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JP5911481B2 - 抗癌性融合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、治療用融合タンパク質、特に組換え融合タンパク質の分野に関する。ことさらには、本発明は、可溶性ヒトTRAILタンパク質の配列のフラグメントを短いアポトーシス促進性ペプチドの配列と組み合わせて含む融合タンパク質、これらを含む医薬組成物、特に抗癌剤としてのこれらの使用、ならびに、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびこれらの発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
アポトーシス（プログラム細胞死）は、癌を予防する上で、および異常な癌細胞のアポトーシスを誘導する剤を用いることによる癌の処置において、重要な役割を果たすプロセスである。
アポトーシスのためのシグナル伝達は、細胞の外側（外因的なまたはデスレセプターの経路）から、または細胞の内側（内因的なまたはミトコンドリアの経路）から開始させることができる。
ヒト癌細胞における外因性アポトーシス経路の活性化合物は、細胞のデスレセプターによる、受容体を活性化するリガンドの結合を必要とする。リガンドが結合すると、活性化された受容体はアポトーシスシグナルを誘導する。
細胞内におけるミトコンドリア経路による内因性アポトーシスの開始は、アポトーシスカスケードの異なるレベルにおいて開始させることができ、最終的にアポトーシスの発生を促進する（proapoptogenic）タンパク質（チトクロムｃ、SmacDiablo、AIF、p53、BH3ドメインファミリーを含むBcl2タンパク質ファミリー）の誘導または機能の修復、核酸の分解、またはカスパーゼの活性化を引き起こす。
TRAILタンパク質は、サイトカインファミリー（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド）、別名Apo2L（Apo2リガンド）に属し、腫瘍細胞における、およびウイルスにより感染した細胞における、アポトーシスの強力なアクチベーターである。TRAILは、体内で天然に存在するリガンドである。TRAILタンパク質、そのアミノ酸配列、コードDNA配列、およびタンパク質発現系は、EP0835305A1において最初に開示された。
TRAILタンパク質は、アポトーシス促進性TRAIL表面受容体１および２（TRAIL-R1/R2）に結合し、その後、それらの受容体を活性化することで、その抗癌活性を発揮する。これらの受容体は、DR4およびDR5（デスレセプター４およびデスレセプター５）としてもまた知られ、TNF受容体ファミリーに属し、様々な種類の癌細胞により過剰発現される。受容体の活性化により、抑制遺伝子p53には非依存的にアポトーシスの外部シグナル伝達経路を誘導することができ、これにより活性化されたカスパーゼ−８が実行カスパーゼ（executive caspase）の活性化をもたらし、これにより核酸の分解をもたらすことができる。TRAILの活性化により放出されるカスパーゼ−８はまた、Bidタンパク質（Bid protein）の放出と、これによるミトコンドリア経路の間接的活性化とを引き起こし得、Bidタンパク質はミトコンドリアへ転位し、ここでこれはチトクロムｃの放出を刺激し、したがって間接的にデスレセプターからのアポトーシスシグナルを増幅する。
TRAILは、このタンパク質に対して耐性である健康な細胞においてはアポトーシスを誘導することなく、腫瘍細胞において選択的に作用する。したがって、TRAILの巨大な潜在能力は、血液系悪性腫瘍および固形腫瘍を含む広範な様々な種類の腫瘍細胞に対して作用し、同時に正常細胞に影響を及ぼさず、潜在的に相対的に小さな副作用を発現する抗癌剤として認識されていた。
TRAILタンパク質は、ＩＩ型膜タンパク質であり、281アミノ酸の長さを有し、そのアミノ酸残基114〜281を含む細胞外領域は、プロテアーゼによる分解により２０ｋＤａのサイズの可溶性sTRAIL分子を形成し、これはまた生物学的に活性である。TRAILおよびsTRAILのいずれの形態も、標的細胞上に存在するTRAIL受容体との相互作用を介してアポトーシスを誘発することができる。TRAIL分子の可溶性部分の強力な抗腫瘍活性および非常に低い全身性毒性は、細胞株試験を用いて実証された。また、ＩＮＮではデュラネルミン（dulanermin）として知られるhTRAILのアミノ酸114〜281に対応するアミノ酸配列を有する組み換えヒト可溶性TRAIL（rhTRAIL）についてのヒトの臨床研究により、その良好な耐容性および用量制限毒性の不在が示された。
最近の研究は、TRAILタンパク質は、アミノ酸114〜281より短い形態を有することができること、およびまた、かかる形態においてDRファミリーの膜受容体（デスレセプター、DR1、DR2、DcR1、DcR2およびOPG）に結合して、これらの受容体を介してアポトーシスを誘導するすることができることを示す（F., FANG, A.、WANG, S.、F., YANG、Antitumor activity of a novel recombinant mutant human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand、Acta Pharmacologica Sinica 2005年11月；26 (11): 1373-1381）。
現在報告される組換えTRAILタンパク質の肝細胞に対する毒性効果は、修飾、すなわち、ポリヒスチジンタグの存在と関連すると考えられ、タグ化されていないTRAILは、全身性毒性を示さない。
しかし、さらなる研究および開発の過程において、多くの癌細胞はまた、TRAILに対する初期（primary）または獲得性の耐性を示し得る（例えばWO2007/022214を参照）。TRAILに対する耐性の機構は完全には理解されていないが、これはTRAILにより誘導されるアポトーシス経路の様々なレベルにおいて、シグナル伝達経路内において細胞表面上の受容体のレベルから実行カスパーゼ（executive caspase）までの範囲で、それ自体を顕化し得ると考えられる。この体制は、TRAILの抗癌剤としての有用性を制限する。
さらに患者に対する臨床試験において、TRAILの単独治療としての実際の有効性は低いことが証明された。この低い有効性およびTRAILに対する腫瘍の耐性を克服するために、放射線療法および化学療法剤との多様な組み合わせ治療を設計し、これは、相乗的アポトーシス効果をもたらした（WO2009/002947；A. AlmasanおよびA. Ashkenazi、Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348；RK Srivastava、Neoplasis、第3巻第6号、2001年、535-546、Soria JCら、J. Clin. Oncology、第28巻第9号(2010)、p.1527-1533）。選択された従来の化学療法剤（パクリタキセル、カルボプラチン）およびモノクローナル抗VEGF抗体と組み合わせての癌の処置のためのrhTRAILの使用は、WO2009/140469において記載されている。しかし、かかる組み合わせは、必然的に、従来の化学療法または放射線療法の周知の欠陥を意味する。
血管新生阻害剤バソスタチンおよびメタロプロテアーゼ切断部位リンカーと連結したTRAILの配列を含む構築された融合タンパク質は、腫瘍細胞においてアポトーシス誘導効果を示すことが、A.I. GuらによりChinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008年、第24巻(10)、925-930において記載された。
血管新生阻害剤タムスタチンのタムスタチン183-230およびTRAIL114-281の配列を含む構築された融合タンパク質は、膵臓癌細胞のアポトーシスの誘導を示すことが、N.RenらによりAcademic Journal of Second Military Medical University 2008年、第28巻(5)、676-478において記載された。
US2005/244370および対応するWO2004/035794は、ペプチドリンカーにより細胞表面結合ドメインとしてのTNFファミリーリガンドの別のメンバーであるCD40の細胞外部分と連結したエフェクタードメインとして、TRAIL95-281のコンストラクトを開示する。当該コンストラクトの活性化は、そのCD40部分の結合を介することが記述される。
さらに、TRAIL治療に関連した問題は、その低い安定性および投与の後での急速な体内からの排除であることが証明された。
多くの臨床的癌治療が現在利用可能であるが、それらはしばしば十分に有効ではなく、多くの周知の欠点を有し、そのうちの最も困難であり限定的なものの一つは、癌細胞に対する選択性の欠如、重篤な副作用、および初期の（primary）または処置の間に獲得される耐性である。現在、癌細胞に対して有効かつ選択的である抗癌剤は、限定された数しか知られていない。したがって、利用可能な剤の範囲を広げること、およびより有効（細胞傷害性）および選択的な剤を見出すことの両方を可能にする新規の抗癌剤に対する、緊急であり満たされていない必要性が存在し続けている。また、より高い安定性および改善された薬物動態学を有する選択的な剤に対する必要性も存在する。
本発明は、TRAILから誘導されるドメインと、TRAILフラグメントを含まず内因性（細胞内）または外因性（細胞外）のアポトーシス促進活性を有する短いエフェクターペプチドドメインとを含み、TRAILの作用を増強または補完する、新たな融合タンパク質を提供することにより、この問題の解決法を提案する。さらに、多くの場合において、本発明の融合タンパク質が、配列のフラグメントを含む可溶性TRAILおよびそのバリアントより強力な活性を示すこと、および、多くの場合においてまた、TRAILに対する耐性を克服することが明らかとなった。さらに、エフェクターペプチドの添加は、腫瘍におけるタンパク質の半減期の延長および保留の延長をもたらし、最終的にその有効性を増大させる。
図面の説明
本発明は、ここで図面を参照して詳細に記載される。
図１は、例１、例２、例３、例４および例５による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図２は、例６、例７、例８、例９および例10による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図３は、例11、例12、例13、例14および例15による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図４は、例16、例17、例18、例19および例20による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図５は、例21、例22および例23による本発明の融合タンパク質、ならびに例24、例25および例26の比較の融合タンパク質の模式構造を表わす。
図６は、例27、例28、例29、例30および例31による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図７は、例32、例33、例34、例35および例36による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図８は、例37、例38、例39、例40および例41による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図９は、例42、例43、例44、例45および例46による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図１０は、例47、例48、例49、例50および例51による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。
図１１は、例52、例53、例54および例55による本発明の融合タンパク質の模式構造を表わす。 図１２は、大腸癌Colo205による負荷を有するSCID/NODマウスにおける経時的な腫瘍容積の変化を、本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１３は、大腸癌Colo205による負荷を有するマウスにおける腫瘍増殖阻害値を、実験の２９日目において本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１４は、ヒト肺癌NCI-H460による負荷を有するマウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける経時的な腫瘍容積の変化を、本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１５は、ヒト肺癌NCI-H460による負荷を有するマウスにおける腫瘍増殖阻害値を、実験の２９日目において本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。
図１６は、ヒト小細胞肺癌A549による負荷を有するマウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける経時的な腫瘍容積の変化を、本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１７は、ヒト小細胞肺癌A549による負荷を有するマウスにおける腫瘍増殖阻害値を、実験の３４日目において本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１８は、ヒト膵臓癌、上皮細胞様細胞株PANC-1による負荷を有するマウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける経時的な腫瘍容積の変化を、本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図１９は、ヒト膵臓癌、上皮細胞様細胞株PANC-1による負荷を有するマウスにおける腫瘍増殖阻害値を、実験の４３日目において本発明の融合タンパク質により処置したものをhTRAIL114-281と比較して表わす。 図２０は、例１、例２、例１４、例２４、例５１および例４２の融合タンパク質について、および特定の楕円率において発現されるrhTRAI114-281についての二円性スペクトルを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、
hTRAIL95よりも小さくない位置のアミノ酸で始まる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるドメイン（ａ）、および、
内因性アポトーシス経路を介してアポトーシス促進作用をもたらす、アポトーシス促進性エフェクターペプチドの配列であるドメイン（ｂ）、ここで、ドメイン（ｂ）の配列は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端において結合している、
を含む、融合タンパク質に関する。
用語「可溶性hTRAILの配列の機能的可溶性フラグメント」とは、アポトーシスシグナルを誘導する任意の、かかる可溶性hTRAILのフラグメントを表わすものと理解されるはずである。
また、TRAILの７０％相同性の存在が当該分野において公知であることは、当業者により理解されるであろう。
用語「ペプチド」は、本発明により、ペプチド結合を通して一緒に連結された複数のアミノ酸から構築された分子として理解されるはずである。したがって、用語「ペプチド」は、本発明により、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、hTRAILタンパク質でもhTRAILタンパク質の一部でもないことが理解されるはずである。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、当該分野において受け入れられた従来の様式において、ペプチドのＮ末端（Ｎ終末）からそのＣ末端（Ｃ終末）へ向かう方向において、表わされるであろう。任意の配列が、したがって、そのＮ末端を左側に、Ｃ末端を右側に有するであろう。
本発明の融合タンパク質は、エフェクターペプチドの単一のドメイン（ｂ）を、ドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に結合して、含んでもよい。
本発明の融合タンパク質はまた、エフェクターペプチドの２つのドメイン（ｂ）を含んでもよく、この場合、ドメイン（ｂ）の一方は、ドメイン（ａ）のＣ末端に結合し、もう一方は、ドメイン（ａ）のＮ末端に結合している。
本発明の融合タンパク質がエフェクターペプチドの２つのドメイン（ｂ）を含む場合、これらのドメインは、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、この場合において、ドメイン（ｂ）は異なっている。
特定の態様において、ドメイン（ａ）は、hTRAIL配列の、hTRAIL114〜hTRAIL121を含めた範囲のアミノ酸で始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わるフラグメント、または、GenBankにおいてアクセッション番号P50591において公開されるhTRAIL配列の他の機能的フラグメントである。
特に、ドメイン（ａ）は、hTRAIL114-281（配列番号27）、hTRAIL119-281（配列番号28）およびhTRAIL121-281（配列番号29）、hTRAIL116-281およびhTRAIL120-281に対応する配列からなる群より選択される。
別の態様において、ドメイン（ａ）は、配列hTRAIL95-281であってよい。
そのアポトーシス活性を内因性アポトーシス経路を介して（細胞内で）発揮するドメイン（ｂ）のアポトーシス促進性エフェクターペプチドは、アポトーシスのミトコンドリア経路のシグナルカスケード成分を活性化することにより、または、細胞内でのミトコンドリアによるアポトーシスの直接誘導により、直接的にアポトーシスを誘導し得る。
本発明の融合タンパク質の一態様において、エフェクターペプチドは、内因性アポトーシス経路を介して作用するペプチドであって、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、および配列番号47、または配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165および配列番号166からなる群より選択される。
上記の群の配列番号30のエフェクターペプチドは、抗アポトーシス因子を阻害するBaxタンパク質のBH3ドメインから誘導されるペプチドであり、具体的には、
Figure 0005911481
 により表わされる１６アミノ酸のペプチドである。
Baxタンパク質のBH3ドメインの配列に基づくペプチドは、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2およびBcl-XLに効率的に結合することができると考えられる。Bcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス活性は、アポトーシスの開始の原因である因子（Bax、Bak、Bad）おいて存在するBH3ドメインとのそれらの相互作用に基づく。BH3ドメインの結合は、タンパク質Bcl-2およびBcl-XLのそれらの天然のリガンドとの相互作用の防止、ならびにそれらの活性の阻害をもたらし、それによりアポトーシスの促進の開始に寄与する。
上記の群の配列番号31のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、Bidタンパク質のBH3ドメインを含む１５アミノ酸のペプチドである。
Bidタンパク質は、Bcl-2ファミリーに属し、とりわけアポトーシス促進因子であるBaxの活性化の原因である。本発明の融合タンパク質に組み込まれたBidタンパク質のBH3ドメインを含む１６アミノ酸のペプチドは、アポトーシスを効率的に誘導すると考えられる。
上記の群の配列番号32のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、リボヌクレアーゼＡ（RNase A）のペプチドホモログである。
リボヌクレアーゼは、潜在的な抗悪性腫瘍特性を有する小さなタンパク質であり、これは、負に荷電した細胞膜に結合することにより、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、次いでサイトゾル中に漏出し、ここでこれらは酵素として作用し、RNAの分解を引き起こす。１０ｎＭの濃度から開始して、これらは、細胞周期を停止させ、アポトーシスを引き起こす。
上記の群の配列番号33のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、チトクロムｃ分子である。
ミトコンドリアから細胞質へのチトクロムｃの放出は、いわゆるミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導する主要なシグナルの一つである。当該タンパク質は、アポトーシス複合体の一部であり、これはカスパーゼ９を活性化する。
上記の群の配列番号34のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、グランザイムＢである。
文献においてはフラグメンチンとも称されるグランザイムは、Ｔｃリンパ球およびＮＫ細胞の細胞粒性（cellular granularity）に典型的なセリンプロテアーゼである。ヒトにおいては、５つの異なるグランザイムが同定されている：Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｋ（トリプターゼ）およびＭ（メチオニナーゼ）。研究により、これらの酵素は、リンパ球により標的細胞に対して発揮される細胞傷害性反応の要素であることが確認されている。これらの酵素は、細胞膜に孔を生じさせてそれにより細胞傷害性応答を媒介するタンパク質であるパーフォリンを活性化することが示されている。さらに、これらの酵素は、標的細胞におけるアポトーシスの誘導に直接的に関与していると考えられている。グランザイムＢは、選択されたプロカスパーゼを活性化形態（例えばカスパーゼ３）へと活性化し、また、Bidタンパク質（Bcl-2タンパク質ファミリーに属するタンパク質）の活性化形態を、タンパク質分解を介して放出させ、これは、ミトコンドリア膜中への組み込みおよび膜における孔の発生と、その後のアポトーシス誘導因子（チトクロムｃ、カスパーゼ９、Apaf）の放出により、アポトーシスの細胞内経路を開始させる。ヒストンへの結合により、グランザイムＢはまた、クロマチン構造の弛緩にも関与し得、これは、その弛緩を引き起こし、DNAのエンドヌクレアーゼへのアクセスを増大させる。
上記の群の配列番号35のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされるNur77タンパク質のフラグメントである。
核受容体Nur77は、非常に強力なアポトーシスの誘導因子である。その作用の機構の一つは、重要な抗アポトーシス因子であるBcl-2タンパク質に結合する能力である。この相互作用は、Bcl-2の構造の立体構造変化を引き起こし、これをアポトーシスの誘導因子へと変換する。上に表わされるフラグメントは、Bcl-2の結合および変換ならびに細胞におけるアポトーシスの誘導の原因であると同定された、Nur77の配列からの９アミノ酸の領域である（Kolluriら、Cancer Cell 14: 285-298、2008年）。
上記の群の配列番号36のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、Bakタンパク質のBH3ドメインを含む１５アミノ酸のペプチドである。
本発明の融合タンパク質中に組み込まれたこの短いペプチドは、アポトーシスを効率的に誘導すると考えられる。
上記の群の配列番号37のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、タンパク質PUMA/BBC3のBH3ドメインである。
PUMA/BBC3（p53により上方調節されるアポトーシス／Bcl-2結合コンポーネント３のモジュレーター）は、Bcl-2タンパク質ファミリー（BH3のみのサブファミリー）のメンバーである。これは、p53に非依存的および依存的な様式の両方において、アポトーシスを媒介する。全て公知の生存促進性Bcl-2タンパク質によるPUMA/BBC3の直接的活性化は、それらの不活化、ミトコンドリアの機能不全、ならびにそれによるカスパーゼの活性化および細胞死を引き起こす。PUMAはまた、BakおよびBaxなどの分子のアポトーシス促進活性の回復に間接的に影響を及ぼす。BH3ドメインは、PUMAの、生存促進性タンパク質との結合の原因である。
上記の群の配列番号38のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、タンパク質PUMA/BBC3である。
タンパク質PUMA/BBC3およびそのBH3ドメインの両方が、本発明の融合タンパク質に組み込まれた場合に、アポトーシスシグナルを誘導すると考えられる。
上記の群の配列番号39のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、タンパク質SMAC/Diabloの８アミノ酸のフラグメントである。
SMAC/DIABLO（第２のミトコンドリア誘導性のカスパーゼのアクチベーター（Second mitochondria-derived activator of Caspase）／低PI直接IAP結合タンパク質（Direct IAP Binding Protein with Low PI））は、ミトコンドリアから放出されるカスパーゼのアクチベーターである。そのN末端モチーフは、IAPタンパク質に競合的に結合し、それらのBIR2およびBIR3ドメインがカスパーゼを不活化することを妨害する。この短いペプチドは、本発明の融合タンパク質に組み込まれた場合に、効率的にアポトーシスを誘導すると考えられる。
上記の群の配列番号40のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、ブフォリンIIbペプチドである。
ブフォリンIIbは、ヒストンH2Aから誘導されるペプチドであって、細胞膜に非依存的に浸透することができ、抗菌特性を有する（Parkら、Biochem Biophys. Res. Commun., 244: 253-257、1998年）。その抗癌剤としての有用性についての研究は、それが、多数の癌細胞に選択的に結合し、細胞に浸透し、核中に蓄積し、ミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導することができることを示した（Leeら、Cancer Letters, 271:47-55, 2008）。
上記の群の配列番号41のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、オンコナーゼペプチドである。
オンコナーゼまたはP-30は、元々は、ヒョウガエル（Rana pipiens）卵母細胞のライセートから誘導された。これは、１２ｋＤａの質量を有する一本鎖のタンパク質であり、RNase Aの構造アナログである。このタンパク質についての研究は、これが、腫瘍細胞に対して顕著な細胞傷害活性を有することを示した（Y Wu、SM Mikulski、W Ardelt、SM RybakおよびRJ Youle、The Journal of Biological Chemistry 268, 10686-10693）。オンコナーゼの活性の機構についての研究は、これは内部移行のプロセスにより細胞内に侵入し、ここで、28Sおよび18SリボソームrRNAの分解プロセスを行い、これが、タンパク質合成の阻害および細胞死をもたらすことを示した。
上記の群の配列番号42のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、p14ARFタンパク質の20アミノ酸のＮ末端フラグメントであり、これは、生存促進性Mdm2タンパク質の阻害剤である。
P14ARFは、Mdm2タンパク質の活性を調節するタンパク質である。Mdm2タンパク質は、腫瘍抑制因子p53に結合し、その分解の原因であり、したがって癌化細胞の生存の可能性の原因である。P14ARFタンパク質は、Mdm2への結合により、そのp53との相互作用を妨害する。p14ARFから誘導された短いペプチドは、Mdm2とp53との間の相互作用を遮断し、後者の分解を妨害するために十分であることが報告される（Midgleyら、Oncogene 19: 2312-2323、2000年）。
上記の群の配列番号43のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、Mdm2に結合する11アミノ酸のペプチドである。
上記のペプチドは、p53の配列に対する配列相同性、およびMdm2-p53相互作用の阻害の著しい有効性を示し（Boettgerら、Oncogene 13:2141-2147、1996年）、それによりp53の分解を妨害する。
上記の群の配列番号44のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、ルナシンペプチドの17アミノ酸のフラグメントである。
ルナシンは、大豆（Glycine max）から誘導される43アミノ酸のペプチドであり、抗癌効力が証明されている。この分子の作用の一般的機構は、ヒストンアセチル化の阻害にある。デアセチラーゼ活性を有する分子が、転写プロセスの共抑制因子としても作用することは知られている（Leongら、Cancer Lett, 18: 42 - 48、2007年）。
上記の群の配列番号45のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、Bikタンパク質のBH3ドメインである。
Bikタンパク質は、生存シグナル（例えばBcl-2）を開始する細胞およびウイルスの因子と相互作用し、それによりアポトーシスを刺激する。多くの他のアポトーシス促進性タンパク質と同様に、これは、Bcl-2との相互作用に必要なBH3ドメインを含む。このタンパク質から誘導されるBH3ドメインを含むペプチドは、他のアポトーシス促進性タンパク質を活性化することにより、または抗アポトーシスタンパク質を阻害することにより、アポトーシスを開始させ得る（Del Gaizo Moore, Vら、, Blond, 111: 2300-2309, 2008年）。
上記の群の配列番号46のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、合成ペプチド−プロテアソーム阻害剤である。
このペプチドは、一連のGlyおよびAla残基の反復からなり、TRAIL受容体DR5の過剰発現の誘導によりTRAIL誘導性アポトーシスを増強することができるプロテアソーム阻害剤である。
上記の群の配列番号47のエフェクターペプチドは、
Figure 0005911481
 により表わされる、プロテアソームS5aのＣ末端フラグメントのドメインである。
プロテアソームS5aフラグメントからのこのドメインは、ユビキチン結合に直接的に関与するUIMsモチーフを含み、したがってアポトーシスを誘導する能力を有する。
上記の群の配列番号151のエフェクターペプチドは、アズリンから誘導されるペプチドである。
銅含有酸化還元タンパク質であり、病原性細菌Pseudomonas aeruginosaにより放出されるアズリンは、多くの癌細胞株に対して高度に細胞傷害性である。これは、サイトゾルに侵入し、核へと移動する。その活性は、癌細胞における活性形態のp53の存在に厳密に依存的である。アズリンは、p53に結合して、転写後にp53およびBaxのレベルを増大させることが示されている。Mdm2-p53機能的相互作用に関してのこの一見拮抗性の作用は、p53に対するアズリンの結合が、Mdm2-p53の関係を妨害し、したがってp53の分解を妨害する可能性があることを示唆する。結合により、これはミトコンドリアのチトクロムｃのサイトゾル中への放出を誘発する。このプロセスは、カスパーゼのカスケードを活性化し（カスパーゼ−９およびカスパーゼ−７を含む）、それによりアポトーシスプロセスを開始させる（Punj Vら、Oncogene. 2004年3月25日；23(13):2367-78、Funari Gら、J Mol Recognit. 2010年7〜8月;23(4):343-51）。アズリン配列から誘導されたペプチドの活性の詳細な分析により、28アミノ酸の領域が効果的な細胞浸透およびアポトーシスの誘発の原因であることを明らかにした（Yamada i wsp., Cell Microbiol, 7:1418-1431, 2005）。
上記の群の配列番号152のエフェクターペプチドは、全長アズリンペプチドである。
上記の群の配列番号153のエフェクターペプチドは、aPPタンパク質およびBaxタンパク質のBH3ドメインから設計されたペプチドである。
aPPタンパク質と再設計されたアポトーシス促進性Bakタンパク質とのキメラは、ヒトBcl-2およびBcl-Xについての高度に強力であり特異性が高いリガンドとしてEP1309680において報告された（また、Chin JW, Schepartz A. Design and evolution of a miniature Bcl-2 binding protein Angew Chem Int Ed Engl. 2001年10月15日；40(20):3806-3809を参照）。
上記の群の配列番号154のエフェクターペプチドは、aPPタンパク質とBaxタンパク質のBH3ドメインとから設計された別のペプチドである。
上記の群の配列番号155のエフェクターペプチドは、レティキュロンRTN1-Cから誘導されたペプチドである。
RTN1-Cタンパク質はERにおいて局在する膜タンパク質であり、神経系において発現し、その生物学的役割は完全には明らかとなっていない。RTN1-Cの残基186〜208に対応するＣ末端領域は、核酸と結合することができ、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）酵素と相互作用してその活性を低下させることができる。
上記の群の配列番号156のエフェクターペプチドは、ヒトレティキュロン３（アイソフォームａ）の全長である。レティキュロン（RTN）は、他の既知のアポトーシス関連ドメインと相補性を有さない膜内在性タンパク質の群を形成する。レティキュロン３アイソフォームは、腫瘍細胞株において過剰発現し、それらをTRAIL媒介性のアポトーシスに対して感受性になるように変化させる。
上記の群の配列番号157のエフェクターペプチドは、修飾された構成的に活性なカスパーゼ−３（一本鎖）である（Srinivasula SM, Ahmad M, MacFarlane M, Luo Z, Huang Z, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. Generation of constitutively active recombinant caspase-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 1998年4月24日；273(17):10107-11）。
上記の群の配列番号158のエフェクターペプチドは、Par-4タンパク質（前立腺アポトーシス応答タンパク質par-4）からのSACドメインである。
Par-4は、アポトーシス促進機能を有する腫瘍抑制因子タンパク質である。Par-4の癌特異的なアポトーシス促進活性は、その中心に位置するSACドメインに帰する。当該分子の機能は、二つの異なる手段により達成される：細胞死機構の分子成分の活性化（FasおよびFasLの細胞膜への転位）、および生存促進性因子（NF-κB経路）の阻害（Zhao Y, Rangnekar VM. Apoptosis and tumor resistance conferred by Par-4. Cancer Biol Ther. 2008年12月；7(12):1867-74、電子出版、2008年12月8日、概説）。
上記の群の配列番号159のエフェクターペプチドは、Noxaタンパク質である。Noxaは、Bcl-2ファミリーのタンパク質のBcl-2相同ドメイン３（BH3）のみのメンバーをコードする。このメンバーは、BH3領域を含むが、他のBHドメインを含まない。Noxaは、p53依存性アポトーシスのメディエーターであり、BH3モチーフ依存的にミトコンドリアに局在化し、抗アポトーシス性のBcl-2ファミリーメンバーと相互作用し、カスパーゼ−９の活性化をもたらす。
上記の群の配列番号160のエフェクターペプチドは、ミトコンドリアでの局在に必要とされるNoxaタンパク質の１０ＡＡ（KLLNLISKLF）のフラグメントである（MTD-ミトコンドリア標的化ドメインまたはCKP（細胞殺傷ペプチド（Cell Killing Peptide））。これは、WO2006/001582において、およびYoung-Woo Seoら（The Journal of Biological Chemistry第278巻第48号、11月28日発行分、pp. 48292-48299、2003年）において記載される。
上記の群の配列番号161のエフェクターペプチドは、WO2010055929において記載される短いハイブリッドペプチドAntp-TPRである。Antp-TPRは、Hsp90を標的とする操作されたハイブリッドペプチドであり、これは、HopのTPR2AドメインとのHsp90の相互作用の阻害に起因する、癌細胞に対する選択的な細胞傷害活性を有する。
上記の群の配列番号162のエフェクターペプチドは、Stat3タンパク質のSH2ドメインのペプチド阻害剤である。
Statタンパク質のSH2ドメインは、増殖因子およびサイトカインに対する応答における正常なSTATシグナルを介して細胞の増殖および分化をもたらす、一連の事象の原因である。
上記の群の配列番号163のエフェクターペプチドは、Bakタンパク質（Bcl-2ファミリー）のBH3ドメインから誘導されたペプチドGQVGRQLAIIGDDINRである（Castelli M、Reiners JJ、Kessel D. A mechanism for the proapoptotic activity of ursodeoxycholic acid: effects on Bcl-2 conformation. Cell Death Differ. 2004年8月；11(8):906-14）。Bakタンパク質は、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性のメンバーであり、アポトーシスの開始に関与する。
上記の群の配列番号164のエフェクターペプチドは、Badタンパク質（Bcl-2ファミリー）のBH3ドメインから誘導されたペプチドKNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGLである（Wang JL、Zhang ZJ、Choksi S、Shan S、Lu Z、Croce CM、Alnemri ES、Korngold R、Huang Z. Cell permeable Bcl-2 binding peptides: a chemical approach to apoptosis induction in tumor cells. Cancer Res. 2000年3月15日；60(6):1498-502）。
上記の群の配列番号165のエフェクターペプチドは、Bfl1タンパク質からのペプチドATAPである。
ATAP（両親媒性のテイルアンカーペプチド）（Bfl1からの残基147〜175、二官能性Bcl2ファミリータンパク質）は、ミトコンドリアを特異的に標的とし、BaxまたはBakを必要としないカスパーゼ依存的なアポトーシスを引き起こす。
上記の群の配列番号166のエフェクターペプチドは、Bfl1タンパク質からの別のATAPペプチドである。ATAPタンパク質は、HCCS1からのMTSドメインに融合している（Ko JK、Choi KH、Pan Z、Lin P、Weisleder N、Kim CW、Ma J. The tail-anchoring domain of Bfl1 and HCCS1 targets mitochondrial membrane permeability to induce apoptosis. J Cell Sci. 2007年8月15日;120(Pt 16):2912-23. 電子出版、2007年7月31日）。
本明細書において上で記載されるように、ドメイン（ｂ）のアポトーシス促進性エフェクターペプチドの第１のバリアントは、内因性アポトーシス経路を介して（細胞内）そのアポトーシス活性を発揮するペプチドであってよく、これは、アポトーシスのミトコンドリア経路のシグナルカスケード成分を活性化するか、または細胞におけるミトコンドリア性アポトーシスの直接誘導により、直接的にアポトーシスを誘導する。
第１のバリアントの一態様において、内因性経路を介してその活性を発揮するドメイン（ｂ）のアポトーシス促進性エフェクターペプチドの一群は、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2および Bcl-XLなどの細胞内抗アポトーシス因子または生存促進因子に結合することによりそれらを阻害および／または調節するペプチドであってよい。
上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例１の融合タンパク質中に存在する配列番号30、例11および47の融合タンパク質中に存在する配列番号37、例21の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号45、例42および43の融合タンパク質中に存在する配列番号158、ならびに例44の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号159により代表されるペプチドである。
この第１のバリアントの別の態様において、内因性経路を介してその活性を発揮するドメイン（ｂ）のアポトーシス促進性エフェクターペプチドの一群は、細胞内において直接的な破壊的効果を発揮して細胞周期を停止させるペプチドであってよい。
前記の細胞内におけるミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果は、エフェクターペプチドにより、細胞死をもたらすカスパーゼカスケードの様々なレベルにおいて開始させることができる。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の例は、核酸の分解、特にホールセルRNAまたはDNA、および分解性ヌクレアーゼの誘導である。かかる効果は、例えば、ヒト膵臓RNAseを含む膵臓RNAse Aのスーパーファミリーのリボヌクレアーゼ、ヒトアンジオゲニン（リボヌクレアーゼ５、hAng）、ヒト好酸球由来ニューロトキシン（EDN）、およびウシリボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ、ならびにそれらのホモログおよびバリアントにより発揮され得る。RNAseホモログの例は、Rana catesbianaおよびRana japonicaから単離されたリボヌクレアーゼであるオンコナーゼである。
核酸の分解により作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例３、４および27の融合タンパク質中に存在する配列番号32、例16、17および46の融合タンパク質中に存在する配列番号41、ならびに例41の融合タンパク質中に存在する配列番号157により代表されるペプチドである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、カスパーゼの活性化である。かかる効果は、例えば、例５および６の融合タンパク質中に存在するチトクロムｃ（配列番号33）、例７および８の融合タンパク質中に存在するグランザイムＢ（配列番号34）例14、21、33、34および35の融合タンパク質中に存在するタンパク質Smac/DIABLOから誘導されるタンパク質（配列番号39）により発揮され得る。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、p53の機能の回復によるアポトーシス促進性タンパク質の安定化の影響に起因する、プロテアソーム阻害である。
プロテアソーム阻害により作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例22の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号46、および例23の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号47により代表されるペプチドである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、p53の機能の回復によるアポトーシス促進性タンパク質の発現の影響の増強に起因する、ヒストンタンパク質の調節である。
ヒストンタンパク質の調節により作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例15の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号40により代表されるブフォリンIIb、例20の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号44により代表されるルナシンである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、p-53の機能の回復（その分解の阻害によるものなど）である。p-53の分解の防止は、murine double minute 2（MDM2）などのp-53のネガティブレギュレーターを阻害してその負の調節を阻害することにより達成することができる。これは、銅含有酸化還元タンパク質であるアズリン、細胞周期調節因子p14ARF、またはSuperTIP（チオレドキシンインサートタンパク質（ThioredoxinInsert protein）、細菌のチオレドキシンタンパク質の活性部位ループ内のmdm-2結合ペプチド）、またはそれらのフラグメントなどの、p-53に結合することについてMDM2と競合するMDM2結合ペプチドにより達成することができる。
p-53の機能の回復により作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例18の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号42、例19の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号43、例29、30および31の融合タンパク質中に存在する配列番号151、ならびに例32の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号152により代表されるペプチドである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、タンパク質Bax、Bak、Bok、Bid、Bim、Bad、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、Bik、BNIP3およびSpikeなどのBcl-2タンパク質ファミリー、とりわけBid、Bim、Bad、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、Bik、BNIP3およびSpikeを含むBH3のみのタンパク質ファミリーに影響を及ぼす、すなわちこれを活性化、阻害または調節することである。特に、Bcl-2ファミリーメンバーのBH3ドメインのフラグメントは、有利なエフェクターペプチドとなるであろう。エフェクターペプチドの他の群は、例えば核受容体Nur77などの核受容体RXR（レチノイドＸ受容体）のファミリーのフラグメントである。
Bcl-2タンパク質ファミリーに影響を及ぼすことにより作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例１の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号30、例２、４および８の融合タンパク質中に存在する配列番号31、例3の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号32、例９の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号35、例10の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号36、例11および47の融合タンパク質中に存在する配列番号37、例12および13の融合タンパク質中に存在する配列番号38、例44の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号159、例45の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号160、例51の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号163、例52および53の融合タンパク質中に存在する配列番号164、例54の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号165、ならびに例55の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号166により代表されるペプチドである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、TRAIL受容体へのTRAILの結合により誘導されたアポトーシスシグナルを、特にカスパーゼの活性化により、転換することである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、アポトソームの形成を促進することである。
アポトソームの形成を促進することにより作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例１の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号30、例２の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号31、例５および６の融合タンパク質中に存在する配列番号33、例９の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号35、例10の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号36、例47の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号37、例33、34および35の融合タンパク質中に存在する配列番号39、例14の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号40、例21の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号45、例36および37の融合タンパク質中に存在する配列番号153、例38の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号154、例41の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号157、例42および43の融合タンパク質中に存在する配列番号158、例44の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号159、例45の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号160、例51の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号163、ならびに、例52および53の融合タンパク質中に存在する配列番号164により代表されるペプチドである。
前記のエフェクターペプチドのミトコンドリア系の内因性経路における直接的な破壊的効果の別の例は、ミトコンドリア外膜（MOMP）の透過化を促進することであり、これに起因して、ミトコンドリアにより放出されるタンパク質がカスパーゼ活性化レベルに対して作用することができる。
MOMPの透過化を促進することにより作用する上記の群の例示的なエフェクターペプチドは、例１の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号30、例２および48の融合タンパク質中に存在する配列番号31、例５および６の融合タンパク質中に存在する配列番号33、例14、33、34および35の融合タンパク質中に存在する配列番号39、例15の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号40、例46の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号41、ならびに、例21の融合タンパク質中に組み込まれる配列番号45により代表されるペプチドである。
本明細書において上に記載されるとおり、本発明のドメイン（ｂ）のアポトーシス促進性エフェクターペプチドの第２のバリアントは、外因性経路を介して（細胞外で）作用するアポトーシス促進性エフェクターペプチドの群であり、これは、その効果のために、癌細胞の表面上に存在する受容体に結合することを必要とする。
細胞外で作用するペプチドとしての以下のTNFリガンド（TNF−腫瘍壊死因子）またはTNFアナログは、競合的なエフェクターペプチドとして使用した：
Figure 0005911481
配列番号48により代表されるデカペプチドは、JP 60,226,816においてTNFのアナログ／アゴニストとして記載されている。
配列番号49により代表されるヘキサカペプチドは、TNFから誘導され、DE 3,841,768において記載されている。
配列番号50により代表されるセプタペプチドは、５アミノ酸のペプチドであって、TNFサイトカインの一部であり、このサイトカインとその細胞受容体：TNFR55およびTNFR75との相互作用の表面から誘導され、２つのシステイン残基によりＣ末端およびＮ末端において挟まれている。システイン残基は、アミノ酸の間のスルフィド架橋の形成を介してペプチドの環化を安定化させる。環化の目的は、ペプチドの安定化およびその活性の改善である。
癌細胞の表面上のTRAIL受容体への結合により、融合タンパク質は、二重の効果を発揮する。TRAILの機能的フラグメントであるドメイン（ａ）は、その既知のアゴニスト活性発揮する、すなわち、細胞表面上のデスレセプターに結合し、アポトーシスの外因性経路を活性化する。細胞内で作用するアポトーシス促進性ペプチドを含む融合タンパク質のエンドサイトーシスを介した内在化の後で、ドメイン（ｂ）は、TRAILドメインの活性と並行して、その作用を細胞内で潜在的に発揮することができる。このようにして、TRAILの抗癌活性を、他の要素およびアポトーシスの機構の活性化により増強することができる。
細胞外で作用するアポトーシス促進性ペプチドを組み込む比較上の融合タンパク質は、TRAIL受容体以外のアポトーシス促進性受容体に結合してこれを活性化することにより、アポトーシス経路を潜在的に付加的に開始させるはずである。
本発明の一態様において、融合タンパク質のドメイン（ａ）および（ｂ）は、互いに直接的に連結していてもよい。
別の態様において、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、細胞環境において、特に腫瘍細胞の環境において、プロテアーゼにより認識される、切断部位の配列を含むドメイン（ｃ）により連結されていてもよい。
プロテアーゼ切断部位は、以下から選択することができる：
− メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列、特に、配列
Figure 0005911481
 − ウロキナーゼuPAにより認識される配列、特に、RVVR配列（配列番号52）、および
− フューリンにより認識される配列、特に、配列RKKR（配列番号53）、または配列RKKRVKR（配列番号172）、
ならびにそれらの組み合わせ。
特に、プロテアーゼ切断部位は、任意の順序で互いに隣接して配置された、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列と、ウロキナーゼuPAにより認識される配列との組合せである。
一態様において、ドメイン（ｃ）は、MMP／uPAの組み合わせ、配列番号51／配列番号52、すなわち配列PLGLAGRVVR、またはuPA／MMPの組み合わせ、配列番号52／配列番号51、すなわち配列RVVRPLGLAGである。
プロテアーゼ類、メタロプロテアーゼMMP、ウロキナーゼおよび／またはフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、コンストラクトの内在化の際の、ドメイン（ｂ）からのドメイン（ａ）の切断、すなわち機能的ドメイン（ｂ）の放出を可能にし、したがってその活性化を可能にする。
プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドを迅速に放出させることにより、細胞内に存在するプロテアーゼによる融合ペプチドのランダムな分解が起こる前に、ペプチドをその作用の場所へと輸送する機会を増加させる。
さらに、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）に対して、輸送ドメイン（ｄ）が結合していてもよく、これは、以下からなる群より選択される：
（ｄ１）小胞体指向性の配列、
（ｄ２）６、７、８または９個のArg残基からなる、細胞膜を通して輸送するポリアルギニン配列、
（ｄ３）Pseudomonas aeruginosaの転位ドメイン（配列番号54）、
（ｄ４）膜輸送ドメイン、
（ｄ５）核局在化ドメイン、および
（ｄ６）ミトコンドリア標的化ドメイン、
およびそれらの組み合わせ。
ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）および（ｄ３）の組み合わせは、特に、（ｄ１）／（ｄ２）、（ｄ１）／（ｄ３）または（ｄ１）／（ｄ２）／（ｄ３）の組み合わせを含んでもよい。
ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）および（ｄ５）の組み合わせは、特にまた、（ｄ１）／（ｄ２）、（ｄ１）／（ｄ３）、（ｄ１）／（ｄ４）、（ｄ１）／（ｄ５）および（ｄ１）／（ｄ２）／（ｄ３）、（ｄ３）／（ｄ５）、（ｄ２）／（ｄ５）、（ｄ１）／（ｄ３）／（ｄ５）、（ｄ２）／（ｄ３）／（ｄ６）の組み合わせを含んでもよい。
さらに、ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）および（ｄ５）の組み合わせは、互いに隣接して配置され、ドメイン（ｂ）の一方の末端に連結するドメイン、および／またはドメイン（ｂ）の様々な末端に結合するドメイン（複数）を含んでもよい。
融合タンパク質が、ドメイン（ｂ）に結合した輸送ドメインと、ドメイン（ａ）と（ｂ）との間の切断部位のドメイン（ｃ）との両方を有する場合は、コンストラクトの切断の後で、輸送ドメイン（ｄ）がドメイン（ｂ）に結合したままの様式で、ドメイン（ｃ）は位置することが理解される。言い換えると、融合タンパク質が輸送ドメイン（ｄ）と切断部位ドメイン（ｃ）との両方を含む場合、ドメイン（ｄ）は、ドメイン（ｂ）とドメイン（ｃ）との間に位置するか、または、ドメイン（ｂ）のドメイン（ｄ）の結合の位置とは反対の末端に位置する。本発明は、ドメイン（ｄ）が、ドメイン（ｃ）とドメイン（ａ）との間に位置するようなバリアント、すなわち、コンストラクトの切断の後で輸送ドメインがTRAILドメインに結合したままとなる場合は含まない。
輸送配列は、ドメイン（ｂ）のＮ末端において結合していても、Ｃ末端において結合していてもよい。一部の態様において、輸送配列はまた、ドメイン（ａ）および（ｂ）の結合の様式に依存して、全コンストラクトのＣ末端部分またはＮ末端部分などの末端部分であってよい。
Pseudomonas aeruginosaの転位ドメインは、リソソーム膜を通した細胞質中への転位置が可能であり、エフェクターペプチドを腫瘍細胞コンパートメントへ導入するために用いることができる。Pseudomonas aeruginosaの転位ドメインの配列は周知であり、
Figure 0005911481
 により表わされる。
小胞体指向性の配列（ｄ１）は、当該分野において公知の任意の小胞体指向性シグナル配列、例えば、非限定的に、KDEL、HDEL、RDEL、DDEL、ADEL、SDEL、KEDLなどであってよい。配列（ｄ１）は、好ましくは、配列KDEL（配列番号55）およびKEDL（配列番号56）から選択される。
好ましくは、標的化配列（ｄ１）は、本発明の融合タンパク質のＣ末端において配置され、そのＣ末端部分を形成する。
膜輸送ドメイン（ｄ４）は、細胞膜を通して輸送する当該分野において公知の任意のシグナル配列、例えば、非限定的に、KPRRPYまたはKPRRPYRなどであってよい。
核局在化配列（ｄ５）は、核中へ標的化する当該分野において公知の任意のシグナル配列、例えば、非限定的に、
Figure 0005911481
 などであってよい。
ミトコンドリア標的化ドメイン（ｄ６）は、ミトコンドリアへ標的化する当該分野において公知の任意のシグナル配列、例えば、非限定的に、
Figure 0005911481
 またはオルニチントランスカルバミラーゼリーダーペプチドであってよい。
融合タンパク質の主要な機能的エレメント、輸送ドメインおよび切断部位ドメインの他に、本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ｅ）、すなわち、三量体の安定化を促進するポリシステインモチーフ、例えば非限定的に
Figure 0005911481
 などを含んでもよい。
さらに、ポリシステインドメイン（ｅ）は、ドメイン（ｂ）の一方の末端に結合していてもよく、および／またはドメイン（ｂ）の様々な末端（複数）に連結していてもよい。
融合タンパク質がドメイン（ｂ）に結合したポリシステインドメイン（ｅ）と、ドメイン（ａ）と（ｂ）との間の切断部位のドメイン（ｃ）との両方を有する場合、ドメイン（ｃ）は、コンストラクトの切断の後で、ポリシステインドメイン（ｅ）がドメイン（ａ）に結合したままの様式で位置することが理解されるはずである。言い換えると、融合タンパク質がポリシステインドメイン（ｅ）と切断部位ドメイン（ｃ）との両方を含む場合、ドメイン（ｅ）は、ドメイン（ａ）とドメイン（ｃ）との間に位置するか、ドメイン（ａ）のドメイン（ｄ）の結合の位置とは反対の末端に位置する。本発明は、ドメイン（ｅ）がドメイン（ｃ）とドメイン（ｂ）との間に位置するようなバリアント、すなわち、コンストラクトの切断の後でポリシステインドメインがエフェクターペプチドドメインに結合したままである場合は含まない。
融合タンパク質の機能的エレメント、輸送ドメインおよび切断部位ドメインの他に、本発明の融合タンパク質は、アラニン、グリシン、グルタミン、システイン、ヒスチジンおよびセリン残基からなる中性の配列／可橈性の立体リンカー（スペーサー）の配列を含んでもよい。かかるリンカー／スペーサーは周知であり、文献において記載される。融合タンパク質の配列中へのそれらの組み込みは、宿主細胞中でのその過剰発現のプロセスにより生成されるタンパク質の正しい折りたたみを提供することを意図する。
特に、可橈性の立体リンカーは、
Figure 0005911481
 からなる群より選択することができる。
態様の一つにおいて、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との間には、さらに、
（ｆ）本発明の融合タンパク質に対するPEGの結合に適した配列のドメイン（PEGリンカー）
が存在する。
かかるリンカーは、付属の配列表において配列番号170として設計される、公知の配列AlaSerGlyCysGlyProGlu（一文字変換においてはASGCGPE）であってもよい。PEGリンカーはまた、付属の配列表においてそれぞれ配列番号178、配列番号177および配列番号179として設計される、AlaAlaCysAlaAla（AACAA）、SerGlyGlyCysGlyGlySer（SGGCGGS）および（SGCGS）、の中から選択してもよい。
別の態様において、ドメイン（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は、さらに、特にグリシンおよびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸残基から形成される３アミノ酸までの残基により分離されていてもよい。
さらに、一部の態様において、融合タンパク質は、全コンストラクトのＣ末端部分として、配列hTRAIL95-121などのhTRAILの非機能的フラグメントを、そのコンストラクトからの切断を可能にする配列、有利にはプロテアーゼ切断部位、好ましくはトロンビンにより認識される配列の後ろに含んでもよい。hTRAILのかかる小さな非機能的フラグメントの組み込みは、全コンストラクトに対してより大きな親水性を与え、したがって発現プロセスの間のタンパク質の可溶性を改善する。精製段階の後で、hTRAIL95-121はトロンビンにより切断される。かかる場合において、hTRAIL95-121は、医薬組成物の調製のために用いられる融合タンパク質中には存在しない。
トロンビンにより認識される当該分野において公知の任意の配列、特に、配列LVPRGS（配列番号174）を用いてもよい。
かかる付加的なhTRAIL95-121配列は、親水性エフェクターペプチドの場合において、および、ドメイン（ａ）が、全TRAILの配列においてアミノ酸114およびそれより上から始まる場合に、特に有利である。
本発明の融合タンパク質の特定の態様は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121により代表されるタンパク質からなる群より選択される、細胞外で作用するアポトーシス促進性ペプチドを含む融合タンパク質である。
本発明の融合タンパク質の他の特定の態様は、配列番号24、配列番号25および配列番号26により代表されるタンパク質からなる群より選択される、細胞外で作用するアポトーシス促進性ペプチドを含む融合タンパク質である。
上述の代表的な融合タンパク質の構造の詳細な記載は、図１〜５および９〜１３において、ならびに本明細書において以下に示される例において示される。
本発明によれば、融合タンパク質により、１または２以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、ペプチド結合を介して各ペプチド鎖内で、さらなる化学リンカーなしで、共有結合していることが意味される。
融合タンパク質はまた、タンパク質コンストラクトまたはキメラタンパク質として、代替的に記載することができる。本発明によれば、用語「コンストラクト」または「キメラタンパク質」とは、用いられる場合、上記の融合タンパク質を指すものとして理解されるはずである。
当業者にとって、このようにして定義された融合タンパク質が、ペプチドおよびタンパク質の化学合成の公知の方法により合成し得ることは、明らかであろう。
融合タンパク質は、化学的なペプチド合成の方法により、特に好適な樹脂をキャリアとして用いる固相におけるペプチド合成の技術を用いて、合成することができる。かかる技術は、慣用的であり、当該分野において公知であり、特に、例えばBodanszkyおよびBodanszky、The Practice of Peptide Synthesis、1984年、Springer-Verlag、New York、Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版。1984年、Pierce Chemical Companyなどの研究書において記載される
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続的なタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個別のフラグメント（ドメイン）を別々に合成して、次いで、１つのペプチドフラグメントのアミノ末端の第２のペプチドのカルボキシル末端からの縮合により、ペプチド結合を介して一緒に１つの連続的なペプチドに組み合わせてもよい。かかる技術は、慣用的であり、周知である。
生じるペプチドの構造の検証のために、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析技術などの、ペプチドのアミノ酸組成の分析の公知の方法を用いてもよい。ペプチドの配列を確認するために、タンパク質シークエンサーを用いてもよい。これは、逐次的にペプチドを分解して、アミノ酸配列を同定する。
好ましくは、しかし、本発明の融合タンパク質は、組み換えタンパク質であり、宿主細胞における融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法により生成される。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義される融合タンパク質をコードするDNA配列である。
好ましくは、本発明による上で定義される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、特にDNAは、E. coliにおける発現のために最適化された配列である。
本発明の別の側面はまた、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義される本発明のDNA配列を含む発現ベクターである。
本発明の別の側面はまた、上で定義される発現ベクターを含む宿主細胞である。
本発明の融合タンパク質の発現のための好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
融合タンパク質を含む組み換えタンパク質の生成のための方法は、周知である。簡単に述べると、この技術は、ポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現を指揮するDNA分子の生成にある。次いで、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を、ポリペプチドの効率的な発現を保証する適切な発現ベクター中へ組み込む。組換え発現ベクターを、次いで、トランスフェクション／形質転換のために、宿主細胞中に導入し、その結果として、形質転換された宿主細胞が提供される。その後、形質転換細胞を培養し、標的タンパク質を過剰発現させ、得られたタンパク質を精製し、随意に、タンパク質の発現または精製のために用いられたタグ配列を切断により切り取る。
好適な発現および精製の技術は、例えば、研究書Goeddel、Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185（Academic Press, San Diego, CA (1990)）およびA. Staronら、Advances Mikrobiol.、2008年、第47巻第2号、1983-1995において記載される。
宿主細胞におけるDNA配列の導入および複製のための発現ベクターとして、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルスを用いることができる。代表的には、プラスミドを発現ベクターとして用いる。好適なプラスミドは、周知であり、市販されている。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、ならびに好適な宿主細胞中に組み込まれたコード配列の転写および翻訳のために必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞の型に依存し、当業者により容易に行われることができる。かかる調節配列の例は、転写開始シグナルを含みコード配列の前に挿入される、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列、ならびにコード配列の後に挿入される転写終結配列である。さらに、用いられる宿主細胞およびベクターに依存して、複製起点、さらなるDNA制限酵素切断部位、エンハンサー、および転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクター中に導入してもよい。
発現ベクターはまた、遺伝子配列のマーカーを含み得、これは、形質転換細胞に対して既定の表現型を付与し、形質転換細胞の特異的選択を可能にする。さらに、ベクターはまた、挿入された標的タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドで形質転換された細胞を、インサートなしのプラスミドを取り込んだものから区別することを可能にする第２のマーカー配列を含んでもよい。より頻繁には、代表的な抗生剤耐性を用いるが、しかし、細胞における（in vivoでの）その存在がオートラジオグラフィー技術、分光分析または生物および化学発光を用いて容易に決定し得る、当該分野において公知の任意の他のレポーター遺伝子を用いてもよい。例えば、宿主細胞に依存して、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を用いることができる。
さらに、発現ベクターは、適切な細胞コンパートメント、例えば折りたたみが促進される周辺質へ、タンパク質を輸送するシグナル配列を含んでもよい。さらに、Ｎ末端に結合したHisタグまたはＣ末端に結合したＧＳＴなどの標識／タグをコードする配列が存在してもよく、これは、その後の生成されたタンパク質のアフィニティーの原理を用いてニッケルカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーを介した精製を促進する。宿主細胞中でのタンパク質分解に対してタンパク質を保護するさらなる配列、ならびにその可溶性を増大させる配列もまた存在してよい。
標的タンパクの配列に結合した補助エレメントは、その活性を遮断するか、または別の理由により、例えば毒性に起因して、有害である場合がある。かかるエレメントは、取り除かれなければならず、これは、酵素的または化学的切断により達成することができる。
特に、アフィニティークロマトグラフィータンパク質精製を可能にする、６ヒスチジンタグHisタグまたはこの型の他のマーカーは、その可溶性TRAILタンパク質の肝臓毒性について記載されている効果のため、取り除かれるべきである。
原核細胞：Escherichia coliまたはBacillus subtilisなどの細菌、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母、および真核細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）を含む、多様な周知の宿主細胞に基づく異種性発現系を用いることができる。
好ましくは、培養および遺伝子操作の容易性、ならびに得られる生成物が大量であるために、E. coli発現系を用いる。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現のために最適化される。すなわち、それは、コード配列において、技術水準において公知の可能な配列バリアントから選択されるE. coliにおける発現に最適なコドンを含む。さらに、発現ベクターは、コード配列に結合した、E. coliに好適な上記のエレメントを含む。
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含む、E. coliにおける発現のために最適化されたポリヌクレオチド配列は：
配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147;配列番号148、配列番号149および配列番号150
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、
それらは、それぞれ、アミノ酸配列：
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117および配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする。
好ましい態様において、本発明はまた、上で示される配列番号67〜配列番号92および配列番号122〜配列番号150のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターにより形質転換されたE. coli細胞を提供する。
形質転換、すなわち、細菌宿主細胞、特にE. coli中へのDNA配列の導入は、通常は、例えば低温（４℃）におけるカルシウムイオンによる処置とその後に熱ショック（３７〜４２℃）に供することにより、またはエレクトロポレーションにより、DNAを取り込むように調製された、コンピテント細胞に対して行われる。かかる技術は周知であり、通常は、発現系の製造者により決定される。
E. coli発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手法は、以下にさらに記載される。
本発明はまた、活性成分としての上で定義されたとおりの本発明の融合タンパク質、ならびに好適な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤および慣用的な補助成分を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、本発明の融合タンパク質の有効量および薬学的に受容可能な補助成分を、キャリアまたは希釈剤中に溶解または分散して含み、好ましくは、単位投与形態または複数の用量を含む処方物において処方された医薬組成物の形態である。
医薬形態およびそれらの処方、ならびに他の成分、キャリアおよび希釈剤は、当業者に公知であり、文献において記載される。例えば、それらは、研究書、Remington's Pharmaceutical Sciences、第２０版、2000年、Mack Publishing Company、Easton、USA。
用語「薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤および補助成分」とは、当該分野において公知の任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定化剤、保存剤（例えば、抗生剤、抗真菌剤）、等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入、局所のための液体、固体およびエアロゾル形態などの、選択された投与の経路および所望の投与形態、ならびに選択された形態が注射によるものなどの投与経路のために無菌でなければならないか否かに依存して、多様な型のキャリア、希釈剤および賦形剤を含んでもよい。
本発明による医薬組成物の好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注射経路を含む非経口、または単一または持続的な静脈内注入である。
一態様において、本発明の医薬組成物は、腫瘍に直接的に注射することにより投与することができる。別の態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内注射することができる。さらに別の態様において、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内で投与することができる。
非経口投与のための医薬組成物は、薬学的に受容可能な水性または非水性の、適切なｐＨに緩衝化され、必要である場合は体液と等張な、媒体中での溶液または分散であってよく、また、組成物をレシピエントの組織または血液に適合性にする抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤および可溶性物質を含んでもよい。組成物中に含まれ得る他の成分は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。適切な流動性および物質の粒子サイズは、レシチンなどのコーティング物質およびヒドロキシプロピルセルロースポリソルベートなどの界面活性剤により提供することができる。液体の非経口用組成物のための好適な等張化剤は、例えば、ブドウ糖などの糖および塩化ナトリウムおよびそれらの組み合わせである。
あるいは、注射または注入による投与のための医薬組成物は、使用の直前に例えば無菌のパイロジェンフリー水などの好適なキャリア中で再構成するための凍結乾燥粉末などの、粉末の形態におけるものであってもよい。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻内投与のための形態は、水溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、等張であるか、またはｐＨ約５．５〜約６．５に維持するために緩衝化されている。さらに、それは、周知の鼻内用調製物中のもののような保存剤または安定化剤を含む。
組成物は、１または２以上の成分の酸化を遅延させる多様な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用を防止するために、組成物は、例えば非限定的にパラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこの型の類似の公知の物質を含む多様な抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。
一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の活性成分を含んでもよい。とりわけ、組成物は、活性成分を、組成物の単位の１％〜７５重量％、または例えば２５％〜６０重量％において含むことができるが、示した値に限定されるものではない。
ヒトを含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、状態の重篤度、処置される疾患の型、先のまたは併用の治療的介入、患者および投与の経路などの、物理的および生理学的要因により決定される。好適な単位用量、全用量および組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。
組成物は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約１マイクログラム〜約１０００ｍｇの用量において、例えば体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲において、または体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、投与することができる。
融合タンパク質およびそれを含む組成物は、抗癌性または抗腫瘍性を発揮し、癌性疾患の処置のために用いることができる。
本発明はまた、上で定義されるような本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物における癌性疾患を処置するための使用を提供する。
本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における癌性疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の抗癌性の融合タンパク質の有効量を、随意に適切な医薬組成物の形態において、投与することする。
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマおよび他の血液系悪性腫瘍などの血液系悪性腫瘍の処置のために用いることができる。融合タンパク質はまた、乳癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、脳腫瘍など固形腫瘍の処置のために用いることができる。
癌の処置における融合タンパク質の適切な投与の経路は、特に、本発明の融合タンパク質を注射または注入の形態においてこの投与経路に適切な組成および形態において投与することからなる、非経口投与である。
本発明は、以下の一般的手法および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載される。
融合タンパク質の過剰発現のための一般的手法
プラスミドの調製
標的の融合タンパク質のアミノ酸配列を鋳型として用いて、それをコードし、Escherichia coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNA配列を生成した。かかる手法により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなる段階の効率を増大させることができる。
生じたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。さらに、生じた標的タンパク質をコードする遺伝子に、制限酵素NdeIの切断部位（リード鎖の５’末端において）およびXhoIの切断部位（リード鎖の３’末端において）を追加した。これらを用いて、遺伝子をベクターpET28a（Novagen）中にクローニングした。それらをまた、他のベクターにタンパク質をコードする遺伝子をクローニングするためにも用いた。このコンストラクトから発現される標的タンパク質は、Ｎ末端においてポリヒスチジンタグ（６個のヒスチジン）を備え（前にトロンビンにより認識される部位を有する）、これはその後、アフィニティークロマトグラフィーを介したその生成に役立った。生じたコンストラクトの正確性を、第１に、単離したプラスミドの酵素NdeIおよびXhoIを用いた制限酵素分析により確認し、その後、標的タンパク質のリーディングフレーム全体の自動シークエンシングにより確認した。シークエンシングのために用いたプライマーは、ベクター中に存在するＴ７プロモーター（5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’）およびＴ７ターミネーター（5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）の配列に相補的である。
生じたプラスミドを用いて、製造業者の推奨に従って形質転換した市販のE. coli株において、標的の融合タンパク質を過剰発現させた。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１％ブドウ糖）上で得られたコロニーを用いて、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および１％ブドウ糖を添加したＬＢ液体培地中で、一晩培養物を調製した。シェイカーインキュベーターにおける約１５ｈの増殖の後で、培養物を用いて、適切な培養物に播種した。
融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手法Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００ｕＭの硫酸亜鉛を含むＬＢ培地に、一晩培養物を播種した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０に達するまで３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧを、０．２５〜１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪してのインキュベーション（３．５〜２０ｈ）の後で、培養物を２５分間、６，０００ｇで遠心分離した。
細菌ペレットを５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を氷上で８分間超音波処理した（４０％の振幅、１５秒パルス、１０ｓのインターバル）。生じた抽出物を、４０分間、２０．０００ｇ、４℃における遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース（GE Healthcare）樹脂を、緩衝液での平行化により前処理し、これを、細菌細胞抽出物の調製のために用いた。樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離の後で得られた上清と共に一晩４℃でインキュベートした。次いで、それをクロマトグラフィーカラム中へロードし、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中のイミダゾール勾配を用いてカラムから溶出させた。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を組み合わせて、４℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＬ−アルギニン、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．０１％のTween 20に対して一晩透析し、同時に、Hisタグをトロンビン（１：５０）で切断した。切断の後で、ベンズアミジンセファロース（商標）樹脂を用いて、トロンビンを標的の融合タンパク質から分離した。生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した（Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、NY、1982年）。
融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手法Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を含むＬＢ培地に、一晩培養物を播種した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０に達するまで３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧを、０．５〜１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪しての２０ｈのインキュベーションの後で、培養物を２５分間、６，０００ｇで遠心分離した。
過剰発現後の細菌細胞を、フレンチプレスにおいて、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中で破壊した。生じた抽出物を、５０分間、８，０００ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース樹脂を、一晩、得られた上清と共にインキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中へ充填した。未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを１５〜２０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（ｐＨ７．８））で洗浄した。次いで、特異的にベッドに結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、NY、1982年）。標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、トロンビン（タンパク質４ｍｇあたり１Ｕ、８ｈ、１６℃で）で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いで、画分を、処方緩衝液（５００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４（ｐＨ７．４））に対して透析した。
２−Ｄ電気泳動を用いた融合タンパク質の特徴づけ
得られたタンパク質をさらに特徴づけるために、およびクロマトグラフィーの条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、以下のスケジュールに従って、２段階において、２次元電気泳動（２−Ｄ）方法を用いた。
ステップ１．ｐＨ勾配および変性条件におけるタンパク質の等電点分離。
１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度でのタンパク質調製物を、アセトン中に１０％のトリクロロ酢酸および０．０７％のベータ−メルカプトエタノールを含む沈殿溶液と１：１の比において混合することにより沈殿させた。混合物を、３０分間２０℃でインキュベートし、ついで、２５分間、１５，０００ｇ、４℃において遠心分離した。上清を除去し、ペレットを０．０７％のベータ−メルカプトエタノールを含む冷たいアセトンで２回洗浄した。次いで、アセトンの残りを、検出可能な匂いがなくなるまで蒸発させた。タンパク質ペレットを、その後に用いるストリップ（strip）に依存して、２５０ｍｌの再水和緩衝液（８Ｍの尿素、、１％のＣＨＡＰＳ、１５ｍＭのＤＴＴ、０．５％の両性電解質（GE Healthcare）、ｐＨ３〜１１または６〜１１のプロフィールを有する）中で懸濁した。タンパク質溶液を、等電点分離のためのセラミックチャンバー内に入れ、その後、適切なｐＨプロフィール（３〜１１または６〜１１）を有する１３ｃｍのDryStrip（GE Healthcare）を入れた。全体を鉱物油の層で被覆した。チャンバーをEttan IPGphor III装置内に置き、ここで、ストリップおよびｐＨプロフィールの次元に割り当てられた以下のプログラムに従って、等電点分離を行った。
１６ｈの２０℃での脱水。
固定ｐＨ勾配での電場における分離（focusing）
Figure 0005911481
次いで、分離されたタンパク質を含むストリップを、１分間、脱イオン化水中で洗浄し、クーマシーブリリアントで染色し、次いで、脱色して、タンパク質の位置をマークするために画像として記録した。脱色されたストリップを、２×１５分間、以下の組成の緩衝液で平行化した：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、１％ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール。
ステップ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる第２方向における分離。
ストリップを、１標準物質サイズあたり１ウェルを含む１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための装置において２００Ｖの電圧で３時間、分離を行った。ゲルをクーマシーブリリアントで染色し、次いで、適用されるスケールで記録した。タンパク質を、その重量をサイズの標準に基づいて決定することにより同定し、そのＩＰＩを、製造者（GE Healthcare）により提供される曲線（陽極としてマークされた末端からのストリップの長さの％に対するｐＨの比）に基づいて６〜１１のスケールについて、または、等電点分離較正キット（GE Healthcare）により実験的に決定された曲線に基づいて３〜１１のスケールについて、読み取った。
本発明の融合タンパク質の代表的な例を以下に記載する。
例１．配列番号1の融合タンパク質
配列番号1のタンパク質は、１９４アミノ酸の長さおよび２２．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、Baxタンパク質のBH3ドメインから誘導された１６アミノ酸のペプチド（配列番号30）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの１６アミノ酸の配列のＣ末端において、７個のArg/R残基のポリアルギニン配列が結合している。ポリアルギニン配列は、細胞膜の浸透および融合タンパク質の細胞内への輸送を補助する。ポリアルギニン配列とTRAILドメインとの間に、互いに連続的に、ウロキナーゼuPAにより認識される配列（配列番号52）およびメタロプロテアーゼMMPにより認識される配列（配列番号51）が組み込まれており、これにより、融合タンパク質の内在化の際に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断される。
融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号1および配列番号67である。
Figure 0005911481
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上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現は、一般的手法Ａに従って、E. coli株BL21（DE3）およびTuner（DE3）pLysS（いずれもNovagen製）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的手法に従って、電気泳動により分離した。
例２．配列番号2の融合タンパク質
配列番号2の融合タンパク質は、１９３アミノ酸の長さおよび２２．５ｋＤａの質量を有するタンパク質であり、ここで、121-281TRAIL配列のＮ末端において、Bidタンパク質から誘導された１６アミノ酸のペプチド（配列番号31）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクタータンパクのＣ末端に、７個のArg残基からなるポリアルギニン配列が結合している。ポリアルギニン配列は、細胞膜の浸透および融合タンパク質の細胞内への輸送を補助する。ポリアルギニン配列とTRAILの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される配列（配列番号52）が互いの隣に連続して組み込まれており、これにより、融合タンパク質の内在化に際して、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断される。
融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号2および配列番号68である。
Figure 0005911481
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上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例３．配列番号3の融合タンパク質
配列番号3の融合タンパク質は、３０３アミノ酸の長さおよび３４．２ｋＤａの質量を有するタンパク質であり、ここで、121-281TRAIL配列のＣ末端において、リボヌクレアーゼRNase Aのホモログ（配列番号32）がエフェクターペプチドとして結合している。ポリアルギニン配列とTRAILの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される配列（配列番号52）が、互いの隣に連続して組み込まれており、これにより、融合タンパク質の内在化に際して、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断される。
タンパク質はまた、TRAILドメイン配列と切断部位の配列との間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSG（配列番号57）を含む。さらに、エフェクターペプチドのＣ末端において、タンパク質は、小胞体指向性の配列KEDL（配列番号56）を含み、これもまたコンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号3および配列番号69である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例４．配列番号4の融合タンパク質
配列番号4の融合タンパク質は、２９３アミノ酸の長さおよび３３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、TRAIL121-281配列のＣ末端において、リボヌクレアーゼRNase Aのホモログ（配列番号32）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドとTRAILの配列との間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGSGGGS（配列番号63）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号4および配列番号70である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Stratagene製のE. coli株BL21DE3pLysSRILおよびNovagen製のTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例５．配列番号5の融合タンパク質
配列番号5の融合タンパク質は、２８３アミノ酸の長さおよび３１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、121-281TRAIL配列のＣ末端において、チトクロムｃの配列（配列番号33）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILドメインの配列とエフェクタータンパク質の配列との間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される配列（配列番号52）が、互いの隣に連続して組み込まれており、これにより、融合タンパク質の内在化に際して、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断される。タンパク質はまた、TRAILドメインの配列と切断部位の配列との間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSG（配列番号57）を含む。さらに、エフェクターペプチドのＣ末端において、タンパク質は、小胞体指向性の配列KEDL（配列番号56）を含み、これは、コンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号5および配列番号71である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例６．配列番号6の融合タンパク質
配列番号6の融合タンパク質は、４０７アミノ酸の長さおよび４５．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、121-281TRAIL配列のＣ末端において、チトクロムｃの配列（配列番号33）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILドメインの配列とエフェクターペプチドの間に、フューリンにより認識される配列（配列番号53）およびPseudomonas aeruginosaからの転位ドメイン（配列番号54）が存在する。タンパク質はまた、可橈性のリンカーを含む：TRAIL配列とフューリンにより認識される配列との間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGS（配列番号58）、フューリンにより認識される配列とPseudomonas aeruginosaからの転位ドメインとの間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーASGG（配列番号65）、転位ドメインの配列とチトクロムｃの配列との間に、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGSGGG（配列番号62）が存在する。さらに、エフェクターペプチドドメインのＣ末端において、タンパク質は、小胞体指向性の配列KEDL（配列番号56）を含み、これは、コンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号6および配列番号72である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例７．配列番号7の融合タンパク質
配列番号7の融合タンパク質は、４０９アミノ酸の長さおよび４６．１ｋＤａの質量を有する融合物であり、ここで、TRAIL114-281の配列のＮ末端において、グランザイムＢの配列（配列番号34）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILドメインの配列とエフェクターペプチドグランザイムＢの配列との間に、フューリン切断部位の配列（配列番号53）が存在し、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGGS（配列番号59）により挟まれている。
融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号7および配列番号73である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例８．配列番号8の融合タンパク質
配列番号8の融合タンパク質は、４０５アミノ酸の長さおよび４５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、121-281TRAIL配列のＣ末端において、グランザイムＢの配列（配列番号34）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、フューリン切断部位の配列（配列番号53）が存在し、これはさらに、グランザイムＢおよびTRAILの両方の配列から、それぞれ、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGS（配列番号58）およびGGGGS（配列番号59）により分離している。さらに、エフェクターペプチドのＣ末端において、タンパク質は、小胞体指向性の配列KDELを含み、これは、コンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号8および配列番号74である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）pLysSを用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例９．配列番号9の融合タンパク質
配列番号9の融合タンパク質は、１８７アミノ酸の長さおよび２１．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、Nur77タンパク質から誘導された９アミノ酸のペプチド（配列番号35）がエフェクターペプチドとして結合しており、７個のArg残基からなるポリアルギニン配列がさらにエフェクターペプチドのＣ末端に結合している。エフェクターペプチドとTRAILの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPのための切断部位の配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAのための切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号9および配列番号75である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Rosetta（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例10．配列番号10の融合タンパク質
配列番号10の融合タンパク質は、１９３アミノ酸の長さおよび２２．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、Bakタンパク質のBH3ドメインを含む１６アミノ酸のペプチド（配列番号36）がエフェクターペプチドとして結合しており、膜を透過する７個のArg残基からなるポリアルギニン配列が、さらにエフェクターペプチドのＣ末端に結合している。エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPについての切断部位の配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAについての切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号10および配列番号76である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）およびTuner（DE3）pLysSを用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例11．配列番号11の融合タンパク質
配列番号11の融合タンパク質は、２０４アミノ酸の長さおよび２４．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281の配列のＮ末端において、PUMA/BBC3分子のBH3ドメイン（配列番号37）がエフェクターペプチドとして結合しており、９個のArg残基を含むポリアルギニン配列が、さらにエフェクターペプチドのＣ末端に結合している。エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、コンストラクトは、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）を含む。
融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号11および配列番号77である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）およびTuner（DE3）pLysSを用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例12．配列番号12の融合タンパク質
配列番号12の融合タンパク質は、３７２アミノ酸の長さおよび４１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281の配列のＣ末端において、PUMAタンパク質（配列番号38）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在し、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSGG（配列番号60）により、TRAILの配列から分離されている。さらに、Ｃ末端において、エフェクターペプチドは、小胞体指向性のKEDL配列（配列番号56）を含み、コンストラクト全体のＣ末端を形成する。
融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号12および配列番号78である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株B.21（DE3）、Stratagene製のBL21DE3pLysSRILを用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例13．配列番号13の融合タンパク質
配列番号13の融合タンパク質は、４９３アミノ酸の長さおよび５３．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、121-281TRAILのＣ末端において、PUMAタンパク質の配列（配列番号38）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とPUMAタンパク質の配列との間に、Pseudomonas aeruginosaからの転位ドメインの配列（配列番号54）が存在し、これはさらに、連続した配列：可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGGS（配列番号59）、フューリン切断部位（配列番号53）および可橈性のアラニン−グリシン−セリンリンカーASGG（配列番号65）によりTRAILの配列から、ならびに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSGG（配列番号60）によりPUMAタンパク質の配列から分離されている。さらに、エフェクターペプチドのＣ末端において、融合タンパク質は、小胞体指向性の配列KEDL（配列番号56）を含み、これは、コンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号13および配列番号79である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）およびStratagene製のBL21DE3pLysSRILを用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例14．配列番号14の融合タンパク質
配列番号14の融合タンパク質は、１８６アミノ酸の長さおよび２１．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列TRAIL121-281のＮ末端において、タンパク質SMAC/Diabloの８アミノ酸のフラグメント（配列番号39）がエフェクターペプチドとして結合しており、７個のArgからなるポリアルギニン配列がさらにエフェクターペプチドのＣ末端に結合している。さらに、ポリアルギニン配列とTRAILの配列との間に、タンパク質は、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）を含む。
融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号14および配列番号80である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）またはTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例15．配列番号15の融合タンパク質
配列番号15の融合タンパク質は、191アミノ酸の長さおよび２２．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列TRAIL121-281のＮ末端において、ブフォリンIIb（配列番号40）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクターペプチドとTRAILの配列との間に、タンパク質は、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）を含む。
融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号15および配列番号81である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例16．配列番号16の融合タンパク質
配列番号16の融合タンパク質は、２７９アミノ酸の長さおよび３１．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＣ末端において、タンパク質オンコナーゼ（配列番号41）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在し、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGS（配列番号58）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号16および配列番号82である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例17．配列番号17の融合タンパク質
配列番号17の融合タンパク質は、２７４アミノ酸の長さおよび３１ｋＤａの質量とを有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281の配列のＣ末端において、タンパク質オンコナーゼ（配列番号41）がエフェクターペプチドとして結合しており、エフェクターペプチドの配列は、さらに、可橈性のグリシン−セリンリンカー、GGGGSGGGGS（配列番号64）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号17および配列番号83である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例18．配列番号18の融合タンパク質
配列番号18の融合タンパク質は、１９７アミノ酸の長さおよび２３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、タンパク質p14ARFのＮ末端ドメインを含む２０アミノ酸のペプチド（配列番号42）がエフェクターペプチドとして結合しており、６個のArg残基からなるポリアルギニン配列がエフェクターペプチドのＣ末端においてさらに結合している。さらに、ポリアルギニン配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼ切断部位uPAの配列（配列番号52）およびMMPの配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号18および配列番号84である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例19．配列番号19の融合タンパク質
配列番号19の融合タンパク質は、１８９アミノ酸の長さおよび２２．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、Mdm2に結合している１１アミノ酸のペプチド（配列番号43）ががエフェクターペプチドとして結合しており、７個のArg残基からなるポリアルギニン配列が、エフェクターペプチドのＣ末端においてさらに結合している。さらに、ポリアルギニン配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号19および配列番号85である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）またはTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例20．配列番号20の融合タンパク質
配列番号20の融合タンパク質は、１９５アミノ酸の長さおよび２２．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、ルナシンから誘導されるペプチド（配列番号44）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドとTRAILの配列との間に、所与の順序において、７個のArg残基からなるポリアルギニン配列ならびにプロテアーゼuPAのための切断部位の配列（配列番号52）およびMMPのための切断部位の配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号20および配列番号86である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）またはTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例21．配列番号21の融合タンパク質
配列番号21の融合タンパク質は、２１８アミノ酸の長さおよび２５．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281配列のＮ末端において、エフェクターペプチドとして、８アミノ酸のタンパク質Smac/Diabloのフラグメント（配列番号39）が結合しており、そのＣ末端に、７個のArg残基からなるポリアルギニン配列が結合している。さらに、TRAIL121-281配列のＣ末端に、第２のエフェクターペプチドとして、Bikタンパク質のBH3ドメインを含むペプチド（配列番号45）が結合しており、第２のエフェクターペプチドは、そのＮ末端に結合した７個のArg残基からなるポリアルギニン配列を有する。TRAILの配列と、ポリアルギニン配列が結合した両方のエフェクターペプチドとの間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号21および配列番号87である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Rosetta（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例22．配列番号22の融合タンパク質
配列番号22の融合タンパク質は、１９９アミノ酸の長さおよび２２．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL121-281の配列のＣ末端において、エフェクターペプチドとして、Gly、Alaの反復からなる合成ペプチド配列（配列番号46）が結合しており、また、そのＣ末端に結合した８個のArg残基からなるポリアルギニン配列を有し、後者はまた、コンストラクト全体のＣ末端部分を形成する。さらに、エフェクターペプチドとTRAILの配列との間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびウロキナーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図４において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号22および配列番号88である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）またはTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例23．配列番号23の融合タンパク質
配列番号23の融合タンパク質は、２８９アミノ酸の長さおよび３２．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、121-281のTRAIL配列のＣ末端において、プロテアソームのUIMsモチーフを含むコンポーネントS5aのＣ末端ドメイン（配列番号46）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクターペプチドとTRAIL配列との間に、フューリン切断部位の配列（配列番号53）が存在し、これは、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGSGG（配列番号61）によりTRAIL配列から分離されており、およびエフェクターペプチドのＣ末端において、小胞体指向性のKEDL配列（配列番号56）が配置されており、後者は、コンストラクト全体のＣ末端部分である。
融合タンパク質の構造を、図５において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号23および配列番号89である。
Figure 0005911481
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上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ｂに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）またはTuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例24．配列番号24の融合タンパク質（比較用）
配列番号24の融合タンパク質は、１８３アミノ酸の長さおよび２１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、119-281のTRAIL配列のＮ末端において、TNFリガンドから誘導されたデカペプチド（配列番号48）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図５において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号24および配列番号90である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株BL21（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例25．配列番号25の融合タンパク質（比較用）
配列番号25の融合タンパク質は、１７９アミノ酸の長さおよび２０．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL119-281の配列のＮ末端において、TNFから誘導された６アミノ酸のペプチド（配列番号49）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図５において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号25および配列番号91である。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例26．配列番号26の融合タンパク質（比較用）
配列番号26の融合タンパク質は、１８０アミノ酸の長さおよび２０．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、TRAIL119-281配列のＮ末端において、エフェクターペプチドとして、TNFサイトカインの５アミノ酸のフラグメント（配列番号50）が結合しており、これはさらに１個のCys残基をそのＣ末端およびＮ末端の両方に有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図５において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号26および配列番号92である。
Figure 0005911481
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上に表わされるアミノ酸配列を鋳型として用いて、上に表わされるそのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例27．配列番号93の融合タンパク質
配列番号93の融合タンパク質は、４５９アミノ酸の長さおよび５０．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281配列のＣ末端において、全長ヒトRNAse A（配列番号32）がエフェクターペプチドとして結合しており、これは、そのＣ末端において小胞体指向性の配列（KDEL）により、そのＮ末端において可橈性のグリシン−セリンリンカー（配列番号175）により、挟まれている。さらに、三量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＮ末端において結合したポリシステインリンカー（配列番号179）を有し、これはそのＮ末端において、グリシン残基により挟まれている。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、所与の順序において、可橈性のグリシン−セリンリンカー（配列番号59）、ペグ化のためのリンカー（配列番号170）、フューリンにより認識される切断部位の配列（配列番号53）、可橈性のグリシン−セリンリンカー（配列番号65）、および改変したPseudomonas aeruginosaの転位ドメイン（ヘリックスＦ欠失（helix F deletion））（配列番号176）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図６において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号93および配列番号122である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例28．配列番号94の融合タンパク質
配列番号94の融合タンパク質は、２１３アミノ酸の長さおよび２４．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281配列のＮ末端において、Nur77から誘導されたペプチド（配列番号35）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した、７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図６において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号93および配列番号122である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例29．配列番号95の融合タンパク質
配列番号95の融合タンパク質は、２０４アミノ酸の長さおよび２３．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAILの配列116-281のＮ末端において、アズリンから誘導されるペプチド（配列番号151）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が存在する。
融合タンパク質の構造を、図６において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号95および配列番号124である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例30．配列番号96の融合タンパク質
配列番号96の融合タンパク質は、２０５アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL120-281の配列のＣ末端において、アズリンから誘導されるペプチド（配列番号151）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、フューリンプロテアーゼにより認識される切断部位の配列（配列番号172）が存在し、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGS（配列番号58）によりTRAIL配列から分離されている。エフェクターペプチドのＣ末端は、小胞体指向性の配列KEDL（配列番号56）により挟まれており、これは、コンストラクト全体のＣ末端部分を形成する。
融合タンパク質の構造を、図６において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号96および配列番号125である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例31．配列番号97の融合タンパク質
配列番号97の融合タンパク質は、２０７アミノ酸の長さおよび２３．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL120-281の配列のＣ末端において、アズリンから誘導されるペプチド（配列番号151）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置され、これらはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGSGGG（配列番号62）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図６において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号97および配列番号126である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例32．配列番号98の融合タンパク質
配列番号98の融合タンパク質は、３２７アミノ酸の長さおよび３６．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL120-281の配列のＣ末端において、全長アズリンペプチド（配列番号152）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置され、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGSGGG（配列番号62）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図７において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号98および配列番号127である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例33．配列番号99の融合タンパク質
配列番号99の融合タンパク質は、１９９アミノ酸の長さおよび２２．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL114-281の配列のＮ末端において、Smac/DIABLOから誘導された８量体ペプチド（配列番号39）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が位置する。
融合タンパク質の構造を、図７において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号99および配列番号128である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例34．配列番号100の融合タンパク質
配列番号100の融合タンパク質は、２２１アミノ酸の長さおよび２５．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＮ末端において、Smac/DIABLOから誘導された８量体ペプチド（配列番号39）がエフェクターペプチドとして結合している。TRAILの配列は、そのＮ末端において結合した、その３量体構造を安定化するためのポリシステインリンカー（配列番号177）を有する。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図７において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号100および配列番号129である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例35．配列番号101の融合タンパク質
配列番号101の融合タンパク質は、２１２アミノ酸の長さおよび２４．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＮ末端において、Smac/DIABLOから誘導された８量体ペプチド（配列番号39）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図７において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号101および配列番号130である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例36．配列番号102の融合タンパク質
配列番号102の融合タンパク質は、２１２アミノ酸の長さおよび２４．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＮ末端において、aPPタンパク質とBaxタンパク質のBH3ドメインとから設計されたペプチド（配列番号153）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、６個のArg残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が位置する。
融合タンパク質の構造を、図７において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号102および配列番号131である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例37．配列番号103の融合タンパク質
配列番号103の融合タンパク質は、２４７アミノ酸の長さおよび２８．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＮ末端において、aPPタンパク質とタンパク質のBH3ドメインとから設計されたペプチド（配列番号153）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、６個のArg残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。TRAILの配列は、そのＮ末端において結合した、その３量体構造を安定化させるためのポリシステインリンカー（配列番号177）を有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図８において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号103および配列番号132である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例38．配列番号104の融合タンパク質
配列番号104の融合タンパク質は、２１２アミノ酸の長さおよび２４．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL114-281の配列のＣ末端において、aPPタンパク質とタンパク質のBH3ドメインとから設計されたペプチド（配列番号153）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図８において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号104および配列番号133である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例39．配列番号105の融合タンパク質
配列番号105の融合タンパク質は、221アミノ酸の長さおよび２４．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL120-281の配列のＮ末端において、レティキュロンRTN1-Cから誘導されたペプチド（配列番号155）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、核局在化配列（配列番号168）を有する。さらに、その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＮ末端において結合した、ポリシステインリンカー（配列番号179）を有し、これは、それぞれそのＮ末端およびＣ末端において２個および３個のグリシン残基により挟まれている。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図８において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号105および配列番号134である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例40．配列番号106の融合タンパク質
配列番号106の融合タンパク質は、４３５アミノ酸の長さおよび４８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL119-281の配列のＮ末端において、レティキュロンRTN1-Cから誘導されたペプチド（配列番号156）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、８個のArg残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＮ末端において結合したポリシステインリンカー（配列番号178）を有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されており、この切断部位の配列は、Ｎ末端およびＣ末端においてそれぞれ、リンカー配列GGSGG（配列番号60）により挟まれている。
融合タンパク質の構造を、図８において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号106および配列番号135である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例41．配列番号107の融合タンパク質
配列番号107の融合タンパク質は、５８０アミノ酸の長さおよび６５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＣ末端において、構成的に活性なカスパーゼ−３（一本鎖）（配列番号157）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、Pseudomonasから誘導された輸送ドメイン（配列番号176）が配置されている。輸送ドメインおよびエフェクターペプチドの配列は、可橈性のリンカーGGGSGGG（配列番号62）を介して連結されている。輸送ドメインは、フューリンにより認識される切断部位の配列（配列番号53）によりTRAILの配列から分離されており、この切断部位の配列は、そのＮおよびＣ末端においてそれぞれ２つのリンカー配列GGGGS（配列番号59）およびASGG（配列番号65）によって挟まれている。
融合タンパク質の構造を、図８において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号107および配列番号136である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例42．配列番号108の融合タンパク質
配列番号108の融合タンパク質は、２４７アミノ酸の長さおよび２８．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL119-281の配列のＮ末端において、Par-4からのSACドメイン（配列番号158）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列は、そのＮ末端において結合した可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSGG（配列番号60）を有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号173）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号108および配列番号137である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例43．配列番号109の融合タンパク質
配列番号109の融合タンパク質は、２４７アミノ酸の長さおよび２８．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL119-281の配列のＮ末端において、Par-4からのSACドメイン（配列番号158）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを、そのＮ末端において、Oct6転写因子からのNLS（核局在化シグナル）配列（配列番号168）を有する。TRAILの配列は、そのＮ末端において結合した可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSGG（配列番号60）を有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号173）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号109および配列番号138である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例44．配列番号110の融合タンパク質
配列番号110の融合タンパク質は、２７０アミノ酸の長さおよび３０．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＣ末端において、Noxaタンパク質（配列番号159）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＣ末端において結合したポリシステインリンカー（配列番号177）を有し、これは、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSG（配列番号57）によりTRAILの配列から分離されている。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号110および配列番号139である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例45．配列番号111の融合タンパク質
配列番号111の融合タンパク質は、２０７アミノ酸の長さおよび２３．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL114-281の配列のＣ末端において、Noxaタンパク質から誘導されたMTD/CKPペプチド（配列番号160）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＣ末端において結合したポリシステインリンカー（配列番号177）を有し、このリンカーは、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSG（配列番号57）によりTRAILの配列から分離されている。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号111および配列番号140である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例46．配列番号112の融合タンパク質
配列番号112の融合タンパク質は、３１１アミノ酸の長さおよび３５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＮ末端において、ペプチドオンコナーゼ（配列番号41）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されており、これはさらに、２つの可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGGS（配列番号59）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号112および配列番号141である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例47．配列番号113の融合タンパク質
配列番号113の融合タンパク質は、２３０アミノ酸の長さおよび２７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＮ末端において、PUMAタンパク質からのBH3ドメイン（配列番号37）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した、９個のArg残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図１０において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号113および配列番号142である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例48．配列番号114の融合タンパク質
配列番号114の融合タンパク質は、２２５アミノ酸の長さおよび２５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＣ末端において、Bidタンパク質から誘導された短いペプチド（配列番号31）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した輸送ドメインKPRRPY（配列番号167）を有する。その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列は、そのＣ末端において結合したポリシステインリンカー（配列番号177）を有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図１０において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号114および配列番号143である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例49．配列番号115の融合タンパク質
配列番号115の融合タンパク質は、２３４アミノ酸の長さおよび２６．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＣ末端において、短いハイブリッドペプチドAntp-TPR（配列番号161）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されており、これはさらに、その３量体構造を安定化させるために、ポリシステインリンカー（配列番号177）により、およびその後ろの２個のグリシン残基により、TRAIL配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図１０において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号115および配列番号144である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例50．配列番号116の融合タンパク質
配列番号116の融合タンパク質は、２１６アミノ酸の長さおよび２４．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL120-281の配列のＮ末端において、Stat3タンパク質のSH2ドメインのペプチド阻害剤（配列番号162）がエフェクターペプチドとして結合している。さらに、その３量体構造を安定化させるために、TRAILの配列のＮ末端において、ポリシステインリンカー（配列番号179）が結合しており、リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端においてそれぞれ３個のグリシン残基およびGSCモチーフにより挟まれている。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図１０において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号116および配列番号145である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例51．配列番号117の融合タンパク質
配列番号117の融合タンパク質は、１９４アミノ酸の長さおよび２２．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＮ末端において、Bakタンパク質のBH3ドメインから誘導されたペプチド（配列番号163）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。
融合タンパク質の構造を、図１０において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号117および配列番号146である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例52．配列番号118の融合タンパク質
配列番号118の融合タンパク質は、２５７アミノ酸の長さおよび３０ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＮ末端において、Badタンパク質のBH3ドメインから誘導されたペプチド（配列番号164）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端において結合した８個のArg残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されている。TRAIL121-281の配列のＣ末端において、可橈性のリンカーGGSHG（配列番号182）が存在し、その後ろに、トロンビンプロテアーゼにより認識される切断部位の配列（配列番号174）およびコンストラクト全体のＣ末端部分としてTRAILの配列95-121が続く。
融合タンパク質の構造を、図１１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号118および配列番号147である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例53．配列番号119の融合タンパク質
配列番号119の融合タンパク質は、２３６アミノ酸の長さおよび２７．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL95-281の配列のＣ末端において、Badタンパク質のBH3ドメインから誘導されたペプチド（配列番号164）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した７個のアルギニン残基からなるポリアルギニン輸送ドメインを有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されており、TRAIL95-281の配列のＣ末端は、GGS残基からなるリンカーにより、切断部位の配列と分離されている。
融合タンパク質の構造を、図１１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号119および配列番号148である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例54．配列番号120の融合タンパク質
配列番号120の融合タンパク質は、２１６アミノ酸の長さおよび２４．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＣ末端において、Bfl1タンパク質からのATAPペプチド（配列番号165）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した、膜輸送ドメインKPRRPYR（配列番号181）を有する。さらに、TRAILの配列とエフェクターペプチドの配列との間に、プロテアーゼMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）およびuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）が配置されており、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGGGSGGGG（配列番号180）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図１１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号120および配列番号149である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
例55．配列番号121の融合タンパク質
配列番号120の融合タンパク質は、２３７アミノ酸の長さおよび２７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であって、ここで、TRAIL121-281の配列のＮ末端において、Bfl1タンパク質からのATAPペプチド（配列番号165）がエフェクターペプチドとして結合している。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端において結合した、ミトコンドリア標的化配列（配列番号166）を有する。さらに、エフェクターペプチドの配列とTRAILの配列との間に、プロテアーゼuPAにより認識される切断部位の配列（配列番号52）およびMMPにより認識される切断部位の配列（配列番号51）が配置されており、これはさらに、可橈性のグリシン−セリンリンカーGGSGG（配列番号60）によりTRAILの配列から分離されている。
融合タンパク質の構造を、図１１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、以下に示す配列番号121および配列番号150である。
上記の構造のアミノ酸配列を鋳型として用いて、そのコードDNA配列を生成した。上記の一般的な手法に従って、DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、一般的な手法Ａに従って、Novagen製のE. coli株Tuner（DE3）を用いて行った。タンパク質を、上記の一般的な手法に従って電気泳動により分離した。
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験を、腫瘍細胞株においてin vitroで、マウスにおいてin vivoで行った。比較を目的として、hTRAIL114-281タンパク質（本明細書において以下また単純にTRAILと称される）を用いた。
１．細胞株におけるin vitroでの試験
細胞株
ヒト大腸癌Colo205（ATCC＃CCL-222）、小細胞肺癌A549（ATCC＃CCL-185）、膵臓癌BxPC3（ATCC＃CRL-1687）、前立腺癌DU145（ATCC＃HTB-81）およびPC3（ATCC＃CRL-1435）、ならびにヒト大細胞肺癌NCI-H460-Luc2（Caliper ＃124316）の細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。ヒト卵巣癌細胞OVCAR-3（ATCC＃HTB-161）を、２０％ウシ胎児血清および０．０１ｍｇ／ｍｌインシュリンを添加したRPMI 1640培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。膀胱癌細胞UM-UC-3（ATCC＃CRL-1749）、肺癌細胞SK-MES-1（ATCC＃HTB-58）、乳癌細胞MCF-7（ATCC＃HTB-22）、HT1080結合組織癌細胞（ATCC＃CCL-121）、肝臓ヘパトーマHepG2細胞（ATCC＃HB-8065）を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone, Logan, UT, USA）を添加したMEM培養培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。結合組織腫瘍細胞HT1080はまた、実験の間、これらの細胞の２日間の通常培養から採取した条件培地においても維持した。ヒト大腸癌HCT-116（ATCC＃CCL-247）およびHT-29（HTB-38）、卵巣癌SK-OV-3（ATCC＃HTB-77）、子宮癌MES-SA（ATCC＃CRL- 1976）およびドキソルビシンに対して耐性であるそのクローンMES-SA/Dx5（ATCC＃CRL-1977）の細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したMcCoy培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。
膀胱癌細胞SW780（ATCC＃CRL-2169）、乳癌細胞MDA-MB-231（ATCC＃HTB-26）およびヒト膵臓癌上皮細胞様細胞株PANC-1、CLS（Cell Lines Service＃300228）の細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したDMEM（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。臍帯静脈からのHUVEC細胞（ATCC＃CRL-1730）を、２０％ウシ胎児血清、増殖因子０．０２ｍｇ／ｍｌのECGS（Sigma）、０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma）を添加したM199培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持し、これらの細胞を、０．１％ゼラチンでコートした培地上で増殖させた。MCF10A胸部細胞（ATCC＃CRL-10317）を、５％ウマ血清、０．５ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌのインシュリン、２０ｎｇ／ｍｌの増殖因子EGF（全てSigma、USA）を添加したDMEM：F12（１：１）（Sigma, USA）において維持した。全ての培地に、さらに、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Hyclone, Logan, UT, USA））を添加した。細胞を、増殖培地RPMI、MEM、McCoyおよびDMEM：F12の場合は、３７℃で５％ＣＯ２／空気中で、DMEMの場合は１０％ＣＯ２／空気中で維持した。細胞は、マイコプラズマの存在について、キットVenor（登録商標）GeMマイコプラズマＰＣＲ検出キットを用いるＰＣＲ技術）（（Minerva Biolabs, Berlin, Germany）により、ルーチン的にチェックした。
MTT細胞傷害性試験
MTTアッセイは、細胞増殖を測定するために用いられる比色アッセイである。その本質は、ミトコンドリア中に存在する酵素コハク酸−テトラゾリウムレダクターゼによる、黄色のテトラゾリウム塩MTT（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、非水溶性の紫色の色素ホルマザンへの分解にある。MTTの還元は、生細胞においてのみ起こる。データ分析の本質は、処置された集団において対照細胞と比較して細胞の数の５０％の減少が起こる、タンパク質のＩＣ５０濃度を（ｎｇ／ｍｌにおいて）決定することにある。結果は、GraphPad Prism 5.0を用いて分析した。
試験は、文献の記載に従って行った（Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvment of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）。
細胞培養培地を、既定濃度（１００μｌあたり１０４〜１０５細胞）まで希釈した。次いで、１００μｌの適切に希釈された細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに、３個の複製において、適用した。このようにして調製した細胞を、２４時間、３７℃で、用いた培地に依存して５％または１０％ＣＯ２中でインキュベートし、次いで、細胞に（１００μｌの培地中で）、さらに、多様な濃度の試験されるタンパク質を含む１００μｌの培地を添加した。細胞を、試験されるタンパク質と共に次の７２時間（これは３〜４回の細胞分裂と等しい）にわたりインキュベートし、その後、試験されるタンパク質を含む培地に、２０ｍｌのMTTの希釈標準溶液［５ｍｇ／ｍｌ］を添加し、３時間、３７℃で、５％ＣＯ２中でインキュベートした。次いで、MTTの溶液を含む培地を除去し、１００μｌのDMSOを添加することによりホルマザン結晶を溶解した。混合した後、吸光度を５７０ｎｍで測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。
in vitro細胞傷害性試験の結果を、表１、１ａ、１ｂおよび表２において、溶媒のみと共にインキュベートされた対照細胞の５０％のレベルにおいて融合タンパク質の細胞傷害性効果が観察されるタンパク質濃度に対応する、ＩＣ５０値として要約する。各々の実験は、少なくとも２回の独立した実験を３個の複製において行った平均値を表わす。タンパク質調製物の活性の不在の基準として、２０００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０限度を採用した。２０００より上のＩＣ５０値を有する融合タンパク質は、不活性であるとみなした。
この試験のための細胞を、天然でTRAILタンパク質に対して耐性である腫瘍細胞株（TRAILに対する天然の耐性の基準：TRAILタンパク質についてのＩＣ５０＞２０００）、TRAILタンパク質に対して感受性である腫瘍細胞株、および、従来の抗癌薬に対して耐性の癌株としてドキソルビシンに対して耐性の株MES-SA/DX5を含むように選択した。
非癌細胞に対する融合タンパク質の影響／毒性の評価のための健康な対照細胞株として、未分化HUVEC細胞株を用いた。
得られた結果は、TRAILに対して天然に耐性を有する細胞への本発明の特定の融合タンパク質の投与により、細胞株のTRAILに対する耐性を克服する能力を確認した。TRAILに対して感受性の細胞中に本発明の融合タンパク質を投与した場合、一部の例において、明らかかつ強力な、TRAILの活性の効力の増強が観察され、これは、TRAIL単独についてのＩＣ５０と比較して融合タンパク質のＩＣ５０値が低下したことにおいて表わされる。さらに、本発明の融合タンパク質の細胞傷害活性は、古典的な抗癌薬ドキソルビシンに対して耐性の細胞において得られ、一部の例においては、TRAILの活性よりも強力であった。
非癌細胞株について得られた２０００よりも高いＩＣ５０値は、健康な細胞に対しての本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果の不在を示し、これは、当該タンパク質の全身毒性が低い可能性を示す。
Figure 0005911481
Figure 0005911481
２．選択されたタンパク質調製物の広範な腫瘍細胞株のパネルに対する細胞傷害活性の分析
表２は、選択された本発明の融合タンパク質についての、殆どの一般的な広範囲の癌に対応する様々な器官からの腫瘍細胞の広範なパネルに対するin vitroでの細胞傷害活性の結果を表わす。得られたＩＣ５０値は、融合タンパク質の高い細胞傷害活性を確認し、したがって、癌の処置におけるそれらの潜在的な有用性を確認する。
Figure 0005911481
３．異種移植片に対する融合タンパク質のin vivoでの抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸癌Colo205、ヒト大細胞肺癌NCI-H460-Luc2、ヒト肺癌A549、およびヒト膵臓癌PANC-1のマウスモデルにおいて試験した。
細胞
Colo205細胞（ATCC＃CCL-222）を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを添加したOpti-MEM（Invitrogen, Cat.22600-134）と１：１の比において混合したRPMI 1640培地（Hyclone, Logan, UT, USA）において維持した。マウス移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することにより、細胞を支持体から剥離し、次いで、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で、８分間、遠心分離し、HBSS緩衝液（Hanks培地）中に懸濁し、計数して、２８．５７×１０６細胞／ｍｌの濃度まで希釈した。次いで、細胞にMatrigel（BD Biocsciences, Cat.354 248）を、最終細胞濃度２５×１０６細胞／ｍｌまで添加した。
H460-Luc2細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを添加したRPMI 1640培地（HyClone, Logan, UT, USA）において維持した。マウス移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することにより、細胞を支持体から剥離し、次いで、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で、８分間、遠心分離し、HBSS緩衝液（Hanks培地）中に懸濁し、計数して、５０×１０６細胞／ｍｌの濃度まで希釈した。
A549細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを添加したRPMI 1640培地（HyClone, Logan, UT, USA）において維持した。マウス移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することにより、細胞を支持体から剥離し、次いで、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で、８分間、遠心分離し、HBSS緩衝液（Hanks培地）中に懸濁した。
ヒト膵臓癌PANC-1細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを添加したDMEM培地（HyClone, Logan, UT, USA）において維持した。マウス移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することにより、細胞を支持体から剥離し、次いで、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で、８分間、遠心分離し、HBSS緩衝液（Hanks培地）中に懸濁した。
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験を、Harlan UK Ltd.（Shaws Farm, Bicester, UK）から入手した７〜９週齢のNOD SCIDマウスに対して行った。A549、NCI-H460-Luc2およびPANC-1細胞の場合、本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験を、Charles River Germanyから入手した４〜５週齢のCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスに対して行った。マウスを、特定の病原体フリー条件下に維持し、食餌および脱ミネラル水への自由なアクセスを与えた。動物に対する全ての実験は、ガイドライン：New York Academy of Sciences’ Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行された「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」、に従って行い、ワルシャワにおけるIV地域の動物実験についての倫理委員会により承認された（No. 71/2009）。
実験の経過および評価
第０日において、マウスに、右側において皮下（ｓｃ）で、０．１５ｍｌのHBSS緩衝液および０．０５ｍｌのMatrigel中に懸濁した５×１０６個のColo205細胞を、０．５×２５ｍｍの針（Bogmark）を備えた注射器により移植した。腫瘍が約９０〜１４０ｍｍ３のサイズに達した場合（第１１日）に、マウスを無作為化して、約１１５ｍｍ３の腫瘍の群の平均サイズを得、処置群に振り分けた。処置群に、本発明の融合タンパク質の調製物を、比較としてTRAIL114-281を投与した。調製物は、腹腔内（ｉｐ）で毎日１０日間（ｑｄｘ１０）、第１１〜２０日において投与した。治療群が約２０００ｍｍ３の平均腫瘍サイズに達した場合、マウスを脊髄の破壊により安楽死させた。対照群には、TRAIL114-281を与えた。
H460の場合、第０日において、マウスに、右側において皮下（ｓｃ）で、０．１ｍｌのHBSS緩衝液中に懸濁した５×１０６個のNCI-H460-Luc2細胞を、０．５×２５ｍｍの針（Bogmark）を備えた注射器により移植した。腫瘍が約１００〜１２０ｍｍ３のサイズに達した場合（第１１日）に、マウスを無作為化して、処置群に振り分けた。処置群に、本発明の融合タンパク質の調製物を、比較としてTRAIL114-281を投与した。調製物は、静脈内（ｉ．ｖ．）で、１日６回、２日毎に投与した。実験の２９日目に、マウスを脊髄の破壊により安楽死させた。対照群には、TRAIL114-281を与えた。
A549の場合、第０日において、マウスに、右側において皮下（ｓｃ）で、０．１ｍｌの、３：１の比において混合されたHBSS緩衝液：Martigel中に懸濁された７×１０６個のA549細胞を、０．５×２５ｍｍの針（Bogmark）を備えた注射器により移植した。腫瘍が約１００〜１２０ｍｍ３のサイズに達した場合（第１７日）、マウスを無作為化して、処置群に振り分けた。処置群に、本発明の融合タンパク質の調製物を、比較としてTRAIL114-281を投与した。調製物は、静脈内（ｉ．ｖ．）で、１日６回、２日毎に投与した。実験の３４日目に、マウスを脊髄の破壊により安楽死させた。対照群には、TRAIL114-281を与えた。
PANC-1の場合、第０日において、マウスに、右側において皮下（ｓｃ）で、０．１ｍｌの、３：１の比において混合されたHBSS緩衝液：Martigel中に懸濁された７×１０６個のPANC-1細胞を、０．５×２５ｍｍの針（Bogmark）を備えた注射器により移植した。腫瘍が約９５ｍｍ３のサイズに達した場合（第２７日）、マウスを無作為化して、処置群に振り分けた。処置群に、本発明の融合タンパク質の調製物を、比較としてTRAIL114-281を投与した。調製物は、静脈内（ｉ．ｖ．）で、１日６回、２日毎に投与した。実験の４３日目に、マウスを脊髄の破壊により安楽死させた。対照群には、TRAIL114-281を与えた。
電気キャリパー（electronic calliper）を用いて、腫瘍のサイズを測定し、腫瘍の容積を、式：（ａ２×ｂ）／２を用いて計算した。ここで、ａは、腫瘍の短い対角（ｍｍ）であり、ｂは、腫瘍の長い対角（ｍｍ）である。腫瘍の増殖の阻害は、式：
ＴＧＩ［％］（腫瘍増殖阻害）＝（ＷＴ／ＷＣ）×１００−１００％
を用いて計算した。ここで、ＷＴは、処置群における平均腫瘍容積を指し、ＷＣは、対照群における平均腫瘍容積を指す。
実験結果を、平均値±上旬偏差（ＳＤ）として表わす。全ての計算およびグラフは、プログラムGraphPad Prism 5.0を用いて準備した。
実験結果を図１２および１３において、Colo205結腸癌による負荷を与えられ、本発明の融合タンパク質により、および比較としてTRAIL114-281により処置されたマウスSCID/NODにおける腫瘍容積の変化の図として示す。図１２および１３においてグラフにおいて表わされる実験の結果は、本発明の例１および例14の融合タンパク質の投与が、腫瘍Colo205の増殖阻害を引き起こし、ＴＧＩは、実験の29日目において、対照に対して、それぞれ３９％および３２％であったことを示す。参照調製物として用いられたTRAIL114-281について、対照と比較して、腫瘍細胞の増殖に対する僅かな阻害効果が得られ、そのＴＧＩは９％のレベルであった。したがって、本発明の融合タンパク質は、TRAILと比較して遥かに強力な効果を発揮する。
試験された融合タンパク質は、マウスの体重の減少により表わされる著しい副作用を引き起こさなかった（すなわち、基線の体重の１０％未満）。このことは、当該タンパク質の低い全身性毒性を示す。
図１４および１５において表わされる実験結果は、NCI-H460ヒト大細胞肺癌による負荷を与えられ、本発明の融合タンパク質で処置し、比較としてTRAIL114-281で処置した、マウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける腫瘍容積の変化の図を示す。例14および例２の本発明の融合タンパク質を投与することにより、NCI-H460腫瘍の増殖の阻害が得られ、TGIは、実験の２９日目において対照と比較して、それぞれ８２％および８１％であったことが示され得る。参照調製物として用いたTRAIL114-281について、腫瘍細胞の増殖に対する僅かな阻害効果が対照と比較して得られ、TGIは７５％のレベルであった。したがって、本発明の融合タンパク質は、TRAILと比較して、この癌細胞に対して、はるかにより強力な効果を発揮する。
試験した融合タンパク質は、マウスの体重の減少により表わされる著しい副作用を引き起こさなかった（すなわち、基線の体重の１０％未満）。このことは、当該タンパク質の低い全身性毒性を示す。
図１６および１７において表わされる実験結果は、A549ヒト肺癌による負荷を与えられ、本発明の融合タンパク質で処置し、比較としてTRAIL114-281で処置した、マウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける腫瘍容積の変化の図を示す。例14および例２の本発明の融合タンパク質を投与することにより、A549腫瘍の増殖の阻害が得られ、TGIは、実験の２９日目において対照と比較して、それぞれ４８％および４５．５％であったことが示され得る。参照調製物として用いたTRAIL114-281について、腫瘍細胞の増殖に対する僅かな阻害効果が対照と比較して得られ、TGIは２０．７％のレベルであった。したがって、本発明の融合タンパク質は、TRAILと比較して、この癌細胞に対して、はるかにより強力な効果を発揮する。
図１８および１９において表わされる実験結果は、PANC-1ヒト膵臓癌による負荷を与えられ、本発明の融合タンパク質で処置し、比較としてTRAIL114-281で処置した、マウスCrl:SHO-PrkdcscidHrhrにおける腫瘍容積の変化の図を示す。例14および例２の本発明の融合タンパク質を投与することにより、PANC-1腫瘍の増殖の阻害が得られ、TGIは、実験の４３日目において対照と比較して、それぞれ４１．５％および４９．８％であったことが示され得る。参照調製物として用いたTRAIL114-281について、腫瘍細胞の増殖に対する僅かな阻害効果が対照と比較して得られ、TGIは３２％のレベルであった。したがって、本発明の融合タンパク質は、TRAILと比較して、この癌細胞に対して、はるかにより強力な効果を発揮する。
試験した融合タンパク質は、マウスの体重の減少により表わされる著しい副作用を引き起こさなかった（すなわち、基線の体重の１０％未満）。このことは、当該タンパク質の低い全身性毒性を示す。
円二色性−本発明の融合タンパク質の調製物の二次構造内容の決定
融合タンパク質の調製物の構造の、それらの構造に関する質を、円二色性（ＣＤ）を用いる二次構造の分析により決定した。ＣＤ法は、光の偏光の平面を回転させる上で明らかになるタンパク質構造の光学活性、および楕円偏光の様子を用いる。遠紫外線（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルは、主要なポリペプチド鎖の立体構造についての正確なデータを提供する。
例１、例２、例14、例24、例51および例42の後において調製されたタンパク質の試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、８０ｍＭのサッカロース、５ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液中に処方し、透析バッグ（Sigma-Aldrich）中で、１２ｋＤａのカットオフで透析した。透析を、タンパク質調製物を含む緩衝液の１００倍の過剰量（ｖ／ｖ）に対して、撹拌しながら、数時間、４℃で行った。透析が完了した後、各調製物を遠心分離し（２５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、適切な上清を回収した。このようにして得られた試料におけるタンパク質濃度を、ブラッドフォード法により決定した。
０．１〜２．７ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度におけるタンパク質の円二色性の測定を、Jasco J-710分光偏光計において、０．２ｍｍまたは１ｍｍの光路を備えた石英キュベット中で行った。１９５〜２５０ｎｍの範囲の波長における測定の実施を可能にする７Ｌ／分の窒素の流れにおいて、測定を行った。
測定のパラメーター：スペクトルの解像度−１ｎｍ；光放射の半幅１ｎｍ；感受性２０ｍｄｅｇ、１波長の平均時間−８ｓ、スキャン速度１０ｎｍ／分。
結果を、３回の測定の平均値として表わす。例１、例２、例14、例24、例51および例42によるタンパク質についての円二色性スペクトルを、図２０において表わす。
得られたスペクトルを、CDProパックを用いて、１９３〜２５０ｎｍの範囲において数値的に分析した。光電子倍増管における電圧が７００Ｖを超える点は、この波長の範囲におけるシグナル対ノイズ比が低すぎるため、無視した。得られたデータは、CDProプログラムパッケージを用いて分析されたタンパク質における特定の二次構造の内容の計算のために役立てた（表４）。
Figure 0005911481
対照（rhTRAIL114-281）は、主にβ−シート構造型を有するタンパク質についての特徴的なＣＤスペクトル（最小波長２２０ｎｍにおいてはっきりと輪郭づけられた楕円）を明らかにした。このことは、僅かな数のα−ヘリックスエレメントを示唆する二次構造成分の計算を確認した。得られた結果はまた、ベータエレメントがその組成部の半分より多くを構成するという、TRAILタンパク質の結晶構造からのデータと一致した。例１および例42のハイブリッドタンパク質の場合、円二色性スペクトルは、アルファ／ベータの混合二次構造型を有するタンパク質についての特徴である。波長２０８および２２０ｎｍにおける２つの最小値により特徴づけられた。このことは、分析されたキメラタンパク質における二次構造の混合型の性質（例４２について、スペクトルの質が低いことに起因して、それはより明確でない）から、これらの存在を確認し得るように、恐らくは、アルファ−ヘリックス型構造を形成するドメイン（例えばBaxからのBH3）のTRAILへの結合に起因する。
例２、例51、例14および例24の調製物について、ならびにTRAILタンパク質について、ベータ型構造の顕著な内容が見出された。このことは、恐らくは、結合した短いペプチドが最初にベータ構造を有するか、または構造が定まらず（unstructuralized）したがってそれらの組成に顕著な影響を及ぼさないという事実に起因する。例２のタンパク質の場合、アルファ構造の僅かな増大がまた観察された。例１のタンパク質と同様に、これは、狭い波長の範囲に起因して類似の形態をとるBH3ドメインの存在に起因する可能性がある（遠ＵＶにおける高いレベルのノイズが読み取りを除外する）。分析されたスペクトルの領域におけるはっきりと輪郭づけられた１８０〜２００ｎｍの範囲の不在は、α−ヘリックス構造の過剰含有を引き起こし得る。

Claims (24)

  1. hTRAIL95-281、hTRAIL114-281（配列番号27）、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281（配列番号28）、hTRAIL120-281およびhTRAIL121-281（配列番号29）からなる群より選択される、ドメイン（ａ）；および
    − 配列番号30のBaxタンパク質のBH3ドメインのフラグメント；
    − 配列番号31のBidタンパク質のフラグメント；
    − 配列番号32のリボヌクレアーゼＡ；
    − 配列番号33のチトクロムＣ；
    − 配列番号36のBakタンパク質のBH3ドメイン；
    − 配列番号39のSMAC/Diabloタンパク質のフラグメント；
    − 配列番号41のオンコナーゼ；
    − 配列番号42のMdm2タンパク質のフラグメント；
    − 配列番号43のMdm2に結合するペプチド；
    − 配列番号44のルナシンのフラグメント；
    − 配列番号46のプロテアソームのペプチド阻害剤；
    − 配列番号153のaPPタンパク質とBaxタンパク質のBH3ドメインとから設計されたペプチド；
    − 配列番号158のPar-4タンパク質のSACドメイン；および
    − 配列番号163のBakタンパク質のBH3ドメインから誘導されたペプチド
    からなる群より選択される、ドメイン（ｂ）、ここで、ドメイン（ｂ）の配列は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端において結合する、
    を含む、融合タンパク質。
  2. ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との間に、ドメイン（ｃ）を含み、該ドメイン（ｃ）は、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列、ウロキナーゼuPAにより認識される配列、フューリンにより認識される配列、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、腫瘍細胞環境において存在するプロテアーゼにより認識されるプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列が、配列番号51、配列番号171または配列番号173であり、ウロキナーゼuPAにより認識される配列が、配列番号52であり、フューリンにより認識される配列が、配列番号53または配列番号172である、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. ドメイン（ｃ）が、互いに隣接して配置されたメタロプロテアーゼMMPにより認識される配列とウロキナーゼuPAにより認識される配列との組合せである、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
  5. ドメイン（ｃ）が、フューリンにより認識される配列である、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
  6. ドメイン（ｂ）がさらに：
    − （ｄ１）小胞体指向性の配列、
    − （ｄ２）６、７、８または９個のArg残基を含む、細胞膜を通して輸送するポリアルギニン配列、
    − （ｄ３）配列番号54または配列番号176から選択されるPseudomonas aeruginosaの転位ドメイン；
    − （ｄ４）膜輸送ドメイン、
    − （ｄ５）核局在化ドメイン、および
    − （ｄ６）ミトコンドリア標的化ドメイン、
    およびそれらの組み合わせ、
    からなる群より選択される輸送ドメイン（ｄ）と連結している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 小胞体指向性の配列（ｄ１）が、KEDL（配列番号55）またはKDEL（配列番号56）である、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 小胞体指向性の配列（ｄ１）が、融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
  9. ポリアルギニン配列（ｄ２）が、融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項６に記載の融合タンパク質。
  10. ポリアルギニン配列（ｄ２）が、ドメイン（ｂ）と（ｃ）との間に位置する、請求項６に記載の融合タンパク質。
  11. Pseudomonas aeruginosaの転位ドメイン（ｄ３）が、ドメイン（ａ）と（ｃ）との間に位置する、請求項６に記載の融合タンパク質。
  12. さらに、ドメイン（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の間にグリシン−セリン可橈性立体リンカーのドメイン（ｅ）を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. グリシン−セリンリンカーが、GGSG（配列番号57）、GGGS（配列番号58）、GGGGS（配列番号59）、GGSGG（配列番号60）、GGGSGG（配列番号61）、GGGSGGG（配列番号62）、GGGSGGGS（配列番号63）、GGGSGGGGS（配列番号64）、ASGG（配列番号65）、GGGSASGG（配列番号66）、GGSHG（配列番号182）、SGCGS（配列番号169）、GGGGSGGGG（配列番号180）、SGGCGGS(配列番号183）およびAACAA（配列番号184）からなる群より選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 配列番号1；配列番号2；配列番号3；配列番号4；配列番号5；配列番号6；配列番号10；配列番号14；配列番号16；配列番号17；配列番号18；配列番号19；配列番号20；配列番号21；配列番号22；配列番号23；配列番号93；配列番号99；配列番号100；配列番号101；配列番号102；配列番号103；配列番号104；配列番号108；配列番号109；配列番号112；配列番号114および配列番号117からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  15. 組み換えタンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. Ｃ末端に、プロテアーゼ切断部位の配列と、その後ろに配列hTRAIL95-121とをさらに含み、該プロテアーゼ切断部位の配列が、融合タンパク質からの配列hTRAIL95-121の切断を可能にする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 請求項１〜１６のいずれか一項において定義される融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  18. E. coliにおける遺伝子発現のために最適化された、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 配列番号67；配列番号68；配列番号69；配列番号70；配列番号71；配列番号72；配列番号76；配列番号80；配列番号82；配列番号83；配列番号84；配列番号85；配列番号86；配列番号87；配列番号88；配列番号89；配列番号122；配列番号128；配列番号129；配列番号130；配列番号131；配列番号132；配列番号133；配列番号137；配列番号138；配列番号141；配列番号143および配列番号146からなる群より選択される、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  20. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  21. 請求項２０において定義される発現ベクターを含む、宿主細胞。
  22. E. coli細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
  23. 活性成分として請求項１〜１５のいずれか一項において定義される融合タンパク質を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、医薬組成物。
  24. ヒトを含む哺乳動物における癌性疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１５のいずれか一項において定義される融合タンパク質の使用。
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