[go: up one dir, main page]

UA111722C2 - Протираковий злитий протеїн - Google Patents

Протираковий злитий протеїн Download PDF

Info

Publication number
UA111722C2
UA111722C2 UAA201300877A UAA201300877A UA111722C2 UA 111722 C2 UA111722 C2 UA 111722C2 UA A201300877 A UAA201300877 A UA A201300877A UA A201300877 A UAA201300877 A UA A201300877A UA 111722 C2 UA111722 C2 UA 111722C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
domain
zeo
protein
fusion protein
Prior art date
Application number
UAA201300877A
Other languages
English (en)
Inventor
Єжи Щепан Пєчиколан
Себастьян Домінік Павлак
Бартломєй Мацєй Жерек
Кжиштоф Казімєж Лемке
Original Assignee
Адамед Сп. З О.О.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Адамед Сп. З О.О. filed Critical Адамед Сп. З О.О.
Publication of UA111722C2 publication Critical patent/UA111722C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/80—Cytochromes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід належить до злитого протеїну, зокрема рекомбінантного, що включає домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну hTRAIL, причому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж hTRAIL95, або послідовності, яка має, принаймні, 70 % гомологію до названого вище, і домен (b), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці С-кінця і/або точці N-кінця домену (а). Злитий протеїн має протиракову активність. Розкрита фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт злитий протеїн.

Description

Винахід належить до злитого протеїну, зокрема рекомбінантного, що включає домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну ПТВАЇЇ, причому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж ПТ ВАЇ! 95, або послідовності, яка має, принаймні, 7095 гомологію до названого вище, і домен (Б), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, при цьому послідовність домену (б) приєднана в точці
С-кінця і/або точці М-кінця домену (а). Злитий протеїн має протиракову активність. Розкрита фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт злитий протеїн.
Винахід відноситься до області терапевтичних злитих протеїнів, зокрема, рекомбінантних злитих протеїнів. Більш конкретно, винахід відноситься до злитих протеїнів, що містять фрагмент послідовності розчинного людського ТКАЇЇ протеїну в поєднанні з послідовністю короткого проапоптотичного пептиду, до фармацевтичних композицій, що їх містять, до їх застосування в терапії, зокрема, в якості протиракових речовин, і до полінуклеотидних послідовностей, що кодують злиті протеїни, до векторів експресії, що містять полінуклеотидні послідовності, і до клітин-господарів, що містять зазначені вектори експресії.
Апоптоз (запрограмована загибель клітини) являє собою процес, який відіграє важливу роль в запобіганні раку і в лікуванні ракового захворювання за допомогою речовин, які індукують апоптоз аномальних ракових клітин.
Сигнал до апоптозу може бути ініційований ззовні клітини (зовнішній шлях або шлях рецептора загибелі) або зсередини клітини (внутрішній або мітохондріальний шлях).
Активація зовнішніх шляхів апоптозу в ракових клітинах людини вимагає зв'язування ліганду рецепторами загибелі клітини, щоб активізувати рецептори. При зв'язуванні ліганду активовані рецептори індукують сигнали апоптозу.
Ініціювання власного (внутрішнього) апоптозу всередині клітини по мітохондріальному шляху може бути розпочато на різних рівнях апоптотичного каскаду, щоб, нарешті, привести до індукування або відновлення функцій проапоптогенних протеїнів (цитохроми С, 5тасбОіабіо, АР, роз3, сімейство Всі2 протеїнів, включаючи сімейство домену ВНЗ), деградації нуклеїнових кислот або активації каспаз.
Протеїн ТКАЇЇ,, що належить до сімейства цитокінів (ліганд, що спричинює апоптоз, який має відношення до фактору некрозу пухлини), також відомий як Арог2!. (Аро2-ліганд), є потужним активатором апоптозу в пухлинних клітинах і в клітинах, інфікованих вірусами. ТКАЇГ. є лігандом, що природно виникає в організмі. Протеїн ТКАЇЇ, його амінокислотна послідовність, що кодує послідовності ДНК, і системи експресії протеїну, були вперше розкриті в ЕРО83530О5А1.
Протеїн ТКАЇЇ проявляє свою протиракову активність, зв'язуючись з проапоптотичними поверхневими ТКАЇГ рецепторами 1 і 2 (ТВА -К1/К2) і забезпечуючи наступну активацію цих рецепторів. Дані рецептори, відомі також як ОКА і ОК5 (рецептор загибелі 4 і рецептор загибелі 5), належать до сімейства рецептора ТМЕ (фактора некрозу пухлини) і піддаються надекспресії
Зо з боку різних типів ракових клітин. Активація цих рецепторів може індукувати зовнішній сигнальний шлях апоптозу, незалежно від гена-супресора р53, який активованою каспазою-8 призводить до активації виконавчих каспаз і тим самим - до деградації нуклеїнових кислот.
Каспаза-8, вивільнена після активації ТКАЇЇ, може також спричинювати вивільнення Віа протеїну і тим самим - непряму активацію мітохондріального шляху, при цьому Вій протеїн, транслокований до мітохондрії, де він стимулює вивільнення цитохрому С, таким чином, опосередковано посилює апоптотичний сигнал від рецепторів загибелі.
ТКАЇГ/. вибірково впливає на пухлинні клітини, по суті, не спричинюючи апоптозу в здорових клітинах, які стійкі до цього протеїну. Таким чином, ТКАЇЇ,, володіючий величезним потенціалом, був визнаний протираковим засобом, що впливає на широкий діапазон різних типів пухлинних клітин, в тому числі гематологічних злоякісних новоутворень і щільних пухлин, але, в той же час, не впливає на нормальні клітини і має відносно невеликі побічні ефекти .
Протеїн ТКАЇЇ представляє собою протеїн мембранного типу ІІ, що має довжину із 281 амінокислот, при цьому його позаклітинна область, що включає 114-281 амінокислотних залишків, після розщеплення протеазами утворює розчинну молекулу 5ТКАЇГ. розміром 20 кДа, яка також є біологічно активною. Обидві форми ТКАЇЇ і 5ТКАЇЇ здатні запустити механізм апоптозу через взаємодію з рецепторами ТКАЇЇГ, присутніми на клітинах-мішенях. Сильна протипухлинна активність і дуже низька системна токсичність розчинної частини молекули
ТКАЇЇ. була продемонстрована із застосуванням тестування клітинних ліній. Крім того, клінічні дослідження людини на рекомбінантний людський розчинний ТЕАЇЇ (ТТТЕКАїЇЇ), що має амінокислотну послідовність, відповідну амінокислотам 114-281 з НТЕАЇЇ, відомий під назвою
ІММ ашапетгтіп (дуланермін), показали його хорошу переносимість та відсутність токсичності, що обмежує дозування.
Останні дослідження показали, що протеїн ТКАЇЇ може мати форму коротшу, ніж амінокислоти 114 - 281, а також те, що в такій формі він здатний зв'язуватися з мембранними рецепторами сімейства ОК (рецепторами загибелі клітини ОК1, ОК2, ОсК1, ОсК2 і ОРО (О5іеоргоїедегіп)) і індукувати апоптоз через ці рецептори (Е., ЕАМО, А., МАМО, 5., Е., МАМО,
Апійитог асіїмпу ої а поме! гесотріпапі тшапі питап їштог песговів Тасіог-теіаїед ароріовів- іпдисіпу Ідапа (Протипухлинна активність нового рекомбінантного мутантного людського апоптоз-індукуючого ліганду, що має відношення до фактору некрозу пухлини), Асіа 60 Ріпаптасоїіодіса біпіса 2005 Мом; 26 (11): 1373-1381.
Дана інформація про токсичний вплив рекомбінаногого протеїну ТКАЇЇ. на клітини печінки, ймовірно, пов'язана з наявністю модифікації, тобто маркувань полігістидину, немарковані ТЕАЇЇ. не демонструють системної токсичності
Однак у ході подальших наукових досліджень і розробок, виявилося, що багато ракових клітин також демонструють первинну або придбану стійкість до ТЕАЇЇ (див., наприклад,
УМО2007/022214). Хоча механізм стійкості відносно ТКАЇГ!. до кінця не вивчений, вважається, що вона може проявлятися на різних рівнях ТКАЇЇ-індукованого шляху апоптозу, починаючи від рівня рецепторів на поверхні клітини до виконавчих каспаз в межах сигнального шляху. Така стійкість обмежує корисність застосування ТЕАЇ!. в якості протиракового засобу.
Крім того, в клінічних дослідженнях пацієнтів дійсна ефективність ТКАЇЇ в якості монотерапевтичного засобу виявилася низькою. Щоб подолати таку низьку ефективність і стійкість пухлин до ТЕАЇЇ, були розроблені різні комбіновані лікувальні методики із застосуванням радіо-і хіміотерапевтичних засобів, у результаті яких досягався синергічний апоптотичний ефект. (ММО2009/002947; А. АІтазап апа А. АзпКепа?і, СуїоКіпе СгоулЛп Еасіог
Кеміем5 (Про цитокіни, фактори росту) 14 (2003) 337-348; КК 5гімазіама, Меоріавіз (Неоплазії),
МО! 3, Мо 6, 2001, 535 - 546, Богіа УС еї аї., У. Сііп. ОпсоїІоду (Клінічна онкологія), Мої! 28, Мо 9 (2010), р. 1527-1533|Ї. Використання гпТКАЇЇ для лікування раку в поєднанні з вибраними звичайними хіміотерапевтичними препаратами (паклітаксель, карбоплатин) і моноклональними анти-МЕСЕ антитілами описано в документі УМО2009/140469. Тим не менш, таке поєднання обов'язково пов'язане з добре відомими недоліками, властивими традиційній хіміотерапії або променевій терапії.
Сконструйований злитий протеїн, що містить послідовності вазостатину інгібітора ангіогенезу і ТКАЇЇ, зв'язаного 3 лінкером (компонувальником) сайту розщеплення металопротеази, був описаний у вигляді речовини, що демонструє апоптоз-індукуючий ефект в пухлинних клітинах, авторами АІ Сицо еї а іп Спіпезе Уоштаї! ої Віоспетівігу апіа МоїІесшіаг
Віоіоду (в китайському журналі "Біохімія та молекулярна біологія") 2008, мої. 24 (10), 925-930.
Сконструйований злитий протеїн, що містить послідовності тумстатину (Типтвіайнп183-230) інгібітора ангіогенезу і ТКАЇЇ 114-281, був описаний у вигляді речовини, що демонструє індукцію апоптозу клітин раку підшлункової залози, авторами М.Кеп еї аїЇ іп Асадетіс дошигпа! ої Зесопа
Зо Міїйагу Меадіса! Опімегейу ( в академічному журналі Другого військового медичного університету) 2008, мої. 28 (5), 676-478.
Документ Ш52005/244370 і відповідна публікація УМО2004/035794 розкривають конструкцію
ТААЇІ95-281 в якості ефекторного домену, зв'язаного пептидним лінкером з позаклітинною частиною іншого члена СО40 лігандів сімейства ТМЕ в якості клітинна поверхня - зв'язуючого домену. Встановлено, що активація конструкції здійснюється через зв'язування її СО40 частини.
Крім того, ТЕАЇГ/. терапія не була позбавлена проблеми, яка полягала в низькій стабільності
ТЕАЇГ. і його швидкому виведенні з організму після прийому.
Незважаючи на те, що в даний час існує велика кількість клінічних методик лікування раку, вони часто недостатньо ефективні і мають безліч добре відомих недоліків, серед яких одними з найбільш неприємних і таких, що обмежують лікування, є відсутність вибірковості по відношенню до ракових клітин, серйозні побічні ефекти і резистентність, яка є первинною або набута під час лікування. В даний момент відома обмежена кількість протиракових засобів, які є ефективними і вибірковими відносно ракових клітин. Таким чином, залишається нагальною та актуальною потреба в нових протиракових препаратах, які дозволили б не тільки розширити спектр доступних засобів, але і знайти засоби, які є більш ефективними (цитотоксичними) і одночасно -- вибірковими (селективними). Існує також потреба в нових селективних речовинах з підвищеною стабільністю і поліпшеною фармакокінетикою.
Даний винахід пропонує рішення поставленої технічної задачі за допомогою нових злитих протеїнів, які містять домен, похідний від ТЕАЇЇ., і короткий ефекторний пептидний домен, без фрагментів ТКАЇЇ, що мають власну (внутрішньоклітинну) або зовнішню (позаклітинну) проапоптотичну активність, яка посилює або доповнює дію ТЕАЇГ. Крім того, з'ясувалося, що у багатьох випадках злиті протеїни за даним винаходом демонструють більш високу активність, ніж розчинний ТЕКАЇЇ і його варіанти, в тому числі і фрагмент послідовності, а в багатьох випадках також долають резистентність до ТКАЇЇ. Крім того, додавання єфекторного пептиду призводить до більш тривалого періоду напіврозпаду і збільшення проміжку часу утримання протеїну в пухлині і, нарешті, до підвищення його ефективності.
Опис ілюстрацій.
Далі наводиться докладний опис винаходу з посиланнями на ілюстративний матеріал, де:
На фіг. 1 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом 60 відповідно до прикладів 1, 2, 3, 4, 5.
На фіг. 2 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 6, 7, 8, 9, 10.
На фіг. 3 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 11, 12, 13, 14, 15.
На фіг. 4 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 16, 17, 18, 19, 20.
На фіг. 5 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 21, 22 і 23, а також для порівняння - злитих протеїнів відповідно до прикладів 24, 25 і 26.
На фіг. б дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 27, 28, 29, З0 і 31.
На фіг. 7 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 32, 33, 34, 35 і 36.
На фіг. 8 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 37, 38, 39, 40 і 41.
На фіг. 9 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 42, 43, 44, 45 і 46.
На фіг. 10 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 47, 48, 49, 50 і 51.
На фіг. 11 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 52, 53, 54, і 55.
На фіг. 12 представлено зміну обсягу пухлини в часі у мишей 5СІЮ / МОЮ, хворих на рак товстої кишки Соїо205, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з НТКАЇЇ-114-281.
На фіг. 13 представлені значення показників уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на рак товстої кишки СоІо205, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 29-й день експерименту, у порівнянні з ПТКАЇ- 114-281.
На фіг. 14 представлено зміну обсягу пухлини в часі у мишей Стгі: ЗНО-Ргкасзсіангтйг, хворих на людський рак легені МСІ-Н460, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з НТКАЇ- 114-281.
На фіг. 15 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людський рак легені МСІ-Н460, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 29-й день експерименту, у порівнянні з ПТКАЇ- 114-281.
На фіг. 16 представлено зміну об'єму пухлини в часі у мишей Сті: ЗНО-Ргкасзсіангйг, хворих на людський дрібноклітинний рак легенів А549, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з ПТКАЇЇ- 114-281.
На фіг. 17 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людський дрібноклітинний рак легенів А549, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 34-й день експерименту, у порівнянні з ПТКАЇ- 114-281.
На фіг. 18 представлено зміну об'єму пухлини в часі у мишей Сті: БНО-РікасзсіаНийг, хворих на людську карциному підшлункової залози, що є подібною епітеліальній клітинній лінії РАМС-1, які отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з ПТКАЇ114-281.
На фіг.19 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людську карциному підшлункової залози, що є подібною епітеліальній клітинній лінії РАМС-1, які отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 43-й день експерименту, у порівнянні з НТКАЇЇ-114-281.
На фіг. 20 показані спектри циркулярного (кругового) дихроїзму для злитих протеїнів за прикладами 1, 2, 14, 24, 51 ії 42 та для гпТКАЇІ114-281, експресованих у специфічній еліптичності.
Детальний опис винаходу
Винахід відноситься до злитого протеїну, що містить: домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну ПТКАЇГ, при цьому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж ПТЕКАЇЇ! 95, і домен (б), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, який здійснює свою проапоптотичну дію через властивий йому внутрішній шлях апоптозу, при цьому послідовність домену (б) приєднана в точці С кінця і / або точці М кінця домену (а).
Термін "функціональний розчинний фрагмент послідовності розчинного ПТКАЇЇ" слід розуміти як назву, що позначає будь-який такий фрагмент розчинного ПТЕАЇГ, який здатний індукувати апоптотичний сигнал.
Термін "пептид" в контексті даного винаходу слід розуміти як молекулу, сконструйовану з безлічі амінокислот, зв'язаних разом за допомогою пептидного зв'язку. Таким чином, термін "пептид" в контексті даного винаходу включає в себе поняття олігопептидів, поліпептидів і протеїнів.
Слід розуміти, що домен (Б) ефекторного пептиду в злитому протеїні за даним винаходом не є ні самим протеїном НТРКАЇЇ, ні частиною протеїну ПТЕАЇГ.
У даному винаході амінокислотні послідовності пептидів будуть представлені звичайним способом, прийнятим у рівні техніки, в напрямку від точки М закінчення (М-кінця) пептиду в бік точки С його закінчення (С-кінця). Будь-яка послідовність, таким чином, має свою точку М закінчення з лівого боку і точку С закінчення з правого боку.
Злитий протеїн за винаходом може містити один домен (б) ефекторного пептиду, приєднаний в точці С закінчення або в точці М закінчення домену (а).
Злитий протеїн за винаходом може також містити два домени (Б) ефекторного пептиду, в цьому випадку один з доменів (Б) приєднаний в точці С закінчення домену (а), а інший приєднаний в точці М закінчення домену (а).
Якщо злитий протеїн за винаходом містить два домени (б) ефекторного пептиду, зазначені домени можуть бути однаковими або відмінними один від одного. В даному випадку перевага віддається доменам (Б), відмінним один від одного.
В одному з конкретних прикладів здійснення винаходу домен (а) являє собою фрагмент послідовності ПТКАЇГ, що починається амінокислотою з діапазону від АТКАЇ1114 до ПТКАЇІ 121, включно, і закінчується на амінокислоті ПТКАЇЇ 281 або інших функціональних фрагментах послідовності ПТКАЇЇ. поміщеної (депонованої) в ГенБанк (СепВапкК) з реєстраційним номером
РБОБ591.
Зокрема, домен (а) може бути вибраний з групи, що складається з послідовностей, відповідних ПТЕАЇІ 114-281 (5ЕО Мо 27), НТРЕАЇІ 119-281 (5ЕО Мо 28) та НТЕАЇІ 121-281 (5ЕО Мо 29), НТВАЇІ 116- 281 і пТКАЇІ 120-281.
В іншому прикладі здійснення домен (а) може бути послідовністю пНТКАЇІ 95-281.
Проапоптотичний ефекторний пептид домену (Б), який здійснює свою апоптотичну активність через внутрішній (притаманний йому) шлях апоптозу (внутрішньоклітинно), може
Зо індукувати апоптоз безпосередньо шляхом активації сигнальних каскадних компонентів мітохондріального шляху апоптозу, або за допомогою прямого індукування мітохондріального апоптозу в клітинах.
В одному з прикладів здійснення злитого протеїну за даним винаходом ефекторним пептидом є пептид, який діє через внутрішній шлях апоптотозу, вибраний з групи, що складається з 5ЕО. Мо. 30, Мо. 31, 5ЕО. Мо. 32, 5ЕО. Мо. 33, ЗЕО. Мо. 34, 5ЕО. Мо. 35, 5ЕО.
Мо. 36, 5ЕО. Мо. 37, 5ЕО. Мо. 38, 5ЕО. Мо. 39, Мо. 40, 5ЕО. Мо. 41, 5ЕО. Мо. 42, 5ЕО. Мо. 43,
ЗЕО. Мо. 44, 5ЕО. Мо. 45, 5ЕО. Мо. 46, и ЗЕО. Мо 47, або ЗЕО. Мо. 151, ЗЕО. Мо. 152, ЗЕО. Мо. 153, 5ЕО. Мо. 154, 5ЕО. Мо. 155, 5ЕО. Мо. 156, 5ЕО). Мо. 157, 5ЕО. Мо. 158 5ЕО. Мо. 159, 5ЕО.
Мо. 160, Мо. 161, 5ЕО. Мо. 162, ЗЕО. Мо. 163, ЗЕО. Мо. 164, 5ЕО. Мо. 165 и 5ЕО. Мо. 166.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО). Мо 30 зазначеної вище групи є пептидом, похідним з домену ВНЗ протеїну Вах, який інгібує антиапоптотичні фактори, і зокрема, 16-амінокислотним пептидом, представленим:
ККІ ЗЕСІ ККІ СОЕЇГ 05 5ЕО. Мо 30
Вважається, що пептиди, засновані на послідовностях доменів ВНЗ протеїну Вах, здатні ефективно зв'язуватися з антиапоптотичними протеїнами Всі-2 та ВсІ-ХІ. Антиапоптотична активність протеїну ВсіІ-2 та ВсіІ-ХІ заснована на їх взаємодії з доменами ВНЗ, присутніми в факторах, відповідальних за ініціювання апоптозу (Вах, Вак, Вай). Зв'язування домену ВНЗ забезпечує попередження взаємодії протеїнів Всі-2 та ВсІ-ХІ з їх природними лігандами та інгібування їх активності, і тим самим сприяє ініціюванню розвитку апоптозу.
Ефекторний пептид послідовності 5Е00. Мо 31 зазначеної вище групи є 15-амінокислотним пептидом, що включає домен ВНЗ протеїну Вій, який представлений:
ЕМІАКНІГ ДОМ 50О5МО (5ЕО. Мо 31).
Протеїн Вій відноситься до сімейства Всі-2 і відповідає, зокрема, за активацію проапоптотичного фактора Вах. Вважається, що 16-амінокислотний пептид, що містить домен
ВНЗ протеїну Від, включений у злитий протеїн за даним винаходом, буде ефективно індукувати апоптоз.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО. Мо 32 з вказаної вище групи являє собою пептидну гомологію рибонуклеази А (РНКази), представлену:
КЕТА АКРЕВОНМО5 ЗТЗААЗЗЗМУ СМОММКЗАМІ ТКОАСКРУМТ ЕМНЕБІ АОМО (510) АМОБОКММАС КМСЮТМОСМО УЗТМ5ІТОСА ЕТаЗЗКУРМО АУКТТОАМКН
ПМАСЕСМРУ МРУНЕВАБМУ (5ЕО. Мо. 32).
Рибонуклеази являють собою малі протеїни з потенційними протипухлинними властивостями, які при зв'язуванні з негативно зарядженими клітинними мембранами проникають всередину клітини за допомогою ендоцитозу, а потім потрапляють в цитозоль, де вони діють як фермент, що викликає деградацію РНК. Починаючи з концентрації 10 нМ, вони припиняють клітинний цикл і спричинюють апоптоз.
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО. Мо.33 описаної вище групи являє собою цитохром С молекули, представленої за допомогою:
СОМЕК СККІРІМКО5 ОСНТУЕКОСОК НКТОаРМІ НОЇ ГЕЕАКТабАРО У5УТААМКМК
СПУУСЕОТІ М ЕМ ЕМРККМІ РАТКМІЕРМаІ КККЕЕВАОІ І АМІ ККАТМЕ (5ЕО. Мо. 33).
Випуск цитохрому С з мітохондрії в цитоплазму є одним з основних сигналів, індукуючих апоптоз через так званий мітохондріальний шлях. Протеїн є частиною комплексу апоптосоми, який активує каспазу 9.
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО. Мо. 34 описаної вище групи являє собою гранзім В, представлений за допомогою:
ПасТнмМАКРН ЗАРУМАМІ МІ МУрОКБІ КАСа аЕГІВООРМІ ТААНСУазвІММТІ аАНМІК
ЕОЕРТООРІР МКВАІРНРАМ МРКМЕЗМОЇІМ ПОЇ ЕВКАКА
ТАВАМОРІ ВІ Р БМКАОУКРОО ТОБМАСУУСОТ АРІ аКНЗНТІ ОБЕУМКМТМОЕО
АКСЕБОІ ВНУ МО5ТІЕЇ Сус ОРЕБІККТЗЕК СЮБИаСРІ МСМ КМАОСІУЗМСО
АММаМмМРРААС ТКУЗЗЕУНУМІ ККТМКАХ (ЗЕО. Мо. 34).
Гранзіми, які в літературі також називаються фрагментінами, є сироватковими (сериновими) протеазами, типовими для клітинної зернистості То-лімфоцитів і МК-клітин. У людському організмі в даний час ідентифіковано 5 різних гранзімів: А, В, Н, К (тріптаза) і М (метіоніназа).
Дослідження підтвердили, що дані ферменти є елементами цитотоксичної реакції, в яку вступають лімфоцити, впливаючи на клітини-мішені (цільові клітини). Було наочно продемонстровано, що дані ферменти активізували перфорин, тобто протеїн, що генерує пори в клітинних мембранах і тим самим виконує роль посередника при генеруванні цитотоксичної відповіді (цитотоксичної реакції). Крім того, наявним є висновок, що дані ферменти безпосередньо залучаються до процесу індукування апоптозу в клітинах-мішенях. Гранзім В
Зо активізує відібрані прокаспази в їх активних формах (наприклад, каспазу 3), а також вивільняє за допомогою протеолізу активну форму протеїну Вій (протеїну, що належить до сімейства протеїну Всі-2), який ініціює внутрішньоклітинний шлях апоптозу методом інкорпорування в мітохондріальні мембрани і формування пор у мембранах, після чого настає вивільнення факторів, які індукують апоптоз (цитохром С, каспазу 9, апаф (Араї)). Зв'язуючись з гістонами, гранзім В також може брати участь в релаксації структури хроматину, що спричинює її ослаблення і полегшує доступ до ДНК для ендонуклеаз.
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО). Мо 35 зазначеної вище групи є фрагментом протеїну
Миг77, представленого за допомогою:
ЕЗАБ5БІ НІ (ЗЕО Мо. 35).
Ядерний рецептор Миг77 є дуже потужним індуктором апоптозу. Одним з механізмів його дії є здатність зв'язуватися з протеїном Всі--, важливим антиапоптотичним фактором. Така взаємодія викликає конформаційні зміни в структурі Всі-2, які перетворюють його в індуктора апоптозу. Фрагментом, представленим вище, є 9-амінокислотна область з послідовності Миг7 7, ідентифікована як відповідальна за зв'язування і перетворення Всі-2, а також індукування апоптозу в клітинах. |Коїигі и др., Сапсег Сеї! (Ракова клітина) 14: 285-298, 20081.
Ефекторним пептидом послідовності ЕС. Мо. 36 зазначеної вище групи є 15- амінокислотний пептид, що містить домен ВНЗ протеїну Вак, представлений за допомогою:
СсОМавВО А аООІМ (ЗЕО. Мо. 36).
Вважають, що даний короткий пептид, включений у злитий протеїн за винаходом буде ефективно індукувати апоптотичний сигнал.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО. Мо. 37 вищевказаної групи являє собою домен ВНЗ протеїну РОМА/ВВСЗ, представлений за допомогою
ЕЕОУМАВЕЇСА ОЇ ВАМАБОІ М АОМЕ 5ЕО. Мо. 37.
РИОМА/ВВОЗ (ро5З - активований модулятор апоптозу / Всі-2-зв'язувальний компонент 3) є членом сімейства протеїнів Всі-2 (ВНЗ тільки для підсімейства). Він виступає посередником апоптозу в порядку, як залежному, так і незалежному від р53. Пряма взаємодія РОМА/ВВСЗ з усіма відомими протеїнами Всі-2 про-виживаності викликає їх інактивації, мітохондріальну дисфункцію, і отже, активацію каспаз і загибель клітин. РОМА також опосередковано впливає на відновлення проапоптотичної активності молекул, наприклад, таких як Вак та Вах. Домен ВНЗ бо відповідальний за зв'язування РОМА з протеїнами про-виживаності.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕС. Мо. 38 вищевказаної групи являє собою протеїн
РОМА/ВВСЗ, представлений у вигляді:
АВАВ ОБО5З5ОРЕРМЕ ПІ АВООРЕРЕ РІ аВІ МРБЗАМ 5СОІ СЕРА ААРААРТІЇ Р
ААУЇ САРТАР РАМТААЇ 5 ВМ/РОСРАЗАР ВАРАРОСРОР 5І 5І АЕОНІ Е
ЗРУРБАРОАЇ АЙОаРТОААРО УАСЕЕЕОУМАВ ЕІСАОЇ ВАМА ОЇ МАОМЕВН
ВОЕЄООВНАР З5РУУВМІ УМ І МОГ І РІ РАН ВАРЕМЕРМ (5ЕО. Мо. 38).
Вважається, що і протеїн РОМА/ВВСЗ, і його домен ВНЗ при введенні в злитий протеїн за винаходом буде ефективно індукувати апоптотичні сигнали.
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО. Мо. 39 з вищевказаної групи являє собою 8- амінокислотний фрагмент протеїну МАС / Оіаріо, представлений за допомогою:
АМРІАОКР (5ЕО. Мо. 39).
ЗМАС / ПІАВГО (другий мітохондрія - вироблений активатор каспаз / безпосередньо ІАР - зв'язувальний протеїн з низьким показником Рі) є активатором каспаз, вивільненим з мітохондрій. Його мотив в точці М закінчення (М-кінця) має перевагу при зв'язуванні з протеїнами ІАР, запобігаючи їх домени ВІК 2 і ВІК З від інактивації каспаз. Вважається, що даний короткий пептид, будучи інкорпорованим в злитий протеїн за винаходом, буде ефективно індукувати апоптотичний сигнал.
Ефекторний пептид послідовності зЗЕО. Мо 40 з вищевказаної групи являє собою пептид буфорін (биїогіп) ІБ, представлений у вигляді:
КЕАСГОГРМОК ГЕ КА (ЗЕ. Мо 40).
Вшогіп ПЬ являє собою пептид, отриманий з гистону Н2А, який здатний до незалежного проникнення через клітинні мембрани і наділений антибактеріальними властивостями (Рагк та ін, Віоспет Віорпу5 Ке5 Соттип, 244 ... 253-257, 1998). Дослідження його корисності в якості протиракового засобу показали, що він здатний селективно зв'язуватися з численними раковими клітинами, проникати в клітини і накопичуватись в ядрах, індукуючи апоптоз через мітохондріальний шлях (І ее і ін, Сапсег І еЦегв5, 271:47-55, 2008).
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО. Мо 41 з вищевказаної групи являє собою пептид онконази, представлений за допомогою:
ОМ Т ЕОККНІТМТА ОМОСОМІМ5Т МІ ЕНСКОКМТ РІМЗАРЕРУК АІСКОПАЗК
Зо ММ ТЕРМІ БОСМУТЗАРО КУКІ ККЗТМК ЕСМТСЕМОАР УНЕМаМав5с (5ЕО. Мо. 41).
Онконаза або Р-30 є протеїном, спочатку отриманим з лізатів жаби Капа рірієп5 оосуїе5 Це одноланцюговий протеїн масою 12 кДа, структурний гомолог РНКази А. Дослідження даного протеїну показали, що він має чудову цитотоксичну активність щодо пухлинних клітин (У УМи,
ЗМ Мікиївкі, МУ Агає!й, ЗМ Вурак апа В) Моше, ТНе дошгаї ої Віоіодіса! Спетівігу 268, 10686- 10693). Дослідження механізму дії онконази показали, що під час процесу інтерналізації вона проникає в клітину, де здійснює процес деградації рибосомних гГКМА 285 і 185, що призводить до гальмування синтезу протеїну і загибелі клітини.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕСО. Мо. 42 з вказаної вище групи являє собою 20- амінокислотний фрагмент протеїну р14АКЕ з точкою М закінчення, який є інгібітором протеїну про-виживаності Мата2, представлений як:
МАВЕЇГМТІ ВІ ВВАСОРРАМ (5ЕО. Мо. 42).
РІ4АКЕ є протеїном, який регулює активність протеїну Мат2, що зв'язується з роз супресором пухлини, несе відповідальність за її деградацію і тим самим забезпечує можливість виживання трансформованих клітин. Протеїн рі4АКЕ, зв'язуючись з Мат2, запобігає його взаємодію з р53. Відомо, що короткий пептид, отриманий з р14АКЕ, в достатній мірі здатний блокувати взаємодію між Мат і р53З і запобігає деградацію останнього (Міадіеєу єї аі, Опсодепе 19: 2312-2323, 2000).
Ефекторний пептид послідовності ЕС). Мо. 43 з вказаної вище групи є 11-амінокислотним пептидом, що зв'язуються з Мат2, представленим через:
РАЕМОТМ/ЕСІ. М (ЗЕО. Мо. 43).
Даний пептид демонструє гомологію послідовності у відношенні до послідовності роз і значну ефективність гальмування взаємодії Мата2г-р5З3 (Вбидег еї аЇ, Опсодепе 13:2141-2147, 1996), тим самим запобігаючи деградації ро53.
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО. Мо. 44 зазначеної вище групи являє собою 17- амінокислотний фрагмент пептиду луназіну (Іпавіп), представлений через:
СЕКНІМЕКІО СНОаророро (5ЕО. Мо. 44).
Луназін є 43-амінокислотним пептидом, отриманим із сої (Гліцин макс.), з доведеним анти- карциногенним потенціалом. Основний механізм дії даної молекули полягає в інгібуванні процесу ацетилювання гистону. Відомо, що молекули, які мають активність дезацетілази, діють бо також в якості Со-супресорів процесу транскрипції (І еопод та ін, Сапсег І ей, 18: 42 - 48, 2007).
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО. Мо. 45 з вищезгаданої групи є доменом ВНЗ протеїну ВІК, представлений через:
ГАЇ АГАС І2ОЕМОМ5 (5ЕО. Мо. 45).
Протеїн Вік взаємодіє з клітинними і вірусними факторами, що ініціюють сигнали виживаності (наприклад, Всі--д2 тим самим стимулюючи апоптоз. Як і багато інших проапоптотичних протеїнів, вона містить домен ВНЗ, необхідний для взаємодії з ВсіІ-2. Пептид, отриманий з цього протеїну, що містить домен ВНЗ, може ініціювати апоптоз шляхом активації інших проапоптотичних протеїнів або шляхом інгібування антиапоптотичних протеїнів (Оеї Саїі2о
Мооге, У, еїаї, Віопа, 111: 2300-2309, 2008).
Ефекторний пептид послідовності 5ЕО. Мо. 46 з вищезгаданої групи являє собою синтетичний пептид - інгібітор протеасоми, представлений за допомогою: дадасоадас дадасадасіА а (5ЕО. Мо. 46).
Цей пептид складається з ряду повторень су - і Ала - залишків і є інгібітором протеасом, здатним до здійснення потенціювання ТКАЇЇ-індукованого апоптозу шляхом індукції над експресії (надлишкової експресії) ТКАЇЇ рецептора ОК5.
Ефекторний пептид послідовності ЗЕО. Мо. 47 з вищезгаданої групи являє собою домен С- кінцевого фрагмента протеасоми 55а, представлений у вигляді
МТІБООЕРа ВТаї РОЇ 55М ТЕЕЕОСІАМАМ ОМ5ІГОСАЕРОа ОАДЕЗАВІСА5 БАМОТЗЕРАК
ЕЕООМОУМОЮ РЕРГОБМІЕМ ІГРЕМОРММЕА ІАНМАМОа5І А ОАТКРОККОК КЕЕОК (5ЕО.
МО. 47).
Цей домен з фрагмента протеасоми 55а містить мотиви Оітв, які беруть безпосередню участь у убіквітин - зв'язуванні і, отже, здатні індукувати апоптоз.
Ефекторним пептидом послідовності 5ЕО). Мо.151 з вищезгаданої групи є пептид, отриманий з азуріну.
Азурін - це протеїн окисно-відновного потенціалу, що містить мідь, випущений патогенною бактерією синьогнійної палички (Реєпдотопаз аегидіпоза). Він є у високому ступені цитотоксичним по відношенню до багатьох ракових клітинних ліній. Азурін входить в цитозоль і переміщується у напрямку до ядра. Його активність чітко залежить від наявності активної форми ро5іЗ в ракових клітинах. Було виявлено, що азурін зв'язується з р5З і посттрансляційно
Зо збільшує р5З3З і Вах рівень. Така явна антагоністична активність по відношенню до функціональної взаємодії Мат2-р5З3 дає можливість припустити, що зв'язування азуріну з ро5З3 може перешкодити виникненню об'єднання Мат2-ро3 і тим самим запобігти деградації роз.
Після зв'язування, це спричинює вихід мітохондріального цитохрому С в цитозоль. Даний процес активує каскад каспаз (в тому числі, каспази-9 і каспази-7), ініціюючи тим самим процес апоптозу (Рипі У, еї аІ Опсодепе. 2004 Маг 25;23(13):2367-78, Рипагі С єї аї. У Мої Весодпії. 2010
Уч Аца; 23(4):343-51). Докладний аналіз активності пептидів, отриманих з послідовності азуріну, виявив область з 28 амінокислот, що відповідають за ефективну клітинну пенетрацію і запуск механізму апоптозу (уатада і музр., Сеї! Місгоріої, 7:1418-1431, 2005).
Ефекторним пептидом послідовності 5ЕС). Мо.152 з вищевказаної групи є азуріновий пептид повної довжини.
Ефекторним пептидом послідовності 5ЕО. Мо.153 з вищевказаної групи є пептид, сконструйований з протеїну аРР і домену ВНЗ протеїну Вах. Химери протеїну арРР і переробленого проапоптотичного протеїну Вак були розкриті в ЕРІ1309680 в якості сильнодіючих і специфічних лігандів для людських Всі-2 та ВсіІ-Х. (Див. також Спіп УМ/, зсперагі:
А. Оевзідп апа емоїшіоп ої а тіпіашге Всі-2 ріпаїпд ргоївїп (Конструкція та еволюція мініатюрного
Всі-2 - зв'язуючого протеїну) Апдем/ Спет Іпі Еа Епої. 2001 Осі 15;40(20):3806-3809
Ефекторним пептидом послідовності 5Е0). Мо.154 з вищевказаної групи є інший пептид, сконструйований з протеїну аРР і домену ВНЗ протеїну Вах.
Ефекторним пептидом послідовності ЗЕС. Мо.155 з описаної вище групи є пептид, отриманий з Кеїїсшоп КЕТМ1-0.
Протеїн КТМ1І-С являє собою мембранний протеїн, локалізований в ЕК (ендоплазматичному ретикулумі) і експресований в нервовій системі, причому його біологічна роль ще не повністю вияснена. С-кінцева область ЕТМ1-С, відповідна фрагменту із залишків від 186 до 208, здатна зв'язуватися з нуклеїновими кислотами та взаємодіяти з ферментами гістондеацетілази (НОАС), знижуючи їх активність.
Ефекторним пептидом послідовності ЕС. Мо. 156 з описаної вище групи є людський ретікулон (Кеїйсціоп З/зоформа а) повної довжини. Ретікулони (КТМ5) утворюють групу інтегральних мембранних протеїнів, які не мають гомології з іншими відомими доменами, що відносяться до апоптозу. Ізоформа а ретікулону (Кеїїсцоп 3) піддається надмірному експресуванню в пухлинних клітинних лініях, перетворюючи їх на лінії, чутливі до ТКАЇЇ - опосередкованого апоптозу.
Ефекторним пептидом послідовності 5Е0). Мо.157 з описаної вище групи є вдосконалена, конститутивно (постійно) активна каспаза-3 (одноланцюгова каспаза) (Згіпімазша ЗМ, Аптаай М, МасгРаїпапе М, цо 7, Ниапа 7, Регпапаез-АІпептіі Т, АІпетігі Е5. Сепегаїйоп ої сопвійціїмеїу асіїме гесотбріпапі сазрабзе5-3 апа -6 Бу геатапдетепі ої Іпеїг зибипії5 (Генерування конститутивно активної рекомбінантної каспази-3 та каспази-б6 шляхом перерозподілу їх підодиниць). .) Віої
Спет. 1998 Арг 24; 273(17):10107-111.
Ефекторним пептидом послідовності ЕС. Мо.158 з описаної вище групи є домен БАС протеїну Раг-4 (протеїну Раг-4 апоптозної відповіді простати). Раг-4 є супресорним протеїном пухлини, що має проапоптотичну функцію. Канцер-специфічна проапоптотична активність Раг-4 зосереджується в його центрально розташованому домені ЗАС. Функція молекули забезпечується двома специфічними засобами: активацією молекулярних компонентів механізму загибелі клітини (транслокація Бах і Разі в плазматичну мембрану), і інгібуванням фактора про-вьіживаності (МЕ-Кб шлях). (2пао У, КапопеКаг ММ. Ароріовзі5 апа штог гезібтапсе сопіеїтей Бу Раг-4. (Апоптоз і пухлинна резистентність, забезпечувана Раг-4) Сапсег Віо! ТНег. 2008 Оес;7(12):1867-74. Ериб 2008 Оес 8. Немівму)|.
Ефекторним пептидом послідовності 5Е0). Мо.159 з вказаної вище групи є протеїн Моха.
Моха кодує ВсіІ-2 гомологію З (ВНЗ) - єдиного члена Всі-2 сімейства протеїнів; цей елемент містить область ВНЗ, але не інші домени ВН. Моха є посередником р53-залежного апоптозу і піддається ВНЗ мотив - залежній локалізації в мітохондріях, а також взаємодіє з антиапоптотичними членами сімейства Всі-2, що призводить до активації каспаз-9.
Ефекторним пептидом послідовності ЗЕС). Мо.160, описаної вище групи є 10-АА (КСМСІЗКСЕ) фрагмент протеїну Моха, необхідного для мітохондріальної локації (МТО - мітохондріальний цільовий домен або СКР - пептид загибелі клітин). Він був описаний в патентній публікації М/О2006/001582 і в роботі Моипд-М/оо 560 вї аї. іп Тне Чдоштпаї ої Віоіодіса!
Спетівігу Мої. 278, Мо. 48, Ізвце ої Мометрбрег 28, рр. 48292-48299, 2003 (у науковому журналі
Біологічна хімія. Том 278. Мо48, випущено 28 листопада, стор. 48292-48299, 2003 р.)
Ефекторним пептидом послідовності ЗЕ. Мо.161 з вищевказаної групи є короткий
Зо гібридний пептид Апір-ТРК, описаний в патентній публікації У/МО2010055929. Апір-ТРК є продуктом генної інженерії - гібридним пептидом Незроб-орієнтації, який має селективну цитотоксичну активність у відношенні до ракових клітин за рахунок гальмування взаємодії
Незро0 з доменом ТРКЗ2А Нор -протеїну.
Ефекторним пептидом послідовності ЗЕО. Мо.162 з описаної вище групи є пептидний інгібітор домену 5Н2 протеїну За.
Домен 5НАІ2 протеїнів Зіаї несе відповідальність за серію подій, які призводять до активізації клітинного росту та диференціювання клітин через звичайну 5ТАТ сигналізацію у відповідь на фактори росту і цитокіни.
Ефекторним пептидом послідовності 5ЕО. Мо.163 з вищезгаданої групи є пептид
СОМСКОЇАПОСООІМЕ, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вак (сімейства Всі-2) (Савзіеїйї М,
Веїпегз У, Кевзе! ОЮО. А теспапібт ог те ргоароріоїйс асіїмпу ої пгводеохуспноїїс асій: еПесів оп
Всі-2 сопіогтаціоп. Сеїї Оєваїп рійег. (Механізм проапоптотичної активності урсодезоксихолевої кислоти: вплив на Всі-2 конформацію. Різні види загибелі клітини). 2004 А!йд;11(8):906-14).
Протеїн Вак є проапоптотичним представником сімейства Всі-2, який залучається до ініціювання апоптозу.
Ефекторним пептидом послідовності 5ЕО. Мо.164 з вищезгаданої групи є пептид
КМ ММАДОВУСАЕЇ КЕМЗОЕРЕОЗЕКОЇ,, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вай (сімейства Всі- 2) (Мапа 9, 2папд 2, СпокКві 5, Зпап 5, Пи 27, Стосе СМ, АІпетігі Е5, Котпдоїа В, Ниапа 7. Сеї рептєаріє Всі-2 Бріпаіпуд реріідеб5: а спетіса! арргоасп їо ароріовів іпдисіоп іп Штог сеїЇв. (Клітина-проникні Всі-2 - зв'язувальні пептиди: хімічний підхід до індукування апоптозу в пухлинних клітинах)Сапсег Кез. 2000 Маг 15;60(6):1498-502).
Ефекторним пептидом 5ЕО). Мо. 165 з вищезгаданої групи є пептид АТАР з протеїну ВИ.
АТАР (амфіпатичний пептид з хвостовою "якірною" функцією) (залишки 147-175 з ВП1; біфункціональний протеїн сімейства Всіг2), призначений спеціально для мітохондрій і індукує каспаза-залежний апоптоз, який не потребує Вах або Вак.
Ефекторним пептидом послідовності 5ХЕО. Мо 166 вищеназваної групи є інший АТАР пептид з протеїну ВІ. Протеїн АТАР зливається з МТС - доменом з НСС5І1 Ко УК, Спої КН, Рап 2, іп
Р, МУ/візієдег М, Кіт СМУ, Ма 4. Тне заї-апсногіпуд дотаїп ої ВТ апа НСС5 їагоєї5 тйоспопагіа! тетбгапе рептеабіїйу (0 іпдисе ароріовзі5. (Домен з хвостовою "якірною" функцією протеїну ВИ!
і НСС51 націлений на мітохондріальну проникність мембрани для індукування апоптозу) у СеїЇ сі. 2007 Ацао 15;120(Рі 16):2912-23. Ериб 2007 ди! 311.
Як описано вище, першим варіантом проапоптотичного ефекторного пептиду домену (Б) може бути пептид, який здійснює свою апоптотичну активності через внутрішній (притаманний йому) шлях апоптозу (внутрішньоклітинно), що викликає апоптоз безпосередньо шляхом активації компонентів сигнального каскаду мітохондріального шляху апоптозу, або шляхом прямого індукування мітохондріального апоптозу в клітинах.
В одному з прикладів здійснення першого варіанту однієї з груп проапоптотичних ефекторних пептидів домену (б), що здійснюють свою активність через внутрішній шлях, можуть бути пептиди, які гальмують і / або модулюють внутрішньоклітинні антиапоптотичні фактори або фактори про-виживаності, наприклад, такі як антиапоптотичні протеїни Всі-2 та ВсіІ-ХІ,, при їх зв'язуванні.
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи є пептиди, представлені послідовністю ЗЕО). Мо. 30, присутньою в злитих протеїнах прикладів 1, послідовністю ЗЕО. Мо. 37, присутньої в злитих протеїнах прикладів 11 і 47, послідовністю ЗЕО). Мо.45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21, послідовністю 5ЕО). Мо. 158, присутньою в злитих протеїнах прикладів 42 і 43, і послідовністю 5ЕО). Мо. 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44.
В іншому прикладі здійснення даного першого варіанту група проапоптотичних ефекторних пептидів домену (Б), що проявляють свою активність через внутрішній шлях, може бути представлена пептидами, які здійснюють руйнівну активність безпосередньо всередині клітини, забезпечуючи арешт клітинного циклу.
Зазначена вище руйнівна активність безпосередньо всередині клітини в мітохондріальному внутрішньому шляху може бути ініційована ефекторним пептидом на різних рівнях каскаду каспаз, що призводить до загибелі клітини.
Прикладами зазначеної вище прямої руйнівної активності ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є деградація нуклеїнових кислот, зокрема, клітинної
РНК або ДНК в цілому, і індукування деградаційних нуклеаз. Такий вплив можуть чинити, наприклад, рибонуклеази, такі як рибонуклеази надсімейства підшлункової залози ЕМАве А, в тому числі підшлункової залози людини ЕМАвзе, людського ангіогеніну (рибонуклеази 5, пАпо),
Зо людського еозінофіл-похідного нейротоксину (ЕОМ), і бичачою рибонуклеазою, а також їх гомологами і варіантами. Прикладами гомологів ЕМАзе є онконаза, рибонуклеази, виділені з
Вапа саїезбіапа (жаба-бик) і Капа іаропіса (коричнева японська жаба).
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, які проявляють активність, в результаті якої забезпечується деградація нуклеїнових кислот, є пептиди, представлені послідовністю ЗЕС). Мо.32, присутньою в злитих протеїнах прикладів 3, 4 і 27, послідовністю
ЗЕО. Мо. 41, присутньою в злитих протеїнах прикладів 16, 17 і 46, і послідовністю 5ЕО. Мо.157, присутньою в злитому протеїні прикладу 41.
Іншим прикладом зазначеного прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є активація каспаз. Така дія може бути здійснена, наприклад, цитохромом С (5ЕО). Мо. 33), присутнім в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, гранзімом
В (ЗЕО. Мо. 34), присутнім в злитих протеїнах прикладів 7 і 8, або пептидом, отриманим з протеїну Зтас / ОІАВГО (5ЕО). Мо. 39), присутнім в злитих протеїнах прикладів 14, 21, 33, 34 і 35.
Іншим прикладом згаданої вище прямої руйнівної дії ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є інгібування протеасоми, завдяки впливу стабілізації проапоптотичних протеїнів на відновлення функцій роз.
Типовими ефекторними пептидами вищевказаної групи, дія яких здійснюється за рахунок інгібування протеасоми, є пептиди, представлені ЗЕО Мо. 46, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 22, і БЕО. Мо 47, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 23.
Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є модуляція протеїнів гістонів, завдяки посиленню впливу експресії проапоптотичних протеїнів на відновлення функцій роЗ
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, що діють за рахунок модуляції протеїнів гістонів, є буфорін (бшиїогіп Ії), представлений 5ЕО. Мо 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 15, і луназін, представлений 5ЕО Мо 44, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 20.
Іншим прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є відновлення функцій Р-53, наприклад, шляхом інгібування деградації Р-53. Попередження деградації Р-53 може бути досягнуто шляхом бо інгібування негативного регулятора Р-53, такого як тигіпе доибіє тіпше 2 (МОМ2), щоб зірвати процес негативного регулювання Р-53. Це може бути досягнуто за рахунок МОМ2 - зв'язуючих пептидів, які конкурують з МОМ2 за зв'язування з Р-53, наприклад, азуріну, окислювально- відновного протеїну, що містить мідь, регулятора клітинного циклу рі4АКЕ, або ЗирегтіР (ТПіогедохіпіпвей Ргоїєїп - протеїну, що вміщує тіоредоксин), тапт-2-зв'язуючого пептиду в межах петлі активної зони бактеріального тіоредоксин - протеїну), або їх фрагментів.
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, що діють за рахунок відновлення
Р-53 - функцій, є пептиди, представлені 5ЕС). Мо, 42, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 18, 5ЕО Мо, 43, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 19, 5ЕО. Мо. 151, присутньою в злитих протеїнах прикладів 29, 30 і 31, і 5БО Мо. 152, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 32.
Ще одним прикладом згаданої прямої руйнівної дії ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення впливу, тобто активації, інгібування або модуляції сімейства протеїнів Всі-2, таких як протеїни Вах, Вак, Вок, Віа, Віт, Вай, Вт/, НЕК,
Моха, Рита, ВІК, ВМІРЗ і 5ріке, більш конкретно, тільки ВНЗ - сімейства протеїнів, що включає
Віа, Віт, Вад, Вт", НІК, Моха, Рита, Вік, ВМІРЗ і 5ріке. Зокрема, фрагменти доменів ВНЗ членів сімейства Всі-2 будуть представлені в якості бажаних ефекторних пептидів. Інша група ефекторних пептидів представлена фрагментами сімейства ядерних рецепторів ЕХК (ретіноїдних Х-рецепторів), таких як, наприклад, ядерний рецептор Миг7 7.
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягала у впливі на сімейство протеїнів ВсіІ-2, є пептиди, представлені ЗЕО Мо 30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, ЗЕО. Мо 31, присутньою в злитих протеїнах прикладів 2, 4 і 8, 5ЕО. Мо 32, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 3, 5ЕО. Мо 35, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 9, ЗЕО. Мо 36, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 10, 5ЗЕО. Мо 37, присутньою в злитих протеїнах прикладів 11 і 47, 5ЕО. Мо 38, присутньою в злитих протеїнах прикладів 12 і 13, 5ЕО. Мо 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44, 5ЕО. Мо 160, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 45, 5ЕО). Мо 163, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 51, 5ЕО).
Мо 164, присутньою в злитих протеїнах прикладів 52 і 53, ЗЕО. Мо 165, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 54 і БЕО). Мо 166, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 55.
Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення зосередження апоптотичного сигналу, індукованого за допомогою ТКАЇЇ - зв'язування з ТКАЇЇ - рецепторами, зокрема, шляхом активації каспаз.
Іншим прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення сприяння формуванню апоптосоми.
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягає в сприянні формуванню апоптосоми, є пептиди, представлені 5ЕО. Мо. 30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, 5ЕО. Мо. 31, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 2, 5ЕО. Мо.33, присутньою в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, 5ЕО. Мо.35, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 9, 5ЕО. Мо. 36, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 10, 5ЕО. Мо. 37, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 47, 5ЕО. Мо. 39, присутньою в злитих протеїнах прикладів 33, 34 і 35, 5ЕО. Мо. 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 14, 5ЕО. Мо. 45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21, 5ЕО. Мо. 153, присутньою в злитих протеїнах прикладів 36 і 37, ЗЕО Мо. 154, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 38, 5ЕО Мо. 157, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 41, 5ЕСО. Мо. 158, присутньою в злитих протеїнах прикладів 42 і 43, 5ЕО Мо. 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44, 5ЕО. Мо. 160, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 45, 5ЕО. Мо. 163, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 51 і 5ЕО. Мо. 164, присутньою в злитих протеїнах прикладів 52 і 53.
Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є сприяння забезпеченню проникності мітохондріальної зовнішньої мембрани (МОМР), завдяки чому протеїни, що вивільняються з мітохондрій, можуть впливати на рівень активації каспази.
Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягає в сприянні забезпеченню проникності, мітохондріальної зовнішньої мембрани (МОМР), є пептиди, представлені 5ЕО. Мо.30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, 5ЕО. Мо. 31, присутньою в злитих протеїнах прикладів 2 і 48, 5ЕО. Мо.33, присутньою в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, 5ЕО. Мо. 39, присутньою в злитих протеїнах прикладів 14, 33, 34 і 35, 5ЕО. Мо. 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 15, 5ЕО. Мо. 41, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 46 і БЕО). Мо. 45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21.
Як описано вище, другий варіант проапоптотичного ефекторного пептиду домену (Б) за бо винаходом являє собою групу проапоптотичних ефекторних пептидів, що діють через зовнішній шлях (позаклітинно), причому їх ефективність можлива у випадку зв'язування з рецепторами, присутніми на поверхні ракової клітини.
Нижче наведені наступні ТМЕ-ліганди (ТМЕ - фактор некрозу пухлини) або ТМЕ-аналоги, як позаклітинно діючі пептиди, що були використані в якості порівняльних ефекторних пептидів: - МАМРОАЕСО)Ї. декапептид (ЗЕО). Мо. 48); - ГАМОМЕ гексапептид (ЗЕО). Мо. 49) або - Септапептид СРБЕСІ С (5ЕО. Мо. 50).
Декапептид, представлений послідовністю 5ЕО. Мо. 48, був описаний в якості аналога / агоніста ТМЕ в патентному документі УР 60226816.
Гексапептид, представлений послідовністю 5ЕО. Мо. 49, походить від ТМЕ і був описаний у патентному документі ОЕ 3,841,768.
Септапептид, представлений 5ЕО. Мо.50, являє собою п'яти-амінокислотний пептид, який є частиною цитокіну ТМЕ, отриманого з поверхні взаємодії даного цитокіну з його клітинними рецепторами: ТМЕК5Ь5 і ТМЕК75, яка примикає (межує) на С-кінці і М-кінці до двох залишків цистеїну. Залишки цистеїну стабілізують циклізацію пептиду за рахунок утворення сульфідної перемички між амінокислотами. Метою циклізації є стабілізація пептиду та підвищення його активності.
Після зв'язування з рецепторами ТКАЇЇ, присутніми на поверхні ракових клітин, злитий протеїн здатний надавати подвійної дії. Домен (а), яким є функціональний фрагмент ТКАЇ., проявить свою відому антагоністичну активність - тобто, зв'яжеться з рецепторами загибелі клітини на поверхні клітини і здійснить активацію зовнішнього шляху апоптозу. Після інтерналізації за допомогою ендоцитозу злитого протеїну, що містить проапоптотичний пептид, що діє внутрішньоклітинно, домен (Б) буде в змозі цілком відчутно здійснювати свою внутрішньоклітинну дію паралельно з активністю домену ТКАЇЇ. Таким чином, протиракова активність ТКАЇЇ. може бути посилена шляхом активації інших елементів і механізмів апоптозу.
Порівняльний злитий протеїн, що інкорпорує проапоптотичний пептид, діючий позаклітинно, повинен потенційно додатково ініціювати апоптотичний шлях через зв'язування ш активацію проапоптотичних рецепторів, інших, ніж ТКАЇ рецептори
В одному з прикладів здійснення винаходу, домени (а) і (б) злитого протеїну можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним.
В іншому прикладі здійснення домен (а) і домен (Б) зв'язані доменом (с), що містить послідовність ділянки розщеплення, розпізнану протеазами, присутніми в клітинному середовищі, особливо в середовищі пухлинної клітини.
Ділянка протезного розщеплення може бути вибрана з наступного переліку: - послідовність, розпізнана металопротеїназою ММР, зокрема послідовності РІ ГАС (5ЕО.
Мо. 51), РІ СІАСЕ (5ЕО Мо. 171) або РІ СІ АБО (ЗЕО. Мо. 173); - послідовність, розпізнана урокіназою шРА, зокрема, послідовність ЕММА (5ЕО). Мо. 52), і - послідовність, розпізнана фурином, зокрема, послідовність КЕККК (5ЕО. Мо. 53), або послідовність ЕЄККЕМУКЕ. (ЗЕО). Мо. 172), та їх комбінації.
Зокрема, ділянка протеазного розщеплення являє собою комбінацію послідовності, розпізнаної металопротеїназою МІМР, і послідовністю, розпізнаною урокіназою иРА, розташованих поруч одна з одною в будь-якому порядку.
В одному з прикладів здійснення домен (с) являє собою комбінацію ММР/ІРА 5ЕО. Мо 51/5еКм/. Мо. 52, тобто послідовність РІ І АСЕМУМК, або комбінацію ни«РА/ММР 5ЕО. Мо 52/5ЕО.
Мо. 51, тобто послідовність ЕММЕРІ СІ АОС.
Такі протеази, як металопротеїназа ММР, урокіназа і / або фурин піддаються гіперекспресії в пухлинному середовищі. Наявність послідовності, розпізнаної протеазою, забезпечує відщеплення домену (а) з домену (Б) після інтерналізації конструкції, тобто секретування функціонального домену (Б) і, отже, його активацію.
Наявність ділянки протеазного розщеплення, завдяки забезпеченню швидкого випуску ефекторного пептиду, підвищує можливості переносу пептиду до місця його дії ще до того моменту, коли може відбутися випадкова деградація злитого протеїну через протеази, присутні в клітині.
Крім того, до домену (Б) ефекторного пептиду злитого протеїну за винаходом може бути приєднаний транспортуючий домен (4), вибраний з групи, яка складається з переліку, що включає: (а1) послідовність, направляючу в ендоплазматичний ретикулум; (аг) послідовність поліаргініну, транспортуючу через клітинні мембрани, що складається з 6, 7, 8 або 9 Агу залишків; бо (а3) домен транслокації Рзхенйдотопах аегидіпоза (синьогнійної палички) (ЗЕО. Мо. 54);
(а4) домен мембранного транспортування (мембрану, транспортуючу домен); (а5) домен ядерної локалізації та (аб) мітохондріальний націлюючий домен та їх комбінації.
Комбінація доменів (а1) (а2) і (а3) може включати в себе, зокрема, комбінацію (а1) / (аг), (ат) / (а3) або (а1) / (аг) / (аз).
Комбінація доменів (41), (а2), (аз), (ад), і (45) може включати, зокрема, також і комбінацію (ат) / (аг), (ат) / (аз), (ат) / (ад), (ат) / (ав) і (ат) / (аг) / (аз), (аз) / (ав), (аг) / (ав), (ат) / (аз) / (ав), (а2) / (аз) / (аб).
Крім того, комбінація доменів (41), (аг), (аз), (ад) ї (45) може включати домени, розташовані поруч один з одним і зв'язані з одним кінцем домену (б), і / або домени, зв'язані з різними кінцями домену (б).
Слід розуміти, що у випадку, коли у злитого протеїну є як транспортуючий домен (94), приєднаний до домену (б), так і домен (с) ділянки розщеплення між доменами (а) і (Б), тоді домен (с) розташований таким чином, що після розщеплення структури транспортуючий домен (4) залишається приєднаним до домену (Б). Іншими словами, якщо злитий протеїн містить і транспортуючий домен (а), і домен ділянки розщеплення (с), то домен (4) розташований між доменом (б) і доменом (с), або він розташований на кітці домену (Б) навпроти точки приєднання домену (4) Винахід не містить такого варіанту, при якому домен (4) розташований між доменом (с) і доменом (а), тобто такого прикладу здійснення, при якому після розщеплення структури транспортуючий домен залишається приєднаним до домену ТКАЇЇ..
Транспортуюча послідовність може бути приєднана в точці М-закінчення або в точці С- закінчення домену (б). У деяких прикладах здійснення транспортуюча послідовність може бути також частиною закінчення всієї структури, наприклад, такою, як частина С-закінчення або частина М-закінчення, залежно від способу приєднання доменів (а) і (Б).
Домен транслокації Рзхейдотопах аегидіпоза (синьогнійної палички) здатний забезпечити транслокацію через лізосомальну мембрану в цитоплазму і може бути застосований для введення ефекторного пептиду в окремі ділянки (компартменти) пухлинної клітини.
Послідовність домену транслокації Рзхейдотопах аегидіпоза (синьогнійної палички)- добре
Зо відома з рівня техніки і представлена наступним:
РЕСОИБІ А А ТАНОАСНІ РІ ЕТЕТАННО РАВСМ/ЕОГ ЕОС СУ РМОВІ МА. МІ ААВІ 5МУМО
МОРОМІАМАЇ А 5РИБИаСОЇ СЕ АІВЕЗБРЕОСАВ ГАЇ ТІ АААЕЗ ЕВЕГУНОСТСОИМ рЕАСААМОаИРА 0 (5ЕО. Мо. 54)
Послідовністю (41), направляючою у ендоплазматичний ретикулум, може бути будь-яка сигнальна послідовність, направляюча в ендоплазматичний ретикулум, відома з рівня техніки, не обмежувальними прикладами якої є КОЕЇ, НОЕЇ, КОБЕЇ, ООБЇ, АОБЕЇ, 5ОБЕЇ, КЕОІ.
Послідовність (а1), переважно, вибирають з переліку послідовностей КОЕЇ. КОЕЇ (5ЕО). Мо. 55) і
КЕОІ (5ЕО. Мо. 56).
Переважно, направляюча послідовність (41) розташована в точці С-закінчення злитого протеїну за винаходом і формує частину його С-закінчення.
Доменом мембранного транспортування (44), може бути будь-яка сигнальна послідовність, транспортуюча через плазмову мембрану, відома з рівня техніки, необмежувальним прикладом якої є КРЕКРУ або К РЕКРУК.
Послідовністю ядерної локалізації (45) може бути будь-яка відома з рівня техніки сигнальна послідовність, направляюча в ядро, необмежувальним прикладом якої є ЕЕЕААСККККККТ (ЗЕО. Мо. 168), ЕРЕААСАКАККАТ, МММААСАКАККАТ, УУМААСЕКАКККЕТ, ААККК, або СК
КАККРТ.
Мітохондріальним націлюючим доменом (06) може бути будь-яка відома з рівня техніки сигнальна послідовність, направляюча в мітохондрію, необмежувальним прикладом якої є
ЕМЗЕСКРОУУЗАМАНЗЕ! ТАТЗУЗОМОЕМОЕМУК (5ЕО. Мо. 166), фрагмент
МІАТКМЕ5І МОККАІЗТОМСМК підгрупи ІМ (ПСОХІМ1), людської оксидази цитохрому, або лідерний пептид орнітин -транскарбамілази.
Крім основних функціональних елементів злитого протеїну, що транспортують домени і ділянки розщеплення доменів, злиті протеїни за даним винаходом можуть містити домен (е), а саме, мотив поліцистеїну, що сприяє тримеру стабілізації, як, наприклад, і не тільки, послідовність СААСАААС (5ЕО). Мо. 177) або СААЕСАДАС (ЗЕО). Мо. 178).
Крім того, домен (є) поліцистеїну може бути приєднаний до одного кінця домену (Б) і / або зв'язаний з різними кінцями домену (б).
Слід розумітися на тому, що у випадку, коли злитий протеїн має як домен (е) поліцистеїну, бо приєднаний до домену (Б), так і домен (с) ділянки розщеплення між доменами (а) і (Б), то домен
(с) розташований таким чином, що після розщеплення структури домен (е) поліцистеїну залишається приєднаним до домену (а). Іншими словами, якщо злитий протеїн містить як домен (є) поліцистеїну, так і домену (с) ділянки розщеплення, то домен (е) розташований між доменом (а) і доменом (с), або знаходиться на кінці домену (а) напроти місця прикріплення домену (4).
Винахід не містить варіанту, при якому домен (є) був би розташований між доменом (с) і доменом (Б), тобто відсутня ситуація, коли після розщеплення структури домен поліцистеїну залишався б прикріпленим до домену ефекторного пептиду.
Окрім основних функціональних елементів злитого протеїну, що транспортують домени і домен (домени) ділянки розщеплення, злиті протеїни за даним винаходом можуть містити нейтральну послідовність / послідовності гнучкого стеричного лінкера (спейсера), що складається з аланіну, гліцину, глютаміну, цистеїну, гістидину і серину залишків. Такі лінкери / спейсери добре відомі і описані в літературі. Їх включення в послідовність злитого протеїну призначене для забезпечення правильного згортання протеїнів, які продукуються в процесі гіперекспресії в клітинах-господарях.
Зокрема, гнучкий стеричних лінкер може бути вибраний з групи, що складається з: СО5О (ЗЕО. Мо. 57), сС1а5 (5ЕО. Мо. 58), СКЗОСОО (ЗЕ. Мо. 59), СОСБОС (5ЕО. Мо. 60), ЗИ, ЗИСЯ (ЗЕО. Мо. 61), ОСС (5ЕО. Мо. 62), С0пСЗИаСсеав (5ЕО. Мо. 63), ССбВОЗИСКОСО (ЗЕ. Мо. 64), АБОаС (ЗЕО. Мо. 65), ССсІБАБОСС (5ЕО. Мо. 66) 5аСбИаБ5 (5ЕО. Мо. 169), СОВВОСОБИСИО (ЗЕО. Мо. 180) (СИНИ (5ЕО. Мо. 182), ЗООСОО5(5ЕО. Мо. 183) и ААСАА (5ЕО). Мо. 184).
В одному з прикладів здійснення, між доменом (а) і доменом (б) додатково присутній домен () послідовності, прийнятної для приєднання до злитого протеїну за винаходом, РЕО (поліетиленгліколь)- молекули (РЕС - лінкера).
Таким лінкер може бути будь-яка відома послідовність АіІазегоІуСузсІуРгосіІм (АБОСОРЕ - в однолітерному зображенні), зазначена у доданому переліку послідовностей, наприклад, 5ЕО.
Мо.170. РЕС-лінкер також може бути вибраний з переліку, що включає АїпЇаАіаСузАїЇаАіа (ААСАА), ЗегоусіуСузсіІусІувег (56500005) І (505005), зазначені в доданому переліку послідовностей, відповідно, ЕС. Мо. 178, 5ЕО. Мо. 177 та ЗЕО. Мо. 179.
В іншому прикладі здійснення домени а) (Б) (с) (а) (е) і (Ї) можуть бути додатково відділені з використанням до трьох амінокислотних залишків, сформованих амінокислотними залишками,
Зо зокрема, вибраними з групи, що складається з гліцину і глютаміну.
Крім того, в деяких прикладах здійснення злитий протеїн може містити в якості частини С- закінчення цілої структури не функціональний фрагмент ПТКАЇЇ, такий як послідовність
ТВА 95-121, якій передує послідовність, що забезпечує його відщеплення від структури, переважно, протеїназної ділянки розщеплення , переважно послідовність, розпізнана тромбіном. Включення такого невеликого не функціонального фрагменту ПТКАЇЇ. надає всій структурі більш високого ступеню гідрофільності, що покращує розчинність протеїну в процесі експресії. Після операцій очищення ПТКАЇ1ІІ.95-121 може бути відщеплений тромбіном. У цьому випадку, ПТЕАЇ1І95-121 не буде присутній в злитім протеїні, який застосовується для отримання фармацевтичної композиції.
Може бути використана будь-яка відома з рівня техніки послідовність, розпізнана тромбіном, зокрема, послідовність | МРКО5З (ЗЕО). Мо. 174).
Така додаткова послідовність ПТКАЇ1І 95-121 особливо доцільна у випадку застосування ліпофільних ефекторних пептидів, а також, коли домен (а) починається амінокислотою 114 і вище в послідовності всієї ТЕАЇЇ..
Конкретні приклади здійснення злитого протеїну за винаходом являють собою злиті протеїни, що містять внутрішньоклітинно діючий проапоптотичний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених:5ЕО. Мо. 1, ЗЕО. Мо. 2, 5ЕО. Мо. 3, ЗЕО. Мо. 4, ЗЕО.,
Мо. 5, 5ЕО. Мо. 6, 5ЕО. Мо. 7, 5ЕО. Мо. 8, ЕС. Мо. 9, 5ЕО. Мо. 10, 5ЕО. Мо. 11, 5ЕО. Мо. 12,
ЗЕО. Мо. 13, 5ЕО. Мо. 14, 5ЕО. Мо. 15, 5ЕО. Мо. 16, 5ЕО. Мо. 17, 5ЕО. Мо. 18, 5ЕО. Мо. 19,
ЗЕО. Мо. 20, 5ЕО. Мо. 21, 5ЕО. Мо. 22, 5ЕО. Мо 23, 5ЕО. Мо. 93, 5ЕО. Мо. 94, 5ЕО. Мо. 95,
ЗЕО. Мо. 96, 5ЕО., Мо. 97, 5ЕО. Мо. 98, 5ЕО. Мо. 99, 5ЕО. Мо. 100, 5ЕО. Мо. 101, 5ЕО. Мо. 102,
ЗЕО. Мо. 103, 5ЕО. Мо. 104, 5ЕО. Мо. 105, 5ЕО. Мо. 106, 5ЕО. Мо. 107, 5ЕО. Мо. 108, 5ЕО. Мо. 109, 5ЕО. Мо. 110, 5ЕО. Мо. 111, 5ЕО. Мо. 112, 5ЕО. Мо. 113, 5ЕО. Мо. 114, 5ЕО. Мо 115, 5ЕО.
Мо. 116, 5ЕО. Мо. 117, 5ЕО. Мо. 118, 5ЕО. Мо. 119, 5ЕО. Мо. 120 и 5ЕО. Мо. 121.
Іншими специфічними прикладами здійснення злитого протеїну за винаходом є злиті протеїни, що містять позаклітинно діючий проапоптотичний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених ЗЕО). Мо. 24, БЕО. Мо. 25 і ЗЕО). Мо. 26.
Детальне розкриття структури згаданих вище репрезентативних злитих протеїнів, представлено на фіг. 1 - 5 і 9 - 13, а також в описаних нижче прикладах.
Відповідно до даного винаходу, поняття злитого протеїну означає одиночну молекулу протеїну, що містить два або більше протеїнів або їх фрагментів, ковалентно зв'язаних за допомогою пептидного зв'язку в межах їх відповідних пептидних ланцюгів без додаткових хімічних лінкерів.
В якості альтернативи, злитий протеїн може бути описаний як узагальнений образ структури протеїну або химерний протеїн. Відповідно до даного винаходу, терміни "узагальнений образ структури протеїну" або "химерний протеїн", якщо вони використовується, слід розуміти як такі, що відносяться до злитого протеїну, згідно з визначення, наданим вище.
Для фахівця, кваліфікованого в даній області техніко, є очевидним, що злитий протеїн, визначений таким чином, може бути синтезований відомими методами хімічного синтезу пептидів та протеїнів.
Злитий протеїн може бути синтезований з використанням методів хімічного синтезу пептидів, зокрема, із застосуванням методів синтезу пептидів в твердій фазі, використовуючи відповідні смоли в якості носіїв. Такі методи є традиційними і відомими з рівня техніки, зокрема, вони описані в таких монографіях як, наприклад, |Водап52Кку апа Водап52Ку, Те Ргасіїсе ої
Реріїде Зупіпезіз (Застосування пептидного синтезу на практиці), 1984, Зргіпдег-Мепад, Мем
УоїК, сіемагі еї аї., од Рназе Реріїде зупіпезі5 (Твердофазний пептидний синтез), 2па Еайіоп, 1984, Ріетсе Снетіса! Сотрапу.
Злитий протеїн може бути синтезований із застосуванням методів хімічного синтезу пептидів як безперервний протеїн. Крім того, окремі фрагменти (домени) протеїну можуть бути синтезовані окремо, а потім об'єднані разом в один безперервний пептид через пептидний зв'язок шляхом конденсації аміно - закінчення одного пептидного фрагменту із карбоксильного закінчення другого пептиду. Такі методи є традиційними і добре відомі з рівня техніки.
Для перевірки структури отриманого пептиду можуть бути використані відомі методи аналізу амінокислотного складу пептидів, наприклад, метод мас-спектрометрії високого дозволу для визначення молекулярної маси пептидів. Для підтвердження пептидної послідовності можуть бути також використані секвенсори протеїну, які послідовно руйнують пептид і ідентифікують послідовність амінокислот.
Однак, переважно, злитий протеїн за винаходом є рекомбінантним протеїном, генерованим
Зо методами генної експресії полінуклеотидної послідовності, що кодує злитий протеїн у клітинах- господарях.
Ще одним аспектом винаходу є полінуклеотидна послідовність, зокрема, послідовність ДНК, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище.
Переважно, полінуклеотидною послідовністю, зокрема ДНК, що, відповідно до винаходу, кодує злитої протеїн, як зазначено вище, є послідовність, яка оптимізована для експресії в
Е. сої.
Іншим аспектом винаходу є також вектор експресії, що містить полінуклеотидну послідовність, зокрема, послідовність ДНК за винаходом, як визначено вище.
Ще одним аспектом винаходу є також клітина - господар, що містить вектор експресії, як описано вище.
Переважною клітиною-господарем для експресії злитих протеїнів за винаходом є клітина Е. соїї (клітина кишкової палички).
Способи генерування рекомбінантних протеїнів, у тому числі злитих протеїнів, добре відомі.
Якщо говорити коротко, даний спосіб полягає в генеруванні полінуклеотидної молекули, наприклад молекули ДНК, що кодує амінокислотну послідовність цільового протеїну і спрямовує експресію цільового протеїну в клітині-хазяїні. Далі цільовий протеїн, що кодує полінуклеотидну молекулу, інкорпорують у відповідний вектор експресії, який забезпечує ефективну експресію поліпептиду. Далі рекомбінантний вектор експресії вводять в клітини-господарі для трансфекції / трансформації, і, як наслідок, виробляють трансформовану клітину-господаря. Після цього культурою трансформованих клітин піддають гіперекспресії цільовий протеїн, забезпечують очистку отриманих протеїнів, і, за вибором, відділлють шляхом відщеплення марковані послідовності, застосовані для експресії або очищення протеїну.
Придатні способи експресії і очищення описані, наприклад, в монографії Соеадаеєї, Сепе
Ехргеззіоп ТесппоЇоду, МеїШйоавз іп Еп7утоїіоду (Технологія генної експресії, методи ензимології) 185, Асадетіс Ргезз, Зап Оієдо, СА (1990), апа А. єгагоп вї аі!., Адмапсев МіКгобіо!., 2008, 47, 2, 1983-1995.
В якості векторів експресії для впровадження і тиражування послідовностей ДНК в клітинах- господарях можуть бути використані косміди, плазміди або модифіковані віруси. Зазвичай, в якості векторів експресії використовують плазміди. Відповідні для цієї мети плазміди добре бо відомі і комерційно доступні.
Вектор експресії за винаходом включає полінуклеотидну молекулу, що кодує злитий протеїн за винаходом і необхідні регуляторні послідовності для транскрипції і трансляції кодуючої послідовності, інкорпорованої в підходящу клітину-господаря. Вибір регуляторних послідовностей залежить від типу клітин-господарів і може бути легко здійснений кваліфікованим фахівцем в даній області. Прикладами таких регуляторних послідовностей є транскрипційний промотор і енхансер (підсилювач) або РНК - полімераза - звязувальна послідовність, рибосома - зв'язувальна послідовність, що містить сигнал ініціації транскрипції, вбудований перед кодуючою послідовністю і послідовність закінчення транскрипції, вбудовану після кодуючої послідовності . Крім того, в залежності від клітини-хазяїна і застосованого вектора, в вектор експресії можуть бути введені інші послідовності, такі як джерело реплікації, додаткові ділянки рестрикції ДНК, підсилювачі (енхансери) і послідовності, що забезпечують індукування транскрипції.
Вектор експресії також буде містити послідовність маркерного гена, який надає визначеного фенотипу трансформованій клітині і створює можливість для специфічної селекції трансформованих клітин. Крім того, вектор може також містити іншу маркерну послідовність, яка дозволяє відрізняти клітини, трансформовані рекомбінантною плазмідою, що містить вбудовану кодуючу послідовність цільового протеїну, від тих, які прийняли плазміду без інсерту (вставки).
Найчастіше використовуються типові маркери стійкі до антибіотиків, однак, можуть бути використані будь-які інші репортерні гени, відомі з рівня техніки, чия присутність в клітині (в природних умовах) може бути легко визначена з використанням методів авторадіографії, спектрофотометрії або біо-та хемілюмінесценції. Наприклад, в залежності від клітини-хазяїна, можуть бути використані такі репортерні гени, як ВД-галактозидаза, ВД-глюкуронідаза, люціферази, хлорамфенікол ацетилтрансфераза або зелений флуоресцентний протеїн.
Крім того, вектор експресії може містити сигнальну послідовність, транспортуючу протеїни у відповідний клітинний компартмент, наприклад, періплазму, де полегшується утворення складчастості. При цьому, може бути присутньою послідовність, яка кодує мітку / тег, така як
НіхТад, прикріплена до точки М закінчення, або О5Т, прикріплена до точки С закінчення, що полегшує подальше очищення протеїну, яке відбувається з використанням принципу афінності, за допомогою афінної хроматографії на нікелевій колонці Також можуть бути присутніми додаткові послідовності, які захищають протеїни від протеолітичної деградації в клітинах- господарях, а також послідовності, які підвищують його розчинність.
Допоміжний елемент, приєднаний до послідовності цільового протеїну, може блокувати її діяльність, або чинити несприятливий вплив з іншої причини, наприклад, через токсичність.
Такий елемент повинен бути вилучений, що може бути досягнуто шляхом ферментативного або хімічного розщеплення.
Зокрема, шестигістидиновий маркер НіхТад або інші маркери зазначеного типу, приєднані для забезпечення очищення протеїну за допомогою афінної хроматографії, повинні бути видалені, через уже описаний вплив на печінкову токсичність розчинного протеїну ТКАЇ..
Можуть бути використані гетерологічні системи експресії на основі різних відомих клітин- господарів, в тому числі прокаріотичних клітин, бактеріальних клітин, таких як кишкова паличка (ЕзеПетісніа сої) або сінна паличка (Васіїйи5 5и,ибійї5), дріжджі, такі як Засспаготусез сегмізіає або
Ріспіа разіогі5 (пекарські дріжджі), і еукаріотичні клітинні лінії (комах, ссавців, рослин).
Переважно, у зв'язку з простотою культивування та генетичних маніпуляцій, а також великою кількістю отриманого продукту, використовується система експресії Е. соїї (кишкової палички).
Відповідно, полінуклеотидна послідовність, що містить цільову послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, буде оптимізована для експресії в Е. соїїЇ, тобто в кодуючій послідовності вона буде містити кодони, оптимальні для експресії в Е. соїї, вибрані з можливих варіантів послідовностей, відомих з рівня техніки. Крім того, вектор експресії буде містити описані вище елементи, що підходять для Е. соїї, приєднані до кодуючої послідовності.
Таким чином, у переважному прикладі здійснення винаходу полінуклеотидна послідовність, що містить послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, оптимізований для експресії в
Е. соїї, вибрана з групи полінуклеотидних послідовностей, що складається з: 5ЕО. Мо. 67, 5ЕО.
Мо. 68, 5ЕО. Мо. 69, 5ЕО. Мо. 70, 5ЕО. Мо. 71, 5ЕО. Мо. 72, ЗЕО. Мо. 73, ЗЕО. Мо. 74, 5ЕО. Мо. 75, 5ЕО. Мо. 76, 5ЕО). Мо. 77, 5ЕО. Мо. 78, 5ЕО. Мо. 79, 5ЕО). Мо. 80, 5ЕО. Мо. 81, 5ЕО. Мо. 82,
ЗЕО. Мо. 83, 5ЕО. Мо. 84, 5ЕО. Мо. 85, 5ЕО. Мо. 86, 5ЕО. Мо. 87, 5ЕО. Мо. 88), 5ЕО. Мо. 89,
ЗЕО. Мо. 90, 5ЕО. Мо. 91, 5ЕО. Мо. 92, 5ЕО. Мо. 122, ЗЕО. Мо. 123, 5ЕО. Мо. 124, 5ЕО. Мо. 125,
ЗЕО. Мо. 126, 5ЕО. Мо. 127, ЗЕО. Мо. 128, 5ЕО. Мо. 129, 5ЕО. Мо. 130, 5ЕО. Мо. 191, 5ЕО. Мо. (510) 132, 5ЕО. Мо. 133, 5ЕО. Мо. 134, 5ЕО. Мо. 135, 5ЕО. Мо. 136, 5ЕО. Мо. 137, 5ЕО. Мо. 138, 5ЕО.
Мо. 139, 5ЕО. Мо. 140, 5ЕО. Мо. 141, 5ЕО. Мо. 142, 5ЕО. Мо. 143), 5ЕО. Мо. 144, 5ЕО. Мо. 145,
ЗЕО. Мо. 146, 5ЕО. Мо. 147; 5ЕО. Мо. 148, 5ЕО. Мо. 149 і ЗЕО. Мо. 150, які кодують злитий протеїн, що має амінокислотну послідовність, відповідну до амінокислотної послідовності, вибраної з огруппи, яка складається з амінокислотних послідовностей: ЗЕО. Мо. 1, 5ЕО. Мо. 2, 5ЕО. Мо. 3, 5ЕО. Мо. 4, 5ЕО. Мо. 5, 5ЕО. Мо. 6, 5ЕО.
Мо. 7, зЕО. Мо. 8, 5ЕО. Мо. 9, 5ЕО. Мо. 10, 5ЕО. Мо. 11, 5ЕО. Мо. 12, 5ЕО. Мо. 13, 5ЕО. Мо. 14,
ЗЕО. Мо. 15, 5ЕО. Мо. 16, 5ЕО. Мо. 17, ЗЕО. Мо. 18, 5ЕО. Мо. 19, 5ЕО. Мо. 20, 5ЕО. Мо. 21,
ЗЕО. Мо. 22), ЗЕО. Мо. 23, 5ЕО. Мо. 24, З5ЕО. Мо. 25, 5ЕО. Мо. 26, 5ЕО Мо. 93, 5ЕО. Мо. 94,
ЗЕО. Мо. 95, 5ЕО. Мо. 96, 5ЕО. Мо. 97, 5ЕО. Мо. 98, 5ЕО. Мо. 99, 5ЕО. Мо. 100, 5ЕО. Мо. 101,
ЗЕО. Мо. 102, ЗЕО. Мо. 103, 5ЕО. Мо. 104, 5ЕО. Мо. 105, 5ЕО. Мо. 106, 5ЕО. Мо. 107, 5ЕО. Мо. 108, 5ЕО. Мо. 109, 5ЕО. Мо. 110, 5ЕО. Мо. 111, 5ЕО. Мо. 112, 5ЕО. Мо. 113, 5ЕО. Мо. 114, 5ЕО.
Мо. 115, 5ЕО. Мо. 116, 5ЕО. Мо. 117 и 5ЕО. Мо. 118, 5ЕО. Мо. 119, 5ЕО. Мо. 120 и 5ЕО. Мо. 121.
У переважному прикладі здійснення винахід також забезпечує вектор експресії, придатний для трансформації Е. сої, що містить полінуклеотидну послідовність, обрану з групи полінуклеотидних послідовностей від 5ЕО. Мо. 67 до 5БЕО). Мо. 92 і от БЕО. Мо. 122 до 5ЕО. Мо. 150, зазначених вище, а також клітини Е. соїї, трансформовані таким вектором експресії.
Трансформація, тобто введення послідовності ДНК в бактеріальні клітини-хазяїни, зокрема,
Е. соїї (кишкову паличку), як правило, здійснюється на компетентних клітинах, приготованих для сприйняття ДНК, наприклад, шляхом обробки іонами кальцію при низькій температурі (4 "С), з подальшою дією із застосуванням теплового шоку (при 37-42 "С), або методом електропорації.
Такі способи добре відомі і, як правило, визначаються виробником системи експресії.
Процедура гіперекспресії злитих протеїнів за даним винаходом у системі експресії Е. сої, буде описана нижче.
Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить злитий протеїн за винаходом, як визначено вище, в якості активного інгредієнта, а також відповідного фармацевтично прийнятного носія, розріджувача та звичайні допоміжні компоненти.
Фармацевтична композиція має містити ефективну кількість злитого протеїну за винаходом і фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти, розчинені або дисперговані у носії або
Зо розріджувачі, і бажано, фармацевтична композиція має бути представлена виконаною в стандартній лікарській формі з дозувальною одиницею або у вигляді препарату, що містить безліч доз.
Фармацевтичні форми і методи їх приготування, а також інші компоненти, носії та розріджувачі відомі кваліфікованим фахівцям і описані в літературі. Наприклад, вони описані в монографії Кетіпдоп'5 Рпагтасеціїса! Зсіепсевз, єй. 20, 2000, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавюп,
БА.
Термін "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та допоміжний інгредієнт" включає будь-які розчинники, дисперсійні середовища, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, стабілізатори, консерванти (наприклад, антибактеріальні засоби, протигрибкові препарати), ізотонічні агенти, відомі з рівня техніки. Фармацевтична композиція за винаходом може містити різні типи носіїв, розріджувачів та наповнювачів, в залежності від обраного способу введення і бажаних лікарських форм, таких як рідкі, тверді і аерозольні форми для орального, парентерального, інгаляційного, місцевого (зовнішнього) застосування, при цьому, обрана форма повинна бути стерильною при її введенні методом ін'єкції.
Кращим шляхом введення фармацевтичної композиції за винаходом є парентеральний шлях, в тому числі із застосуванням маршрутів ін'єкції таких як внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньочеревний, внутрішньопухлинний, також шлях або одноразового, або безперервного внутрішньовенного вливання.
В одному з прикладів здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена шляхом ін'єкції безпосередньо в пухлину. В іншому прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена внутрішньовенно. У ще в одному прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена підшкірно або інтраперитонеально (внутрішньочеревно).
Фармацевтичною композицією для парентерального введення може бути розчин або дисперсія в фармацевтично прийнятному водному або неводному середовищі, що містить буферний розчин для забезпечення відповідного показника рН та є ізоосмотичним щодо внутрішніх рідин організму, в разі необхідності, а також може містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні агенти і розчинні речовини, які роблять композицію сумісною з тканинами чи кров'ю реципієнта. Іншими компонентами, які можуть бути включені в композицію, є, наприклад, 60 вода, спирти, такі як етанол, поліоли, такі як гліцерин, пропіленгліколь, рідкий поліетиленгліколь, ліпіди, такі як тригліцериди, рослинні олії, ліпосоми. Відповідна плинність і розмір часток вказаної речовини може бути забезпечена за рахунок покривних речовини, таких як лецитин і поверхнево-активні речовини, наприклад, гідроксипропілцелюлози полісорбат, і інших подібних речовин. Підходящими ізотонічними (ізоЇопіпд) засобами для парентеральних рідких композицій, є, наприклад, цукри, такі як глюкоза, і хлорид натрію, а також їх комбінації.
Крім того, фармацевтична композиція для введення шляхом ін'єкції або інфузії, може бути приготована у вигляді порошку, наприклад, у вигляді ліофілізованого порошку, що розводиться безпосередньо перед використанням у відповідному носії, такому як, наприклад, стерильна апірогенна вода.
Фармацевтична композиція за винаходом для парентерального введення в організм може також мати форму, придатну для інтраназального введення, в тому числі, вона може бути приготована у вигляді розчинів, спреїв або аерозолів. Переважно, форма для інтраназального введення представлена у вигляді водного розчину і є ізотонічною або містить буферний розчин для підтримання показника рН від приблизно 5,5 до приблизно 6,5, щоб забезпечувати характеристики композиції аналогічними за своїми ознаками виділенням з носа. Крім того, композиція містить консерванти і стабілізатори, наприклад, такі як у відомих інтраназальних препаратах.
Композиція може містити різні антиоксиданти, які уповільнюють окислення одного або декількох компонентів. Крім того, з метою запобігання дії мікроорганізмів, композиція може містити різні антибактеріальні і протигрибкові засоби, в тому числі, наприклад, і не обмежуючись названим, парабени, хлорбутанол, тімеросал, сорбінова кислота, і подібні відомі речовини зазначеного типу.
Загалом, фармацевтична композиція за винаходом може включати, наприклад, щонайменше, близько 0,0195 по вазі активного інгредієнта. Зокрема, композиція може містити активний інгредієнт у кількості від 1956 до 7595 за вагою одиниці композиції або, наприклад, від 2595 до 6095 за вагою, але не обмежуючись зазначеними значеннями.
Фактична кількість дози композиції за даним винаходом, введена пацієнтам, включаючи людину, має визначатися фізичними і фізіологічними факторами, наприклад, такими як вага тіла, тяжкість стану хворого, вид захворювання, яке лікують, попередні або супутні терапевтичні втручання і спосіб введення композиції. Підходяща одинична доза, загальна доза та концентрація активного інгредієнта в композиції повинна визначатися лікарем.
Композиція може, наприклад, вводитися при дозуванні від близько 1 мкг / кг маси тіла до, приблизно, 1000 мг / кг маси тіла пацієнта, наприклад, в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 100 мг / кг маси тіла або в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 500 мг / кг маси тіла.
Злитий протеїн і композиції що його включають, проявляють протиракову або протипухлинну активність і можуть бути використані для лікування ракових захворювань.
Винахід також відноситься до застосування злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, для лікування онкологічних захворювань у ссавців, включаючи людину.
Винахід також відноситься до способу лікування онкологічних захворювань у ссавців, у тому числі людини, що включає введення пацієнту, потребуючому такого лікування, протиракової ефективної кількості злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, опційно, у вигляді відповідної фармацевтичної композиції.
Злитий протеїн за винаходом може бути використаний для лікування гематологічних злоякісних новоутворень, таких як лейкемія, гранулематоз, мієлома та інших гематологічних злоякісних новоутворень. Злитий протеїн також може бути використаний для лікування щільних пухлин, таких як рак молочної залози, рак легені, в тому числі недрібноклітинний рак легені, рак товстої кишки, рак підшлункової залози, рак яєчників, рак сечового міхура, рак простати, рак нирки, рак мозку тощо.
Відповідні шляхи введення злитого протеїну при лікуванні раку, зокрема, включають парентеральний шлях, який полягає у введенні злитого протеїну за винаходом у вигляді ін'єкцій або інфузій (вливань), застосовуючи композицію і форму, прийнятну для такого шляху введення.
Винахід більш детально розкрито в описі наступних загальних процедур і прикладів специфічних злитих протеїнів.
Загальна процедура гіперекспресії злитого протеїну
Приготування плазміди
Амінокислотна послідовність цільового злитого протеїну була використана в якості шаблону для генерування кодуючої його послідовності ДНК, що містить кодони, оптимізовані для експресії в ЕссПегіспіа соїї (кишковій паличці). Така процедура дозволяє збільшити ефективність бо наступної операції синтезу цільового протеїну в Еб5сПегіспіа соїї (кишковій паличці). Далі була автоматично синтезована результуюча нуклеотидна послідовність. Крім того, ділянки розщеплення ферментів рестрикції Маеї (на 5'-кінці ведучої нитки) і Хпої (на 3'-кінці ведучої нитки) були додані до результуючого гену, що кодує цільовий протеїн. Вони були використані для клонування гену у векторі рРЕТ2ва (Момадеп). Вони також можуть бути використані для клонування гену, що кодує протеїн для інших векторів. Цільовий протеїн, експресований з даної структури, був забезпечений на М-кінці полігістидиновим тегом (шість гістидинів), якому передує ділянка, розпізнана (активізована) тромбіном, що згодом застосовується для його очищення за допомогою афінної хроматографії. Коректність отриманої структури була підтверджена, по- перше, дослідженням рестрикції виділених плазмід із застосуванням ферментів Маеї ї Хпої, а потім автоматичним секвенуванням усієї рамки зчитування цільового протеїну. Праймери, використані для секвенування, стали доповненням до послідовностей промотора Т7 (5-
ТААТАСО,АСТОСАСТАТАСИ-3 У) і термінатора Т7 (5-Я4СтТАаТТАТТаСтТодасСааИ-3, присутніх у векторі.
Результуюча плазміда була використана для гіперекспресії цільового злитого протеїну в комерційному штамі Е. сої, який був трансформований у відповідності до рекомендацій виробника. Колонії, отримані на селективному середовищі (І В агар, канаміцин (50 мкг / мл), 195 розчин глюкози), були використані для підготовки нічної культури в рідкому середовищі І В, доповнені канаміцином (50 мкг / мл) і 195 глюкозою. Через 15 годин росту культури, отримані в перемішувальному інкубаторі, були застосовані для інокуляції відповідної заданої культури.
Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів - загальна процедура А
ЇВ середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкм (ОМ) сульфату цинку інокулювали нічною культурою. Культуру інкубували при 37 "С до тих пір, поки оптична щільність (00) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Потім додавали ІРТО до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,25-1мМ. Після перемішувальної інкубації (3,5 - 20год-) при 25"С культуру центрифугували протягом 25 хв при 60009).
Бактеріальні гранули повторно суспендували в буфері, що містить 50 мМ КНеРО», 0,5 М
Масі, 10 мм імідазолу, рН 7,4. Суспензію обробляли ультразвуком на льоду протягом 8 хвилин (40956 - амплітуда, 15-секундний імпульс, інтервал 10с) Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 40 хвилин при 20000 д, 4 "С. Смолу Мі-зернагозе (Мі-. сефароза)
Зо (СЕ Неаййсаге) попередньо обробляли методом урівноваження буфером, який використовували для приготування екстракту бактеріальних клітин. Далі смолу інкубували протягом ночі при 4 "С з супернатантом, отриманим після центрифугування екстракту. Далі її завантажували в хроматографічну колонку і промивали від 15 до 50 об'ємами буфера 50 мМ
КНе2РО», 0,5 М Масі, 20 мМ імідазолу, рН 7,4. Отриманий протеїн елюїрували з колонки з використанням градієнту імідазолу в буфері 50 мМ КНе2РО» з 0,5 М Масі, рН 7,4. Одержані фракції досліджували (аналізували) за допомогою 505-РАСЕ. Відповідні фракції об'єднували і діалізували протягом ночі при 4 "С проти 50 мМ Тріс-буфера, рН 7,2, 150 мМ Масі, 500 мМ 1 - аргініну, 0,1 мМ 2п5О»5, 0,0195 Твін (Твін) 20, і в той же час Нібхіїад розщеплювали тромбіном (1:50). Після розщеплення тромбін був відділений від цільового злитого протеїну, завдяки використанню смоли Веплатідіпе Зерпагозе"М. Чистоту продукту досліджували із застосуванням 5О5-РАСЕ - електрофорезу |Мапіаїі5 еї аі, МоіІесшаг Сіопіпд. (Молекулярне клонування) Соїй 5ргіпд Нагбог, МУ, 19821.
Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів - загальна процедура В
ЇВ середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ сульфату цинку було інокульоване нічною культурою. Культуру інкубували при 37 "С до тих пір, поки оптична щільність (00) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Далі додавали ІРТО до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,5-їмм. Після 20 - годинної перемішувальної інкубації при 25"С культуру центрифугували протягом 25 хв при 6000 4.
Після гіперекспресії бактеріальні клітини були зруйновані у френч-пресі у буфері, що містить
БО 50 мМ КНоРО», 0.5 М Масі, 10 мм імідазолу, 5мММ бета-меркаптоетанолу, 0,5 мкм РМ5Е (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8.
Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 50 хвилин при 80000 4.
Смолу Мі-5ернагозе (Мі-сефарозу) інкубували протягом ночі з отриманим супернатантом. Після цього смолу зі зв'язаним протеїном упаковували в хроматографічну колонку. Для вимивання 55 фракцій, що містять незв'язувальні протеїни, колонку промивали від 15 до 50 об'ємами буферу мМ КНоРО»х, 0,5 М Масі, 10 мМ імідазолу, 5 мМ бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ РМ5Е (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8. Далі, щоб вимити більшість протеїнів, специфічно зв'язуючих із шаром (постіллю), колонку промивали буфером, що містить 50 мМ
КНегРО», 0,5 М Масі, 500 мМ імідазолу, 1095 гліцерину, 0,5 мм РМ5БЕ, рн 7, 5.
Отримані фракції досліджували із застосуванням 505-РАСЕ (Мапіаїзз евї аі, МоїІесшаг СіІопіпд (Молекулярне клонування). Соїа ргіпу Нагбог, МУ, 1982).
Фракції, що містять цільовий протеїн, об'єднували і розщеплювали тромбіном (1 на 4 мг протеїну, 8 годин при 16 2 С), щоб видалити полігістидиновий тег (мітку). Потім фракції піддавали діалізу проти буфера (500 мМ Г -аргініну, 50 мМ Тріс (Ттгів), 2,5 мМ 2п5О», рН 7,4).
Кваліфікація злитих протеїнів з використанням 2-О електрофорезу
З метою подальшого вивчення отриманих протеїнів і підбору точних хроматографічних режимів, були визначені ізоелектричні точки протеїнів. Для цього був застосований спосіб двовимірного електрофорезу (2-03), виконаний в два етапи у відповідності з наступним графіком.
Етап 1. Ізоелектричне фокусування протеїнів в умовах градієнту рН і в умовах денатурації.
Протеїнові препарати при концентрації 1 - 2 мг / мл осаджувалися шляхом змішування в співвідношенні 1:01 з розчином осаду, що містить 1095 трихлоруксусної кислоти і 0,0795 бета- меркаптоетанолу в ацетоні. Суміш інкубували протягом 30 хв. при температурі -20 "С, а потім центрифугували протягом 25 хв. при 15000 д і 4 "С. Супернатант видаляли, а осад двічі промивали холодним ацетоном з 0,0795 бета-меркаптоетанолом. Потім залишки ацетону випарювали до зникнення запаху. Осад протеїну суспендували в 250 мл буфера регідратації 8
М сечовини, 195 СНАР5, 15 мм ОТ, 0,595 амфоліту (СЕ Неайвсаге) з профілем рН 3-11 або 6- 11, в залежності від використовуваної в подальшому смуги. Розчин протеїну поміщали в керамічну камеру для ізоелектричного фокусування, а потім досліджували за допомогою пристрою 13 см Огузігір (СЕ Неайсаге) з відповідним профілем рН (3-11 або 6-11). Весь вміст було покрито шаром мінерального масла. Камери були розміщені в ЄНМап ІРорпог ПІ апараті, де ізоелектричне фокусування було проведено відповідно до наступної програми, призначеної для обраних розмірів смуги і рН профілю: 16 годин дегідратації при 20 "С.
Фокусування в електричному полі при фіксованому градієнті рн
Далі смугу, що містить сфокусовані протеїни промивали протягом 1 хвилини у деїонізованій воді, фарбували кумасі діамантовим (Соотабввзіе ВгіПапі), а потім знебарвлювали і архівували в
Зо якості зображення, щоб відзначити розташування протеїнів. Знебарвлену смугу врівноважували 2 х 15 хв. буфером, що має наступний склад: 50 мМ Ттгі5-НСЇ, рН 8,8, ЄМ сечовини, 195 ОТТ, 295
ОБ, 3095 гліцерину.
Етап 2. Відділення (розділення) в другому напрямку за допомогою ЗО5-РАСЕ.
Смуга була поміщена на 12,595 поліакриламідний гель, що містить єдину лунку на стандартний розмір, після чого проводили відділення в апараті для здійснення електрофорезу
ЗО5-РАСЕ при напрузі 200 В протягом З годин. Гель фарбували кумасі діамантовим, а потім архівували з нанесеною шкалою. Протеїн ідентифікували шляхом визначення ваги на основі стандарту розміру, при цьому його ІРІ був прочитаний для шкали 6-11 на основі кривих, наданих виробником (СЕ Неайсаге) (відношення рНоО» до9о довжини смуги з кінця, поміченого як анод), або для шкали 3-11 на основі кривої, визначеної експериментально за допомогою ізоелектричного фокусуючого калібрувального комплекту (СЕ Неайсаге).
Типові приклади злитих протеїнів за винаходом, описані нижче.
Приклад 1. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 1
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 1 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 194 амінокислот, і масу 22,7 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКА 121-281 16- амінокислотний пептид, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вах (ЗЕО. Мо. 30), приєднаний в якості ефекторного пептиду. На С-кінці 16-амінокислотної послідовності ефекторниого пептиду приєднана поліаргінінова послідовність з 7 Агод / К залишків.
Поліаргінінова послідовність сприяє забезпеченню проникності клітинної мембрани і створює умови для транспортування злитого протеїну в клітину. Між поліаргініновою послідовністю і доменом ТКАЇ/Г. існують інкорпоровані послідовно один за одним послідовності, розпізнані урокіназою чРА (ЗЕО). Мо. 52) і металопротеїназою ММР (5ЕО). Мо. 51), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 1 і ЗЕО. Мо. 67.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 1 1 ККІЕЗЕСІ КВІ аСЕГОЗАААВ ВВА РМУМРРІ С ГГ АСАМААНІТ аТтвав5МТтіІ 5 51 БРМУКМЕКАЇ. САКІМЗУЕЗ5 БОННІ ЗМІ НІ ВМО МІН ЕКСЕУМІМ5О 101 ТУЕВЕРОЕБЕІК ЕМТКМОКОМУ ОМІУКУТ5МР ОРІ МКБЗАВ МЗСУМУЗКОАЕУ 151 СІ БІОС ЕЕ КЕМОВІЄЕ МЗМТМЕНІОІО МОНЕА5БЕРЕСА РІ Ма
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 67 1 ВСССАССАСА ДАТаСАССАА АДААаСтТаас ТСАТОаАТОС АТАТСААТСА САТаТТСАТТ ваТСАСасто АСАДАДААТас аАТСАТТТТО ТТТСАаТаттТсСА 101 ААААТаССАС ССТОаАТААДАТ аСтТАТАСАСВОС ССАТАТІСТО САТСТТТаст
ССААСАСаСТА ТТАСОЯааТОаСас ТТТСАТСАС САВААТССОССА ТССа,аАТАСО 201 ТастТАТАТТТ АТАААТатТАС ТАСАССАТТТ СТТТАТСАТТ ТТТОСТАТТТ ТСТТТААТТТ
СТТОСТОаААА ССОПСААдАТАа атСстасйстТАТ АААТАТААТА 301 АААОССТТТІ ТСАТОААТСА ССАпТТСАСС АТТАСОаСАСА тТаСАсСАТТаС
ТСАСАдАасСтТ АТаАдсСсастА Ссастастт ссСАастТАТТ ААТТТТасСаА 401 сСССАпаОаСТ ТІ САТТІ асСтТАТТСсСса! СТаСтСАпсс 0 тТАТТасСтТАСа
АССАСССОаТа ССаатААТАТ ЧаТаСтТасААС Асада АйАСоСА,асСа 501 сСАССААСААС АСадСадбас бОаАСсАСаАС сАСОассСТАТСО САСТТСАТСА
ССААТАСИатТтТ ТСАсасАТТО астТоСАСТТ ТТ
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування її кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами БЕ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) і Типег (ОЕЗ) рі уз5, обидва з
Момадеп. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу у відповідності із загальною методикою (процедурою), описаною вище.
Приклад 2. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 2
Ко) Злитий протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 2 являє собою протеїн, що має довжину, складену із 193 амінокислот, і масу 22, 5 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТВАїЇЇ 16- амінокислотний пептид, отриманий з протеїну Вій (ЗЕО. Мо. 31), приєднаний в якості ефекторного пептиду. Крім того, до С-кінця ефекторного протеїну приєднана поліаргінінова послідовність, що складається з 7 Агод - залишків.
Поліаргінінова послідовність сприяє забезпеченню проникності клітинної мембрани і створює умови для транспортування злитого протеїну в клітину. Між поліаргініновою послідовністю і послідовністю ТКАЇЇ існують інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані урокіназою чРА (ЗЕО). Мо. 52) і металопротеїназою ММР (ЗЕО. Мо. 51) і урокіназою ЧчРА (5ЕО. Мо. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 2 і ЗЕО. Мо. 68.
Амінокислотна послідовність: ЕС). Мо. 2 1 ВМІАВН АОМ СО5МОААВААВА ВВРУМАРІ а. АЯВМААНІТа ТВОаВ5МТтІ 55 51 РМЗКМЕКАЇ Сх ВКІМЗУУЕЗЗА БОН5ЗЕЇ ЗМІ Н І АМОЕЇ МІНЕ КОЕММІМ5ОТ 101 МЕВЕРОЕЄЕІКЕ МІКМОКОММО МІУКУТ5МУРО РІЇ МКЗАВМ 5БСМУЗКОАЕМО 151 ГМБІМОСИаїв ЕГКЕМОВІЄЕМ БМТМЕНІ ТОМ ОНЕА5ЕЕСАБК І Уа
ДНК послідовності: 5ЕО). Мо. 68 1 СОаОтТААТАТТа САСОТСАТСТ паСАСАСаТ сатТОАТАаСА таспСАоСатса тсстсатсас сатсатсата па,аттсатосб астасатта асадсостата 101 ТТаСАпСАСА ТАТТАССсСОаС АСбобатаато атТАайСААТАС сбтадасСсАас
ССОААТАССА ДДААТИАААА ДОСССТОСИаТ СаСААААТТА АТАаСтТасад 201 ААдаСАасаСбСаТ АаСбОасІСАТА ас СстТаАсС СААТСТаСАТ СстТасСатААТОа стТаААСТастТ аАТТСАТОАА АДАСаТстттт АТТАТАТТТА ТАаССАСАСС 301 ТАТТТТСОаСТ ТТСАпОдДАСА ААТТАААСАА ААтТАССАдДАА 0 АТОаАТАААСА
ААТаСТаСАСсіЇї ТАСАТТТАТА ААТАТАССАС СТАТОСИаСаСАТ СССАТТСТаС 401 ТОАТОАДААС СаСАССИТААТ дасСстТаттаспА сСАААпАТаС АСПААТАТаСС
СстТатАТАСаСА ТПТАТСАСОаос ТаССАТТТТТ ААСТаАдАО ААААТОаАТСа
501 САТТТТатТа АаСатТаАССА АТОААСАТСТ сАТТОАТАТа пАТСАТОаААС ссаестт тастасАт стастасас
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї ВІ21 (0ОЕЗ3) з Момадеп. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу у відповідності з загальною процедурою, описаною вище.
Приклад 3. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. З
Злитий протеїн послідовності 5ЕО. Мо. З являє собою протеїн, що має довжину, складену із 303 амінокислот, і масу 34,2 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ гомолог рибонуклеази КМазе А (ЗЕО. Мо. 32) приєднаний в якості ефекторного пептиду. Між поліаргініновою послідовністю і послідовністю ТКАЇЇ. інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані металопротеїназою ММР (ЗЕО. Мо. 51) та урокіназою ЧчРА (5ЕО. Мо. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини.
Протеїн також містить між послідовністю домену ТКАЇГ. і послідовністю ділянок розщеплення гнучкий гліцин-сериновий лінкер СОС5О (5ЕО. Мо. 57). Крім того, на С-кінці ефекторного пептиду протеїн містить послідовність КЕОІ (5ЕБО. Мо. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи також С-кінцевою частиною всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. З і ЗЕО. Мо. 69.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. З 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМИаї м віІМОСагЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕНООМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асаБаРІ а А аАУУАКЕТАА АКРЕВНОНМО5 5Т5ААБООМУ
Коо) 201 СМОММКЗАМІ ТКОВСКРУМТ ЕМНЕБІГ АЮМО АМОБОКММАС КМСОТМОМО 251 У5ТМ5ІТОСА ЕТа5ЗКУРМО АУКТТОАМКН ПМАСЕСМРУ МРУНЕВСАБУК 301 ЕОГ.
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 69 1 сататтаСАСб САСАТАТТАС боааСАСССсІ аатСатАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДАААТОа АААддассст асатсабААА АТТААТАасСтТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 саАССТАТТТІ СОаСТІТСАСОос ААСАДАТТАА АпААдДАТАСС 0 АААДАТОаАСА
ААСААДАТасаТ аСАатТАТАТО ТАСАААТАСА ССАааСТАТОС ССАТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тасоСстатАТ АССАТТТАТО ДАаСИСТВИСАТ ТТТТОААСТОа АДАСААААТта 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассбАааст тпттта,стас Атеотасат сатаатаватА ассатосаст 01 ссатстааСА сиатоатТато ТТСаТАААпА ААССОаСАсаСА аССАААТТТа ААСсатСАасСА САТасАТАаС ДАСАССАаОСОсС САаСААлаСАсі, САССААТТАТ 601 ТаСААТСАСПА ТаАТОААААС ССаСААТСТОа АССАААСПАТО аттатАААСС сатТаААТАСС ТТТатТСАТа ААдасСстацао АпАтТаттоАа асаатттасА 701 аССАСАДААА тТатТайосСТаТ АААААТасТо АСпАССААТТОа СТАТСАСАаС
ТАТАаСАССА ТаДаСАТТАС САТТаТСаИт аАдАССастА аСсАасСАдДАТА 801 ТоСОААТТаС саССтТАТАДАА ССАСССАСпИС СААТАААСАТ АТТАТТИаТаС сСстТатаААсас СААТОоСатАтТ аттоСаа!тто АТТТТаАТаС САДаСатаААА 901 СААДСАТСТОа
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штам БЕ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) з Момадеп.
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. 60 Приклад 4. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 4
Протеїн послідовності ЕС. Мо. 4 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 293 амінокислот, і масу 33,2 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281 ВАЇЇ. гомолог рибонуклеази КМазе А (5ЕО. Мо. 32) приєднаний в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇЇ. є гнучкий гліцин-сериновий лінкнер ССО5ООО5 (ЗЕО. Мо. 63).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 4 і ЗЕО. Мо. 70.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 4 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМ5УЕЗЗАБаИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асасВациаЗкК ЕТАААКЕРЕНО НМО5ЗТЗААЗ 5ББМУСМОММК 201 5БАМ-ТКОВСК РУМТЕМНЕ5І АОМОАМОБОК ММАСКМОСОТМ СМОБМУ5ТМ5І 251 ТОСВЕТОа55оК УРМСАМКТТО АМКНІМАСЕ СМРУМРУНЕО АБУ
ДНК послідовність ЗЕО. Мо. 70 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 САССТАТТТТ СОаСТТТСААСб АДОдДААТТАА АпдДАААТАСС 0 АДАААТОАТА дасАпАтТаст асСАатТАТАТО ТАТАААТАТА ССАДасСтТАТОС САТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТОаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ слада,ассАааст тттта,стас Атотаст сатаатаата атласбсаатас 501 ТасаТАСТААА сСАААССОаСАсС САпСААААТІ ТаААСаТСАсС 0 САСАТасСАТА аСбАаСАССАа баСАаСАдаС ДаСАСасСААТТ АТТИТААТСА САТаАТИаААА 601 АаССОаСААТО ТаАССАААСА ТСаТтТатААА ССаатТаААТА СсСТТаттсСА
Зо тТаААДАДаССТа асАаспАТта7атто асасСсАсаттта,а тТлаССАСпААА ААТаТтТа7асст 701 аСТААДАААдТОас ТСАпАССААТ ТасСтТАТСАСА сСТАТАаСАС САТаАСаСАТТ
АсСсадттато атаАдАССоса ТтАаСАаСААдДА ТАТСОССОСААТТ аТаСАТАТАА 801 ААССАСССАсС аССААТАААС АТАТТАТТИаТ табСтатаАА аапсСсААТОСатТ
АТаТтТОоСОастТ ТСАТТТТОаАТ аСАДОаСаИТтт
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами БЕ. соїї ВГ 210ЕЗрі уз. из
Зігаїадепе и Типег (ОЕЗ3) з Момадеп. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 5.Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 5
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 5 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 283 амінокислот, і масу 31 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність цитохрому С (ЗЕО. Мо. 33). Між послідовністю домену ТКАЇГ. і послідовністю ефекторного протеїну інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані металопротеїназою ММР (ЗЕО. Мо. 51) та урокіназою иРА (5ЕО. Мо. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини .
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. ї, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 5 і ЗЕО. Мо. 71.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 5 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЕЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОМІ УКМТ5МРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асазаРІ а А чаВУУВармЕК аккіІРІМКО5 ОСНТУЕКОСОК 201 НКТаРМІ НОЇ ГЄЕАКТаоОАРО УМ ТААМКМК СПУУСЕОТІ М ЕМІ ЕМРККУІ 251 РаТКМІЕМаїІ КККЕЕРВАБІ І АМІ ККАТМЕК ЕОІ. 60 ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 71
1 САСАТСТТСТ ТТТТСАТТаа ТааСТТТТТТ САСАТАаасСА АТСАСАТСТа СОИСИатТтстто
ТТТТТТТТТА АТаСССАСАА ДААТСАТТТТ СИТАСССаслА 101 АТАТАТТТТТІ ТСасСАТТТТС САСАТАТТСС АТСАпОСТАТ СТТСАССССА
ААТААТОаССТ ТТатТттТАТ ТасССТасСсосат АТАаСТАТАА СССОССОТасСстТ 201 саАССОСТТТТ АСОАССАААС АпАССАТаСА сАТтІСбОасАСС сатТТТТАТИаТ тТассАССТТ ТТІТСААСИОаИСТ АТИАСАСТОасСТасАТТТСА ТААТАДААДАТ 301 Тесс ТТ ТССАСАТ САССАСОААС ААСАСОСАССТ аССАпАСОССА аСбапАССаст АССАССАССА АССАСПСААДАТОа САССААДААА ССТааСТТСА 401 ТОАТССАТАТ СААТСАпАТ ТТСАТТОасСТО АСОСТСАСАА ААДАТтТасСаАТО
АТТТТСТТТО АСТТСАДААА ТАССАСССТОа АТАААТастА ТАСАСаССАТ 501 АТІСТОСАТС ТІТаСТоОСАА САсаСтТАТТАС аТаСОаСТТ САТСАСаСАСА
АТСсСОасаАТОСОа вАТАаСтТасаст АТАТТТАТАА АТаТтТАСТасСА ССАТТТОаТТтТ 601 АТССТТТТТа,а аТАТТТТСТТ ТААТТТСТТО СТОААДАаСОаЦА АААТАСаИтстТ вастАТАААТ
АТААТААДААСа ССТТТТТСАТ СААТСАССАС ТТСАССАТТА 701 СОаСАСАТаОСА сСАТТаСТСАС АААсаСТАТаА СсСасСстТАСасо тТасттоСсСА аСсСтТАТТААТТ ТТаСОсАСССА СОСІСИСТТТТТо АТТтТттТастА ТтІТссСа,аИстас 801 ТСАаСсеиТтАТТ аСтТАСОаАССА СССОИТасССа,с,с;тТААТАТаТас ТаСААСАСас АТ
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп.
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 6. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 6
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. б являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 407 амінокислот, і масу 45,2 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇГ. послідовність цитохрому С (ЗЕО. Мо. 33) приєднана в якості ефекторного пептиду. Між послідовністю домену
ТЕАЇЇ. ї ефекторним пептидом розташована послідовність, розпізнана фурином (ЗЕО). Мо. 53), і домен транслокації Рзендотопаз аегидіпоза (5ЕО. Мо. 54). Протеїн також містить гнучкі лінкери: між послідовністю ТКАЇЇ-послідовності і послідовністю ділянки розщеплення, розпізнаної фурином, є гнучкий гліцин-сериновий лінкер (3005 (5ЕО. Мо. 58), між послідовністю ділянки розщеплення, розпізнаної фурином, і доменом транслокації з Роендотопазх аегидіпоза є гнучкий гліцин-сериновий лінкер АБО (5ЕБО. Мо. 65), а також між послідовністю домену транслокації і послідовністю цитохрому С є гнучкий гліцин-сериновий лінкер ССО5БО(СО (5ЕО).
Мо. 62). Крім того, на С-кінці домену ефекторного пептиду протеїн містить послідовність КЕОЇ. (ЗЕО. Мо. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи також С-кінцевою частиною всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 6 і ЗЕО. Мо. 72.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 6 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТ5МРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асоасАККАА 5аСРЕСЦИБІ А А ТАНОАСНІ РІ ЕТЕТАННО 201 РРОМ/ЕОГ ЕОС СУРМОВІ МАГ. МІ ААВІ 5М/МО МООМІАМАГА 5БРОВОСОЇ СЕ 251 АІВЕЗРЕОАВ ГАЇ ТІ АААЕ5 ЕВЕУНОСТОаМ СЕАСААМОаРА ОСсИССЗССАМО 301 ОМЕКОККІРІ МКСОЗБОСНТУЕ КОСКНКТОаРМ І НОЇ Ра ВАКТа ОАРИУЗМТАА 351 МКМКОИапуусЕ ОТІ МЕМГЕМР ККМІРЕТКМІ ЕМаІКККЕЕВ АОГІАМІ ККА 401 ТМЕКОЕЇГ
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 72 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 сАССТАТТТТІ СОаСтТТТСААС АДОдДААТТАА АПАДААТАСС 0/0 АААААТтТОаАСА
ААСААДАТасатТ аСАатАТАТО ТАТАААТАТА ССАДасСтТАТОС ССАТССС,АТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА 60 тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа
401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассАаст ттта,стас АТттсотаст сатаатаата атТласСсСатАА 501 ААААСбатТасСсА дабсатаІо басААсааТас тАаССтасаСА асСАСТаАССа
САСАТСАСОаС АТатТоАТСТа ССсс,аСтТасдААА ССТТТАСССа ТтсАТСИТСАС 601 ссСтбатаст сасААСАОСІ сапААСАасТаТ сааттАтТоСоса ттсАдасатст сатасАСтТа ТАТСТааСАса САСсатоталда стасвААТСАСа СТ ТОАТСАСаИ 701 ТТАТТаСАДА ТаСАСТОйСА датобасатТА сбсстастаА ттасатадА
ССААТТСОатТа АААдатОоСацсА АСАпСасАсат стааСАСТОаА СССТОССАСО
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп.
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 7.Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 7
Протеїн послідовності ЕС. Мо. 7 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 409 амінокислот, і масу 46,1 кДа, в якому на М-кінці послідовності 114-281ТКАЇЇ. в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність гранзіму В (5ЕБО. Мо. 34). Між послідовністю домену ТКАЇЇ. і послідовністю гранзіму В ефекторного протеїну розташована послідовність ділянки розщеплення фурину (ЗЕС. Мо. 53), додатково оточена (що межує 3) гнучкими гліцин-сериновими лінкерами (05 (5ЕО. Мо. 59).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, БЕО. Мо. 7 і ЗЕО. Мо. 73.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 7 1 ПО НМАКРН ЗАРУМАМІ МІ М/ РОКІ КАСа аг ПАВОРМІ ТААНСУ/Оа55І 51 ММТІ аАНМІК ЕОЕРТООРІР УКААІРНРАМ МРКМЕЗМОЇМ ГГ ОЇ ЕВКАКА 101 ТВАМОРІ ВІ Р БМКАОМКРОО ТОЗБМАСУСОТ АРІ акКНЗНТІ ОБЕМКМТМОЕО
Зо 151 АВКСЕБОІ ВНУ МО5ТІЄЇ Са ОРЕІККТОЕК ЮБИСРІ МСМ КМАОСІУЗМУС 201 ВММЕМРРААС ТКУЗЗЕУМНУМІ ККТМКА жаса азАКкКквасас!с., 5МАЕНИ РОВУ 251 ААНІТатТНав 5МТІ 55РМЗК МЕКАГСАКІМ БУУЕЗЗАБОИН5 РІ ЗМІ НІ Ма 301 ЕГМІНЕКСОЕМ МІУ5ОТМЕВЕ ОББІКЕМТКМ ОКОММОМІУК МТ5МРОРІШ 351 МК5АВМЗСМУ5 КОАЕМИЇ БІ МОСС ЕЕЇ КЕ МОВІЕМ5УТМ ЕНІІОМОНЕА 401 БЕРСАРІ МО
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 73 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДАААТОа АААддассст апатсОатТААА АТТААтТАаст 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат ААТааСОсСААС ТаСИТОаАТТСА ТИААААдОаас ТТТАТТАТА ТТТАТАИаССА 201 сАССТАТТТТІ СОаСТТТСАСО! ААСАдДАТТАА АпААдДАТАСС 0 ААДААТОаАТА
ААСААДАТасатТ аСАатАТАТО ТАТАААТАТА ССАДасСтТАТОС ССАТССС,АТТ 301 сСтТасСтТОАТОА ААддаСаСАСбО ТААТАа!СТОаЇ тасАсаСАААС АТаССаААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассАаст ттта,стас АТттсотаст сатаатаата атТласСсСатАА 501 ААААСбОстасІ ссаТаасбОесТ СТАТТАТТОасС ТасСТСАТОТІ аСАдДААССас
АТАСССИТОС СТАТАТаССА ТАТСТОАТаА ТТТаСОСАТСА СААдАаССтТОа б0О1ї АААбаттата атаастсТ сАТТСатТтОаАТ саАТТТаТтІС таАсСсасАас
АСАТТаТтТОа астАасСАаСА ТТААТИТТАС ССТОСатТасс САТААТАТТА 701 ААПААСАСеА АССсАСССАсС САСТТТАТІО СасаСТТАААСОа 0 тТасСААТТОСа
САТОСОаСаСАТ АТААТОССОСАА АДАТТТТАСС ААТОАТАТСА ТОСТО,СТаСА 801 ОасСтТапйААСОсТ ААдаСААААС атАсоСбатаб АапсАаССс стасатотас
СаАаСААТАА ДЯСАСАсСОИТтТТ АААбСасато аЧаАсСстТа,атАаа саттасСсАсцат 91 тасссТСАпА сССаСАССОаСТІ ссстТАААСАТ ТоТСАТАССС тТаСААСаАСаИат
ТААДААТаАСО аТОСААсСАС,ОИа АТСИТАААтТа ссАААлдаСссАтТ стасассСАТТ 1001 АТТАТОАТАС САССАТТаАА Сстатататас аСаАТССОасА ААТСААдДААА
АССАССТТТА ААСатаАТАас Саатаатоба стаатТтатА АТАДАДаТТас 1101 сССАсСосатТАТІ аттАаСтТАТа сатТсатТААТАА тТастТАТаССс сбасатТасАТ 60 СТАССААдИатТ тТАасСАастТТтТ атасСсАТТасА ТТААААДААС САТИАААСас
1201 ТАТАДАСАТОа ААСТта
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп.
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 8. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 8
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 8 є злитий протеїн, що має довжину, складену із 405 амінокислот, і масу 45,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність гранзіму В (ЗЕО. Мо. 34). Між послідовністю домену ТКАЇЇ і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянки розщеплення фурину (ЗЕО. Мо. 53), додатково відокремлена від послідовностей як гранзіму В, так і ТКАЇГ. за допомогою гнучких гліцин-серинових линкерів (035 (ЗеКм/. Мг 58) і БОо(ОсО5(5Б0. Мо. 59), відповідно. Крім того, на С-кінці ефекторного пептиду протеїн містить послідовність КОЕЇ, направляючу ендоплазматичний ретикулум, який є частиною С-закінчення всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, БЕО. Мо. 8 і ЗЕО. Мо. 74.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 8 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОМІ УКМТ5МРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асосазАККАа саансаанмМ АКРНЗАРУМА МІ МІМУСОКОБІ. 201 КАСаСаЕИАО СЕМ ТААНСУУ а55І1ММ ТІ СА НМІКЕОЕРТО ОРІРУКВАЇР 251 НРАУМРКМЕ5 МОЇМ ОЇ ЕВ КАКАТАВАМОР І ВІ РОМКАОМ КРООТОЗМУАС 301 МУМСОТАРІ КН ЗНТ ОЕУКМТ МОЄОВКСЕБО І АНУМО5ЗТІЕ І СМОарРЕЇКК 351 Т5;ЕКаОБИаСР І УСМКМУАОаІ Уа в!ММаТмР РВАСТКУЗЗЕ УНУЛККТМКА
Коо) 401 МКОЕГ
ДНК послідовність ЗЕО. Мо. 74 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 сСАССТАТТТТІ СОаСтТТТСААС АДОдДААТТАА АПАДААСАСС 0 ААДААТОаАТА
ААСААДАТасатТ аСАСаТАТАТТ ТАСАДАТАТА ССАастТАТОС ССАТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТОаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассАаст ттта,стас АТттсотаст сатаатаата атТласСсСатАА 501 ААдАбатасІі сатапбастТА сатТАТТАТТОсС ТасаТСАТИОТІ аСАДААССас
АТАСССИТОС СТАТАТаССА ТАТСТОАТаА ТТТаСОСАТСА СААдАаССтТОа 601 АААСбОспата атасатттсТ сСАТТСаТОАТ сАТТТатТІС тТаАсСасСсАсас
АСсАТТаТтТОа астТАасСАаТсСА ТТААТИТТАС ССТОСИатТасСсо САТААТАТТА 701 ААпйААСААДСПСА АССОАСССАС САСпТТТАТІС СасСТТАААба тТасСААТТОСа
САТОСОаСаСАТ АТААТОССОСАА АДАТТТТАСС ААТОАТАТТА ТИОСТаСтТасА 801 асСтТапйААСбОаС ААдаСААААС атАСоСбОатаС лдаттсАааСба стасатотас
СаАаСААТАА ДЯСАСАсСОИтТТ АААбСасаато аЧаАсСстТа,атАаа саттасСсАсцат 91 тасОапТСАПА ССОаСАССОасСІ спатТАААСАТ ТСАСАТАССС тТаСААсАсаИт
СААДААТаАСС атТСААспАсца АТССТАААТа саАдАдАдасаАтТ стТасСсассСАТТ 1001 АТТАТОАТАС САССАТТАА Сбтататато атаАТоСацпА ААТТАДАДААд
АССАССТТТА ААсасСсаАтА,а ссатастоСа стастттатА АТАААсСТТасС 1101 АСАсСССаТАТІ атаАдаСтТАТа атТсатТААТАА тТастТАТаСсСТ сбасатасСАТ
СТАССААдИатТ тТАасСАастТТтТ атасСсАТТасА ТТААААДААС САТИАААСас 1201 ТАТАДАСАТОа ААСТта
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у бо відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) р уз5 з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 9. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 9
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 9 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 187 амінокислот, і масу 21,9 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний 9-амінокислотний пептид, отриманий з Миг77 протеїну (ЗЕО).
Мо. 35), при цьому послідовність поліаргініну, що складається з семи Агд-залишків, додатково приєднана на С-кінці ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇЇ- розташована послідовність ділянок розщеплення для металопротеїнази ММР (ЗЕО. Мо. 51) і урокінази чиРА (5ЕО. Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо. 9 і 5ЕО. Мо. 75.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 9 1 ЕБА5І НІ А ВВЕВЕВРАВРУМА РІ а АСАМАА НІТатТРеаИВ5М ТІ 55РМЗКМЕ 51 КАГОЯ!КІМОУУ ЕБЗАБОаНЗЕЇ. ЗМІ НІ АМС МІНЕКСЕМУМУІ У5ОТМЕВЕОЕ 101 ЕІКЕМТКМОК ОММОМІУКМТ 5МРОРІЇ МК БАВМЗСМУЗКО АЕМаИїЇ БІМО 151 СІРЕ КЕМО ВІЕМ5МТМЕН ПІОМОНЕАЗЕ РСАРІ МО
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 75 1 тптАаССатТА саССтТаСАТАС сстаСстабат Сбосетсатбат ,ассатсатооа татпаттсат ссастасато тасСбАасатСа таттасСАасСА САТАТТАССС 101 саСАСССИатТОас ТостТАпСААТ АСССТаАОаСА аСССОпААТАС САААдДАТИаАА
АААССССТас!с аТтСасСАдДААТ ТААТАаСтТас!с пААдда,асАасо атаабаатСА 201 тТАаСТТІСТа АСаСААТСТаС АТСТаСОсТАА тТастТаААСтТа атаАТТСАТа
АААДАСасттТ ТТАТТАТАТТ ТАТААССАСА ССТАТТТТСа ст ТСАСаАА 301 сСАААТТАААС. ААААтТАССАА АДААТОАТАДА САААТаспТаС 0 АСТАСАТТТА
ТААДАТАТАСС ДИСТАТССИЯИ, АТССС,АТТОТ аСтТаАТОААА ДООСаСАСИТА 401 АТАОСТОТТ! сАССАААпАТ сСАСААТАТа аССтТатТАТАС САТТТАТСАС
Зо сатассСАТТТ ТТаААСТаАА АСААААТОАТ ССАТТТТТа тТтадаСатаАс 501 СААТОААСАТ СтТаАТТОАТА тТасйАТСАТаА АаССАсасСт ттаатасАТ тпстастасас
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Козеца (ОЕЗ з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 10. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 10
Протеїном послідовності ЗЕ. Мо. 10 є злитий протеїн, що має довжину, складену з 193 амінокислот, і масу 22,4 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний 16б-амінокислотний пептид, що містить домен ВНЗ протеїну
Вак (5ЕО. Мо . 36) при цьому мембрана-проникаюча поліаргінінова послідовність, що складається з семи Агд-залишків, додатково приєднана до С-кінця ефекторного пептиду. Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ наявні послідовності ділянок розщеплення для металопротеїнази ММР (ЗЕО). Мо. 51) і урокінази иРА (5ЕО). Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані
БО для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо.10 і ЗЕО. Мо. 76.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 10 1 СОМОВОЇ А СОБІМААААА ВВРУМАРІ а АСАМААНІТа ТАОаВ5МТІ 55 51 РМЗКМЕКАЇ Сх ВКІМБЗУУЕЗОА ЗОН ЗМІ Н І АМОЕЇ МІНЕ КОЕУМІМ5ОТ 101 МЕВЕРОЕЄЕІКЕ МІКМОКОММО МІУКУТ5МУРО РІЇ МКЗАВМ 5БСМУЗКОАЕМО 151 ГМБІМОСИаїв ЕГКЕМОВІЄЕМ БМТМЕНІ ТОМ ОНЕА5ЕЕСАБК І Уа
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 76 1 сстодсаатса стсатсАссСІ ссаСААТТАТІ сатТОаАТОАТА ТТААССатоса тсстсатсас сатссатсата па,аттсатос астасатта асбадсостоата 101 ТТаСАпСАСА ТАТТАССсСОаС АСбобатаато атТАайСААТАС сбтадасСсАас 60 ССОААТАССА ДДААТИАААА ДОСССТОСИаТ СаСААААТТА АТАаСтТасад
201 ААдаСАсаССаТ АсаСОпТСАТА ас СТаАС СААТСТОаСАТ СстТасатТААТа сТаААСТастТ аАТТСАТОАА АДАСаТсттТтт АТТАТАТТТА ТАИССАСАСС 301 ТАТТТТСОаСТ ТТСАпОдДАСА ААТТАААСАА ААтТАССАдДАА 0 АТОаАТАААСА
ААТаСТаСАСсіЇї ТАСАТТТАТА ААТАТАССАС СТАТОСИаСаСАТ СССАТТСТаС 401 ТОАТОАДААС СаСАСИТААТ дастТаттаспА сСАААпАТОаС АпААТАТОасо
СстТатАТАСаСА ТПТАТСАСОаос ТаССАТТТТТ ААСТаАдАО ААААТОаАТСа 501 САТ ТатТа АаСОстТаАССА АТОААСАТСТ сСАТТОАТАТОа спАТСАТОаААда ссаестт тастасАт стастасас
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами Е. соїї ВГ 21 (ОЕЗ) и Типег (ОЕЗ) рГуз5 з Момадеп Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 11. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 11
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 11 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 204 амінокислот, і масу 24,3 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇ.. в якості ефекторних пептиду приєднаний домен ВНЗ молекули РОМА/ВВСЗ (ЗЕО. Мо. 37), при цьому поліаргінінова послідовність, що складається з 9 Агд-залишків, додатково приєднана до
С-кінця ефекторного пептиду. Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ. конструкція містить послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами пиРА (5ЕО. Мо. 52) ії ММР (ЗЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо.11 і ЗЕО. Мо. 77.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 11 1 ЕЕСМ'АВЕЇСА ОЇ ВАЕМАООІ М АОМЕВВВАРА ВВЕРРУМРВРІ С ГГ АСАМААНІТ 51 атТвавВ5ЗМТІ 5 5БРМЗКМЕКАЇ. САКІМЗУУЕЗ5 АБОаНЗЕЇ ЗМІ. НІ АМС МІН
Коо) 101 ЕКСОЕУМІМ50О ТМЕВЕРОЕБІК ЕМТКМОКОМУМ ОМІУКМТ5МР ОРІ МКЗАВ 151 МЕСУМУБКОАЕМ СІ УБІМОСИЇ ЕЕКЕМОВІЄ МЕМТМЕНОІЮ МОНЕАЗЕБРИА 201 Р Ма
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 77 1 СААдСААСАсСІ сваСАСбатаА ААттааТаСА САаабтабат атАтТааСАаА тТаАТСТаААТ ЧаСАСАСТАТа ААСОСТСатос теа,;тса7асса,ат баасбатоато 101 стапстбс тосаСстасаї СбтааСбАасаТо стат аСАсбС АСАТАТТАСС сасАассСата атсатАасСАА ТАСССТадаб дасСССапААТА аСАДАААТаА 201 ААДААдОаСАСТа сатСОсаСАААА ТСААТАаСТО! пааАдАаСАаС боатАаСбаато
АТАЯаСТТТотТ вАаСААТСТа САТСТаСатА АТаИСЄТОаААСТ аатаАТТСАТ 301 САДААдДОпасСІ ТТТАТТАТАТ ТТАТАаССАС АССТАТТТТС асСТтТТСААСА
АСПСАСАТТАДА САДААТАССА ДДААТОИаАТАА АСАДАТОаИ,Та сАСтТАТАТТТ 401 АСААДАТАСАС САаСтТАТОСО! сАСССОсАТІС ТаСТОаАТОАА АдасСасСАСат
ААТАССТОИаТТ ЧаИМАаСАААСА ТАСАСААТАТ ССТСТИатАТА ССАТТТАТСА вБо1 састТаспсСАТО ТОД ОаСтТОА ААдпАДАААТОА ТСасСАТСТТ аттАааСбатаА
ССААСО,ААСА ТСТаАТССАТ АТасСАТСАТа АдаССАс,аСт тттаатасА
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами Е. соїї ВГ 21 (ОЕЗ) и Типег (ОЕЗ) рГуз5 з Момадеп Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 12. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 12
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 12 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 372 амінокислот, і масу 41 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний протеїн РОМА (5ЕО. Мо. 38). Між послідовністю ТКАЇ'. і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянок розщеплення, розпізнана металопротеїназою ММР (5ЕО. Мо. 51) та урокіназою ПРА (ЗЕО. Мо. 52), яка додатково відділена від послідовності ТКАЇЇ за допомогою гнучкого гліцин-серинового лінкера СС500О
(ЗЕО. Мо. 60). Крім того, на С-кінці ефекторний пептид містить послідовність КЕОЇ (5ЕО. Мо. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум і формуючу частину С-кінця всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо.12 і ЗЕО. Мо. 78.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 12 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ САК ІМЗУУ/ЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асазасРІ ві АБВУУВАВАВ ОБИЗОРЕРМЕ СІ АВрОаРАРЕ 201 РГСВІ МРБАМ 50 СЕР А ААРААРТІ І Р ААМІ САРТАР РАМТААЇ СИ 251 ВМ/УРОСРАЗАР ВЕОРАРОСРОР 5І БІ АЕОНІЕ 5РУРБЗАРОАЇ АБОРТОААРС 301 МАСЕЕЕОУМУАВ ЕІСАОЇ ВАМА ОЇ МАОМЕВА ВОЄЕОСОВНАР 5РУУВМІ УМГ І 351 Маг І РІ РАН ВАРЕМЕРМКЕ 0
ДНК послідовність Мо. 78 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДАААТОа АААддасАстТ ааиаТтСасСАдДА АТСААТАаСТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 саСАССТАТТТТІ СОаСтТТТСААС ААСАСАТТАА АпААдДАТАСС 0 АДАААТОаАТА
ААСААДАТастТ аСАатТАСАТТ ТАСАААТАТА ССАССТАТОС ИВАССССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотатАТ АаСАТТТАТО АсаСсСОаТасСАТ СТТТОдДасСтТОа АААСАдДААТа 401 АТСОСАТСТІ ТаттАсаСОато АССААСОААС АТСТОАТСОА ТАТаСсСАТСАТ сдда,ассбАааст тттта,стас АТттсотаст сатаатаатА ассатаатоо вБо1 сстасстСта асАдаатбат тата сабо СААпАдаатА ссла,атоСбацсА А СсСсва7аттаАА сатстасасАс ататаатоо асатосатт бої ссастапато стотасаттоС слеабаеасСАаат даСтатат тТататаААСо саатстаасСА аСсСаСАССас сСАаСАССОоАС АСстТастасст асСАССАТАТС
Зо 71 тататаСбАСбС сАббасСсАбба сбтасСсАатТА СббасСсАаСАСТІ ссватастТАас саттоасста атастоСасСоа тлатсатосо сатаатосто атобапАтас вої тобасАааСббо лдасстаАдаСС тТапСАСПСААСА саСАТСТапАА датоСбастас ссдаСсасасс асатасАста асдсасаато СТАСАСАааас ааСсАсСавчат 91 сттбсатаста ААпАсСОсААСА сатапаСАСаТ спСАААТасТа САСсАаСТаса з; тсатАТаСайСА САТаАТСТОаА АТаСАСАС,ТА ТІОААСатСат сатСААсСААС 1001 ААСсАспСАсаСс тТСАТОСсСТОСа дао, ататсСтТатА ТААТСТОАТТ адтасатотаб тассастасо тса7атаатСАТ СаТасСАССОасснАААтТасААСс 1101 СААТАДАСІАА СААТСТОИ
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї В.21 (ОЕЗ) от Момадеп і
ВІ21ОЕЗрі УК. от Бігаїадепе. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 13. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 13
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 13 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 493 амінокислот, і масу 53,4 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність протеїну РОМА (ЗЕО. Мо. 38). Крім того між послідовністю ТКАЇЇ і послідовністю протеїну РОМА є послідовність домену транслокації з
Рзендотопав аегидіпоза (5ЕО. Мо. 54), яка додатково відділена від послідовності ТКАЇЇ за допомогою послідовних послідовностей: гнучкого гліцин-серинового лінкера оО(05 (5ЕО. Мо. 59), ділянки розщеплення фурину (5ЕСО. Мо. 53) і гнучкого аланін-гліцин-серинового лінкера
АБОС (5ЕО. Мо. 65), а від протеїну РОМА - за допомогою гнучкого гліцин-серинового лінкера со5ОЄС (560. Мо. 60). Додатково, на С-кінці ефекторного пептиду злитий протеїн містить послідовність КЕРІ (ЗЕО. Мо. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи частиною С-кінця всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані 60 для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо.13 і ЗЕО. Мо. 79.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 13 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТУЕ ВЕОЕБІКЕМТ КМОКОММОМІ УКМТ5МРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асоасАККАА 5аСРЕСЦИБІ А А ТАНОАСНІ РІ ЕТЕТАННО 201 РРОМ/ЕОГ ЕОС СУРМОВІ МАГ. МІ ААВІ 5М/МО МООМІАМАГА 5БРОВОСОЇ СЕ 251 АІВЕЗРЕОАВ ГАЇ ТІ АААЕ5 ЕВЕУНОСТОаМ СЕАСААМОаРА ОСОБ, АВА 301 ВОЕС55РЕРМ ЕС АВОСРАР ЕРІ ВІ МРЗА УСІ СЕРОЇ. АДАРААРТІ ЇЇ. 351 РААМІ САРТА РРАМТААЇ С 5ЗАМУРИаСРАБЗА РАСРАРОСРО РБІ БІ АЕОНІ. 401 ЕБРУРБАРОА І АБОРТОААР СУМАСЕЕЕОМА ВЕІСАОЇІ ВАМ АООІ МАОМЕВ 451 ВВОЕЄООВНА РБЗРМУУ/ВМІ УМІ ІМС І Р РА НВАРЕМЕРМК ОЕЇГ.
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 79 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 САССТАТТТТ СОаСТТТСААС ААДОАААТТАА АпААААТАСС 0 АДАААТОАТА дасАпАтТаст асСАатТАТАТО ТАТАААТАТА ССАДасСтТАТОС САТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассАаст ттта,стас АТттсотаст сатаатаата атТласСсСатАА 501 ААААСбатТасСсА дабсатаІо басААсааТас тАаССтасаСА асСАСТаАССа
САСАТСАСОаС АТатТоАТСТа ССсс,аСтТасдААА ССТТТАСССа ТтсАТСИТСАС 601 ссСтбатаст пас ААСАОСІ апААСАасТаТ сааттАтТоСосс ттодасатст сатасАСтТа ТАТСТОСаССА, САСсатотада стаспААТСАа СТТОаАТСАца 701 ТТАТТаСАДА ТаСАСТОйСА датобасатТА сбсстастаА ттасатадА
ССААТТСОатТа АААдатОоСацсА АСАпСасАсат стааСАСТОаА СССТОССАСО 801 АСБСАСАДАСС сСААСаттта пбатСАпОас САССОасСТААТ пАтТаАдаССа
Зо стасдасСААА ТаСТОоСва7асА САТОосастастА атестата тасАса7атаст 901 СатСААпАда атАдасСАатТоС с,асвААССаст аАдааТСТас САСсатаАСас тос,ассатосСа,а тттоса7астас атса,7атстаст тоба,сда,аСасСА сттаастата 1001 СстотТататаА АсСсватота саСбАдаСбСбасСАС босаСАаСАСС спАСАСТаста сСстасСсАасСАТ АТСОТаТОаТтаб АССсАССасА сСсСсОоСстасАа ТТАССасСАсаСс 1101 АСТаССТОСТ Асатсатасабо сбтаатаатб ссСатаатбаї ссаеасбстаато сесстоСасва тастоСбасАаа сссА;атотаА асстаасСАСА АСАаСАТСТО 1201 сСАААСТоСТа таббсАсабаС АсбасатТасСА СбтааСбАсаба атоСОсАСАСА сасАдасАсст вататтата атТаААпААсСА АСАа,тТасасСА СасСсаАААТТОа 1301 сстаСАСАаСТІ сбатСатТАТа саСАСАТОАТО ТОААТаСАСА атАТИААСат сатсатСАДОа ААЙААСАаСА ССИаТтСАТСССТ ССОСчАСсСОоССат аасбататтст 1401 сСТАТААТСТа АТТАТОСОСТО таСтаббасСІ асстобаТпІ САТССТасСАС
СапАААтТасА АССОСААТААА САТаААСТОа
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами БЕ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) от Момадеп и
ВІ21ОЕЗрі ук. от Бігаїадепе. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 14. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 14
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 14 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 186 амінокислот, і масу 24,3 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ. в якості ефекторного пептиду приєднаний 8-амінокислотний фрагмент протеїну ЗМАС / Оіаріо (ЗЕО. Мо. 39), при цьому поліаргінінова послідовність, що складається з семи Агд-залишків, додатково приєднана до С-кінця ефекторного пептиду. Крім того, між поліаргініновою послідовністю і послідовністю ТКАЇГ/. протеїн містить послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами
МИРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (ЗЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані 60 для експресії в Е. соїї, відповідно, ЗЕО. Мо.14 і ЗЕО. Мо. 80.
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 14 1 АУРІЛОКРАА АВАААВЕУМРАР І аг АСАМААН ІТаИТваИнвзімт І 55РМЗКМЕК 51 АГ ЯВКІМЗУ/Е 55АБОаНОРІ 5 МІ НІ ВМО М ІНЕКСЕМУМІМ БОТМЕВЕОЕЕ 101 ІКЕМТКМОКО ММОМІУКМТ5 МРОРІЇ МК АВМЗСМ/ЗКОА ЕМИ! УБІМОС 151 СІРЕ КЕМОВ ІРМ5УТМЕНІ. ІОМОНЕАЗЕРЕ САРІ Ма
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 80 1 асСАСТІССОА ТТ аСАСАПАА доСа,аСсатбатї Сбатстбабб атостса;атат татсстоса,а стасоатстас сасатсатат тасСАаСАСАТ АТТАССОасСА 1011 сбСбстастос ТАаСААТАСС СсТаАдаСАсСС СОААТАССАА АААТОадДААдДА соостасато аСАдДААТСАА ТАаСТасанАА даСАа,асСатА абссаТСАТАСЄ 201 СТТІСТаАОС ААТСТаСАТСО тТаСОаТААТас тТаААСТаста АТТСАТОаААА
ААСаСТТТТА СТАТАТСТАТ АаССАСАССТ АСТТОСОастТТ ТСАасСАдСаАА 301 АТТАДАСАДА АТАССАДААА ТаАТАДАСАА АтТастаСАСІ АТАТСТАТАА
АТАТАССАСаС ТАТССОаспАТО СИАТТСТастТ аАТаААдАаС асАСатААТА 401 асСстТаттОацпйАСйб СААдАпАТОаСА спСААТАТОаС!СС тТатТАТАССАТ ТТАТСАСОваИт вСасСАТТТТТа ААСТаАдДАСА АААТОАТСас АТТТТТатаА асатаАССАА 501 ТАДАСАТСТОа АТТОАТАТОаСС АТСАТИдАСС САаасттт соета7асАтТттто тастасат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) или Типег (ОЕЗ) от Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 15 Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 15
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 15 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 191 амінокислоти, і масу 22,2 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ. в якості ефекторного пептиду приєднаний буфорін (бшитогіп) Ір (ЗЕО. Мо. 40). При цьому між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇ/. протеїн містить послідовності ділянок розщеплення, розпізнані
Зо протеазами иРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 15 і ЗЕО. Мо. 81
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 15 1 ВАСІ ОЕГРМОВ ІІ АВ ВВ АМУВРІ а АС ВМААНІТатТА САМІ З5РМ 51 БКМЕКАГ аВАК ІМБУ/ЕЗЗНАБОИа НОРІ ЗМІ НІ А МОЇ МІНЕКОа ЕММІ5ОТМЕ 101 ВЕОЄЄБІКЕМТ КМОКОММОМІ МКУТЗУРОРІ ГІ МКЗАВМ5О МУЗКОАЕМИЇ М 151 БІМОСОІРЕГ КЕМОВІРМ5М ТМЕНІІОМОН ЕАЗЕРСАРІМ а
ДНК послідовність: 5ЕО). Мо. 81 1 сСатаСАассто тасАатоб сатптоеасАбат сСстатАаАСбат а,асстастаСа тса7атстаста сесатта,атто стоса7астава тота,аСАасват сататтасСАа 101 САСАТАТТАС СбаспСАСоСОсІ спатСатАаСА АТАСССТаАС СсАасССсСаААТ
А,ЧСАААДАТтТа АДДААаСАСТ аастоасААА АТСААТАСаСТ аспсаАААлаСАС 201 сСатАаСОоспІ САТАОСТТІС ТаАСаСААТСТ аСАТСТаСОаТ ААТтастТОаААС тастаАТТСА ТОАДААдДАсас ТТТТАТТАТА ТТТАТАаССА САССТАТТТТ 301 СаСтТТТСААСі, ААпАСАТТАА АСААДАТАСС ААдАДАТОаАТА ААСААДАТОааТ ,САСТАСАТТ ТАСАААТАТА ССАССТАТОС СИЧАССССОСАТ СТастаАТаА 401 АААсСОаСАСОс ТААтТАаОаСТОаТ тапАспСАдДАСі АТаСАСпААТА таатстТатАТ дасАТТТАТО АасатасйсСАТ СТТТадОаСтТа АААСАДААТтТа АТСаСАТСТТ 501 тата ата АССААСОАДАС АТСТОАТОСА ТАТаСАТСАТ сАдассдаст тттаатас АТттсотаа,ата ватотастто сасатаатАс баатТАаСАсас 601 САТСАТСАТО АТСАССАТАСа САСССОССТ
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. 60 Приклад 16. Злитий протеїн ЗЕО. Мо. 16
Зо
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 16 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 279 амінокислот, і масу 31,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇ.. в якості ефекторного пептиду приєднана протеїну онконаза (ЗЕО. Мо. 41). Між послідовністю
ТКАЇЇ ії послідовністю ефекторного пептиду міститься послідовність ділянок розщеплення, розпізнана протеазами ММР (ЗЕО. Мо. 51) і шиРА (ЗЕО. Мо. 52), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇГЇ. гнучким гліцин-сериновим лінкером (05 (5ЕО. Мо. 58).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, ХЕО. Мо. 16 і ЗЕО. Мо. 82
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 16 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М аа БаРІ СА АУМВОВУМТ ЕОККНІТМТА ОМОСОМІМ5ЗТ 201 МЕГЕНСКОКМТ РІМЗАРЕРУК АІСКСОПАБК ММІ ТТЗЕРМІ БОСМУТЗАРС 251 КУК ККЗТМК ЕСМТСЕМОАР УНЕХО МЗС
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 82 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААДАасАСТ аастсасСАдА АТТААТАСаСТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 САССТАТТТТ СОаСТТТСААСб АДОдДААТТАА АпдДАААТАСС 0 АДАААТОАТА дасАпАтТаст асСАатТАТАТО ТАТАААТАТА ССАДасСтТАТОС САТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ сдда,ассбАааст тттта,стас АТттсотаст сатаатаватА асса7атоСаст
Бої ссстбтааСбА соатбатата тІбатСАпсА тТТааСТаАСС ТТТСАСпАдААд
ААСАТАТТАС СААТАССССИЯТ 2МАТатасдаятт ассАТААТАТ ТАТОДИаСАСС
Зо 601 ААССТИТТТС АТТОСАдДАСА ТАДАААТАСС ТІТАТТТАТА аббатобасА
АССИИТТААА ССААТТТатА ААДСС,ТАТТАТ ТасССАсССААА ААТИТасСстад 701 ССАСОдДОаСОаА АТІСТАТСТОа АОаСОаАТТаТА АТаТтТАССАсаС СсбатоСсатат
АААТАТАААС ТИААААДАдАСіЇ САССААТААА ТТТТОСИатТтаА6А сстТасСапАдДАА 801 ТСАааСАССа атТсАТТТтТа тастаттоас!с тАаа7астат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування вказаної вище кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 17. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 17
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 17 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 274 амінокислот, і масу 31 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднана протеїну онконаза (ЗЕО. Мо. 41). При цьому послідовність ефекторного протеїну додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ гнучким гліцин- сериновим лінкером, осо 505((05055 (5ЕО. Мо. 64).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
БО Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 17 і ЗЕО. Мо. 83
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 17 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ! МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИї М БІМОСИИї!РЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕНОІОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М асссЗациасе ОМ ТРОККН ІТМТАОМОСО МІМЗТМІ ЕНС 201 КОКМТРІМ5А РЕРУКАІЇСКаИа ПАЗКММІ ТТ ЗЕЕМІ БОСММ Т5АРОКУКІ К 251 КОТМКЕСУТО ЕМОАРУНЕМОа УМОааБС
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 83 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада 60 САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ
101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 САССТАТТТТ СОаСТТТСААСб АДОдДААТТАА АпдДАААТАСС 0 АДАААТОАТА дасАпАтТаст асСАатТАТАТО ТАТАААТАТА ССАИСТАТОС СИЗАТССС,АТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ слада,ассАааст тттта,стас Атотаст сатаатаата атласбсаатас 01 тастааСАаС САсаАТТОасС ТаАССТТТСА сАААДААСАТ АТТАССААТА ссса,атТаАтТатТ апАТТассАТ ААТАТТАТаА ВСАССААССТ ТТТСАТТОаС 601 АдДАСАТААДАА АТАССТІТАТ ТТАТАаССОсСІ СсСапААССОас о ТТААддасСААТ тТатАДАДаатТ АТТАТТаССА ССАААДААТат астаАССАСа АаСОСААТТСТ 701 АТСТОАдОСОА ТТатТААТИТІ АССАсаССОсТо СОатТатАААТА ТАААСТОадАА
ААДАдДаСАССА АТАААТТТТа СИаТаАССтТас аААААТСАСО САСС,атТСА вої тт"ттаттсат аттаатАаст ат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 18. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 18
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо.18 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 197 амінокислот, і масу 23,2 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний 20-амінокислотний пептид, що містить домен М-кінця протеїну р1!4АКЕ (5ЕО. Мо. 42). При цьому поліаргінінова послідовність, що складається з шести Аго- залишків, додатково приєднана на С-кінці ефекторного протеїну. Крім того, між поліаргініновою послідовністю і послідовністю ТКАЇЇ розміщена послідовність ділянок розщеплення протеази
Коо) МИРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 18 і ЗЕО. Мо. 84
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 18 1 МАВРІГМТІ ВІ ВАВАСОаРРАМА ВВР АРУМА РІ а АСАМАА НІТОТНОВОМ 51 ТІ 55РМЗКМЕ КАГСИВКІМОУУ Е5ЗАБЗОаНОРЇ. ЗМІ НІ АМС МІНЕКСЕУМ І 101 ХУ5ОТУМЕВЕОЕ ЕІКЕМТКМОК ОММОМІУКМТ 5МРОРІ МК БАВНМЗСМ/ КО 151 АЕМОї У5ІМО СС ІЕЕЇКЕМО ВІЕЄМ5УТМЕН ГІОМОНЕАЗЕ ЕСАРІ а
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 84 1 соттбстбат пСтааттАС ббтаСОатТАТ СатбатТасСАТ атастостоо ссататасат сатсстсато ассатсатса татта,аттсат сстотасаиато 101 таасСсдастба СОТ аСАсаСА САТАТТАСбСЯа аСАСбоСОсТас тоатАасСААТ
АсоСстТадаСАСССССААТАСЄ СААДААТИАА ААДСаСССТта,с атоасСАААДАТ 201 ТААТАССТОСсС сАдАаСАпСС атТАаСасатСА тТАаСТтСТа АаСААТСТОаС
АТСТасСатАА ТаСТОаААСтТа атаАТТСАТОа АДАААСаТстт ТТАТТАТАТТ 301 ТАТАВССАСА ССТАТТТТСО СТТТСАСпОдДА сСАААТТАААС. АДААТАССАА
АААТОаАТААА САДАТОСТаС АИТАТАТСТА ТАДАТАТАССО ДИСТАТОСССОС 401 АТССОСАТІСТ аСТОАТОААА даСаСАСОсТА АТАаСТОаТтОа! ,САаСАдАСАТ вСАСААТАТа (ССТОаТтАТАСЄ САТТТАТСАСа СКИСТаССАТТТ ТТІААСТаАА 501 АСААДАТОАТ СасСАТТТТТа тТаАаСатаАС СААТОААСАТ СтТаАТТаАТА тасАТСАТаА АаССАсСсТтт ттОосатТасАТ тсотааттаа т
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 19. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 85
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо.19 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 189 амінокислот, і масу 22,3 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний 11-амінокислотний пептид, зв'язаний з Мат2 (ЗЕО. Мо . 43).
При цьому поліаргінінова послідовність, що складається з семи Агод-залишків, додатково приєднана на С-кінці ефекторного протеїну. Крім того, між поліаргініновою послідовністю |і послідовністю ТКАЇЇ наявні послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами игРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (ЗЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 19 і ЗЕО. Мо. 85
Амінокислотна послідовність: 5ЕО. Мо. 19 1 РРЕМОТМУ/ЕСІ МАААААНАВМ УВАРІ СІ АОВМ ААНІТатТНОВ 5МТІ 55РМК 51 МЕКАЇ САКІМ 5БМЕБОЗАБИаН5 РІ ЗМІ НІ АМС ЕІ МІНЕКОЕМ МІМ5ОТУЕВЕ 101 ОЄББІКЕМТКМ ОКОММОМІУК МТ5УРОРІИ ЇЇ. МК5АВМЗСМ5 КОАЕМИЇ МІ 151 МХОСОІРЕЇ КЕ МОВІЄМ5МТМ ЕНГІОМОНЕА 5ЕБЕСАРІ Ма
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 85 1 ССТССТТТТА тТООАТАССТО ппАдОсІСТО ААтСасСато сасатСатса ссатсстап атссатосСсас тасатстасао асатоатат асСАсаСАСАТА 101 ТТАССООСАС СсСатТоаатсСатТ АаСААТАССС ТОАпСАОССС 0 сААТтТАаСААА
ААТаААддАс САСТасатсСа СсААААТТААТ ДИСТасасААА аСАассСсатАс 201 СОСТСАТАОС ТСТОАОСА АТСТОСАТСТ саСаТААТОСТІ пААСстастаА
ТТСАТОАдДААДА АСОИастТтТТТАТ ТАТАТТТАТА ЧаССАСАССТА ТТТТСОаСТТТ 301 САСОдДАСАдДА ТТАААСАААДА ТАССАДАААТ САТАДАСААА 0 тТааТасСАатА
САТТТАСАДА ТАТАССАСОСТ АТССОасСАТОС САТТСТаСтТОа АТОАААддаСа 401 САССТААТАсС Стат ОсСАсС АААСАТОаСАС ААТАТОсСІСТ аТтТАТАССАТТ
ТАТСАСОИСТОа аСАТТТТТОаА АСТОДАДОАА ААТаАТСОаСА ТТ ТТТаТада 501 СОаТОАССААТ сСААДСАТСТОА ТТОАТАТОаСА ТСАТаААсаСС 0 дасттттта стасАттст ва7аттОастТ
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для
Зо генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) або Типег (ОЕЗ) от Момадеп. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 20. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 20
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 20 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 195 амінокислот, і масу 22,9 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з луназіну (ЗЕО. Мо. 44). Між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇЇ в певному порядку розташовані поліаргінінова послідовність, що складається з семи Аго - залишків, і послідовності ділянок розщеплення для протеаз иРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (ЗЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 20 і ЗЕО. Мо. 86
Амінокислотна послідовність: 5ЕО. Мо. 20 1 СЕКНІМЕКІО СНО, ОВОООААА АВЕААВМУМАРІ. СІ АСАМААНІ Тата В5МТтіІ. 51 Б5БРМБКМЕКА І ЯАКІМОУМЕВ 5АЗОаН5РЇІ 5М І НІ АМОЕЇ МІ НЕКОЕГУМІМ5 101 ОТМЕВЕРОЕЕІЇ КЕМТКМОКОМ МОМІМКУТМ РОРІГІ МК5А АМЗ5СМУЗКОАЕ 151 МО БІОС ІРЕЇ КЕМОВІ ЕМБОБМТМЕНІЇ ОМОНЕА5БЕРОИ АРІ МО
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 86 1 ТаТОАААдДАС 0 АТАТТАТОаСА / АДАААТТСАС ссатсаСбОста АТОАТОАТалд тса7ссатссо сатсатсаоас атостаттат тса;тосаста ватотаасСсАа 101 сТСсТТтОоСб АССАСАТАТІ АССпаСАССС стасТСсТАС 0 СААТАСОСТа
АпВСАаСССОА АТАССАдДААДА ТОАДАДАДаТасА Стаса тТсСасА АААТТААТАС 201 сСстТОпОАддОоС АаСсСОсТАспСс сТСАТАаСТІ ТСТОАОСААТ СстТОаСАТСТОаС
СТААТОаСТала АСТастТаАтТТ САТаАдДАдАда астТТТТАТТА ТАТТТАТАСС 301 САСАССТАТІ ТСОаСтТТТСА сОпАДАСАДАТІ ААдАСАдДААТА 0 ССАдДАДАТОА
ТАААДСАДАТа аГгасСсАаТтАСА ТТТАСАААТА ТАССАОСТАТ ССОСАТОСИА
401 ТІСтТаСТаАТ САДААсаСОаСА СОаТААТАОСТІ аттапАаСАА АпАТаСАСАА тТАТОСТОоТат АТАВСАТТТА ТСАсСсСИатассо АТТТТТОаААС ТІДАААСАДАА 501 тТаАТСОСАТІ пат ОАсСс ТаАССААТаА АСАТСТОАТІ сСАТАТОаСАТС
АТтаАдАдассАа ст та,аст асАТТТСТтас ттО,ат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) або Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 21. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 21
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 21 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 218 амінокислот, і масу 25,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний фрагмент 8-амінокислотного протеїну Зтас / Оіаріо (ЗЕО. Мо. 39), який приєднаний до його поліаргінінової послідовності кінця С, що складається з семи Аго- залишків. Крім того, до С-кінця послідовності ТКАЇЇ 121-281 в якості другого ефекторних пептиду приєднаний пептид, що містить домен ВНЗ протеїну ВІК (ЗЕО. Мо. 45), причому другий ефекторний пептид має на своєму М-кінці приєднану поліаргінінову послідовність, що складається з семи Агд-залишків. Між послідовністю ТЕАЇЇ. і обома ефекторними пептидами з приєднаними поліаргініновими послідовностями розташовані послідовності ділянок розщеплення, розпізнані металопротетїназою ММР (ЗЕО. Мо. 51) та урокіназою ЧРА (5ЕО. Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 21 і ЗЕО. Мо. 87
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 21 1 АУРІАЛДОКРАВ ВЕАЕАВАВААЕУМРАР Іа АСАМААН ІТаТТтваИнвзімт І 55РМЗКМЕК 51 АГ ЯВКІМЗУ/Е 55АБОаНОРІ 5 МІ НІ ВМО М ІНЕКСЕМУМІМ БОТМЕВЕОЕЕ
Коо) 101 ІКЕМТКМОКО ММОМІУКМТ5 МРОРІ МК АВМЗСМ/ЗКОА ЕМИа!Ї БІОС 151 СІРЕ КЕМОВ ІРМ5УТМЕНІ. ІОМОНЕАЗЕРЕ САРІ МОРІ а АСЕеЕУУВАААА 201 ВАВ АІ ВІ АС С0ЕМОМ5
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 87 1 асСАСТІССОА ТТ аСАСАПАА доСа,аСсатбатї Сбатстбабб атостса;атат татпсатост стасатотаа саАастоа,абат ТтаСАасСАСАТ АТТАСССасА 1011 сббстастбс ТАаСААТАСС СсТаАдаСАсаоС СОААТАССАА АДААТИАДААдА соостасато аСАдДААТТАА ТАаСтТасааАА дДаСАасСатА асасаТСАТАС 201 СТТІСТаАОС ААТСТаСАТСО тТаСОаТААТас тТаААСТаста АТТСАТОаААА
ААсСІасСтТТТТА ТТАТАТТТАТ АаССАСАССТ АТТТТСОаСтТТ ТСАССААСАА 301 АТТАДАСАДА АТАССАДААА ТаАТАДАСАА АтТастаСАСІ АТАТСТАТАА
АТАТАССАСаС ТАТССОаспАТО СИАТТСТастТ аАТаААдАаС асАСатААТА 401 астТаттапйАСйб СААдАпАТаСА сААТАТОасСоС ТатТАТАВСАТ ТТАТСАСОССИТ вСасСАТТТТТа ААСТаАдДАСА АААТОАТСас АТТТТТатаА асатаАССАА 501 тТОААСАТСТОа АТТОАТАТОасС АТСАТОААСС САОасСт 0 аатасАТТТСО таатасестоб астосасста астасссата тасттоасосоа аса,асса,атсас во1 сатса,ассасс тааСАСсТаСа тотааСАТатТ АТТасСстТаАТа АААтТасАТат влас
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї Козеца (ОЕЗ3)з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 22. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 22
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 22 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 199 амінокислот, і масу 22,3 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднана синтетична пептидна послідовність, що складається з Су, Аа повторень (ЗЕО. Мо . 46), що має також приєднану до С-кінця поліаргінінову послідовність, що складається з восьми Агд-залишків. При цьому, остання формує також частину С-кінця всієї бо конструкції. Крім того, між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних металопротеїназою ММР (ЗЕО. Мо. 51) та урокіназою иРА (ЗЕО). Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.4, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 22 і ЗЕО. Мо. 88
Амінокислотна послідовність: ЗЕО. Мо. 22 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ У авВУУВвРІаїгА сАСАсСасАсОа АСАсацАаагА аптитит
ДНК послідовність: 5ЕО). Мо. 88 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАддаСАп ббатАааСОасі САТАОСТТТСО ТаАСаСААТСОТ асСАтотасат
ААТаатТадАС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 сСАССТАТТТТ СасСТТТСААС ААСАААТТАА АпААААСАСС 0 АДАААТОаАТА
ААСААДАТасатТ аСАСаТАТАТТ ТАСАДАТАТА ССАастТАТОС ССАТСССАТТ 301 сСстТасСстТаАТОА АААаСаСАСс ТААТАаСТО!Т тТапАпСАААС АТаСАСААТА тастотТатАТ АаСАТТТАТО АССсСО/СІТаССАТ ТТТТОААСТОа АДАСАДААТа 401 АТСОСАТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТаСсСАТСАТ слада,ассАааст тттта,стас Атотаст сатаатаата атласбсаатас 01 тастссатат атоатобаб тасотстааб тастаббоасаї ,аосесТаата стасдассас тастастаСсо ватааСссадоа сссатастас даастсатсат во1 сатоассс,то атосасат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) або Типег (ОЕЗ)
Зо з Момадеп Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 23. Злитий протеїн 5ЕО. Мо. 23
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 23 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 289 амінокислот, і масу 32,6 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281ТКАЇЇ в якості ефекторного пептиду приєднаний домен С-кінця протоасомного компонента ба, що містить
ШІМ5 мотиви (5ЕО. Мо. 46). Крім того, між ефекторним пептидом і послідовністю ТКАЇЇ- знаходиться послідовність ділянки розщеплення фурину, (ЗЕО. Мо. 53), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ гнучким гліцин-сериновим лінксером сОосОо5ОО (5ЕО. Мо. 61), при цьому на С-кінці ефекторного пептиду розміщена послідовність КЕОЇ., направляюча в ендоплазматичний ретикулум (ЗЕО. Мо. 56), причому остання є частиною С-кінця всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 5, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 23 і ЗЕО. Мо. 89
Амінокислотна послідовність: зЕО. Мо. 23 1 ВМААНІТатТА САБЗМТІ 55РМ ЗКМЕКАГ СИВАК ІМБУЕЗЗАБОИ НОРІ ЗМІ НІ В 51 МОЇ МІНЕКОа ЕММІМ5ОТМУЕ ВЕОЄБІКЕМТ КМОКОММОТМІ УКУТУРОРІ 101 ГІ МКЗАВНМЗО М/ЗКОАЕМаИаї м вІМОСаїгЕеЇ КЕМОВІЄМ5М ТМЕН ОМОН 151 ЕАБЕРСАРІ М ассасасеАКК АМТІЗООЕРа ВТаї РОЇ 55М ТЕЕЕОСІАМАМ 201 ОМ5І ОСАЕРОа ОАЕЗАВІВА5 БАМОТ5ЕРАК ЕЕООМОММОЮ РЕБРІ ОБМІ ЕМ 251 ГРОМОРММЕА ІВМАМОа5І А5 ОАТКООККОК КЕЕОККЕОІ.
ДНК послідовність: 5ЕО. Мо. 89 1 сататтаСАсп САСАТАТТАС бааСАСобаТ ссаТСатТАаСА АТАСССтТОада
САаСССОсААТ АБСАДААДАТОа АААддасАСтТ аааТтСасСАдДА АТТААТАССТ 101 сОаспАдАдаСАс ббатАаСбОасІ САТАаСТТІС ТаАСаСААТСТ асСАтотасат
ААТОаСИСТаААС ТасТтаАТТСА ТИАААДААсСИас ТТТАТТАТА ТТТАТАаССА 201 сСАССТАТТТТІ СОаСтТТТСААС АДОдДААТТАА АПАДААСАСС 0 ААДААТОаАТА
ААСААДАТасатТ аСАСаТАТАТТ ТАСАДАТАТА ССАастТАТОС ССАТСССАТТ
З01 сСтТастТаАТОА АААдаСаСАСс ТААТАааСТОаї тасАсССАААс; АТаСАСААТА во таатотТатАТ АаСАТТТАТО АаСИТОаСАТ ТТ ТаААСТОа АДАСААдДАТОа
401 АТСОСАТТТТ татадаСбатТа АССААТаААС АТСТОАТТОА ТАТасСАТСАТ слада,ассАааст тттта,стас Атотаст сатаатаата атласбсаатас 501 ТСаТАДАдДАА СатТАТОАССА тТТАаССАСпСА АСААТтттасІ СбатАсСсаатТо тасСасАТСтТ чадасАдасСАТа АССОСААДСАдОа ААСААДАТТаС СТАСаСААТОа 601 САСАТаАДОаСС тасАас,сасТаС АСААТТТасСІ САпОаСАСпААА саСасСАСАТАТ
ТаАТаСААдОаС ДаСасСААТай АТАССАаСОСА АССИ,сСАААдА аААпААсСАСаИ 701 АТТАССАСОТ ТАтТаСАсСОсАТ СбОасААТТІС тТаСАпАсаСатТ тот асААААТ стасбсаата ТОаАТССОАА ТААТадАасСА АТТССТААТа СААТацСатАс 801 ССТаОпСААОС СААаСААССА ААпАТОСпйСАА АДААСАТААА АААспАсасААС
АСААДАААСА АВАТСТаИа
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) або Типег (ОЕЗ) з Момадеп Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 24. Злитий протеїн послідовності БЕО. Мо. 24 (порівняльний)
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 24 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 183 амінокислот, і масу 21 кДа, в якому на М-кінці послідовності 119-281ТКАЇЇ. в якості ефекторного пептиду приєднаний декапептид, отриманий з ліганду ТМЕ (5ЕО. Мо. 48). Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташовані послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами чРА (5ЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 5, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 24 і ЗЕО. Мо. 90
Амінокислотна послідовність: 5ЕО. Мо. 24 1 МАМРОАЕСОЇ ВУМАРІ а АС РОВМААНІТа ТВОВ5ЗМТІ 55 РМЗКМЕКАЇ С 51 ВКІМБМ/ЕЗЗА 5ОН5ЗЕЇ ЗМІ Н І АМОЕЇ МІНЕ КОЕУМІМ5ОТ МЕВЕОЕБЇІКЕ
Коо) 101 МТКМОКОММО МІМКУТОУРО РІ МКЗАВМ 5БСМУЗКОАЕМИ І УБІМОСИЇЕ 151 ЕГКЕМОВІЄЕМ БМТМЕНІ ОМ ОНЕАЗЕРСАРЕ І Ма
ДНК. послідовність: 5ЕО. Мо. 90 1 саТТаСАААТО баСАпаСАпА дасатсАааСста Са,асатптато атосастаса тотассадсат сса,асда,аСатоа ттасСсАдасСАСА ТАТТАССССО АСОСОИТаатТо 101 сатТАаСААТАС сСТаАдаСАс!С ССОпААТАаСА ААААТаАААА дабоСтават
СатТААААТТА АТАИаСтТОаааА АдасСАас,асСат лабастТСАТА ССТТТСТОаАС 201 СААТСТаСАТ СТаСОстТААТа саСОпААСТОаст сАТТСАТОАА АААсасттт
АТТАТАТТТА ТАССАСАСС ТАТТТТСОаСтТ ТТСАС!ОААСА ААТТАДАСАА 301 ААТАССАдДАА АТОАТАААСА ААТастТасСАс ТАТАТСТАТА ААТАТАССАС
СТАТССОаСАТ ССЧАТТСТасС ТОАТОААдАа СасСсАСатААТ АаСТИаИТТаслаА 401 аСААдАСАТОС СОААТАТОаСТІ СТатТАТАССА ТІТАТСАСОсс 0 тТааСАТТТТ
СААСТаААдОа АДААТаАТСа САТ Тата даСатаАССА АТОААСАТСТ 501 СОАТТаАТАТа САТСАТИаААСс ССАССТТТ тастасАтт стааттаат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї В21 (ОЕЗ3) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 25. Злитий протеїн послідовності БЕО. Мо. 25 (порівняльний)
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 25 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 179 амінокислот, і масу 20,7 кДа, в якому на М-кінці послідовності 119-281ТКАЇЇ. в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність б-амінокислотного пептиду, отримана з ТМЕ (ЗЕБЕО. Мо. 49). Крім того, між послідовністю ефекторних пептиду і послідовністю ТКАЇЇ- розташовані послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами пРА (ЗЕО. Мо. 52) і
ММР (ЗЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 5, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в 60 Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 25 і ЗЕО. Мо. 91
Амінокислотна послідовність: 5ЕО. Мо. 25 1 ГАМЕОМЕВУМА РІ а АаРОВМ ААНІТатТВаИВ 5МТІ 55РМ5К МЕКАЇ САКІМ 51 БМ/ЕЗЗАБОНЗ5 РІ ЗМІ НІ АМС ЕІ МІНЕКО ЕМ МІМ5ОТУЕВЕ ОБЕБІКЕМТКМ 101 ОКОММОМІУК УТ5УРОРІ МКЗАВМЗСМУЗ КОАЕМИЇ БІ МОСИІЕЕЇ КЕ 151 МОВІЕЄМ5УТМ ЕНГІОМОНЕА 5ЕРСАРІ Уа
ДНК-послідовність: ЗЕО. Мо. 91 1 сСтапСААдАТа статосААСба тапатпссаї ссаеастаасІо та,аСбАдаатоо ссла,асатат аСАаСАСАТА ТТАССОСаСАС СССТа,Ттоат АаСААТАССС 101 таАаСАаССС пСААТАССААДА ААТОААААдА сота СОс 0 ТААААТТААТ дастасаААА аСсАааСсСсатАа саатСАТАаС ТТоТаАасСА АТСТасСАТСТ 201 асСсаТтТААТассС сААСТОСТОА ТТСАТОАААА АсСОасСтТТТТАТ 0 ТАТАТТТАТА аССАСАССТА ТТТТСОасСтТТТ САаСАдДОАдДА ТТАААДСААДАА ТАССАДААДАТ 301 сСАТАААСААДА тТасптТасСАсСтТА ТАТСТАТААА ТАТАССАОСТІ АТтТоСасАТОС вАТТСТасСтТа АТИААААсаСОеа сАСОатТААТАа СсТаттасвАсаС АААДпАТасссо 401 ААТАТаСТІСТ саТАТАССАТІ ТАТСАСОссТО аСАТТТТТаА 0 АСТаАААСАА
ААТаАТСаСА Тттттатада сСатаАССААТ СААСАТСТОаА ТТОАТАТаСА 501 ТСАТадАдасСо дасттттта,а сатасАттеосеатаат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 26. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 92 (порівняльний)
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 26 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 180 амінокислот, і масу 20,8 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 119-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний 5-амінокислотний фрагмент ТМЕ цитокіну (ЗЕО. Мо 50) з додатковим ван-Сух залишком на обох кінцях, тобто на С-кінці і М-кінці. Крім того, між послідовністю ефекторних пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташовані послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами ЧчРА (ЗЕО). Мо. 52) ії ММР (ЗЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 5, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені нижче, відповідно, 5ЕО. Мо. 26 і ЗЕО. Мо. 92
Амінокислотна послідовність: 5ЕО. Мо. 26 1 СРБЕСІ СВУМ АРІ АСРОВ МААНІТаТтАНа ВЗМТІ 55РМ5 КМЕКАГ СИВКІ 51 М5М/ЕЗЗАБОИН БІ ЗМІ НІ ВМ СЕ МІНЕКОЕ УМІМ5ОТМЕВ РОЕБІКЕМТК 101 МОКОММОМІМ КУТЗУРОРІЇ І МК5АВМЗСМ ЗКОАЕМИїЇ У ІМОСИЕЕЇ К 151 ЕМОВІЕМ5МТ МЕНІГІОМОНЕ АЗЕРСАРІ Ма
ДНК-послідовність: ЗЕО. Мо. 92 1 татобОАабос ААдсатотата тстаптагт сстосаСстаа аттааСАса тоса,аслаСсат аттасСАасСАС АТАТТАССОО САсСоСатаст сСатАасСААТА 101 сСССтТОАаСАСп СССОААТАСС АДАААТОААА АдаСоСТапо! ТоатТАдААТТ
ААТАССТОаСО ААДаСАсСОоСОо тлабасТСАТ АИСТТТСоТОаА ССААТСТасСА 201 тТСстТаСатТААТ саСОсААСТОс о тТаАТТСАТОА ААДААСОасСТТІ 0 ТАТТАТАТТ
АТАаССАСАС СТАТТТТСОаС ТТТСАСОСАдДОа АААТТАДАСА АААТАССАДА 301 ААТОАТАДАС АААтТастТасСА сатТАТАТСОТАТ ААДАТАТАССА астАТОСОааЙА тТоСаАТТСТа стТаАТаАААА СОаСАССОТАА ТАИСТИаТТас; АсССАААСАТОИ 401 ССОААТАТОС ТотТатТАТАСС АТТТАТСАсСа стТасаСАТТТ ТаААСТОаААА
СААДААТаАТО ССАТТтТтТТат адаСатаАСо ААТИААСАТО ТаАТТОаАТАТ 501 асйАТСАТаАА СССАССТІТ тОесТа,асАТт ттаесттаат
Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, яка вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище.
Приклад 27. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 93
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 93 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 459 амінокислот, і масу 50,4 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднана людська КМАзе А (5ЕО. Мо 32) повної довжини, що межує на своєму С-кінці з послідовністю, яка направляє в ендоплазматичний ретикулум (КОЕМ), а на своєму М-кінці - з гнучким гліцин-сериновим лінксером (ЗЕО Мо. 175). Крім того, для стабілізації тривимірної структури послідовність ТКАЇЇ має приєднаний на своєму М-кінці поліцістеіновий лінкер (ЗЕО. Мо. 179), межує на М-кінці з гліціновие залишком. Крім того, між послідовністю
ТКАЇЇ і послідовністю ефекторного пептиду в певному порядку розташовані гнучкий гліцин- серинових лінкер (5ЕО. Мо. 59), лінкер для РЕСуїайоп (ковалентного зв'язку) (ЗЕО. Мо. 170), послідовність ділянки розщеплення, розпізнана (активізована) фурином (ЗЕО. Мо. 53), гнучкий гліцин-сериновий лінкер (5ЕО Мо. 65) і модифікований домен транслокації Рзепдотопав аегидіпоза (делеція спіралі Е аеїейоп) (ЗЕО. Мо 176).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.б, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, 5ЕО. Мо. 93 і ЗЕО. Мо. 122
Описана вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп.
Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 28. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 94
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 94 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 213 амінокислот, і масу 24,7 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ. 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний Миг77 - похідний пептид (5ЕО. Мо 35). Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на М-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агд-залишків. Між послідовністю ефекторних пептиду і послідовністю ТКАЇЇ- знаходиться послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР
Коо) (ЗЕО. Мо. 51) і иРА (ЗЕО). Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.б, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 93 і ЗЕО. Мо. 122
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам БЕ. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 29. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 95
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 95 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 204 амінокислот, і масу 23,1 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 116-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний азурін - похідний пептид (ЗЕО. Мо 151). Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ. знаходиться послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (5ЕО). Мо. 51) і иРА (ЗЕО). Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.б, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 95 і 5ЕО. Мо. 124.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 30. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 96
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 96 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 205 амінокислот, і масу 23,3 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 120-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний азурін - похідний пептид (ЗЕО. Мо 151). Крім того, між послідовністю ТКА ої послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянки 60 розщеплення, розпізнаної (активізованої) фуриновою протеазою (ЗЕО. Мо. 172), додатково відокремленою від ТКАЇЇ -послідовності гнучким гліцин-сериновим лінкером с(о(О5 (5ЕО0. Мо. 58). С-кінець ефекторного пептиду оточений (межує) послідовністю КЕОЇ, спрямовуючою в ендоплазматичний ретикулум (ЗЕО. Мо. 56), яка формує частину С-кінця всієї конструкції
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.б, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 96 і 5ЕО. Мо. 125.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 31. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 97
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 97 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 207 амінокислот, і масу 23,1 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 120-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний азурін - похідний пептид (5ЕО. Мо 151). Між послідовністю ТКА ої послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (5ЕО. Мо. 51) і иРА (ЗЕО. Мо. 52), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ гнучким гліцин-сериновим лінкером сававиасиа(5ЕО. Мо . 62).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.б, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 97 і 5ЕО. Мо. 126.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Ко) Приклад 32. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 98
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 98 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 327 амінокислот, і масу 36,2 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ. 120-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний азурін - похідний пептид повної довжини (ЗЕО. Мо 152). Крім того, між послідовністю ТКАЇЇ і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (ЗЕО. Мо. 51) і иРА (ЗЕО. Мо. 52), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ гнучким гліцин-сериновим лінкером ссавБаціи(5ЕО. Мо. 62).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 7, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 98 і ЗЕО. Мо. 127.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 33. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 99
Протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 99 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 199 амінокислот, і масу 22,9 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 114-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний Зтас / СІАВІО - похідний октамірний пептид (ЗЕО. Мо 39).
Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на її С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що містить 7 Агуд - залишків. Крім того, між послідовністю ТЕАЇ! і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧчРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (ЗЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 7, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 99 і ЗЕО. Мо. 128.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу бо послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 34. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 100
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 100 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 221 амінокислоти, і масу 25,2 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний 5тас / СІАВІ О - похідний октамерний пептид (ЗЕО. Мо 39).
Послідовність ТЕКАЇЇ на своєму М-кінці має поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 177) для стабілізації своєї тривимірної структури. Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на своєму С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агуд - залишків. Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами иРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (ЗЕО.
МО. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 7, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 100 і 5ЕО. Мо. 129.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 35. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 101
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 101 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 212 амінокислот, і масу 24,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ. 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний 5тас / СІАВІ О - похідний октамерний пептид (ЗЕО. Мо 39).
Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на своєму С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агоу - залишків. Крім того, між послідовністю ТЕАЇ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення,
Зо розпізнаних (активізованих) протеазами чРА (5ЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 7, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, хЕО). Мо. 101 і 5ЕО. Мо. 130.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 36. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 102
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 102 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 212 амінокислот, і масу 24,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, сконструйований з аРР - протеїну і домену ВНЗ протеїну Вах (5ЕО . Мо 153). Послідовність ефепкторного пептиду має приєднаний на своєму С- кінці поліаргініновий транспортує домен, що складається з б Агуд - залишків. Крім того, між послідовністю ТКАЇГЇ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧчРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.7, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
БО Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 102 і 5ЕО. Мо. 131.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 37. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 103
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 103 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 247 амінокислот, і масу 24,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇІ 95-281 в якості бо ефекторного пептиду приєднаний пептид, сконструйований з аРР - протеїну і домену ВНЗ протеїну Вах (5ЗЕО . Мо 153). Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на своєму С- кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 6 Агд - залишків. Послідовність
ТКАЇЇ. має приєднаний на своєму М-кінці поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 177) для стабілізації тривимірної структури. Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ. розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами РА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (ЗЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 8, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 103 і 5ЕО. Мо. 132.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 38. Злитий протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 104
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 104 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 212 амінокислот, і масу 24,4 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 114-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, сконструйований з аРР - протеїну і домену ВНЗ протеїну Вах (ЗЕО . Мо 153). Крім того, між послідовністю ТКАЇГ/ і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (ЗЕО). Мо. 51) і иРА (5ЕО. Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 8, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 104 і 5ЕО. Мо. 133.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А,
Зо використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 39. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 105
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 105 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 221 амінокислоти, і масу 24,8 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 120-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з Кеїйсціоп КТМ1-С (ретікулона) (ЗЕО. Мо 155). Послідовність ефекторного пептиду має приєднану на своєму С-кінці послідовність (ЗЕО).
Мо. 168) ядерної локалізації. Додатково, для стабілізації своєї тривимірної структури послідовність ТКАЇЇ. має приєднаний на своєму М-кінці поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 179), що межує з двома або трьома гліциновие залишками, відповідно, на М-і С-кінцях. Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧчРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 8, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 105 і 5ЕО. Мо. 134.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 40. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 106
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 106 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 435 амінокислот, і масу 48 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 119-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з Кеїїсцшоп КТМ1-С (ретікулону) (ЗЕО. Мо 155). Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на своєму С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 8 Агуд - залишків. Додатково, для стабілізації своєї тривимірної структури послідовність ТКАЇЇ має приєднаний на своєму М-кінці поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 178). Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ- розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами иРА
(ЗЕО. Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51), причому, зазначена послідовність ділянок розщеплення межує (оточена) з лінкерною послідовністю (051505 (5ЕО. Мо. 60), відповідно на М-та С-кінцях.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 8, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, БЕО. Мо. 106 і 5ЕО. Мо. 135.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 41. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 107
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 107 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 580 амінокислот, і масу 65 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднана конститутивно активна каспаза-3 (єдиний ланцюг) (ЗЕО. Мо 157). Крім того, між послідовністю ТКАЇЇ і послідовністю ефекторного пептиду розташований транспортуючий домен, отриманий з Рзепдотопаз (5ЕО Мо. 176). Транспортуючий домен і послідовність ефекторного пептиду з'єднані за допомогою гнучкого лінкера вОос5(0ОО (5ЕО.
Мо. 62). Транспортуючий домен відділений від послідовності ТКАЇЇ послідовністю ділянки розщеплення, розпізнаною (активізованою) фурином (5ЗЕО. Мо. 53), при цьому дана послідовність ділянки розщеплення оточена (межує) на М-і С-кінцях двома лінкернимі послідовностями (005 (5ЕО). Мо. 59) і БОС (5ЕО. Мо. 65), відповідно.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 8, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 107 і 5ЕО. Мо. 136.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А,
Зо використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 42. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 108
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 108 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 247 амінокислот, і масу 28,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 119-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний БАС домен від Раг-4 (5ЗЕБО. Мо 158) Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на своєму С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агд - залишків. Додатково, послідовність ТКАЇЇ має приєднаний на своєму
М-кінці гнучкий гліцин-сериновий лінкер сО5ООС (5ЕО. Мо. 60). Крім того, між послідовністю
ТЕАЇЇ. їі послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧРА (5ЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО). Мо. 173).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.9, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 108 і 5ЕО. Мо. 137.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
БО Приклад 43. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 109
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 109 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 247 амінокислот, і масу 28,5 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 119-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний БАС домен від Раг-4 (5ЗЕБО. Мо 158) Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агу - залишків, а на М-кінці - послідовність МІ.5 (сигналу ядерної локалізації) від фактора транскрипції Осіб (5ЕО. Мо. 168). Послідовність ТКАЇЇ має приєднаний на її М-кінці гнучкий гліцин-сериновий лінкер со5ООС (5БО. Мо. 60). Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧРА (5ЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО). Мо. 173).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.9, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 109 і 5ЕО. Мо. 138.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 44. Злитий протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 110
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 110 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 270 амінокислот, і масу 30,8 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇІ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний протеїн Моха (5ЕО. Мо 159) Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на М-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7
Ага - залишків. Додатково, для стабілізації її тривимірної структури послідовність ТКАЇЇ має приєднаний на її С-кінці поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 177), відділений від послідовності
ТКАЇГ. гнучким гліцин-сериновим лінкером сО505 (ЕС. Мо. 57). Крім того, між послідовністю
ТЕАЇЇ. ії послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (ЗЕО). Мо. 51) і иРА (ЗЕО. Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 9, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, хЕС). Мо. 110 ії 5ЕО. Мо. 139.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 45. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 111
Ко) Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 111 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену 3 207 амінокислот, і масу 23,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇЇ 114-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид МТО / СКР, отриманий з протеїну Моха (5ЕО). Мо 160).
Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на М-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Аго - залишків. Для стабілізації її тривимірної структури послідовність
ТКАЇЇ має приєднаний на її С-кінці поліцистеїновий лінкер (ЗЕО. Мо. 177), відділений від послідовності ТЕАЇЇ. гнучким гліцин-сериновим лінкером ОБО (5ЕО. Мо. 57). Крім того, між послідовністю ТКАЇГЇ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (5ЕО). Мо. 51) і иРА (ЗЕО). Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.9, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 111 і 5ЕО. Мо. 140.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 46. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 112
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 112 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 311 амінокислот, і масу 35 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ95-281 в якості ефекторного пептиду приєднана пептидная онконаза (5ЕО. Мо 41). Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ПРА (5ЕО. Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ двома гнучкими гліцин-сериновими ліннерами СОСО5 (ЗЕО. Мо. 59).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг.9, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 112 і 5ЕО. Мо. 141.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону бо для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 47. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 113
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 230 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 311 амінокислот, і масу 27 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний домен ВНЗ від протеїну РОМА (5ЕО. Мо 37). Послідовність ефекторного пептиду має приєднаним на її С-кінці поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 9 Агд-залишків. Крім того, між послідовністю ТКАЇЇ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами иРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (5ЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 10, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 113 і 5ЕО. Мо. 142.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 48. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 114
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 114 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 225 амінокислот, і масу 25,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇІ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний короткий пептид, отриманий з протеїну Вій (ЗЕО. Мо 31).
Послідовність ефекторного пептиду має приєднаний на С-кінці транспортуючий домен КРЕККРУ (ЗЕО. Мо. 167). Для стабілізації її тривимірної структури послідовність ТЕКАЇЇ. має приєднаний на її С-кінці поліцистеїновий лінкер (5ЕО. Мо. 177). Крім того, між послідовністю ТКАЇ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення,
Зо розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (5ЕО. Мо. 51) і иРА (5ЕО. Мо. 52).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 10, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, БЕО. Мо. 114 і 5ЕО. Мо. 143.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 49. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 115
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 115 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 234 амінокислот, і масу 26,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇІ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний короткий гібридний пептид, Апір-ТРЕ (ЗЕО. Мо 161). Крім того, між послідовністю ТКАЇГ. і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (ЗЕО. Мо. 51) і иРА (5ЕО.
Мо. 52), додатково відокремлена від послідовності ТКАЇЇ. поліцистеїновим лінкером (ЗЕО). Мо. 177) для стабілізації її тривимірної структури, з наступними двома гліциновими залишками.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 10, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
БО Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 115 і 5ЕО. Мо. 144.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 50. Злитий протеїн послідовності 5ЕО. Мо. 116
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 116 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 216 амінокислот, і масу 24,3 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇІ 120-281 в якості бо ефекторного пептиду приєднаний пептидний інгібітор домену 5Н2 протеїну 5іаїЗ (5ЕО. Мо 162).
Додатково, для стабілізації тривимірної структури на М-кінці послідовності ТЕАЇЇ приєднаний поліцистеїновий лінкер (ЗЕО). Мо. 179), при цьому зазначений лінкер оточений (межує) на М-і С- кінцях трьома гліциновими залишками і 3505 - мотивом, відповідно. Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧчРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (ЗЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 10, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 116 і 5ЕО. Мо. 145.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 51. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 117
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 117 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 194 амінокислот, і масу 22,8 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇІ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вак (ЗЕО. Мо 163) - Послідовність ефекторного пептиду на своєму С-кінці має приєднаний поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агд-залишків. Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ЧчРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (ЗЕО). Мо. 51).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 10, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 117 і 5ЕО. Мо. 146.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А,
Зо використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 52. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 118
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 118 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 257 амінокислот, і масу 30 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇЇ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вай (ЗЕО. Мо 164).
Послідовність ефекторного пептиду на своєму С-кінці має приєднаний поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 8 Агд-залишків. Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю ТКАЇЇ розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами иРА (ЗЕО. Мо. 52) і ММР (5ЕО. Мо. 51). На С-кінці послідовності
ТААЇГ 121-281 є гнучкий лінкнер СО5НО (5ЕО. Мо. 182), за яким слідує послідовність ділянки розщеплення, розпізнаної (активізованої) протеазою тромбіну (ЗЕО. Мо. 174), і послідовність
ТВАЇІ 95-121 в якості частини С- кінця всієї конструкції.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 11, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 118 і 5ЕО. Мо. 147.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 53. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 119
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 119 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 236 амінокислот, і масу 27,5 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇІ 95-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид, отриманий з домену ВНЗ протеїну Вай (ЗЕО. Мо 164) - Послідовність ефекторного пептиду на своєму М-кінці має приєднаний поліаргініновий транспортуючий домен, що складається з 7 Агд-залишків. Крім того, між послідовністю ТЕАЇ і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (5ЕО. Мо. 51) і иРА (5ЕО. Мо. 52), при цьому С-
кінець послідовності ТКАЇ1І95-281 додатково відділений від послідовності ділянок розщеплення лінкером, що складається з (305 - залишків.
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 11, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 119 і 5ЕО). Мо. 148.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Приклад 54. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 120
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 120 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 216 амінокислот, і масу 24,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності ТКАЇІ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид АТАР з протеїну ВЯ1 (5ЕО. Мо 165). Послідовність ефекторного пептиду на своєму М-кінці має приєднану мембрану, транспортуючу домен
КРЕКРУК (5ЕО. Мо. 181). Крім того, між послідовністю ТКАЇЇ і послідовністю ефекторного пептиду розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами ММР (ЗЕО). Мо. 51) і иРА (ЗЕО). Мо. 52), додатково відокремлених від послідовності
ТКАЇЇ гнучким гліцин-сериновим лінксером СО 5((0(00о (ЗЕО. Мо. 180).
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 11, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 120 і 5ЕО. Мо. 149.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Ко) Приклад 55. Злитий протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 121
Протеїн послідовності ЗЕО. Мо. 120 (1217?) являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 237 амінокислот, і масу 27 кДа, в якому на М-кінці послідовності ТКАЇІ 121-281 в якості ефекторного пептиду приєднаний пептид АТАР з протеїну ВЯ! (5ЕБО. Мо 165).
Послідовність ефекторного пептиду на своєму М-кінці має мітохондріальну цільову (націлюючи) послідовність (ЗЕО. Мо. 166). Крім того, між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю
ТКА розташована послідовність ділянок розщеплення, розпізнаних (активізованих) протеазами чРА (ЗЕО). Мо. 52) і ММР (ЗЕО). Мо. 51), додатково відокремлених від послідовності
ТКАЇЇ гнучким гліцин-сериновим лінкерос с(ое50(0о (5ЕО. Мо. 60) ..
Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 11, а його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в
Е. соїї, представлені, відповідно, ЕС). Мо. 121 і 5ЕО. Мо. 150.
Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну виконана у відповідності з загальними процедурами. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам Е. соїї Типег (ОЕЗ) з Момадеп. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище.
Дослідження протипухлинної активності злитих протеїнів
Дослідження протипухлинної активності злитих протеїнів було проведено іп міїго (у пробірці) при випробуваннях проби на цитотоксичність на клітинних лініях пухлини і іп мімо (в природних умовах) на мишах. Для порівняння був використаний протеїн ПТКАЇЇ 114-281 (далі по тексту також позначений як просто ТКАЇМ). 1. Випробування на клітинних лініях іп міїго.
Клітинні лінії
Клітини людського раку прямої кишки СоЇо205 (АТСС й ССІ -222), дрібноклітинного раку легені АБ49 (АТС Ж ССІ-185), раку підшлункової залози ВХРОЗ (АТСС Ж СКІ -1687), раку простати 2БО145 (АТСС Ж НТВ-81) і РОЗ (АТСС Ж СКІ-1435) і крупноклітинного раку легені людини МСІ-Н4бО-Гис2 (Саїїрег Ж 124316) витримували в середовищі КРМІ 1640 (Нусіопе,
Годап, ОТ, О5А) з додаванням 1095 ембріональної телячої сироватки. Клітини раку яєчників 60 людини ОМСАВ-3 (АТОСС я НТВ-161) витримували в середовищі КРМІ 1640 (Нусіопе, І одап, ОТ,
БА) з додаванням 2095 ембріональної телячої сироватки і 0,01 мг / мл інсуліну. Клітини раку сечового міхура ОМ-0ОС-3 (АТС Ж СВІ -1749), клітини раку легені ЗК-МЕ5-1 (АТОС Ж НТВ-58), клітини раку молочної залози МСЕ-7 (АТОС й НТВ-22), клітини раку сполучної тканини НТ10О80 (АТС Ж СС -121), клітини Нерс2 гепатоми печінки (АТСС й НВ-8065) утримували в культуральному середовищі МЕМ (Нусіопе, І одап, ОТ, О5А) з додаванням 1095 ембріональної телячої сироватки (Нусіопе, Годап, ОТ, ОБА). Пухлинні клітини сполучної тканини НТ1ТО80 витримували також в ході експерименту в кондиціонованому середовищі, зібраному з 2-денної нормальної культури зазначених клітин. Клітини людського раку прямої кишки НСТ-116 (АТО Я
СОС -247) і НТ-29 (НТВ-38), раку яєчників БК-ОМ-3 (АТО я НТВ-77), раку матки МЕ5З-5А (АТОС
Ж СВІ- 1976) і її клону, стійкого до доксорубіцину МЕЗ-5А/Ох5 (АТОС я СВІ -1977) витримували в середовищі Маккоя (МеоСоу'5) (Нусіопе, Годап, ОТ, ОА) з додаванням 1095 ембріональної телячої сироватки. Клітини раку сечового міхура 5МУ780 (АТСС Ж СКІ -2169), клітини раку молочної залози МОА-МВ-231 (АТС я НТВ-26) і подібну епітеліальній клітинну лінію РАМС-1 людської карциноми підшлункової залози, СІ 5 (Обслуговування клітинних ліній Ж 300228 (СеїЇ
Ііпе5 Зегмісе Ж 300228) витримували в ОМЕМ (Нусіопе, Годап, ОТ, О5А) з додаванням 1090 ембріональної телячої сироватки. Клітини НОМЕС із пупочної вени (АТСС Ж СКІ-1730) утиримували в середовищі М199 (Нусіопе, І одап, ОТ, ОБ5А) з додаванням 2095 ембріональної телячої сироватки, фактору росту 0,02 мг / мл ЕСО5 (5Зідта), 0,1 мг / мл гепарину (Зідта), дані клітини були вирощені на середовищі, покритому 0,190 желатином. Клітини молочної залози
МСЕТОА (АТО Я СВІ -10317) витримували в ОМЕМ: Е12 (1:1) (Зідта, О5А)) з додаванням 595 кінської сироватки, 0,5 мг / мл гідрокортизону, 10 мкг / мл інсуліну, 20 нг / мл фактору росту ЕСЕ (усі Зідта, ОБА) У всі середовища було додатково додано 2 мМ І -глютаміну і антибіотики (10бод./мл (Ш/ті) пеніциліну і 100 мкг / мл стрептоміцину (Нусіопе, Годап, ОТ, О5А)). Клітини витримували при 37 "С в 595 СО2/повітрі на випадок росту середовищ КРМІ, МЕМ, Мссоу і
ОМЕМ: Е12, и в 1095 СО2/повітрі на випадок наявності ОМЕМ. Клітини регулярно перевіряли на наявність мікоплазми методом ПЛР (РСР) (Полімеразної ланцюгової реакції)з використанням набору виробництва Німеччини для визначення наявності мікоплазми (Мепогеобем Мусоріазта
РОК Оегесійп Кії (набор для ПЛР визначення мікоплазми) (Міпегма Віоїарв, Вепійп, Септапу).
Тест на цитотоксичність МТТ
Зо МТТ є колориметричним аналізом, застосовуваним для вимірювання клітинної проліферації, життєздатності і цитотоксичності. Він полягає в розкладанні жовтої солі тетразолію МТТ (4,5- диметил-2-тіазоліл). -2,5-дифенілтетразолію броміду) до нерозчинного у воді фіолетового барвника формазану за допомогою ферменту сукцинат-тетразолію редуктази, присутньої в мітохондріях.
Скорочення МТТ відбувається тільки в живих клітинах. Аналіз даних полягає у визначенні
ІСво концентрації протеїну (в нг / мл), при якому 5095 скорочення числа клітин відбувається в обробленій популяції, у порівнянні з контрольними клітками. Результати були досліджені з використанням програмного забезпечення сСгарпРай Ргізт 5.0. Випробування проводилися відповідно до описів з літератури (Сеїї5, УЕ, (1998). Сеї! Віоіоду, а І арогаїгу НапароокК (Клітинна біологія, лабораторний довідник), зесопа еййіоп, Асадетіс Ргев5, Зап Оіедо; Мапо, У., Коп, МУ,
Тваї, УН., (2004); Іпмоїметепі вірусних і хімічних факторів з раком порожнини рота в Тайвані (Дослідження впливу вірусних і хімічних факторів на злоякісні новоутворення порожнини рота в
Тайвані), Урп У Сіїп Опсої, 34 (4), 176-183). Середовище клітинної культури розбавляли до певної щільності (102 - 105 клітин на 100 мкл). Потім 100 мкл належним чином розведеної клітинної суспензії поміщали в 9б-лунковий планшет в трьох повторах. Підготовлені таким чином клітини інкубували протягом 24 ч. при 37"С у 595 або 1095 02, залежно від використовуваного середовища, а далі до клітин (в 100 мкл середовища) було додано ще 100 мкл середовища, що містить різні концентрації досліджуваних протеїнів. Клітини інкубували з дослідженими протеїнами протягом найближчих 72 годин, що еквівалентно 3-4 разовому поділу клітин, після чого до середовища з досліджуваним протеїном додавали 20 мл робочого розчину
МТТ (5 мг / млі/і і інкубували протягом З год при температурі 37 "С в 595 СО2. Після цього середовище з розчином МТТ видаляли, і кристали формазану розчиняли шляхом додавання 100 мкл ДМСО. Після змішування вимірювали спектральну поглинальну спроможність при 570 нм (референс - фільтру 690 нм).
Результати досліджень цитотоксичності іп міго наведені в Таблицях 1, 1а, 16 р та в Таблиці 2 як значення ІСво (нг / мл), відповідні концентрації протеїну, при якому цитотоксичний ефект злитих протеїнів спостерігається на рівні 5095 по відношенню до контрольних клітин, інкубованих тільки з розчинником. Кожен експеримент представляє середнє значення щонайменше двох незалежних експериментів, проведених у трьох повторах. В якості критерію відсутності активності протеїнових препаратів була прийнята межа ІСзо, відповідна 2000 нг / мл.
Злиті протеїни зі значенням ІСво вище 2000 вважаються неактивними.
Клітини для даного дослідження були обрані таким чином, щоб включити пухлинні клітинні лінії з природною резистентністю до протеїну ТКАЇЇ (критерій природної резистентності до
ТАВАЇЇ: ІСво для протеїну ТКАЇЇ» 2000), пухлинні клітинні лінії, чутливі до протеїну ТЕАЇ. і резистентні до доксорубіцинової лінії МЕ5-ЗА/ОХ5 як ракової лінії, резистентної до звичайних протиракових лікарських засобів.
Недиференційована клітинна лінія НОУЕС була використана в якості здорової контрольної клітинної лінії для оцінки впливу / токсичності злитих протеїнів на неракові клітини.
Отримані результати підтверджують можливість подолання резистентності клітинних ліній у відношенні до ТКАЇЇ шляхом введення певних злитих протеїнів за винаходом в клітини з природною стійкістю до ТКАЇГ. При здійсненні введення злитих протеїнів за винаходом у клітини, чутливі до ТКАЇГ,, в деяких випадках дійсно спостерігалося чітке і сильне потенціювання потенції дії ТКАЇЇ, проявляючись в зниженні значень ІСво для злитого протеїну в порівнянні з
ІСво тільки для ТЕАЇ. Крім того, цитотоксична активність злитого протеїну за винаходом була отримана на клітинах, резистентних до класичного протиракового лікарського засобу доксорубіцину, в деяких випадках сильніша за активність ТКАЇЇ..
Значення ІСво вище за 2000, отримане для неракових клітинних ліній, показують відсутність токсичних ефектів, пов'язаних з використанням протеїнів за даним винаходом, відносно здорових клітин, що вказує на потенціал низької системної токсичності протеїну.
Таблиця 1
Цитотоксична активність злитих протеїнів за винаходом і порівняльних протеїнів
Безперервна інкубація препаратів з клітинами протягом 72 г од (тест МТТ, нг/мл)
Протеїн МЕ5-БА |МЕ5-ЗА/Юх5| НСТ116 ЗК-МЕ5-1 А5б49 МСЕТОА
ТВА. 114-281Ї52000| |322)12.40| 173 | 31.3 | 122 |233|52000| 52000 щ-- нед и Я По ПНЯ ОХ ПОЛОН КОНЯ КОНЯ НОЯ КОНЯ КОНЯ КОХ
Приклад 1
Приклад 2
МК: евро ен ниви теливю пес раю
Приклад 5
МЕМ: верес золи нев тнотве пе гяті нео
Приклад 9 2 9ТАРІ 22000 ЩІ 1720 | 312.7 |х2000 ЩО 791.8 22000 ЩІ 22000 ЩО
Приклад 14
Приклад 18
Ми, |еетов| зе зт зи онко тек зако реко
Приклад 19
МЕ е|нз те то/те осот ел те вен тв
Приклад 20
Приклад 24 (не за »2000 1760 |367.7| 85.6 |19.96) 36.8 | 7.44 |52000 »2000 винаходом) 2.2АТТВІ1
Приклад 25 (не за »2000 157.) 40.0.) 991 |119.0 | 117.4 | 424 |52000 »2000 винаходом) 2.251182
Приклад 26 (не за 22000 22000 1895 | 70.0 | 245 | 19.2 52000 22000 винаходом) 2.261711 83
Таблиця Та
Цитотоксична активність злитих протеїнів за винаходом
Безперервна інкубація препаратів з клітинами протягом 72 г од (Тест МТІТ, нг/мл)
Протеїн А5б49 НСТ116 МСЕ10А МЕ5-БА |МЕ5-БА/Юх5| 5К-МЕ5-1 10000 ЩО 7558 ЩІ 10000 ЩО 10000 ЩО 29.15 | 12.66 зво! не и п Я ППО КОНЯ ПОЛОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОН КОХ трек, 2632.50219.911132.65| 37.69 1890.00894.03| 65.63 32.24 788 20.31 2632.50
Приклад 23 10000 223.551105.29І 10000 1280.00304.06292.50186.97182.46| 1,48
ІРВОТ2.0
Приклад
Приклад 3170 (1174/1532 12 53581240
Приклад 36 142.05 32.46) 5.66 | 2.26 | 79.16 | 3.33 2392.50| 2.12.) 0.58 1 0.10 | 3.95 тТАЗМ3.0
Приклад З пдтято 39 ва) яв) ве) ов? ев
Приклад 35 889.55 |(276.41| 1410 1273.50 57.14 1.18 10.82 3.93) 0.32 тТАЗМ2.3
Приклад
Таблиця 16
Цитотоксична активність злитих протеїнів за винаходом
Безперервна інкубація препаратів з клітинами протягом 72 г од (Тест МТІТТ, нг/мл
Протеїн Нтго наво РІ С/РВЕ/5 РАМСІ1
ТВАШ 95-281 |10000| Щ|9000| 100001 |т10000| 10000 ЩД М нед я п Я ПНЯ ПОЛЯ ПОН КОНЯ КОНЯ КО КОХ
Приклад.З
Приклад 35
Приклад 51 2. Аналіз цитотоксичної активності окремих вибраних протеїнових препаратів проти широкої панелі клітинних ліній пухлин
У Таблиці 2 представлені результати цитотоксичної активності іп міго для окремих вибраних злитих протеїнів за даним винаходом у відношенні широкої панелі пухлинних клітин різних органів, відповідних великому спектру найпоширеніших видів раку. Отримані значення ІСво підтверджують високу цитотоксичну активність злитих протеїнів, і отже, їх потенційну корисність у лікуванні раку.
Таблиця 2
Аналіз цитотоксичної активності окремих вибраних протеїнових препаратів відносно широкої панелі клітинних ліній пухлин . г. нг/мл)
Клітинна лінія нетітб 1 109.41 | 2445 | 3920 | 11 | 1113 | 069 | 303 | 042
Сою2о5 | 732 | 1.46 | 2.26 | 030 / 1.06 | 0.06 | 047 | 0.09 5УМУ780 1 2553 | 5ЛО | 386 | 1.39 0.99 | 015 | 018 | 003
АБУ 152000 | | 52000177 0152000 | | 485.3 | 55.51
ОМОА-МВ-231 | 8118 | 3.78 | 11.66 | 2.06 / 23.80 | | 789 | 281
ОМЕБ-ЗА | 52000 | - | 699 | 1.01 / 340 | | 180 | 049 рш45 | 52000 | | 10.76 | 1.63 | 137.8 | 120.3 | 589 | 23
НОМЕС | 52гобо | | »2гово | | гово | гою. 3. Протипухлинна ефективність злитих протеїнів іп мімо на ксенотрансплантатах
Протипухлинну активність протеїнових препаратів досліджували на мишачій моделі раку товстої кишки людини Со1Іо205, крупноклітинного раку легені людини МСІ-Н4АбО-Іис2, раку легені людини А5Б49 і раку підшлункової залози людини РАМС-1.
Клітини
Клітини Соіюо205 (АТСС СС й -222) витримували в середовищі КРМІ 1640 (Нусіопе, ГГ одап,
ОТ, ОА), змішували у співвідношенні 1:1 з Орі-МЕМ ((Інвітроген, Саї.22600-134) з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки і 2 мМ глютаміну. У день щеплення мишей клітини були відокремлені від підкладки шляхом промивання клітин трипсином (Інвітрогеном), далі клітини центрифугували при 1300 оборотах на хвилину, 4 "С, протягом 8 хв., суспендували в буфері
НВ5БЗ (середовищі Хенкс (НапкКз5 теаішт), підраховували і розбавляли до концентрації 28,57 х 105 клітин / мл. Потім до клітин додавали матрігель (Маїгіде!) (ВО Віосзсіепсе5, Саї.354 248) до отримання кінцевої концентрації клітин 25 х 105 клітин / мл.
Клітини Н4іб60-І ис2 витримували в середовищі КРМІ 1640 (НусСіопе, І одап, ОТ, США) з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки, 2 мМ глютаміну. В день щеплення мишей клітини були відокремлені від підкладки шляхом промивання клітин трипсином (Інвітрогеном), далі клітини центрифугували при 1300 оборотах на хвилину, при 4 "С, протягом 8 хв., суспендували в буфері НВЗ5 (середовищі Хенкс (Напкз5 теаішт), підраховували і розбавляли до концентрації 50 х 105 клітин / мл.
Клітини А549 витримували в середовищі КРМІ 1640 (НуСіопе, Годап, ОТ, США) з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки, 2 мМ глютаміну. В день щеплення мишей, клітини були відокремлені від підкладки шляхом промивання клітин трипсином (Інвітрогеном), потім клітини центрифугували при 1300 оборотах на хвилину, при 4 "С, протягом 8 хв., суспендували в буфері НВЗ5 (середовищі Хенкс (Напк5 тедішйт).
Клітини раку підшлункової залози людини РАМС-1 витримували в середовищі ОМЕМ (НуСіопе, Годап, ОТ, США) з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки, 2 мМ глютаміну. В день щеплення мишей, клітини були відокремлені від підкладки шляхом
Зо промивання клітин трипсином (Інвітрогеном), потім клітини центрифугували при 1300 оборотах на хвилину, при 4 "С, протягом 8 хв., суспендували в буфері НВЗ5 (середовищі Хенкс (Напк теаїт),
Миші
Вивчення протипухлинної активності протеїнів за винаходом було проведено на 7-9 тижневих мишах МОЮ 5СІЮ, отриманих з Харлан ШК Це, Зпам: Рагт, Вісезіег, Великобританія.
У випадку з клітинами А549, МСІ-Н4іб60-І ис2 і РАМС-1, дослідження протипухлинної активності протеїнів за винаходом було проведено на 4-5 тижневих мишах Ст: 5НО-Рікасзсіанітнг, отриманих від Спагпез Кімег, Німеччина. Мишей витримували в специфічних умовах без 5О0 патогенних мікробів з вільним доступом до їжі та демінералізованої води (досхочу (ай Ірпшт)).
Всі експерименти на тваринах були проведені відповідно до правил керуючих матеріалів: "Іпіегаівсіріїпагу Ргіпсірієє апа Сіцідейнев їог Ше О5е ої АпітаІє іп Везеагси, МаїКеїйїпа апа
Едисайоп" (Міждисциплінарні принципи і керівництво по використанню тварин в області наукових досліджень, маркетингу і освіти", виданих Спеціальним комітетом з експериментальних досліджень тварин Нью-Йоркської академії наук і схвалених ІМ Місцевим комітетом з етики експериментів на тваринах у Варшаві (Мо 71/2009).
Хід і оцінка експерименту
У день 0 миші були щеплені підшкірно (ЗС) з правого боку із застосуванням 5 х 105 клітин
Соіо205, суспендованих в 0,15 мл буферного розчину НВ5З і 0,05 мл матрігелю (Маїгідеї) за допомогою шприца з 0,5 х 25 мм голкою (Водіпагк). Коли пухлина досягла розміру «-« 90-140 мм (день 11), миші були рандомізовані для отримання середнього розміру пухлин у групі «- 115 мм3 і розподілені по групам для проведення лікування. Групам вводили препарати злитих протеїнів за винаходом і ТКАЇІЇ 114-281 для порівняння. Препарати вводили внутрішньочеревно (ІР) щодня протягом десяти днів (дах10) в дні від 11 по 20 день. Коли в терапевтичній групі пухлина досягла середнього розміру ї 2000 мм3, мишей умертвляли методом руйнування спинного мозку. Контрольна група отримувала ТКАЇ-114-281.
У випадку з Н4ібО в день 0 миші були щеплені підшкірно (5С) з правого боку із застосуванням 5 х 105 клітин МСІ-Н4А60-І ис2, суспендованих в 0,1 мл буферного розчину НВ5Б5, за допомогою шприца з голкою 0,5 х 25 мм (ВодтагкК). Коли пухлина досягла розміру « 100-120 мм (день 11), миші були рандомізовані та розподілені по групам для отримання лікування.
Групам вводили препарати злитих білків за винаходом і ТКАЇЇ 114-281 для порівняння.
Препарати вводили внутрішньовенно (ІМ) б разів на день кожен другий день. На 29-й день експерименту мишей умертвляли методом руйнування спинного мозку. Контрольна група одержувала ТКАЇЇ 114-281.
У випадку з А5бБ49 в день 0 миші були щеплені підшкірно (5С) з правого боку із застосуванням 7 х 109 клітин А549, суспендованих в 0,1 мл суміші буферного розчину НВ55: мартігель (Магіїдеї) у співвідношенні 3: 1 за допомогою шприца з голкою 0, 5 х 25 мм (Водтакгк).
Коли пухлина досягла розміру «- 100-120 мм" (день 17), миші були рандомізовані та розподілені
Зо по групам для отримання лікування. Групам вводили препарати злитих протеїнів за винаходом і
ТВА 114-281 для порівняння. Препарати вводили внутрішньовенно (ІМ) 6 разів на день кожен другий день. На 34-й день експерименту мишей умертвляли методом руйнування спинного мозку. Контрольна група одержувала ТКАЇЇ 114-281.
У випадку з РАМОС-1 в день 0 миші були щеплені підшкірно (52) з правого боку із застосуванням 7 х 106 клітин РАМС-1, суспендованих в 0,1 мл суміші буферного розчинну
НВ5З5: мартігель (Магіідеї) у співвідношенні 3: 1 за допомогою шприца з голкою 0,5 х 25 мм (Водітагк). Коли пухлина досягла розміру їх 95 мм3 (день 27), миші були рандомізовані та розподілені по групам для отримання лікування. Групам вводили препарати злитих протеїнів за винаходом і ТКАЇЇ 114-281 для порівняння. Препарати вводили внутрішньовенно (ІМ) 6 разів на день кожен другий день. На 43-й день експерименту мишей умертвляли методом руйнування спинного мозку. Контрольна група одержувала ТКАЇЇ 114-281.
Розмір пухлини вимірювали за допомогою електронного вимірювального інструмента (кронциркуля), обсяг пухлини розраховували за формулою: (аг х Б)/2, де а - менша діагональ пухлини (мм), а Б - більша діагональ пухлини (мм). Гальмування росту пухлини розраховували за формулою:
ТОЇ (95) (інгібування росту пухлини) - (М/ТЛ/С) х 100-100 95 де МЛ відноситься до середнього обсягу пухлини в групі лікування;
М/С відноситься до середнього обсягу пухлини в контрольній групі.
Результати експерименту представлені у вигляді середнього значення ж стандартне відхилення (50). Всі розрахунки і графіки були отримані з використанням програмного забезпечення СгарпРаа Ргіхт 5.0.
На фіг. 16 і 17 показані вибудувані за результатами експериментів графіки зміни об'єму пухлини у мишей СІЮ / МОБ, хворих на рак товстої кишки СоЇ0205, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, а для порівняння - ТВАЇЇ 114-281. Результати експериментів, представлені на графіках на фіг. 12 ії 13, показують, що введення злитих протеїнів за винаходом у Прикладі 1 і Прикладі 14 спричинює гальмування росту пухлини Соіо205, з ТОЇ, відповідно, 39906 і 32 96, у порівнянні з контрольною групою, на 29-й день експерименту. У випадку з
ТВАЇЇ 114-281, який використовували в якості еталонного (посилального) препарату, було отримано незначний гальмівний вплив на ріст пухлинних клітин, у порівнянні з контрольною групою, ТОЇ становив близько 9 95. Таким чином, злиті протеїни за винаходом надають набагато більшого позитивного впливу, в порівнянні з ТКАЇ...
Досліджувані злиті протеїни не викликають значних побічних ефектів, що проявляються в зниженні маси тіла мишей (тобто менше 10 95 від базової лінії маси тіла). Це свідчить про низьку ступінь системної токсичності протеїну.
На фіг. 14 і 15 показані вибудувані за результатами експериментів графіки зміни об'єму пухлини у мишей Сті: 5НО-РгкасзсіаНійг, хворих на крупноклітинний рак легені людини МСІ-
Н4іб0, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, а для порівняння - ТВАЇЇ 114- 281. Можна бачити, що введення злитих протеїнів за винаходом, відповідно до Прикладу 14
ТАКБМО2 і Прикладу 2 МСІ-Н460, спричинювало уповільнення росту пухлини з ТОЇ, відповідно, 8295 і 8195 у порівнянні з контрольною групою на 29-й день експерименту. У випадку з
ТВАВАЇЇ 114-281, який використовували в якості еталонного (посилального) препарату, був отриманий незначний гальмуючий вплив на ріст пухлинних клітин; в порівнянні з контрольною групою, рівень ТО склав 75 95. Таким чином, злиті протеїни за винаходом сильніше впливають на зазначені ракові клітини, в порівнянні з ТКАЇГ.
Досліджувані злиті протеїни не викликають значних побічних ефектів, що проявляються в зниженні маси тіла мишей (тобто воно складає менше 10 95 від базової лінії маси тіла). Це свідчить про низьку системну токсичність протеїну.
На фіг. 16 і 17 показані вибудувані за результатами експериментів графіки зміни об'єму пухлини у мишей Сп:5НО-РікасееанНіу", хворих на рак легені людини А5б49, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, а для порівняння - ТВАЇЇ 114-281. Можна бачити, що введення злитих протеїнів за винаходом, відповідно до Прикладу 14 і Прикладу 2, викликало уповільнення росту пухлини А549 з ТОЇ, відповідно, 48 95 і 45,5 95, в порівнянні з контрольною групою на 29-й день експерименту. У випадку з ТКАЇЇ 114-281, який використовували в якості еталонного (посилального) препарату, було отримано незначне уповільнення впливу на ріст пухлинних клітин. У порівнянні з контрольною групою, рівень ТО склав 20,7 95. Таким чином, злиті протеїни за винаходом сильніше впливають на зазначені ракові клітини, в порівнянні з
ТВАЇ,.
На фіг. 18 і 19 показані вибудувані за результатами експериментів графіки зміни об'єму
Зо пухлини у мишей сті: ЗНО-Ргкасзсіанійг, хворих на карциному підшлункової залози людини
РАМО-1, при цьому клітини, подібні епітеліальним, були оброблені злитими протеїнами за винаходом, а для порівняння - ТААЇЇ 114-281. Можна бачити, що введення злитих протеїнів за винаходом, відповідно до Прикладу 14 і Прикладу 2, спричинило уповільнення росту пухлини
РАМС-1 з ТОЇ, відповідно 41,5 95 і 49,8 95 в порівнянні з контрольною групою на 43 - й день експерименту. У випадку з ТКАЇЇ114-281, який використовували в якості еталонного (посилального) препарату, було отримано незначний вплив на уповільнення росту пухлинних клітин. У порівнянні з контрольною групою, рівень ТО склав 32 95. Таким чином, злиті протеїни за винаходом сильніше впливають на зазначені ракові клітини, в порівнянні з ТКАЇ...
Досліджувані злиті протеїни не викликають значних побічних ефектів, що проявляються в зниженні маси тіла мишей (тобто воно складає менше 10 95 від базової лінії маси тіла). Це свідчить про низьку системну токсичність протеїну.
Циркулярний дихроїзм - визначення вмісту вторинних структур в препаратах злитих протеїнів за винаходом
Якість препаратів злитих протеїнів з точки зору їх структури визначається на основі аналізу вторинних структур за допомогою циркулярного дихроїзму (СО). У методі СО використовують оптичну активність протеїнових структур, що виявляється в повороті площини поляризації світла і в появі еліптичної поляризації. Спектр СО протеїнів в області дальнього ультрафіолету (ОМ) надає точні дані про конформацію основного поліпептидного ланцюга.
Зразки протеїнів за Прикладами 1,. 2, 14, 24, 51 ї 42 після приготування композиції із застосуванням буферного розчину, що складається з 50 мкм Ттгі5-НСІ, рН 8,0, 100 мкм Масі, 10 95 гліцерину, 0,1 мкм 7псСі», 80 мкм сахарози, при цьому 5 мМ ОТТ, були піддані обробці методом діалізу в пакетах для діалізу (5ідта-Аїагіс!п) з відрізаними 12 кДа. Діаліз проводили з перемішуванням проти 100-кратного надлишку (М / М) з буфера, в порівнянні з білковими препаратами, протягом декількох годин при температурі 4 "С. Після завершення діалізу кожен препарат центрифугували (при 25 000 оборотів за хвилину, протягом 10 хв., при 4 "С) і збирали відповідні супернатанти. Концентрацію протеїну в зразках, отриманих таким чином, визначали за методом Бредфорда.
Вимірювання циркулярного дихроїзму для протеїнів в діапазоні концентрацій 0,1-2,7 мг / мл було виконано на дазсо У-710 спектрополяриметрі в кварцовій кюветі з оптичним шляхом 0,2 мм або 1 мм. Вимірювання проводили в потоці азоту 7 л / хв., що дозволило виконувати вимірювання в діапазоні довжини хвилі від 195 до 250 нм.
Параметри вимірювання: спектральний дозвіл - 1 нм, половина ширини світлового пучка 1 нм, чутливість 20 таед (тад?), час усереднення для однієї довжини хвилі - 8 с, швидкість сканування - 1Онм/мін.
Результати були представлені як середнє значення трьох вимірювань. Спектри циркулярного дихроїзму для протеїнів, відповідно до Прикладів 1, 2, 14, 24, 51 їі 42, представлені на фіг. 20.
Отримані спектри були проаналізовані числовими методами в діапазоні 193-250 нм з використанням СОРГО пакета. Точки, для яких напруга на фотоумножувачі перевищувала 700 М, були опущені через занадто низьке співвідношення "сигнал-шум" в даному діапазоні довжини хвилі. Отримані дані були використані для розрахунку вмісту окремих вторинних структур в досліджуваних протеїнах з використанням пакету програмного забезпечення СОРГО (Таблиця 4).
Таблиця 4
Вміст вторинних структур в досліджуваних протетїнах - спі і Що? опТвАй 77777711 19496 | 50О9ИОЬ | 7.749656 | 393596 » значення, отримане на базі кристалічної структури 104М
Контрольна група (гТКАЇІЇ 114-281) виявляє характерний спектр СО для протеїнів з переважним типом структур В-5Певеї (різко окреслена еліптичність, мінімум, на довжині хвилі 220 нм). Це підтверджує розрахунок вторинних компонентів структури, який передбачає наявність незначної кількості а-пеїїх елементів. Отриманий результат також узгоджується з даними про кристалічну структуру протеїну ТКАЇЇ, відповідно до яких бета-елементи становлять більше половини його складу. У разі гібридних протеїнів Прикладу. 1 і Прикладу 42, спектри дихроїзму характеризуються двома мінімумами на довжинах хвиль 208 і 220 нм, що є характеристичною ознакою для протеїнів зі змішаною вторинною структурою типу альфа / бета. Це, ймовірно, пояснюється приєднанням домену (наприклад, ВНЗ від Вах), до ТЕКАЇЇ, який забезпечує утворення альфа-спіральних структур, так що змішаний характер вторинних структур в досліджуваних химерних протеїнах може підтвердити їх присутність (що стосується Прикладу 42, через низьку якість спектру, це представлено менш виразно).
Що стосується препаратів Прикладів 2, 51, 14 і 24, ТАР4, ТАР15, і ТА5М2.0 ТТА1.0 а також
Зо ТВАЇЇ. протеїну, то в них було виявлено значну кількість структур типу бета-структур. Ймовірно, це пов'язано з тим, що приєднані короткі пептиди спочатку мають бета-структури, або вони не є структуралізованими і тому істотно не впливають на їх композицію. У випадку з протеїном
Прикладу. 2, було відзначено також невелике збільшення вмісту альфа-структур. Так само, як і з протеїном з Прикладу 1, це може бути пов'язано з наявністю домену ВНЗ, який створює подібні форми, або у зв'язку з вузьким діапазоном довжини хвиль (високий рівень шуму в дальньому ультрафіолеті виключає читання). Недостатня наявність різко окресленого діапазону 180-200 нм в аналізованій області спектра може спричинити надмірний вміст структур типу а- спіралі.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1165 АДАМЕД СП. 3.0.0. (Р)
Пенькув 149, 2-05-152 Чоснув,. Польща.
ПЕЧИКОЛАН Єжи ШЩепан
ПАВЛАК Себастьян Домінік
ЖЕРЕК Бареломей Мацей
ЛЕМКЕ Кжийшчтснв Казімєж «1205 Протираковий злитий протеїн е1305 РОбО/дг/РСТ «1505. РІ.391627 «131» 2030-05-25 «1805 184 «170» вахептІай Уегетоп 3,5 «105 1 «2115 194 «ой РТ. , «в13ж дж тьсСіа1 Бедцепсе «ве ще І «2235 актттісіві «4005 1 їу5 муч ївец оявгобіц сСує ген Був Ага ї16 с1у Ар об1у цен Ар об5ев 1 5 10 15
Ага Ага го Агу Аг АК Аго Аг о маї маї Аго Рго без б1у бе Аїа га 25 30 сту дга уа1 Аа Аїа ніє Ї1е тт обіу тнголго оіу Агуу 5его деп тн
Гец бек зе? РгОо АбпоЗег о їух дяп 1 муз аіїв бей сту Ага гу Ще 5
АБ Яег о тгр обі бек бег Аг 5егосіу ні бек Ре цем о5ег АЗИ Бец 55 70 7З 80
Ні Бей АгУ Аби бі бід бер Уа? ті ні іш ву5 біу Ре Тук тук 85 90 35
ІТе Тук ек сіп тйг оТуг Ре дгЯ вне ооій бій ої Іте уз 18 Ав 00 105 310
Твг фу Депо Ар ух бій меб маї єп стук їТе туг -уз тук тнг век 115 120 12755
Тук Рго А5р. Рко Іі Ге бе) меї ух 5ег Аїд Аго АЗИ Бек сСу5 Тгр 130 135 140 ек іу5 АЗр АЇа бій туго сіу вец туї бегої1е тукоб1їа б1У о1у тів 145 150 155... 160 вре бій їец оку бій Аа Ар Аг ї1е рРпе уз! бек Уді ТК Ап с 165 170 175
Ні вец іє лев Мех дар ніх сій Аіа Зег Ре рве с1у АТа РНе ве 180 185 190 уаї сіу «0 2 «21їз 193 «2125 РЕТ «213» АгжатІсізі бефіепсе срей» шк «223» агкітісіз! «00» 2 дгуд АБИ тІ1іе Аза Ага нія Ге Аїа сій маї о1у А5р о 5ег Мет А5р Акад 1 5 10 5 дк Аго Ага Ага аку Ага Аго ма! маї дека вРго ей аіїу ве АТа су
Ще. 25: 30
Ага маї Аіа Ата Ні Іі те сбіу те дга б1у АкЯ 5ег АБ тАиг Без 35 40 45 бег бек рРго Азп Бек Гує Ап осі ух АтТа Ге) бі Агу ух ІТ Ап 50 зег ткро'єїц бек обег дгЯ баг біу нів 5еб РНе рей зег Аа Бец нів 65 А) 75 о іївгу Аго А5п осіУу бі ен маї ІТе Ні б1н Гу5 біу Рйе Тук Туг їв 85 0 95 тує 5ег оій те тує Ре Ага рве бій бій біз тТе вух 10 АЗИ ст 100 105 10
Муз д5п Ар огу5 віп меї маї їй тує ї1е туго сух тує отнг бек Тус 115 | 120 125
Рко АхроРго І11е тез Геи Меї груз бвг АТа зго деп бек оСух Тгрозег 130 135 140 суб А5роАїа бі тує біУ рей туг бег тів туго стя с1у б1у т1є ве її 150 | 155 160 сій ївеу бує бій А5п Ар Ага тів ее маії бек омаї Тк Ази бі нів 165 175 175 цер ІЛе Ар Мет Ар Ні бій Аїа бер орРйе Ре с1у АТа Рів ви Уві 18о 185 190 сіу «8105 З «211» 303 «12» рРЕТ к2і13» АРЕІТІіЄТа! 5едивапсе «220» «?23з агкініста! «4005 3
Аго уаї АТа АТа ніх ІтІїє тгобіу ТНг дк о1у АгоЯ бек Аа Ті Беч ї 5 10 15 зег о 5ег о Рго А5побег Гуз Ай бій фу5 АТїа їв біу Ага уз ТІВ Авп бег Тгр обої бег бЗег дра Зее сіу Ні его ре бе 5ег Ап ви Ні
Се ага Аби сіу бі бен маї ї1в ні біш їу5 б!у Ре Ту? туго Те 60
Туг его бів тТйг оТуг Ве Адед оре сів б10 бі) ї1е (Суб 610 Ай ТВг 65 70 75 ва цуч АбБа Арогук бій Меї Уаї бій туг те тує Бу тує тигР обер о туг 85 вд) 95
Бко Ар орго ї11е бец сн Меї рух 5ег діа Аг Ап Зегобуз тгтробег 100 105 16 су ваБр Аїа бій Туг су сей Туг б5ег їі Тукг бій сіу сіу Тіє вве 115 126 | 125 ій тен і у5 ОЦ АБ зр Аг Те Рпе маї 5ек уаі! тре Ап 1 Ні 130 13 140 бец Іі Ар о Мек др нів біи АЇш бек Рне Ре сіу Аїа Рпе бец Уа 145 150 155 160 сіу сту а1у 5ег бі Рко ке бі Бей АТа сбіу Ак хУаї мн ат ув 165 170 175 бін Тк АТа АТа АЇа 1у5 РМЙЄ 518 Аго бїп Ні меб д5р о зег 5аг о таг і80 185 190 чег Аза діа бек бег бек дей Ту Су Ап бій Меї Меї Куб 5ег Аго 195 200. 205 дей їец тТиг Гуз Авроаго Суз бух Рго Уа! Аби тВг о РНе уді нів 919 210 215 220 заг бец Аза Ар ма! бів А1а мат Суб бегосій Бу АБ Ууді АїЯ Су 225 239 235 240 ув А5п о1у бій Тв Ап Сухотуг бій зЗекотук зеботТвк Меб бек їв 245 750 255
Тиг оА5росСує АгРУ бі) Тве о біу бег бек руб туг Рго да Су Аза тТуг 260 285 279 бує тТвк таб обТи АТасаАб5й Бу5 ніх Те Хіе ма АТа о Суз бі о1у деп 275 280 2855
Рго Тує маї Рго уаї Ні5 Ре Ар АЇа Зееомаі уз 1 йзріей 29 285 з00 «10ю й «211 293 «ай ВК «21325 Аг Тісїаї «едцепсе «2205 пи «223» актітісіа! «в 4
Аго Маї АТїа АтТа ніх І1є тпг о біу таг оАго с1у Аго бег АБп тВг Ге 1 5 10 15 бек бег Рго Аби Бек Був деп ша Аїа сец біу ду Су тів дви о 25 30 ек Тер ср) бек бег дго бек б1у Ні его Ре бе чего АЗп ово Ні зей Агу Ав сіу зім бец Уа! же нІі5 бій був б1у Рйе тук туг ІїТе
БО тук авг стій те тус РНе АБд РаЄє 1 сту бій тіе суб бі Ав таг ба 70 75 Ї:38) цу5 Аби дер губ біп Меб маї бій туго жіє туго цує туго тик 5ей туг 85 90 95
Рго Ар Рго ІТе ей бен Меї Гуз 5Зег АТа Аг Аби Бег Су Тигр о5ег 100 105 о цух яр А1а ан тує Ту гей о Тук бег їТе тує біп біу с1у ї1е Ре 115 120 125 бій рен бу5 610 АБИ А5р асо Ті рне Уа1ї Зесг уа! Тие Ап оси Ні 130 13 140 іеи ї1Іе А5зроМеї Ар Нт5 біб Аіа его РБе РНе сіу АЇа РБе бен Уді 145 150 155 160 сіу сіу біу сіу бЗег б1у біу сіу чзвг о Гуз Біб ТНК оАТа Аа АТа їу5 165 170 175
Ре сій Агу біп о ніз Ме дер ек зву тнгобек Атя АТа бек бек бе 180 185 190
А5п туго Сух дзп б1п Меє Мет 1у5 Зег Агу Авпогец тагогСуз Ад5р Ага 195 200 205
Суб бух ргоа омаї А5а Тис оРйе Уа! нії бТи баг оре) дій АбБр Уаї С1й 2АВ 215 220 діа чаї сСух бер біп бух деп Уа! АТа Су5 суб деп ооіу біп Ме Аза 25 230 35 240
Суз тук сіп 5ер туг бек ТК Меї бег ті ТВг др Сух Аг бі тг 245 2550 255 сіу бЗег 5ег рух Тук Рго деп Суб АТа Туг ух Так отйго бій АТа Ахп 250 265 270 їуз нів тів тіє Уа! Аїа Су біц б1у Ай рРго Тук Уа! Рко уаї Ні5 275 280 285 рРпе Ав дій 5ек ма 290 «2105 5 «21ї» 283 «2105 РЕК «213» АгжТісіаії беднепса «7о0х . І «23» агтітієїіа! «400» 5
Ага маї Аіз Аа Ні їїе Тбгобіу ТНгоАгу біу Ага обес Або ТНК Кей 1 5 10 15 зек черг вго Ахи 5ег вух Ап бій сує діа ів сбіу га гу їв Ап 5ег ТРр Є бегозег Агу бек сіу Ні его оре Ге б5ег Ап Сем Ні веш Агд Ап о бІу сій бен маї т11е Ні сти вуб5 ЄТу пе стук туг 116 що ве 60 ту бек ої ТИготує Ре Аго РАе бій бід сі) 1Те уз 516 А5па тТвг 53 70 75 во
Су АБп о А5рогуз біл мет Маі біп тує тів тук руб туго Тигоб5ЕК Туг 85 90 95
Вга Абробго Тіе бен оте Ммеї цу5 5ег діа Абд Ап 5ег Суб Тгр бе?
Т00 105 130
Муз А5р АТа оїш туго оіїу іер тує б5ег Ті тукг 51п бім сіу їТе Рпе 115 123 125 обі еп Бу ба деп одер Ага т1е Ре уаї бек оуаї ТВг АБ ОВ Ні 130 135 140 іївц те А5р Мет Ар онія бін Аїа 5ег РНе ре с1у АЗа РНе їв уд 145 150 155 1650: сїу біу сіу 5ек сіу Рго 1ецу су сей дів с1у ака Ууаі ма! Ага су 165 170 175
Ахр маї бі ку Оу уз уз ї1е РМ ІЇв Меб вує Суб Зак бій Суз 180 185 190 ні твг о УДІ сі бу5 О01У бІУу уз Ні Гу5 ТВгосСТу РГО АхИи гей Ні 195 200 705 с1у ги Ре СТУ Аго гу тТАгосіу сів АТа рго біу тук заг туг тНе 210 215 220
Аїа Аїа Ап оМуз дп оу5 біУу т11е ї11е Теробіу бі Аб5р о тТвгосец мет, гай 230 235 240 сін тує їв біб А5п РГО уз їуб тут 112 его сіу тйК губ меє Іїе 245 250 | 255
Ре уаї с1у І1Те Гуз їуб 1у5 си бій Ака Аза Ахр тен І1е Аа Туг 250 255 БВ:
Кеш цуз мух Аіа тат одяп СТО Су 18 Ар гей 280 «іх 6 «2315 407 «Без РКК «йї3з АгТІТіства! 5едиепсе «220» «223» аккібтстіа!
«3005 6
Агу ма! Аїа Аїа ні тТе таб остТу ТИР о АгЯ є1їу Агу его АБп отвг гео 1 5 10 15 дар Баг ко Ай обег рух Ап іш іУу5 Аа іви біу АкгЯ Гуз Ті дп
Фег Тер Осій чегобег Ага бек сту Ні 5ег о рйе Сен зег Ай Сей нів
Геш Ага деп осіу ЗШ меш ма! 112 Ні5 б губ б1у Ре тує тує Ле 5О 55 60 тує бБег бій Тк оТук Ре Аго Рпе сій сіш б1у ї1Те їу5 Ти АБИ ТВг 655 70 75 8о іуб АБ Азр гу ст Меб маї бій туг їТіе туго уз Тує тиг о 5ег тує 855 50 95
Ргб Ар Рго ї1і1е бен мен Меї ух б5ег АТа Ага Аби Заг Сух Тер озег 100 105 що
Су а5ройіа бій тТуг Ту бе туго 5ег 116 тує оій біу б1у ї1е Ре 115 120 125 соіш вед був сій Аби АБроАгу т1е Ре Уа! бек омаї тигоАвп сів НІ 130 135 140 ес ІТ д5р о меї А5р нів сі аїяа бек оРйе рНе сту діа Рне ївс Уаї 145 150 155 160 с1і1у б1у бі біу б5ег Аг 1ує су АгЯ АТа зегосіу Ту Рго бів біу 165 | 170 175 с1іу заг івгць Аїа АТа вен тТбгоАТа Ні біп Аїа Сух Ні Гей вго Се 1850 185 190 сіб те вве тяг о АКа нів Ага сів вРго АгЯ біу тероБіц стій рев є 195 200 2935 віп ос с1у тує вго Маїс сій Аг іви Уа! Ала рей туго бе Аїа Аїд 2450 їх 220
Ага цец бек Тер Ап бій Уа! АзробТй Ма! 516 АТа Ап Аїа ен АТа га 230 235 240 явговго біу бег сіу б1Уу А5р о їеу біу біш АТа І1Те АК бі б5егоРго 245 250 255 сій бій Аїда АКЯ еу Аїд ре) так меш Аїд АТа Аїа ої ек бій АК 250 265 270 бо
Ре уаї де сп осіу тк сіу а5п Абробїш АТа с1у АТа Аа ап оту 275 і 280 285
Рко Аа Ар осіу сіу б1у б5ег о с1у 1у сту Мес бу А5р Маї б 1ух 290 295 з00 сіу вує пуб ІТе Ре ї1е Меї вуз суб 5ег бій Суз Ні ТИР о Маї він 305 310 315 з20 їух аіу О1у су нія рує ТИгоЯ1у Рко Ап цец ні5 Ту Се бе сіу 325 330 335 дга мує ТИР біу сіп АТа вБго бі Тук бег тує Тк Аза АТа Абп у 340 345 350 деп гу б1у ті тіє тер б1у іш А5ротйкК їеу Ме бі тує ей собів 355 360 3655
АБИ Рге Гуз рух Тук Її1е рго сіу ТВеб о гуз Мек їТе Ре муаї віх 31е 370 375 зво
Гуз їує Суб бі біш АК Аїа Ар обец 16 Аїа тує Се бує Суз Аа 385 390 395 500
Тк деп 10 Бу Ар оц рем 405 «а Я «211 Я «Тез: ВНІ «213» дет Ттісіві 5еиенсе «Бах , од «223з авгізтієтаї «400» 7
І1є її сЄїу біу ніб5 ма) АТа фу5 Рго Ні бег Агу Рго Тує Мебє Аїа ї 5 10 ї5 тує гец Меє ї1е тгроАдхр сіп уз его Бей їух Аго Суз ТУ 01уУ РНе 75 Зо їв 116 Агу Аєр Азр о РМНе МаЇ бе тпгоАаза Аа нів Суз тер обіу 5ег й 45 зер ТТе дп ув! Тигоген біу АТа Нія А5потТе їм5 бій бій зі РКО 60
ТНкобіп біп вне х1іе Рго Узт їуб5 Ага АТа їТе Рко Ні бро АТа тук 655 70 | 75 ва
А5повВгОо су деп РНе бек деп АБр ІТе Мет Сей ме бій ем бій ака 85 за 95 іїу5 АТа Суб Аго Те Аго АТа маї боїв РКО Бе) Аго гей РгО Берг о Ави 100 105 110 ух АТа сій хаї уз Рго 61у біп тіпгобуз зе" маї аа су тгр о1у 115 120 125 бій тігоАТа Рго ге сіу Суз нів 5ег Ні ТВг іви оїп бін маї гув їх 135 10 мет тве Уді бій бій адзр о Ако цу Суб біб бек Ар без Аго ніз туг 145 1595 155 ї65О тус А5р о зек тий т1е сеї цен Су ма! сту Ар оРКО ОТ ї1е уз му 1655 170 175
Тег о5ег о РНе рух с1іу Ар бег бі б1іу Рго бец уаї Су Ап Су ма 180 1855 1950
Аїа отй біу ї12а маї бек Туг с1у Аг Ап АБИ біу Меї его его Ага 195 200 25
А1а Сух Тйгосу« уаї б5ег бек Рпе с уаї Ні Тер Ї1е Гуз цу5 ТНг Мек й 215 е2а ух Аго туго бїу с1у біу сіу бег ага уз їу5 Аго «Ту біу бі 1у 225 230 235 240 зег Ууаї Ага біб Аго сім бго біл Аго Уві Аїд АТа Ні їТе так Фу 24 250 233
ТВеЕ Ага су ва ек АЗИ ТИг о Бви бегобег Рго АБИ Бек суб АБИ о 26 255 2789
Гуз Аїа се сіу Ак уз ІТе Аби 5ек Тр оби 5ег бек Аго 5ег у 275 280 285
Нія бег РМНе реп о бего Азп їБец Ні вен АФ о А5п оБіу бій Бен Уаї тів 290 295 300 ні б вух б1у Ре тук тує її тук бек о бія Тік отут Ре до РНе 305 316 315 329 ей Ти бід ї1е суб сів деп тар о гує Ап дер бу ет Мет маї єїй 325 330 335 тугії1е Тує бух туг Тег бек Туг Рго Ар о Бго їТе реу бен мет Гу 340 345 350
5ег діа Ага АБИ бегоСуб тер бек 1у5 Ар дія бі) тує Є1у ви тут 355 БІ 305 баг тіе тук біп сІу сіу їі РНе бТ0 Гей туз біз Аби Аб5р АК т11е 370 375 зво
Бпе мя! бек ма! ТНгодбп о1у Ні Гей хіе Ар Меб д5о Ні С1іМ Аїа 385 390 395 дО ер вне Рбе сту АТа пе їеи ма! бу 405 «2105 8 «ії 05 «212х РЕК «2135 АгтТіЖтстіаії 5едцевсе «020 «вааю аг тсіяв «3005 8
Ага маї АТа Аїд нів тів тйг осіу Тг Ага сіу Або обег дп тик Беу ї 5 10 15 5ек бег Рго деп о 5ег су Ап сій ух АТа Гео оту Аго бух 16 А5п за
Феї Тир біо 5ег бег Агу б5ег сіу Ні5 5ег Ре ів Заг АБИ їец Ні еп АгЯ Ап сім сій рей уд! ї16 Ні 510 (у5 о1у ре тує туг їТе бо тут чек біп тайготук Ре дед Ре сів бі) біз тіе уз Бій Аб5потАг 05 70 7З о
Су Ап АБрогуз бій Мек Уа! сіп тук о ї1Те Туго суб туг Тгобевг туг 85 ча 95
Рго АВ ОРгОо Ії ген се меб ух заг АТЯ АКЯ Ай его Суб тер бар 100 105 110 уз дер Аїа сім Тукобіу ГСец Тугсб5ек ї1е тує бїй сту є1їу тів РВе 115 120 125 сі вен суч 10 Ап АБО ато те РНе маії бек маї тк АБИ Ту нів 130 З. 140
Ген те А5р о Меб азр Ні бі Аа бег рпе вне біу Аїа РНе гец Уа 145 150 155 160 с1у біу с1у сіу хек Ага цу цу5 Аго су с1у біу біу бБег т31є ге 165 170 175 об1у а1і1у Ні маї Аїа їух Рго Ні бегоАго Рге Тук Мебє АТа Туг Гец 180 185 190 меї їТе тгр о А5р оп Су бегоїец бує Агу Суз б1у біу Ре їец тіє 195 200 295
Ага Ах» Авро Ре уаї цен тпг АТїа Аза ні сСу5 Тгробіу бЗег бер іє 210 715 280 деп ма! Твгоїей о1у Аїд Ні А5п Ііе бує бін біб сн рРго стве бій 225 230 235 240 біп вве ті Рго ма! бух аг Аа ЇІТе рго ні вго Аіа туго ди вро 245 250 255 у Ай Ре 5ек А5п А5р о тТіе Меї їецш о іец сіп іїеу бін дк уз Аїа 255 27О вує АГу ТНИК Ага Аіа Ма! сій Ро Бен Аг ей вгбоб5еє А5п Гу АТа 275 «ВО 285 сіп ма! уз Рко Ту біп так оСуз чего омаї Аа с1у тгробТу о1вб ТАе 290 295 30
Аіа ро тен сту муз Ні бек ні Те огец сій 610 маї Сме МЕЖ ТИР 305 310 315 320
Уаї бій он Аб5раАгу їуз Суб бід зего ах без Ага Ні Туг о Туг Ар 325 330 335 чек тТпготїіє біз без Су Уаї оіу Ахрорго віз ї16 їу5 губ ТНгобеб 340 3455 350
РНе ух щіу ар Зек бі б1уУ РРО іви ма! Суб А5погуз ма! АТа віп 355 зва і 365 с1у іа маї его тує БІУ ага Аз Ази біу Ме Рго бро ака Аїд Су з7й 325 зво тТвк о руз уаї 5ег бек рнє Уа! Ні тгрот1е їу5 буз ТНг о мМеє Гу5 Ага 3855 30 3955 400 тук рух АВ 19 ву 405 «2105 З хиїї» 1857 «217 ю ЕТ е2135 дгтіжісіа! 5адцейса «220
«223» атігісіві «4005 9
Ре Зег Агу бек бе) Ні 5ек ву бе ака Ага Аг Ага Або АгЯ АгО 1 5 то і 415
Аго ма1 Маї Ага Рго вп сіу їец Аїа с1у Аго ма! Аїд АТа Ні Іїе 20 25 30
Те озіу ТНгоАка Ту Ага бек А5а тик о їец бек бе го А5пПобек Бу 35 40 45 деп овіс ух Аїд Сец б1у Ага іує ті Ай его Тео бід его бат Аго 50 55 бо век сіу нія ек Ре іву бер дп о геи нНіз Ге Агу Аби с1у їй це 55 70 75 о змаії Же нія бі Гуз бІу РМйе тує Тут їТе Туг бер стій тег о тТуг вле 85 90 95
АгЯ Ре сіп сій сій тіє руб сі Ай Твгогуз Ап АЗроїує їй Мет 100 105 10
Уаї бій туг т1іе Ту су стук тТиг баб тук орто Ар РКО ї1е ге. гей 120 125
Меї їуз бек Аїя8 Аго Ал обек о Сує тТеро5ег Туз Азов Аїд а1іб Тук бІх 130 135 140 веш тує обег жт1е тує тя сіу 6ту тів вве сій ге) суз бін Абп А5р 145 150 155 160
Ага їТе Ра Уаї зек уаї так Аа сіу ні Зец Ї1е Абр Меї д5р ні 165 170 175 сій АТа зек Ре РНе Ту Аа РНе Геу Уаї су 180 1855 «210» 10 «2115 93 «вій РЕК «213» АРтітТісіа!ї зедценпсе «20» «223» актітіста? «4005 10 біу біп Уаї б1у Ага бїп Кеш Аїя тТіє 116 бу др АЗр хів Ал АК і 5 15 15
АгОд Аго АгЯ Аго Агу Ага Аго Ма! Ммаї Аббовго бен бі ве) Аза су дга ма1і АТа Аа ні ї1їе тйг ові ївг оАрРО сту Акад 5ег дви Тйг о рей зег бек ро Ази 5ес г ух Аби сіб руб Аїа зей біу Ага суб Те Аби
БО чек Теробій бек бек Агод бегобіу Ніз бЗег РБе бе бек АбА ви НІ5 65 70 75 50 цей Аго А5и с1іу б! ген ма? Тіє Ніб сіи бух б1у РНе туг Тук тів 85 90 95 тук век біп Твготує Ре аг рве піп оіи біз їТе суб бід д5потйг 100 105 1590 їу5 Ап Аз Су оїп Меї Маї сій туго тів Туг Гує Туг Ти бек Туг 115 | 120 125 вго А5р о вго її мез Се) Меб бує явк АТа АгУ Ап бег Су Ттгробег
ІЗ30 135 140 їуз А5р Аа віч Тугб БІУу Ген Туг Зег т1е Тур сів б1у бі іє РН 145 150 155 160 пи гей су5 бін одеп А5р Ага ш1е Ре уді зек о маї Тнт АЗИ іш нів 165 Й 170 175
Се (12 Ар оМеж А5р Ні біц А1а зе ре Ре о1у Аа Рлпе ей Уа во 185 1950 віу «2105 1 «2115 704 «Ей» РКК, «213» АртітТісєїа! 5едпепсе «220» «гйЗ» агтттісіді «4005 11 сш біз бій Тер Аа дго біз те Є1у Аїа бій сМез Аго Аг мех діа 1 5 10 15
Ав АБО ки 5 Аїа біп ту? бїц вся Ага Ага Ага Ага оо Ака Аг
Ага Ага Маї Уаі Ага Рко цен осіу се АТа б1у Ага маї АТа Аа Ні 35 40 45
І1е Те о сіу Тис Аг біу Агу 5вг Ап Тйгосей бес бег о Рго АБА бек 20 55 Бо іїух дБА бі цу АТЯ ів оту Аго губ Ті Азй бег Тер обо) 5ег 5ег 55 70 75 50
Ага его оту нів 5зег о РНе Ген; баг Абп се нія сер дко Ай біу ау 85 90 95 іен Уа! тіе Ні бішц туз бІуУ пе Тук Туг І1е Туг бек БІВ ТАйг тТуг 103 05 1
Ре Ага Рене бій аїш сб1ц о ІТе груз сій АБ ТИг губ деп Ар обу бій 415 126 1925
Мех маї біп тує їіє туго уз туго ТВе зег Туг о Рго дзровго І11е Ге 30 135 140
Се мес цує бег АТа Аго Ави Бег Су тер озег бу дер Аїз січ Туг 145 150 155 160 б1у Гей Тук обер тіє туго біп сіу біу І118 Рпеє сій бец куб бій дп 165 170 175 дер АгОо 116 Ре Уа! чек уаї тпг дев оо Ні Бей ї1і6є Ар Мет Ар ї80 185 1990 ніх січ Аїа бек РНе вне біу Аїа ве ви ма! с1у 135 200 «вію 19 «?21іїх 372 «їв» РЕГ. «Й13» Агт1тісівї 5зедоепсе «220» ще ха23» агтттієїа! «00 12 дегу ма! Аа АТа ні ї1е Тпгоє1у Тс о Аго сіу Аго беб Ази Тйг Гео ї 5 10 15 зегозег о Рго Ап Бек оГух АБ біц ух АТа гео бі Ага губ І11е Ази 25 25 З) бег Тср сій бБег бег Агуо озег о біу Ні бек РП сен б5ег АБИ Сем нів чо 45 цей Аго А5п о біу біч геу ма! їТе Ніз бі 1їу5 бу Вке туго Туг Те
БО
Туг Бег бій Тне тує Ре Ага Ре вій бій біч їТе уз бій Ах тТАг 55 70 75 о вує Ай Ар обує вій меї ді сіб тує тів Тук Гу тур ТВ я Туг 85 90 95
Рко Ар орго т1іє Ге їеу Мех (уз его Аїа до Ап бек Су Тер. Бег
Той 195 по вує Ар оАїаз єї тук сту геу туг звг оїТе туго бій біу с1у ї1Те Ре 415 120 125 бів їен гу сій Ап Ар ака їіе Ре мМаї б5ег Уа! Тигр дл б Ні 130 135 140 їеч тів АзроМет А5роНіЗ сім дід бееорйе рве біу Аїа Рйе гео ма! 145 150 155 160 сіу б1у біу зес б1іу бу Рго сен бу Бей АТа с1у Ага Уа! Уа! Аго 155 | 170 175
Аїа Ага АТа Ака сіп бів біу зеб о 5егорго біб Рго Маї би с1у сем ї18ва 155 190
Аза Аго Ар оаіу Рго Аг Рго Ре Рго бе) бТу АгЯ ве ма! рго 5ег
КЗ5 200 205
АТа уаї заг бує а1у беу о сух Є РГО б61у сей Аа Аа АТа Рго АЇа 210 215 220 діа рго тьк осей сей оббо АТа АТа туго цец суб Аїа РГО ТВ АТа РгО 225 230 235 240
Рго Аїд маії ТАг дія Аія івец сіу біу бек Аг ТгроРго Ту сту Рго 245 250 255
Ага бег о Аго Рго аку сіу РГо Акад РГо А5робТу Ро сій Рго бер їв 250 265 270
Зег ви Аза біз біп Ні рез бін бегорго уд! бро Зег АТа рго о1у 275 280 285
Ата мен Аїд біу сіу го Тег ооїо0 Аза с Аїя Рко сСіу Уаї Ага бі сш 290 295 300 вічш сти аїй тк Аа аг сі тів бу АТа аїй без Ага ага меб АТ 05 33 35 320 дер Ар Ген Ап Аа віп тує бі Аго аку Ага бій он о бій бій 325 330 335
Ага нів Аг бго 5ег РКО Тер оАгу маї цей Тут Аби бец ї1е меж Ту 340 345 350
Мен Бен рго Бец РГО Ага бім нія Ааго Аа вро січ Меє сто еко дБА 355 360 365
КУ5 019 Азр Мей 370 «2105 13 «211: 493 «212 ВЕТ «13» АгжЗтісів! зедцепсе: «2505 ИН «23» сактітіста! : «400» 43
Ага ма! А1їа АТа ні ті так ос1їу тт о дка б1іу Аг бек деп тиф Сей 1 5 юю 15 дек зе рРго Ази Бебг о вух Ап Бім Су АЇа веб бі Аго Гує п1е САБИ хо 25 30 -ек тв осі 5ефБ 5егоаАгу зек об1іу Ні 5ег Ре раец Заг дп гер Ні іїен Агу дело су бій Бей ма! тіеє нія бі вуз бі Рйе туг Туг Бе 50
Тут бзекг бій тпг тує Бе Ака вне бій біб б тів бує 1М Ап Так 65 7а 75 во
Гуз Ап Авровух біп Мет маї біїп туг ЇТе Туг (уз Туг Твг о бек тує 85 чо 95
Рко дер РКО І1е безпо геу Мет ух 5вк АЇа Ако деп обЗег о сСух Терояей 10а 105 о уз азр Аа бін о тук б1іу Бец туго 5ег їі туго яп б1у бу іє РНе 115 120 125 ср беш вує 610 АБИ Ар по тІ1е рн Удф бег о маії тНгодй б 5 1530 18: 40
Гей ІТе 45 Мет А5ронів бій Аїда 5ек РНе вне біу Аа рРйе бе Уа 145 ї150 155 160 зіу біу біу сіу 5ег Аг вух гу Агоо Аїд 5ег с1у С1у Рго біц 1у 165 170 175 сіу зек ве АТд АТа їгу тп Аїд Ні зіп Аїа Суз Ні Кеш Рго Ге 180 185 190 сіц тТве о рРйе ТВг Аг ніх дго біп Рго Аго зіу тгробій зіп о вец бід 195 200 205 бТп Сує с01у Туг Вго Ма! бій Аго бен Ма! АТа бен Туг о їей Ав АТ 210 215 220
Ага бен бек Тгр оАви бій Уаї Аб5робівп ма! хів Аїд Ав Аїа г ец Аа 725 230. 235 24й бек Рго сіу бек біу бу А5роївги віу біз Аїа т1е Аг б ек рго 285 250 235
ІЧ бій АТа ага бе) Аза гео таг осей Аза АТа Аа сі 5ег бід Аг 260 255 270
Рпе Ма! Ака сій сту тик обіу Аз Абр сти Аа б1у Аїа АТ Ахи оту 275 250 285 го Аа дробу біу бек бім ту біу Азїа Аго Аа Ага біп віч у 990 295 зо его бек рго аїй Рео Маї бір сіу сей АїасАго Ар ау Рго Аго Рго 305 310 315 350
Ве вго їец б1іу Аго бен оУаї рРго бек Аїа ма! бек Су5 61у цей суб 325 330 335 сід го аїу се) АТа Аз АТа его Аїд Аїа вго стик ген о вей рго Аа 340 345 350
Аа тук іеу Суб Аїд Рко тйгоАїа Рго Рго Аїа уаї тег Аїд Аа бе 355 350 365
Оїу аіу бек Агу тгр ого со1у біу вго Агд баг Агу Рго агу о1уУ РгО 370 375 380
Ага го д5р о с1іу вго віп Рго 5агоїец 5ег оре Аїа сін соти Ні Сеч 3855 390 395 400 сі 5еговго маї Рго бек діа рго б1у АТа цей Аза су сіу вго тиг 405 що 415 ст АТа АТа Рго біу ма! Аг б1у віч бін бім бій їгр Аа Ага от 420 425 430 1Іе б1у Аа сіпоїео АКЯ Аго Меб дія А5р Ар іев АБ АТа бій туї 435 440 445 сій дея АгЯ Ага бій бій сію біп бів Ага Ні5 Агу ро 5егобко ттр 455 з50
Ага ма! Сен тук Ай еп тіє Меї ЄТу Бе Гени Рго сей Рго Аг сту 465 470 475 480 нів Ага Аїа РгО о1И Мех сій Рго АБИ суб Ар оби Гей 485 490 «2105 14 «211» 185 «125 РЕТ «2135 Агтітісіа! бедцепсе «220 «ийз» аг тсеїа! «4005 14 діа ма! РРО т11е АТа біп руб РО АгО АгЯ Аго Ага Аго Агу Аг Ага ї 5 їо І уаї ма! ага Рго сей о1у бен Аа біу Аку ув! Аа АТа ні тТі1іє тн 5іу тпг Аг біу Аго 5Бег А5п о тАговБей бегобаг рРго дело бек ух доп 315 40 45 іч суз А1з сей б1у Ако вуз 116 Аби бек тер сій 5ег о бег Ага ес 50 сіу ніз бек РНе сей зег Ап їеу ні Ге Аг Ап осіу бі бен Уа б5 70 75 о
Я1е ні бій цу сіу Ре туг Туг ЇТе тук б5ег сій тиготук впе Ак 85 90 95
Рпе бій біШ сіб їТе Ку5 сш АЗИ Твору дей Азр бує бій меє ма! 100 105 о зів Тут ї1Те Тук суб тує Твг обер Тук ргОо дер РО Тіе Сем гей Мет 315 120 125
Куб б5ег АТа АгО Ап бегобу5 Тгроб5еб куб др діа сім Тук о біу Гей 130 135 149
Туг зек жхїв Туг біп біу с01у те РБе сіц їец бух бу АБп Ар АгО 145 1590 Б» 160
Ііе Ріпе Уа! бек Уа! тТиг дело сів ніз реу т1є Ар Меж Ар ні Ту
Тї65 120 175
Аіїа вег РЕ РБе сіу Аїа Рене Ген Маї С1У 150 185 «10 015 «11» 191
«1 РЕ «213» АгТ1жтста! 5едцепсе 5220» к?а3з а ттстаї «Об» 15
Ага діа а1у цен бій РВе рРго Уді 5іу АгЯ еп рей Ага Ага цен Сец 1 5 ло 15
Ага Ага бе грец аг маї Ма! Аг Ро гео б1у гей АТа сту Аго чаї
Аіїа АїТа Ні І1е твгооїу ТОК оАго біу аку ЗегоАей Тйгоїбе) бег Бек
Рго АЗИ 5ег був Ап ОЗ цу Аза сем с1у Аго ух ї1е Ап оЗег тгв 5 во січ Зег зЗег Аго зек біу ніз бек Ре ге зег Ап тез Ні ей до 75 75 во
Ази су бій ген уаї їте нів їм Ку 61у ве туг тук І1е тТуг 5ег 85 що 95
Єв тие тук Ре дго Ре біз сіб біш дів Суб біш Ап о тТйе бух дп 100 105 10
Аазр уз бїй мМеє уді сій туго ж1е Туг уз Тук Тс озек о Тук рго др 115 120 125
Рео хів вен цей меж Цу5 еп АТа АКу А5й бег Сух тир обег Куя Ар 130 135 140
Аїа біз тук сЇу се тук зег Ше Туг б1п оіу Фу Пе рРБе сін Ге 145 150 155 160 вує 610 АБИ Арх А РнНе Уа) хек омаі Ти АБ бі) Ні вец ще 165 170 175
Азр Мек о А5ронНі5 бін Аза ек Ре рае бу АТа Ре Бе маї сіу 180 ї85 150 «віх 16 «21 279 «2125 РЕК шо «135 АгжтРТісіа! 5едуепсе «220 «2235» акгтітісіа! «400» 1І6б
Ага маї А1я АТа ніз тіє тис осіу тТАг о Ага сту Аку б5егодба твк Кей 1 5 то 15 заг Бек вгО Абпобег губ Ахп осі) фу Аїа зем С1у АКЯа Бу5 ІТ АБО 5ег тгр о ої 5Зег 5ег Аго Зег біу Ні Зек Ре се Заг А5п рен нів зе Аго Ази СТУ оїш сви ма! ліє ні5 1 був Ту Ре тук туг Те
Ба Бо тТуг баг бій ТВготук рве дгЯ Ре біт сій сі тТ1е Су сій АБИ тАг б5 70 75 80 ух Азп др ух біп мес маї сЄ1й туго тіе тук їу5 тує тег б5ег Тут 85 90 95
РРО АЮ РКО Те це гео Меї уз Заг Аа Аг Аза Зако Су тррозаг 1 105 і 119
Гу Ар Аїд осі тує біу Без Туг баб тіе Тут сіп б5іу біу ів вва 115 120 125 ст цей уз 165 Ай Абр Ага ті Ре маї бек Уа! тТНг Аби Є! Ні 130 135 КЕ;
Меч тІе А5р Ме Ар нів бі Аїа его РВе Ре б1іу АТа Рпе Гец Уа! 145 150 155 160 сіу ту біу бек обіу Вкго Беу сЇу Ге Аа б5іу Ага Уа! ха! Аква сій 165 170 175
Дер тер цей ті Ре біп уз суб Ні Хе твг о АБло тик Агу А5роУві 180 155 190
Азро'сСуз А5р АБИ тів меж бек Таб Аа Бей Ре Ні сСуз уз Ар огу 195 200 | 205 депоївг опе тіє Туг баг аг Рго с а1ш го Уа! Гу5 Аїа тів Суз 1у5 210 215 220 сту ї1е І1е А1а 5ег руб д5п ма! мем тиКотие зек сім вве тук ев 225 230 535 240 век Ар Сух Азпома! Тс озег Ага бко Су ру Тупг Су реп ух Ку 245 250 5 ек тн А5в вує Ре сСуз уд! ТНгосСує 010 дев сіп Аїа Рго маї нів 260 263 27й
Рпе ма1! біу ма! Ру век Су 275
«21йх 37 «Ріїх 274 «125 ВВ. «213» АРІ тіста! зейцейсе «ге ; : «35 агтітттета! «400» 17 дга уві АТа Аїа ніх т1іє ТВг о біу Тит Ага біу Аго 5ег депо Тве ей 1 5 їа 15 ееаг зей РгОо деп о Зег о рух АЗп сій уз АТа їв біу ака Суб ЇТе Ав еко Тгросїв его обег о Аго его с1у Ні бес РБЄ беу 5ег деп цей Ні
БТ 45
Кец Аве ап осіу сти ве) узі п1іе ні сія Гуз су Ре тук Туг їїе бо
Туг бБег бій Тит тугсрпа Ага РНе сій біз сії І11Те ух біш АБа Тит 65 70 7З 80 рух Ап Азрогуз біт мет уді бій тує ті тТук уз тує Так бер о тук 85 КІ 95
Рез Азрорго 116 Бео їев мМеї ту 5ег дій Ага Аби зве Су Тгровеєб о 105 110 уз Ар АТа 10 Туг о біу Гей Туг о бег Тїе тує біп сту с1у ї1е вне 115. 120 125 сі Ббеш губ сі) Аби др Ага дів Ре ма! его ма! Те А5поб Ні 130 135 140 їен ї1іе А5р меї Ар ні« біц Аа бек РВе рРНе сІу Аіїа Рпе еи Уві 145 150 155 160 сіу сту б1у віу 5ег с1у віу Сіу біу бек біп Абр Тер осей Те Ре 165 170 175 бій був Суб нів їв Тиг Аби ТИг Аго Абзр ма! А5р Су Ар Ап оте 1850 185 | 190 мегояег таг о АЗпосез Рпе Ні Суз уз А5рогуз дп тає Ре ї16 тус 195 290 205 бек АгЯ Ргб бій Ро маї уз Аа тів Суб вух 61у їТа її Аїд баг 210 215 Бей їуз Аяп маї іеу Тис тТВгобес бій Ре туго їеу 5ес дер Су АЙ Май 225 230 235 240
Те обег дк РГО Су Суб туг бух Сей бує ух баг Те А5п іме РНе 245 250 255
Суб маї Те сСуз бій д5повій АТа Рго маї ні впе Уа! С1у Уа! біу 250 285 270 век су» кій» 48 «її» 397 «гій». РВАТ «213» Аг тіста! зедцепсе «290» «223» актітіста!ї «400х 38
Ма! Ага Аг РВе веб уа! тн оїеу АР ІТе Ага АРО Аза Суб Ту во 1 З 10 15
Рто Ага Уаї ака АгЯ Аго Ага Ага АК Аго Ага уаї Уаї АК бго гей 25 30 с1У вв Аїа с1у Ага Уа АТЗ А1їа ні5 ті тк обТу тнг Ага сту Аго
Зег А5поТВг Ге бегочбекобго Азпобег бує А5п обі суб АТа Гей с1у бо
Ага буз ІТе А5побег терій его обег Ага бБег обіу Ні беб РН тей 65 70 75 80 его Ап о Мво Ні Гея Аго А5п б1м біб ви ма1 кіє Ні5 ої сух 61У 85 90 95
Ре тут тує ті туго бек сій тТйбе тує Рне Ага вне с1п ст бід т1є 100 105 іо уз БТ Ап ТВКору5 Аби АбЗрогуз бій мМек уаї сбіп тує їТае тує бух 115 120 125 тук Тіг бег Туг Рго А5р Рго ЇТе Ген гейш мет їуз Зег АТа Ага Ап 130 135 140
Зег сСуз тТерочзеб руб Ар АТа бій тує б1у бе) тує бек Ії тує б1п 145 | 150 155 1650 су б1у ІТе ве бій ценосує б1ц Ап Ар о Аго І1е Ре ма! 5ег ма! 105 170 175
Те А5а бій нія ген т1е Ар Меб д5о НІ 5із Аіїа бек РНе Рг с1Уу зо 185 190
Аза РН Кев ма с1у 195 «710х ща «11» 189 «еїа» РЕТ «213» АгтітТ1сіа! Зеепсе «г?» «ваЗ» агттт ста! «Ю» То го Ага Ре Мет АзротВе Тер ості сїу Беш Аби АгО АгО Аго Аго АКО 1 5 10 15
Ага Аго Аго Уді Уаї Ага Рго ви біу їн Аїа сіу ага Уа! А1їЯ Аа
Ні Тіе те обу таб АРД ЄСТУ Агу 5ек Аза тВг о ве Бе бег го АЗИ 30 45 его огуз Аби бій суб Аа бе сіу Агу уз І11є А5и б5ег Трр ати ее 513) 5ег Ага бег біу нів бек Ре цей бек Аби їво Ні сеш Агро да б1у 855 70 75 во із реп муаї їіє ні сїи цу5 біу пе туг туго ї1е тут бег сій те 55 90 95
Тук вне ака Ре сів біШ ст Хе ру5 бій АбпотТвК цу дев Або гу 100 105 Мо біп мех уУаї сіп тує 112 Ту о Губ5 Туг ТВгозег Тут рро Або о рго те 115 120 125 цей цею Мет ух хек Аа Аку Аза бегосуз Тер бег їув Ахр АїТа бід і30 135 | 10 туп бі їв Тукозек тів Тук біп ві біу тіе Ривости реп Еу5 бю та5 150 155 160
А5п Ахр Ага ї1е вне Уа! бек уаї тб деп сі Ні ред тів Азр Мех 165 їй 175 дев нія бій Аза бек о рпе Ре сС1у АТа Ре ей уаї сіу 150 | 155
«2105 20 «ії» 195 «дих РТ «213з Артітісід! 5едоуєепсе «рейх що «223» агтітісіа! «Мюх 20 суз січ су5 Ні І1їе Мет бі вух ї11е бій обімж дид є1у Ар о Авр о А5р ї 5 10 | 15
Аби ака Ага Ася Ага Ага Аго Ас Ага ма! Ма! Ага с Рго Сец біту ге 23 30
Аза е1у Ага Ма! АТа Аза ніх тів Тег осіу тб акго віу Аго 5ег деп
ТВг огбес зег бег рго А5побеє рух Ап біб Сух АїЯ без б1іу го ув
БО
Ії дзп бек о Теробібв зеб бег дгу бек о спіу Ні бек Рпе Гем 5егодьй 655 70 75 50
Без сні ей га дп с1у біз тез уа! ї1є ні 410 Суб с1у Ре тус 85 90 95
Туг ІТе тує бек бій те тує ве да Ре сій сії єї 116 су су 16 105 о депоТне рух АБИ Або ух біп меє маії сій тує 16 ту су ТУуг От 115 120 155 зег тТук Рго д5роРго 11 гео сеу Меї їу5 Бег А1я Аго Ап Зег Су 130 135 140 тТетрозає бух дер Аза вів тує о1у івц тук зек Ж1е туго бій о1у у 145 150 | ї55 160
Тв вве сто Гео уз єї А5п др одсо їТе вне уді беє маї ТНиг Ав 165 170 ТТ 75 си ні це те дер Мет Ар нів бі) Аїа 5ег РНе Ре біу Аїд РНЄе 180 185 190
Мей маї Фу 195 «2105 71 «й1ї5» 718 «о» ЕТО -21325 Агтітіста1! 5едцепсе хойО
«Ра3У актітісїіві «400» 21
Ата ма! его ті діа Єїп Суз рРгОо АгД Аг Аго АгЯ АРЯО АгУ АгГЯ Аг 1 5 10 | 15 чаї Маії Агу го Се аіу бе Ааїа оту Ага маї Аїа АТа НІ Х1е Вр 20 25 30 сіу тйгоасу біу Ага бег ав Тс о їец бег о бег рго Ай 5ег Єує А5А 35 40 45 сі їу5 Аза бен 01у Ако ту тів А5п бек о Трробіб бегбоб5ег Авсу 5ег 50 55 (8) сім Ні бег РБе їец бего дей бе Ні Геу Ак А5а с1у бів гео Уві 65 70 5 850
Ж1е ніх сто бує б1у Ре тук тус тІ1є туго 5ек бів тиготуєк Рне Аго 85 90 95
Ре сів бі від т1е уз Є АЗИ ТАгогу5 Аби Ар огуз бів мех уві но 195 110 бів тує тТє туг уз Тує Тиг бак тТук РГО АБО) РГО Т1є ів івц Мет 120. 125
Ту бег дід Агу А5и 5егоСуз Тгробек о буб5 АБО Аїа бі туг о1у Тен 138 135 140
Тут бек І1е туг біп бі с1у їїе Ре 16 1ей бух С1й А5п Ар. АгО 145 150 155 169 т1Те РНє ма! бег уд! Тйг ОА ОО Ніх без І12е АвроМеж АвроМі5 ОТ 165 170 175
Та хек рве Рпе б!у АТа ее гей ма! б1у Рго цеу б1у сец Аза у 150 185 190
Аго мМаї Узі Аго Аг Ас Аго еВ Ага Агу Ага Сей Аїа Сем Ага еи 195 | 20 | 205 діа суб ї11е біу ар сій Меї др Уа! Зег 210 715 «Ох 22 «211» 199 «Ір РТ... «2135 АРІ ста! 5Зедпепсе хоох «23» ангтібісіа!
«НЮ» 22
Аг ма? АТа Аїа Ні ї1е ТВ осТу Тве Ага біу Ага бЗег о д5п ТАг ог ец 1 5 10 ї5 ек бек Рго АЗй его бух АБ 619 цу А1їа се) 01уУ АкЯ цу Те Ав 20 2: 30 бек о Тгробіу 5ебозег Агу бег бу Ні беб Ре цей бег Абп о гГву Нів 35 40 45 іей Аго Аби оту бій бец оуаї їТе ні5 сій бує бі вне тук отут сіє 50 55 60
Туг бек бій тег о Тук вне Аго Ре бій сіц бе Те Бу5 бі Ап тА 65 70 75 80
Гуз Ахи Ар обу бій меж маї сів тук ї1іе ту вує Тук тВкоб5ег тує 855 що 95
Рго Ар обго І11е ген Сея Меї їу5 бек АТа Аго Аа бек обує Тгробаг 100 105 що руб А5родіа бін тує бім йец Туг бек ї1е ту осів бБіу б1у 1е вве 126 125 ср мем цу5 бій Ап Абр о Аво жів Ре маії бЗегоуді Тигодзп бій Ні 130 135 140
Кей їТе Ар Мет Абр нів бій Аїа бек Ве Ре Ту діа Рпе ген маї 145 150 155 160 сіу Аг ма! Ма! дга Рго о веу сіу це Аа сіу АТа сіу Аза б1у сту 165 10 175 сіу АТа біу біу Аїх біу Аїз біу ву сту АТа СІу 6бТу АТа сі Ага 180 185 тю
Ага АгЯ Ага Аг АгЯ Ага Аг 195 «йА0» 3 «2115 289 «212» РЕТ «13 АгтітТісіа! 5ецдцепсе «дО» «баз» аптттістві «005 25
Ага уаї АТ АТа Ні5 Ії тВгосту тТаг о Ага б1у Агро бег о АБа ТК гей
Ії 5 10 15 зек век вга доп бегосух делі у Аїд сей с1у Аго уз Те Ап 20 25 за зек Тер о біш чег бек Аго бег біу Ні5 5ег о РбБе ге баг одеп гец Ні 35 Кто) 45 меч Арка АЗп о с1у сі бен ма! їіе ві5 бі ву5 б1у ве тує тукг їв 50 55 бо тук вес с1п о твготукє Ре дра явне свій бін бів тіє зу бій дев ТЯГ 55 7а З 80 у А5и Ар Туз бій Мет маї біп Туг їТе туго руб Туг тТрк бек туг 85 90 95
Рго Ар оРГО їі еп івеи Меб цу зак АТа дго да бек Су Троробаг 100 405 іо уз Азр Аїд бі тус біу рей тук бек ІТе туго бів біу с1у їТе вне 129 125 510 сей фу бо АБИ Ар о Агу Те РБе Уа! чегоуві тб оАби оті Ні 130 135 440 іец ї1е Ар Меї А5р нів сім АТа бек Ре Рпе сіу АТа Ре цей Ма! 145 150 155 160 оіу Біу 01у б1у зег б1у сбіу Аг цу уз ка Меї Те тів бек осїй 155 179 175 сій 10 рйє сіу дкд Те обіу цен оРго Азр оцей бегобЗег Мет Тр ої 180 185 190 а бін сій Хі6Є Ата Буг Аїд Меї бій Мек звер освоа бій сту АТа 61 195. 290 205
РНе біу іп Аїя бі) бег Аїд АВ ІТ Ар АТа баг бе АТа Меї Ар 216 215 ий
Твкозеб бі РРО Аїя вуз Ти бій Ар Азр отуг Азрома! меї сій Ар 225 230 235 240.
Рго біш Ре іву біп бек ма)! се ої А5и се го 01у Маї Азо Рго 245 250 255
Ай АБИ біц Аза ж1е Агд о Абп о А1їа Ме о сіу хег се Аа бег ств їз 250 2655 270
Тиг сух Авр о с1у 1у5 1 м5 Ар їує ух 61 сн Ахр бух Гу5 біз Ар 275 280 255 і ви «2105 24 «211» 183 «2122 РТ «235 АгтЗТїсіВ! зебуспсе «га» кй?Зз» агтзтісіді «4005 24
Уаі Аїа А5л о РгГО бій Ата бій сіу бій беу Ага Уді Уаї АгЯ Рго Сец 1 5 ву) 15 с1іу ев АтТа біУу РРО сій дкЯ Маії Аїа АТа нів тіе тик обіу тяг Ага 24 25 30 сту Агуд 5ек А5п тагоїец бЗегобег Рго АБИ 5егоі уз А5и бін Ббуз Аїа бер бту Аг уз ЇТІе АБИ 5еготгр о біу 5екобес Абу бек оо1у нів баг за ва бо
Рів цен бек Ап оїен Ніз ей Ага Ап б1іу бій Се) Уа? ІТе ніє сто 65 о 75 50 ру сту ве туго туг ті тук обер о біп лйк тує яле Аго Рпе бів ото 85 | За 95
Єр жів вуз бін Аби ТНК вуз дп оАвроіув бзіпоМет уд! о1й туг ще 1090 105 зо
Туг ув тук тигобег о Тук Рго Ар оРгОо 112 цем їв Меб уз зег АТа 115 1205 125 дека Аб5п овес Сух Ткрочек Бу АЗИ Аза 1 тус соїу без гук ес їв ї130 ше 140 тук оїп я1у сіу їїе вве біб іецоїу5 Є Аєп АзроАгЯ їі вне маї 145 159 155. 10 ек ма! ТЬг Ап бій нія їеь ї1е Ахр Мет Азр о Ні біц діа бег рРНе 155 170 175
РНе Ту АТа бе цец маї ФУ 180 «2105 25 «2115 179 «2125 РТ «13» АгжЯТісіаі! б5едцепсе. «г2Пх
«223» актітісів! «А» 25 іей Аїа аА5и біу ма! сій Ага ма? маї Ага Ррво гер обі ер АТа бу 1 5 І 15
Вго біп ага Уа! Аза Аїа Ні тТе те о б1у Трг о Аго біу аку 5ег Авп ?5 30
Ти о гбец бек обеє вро Абп ояегогцу5 А5п сі туз Аїд рен бу Ага Гу
Ів Ап Зеготгро обі бек бвг Агу 5ег Є1у Ні его РНе гер о 5его АБО за 55 Бо
Меч нія їец Ага Аби о1у сту ем уа1 т11е Ні б1в у5 бТу вве. туг 655 70 75 о туг ІТе туго зек сіп так туго вве Аго вве сів сіб бїц те був сш 85 90. 95
Авп тк Гсує Ап Ав уз бій Мех Ма! с1й Тук ї1е туго рух тує тв 100 105 ж; век туг рго АзровРгОо 16 Се) вец Меї уз бег АТа дгЯ Ач 5ег Су 115 120 125
Тер 5ег уз Ар АТа бі тує б1у цен о тук бек Те тує б1іп сі с1у 130 1435 140 тів еНе сій гешіу5 сіб дБ Ав АРО ж1іе РН маі 5егомаії ТНг од 145 150 155 160 бій нія іеи тів Ар оМеб Ар о Ні бін діа бег рпе Рпе біу діа РвВе 165 170 175 їец ма! віу «10» 96 «23115. 180 «кг125 РК. «ї3» дЕЗтТісіаї зеацейсе «дих , «ва3» акті йісіві «а0О0» 25
Суб Рго ек сії с1у геу Суб5 Агоо Маї Маї Аге го зей сіу сви дів х 5 10 15 сіу Рго біп дге Уві А13 Аа ні Хі тТвгосіу тб ага б1у Ага бе о 25 30 деп тйг омбец Зес о зег рео деп баг бух деп бі уз Аїа фей сіу Аго о 35 губ ІТ Ап бек тер Оу 5аг бек Аго бег біу Ні бег Ре ву баг 50 хо 60 деп вв нія сеноага дей с1у сій Бен оуаї 1лТе нія сім уз сіу РНе 65 7а 75 о
Тук тут ї1е Ту 5зег о сіп тнг о тує ве Ага Ре сія 16 обі) ї1е губ 85 20 ЗУ с дл тТвгогу5 Ап АБО уз сій мет маї ств тує тів Туг куб тук 100 | 105 110
Тис обеє Тук бго Ар оРго 112 гец о іеи Мет рух его дій Аго АЗп о бег 115 120 125
Су Тер обег вуз Абр Аза бі туг су ге о тук бек їТе Туг віп Су 130 155 | 140 бі Те Ре ЄТи Беш Суб 41Ш Аби Ар оАго їТ8 вБе уді бег Уа! тег 145 150 155 160
Аєп оїй Ні вен тїїе ЯА5р Меї Ар Ні сій Аа бек РМе Рне сіу Аїа 65 170 175
Рпе сей ма1 СТУ 150 «1 27 «21їз І168 «хйїйз ВАК «2135 Ното 5аріепь «300» «308» РУОЗЯМ «З0а5 1996-10-03 «813» (1143... 281) «800х 27 уаі Аго бТи Ага біу бро б1п Аго Уаї АТа АТа нів тів твг б1у Те ї к! 19 15
Ага Є1у Ага 5ег Аби Твгорец ес бег РгО Ажи 5ег уз Аби б1И -у5 за
АїТа ген о1у Ага бух І1е Ап о беготер о оів 5ег 5ег агд 5ег б1у нів 5ег рве се бег Ап о рео нз5 спец Ага д5п о1у біз гео уаі 116 Ні5 й бо сін цуз 5ІУ Ре тТук тук т18 Туг ек бій таготук Ре Аг рве св 655 70 75 о сіш сти ї1е уз бі Аби тВгогух дей др огух єї Мет уда1ї сій тує 85 90 95
Та тук (ує Туг Тнго5ег отук РгГО Або Рго 116 ей ге Меї бух 5ег 190 305 440
Аїа Ага д5п Берг сСує Тткробег цу Абр оАїа бі туго біу ем тук вет 120 125
Те Туг' біт аїу б1у Ів Ре бі ївейо бує 615 Ап Ар оАго ї1е вве ї3а 135 140
Ма! бег ма! Тиг ОА біц Ні 1еу їТе Ар о Ме Ар нія би Аа 5ег 145 150 4155 160 ре ве піу Аїа Ре Сен омуаї с1у 185 «2102 28 -«211» 163 «212» РЕ «2І3» Ното зарієне5 «300» «З0Ях 850593. «3095 19955310-01. «3135 (1193. .(2813 «4005 (28
Рго бій дга маї А1а АТа нів І1е ТНгобіу ти Агу б1у дго чего деп 1 5 10 15
ТИг ген чего баг о рго Ай яег обу Ап сш губ Аїа ме) біу АгО гу 23 Зо
Іте дей 5ег о тгросіц Зег Зеб АгЯ бЗег о аТу Ні его РН Гей бег оАяй о. 45 іїен нНіб Гец дгд Аза сту ти ей маі їТе ні сту Суб 61у Ре ту | 55 80
Тук Те тук баг бій тТийг тує Ре Ага Ре бів біз Єїи їТе цу5 Ту 65 70 75 о ди тТАгогуз Аа Ар обу бій Мебс маї сій ту їі Туг вує БУК ТВ 85 90 95 ек Туг Рго А5р РгГОо Ті ме Бей Меї губ 5ек А1а Ага АБИ Бек суб 100 105 по тТге бак груз дер оА)іа біб туго су ей туг бзекоІ1е тук сій б1у б1у 115 1260 125 те РНе 10 ген ух СТ А5п Ар Аго І1Те рРНе ма! бек Уа! ТАгоА5А 130 135 140 оІш нія рей ІТе Ахромеє Я5р Ні бій АЗїа бак ле Ріє с1у Аїд Ре 145 150 155 т60 цей Уді сіу «210» 28 «2115 161 «ій» РЕТ «213» Ношто 5зарієне «3005 «308» 250591 «309» 1995-10-01 «313» (1213..5(2813 «-4005 95
Аг Ма! Аїа АТа ні тіє ТиИгобіуУ твгодро Є1у Агуу бер Ап о тг Бей ї 5 10 15.
Зак Зек го Аа его вуз Ап соти цу діа еи с1іу Аг Гуз 118 Ап чего ТгросіО зегоЗегодгу его піу Ні Яегобнв о іви бес д5п і ем Ні5
М 45 рец Ага Абп оту би Бей уаї Тіеоні5 СТЕ бух біу РНе Туг Туг їв
В: 60 тук бек ап Те оТуг Рпе Аг Ре бій сіб біб ї1є губ біб Аза тик 70 75 о
Гуз дей АзОо уз Бій Ммеї Уві віп тує т1іе туго цу5 тус Тиг бек тук 85 90 95
Рго А5р о Рго Ті Геу бе Меж сує бег АТа Аг А5З бек оСує тгробег 100 105 110 ау Авр Аїа ої Туг О1у Кей тує об5ег те туго бій біу о1у ї11е Рене 415 120 125. еТи реп суб бі А5подвр АКо ї1е рРйпє уаї 5ег уд! ТК АБИ би нів 30 ІЗ5 146 їен Те др Мет Ар нНіз сі АТа 5ег Ре Рпе сіу дія Ре і ви ма 145 150 155 160 сіу к2105 30 «щії» 16 «2125 вт : «2135 ото 5арзене «300» І «3085» бенВапк/ АдАЕ?125657.ї «309» 2000-05-21 «3135 (873..60783 «4005 30 іїу5 Гуз Сей зЗвг боти Су гей гу Або тів Біу Ар сти веу АД о б5ег 1 5 10 | 15 «М» ЗІ каїї» 15 «ій» вт й «2і3з Ното зартівне «00» «3085 бепвайпк/ ААН2г072,2 «309» 2005-07-21 «313» (1413..01553 «400» 31
Аг Аби ї11е Аа Ага нів се) Аїа бій уа1! бу Ар ес Меж А5О і 5 10 15 «230» 32 «211» 124 «125 РЕ о «213» Нею заріеєпйе «005 «3082 бепвапк/ АААУот5Ии.ї «3095 1993-08-30 «3135 (353..0156) «4005 32 уз сім тиг о АтТа Аїа АЇа уз Рпе біш Аг сій Ні Меї Ар 5ег 5ег 1 5 10 15
ТНгобБек АТа АТ бер зег ес Ай Туг Суб Ахй бій меї Меї Су бек | 25 30
Ага АБИ Бен Тиг огуз А5рОАгЯа Суз Гуз Рго Уаі Ап Тег РНе Уді Ні іш 5Зег бен АТа Ар оуа!ї сін Аа Ма! сСу5 бег бій 1їуз А5й ма1ї Аїд | бо су ув Ап о1у сій те дян Су тує біпобЗек тує обег тве мех 5ег 655 7 75 во
Ті Так Азр Су Аго 610 Те оту бек бек бух Туг Вго Ай су А18 85 20 9.
Тут бух тіж Тигобій Аїд А5п о гу5 Ні ті тІе Маї дід суз 651 біу цю 105 110
АЗп орга Тук маї го ха1ї Ні Рпе дзр Аа зер ма 115 120 «105 33 «2115 104 «212» вт «213» Ното 5арівй5 «3 «3085 бепвапк/ дАНбгга -3095 2006-07-15 «313» г23,.01057 «8005 35 оіу Ар ма! біз ву сіу уз бух І11е Ре І1е Ме уз Су бек СІЙ 1 З 10 15
Сух нії Те о маї сії Суб оту СТУ су НІ уз Те о сіу РгОо Ап цей
Ні б1іу сей Рпе сіу Ага Гуз те о с1у б1п Аїа Рго біу Тук бег тук
Тс АТа АТа А5й БУуб Ап о Гу5 СТУ т1е ї1є Тгробіу бі А5р о тТАг Се 60 меж іш тує рей бій дей РО мух уч тук жх18 вго біу тнг вує МЕЄ 65 70 о жх5 во їТе впе узі сбіу їТе губ гу5 ух бій бін ага АЇз Азроїеу 112 Аа 855 90 95 тує рей уз су діа тт Аза ти 190 «Рій» 34 «211ю 227 «2122 РЕТ «213» Нощто 5артіепь «300» «3085 депвайк/ сААОї810.1 «309» 1995-10-17 «3335 (13..(2973 «Об» 34 тіе тіе б1у с1у нія уаї Аїа цу РгОо нНіє 5Зег Аго Рго Туг мех Ата ії 5 10 15
Туг цеч Мек ті тгр о Азр бій вух зег і ей гм5 Ак Суб Ту ТУ Ре 20 25 30 це те Агу Ар Ар Рпе Маї гей тб Аза Аїа ні суб тир о біу 5ег 35 40 43 бег о тіе А5п Маї ТВг огГез б1У АТа нів Абп Т1іе Су бі) 14 бБРу Рго 50 55 БО
Тнгобіп біп вне їТе Рго уаї фу Аго діа ї11е Рго Ні вго Аїа г б5 70 75 ве
Ап вго бух Аба РНе его А5п Ар о т1е Мет гей меш бій Свою ст Аго 85 90 95 і цу АТа Гуз Ага тиг Аго Аїа Уаї сіп Рго ей Або беч рго 5ег дп 100 105 110 мух АТа біп маії уз Рєго 51у бій тк оСуб его уа1ї дід 5ІУу Тер Оу 115 120 125 сіп тиг АТа Рго ім біу бух Ні век нів тік о вбец бій 614 Ма! фу5 430 41535 тяО мек тТиг маї бій ої Ар АгО їу5 Суз С1у 5ег Ар Сен АКО НіВ тує 145 150 ї55 160 тує Азр зег твг о І1їе єЇїй Геи суб Уві! б1у Ар о вгОо б1ч І1е Гуз ув 165 170 175
Тиг бек Ре їу5 б1у Ар бег Є1У сіу Ргб о іен ма! Суз Ап огух Уа! 150 185 190
Аза сій с1у ї1е ма! чек туг б1у АгЯ дей Ай Ф1у Ме Рго РО Лео 1955 200 205 діа су» тс куя маї зЗег бек РНе маї ні5 Тер 112 ух Сух твг о Меє 210 215 22й
Аго тук 225 «вх 3 «2115 9 к?1і2» РЕТ я?і35 Нощо зарієп5 «ЗО» «ЗОВ» сепванки Едш5ЗВ2231 «309» 7005-12-18 «3135 (5613..4(5693
«400» 35 рве его Аго 5ег зай Ні бБег цем геу «210» 36 «211» 15 хезтй» РЕТ «2135 нот зарієй5 «300» «3085 бепвапк/ ААтІТОЗЗЯ. 1 «Зо 2009-03-18 «ЗІЗ» С723..(85) «Нюх Зб сіу біп ма! сту Аго б Б Сем Аа те 116 с1у АБр А5рот1е БП 1 З 10 15 «2105» 37 «211» 24 «212 РЕК «2135: Нато 5аріепе5 «30 «3085 сепвапк/ ААВ51243.2 «3095 2001-09-26 «33» 01303..(1533 «Ой 3 сти її ста тгроАтТа Аго су тІе б1у АТа бій геш аку ака Мек Аїа 1 їх 18 45 дер ар тен дп АТа бій Тут 619 «Нр з х2ії» 192 «12» РЕТ , «3». Ното заріегп5 «300» «308» сепвайк/ АдеЕ51243,2 «309» 2001-09-26 «Зі3» (53..0193) «800» 38
Аі1а Аго АЛа Ага ап бін б1у бегобек рго біц бго Маї «1 сіу Сей 1 5 ї1а 15
Аїва дка Ар б1у РгО Ага вго РН Рго рей с1у Агд Сей ма! рРго 5ег аб
Аїа маї зек Сує б1у бец суб бу рго сіу сей Аїа АТа Аза Рго АТа
АТа РКО тиг ве сей РКО АТа АТа Туг сей Суб Аїй РГОо ТАК Аа РРО 53 60 вго АТа уаї тиг о АТа АТа ге біу сіу бегоага тер о Рко о1іу Ту Рго 65 70 75 що
Агуд бег о дАкаЯ Рго Агу біу Рго Агу рРго Аброо1у Рг віп Рко бег Ге 855 90 95 5ег гер АТа бій біп Ні5 Сец сід бер о Рго Маї Рго баб АЇїа Рго б1у ла 105 110
Аїа сег АТа біу біу Рго трКобів Аїа АТд Рго біу ма! дк біу Є 115 120 125 сі ої бій тера А1Та Аг бій ї11їе сіу АТа вій ей Аго Ак мех Аа 130 115 140
Ар Ар огец Авп АТа ої тус бій АГРО Ага Аг біп бій біб ста 1 145 150 155 160
Ака Ні Агд РКО 5Еве РгО ТгроАКЯ ма? ем тує А5п рем те мех сіу 165 170 175 еп бе) го еф РГО Ак біу Ні Аго АТа Рго сій Мебє біч Рго Ап зво 185 1950 «2105 39 «ії» 8 к21» РЕТ І «213» Ното зарігегп5 «ЗП «3085 бевпвайпки БАМУВЗ111 «З0а» 2006-12-18 «313ж (1323..4138) «М» 35
АТа Ма! го ЇТе АТа сій гу рко 1 5 «2105 40 «211» 20 «212» РЕТ «дї3»2 Ното завівпе «00» «308» сенвапку БАе350650.1. ха» 2008-05-24 «313» (213..(385) «а00» 40
Ага Аа оту Гей ої Ре бго Уа! с1Уу Агод бен геу Агуо Агу ев ву 1 5 10 ї5
Аго Ага Гей Ге)
«Ом 41 кої» 1404 «їй РЕТ «213» Ното зарієнйе5 «З0йх «3085 55 -РРОКИ рР?22О69.2 «3095 2010-03-02 «З13ж С13..6043 «400» 4 сів абр отгросею тк Ре с1п о гує вує Ні тів ТйгоАБп тТвк Ага АЗр 1 5 о 15
Уа! А5р Сух А5р Ав Іїе Мет бег пі Ази Сеу Ре Ні Суз іу5 А5р 20 25 30 вує діп Ве РНе Х1е Туг беє Акд РГО бій го маі суб АТа Ї1е су 3 40 45
Гуз бі тіє І1е Аї8 5его вуз дзлпоуа! ей отйготпгобег о бію вбеотуг 50 55 БО цей бек др Суз Ап маі ТИР обег да РгГО Суз цує« Туг бу5 цеч куз 65 70 75 о
Буз б5ег тп АЗИ Гуз РИ Суб хаї ТВ Суз БТ Аза єї Афа Рко чаї 90 35
Ні Ре ма! біу маї СТУ бег су 700 «2105 42 «211» 198 «ій» РВТ , кеії3» Нео зартепя «300» шк «3085 бепвапк/ АлАнІіЗОбО.3 «3095 2008-11-30 «313» (183..5353 «400ю 42
Уа! агЯ Аго Ре се Ма! ТвК оіен Аго тТе Ак Абу АТа Сує бу вро і 5 10 15 вго Ага таз «и305 43. «2115 4 «М1дз РЕК «2ІЇ32 Ноато зда еп «300»
«З01х ВцЕЕдег «303» Опсодене «НМ» 13 х3Об» 2141-2147 «307» 1996 «00 43 вро Ага Ре мех Або тк ткросбіч е1у ей Ав 1 5 Ю «2105 44 «11» 17 «»12- РЕТ «13» біусіпе тах «300 ши «308» бепвапки АСЕЗБОВ3.1 -309» 2008-02-10 х3Зї3» (433..0593 «100» 44
Суб біш Гу Ні ХТе Меб бі рух іє біп б1у Аго біу Азр Ар Або ї 5 10 їх
АБО
«2105: 45 «ії» 15 «гі» ВЕ х?і3» Ношо зарієпь5 «300» | сі «ЗО» бепвайк/ гАшОВ311.1 «Зб» 2006-12-18. «3132 (1323..0138) «400» 45 їво АТа зе Ага ей АТа сСуз Їіе біу Абр сій Меї Ар маї зег 1 5 10 5 «210» аб хиїї» 20 «212» еВ х2135 АгтіТісіа! 5едивпсе ж?» «23» агтітісіа! «300» «308» сейпвапнк/ ААЖЯІТ125.ї «3095 2905-01-06 «313» (1483,..01673 ка» 46
Аа с1у Аїа сіу сіу С1У Аїа сту сіу Аїа сту аїа сту сіу с1у Аа 1 5 10 й І сіу с1у Аїа сту
«г105 47 «йї» 114 «212» ВТ «213» Ното зартієп5 «Ох «308» бенвапк/ сАо72169.1 «309у 2009-01-13 «3135 (793..51913 «400» 47 мех те їі 5ек бій сії біцш РНе біу Ако Ти бім ей Рго А5р Бей 1 5 10 ІЗ
Бег ЯЗек Меє Тег осіц бір об1ч бій ІТ Аїда тук АТЛа Меб біп Меє 5ег 20 25 30 сек оів'єЇу Аа бі рн с1у біп АТа бі) Зек Аїа до ї11е А5В Аїд що 45 зег 5Зег діа Мет Ар ТНг обегобіц Рго АЗа ву5 бін сій А5в Ар тТуг бо двр уаї! мек бій А5р РРО біц вРпе вен сій Бек уаї гей бів Ай рей 58 70 75 ва
Рго сіУу уаї д5роРГО А5п АБ Бій Аза сте Ага дп оАїа меб О1у зег 55 90 95
Сен йїа бег оіп АТа твгосСух ав осіу губ (Су« дбр му Гу 01 сій 100 105 мо
Ар су «10» 48 «2115 юю «9125 РЕК «13» Ното зарігп5 «300» «308» бепвапки дло21132.1 «3093» 2003-01-18 «33» (933. (1023 -8005 48
Уа! АТа Ап о РГО бій Аза б сіу б1п Геу ї 5 16 «210» 459 «711» 5 «212» ВК «13» Ното «арієйпв
«3052» бепвайк/ даАОо21132,1 «-3095 2003-01-18 313» (1133. С185У «00» 45 іен Аїа Ап о1у уаї сн 1 5 «2105 50 «2115 7 «212» РЕТ «213» Ното зартієепве «390» 308 сепвайки ААОг1132.1 «305 2003-01-18 «3135 41973. 131Х «005 50
Су Рго 5ег бів ву муеи суз 1 «10» 51 «81125 5 кої» РЕТ «213з АгжіТісіа! едоглсе «20» «ве3З» а Тісізі1 «4005 51 рго бен о біу гец А1а оту ї 5 «ЙО» 82 «211» 4 «в1йУ РТ «213 АРТ ТЯсСтіа! 5едивпсе «20» «Р2З3» агжітЯсіа! «0» 52 дв чаї маї го «210» 53 «МІ 4 «й12» РТ «2ї32» Агтійісіа! зефшепйсе «РО» ! «В2Зв о агтітісіа! «А» 53
Ака Гу5 (ух Ага ї
«Оз 54 «11» 118 «212» ВТ «2135 Реешщотопах аекидіпоза «400ю 54 рго сб біу б1у зекгогеу Аїа АТа ве ТАаг діа нів бій Аїа Суб Ні 1 З 10 15 цец Рго Се сіб Те о Рбе Тр оака Ні Аго біп Рго Аг осіу Тер біо сій сер бі сій сСу5 б1іу туго Рго Уаї біп Агу вбей уа1! Аза Бей тує цеч АТа Аїа Аго цец оЗег тероабпобій Уаї Ар осі мМаї 116 Аа АБп
БО
Аза їв Азїа бек рго б1у бек сту бу Ар це сту бій АТа Те АКО 655 70 75 о сій век орго б1у сій Аа Або геу Аза сец тк огеу Аа АТа Аа си 85 50 95 «ег бій Ага РНе уаї дга бій б1у Таб о о1у А5п Авр осі Аїа СТУ Аа 100 ЩО05 110
АТа Аби біУ ргОо А14 АБО 115 і «2310» 55 «ії» Я кгіг» РЕТ І «?1З» НОше зарієнух «4005 55 гу дер сі Сей «г 55 «211» 4 «г12з РТ «її» Ното зартепь5 «4005 56 ух Бій Азр о Гец
ЗХ
«2105 57 кріїх» а «жів РЕ «г13» АгЖітТісіа3 бедцепсе 220»
«вйїх агттттсіа! «005 5 су с1у бек с1у «210» 58 «14 «2312 РК «гі3» АКЕЗжЯсіа!| хедпвпсе «ЕЙ» «3» агсітісіаі «005 58 пу оТу біу зег «ій» 59 «21їх 5 «12 РЕТ «13» АРТіжістаї 5едивлсе «еОх 2 х223» агтітісів! «00» 59
ФіУу аїу сІу сіу б5ег 1 5 «210» 60 кої 5 «212» РЕТ «віз» АстаТтісзїаї 5едоевсе «Ох | ! «вйЗ» атітіста! «4005 60
С1у біу бек б1у Су ї 5 «ех б «ії: 6 «212» РЕТ «гї135 дежатісіві Зедуепсе «Вей «РеЗ» актійіста! «00» 61 су б1у оту бек с1у ту 1 5 «2105 562 «ві «рід вит «213» Агтігісіїа! зедиепсе
«223» вгжтісіві «00» 62 б1у сіу бу 5аг су сіу СУ в. «210» 53 «21їх 8 «Т12» РЕВТ «213» АКЕТТІіСсСіВаї 5едценсе «ах «223» агтітісіаві «а0йх 53
МУ сіу 1у зег сіу еїу ту 5ег
З
«210» 564. «-82115 З «125 РТ «13» АгІіТісіаї зедуепсе ч«еадх «аЗ» аглітісіа! «Ох 54 ву с1у с1у бек сту Су С1у сту 5ег 3 «2105 65 «21ї5 й «212 РЕ кй13» АГЕТРісіаК зедцепсе «2405 шк «раз» агтітбістіаї «НК 55 ! мів ек ау сту «2105 б56 «2115 8 «122 РаТ «213» Агті1тї1стаї 5едцепсе, «йеОх І «23» агхіттставі «4100» б су сту сіу 5ег АТа бег с1у сім
З
«їй» 57 «11 585
«212» ОМА щи «213» Агтітісіаї 5едцчевсе «220» но «аз» агтзтісіаі «45 67 дсссассвуа аатодсассаа аазадстдес кесСатуаєсс асаїсааєса затакесаєє бо чЧассасостс асадзаатуєс дассаттсттс тстсадітїса ваватоссас сстодатаааї 120 пстатасаду ссататєтсто сатєстттдсєт ссаасадста Єтасегасає стесатсад 180 садазссода сссддаслЯяс тодтастатту агавасцтас хасассаттт дістаксате 240 тУЕусататеЄ сстеєтааттє сіксєстпава Ясадававтяау дістооєтає аадатаєвата 300 заацестстх ссатозаєса ссасттсаєс аєтасосада тосадаттос тсадаазас збо атаассадсса садсстдсктт сєсадстате аатсстасда сесаддастє сттсастокт го адстакссдоЯ стдстісадЗзоя сассастасо ассасодато ссрохаатає асостасавс 480 асцасстодєс апасссацдсо дасоваєвас аспдсдасоюд содасдасєдас дасцдстатс 540 садстєатса єсааїтасусї гсаддсаєсс астсадаесе т 582 «2105 68 «11-х 579 12 ВА. «2135 Акті гісєїа! зедуепсе «220» шк хе?аз агтітісіві «400» 58
Сатхзаєатто сасодїсахсю доасасадоєт оддковтяоаса тааасєсоксо сао єсос БО соєєдесува ссосСесуєсс дсеудЧсто дсадуєсоєд ЕсЕодсадсаєа татстассоде 120 асссатадіс втадсаатасє сстоазосадс ссазасадса ааззстовава зассстоаця І50 кгосааааєта зсвастдодса задсадссої восооїсата дстсЕстдад сааєстасає 240 стясоєаато кдзастоде заттсастоаа заздостттс актатсастта садссазасс 300 тактсссост стсабдааба застзаадва засассаввна агуатазаса захдастасад зва
Тасаєттата зататассаду статссудає ссоаєтстас сдатоазала сосасоєаваїт 420 застаєсоца чЧезазадвідс адзататдас сідтатадса їстатсвяада гтадсаєсттк 480 дзастовазо азаатнаєсо сатсттттото засутааєса асудаасаєст дазстдахтата 540 чаєсасдаву ссадстектє водсасаєтє скодкадас з7З «210х 59 «її» 305 «геїв ВМА 0000. «135 діт тіста! 5едуепсе ках Й «еЗ» аг тіста! «4005 65 сасохтосао сасасаттас созсасссуї пассогтадся атассстово саосссаває бо зоасазасата айаазуссст Зодїсосааа астааїзусі доддвзазасад ссосаасод 120 сатадчестттс свадсааєст осатстасоаї аатооуїсазс гоабсдастієз сазазаадає 150 їтІтавтата стїтатєадсєса дасстаєттї состттсадоа задазаттва адаазатаєсс 2740 ааазасоааса аасазаїтчт осавтатаєс тасалзатаса ссаастатсс ддатссдатх 200 стастчатаз яававсосасо їааїзостаї бадзосавау агасададта содсстатах 360 адсаїїїтатєс адодтдосає кІссозассо зааозазаєу аїсдсасіїтї сдгдавсота 42о ассадтдавс аєстдаєтоа татодаєсає дазудєсацеє сект тодсас асесстати 480 взасдасоаса дсдоєссосі двоїстодса одісогостта гЕсодтааача авассосадеа 540 пссаватст9 авасуссадса сасоватаос адсассвяосо садсавосацз садсваєтах 600 бдсаатсаца суатузааао ссдсазесто зесаазуатєс дссодтавасс дусдаатасс 560 хттостсасо аааосстоос адасосесад дсавсстаса оссадавааа суакдоєстах 729 зазазтдасс адассватта стаїсгададє табадсассяа тоадсассає содутаксох 780 даззассЯадса дсаздсазата їссозаттусє дсстатааза ссасссадусє саатваасаї в) астатєттасод сетагозада саасссустаї десссаосес аесстаасус сасососдаза 900 азадаєсту 909: «210» 70 «231» 875 «212 ОМА «213» АРТіЖістТаї 5едцепсе «го «2235 вактітісіаї «4005 70 І сеготтоасаЯ сасастастас сбвосасссчї яЧісатадса атассстагу садсссаває 650 зусааазато ааааадсаєт зас сосаза астватадст папдазадсва ссатадсоЧі 20 сатзаєтттс гдяадсаатст асяхсстосуї адтоадсовас тодховтсса тодазазаас 180 ттІтаєкзта Сттасадсса дасстатттт соасеттсаво ааддааєтва адзазакаєс 40 заадатпата аусялоатастї дсадтатасєс татазатата ссасствісс дбагссоат 200 стдстйатаа айдасасасу саатаостує єосвосааао зтосарзата єдоахстатах збо зддсаїттатсс адодсзосах стттдаасто авадвазато аксосаттсс ЄусдзвасяУТо 420 ассаатзаас аїстовттоа татодахсат дааоссайсу тІкстувтає ахтесесде аво0 пасоусооєа дсадсоуєча сдагабтааа дазассосад садсазааєє созасаєсад 540 сасатодата дсвосассад сосадсааос апсзосзатєе ахстосайтса сдасдастоава 600 аоссдсаажс тдассвазца Тсаєїстайа єсодідната сстктоксса гозавасстя Бо зЗсадатасєтє вубсачеесо сзассадаваа азтастасст дсаваяасоо ссздассавях 729 тастатсада остатадсас сатдзусаєє ассдаїкотс дкуаааєсоу свдсадсава тво татссодваттї дсосСататаа азссасесзо чссаятазає ататтастаєї тдсстогова 840 дослаєссоє акоєтесоає ссастєєдає дсавоасає 879 «ій 71 «2115 852 ей ВМА «213» АтЕ1т1сіа| зедцепсе кигйх ни «23 арт тіста! «4005 7 сядаїстєск єстїсаттоо кодстіЄ садабадоса зссадаєсто сасасістЕс 6о жттсетста атосссасаа ааатсатттє сутассосоуда втатаскстт ссодаєтсьс 120 сачатаєєсс ассасоотат сттсасссса ваїзатоасст тсасстєтає тодстасоди 180 атадстатаз сссадтосст дассачтїїї асдассавас здасєсатуса дастсодасе 240 дак такат тсоссасстс їстсаасоує агтозсаєтуо стоасаттітса таатаазаатс 300 кгс стоссЕ тт єссасатє сассасузас васасдасся дссадаєсса зсядассост 3650 ассаєсасса дссабдадато сассваааааа Зсбадстсса тдакєссатає сааєсавоато 420 тісаїттодіс асостсасдя азатосдвіс агттсстссс зоагтсавзаза тоссаєссто 480 атазакаста тасаруссат асстстасатс єетасессСаз садстаєтає зедсасЕ 540 саєсайсадча зссодбатссяо датасостдох агатіїтасая згасастаяаса ссясттасе 500 ахсоссттто зсаттсжстЕ тааїттстіс ссозавусоз ааатадахст дастатаває 6560 атайтаавад ссстіттсатє дзаєсассад тссассаєта сасадатуаса чаттастса9 72а аазасстатода ссастасцас состтсссса статева Єтосдасєсса аЯсеескес 750 атсестаста хтсодастас тсяооатасєх шстассасса садохассоа сзасахактоєс 540 тосвасасоас ах 852 «тож 72 «2115 800 кейй» ОМА «2135 АгкіРісіаї 5зеоцепсе «220 «223» астітсїаї «йдбю та ШИ ше сатустосад Сасатаєтас суосасссує доссуїаоса атасестоз9у саусссозає бо адсазалато пазазасаст одоссосаавз асїзатадстї одаааадсад ссокаосаає 120 сахтадсстїс традсзаїст дсаїстосої затааковас кдотдаєтся сдааазазас 150 тт(таїтата їттаєзудсса дасстаттст состстсазо задаааттза адаазатасс 240 заазаєчаса засзазсцдої зсадтататс сСаїазастата ссайстатссс оуатссватх 300 стастзаєда зазоасосасоа сзаїадстоєї тодадсалау агосадавтіа тадістатає 36о засасссаїтс асостедсат тЕтксаасто даасазазтя вісасаєттт хотавусеа 42 ассватузвас аєстоаттда татобатсає пзадсесадст тестах уєс агсестадсе 480 четавсоосо дтадссотаа зааасатодса засодїаоатс соддаачоасоо тадсствоса 540 осастдасся сасассасас атотсатста ссостддзаа сесстсасссо ссатсдесава 6О0 сстсоєовіє Зудаасаоєт дуаасадсоє одоссзессоо сЕСВОСОКсє дуєсосасту 6бО жЖакстоддсад саєдтстоадч стадзаєсад дЕсдассаво статкосаава тасастдоса 720 здфієсоЧата осаотзаєда єстодуєдаа дсааттсахо ааадессода зсадусасоє 780 себусастда сестодсаде во «8105 73 «Із 1715 «212» ОМА «213» девітістаї 5едцепсе «ау ! «293» агтітіста «4005 УЗ сутЧІсосао сасатастає содсасєссої дбссотадса атассстдад садсссодзає бо адсазаазасти зазавдссст одоссатада ассваатадсс додавадсво ссосачсце 120 саїтадстїїс товасааїстї Фсаїстосаї вахтоосодас содохдаєсса соаавадоде 180 тестаттата гттатадсса сасстатттї сдстттсаоо задаааєсах адаазатаєс 240 заззаєдаєа аасачзасддс дсадтатаєс сабазатата Єсадстатсос одасссватє 300 стостдасуа вазососасо таатасстої содассавао асоссоваса досто ає 360 адсаєтстаїс аодосодсає тЕїтовасто заадзазаєу атсосаттст тотодвосето 420 ассаатодас азсставттоа тасоадатсає дайзссадся стестадтас атееескав 480
Чохаосдаса дсадссутаз зааасутааї чогазсоаії статтаєсоя тобтсасосх 540 асзазассоає зівоссассс пбататодса тТасстозкоа ТтЕВоОовасса яздадчссєто бО0 заасасттатоа охаасттІс дастсотазт дата соассусадс асаттуєкоа 660 ачдсадсзуса стзатастяс сссовакУсс сзсаасасєта азогасзада зссуасссво 720 сафістаттс содссаваєд тосаатсссо сатесоосат асватссоаа аааттттвос тво аатоахтатса тоссостоса дстодаасої азаосаазас отасссятає адтссвассо 840 стасуєстас соадсватяа аодсасадоєє яаассудчаєс адасстотад саттосваЧе зо тадчуєсада ссдсассоєї зуЯтавасає сстісаКассс ждєзачаоЯї сааааєуасєс 950 дтссаацадо аєсобааату сдааадсдає стососсатєє аєтатазтад сассаєтова 1020 стшсдтатоа дсодатссода заїсвалаава ассадстктуа ядадуєдатад садову то стадсесата акавадчієдс ссадацтатс детасстато дісЯєавіад єдатасоссо 1140 ссосдтасат дтассаавує тазсаавстєї отосатїдда тбзазазаас дасузавсос 1200 таїазазатоа васта 1715 «2і05 74 «2112 1215
«й1йз ВМА «213» АгжІЖтсія! 5евиетсе «220» каг3» ветіттсіа! «4005 074 сотаєтосад сасатаєтає судсасеєсуї дуссутадса асассстуад сСадсссовах бо адсваввато аазааосаст дооссасааа аттаахтааст дддавадсяо ссотадсаде 120 сайїаостїїс тдадсааїстї зсакстуєвї аакдоєозас состіоастса сдазазадос 186 тЕттаттата ттсасадсса дасстасєстт єдстстсвай задааатєяа аадаавасасс 240 зазаасдата засаватаві усаосататєсї сасазаєтата ссадстаєсє зааєеєсдає 300 сЕЧусісасоа аайдсосасу тайтадссої содаосааау абосадазта тдоєстогає 360 аодсакттаєс звовотодсат тттстодасто задодааато ассосасітє тотоавсоко 470 ассаатдазс асстдасєтца тасддаєсат даадссаост сЄсстЕтуведсє ассессвоаакЕ зво
Чцесучедасо дгадссосяа зазассотазс ддтоодсодта статєтаттоє савеєсасутх 540 удсаазассяс атадссоїсс дсататодса стаїстоасда Єттодоавса Зазазоаєстяа 6вой азасоттосо ясоокестсЕ даєсєсоктаає датсстсдєсс кдассдсадє зсаєтеєсоу оо чзусадсаоса єтаатостас сстапавсосс сатадтаста дадаасааца ассдасссад 720 сачсіїатсс саастазасі тосааїсссо сатссадсаї агзакссоза ааассттвос 780 аатоататтіа бостуєтуса остодаасос заадсазаас отасссовоє аотісзоссо 340 стасусстус савусаатаа адсасадуєт азассадаєс адасстатао соссосадує. 900
Чопа єсада ссдсассост пудсядасаї тсаєатассс тусазуачуї двазаєдаєс 96О
ЧЕссзадада зісоЯсавзаєд созвадсвдає стосассяст аїсасдаєзо сассаєтада 1020 стасаєутта псдатссода застяаваза ассадстста задосдатад: сддтодесся 1о8о0 січе таса абаззоєсвс асадЯабвстаєє ссозадстаса ассасваєла тодтсакдесе 1140 ссасптдсат утассаваді тайсадсстт бтосассода сгааадазасє дасдадасоє. 1200 тагзаздато засто 1215 «вай» 78 «аМі» 861 «2125 ОМА «2135 дДежітгісів1 5едцепсе «220» «23» сагтітіста! «400». 75 тІтадссота дсстосакад сєхтастосяє сохсотедкс одссдтсеаєсо густа есде бо ссастоцаєс спдодсадассо сдссосачса сатаєтаєссо ясасссасод ссосадсаве 120 ассстйлуса дсссдаатад садааатодаа зайдссстоя вссосааааї саватадстовд 1850 даавосадсс дівосудеса тадсесссто адсаатстос ахстосясвза содєдвасто 740
ЧЕдаттсата ззааачасії тгтаттасаї: їтабїзассада сстаттссса серьсзодада зо чЧазаєтавад задатассяа заатоатава садатстодтас зодтасаєтта тазататасс 360 застасєсяє ассєдатксї Ччстдатодава адсосасута агадетеєта дадсааацах 420 дсайзатстато осстотатац сатттасєсад дагадсасеї ссозастуаа адаазатцчат 480 сасатіїста їодаосатдас сзаєтувасатє стуаєстцаєа стапдаесяасоя адссаостЕ 540 сстоадтасат ЕСТоЗКода с зві «10» 75 вії» 579 «гід» ОМА «213» А Тісіа!ї бедрепсе «20 п ку2а3» акті ттсівВ! «4005 76 ,
Здісаочіта ЗЕсассадсІ досааєстаєт одсаатєдакта ссзассоєся ссухсассос 50 свісаїсско тбасссеаєсс остодоїсто осацдЯатсаЯва стосадсаса татеассадес 20 асесоасудєс дсадслаєтає сссдадйсаче ссдзатадса зазатаваза адсестадує Іво сасазаатса атавстоаса азусауєсує адсочтсатия Ястстстозо саатестусає 240 стасосвата отоаастоої дасссаєдаа азадастссе аєтататтта тадссадасс зо татттссасе стсаодаваца аассазаова аатассааза астадтавасяа ааєцзотосад 350 тасакттстата забаїассая стактєсодат сспатстссоє соазсозааад сосасотаве 420 адстуїтаза дсазацатує адазтатоус стоасатадса ткстаєсадво соасакеттє 480
Заастозаза аазатоатсо саттїссого аособоаєса агазасатст дагтодатаєо 546 чатсатдаау ссадсстттЕт содсдсасєтт стадсдвдос 579 «іх «11» 8566 «2125 ОМА. «13» Аг тісіаї бедцепе «220» «ой3ж агтітісіа! жах и | І
ЗЧаводзасаче Ядчдасасуєда авітотаса саостуасес с дсасодсада соаатстдаах 5о дсасадіато васатсЯтсо ссассасєсятє соадсяссасс атастоаєсЯя ссосастадає 120 стодсароєс охогтЯсаас асататсасєс зосасесуєод ассятабсва бассстдадс 180 адсссдпата дсававасуа аазадсасто подїсоєлава ссваатадсту доааадсяде 240 сасзосааєс асадстстст дадсватсто саєстоусогта асадсузасю ддосдастсає з
Чавазвадуєї тісаттатаї Єбаїтассад асстаєтттс остстсааоз адабатсттвай зво чазчзасасся зазагузіаа зсаяасзота сазтатасск асазатасає сзоствіссо 2 часссдаєсс тустдакєуаа задсасасчу длатадесастх чдадсааадя тусадаатає 4850 частогата дсаєссаїса одУєдосаєс гітодадстуа аабаазаєда сосайєсттї 540 стгассатда ссаасудваса сстдассоаат асдоаєсаста авдссадетт тсетодкаса во тсЕстоокодй осстодессс дсусодсадс догадсаусс аєсатсаєса тсасєсатадс 5БО засЧох 666 «10 В «21 1116 «212» ОМА й «2135 АРтітісіа! зедцепсе «220» : «2235 актітістіаї «А» ув сетттосав сасататтає сдосасссЯє доссутазоса атассстого садсссозає бо адсадлавато дазалпосасі додісосава аїсзяатбацсї дадзааусво ссЯтаосод 120 сатадйстсіс тдадсзатеє осасстоасої затоакозасє тоддхоаесса тзазаавоос 180
Ес таєтаса гсїаТадсса дасстаєттї састтЕсаду аадачасєїза вазадатасс 240 азапатдата засазасуос псадсасасу тасвавтата ссадстатсс ддасссдакт зпа стастдатоад аазососасео тавівоастає їддзоусаазо аїтасадаата стадЕсКохах 350 аусастттаєс адодтадсаїт стесдадесо азадавзаєд аксусаєстє тостадсуєо ща ассаасаявзає аїстсдатсда татоудаєсат сазоассацст іт ссодтос аттессуче 450 одсоатовса зсодтдоєсс осєудатсто осадотсосо сесутссоєос сеутосасоє 540 саачаадата дсаадтссада аєсодостдза досстодєсас дтдатсааксс дсассса 6О0 ссостедотс аєскдастсос дадсосадст адстдстодес тесотоваєс дадхстадса обо дссасассод садсассдас астдстуєсьі дезосатаєс тутатосаєс дассусаєся 120 сетасачіта ссосадсасі саусадтвас састдоссто дтадфіссося тадїсотесо 780 свтодесстс вессодатад сссусадссоя адсстоаЗсс соувсадзася усакссоваа 84о здсссеосас сузососасс оодсосасто осацосочЕЄ стасасадас адсаєсоЧчайх 900 астсастЧаКЯ зададоааса асодосасає вдадатсочта сасаастасо зсосасавса зва дахтозістов атасасадта сузасуєсої сатсвдадаго засзусачсо ссавсеєсса 1020 засссусодс дтасессата сватссдаєє зсодусстас сдссуєтасс тсасудєсає 1089 соутдсаєсву авасодаасс даатслазуая басско 1116 «1йх 79 «ії» 1478 «2125 ЮА «2135 Артітісєта! бедиепсе кий» «деЗю акхіжьстіа! «4800х 79 . Й сЯгостосав сасаєсаєтає сподсасссЯє дЧісотадса атасссідав садсссоває 6О зодсааавахоу задвадсастї опдоссосава агсватадст додааддсад ссасавсоди 1294 сасаодсттєтс тодаусаатсс дсатстясос засодтозає сдасуасєсса тозазавоудс 1850
ЖЖЕсахєсата гттаєдосса дасстатттс сустїссаао адозазісаз адазаатасс 280 адааатдата ассадасопс ослоасатаєс тагаватата ссаостатсс оратссдатї 300 стасстдатоа авадсосасуо гаатадстує тададсаазо атоасадаата тодестотах 360 доасакттатс яоЧчатвдсат сектозаста аалоувзазатЯ абсосатеєс тагвадсато 429 ассаатадває атсстоуаттоа татодатсає пазоссадст тт тодкас актесеооиу 480 чутоасудта зсадссухаа аваасатоса аусадтоуєс суозадаєод тадсстадса 54 асастдассо сасаєсачоє атодссаїтсто ссадссодаза сстттасссЯ єсаєсуєсава БОЮ сстІсутЯаоІї усоааясваост одвасавтої дасстатссзЯ сссадсяєст даскосасто 56БО гаєствоасао сасдєстого стодааіслу дісдассадо статтіудсааз хосастодса 720 адіссддаата асадедахоа сстдоЧЕдаа дсаваєєсяво давохссоца асадосасоує 780 стдчсастца ссстдвсадс айсадазадче даасасттто стсдесадоя сассавеааї 840 датдзадссЯа уГасадсава сосбісєсдоса чатоасодота чо адкад тоасасвтасе 500 сотсаздазу усадсаотсс ддааскодсс дазадістод сасоєзасод тссасдтоса 960 кттссуства зссосссові Ессовесуса зссзоссЧуто ЗсстосЯсода ассоЧатсте 1020 зсадссасас сддсадсасс дасастдєта сетосавосає вістуєуаєує ассвассоса ТоБо ссдсстдсвао хтассосаде астодоваче адесеєсоЯс стадтооссс дсотачесде 1140 ссдсотоЧчис сососссоЧа годкссосяЯ ссоадіссда дсстудсава асадсаєсто 1200 зазачстссто тассдацсяс ассудасаса стодсадоаса осссдасаса досадсаєсе 1260 чесасссота осодвадааца асадіодяса сосдазатєто дтосасвост одсохсотата 1320 опсадаєдаєс тавасусаса обатодласує суссуєсазо аадзасадса осохсаседе ї3850 ссдаоссесЯх оусакусєкеЕ обасавсста астасадаєс состяссосе дестсаваодє 1440 сагсукасас садаваєтоаа ассдаатааз датозасса 1479 «210» 80
ШЕ оо «213» РЕ ТіЄТа! 5едіевсе ком «2235 сагтатіста «430 80 дсавсіссоя їтіосасадаа ассосотсає сотсоссосс десоссотає тостсвкссЯ 60 студассто9ч садоєсусає сдсаасасак астассядса сосотпассу тайсватасс 120 «тозусадсс сдаасадсав аадзтдаааая дссстдаЧЕС дсадаватєсаа бадетодудва 1850 восвассота дсодоїсатай стетстдаає затетасаюнс тасохаятоу гавастодто 20 зтїсаїдаза азадсстїса ставаєстає зоссадаєст асттссустї ссаддавуза з агсаайаузаа асассаааза сЧасавзасва аєводхасауу асасстаєва агасассаде 350 чахтссвоатс сдатсссаст дасазааайс зсасуєаата остаєстодає садачатоса 420 чдзататацес сатазтадсаї Тбассзаоуї доасакі сто аастуаадоа ааясуатсдс 480 аттеттосба асосдассай тдаасатссу віїЗатакду аїсасоузавс садсесстее о дасосатстс сдасоаде 558 «БІО В 2115 697 «їй» МА «їз» АРІЯ сТаї бедуепсе а «ее» агтітзстаї «4005 81 шк | Що соЯхасачатс сосаотсесс дастадасає статтасяєс одсстастоса єсдестосха бо сасастастс дЕссЯстода тстоасао9ї сесостосад сасасаттас садсасосує 120 дассоседса яасассстдаа сядсссоаат адсзазаата далазосаст дадесусава 180 агсаатадсті пдддлавусау сбусайсуаЄ саєадстевс тоадсявесю дсасстасує 240 засускогас тосібаєтсса тозаааачис Стає таїта тстатавзсса васстатесь 300 соссстсало азоддаттая адйвавасасс ваваатузта азсааатооі дсадтасайи 350 тасаватата ссайстатсс оззасссвакт стасєоактуа заздсосася саатвоУстяє 420 хОдадсвача зіодсадзаса хадсстастає аосатссатс зодоксадсає стєтсодаасто 80 дайдазаата ассосассЕк Тассвасоцоу ассазесуаасє асстуаєсца табсозаєсає 540 азоссадст їттгтодсЯс астісстодта пдессоадтвс сесоатоатад содтадесвос ОВ саїсатсатс ахсаєсаєза сацсод: 627 «105 82 «в4іїх 8 «21йю ОМА «2135 АРТІТісівд! Зедцепсе «го ше «23 вктітіста «400 82 сотаттосад сасаєсаттас содсасссує даєсуутїайса атассстоао сабесссдаат 5О засавадзаїєо азазазцсаст доддЕСдєваа аттдатачст чадзаавосає седтадсоде 120 сагадстттс тоадсватст всахстосЯях ааходсоває тодітдатскса сезазавочде 1850
Есттатєтата сстатаосса дасстаттє сусссєсзад аздадзаєтаа здааватаєс 240 аазяатсзса засадатаєє осзоасасаєс татзаатата ссадстатсс одясссаас 300 стостдасєда авадсусасо таатачстоаї тоуадсазаз аїудсачаата доста тає 360 адсатттатс асодтчасає хстсоааста давдазаато ассоосаєтстх касазасота а2о ассаатуаає асстдаєтаа татдоаяксаї узадссадсі ЕТ ЕродЧувас асктстуцих 48
Чаєбухавста асузкссасх пдокстоадса похсосоаєсте гтсоссадв тсодствасс ЗАО
Тс сСваадаза засабастас саяасасссЯаї басосодас чдсодатавтає Тасдадсасс 500 звасстаттсс атсосаазоа їтазааатасєс їттасттата дссасессада ассдаєсава БО зсаастсоїа аадотастатї судссадсаад затабастда ссасдавсоа аскстаїско га задсдвісаса асуттассяу ссуєосуєує ааятасааас сдадавааад сассяйсава 78а ст тасахда сстасдазай ссадасяєсо встсатєкста скота гтачстої 837 х2105 83. «її» 822 «вій ОМА. «213» АРЕіТтіста! 5водцепсе «ад «вії» актів «00» В сасогтасСад сасататєтає соусасеосує ддесусадся аїтассстдау садсссвзавї 6о0 а9дсваааата аазазосасі пдбЯаїсосаза атсаатачстї адозазасля ссадсвасоде 120 сахбадстскс тдаусаатст Ядсатстосує аатоуїдазас содсдакєтса сдааазавдас 450 г таєтата гітасзаєса ЗасствттЄ состітсяай дадааастяа адазаатаєє 240 зазааїтцата авсадчатадс дсадсатаєс татїаватата ссавстатєс дпсаєссдати 390) стестдаєцда авадсосасу саатадстої єдудаосавад абосачааса сазустотає 350 зосаїтїтаєс адодіпосат їсгсоваєто аазодзавато аїсусаєіттєє тогозосога 420 ассваєдаас зїстуасєтва сакддаєсат даадйссадст тесстоЧкос асесстоачес 45о чаєоокачко отазусвоєво тадсодсадс садоаттї99с їбассттїса дазаваасає 5-0 агтассаата сесосдзатат здаїхосоаї затаїсаїда дсассзасст одсктсаєтос во0й аадсатазая асассттсає їтасадесує ссодааєсод ттааадсаає стосазадчає ббо астассодєса усвзаазатої ЯсЕдасєсася адсочааєсст аїстуаоуєва сувсваєуєе 720 ассадссожс сотптазата тазяствадаа зададсаєся атацзастіто сосдаєстоє 78о0 чзаззаєсачяа сассодчетса сет єкУоЄ дстодсадс ве 822 «А» ва «й1їх 591 «1 ОМА й «ІЗ» АТІТісіяї беднейнсе «22йх «223» агтітіста! «А0ах 84
Четсатсуєу кестодеєтає сстосясаєс согсотасає двідоессвсє дсосокаєсдє БО сагсасокс дссатсоксЯа состасссає себстодцатс тЗудсаддєся сустасадса 120 сатастассо ссасссокоз ксоїлоасааї ассостозаса дсссоватао сававатува 180 азадєсстод оїсоусвядас таатадстод дааацсадсс осзосоддеса тадсстесто 240 засазтстис атстосастаа соддсоаасто бдедаттсато азазадастя бтаттатат 300
Єатадссада сстатєітїсо сЕсЕсавоза даваїтавао задастассаа азаєуатааая 360 саадасодвечс адтятатста тазасатасєс адстаєссод асссдасест удстодатоава 420 аюжасазсата атзостаєто оацусааацаї зсадватато осссттатач сажстатсад 80 пЧусадсастк тгтоласєдая здааавідатє сосатттєсо тазусоатдає саатодласає 540 стаассцчата хадаєсаєца адссадсттт ксхастасвх єства х з91 «2105 85 «с11ж 567 «їз СПА хИ135 Агжітісіа! зедцелсе «220» но «223» вагкіжіста! «500» 55 ссїсоКтїта соддатассто здазовссту загсоссоєс ддсдєсоєсЯя всЯхсеває 60 дЕКСаТИСсЯсС Кодасстоас зуотстЯ пдсачсасата гтассподсас сс есох 120 засаатассс тдадсадссс даатадсаза засодааазад састоуахса саазваєтаат 150 аздстдодаза дсасссоєад союєсатавс ТЕтстдадса атстосатсо дсоєзатаде 240 чаастдатсца сісагдзааза адасттсває Багатєсбата дссадаєста сет сас 300 садлазбаая ссааадвала тассавазах пасааасава кого сацта сатстстасвзай 360 татассадсї ахссоуаєсс ватїстєстосто ахдаваачсо сасодєзатад статтодаде 420 авадаєтосад аатсатодтст статадсате тассаодосо осасттєєда астоаадддва 480 аасзаєсдса ст косвад сасвассаає бдаасаєстда Єтпаєсатода ссатазачес 540 зустткееєто аєосатстст адсто9Е 567 «2105 86 «211» 5853 «й12ю ОМА «2135 дрсРтісСтТаї зедденсе «Фр шй «т23» актів єтіа!ї «400» б тхдтазвазас ататтасєода зааааттсзо дохсосудто аївакдаєда ссосеуксад 50 сефсассуає вісотаєтоа: тсоєссаста чосстпдсад сісутаткасє васасатате 120 ассоддсассс ссвдтсусва савтасссто адсадсссоЗ ятайсаазаз тдаааааоса 180 стддчксоса аааїїаатаєю ствдоааавас аЯдссятадсо дісатадстк гстазоасаах 2 стосатстос атзатадтда астодкдатх сатоваадад оссттттаста гасстатаос 300 садасстатт єссастстса уЗазозааїт зазозавата ссзазнасаа саазсазата 360 цівсаптаса кстасазата тассацстат ссвудатєсоа ттстдстуає дзвазоасоса 420 сатласадсх Зстададсза ачатасадаа татастстає атадсаєтта тсавочасдас 480 аттсттовас тдазацаааа туаєсоусату сстотдадсо соассазсда асатстодаєх 540 датасуцдаєс зЕдавдссад ст Єсраді асатесстоо Код 585 «й10х 87 «211» 654 кгїйх БМА. жкй1ї3» АРТІітістаВ Зедцепсе «дух шк «ййа» агтітісіа! «4005 87 дсачссссув їтосасадаа ассосуєсаї соссассусс десоєсвсах гокссатесх БО стадасствоа саваєсосає Госвосасає аїтасспаса сссутодссоа садсвакаєс 120 стчадсацсс соватаусаа азакодвайаз десстаЗуєс усааааєстай садстадова 180 аасачссута дсастсатав сіттсєтовас аагстудсатс тасоєлатоу ссзастодта 240 агїсатдава засостттїа єтататттає додссвдасстї аєсетсастс єсадпавоуга з00 аттазвадааа абассазаза їспасаазасаз атоукосаує атасстатаа агасассаде 350 тахтесудатс сдаттстаст дасдаваачс дсасатаата дстуттодзо сдаздаатуєса 420 павтатоадес Тогатаосат гтаєсадоаді очсаєсіїса застдааадца азасдвісас 480 акттткЗтоз осоіоассва созасатста зЕтоОзсатоз ассатозаєс садсттссх за0
Ччегасасвєс тоуотідеїсс стоудесто дсгудесЧва таЧеесоЯсся осассоксос 0 сухтсоссдсє сдасастоса єстадсатеї встодкоактаЯ заатадчасаї дЗадс 6554 «2105 ВВ. «21» 618 хід» ОНА «213» АРТ тТісіаВ 5едпепсе «ие» «ВЗ» актжіРісіаї «3005 88 сутассосад сасаїтатсає судсасссаї 99їсасазса асассстуза садсссуаах 60 заасаазазту ааазайсвст пдатсодсава аттаасваЯсс доддазасзу ссасвосаве 120 сатассеЕтїс Бувосадтсї одсатстосаї засвасузає саасдаттса Созавазучс 180 їЕсСтаєтата тЕтасадсса чаєстаттсє сустсссаау аадаааєтаа адаачасаєс «40 заадатцаса сасазатооєс одсвасатату тасзаатата ссадстатсс ддатесдаєтє 00 стеассдаєчая зазадсосаса Сзаїацстаї гсодадсзаай зсосадаата одустоках о адсахтстаїхс зодвдоатадсаїт тсстддаста звадазлаєу аєсосаєстє тотоаясуєд га ассаасдаас аїстодаттода татодатсах сазоссваст сітєкодтос аїжестоаіє 480 аЗзсоцідатЯ освасдоссо содссасосі дуссоагесає тодвсстдас кодсоссаох з40
ЯсседакоасЯ отасадаєно сЯяссватосу часодсодає ссочедотас збе во суссассоїс дЕсЧдасох 518
«0» ВЗ «2115 867 «2125 ОМА «213» АикіТієтаї 5едцепсе «220» «223» акхіттстаї «400» 89 соугдісасац сасатаєтає судсасссої доссотазса асасссєвад євоєссаває БО ацдсазазатіа даваадсаст падтсосада атїтзатадсу доададаоасва ссасзасоаиї 120 сатачдсткїє тудацдсваєсії зсаїстсоЯї авідасоавас соухаастса тЗвааавадс 180 тЕтжактата сттатаодсса часстатттт состттсадо зздазастаа взудаазасасе 240 зааазедата засаазіоддці усадтатаєї гасааасата ссадетавксс ддаєссдаєє 360 стостдатча азацсосасо каатадстос тпдадсаадо атасаозата сепйксстотаї 360 ашжатетатс адавтодсат тессдавств азадаааате ассосатсст тотовосаєо зга ассаакодає аїстватєтда таєсодатсаїт дайоссаваст тесксвосас акті стадЕх 480
Чедакооса дсаосоуса9 ссутааазаа собаєдаєсса стадссяаоса адаатстоає 540 сусассоуєс тассодатєст дадсвусасо ассдаадазо аасазаттоас стасуєвата «о садатоадсс тосадузтос здаасєстоддї сводсадаза дсосадатає тоахдсавуєс Бо засоасзаєодв атассацсуд ассоддсазай азадзадаєсц агтасдаєає татесаддат 7? ссдодзассес сосададсої єстодааваї стассдазто ксуаїссваа таасдввася 780 астсбізато саатооотац сстодсаадє саадсааєса аазасоодсах зазадатааа 540 звададозад асааадааца адатста 867 «105 90 «»1із 549
Зв» Аеті тіста зеднепсе «2305 «даЗ» агтітісів) «005 90 дітасвавтсє спсадосада адоссаостЯ сосостастс дессодствуя сстдодсавох во ссадєвдсдто стосСадсаса таттассоддс асссосдаєє дгзодсаатає сстдадсадс 170 седзасвоЯса зазасдазай адссссодає саглазатта зсачстдада задсауесоє 180 водсодссаса дес стдад савістосає ссдсестазато зсоааастояс дасссакодга 240 азадасестї абсасасіса бадссадаєс тасттїсасї їїсадоаада аассззачаа 390 затассвади атбдтаваса застодтдсло татаєстата засатаєсац стаєсссодах за ссдаттстас суакогазад сясасотавї аостестаса дсазадатос сазасакцчає 420 стотаєвося сттаєсаддо кЯдсаскес даастоааау заваїдатєсо саєссєтеоо 48а адсутдасса атузасєатст датсдатато даїсвтсадо сезостттє содсосаст 540 сто оЧЕ 549
«210 91 «г1ї» 537 «2125 ОМА «2135 Ает1РЕстТа! бзецдцепсе «вод» | ще же» сагтітієта! «005 91 ствосагато укассовася сота сок ссЗссоадоєс содсадатсє дсвасуєае 5о дсадсасата стассудсає ссусоссоєЄ вдсаяатаєсс сдадсвоссс уватадсава 120 закдазазад ссстрацдіся таваастзак застодаазаа дсзассасад садесатаве 180
І Естдадса асстосатєст дсдсзасєддс даасєдотов ЄсСсатдаваа задстеєгах 240 жатакстатстяа дссадаєста тЕссОасттє сасдазовад їбадазааза сассадаваєх з90
Часааасаза тЧатосадта таїстатаза статассауст асссоваєсс дасестоєста 360 асдавазасоя сасуєаатад сстостадаас азачатассо засахоцест дсасазсасє «га тахсаодоато осатісттоа астовайадяа загозєсоса Єскісосдвао согоассаах 455 узасаїстда стоатсзсооа ссагдзадсс застосо окосатттст дасєсадх УЗ «М 92 «211» 550 хаї2» ОМА «135 АгтіТтісіз! 5едчепсе «2205 шо «223» савтітісів! «4005 95 татессовосо азодсстотоа ссесаїтоєх суусссастоо асстдасада хссосавсоє 60 дстосадсас ататтасєсяд сасєссутацеЕ сутадсваїта сестовосво сссдзатадс 120 азазасдааа задссстода тсусаазаєт затапстоЧа зазусаєесо тадсвоєсах 180 вастсЕстаа осавсстаса сстасусазі: удсоовастоад Каса двазачуєтті 240 жатїтататтт атадссводає стахтттсос тессзадвад зааставада азатассава з00 аатуатстааасє ааатодтаса укатасстає аватасаєса дстатссада єссчасеста 360 стдаєдааза осасасосаа гас адсазадато ссодататоч Еставбатаце БУ) аскттатсауа дЕіуосассто созастодава даваатозсс дсасттгоЄ дадсдкдасс 480 ватоавасакс трастуатат доазссасоза дссадсеетт куоуєосатє тека За «2305 93 «21І» 459 «1йх ВАТ Я «213» дітітісів! зедчейсе «Ох у ; «гез» Ти5іов рготеїй «4005 93 с1у суб Аїа аа Аїа Суб Аїа Аза Суб тиго5ег бів 10 Те от1іе б5ег
Її 5 Іо 15 тигоуа! бій аІй ву біпобів Або тіе бегоРго їецомаї Агд си Аго о 25 зо і
Є1у вго біп дге Уа! Аїа діа ні їтіє твг о б1у Тиг Аго су Аг бес 35 40 45
А ТТГ бен его обег вро Ап о бвб оку АБИ бій рух Аа Ге) оту Аго 50 55 | бо іу5 їТе дбп бек отгробіш бек чек Агу бег о біу нія 5ег Ре ів 5ек 65 7о 75 ко
Азй рем Ні Ге Ака АЗИ сі 10 їеу маї 11е ні бій 1у5 оту Ре 85 90 95 туго туп ї11є туго Зак бій тег тує Рйе дка ве сій бій сів ї1е бух 100 105 і сі Ахи ТВгоїуя Ап АБО уз сів Мебє маї біп туго т1іе тук уз туг 120 125
Тиг обег тує орго Ар ого ТіЄ Геу гей Меб ух зег Аїй Агу А5а бек 1350 135 140 і сСув Тгр бек губ АвроАТа бів туго бім сец тук беб тЗ1е тує біп б1у 145 150 155 160 сіу їтТе не сій івеи сСує 1 Ави АБО па Її РНе ма! 5еє узі тіг 155 170 175
Ахп бі нів цем хіе д5р Меї Ар ніх сі Аіа зег о РБе Рне б1у Аа 180 155 190
Ре бен уаї бі біу Є1у біу зек Аїа хек біу Суб біу Ркго зів Ага 195 200: 205 буз бує Аго Аіа Бек біу сі рго віч біу с1у бег бе Аїа діа Сец г 215 220
Твг о АТа нія сіл Аза сух нія гей РРО о вец бу ТВк РНе ТАг о дго Ні 225 23а 235 гАЙ
Ага бій оРРо Аго б1у Тгробів бій се обі біп суз 61у тує вро ма 245 250 255
Ф1й АРЯ їец маї Азтаоїец тує сец Аїа Аа Аго це зе Тер Аби сто 250 265 270
Уа Ар бій Маї тів Ага Аби Аїд ів АТа бегорго біу бег 61у о1у 275 280 285
Ар сен ім б Аза ї1е Ага ої бій Рго а бій Аза Аго бей АТа 290 235 300
Меп тег оїву АТа АТа Аїд сіб беб бін АгЯ Ре уд! ага біб біу твг 305 з10 315 320 сіу АБИ сіу сіу біу б1у б5ег о сіу сту сіу бек Гсує бвіц Тиг Аа АТ й 325 330 335
АТа бух Ре бій Ак біп ні Меж АЗр 5ег зе твг о5ек діз діа 5ег 340 345 350 вес 5ег дп тТуг Суз дей сій Меї Ммеб бує зак ого д5п іо тТАиг Су 355 350 365
Ар щ5а сСуз Су вге маї ди Те Ре уаї ні5 бі чек о геу АТа до
ТІЛ 3/5 380 чаї віп Аіа Уаї Су зе" бів руб Ави Уа! АТа Суз Гуз ди бу іп 385 390 355 400 таг Аби Суб туго бій бек тук бек таб Мет 5ет ті тс Ар Су Аго 405 410 415 сід Тис осіу баепозеак іуб5 Туг Рго Ап Суб АТа Тук о Гуз Тк тйгооі1вй 420 425 430
Аїа дзп о буз нія ї18 Х1е маї Атїа сух їй бу АБИ РКО Тук ма1ї еко ве. 445
Уаї Ні РНе Ар Аій бек узі рух Аа б1М Це 450 455 «їй» 94 «іх 213 «12» РТ «213» АгЖітісСтіаї бедцейсе «2 «фа3У Ти5Топ рготеїй «4005 94
Рене баг Аг 5ек ів Ні бер Гео Сей Або дКЯа АК Аг Ага АРО АгГО і 5 10 15 го Маї Уаї Аг Рго бе біу їез АТа біу ТВгояег 01 бій Тве Те
Бек Тиг ма? То сб фу бій біп А5п їі 5егобко гей маї дгу ої дея сіу вро бій аго ма! Аа Аа нів її ТР осіу Те Акесо1у АгО 50 55 бо чего ап Тит ге бек чек рго АБ Зег уз ди сій 5 АТа сей о1у 65 70 75 86
Аква суб 112 дей бек тгробій 5егобег Аго 5ег б1у ні 5ег РНе Геи 85 90 95 зе деп іеу нія без Агу Ап о сіу бін без ома! т1Те Ні5 би суз О1У 100 305 ії10
РНе Тук Тук ї1Те Туг зек бій Твг тує Рбе Агд вне біп сш сти її2 115 120 125
Вуз бі АЙ ТВгоцує Ап дв губ біп Меб ма! біп туг т1е Туг бух 130 135 140
Тут ТВг обек туго Рго др о Рго І1е 12 іеи Мет су Бек АТа Аг Ази 145 150 155 169 б5ег Суб тгр о бег цу АБО Аїа сій туго біу бе туго бек І11Те тТуг бій 165 170 175 сіу е1у І11е РіПе би цей бух їм А5п АБроАго ї1е вп уаї бег ма!
ТВО 185 КІ;
Твгодбп біц ні бен тіе Азро мес АБр нів сій АТа бек Рпе рРНе сту 195 200 205
АТа Ре ьви ма! с1У 210 «2і0» 95 «гії» 204 «їй РТ. ши «2135 АРТЗТісіа! Зедцейсе гл НИ «кй3»м їМи5лоп о рготеївй «4005 93 цей бег тигоОАТа Аз А5о Мех сій с1у Уаї ма! тйг А5в біу мес АТЛа і 5 о 15 ек біу ївп др гу Азротук ев ви Рго А5р Ар РгО еу біу Бей 2 і 30
А1іа біу Ага Уа! Маї АгРуд сії Агу біу Рго біп Аго Ма1 АТа діа Ні5 тів ТВе остТу Тк дгя б1у Агу бег дей Те рен 5ег бар о рго АБп 5ег 50 55 БО їуз дев 10 уз АТа їв б1у ага ув 112 дзй 5ееоТеробімй обег бек 65 і 79 75 о
Ага 5ег біу Ні 5ег бе їв бег дзпобеу Ні це Адку Азп б1у бів 85 90 95 іеи маї їТе нів бЇш буз біу ре тТуг тук лі тує б5еб сій тйготуг 00 105 мо
Рне Аг Бе біп бій сіш 716 уз 61 Ап ТНК огуз Ап Ахрогув сів 115 120 125
Мех Уа! біп тут ті туго Цує Туг Тк бек Тук Рго д5р Рго І1їе сСец | 135 140 без Меє ух бек Аїа Аго деп оЗек Суз Тр Зек уз ав дія сім туг 145 150 155 160 сіу бен Туг бег ІТе Туг біп сіу оту ті Ре бІм цей Бу Су Авп 16565 170 175 авро Ага ІТ РКе Уа! Зак оуаї тт Ап бій ні зей тта а5ромежх Ар 150 185 що
Ні бів діа бек Ре бпе біу Аза Ре еп маії бу 195 200 «2105 95 «11» 205 «їй КТ. ще «2135 детібтсіа! 5ецицєпсе «20» «2235 Тивіой ргоїтаїй «4005 96 біп агу ма! Аіа Аа ні ІТе тв обіу тс о Агуу оту Агу 5ег ай ТАК 1 5 10 15 їец бег бек Рго депобек бух Ап осів буз Аа бен бі ага Був жіє
Акп б5ег Тер бів 5ег б5ег дго ес о сіу нія бег Ре сви бак одєп ви
Ні ей вагу Ап с1у біб Сем ма! їТе Ні бів їу5 сі впе тує тує 35 Бо ї1іе туг бек бій ТВготує впе о Аго Ре бій бів бів їТе бу5 бід АБ 65 7а 75 Бо
Те груз АБп авр. ух сбТпоМесохуа1ї біп Тут Же Туг буз Туг ТНг о бег
В! 90 95
Туг Рго АЗр о Рго 116 без еп МеєЄ уз бек А1з Ага Ап о бег су Тер 100 т105: ї10 бЗег гу др діз бій туго біу сей тує бег її тує біп біу сіу хіє 115 і ла 125
Ре ої гей їує 010 Ап Ар оага Т1е ве уаї Зег о маї Таб дев Є 130 135 140
Ні рез тів Або Ме Ар ні бій Аїа зег вве Ре 51у АТа Ре Кей 145 150 125 150
Уаї б1іу бім діу б1у чеаг Агд Су5 Су Ага маї Суб АгЯ Сен о 5еє ТАг 165 170 175
Аіа Аїа Ар Мет сій біу ма! маї Тк А5р о біу Меї Аїя 5ег о с1у ке 180 185 130
АБр вуз дер туго ів бує Рго Абр Азр Гу дер аїц грец. 195 290 205. ким» 97 «іїх 207 «210» РЕ. ! «2135 АРТі1ТІЄТаї 5едиепсе «20» «РаЗУ Твіст ргаохеїнй «00» В біп аАго Маї Аа АТа Ні ї11е тТагобіу тік Ага біх Ага баг Ап оте 1 5 10 15
Бей 5ег б5ег го Ав 5ег о вБу5 АЗп осі бує Аїа ев біу Аго Су Те 55 30
Ап Бек Ткр о б1у бек бзег Аго Зег сіу Ні 5ег Ре Гец бег Абп ге
Ай 45 нія Бек Аг АБИ Біу ої ви уд! ї1е нів біз бух піу яйе тур тує
Бо
І1е тук его ств типг туго РНе Аг ве сої сі бін се руб оїЇц Ай 55 і) 75 о
Твг вуз А5п дер уз біп Меж уд! сій туго те туп був тук тиг 5ег 5У зо 35
ТУР Рго А5р о РгОо ї1в рей іви Меї бух ек АТа Агуд дБ Бек Суб того 100 15 ла его губ Ар АТа оїи Туг бі Гец туг Зег їТ1е тук сій бік сту Ше 115 120 125
РНе бі Бе суб 16 Ап Ар Ага Т1е Ре маї бек уд! Те Ази бів 130 щ35 140
Ні бец ліве Азромеї Ахр Ні б1ц. АТа бег Рпе Ре сІУ Аїд Ре Дей 145 1590 ї155 160.
Ууаї біу 51у сту сіу бек 01у біу сіу Рго ге біу їец Аїд О1Уу Аго 165 170 175
УВІ Маї Ага цец 5ек тк о АЇа Аїд Ар оМеє сіп біу мМаї ма! ТЕР Азр
ІВО 185 мо
О1у мет АТа бак сту семи Азр Суб Авротуг тей уз Рго Ар АБО 195 200 205 «2Ад» 95 «і» 397 «-212» вит «2132 АгІїгісіа! бедуепсе р ЗИ «223» Ти5іоВ ргобеїй «4005 95 боїв Ага ма! Аїа Аїа Ні ІТе Те біу тг ага б1у Агае зег А5п тТИе 1 5 юю 15 сей чего бак Рга Аби баб огух Ап ст уз АТа гео сіу йга Гуз їїе 5 зо
Ав вег Терор обі беб заг дра бек оту Ні Зег РМНе гей бек деп геу
Ні бен Аго Ап біу бТ6 це ма! тІе мі ві бух біу Ре Туго туг шк; 55 | БО те тук бег сбІй тие тук Ре Ага Ре бів ст біс т11е губ би деп 65 70 75 во
Ткгору5 деп др рує сій меж уаї бій туг т1іестугт ру5 Туко тик 5ег 85 90 95
Тут рго дяр Рго Те Сен Сеч Ме іу5 5Зег АТа Ага Ачи Зег о сСуз Тр 100 05 мо век туз дер АТа м тує сім беш тує беб т1е тук бій 61У ту т1е 115 120 1955
Рне сій цей уз сїй д5п Ар оАгО І1е бе ма! бЗег ма! тагоАбп оц 130 135 140 нт Гез жіе Ар Мет Ар ні сіш Аїда Зек РНе РМКе біу АТа пе беу 145 150 155 160
Уа! 61 аіу сі біу заг біу ЄТу біу Рго ей сту Бей АТа о1у Ага 165 то 175
Уві Уаї дка мет реп дко Цує вес Аїд Аїа Маі бек обец Ген Баг вец
І18о 185 150 сей б5ег діа Рго бе бей АТа АТа сій сСує бег Уа! дер 116 1 ЛУ 195 290 205
Ап Абросіп Мет біп Ре ав Тв Аби А1а ї1е Таб уді А5р бух 5ес 210 715 220
Суз ух сій вне тйг маї Ап оїей баг ніє Рго б1у АбБп ей РгОо бух 225 230 235 240
Азп омаї Меї сіу Ні дп Тгроуд! їенобег тирг Аїа АЇїа йвр Меї сій 245 250 255 біу ма! жаї Тит Ар оЄїу Ме АТа бег бу Ге А5р о вух др Туг веуц 250 265 270
Муз Рго Ар АЗо 5егодго маї 11Іе Аїд ні Тс цу ему т1е б1у 5ег и 280 285 о1у січ губ Або бегоуа! ТПеоРВе АБр Ма! 5ег (ув вец уз 10 оту 290 295 300 бів бій тук Ме РНе вйе с сСує Тк РПа Рго с1у Ні 5ег Аїа беу Мех 305 зій 315 320 уз б1У Тв Бен тк ів Гу 325 «ха10х 99 «211» 193 «2125 РТ «213» Агті1тістаї 5едувепсе «во , «й»3» Жувіойп рготеїп «4005 99
АТа маї Рг ІТе діа ой уз РКО АгО АД Ага АгОо Агу Ага ака АгО ї 5 10 їх
Ма! Уа!ї дга рРго їей біу без Аза біу уаії Аго бій дго б1у го сій
Ага маії АтТа Аа нів І1е тйг о сіу тнг Аго с1у Ага бек дей тнг гей і 35 «й і 45
Чег бег вро Ап обег обу Ач бій Суб АТа ів с1у Аго бух Ії1Те Ап 50 55 50
Зес тер о бІш его чего ако заг сіу Ні5 Бер бле бе зег дей бец Ні 55 70 7 50 ей Ага АХА Я1Уу от бе уаі тіе ні бій су б1у вне тук тук ІТе 85 90 95
Туг баг осів Таг оТуг бе Ага вве біп сі о1м ї11е дуб с Авпо Те 100 105 110 ув Ап Ар о гує віп мет маї сій тує їТе тут ру5 Тук ТК беє тує 115 170 125
Рко дер Рго її ке їв Меї Суз бег Аїа Агу Ап оЗег бу5 Тгробег 130 135 140 їу5 Ар Аа біб туго сіу їец туго б5его тів тук бій с1у Я1Уу їТе вве 145 150 155 160 сіш їеи їує 010 А5п о Аєр Агу ї1Те Рпе Уа! бег уа! ТВроАБа біШ нів 165 170 175 рем ті Ар о Мех Ар нія біз АТа 5ег Ре Ре біу дія РНе веу ма! 180 185 150 су «1025 100 киїїх 291 «2125 вВТ. «2135 АРЖіТТстаї зедцепсе «2205 «а3З» Ти5іоп ргоєеїй к4аб00» 00
Аїа Уа! Рго тів АТа бій ух РКО АКО АгО АгО АгО АгОо АгО АКо го 1 5 40 15 уатї ма! Ага Рго цец біу це да біу біу сСув АТа АЇз АТа сут АТа 20 25 за
АТа сСуз тигобег сш СТИ тТвг оте 5ег тк Уа! стй би губ бїв бій 35
Авп 112 зегорго гей уді АКкОо бів ага сіу Рго біб Аго Су Аа Аа 50 55 50 ніч же тк сту ТВг о Аго біу Агд бек Ап о Тйг осей бег бегорко АБ 53 70 75 80 вег Гуз А5и бій ух АТа без оіу да їу5 І1е А5й бек Тр би век 85 90 95
Бег Ага б5ег біу нія 5ег оре Гей бек Ай Сен ні Ге Ааго АЗт о с1у 100 105 110 сІм ін Уа! Тіе ні5 біб їу5 біу Ре Тук Туг Іч1Те Тук бегоо1й Тег 115 120 125 тує Ре Агд Рле віп 10 би т1іє Суб ой Ап оте уз АЗИ дер кує 130 135 140 стій Меї уві біп тує їі Туг буз Ту ТНг 5ег Туг РгГо Ар Рго їїе 145 150 155 160 мен сен Меї уз бек АТа Аг АЗп бек Сує Теробег губ Ар оА1д си 165 170 175 тує сім Бец Тугобег їТе туго біп сіу б1у с х1іе РНе сію Бец Ту и ї80 285 190
Азп о АброАгу т1е рНе маі бек ма! тТие оди о нія 1ви те А5ро Ме 195 200 205
Азроніз бій АЗа 5вб оРНе рРйе Є1у діа Ре сепоУді Су 7 215 220 «10» 01 «21ї» 912 «б19х РЕТ «йт13» АРІ ЕтсСтіаї беднепсе «ДО» «йг3 ТизтРойп о ргосети «8005 10
Аіїа маї Рго тіє АТЗ сій Бу РгГО АгЯ Ако Аго Агб Аг Аго АКа Аго і 5 10 15
Уаї Маї Аке Ро сви сіу сеш Аа біу тигозег зіш бі тТвкотіе 5Зег їй 25 за
Тве уаї бїв бід ух бій ста Ази Хе бек о бго це уаі АкЯ 019 Ага с1іу ко біп дго ма! АТа Аїа ні ї11е тагоб1у Тиб ага у Аго 5ес 50 53 во
Ази тТиг Омез зебозек рго Азпозек Су5 Ап бій Суб АТа їв) Зі Ко б5 70 75 во руб ї1е Ан зег о Ткр о біш 5егохег аед бек біу ніє ек о Рпе беи зе 85 90 95 деп Беу Ні5 (Сец АгЯ А5а с1іУу бі ей ма! Ї11е Ніє біб уз Ту рве 100 105 110
Туг Туб те тТуг бек бів тпг оТуг РБе Ага РНе с біп ст біо тіє Суб 115 120 125 сій Аза Твгоїух Ал А5рогуз бій Меї Маї біп тує Те туго бу тує 130 135 150
ТК бек Туксрко АбВ РгОо 516 мер тео Меб цуз ек Аза Ага Абзп о 5ег 145 53о 155 160
Суз Тер обЗег груз А5р А1а бі) Туг о сіу рей Ту бег їіе туб біт б1у 165 170 175 оту же Ре сти Бей буб б Аби Ар Ак т1іе РНе маї Бер оуді тег 180 185 139
АБИ Біб ні бец жхіе Ар Меї д5р нія бі Аіа бек вне рве с1у АТ 185 200 205
Ре сей хаї сіу 210 «8305 102 «а1їх 215 «12 РАТ. «135 Аг сСтіа| зеднепса «а» «223» ТиБтот рготетї «4005 3102 біу Рго 5ег бій Рго ТВ туго РБо Сіу Ар Ар. Аїда Рго Ууаї сін А5р ну 5 10 15 їен Ії1Те Аго РНе муаї с1у ага еп гей АТа тус оРНе Ту Ар тик пе 290 5 БІ авп Ага Ас Ако Ага Ага ага аго ака Ага Ууаі Уа! Ага го гей сіу ісш Аїа біу Ага уаї АТа Аїа Ні тї1іе ТВробіу Тег о Аго біу Агоу 5ег бо
Ап Тнг Бей бек бек вга Аби бек вух дблобіз уз Аїа гей с1у Аго 65 70 75 8о їує І1е Абпобег Тр бій 5егобег Агу бзег боту вії бек РБе Ге 5ег 85 о 55 дей Гец нія се) дед Ази с1у біц бен о маї ї1е впі5 бій СУ5 су РНе 100 105 що тук тує діє тук Зег біп Те тує Ре Ага РВе сп бій бої їТе вуз 120 125 біз дей їпгоїу5 Ап АБроїуб5 бій мет Уві біп тує ї11е туго був туг шия 135 140 тТиК бек туг РКО Ар оРГО Те веб гео Меж суз 5ег А1а АгОо АЗпо5ег ї45 150 155 160 сСув Тер о 5ег губ др Аїа Я тує б1у ем туго бвг ї11е тує віп сту 165 170 175 оту пе Рпє бі еп губ СМ Аби Абр Ага т11е Ре ма! хегомаї тп 180 185 1830 два бій Ні5 їео те АзроМеї й5р Ні сім АТа Зег Рі Ріе б1у АТа 195 200 205
Рпе ен уді ФУ 210 «205 303 «11» 247 «ріж РЕТ «2135» АЕН сізі 5ефоепсе «ги «айЗ» тТиБ5ТОоМт ргожеїй кА» 303 сіу Рго 5ек бій РГОо Тнготує рго о1уУ Ав АБр о Аїя Рго Уаї бів Бе 1 5 10 15 ен ї1е Ак РНе Уді біу Акд бе їец АТа тукорне бТу Авр твк їТе
БТ
А5п Ага асо Аг Ага Ага Ага Аг Аква Ага ма! Уа! асо Рго цем сту : й 4 ме Аз о1у с1у Суз Атя Аїа йіїа су5 Аа Аза сСух тйго бек ТИ СТИ 50 тьКоїТе ект уаї бій б руб бій бій А5п їТе 5ег о Рго Сед ма! 55 7 75 80 дго їй Ага сіу го біп Аг маї АТа АТа нів ї1е твгосіу те Аго 85 9о 95 біу дга б5его Аза ТК орви зеб зей рго Ап 5агобує АБИ бід Гу АТа 190 195 | о
Бей біу ага су їТа Абпобег тгтробій бег Заг аг зего біу Ні 5ег 115 120 125
Ре їей вк Ап бец ні реп асо деп о1У бій Сей маї тів 15 130 135 140 ух біу РНе тТук тує їі тує бек бій Тит тує РПе Аго вне вій Оу 145 150 155 160 біц ї1е ух бій Ап ТВгоїух деп о АБроїу5 біп Меї Уа! бій тує ше 165 170 175
Туг Гує тує ТТ бек туг рго Аврорго ї11е Ген цей Меї фух бег Аа тво 185 та
Агу д5п зве Сух Тгрозек вух АброАїа 10 туго біу меи Тує 5ег 112 195 200 205 тук біп о1у б1у гів РНе сій Сей бує сі) Ай А5роАго т11е Рйе Уа 210 215 | 220 зег ма! тТИг Ап сш нія це ї1е А5р мес дер нія сі АТа 5ег Ре 225 230 235 240
Ре сту Аїа РКе ев муаї с1У 245 «20 104 «ії 2152 ! «вігю РТ. «13» Агтітісіа! звдуепсе «кох І «23» Титов рготезтп «40О0х 04
Уа! ага а1н о Аго бр бго бій Аг Уа! Аіва Аза нія т1іе тн оту тиг 1 5 10 15
Ага біу АгЯ бек А5и твпгбоген бек о 5ег РКО А5п Берг рух деп би 1 ух
Аіа ей обіу Аго Був ї11е Або Зег о Тгтробїц ве Заг Агро бег б1у Ні
Зег РМе во зек два Беш Ні ген Аг АБИ оту біз Сей маї їів ні 50 55 бо бід бу б1іу Ве тТук Тут ї11е туго Яви о б1й Тс отук вве дгЯ Рпе бій ба 70 7З 80 сій біб ІТе суб б10 АБИ ТИг о Єу5 А5п др о їує бів меї маї 01 тує 85 90 95 тіє тує іу5 Туг ТЬг о бег тус Ро А5р ого 116 іен їв) меж губ баг по 1605 о
АТа Аго Аби бек Суб Тгробег Гуз Ар о А1їа 01) тук Ту їв) тує Зег 115 120 4125
І1є тув сій б1у біу тіе Ре си Себ у 610 деп Ар Аго Се РНе 130 135 140 уаї ее Ма! ТВг Ап о біц Ні без 12 Ар Меї А5р Ні біз Аа 5ег 145 150 155. 160 пе Рпе сіу Аїд РБе івц ма! сЇу Рго Беи сту це АТа сіу пев чаї 165 170 175
Ууаї Ака с1іу го Ако Ага Рго Агу Ак Рго зіу АБроАбр Аїа вго ма 150 185 т9а сій А5р оце Тіе АРо Ре ма! біу Аг їви сей Аа тує рве Ф1у Або 195 200 205
ТАК Те депо Ага 230 «210х 105 «ЛІ 221 «ід» РЕТ «2135 Агжіттстіаї 5ейепсе «гЕдх жайЗж тивів рготеїй «4005 105 дей о тТве Ні їіе Аби ТАК омаї Ууаї Аза бух Х1е 10 А1а ув Хе РКО 1 5 10 15 бу Аїа суб Аго ніх дід сій су біо біб Аза Аа сіу го ух АгО
Зо іїуз суб деку Тйпг АК уаї маї ага Рго бе оіу фей АТа біу сту 1У да 45
Су Аїа Аіа АТа Суб АлТа діа су сту є1у біу бій АгЯ Уаї АТ Аа 50 55 бо
Ні те твг опту ТИг о дкЯа б1У Аго бек АБИ тТИг Бе) Яег 5ег рго деп б5 70 73 во 5еР Туз Ап ТИ уз діа еп обі дк уз 116 Азп бек тер БТ 5ег 85 90 95 5екг дк озек о1у іх 5ег Ре цей бек ди беу Ні цей Ако Азп СТУ 100 105 110 бій іє маї 12 ні5 б Суб бі Рпе Тугк туг тів Туг бат 415 тТВкг 115 20 125 тус рве Аг вне бій сів біз ті6 ру5 б АБО тТвВе був АЗа АвросСуз 130 135 140 сіп мет маї бІп тує Тіе Тукг гу тує ТНт бер Туг Рко Ар Рго її 150 155 160 мец їеи мех цу 5ег АТа АгО АЗй 5ег о Суз тгробег їу5 Ар АТа и 165 170 175
Тук єїу їец тує зег 116 тук віп бІу сі 116 Ре бій сен суб б 180 185 195 деп Азр Ага ТТе Ре Уа! бе ума! тТпгОоАха бі Ні іен ІТе Ар Мет 195 200 205
Ар нів сій Аа 5ег Рпе РЕЄ БІ АТа Рне гео уд у
РАК! 215 220 «30» 306 «24і» 435 «вій РТ. «213» АсТІТістїа! Зецдиепсе кагОх «23» Ти5іоп рготеїв «400» лоб
Аїа си рРго бек Аїда АЗіа Тпгобіп бек Ні 5ег тів бек б5ег 5Зег 5ег 1 5 їо 15
РнНе Ту АЛа бій Рго бек АТа Рко сіу біу 61у 01у 5ег вка сту Аїв
Су Рго А1з цен піу тк обу зер Су 5ег бег бек Сух Аїа уа1! Ні
Азр ред їі1е вйе ТгроАга АЗо Ууаі вух вуя тк оо1у Ре маї Не ЛУ бо
Те тА рес їТе Меї ем рей бег о гей Аїа Аід Ре бег о Уді Їїе 5ег 65 70 75 о уаії ма! 5ег Туг цей Іїе їец діа сей бен бегома! те тіє хек рве 85 90 95
Аго ІТв туго руб чего ма| ї1Іе біп Аїа Уаї біп Суз зек сТи би біу 100 105 110
Ніж РКО РМйе уз дій тТук ів Аяр ма! А5р І1е тТигР се баг обег Ой 115 150 125
Аїш Рне ні Ал тує Меї А5лоаїа дія Мет ма! нів ї1е Ай Агу діа 130 | ї35 140 цен Гуз Гец те Ігіе Агб о іец Ре цен ма! бій Ар Сей маї Ар бер 145 150 155 160 іїец уз івеи АтТа уд! Ре Мет Тероген Меї ТБготує уаї Су Аа ха 165 т17а 175 впе Ап 01у 112 Тс рей без ІТе бец АТа біц бец бен ЖІе РБес б5ег
Ко 185 190
Уві Рго їі ма! тус б Гуз тує був ТПгоєїй тів Ар ніх туго Уа! 195 200 295 біу тіє АТа с Аго Авробіп ТАК обу бек тів Уаї бій уз Пе бій Аїд 210 715 220
Туз грец Рго сту їїе Аіа 1у5 суб уз АТа бі сАгЯ Аго Ага Аго ка 225 230 235 240
Аго Ага Ага сту біу б5ег сіу БІу Ага Уа! УЗ Агу РГО Ге а1у Сей 245 250 255 дів у ту сі1у зек сіу сту суз Аїа АТа 3ч Суб АТа Аа Ата су 2650 265 270
Бго біп Ага Маі! Аіа Аія Ні ї1іе Тік обіу тар Аго біу дку бег А5п 275 280 285
Ти фей бек бек рРГО А5в Бек Ку АБИ 13 Ку5 Аа їв Ту Ага Су 250 295 БІ)
Т12е Азп Бек Тр обТи бек заг о Аго бег бс1у Ні бег Ріе Ге бег деп 305 ЗВ 315 320 бец ні ву Ага дяп о спіу біб бен омві тів ні5 бій Бу5 б1у Ре туг 375 330 335 тук ї1їе тує бек піп тес стук Рре Агу бе віп сі) 518 тіе Суб 618 340 345 350 дБп ОТигоГу5 Ап дер Гуз вій мет маї бій тук ліве Туг Гуз туго тик 355 збо 365
Зек Тук ргОо Абр орРво І1е гец вец Меї ух бег Аїа Ага Авп оЯве Су 370 375 380
Тер Зег ув Азр Аїа бі Тук біу се Туг о б5ег те туго б1п б1іу 1у 385 390 395 40
Т1е Рв сі без суб оТй Аби Ар о Ага тіе вне Уаї зег Уа! ТИг Аз 305 410 415 сіц снів грец тІе дбр Мет Авронів бій АТа беб рйе РНе с1у Аїа рве 420 425 430 еп маї сіу 435 «2305 107 «211» 580 «212 РТ. й «2135 дРІЗТістаї ч«едцуепсе «0» «223» Титов рготеїп «АЮ» 107 дга ма! Аїа АТїа Ні Ії1Те тйг о сіу ТНК Ага б1Уу Аг бБег АБИ ТК 1 еу і 5 Іо 15 чзегозек рго Ап бек ку АБ сі уз Аза гей віу Ага гу Х16 АЙ за бег Тгробіш бек бек Агу 5ег о біу Ні бег РБе бен бег Ап Ген Ні я 45 це Аг АБп біу бін тез маї чІїє Ні сі ух біу Рне туг Туг Іїе
БИ тує зек еїп тис тує Ре Аго впе сів єї) бій те уз сти АБИ ТВг 55 20 75 5о уз Ази Авроїуз бів Меб ма! сій Тук її Туг губ Туг ТНтг бег Туг 85. 90 5
Рго йзр рРго тів бен ен Меї цСу5 5Зег АТа Аг Ап бег су ТВ бе 100 105 мо вує Ар оАїа біш ту Ту вен тук Зег тіє тук біп сії оту 112 рве 115 120 125 сім Сер вух Ім о Азп Ахр о Аго ї1е бе Уа! 5ег ма! таг АБ Оу нів 130 135 140 сец її А5р Мек ар нів О1ц АТа 5ег РНе вне с1у Аїа РНе це ма 145 150 155 ІчІвй сі біу біу сіу 5аг Аг руб ту Аго Аа бер бі 1у вго біб у і 185 і 170 175 с1Уу Бек Гей АТа Аа іей Тег оАїа нів біп Аа Суз Ні цей Ро Ген 150 185 150 сі тис Ре тпгоАго нія Ага бій бро АР с1У тТкробів Бій се) у 195 200 705 бів Суб сіу Туг рго уді Є1п Аго іец уз! Аїа це тує бе Аїа Аа 210 215 г2й
Агу Сей бек ТгроАяп біп Уа! Азр бій Уаї ї11іе АТа Азп Аа ієн Аа 275 230 235 240 бег о рго сіу 5ег б1іу сїу Ахр мец б1у біо Аїа ліе Аго оц 5ек Рге 245 250 255 бі бій Аїа Аго цеу АТа Меу ТАгобей АТа Аїа Аа біц 5ег ої Ага 2650 255 270 ейе ма! Ак сій с1у ТАК ОСТу деп АВ СТИ АТа с1у АТа АТа деп ФУ й 280 785
РгОо Аза Азр оіу с1у іу б5ег су б1іу бтіу меб І1Те бі) Тбг Абр бе 290 295 300 зіУ уд А5р Ахр Ар о Мет АТа сух ні уз 116 РКО УЗ! Ар АТ А5р 305 зо 315 320 вне сей Туг Аїа туго бег ТНК Аа Рго біу Туг Туг Бег Тер Аго АБ 325 З 339 5ег Гу5 Ар біу б5его Терорйе ї1е біп 5егогец Су5 Аза Меї Теми 1у5 350 345 350 тий тТуг Аа Азро уз бец сій Ре меї ні їїе ве ТК Ага Уаї Абп 355 360 305 деку бу маі АТа те обід ве біц бек рве зег РМ Ар А1їва тТвгОовне з7о 375 БА)
Ні АТа їує фуб бій Те вко Сує жі Уа! 5Зег Меї бец тп" губ ТИ 385 390 395 400
Кеш отук Ре тТук Ні Ар ма! А5росіу Меб бій дб5й ТНг обі Ай бек 405 410 415 чаї Ав баг о Гсує Бег Іі іух Авп Се бій Рго Су 11 тів ні СТУ 420 425 | 430 чег біб зег о мек Ар озег сіу Мет 5ег отр одер тс с1у туг гу Мет 415 440 445
Авротук Рго сім мес б1у їв Суз ї11е ї1е ІТе Азп дБ у Ав ве 450 455 460
Нтз бує зак ТК О1іу Меї Тйг о 5ег дко 5ег біу ТК Ар Маї Ар АТа 465 470 475 480
Аїа А5п Гец Ага бід Тег РНЄ Аго Аблоївеи уз Туг віч Уві аоо деп 485: 90 49 цу йбп дБ ге твгодга сі Єв тте маї бі сей Меє Ако А5р Уді 500 505 510 ек бує 1 Ар Ні 5ег бує Аг 5ег Бековне ма1 Суз ма! Сеу сви 515 520 525 чек нія сіу єї БіФф бу Т1е тІв впе біу Тир Ав біуУ РКО Уаї дев 530 535 540
Бе був ув т1е те Аби РНе ее Ака о1у Ар. Акад Су дДго бег Бец 545 550 555 з60
Тве оту уз Рго ме бец РНе їТе їіе бів Аїа Суб Аго аіу Те обід 565 370 575
Ген Ар осує ТУ 580 «2105 108. «в115 947 «21275 вЩТ «аїЯЗ» АРТ стаї бедцепсе «ФР? Пх «223» ЖТи5ісй реехеїп «4005 108
Аіїа Ага Гуз біу Бу5 бї1уУ бій т1іе 51ц ух ака Бу5 бец Ага 10, був ї 5 10 15
АгшоАгЯ 5еготвВк о Біу маї маї деп їі вго Аза АТа сі) Су ей АБО 70 | 25 ЗО си тує біц Ар Ар о біц Аа біу ій вує Ту Ага бує Ага 1 Ар «0 45
Аїа їтіе тає осів бій АБИ Те Же бій Ап сту АТ Ага Ага Ага Ага бо
Ак Ага ака Аго ма! Уаї дк Рго без біу гео АТа б1у бій б1у сту: 55. 70 75 80 5вг обіу біу заг ро сІп ака уд! АТа Аза ні їіе тк обіу тк око 85 0 95 сі1Уу Агу 5ег АБ5пП ТК осеу бек бек РКО АБИ Бек фу Ап сін ув Аїа то 105 То
Мец сіу Ага Су І16 Азп обег тгр оц бегобек Аго бек сіу Ні бег 115 20 125
Ре ен бек Ап без Ні ред ака деп ооту сій цей маї ї1е Ні 51 130 155 140 іу5 біу впе туг тук ІТ тує бек сія стае Туг вве Ага вне с1п соти 145 150 155 160 сіц тіе губ біз А5п тик ому5 доп дор уз бій меї ма1ї бій тує їв 165 1705 175 тус ух Тує Тиго5ег тує Рго дер овго ті сечо во Меї су б5еб діа 180 185 190
Ага А5поЗегосСух Тер озег гу Ар Аа бін Тук о б1у гео туго беготіє 195 203 205 туго бів сіу сіу тТе впе сій мем буз оїй Ап Абр Ага теє Рпе ма! 2 215 220 его уаї тТпг АБИ єЄїа ні іє їТє Ар Мех АзроНів Ти Аїд 5егоРве 225 230 235 240 рпе су Аїа вне їеи Уа! сІу 245 «Оз 409 «211» 260 «2125 Вт «2135 АгІїтіста! 5гдвгепсе «го» «223» Та5іоп ргожеїп -40025 Й ЩД7209 січ сій оіц Аа АТа біу Аг куб Ак Гуз ув дя Тк Аїа Аг Ту
І 5 10 В 5Іу уз сту сій тів 610 15 АгЯ Бу гей Ага бі у5 Аг аку 5ег 70 25 30 і
Тк біу Уаї Уа! а5п о т1є Рго АТ АТа сії сСу5 Гей Аб5рооТи туг бій
Ар Ар Та Аа сбіу бій Суб ст Ася уз Ага о1и Ар Аїа ї1е те во біп бій депо отве ї1е біп Ахи 91 А1а Аг Аго Аго Аго Ага Аг Аго 655 70 75 во дго Маї У! Аго рРгОо ви б1у бе Аїа біу сій Ту біу бер о1у б1у 85 90 95 его рго віп Аго Уаї АТа Аза нів т1е Те осіу Тнг о Аго біу Агу бе 100 105 110
А5пПоТьг їец 5егобег рго деп Бек їу5 Ал бій був А1а ви о1у АгО 115 1250 125 бує 16 Аяй бег Тер осі 5ес бек Ага 5ек о сі1у Ні бек ре Гени 5еаг 130 135 | 140
АБп о беу нія ів) Ага дп біу сш їеи уаї 11е ніб5 біб Гуз біу пе 145 155 155 160 туго тує їтієє Тук бег о бїп Тве тує РНе дгу Ре сій вії бій т12 вух 1685 170 175 сім Ап ТвгогСуб Абп Аброїуз бій Меб Уа! с1п тує їТе тук гу туг 150 4185 190
Те бек Туг реко Азро его Те гей їеу Мет сує бег АТа Агро Ав бег 195 200 205
Суз Тктрозег цу дБр Аа сім туго бу Ге Ту бек ІЛ6 туг біп Ф1у 210 215 220 с1іу хів Рбе а1й це) ух бі дей Ав Ага ї1їе вий о маї бек уві те 225 230 35 гай
Аби біц Ні Ге тів Аяо Мет Ар о ні біб Аза зегоРпе Ре с1у Аїва 245 250 255
Рпе Кей маї су 260
«210х 119 «2115 270 «210» РЕТ «2135 Акті стіа! бедцепсе «220» «235 тТи5іОоп рготетп «-4005 110
Твеозек осн сі: твгот1е яекотие омаі сів 61у фу біп сій хи Іїе 1 5 10 15 «ег Рго сем уаі го бі Ага біу бро біп Аг уаї Аза Аа щі Іїе тик ооїу тнгодеа сту Або Зеб Ази Тиг осей бБегобег Рго Ахй бек ув
Ап оо Суб АТа ву біу дго суб Хі Ап бек о їгр обу зеб бег до
БО
5зек сту Ні 5ег Ре їеу 5ег Ап без Ні без Ага АБ б1Уу си ву 65 70 К: 80 ча! лів ні біш бує С1у Рйе тує ту гів тує бек бій те тує Ре 85 90 95 дгу ве оів бі бі те Куб с! АБ тб Оу Аби АдхрогСух бій меє 100 105 цо чаї бійстує Її1е тук рув Тук ТигоЗег туг Рго Ар во Ї1е сей сего 115 мо 125
Мек Суб 5ег Аа АК Ап бегоСує Тгрозеб їуб дер Аза бін туго су 130 135 140 меч тує чек тіє Туб біп біу Біу їТє Ре їм ве суб бій Ап оА5р 145 150 155 160
Ага жіе Ре мМаї бек уві ТАг оАзЗп осі із без їТе д5р Мет Ар нів 165 170 175 сій Аїда зегорйе вве су АТа ее тей узі б1У с1у бту бегосіу суб 180 185 зо
Аї8 Аа су Аїа Аа Аа Су Рго Гецобіу рей Аїа сіу Ако маї уд 195 200 205
Ага вив Ага Аго Ага Агу Агу Ага меж вго сіу ух груз А1а Аг Гу 21 215 2250
Ап о Аіа бій рго Бег Рго АТа Акд АТа Рго Аа бі їв бін маї 61 223 230 235 240
Су Аїд ТНгОобіІп бе Аг Ака Ре бім А5в Гу сени АБИ РВЄ Аго бій 245 250 255 цу Гей гей дей сей х1е забору рец ве Суб хек Ту тик 2650 255 270 «Ох Мі «г1їх 207 «210» ВЕТО «21325 АгртіТ1сіаї б5епувпсе «Ох «23» Твіст ргсоабезп «00» ЦІ маї Абу сіб Ага о1у вго сій Аго УаТ Аза АТа нів Ії те Ф1у тп
ХЕ 5 | 10 15
Ага с1у Аго б5ег деп тб ем бег обзег Вго Ап обег Гуз Ап ооіц Ту 20 25 за
АТа беу біж АгЯ ух ІЇ1е Ап о5ег їТгр бін бек 5егодго баг оТу Ні его РНе Бей 5ег Ап Гец Ні Бей дго Ап бТУу си Кей ма! 116 нів о ст уз 1у вне тує туг ї11ї6 Туг 5ег ба Тис о тук Рпе Аго РНе бій 65 70 75 Во сій сти тї1е руб бій АБИ тТИБ Був АЗИ Ай гу сти Мет оуаї бій туг 85 90 95
Т1е Тукоїує тур Пг обег Туг РРО А5р о вго у1е без реп мет бу бек 100 105 110
Аа Аго Ап обег Суб Терозег Гуз дер Аа бі тук С1у беб Туг 5ег
Т15 120 125
Те тме бій 51у єїу Те Рне сі Гев гу БЦ Ап дв Аго те Ре 130 135 140
Уа! бег уд! Тег оАєп сі ні геп Ті др омек Ар ні бім Аїд 5 145 150 155 160
Ре Ре сі АТа Не Бей маї сіу зіу сіу бек бу Су5 Аз Аїа су 165 179 175
Аїа АТа Аїа Суб Рко ге а1у мен дія су Ага маї маї Аго Ага Ага тво 185 | 190
Ага Аго Ага Аго Аго уз Се гей доп бе дТіе бегогух ген вне 195 200 205 «2105 112 «231 З «біг» РЕТ. «213» Акті гісіа! бедйепсе «а «да3» Би5іоп рготети «4005 112 сп А5р тер бе те вив стіп Суб і у Ні Же ТНК Ай Тг оАгЯ дер 1 5 10 15
Уаї АБр Су др Ап їв Ме бек ТИГР Ахп Ге) Ре Ні Су5 Гуз Ар
Гуз ай Ти" орпа тів тукобеб Акад РгО Є) РКО мЯ1 ух АТ т1в Су
Гу бБіу т1іє 116 Аїд зег ух Азпоуаї Бен тТиг тт бек біб Ре туг 5 во
Гец зег Ар сСух Азп о уаї ТНг обег до РГО Суз вує Туг Гу цеу уз 65 70 ге 538) рух заг те Аза Суз Ре Суб Уа! Твг Суб бі дп бій АТ Рго ув 85 90 95
НЯ Ре маї сіу ув! с1у заг суб дк Уа! Ууаї Аг Рго бец біу Ге 00 195 о
АТа біу с1у су б1у сіу бег біу Ту бі1у су 5его тик ак біц би 115 120 125
Твгот1є чеготйг ма? біпосіу сує біп бів А5лп їТе бег о рго цем ма 130 135 140 дга сій АеЗ е1у Ро о1л Ага Уа! АтТа Аїа нів ІТе таб овіу тег веЯ 1455 150 155 16
Зіу акад 5ег Ап о тигоеу бег о 5ек РКО А5п бек гу Авп сін їу5 діа 155 ї7О Т75 цен Бім Ага уз Ї1е Азпозек о тТгросі) 5ек о Бег Аго бек обіу нт 5ег 180 185 то
Не бец бер Асп Сей Ні їей Ага Абп біу бій геу уді ті нів сін 195 200 205 бух бІу Ра туг Тук ІтТа туго баг бій те отує РВе дка вйпесоіо би 210 215 220 віч ті уз бів аб те уз Аа АЗрої ув бів Меє маї сб1п Туєб Те 225 230 235 240
Туг фу тут твг обзає о тук рРго АброРго їі Бей ве мет уз 5ег о АТа і 2А5 250 255
Ага А5п о бег Су Тгр бек уз Азр Аа от тТук біу ен Тук Бек Ле 260 265 270 туг сти с1у с1у Те Ре 016 Гей губ сій Азп Абр АгОо Ії1є Ре. Ма 275 280 ев
Зег Уаї ТК од5п о біб нів сен ї1е зро Мет Ар Ні бі Аїа 5ег РНе 295 300
Ре С21У Аїд РН рей ма! Оу 305 310 «2105 313 «211» 230 «212» РА «213» Агтійсівї Зедцепсе «ий, І «й» Ту5топ рготети «4005 113 ст сЄТЬ соів тТгр о Аїа Аг бін їТїе СТУ АТа бій Бей Аго ага Меї Аїа
І я 10 15 дер Азровви Ап АЇїа бій тує 01 Агб о АКо Ага Аг Аг Аго Ага го «0 25 30
Аго Абу Уа Уві Аго РГО ев біу без АТаоб1у тб багосіш сій ТВе тів бег тТвпгбоУузі стій бів рух біп зіп А5п І1е зек о Рго Гец ма! АгОо 35 БО сі аку сіу Рго біп о Ако Уді діз АТа ні ї1е ТНК біу тб Агу с1У 65 7 7 ВО
АгЯ баг деп Тнг осей Бег баг РгО А5ап бес суб Ай сій Гуз Аїа беч 85 90 35 с1у Аг гу тІ1е Ал бек Тгробіц его б5ег Ага бег с1у нів бег Ре
КО 105 110
Ген бек АЗп оре Ні гей Аго Адбп о біу ої їве ма! т1е ні см суб вищ 120 125 б1у Рне тує тук І1е Туг бег біп ТйгсотТуг Рв Агу ре бів сі су 130 135 15 ї16 Дуб бі Ази ТК огуз деп Азрогуз бій меї уаї тп отук Т1іе тук 745 150 55 1650 іу5 Туг ТВг 5ег туго Рго Ар о РГО Ті фей ву Меб уз бег діа Аг 165 170 175 деп озег Суз то бек їу5 Ар Аза сій туго біу бен Тує бег тів Туг 180 185 190 бій сіу б1у ї1е Ре бій Сей туз бі да Ар АгЯ ІТе Ре ут 5ег 195 200 295
Уаї тйг деп бій Ні рез ї1в дер Мет Абр Ні сі) дТа бег оре РНе 216 215 220 сіУу Аїда РНе їв маї Ту 275 230 «2105 ЛІ «215 725 «їв» РТ. «2135 АгЕТйсіаї бедиевсе «220» ; : «0235 Бив5іоп рготели «4005 іа
Тв Бек сій біз Твг ої1їе бек о тйг ма! сіп бій бу5 бі біп А5п о ї1е 1 5 10 І5 зекорио Меп уд! Агд бій дк біу вкоосій аку уаї АТа А1а ні те
Те обіу пн Аго ім АгЯ бес ода ТИб оБед бек бег рРго АяпоБек | ув 59 45
А5посїм ув Аа мен Оу Аго Суб Їте Абп бек тТгросіз 5еб 5ег Аго
ЗО 55 бо зек біу нія чег Ре (ец бек Аби Ме Ні Геу Ак А5а о с1у бій їв 65 70 75 ВО ма! Те нія бій вуз біу Ре туго туго 118 туго б5ег бів твге тТуг Рпе чо 95
Ага впе біл біз ої ї16 уз 01 Ап тб оГу5 аз Ар огу5 біп Ме 300 105 що
Ууаї віп Туг Іте тТук су5 Туг тВк бек тує вго Азо Рго 116 вен Му 115 120 125
Мет 1у5 чего АТа Аг оАБІ: зебр бує Тр бЗек вуб АзроАза сі тує бІу 130 135 140
Маец тук бЗег т1є туго біп о с1іу біу Хе ре бін бе вух б10 Ап одер 145 150 155 160
Ага їїЄ Ре Уді 5ег Ма! ТЕ Ап б1ш нів фрез ті А5зр о меї А5о Ніб 165 170 | 175 січ Аїа 5ег о Рпе Ре 61у Аїд РНе їжи Уа! с1у Суб АЗа АТЯа суб Аа. 1850 185 196
Аа АТа Суз Рго Гец біу ін А1а біу Аго Уаї Ма1ї Аго А5а Ії8 Аїа 195 200 205
Ага нія Се Аїа біп о Маї біу Ахр бек Мет Ар Гу рРго Аг Ага Ро 210 215 220 тТуг 225 «ій» 115 «Лі» 234 «Дій» ВК. «23» АРТ тіста! 5едчейсе «га» «2235 Ти5іоп рготеїй «00». 1315
Тег обегобійв оту ТАготіе бег о Твгомаї сїп с16 уз Я1п біп Ази ІЇе
І 5 10 я 5ег РГгГО цен маї Агуд біб Агд біу Рго бТй ака ма! Аза Аїя нів ї1е тТігобіу тиг Ага б5іу Аг бек Аб5п ТВг осей бек бек Рго А5йЙ Зек Ту аа 40 45
А5п ості гуз дів реву вБіу ага су о т1е Ай зав тер Є бек бас ака
Ба 80 яек о о1у нів 52 Ре цец бег абп гей Ні ген ага А5п о о1у си ев 65 70 75 о
Уаі те ні бій руб біу Ре Ту тук І118 тук яЯвкг об те тує РНе 85 90 95 дра Ре сіп є!ЇчЧ бі ї11іє Суб ТИ Ав Твг огує Ап о Азр гу бій мех 100 05 ло чаі бій тує тї1іе тук рух туго тк бек туго вго Ар Рго тів Ге Ге 115 120 125. мес і ув чего А1а Аго Аби чего сСуз Тго Яек су Абр Аза іш тує С1У 130 135 140 ем тує бек ті тут єї оіу С1Уу ІТє вне біц ем суб оіи АЗИ А5р 145 150 155 150
Ага тіе ве ма! чЗег о уа! тБк деп біб нів бем 112 д5р Мет а5р Щ15 165 170 17 він аа заг о РБе впе сту Аіа вне ген ма! 61Уу Суз АТа АТа Сух Аїд ї80 185 190
Аа Аа Су со1у б1у Рго їей сіу цей Аза б1уУ Ага ма! ма! Агу ой 495 20 | 705 116 су5 г1е тгровйе віп Ап одго Агу Меї Гуз Тер ув Буб уз Аїа 218 215 222 тує Аа АїТа Аїа сіу д5побеє тую Не 1 ух 225 239 «210х 116 «211» 216 «2125 РТ хй1і35 Агжзтісіа! беаценсе «220 «г235 Ти5той ргобетл «Ах 16 риє їТе бек губ сій Ага АгУ 516 Ага Аза їв Бе бек ТВг Був Рго ї 5 10 15
Рго о1у тВговБе бец вен Аго Рбе бек бі) бек 5ек іу5 Ага Уа! ма!
І)
Ага вго рей ос1у ті дій оту 510 БтЖж б1у оту су5 А18 АТасАТа Су 33 40 45 кїа діа Су» б1у бег ЗіУу біп о Агу Уаі Аів Аза нів їТе тб об1у Те
БО дга біу Аго Зег Ай ТИгГ овен об5еє 5ег РКО деп бек гу Абп бів Су 55 7а 75 і 50
Аїа вени біу Ага бух ТІ Ап бек тро Єїу 5ег Баг о Агу чего бсіу Ні 85 90 95
Зв о рРБе гей баг о адєпоїей Ні Сео дка Ав б1у бій еп маї Те ніє 100 105 по сів губ б1Уу Ре тут Туг ї116 Тук бек бів Тк отує Ре дго Не віп 115 120 125 і бі тіє Губ5 Бій Ап ТК Суб Ази дер осу5 бій меї ма! біт туг 138 135 140
І1є Туг їух Тук Те об5ег Тук Рго Ар РКО ІТе Сей цей Меж гу 5ег 145 150 155 160
Аїа АгО А5а 5екоСув тгроуеє руб АВ Аїд от тує ЯТУ Бей Туг 5ег 165 170 175
І1е Тук сіп о сіу бі ї1е Рйе бі Ге бу би А5п АзЗр ле І1е Ре 180 185 195
Уаї бек уаї Те Аби бін Ні це) їТе Ар Меб Ар нів сіб А 5ег 195 200 205
РНе рів Ту Аїда впе гев уві 61Уу 210 215 «2105 117 «24115 КМ «від» РТ «13» АРтітістя! 5Зедцепсе «ве0» й «23» ти5іп ргротеїн «40055 117 с1у віп чаї сіу аку бій вец Аїа їіе ї12а б1іу Ар Ар о т1е Аби АКО 1 5; 10 15
Дко Ага Аго Ага АК Аго Ага Ага уаї Маї Аго реко ву бі Сец Аа с1у аку ма! АТа діа нів ті тс обіу тнг Аг біу Ага бег да тат «0 45 їер зег о бег рго Аби обег тує Аа о біц ту Аза бен о1у АгРО іу5 те 60
Депобеєв о Теробіц, его зег Ага его біу Ніє заг Ре цеч 5ег Ап Кей бз 70 75 во іє сви Агу Абп о1у бій рей оуаї Ї1е Ні бін вуз 61у вве тук туї 85 20 95
Т1е туг бек сп Тако туго Рпе ага Рне біп сіб біч ї1е ух 10 деп цю 7ло5 ма
Тв Бубє Аа Абробуз біп Место уаї іп тує Ії1ї6 Тур їуз тує ть баг 115 120 125
Туг РРО АБр орга ІЇїє ей цен Меї Суб бек Аїй Аг Акпобег буз Тер 130 135 14
Зег бух д5роАїа біц тТукоб1у гей Тук бег тів туго бїв е1у бБІіу Пе 145 150 155 160
Ре біц їв гу5 Бій Аби й5р о Аго ті РБе ма! 5ег уді тиг Аби 1 155 170 175
Ні їец тіє А5р Мет Аб5р Ні ОТ Аа его рРйВ ре Ту Аа Ре гео 1850 185 190
Уві су «2105 18 «з 243 «212 РЕ. й «Бі3ж Агжітіста! 5ецдиейсе «ах. , «аж Тиіой ргосетй «ВМО» 118 їу5 А5п ви тТероаїа Аа бій до тує бу АгУ 10 ен зго Аго мех 1 5 10 15 ек дер ОЦІ РНе сій біу 5екорне вує сіу Сем Агу Ага Ага Ака АКа
Агу Аго Аго Аго ма! маї Аго Бго їеу сту рей Аза біу го Уаї дів
АТа нів їі Тигр осіу Тпг Ага біу Акуд о Зек Ап Трої веб о бего бер. рРго 5 60 дп Зег губ АБ осі їух Аій бе бі Ага уз Ж1Є Ап о бег тер осот 655 70 75 50 5ег бак о дго 5ег Ф1у Ні 5ег РМе бе бек Ап бен Ні їец Ак. Ап і 85 90 95 біу бін сви Уа! т1е Ні ої гу5 бі Ре тує тук ї1є Туг 5ег й 100 195 їю тТагсотук рве Аг ве бій сі бір тіє губ бі Ази ТВгоОгу5 Ап АБр 115 120 125
Су віп Мех Уа! сій туго лі тує ому Туг Тк о5Зег Туг ого Авр. РгОо 130 135 140
ІТ Ге ген Меї Гуз бек о АТа Ага Азпобег о Сує теробег був Ар Аїа 145 150 155 160 сіц туг зіу геу туго 5ег ї11е тук бій біу с1у ше РНе бій Бей уз 165 | 170 175 сОіш Ахп Абро Ага ІТє РНе уді его уа! тТиг оди 1 нт їец ті др 150 185 190
Мет дер нія сій АТй чего РНе Рйе сту А1а РЙЄ генома! с1у СУ. СТУ 195 200 205 бек нів о1у сей уаї Рго до б1у его таб обзек біц оту Твг оте 5еє 210 215 220 тне Уа! сій бі Був бів бій деп Т1е бек о Рго їв уаї Аго БІК Аг 225 280 23 240 оту Рго сів «вій» 119 «гії» 836 «212» ВК , «і3х АгРЖТРісСтТаї 5едуєпсе «вед» «Раз» Тизтай реротеїн «4005 119
Ти 5ег бів біз тТвготТіе Зеготвгб ма! са бів уз ота біп Аби їїе ї 5 10 15 зегоРго ісеи уд! ака бій Ага Ту Ро бів Аго Уві Ата Аїд нів ї1е
Тве обу їйг або біу ага б5ег дей ТВе о їев ак б5ае вро А5й Бек гує | 40 45 деп біц гу АТа ле) б1іу ака Суз те Аби бег тТкр бін бег 5ег Ага ва чек ім Ні Бек Ріє ей 5ег Аєп о бен Ні цец ака Ап обтіу 019. Кей 65 7а 75 БІ маї жів ні вій груз біу Рйе Тук тує те тує бек бій тв тук вве 85 90 95
Аг пе бів біц бі ї1е їух бу аАБй Тис цу Ай дер Гуз бій Меє 100 105 1160
Уа! біп тук 11іе туго гує туг тайг бек Туг Рго Авр РГО ІТ Бец ге 115 | 120 125
Меї цу баг А1а Ага А5поЗег Сух Тгробег вуз др Аїд би Тут б1у 1:30 135 140 ре Тук 5ек т16 тук сіп біу біу тІ1є Ме біб Се бує 01 А5п Ар 145 І5О0 155 150
Ага Ііе ее уді бек Уа! Тнг о Азп єї Ні Тен те АвроМеї а5в Ні 1655 170 175 сії АТа бак бе Ре бТу Аїда Ре реу Уді біу «Ту сту бек Рго рем ї180 ІВ5 150 с1у сей Аїа оіу Су Аго ма! Уаї Аго дкЯ Ага Ага вв АгЯ Ага Ак 155 200 | 20
Ага уз дб5п ген пр оАїа Аа сів Ага тує оіу Ага обі Гей Ага ОАга 210 215 22
Меї «ек др бій Ре бі біу его РНе бух сіу ей 225 230 235 «2105 120 «11» 216 «ай ВВ. «б13ж Агсті1тста! б5едиепсе ко» «бУ3х Тивіосп рготеїн -4002 120
Аго ма! Аза Аа снів ї116 ТНг о ЄТу Тк одга оту ага Баг оАби ТВАг овен 1 В! 10 -ї5
Зег 5ег Рго Азп бек Гу« Аби БІ Гуз Аїа беу б1у Ага бух т11в дБ его ттр о бім 5екочек Аго его сіу нів Зег Не се Зек Ай рец ів 35. «й 45 іем Ага А5п оту сін овец маї 116 Ніз сіб Зуб б1у Ра Туг Тук 116 5о 55 бо тут бЗег сп ТИготук Рве Аго Ре бія їй сти ті Суб бій аб отв бо 70 75 во іїу5 АЗп АБр гу бій мет Уа! бій Туг жів туг їм5 ту тне бас тус 85 90 95
Рго Ар оРго Те бецоїей Мебоцу5 5ег діа Агу Ап Бек Суб тев бек то 105 10
Ту дар АТа бій Тує о біу їеу Туг бек теє Тук біп сіу с1у ІЇе РНе 115 120 125 сі гей уб5 біо АБО Авр пе ї1е вйе маї бег маі! ТИг оАб5п со Ні 130 І 140 щеч їТе Абр Меїг Ар нів сій АТа 5ег Ре РНе с1у АТа РНе веи маї 145 150 155 160 сіу біу сіу біу 5Т1у 5ег о1у сту біу сбіу Рго ге) сіу Ге Аа оту 165 175 175
Ага ма! маї го вує Ре бій РКО Сух вег сіу тер омеє тик о РМне ген 180 Т85 190 сін ма! Те біу уз Те Суб бів Меї бев о 5ег ово Бей гуз бів отугє 195 200 205 і суб туз бго дга АгЯ РКО тує Ага 210 215 «2105 121 «211» 237 «21 РТ, «2135 дефітТьстаї зедцептсе «2205 . . «Ра3ж Тизіоп ргосеїп «4005 121
Ага Уа! 5ег РНе Суб АР РгОо аіу Тгр о бег АїТва Меї Аїа Аго 5ег Ага 1 5 10 15 рец ТВг о Аїа тТАгобего Уа! бег бів ма! бІт об А5п сіу Рпе уаї (у
Су РНе бІш Рго ух 5егобіу тТгроМек тяг Ре ге) сі ма! Тег ос1ту ів т1е Суб біш Меї бе бер цец бе (уз біп тук Сух Ако маї Маї
БО
Ага его меш біу цен Аїа біу о1у біу бек біу ЄЇїу Ага ха! АЇ8 АЇТА 65 70 75 ва
Ніз тів тйгбосіу ТпгоАга сіу Аг 5ег д5потнгоїеу чего бег РгОо АБИ 85 90 95 ак руз Аєп Бі бує Аїа грец о сіу дка вуз ХТе Ай Бек тер обти 5ег 100 105 110
5ек Ага бег бі нів бе РНПе Бе) бек Ап Без Ні Сей АгЯ Аа біу 115 120 125
Сів беу маї 1іесні« біс їу5 сту Ре туго тує тт тук бек ств ТАК 130 155 140 тТук вне аг РНе біп бій бій тіе Суб бІй Ал о Тиг уз А5пОАБр Бу 145 т5О 155 1650 стій меж Уа! сєїпй Туг ї1Те Туг руб Тугк Тне об5ег тує Рг АЗроРго Тіє 165 | 170 175 еп гер мет уз 5ег АТа Агу дей бак Сух Теробек бух Абр АїТа бій 180 185 190 тук сіу ів туг бзег Те Тур сїп біу біу іє Рйе бін Сей цу бїн 195 200 205 ав Ар Аго те Рйе УЗ 5егомуа! ти дей біо Ні гіец отТе дер мех 210 215 220
Азр Ні 10 АТа бек вна РНе сту Аїд Ре грец омуа! С1У 2755 230 235 «2105 122 «1 1377 «РІЙ» ОМА «213» Акті тісіїаї 5ейепсе «20» «35 тТу5Топ ргокеїп «00» 122 І дастотосач садсатоєує адсстдатасс восдаздава ссаєтадсає сустсааува 60 заасадсаца атаєтадтєс уєтооттсох бзасусадЕс сдсачсотеє тосадсасає 120 аїсассдаса сссасоаксо садсаатасс стдадсаасс сааатадсва звасоазвавза 1850 одссстодатс осааазтісаа саастодддаа адсадссота дсооєсатад стісстодає 240 забстаєаєс тасусзаєою содзастоусо асссасоада зададеєсєтста ттатаєстає Зоо ачссадасст атстссЯстЕ ссвадазазі ассаваудаца асассвнаааа суасаваєсва. зво аквагсосачі асасїстатавз атасассадс бакссодаєс счаєстстасто дагдававас 20 асасотаата остуттодад сазадатоса ддататодесс тататєзосаї статсадоду 4во васаєесста дастідазаца задсуаїсос аксіїєоєда ососодассва тодасахств 340 ассрататод атсасдааус савстєстеї доустосаттєс сдвеєвотоя содсадтаде 650 усааосодії отоддтссвда асотазаааа сагосвацсд дсбатссода аодсовдеває бо сеЕЧосадсаєс тоассосаса ссадосатуї сасстассес тодадасстє стасссаєсах 720 соссадсссс дсадссодпа асадстодаа садтосодії ахссоатєєса асохстачеє 780 дсастотаєс тодсадстсо їстоадста9 ааєсадуєсо аєсаудітає єсдтлаєдса: 840 стддєзаєес сапасадсда єдосузІст9 дагдаадсаа сесотозаса дссдадасай що дсасоксіда састдассст опдсаосадса давадсодає песто Есо гсааддсаєс збо дутаатузтЯ дсоддсодстад суогодсоду ссяазадаяа ссодсадсадє саваєстдаз 1020 сдссадсаса одаєаісаз9 сассадсоса дсаадсадса дсааттаєто сеассадчато 1089 агогавадсс дсваїстоас сададатсої габавзассод кадасасстії тк ссатоаа 1140 восстідосач аїдстсадос азіїїФсадс садазаватєта тадссвотаа азатоадесво 1200 зссааттост аїсададста садсассато здсаєтаєсо аттотсатуа зассаддтаде 12650 васапатаїс суваїтасує статадаасс асссайодсса атадасататє тасхтогоовсс 1329 тусааадуса атссотатат Єссоддіссаї тттЗатосса дсогозаада тозасхоа 1377 «210» 123 «вії» 5395 «212» ОМА «213» дгежітіста!ї зейцепсе 220» І «223» Ти5іоп рготеїп «4005 123 тттадссута чсстусаєад сстостосчк соассксасс пеЕсатсоосЯ Такса є 60 ссастодоаїс туосадосас садсозадаа ассаїстадса ссотхсвада азаасадсад 120 авсаттауєс састоууттсо єдазсотоух ссусвосоаво стосзосаса таєтассаде 180 ассеутоутс дсвосвасає сстдадсадс ссодаастадєса заватсозада зассстодах 240 содсанайста асадстдода азосасєсої ачсдртсаса дстссстозо сааєстосає 300 стосутаато дгуаастаді датісасуво аавдостіст аїтатаєста тадссадасс зво тагжтссоосс сссазаладча баїсазадчау засассяаза асцасазласа затадедсава 420 тасаїстата аятасасєсао стаєссодцах ссчаттстос тдатдавадо сасасосват 480 застоатєуда псазазоатас дузабасудє стобасаоаса сстаєсадоава тадсатт 540 даастдлазо аазасчаєсо сатсттходву засдєдасєса атуаасаєст бастаятато БО0 чатсасчава ссаасскттє гдогассв сеудскаЧу 535 «ЛО 124 «2115 5612 «а ОМА «72135 АгжіТістаї 5Зедувпсе «220» , «223» Ти5тТоп рготеїй «005 124 стасстассо савсачатат осадцатокі асстассаасо дтатовсзая соохстоадає БО авзачаєтаєс тоавассода тоатссоста дасстоаосва пссосастає ссотозасдї 120 аососодсаує дїастосадс асататтасєс дасасссото аїсЧкадсаа тассседадс Во здсссувата дсазалатєтда зададсссто додєсдсаава їтазсвостЯ додвазосаде 240 каївосоЧіс атадсттЕсс дадсаассто сасстосута асудстазаст дасдакєтсах з00 пазазачасєс сттастатає статадссва асстактІсс дстттсавда адяаваїтсааа 360 дазаасаєса даватєоаєза асаааєосто савтататст атазактасас свостатссо 420 чатїссдатес тостдзсоаа азасосасає аатабстеєє ддвусазада тосадзатах 480 досесвтата асатстаїса доадтодсатї гстозастоа аздаваатєда тсасаттттт 540 псдадсоїоа ссаатоваса сстраттоаї атодаєсаїєо агдссазстї гЕстодкоса 500 техстЗета ЧЕ 6і2 «Ах 125 «211 615. «125 ОМА «135 АРІТЕтТсСТаї зеочепсе «220» , й «223» ти5іой реотеїй «4005 125 сапсчєЧіта садсасастає тассуосасєс соїацдеЕсова дсаатассся сарсадссео бо заєацсазда зсцаднааає аскодатсос зазассааса устдадаава садссдваде 120 дотсасадех жсстозосва тстосаєсто срдхаатсадед аастдатоає тсасоааваа 180 частсстастї актаїстасай ссачаєстаї ТТЕсоуєстІсс аводацясаї Тазадазаас 240 ассзадзвасу ясазасават дегасСадтас аїстатазає асассадста тТесодаєсса з00 астсгассда сдазааусус асосзастайс суктсдаоуса авуактасада ебатвоссха 360 татачсаїсс агсадоутод сасстттоЗаа стдазадаза асчдаєсястат ттесакаадс 20 дідаєсвату дасаєстдчатє соасатодаї сасдадассв дссттстсою тосаєсюсто 480 зсацасозса асоохачессо сзааадасаї 9дкссазасукс тозосассасє засадатахц 540 сачачсцесо стассоатдо тасдоасавос дасставата задассатст оздассядає 600 часзавоахта заста 615 «210х 125 «її» 6821 «12 ВМНА й «і3З» АрРТітТіста! 5едистое «Его «ТЗ Би5їіой ророкеївй «4005 1265 сачсусутта садсасвтат тассодасасс сухасвісорта асаакассся часазсссй бо азкадсаваз аєдазададс астодактсус азааєсаата зстдодазає садссуєаде 120 доссасауюх скстдайсва сстосаєста сухазтоутЯ застдатаає ссакуавава 1850
Чдоасттстате атаїттатай ссадасстат ттСсостІтс аадаададаї Таававаааї 740 ассазааатєя абааасачат досасадтас астсасавазє агассаусєта тссдавесся З00 агтстдсстуа тоааазясос асасаатаас тоастадвоса задатстосада абатовсста 360 їагаосаїїс ахсавдостод сатстстдао стазаадааа атдаксосає стекаєсаде 420 усдассяасо азасатстоат созататодаї сасдааоєса дсстесскод тосаєстісто 450 остаасооко атовсадсуа суаточесся стодаєстод саддкєсетоє УСС 540 адсассодсадч садататаса додає ассдасоозта свасзаєсод сстадасвав Бо дзісахстда аассодасуа г 621 «ех ий «ії» 98 «2125 ОМА. я«?іЗз Аг тісіа! 5едугепсе «220» І «е3» тиу5іоп реожетп «4005 7197 садсосусто садсасатає тассодсасєс саБадіссва дсаатасссї давсавссся 50 засадсаада атдааавадс асєтодцесос аазассяата дстаддавад садссоєвоє 120 чаїсбатадстї сестазосая їстосаєсто сдтаатодта застоуїтдатї ссасудааааа 180 чессттттасі атаєттстатач ссабсасстаї гіссосіїтс аадйзаададаї тагадававї 240 ассааавата атазасваат дотосадіасє аїттатавах атассадеста тссадасссо: 300 аєсстоссуа Коааааосос асоїзатадс туссодадса задаєсусада асасдеєста 360 татапсаттї ассадчатао сасстссочал стоададаза атааєссесає сестаттвас 420 птдассааса аасатстуає сдатаєодає сахтодзадсса дес тод тосатвеста 480 четавтдота ятаосассоЯ ходтоссссо стодосстао сводесосох токссутаса 54й стасосазас тдоасасдсадс тадсстосто адсстостда чсдсаєсоасюе дскадсадса 600 чдаатосадсо їтоасасгїса Ччадіаатозі садахсосаче стїаасассва тоссазутасс бо детдасаада дстосадаса зстхассото заєстозасс ахссодоєда сстссазад 720 затуєтатад дссатаатто дасєссдадс ассдсадсад ататосадоо соттуєтасс У8о батадіасод сааусоЯісе Здагазадат тасставадс садаєчатад ссутастаєх 840 дсасатаєса застдатідо тадсодсдаа заазатадсо гтасстттоя тосолосава 900 стозазвавач Ясозосадтіа каст Ескек госасстстс сваєссатад сосастоавто чо азаддсассс тдассстова а иа «210 198 «115 578 «аю ВМА «2115 АКітісіа! хедцепсе «2205 й «23» тиБіоп рготеїй «4005 195
Чдсадтєссда тіпсасацаа ассасотсос сдгсєдесцсс ахсадсатоах тесссахссо Бо стдоадсстод сазасисєсо казасесдос ссасвоасесу стдсадсаса гтаїтассоуес 120 асссутодхс діаосаатає сстоадсвус ссудатвоса аазакувааав ваасастсаде 180 спсазаатся астаєстовдаа аадсадссує адсдассакта одстссстодао сазтстасає 240 стосдтазтд деддаастуує датісаєдав азасодссжІх атсасаєєта тадссадаєс 00 таттктсосі Ссаздазоа Ззаставадав аатассядаа асоатайаса васоокасад 360 татаєстата ватасассад статссодзає ссааєтсвує траїдадаво сасасуєсвах 420 застостода асазачатас асзасатдає єсостатадся стсаєсводо содсаєсесу 480 чдаосісзаду аазатаатссо саксстстокї аодсоєдасса ясоавсатст дассватата 540 датсатодзад ссадсттсст єддтасаттх стадвссоду за «рій 129 «211» Бб3 «122 ВМА «2132 АгтіТтісівд! зедцепсе ке І «3» Тизіоп рготеїп 4005 129 псадціїссда їтодсасяадаа ассосуєсаї соксоссдсс ассоаосаєоє катесаєссо 6О седачістод садасодета тосадсадса совусацесст отассауєда адааассате 120 засассоїтїс агдаааааса дсадзатасєт: автссостод сєсоєдааса єодессосад а сдссахосад сасататтас содсавсссає пдодхсосадса атассстоаа свосссоаає 240 зодсазазасу аазааосаст чоаоссосаза ассватадсї оодадаавсад ссоасзоасоо 300 «каєзасттїс судадсаатсє осатстасуєЄ засудєдзає содсраккса созаазадує 360 сІстастата сстаїафеса дЧасстаттїс састессаая дадуадаїсав воаадатасс 420 азазатуата аасавастоабі дсласатаєс тасазаататса ссзоастаєсс дваєссвати 480 стостчаєда захусосасо таатадстос содадсазау атосвузваса сво ссеоває 540 восаттїтатс додотаасає стттодоста заддаааато ахсасаєсіє таттааста 500 аєсааснаає атстдатсда батоадатсас дааводссадст ЄссссовКас веЕссстааса 6БО ах 553 «210» 130 «211 036 «212 ОМА ху АгІТТіСЄтТаї 5ефиепсе. «дО» , «абз» стивТой рої «400» 130 псадстссоа стосасадаа зссасассає сотсоєсаєє десадсаєує састедессо БО стадесстаа сауосассад тудаацазаєє аїїадсассЯ стсбавозада всадсадаат. 120 астаасссос тоастсосоа асотватсєся садсесуєса свосасатає сгассодсаєс 180 сосадтсота осаатассст дадсадсссу васадсазад ахсдазававс астодоєсос 240 аазаєсаата бстодуаазо садсєзЗсадс доїсатадся сестовоасяа сстодсатстао 300 сотаатауха застаусоаає тсасозаааа дстістасс атасстасва ссадаєстат 360 ткІсасЕЕсс задаадваає савлодвоадає ассазвазсо асавагават дотоасадсає 420 акстасааає агассадста сссцдаазкссо ажєтстистода гдайаводєде асосаатадес «80 тостодадса задатосада атакдаєсто сатадсаєтт ассаддатая сасстесодавд 540 сктозавадала зсовісвсах ссстастадс дсдассазсу засатстдат ссасатудах 600 сахозадсса зсететаЯ сосастстста спав 535 «210 131 «211» 636 «2123 ОМА «213» Астітісіаї бедпепся. хг «вг3» Ти5іоп ргогеїй «ах 131 | | | ще пЧЕссдадсс адссдаєста сссодоєдаї батосассоЯає гтовавдаєст цдаттсуєсе бо
Фітооаєсетс тостодсата стістдоссає зссятсватс дісоісотав асотсотсда 120 кутсоагоста гтсдіссосє ддосстооса дассЯтаска саясасасає сассдасасс тво скоса чдсаатасссї дддоасаасссо васадсаааа ахдазааавис астодахсас 4 аадаїсаата Зссоддазає сачссабвоає зуєсатадсї СЕстуадеєза тебасяєста зо сасєзаєцоата засєратдаї Ісасудазаа опудссестатт атаєстатад ссадасстах 365 кеІКсОсСТКТс забдададає ївазоааааї ассадаааєд зтавасаваї доасасадтах 420 аісідтайаї атассадста їссодаєсса аїїстасєда гавзадасас асутваєадс 480 тохтЧоаодса аачатасаца ахтатодісто татадсаєст атсадсатуд сасєсттсова 540 сСстдазаозаа асдаассасає стттоаттзас осдассзаєд аасатстват соататадах 600 сасуззоаєсса аск ттав тесасттсто асо 635 «210» 132 «2115 741 «122 ОМА «2135 АрРтітісіа! 5едценсе ва ДИНИ «2933 Тичіой ррохеї" «400ю 132 здЧдЕссравес адссдасста сссопдакуаї часдсасєсво Стоазадатсє оагссакесе бо цШфстоЧксетс тостоосата ЄЕКСТОасЧАТІ ассвтєзатс аЕсаксвкса ссотсатацда 120 стсаєоєта тесоєссаст додоєстодса досооктЯто савсадсатя тдсазесвух 180 ассайсудау заассаєєау сасєсотєсаа дазавасачс адазтіаттяд єссустаоєе 240 сотдаасуєа охссясадсо стотосаоса сататсассо дсасссатода ссбкассдає 300 ассстдадса дсссозатао сааазасоза ааадсастою дісосаааає саатадстод 360 дазайсаасс Фгаосоопсса їадсстсто адсвакстос зІстососбаа содЧтояасту 450
Чідаїтїсато ааазацостї стастатаїс таїадссада сстаїттссо стіссадода 480
Чазаїсавач дазаїассва ззатдасаза сааасудстос зусасаєста сазасатасс 240 застатссада аєссдаттсї одстдатдава аадсасасота асваостаста оадусаававх 60 дсадаатато дістокатау сатттаїсай дутдадсатст хтовастоаа адаззаєцах Бо содсатстсто ттзодсотрас саязсдаасатє стдаєсдата тодаєсяєда адссадчесссх 729
Тсквогосатє ссстоотадо є 741 «2» 133 «2115 в8б «123 ОМА «213» Агтітісіїаї! 5ейиепсе «ох | Я «223» Ти5іоп рготеїп «4005 133 дуєссдадсс здссдасста тссодЗасчаї дасосаєсод єсдаадаєсю діхсоєувнас БО егоЧІссоса ссотусєтоса дсасатаєта ссадсясесо сдпдссеказє аатассстда 120 дсадсссдаз тадсадазат даавазвосас таддєсосаа затсавтадс тдпававаса. 150 дссдсасдсуо ссатадсссї стовусаатс тасасстоасо таасодедаа стаЧсдатс 240 аєдзаавазао сттттаєсСає асттбаєаадсс здасстаєтє Єсосіїссда дазчачасса 390 зададаатас сааазаїдає азасадаєау Кясазсасає стаєааатає ассадсіатс 360 соезасссдаї їстостЯзіа заанодсосас дтаатаостд їсдовосава затасацаат 420 асдасстота тадсаєстат саддаясоддса сстекдадстс дааадаазах датсосасся 480 тсветадсос сассавасоаа саєстоатсо атаходатса стсавассаає тт стеодта 540 сасссстодЕ содосссоссто досстчасач чесосаєтає гсобєодсссЯа сатсотесте 60 дссосссода сдаєсаєтоса ссадетозву асстдаєься тост аде сесстастод 560 сахтаттттоо сдаєаєсаїтє авесус 685 «210» 434 «21ї» 6553 «12 ОМА «2135 АкКЕІРІсіВі 5еднейнсе ее Ав» НИ «айва» Ти51оп о ргобеїнл «4005 134 содсасссата їтаяасассуї Густоасазаа астсаздаєса звастссдЯад сасаваасої бо сатдсспазо вадавдадос адсадотсоа: язасотааая аасоктасссі тоаттостсдх 120 ссдстдадтс таосадосоу садттососа усадсатато садсстутає хаадтодесаа 180 с«удсассосад сасаєзіїтас содсаєссоє даксосадса асассстдай садчесссЯзає 249 засазазаєа зааддасасі Зап сдсваая абтазсачсї сддвавосая ссотзасачі 300 сатадстєсс тазасаатст одсатстусої ааєудтовас хдатдаєєса сдааааадйоє 360 ттІстастата їстасадссая дасствіттї состессазуо авузозівтаз збдавазсасс 420 аазвасдата засазаєоує апсадтасаєс тахааатаса ссвостаєсс ддатссавєє 480 стастдакда азаздсодсаса саатзастуї тодадсвазо атасадаата судоєстотат 540 адсатттатс ауддтадсає стотовасто азадалаасо асо сосдадсаго 600 ассзактазас асстдассоа тзсоудаєсає давассаусї тсксстадтасє аєтестоота БО час 63 «т10х 185. «2112 1305 киї2» ОМА х2135 АУТіТісзіаї 5вавейсе «в20х «223» Ти53іоп рготеїй «АВО» 135 ! дсздзассод дсдсвосаас ссададсесає адсаттацдса дсадсадстє годдсосадва во ссогсаудсас суоотооєЗа садсавесся д9тасасоєс садсастодо сассзавадс 129 тосадсадса Ястатосаці ссабдатста аєсетесвос дсдаєдеова заазассоаде 180 тегаттЕсто дсассасссє даттатаста стдаясство садсатттїдо састаттаде 240 дстасрачсе асссдасеісс дадсассустя зосоттаєса ттаоєстісо сасстаїзай КІ аосохкатсс айдссотоса даазадсоза дазодксатс сотставадс зтаєстдавє 360
Зіїдататта сестдадсад садавосакт: сасваттата тозатадсадсе сатадідсає 320 актазтксока сестозааст даттасксЯї сбоакстстоо стааадатсє оосодатач 480 стадааассод садсттстає дсдоассдато асстатоасєто дсассутаєе таатоадсате 540 ассстоєссоа їсстодссуа астоєсаатї сЕсадсос Ес суаєсотота Єврааавасас 500 зазасссада ссцдатсаста готоосатаєє адсасобєдатс абассазаво сатєтосадаа 6БО азааттсада саваастосс твддатсоса ааааадавад садаасотсу єсатедесох 720 сохсовуєоса ссодевсаоо тоабесосає осЕсСОсЄсеє тодВЕСтддЄ ввоасватоаЄ 780 адсудсодІї чсбсвЯсауа атоєусадсс дсатдіссос зудсусотоєЄ адсасатаєтх вла ассудсассс ясоадісогай сСаатасссто адтадсссоз абадсазваа тдзазавася 300 седадєсота аватсаасад стподазадс адссотадсо дссатадсттї єстдвоаєвах 960 стасаєстоє дтаасЗвасда асточедатк сасозавазо Ясссстаєта Єаєстасаує 1020 сачасєстатт тЕсдстксса адазоадаєт азайозазася ссававдасоз сазасавато 1050
Чгасадсаса ссстатадата сассадссає ссодаєссоз сестастваї пазадососа яв сутаасазстї дЕсОддадсаа здатосаоаза такоросссої атадсаєтта ссасоадчтоди 1200 атсєтетозас тдададаааа сдчатсоусаєт тстотавосо сдассаакда ясатстуаєс 1260 чзатасодаєс акдазуссяй секта дсасєтсссо супи 1305
«ВМ 136 «її 4740 «10 ОМА «2135 детітТістіа! бедцепсе, кеох «223» Жи5іоп рготеїзп «4005 136 сотосоодсад сасатаєтас содсасссує пдссабадса атассстцза садсссавх бо зоасадяааєу завадосасі: допісосава агсазбсабст досазазсає ссдсадсоди 120 сатадстстс тдаосавтст асакстасує затодусдаасє сдаєуасттса спзаааавдає 1850 тІттаїтатд ЕСтТабнодсся басстатіїї состтєсвад задачастаа зуаааатасс 240 дазааєчакта адсазаєуа: асадтасаєс татазатаса єсаустаєсс одасссдаті 300 тестазтда аавосусасо таатачцстЯсє тодудзосазає акудсадаата суді стотає 360 зодсатттатс аацдатадсат ссттдазста даядчаазато атсоосатстт татставсаска 420 ассаасудає вістаазтсда таїодадатсат даавссачсї тт тавтоє асо 480
Часдосадсо дтадссотаа аазасоустаса адсоасоЧес суоладатоз садсстоадса 540 дсассуаєсо сасатєсачасє асоісасстоа ссастоуава сстстассся єсассаєсад: 600 сстсдтадсї доадавсзасї водзасвогую пдостасссод ттсддсатсе адстосаєста 66бо тасстодвсад сасоїстову стдодаєсая сЕтодаєсачао Єтаєтосвад сосастодса 72а адсссодута Ясадтддсов сстубосодаа обаастсдко аадосссода асаддсасох 780 стоачсасіда сесідусазс зодсадаазос даасосевка тссвссаЗод сассовкаає 840 чатааачссо осусадсава гаддесссодса вабсдотодко Ястсадоїтао тайсахдати 900 дцааассоата дсоатотсоа сдатоватаса асстоссата азаїсєсссодт тдатассдах 60 їгсстасату сабсатадсає сасасефіує гтастатадсЕ десосватач сазадатдос 1020 здстадіста стсададсст охаЯсосвата стдавасаді акусадаєаа астодаатес То80 асасататтс сроасссотеє їтаатсуєааа 9ді1Кдсааєсо ааттутоводу сестадсе 1140 пасзсзасст сссатассва азавсааатс ссаятосаєто ствосасасє дассазадай 1200 стататтссс атсасбасєує ддасодсасо дааватассо аазасеясає сазсадвсазва 1260 аазсатстазаз асстудаасс дадватсатс сасдчетаосо адассатачя саасодосата 13720 адстподата ссдаттаїаа заїцдааксат ссодазатуа осстатосаї таєсаєсаає ІЗВО дасаазавст стсатзавад сассдудтасо ассавссота дтпдсассовз тестдатоса 1440 сазакстос огдааассЕї тсоасааєста азататогад тосдсаасаа заасазтста 1500 асссутазаад завссоїсда астватаєді датоєдасса аздзадаїтса тадсазасує 1550 адсадстеса сстасаттст остазассат пдтдазозач асаткасекх содсассаах 1620 ааЕссдактод асстддааавя авісассааї їІТІтІсого дкодаєсоту ссававсоста 1650 ассдодтавас сдавастоїхт таксаттсад дсахатсосо дсассдавасє дос тато 74
«2» 137 «із 741 «вій ОМА. «13» АРжТріста! 5едцепсе: ва М , «айЗ» о Ти5іоп рготеїп «4005 137 - асасотазад отяаапасса дассозазза сотаваєтас дідазавасо ссоатвусасс 6о дагастагста ататкссовус здсаваатах стсудасозаї абдаадчатода тозадссвоє 120 садавачаас отавасотоа асятосааєтї асссадсада атассаттса дзатдаваса 1850 саєсотсуєс втсссохсо сУусаЯЕСУЄЄ сатссусєстод зестдасада садова о задсодтдата осссосацоо сеастосадса сабаттаєсу дсасссасоЯ ссоізосаат за ассставаоса цсссдватад сазааасоза заздсастоад чссосаааас тазтадстод збо сааавоасадсс агаусадєса тадстітсто адслаєстас атстосусаа сдобсозаста 429 дтваєтсато аазавачостЕ тїтаїтататтї Батапссваа сстастттсЯ стттсадаза «50 чЧааваїсадад аазатаєсва адасдатана садатуддтас адбатаїска таватаєасс 540 зостатссод атссдатєтстї чстоасааза аусясасуса асадстосву дадсвавааи БОЮ целазаатато осстотатза саєстатсяу догтадсаттт гттодастоаа зддазаєсат вбО свсасєтттсЯ тозосуєдас сзатодасаї стуаттдата содастсатоа зассадстее 720 тссодЕосає єсстдова9у 7Аї «20» 138 «2115 750 «12» ОМА й «2135 дРхітісія! чедейпсе «вх кдайЗ» Жизіоп рготеїп «4005 38 ще пагозадаао садсадессу тааасутада авасутаєся сасоєдавуя сававосска9 5о аттдазааас дтзаастосо соОзазаасає сусадсяссу сус соєтая тастссодся 120
Зсадаатаєс ходатоваса тозадасдає давассдохс адзааозвасо сазасуєчах ї8о
Ччатусазєта сссадсадай Сассатїєіїсау засдаадсає озсаєсуссЯ ссдєсотсоа 240 сотЯстостс дессоассдад сствоасадах сядодтавта асоокапево гссусаасут 300
Чстосадсас асвзтсассда сасссотодтї соїадсаата сестоаасая сссодаатадс 360 зазавтдада задсастуду тсусаваатх засадсте94 заадсадссу ставсодісає з5а адстстстаа дсваєстаса сстосухаає чзбсозаствд соасесасда азазадетес а8о тастатаєсї аслоссадас статтетїсусЄ стссаауаву адаєтавада азасассаза 540 айсдатахас даатодкоса чтіасасстаї давятасасся остатссода сссоатсста БОЮ стдатодзада дсосасоєаа бадстаєсуд адсазадаєд сзозататод сетотаєавоє ББО асстахєсадо осдоасатстт созастдваа даавасцатс дтатесксає дадсокаасе 72 затїдазаєсатс сдаїсоатаї дуоатссатдаа оссадсєттст єсдасесаєє тстдатодоЕ 7-80 «210» 139 «211ж 8510 «йЩаюМ ОМА «2135 АРТТТРсТа! б5еругйсе «йгОх , «223» Ти5топ о рготеїй «400» 139 ассадсдаау ваассаттво сассостсаа узаазасаус ядаатаєсай тссастаох 50 согоувасоасе асссосадсо тастосаюдса сатаїтассо дсасссасоу їсасвасаає 120 ассстоабса чсссадзатад сезадаєодаа зазасастоа чссусаават савтадстод Іо дазаасадсс дтаосадтса тадстттсто адсаатстос атстусогах тоосоваєто 240 усдатесато зааааоусту стастатаєс тзтадссзда сстасткссаЯа сстссавоуза 390 даззісазад заватассад азасдаєаана седатвЧдтає адеатасстка садатасасс 360 воастаєссоч асссодастст ЗстЯасваза зосясасоста атадстУєтЯ даосавават 420 дсадаатато Якстотатау састтаєсад досдосаєстї хсдадстада адазаатдає 480 сусатєсттсто ссассдідас саасчаасат ссдаєсдата соддассасда здссадесст Бай кЕсодеосає сстодсвою Содсоотадс дассасосад савдтдсадс сасатеоєосо в стдоЧчЕстоЯЯ садоєсатоє согтсуєсоо сассоссасе ассотсосат дсстодтава 560 зазадсаєдта задаїдсаса чсссадЕссо дсасутосає сддсадаастї оуазоаєкай 720 тудхоасаассс востасоїтсд стттдоєдає авассозаєс сесоссадаа зстостазаї "во сіозїтадса застаттєсо гаосувсасє 810 «210» 3140 «-81ї» 621 «212х ОМА Й «21535 АгіРістя! беоцепсе «е2Ох «каз» Та5іоОп рготеїй «00х 140 дЕссЯЕчаає ДТОдЕсСсоса чсатуєтодса дсаєатаїта ссодсасссо тдоксоатадс во чзатассстодя псадсссдаа тадсавачає дзаааадсяс тодуссасаа ааєтавсадс 120 тпадазачса дссатачсво ссасавоастЕї ставдаєаатс сосаєстасо їзатдокова 150 ствоасуатіс атдазазаду стЕстастат абгстасадесє зодвестасіх хсостессай 240 дазодздаєта азозачасас свазаасоатє заасазатау кусадсасає статаваатає 300 ассадстаєс сцоаіссдак тстостцато зазадсасас дтяатавска сбоддадсада зб датасачаат атуасстса тадсаєттат садазтодса сстттуаасе овлазовазас А?0 заїсасатсс Ссотозосоє дассаасояа саєстватєсо затасодаєса тбдаадссадес 480 їтттссодсЯ сасссостаче содходвкодє адсачЕСоєо садсаєоєвос авссесатає 540 ссдстдаЧіс гобсаЧатсо вахту кЕсеєЄ саксотсосс огсфгсдосаЯ хзадстоста 00 аасстоазтта дсазастуєт т бе1 «7105 141 «211» 933 «10 ВМА «13» Аг тіста! Звдуепсе «ЙО Й «ваїх Ти5іоп рготеїп «а 41 савчаєтоас тоасстттся дааавааасає агтассааса сссоєдатої доаєтсаах бо засаттаєда усассаасст дЕтссаскос азадатаааа асасстєсає статадссує 120 ссддааєсую сСсазадсвахє гідсазадаї аксассуссяа осазазатоє тссдзссасо 150 засаадеесІ атстазосдаа їсутаатоєє ассадссаєс сасосбавата сапаствава 240 ааазоасасса асазатусто сатсасстої баадаєсацо сассодітса тестатхади з00 сптсдасласт ассатассає тсакссоасто адсстоосяо осдосваєда ходтадеуоє 360 асоссцаса осассзусуа адзаассакї адсассостс задававаса сваоватсаєх 420 аЧіссЗсідЯ гтєдедазсоя сооЕссвосаб сатастдсад сасатаєтає соутасаєді 480 чзахсудтадса атассстудад садсссозає ассазазато авададсаст доадіссава. 540 ассвзастацдест даддазвусад ссотзосодх сасадстітс єдадсаатст дсатетоєв во засдосозає сачевастса сдазазачусє сїстастата (стасадсса чзасстаєіїс 560 сЯстЕссаво задавассаа ададзасасс азазасоата засааатоадї осабтасатс 729 татаватаса ссадстатсс ддасссувит ссустдатоа авадсдсаса Саатачстоє 780 тудадсааву ахтасауааста гадтссосат здсасттаєс аддасаасає сестдадесто ло азададаасо атсосатстт тастаосако асєзасоває зтстуаєсва татодахсат 900 даадссаось сист тодхас атткстідого дах з33 «10» 147 «гії» 690 «10 ВА «2135» АеРТ1РісСія1 бедпенсе «аг» . «223» Жниевоп ргобеїнп «4005 142 даадаасаоє сдосасоїтваа застоостаса садстасосє отасоадсада тдасстодаат ба дсасвоотаєо засоссяєся ссоссоссує авасоїтсоєс акаде єося єссостдаах 120 стдасадоса ссадідзава аассаєсядс ассусЕсаау заааасадса даатастадие 1850 ссастдаттс дсдласотає сссосаосоЄ десослоєвс акактаєсоу сасссакадє 20 соатадсзата ссстузосад сссузатачє азазатоваа агосестово тсодсаават зо васадчсєтачо аздосадссо бадсадтсаїє адссстстда дсааєстоса хстдсатває 360
Четчаазстод сдаттсасода ддаводетьс таттатсатсх асзодєсадає стаєттссос ч26 тіссаачааа адаїсзаада дзасассаза дасуасадає авасудсдса дтасаєстає АВО азасасасса Ястаєссоца тссдзітста стдасоцавая осусасотаа тадстогтоз 540 айсавадато садаатаєод сстутатадс аїстаєсадо дсдосаттісс хозастдава БО
Чаааасдатс дсасстікоє дадсосдасс аасузасатєс суасвдатаї доатсасоза 6БО пссаасістс хаос асстя соехаатЗах бю «210» 143 «211» 575 «ій ІЖА. «із» АКТ РІсСТаї едцепсе: «70» | Й «223» Бубіоп рготеїпй «а» 143 ассачсдаач азассаєтад сассдсстсяла дааазасзус зчаатаєтаю тссустодех 60 сатодзасога зіссдсадсо тастосадса сатаїстасся дсасссукчє гсогаосаає 120 ассстузоса ссссозаїву садазатуаа зазосаєстод оссоасазааї сазсвасто9а 150 чаазасайсс деадсоддіса тадстттсту адсаатстоє дестодсатаа садсоваста 240 ведаїтсаса аазавудстії стастіатаєс татадссада сстаєтсссо сстссаваоай щюЮ удзаяссааад даваїассва аазтоатааа сазаєудтоє вусататста сазататаєс 360 адстзсссоад аїссцатіст ястоасоозая адсосасога атаодстуєто оадсаааваї 420 чсазчаатаєб стстдасатац састтїатсад йогудсатсі тсодзостдаа азааватвах 450 сасасссіта стассасуає Ссаасудвасатє стрдатсояата тодаїтсаєча аассадссї 540 тгтдатоасат схсєтовстов стуотасаоса тасосадеєся сатосссост дасестодса 500 дотсататта стсотазсає садсасоєсає стодсасвою ссообсдаєао сасудаєааа во ссасаєсотс стат 6575 «КО» 144 «211 й «212 ОМА 0. к?135 АРЖТТс1а! бедцепсе «220» «293» Ти5іоп реоєевіп «005 144 ассадсдаау вазссастад сассуїтсава даававсадеє адазтаєтає хссастазех БО сшазасусу піссосадсо тастосадся сатбастассо зсасссоусуя ссоєсвосаах 120 асестдадса дессодватзЯ сзааааєдаа азадсастоуд атсосаааатє Таасзостод 180
Чавадсадкс дтайсяодтса садстжтста адсааєстос асстосотаа тЯотуаясту 24
Ччідаїтсато ваавацасеї стастатаїс тасадйссада сстатіїїс9 сттссвзадав зо дадаєсизад ззаасассаа заасдатада сазасозкос адтасаїста тазатасасс 360 вастатссад втссчасєсстї сстовєоааа аососаєота аївостаєса садсазаває 420 апсадаасато одсстутатад саєстатсяя дасодсассо седавстова зозаласдат 450 сутаєссісЯ сдадсотоас Саазсузаєає ссдатсдата содаєсатуа зассауєтсх 540 тЕхаотесак ссстоост99 гтобасадса тосдсадссо сасосваєоя сссастоває 6500 стдосадатс огастостсо тсвоаттаза атстодітсє адаассаєсю сатозаатоє 66о заадаазазо сстатосац зассопаіаас адстастіта аа 702 «ем 145 «211» 648 «тій МАС «213» АгтіТсіВ! бешенсе «Й «Зх ТибБіоп рготеїв «4005 45 тісатсадуса задаасотсо хоавасостоса атхстодоса ссааассоссе хаптсассту 219) стдстосеєЄ тізодсузава Садсазасої ЯкссосісЧЕс состоуесає тоссвасоаа: 120 аотоакадсє Ясасадсаусє асоатасваєс сасдосяавсо ассаосЯстоє тдсадсасаї 180 астассоадса сссотооісо гаосаатасєс стдадсаосс созатадсаа даатозалай 240 псастдацтс дсаазаєтяа садстодола адсадссята деддєсаєад стссстовдє 300 заїсстосаєс коасостазтує содзастдато асссасуава задустіста статаєстає 350 айссадчаєст акттесостї ссаадаадад атсавадчада асассяяаза савтзадсяй 420 акодтасаот асатстатав атасассадеє татссодатє сдатестусе дасолаваче 480 сасціватах десостадао Ссазадатоса дзактаточесс тостасацесає статсадади з40 ддсассттту застдааадца заасоатсоує аттстєссда усакдассяа тозасаєсто 600 ассоасатод аєсаїдазоаєс садсентттї уаестасаєтис тоусодої 648 «240 446 «2415 582 «й12» ОМА «135 АРЕТТІсТа! 5ефіепсе ках , й «а23х Би5зоп рготеїй «400» 146 дчасадосто дїсоєсадся дусваєтаєт догаатозса тЕватсоєсо хсатсодсоє 60 сотїауасоїс отаїтостса тесустаооє стуусводеіє отагтасадс зсатаїсаєс 120 досаєссуто дісатадсяа тассстдаос адсссозата дсавадатоа заазасаєта 180 буссосзааа савізосто одаазосадс сотадсооєс атадстт ст садсваєсто 740 сатстдсата асодтузасе оосдаєстсає давзаачасє сітаєстасає сЄтатадссад 300 асстатсттс дсттІсвадЗа заздастада дааадтасса адзатдатля асазатавса 360 садтасаєстї аідаатасас саостаїсся дасссдаттс састдасеза вадсосасцє 220 аахадстатт чозосааада гусадаатат дукстасета дсасттаєса додотовсатс «80 тгтоздастуа аздаваатєца їсосасстєє діксадсотаа ссаасуааса став содаї 540 агочатсато азоссайсте ксттдвотаса сестЧчасто де 5382 «2105 157 -2445 723 «125 ОМА «213» дгтітьстяї 5едцепсе «ег0х Й І «23» ТиБіоп реокеїй «4005 147 Ше авазатстоє пдбосазсаса сфсоссасоддт сасдаастує чесосатова овсоваєсс БО дладосадстї Стаазаавоссв зсЯассосях соагсоассатс дісоддсаЯвох х9ссассса 120 сточЧЕсто9 садуєсасує хасадсасає аттассодса сссусодесо садсаатасс тво стдадсадсе сдааєзодсва заасдазава зсастоЗуєс дсвааассяа тзостддогва 240 зосадссата осодісаєсад сіттсєсдадс ааєстасаєс тасасвлаєцо стувастодса 300 дЕтсасозлаа аадоустєкта єтатаєттає адссадаєсть астсїсоссї ссгадааоає зай астазадцава абассазада совсайасаа асоугусачі асаєсстатай абз:аєсацдеє 420 такседуаєс свастстаст датдазаадс осасоєтазата дстассодад саяацатосе 46о чаасатадЕС Тасатадсає хтаїсадудс досаєсттву здстезаауа аазіїваєсоус 50 асстттосхта зсоатодссаа содвасатстя ассоататоа зссатозаус садсккетсх 500 датосастсес тоудсєпасо єддсадссає даєстодіте сдсотодсао саєсадсвдав 560
Ззадассатта зсассостса здазазасєзо садазтаєта дессастодї гсотозасох 720
Чоагссодсад 723 «2105 148 «115 705 «2122 ОМА й «йі3» Акт тісіз! 5едцепсе «0» «2а3ю Ти5тОоп ргожети «4005 лав ассвдсоляд заассасєтву сассустісай дазавасядс адаататтац сесестдаєс 50 сдсазасоза дсссосаусо сохтасзоса сататтассая дсасссатод тсуухавсваї 120 ассестдяашса дсссуаатяну сазазатова зазудсастуа атсоосзазває єЄзасасстоо 180
Чааадсадсс дтадсоосса єЄадстєтсто вдсаатстос асстасоасаа содтпваста 240 акоаттсато зазавадстЕ їтастатаєє тастацесабва сстатттссу сттесСаасаа 300 чЧасаїсадай яаватасєсва вааїдатава сазатадтос адтасатста тазатасаєс 360 асстатссво асссдаттстс астуассала зосусасота аїасєстоаїтЯ садсавачає 420 дсадгатако дістосатав састсаєсаю часоосаєст стозоустдва адааааєдат 480 сусатстска сбадсосдає саасоласає ссоаєсоата тобаєсатоа адссадетс 540 тІгоотоасат їтстдастод саасобтаде ссастддціс садсадзатто ссатастасу 600 сдісассдіє дссоссууса Зсоїсостааа автстоєоує садсаєвосеа хтатавтсох 66 аассасаєс обатсозоатоа тозааєствад оодтадесстта азадесста 708 «МО» ЛЯ9 «211 АВ «12 ОМА «23» АгЖІТтісіа! бедценсе «Ох «223 туєзіов ргожеїтп «00» 143 сосасвдсад сасататтас соадсасссяє дотсогадса атассстоаа садсссдвах 60 ддсадвавато азааздсаст додтсосаза аттааслосєт додзаадсач ссерадсаде 120 саєаасттсс тодосватсс усасссосує засодтдаас тодсаастса созазаадоє ї18о їтстастата сстакадсска Часстактсх састтссазо дачзЧчаєсва аоазазасасс 240 зазаасдата засазатовї дсвзотасатс таїдаатаса ссадстакссо здатсосдахх 200 сЕшстдаєда аазосоасасо таатадстої Тудадсааава аєусадаата гоаосстотах 360 засасттаєє здаасадсат стттваасто ааадаазася зхсодхасттх саєваусахе 420 ассзатдаає атссдаєсда саодватсає даздссадсї Есе соЧеде атестата 450
Чоехосадсо асодтадтаа соосоадтовс сстстдодес тоодсайуєсо єдттаєссох 54 аазІстдазас содаваяосоу Стобзбоаєс ТТЕстоОаза Бассудсаз засттосєдав 6500 ахостдадес тостазааса осаттатада ссосятсотс сатаєсос ба «2105 150 «11» її «вію ОМА «г13» АРТІТіста! зефцепсе «вах «23» Тивтоп рготеїпй сосдстадст тттатсЧєсс одастодадс дсазтудсаєс цеадседеся дассуєчасс бо зосаставасс вобітсвада заатоаЕкіс ухозанаааї ссозассаза засад. 125 ахдасстсїс кодазоассас субсяаааєє свсоааасоє тдадсстост давасавсаї 180 татсоататто ттсотесаст дадсстодса зоспосодта дспаасвасся сассосадса 240 сатаєтаєсо дсасссут99 тсодсадсзає ассстдауса дсссддаатад сазааатоза З00 вапдсастов дісосаадаї сааєвоєстод даавосласс дхадсодесяа садстекето 360 васааїстеас аїстдсаїаа тоосдаасто стуаїїсато азададоастє стастатаєс 420 тасавдссаца сетатстттсу сттссаадза дадаєсазад зазасассаа азасдасааа 48 сазаєцатус адтасатста тазатасасєс адстасссод зіссузжсеєх дстдатааза 540 звадасосасота атаостдеко дапсвайвдат дсадаатаєо оєстуєаєзоа саїстаєссад соб часддсатст сСстозастодаз адазвассає сагастсстсєЯ сдздсаєдцає саасоаасат бо стдаєсдата топдассатода аоссадстт тттодтасає тестоох9Ча 711 «УОЗ 51 «211 28 «їй» ЕТ «13». Роецаотопах аегудіпаза «300» «308» бепвапкадАд?25730.1. «3095 2000-03-19 «3135. (70.97 «40а5 151
Ге 5ег ТК АїВ Аа др Мет сіп біу уа1ї ма! Таб о Азросіу мес А1а ї 5 10 ня бег діу ви дер Гуз А5р о туг І ей Гуз рго Ар Ар «2105 152 «?і1іх 4148 «212» ВВ «ФІЗ» Резендотопає аегудіповза «300» Що «З0Я» бепвапк/АдАаЗиЗО «305» 2000-03-29 «813» -(13..6483 «005 152
Меє Сен Аго су цецз Аа АТа Уа! бек сеу цем бек Сем сец зег Аа 1 5 10 15
Рго Сей це Аїа Аїа сіц Су5 5егоУуді Абр ї1їве біп с1у деп А5робій 30.
Мес біп Рбе АзпотТвгодеп лід їі твгб ма! Аброгух бег бух Бу5 сп вве ств Ума! дей меш Бек Ні Ро бі Ази беу РРО оїу5 дви ма! меє бо
О1у нія Ап терома! бец бек тик Аа АТа Абр Мек біп б1у Ма! ма! 65 70 7 80
Тк Ар б1у Мет Аза 5ег о біу цем Ар Гу Ар Туг іен бує рРго А5р 55 90 95
Азр бег Аг Уа! їТе Аїа Ні тс оїуз Сей ї1е біу чек б1у Ту Гу 100 305 о
Ав баг уаї ТК о РНе АБр о МУаї зег вух іви Бу сіц біу бі ої тує 115 120 125
Меж Ре Рнє Суз Тиг Ре Рго Ту ніх 5ег Аїа гей меж Гу5 оту ТНе 130 135 140 цей твгозец Гуз 145 «210» 153 «її» 35 212» ЕТ «213 АРІ тТістві бедувепсе «220» ши хей3» Жти5тоОп пгт «З005 «01» Б. Р. нОоїіпдек, т. Спієтепден, В. 2. ШИ 25, й «302» вак вні рерїійе5 зптіадопіле ВС1-хІ Тупссіоп апіа тадисе арорхові5
ТВгоцов сутоспроте с-1пдерепіснт астімаєіомп ої са5разев5. «З03» Зонгнаії Є віоТосіса! Спетізєгу «Зах 7 «303» АС: «З0б» 13298-304 «307» 1995-05-07 «А» 153 сіу рго чего біп о Рко тготуг Рго б1у Аер Ар Аіа Рго Уа! б1и А5р 1 рі 10 15 уеи хе дгу Ре ма! сіУ Аго сей тез Аїа туго Рпе Є1у Абротвг Те 26 25 30
А5п Ага АгО кій» 154 «211» ЗА «212» РТ «2135 АгЕітієЄзді 5едиепсе ква . «223ж тив5іоп вгожеїй «3005 «301» Б. Р. Но їіпдег, ТТ, Спіттепдеп, К. 5. ГШитЕ «3025 вак ВНЗ Рертійеє Аптацопіхе всі-хі. Бопсстіоп ап тлацсе Арорховів о жВгоБув сСутоспготе с-тпдерепіаєпу АстіУуатіоп ої Сазразе» «303» Зойепа! от втоіодієвї Спеті5їту впр ДИ «305» 27411953 «306» 13998-304 «3075 1999-05-07 «М» 154
О1у РГО АгО Аг Рго Аг Аг Рго с1у Ар Абр АТа Рго маї сіц А5р 1 | 5 ла 15 цей І116 Ага Рйе ма! б1у дк Мей о цез АТа тує Ре сту Аборти" 1їе 23 30 деп Ага «2105 155 «Кіз 93 «оЇб» РТ «2135 Ното зарівпе «3005 що и Що «301» Мергамі5пїа3 Кк, ВеїТотаєіа А, РОЇїжіо б, Расі М, Меїіпо 5. «302» ветісчісп ВТМІ-СССт)Ірерсіде: а роїептїаї пистіведзе вп зей Біхог ої нібтопе йеасетуТазе еплутев «3035 Віоснептізсгу ж304» 13 «3055 49(2) «306» 259-8 -3075 2010-01-19 «4005 155
Агу Тигонія Ті Ази те омаз! маї Аїа 15 же сій АтТа Бу» тів Рго 1 5 10 15 сту АТа їуз Ага нів діа си 20 «105 156 «вт 7555 «212з РЕТ «213» ното зарівєпе «ЗО «3085 бепвапк/мрР. 006045 «3095 2011-08-01. «313» (23..0236) «00» 156.
АТа бій Рко б5ек АЗя АТа Те бій 5Зек нів бак тІТе бек зви бек 5ег 1 5 10 ї5 вне б1у АТа бін рРго бек АЇїа вро біу ЄТу біу о1у бег рРго сту А1а 20 25 за бух Рго діа іє) б1Уу ТВговує бегосСу5 бег обЗег беє Су АіЗ Мма1 Ні «0 45
Авр бе ї1е Рне терка АБроуд! Гуз уз тйгоб1іу рве уаї Ре С1У за З БО
УТвготвгоген ті Меї без о рео Зег без діа Аа вве бек о маї ї1є 5ег 70 75 8о0
Мат маї зег Тут їец ЇТе Сеу АтТА Гец грец бек Уа! Твк її б5ег Ре
85 90 95
Ага іє тує ув бег Уа! ї1е біп АТа ма! біпову5 зег біз єї сту 100 105 410
Ні его РПа Гуз Аїа туп івц Ар Уа! Ар їїе Тк Бей беє заг с 115 120 125
Азїа вйе нія д5оп Туг Мет Або АТа АТа Меї Уа! Ні ті Ап Ага Аїд о | 135 | 140 ви бує цей тів т11Те Аго сей Ре се уаї бій А5р бе уаї А5розег 145 150 155 ібо
Сен бує Гей Аза Ма! еРйе Меї Тгробец мМмеї їпйг Тує Маї с1у Ааїа Уві 165 170 175
Ре Аби біу 116 тибР ге гей х16 рей АТа сій ре) Бей 16 РНе чег 180 185 190
Ууаі РКО жів Удії тук біб Гуз Туг бу тве б1й ІТе А5р ніх туго ма! 195 200 205 сіу те Аа Ага АЗросій Тег оїуз Зег ї1е ма! сів єу5 їТе св АТа 210 215 220 бух Сей рго біу тліє Аїд ух уз у5 Аїд 1 225 230 235 «210» 157 «в11» 2872 «Рій» РЕтТ «135 нНото хартепе «ЗО ; «3015 Зеіптуазоїа 5М, Айтай М, Масвагіапе М, виб 2, Нрапу сх,
Бегпатівє-Аіпетті т, АТпеткі Е5 , «302х депегатіоп ої сопеізіїосічеїу астіуе кесошмбіпапі сазрабез-3 апа -6
Бу геаггапдетезт об тпеїк 5убупітте «3032 зогла! ої Віоіодіса! Спемізжгу -80ах 273 «052 17 «306» 10107-11 «307» лаа8-04-24 «005 157 мет їіє бій Тиг Ар о5егє ві узі АБродбр о Азо меж лій Суб Ні5 у 1 5 10 в лев Рко Уа! А5р АТа Авр РНЄ їеу тТуг АТа тук век ТР АТа Рго бу туп тус век тер Ага Ап яег о їуз АБрооТу бек Тер Ре їТе біпозег «0 45 цем Су Аїа Меї бен о цух біб ТтТуг Аа А5роїу5 во сід рНе мет ніх во ті зе тйг Аго ма! Аби Аго вух хяаі АТа тягоб1у Рае сім бек о РНе 65 і 70 75 850 бек Ре до Аза г оРпе Ні Аїа ух | у5 бій ї1і1е Рго Суз Ії« ха 85 З 95 сег мах грец Тиг вуз бів ей туг вве тує ні Азр Ммаї Ар сту мех що в 110 бій Аби Твг обі Або хек ома! Ар озек о гсуз ек І116 Суб Ап рем су 115 125 125 рго суб ї1е тів нія сіу зег бін бег Меж Ар озег сту мех зег Тгр 3 335 т4а д5ротпгосіу туго суз Мек дер туг Рго сій мет е1у цай сСух тіє ше 145 150 155 1050
Т12е А5п о АЗпоіуб АЗИ РНЄ ія Туз 5ег Тк о б1у Меї Тиг 5ег ле чег 65 170 17 зу тиг о Авроуаї АВ Аа Аа ап бен оАку бід тигоРне т5а А5п ОКей 180 1855 НК іу5 тТуг СТ маї ага АбЗпогує АБИ Аярогсео тк Абу біо біо ї1е о маї 195 200 205 бій фей Меї Агб А5р о маі 5ег Бу5 бів Або Ні бег о вує Агу бег 5ег 210 215. 220 вне Уа! Су Уаї ге ієм бег Ні 61у 68 сіб б1у тіє хі вве су 225 230 235 240
ТАг ОА біу вго маї Ав о сСец вуз вух ті Тйг о А5а Рне Рве асо ох 245 250 25 д5роАго сСух Аго бек о бви Те Є1у бує вро су ген Ре тів тів бів 250 255 279
Аїа Суб Аго біу Так оаїм Беу Або Су Є1уУ 775 20 -2105 158 «7115 б «21йт РВТ Ш «213» Ното зарігаб «300» «3065» бепвапк/дАСо4947.1
«3095 1998-07-01 «3135 (14653.. (2053 «400» 158
Аїа Аго вуз сіу уз біу віп тіє січ їу5 Ага вух ев Ага бін гу» 1 5 10 15
Ага ага бек тіг о о1у Уаії муаї Ап тів Рго АТа Аїа сій Суб тей Ар зо сі тує біш Азв Абробіц дідо оіу бій Суб бі Аго Гуз Аго бу АБО
Аа тх1е тТнгобіо Єтй Ай тб жі б1б Аб5ло сі Аа 0 55 60 «2105 159 «211» 5 «2ї22 ВТ «А35 Ното 5арієпеь «300» | шо «3085 бепаапкумР..ОбБУ5О «309» 201-06505 «3135 (1Р..54) «4005 159 мес Рго оту уз Сує АТа Ага Куб Ап АїТз бій Ро бек РГО АТа АгО 1 5 10 15
Аїа РКО АТа дії їео ої Уа! бій Су Аїа тВк сій Шеу АКо Аг вве 20 25 30 с1іу Аброєуз ген АБИ Ре Аго біп губ сей гей Ап гео тів Бек гу 35 40 45
Бей Ре сСух чає обіу таг «100 160 «-21її» З «812» РТ й «2135» Мото зарієне5 «300 «З0ЖУ СЕКСІ -КІСЬІМО РЕРТІОЕ «ЗО» щОо2г005001582 «31їз 2005-03-22 «3125 2008-01-05 «4005. 160
Гу Сей ей АЗп Се Іїе бек Гуз 1 ви 1 «Р1б5 161 «вії» 27
«2125 ВЕ , «2135 Ното 5артепь «300» І «302» МОУКІ НЗРУЗЙ-ТАКСЕТЕВ, АМТІЗСАМСЕЯ СНІМЕКІЄ РЕРТІВЕ «3105 мОо2010055929 «31. 2009-11-13 «312» 2010-05-20 «Ай» 61 сій ї1є Куб ІТе тер вве бій Ай Аго Ага Ме бух Тгроцух бує їм ії 5 о | 15
АТа тує Аїд АТа АТа со1у дп бег Туг РВЕ Куб 25 23 «1» 162 -24їЇх 29 «217» вт «2135 Мото зарієйв «300» «З0ї1ж бйво м, задапаєнап 5, тТикКзой що «302» А сеїйІ-регтеабіє 5таї3 5Н2 дотаїй ттекіс іпанібтє5 са астііуакісп апа ї1пбисез аптітсцтогК се1їії еттеств іп Уїтко «303» зоигпа! ої віоіодієй! сЄпейптггу «304» 255 «305х Я «3065 35855-65, «307» 2010-11-12 «308 делварк/ не. 644805 309» 2011-96-05 «313» (517)..(544) -4005 162 енпе тів зебр груз 5 Аго Аго бі Або АТа ті фец о 5егботни Су Рго 1 5 160 І5
Рго біу Те ре бец еп Ак пе бег бі) бек о бЗег Гу «ВО» 183 «іх 15 «12» РЕК «РАЗ» Номо варієпь «Ох що «308» бепвайк/дАА?ТЯ466,3 «За» 1995-08-18 «3135 с723..586) еВщОз 163 сіу біп Уа! біу Агу біп се) АТа їіе тіе бу А5р дер ї1е Ави 1 З 15 15 «210» 164 «Ії» 97 «2125 ват «13» ною зартепь
«З» й «ЗІ» жало зб, ЯНапа й, СпокзЗі 5, зНап 5, Що й, сСгосе СМ, Аїпетгі Е5, і когпоаоій Кк, НоапЯ Я. | ше «3022 сеї! регтедаріє 8сТ-2 Біпаїпо рертідеє: а спетіса! арргоасі хо арортовтія їпінстіой їй соток се1!15 «303» сСапсег везеакер «ВОЯз 80 «3055 б «3065 1498-502 «307» 2000-03-15 «4005 1364 кує Ай оіву Тгр о Аїа АТа бій Ага туго біу АгЯ бі ге АКЯ Ага мех
І У 5 10 15 зе Ар Бій Ре с1у Зіу бег Рпе Су З1у їМец го а «10» 165 хйії» 29 «ий» РТ «213» Ното зарівпь «300» «308» бейвапкусАб46760,1 «3095 2004-06529 «3135 (1473..(17513 «4005 165 вує Ре стш Рко рух зег сту тгромеєс ТВг Ре їеу бій маї тат біу 1 5 і 10 15
Гуз Ії суз він меє гей бег (ер й уз «їй тук Сук «210» 166 «й1їЇ» 32 «їй» РЕ «213». Ното 5арієйе «ЗО» | ! «3015 КО ак, сСпої КН, Рап ох, іп орг, меїб5Ледек М, Кіт См, Ма 3. «302» тТВе хаї!-айслогімйа йотаїп ої ВТ11 па носі тагдєт тітосптопагіа! тейргапе регтеавтїтву жо іпдосе ароржо5ів «303» 22 сеї ст. «304» 120 «305 16 «306» 2919-23, «3075 2007-07-31 «8005 166
АгЯ Маї 5ек Ре Су5 Ага Рго б1у Тгробег АТа Мех АТЗ Ага бег АгО 1 5 | 10 15 їен тйгодіз тйгобЗаг о маії 5Зег бів Узі оїл їй Ап пу Ре уд! гу жо 23 30 «Аз 167 «2312 5
«212» РЕТ «2135 Ното х5арівпе «а0й» 167
Сув Рго Ага Ага го тТуг 1. ї «2105 168 : «Ії» 13 «ато» РЕК І «Еї3» МНошо зарієй5 «3005 Й «308» МмсВт ветегепсе 5едцепсе/МчР. 002690.3 «3095 2011-04-19 «313» (3343.,.(3443 «4005 168 ств сім бів Аа ма с1у лк9 цув Ага ув Гуз дгд тиг «-210» 1695 «24115 З «2125 РТ «вї3юх РЕЯ РІсіаї бедоепсе «Й «23» БіехіВів Тінкес «ч00х 169 5ег б1у Сух сіу 5ег 1 5 «23105 170 «ей ж 2125 РЕТ «213» АРІЇТіЄТаї 5едцепсе «РеОх «223» Редутатєіот ЗіяКкег «А0О» 170
Аа зег бу су су рго біш «Ох 171 -2115» 7 кої? Р , «БЕЗ» АгттІтсЄіа! 5Зедуепсе «220» І , «ваЗ» ММР ркотедбзе сігамаде зіхе «4005 171 реко беж со1у їїа АТа б1у у 1 5 «2105 172
«ЯМ я «в ВК «13» Агжі1ттсія! 5едиепсе «Раб І «23» Бгіпт сіватудуе 5іте «3005 н «301» спаго5 ям, Божу ре, 5СВ1Т1ек зт, Оау РМ «302» Сієдмаде ої спе раріНіотаміги5 тіпег о сарзій рготеїв, 2, аг а
Твій сопеепзув зії і5 песез5агу Ток іптестіоп. «303» Ргос масі! асай зсї у А «-3045» 193 «3052 5 «306 15995. «3075 2006-01-31 «4005 1772 по Суб сух ага ув! ув Ага «ві» 173 «ії» 7 хорах вт «2135 АгТігісіа! Зедцепсе «вв «223» ММР сіедмаде 5іте «0» 173 вго Сен о біу геи А1Та су вій 1 5 «9105 174 «231» 6 «вію РТ «213» Агтітіста! чаопепсе «вах | і «03» Нгопій єіедхаде вів. «4005 174
Бей ма! рРго Аго біу зЗег 1. з «105» 175 «21їх З «1 РЕК. «2135 АгГТТжтсіаї зедицепсе «вх «23» ЖіехібБів 5тегіс Тіпкег «НЮ» 175 су «у сту с1у ваг в5іу віу оту бек «2105 175 «г1ї» 107 «212» РЕ
«213» Реецботопа5 аегудіповза «308» сепвапкліткКо А «-3055 2008-08-24 «313» (9515. 53573 «4005 176
Рко аіїй бту б1у чего Сей Аїд оАТа Ббеу ТАс дід ні бій Аїа Су НІВ ії 5 10 15 іїецп Рго ге бі те Ре ТАК ака ніх ага сій Рго дго оіу Тер оби сій ів би 1 Суб оту тук рго Уа! Ти Ака сен о уаії АтТд Себотуг іїєи Аза АТа дго ів бег тгроАба с1п о Уді Ар сп Уа) ї1е Аг Аяп 50
Аїд ген АТа бек Ргообіу 5ег сіу 1 Ав бе о1у бій АТа їТ1е Аго 55 різ 75 30 січ еп Рго біб сіб АТа Ага без АТа цей тн Ге) АТа АТа АТа сти 85 зо 95 его сі Ага Ре уаі Ага біп сіу тик осту деп 100 105 «2105 177 -211» 8 «125 РЕТ «біЗ3х АРтігієзтаі бедчепсе «2205 «23» жгішегілатіоп ботдіп «НЮХ 0177 с АТа Аа су ва Аі1а АТа су «2105. 178 «гії» а «їй РТ «213» АгРТтІТісіа! бедиепсе «720» «во3» жгітетігаєіоп дотаїй «4005 178
ТУ АІа дія 1 СУ АТа Аїа АТа суб ка 179 «21» В «еї2м РВЕ
«2135 дктіжісіа! бвдмепсе «б20х ; «223» тгатегігатіоп дотаїп «3005 179 суз АТа лів Аа су» АТа АТа суб «105 80
ЕТаше ше! «Ще» РЕТ І . «13» АРІ РІСЄтТа! 5едцепсе «Ох «пої бівхівів І1тиКкег «МЮе 180 сіу су сіу сту Бер оту віж Фу сту ії «2105 181 чвїї» 7 «125 РК «213» нНото зарівнь5 «00» 181. зуб РгОо дкЯ АгОо ро Туг да ії «їй» 82 «вАїЇ» 5 хг12» ВЕт «2135 АгжітТіста! 5Зейцепсе «в ки?3» БіехібТе Тіпкег «005 ВО
Фу біу бек Ні5 б1У ї шо 5 «КМ» 183 «11 «212ж РЕТ «13» АРЕТТІісСтТа! бешепсе сг?О» «223» Б1іехібів ТїпкКег «00 183 заг біу віу Сух бЇм Фф1у 5ег 1 З «ЦІ» 184 «21ї» з «2і1й4з РТ «віЗ» дж КістТаї б5едуєпсе
«223» іехірТвє ТіпКег «4005 184 діа АТа суб АТа Аз

Claims (17)

1 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Злитий протеїн, що містить: домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну ПТКАЇГ, що здатний індукувати апоптичний сигнал, причому даний фрагмент починається амінокислотою з діапазону від НТЕКАЇІ 95 до ПТКАЇЇ 121, включно, а закінчується амінокислотою ПТЕАЇЇ 281 або послідовністю, яка має принаймні 70 95 гомологію до названого вище, і домен (Б), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, що здійснює свою проапоптотичну дію через властивий йому внутрішній шлях апоптозу, та вибирається з групи, що складається 3: - фрагменту домену ВНЗ протеїну Вах послідовності ФЕО МО: 30; - фрагменту протеїну Віа послідовності ЗЕО МО: 31; - рибонуклеази А послідовності ЗЕО МО: 32; - цитохрому С послідовності ЗЕО МО: 33; - фрагменту протеїну ЗМАС/Оіавріо послідовності ЗЕО МО: 39; - онконази послідовності ЗЕО МО: 41; - фрагменту протеїну Мата2 послідовності БЕО МО: 42; - пептиду, що зв'язується з Мата послідовності ЗЕО МО: 43; - фрагменту луназину послідовності ЗЕО МО: 44; - пептидного інгібітору протеасоми послідовності ЗЕО МО: 46; - пептиду, сконструйованого з протеїну аРР і домену ВНЗ протеїну Вах послідовності ЗЕО МО: 153; - домену 5АС з протеїну Раг-4 послідовності ЗЕО МО: 158; та - пептиду, отриманого з домену ВНЗ протеїну Вак послідовності БЕО МО: 163; при цьому послідовність домену (Б) приєднана в точці С-кінця і/або точці М-кінця домену (а).
2. Зпитий протеїн за п. 1, у якому домен (а) вибраний з групи, що складається з ПТЕАЇІ 114-281 (ЗЕО МО: 27), НТВАЇЇ 119-281 (ЗЕО МО: 28) та НТЕАЇІ 121-281 (5ЕО МО: 29), НТВАЇІ 116- 281 їі Зо НТ ААЇІ 120-281.
3. Злитий протеїн за п. 1, у якому домен (а) є послідовністю ПТКАЇІ 95-281.
4. Злитий протеїн за будь-яким з пп. 1-3, який між доменом (а) і доменом (Б) містить домен (с), що включає ділянку протеазного розщеплення, розпізнану протеазами, присутніми у середовищі клітини пухлини, вибраними з послідовності, розпізнаної металопротеїназою ММР, послідовності, розпізнаної урокіназою шРА, послідовності, розпізнаної фурином, і їх комбінаціями.
5. Злитий протеїн за п. 4, у якому послідовністю, розпізнаною металопротеїназою ММР, є ЗЕО МО: 51, БЕО МО: 171 або 5ЕО МО: 173, послідовністю, розпізнаною урокіназою иРА, є 5ЕО МО: 52, а послідовністю, розпізнаною фурином, є ЗЕО МО: 53 або 5ЕО МО: 172.
6. Злитий протеїн за п. 4 або 5, у якому доменом (с) є комбінація послідовностей, розпізнаних металопротеїназою ММР і урокіназою іЇРА, розташованих поруч одна з одною.
7. Злитий протеїн за п. 4 або 5, у якому доменом (с) є послідовність, розпізнана фурином.
8. Злитий протеїн за будь-яким з попередніх пунктів, у якому домен (Б) додатково зв'язаний з транспортуючим доменом (а), вибраним з групи, яка включає: - (а1) послідовність, направляючу у ендоплазматичний ретикулум, - (а2) поліаргінінову послідовність, транспортуючу через клітинну мембрану, що містить 6, 7, 8 або 9 Агд-залишків, - (43) домен транслокації Рзеидотопах аегидіпоза, вибраний з ЗЕО МО: 54 або ЗЕО МО: 176; - (44) домен мембранного транспортування, - (а5) домен ядерної локалізації і - (аб) мітохондріальний домен націлювання та їх комбінації.
9. Злитий протеїн за п. 8, у якому послідовністю (41), що направляє у ендоплазматичний ретикулум, є КЕОЇ (5ЕО МО: 55) або КОЕЇ (ЗЕО МО: 56).
10. Злитий протеїн за п. 8 або 9, у якому послідовність (41), що направляє у ендоплазматичний ретикулум, розміщена на С-кінці злитого протеїну.
11. Злитий протеїн за п. 8, у якому поліаргінінова послідовність (42) розміщена на С-кінці злитого протеїну.
12. Злитий протеїн за п. 8, у якому поліаргінінова послідовність (а2) розміщена між доменами (б) і (с).
13. Злитий протеїн за п. 8, у якому домен транслокації Рзхенйотопазх аегидіпоза (аз) розміщений між доменами (а) і (с).
14. Злитий протеїн за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково включає домен (є) гліцин- серинового гнучкого стеричного лінкера між доменами а), (Б), (с) і/або (4), у якому гліцин- сериновий лінкер вибраний з групи, що включає: 5505 (5БО МО: 57), зОО5 (5БО МО: 58), свасце (5БО МО: 59), С0БДБИС (5ЕО МО: 60), ИОаБИС (5ЕО МО: 61), ОСОСІВОСО (5ЕО МО: 62), асавасавз (5ЕО МО: 63), О0ДбХОЗССІЯСО (ЗЕО МО: 64), АБОаСІ (5ЕО МО: 65), ОЖМОИБАБОСЯ (5ЕО МО: 66), ССБП (5ЕО МО: 182), БаС,ав (5ЕО МО: 169), СЬЗавОСОЯО (5ЕО МО: 180), ЗзООоС(ОО5(5Б6О МО: 183) і ААСАА (5ЕО МО: 184).
15. Злитий протеїн за п. 1, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає: ЗЕО МО: 1; 5ЕО МО: 2; 5ЕО МО: 3; 5ЕО МО: 4; 5ЕО МО: 5; 5ЕО МО: 6; 5ЕО МО: 14; 5ЕО МО: 16; 5ЕО МО: 17; 5ЕО МО: 18; 5ЕО МО: 19; 5БО МО: 20; 5ЕО МО: 21; 5ЕО МО: 22; 5ЕО МО: 23; ЗЕО МО: 93; 5ЕО МО: 99; 5ЕБО МО: 100; 5ЕО МО: 101; 5Е6О МО: 102; 5ЕО МО: 103; 5ЕО МО: 104; 5Е6О МО: 108; 5ЕО МО: 109; 5ЕО МО: 112; 5ЕО МО: 114 і 5ЕО МО: 117.
16. Злитий протеїн за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково включає, як свою С- кінцеву частину, послідовність ПТКАЇІ 95-121, перед якою розміщена послідовність протеазної ділянки розщеплення, що забезпечує її відщеплення від конструкції.
17. Фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт злитий протеїн за будь-яким з пп. 1-16 у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм.
сайт розщеплення пра, ММР полі Агер послідовність фрагмент протеїна Вах | | Ша Щи 194 за Приклад 1 сайт розщеплення Ра, ММР полі Агро послідовність І ТА. фрагмент протеїна Ви 195 га Приклад 2 І нжер І : сайт розщеплення пра, ММ . ТВА | ВМдзеїй домен направлення в ЕР 303 аа Приклад З тва Нінкер ВМА-зе шк 793 га Приклад 4 Лінкер : сил ТВА Кайх розщеплення пра, ММ й цитохромсо ломен направлення в ЕР Що ! і ШИ | щ 285 за Приклал 5
Фіг. 1
Лінкер домен транслокації сайт розчеплення фурину Рвепдботопаз | домен направлення в ЕР тні. пінкер Лінкер цитохром Со Ці | щ- 407 аа Приклад 6 Лінкер сайт розчеплення фурину Гранзим. В | | Лінкер ТВА. «вини «ан. 409 аа Приклад 7 й Ф Лінкер сайт розчеплення фурину : Я омен направлення в КР ТВА Лінкеро | Гранзимв й Р 405 аа Приклад 8 сайт розщеплення пра, ММР полі Аги послідовність пептид Миг7 7, ! ТВА, ' ! . 187 ва Приклад 9 сайт розщеплення Ра. ММР полі Агя послідовність фрагмент протеїна Вак ТКА. 193 аг Приклад 10
Фіг. 2 сайт розщеплення па, ММ полі. Аге посліловність домен ВНЗ протеїну РОМА С КА 204 аа Приклад ІЗ свит розщеплення пра, М! щк з т Що яка | ММе РОМА пори направлення в ЕР 372 аг Приклад І2 домен транслокації , Реєчпдстютах Лінкеро! сайх розчеплення фурину | що ломен ваправленця в ЕР. ТВА ОЗнВКер | Лінкер РУМА ; 493 за Приклад 13 сайт розщепцнення чРа, ММ? по Ате послідовність фрагмент протеїну БМАСЛавів ДНА. 186 за Приклад 14 саят разшеплення цшРа. ММ Буфорин Не. | ТВА 191 аа Приклад 15
Фіг. З
ДЛінкер «сайт розщеплення пра. ММР ТА, і онконаза 2179 аз Приклад 16 ТВА, ЛДінкер онконЯза ! Й і 214 ва Приклад 17 сайт розшенлення ра. ММ Р полі Атр послідовність. інібіор МОМІ | ТНАї, 97 ва Приклад 18 сайт розщеплення Ра, ММ Р. полі Ага посліловийсть лолі Ага пос пІлоВшсть | тва інгібітор рІЯ, ! ЦЕ 189 за Приклад 19 сайт розшенлення пря. ММ. полі Агр послідовність - пептид Лумазино 1. ТВА 195 ав. Приклад 20
Фіг. 4 шт розщеплення пра, ММ? сайт розщеплення пра, ММ полі Агя послідавність полі Аге поспідовнсть фрагментемаствне ТВА. о уфрагмент домену ВИЗ ВІ
ШИ . ши хі8 ва: Нриклад 21 шо сайт розщеплення пра. ММ. Я інгібітор протевсомМи тям 50010 хлолі, Ако послідовність їі ва Приклад 22 Лінкерсайтрозченлення ФУрИНУ ! І; пшібітор протеасоми о «в
ТВА. ще : домен направлення в ЕР 280 за Приклад 23 пли ВИТ розщеплення ша. ММ фрагмент ліганду ТМЕ | тва 183 га Приклад 24 ШИ Щ о сант роезінепленняхіра, ММ фрагмент ліганду МК тТВАК. 179 ага Приклал 25 кайх розщенлення пра, ММР І фрагмент лианду ТМЕ ТКА Ї ! ! 1 М Й Й ї М й 180 га Приклад 26
Фіг. 5 твккевовВі трансєпортувальний домен РЕ єр націлююча послі довність Тонке і в : Лінкер ! сайт розчеплення фурину ' Лінкер пня Я " Лінкер. людерка пнае Прихлад 27 459 за транспортувальний домей похідний з Ме? пептид зетсайт розшенлення пра, ММ тин оч:тВі І НА о ! 713 ав Приклад 28 похідний з азурину петптил п сайт розщеплення Ра, ММ? ВАВ 204 ав Приклад 29 сайт розчеплення фурикує----л ЕР Націяююча послідовністі ТААНЛІЮТІВІ лінкер ; похідний зазурину пейтнд! ше 705 аа Приклад 30 сайт рОЗщеллецня пра. ММ «сля тва ІБКЕВ ення | похідний з азурину пептий І | : ! ! шо ! 207 аа Приклад 31
Фіг. 6 сайт розшеплення ура: ММР---: ТВАНЛ?О: ІВ | й
І . азурин ЛІНКО О : 327 ав Приклад 32 транспортувальний домен охідний з ХЗМАС/Юіаріо йпсптидо сайт розщеплення ВР. ММ рда зві ФІ 199 га Приклад 33 транспортувальний домен ще пан Їх вай ВОЗЩеплення вра. ММР жідний з ЗМАСТт нано есе теАЙ ою ТВИ пептид ГОрорчннннян ВІНКЕР І : ци ! Ж ва Нриклад- 34 транспортувальний домен 4 Ту мі с: ч й й й дор сука - я /- цахідний з Білас ОТАВЬО говайхт розщеплення пра, ММР твановові пептТяд |. і 717 ав Приклад 35 транспортувальним домен похілний заявах пептид о с--- сайт ог еплення її до похідний зар Бах пет А сайт розщеплення пра. ММР ТАНЯ дви Щи 72 аа Зіриклад 36
Фіг. 7 транспортувальний домен Щ І Го о----кайт розщеплення зра, ММР дний зарРрР/Вах пептил | : ТВАНОБ-ЯВІ : РО нн - - НКЕЮ ' ви і 247 ва Приклад 37 транснортувальний домен я--5 ТЕАтАІВІ х о похідний з арр/Вах пейти? ! сайт розщеплення дра, ММР -о і: й : ах певтид Н 1 ї 1 ; І ! Н З 1 ! Н 212 аа Приклад 38 трапспортувальний домев похідний а КІ МІС 17777 сайт розшенлення орв. ММ дню що пептид ПОВ рн - - - о А Кер КИ 221 аа Приклад 39 вм пінкер- свт розщеннення пга, ММ зва звові транспортувальний домено ої 5 лікер ! ' ше ! 435 ва Приклад 40 ТЕАТР ТВ ' транспортувальний домен РЕ сайт розчеплення фурину | похідний З касмаза- пептид ЛІНКеЕр о І лінкер ! і ЦИ Й Н Н 380 аа Приклад 4
Фіг. 8 хтрансплортхувальнни домен похідний з Ра ЖАЄ | тен сайх розшепнення зга. ММ? беж: 1 Е ТВА 9-2 ломен ! | рот жнкер : Н НИ : 447 ва Приклад 42 Транспортувальний домен ТтТрапспортувальний домен нохідний з Ра ДАЄ ун - - СВЯТ розшеплецня дра, ММ Шо домен ! ренннттттнттт- Л ОН НЖер тами 260 за Приклад 43 сайте рочщенлення чра. ММ -трансепортувальний домен ТКАНЯБЕЕ лвЖер-я оф жінк -- 3100. Моха : НЕ ! 270 ва Приклад а сайт розщеплення пра. ММР::----500х транспортувальний домен ТВАПЛЯВІ я вів 5-5 ! : КОР ї дінкерояяя РОЇ Ске 207 аз Приклад 45 сайт возщекпотення ча, ММ (он ВінКер онконаза Го дн інКев ТВАНО5 ВІ ЗІ ва Приклад 46
Фіг. З р-н Ттранспортувальний домен похіпняй ЗРИМА ВНУ. кШ Що | н ле домен | р сайт розщеплення пра, ММР пМУИ 730 ва Приклад 47 сайт розщеплення пга, ММ Р транспоріувальний домен ТВАПЗ5-ОВІ й С дни вив ! лінкер--- похідний з Вій пептня 725 ва Пойклал 48 ! сайт розщенлення пра, ММР ТНАНЯВ ВІ | ' лінкер шин АВЕО-ТРК 234 аа Приклад 49 рено х розщеплення пра, ММ? знаінгібітер 00 2--- дінкер ТЕАНЛ ІОВ 16 ва Пвиклад 50
, . я транспортувальним домен похіІДНИЙ З ВАК ВНІ й пептид ог сайт розіцеплення ра. ММР о твАВаеаВ І 194 га Приклал 5
Фіг. 10
, . та п Транспортувальний домен похідний з Вай ВНІ. їй лення в пиши о" тчайт розшенплення пра, ММР ТАНЯ Ю ОопейтТИдД о |: | | до : ! і ТВАНІ2Я-78ї сайт розшенлення трамеану у 757 аа Приклад 52 о Й щи транспортувальний доме сайт розщецлення пра, МІМР-А-- - и лемен тТВАНО5-ВІ . ще І лІНКЕр -----3..5.. сіно т кер 0 0 похіднийз Ва ВНІС М й ше пептид 236 ва Приклал 33 сайт розінеднення пра, ММ ---«Транепортувальний ломевн о . ! кий пінкер шо : ДТАР пЕПТИЗ ! ще 716 ав Приклал 54 т Кхранспортувальний домен руна розщеняення чРа, ММР с АТАВ деп ! : стві лента Го рн ЖнЖер ТА 81 237 ва Приклад 55
Фіг. 11
UAA201300877A 2010-06-25 2011-06-24 Протираковий злитий протеїн UA111722C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL391627A PL391627A1 (pl) 2010-06-25 2010-06-25 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
PCT/EP2011/060666 WO2011161260A1 (en) 2010-06-25 2011-06-24 Anticancer fusion protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA111722C2 true UA111722C2 (uk) 2016-06-10

Family

ID=44627460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201300877A UA111722C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-24 Протираковий злитий протеїн

Country Status (24)

Country Link
US (1) US9102759B2 (uk)
EP (1) EP2585480B1 (uk)
JP (1) JP5911481B2 (uk)
KR (1) KR101861872B1 (uk)
CN (1) CN102958940B (uk)
AU (1) AU2011268876B2 (uk)
BR (1) BR112012032708A2 (uk)
CA (1) CA2800841C (uk)
CY (1) CY1116099T1 (uk)
DK (1) DK2585480T5 (uk)
EA (1) EA023005B1 (uk)
ES (1) ES2531288T3 (uk)
HR (1) HRP20150241T1 (uk)
IL (1) IL223640A (uk)
MX (1) MX2012015246A (uk)
PH (1) PH12013500050A1 (uk)
PL (2) PL391627A1 (uk)
PT (1) PT2585480E (uk)
RS (1) RS53851B1 (uk)
SG (1) SG186439A1 (uk)
SI (1) SI2585480T1 (uk)
UA (1) UA111722C2 (uk)
WO (1) WO2011161260A1 (uk)
ZA (1) ZA201300677B (uk)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL219845B1 (pl) * 2011-01-05 2015-07-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
ES2388020B1 (es) * 2011-03-10 2013-10-01 Universitat De Girona Proteínas recombinantes con efecto antitumoral.
PL394618A1 (pl) * 2011-04-19 2012-10-22 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
BR112015013183A2 (pt) * 2012-12-05 2017-09-26 Thevax Genetics Vaccine Co Ltd proteínas de fusão para uso como aperfeiçoadores imunogênicos para indução de respostas de células t específicas para antígenos
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
CN103255160A (zh) * 2013-05-06 2013-08-21 徐霞 重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的制备方法
CN103524627A (zh) * 2013-10-14 2014-01-22 成都华创生物技术有限公司 一种增强trail抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白
WO2015134365A2 (en) 2014-03-03 2015-09-11 Acharjee Sujata Chimeric dystrophin-vsv-g-protein to treat dystrophinopathies
BR102014031185A8 (pt) * 2014-12-12 2021-05-04 Fund De Amparo A Pesquisa Do Estado De Sao Paulo Fapesp proteína recombinante indutora da apoptose; processo de obtenção da dita proteína e o seu uso no tratamento do câncer
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
WO2016127346A1 (zh) * 2015-02-11 2016-08-18 四川大学华西医院 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
CN105985445B (zh) * 2015-02-11 2020-02-04 四川大学华西医院 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
CN107249629A (zh) * 2015-02-26 2017-10-13 生控基因疫苗股份有限公司 包含免疫原性蛋白质及组合佐剂并用以诱发抗原特异性t细胞反应的疫苗组合物
CN106164090B (zh) * 2015-03-02 2019-07-23 成都华创生物技术有限公司 TRAIL穿膜肽样突变体MuR6、制备方法及应用
EP3266796B1 (en) * 2015-03-02 2018-12-19 Chengdu Huachuang Biotechnology Co., Ltd Trail membrane-penetrating peptide-like mutant mur5, preparation method therefor, and application thereof
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN111234027A (zh) 2015-05-21 2020-06-05 哈普恩治疗公司 三特异性结合蛋白质及使用方法
CN108026181B (zh) * 2015-10-22 2021-07-02 成都华创生物技术有限公司 一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR6S4TR、其制备方法及其应用
WO2017066962A1 (zh) * 2015-10-22 2017-04-27 成都华创生物技术有限公司 一种TRAIL双靶点突变蛋白MuR5S4TR、其制备方法及其应用
EP3402509A4 (en) * 2016-01-14 2019-07-10 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) TUMOR SPECIFIC IFNA SECRETION BY CAR T CELLS FOR RESTORING SOLID TUMOR MICRO ENVIRONMENT
CN114028549A (zh) * 2016-02-19 2022-02-11 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
GB201602918D0 (en) * 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
US11939609B2 (en) 2017-07-24 2024-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Rewiring aberrant cancer signaling to a therapeutic effector response with a synthetic two-component system
UA129446C2 (uk) 2017-10-13 2025-04-30 Гарпун Терап'Ютікс, Інк. Триспецифічні білки і способи їх застосування
RU2760984C1 (ru) * 2017-12-13 2021-12-02 Иновио Фармасьютикалз, Инк. Противораковые вакцины, направленные на lemd1, и их применение
WO2019147844A1 (en) * 2018-01-25 2019-08-01 University Of Washington Engineered cell death-inducing enzymes and methods of use
CN108324692B (zh) * 2018-04-26 2019-09-24 北京爱泰浦生物医药科技有限责任公司 Atap多肽和紫杉醇类药物共晶药及其制备方法和应用
WO2019222283A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
EP3802619A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 F. Hoffmann-La Roche AG Peptidic linker with reduced post-translational modification
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
EP3877526A4 (en) * 2018-11-08 2023-03-29 Summation Bio, Inc. Mini-nucleosome core proteins and use in nucleic acid delivery
CA3120327A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
KR20220008866A (ko) * 2019-05-14 2022-01-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. EpCAM 결합 단백질 및 사용 방법
WO2021072250A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Recombinant polypeptides for regulatable cellular localization
US12416634B2 (en) * 2020-06-01 2025-09-16 Galderma Holding SA SNAP-25 reporter constructs and methods of using the same
CN113549143B (zh) * 2021-07-21 2022-05-27 吉林大学 一种抗肿瘤多肽Bax-BH3、荧光高分子纳米胶束及其制备方法和应用
CN113717289A (zh) * 2021-07-23 2021-11-30 华东理工大学 一种sac-trail融合蛋白及其制备方法和应用
AU2022339011A1 (en) * 2021-09-02 2024-03-14 Umc Utrecht Holding B.V. Pro-apoptotic construct and use thereof
US20240409608A1 (en) * 2021-10-26 2024-12-12 Navicure Biopharmaceuticals Limited Combination therapies against cancer and infectious diseases
WO2023081595A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 Navicure Biopharmaceuticals Limited Immunogenic fusion proteins against infectious animal diseases
WO2024205149A1 (ko) * 2023-03-24 2024-10-03 카오티에스 주식회사 신규한 그랜자임 융합단백질 및 이의 용도
CN119656338A (zh) * 2024-12-16 2025-03-21 浙江大学 一种增强T细胞疗效的mRNA药物与应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60226816A (ja) 1984-11-16 1985-11-12 Asahi Chem Ind Co Ltd 抗腫瘍活性をもつヒト由来蛋白質
DE3841768A1 (de) 1988-12-12 1990-06-13 Basf Ag Neue tnf-peptide
KR101004174B1 (ko) 1995-06-29 2010-12-24 임뮤넥스 코포레이션 세포소멸을 유도하는 시토킨
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
US6962696B1 (en) * 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
DE60118935D1 (de) 2000-04-24 2006-05-24 Univ Yale New Haven Dna & protein bindende miniatur proteine
US7786282B2 (en) * 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
CN1257187C (zh) * 2003-10-22 2006-05-24 上海恰尔生物技术有限公司 钙网蛋白－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
CN1256347C (zh) * 2003-12-10 2006-05-17 中国人民解放军第二军医大学 激肽原第五结构域－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
KR100685345B1 (ko) 2004-03-27 2007-02-22 학교법인조선대학교 세포사 유도 펩타이드
CN101287990B (zh) 2005-08-16 2012-07-04 健泰科生物技术公司 通过检测细胞/组织中galnac-t14的表达判定对apo2l/trail的凋亡敏感性
CN101168742A (zh) * 2007-03-08 2008-04-30 中山大学肿瘤防治中心 一种溶癌病毒及其制备方法
US20090131317A1 (en) 2007-06-22 2009-05-21 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
CN101157729B (zh) * 2007-10-23 2011-01-12 南京大学 一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用
TW200950778A (en) 2008-05-14 2009-12-16 Genentech Inc Methods of using Apo2L/TRAIL to treat cancer
WO2010005519A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-14 University Of Pennsylvania Fn14/trail fusion proteins
JP5700409B2 (ja) 2008-11-14 2015-04-15 国立大学法人京都大学 Ｈｓｐ９０を標的にした新規抗がんキメラペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
SG186439A1 (en) 2013-01-30
PL391627A1 (pl) 2012-01-02
DK2585480T3 (en) 2015-03-23
EA023005B1 (ru) 2016-04-29
JP2013532972A (ja) 2013-08-22
CN102958940A (zh) 2013-03-06
BR112012032708A2 (pt) 2016-10-11
MX2012015246A (es) 2013-02-07
AU2011268876B2 (en) 2014-01-30
WO2011161260A1 (en) 2011-12-29
PH12013500050A1 (en) 2022-10-05
ZA201300677B (en) 2013-09-25
CA2800841A1 (en) 2011-12-29
IL223640A (en) 2016-05-31
JP5911481B2 (ja) 2016-04-27
EA201291362A1 (ru) 2013-06-28
HRP20150241T1 (xx) 2015-06-05
US9102759B2 (en) 2015-08-11
EP2585480A1 (en) 2013-05-01
SI2585480T1 (sl) 2015-02-27
ES2531288T3 (es) 2015-03-12
DK2585480T5 (en) 2015-06-08
EP2585480B1 (en) 2014-12-10
KR101861872B1 (ko) 2018-05-28
PL2585480T3 (pl) 2015-05-29
AU2011268876A1 (en) 2013-01-10
US20130164254A1 (en) 2013-06-27
RS53851B1 (sr) 2015-08-31
HK1178908A1 (en) 2013-09-19
CN102958940B (zh) 2015-12-02
CY1116099T1 (el) 2017-02-08
PT2585480E (pt) 2015-03-02
CA2800841C (en) 2018-07-10
KR20130088137A (ko) 2013-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA111722C2 (uk) Протираковий злитий протеїн
EP2661496B1 (en) Anticancer fusion protein
EP2797950B1 (en) Anticancer fusion protein
US20130251676A1 (en) Anticancer fusion protein
CN110418839A (zh) 用于临床的修饰的NK-92 haNK003细胞
US20140031283A1 (en) Anticancer fusion protein
US9364514B2 (en) Anti-tumor adjuvant therapy
WO2015092756A1 (en) Recombinant fusion protein prostat and uses thereof
WO2011079431A1 (zh) 具有端粒酶抑制活性的融合蛋白、其制备方法和用途
HK40058869A (en) Polypeptide, and preparation method therefor and use thereof
HK1178908B (en) Anticancer fusion protein
HK1186209A (en) Anticancer fusion protein
HK1186209B (en) Anticancer fusion protein
NZ617353B2 (en) Anticancer fusion protein
WO2013028527A1 (en) Compositions and methods for treating cancer