокислоти в положенні 124 і 123 замінені на К, і де в константному домені СНІ другого легкого ланцюга амінокислоти в положенні 147 і 213 замінені на Е, і в варіабельному домені МІ. першого легкого ланцюга амінокислота в положенні 38 замінена на К, в варіабельному домені МН першого важкого ланцюга амінокислота в положенні 39 замінена на Е, в варіабельному домені МІ. другого важкого ланцюга амінокислота в положенні 38 замінена на К, і в варіабельному домені

МН другого легкого ланцюга амінокислота в положенні 39 замінена на Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабрад.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є двовалентне біспецифічне антитіло, що містить: а) перший легкий ланцюг та перший важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з 60 першим антигеном, і б) другий легкий ланцюг та другий важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з другим антигеном, де варіабельні домени МІ і МН другого легкого ланцюга і другого важкого ланцюга замінені один на одного, і де константні домени Сі і СНІ другого легкого ланцюга і другого важкого ланцюга замінені один на одного, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Антитіло згідно а) не містить модифікацію, як описано згідно б), і важкий ланцюг та легкий ланцюг згідно а) являють собою виділені ланцюги.

В антитілі згідно б) в межіх легкого ланцюга варіабельний домен легкого ланцюга МІ. замінений варіабельним доменом важкого ланцюга

МН зазначеного антитіла, і константний домен легкого ланцюга Сі замінений константним доменом важкого ланцюга СНІ зазначеного антитіла; і в межах важкого ланцюга варіабельний домен важкого ланцюга УН замінений варіабельним доменом легкого ланцюга

МІ. зазначеного антитіла, і константний домен важкого ланцюга СНІ замінений константним доменом легкого ланцюга Сі. зазначеного антитіла.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є двовалентне біспецифічне антитіло, що містить: а) перший легкий ланцюг та перший важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з першим антигеном, і б) другий легкий ланцюг та другий важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з другим антигеном, де константні домени Сі ї СНІ другого легкого ланцюга і другого важкого ланцюга замінені один на одного, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Антитіло згідно а) не містить модифікацію, як описано згідно б), і важкий ланцюг, і легкий ланцюг згідно а) являють собою виділені ланцюги.

В антитілі згідно б) в межах легкого ланцюга константний домен легкого ланцюга Сі. замінений константним доменом важкого ланцюга

СНІ зазначеного антитіла; і в межах важкого ланцюга константний домен важкого ланцюга СНІ замінений константним доменом легкого ланцюга

Сі. зазначеного антитіла.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є мультиспецифічне антитіло, що містить: а) повнорозмірне антитіло, що специфічно зв'язується з першим антигеном і складається з двох важких ланцюгів антитіла і двох легких ланцюгів антитіла, і б) один, два, три або чотири одноланцюгових фрагмента Бар, що специфічно зв'язуються з одним-чотирма додатковими антигенами (тобто другим та/або третім, та/або четвертим, та/або п'ятим антигеном, що переважно специфічно зв'язуються з одним додатковим антигеном, тобто з іншим антигеном), в якому зазначені одноланцюгові фрагменти Бар згідно б) злиті з зазначеним повнорозмірним антитілом згідно а) через пептидний лінкер на С- або М-кінці важкого або легкого ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла, де перший антиген або один з додаткових антигенів є СЮО19 людини.

В одному втіленні один або два ідентичних одноланцюгових фрагмента Рар, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці важкого або легкого ланцюгів зазначеного повнорозмірного антитіла.

В одному втіленні один або два ідентичних одноланцюгових фрагмента Рар, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці важких ланцюгів зазначеного повнорозмірного антитіла.

В одному втіленні один або два ідентичних одноланцюгових фрагмента Рар, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці легких ланцюгів зазначеного повнорозмірного антитіла.

В одному втіленні два ідентичних одноланцюгових фрагмента Раб, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці кожного важкого або легкого ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла.

В одному втіленні два ідентичних одноланцюгових фрагмента Раб, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці кожного важкого бо ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла.

В одному втіленні два ідентичних одноланцюгових фрагмента Раб, що зв'язуються з іншим антигеном, злиті з повнорозмірним антитілом через пептидний лінкер на С-кінці кожного легкого ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є тривалентне біспецифічне антитіло, що містить: а) повнорозмірне антитіло, що специфічно зв'язується з першим антигеном і складається з двох важких ланцюгів антитіла і двох легких ланцюгів антитіла, б) перший поліпептид, що складається 3: ба) варіабельного домену важкого ланцюга (УН) антитіла, або бб) варіабельного домену важкого ланцюга (МН) антитіла і константного домену 1 (СНІ) антитіла, де вказаний перший поліпептид злитий М-кінцем його домену МН через пептидний лінкер з кінцем одного з двох важких ланцюгів зазначеного повнорозмірного антитіла, в) другий поліпептид, що складається з: ва) варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла, або вб) варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) антитіла і константного домену легкого ланцюга (СІ) антитіла, де вказаний другий поліпептид злитий М-кінцем домену МІ. через пептидний лінкер з кінцем інших двох важких ланцюгів зазначеного повнорозмірного антитіла, і де варіабельний домен важкого ланцюга (УН) антитіла першого поліпептиду і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла другого поліпептиду утворюють разом антигензв'язуючий сайт, що специфічно зв'язується з іншим антигеном, і де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

В одному втіленні варіабельний домен важкого ланцюга (УН) антитіла поліпептиду згідно б) і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла поліпептиду згідно в) зв'язані і стабілізуються за допомогою міжланцюгового дисульфідного місточка за допомогою введення дисульфідного зв'язку між наступними положеннями: ї) положенням 44 варіабельного домену важкого ланцюга і положенням 100 варіабельного домену легкого ланцюга або ії) положенням 105 варіабельного домену важкого ланцюга і положенням 43 варіабельного домену легкого ланцюга, або ії) положенням 101 варіабельного домену важкого ланцюга і положенням 100 варіабельного домену легкого ланцюга (нумерація завжди здійснюється відповідно до індексу ЄЮ за Кара).

Методики для введення неприродних дисульфідних місточків для стабілізації описуються, наприклад, в М/О 94/029350, Ваіадораї, М., еї аї!., Ргої. Епо. (1997) 1453-59; Корауавні, Н., евї аї.,

Мисівєаг Меадісіпе « Віоіоду, Мої. 25, (1998) 387-393 або Зсптіаї, М., еї аІ., Опсодепе (1999) 18 1711-1721. В одному втіленні можливий дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами поліпептидів згідно б) і в) утворюється між положенням 44 варіабельного домену важкого ланцюга і положенням 100 варіабельного домену легкого ланцюга. В одному втіленні можливий дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами поліпептидів згідно б) і в) утворюється між положенням 105 варіабельного домену важкого ланцюга і положенням 43 варіабельного домену легкого ланцюга (нумерація завжди здійснюється відповідно до індексу ЄЮ за Кара). В одному втіленні переважним є тривалентне біспецифічне антитіло без зазначеної можливої дисульфідної стабілізації між варіабельними доменами МН і Мі. одноланцюгових фрагментів

Еаб.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є триспецифічне або тетраспецифічне антитіло, що містить: а) перший легкий ланцюг і перший важкий ланцюг повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном, і б) другий (модифікований) легкий ланцюг і другий (модифікований) важкий ланцюг повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з іншим антигеном, де варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, та/або де константні домени СІ. і СНІ замінюють один одного, і в) де від одного до чотирьох антигензв'язуючих пептидів, які специфічно зв'язуються з одним або двома додатковими антигенами (тобто з третім та/або четвертим антигеном), злиті 60 через пептидний лінкер з С- або М-кінцем легких ланцюгів або важких ланцюгів а) та/або б),

де перший антиген або другий антиген, або один з додаткових антигенів є СО19 людини.

Антитіло згідно а) не містить модифікацію, як описано згідно б), і важкий ланцюг та легкий ланцюг згідно а) являють собою виділені ланцюги.

В одному втіленні триспецифічне або тетраспецифічне антитіло містить відповідно до в) один або два антигензв'язуючих пептиди, які специфічно зв'язуються з одним або двома додатковими антигенами.

В одному втіленні антигензв'язуючі пептиди вибрані з групи фрагмента 5сЕм і фрагмента зегГар.

В одному втіленні антигензв'язуючі пептиди являють собою фрагменти 5сЕм.

В одному втіленні антигензв'язуючі пептиди являють собою фрагменти 5сЕар.

В одному втіленні антигензв'язуючі пептиди злиті з С-кінцем важких ланцюгів а) та/або б).

В одному втіленні триспецифічне або тетраспецифічне антитіло містить згідно в) один або два антигензв'язуючих пептида, які специфічно зв'язуються з одним додатковим антигеном.

В одному втіленні триспецифічне або тетраспецифічне антитіло містить згідно в) два ідентичних антигензв'язуючих пептида, які специфічно зв'язуються з третім антигеном. В одному переважному втіленні такі два ідентичних антигензв'язуючих пептида злиті обидва через однаковий пептидний лінкер з кінцем важких ланцюгів а) та б). В одному переважному втіленні два ідентичних антигензв'язуючих пептида являють собою або фрагмент 5сЕм, або фрагмент 5сЕаб.

В одному втіленні триспецифічне або тетраспецифічне антитіло містить згідно в) два антигензв'язуючих пептида, які специфічно зв'язуються з третім і з четвертим антигеном. В одному втіленні зазначені два антигензв'язуючих пептида обидва злиті через однаковий пептидний з'єднувач з С-кінцем важких ланцюгів а) і б). В одному переважному втіленні зазначені два антигензв'язуючих пептиди являють собою або фрагмент 5сЕм, або фрагмент зегГар.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне чотирьохвалентне антитіло, що містить: а) два легкі ланцюги та два важкі ланцюги антитіла, які специфічно зв'язуються з першим антигеном (та містять два фрагмента Раб),

Зо б) два додаткових фрагмента Раб антитіла, які специфічно зв'язуються з другим антигеном, де зазначені додаткові фрагменти Раб обидва злиті через пептидний лінкер або з С-, або з М- кінцями важких ланцюгів а), і де у фрагментах Раб були здійснені наступні модифікації: її в обох фрагментах Раб а) або в обох фрагментах Раб б) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, та/або константні домени СІ. ії СНІ замінюють один одного, або ії) в обох фрагментах Раб а) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, і константні домени СІ. ї СНІ замінюють один одного, і в обох фрагментах Бар б) варіабельні домени Мі і МН замінюють один одного, або константні домени Сі. і СНІ замінюють один одного, або ії) в обох фрагментах Рар а) варіабельні домени МІ і МН замінюють один одного, або константні домени СІ ї СНІ замінюють один одного, і в обох фрагментах Раб б) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, і константні домени СІ. ї СНІ замінюють один одного, або їм) в обох фрагментах Раб а) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, і в обох фрагментах Раб б) константні домени СІ. і СНІ замінюють один одного, або м) в обох фрагментах Раб а) константні домени Сі і СНІ замінюють один одного, і в обох фрагментах Раб б) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

В одному втіленні зазначені додаткові фрагменти Рабвб обидва злиті через пептидний лінкер або з С-кінцями важких ланцюгів а), або з М-кінцями важких ланцюгів а).

В одному втіленні зазначені додаткові фрагменти Раб обидва злиті через пептидний лінкер з

С-кінцями важких ланцюгів а).

В одному втіленні зазначені додаткові фрагменти Раб обидва злиті через пептидний з'єднувач з М-кінцями важких ланцюгів а).

В одному втіленні у фрагментах Рар здійснюються наступні модифікації: ї в обох фрагментах Раб а) або в обох фрагментах Раб б) варіабельні домени МІ і МН замінюють один одного, та/або константні домени Сі. і СНІ замінюють один одного.

В одному втіленні у фрагментах ЕРар здійснюються наступні модифікації: ї) в обох фрагментах Раб а) варіабельні домени МІ. і МН замінюють один одного, та/або константні домени Сі. і СНІ замінюють один одного.

В одному втіленні во фрагментах Раб здійснюються наступні модифікації: ї) в обох фрагментах Раб а) константні домени СІ. ї СНІ замінюють один одного.

В одному втіленні во фрагментах Раб здійснюються наступні модифікації: ї) в обох фрагментах Раь б) варіабельні домени МГ. і МН замінюють один одного, та/або константні домени СІ. ї СНІ замінюють один одного.

В одному втіленні во фрагментах Раб здійснюються наступні модифікації: ї) в обох фрагментах Раб б) константні домени СІ. ї СНІ замінюють один одного.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне чотирьохвалентне антитіло, що містить: а) (модифікований) важкий ланцюг першого антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном і містить першу пару доменів МН-СНІ, де С-кінець зазначеного важкого ланцюга і М- кінець другої пари доменів МН-СНІ зазначеного першого антитіла злиті через пептидний лінкер, б) два легкі ланцюга зазначеного першого антитіла а), в) (модифікований) важкий ланцюг другого антитіла, яке специфічно зв'язується з другим антигеном і містить першу пару доменів МН-СІ, де С-кінець зазначеного важкого ланцюга і М- кінець другої пари доменів МН-СІ. зазначеного другого антитіла злиті через пептидний лінкер, і г) два (модифіковані) легкі ланцюга зазначеного другого антитіла в), причому кожний містить

Ко) пару доменів СІ-СНІ, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне антитіло, що містить: а) важкий ланцюг та легкий ланцюг першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном, і б) важкий ланцюг та легкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з другим антигеном, де М-кінець важкого ланцюга з'єднується з С-кінцем легкого ланцюга через пептидний лінкер, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Антитіло згідно а) не містить модифікацію, як описано згідно б), і важкий ланцюг та легкий ланцюг являють собою виділені ланцюги.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне антитіло, що містить: а) повнорозмірне антитіло, що специфічно зв'язується з першим антигеном і що складається з двох важких ланцюгів антитіла і двох легких ланцюгів антитіла, і б) фрагмент Ем, що специфічно зв'язується з другим антигеном, що містить домен МН: і домен МІ, де обидва домену з'єднуються один з одним через дисульфідний місток, де тільки або домен УНЕ, або домен МІ: злиті через пептидний лінкер з важким або легким ланцюгом повнорозмірного антитіла, що специфічно зв'язується з першим антигеном, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

В даному біспецифічному антитілі важкі ланцюги і легкі ланцюги згідно а) являють собою виділені ланцюги.

В одному втіленні інші домен МН? або домен МІ не злиті через пептидний лінкер з важким або легким ланцюгом повнорозмірного антитіла, що специфічно зв'язується з першим антигеном.

В усіх аспектах, як описано в даному документі, перший легкий ланцюг містить домен Мі і домен СІ, і перший важкий ланцюг містить домен МН, домен СНІ, шарнірну ділянку, домен СН2 і домен СНЗ.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне тривалентне антитіло, що містить: а) два фрагмента Раб, які специфічно зв'язуються з першим антигеном,

б) один фрагмент Стго55ЕРар, який специфічно зв'язується з другим антигеном, в якому домени СНІ і СІ. обмінюються один з одним, в) одну ділянка Ес, що містить перший важкий ланцюг ділянки Ес і другий важкий ланцюг ділянки Ес, де С-кінець доменів СНІ двох фрагментів Раб з'єднаний з М-кінцем поліпептидів важкого ланцюга ділянки Ес, і де С-кінець домену СІ фрагмента Стго55ЕРар з'єднаний з М-кінцем домену МН одного з фрагментів Раб, де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне тривалентне антитіло, що містить: а) перший і другий фрагмент Рар, який кожний специфічно зв'язується з першим антигеном, б) один фрагмент Стго55Бар, який специфічно зв'язується з другим антигеном, в якому домени СНІ і СІ. обмінюються один з одним, в) одну ділянку Ес, що містить перший важкий ланцюг ділянки Ес і другий важкий ланцюг ділянки Ес, де С-кінець домену СНІ першого фрагмента Раб з'єднаний з М-кінцем одного з поліпептидів важкого ланцюга ділянки Ес, і С-кінець домену СІ фрагмента Стго55ЕРар з'єднаний з М-кінцем поліпептиду другого важкого ланцюга ділянки Ес, і де С-кінець домену СНІ другого фрагмента Рар з'єднаний з М-кінцем домену МН першого фрагмента Раб або з М-кінцем домену УН фрагмента Сгоз5РаБ, і де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне тривалентне антитіло, що містить: а) перший і другий фрагмент Раб, який кожний специфічно зв'язується з першим антигеном, б) один фрагмент Стго55ЕРар, який специфічно зв'язується з другим антигеном, в якому домени УН і МІ. обмінюються один з одним, в) одну ділянку Ес, що містить перший важкий ланцюг ділянки Ес і другий важкий ланцюг ділянки Ес,

Зо де С-кінець домену СНІ першого фрагмента Раб з'єднаний з М-кінцем одного з поліпептидів важкого ланцюга ділянки Ес, і С-кінець домену СНІ фрагмента Стго55Еар з'єднаний з М-кінцем другого поліпептиду важкого ланцюга ділянки Ес, і де С-кінець домену СНІ другого фрагмента Раб з'єднаний з М-кінцем домену МН першого фрагмента Раб або з М-кінцем домену МІ. фрагмента Сго55Рарб, і де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне антитіло, що містить: а) повнорозмірне антитіло, що специфічно зв'язується з першим антигеном і що складається з двох важких ланцюгів антитіла і двох легких ланцюгів антитіла, і б) фрагмент Раб, що специфічно зв'язується з другим антигеном, що містить домен МН: і домен МІ, що містять фрагмент важкого ланцюга і фрагмент легкого ланцюга, де в межах фрагмента легкого ланцюга варіабельний домен легкого ланцюга МІ? замінений варіабельним доменом важкого ланцюга МН: зазначеного антитіла, і в межах фрагмента важкого ланцюга варіабельний домен важкого ланцюга МН. замінений варіабельним доменом легкого ланцюга МІ 2 зазначеного антитіла, де фрагмент Раб важкого ланцюга вставлений між доменом СНІ одного з важких ланцюгів повнорозмірного антитіла і відповідною ділянкою Ес повнорозмірного антитіла, і М-кінець легкого ланцюга фрагмента Бар кон'югований з С-кінцем легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, що утворює пару з важким ланцюгом повнорозмірного антитіла, в яку було вставлено важкий ланцюг фрагмента Га, і де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

Одним аспектом, як описано в даному документі, є біспецифічне антитіло, що містить: а) повнорозмірне антитіло, що специфічно зв'язується з першим антигеном і що складається з двох важких ланцюгів антитіла і двох легких ланцюгів антитіла, і б) фрагмент Рар, що специфічно зв'язується з другим антигеном, що містить домен МН: і домен МІ, що містять фрагмент важкого ланцюга і фрагмент легкого ланцюга, де в межах фрагмента легкого ланцюга варіабельний домен легкого ланцюга МІ? замінений варіабельним доменом важкого ланцюга МН: зазначеного антитіла, і в межах фрагмента важкого ланцюга варіабельний домен важкого ланцюга МН? замінений варіабельним доменом легкого ланцюга МІ? зазначеного антитіла, де С-кінець фрагмента важкого ланцюга фрагмента Раб кон'югований з М-кінцем одного з важких ланцюгів повнорозмірного антитіла, і С-кінець фрагмента легкого ланцюга фрагмента

Еар кон'югований з М-кінцем легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, що утворює пару з важким ланцюгом повнорозмірного антитіла, з якою кон'югований фрагмент важкого ланцюга фрагмента Раб, і де перший антиген або другий антиген є СЮО19 людини.

В одному втіленні всіх аспектів антитіло, як описано в даному документі, являє собою мультиспецифічне антитіло, яке вимагає гетеродимеризації щонайменше двох поліпептидів важкого ланцюга, і де дане антитіло специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину і з другим антигеном рецептора трансферину, що не є людським.

Було описано декілька підходів для модифікацій СНЗ для того, щоб підтримувати гетеродимеризацію, наприклад, в УМО 96/27011, МО 98/050431, ЕР 1870459, МО 2007/110205,

МО 2007/147901, МО 2009/089004, МО 2010/129304, МО 2011/90754, МО 2011/143545, МО 2012/058768, МО 2013/157954, МО 2013/096291, які включені в даний документ за допомогою посилання. Характерно в підходах, відомих в даній галузі і домен СНЗ першого важкого ланцюга, і домен СНЗ іншого важкого ланцюга генетично модифіковані комплементарно таким чином, що важкий ланцюг, який містить один генетично модифікований домен СНЗ, більше не може гомодимеризуватися з іншим важким ланцюгом тієї ж самої структури (наприклад, перший важкий ланцюг з генетично модифікованим СНЗ більше не може гомодимеризуватися з іншим першим важким ланцюгом з генетично модифікованим СНЗ; і другий важкий ланцюг з генетично і модифікованим СНЗ більше не може гомодимеризуватися з іншим другим важким ланцюгом з генетично модифікованим СНЗ). За допомогою цього важкий ланцюг, що містить один генетично модифікований домен СНЗ, можна примусити до гетеродимеризації з іншим важким

Зо ланцюгом, що містить домен СНЗ, що генетично модифіковано комплементарним чином. Для цього втілення домен СНЗ першого важкого ланцюга і домен СНЗ іншого важкого ланцюга генетично модифікуються комплементарним чином за допомогою амінокислотних замін таким чином, що перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг примушують до гетеродимеризації, тоді як перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг більше не можуть гомодимеризуватися (наприклад, з стеричних причин).

В даній області відомі різні підходи для підтримування гетеродимеризації важких ланцюгів, які були процитовані і включені вище, і вони розглядаються як інші альтернативи, що використовуються в наданні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, яке містить "неспарену ділянка Бар", одержану з першого антитіла, що специфічно зв'язується з першим антигеном, і "спарену ділянку Бар", одержану з другого антитіла, що специфічно зв'язується з другим антигеном, в комбінації з конкретними амінокислотними замінами, описаними вище.

Домени СНЗ мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, можуть бути змінені за допомогою технології "виступ в западину", яка детально описана з декількома прикладами, наприклад, в МО 96/027011, Віддмау, 4.В., еї аї., Ргоїєїп Епо. 9 (1996) 617-621 і

Мегснапі, А.М., єї аї., Маї. Віотесппої. 16 (1998) 677-681. В даному способі взаємодіючі поверхні двох доменів СНЗ змінюють для збільшення гетеродимеризації обох важких ланцюгів, що містять дані два домени СНЗ. Кожний з двох доменів СНЗ (двох важких ланцюгів) може бути "виступом", тоді як інший - "западиною". Введення дисульфідного місточка додатково стабілізує гетеродимери (МегсНапі, А.М., еї аї., Майте Віоїесн. 16 (1998) 677-681; Амеї, 5., єї аї., у. Мої.

Віо!. 270 (1997) 26-35) і збільшує вихід.

В одному переважному втіленні мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутацію ТЗ366УУ в домені СНЗ "ланцюга виступу" і мутації 73665, І З368А, У407М в домені

СНЗ "ланцюга западини" (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). Також може бути використаний додатковий міжланцюговий дисульфідний місток між доменами СНЗ (Мегспапі, АМ, еї а!., Маїиге

Віотеспи. 16 (1998) 677-681), наприклад, за допомогою введення мутації У349С в домен СНЗ "ланцюга виступу" і мутації ЕЗ56С або мутації 5354С в домен СНЗ "ланцюга западини". Таким чином, в іншому переважному втіленні мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутації У349С і ТЗ366УМ в одному з двох доменів СНЗ і мутації ЕЗ56С, 73665, бо Ї368А і х407М в другому з двох доменів СНЗ, або мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутації У349С і Т366УУ в одному з двох доменів СНЗ і мутації 5354С, 73665, І З68А і 407 в другому з двох доменів СНЗ (додаткова мутація У349С в одному домені

СНЗ і додаткова мутація ЕЗ56С або 5354С в другому домені СНЗ утворює міжланцюговий дисульфідний місток) (нумерація згідно індексу БЮ за Кабра)д.

Але також альтернативно або додатково можна використовувати інші технології "виступу в западину", як описано ЕР 1870459А1. В одному втіленні мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутації К4090 і КЗ70ОЕ в домені СНЗ "ланцюга виступу" і мутації

О0399К і ЕЗ57К в домені СНЗ "ланцюга западини" (нумерація згідно індексу БО за Кара).

В одному втіленні мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутацію Т366УУ в домені СНЗ "ланцюга виступу" і мутації 73665, І З368А і у407М в домені СНЗ "ланцюга западини", і додатково мутації К409О0 і КЗ7ОЕ в домені СНЗ "ланцюга виступу" і мутації О399К і ЕЗ357К в домені СНЗ "ланцюга западини" (нумерація згідно індексу ЄЮО за Каба).

В одному втіленні мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутації У349С і Т366МУ в одному з двох доменів СНЗ і мутації 5354, 73665, І З68А і У407М в других двух доменах СНЗ, або мультиспецифічне антитіло, як описано в даному документі, містить мутації У349С і Т366УУ в одному з двох доменів СНЗ і мутації 5354, 73665, І З3684А і

У407М в других двух доменах СНЗ і додатково мутації К4090 і КЗ70Е в домені СНЗ "ланцюга виступу" і мутації 0О399К і ЕЗ57К в домені СНЗ "ланцюга западини" (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара).

Крім "технології виступ в западину" в даній області відомі інші методики для модифікації доменів СНЗ важких ланцюгів мультиспецифічного антитіла для підсилення гетеродимеризації.

Дані технології, особливо технології, описані в М/О 96/27011, МО 98/050431, ЕР 1870459, МО 2007/110205, МО 2007/147901, М/о 2009/089004, МО 2010/129304, МО 2011/90754,

МО 2011/143545, УМО 2012/058768, УМО 2013/157954 ії МО 2013/096291, розглядаються тут як альтернативи "технології виступ в западину" в поєднанні з мультиспецифічним антитілом, як описано в даному документі.

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в ЕР 1870459. Даний підхід

Зо грунтується на введенні заряджених амінокислот з протилежними зарядами в конкретні положення амінокислот на поверхні контакту домену СНЗ/СНЗ між обома - першим і другим важкими ланцюгами.

Відповідно, дане втілення відноситься до мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, де в третинній структурі антитіла домен СНЗ першого важкого ланцюга і домен СНЗ другого важкого ланцюга утворюють поверхню контакту, яка розташована між відповідними доменами СНЗ антитіла, де кожна з відповідних амінокислотних послідовностей домену СНЗ першого важкого ланцюга і домену СНЗ другого важкого ланцюга містить набір амінокислот, які розташовані в межах зазначеної поверхні контакту в третинній структурі антитіла, де з набору амінокислот, які розташовані на поверхні контакту в домені СНЗ одного важкого ланцюга перша амінокислота замінена на позитивно заряджену амінокислоту, і з набору амінокислот, які розташовані на поверхні контакту в домені СНЗ другого важкого ланцюга друга амінокислота замінена на негативно заряджену амінокислоту. Мультиспецифічне антитіло згідно даному втіленню в даному документі також зветься "СНЗ(/-)-генетично модифіковане мультиспецифічне антитіло" (де скорочення "/-" означає протилежно заряджені амінокислоти, які були введені у відповідні домени СНЗ).

В одному втіленні зазначеного СНЗ(ї/-)--енетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, позитивно заряджена амінокислота вибраназк, Кін, і негативно заряджена амінокислота вибрана з Е або 0.

В одному втіленні зазначеного СНЗ(ї/-)--енетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, позитивно заряджена амінокислота вибрана зкКів, і негативно заряджена амінокислота вибрана з Е або 0.

В одному втіленні зазначеного СНЗ(ї/-)--енетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, позитивно заряджена амінокислота являє собою К, та негативно заряджена амінокислота являє собою Е.

В одному втіленні зазначеного СНЗ(ї/-)--енетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота К в положенні 409 замінена на б, і амінокислота К в положенні замінена на Е, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Ю в положенні 399 замінена на К, і амінокислота Е в положенні 357 замінена на К (нумерація згідно індексу БО за Каба).

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в М/О 2013/157953. В одному втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені

СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Її в положенні 351 замінена на О (нумерація згідно індексу БЮ за Кава). В іншому втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К, і амінокислота ГІ. в положенні 351 замінена на К, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота ГІ. в положенні 351 замінена на 0 (нумерація згідно індексу БО за Кара).

В іншому втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на К, і амінокислота Ї в положенні 351 замінена на К, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Ї в положенні 351 замінена на О (нумерація згідно індексу БО за Каба).

Додатково в домені СНЗ другого важкого ланцюга міститься щонайменше одна з наступних замін: амінокислота ХУ в положенні 349 замінена на Е, амінокислота У в положенні 349 замінена на 0, і амінокислота І в положенні 368 замінена на Е (нумерація згідно індексу БЮ за Кара). В одному втіленні амінокислота І в положенні 368 замінена на Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за

Кабай).

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в М/О 2012/058768. В одному втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені

СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота І в положенні 351 замінена на У, і амінокислота У в положенні 407 замінена на А, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на А, і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація згідно індексу ЕО за Кара). В іншому втіленні в домені СНЗ другого важкого ланцюга, крім вищезазначених замін, замінена щонайменше одна з амінокислот в положеннях 411 (початково

Т), 399 (початково 0), 400 (початково 5), 405 (початково Е), 390 (початково М) і 392 (початково

Зо К) (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). Переважними замінами є наступні: - заміна амінокислоти Т в положенні 411 амінокислотою, вибраною з М, К, О,К, О, Е і М (нумерація згідно індексу ШО за Каба), - заміна амінокислоти О в положенні 399 амінокислотою, вибраною з КЕ, ММ, М і К (нумерація згідно індексу ЄЮ за Каба), - заміна амінокислоти 5 в положенні 400 амінокислотою, вибраною з Е, 0, Е і К (нумерація згідно індексу ЄЮ за Каба), - заміна амінокислоти Е в положенні 405 амінокислотою, вибраною з І, М, Т, 5, М і М (нумерація згідно індексу ШО за Каба), - заміна амінокислоти М в положенні 390 амінокислотою, вибраною з К, К і (нумерація згідно індексу БО за Кава і - заміна амінокислоти К в положенні 392 амінокислотою, вибраною з М, М, БК, Її, Бі Е (нумерація згідно індексу БО за Кара).

В іншому втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі (генетично модифіковане згідно ММО 2012/058768), в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота ГІ. в положенні 351 замінена на У, і амінокислота У в положенні 407 замінена наА, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на М, і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кава). В іншому втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені

СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота У в положенні 407 замінена на А, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на А, і амінокислота К в положенні 409 замінена на Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кава). У зазначеному останньому вищезгаданому втіленні в домені СНЗ зазначеного другого важкого ланцюга амінокислота К в положенні 392 замінена на Е, амінокислота Т в положенні 411 замінена на Е, амінокислота Ю в положенні 399 замінена на К, і амінокислота 5 в положенні 400 замінена на К (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кава.

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в М/О 2011/143545. В одному втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домени

СНЗ обох важких ланцюгів вводятся модифікації амінокислот в положеннях 368 та/або 409 (нумерація згідно індексу БО за Кара).

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в УМО 2011/090762. УМО 2011/090762 відноситься до модифікацій амінокислот згідно з технологією "виступ в западину".

В одному втіленні зазначеного СНЗ(Кін)-генетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на МУ, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота У в положенні 407 замінена на А (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В іншому втіленні зазначеного СНЗУ(КіН)-генетично модифікованого мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота Т в положенні 366 замінена на МУ, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота У в положенні 407 замінена на Т (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабра).

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, яке належить до ізотипу дО2, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в М/О 2011/090762.

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в М/О 2009/089004. В одному втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені

СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота К або М в положенні 392 замінена на негативно заряджену кислоту (в одному переважному втіленні - на Е або О, в одному переважному втіленні - на 0), і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Ю в положенні 399, амінокислота Е або Ю в положенні 356, або амінокислота Е в положенні 357 замінена на позитивно заряджену амінокислоту (в одному переважному втіленні - на К або К, в одному переважному втіленні - на К, в одному переважному втіленні амінокислоти в положеннях 399 або 356 замінені на К) (нумерація згідно індексу БЮ за Каба). В одному додатковому втіленні, крім вищезазначених замін, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота К або К в положенні 409 замінена на негативно заряджену амінокислоту (в одному переважному втіленні - на Е або 0, в одному переважному втіленні - на 0) (нумерація згідно індексу Є за Кара). В ще одному іншому втіленні, крім або як альтернатива вищезгаданим замінам, в домені СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота К в положенні 439 та/або амінокислота К в положенні 370 незалежно одна від одної замінені на негативно заряджену амінокислоту (в одному переважному втіленні - на Е або 0, в одному переважному втіленні - на О) (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабаю.

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в МО 2007/147901. В одному втіленні зазначеного мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, в домені

СНЗ одного важкого ланцюга амінокислота К в положенні 253 замінена на Е, амінокислота О в положенні 282 замінена на К, і амінокислота К в положенні 322 замінена на 0, і в домені СНЗ другого важкого ланцюга амінокислота Ю в положенні 239 замінена на К, амінокислота Е в положенні 240 замінена на К, і амінокислота К в положенні 292 замінена на 0 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабрад.

В одному втіленні мультиспецифічного антитіла, як описано в даному документі, для підтримання гетеродимеризації першого важкого ланцюга і другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла використовується підхід, описаний в УМО 2007/110205.

В одному втіленні всіх аспектів і втілень, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло являє собою біспецифічне антитіло або триспецифічне антитіло. В одному переважному втіленні мультиспецифічне антитіло являє собою біспецифічне антитіло.

В одному втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, антитіло являє собою двовалентне або тривалентне антитіло. В одному втіленні дане антитіло являє собою двовалентне антитіло.

В одному втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло має структуру константного домену антитіла типу Ід. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу ЇдДС1 або до людського підкласу бо ІДОС1 з мутаціями 1 234А і І1235А. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Ідс2. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Іде3. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Ідс4 або до людського підкласу Ід04 з додатковою мутацією 5228Р. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу ЇДС1 або до людського підкласу Ід054. В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Їдс1 з мутаціями 1 234А і І 235А (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу ДО1 з мутаціями І 234А, 1235А і РЗ290 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Ідс4 з мутаціями 5228Р і 1235Е (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В одному іншому втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, мультиспецифічне антитіло характеризується тим, що зазначене мультиспецифічне антитіло належить до людського підкласу Ід04 з мутаціями 5228Р, 1235Е і РЗ290 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кабрад.

В одному втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, антитіло, що містить важкий ланцюг, що включає домен СНЗ, як визначено в даному документі, містить додатковий С- кінцевий гліцин-лізиновий дипептид (05446 і К447, нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В одному втіленні всіх аспектів, як описано в даному документі, антитіло, що містить важкий ланцюг, що включає домен СНЗ, як визначено в даному документі, містить додатковий С- кінцевий залишок гліцину (5446, нумерація згідно індексу БЮ за Кабрай.

Антитіло, як описано в даному документі, в одному втіленні характеризується тим, що належить до людського підкласу Ї(ДС1 з мутаціями РМА236, І234А/Л 235А та/або сі РОЗЗ331 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара) або до підкласу ІдД54. В іншому втіленні антитіло характеризується тим, що належить до любого підкласу Ідс, в одному втіленні - до Ідс1 або

ІЧ04, що містить щонайменше одну мутацію в Е233, 1234, 1235, 5236, 0270, М297, ЕЗ318, КЗ320,

КЗ322, АЗ27, АЗ30, РЗ331 та/або РЗ329 (нумерація згідно індексу ЄЮ за Кара). В одному втіленні антитіло підкласу ІдДсС4 додатково містить мутацію 5228Р або мутації 5228Р і І 235Е (Апааї, 5., єї а!., Мої. Іттипої. 30 (1993) 105-108) (нумерація згідно індексу ЄЮО за Кара).

С-кінець важкого ланцюга антитіла, як описано в даному документі, може являти собою повний С-кінець, що закінчується амінокислотними залишками РОК. С-кінець важкого ланцюга може являти собою укорочений С-кінець, в якому були видалені один або два С-кінцевих амінокислотних залишки. В одному переважному втіленні С-кінець важкого ланцюга являє собою укорочений С-кінець, що закінчується РО.

В деяких втіленнях запропоноване тут антитіло може бути додатково модифіковано так, щоб воно містило один або більш ніж один човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру, який відомий в даній області і легко доступний.

Човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру характеризується наявністю специфічності зв'язування відносно рецептора гематоенцефалічного бар'єру. Ця специфічність зв'язування може бути одержана або злиттям човникового модуля гематоенцефалічного бар'єру з антитіллом до СО19 людини, як описано в даному документі, або вона може бути одержана введенням специфічності зв'язування до рецептора гематоенцефалічного бар'єру як одної з специфічностей зв'язування мультиспецифічного антитіла, що специфічно зв'язується з

СО19 людини і, таким чином, має специфічність зв'язування антитіла до СО19 людини, як описано в даному документі, і специфічність зв'язування до рецептора гематоенцефалічного бар'єру.

Один або більше ніж один човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру може бути злитий з будь-яким кінцем легкого або важкого ланцюга антитіла до СО19 людини, як описано в даному документі. В одному переважному втіленні човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру злитий з С-кінцем важкого ланцюга.

Один або більше ніж один човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру може бути злитий з відповідним ланцюгом антитіла або безпосередньо, або через лінкерний пептид. В одному переважному втіленні лінксерний пептид має амінокислотну послідовність сазасасвзассавасисе (ЗЕО ІО МО: 41).

Човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру може являти собою фрагмент 5сЕм антитіла. В одному втіленні човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру являє собою 5СЕм, що містить в порядку від М- до С-кінця варіабельний домен легкого ланцюга - константний домен легкого ланцюга - лінкерний пептид - варіабельний домен важкого ланцюга - константний домен 1 важкого ланцюга.

В одному переважному втіленні човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру являє собою фрагмент 5сЕм антитіла 803 до рецептора трасферину з (545)6є лінкерним пептидом або його гуманізований варіант.

Термін "його гуманізований варіант" означає молекулу, яка була одержана пересадкою СОК мишиного антитіла 803 на людський каркас з можливим введенням, незалежно один від одного, однієї-трьох мутацій в кожну з каркасних ділянок (ЕК) та/або гіперваріабельних ділянок (НУК).

В одному аспекті в даному документі запропоновано злитий поліпептид антитіла до СО19 людини, що містить антитіло до СО19 людини, два пептидних лінкера і два одновалентних зв'язуючих елементи, які зв'язуються з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, де даний лінкер зв'язує антитілли до СО19 людини з одновалентними зв'язуючими елементами, які зв'язуються з рецептором гематоенцефалічного бар'єру.

В одному аспекті в даному документі запропоновано злитий поліпептид антитіла до СО19 людини, що містить антитіло до СО19 людини, пептидний лінкер і один одновалентний зв'язуючий елемент, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, де даний лінкер зв'язує антитіло до СО19 людини з одновалентним зв'язуючим елементом, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру.

В одному втіленні одновалентний зв'язуючий елемент, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, вибраний з групи, що складається з білків, поліпептидів і пептидів.

В одному втіленні одновалентний зв'язуючий елемент, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, містить молекулу, вибрану з групи, що складається з ліганда рецептора гематоенцефалічного бар'єру, зсЕм, Ем, зсЕабр, МНН, в одному переважному втіленні -5сЕм або зсЕаБ.

В одному втіленні рецептор гематоенцефалічного бар'єру вибраний з групи, що складається з рецептора трансферину, рецептора інсуліну, рецептора інсуліноподібного фактора росту, білка 8, родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності, білка 1, родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності, і гепаринзв'язуючого фактора росту, подібного епідермальному фактору росту. В одному переважному втіленні рецептор гематоенцефалічного бар'єру являє собою рецептор трансферину.

В одному втіленні одновалентний зв'язуючий елемент, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, містить один 5сБар або один 5сЕм, спрямований на рецептор трансферину, більш конкретно 5сЕар або 5сЕм, що розпізнає епітоп в рецепторі трансферину, що міститься в межах амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО: 42, 43 і 44.

В одному втіленні одновалентний зв'язуючий елемент, який зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру, зв'язаний з С-кінцевим кінцем важкого ланцюга антитіла до СО19 людини за допомогою лінкера.

В одному втіленні пептидний лінкер являє собою амінокислотну послідовність, що має довжину щонайменше 15 амінокислот, більш переважно - довжину від18 до 25 амінокислот.

В одному втіленні антитіло до СО19 людини являє собою повнорозмірне антитіло, в одному переважному втіленні - повнорозмірний до. Термін "повнорозмірне антитіло" означає антитіло, що складається з двох поліпептидів легкого ланцюга антитіла і двох поліпептидів важкого ланцюга антитіла, де в двох поліпептидах важкого ланцюга антитіла С-кінцевий залишок лізину (К) може бути присутнім чи ні.

В одному переважному втіленні злитий поліпептид антитіла до СО19 людини містить повнорозмірне антитіло (ДС до СО19 людини як мозковий ефекторний елемент, лінкер послідовності сОо5((((5(0((о(505(50о(05 (5БО ІЮО МО: 41) і один 5сРар як одновалентний зв'язуючий елемент, що зв'язується з людським рецептором трансферину як рецептором гематоенцефалічного бар'єру, де 5сЕРар зв'язаний за допомогою лінкера з С-кінцевим кінцем (частини Ес) одної з важких ланцюгів повнорозмірного антитіла до СО19 людини, і де зсЕар розпізнає епітоп в людському рецепторі трансферину, що міститься в межах амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 52, 53 і 54.

В одному переважному втіленні злитий поліпептид антитіла до СО19 людини містить бо повнорозмірне антитіло ДОС до СО19 людини як мозковий ефекторний елемент, лінкер послідовності СО5ООС(О5ОСОО5БОС(О(З5 (БО ІЮО МО: 41) і один 5сЕм як одновалентний зв'язуючий елемент, що зв'язується з людським рецептором трансферину як рецептором гематоенцефалічного бар'єру, де 5сРар зв'язаний за допомогою лінкера з С-кінцевим кінцем (частини Ес) одного з важких ланцюгів повнорозмірного антитіла до СО19 людини, і де 5сЕар розпізнає епітоп в людському рецепторі трансферину, що міститься в межах амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 42, 43 і 44.

В одному втіленні перший важкий ланцюг антитіла до СО19 людини містить перший модуль димеризації, і другий важкий ланцюг антитіла містить другий модуль димеризації, забезпечує гетеродимерізацію двох важких ланцюгів.

В одному втіленні перший модуль димеризації першого важкого ланцюга антитіла до СО19 людини являє собою важкий ланцюг виступу, і модуль димеризації другого важкого ланцюга антитіла до СО19 людини являє собою важкий ланцюг западини (згідно зі стратегією виступ в западину).

Злитий поліпептид антитіла до СО19 людини, як описано в даному документі, можна використовувати для транспортування антитіла до СО19 людини через гематоенцефалічний бар'єр.

В одному втіленні важкий ланцюг антитіла до СО19 людини, який зв'язаний на його С- кінцевому кінці ділянки Ес з 5сбар як одновалений зв'язуючий елемент, що зв'язується з людським рецептором трансферину, має наступну структуру в напрямку від М- до С-кінця: важкий ланцюг Ід, пептидний лінкер, що зв'язує С-кінцевий кінець ділянки Ес важкого ланцюга дос з М-кінцевим кінцем домену МІ 5сЕар, в одному переважному втіленні даний пептидний лінкер має амінокислотну послідовність ОБО 5ОСс(ОО5ОС(ОО5 (5ЕО ІЮ МО: 41), варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) і домен С-каппа легкого ланцюга 5сЕаб, пептидний лінкер, що зв'язує С-кінцевий кінець домену С-каппа легкого ланцюга 5сгар з М- кінцевим кінцем домену УН 5сЕаб, в одному переважному втіленні даний пептидний лінкер має амінокислотну послідовність (45)6с12 (ЗЕО І МО: 45), варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла 5сбаб і домен СНІ важкого ланцюга ща.

В одному втіленні важкий ланцюг антитіла до СО19 людини, який зв'язаний на його С- кінцевому кінці ділянки Ес з 5сЕм як одновалений зв'язуючий елемент, що зв'язується з людським рецептором трансферину, має наступну структуру в напрямку від М- до С-кінця: важкий ланцюг дос, пептидний лінкер, що зв'язує С-кінцевий кінець Ес-ч-астини важкого ланцюга Ідс з М- кінцевим кінцем домену МІ фрагмента антитіла зсЕм, в одному переважному втіленні даний пептидний лінкер являє собою пептид Кк! амінокислотною послідовністью сазасасвзассавасисе (ЗЕО ІО МО: 41), варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), пептидний лінкер, що зв'язує С-кінцевий кінець варіабельного домену легкого ланцюга з М- кінцевим кінцем домену МН 5сЕм, в одному переважному втіленні даний пептидний лінкер являє собою пептид з амінокислотною послідовністью ((345)6032 (ЗЕО ІО МО: 45), варіабельний домен важкого ланцюга (УН) фрагмента антитіла 5сгЕУ.

В одному втіленні човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру/єсбар або в5сгм, направлений на рецептор гематоенцефалічного бар'єру, походить з гуманізованого антитіла 803 до рецептора трансферину (див., наприклад, Воадо, К.., еї аІ., Віоїесппої. Віоепд. 102 (2009) 1251-1258). Варіабельний домен мишиного важкого ланцюга має наступну амінокислотну послідовність:

ЕєЛОПУЮЕВОСО БУОРСМВІТІ, БСМАВСЕТЕВ МУСОМНВІВОА 0 РЕКСОБЕМТАМ ІУТУрЕБКММУ

АБТУКОВЕТІ ЗВАБМВКМТЬУ ПЕММАЬВОКЕБ ТАМУУСАУРТ ВНУУУНВУуУМОО сУудутувв (ЗЕО ІО МО: 46).

Варіабельний домен мишиного легкого ланцюга (варіант 1) має наступну амінокислотну послідовність:

ПІОМТОВРАВ ІЗАБТЕВБТУТ ІТСОАЯОТІС МИТАБУООКР бКЕРОБЬІУС 0 АТВБАрСУРа

ВЕБСБВБСТО КБЗЬКІБВУОУ ЕРІСІХУУСІО АХУМТРИТЕОО СТКОВІК

(ЗЕО І МО: 47), і варіабельний домен мишиного легкого ланцюга (варіант 2) має наступну амінокислотну послідовність:

ПІОМТОВБРАБ БВАББЕБІХУТ ІТСОдВартс МЖРТАШУООКР СскдРОБЬТУС 0 АТВБАрСУРА

БЕБСОВаСТО КЗОКІБВУСУ ЕВІСІУУСЬО АУМТРИТЕСО СТКУКІК (ЗЕО ІО МО: 48).

В одному втіленні антитіло до рецептора трансферину або специфічність зв'язування проти рецептора трансферину містить (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ

МО: 51; (б) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 52; (в) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 53, 54 або 55; (г) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 56; (д) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 57; і (е) НМК-1І 3, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 58.

В одному втіленні антитіло до рецептора трансферину містить щонайменше одну пару варіабельного домену важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 49 і варіабельного домену легкого ланцюга

ЗЕО ІЮ МО: 50, що утворює сайт зв'язування у відношенні рецептора трансферину.

Один човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру

В одному аспекті антитіло до СЮО19 людини або злитий поліпептид антитіла до СЮО19 людини має точно одну специфічність зв'язування або човниковий модуль для гематоенцефалічного бар'єру, таким чином, є щонайменше біспецифічним, де специфічність зв'язування або човниковий модуль для гематоенцефалічного бар'єру містить гуманізовані варіабельні домени антитіла 803 до рецептора трансферину людини або пару варіабельного домену важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 49 і варіабельного домену легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 50, при цьому специфічність зв'язування або човниковий модуль для гематоенцефалічного бар'єру транспортує антитіло до СО19 людини через гематоенцефалічний бар'єр.

Один або два човникових модуля гематоенцефалічного бар'єру

В одному аспекті антитіло до СЮО19 людини або злитий поліпептид антитіла до СЮО19 людини має одну або дві специфічності зв'язування або човникових модуля для гематоенцефалічного бар'єру, таким чином, є щонайменше біспецифічним, де сайт зв'язування або човниковий модуль для гематоенцефалічного бар'єру походить(дять) з антитіла, яке зв'язується з рецептором гематоенцефалічного бар'єру (ВВВ-К, специфічність зв'язування у відношенні ВВВ-

К) з низькою афінністю, при цьому специфічність зв'язування або човниковий модуль для гематоенцефалічного бар'єру, що походить 3з антитіла, яке зв'язується з рецептором

Зо гематоенцефалічного бар'єру з низькою афінністю, транспортує антитіло до СО19 людини через гематоенцефалічний бар'єр.

В одному втіленні ВВВ-К вибраний з групи, що складається з рецептора трансферину (ТІК), рецептора інсуліну, рецептора інсуліноподібного фактора росту (рецептор ІСЕ), білка 8, родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності (І КРВ8), білка 1, родинного рецептора ліпопротеїну низької щільності (І КРІ), і гепаринзв'язуючого фактора росту, подібного епідермального фактора росту (НВ-ЕСЕ). В іншому такому аспекті ВВВ-К являє собою людський ВВВ-К. В одному такому аспекті ВВВ-КЕ являє собою ТІ. В іншому такому аспекті

ВВВ-К являє собою ТІК, і антитіло не інгібує активність ТІК. В іншому такому аспекті ВВВ-В являє собою ТЕ, і антитіло не інгібує зв'язування ТІК з трансферином.

В одному втіленні антитіло не погіршує зв'язування ВВВ-К з одним або більше ніж одним з його природних лігандів. В одному такому втіленні антитіло специфічно зв'язується з людським рецептором трансферину (ПТК) таким чином, що воно не інгібує зв'язування ПТК з людським трансферином.

В одному втіленні специфічність зв'язування у відношенні ВВВ-К має ІСво (напівмаксимальна інгібуюча концентрація) у відношенні ВВВ-К від приблизно 1 нМ до приблизно 100 мкМ. В одному втіленні ІСво становить від приблизно 5 нМ до приблизно 100

МКМ. В одному втіленні ІСзо становить від приблизно 50 нМ до приблизно 100 мкМ. В одному втіленні ІЇС5о становить від приблизно 100 нМ до приблизно 100 мкМ. В одному втіленні специфічність зв'язування у відношенні ВВВ-К має афінність у відношенні ВВВ-Е від приблизно 5 НМ до приблизно 10 мкМ. В одному втіленні специфічність зв'язування у відношенні ВВВ-НВ, при кон'югуванні з або знаходженні в антитілі до СО19 людини, має афінність у відношенні ВВВ-

Е від приблизно 30 нМ до приблизно 1 мкМ. В одному втіленні специфічність зв'язування у відношенні ВВВ-К, при кон'югуванні з або знаходженні в антитілі до СО19 людини, має афінність у відношенні ВВВ-К від приблизно 50 нМ до приблизно 1 мкМ. В одному втіленні афінність специфічності зв'язування у відношенні ВВВ-К або злитого поліпептиду антитіла до

СОр19 людини у відношенні ВВВ-К вимірюється з використанням аналізу Скетчарда. В одному втіленні афінність специфічності зв'язування у відношенні ВВВ-К або злитого поліпептиду антитіла до СО19 людини у відношенні ВВВ-К вимірюється з використанням аналізу ВІАСОКЕ.

В одному втіленні афінність специфічності зв'язування у відношенні ВВВ-К або злитого поліпептиду антитіла до СО19 людини у відношенні ВВВ-К вимірюється з використанням конкурентного ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз).

Застосування злитих поліпептидів антитіла, що містять човник гематоенцефалічного бар'єру

В іншому втіленні в даному документі запропоновано спосіб збільшення впливу на ЦНС антитіла до СЮО19 людини, де антитіло до СЮО19 людини зв'язано з антитілом або фрагментом антитіла, який з низькою афінністю зв'язується з ВВВ-К, збільшуючи, за допомогою цього, вплив на ЦНС антитіла до СО19 людини. Термін "зв'язаний" включає випадки, в яких антитіло зі специфічністю зв'язування до ВВВ-К вводиться як друга специфічність зв'язування в щонайменш біспецифічне антитіло до СО19 людини/ВВВ-К. В одному втіленні збільшення впливу на ЦНС антитіла до СО19 людини вимірюється відносно впливу на ЦНС антитіла до

СО19 людини, зв'язаного з типовим антитілом, яке не має знижену афінність у відношенні ВВВ-

КЕ. В одному втіленні збільшення впливу на ЦНС антитіла до СЮО19 людини вимірюється як відношення кількості антитіла до СО19 людини, що знаходиться в ЦНС, відносно кількості, що знаходиться в сироватці після введення. В одному втіленні збільшення впливу на ЦНС призводить до відношення більше, ніж 0,1 95. В одному втіленні збільшення впливу на ЦНС антитіла до СО19 людини вимірюється відносно впливу на ЦНС антитіла до СО19 людини за відсутності зв'язаного антитіла до ВВВ-К. В одному втіленні збілошення впливу на ЦНС антитіла до СО19 людини вимірюється за допомогою візуалізації. В одному втіленні збільшення впливу на ЦНС антитіла до СО19 людини вимірюється за допомогою непрямих даних, таких як модифікація одного або більше ніж одного фізіологічного симптому.

Запропоновано спосіб збільшення утримування в ЦНС антитіла до СЮО19 людини, введеного суб'єкту, при якому антитіло до СО19 людини зв'язано з антитілом або фрагментом антитіла, яке зв'язується з ВВВ-К з низькою афінністю, таким чином, що збільшується утримування в

ЦНС антитіла до СО19 людини.

В іншому втіленні в даному документі запропоновано спосіб оптимізації для того, щоб фармакокінетика та/або фармакодинаміка антитіла до СЮО19 людини була ефективною в ЦНС суб'єкта, де антитіло до СО19 людини зв'язано з антитілом або фрагментом антитіла, який зв'язується з ВВВ-К з низьких афінністю, при цьому антитіло або фрагмент антитіла вибраний

Зо таким чином, що його афінність у відношенні ВВВ-К після зв'язування з антитілом до СО19 людини призводить до рівню транспортування антитіла або фрагмента антитіла, кон'югованого з антитілом до СО19 людини через ВВВ, який оптимізує фармакокінетику та/або фармакодінаміку антитіла до СО19 людини в ЦНО.

В іншому втіленні в даному документі запропоновано спосіб лікування неврологічного розладу у ссавця, що включає лікування ссавця антитілом або фрагментом антитіла, який зв'язується з ВВВ-К, і який зв'язаний з антитілом до СО19 людини, де дане антитіло було вибрано так, щоб мати низьку афінність у відношенні ВВВ-К, ії, за допомогою цього, покращує поглинання в ЦНС антитіла і пов'язаного антитіла до СО19 людини. В одному втіленні лікування призводить до зменшення або усунення симптомів розладу. В іншому аспекті лікування призводить до зменшення інтенсивності неврологічного розладу.

В одному втіленні всіх попередніх аспектів антитіло до ВВВ-К має ІСхо у відношенні ВВВ-А від приблизно 1 нМ до приблизно 100 мкМ. В іншому такому втіленні ІСво становить від приблизно 5 нМ до приблизно 100 мкМ. В іншому такому втіленні ІСхо становить від приблизно 50 нМ до приблизно 100 мкМ. В іншому такому втіленні ІСво становить від приблизно 100 нм до приблизно 100 мкМ. В іншому втіленні антитіло має афінність у відношенні ВВВ-К від приблизно 5 нМ до приблизно 10 мкМ. В іншому втіленні, при зв'язуванні з антитілом до СО19 людини, антитіло має афінність у відношенні ВВВ-К від приблизно 30 нМ до приблизно 1 мкМ.

В іншому втіленні, при зв'язуванні з антитілом до СО19 людини, антитіло має афінність у відношенні ВВВ-К від приблизно 50 нМ до приблизно 1 мкМ. В одному втіленні афінність антитіла до ВВВ-К або злитого поліпептиду антитіла до СО19 людини у відношенні ВВВ-А вимірюється з використанням аналізу Скетчарда. В іншому втіленні афінність антитіла до ВВВ-

К або злитого поліпептиду антитіла до СО19 людини у відношенні ВВВ-К вимірюється з використанням аналізу ВІАСОКЕ. В іншому втіленні афінність антитіла до ВВВ-К або злитого поліпептиду антитіла до СО19 людини у відношенні ВВВ-К вимірюється з використанням конкурентного ЕГІЗА.

В іншому втіленні злитий поліпептид антитіла до СО19 людини є міченим. В іншому втіленні антитіло до ВВВ-К або фрагмент не погіршують зв'язування ВВВ-К з одним або більше ніж одним з його природних лігандів. В іншому втіленні антитіло до ВВВ-К специфічно зв'язується з

ТІК таким чином, що воно не інгібує зв'язування ПТК з людським трансферином. В іншому 60 втіленні злитий поліпептид антитіла до СО19 людини вводиться ссавцю. В іншому втіленні ссавець являє собою людину. В іншому втіленні ссавець має неврологічний розлад. В іншому втіленні неврологічний розлад вибраний з групи, що складається з хвороби Альцгеймера (АВ), інсульту, деменції, м'язової дистрофії (МО), розсіяного склерозу (М5), бічного аміотрофічного склерозу (АГ 5), муковісцидозу, синдрому Ейнджелмена, синдрому Ліддла, хвороби Паркінсона, хвороби Піка, хвороби Педжета, раку і травматичного ураження мозку.

Нековалентні комплекси як човники гематоенцефалічного бар'єру

Одною частиною нековалентного комплекса є човниковий модуль гематоенцефалічного бар'єру (човниковий модуль ВВВ), який являє собою біспецифічне антитіло з першою специфічністью зв'язування у відношенні гаптену і другою специфічністью зв'язування у відношенні рецептора гематоенцефалічного бар'єру (ВВВК). Такий човниковий модуль ВВВ розпізнає здатну піддаватися трансцитозу мішень поверхні клітини на гематоенцефалічний бар'єр (таку як ТІК, І ЕР або інші мішені - ВВВ-К) і одночасно зв'язує гаптеніловане антитіло до

СО19 людини.

Більш докладно, антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, кон'югується з гаптеном і комплексується за допомогою гаптензв'язуючого сайту човника гематоенцефалічного бар'єру. Даний комплекс є визначеним і стабільним, і специфічно доставляє гаптеніловане антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, через гематоенцефалічний бар'єр.

Оскільки гаптеніловане антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини, є нековалентно комплексованим човником гематоенцефалічного бар'єру, дане гаптеніловане антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, з одного боку, зв'язується з його носієм для доставлення (відповідає човнику гематоенцефалічного бар'єру, відповідає біспецифічному антитілу) на протязі його часу знаходження в кровотоку, але, з іншого боку, також може ефективно вивільнятися після трансцитозу. Кон'югування з гаптеном може здійснюватися без перешкоджання активності антитіла, яке специфічно зв'язується з СО19 людини. Човник гематоенцефалічного бар'єру не містить незвичайного ковалентного приєднання і, отже, позбавлений будь-якого ризику імуногенності. Комплекси гаптенілованого антитіла, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, з біспецифічним антитілом, що містять гаптенспецифічні сайти зв'язування, надають сприятливі біофізичні характеристики антитіла, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини. Крім того, такі комплекси здатні адресувати вантаж

Зо в клітини або тканини, які демонструють антиген, що розпізнається другою специфічністю зв'язування біспецифічного антитіла.

Антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, зберігає його функціональність, незважаючи на гаптенілування а також при комплексуванні човником гематоенцефалічного бар'єру (біспецифічним антитілом). Крім того, сайт зв'язування біспецифічного антитіла з рецептором гематоенцефалічного бар'єру зберігає його специфічність зв'язування і афінність в присутності комплексованого гаптенілованого антитіла, яке специфічно зв'язується з СО19 людини. Комплекси гаптенілованого антитіла, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини, з біспецифічним антитілом, як описано в даному документі, можна використовувати для спрямованого доставлення антитіла, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини, специфічно в клітини, які експресують рецептор гематоенцефалічного бар'єру. Оскільки гаптеніловане антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини, нековалентно зв'язано з біспецифічним антитілом, антитіло, яке специфічно зв'язується з СО19 людини, може вивільнятися після інтерналізації або трансцитозу.

В іншому аспекті антитіло до СЮО19 людини згідно будь-якого з наведених вище втілень може включати будь-які з характеристик, одиночно або в комбінації, як описано у розділах 1-5 нижче. 1. Афінність антитіла

В деяких втіленнях антитіло, запропоноване в даному документі, має значення Ко, яке менше або дорівнює 1 мкМ, яке менше або дорівнює 100 нМ, яке менше або дорівнює 10 нм

БО (наприклад, 10-8 М або менше, наприклад, від 1077 М до 103 М).

Наприклад, Ко можна вимірювати з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОКЕФ). Аналіз з використанням ВІАСОКЕФ-2000 або ВІАСОКЕФ-3000 (ВІАсоге,

Іпс., Різсаїаж"ау, М)) проводиться при 25 "С з чіпами СМ5 з іммобілізованим антигеном при -10 одиницях відповіді (КО). Біосенсорні чіпи на основі карбоксиметилованого декстрану (СМ5,

ВІАСОКЕ, Іпс.) активуються М-етил-М'-(З-диметиламінопропіл)-карбодіїміду гідрохлоридом (ЕБОС) ії М-гідроксисукцинімідом (МН) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розводиться 10 мМ ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (-0,2 мкМ) перед ін'єкцією при швидкості струму 5 мкл/хвилину для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (К)) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена ін'єктується 1 М етаноламін для блокування груп, що не прореагували. Для бо вимірювань кінетики ін'єктуються дворазові серійні розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) в

РВЗ (фосфатно-сольовий буферний розчин) з 0,05 95 поверхнево-активної речовини полісорбат 20 (ТМ/ЕЕМ-20ТМ) (РВ5Т) при 25 "С при швидкості струму приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Кол) ії швидкості дисоціації (Ко розраховуються з використанням простої моделі зв'язування один до одного Лангмюра (ВІАСОРЕ? ЕмаїЇчайоп Зоймаге, версія 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважна константа дисоціації (Ко) розраховується як відношення Кон/Коп (див., наприклад, Спеп, У. еї аї., У. Мої. Віої. 293 (1999) 865-881). 2. Фрагменти антитіл

В деяких втіленнях антитіло, запропоноване в даному документі, являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіла включають фрагменти Раб, Рабр', Бар'-5Н, К(аб», Ем і 5сЕм, та інші фрагменти, описані нижче, але не обмежуються ними. Для огляду визначених фрагментів антитіла, див. Ниазоп, Р... еї аї!., Маї. Меа. 9 (2003) 129-134. Для огляду фрагментів 5сЕм див., наприклад, Рісескіпип, А., п; Те Рпапптасоіоду ої Мопосіопа! Апіїбодіе5, Мої. 113, Козепригд апа Мооге (еєав.), Зргіпде!-Мепад, Мем/ Моїк (1994), рр. 269-315; див. також УМО 93/16185; 05 5571894 і 05 5587458. Для обговорення фрагментів Раб і Е(ар)», що містять залишки епітопу, який зв'язується рецептором утилізації і що мають підвищені періоди напіввиведення іп мімо, див. ОЗ 5869046.

Діатіла являють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язуючими сайтами, які можуть бути двовалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 0 404 097; МО 1993/01161;

Нидзоп, Р.у. еї аї., Маї. Меа. 9 (2003) 129-134; і Ноїдег, Р. еї аї., Ргос. Май. Асай. зЗсі. ОБА 90 (1993) 6444-6448. Триатіла і тетратіла також описані в Нидзоп, Р.». еї аї., Маї. Меа. 9 (20039 129- 134).

Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, що містять увесь варіабельний домен важкого ланцюга антитіла або його частину, або увесь варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або його частину. В деяких втіленнях однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (Шотапіїйв, Іпс., УМакпат, МА; див., наприклад, О5 6248516).

Фрагменти антитіла можуть бути одержані різними методиками, що включають протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також продукування рекомбиіїнантними клітинами-хозяївами (наприклад, Е. соїї або фагом), але не обмежуються ними, як описано в даному документі. 3. Химерні і гуманізовані антитіла

Антитіло, запропоноване в даному документі, являє собою химерне антитіло. Визначені химерні антитіла описуються, наприклад, в 05 4816567; і Моітізоп, 5.І.. еї аї., Ргос. Маї). Асад.

Зсі. ОБА 81 (1984) 6851-6855). В одному прикладі химерне антитіло містить варіабельну ділянку, яка не є людською (наприклад, варіабельну ділянку, яка походить від миші, щура, хом'яка, кролика або примату, який не є людиною, такого як мавпа), і людську константну ділянку. В іншому втіленні химерне антитіло являє собою антитіло "з перемиканням класу", у якого клас або підклас було змінено від класа або підкласа родинного антитіла. Химерні антитіла включають їх антигензв'язуючі фрагменти.

Гуманізоване антитіло являє собою химерне антитіло. Типово антитіло, що не є людським, гуманізують для зменшення імуногенності у людини, при збереженні специфічності і афінності батьківського антитіла, яке не є людським. Загалом, гуманізоване антитіло містить один або більше ніж один варіабельний домен, в якому НУК, наприклад, СОК (або їх частини) походять з антитіла, що не є людським, і ЕК (або їх частини) походять з послідовностей людського антитіла. Гуманізоване антитіло можливо також буде містити щонайменше частину людської константної ділянки. В деяких втіленнях деякі залишки ЕК в гуманізованому антитілі замінені відповідними залишками з антитіла, що не є людським (наприклад, антитіла, з якого походять залишки НМК), наприклад, для відновлення або поліпшення специфічності або афінності антитіла.

Огляд гуманізованих антитіл і способів їх одержання описується, наприклад, в АІтадго, 4).С. апа Екапб5оп, у., Егопі. Віобсі. 13 (2008) 1619-1633 і додатково описується, наприклад, в

Віесптапп, І. еї а!., Майте 332 (1988) 323-329; Оцееп, С. еї аї., Ргос. Маї!Ї. Асад. осі. ОБА 86 (1989) 10029-10033; 005 5821337, 005 7527791, 05 6982321 ії 005 7087409; Казптіїгі, 5.М. еї аї.,

Меїтпоаз 36 (2005) 25-34 (що описує пересадження ділянки, що визначає специфічність (5ОК));

Радіап, Е.А., Мої. Іттипої. 28 (1991) 489-498 (що описує "зміну поверхні (варіабельного домену)"; БаіІгАсдца, УМ.Р. еї аї., Меїнпод5 зб (2005) 43-60 (що описує "перетасування ЕК"); і

О5рошт, у. еї а!., Меїйнодз» 36 (2005) 61-68 і КіїтКа, А. еї аї!., Вг. У. Сапсег 83 (2000) 252-260 (що описує підхід "направленого відбору" для перетасування ЕК).

Людські каркасні ділянки, які можна використовувати для гуманізації, включають каркасні 60 ділянки, відібрані з використанням методу "найкращої апроксимації" (див., наприклад, біт5, М..

Зо еї аїЇ., У. Іттипої. 151 (1993) 2296-2308; каркасні ділянки, що походять з консенсусної послідовності варіабельних ділянок легкого або важкого ланцюга конкретної підгрупи людських антитіл (див., наприклад, Сагіег, Р. еї аї., Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 89 (1992) 4285-4289; і Ргевчга,

Га. єї аї., 9. Іттипої. 151 (1993) 2623-2632); людські зрілі (соматично мутовані) каркасні ділянки або людські каркасні ділянки зародкової лінії (див., наприклад, АїЇтадго, 9У.С. апа Егапв55оп, 5.,

Егопі. Віозсі. 13 (2008) 1619-1633); і каркасні ділянки, одержані в результаті скринінгу бібліотек

ЕК (див., наприклад, Васа, М. еї аї.,.. Вісі. Снет. 272 (1997) 10678-10684 і КозокК, М... еї аї., .).

ВіоЇ. Спет. 271 (19969 22611-22618), але не обмежуються ними. 4. Мультиспецифічні антитіла

В деяких втіленнях антитіло, запропоноване в даному документі, являє собою мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла являють собою моноклональні антитіла, які мають специфічності зв'язування у відношенні щонайменше двох різних сайтів. В деяких втіленнях одна з специфічностей зв'язування спрямована у відношенні СО19 людини, та інша - у відношенні будь-якого іншого антигену. В деяких втіленнях біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами СО19 людини. Біспецифічні антитіла також можуть використовуватися для локалізації цитотоксичних агентів в клітинах, які експресують СО19 людини. Біспецифічні антитіла можна одержувати у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.

Методики одержання мультиспецифічних антитіл включають рекомбінантну коекспресію двох пар важкого ланцюга - легкого ланцюга імуноглобуліну, що мають різні специфічності (див.

Міївівїп, С. апа СиеПо, А.С., Маїиге 305 (1983) 537-540, УМО 93/08829 і Тгаипескег, А. єї аі., ЕМВО

У. 10 (1991) 3655-3659), і генетичну інженерію "виступ в западину" (див., наприклад, 05 5731168). Мультиспецифічні антитіла також можна одержувати інженерією ефектів електростатичного наведення для одержання Ес-гетеродимерних молекул антитіла (М/о 2009/089004); поперечним зв'язуванням двох або більше ніж двох антитіл або фрагментів (див., наприклад, 5 4676980 і Вгеппап, М. еї аї., Зсіепсе 229 (1985) 81-83); застосуванням лейцинових блискавок для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад, КовіеЇІпу, ЗА еї аІ., У. Іттипої. 148 (1992) 1547-1553; застосуванням технології "діатіла" для одержання біспецифічних фрагментів антитіл (див., наприклад, Ноїїїдег, Р. еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 90 (1993) 6444-6448); застосуванням димерів одноланцюгових Ем (5Ем) (див., наприклад, сгибег,

М еї аї., уУ. Іттипої. 152 ( 1994) 5368-5374); і одержанням триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, в Тиї, А. еї аї.,». Іттипої!. 147 (1991) 60-69).

В даний документ також включені генетично модифіковані антитіла з трьома або більше ніж трьома функціональними антигензв'язуючими сайтами, що включають "антитіла-восьминоги" (див., наприклад, ОЗ 2006/0025576).

Антитіло або фрагмент в даному документі також включає "Раб подвійної дії" або "ОАЕ", что містить антигензв'язуючий сайт, який зв'язується з СО19 людини, а також з іншим, відмінним антигеном (див., наприклад, О5 2008/0069820).

Антитіло або фрагмент в даному документі також включає мультиспецифічні антитіла, описані в УМО 2009/080251, М/о 2009/080252, МО 2009/080253, МО 2009/080254,

МО 2010/112193, МО 2010/115589, МО 2010/136172, МО 2010/1145792 і УМО 2010/145793. 5. Варіанти антитіл

В деяких втіленнях розглядаються запропоновані в даному документі варіанти амінокислотної послідовності антитіл. Наприклад, може бути бажаним поліпшення афінності зв'язування та/або інших біологічних властивостей антитіла. Вариіїанти амінокислотної послідовності антитіла можуть бути одержані введенням відповідних модифікацій в нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або за допомогою пептидного синтезу. Такі модифікації включають, наприклад, делеції з та/або вставки в, та/або заміни залишків у межах амінокислотних послідовностей антитіла. Можна зробити будь-яку комбінацію делеції, вставки та заміни для одержання кінцевої конструкції, за умови, що дана кінцева конструкція має бажані характеристики, наприклад, зв'язування антигену. а) Варіанти із заміною, вставкою і делецією

В деяких втіленнях запропоновані варіанти антитіла, що мають одну або більше ніж одну амінокислотну заміну. Необхідні сайти для мутагенезу, що приводить до замін, включають НУК і

ЕК. Консервативні заміни показані в Таблиці нижче під заголовком "переважні заміни". В

Таблиці 1 запропоновані більш істотні заміни під заголовком "типові заміни", і, як описано далі нижче по відношенню до класів бічних ланцюгів амінокислот. В необхідне антитіло можуть бути введені амінокислотні заміни, і продукти, що піддаються скринінгу, у відношенні бажаної активності, наприклад, збереженого/ поліпшеного зв'язування антигену, зниженої імуногенності 60 або поліпшеної АОСС або СОС.

залишок е() 1 |сСешома;МекАгз; Рпеснорлейцин.//////777777777777 їв цец(Ю 0 Інорлейцин;ойе Ма; МерА-2в РйЄ 7777777 ес

Амінокислоти можуть бути згруповані відповідно до загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Су, 5ег, Тиг, Авп, Сп; (3) кислотні: Ар, СМ; (4) основні: Ні, Г ув, Ага; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: су, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.

Неконсервативні заміни будуть тягти за собою заміну члена одного з цих класів на інший клас.

Один тип варіанта з замінами включає заміну одного або більше ніж одного залишку гіперваріабельної ділянки батьківського антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Загалом, одержаний(ні) в результаті варіант(ти), відібраний(ні) для подальшого дослідження, буде(дуть) мати модифікації (наприклад, поліпшення) деяких біологічних властивостей (наприклад, підвищену афінність, знижену імуногенність) відносно батьківського антитіла та/або буде(дуть) мати по суті визначені біологічні властивості батьківського антитіла, що зберігаються. Типовим варіантом із замінами є антитіло з дозрілою афінністью, яке може бути з зручністю одержано, наприклад, з використанням методик дозрівання афінності на основі дисплею, таких як методики, описані в даному документі. Коротко, один або більш ніж один залишок НУК мутується, варіанти антитіла піддаються дисплею на фагі і піддаються скринінгу на визначену біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування).

Зміни (наприклад, заміни) можуть бути зроблені в НМЕК, наприклад, для поліпшення афінності антитіла. Такі зміни можуть бути зроблені в "гарячих точках" НУК, тобто залишках, що кодуються кодонами, які з високою частотою піддаються мутації під час процесу соматичного дозрівання (див., наприклад, Споулапигу, Р5, Меїподе Мої. ВіоЇ. 207 (2008) 179-196), та/або залишки, які контактують з антигеном, причому одержані в результаті варіанти МН або М тестуються на афінність зв'язування. Дозрівання афінності за допомогою конструювання і

Зо повторного відбору з вторинних бібліотек було описано, наприклад, в Ноодепроот, Н.Е. еї аї. іп

Меїподз іп МоїІесшціаг Віоіоду 178 (2002) 1-37. У деяких втіленнях дозрівання афінності у вибрані для дозрівання варіабельні гени вводиться різноманітність за допомогою будь-якого з цілого ряду способів (наприклад, ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), схильне до помилок, перетасування ланцюга або мутагенез, керований олігонуклеотидом). Потім створюється вторинна бібліотека. Дана бібліотека потім піддається скринінгу для ідентифікації будь-яких варіантів антитіла з бажаною афінністю. Інший спосіб введення різноманітності включає підходи, спрямовані на НМК, в яких рандомізуються декілька залишків НМК (наприклад, 4-6 залишків за раз). Залишки НМ, які беруть участь у зв'язуванні антигену, можуть бути специфічно ідентифіковані, наприклад, з використанням мутагенезу на основі аланінового сканування або моделювання. Зокрема, часто як мішені використовуються СОК-НЗ і СОРБ-Ї 3.

В деяких втіленнях заміни, вставки або делеції можуть відбуватися в межах однієї або більше ніж однієї НМЕ, за умови, що такі зміни по суті не зменшують здатність антитіла до зв'язування антигену. Наприклад, в НУЄ. можуть бути зроблені консервативні зміни (наприклад, консервативні заміни, як запропоновано в даному документі), які по суті не зменшують афінність зв'язування. Такі зміни, наприклад, можуть бути поза залишків, що контактують з антигеном в

НУК. У деяких втіленнях варіантів послідовностей МН і Мі, запропонованих вище, кожна НУК або є незмінною, або містить не більше, ніж одну, дві або три амінокислотні заміни.

Корисний спосіб ідентифікації залишків або ділянок антитіла, які можуть служити як мішені для мутагенезу, називається "мутагенез на основі аланінового сканування", як описано

Сиппіпдпат, В.С. апа М/еїІ5, У.А., Зсієпсе 244 (1989) 1081-1085. В даному способі залишок або група залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, таких як Аго, Авр, Ніб, Гуз і Сім) ідентифікується і замінюється нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном) для визначення того, чи піддається впливу взаємодія антитіла з антигеном. Додаткові заміни можуть бути введені в положеннях амінокислот, що демонструють функціональну чутливість до вихідних замін. Як альтернатива або додатково, може бути визначена кристалічна структура комплексу антиген-антитіло для ідентифікації контактних точок між антитілом і антигеном. Такі контактні залишки й сусідні залишки можуть служити як мішені або усуватися як кандидати для заміни. Варіанти можуть бути піддані скринінгу для визначення того, чи мають вони бажані властивості.

Вставки в амінокислотну послідовність включають аміно- та/або карбоксикінцеві злиття, які варіюють по довжині від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше ніж сто залишків, а також вставки всередині послідовності одиночних чи багатьох амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком.

Інші вставні варіанти молекули антитіла включають злиття з М- або С-кінцем антитіла ферменту (наприклад, для АОЕРТ (антитілоопосредкована терапія з використанням ферментів і проліків)) або поліпептиду, який збільшує період напіввиведення антитіла в сироватці.

Зо б) Варіанти по глікозилюванню

В деяких втіленнях запропоноване в даному документі антитіло змінюють для збільшення або зменшення ступеня, в який глікозилюється антитіло. Додавання або делеція сайтів глікозилювання в антитілі можуть із зручністю здійснюватися за допомогою зміни амінокислотної послідовності таким чином, що створюється або видаляється один або більше ніж один сайт глікозилювання.

Коли антитіло містить ділянку Ес, може бути змінений вуглевод, приєднаний до нього.

Природні антитіла, продуковані клітинами ссавців, типово містять розгалужений двохантенний олігосахарид, який зазвичай приєднаний М-зв'язком до А5п297 домену СН2 ділянки Ес. Див., наприклад, УМугідні, А. апа Моітізоп, 5.Г., ТІВТЕСН 15 (1997) 26-32. Даний олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (сІсСМАс), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до (СІСМАс в "стовбурі" структури двохантенного олігосахариду. У деяких втіленнях можуть бути зроблені модифікації олігосахариду в антитілі, як описано в даному документі, для того, щоб створити варіанти антитіла з деякими поліпшеними властивостями.

В одному втіленні запропоновані варіанти антитіла, які мають структуру вуглеводу, в якій відсутня фукоза, приєднана (прямо або опосередковано) до ділянки Ес. Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може становити від 1 95 до 80 95, від 1 95 до 65 95, від 5 95 до 65 95 або від 20 95 до 40 95. Кількість фукози визначається розрахуванням середньої кількості фукози в межах ланцюга цукру на А5п297 відносно суми всіх глікоструктур, приєднаних до А5зп297 (наприклад, складних, гібридних і високоманозних структур), при вимірюванні мас- спектрометрією МАГОІ-ТОЕ (часопролітної мас-спектрометрії з лазерною іонізацією |і десорбцією з рідкої матриці), як описано, наприклад, в УМО 2008/077546. А5п297 відноситься до залишку аспарагіну, розташованому приблизно в положенні 297 в ділянці Ес (ЄЮ нумерація залишків ділянки Ес згідно Кара); однак, А5п297 також може бути розташований приблизно в плюс/мінус З амінокислотах вище або нижче положення 297, тобто між положеннями 294 і 300, через мінорні варіації послідовності в антитілах. Такі фукозильовані варіанти можуть мати поліпшену функцію АЮСС. Див., наприклад, 05 2003/0157108; 5 2004/0093621. Приклади публікацій, що відносяться до "дефукозильованих" або "дефіцитних за фукозою" варіантів антитіл включають: 05 2003/0157108; УМО 2000/61739; М/о 2001/29246; 05 2003/0115614; (510) О52002/0164328; 5 2004/0093621; 05 2004/0132140; 05 2004/0110704; 5 2004/0110282;

О52г004/0109865; МО 2003/085119; М/о 2003/084570; М/о 2005/035586; УМО 2005/0357 78;

МО 2005/0537427 МО 2002/031140; ОкКалакі, А. еї аї!., У. Мої. Віої. 336 (2004) 1239-1249; Матапе-

ОпНпикі, М. єї а!., Віотесін. Віоєпо. 87 (2004) 614-622. Приклади ліній клітин, здатних продукувати дефукозильовані антитіла, включають клітини СНО (яєчники китайського хом'яка) Гес13, дефіцитні за фукозилюванням білка (Кірка, .. еї аї., Агой. Віоспет. Віорпуз. 249 (1986) 533-545; 5 2003/0157108 ї УМО 2004/056312, особливо в Прикладі 11), і нокаутні лінії клітин, такі як нокаутні клітини СНО за геном альфа-1,6-фукозилтрансферази, РОТ8 (див., наприклад,

Уатапе-ОнНпикі, М. еї а!., Віоїеси. Віоепо. 87 (2004) 614-622; Капаа, У. еї а!., Віотесппої. Віоепд. 94 (2006) 680-688 і УМО 2003/085107).

Крім того, запропоновані варіанти антитіл з розділеними надвоє олігосахаридами, наприклад, в яких двохантенний олігасахарид, приєднаний до ділянки Ес антитіла, розділений надвоє СіІсМАс. Такі варіанти антитіл можуть мати знижене фукозилювання та/або поліпшену функцію АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описуються, наприклад, в УМО 2003/011878; 56602684 ії 05 2005/0123546. Також запропоновані варіанти антитіл з щонайменш одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до ділянки Ес. Такі варіанти антитіл можуть мати поліпшену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описуються, наприклад, в УМО 1997/30087;

УМО 1998/58964 і УМО 1999/22764. в) Варіанти ділянки Ес

В деяких втіленнях в ділянку Ес антитіла, запропонованого в даному документі, можуть бути введені одна або більше ніж одна амінокислотна модифікація, генеруючи, за допомогою цього, варіант ділянки Ес. Даний варіант ділянки Ес може містити послідовність людської ділянки Ес (наприклад, ділянки Ес людського Ідс1, Ідс2, ІдСЗ або Ідс4), що містить амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) в одному або більше ніж одному положенні амінокислоти.

В деяких втіленнях в даному документі запропоновано варіант антитіла, який володіє деякими, але не всіма ефекторними функціями, що роблять його бажаним кандидатом для застосувань, в яких важливим є період напіввиведення антитіла іп мімо, проте, визначені ефекторні функції (такі як комплемент і АЮОСС) не є необхідними або є шкідливими. Можуть проводитися аналізи цитотоксичности іп о мйго та/або іп оммо для підтвердження зменшення/усунення активностей СОС та/або АОСС. Наприклад, аналізи зв'язування з

Зо рецептором Ес (БСК) можуть проводитися для забезпечення того, що у антитіла відсутнє зв'язування з Есук (відтак, ймовірно відсутня активність АОСС), але зберігається здатність до зв'язування з ЕсКп. У первинних клітин для опосередкування АОСС - клітин МК - експресується тільки ЕсСуКкП, тоді як моноцити експресують ЕсукКіІ, ЕсукІИ і ЕсукКІШ. Експресія БСК на гематопоетичних клітинах узагальнена в Таблиці З на сторінці 464 Камеїсі, 9.М. апа Кіпеї, 9.Р.,

Аппи. Веу. Іттипої!. 9 (1991) 457-492. Необмежувальні приклади аналізів іп міго для оцінки активності АОСС необхідної молекули описуються в 05 5500362 (див., наприклад, Неїївігоп, І. еї аї., Ргос. Маї|). Асай. 5сі. ОБА 83 (1986) 7059-7063 і НеїЇ5ігот, І. еї аї., Ргос. Ма. Асай. Зсі. ОБА 82 (1985) 1499-1502); 05 5821337 (див. Вгиддетапп, М. еї аї., У. Ехр. Меа. 166 (1987) 1351- 1361). Як альтернативу, можна використовувати способи нерадіоактивного аналізу (див., наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІМ для проточної цитометрії (СеПТесппооду, Іпс. Мошипіаійп Міему, СА; і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуїоТох 969 (Рготеда, Мадізоп, УМІ). Корисні ефекторні клітини для таких аналізів включають одноядерні клітини периферичної крові (РВМС) і клітини-природні кіллери (МК). Альтернативно або додатково, активність АОСС необхідної молекули можна оцінювати іп мімо, наприклад, в такій тваринній моделі, як модель, розкрита в Сіупе5, К. еї аї., Ргос. Майї). Асад. 5сі. ОБА 95 (1998) 652-656. Також можна проводити аналізи зв'язування С14 для підтвердження того, що антитіло не здатне зв'язуватися з Сід і, отже, не має активності СОС. Див., наприклад, ЕГІЗА зв'язування С1д і СЗс в М/О 2006/029879 ії УМО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу можна проводити аналіз СОС (див., наприклад, Са7апо-Запіого, Н. еї аї., у. Іттипої. Меїйосд5 202 (1996) 163-171; Стадо, М.5. еї аї., Віоса 101 (2003) 1045-1052 і Стаду, М.5. апа М.9. СІеппіеє,

Віоса 103 (2004) 2738-2743). Зв'язування з ЕсКп і визначення кліренсу періоду напіввиведення іп мімо також можна проводити з використанням способів, відомих в даній області (див., наприклад, Реїкома, 5.В. еї аї., Іпї. Іттипої. 18 (2006: 1759-1769).

Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла з заміною одного або більше ніж одного залишку ділянки Ес 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (05 6737056). Такі мутанти Бс включають мутантів Ес з замінами в двох або більше ніж двох положеннях амінокислот 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий мутант Ес "ОАМА" з заміною залишків 265 і 297 на аланін (05 7332581).

Описано деякі варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням з ЕсК. (див., наприклад, 5 6737056; УМО 2004/056312 і 5Піеїд5, К.Г. еї аї., 9У. Віої. Снет. 276 (2001) 6591- 6б6о4).

У деяких втіленнях варіант антитіла містить ділянку с з однією або більш ніж однією амінокислотною заміною, яка поліпшує АОСС, наприклад, з замінами в положеннях 298, 333 та/або 334 ділянки Ес (ЄО нумерація залишків).

У деяких втіленнях в ділянці Ес робляться зміни, які призводять до змінених (тобто або поліпшеним, або зменшеним) зв'язуванню з С14д та/або комплементзалежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано в 05 6194551, МО 99/51642 та Ідизодіє, ЕЕ еї аї., 9. Іттипої. 164 (2000) 4178-4184.

Антитіла зі збільшеними періодами напіввиведення і поліпшеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Ес (ЕсКп), який відповідає за перенесення материнських до в плід (Сішуеєг, ВІ. еї аї., 9. Іттипої. 117 (1976) 587-593 та Кіт, УК еї аї., У. Іттипої. 24 (1994) 2429- 2434), описуються в 5 2005/0014934. Дані антитіла містять ділянку Ес з однією або більше ніж однією заміною в ній, яка поліпшує зв'язування ділянки Ес з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають варіанти з замінами в одному або більше ніж одному залишку Ес: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, із заміною залишку 434 ділянки Ес (5 7371826).

Див. також Юипсап, А.К. апа Уміпіег, ., Маїиге 322 (1988) 738-740; 005 5648260; 005 5624821 та УМО 94/29351 відносно інших прикладів варіантів ділянки Ес. г) Варіанти антитіл, модифіковані за цистеїном

В деяких втіленнях може бути необхідним утворення антитіл, модифікованих за цистеїном, наприклад, "тіоМАб", в яких один або більше ніж один залишок антитіла замінений залишками цистеїну. У конкретних втіленнях замінені залишки зустрічаються в доступних сайтах антитіла.

За допомогою заміни даних залишків на цистеїн реакційноздатні тіольні групи розташовуються в доступних сайтах антитіла і можуть бути використані для кон'югування антитіла з іншими угрупованнями, такими як угруповання лікарських засобів або угруповання лінкер-лікарський засіб, зі створенням імунокон'югату, як описано в даному документі далі. У деяких втіленнях будь-який один або більше ніжм один з наступних залишків може бути замінений на цистеїн:

Зо М205 (нумерація за Кара) легкого ланцюга; А118 (нумерація ЕЮ) важкого ланцюга і 5400 (нумерація Е)У) важкого ланцюга ділянки Ес. Антитіла, модифіковані за цистеїном, можуть бути одержані, як описано, наприклад, в 05 7521541. д) Похідні антитіл

В деяких втіленнях запропоноване в даному документі антитіло може бути додатково модифіковано так, щоб воно містило додаткові небілкові угруповання, які відомі в даній області і є легко доступними. Угруповання, які підходять для дериватизації антитіла, включають водорозчинні полімери, але не обмежуються ними. Небмежувальні приклади водорозчинних полімерів включають поліетиленгліколь (РЕС), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1, З-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери) і декстран або полі(н- вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімери поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетиловані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші, але не обмежуються ними. Полієтиленглікольпропіональдегід може мати переваги у виробництві через його стабільності в воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Число полімерів, приєднаних до антитіла, може варіювати, і, при приєднанні більш ніж одного полімеру, вони можуть бути однаковими або різними молекулами. Загалом, число та/або тип полімерів, використовуваних для дериватизації можуть визначатися на основі міркувань, що включають конкретні властивості або функції антитіла, яке підлягає поліпшенню, але не обмежуються ними, незалежно від того, чи буде похідна антитіла використовуватися в терапії при певних умовах, і т.д.

В іншому втіленні запропоновані кон'югати антитіла і небілкового угруповання, яке може бути селективно нагріто під впливом радіації. В одному втіленні небілюове угруповання являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат, М.М/. еї аіІ., Ргос. Майї). Асад. Зсі. ОБА 102 (2005) 11600- 11605). Радіація може мати будь-яку довжину хвилі і включає довжини хвиль, які не завдають шкоди звичайним клітинах, але які нагрівають небілкове угруповання до температури, при якій вбиваються клітини, наближені до небілкового угруповання антитіла, але не обмежується ними.

Б. Способи і композиції генної інженерії

Антитіла можуть бути одержані з використанням способів і композицій генної інженерії, наприклад, як описано в 05 4816567. В одному втіленні запропонована виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до СО19 людини, описане у даному документі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, что містить МІ, та/або амінокислотну послідовність, что містить МН антитіла (наприклад, легкий та/або важкий ланцюги антитіла). В іншому втіленні запропонований один або більше ніж один вектор (наприклад, експресійний вектор), что містить таку нуклеїнову кислоту. В іншому втіленні запропонована клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту. В одному такому втіленні клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована): (1) вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, что містить МІ. антитіла, і амінокислотну послідовність, что містить

МН антитіла, або (2) перший вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність, что містить Мі. антитіла, і другий вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність, что містить МН антитіла. В одному втіленні клітина-хазяїн є еукаріотичною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'яка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, клітиною МО, МО, 5р20). В одному втіленні запропоновано спосіб одержання антитіла до СЮО19 людини, де даний спосіб включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, як запропоновано вище, при відповідних умовах для експресії антитіла і, можливо, виділення антитіла з клітини-хазяїна (або культурального середовища клітин-хазяївів).

Для рекомбінантної продукції антитіла до СО19 людини нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, наприклад, як описано вище, виділяють і вставляють в один або більше ніж один вектор для подальшого клонування та/або експресії в клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту можна легко виділяти і секвенувати з використанням традиційних методик (наприклад, за допомогою застосування олігонуклеотидних зондів, які здатні до специфічного зв'язування з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги антитіла).

Відповідні клітини-хазяїви для клонування або експресії векторів, які кодують антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані в даному документі. Наприклад, антитіла можуть бути продуковані в бактеріях, зокрема, коли не потрібні глікозилювання і ефекторна функція Ес. Відносно експресії фрагментів антитіла і поліпептидів в бактеріях, див.,

Зо наприклад, 5 5648237, 05 5789199 ії 05 5840523. (Див. також Спапоп, КА, Іп: Меїпоаз іп

Моїесшіаг Віоіоду, Мої. 248, Го, ВКС (єйд.), Нитапа Ргев5, Тоїоула, М) (2003), рр. 245-254, що описує експресію фрагментів антитіла в Е. соїї.). Після експресії антитіло може бути виділено з пасти бактеріальних клітин в розчинній фракції і може бути додатково очищено.

Крім прокаріотів, придатними хазяївами клонування або експресії для векторів, які кодують антитіло, є еукаріотичні мікроби, такі як нитчасті грибки або дріжджі, що включають штами грибків і дріжджів, шляхи глікозилювання яких були "гуманізовні" приводячи до продукції антитіла з частково або повністю людською картиною глікозилювання. Див. сегпдго55, Т.О., Маї.

Віотесн. 22 (2004) 1409-1414 1 1, Н. ег а)., Маї. Віоїтесі. 24 (2006) 210-215.

Відповідні клітини-хазяїва для експресії глікозильованого антитіла також відбуваються з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можна використовувати в поєднанні з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин 5родорієга

Тгидірегаа.

Культури клітин рослин також можна використовувати як хазяївів. Див., наприклад, 55959177, 0556040498, 05 6420548, 5 7125978 і 05 6417429 (що описують технологію

РІГАМТІВООІЕ5"М для продукування антитіл в трансгенних рослинах).

Як хазяївів також можна використовувати клітини хребетних. Наприклад, можуть бути корисними лінії клітин ссавців, які адаптовані для росту в суспензії. Іншими прикладами корисних ліній клітин-хазяївів ссавців є лінія нирки мавпи СМ1, трансформована 540 (СО5-7); лінія ембріональної нирки людини (293 або клітини 293, як описано, наприклад, в Сгапат, Р... еї а!., У. Сеп Мігої. 36 (1977) 59-74); клітини ембріональної нирки хом'яка (ВНК); мишині клітини сертоли (клітини ТМ 4, як описано, наприклад, в Майег, .Р., ВіоїЇ. Кергод. 23 (1980) 243-252); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки сірого щура (ВК. ЗА); клітини легені людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТКІ, як описано, наприклад, в МаїНег, У.Р. еї аї.,

Аппаїв М.У. Асад. сі. 383 (1982) 44-68; клітини МЕС 5 і клітини Е54. Інші корисні лінії клітин- хазяївів ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), що включають клітини

СНО ОНРЕм:- (негативні за дегідрофолатредуктазою) (паиб, с. еї аї., Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА 60 77 (1980) 4216- 4220), і мієломні лінії клітин, такі як 0, МО ї 5рг/0. Відносно огляду визначених ліній клітин-хазяївів ссавців, що підходять для продукції антитіл, див., наприклад, Уалакі, Р. апа

Ми, А.М., Меїпоадз іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 248, Го, В.К.С. (єа.), Нитапа Ргевзв, Тома, М/ (2004), рр. 255-268.

В. Аналізи

Запропоновані в даному документі антитіла до СО19 людини можуть бути ідентифіковані, піддані скринінгу або охарактеризовані для їх фізичних/хімічних властивостей та/або біологічних активностей за допомогою різних аналізів, відомих в даній ділянки. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи

В одному аспекті антитіло, як описано в даному документі, тестується на його активність зв'язування антигену, наприклад, відомими способами, такими як ЕГІ5А, вестерн-блотинг і т.д. 2. Аналізи активності

В одному аспекті запропоновано аналізи для ідентифікації антитіл до СО19 людини, що мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, інгібування проліферації В-клітин або умертвіння В-клітин. Також запропоновані антитіла, які мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міїго.

В деяких втіленнях антитіло, як описано в даному документі, тестується на таку біологічну активність.

Г. Імунокон'югати

В даному документі також запропоновано імунокон'югати, що містять антитіло до СО19 людини, як описано в даному документі, кон'юЮговане з одним або більше ніж одним цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби, агенти, які інгібують рост, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, або їх фрагменти) або радісактивні ізотопи.

В одному втіленні імунокон'югат являє собою кон'югат антитіло-лікарський засіб (АОС), в якому антитіло кон'юговано з одним або більше ніж одним лікарським засобом, що включає майтансиноїд (див. 5 5208020, 05 5416064 і ЕР 0 425 235 В1); ауристатин, такий як монометильні лікарські угруповання ауристатину ОЕ ії ОЕЄ (ММАЕ і ММАБЕ) (див. О5 5635483, 55780588 і 5 7498298); доластатин; каліхеаміцин або його похідна (див. 05 5712374,

Зо 55714586, 055739116, 0055767285, 055770701, 05 5770710, 0055773001 ї 05 5877296;

Ніптап, І.М. єї аї., Сапсег Рез. 53 (1993) 3336-3342 і І оде, Н.М. еї аї., Сапсег ВНев. 58 (1998) 2925-2928); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (див. Кгаїт, Р. еї аї., Сит. Мед.

Спет. 13 (2006) 477-523; дейтеу, 5.0. еї а!., Віосогу. Мед. Спет. І ей. 16 (2006) 358-362; Тогдом,

М.Х. еї аї., Віосопімд. Спет. 16 (2005) 717-721; Маду, А. евї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 97 (2000) з5 829-834; Виром/спік, С.М. еї аї., Віоогд. 5 Мед. Спет. І еНегв 12 (2002) 1529-1532; Кіпо, Н.О. єї а|І., У. Мед. Спет. 45 (20029 4336-4343 і 05 6630579); метотрексат; віндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел і ортатаксел; трихотецен і СС1065, але не обмежуються ними.

В іншому втіленні імунокон'югат містить антитіло, як описано в даному документі, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, що включає ланцюг А дифтерійного токсину, активні фрагменти дифтерійного токсину, що не зв'яуються, ланцюг А екзотоксину (з Рзепдотопах аегидіпоза), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг А модексину, альфа-сарцин, білки АїЇІеигіев Тогаїї, діантинові білки, білки Рпуїїаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ і РАР-5), інгібітор Мотогаїса спагапііа, курцин, кротин, інгібітор Заропагіа опісіпаїв, гелонін, мітогеллін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени, але не обмежуються ними.

В іншому втіленні імунокон'югат містить антитіло, як описано в даному документі, кон'юговане з радіоактивним атомом, з утворенням радіокон'югату. Для одержання радіокон'югатів доступний цілий ряд радіоактивних ізотопів. Приклади включають Аг", 1191, 125,

БО 89 Ве"86 Де!88, Зпт/»з, Віг!2, рзг2, рр" і радіоактивні ізотопи І и. При використанні радіокон'югата для виявлення, він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад, ТС9т або 123, або спінову мітку для візуалізації за допомогою ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відомого як магнітно-резонансна томографія), таку як знову-таки йод- 123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.

Кон'югати антитіла і цитотоксичного агента можна одержувати з використанням цілого ряду біфункціональних агентів зв'язування з білком, таких як /М-сукцинімідил-3-(2- піридилтіо)пропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)-циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат НОСІЇ), бо активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-

азидосполуки (такі як біс-(п-азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п- діазонійбензоїл)-етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол 2,6-діізоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, імунотоксин рицин може бути одержаний, як описано в Мена, Е.5. еї аІ., Зсієпсе 238 (1987) 1098-1104. Мічена вуглецем-14 1- ізотіоціанатобензил-3-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ЮОТРА) являє собою типовий хелатуючий агент для кон'югування радіонуклеїду з антитілом. Див. М/О 94/11026.

Лінкер може являти собою "розщеплювальний лінкер"-у що полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу в клітині Наприклад, можна використовувати кислотолабільний лінкер, чутливий до пептидази лінкер, фотолабільний лінкер, диметильний лінкер або лінкер, що містить дисульфід (Спагі, К.М. еї аІ., Сапсег Вев5. 52 (1992) 127-131; 55208020).

Серед імунокон'югатів або АБС в даному документі прямо розглядаються кон'югати, одержані з використанням поперечнозв'язуючих реактивів, але не обмежуються ними, які включають ВМР5, ЕМОС5, СМВ5, НВУЗ, І С-5МОС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, 5ІАВ, МОСС, ЗМРВ,

ЗМРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМО5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-

ЗМОСС, сульфо-5МРВ і 5М5ЗВ (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), але не обмежуються ними, які є у продажу (наприклад, у Рієгсе Віотесппо!іоду, Іпс., Косктога, ІС., США).

Д. Способи і композиції для діагностики та виявлення

В деяких втіленнях будь-яке із запропонованих в даному документі антитіл до СО19 людини є корисним для виявлення присутності клітин, презентуючих СО19 людини, в біологічному зразку. Термін "виявлення" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, охоплює кількісне або якісне виявлення. У деяких втіленнях біологічний зразок містить клітину або тканину, таку як, наприклад, кров, сироватку крові або плазму крові.

В одному втіленні запропоновано антитіло до СЮО19 людини для застосування в способі діагностики або виявлення. В іншому аспекті запропонований спосіб виявлення присутності клітин, презентуючих СО19 людини, в біологічному зразку. У деяких втіленнях даний спосіб включає приведення біологічного зразка в контакт з антитілом до СЮО19 людини, як описано в даному документі, при пермісивних умовах для зв'язування антитіла до СО19 людини з СО19 людини і виявлення того, чи утворюється комплекс між антитіллом до СО19 людини і СО19

Ко) людини. Такий спосіб може являти собою спосіб іп міго або іп мімо. В одному втіленні антитіло до СО19 людини використовується для відбору суб'єктів, які підходять для терапії антитілом до

СО19 людини, наприклад, де СЮО19 людини являє собою біомаркер для відбору пацієнтів.

Типові розлади, які можна діагностувати з використанням антитіла, як описано в даному документі, включають В-клітинні ракові захворювання, такі як В-клітинна лімфома і В-клітинні лейкози, за винятком множинної мієломи, наприклад, неходжкінську лімфому і гострий лімфобластний лейкоз. В деяких втіленнях запропоновані мічені антитіла до СО19 людини.

Мітки включають мітки або угруповання, які виявляються безпосередньо (такі як флуоресцентні, хромофорні, елекроннощільні, хемілюмінісцентні та радіоативні мітки), а також угруповання, такі як ферменти або ліганди, які виявляються опосередковано, нариклад, через ферментативну реакцію або молекулярну взаємодію, але не обмежуються ними. Типові мітки включають радіоїзотопи З2Р, 190, 125І, ЗН ії 191ї, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних металів або флуоресцеїн та їх похідні, родамін та його похідні, дансил, умбелліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світляка і бактеріальну люциферазу (05 4737456), люциферин, 2,3- дигідрофталазиндіони, пероксидазу хріну (НКР), лужну фосфатазу, р-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, сахаридоксидази, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, гетероциклічні оксидази, такі як уриказу і ксантиноксидазу, зв'язані з ферментом, що використовує пероксид водню для окислення попередника барвника, таким як НЕР (пероксидаза хріну), лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/авідин, спинові мітки, бактеріофагові мітки, стабільні вільні радикали і тому подібне, але не обмежуються ними.

Е. Фармацевтичні препарати

Фармацевтичні препарати антитіла до СО19 людини, як описано в даному документі, одержують змішуванням такого антитіла, що має бажану ступінь чистоти, з одним або більше ніж одним можливим фармацевтично прийнятним носієм (Кетіпдіоп'є Рпагтасешііса! Зсіепсев, 161 еайіоп, О5ої, А. (ва) (1980)), у формі ліофілізованих препаратів або водних розчинів.

Фармацевтично прийнятні носії зазвичай є нетоксичними для реципієнтів в застосовуваних дозах і концентраціях і включають: буфери, такі як фосфатний, цитратний і на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, що включають аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; 60 бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил або пропілпарабен; катехін; резорцин; циклогексанол; З-пентанол і м-крезол); низькомолекулярні (менше, ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полі(вінілпіролідон); амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, які включають глюкозу, манозу або декстрини; хелатори, такі як ЕОТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти); цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиїіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок); та/або неіїонні поверхнево-активні речовини, такі як полієтиленгліколь (РЕС), але не обмежуються ними. Типові фармацевтично прийнятні носії в даному документі додатково включають агенти для диспергування лікарського засобу в кишечнику, такі як розчинні нейтрально-активні гіалуронідазні глікопротеїни (5ЗНАБЕСР), наприклад, людські розчинні гіалуронідазні глікопротеїни РН-20, такі як гпиРН2го (НМ ЕМЕХ-У, Вахіег Іпіегпайопаї, Іпс.). Деякі типові ХНАБЕСР та способи застосування, включаючи гпиРН2О, описуються в ОЗ 2005/0260186 і 05 2006/0104968. В одному аспекті ЗХЗНАБЕСР об'єднується з однією або більше ніж однією додатковою глікозаміногліканазою, такою як хондроїітиназа.

Типові ліофілізовані препарати антитіл описуються в 05 6267958. Водні препарати антитіл включають препарати, описані в 05 6171586 і М/О 2006/044908, причому останні препарати включають гістидин-ацетатний буфер.

Описаний в даному документі препарат також може містити більше, ніж один активний інгредієнт, необхідний для конкретного показання, яке лікують, переважно інгредієнти з взаємодоповнюючими активностями, які не роблять шкідливого впливу друг на друга. Такі активні інгредієнти, відповідним чином, присутні в комбінації в кількостях, які є ефективними для наміченої мети.

Активні інгредієнти можуть бути захоплені в мікрокапсули, одержані, наприклад, методиками коацервації або за допомогою полімеризації на межі розділення фаз, наприклад, в гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули і в полі-(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно, в колоїдні системи доставлення лікарського засобу (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методики розкриті в Ветіпдіоп'є Рнагтасеціїса! бсієпсев, 16? еайіоп, О5оЇ,

Зо А. (вйд.) (1980).

Можуть бути одержані препарати з уповільненим вивільненням. Відповідні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, які знаходяться в вигляді формованих предметів, наприклад, плівок або мікрокапсул.

Препарати, що застосовуються для введення іп мімо, зазвичай є стерильними. Стерильність може легко досягатися, наприклад, за допомогою фільтрування через мембрани для стерилізуючого фільтрування.

Ж. Терапевтичні способи і композиції

Будь-яке із запропонованих в даному документі антитіл до СО19 людини можна використовувати в терапевтичних способах або одне, або в комбінації, або у вигляді моноспецифічного антитіла, або у вигляді мультиспецифічного антитіла.

СО19 експресується на більшості В-клітин (пан-В-клітинний маркер), за винятком стовбурових клітин і плазматичних клітин, і часто експресується при більшості людських В- клітинних злоякісних захворювань (антиген, асоційований з пухлиною), таких як лімфома і лейкози, за винятком множинної мієломи, наприклад, при неходжкінській лімфомі і гострому лімфобластному лейкозі.

Біспецифічні антитіла, які розпізнають два білка поверхні клітини на різних популяціях клітин, мають потенціал перенаправлення цитотоксичних імунних клітин для руйнування патогенних клітин-мішеней.

В одному аспекті запропоновано антитіло до СО19 людини для застосування як лікарського засобу. В інших аспектах запропоновано антитіло до СЮО19 людини для застосування в лікуванні

В-клітинного раку. У деяких втіленнях запропоновано антитілло до СО19 людини для застосування в способі лікування. У деяких втіленнях в даному документі запропоновано антитіло до СЮО19 людини для застосування в способі лікування індивіда, що має В-клітинний рак, що включає введення даному індивіду ефективної кількості антитіла до СО19 людини. В одному такому втіленні даний спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента. В інших втіленнях в даному документі запропоновано антитіло до СО19 людини для застосування в виснаженні популяцій В-клітин. У деяких втіленнях в даному документі запропоновано антитілло до СО19 людини для бо застосування в способі виснаження популяцій В-клітин у індивіда, що включає введення даному індивіду ефективної кількості антитіла до СО19 людини для виснаження популяцій В-клітин. "Індивід" згідно будь-якого з наведених вище втілень переважно являє собою людину. В- клітинний рак в одному втіленні являє собою В-клітинну лімфому або В-клітинний лейкоз. В одному втіленні В-клітинний рак являє собою неходжкінську лімфому або гострий лімфобластний лейкоз.

В інших аспектах запропоновано антитіло до СО19 людини для застосування в імунотерапії раку. У деяких втіленнях запропоновано антитіло до СЮО19 людини для застосування в способі імунотерапії раку. "Індивід" згідно будь-якого з наведених вище втілень переважно являє собою людину.

В іншому аспекті в даному документі запропоновано застосування антитіла до СО19 людини у виготовленні або одержанні лікарського засобу. В одному втіленні даний лікарський засіб призначений для лікування В-клітинного раку. В іншому втіленні лікарський засіб призначений для застосування в способі лікування В-клітинного раку, що включає введення індивіду, що має

В-клітинний рак, ефективної кількості лікарського засобу. В одному такому втіленні даний спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче. В іншому втіленні лікарський засіб призначений для виснаження популяції В-клітин. В іншому втіленні лікарський засіб служить для застосування в способі виснаження популяції В-клітин у індивіда, що включає введення індивіду ефективної кількості лікарського засобу для виснаження популяції В-клітин. "Індивід" згідно будь-якого з наведених вище втілень може являти собою людину. В-клітинний рак в одному втіленні являє собою В-клітинну лімфому або В-клітинний лейкоз. В одному втіленні В-клітинний рак являє собою неходжкінську лімфому або гострий лімфобластний лейкоз.

В іншому аспекті в даному документі запропановано спосіб лікування В-клітинного раку. В одному втіленні даний спосіб включає введення індивіду, що має такий В-клітинний рак, ефективної кількості антитіла до СО19 людини. В одному такому втіленні даний спосіб додатково включає введення індивіду ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, як описано нижче. "Індивід" згідно з будь-яким з наведених вище втілень может являти собою людину. В-клітинний рак в одному втіленні являє собою В-клітинну лімфому або В-клітинний лейкоз. В одному втіленні В-клітинний рак являє собою неходжкінську

Зо лімфому або гострий лімфобластний лейкоз.

В іншому аспекті в даному документі запропановано спосіб виснаження популяції В-клітин у індивіда. В одному втіленні даний спосіб включає введення індивіду ефективної кількості антитіла до СО19 людини для виснаження популяції В-клітин. В одному втіленні "індивід" являє собою людину. В-клітинний рак в одному втіленні являє собою В-клітинну лімфому або В- клітинний лейкоз. В одному втіленні В-клітинний рак являє собою неходжкінську лімфому або гострий лімфобластний лейкоз.

В іншому аспекті в даному документі запропоновані фармацевтичні препарати, що містять будь-яке з антитіл до СО19 людини, як описано в даному документі, наприклад, для застосування в будь-якому з вищезазначених терапевтичних способів. В одному втіленні фармацевтичний препарат містить будь-яке з антитіл до СЮО19 людини, як описано в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому втіленні фармацевтичний препарат містить будь-яке з антитіл до СЮО19 людини, як описано в даному документі, і щонайменш один додатковий терапевтичний агент.

Антитіла, як описано в даному документі, можна використовувати в терапії або одні, або в комбінації з іншими агентами. Наприклад, антитіло, як описано в даному документі, можна вводити спільно з щонайменше одним додатковим терапевтичним агентом.

Такі комбіновані терапії, зазначені вище, охоплюють комбіноване введення (де два або більше ніж два терапевтичних агента включаються в ті ж самі або в окремі препарати) і роздільне введення, причому в даному випадку введення антитіла, як описано в даному документі, може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного агента або агентів. В одному втіленні введення антитіла до СО19 людини і введення додаткового терапевтичного агента відбувається в межах приблизно одного місяця або в межах приблизно одного, двох або трьох тижнів, або в межах приблизно одної, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести діб одне від одного.

Антитіло, як описано в даному документі (і будь-який додатковий терапевтичний агент), можна вводити будь-яким відповідним способом, що включає парентеральне, внутрішньолегеневе та інтраназальне введення, і, якщо це бажано для місцевого лікування, введення в область поразки. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. 60 Дозування може здійснюватися будь-яким відповідним шляхом, наприклад, за допомогою ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, частково в залежності від того, чи є введення короткостроковим або хронічним. В даному документі розглядаються різні схеми дозування, що включають одноразові або багаторазові введення протягом різних моментів часу, болюсне введення та імпульсну інфузію, але не обмежуються ними.

Антитіла, як описано в даному документі, були б приготовані, дозовані і введені способом, що відповідає з належною медичною практикою. В даному контексті фактори для розгляду включають конкретний розлад, який лікують, конкретного ссавеця, якого лікують, клінічний стан індивідуального пацієнта, причину розладу, місце доставлення агента, спосіб введення, схему введення та інші фактори, відомі практикуючим лікарям. Антитіло не обов'язково повинно, але може бути приготовлено з одним або більше ніж одним агентом, використовуваним в даний час для попередження або лікування даного розладу. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, присутнього в препараті, типу розладу або лікування та інших факторів, що обговорювалися вище. Вони зазвичай використовуються в таких самих дозах і з використанням таких самих шляхів введення, які описані в даному документі, або приблизно від 1 до 99595 від дозувань, описаних в даному документі, або в будь-якому дозуванні і за допомогою будь-якого шляху, що емпірично/клінічно визначено як відповідний.

Для попередження або лікування захворювання відповідне дозування антитіла, як описано в даному документі (при застосуванні його одного або в комбінації з одним або більше ніж одним іншим додатковим терапевтичним агентом), буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіла, тяжкості і перебігу захворювання, того, чи вводиться антитіло для попереджувальних або терапевтичних цілей, попередньої терапії, клінічної історії та відповіді на антитіло пацієнта, і рішення лікаря. Антитіло відповідним чином вводиться пацієнтові за один раз або протягом серії обробок. Залежно від типу і тяжкості захворювання, початковим дозуванням-кандидатом для введення пацієнту може бути приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг) антитіла, незалежно від того, чи здійснюється воно одним або більше ніж одним роздільним введенням або за допомогою безперервної інфузії. Одна типова добова доза може варіювати від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, в залежності від факторів, згаданих вище. Для повторних введень протягом декількох діб або довше, залежно від стану, лікування зазвичай підтримувалося б до бажаної появи придушення симптомів

Зо захворювання. Одне типове дозування антитіла перебувало б в інтервалі від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Таким чином, пацієнтові могла б вводитися одна або більше ніж одна доза приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яка їх комбінація). Такі дози можуть вводитися періодично, наприклад, щотижня або кожні три тижні (наприклад, таким чином, що пацієнт отримує від приблизно двох до приблизно двадцяти, наприклад, приблизно шість доз антитіла). Може вводитися вихідна більш висока завантажувальна доза, з подальшими одною або більше ніж одною меншими дозами. Однак можуть бути корисними інші схеми дозування. Прогрес даної терапії легко відстежується традиційними методиками і аналізами.

В даному документі додатково запропоновані способи лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу і захворювання кістки, що включають введення пацієнту, діагностованому як такий, що має таке захворювання (і, отже, що потребує такого лікування), антитіла, что специфічно зв'язується з СЮО19 людини, як описано в даному документі. Дане антитіло може вводитися одне, у фармацевтичній композиції або, як альтернатива, в комбінації з іншими лікарськими засобами для лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки. Антитіло вводиться в фармацевтично ефективній кількості.

В даному документі додатково запропоновано застосування антитіла, як описано в даному документі, для лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки і для виготовлення фармацевтичної композиції, що містить антитіло, як описано в даному документі. Крім того, в даному документі запропановано спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, що містить антитіло, як описано в даному документі.

В даному документі додатково запропоновано антитіло, як описано в даному документі, для лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки.

Крім того, в даному документі запропоновано застосування антитіла, як описано в даному документі, для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки. Дане антитіло використовується в фармацевтично ефективній кількості.

Крім того, в даному документі запропоновано застосування антитіла, як описано в даному документі, для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування запального захворювання, аутоїмунного захворювання, ревматоїдного артриту, вовчака, псоріазу або захворювання кістки. Дане антитіло використовується в фармацевтично ефективній кількості.

Зрозуміло, що будь-які з наведених вище препаратів або терапевтичних способів можуть проводитися з використанням імунокон'югату, як описано в даному документі, замість або крім антитіла до СО19 людини.

І. Вироби

В іншому аспекті запропоновано виріб, що містить речовини, корисні для лікування, попередження та/або діагностики описаних вище розладів. Виріб містить контейнер і етикетку або листок-вкладиш в або на упаковці в асоціації з контейнером. Відповідні контейнери включають, наприклад, бутлі, флакони, шприци, мішки з в.в. (внутрішньовенний) розчином і т.д.

Контейнери можуть бути зроблені з цілого ряду матеріалів, таких як скло або пластмаса.

Контейнер містить композицію, яка сама або в комбінації з іншою композицією є ефективною для лікування, попередження та/або діагностики стану, і може мати стерильний порт доступу (наприклад, контейнер может являти собою мішок для внутрішньовенного розчину або флакон, що має пробку, проникну підшкірною ін'єкційною голкою). Щонайменше один активний агент в композиції являє собою антитіло, як описано в даному документі. На етикетці або листку- вкладиші в упаковці вказано те, що композиція використовується для лікування вибраного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, що міститься в ньому, де дана композиція містить антитіло, як описано в даному документі; і (б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, де дана композиція містить додатковий цитотоксичний або інший теапевтичний агент. Виріб в даному втіленні може додатково містити листок-вкладиш в упаковці, на якому зазначено те, що композиції можуть бути використані для лікування конкретного стану. Альтернативно або додатково, виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкції (ВУМЕЇ), фосфатно-сольовий буферний розчин, розчин Рінгера та розчин глюкози. Воно може додатково включати інші матеріали, необхідні з комерційної точки зору або точки зору користувача, що включають інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.

Зо Зрозуміло, що будь-який з наведених вище виробів може включати імунокон'югат, як описано в даному документі, замість або крім антитіла до СЮО19 людини.

ІМ. Опис переліку послідовностей

ЗЕО ІЮ МО: 1 варіабельний домен важкого ланцюга мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮ МО: 2 варіабельний домен легкого ланцюга мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮО МО: З НМВ-НІ мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮО МО: 4 НМВ-Н2 мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮО МО: 5 НМВ-НЗ мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮ МО: 6 НМВ-Ї1 мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮО МО: 7 НМВ-І2 мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮ МО: 8 НМВ-ЇЗ мишиного антитіла 888 до СО19 людини

ЗЕОІЮО МО: 9 варіабельний домен гуманізованого важкого ланцюга

ЗЕОІО МО:10-28 черговані послідовності гуманізованого варіабельного домену легкого ланцюга і гуманізованого варіанта НМК-Ї 1

М. Номенклатура антитіл 11111111 номерпослідовності.д//:/ (С варіа- варіа- антитіло або Ібель-ний| бель-ний варіабельна домен | домен | Нуд-ну | нуд-но | НУВ-НЗ | НУВЯ1 | НУВ42 | НУВАЗ ділянка важ-кого| легкого антитіла |лан-цюга| ланцюга

УН МІ. бом | 1 | 2 | 3 | 4 1 5 1 6 | 7 | 8 лмгетан | 9 | 70 | з | 1 5 | 712 | 7 | 8 2гмгтаю | 9 | 13 | з | п 1 5 | 74 | 7 | 8 3ЗваЛеА | 9 | 15 | З | 7 | 5 | 716 | 7 | 8 аЗа7теМ | 9 | 17 | з | чп 1 5 | 718 | 7 | 8 5ББаЛОР | 9 | 719 | з | її 5 1 20 | 7 | 8 бмагво | 9 | 21 | з | 1 1 5 | 22 | 7 | 8 70294. | 9 | 23 | З | 7 1 5 | 24 | 7 | 8 8с293М | 9 | 25 | з | "п 1 5 | 256 | 7 | 8 а527еРМ285І 9 | 27 | з | 1 11 5 1 28 | 7 | 8

МІ. ПРИКЛАДИ

Наступне являє собою приклади способів і композицій даного винаходу. Зрозуміло, що можна втілювати на практиці різні інші втілення, беручи до уваги загальний опис, наведений вище.

Хоча вищевикладений винахід і було описано в деяких подробицях за допомогою ілюстрації та прикладу для цілей ясності розуміння, дані описи і приклади не слід тлумачити як обмежуючі об'єм винаходу. Розкриття всієї патентної та наукової літератури, процитованої в даному документі, прямо включені у всій їхній повноті за допомогою посилання.

Приклад 1

Імунізація та одержання мишиних антитіл до СО19 людини (гібридом)

Мишей Ваїр/с шість разів імунізували і піддавали бустерної імунізації клітинами НЕК293, трансфікованими СО19 (середня щільність рецептора 35000 на клітину). Імунну відповідь відстежували шляхом тестування зразків сироватки з використанням ЕГІЗА на клітини з СО19 на клітинах МІН-3Т3, трансфікованих СО19. Клітини селезінки від мишей з достатніми титрами антитіла до СО19 людини використовували для створення безсмертних клітин за допомогою злиття з мишиною мієломною лінією клітин РЗХбЗ Ао8.653. Здійснювали три злиття, і супернатант гібридоми піддавали скринінгу за допомогою ЕГ І5А на клітини на клітинах МІН-ЗТЗ, трансфікованих СО19 людини, і аналізу зв'язування ЕАС5 (флуоресцентне сортування клітин) на антитіла, специфічні у відношенні СЮО19 людини, з використанням клітин Дауді (СО195) ії клітин СО19".

Приклад 2

Скринінг гібридом та клітинна біологічна функціональна оцінка антитіла до СО19

Клітинний ЕГІЗА для скринінгу антитіл проти НСО19

Для скринінгу гібридом і для ідентифікації тих гібридом, які секретують антитіла проти СО19 людини, застосовували клітинний ЕГІЗА. Як позитивні клітини використовували клітини МІНЗТЗ, трансфіковані СО19 людини; нетрансфіковані клітини МІНЗТЗ використовували як клітини

Зо негативного контролю. Для оцінки позитивних гібридом кількісно визначали відношення ОЩ (оптична щільність) між трансфікованими і нетрансфікованими клітинами МІНЗТЗ. - Культуральне середовище: ЮОМЕМ (середовище Ігла, модифіковане за Дульбекко) з високим вмістом глюкози (4,5 мг/мл), 10 96 ЕС5 (фетальна теляча сироватка), Ма-піруват, МЕАА (замінні амінокислоти), глутамін. - Позитивний контроль антитіл: моноклональне антитіло до СО19 (Ідс1) Кат. Мо 555409 з від

Рпаптіпдеп - 1 мг/мл. - Виявляюче антитіло: кон'югат з НЕР антитіла кози проти дО миші (НІ), Кат. Мо 170-06516 від Віо-Наа. - Розведення 1:2000 в 1х блокуючому реактиві для ЕГГІ5А. - Інші реактиви: фібронектин, Кат. Мо 838039 з від Коспе, 1 мг/мл. - Глутаральдегід: 25 уо-ний матковий розчин // високоочищений агар для наукових цілей -

МоК102, кінцева концентрація 0,05 95 в РВ5. - Блокуючий реактив для ЕГІЗА: 10х матковий розчин // Кат. Мо 1112589 від Коспе.

- Субстрат ТМВ (тетраметилбензідин): Кат. Мо 11432559 від Коспе. - Зупиняючий розчин: 1 М Небо. - Кат. Мо 170-6516 Віо-Ваай - розведення 1:2000 в 1х блокуючому реактиві для ЕЇГ ІА.

Доба 1: - Покриття фібронектином: 5 мкг/см? в РВ5; 96-лунковий планшет - 32 см; 160 мкг/планшет в б мл. - РВ5, 50 мкл/лунку. - Інкубувати 45 хв при КТ (кімнатна температура), відсмоктати покривний розчин. - Висіяти 1,25х107 клітин/лунку в 50 мкл культурального середовища в 96-лунковому планшеті. - Інкубувати 40 годин при 37 "С. - Додати в верхню половину планшета: клітини МІНЗТЗ, що експресують СО19. - Додати в нижню половину планшета: нетрансфіковані клітини МІНЗТЗ.

Доба 3: - Додавання антитіла позитивного контролю або зразків (супернатант або мишина сироватка) в 50 мкл культурального середовища. - Інкубувати протягом 2 год при 4 "С. - Видалити середовище, зафіксувати клітини 100 мкл глутаральдегіду (0,05 95 в РВ5). - Промити два рази 200 мкл РВ5. - Додавання виявляючого антитіла 1: 2000, 50 мкл/лунку. - Інкубувати 2 г при КТ. - Промити три рази 200 мкл РВ5. - Додати 50 мкл ТМВ, інкубувати протягом 30 хв при КТ. - Зупинити додаванням 25 мкл 1 М Н25Ох; рахувати екстинкцію при 450 нм/620 нм. - Розрахунок результатів: відношення ОЩ МІНЗТЗ СО19: ВП нетрансфікованих МІНЗТЗ.

Приклад З

Гуманізація антитіла до СЮО19

Специфічність зв'язування мишиного антитіла до СО19 переносили на людський акцепторний каркас для усунення потенційних проблем імуногенності, що виникають через відрізки послідовності, які людський організм буде розпізнавати як чужорідні. Це здійснювали пересадкою повних ділянок, що визначають комплементарність (СОК), мишиного (донорного) антитіла на каркас людського (акцепторного) антитіла, та даний процес називається пересадкою СОК або гуманізацією антитіла.

Мишину амінокислотну послідовність вирівнювали з набором М генів антитіла людської зародкової лінії і сортували згідно ідентичності і гомології послідовності. Перед вибором однієї конкретної акцепторної послідовності повинна бути визначена так звана канонічна структура петель донорного антитіла (Могеа, У., еї аІ.,, Меїоа5, Мої 20, Івце З (2000) 267-279). Ці канонічні структури петель визначаються типом залишків, присутніх в так званих канонічних положеннях.

Дані положення знаходяться (частково) поза ділянок СОК і повинні підтримуватися в кінцевій конструкції функціонально еквівалентними для того, щоб зберігати конформацію СО батьківського (донорного) антитіла. Як акцептор для важкого ланцюга була вибрана людська послідовність зародкової лінії МВАЗЕ УНІ 1, і для легкого ланцюга була вибрана послідовність

МВАБЗЕ МКа2 5. Це призвело до гуманізуваного антитіла дикого типу.

Приклад 4

Експресія антитіл, що зв'язуються СО19

Послідовності, кодуючі варіабельний домен антитіла, одержували за допомогою синтезів генів.

Для введення відповідних точкових мутацій була проведена реакція швидкої заміни на основі 33-мірного праймера. Все послідовності підтверджували секвенуванням (5едиізегме,

Маїегзіенеп, Німеччина). Всі послідовності клонували в вектори, які забезпечують селекцію і розмноження в Е. соїї (реплікатор з вектора рОсС18, бета-лактамаза для стійкості до ампіциліну).

Дані вектори додатково містять касети, які забезпечують експресію в клітинах ссавців (реплікатор огіР вірусу Епштейна-Барр (ЕВУ), негайний ранній енхансер і промотор з людського цитомегаловірусу (НСМУ) і послідовність поліаденілювання).

Всім сегментам гена, які кодують легкий та важкий ланцюги антитіла, передувала послідовність ДНК, кодуюча сигнальний пептид (МЕОМУЗСІ РІ МАТАТОаМНе; ЗЕО ІЮО МО: 29).

Дані білки експресували за допомогою тимчасової трансфекції клітин людської ембріональної нирки НЕК293 в суспензії. Дані клітини культивували при 37 "С і 8 95 СО». В добу трансфекції клітини висівали в свіже середовище в щільності 1-2х105 життєздатних клітин/мл. бо Співтрансфікували еквімолярні кількості плазмідних ДНК та важкого, та легкого ланцюга.

Супернатанти культури клітин відбирали через 7 діб після трансфекції, центрифугували (14000 д протягом 45 хв при 4 "С) та потім фільтрували через 0,22 мкм фільтр. Дані супернатанти могли бути заморожені та збережені при -20 "С до очищення.

Приклад 5

Очищення антитіл, що зв'язуються з СО19

Безклітинний супернатант ферментації (НЕК 293) завантажується на попередньо врівноважену (фосфатно-сольовий буферний розчин, РВ5) афінну колонку на основі білка А (марб5еіесі М5уВе, СЕ Неайнсаге, 8х100 мм) з контактним часом 5 хвилин. Після промивання (РВ5, 5 об'ємів колонки) антитіло елююється 25 мМ лимонною кислотою/маон (рн 3,0). Елюат доводиться до рН 5,5 1 М Тті5 та інкубується протягом ночі при 4 "С. Потім здійснюється кінцеве фільтрування (0,45 мкм).

Очищення варіанта 5 антитіла до СЮО19 людини (527еР):

Безклітинний супернатант ферментації (244 мл, НЕК 293Е) завантажували на попередньо врівноважену (фосфатно-сольовий буферний розчин, РВ5) афінну колонку на основі білка А (Марзеіесі "М5иВе, СЕ Неайнсаге, 8х100 мм) з контактним часом 5 хвилин. Після промивання (РВ5, 5 об'ємів колонки) антитіло елюювали 25 мМ лимонною кислотою/маон (рн 3,0). Елюат доводили до рН 5,5 1 М Тгтгі5 та інкубували протягом ночі при 4 "С. Кінцеве фільтрування (0,45 мкм) давало 31,1 мг (5,7 мл, 5,45 мг/мл) продукту 99,0 95-ної чистоти (ЕС - гель-фільтрація).

Очищення варіанта 9 антитіла до СЮО19 людини (527еР/М285):

Безклітинний супернатант ферментації (260 мл, НЕК 293Е) завантажували на попередньо врівноважену (РВ5) афінну колонку на основі білка А (МарзЗеІесі М5уВе, СЕ Неайнсагеє, 8х100 мм) з контактним часом 5 хвилин. Після промивання (РВ5, 5 об'ємів колонки) цільовий білок елюювали 25 мМ лимонною кислотою/Ммаон (рн 3,0). Елюат доводили до рН 5,5 1 М Ттгіз (рн 9,0) та інкубували протягом ночі при 4 "С. Кінцеве фільтрування (0,2 мкм) давало 9,1 мг (5,2 мл, 1,75 мг/мл) продукту 98,0 95-ної чистоти (ЕС).

Приклад 6

Надання клітин, що експресують ЕСО СО19, та зв'язування з ними антитіл

Клітини НЕК293 трансфікували 1 мкг плазмідної ДНК на 1,5х106 клітин з використанням

МПрогесіАтіпе 2000 і потім інкубували протягом 48 годин при 37 "С. Дані плазміди кодували позаклітинний домен (ЕСО) або СО19 людини (РЕЕРЬУУКУЄ ЕБОМАУБОСТЬ КОТ5ВСКТОЮ

ТТИВРЕЯРІК веЕБКЬВЬсЬР СЬСІНМАРЬА ІЖЬБІЕМУБО ОМОоБКУБСОР бРРБЕКАМОР сИРУуМукаяос ЕВЕР УЄВІ. сОІ16ССсЬКМВ ЗвЕОРББвВ кимБеКІУчУЮ АКБЕРЕТНКО

ЕРРСІвРЕОВ ІМОБТБОБЬТ МАРОБТІШЬВ СОУРРОБЗУВВ бРІВЖТНУНе КОРЕКББТВЬЕ

ІКЕОКРАВІМ МУМЕТСТЬТР ВБАТАОГАСбКУ ЖУСНЕОМІТМО ЕНЬБЕТІТАВРУ БЖНИТБЕТОоЄ як.

ЗЕО ІО МО: 30), або ср19 яванського макака (РОБРІМУКУЄ ЕОБОМАУБОСЬ Став ТУЖСвраРЕЕ

РЕБМЬБЬСЬР о СМСІВМОРІС 0 ІШЬБІЕМУЗМ ОТОСЕХЬСОР СЬРЕЕКАЩОР ситудукове

ЕБЕБШЮМ БІ, есте ен вевш:рБеРи КЕМОВОБУУЄ АКРЕРЕМИКО ЕРУСОвРЕрБ

БМмОоБЕБОБІтТ МАРОБТЬНЬВ СсОУвРовУВК ОЗРЕБЖТНУВР КкОоРКББЬТВІ. ЕБКБбЕРПКр

МЕШУУБТОІТІ, ТЕАТАСПАСК УХСНеОМшТК БЕТУБЕІТАКР АРЖНШЬВІЄС ОИКУ,; 5ЕО ІЮ

МО: 31), злиті з послідовністью ОРІ (глікозильований фосфатидилінозитольний) якоря людського РОСА (антиген стовбурової клітини простати) для позаклітинної презентації.

Відповідні трансфіковані клітини двічі промивали в буфері РАС5 (РВ5, что містить 5 95 фетальної тялячей сироватки (ЕС5)) та ресуспендували в буфері ЕАС5 до кінцевої концентрації 27105 клітин/мл, що відповідає 5,010 клітин/25 мкл/лунку. Була встановлена вихідна концентрація антитіл 60 мкг/мл (2х кінцева концентрація), і потім здійснювалося розведення 1: З (об./06.) в серіях титрування. Первинне антитіло інкубували на клітинах протягом однієї години при кімнатній температурі з подальшими двома стадіями промивання. Для вторинного виявлення використовували антитіло до пиЇдс (НІ), кон'юговане з АІеха488, в концентрації 30 мкг/мл. Вторинне антитіло інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім клітини двічі промивали і ресуспендували в 70 мкл/лунку буфера БАС5 і аналізували з використанням ВО ЕГАС5 Сапіо.

Відповідні значення ЕСво (напівмаксимальна ефективна концентрація) для гуманізованого антитіла дикого типу і варіантів 5 (527еР) і 9 (527еР / М285) показані в наступній Таблиці. 11111111 | ммкимл| | оваріантб5імкумл| | оваріантО|мкг/мл

Приклад 7

Мас-спектрометрія (РХ-МС/МС)

Речовину антитіла (приблизно 80 мкг) денатурували в 200 мМ гістидин-НСЇІ буфері (рН 6,0), що містить приблизно 7 М гуанідиній-НСІ, відновлювали з використанням 10 мМ ТСЕР (трис-2- карбоксіетилфосфін), і замінювали буфер на 200 мМ гістидин-НСІ (рН 6,0) з використанням колонок 2ера ріп з МУУСО (поріг відсікання молекулярної маси) 7 кДа (Тпепто зЗсіепійіс).

Нарешті, речовинау розщеплює 2,5 мкг трипсину або термолізину (Рготеда) протягом 16 годин при 37 "С. Збір даних здійснювали з використанням градієнта ЕР-ОРІ С (надефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою) на С18 колонці АСОШІТУ ВЕНЗОО (Умаїег5), використовуючи систему ОРІ С МапоАсдийу (У/аїег5), з подальшою МС/МС (тандемна мас-спектрометрія) на основі СІО на мас-спектрометрі Огрйгар Ризіоп Тгіргій «(«ТПпегто Зсієпійіс) з Тгімегза МапоМаїе (Адміоп) як джерела наноелектророзпилювалюної іонізації. Дані оцінювали з використанням пошуків іонів МС/МС Мазсої (Маїгіх Зсіепсе) і пептидного аналізатора (Коспе Оіадповійс5

СтЬН), програми для оцінки даних МС власної розробки. Кількісний вимір здійснювали за допомогою інтегрування витягнутих хроматограм іонного струму відповідних пептидів.

Результати:

У наведеній нижче таблиці рівень дезамідування та утворення сукцинімідів гуманізованого антитіла до СЮО19 дикого типу (варіант 0: м/) при інкубації при 37 "С протягом 2 тижнів при рн 7 А в буфері РВЗ (використаний фрагмент: 55051. ЕМ5МОМТМІ МУУМІ ОКРООБРОЇ ПУЕ; 5ЕО ІЮ

МО: 35). жонтроль/////Ї71711111111115811Ї1111111111111110111 інкубоване при 37 "С протягом 2 тижнів при 26-32 рН 7,4 в буфері РВЗ

У наведеній нижче таблиці наведений рівень дезамідування та утворення сукцинімідів при інкубації варіанта 5 гуманізованого антитіла до СО19 (527еР) (використаний фрагмент:

ЗОБІ ЕМЗМОаМТ МІ ММ ОКРИОБРОМПІІМА; ЗЕО І МО: 35). інкубоване при 37 "С протягом 2 тижнів при 7 рН 7,4 в буфері РВЗ інкубоване при 40 "С протягом 2 тижнів при А 2 рН 6,0 в буфері гістидин/Масі

В наступній таблице наведений рівень дезамідування та утворення сукцинімідів при

Зо інкубації варіанта З гуманізованого антитіла до СО19 (527еА) (використовуваний фрагмент:

ЗОБІ ЕМЗМОаМТ МІ ММ ОКРИОБРОМПІІМА; ЗЕО І МО: 35). інкубоване при 37 "С протягом 2 тижнів при 23 1 рН 7,4 в буфері РВ5 інкубоване при 40 "С протягом 2 тижнів при 13 4 рН 6,0 в буфері гістидин/Масі

В наступній таблице наведений рівень дезамідування та утворення сукцинімідів при інкубації варіанта 7 гуманізованого антитіла до СО19 (529А) (використовуваний фрагмент:

ЗОБІ ЕМЗМОаМТ МІ ММ ОКРИОБРОМПІІМА; ЗЕО І МО: 35).

жонтроль/////Ї71777111111178111111111Ї111111111111111011 інкубоване при 37 "С протягом 2 тижнів при 45 0,5 рН 7,4 в буфері РВЗ інкубоване при 40 "С протягом 2 тижнів при 13 рН 6,0 в буфері гістидин/Масі

Приклад 8

Визначення афінності до СО19

Для визначення кінетичних параметрів зв'язування між антитіламі до СО19 людини та позаклітинним доменом рекомбінантного рецептора СО19 людини використовували аналіз на основі поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК).

Протокол 1:

Для захоплення антитіла до СО19 людини використовували фрагмент антитіла К(ар)2 проти антитіла людини як захоплюючого антитіла аскзоп Іттипо Кезеагсі; код замовлення: 109- 006-006). 20 мкг/мл захоплюючого антитіла іммобілізували на чіпі СМ5 (СЕ Неаййсаге; ВА-1005- 30) при рН 4,5 за допомогою застосування набору для амінного зв'язування згідно з інструкціями виробника (СЕ Неайїсаге). Буфером для зразка і рухомим буфером були НВ5З-ЕР-- (СЕ Неайнсаге; ВА-1006-69). У проточному осередку була встановлена температура 25 "С. У блоці для зразків була встановлена температура 12 "С. Обидва були первинно оброблені рухомим буфером. Антитіло до СО19 людини захоплювали за допомогою ін'єктування 35 нм розчину протягом 60 с при швидкості струму 20 мкл/хв. Асоціацію вимірювали за допомогою ін'єктування рекомбінантного людського ЕСО СО19 в різних концентраціях в розчині протягом 120 с при швидкості струму 50 мкл/хв, починаючи з 900 нМ з разведениями 1:3 і використовуючи всього п'ять концентрацій. Фазу дисоціації відстежували протягом з точністю до 600 с, і запускали її перемиканням від розчину для зразка до рухомого буфера. Поверхню регенерували два рази за допомогою 60 с і 30 с промивання 10 мм розчином гліцину (рН 1,5) при швидкості струму 30 мкл/хв. Загальні відмінності показника заломлення коректували шляхом вирахування відповіді, одержаної від поверхні з Е(аб)2 кози проти людського антитіла.

Також віднімали порожні ін'єкції (подвійний контроль). Для розрахунку уявної КО та інших кінетичних параметрів використовували модель Лангмюра 1:1.

Протокол 2:

Для захоплення антитіла до СО19 людини використовували захоплююче антитіло проти Бар людини. Спочатку іммобілізували 30 мкг/мл антитіла кози проти Рар людини (код замовлення: 28958325; СЕ Неайнсаге Віо-Зсіепсез АВ) на чіпі СМ5 (СЕ Неайсаге; ВК-1005-30) при рН 5,0 за

Зо допомогою застосування набору для амінного зв'язування (СЕ Неаїїйсаге) згідно з інструкціями виробника. Буфер для зразка і рухливий буфер являли собою НВ5-ЕР-- (СЕ НеайНсаге; ВВ- 1006-69). У проточному осередку була встановлена температура 25 "С. У блоці для зразків була встановлена температура 12 "С. Обидва були первинно оброблені рухомим буфером. Антитіло до СО19 людини захоплювали за допомогою ін'єктування 10 нМ розчину протягом 60 с при швидкості струму 10 мкл/хв. Асоціацію вимірювали за допомогою ін'єктування рекомбінантного людського ЕСО СО19 протягом 90 с при швидкості струму 10 мкл/хв в концентрації 250 нМ. Фазу дисоціації відстежували протягом з точністю до 60 с, і запускали її перемиканням від розчину для зразка до рухомого буфера. Поверхню регенерували за допомогою 60 с промивання 10 мМ розчином гліцину (рН 2,1) при швидкості струму 10 мкл/хв. Загальні відмінності показника заломлення коректували шляхом вирахування відповіді від порожньої поверхні.

Розрахування:

Відносне зв'язування зразка являє собою відношення, розраховане з рівня захоплення та рівня зв'язування (КИ зв'язування, розділені на КИ захоплення): рівень зв'язування відносне зв'язування -: (- З З З З З З 5 З Ж З - - -- -- -- рівень захоплення

Відносна активна концентрація зразка являє собою відношення зразка в порівнянні з контрольним зразком: відносне зв'язування зразок відноснаактивна концентрація - - - - Є Ж х - - ч Є Є Є 2 : Є -- - - - - відносне зв'язування контроль

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 ж. НОоббвапп-іа Коспе до «1205 ГУМАНІЗОВАНІ АНТИТІЛА ДО СВБІЗ ЛЮДИНИ ТА СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 РІЗОЗА «150» ЕРІХІ15УБ20.4 «151» 2615-10-01 «180» 70 «170» РатептІй хегеїоп 3,5 «2105 ії «гії» 1521 «212» ПпПРТ «213» Миз тивсцій5 «3005 1 бін Уаї віп івец бій бій баг обіу Бго вій івец Уаї уз Рго біу Аїа і 5 10 15 5ег Ууді уз Меї Ат Су і уз Аіа Заг обіу Тук тТиг о РНае тйг Або тТуг зо

Іїе мет ні тго чаї Суз Зіп о іуб5 тВгобтіу оіп бїу іп обіб тгроІ1е 35 соіу тук ІтІ1а д5поРгОо ТуУуг АБИ АБробіу Бег і уз Туг тик обіц іув РКе а 55 0

А5зп о біу Гуз АтТа тТйгоїец тйг 5Зег одер уз бЗег о Зек о тіє тНг о Аїа туг 65 то 75 Ба

Мет біц ігц Бек бек оіец ТНК бек сто Азр бек Аїа Уві Тук туго Сух 85 50 За

Атїа ага біУу тйг отТук тує Тук о віу бБег АТа ів вне д5ротук тгровіу 100 105 110 зіпобіУу тТагОотТВгоївц тТвгомаії бБегобег 115 129 «ій» 2 «2115 112 «2125 ПРЕ «21325 Ми5 швшазсуіна «М г

Азов Аїа уві Меї тВг осіп тТаг о РгОо івец баг оіец Рго Уа! багоівеу су 1 5 10 15 азр віп аїа б5ег Іїе бБег Су5з Ага бЗег бБег о бій бЗег о ів) бу АБИ 5ег

ТО 25 о

Азпосіу Аби тТВК туго їіец дп тгротук о іву віп уз Рго біу бБіп Баг за 45

Рго біп ів оієц Іі тТуг Ага Уа! Заг ої ух Агу Рпе Заг осіу узі івв 5о

А5роАгОо Ре Заг обі бег бі бЗег о біу ТпгоАБ5роввйе тк оівгц рух І1е 65 та 75 ка век Агоп Узі зі Аїз Б1ц АБріву біу уУуді тук Ра Суб ігц біп 1 ви 85 зо ак

ТВгонНтя Уаії вго туг тВг Ра біу сбіу б1іу ТЕГ Гуз Гви Ой Ії г уз 1050 105 10 «210» з кеії» 5 «від» ПРЕ «213» Ми тузсиінз «00» 4

А5ротук ті Мет Ні 1 5 «2100» 4 «21їх 17 «212» ПРЕ «215» Мив ми5сиінз «400» а

Тук Ії А5п РгОо тТуг АБп АЗроОіу бек огув тТук тВг осіц ух РНЕ АЗВВ 1 5 їй 15 сіу «210» 5 «гіїх 15 «212 пПРТ «215» Ми тузсиінз капа» 5 сіу тВготуг туго туг Біу бек Аїз івц вве Ар отуг 1 5 13 «210» 5 «811» 16 «212» пРТ «135» Мив тизситив к«ойх 5

Аг бБег бБег бій баг іє б1Ц АвБп баг оАвп о біу Авп таб туго і ви Ав 1 5 10 15 «210 7 «2115 7 «812» пет «213» Ми тизситих «400х 7

Ага Уві Бег у Ага вБе бег 1 5 «210» й «гії» з «2123 ПпПРК «213» Ми тизсиїих «300» 5 іец озіп іец о твгонНія маії го тТук о тг 1 5 «гій» З кгіїх 121 «від» ПРЕ «213» Штучна послідовність «ех «223» гуманізованни УНН «3005 З сіп Уаії зіп оієц Уві сій Зег сіу АТа біц УуВЗі іу5 уз Рго Бім Аїд і 5 13 15

Зег Уа1ї іуз Уа! Бег Суз 1у5 АТа бБегобіу тук тВг оРНе тйг о АЗротуг го 25 за

Ііе Мат Ні тгроуаї Ага біп АТа Рго оіу Біп біу ге бі: ТгроМмаї 35 0 45

Зіу туг ІТ А5ип вго тТуг А5пП о А5о біу 5ег Гуз Тук ТЕ бі 1у5 вве 50 55 5о сів сбіу Ака Ууді тВгоМмат твгобзак дев те бег ІтІїа бБег те АїЗ тут 55 та 75 о

Мет сій івги б5ег Аго ей Аго бег А5р АБротаг АТЗ Уа! туго туго сСує 85 50 35 діа Ага бі тТйготук Тут тук сіу баг Аїа ів Ра Ад5ротТуг тер ооїу 105 110 б5іп о біу так отвг оУуаї тВг оУаї бегобеаг 115 120 «іо» «2115 112 «2175 ПРТ «213» Штучна послідовність ч«ваОх «г23х Мі М2тан «Нюх» 10

Ар Ії ува! Меї тк обіп тВг оРго ів баг оїіец бак ма! Таговго о1у і 5 10 15 сій оБго АТа Зек ті 5Зег Суз Гуз Бек Зег біп Берг оієц 5іц НІ 5ег за деп о біу дап о твг отук гар одап тТгротук іац о біп їіу5 Рго біу біл баг за 45

Бго зіп о іецоігц її ТтуУг Аго Узі баг оі ув Ага вве бак обі уУуді вго 5о дер Ага Ре баг обіу баг обіу Заг обіу тТйг одер Ре тТВг о івец і Іа 55 та 75 о ак Ага Уа! 61 Аїа Бій Азр уві біу Уаі Туг Туг Суз ієц соіп г гц 25 0 35 так оНіз Уаї Рго Туг ТВг вБе соіу біп о1у ТВг оіуз Гец оіцб ІТЄ і уз 1350 105 110 «210: її «гії» 17

«від» ПпРТ «213» Штучна послідовність «220» «23» гуманизированная НУВ-Н2 «400» 11

Туг тів Ап оРго Туг А5п одер о біу баг оїуб тує Тег обвіц іу5 РВа бів 1 5 16 15

У

«гій» 12 «211» 16 «8125 ПРТ «213» Штучна послідавність «его» «223х НнУук-іі Мун «о» 12 їує баг баг о біп 5ек ів біб НІ баг дп сіу Аи тТВготук івец Ап 1 5 іо 15 «гій» 13 «211» 112 «12» ПпРТ «213» Штучна послідовність «ев «ве32 мі мата «Но 15

Ар оті узі Меї тнг осів тигоРго ггец бек ій бек УЩЗі тВеКоРГгО оі1у і 5 ів 15 іп о вго Аза бЗег ІТе бег Субз іу5 5ег бЗег зіп бБег оіен зіц бій 5ег го 25 за деп біу Ап отВг о туго івгц деп о тгротуг іеу сіп о іу5 Рго зіу зіп бег

Рго зіп о івцоівгц ІЗіе Туг Ага Щі Бег їу5 Ага РНе Бек о біу Уаії Рго

Бо дер ага РНе бЗег Біу бЗег сіу Бек сіу ТВг о Азр Ре тпйг оіен іуз Іі аа 70 Уа ко ек Ага Уаї б5іц Аза віц А5роУузі бі Уді Тук Туг Суз іван сій і гц

85 90 5 тТвг НІ Уа! Рго тТуг тТиг о РНе біу сіп о біу ТК оїуз ів біц т1тТе 1їу5 100 105 іїто «21025 14 «211» 16 «212» ПпРТ «2іЗ» Штучна послідовність «220 «223» нНУув-1і1 М2709 «00» 14 їуз Зег о бег піп о бЗег о Гец біцн сій бЗег дбзп о біу дза тйг туго гей зп 1 5 10 15 «210» 15 «211» 112 «218» ПРТ «213» Штучна лослідовність «ввОх «2235 УН 5278А «00» 15

Азр тів уа! Мет тпйг обі тйг оРго їеп обег їв о бЗег о уа1ї тТйг о Рго біх 1 5 іо 15 бій Рго Аз 5ег Іїа бек Су5 іу5 бБег бек бБіп бек івц бій Ап Аїа га 30 деп сі д5потиг туго івец доп о Тгротук ів бій 1у5 Рго зіу зіп Зег

Рго сіп о ец їв Іі Туг Ага Ууаї бег і у5 Аго Ре бег зі хаї Рго

Бо

Ав АгО РБа бек біу Бек біу бЗег зіу Тйг оАзр Ре ТК ієц і ув Ії 55 70 75 во хег ага хаї сі АТа сід аАб5роузі бі ув! Туг Туг Суб івн сів ге 85 о 5

ТВк нів Ууаі Рго Туг тТВг о Ра оі1у іп піу Тпгоїуз ін сін Ії і уз 100 105 110 «210» 16 «211» 16

«212» ПРЕ «813» Штучна послідовність «во» «223» нУук-Еі1 52УвА «пай» 15 іуз Баг баг біп Бак без ОН АБИ Аїа деп о1у АБИ тТАг туго іван деп 1 5 10 15 «210х 17 «2115» 112 «вії» ПР «213» Штучна послідовність «220 «ВиЗ» Мі 5ЗиуєМ «400» 17

Авротіе Узі Меї таг Осій ТИС оРКОо іец баг Бей бак узі тк овкоа пу 1 5 10 15 сіп вго Аа бег ІТе 5Зег Суб гу Заг обБег Зіп бБег оі ви 510 Азп Уа! 283 25 30

Азпосіу АзпотТвг о тТуУг іву деп Тгротуг ів обіп уз Рго оіу біп 5Зег а 45

Рко біп оівгн оїєц ІТе Туг Аго Уді Заг оіу5з Агу Ре бек обіу уаії Рго 5о дер Ага Рпе баг обіу 5ег сіу 5аг о піу ТВг о АБО вва тпг ів їіу5 ге 55 7 75 за 5Зег ага щі ЗіБ Аза офіц АвроУуаї бі Ууаії туг тТуг Сув ів біп і ец 85 зо 95

Те оНіз уаі вго Тук тТпг о РБе біу зів бБіу Так іує і2гу бі Іїв і у5 100 105 110 «210» і8 «211» 158 «812 ПРК «213» Штучна послідовність «220 «ве3з нНУК-іІ1 5гтах «0» 18 іуз Бег бег зіп обЗегоі гу зі А5зпоУаї а5п Біу А5п ОтТВг о туго і еб Ап 1 5 10 15 «810» 19 «гії» 112 «212х ПРК «213» Штучна послідовність «0» «23» Уї 52увРв «зах 13 азро тів Ууаії Мет тайгоБіп тТпг о вго іви о бегоіву бег оуді тВгоРго оіу і 5 13 15 іп РКО Аїа Баг ІТЄє 5ег Суб уз бег баг біп бек ів ої Аби РГО

Ап обвіу дзп о тТВг о тТуУуК Бец дп тТгротук ге о зійп губ Рго б5іу бій бек 30 45

Ркго віп іец о іец Ії ТУуг Аго уві бег оіуз ага РвБе о бБег зіу Уді Рго ва

АВр Ага РНе бег бі бег біу бек біУу тпг оАзо Ре тіг івц іуз ІЇЄ 55 7а 75 50 зак Ага Ууаі! бів Аза Біб А5роузі зіу УЩї тук тУук Сух іго біп і ги 85 20 35

Твгоні5 Уві вго туго ТВг о РБе біу зіп біу тіг іуз ігц бі те у 105 105 113 «гій» 20 «гії» 16 «212» ПРЕ «213» Штучна послідовність «вах «газ» нНУув- 1 5272аР «400» 20 їуз Звг обег о бзіп бБег оіву біц АзЗп Рго А5ип біу А5п отаг туго ге Ахп 1 5 ій 15 «2105 21 «211» 112 «212» ПРТ

«2135 Штучна послідовність «гей» «2283» МІ М250 «00» 81 азр тів уаі1ї Мет так обіп Таг о Рго івц обегоіву Зег о уаї ТВгОРго бі 1 5 10 15 б1поРгОо Аїа баг Іїє Зег Суб іуз бБег баг бій бЗег ге 51 Асп о бег 20 25 зо зіп сі Аза тиг отук ігец одвй теротук ієец о біп уз рРко сіу бій бЗаф

Рко віп іен о іер Ії тТуг адго узі бБег оі уз Ага вве баг о Бі Уді Рга в

Авр ага Рпе бег о біу бЗег бім бек бі тТг одер Ре тТг івц іуб ІЇв 55 7 75 50 зек дка Ууді сів Аїд Бі дер омазі бі Маї тує туг Суз ігр сіп і ец 85 о 35

ТвкЕ оні5 Уві Рго тугБ тТаг вБа оту іп сіу ТВаг іуз гц бої Ів 1 у5 100 115 1105 «210» 22 «гії» іб «від» ПЕТ «213» Штучна послідовність «о» «в83» нУув-11 к2ВО «400х 22 їуз Бег бБег сій бег оїец 01 Ап обегооій біу АЗзпотТаг о Туг ге Аза 1 5 10 15 «2100» 23 хаїї» 112 «12» ПР «213» Штучна послідовність квгох «гаї» У в2гЗА «4005 23

Ар оті Узі Меї твгобіп Твг оРркго ігор бегоїеу бек ма! те о Рго біу 1 5 10 15 сіп его Азїа бег І1Їв б5ег Су5з іуз баг о бег о біп бек оіац бі) А5п о 5ег го 25 за

А5п Ааїа Аза тйготуг іец деп тро туго іецн о біп гу5 Рго біу біп баг 35 30 45

Рго бБіп ігноівц Іїе туг Ага Ма) баг оіув Аго впе бак обіу Уаії Рга 50 55 ва

АБр о Аго Ре баг бі Заг обіу бак бі тТВйг о Абр Ре тк оівц іу5 118 70 75 во

Зак оаАго уа1і біц Аіа біз аАзр Уа? зі Ууді тТуг туг Суз ів іп ігц 85 зо 95 те оНіз Уаі го тТуг тТВгоРНе бсіу бій оіу тТБг оіуз Ге біо Ії г ув 100 105 110 «ій» 24 «211» 16 «21і2ж ПРЕ «8132 Штучна послідовність «ЗО» «г23х сб2зЗА НУД-ії1 «дпй» 24 іїуз Бег Бак б5іп Заг огец сіб Аєп баг Ап Аза АБИ ТК о тТУук і ви деп 1 5 12 15 «210х 25 «811» 112 «ВІ1гз ПР «213» Штучна послідовність «220х «гей» У ве «400» 25

АвБротіе Узі Меї таг осів тТпгоРко іец баг ге бак Уа! Такого о1у 1 5 10 15 сіп о Рго Аїа бег ІТе бег Суз іує баг о бБег обзіп бек оі ву б1ц Ап обег о 25 30

Азп оУуді Аза тпготук ген дзп о тТгротук іец біп іуз РКО сіу Зівп бег 35 30 45

Рго біп о іец оіго Ії Туг Ага узі Бег оіуз Ага Ре бек Бу Уді РгО 50 55 ва

Ар Ага вйпВ баг ошіу бегобіу бак о біу тТаг дер Ре ТК івц іуб ІЇв 55 70 75 50

Заг Аго Ууаі зіч Аїа Бій а5р Уа! с1у Уаї Туг туг Су5з іву бій ігй

За з5

ТЕБгоНіз Узі Рго туг ТВг о впе сіу іп о1у таг оіуз іец Зіц ІТє їу5 106 115 110 «10» 26 «гії» і6 «212 ПЕК х213» Штучна послідовність «В20» «е23» нУуК-і1 529У «400» 25

Гуз 5ег баг о біп зЗекогец зіц АБлоБаг АБи Узі ап отТиаг о тУК ву деп 1 5 10 15 «210» 87 «г1ї» 112 «212 ПРТ «213» Штучна послідовність «220 «г23» УН 5г7ерР,/М2В5 «3005 27

АБ Ії Узі Меї тагозійп тпгоРго іец баг оіец бег уа! тТйг о РгОо пу 1 5 іо 15 сіп его Аїа бег тів бег Су5х Гуз баг бек бій б5ек іа бій дп РГгГО го 25 30 ек сіу Ази тйг о туг іа АдБп о Тгротуг іеносіп уз Рго біу біп Заг

Рго бБіп ізн оівц Ії туг Ага Уа1ї Баг іУб Аго вБе бак обіу Ууа1ї Рга во 55 5о

Ар Ага ве баг осіу бЗегозіу Заг осіу тег о А5о РНа тпг івц і 118 7 755 80 зак Ага уаі! 5іч Аїз бій Азроуаї Зіу уві! Тут туг Суз ів зЗіп ігиц 85 За 95

Тьконіз уві Рго туг тег о вРБе сіу Бій с1у ТВгофїух гец сіц ІТВ 1у5 100 105 110 «21» 25 «г1ї» ів «212» пт «213» Штучна послідовність «вад» «223» нУуВ-і 1 5272еР/М285 «а» 25 іїу5 Бек баг біл баг оїегеу оф Ап о РКО 5екобіу деп отТвг ТУук о фец деп 1 5 10 15 «гій» 28 квії» 13 «2125 пПРТ «213» Штучна послідовність «22ах «23» сигнальний пептид «ОО» 29

Ммеї сіу ткр баг Суб Ії ІТ12е іа) ве івац УЗ) АТ тТВкК о АТа твгопіу 1 5 15 15

Уа! нів баг «210» за «21ї» 292 «212 пПвК «8135 Ното б5арігп5 «ай» за

Рго Зі біц Рго іец узі Удаії уз Ууді Зій біз зіу АЗзр о А5п діа ха 1 5 10 15 без бій сСуз іец ів біу ТВгобек о Абробіу Бго тьг бів бій івецй о тне го 25 Зо

Тгр о бЗек Ага біц Заг Рго івц і у5 Рго РНЕ ігц 1їуб5 ігу бегоігу бу 35 30 45

Кец РКО біу іги біУ ІТе Ні Меї Ага РгО їв оАїз Іч11а Ттрівц вве 50 55 ва

Ії8 РНе Ап о Уді ек сіп зіп Меї бі сіу Ре тТуг Гец Су5 іп о Рго 70 5 о

О1у Его Рго 5ег ЗШ ув Аза тгрооіп Рго зіу тгротвг ма! Ап ха! 85 За 35

БІЧ сіу бБег оіу біц іа) Рвпе ага тро оА5п Узі баг АБр і ву біу сіу 106 105 110 іп біу Суз бі іецн ух А5п о Аго Звгоб5ег зі біу Рго 5ег о бевг Рго 115 120 125

Бек сзіу 15 іа Меї бег Рго і уз ієц Туг о уаї тгтр Аїд і уз Або АГ 150 135 140

Рго бі ті тгробіц біу зіц вго Рко Су іву о вго РгОо АКа А5о бек 145 150 155 150 ій азп о зіп бЗег оіец бЗег озіп а5зроієц тйг о мМеї АїЗз Рго Зіу 5ег тАг 165 170 175 їЇген о тгроівн обег осСуз біу Узі Рго Рго АвробЗег уаї Зак одка о1у Рго 1556 1855 130 реч Бак тгротак Ні Уві Ні Рго ух О1у Рго іуз бек івц іву бек 135 200 205 їец сін і іу5 др Ар Аг РгОо Аіз дга дер Мет тго Уді Меї сій 210 215 го так Біу ген ів іа) вго Ага АТ тг АЇВ оіп Або АТа бі гу туг 225 25 гї5 240

Туг Суз НІВ Ага біу А5поїец тТАг о Меї баг РВе Ні гей сіц Іїе таг 245 2585 255

Аа АгОо Рго Уаї ішц о тгор Ні тгроієц ів Ага тВг осіу піУ тро ув 250 255 уа «210» зі «гії» 274 «2125 ПРТ «213» Масаса Тазстсціагтів

«00» 31

Рго зіп бін Рго і-й ув) Уаї уз Уді 51 бі о зіу А5р АБЗ Аїд Уві 1 5 10 15 бен сів о Суз ів бі оїУ ТБгобег оАБрооіж вго тАгобій зіпоігв Уді зо тТгросСуз Ага дер обБаг о вго Рпе сід вко Ре ів Ап іец Баг оівц бі

Їец Рго зіу Меї біУ Іт1їе дго Меї біу Рго ів біу Ії ттвівпігц во

Іа РБе а5п оУЗі бек одБп зів тВгозіу біу Ре туго іец Суб зіп вгО 55 70 75 о

Зім іа го баг вій іуУу5 АТЗ тТгРровівй Ркго біу тевотаг Уві бегоуд! 85 50 535 зін біу зег бі зіц о іец Рпе Ага о тгр ап Уді Зег А5ріво Ту віх 159 105 110 іец соту Су5 о1у їеш іу5 Або дго бег обаг о біц Зіу Ркго Заг о бек РгГО 115 125 125 бек біу іуз івц Азп о баг бек бій іен туго мві тер оАїЗз ух Ар Ага 130 155 1430

Рго вій Меї тгтрооіц віу зі Рго Уді Суб біу вго Рго АгОо Ар о5ег 135 152 155 165а іей Ап осоіп о бегоїіву бег о Зій Аб5роізу тагоМеї АТа Рго біу зЗеготвг 155 175 175 ігц откроієен заг Су ві Уа Рко РКО др баг уві бек АкО оіу РгО 158 155 15

Бе бБег отгротвг Ні Уаі АБО Рго іув зіу Рго їу5 Бег баг ів 1 гц 195 200 205

Заг іец сін іен іуз дБр о А5р АгОо РгОо АБроАго Ар оМаї тгроУуаі чаї 210 215 аа

Ар о тьг Біу ізн ге іги тпг о Ага АТа тйг о АТа оій АбБр АТа біу їуз ге5 250 23 249

ТуУуг Туг осСуз Ні Аго Оту д5п о тгротнг оіУу5 баг о вБе Туг іед бід те 245 250 255 тТнг о Аїа Ага Рго Аїд іву тгроНіЗз ттрівнііви Аго ї11е оіу біу тго 2556 265 270 уз Уа! «ій» 32 «ії» 55 «Фіг» ПРТ «2132 Ношо зарзейпе «00» 382

Ар отВг ОА оіец Суз АБа Ав бБег біу АТа Ні АТа ін о оіп Рго АЇа 1 5 10 15

Аіа Аїз ІТе ігц Аїа іецівен РгО Аза івец сіу гецівн о ггец ТгробБіу 29 25 зо

Его біу сіп і г 25 «тій» 33 «ії» 557 «Ріг» пПРТ «213» Ношо зартівепа «00» 33

Рго бій бій Рго гец о Уаї УЩаії іуз Уді бій Бій оіу Ар оА5а АТа Узі 1 з 10 15 їец сій Суб іву у біУу тВгобаг о двросзіу Рго тайгосіп віп іви о тАг 20 25 за

ТгроБег Ага бі баг Рго івец о іу5 РГО Ре іец іуз івц о бег гівгц зіуУ 15 40 35 їец Рго бБіу іц сіу І1фа Ні Межб Ага Рго ій Аа тів Тгтріви ве зо 55 50

Іа РБе А5п У Заг віп бій Меї сіу бі Ре Тук о івгц Суз бій Рго 55 750 75 во сіу Рго Рго бЗег бін іх Аа тгрозій вго біу ТтгротвК о Уді азпоУді 9о 55

Зі сіу бег біу бій ігцв Рбе Аго тгродбп Уа! бег Азріво О1у оту 100 і05 110 іез біу Су біу еп У Ап одга баг обег піц біу Ррго Бег бег Рго 115 126 125

Бек біу Гуз івц Меї баг оРго 1іу5 івц туго уаї Тгр Аа і ув А5р Аг 150 155 1430

Рго Зіц ІТе тгрооій зіу бін его Рго Су5 іви Рго Рго Ага д5р 5ег 145 іза 155 150 івц дзпозій 5ег ієц бек озій АзЗр о їец тВг меж Аза Рго зіу Бег о таг 155 170 175 іви ТтТкро Гей бег Сує Бі уаї РгОо РКО Ар бек Уа бак АКко ту вго 150 155 130 іец бек тгро тйг о нНіз Уа! Ні Рго іу5 сіу Бго іуз Бег ів ієц 5Зег 155 250 205 ін Зіц еп іуз АвЗр о аАзр Аг РБго АТа Ага дер Меї тгроуді Меє бі 210 2515 гей тТВг сіУу геш івц ів РГО Ага АВ тТВг Аза біп АБр Аа біу іу5 Туг 225 230 235 349

Тук Суб Ні Ага піу А5поївец тВг о Мет Бек вне нНіз іп офіц ттв таг 245 250 255

Аіа Акоа Рго Узі! іец о Тгр Ні Тгроіен ігор Аго тТнгосіу віу тгріхз 250 265 гуд

Узі Бек Аїд хаії ТИг ін АїЗз тук івгц Ії Рне Суз ін Су5 бег і ву гу5 250 285 чУуаї бі ІчІїе івец Ні ївц бів Аго діа гвц о Уаії іє ага Ага іу5 го 2950 255 зо іЇуУуз Ака Межє ТВг о Авр оРКго тТпг Ага Аго Ре Ре іуз Узі тВг оРго Рго 305 зій зів БУ;

Рго зіу бег о Ззіу Рго зіп дб5п бій туго біу д5п о уУді івн Баг о івен го 325 330 355

ТАгОРвРКОо тТВгобек зіу ге 5іуУу АгО Аза іп Аго тТгрАЇа Аїа біу і ге) 340 з4х 350 біу Біу тТвг о Аза Рго Бек о Туг біу ази Бго бБег бЗег дзр о худі бів Аа 355 650 385

Ахр о зіУу Аїа івцу бЗіу 5ег Ага бег го Рго біу Уа1ї бзіу Рго 5іц зіц

Зо 875 350 віп біц сіу Ззіц о сіу Туг біб Зіц Рго А5розекг біц 16 АЗробЗаг Оу 355 50 3935 300

РвВе тук зіц А5п Ар обек АхпоівБ біу сіп Ар овій іец баг бій др 455 410 415 сіу бБег аіу Туг сіш а5п Рго бій АЗр бін Рго ген озіу Рго ЗРО Ахр

420 425 430 сін аїр оЗег Рне бек А5п Аа зіц бег туг ій Ап бін АБО а Б 435 440 345

Сей о твг осів Рго УуЩі АТа Аго тв о Меж Аб5о РП івец бек Рго Ні оіу 450 455 450 5ек АТа Тр АБО РгО баг ага сій діа тб обБег оігц біу бегобів бег 465 379 АТ 450

Туг Би Ар о Меї Аг Біу Іч118е Бей тукг АТа АТ РгОо бБіп іецй аАго бег 355 490 зах тіе Ага біу Зіп РКО Біу РКго Ав НІ біц сій Ар о Аза Авробек туг зай 505 вій сіц Азп о Маї дб Аа Рго А5розіу Бго АБр о вго Аа тгровіу біу віу 515 529 525 бі Аг оМеї бЗіу тТйготго бег о таг Аго з32й 555 «2105 4 «211» 535 «12» ПРТ «Віз» Ното зарзеп: «ВО» 34

Рго віц бій Его іен о уді Уаї уз Уа! зіц о біц Зіу а5р Ап діа Уа! 1 5 10 15 їец аіп Суз іїец іх біу тТВг б5ег Ар осіу Рго твгобзіп віп ївецй твг

Тер бБег Аго бій бБес Рго івец о їу5 Рга Ре ів іуз іви о бег іго біх

Зо 45

Бей Еко біу гц о біУу ті Ні Меї дга РгОо ів) АїЗ тіе тгор їв Ре

БО тТ1єе Ріг АЗпохаї бек обіп бів Меї зіу О1у РБе Туг ів Су5 ій Бго 55 7 75 БО

Оіу Рко Рго бек Біц іу5 Аза ткр о біп Рго біу ткротйг Узі Ап Узі! 55 90 95 січ Біу Заг обі сід ген Ре дгоа тго о дхп Уві его др івн віу оіуУу 100 105 110 бе аіу Су зіу і2гц Гуз А5поАКо Бег бак Фоіц бБіу Рго Бег бБег РгГО

115 120 125 5ег сіу Гуз іен Меї баг Рго уз гбец туг Узі Тгр АїЗз Гу5 АБр АгО 150 155 1305

Рго біз І1іе тгрозіц б5іу офіц Бго Рго Суб гей вго Рко Ага Ар о бег 145 150 155 ії65а ін о дзпозіп бегоівеу бег обзіп д5роівев тВг оМеї дія Рго с1іу беготаг 1655 1705 175 іец тгр оіен бЗег Суз бБіу чаї РКО Рго Абробег Узі бак Аго с1у РгО 150 185 153 іец Баг тго тк о нів ді Ні Рго і у зіу РгОо уз бБег іац іец Баг 135 200 205 ів бБіц івгн о іух А5р Ар Аго РгО А13 Аго Ар о меї Тгро Уа)! Меї біц 210 215 чи: тТнгосіу ей ген ге Рго Ага АТа тпг оАТа бій Азр о АТа сту 1у5 тТук тез 230 235 240

ТуУук Су5 нів Ага бі д5п о гец ТВг оМеб бег о вве ні гвец о біц Іа так 245 5 255

АЗіа Ага Рго УЗі іец тгроніз тгрієц ів аАго тВг о сіу шіу трріув 250 255 270 уаї Заг Аїз Удаі ТВгоіец АТЗ Тук іен ті Рбе Сух Гец Суз бек і ги 275 280 255

Уаї сіу тів ів Ні ів о біп Аго дід ін оУуаї Евеб Аго Ага 1у5 Ага 290 255 зай

Гуз Ага Мет тг одБр о Рго тТвг о АгОо Агд Бе Ре уз Ма) ТАгОРгО РгОо зо5 зів 15 329

Ро зіу бег о біу Рго віп А5побіп туго біу А5п уві іаец бБег і веи РгО 125 330 3535

ТИгОоРго тйгобег о біу і) зі АГРО Аїа іп Аго тгроАїЗ Аїа бі івц 345 з45 350 сіу зіу тВК Аїд Рго бБег Тук біу АЗзп о вго Заг бек а5р Ущі сію АВ 355 з5о 355

Авросіу Аїа іван о біу Зег Агоа бак вка Рго біу Узі Бі Рго біб оц 370 375 зво сід січ зіу зіц біУу Туг зіц біц РКО дер озек бій Зц Ар зек оц 355 зо 155 оо тепа туг він А5п др обег ап іенобіу піп д5рооівп івнобег бій д5р 410 315 сіу Баг біу туг Ой деп РКО Бій дзЗробіц Рго ів о о1у вго бій АБ 320 425 їзо

Зіни азр бег Ре 5ег А5п АТїВ оій Зег о тук зіц А5п обіц А5розіц ій 435 440 445 іви тйгосів вго Уаї АТа Ага ТТГ о Меї Ар Ре ів обег го НІб сіу 450 55 450

Бек Аіїа Тер оАзр о Бго бек Агор біб Аіїа тТВг о бЗег оівн Аза зіу Зег бій 355 470 475 Бо

Зак отуг зід др Меї Аго біу тів івгц о Туг Аза Аіа Рго біп гей Аго зо 435 ваг тів Ак віу бій Рго б5іуУ РгО Аза Ні Бій бів А5роАтТа А5р бек 5050 зх 510 тук Бій дзп МЕЖ АЗр ОА Рго АБрозіУ Рго А5о РгГОо Аза тго ові свіу 515 Б2гй 525

Зіу сіу Ага Меї біу тТВг оТгробег тиг дга 530 535 «210» 35 «гії» з1 «212» пРТ «2135 Штучна послідовність «ВО» «223» Фрагмент антитіла для аналізу МО кгейх «1» МІБЗС РЕАТуКЕ «ай» (85)..С83 «223» Х 5, В, А «во» «21» МІ5С РБЕАТУВКЕ «Ева» С0103..с03 «гаї» х ж ОоОогА «00» 35

Зег бБег сіп бБег ів зіц АЗзп о Хаа Азп о Хаа ап тйготуг іец два тер і 5 10 15

Тук Гей зіп ія Рго біу зіп бБег Рго б5іп ізц ів Ії тТуг Аго зо «10» 36 «211» 5 «2122 ПРТ «2132 Мив ти5сиіц5 «00 55

АвпобБег ап Бі Аа тТВг і 5 «10» 37 «11» 4 «Вії» ПРТ «213» Ми тузси1й5 «00 37 ру Ре дп 1у ії «210» 38 «вії» 5 «12» ПРТ «213» Штучна послідовність «го» «223» гуманізований Фрагмент НУК-НО з мутацією Мб40 «400з 35

ТВг ост Гуз Ре бів біу і 5 «10» 39 «211» 8 «г122 ПРТ «2152 Штучна послІДОВНІіСТЬ «вейх «23» гуманізований фрагмент НУК-1і1 з мутацією 5276 «400» 39 їгц оц АБИ РКО Ап о ОТУ дБ ОТ 1 5

«2102 40 «1ї» 5 «12 ПРТ «2152 Штучна послідоЕНіСТЬ «220» «223» гуманізований Фрагмент НУК-11 з мутацією 527ар/М2855 «3005 40 їгц 010 АЗп РКО Зег о біу Аза о таг 1 5 «210» 41 «211» 18 «212» пет «213» Штучна послідовність кегох «223» дінкер «00» 41 сі сіу бег 01у біу 2іу в5іу зак біу с01у бБіу зіу бБег с1у вію щу 1 5 10 15 сЗіу зЗег «51оО» 42 «811» 15 «212» ПРТ «2152 Штучна послідоЕНіСТЬ «го» «23» фрагмент людського рецептора тозноеФферину «ОО» аг

ІчІТеє сіу б5іп Азп о Меї Узі тВготів Уа) зіп бег А5а біу азп ів 1 5 10 15 «2105 43 «311» 15 «2і2з ПРЕ «213» Штучна послідовність чага» «223» фрагмент людського рецептора трансФферину «ай» 43

Авп Мет Уа! тк о ІТ заї бїй бБег А5п о О1у АбЗп ів Абр вго Уві 1 5 10 15 «2105 44 «гії» 15 «212» ПРТ «213» Штучна послідовність «220» «га» фрагмент людського ренептора трансФферину «400» 44

Зіп о бБег А5зп бТу Азпоіен Азр Рго Ууаї біз бЗег Рго бін о1іу тТуг і З 10 15 «210» 85 «вії» 32 «Ріг» ПРТ «2125 Штучна послідовність «вддх «283» пептидниМм лінкер «ОО» 45 сіу 5іу бБіу біу Заг біу шіу біу Біу бек о сзіу біу віу Біу бек сіу 1 5 10 15 сіУу Біу піу бек сіу швіу Біу зіу заг піу Біу біу піу бек біу віх «210» 46 «211» 115 «21225 ПРТ «215» Ми5 ви5сИпіцв5 «400» 45 сій Уві бій бец Узі бій баг обіу біу б1іу ївц уаї бій Бго Біу деп і З 10 15 5екг івц тВгоїви 5егоСу5 Уаї Аїа Бег біу Ре тТпг о РБе баг деп о туг 20 25 зо свіу Межї Ніз тгроІЇїв ага іп Аїд Рго іух Гуз оіу івц сі) Тгро тів 35 30 45

Аа Меї Іїе туг туг Ар баг Зег іу5 Мет А5потугк АТа Ар отаг ха 50 55 БО іув 0іУ Аго Ре таг оІіе 5ег АгО о АБродявп Баг о фу Ап отпг і ву тут 55 70 75 50 ін 5іц Меї Адяп Заг оіец Аго бег сій АБротВг о АТа Меї Туг туг сСуг о з5

Атаз уаі Рго тпг обег ніЗ туго узі Уаї аА5р уаї тгрошіу Зіп о б1у ха 100 115 110

Зак Ууаі тТвг Узі бек бБег 115 «гій» 47 кгії» 107 «812» ПпРТ «213» Мив тизсніце «300 47 аз жі сів Меє твкобБіп бак Рго Аїа бБег оіву бег Аїа бек оіецй бі 1 5 15 15 іч тіе УЩзі тйг оті тк оСу5 сій Аїа баг обіп АзроїТе б1у Аєпотго 20 25 зо ей Аїз тгвротуг зіп віп іу5 Рго зіу ів баг Его піп ів іец тіє 35 430 45

Туг аіу Аїа тТВг обег оі2ги Аз АзробБі Уаї Рго бек Ага Ре 5ег пу 50 55 ви

Зак Аго Заг обі Так обіп Рйе б5егоівц ія ІТе бег Аго Узі Зіп Уа! 55 70 75 о сін др тів біу тіє Туг Туг Суз ієец о бзіп Аа туго АБИ ОТВК РКО то 85 зо 535

ТЬеЕ РНе сіу біу шіу Тг іуз іец біб івец ік 105 «гій» 45 «21ї» 107 «гі12» Пет «2іЗ» Штучна послідовність

«вгОх «2232 варіант 1104У 1 131061 5БЕО І МО: 57 «ВО» 45

Азор о ІтІТїе сбіп Меї тпгоБіп баг оБго Аіа 5Зег іец бек Аїд бБег гівгц оц 1 5 і 15 ій тІТе уаї тб о ІїІЇїе твг осСуз сів Аїа бЗегє о біп Абр тів біу Азп о тгр 20 25 30 іви Аіз тк отуУк сій бів іу5 вго біу іу« баг Рго віп іен ів Ів 35 40 45

Тук щ1Уу АТ тиг о бЗегоїівц АтТа АЗзросіу Уді Рго бек Ага Рпе 5ег бвіу ха 55 о ак Ага Заг обі Тпгобіп Рпе бек ієц і ує ІТ бек Ага Ууаї бій Узі 7о 75 ва бій Ав Отто бзіу 11іе тТуг туг Суз ів бій АТа Тугодеп о таг о вго тгр 55 за 55

ТВЕ Рне сіу сіу біу тТВг о іуз Ууаї Зіц ІТ 1 уз 1683 іо5 «ій» 49 «211» 127 «іо» пПРТ «213» Штучна лослідсвність «ве» «223» гуманізований варіант ПАБО УНН 295-023 «Од» 49 сіп зЗзегоМеї іп сі бЗегобіу Рго сіу іец о Ууаії іу5 Рко бЗег о аіп тег ії 5 10 15 їгц бек огец тве оСуз тТВге о Уаї бек обіу Ре Зег іви бек Зег о Туг АТа 23 50 меї Заг отгр тів Ага віп Ні Рго бі іу5з біу ів бій тгрот1ів зіу тУук тІТе Тгр бек Зіїу біу Бег тТВг Ар отук А1їа бек тро Аза іх 5ег

Зо 55 50

Ага уві твг о ІТа бек іуб5 ТНг бек твге о тйпг о Узаї Зек івц іуз іго бер 65 то 75 80

Зег Уді тйг Аїа АТа Ар оОтТвг Аа уаї туго тук Су5 АТа Ага Агд тут 55 за 55 біУу твгобБег о туг Рко др отТук о сіу Азродіа баг оту Ре АЗровБга то 100 105 110 сіу сів зіу тпгобен чаї ТБг ота! 5ег о бег 115 150 «105 59 «211» 110 «ід» ПЕТ «2ї13х Штучна послідовність «ад» «283» варіант гуманізації МУА У 255-009 «Мох» 50

Аза Ії сіп о іев тТБгозіп обЗег о вго бБег обЗег оі-ец Зег дія Зег о Ууді О1У 1 5 10 15

Авр Ага узі тВг оті тагоСуб5 АгЯ АЇїЗ Баг бій баг ІТ баг о б5ег Ттук 20 25 зо їец Аїа Тер отуг сів біп іуз Рко со1у ув Аїа РгОо гу5 беч і ви те 35 40 45

Туг Ага АїЗ бЗег тпгоіви дія зве об5ім Уа вго Заг о Ага Ре бег 1у 50 55 во

Зег біу бБег біу ТБг о Ар о РНе ТК оіецу твг о Іїе 5ег о бЗег іє зп РгО 70 75 50 сіц АБровйпа Аїа тиготТук туго Суз бій зій АБИ Туг АТЗ баг о бБег Ап 50 з5

Уаї Азроазп типг Ре бзіу зіу Біу Тпг іу уві ОБ Ії12е 1 у5 1 105 110 «21О0х 51 «гії» 7 «Вій» ПРТ «її» сгУустоЇіадив сипісціце «й» 5 сіу Рйпа баг ігц бБег о бег Тук ї 5

«210» 52 «11» 5 «212» ПЕТ «ві3» Огустеізацз суптевіц5 «00» 57

Тер бек сіу біу баг і 5 «10з 553 «211» 17 «2122 ПЕТ «213» Огустоізвиз супісніце5 кох 53

Ага Тук о Біу ТНг оБаек отТуг РгОо А5ротТуг біу А5р Аїд А5п о біу Ре Ар і з їз 15

Рго «10 54 «211» 17 «212» Пет «213» Штучна послідовність «г «223» НУуКк-НІ ВАБО 253-000 «ОО» ва

Ага тук о біу ТВкК бак тук Рго дхротуг п1у АЗр о АТа бек о біу РКе дер і 5 10 15

РКО

«іо» 55 «вії» 17 «Різ» ПРЕ «2132 Штучна послідовність «во» «ве3» нНУК-НІ ПАС 259-000 «ОО» 55

Акд о тук осіу ТНгЕ Заг о Туг Рко Абротук біу Азр Аїд іп б1Уу Ра Ар ії 5 іо 15

Рго «10» 56 «21ї» 11 «212 ПРЕ «213» Штучна послідовність «Вей» «223» нУК-11 ВАА 283-000 «4005 55

Ага Аїз Бак бій бек Іїеє бак бег туго івц Аїз і 5 10 «2105 57 «211» 7 «212» РТ «215» Огустоїідпи5 сопісцівз «400» 57

Ага Аїз Баг тпгоіїіву АтТа бег 1 5 «210» 58 «211» 12 «212» пет «213» Штучна послідовність «20» «г23з НУК-1 З МУЖА 299-003 «3005 58 зіп сів АБп туг Аіа баг обЗег о а5п о УВІ А5роАБп отаг 1 5 10 «2105 55 «211» 12 «еі2» ВЕТ «213» Штучна послідовність «гей» «223» варіант послідовності С «400» 59

Ззіп о зегоівгц о біч А5п оЗег А5побБіУу А5потТВг о тТуг гц 1 5 10

«гі» БО «21ї»х 12 «212» ПРЕ «213» Штучна послідовність «ва» «223» взріашнт послідовності іс 1 «-300» 60 сій баг оівн обіц Ніз бЗег о дзпобіу Аа твготук г ги 1 5 10 «гій» 561 «гії» 12 «212» ВР «213» Штучна послідовність ква «В23» варіант послідовності С 2 «400» БІ

Зіп бек оівц зіц о зіп бак о д5п о1у Ап о тВг тугі ей 1 5 10 «гі» 52 «21ї»х 12 «212» ПпПРт «213» Штучна послідовність «вд» «223» варіант послідовності іс 3 «3005 62 сів бегоівни обіц д5п Аїда АЗп обіу Аа таг отТук г гц 1 5 15 «21іп» 53 «21ї» 12 «гід» ПРЕ «213» Штучна послідовність ква «В23» варіант послідовності С 4 «400» 83 сіп 5ег іец 510 Аа Уаї АЗп о БіУ А5п о тВг о тТук і гц 1 5 10 «210» ва кЕ11» 12 «Із пет «213» Штучна послідовність «ее» «23» варіант послідовності С 5 «ОО» 54

Зіп бЗег оігу бі Аза Рго Ап осбіу Ап оте тук іє 1 5 10 «10 65 «2115 12 «212» пет «213» Штучна послідовність «ВгОх «223» варіант послідовності С 6 «йо» 65 сіп бек оггцо бі деп Зак обійп зіу Авбпотйг туго і гу 1 5 їз «21025 56 «2112 12 «12 ПРТ «13» Штучна послідовність «220» «223» вартзнт послідовності С 7 «ОО» б

Зіп бег іви Бій А5п о Бег А5п Аз Ап тТВг Туг гей і 5 10 «2105 587 «гії і «212 пПРТ «2152 Штучна послідовність «гг» «гі» варіднт послідовності С 5

«30п0» бу сів бегоівн обіц д5п обЗег дзп о Узі Аа таг отТук гг 1 5 18 «гіп» 68 «гії» 12 «812» ПРТ «213» Штучна послідовність «г20х «23» варіант послідовності С З «00» 58

Зіп Зек оівц зіц А5п о Рго его о1у Ап о тВг туг і ей 1 5 10 «810» 59 «г1ї» 10 «гід» пет «21325 Штучна послідовність «20» «228» варіант послідовності НС 0 «300» 65

Твгобіц іуз впе А5побіу Гуз АТ тіг ої єн 1 5 10 «210» 70 «гії» 10 «212» ПРЕ «2і3» Штучна послідовність «вгх «В23» варіант послідовності НС 1 «400» 70

Твгосін іуз Ре зіп о біх ага Ууді таг мех

Claims (14)

1 5 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО19 людини, де дане антитіло містить: (а) НМЕА-НІ (гіперваріабельна ділянка важкого ланцюга 1), що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 03, (б) НМА-НХІ2, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 11, (в) НМА-НЗ, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 05,

(г) НМА-І1 (гіперваріабельна ділянка легкого ланцюга 1), що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20 або 28, (д) НМК-12, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 07, і (є) НМА-І3, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 08.

2. Антитіло за п. 1, де дане антитіло являє собою моноклональне антитіло.

3. Антитіло за будь-яким з пп. 1-2, де дане антитіло являє собою людське, гуманізоване або химерне антитіло.

4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де дане антитіло являє собою фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з СЮО19 людини.

5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, де дане антитіло містить: (а) послідовність МН (варіабельний домен важкого ланцюга), що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 09, і послідовність МІ. (варіабельний домен легкого ланцюга), що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 19, або (б) послідовність МН, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 09, і послідовність МІ, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 27, або (в) послідовність МН і послідовність МІ, таку ж, як в (а) або (б).

6. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-5 і фармацевтично прийнятний носій.

7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5 для застосування як лікарського засобу.

8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5 для лікування В-клітинного раку.

9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5 для застосування в виснаженні популяції В-клітин.

10. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-5 у виготовленні лікарського засобу.

11. Застосування за п. 10, в якому лікарський засіб призначений для лікування В-клітинного раку.

12. Застосування за п. 10, в якому лікарський засіб призначений для виснаження популяції В- клітин.

13. Спосіб лікування індивіда, що має В-клітинний рак, який включає введення даному індивіду Зо ефективної кількості антитіла за будь-яким з пп. 1-5.

14. Спосіб виснаження популяції В-клітин у індивіда, що включає введення даному індивіду ефективної кількості антитіла за будь-яким з пп. 1-5 для виснаження популяції В-клітин.