UA116002C2 - ПОХІДНІ 2-((4-АМІНО-3-(3-ФТОР-5-ГІДРОКСИФЕНІЛ)-1H-ПІРАЗОЛО[3,4-d]ПІРИМІДИН-1-ІЛ)МЕТИЛ)-3-(2-(ТРИФТОРМЕТИЛ)БЕНЗИЛ)ХІНАЗОЛІН-4(3H)-OНУ І ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ ЯК ІНГІБІТОРІВ ФОСФОІНОЗИТИД-3-КІНАЗИ - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується, разом з іншим, сполуки формули (І) EMBED ISISServer (I) і композицій, які її містять, і застосування зазначеної сполуки і композицій зазначеної сполуки для лікування, наприклад для лікування запальних захворювань, зокрема респіраторних запальних захворювань. Даний винахід також поширюється на способи одержання зазначених сполук.

Description

(в) ОоМе ета о СЕ,

М ло

М ра М

М х // З -И-М но

НЖм о | | й

ІЇ КОМПОЗИЦІИ, ЯКІ Ії МІСТЯТЬ, І Застосування зазначеної сполуки ії композицій зазначеної сполуки для лікування, наприклад для лікування запальних захворювань, зокрема респіраторних запальних захворювань. Даний винахід також поширюється на способи одержання зазначених сполук.

Галузь техніки, до якої належить винахід

Даний винахід стосується сполук, що інгібують фосфоїнозитид-3-кінази, (РІЗ кінази, РІЗК).

Зокрема, винахід стосується сполук, що інгібують РІЗК дельта підтип і, крім того, їх гамма підтип, і їхнього застосування в терапії, включення у фармацевтичні композиції, особливо для лікування запальних захворювань, включаючи запальні захворювання легень, такі як ХОЗЛ і астма. Даний винахід також поширюється на способи одержання зазначених сполук і на фармацевтичні композиції, які містять їх.

Рівень техніки

Ліпідкінази каталізують фосфорилування ліпідів з одержанням видів, що беруть участь у регуляції широкого кола фізіологічних процесів, включаючи клітинну міграцію й адгезію. РІЗ кінази (РІЗК) являють собою зв'язані з мембранами білки і належать до класу ферментів, що каталізують фосфорилування ліпідів, які самі зв'язані з клітинними мембранами. РІЗК дельта ізозим (РІЗК б) являє собою одну з чотирьох ізоформ типу І РІЗК кіназ, відповідальну за вироблення різних 3-фосфорилованих фосфоїнозитидів, що опосередковують клітинний сигнальний шлях, і беруть участь у запаленнях, передачі сигналів фактора росту, злоякісних перетвореннях і в імунітеті |Див. огляд Катей, Г. Е. апа СапіЦеу, С. С. 9. ВіоЇ. Спет., 1999, 274:8347-8350.|.

Участь РІЗК у контролі за запаленнями було підтверджено на декількох моделях з використанням пан-активних РІЗК інгібіторів, таких як І У-294002 і УМогітаппіп (МО, К. еї аї., у

Рпагтасої. Ехр. ТНег., 2007, 321:1-8.1. Нещодавно були проведені дослідження з використанням або селективних інгібіторів РІЗК або з нокаутними мишами, у яких відсутня специфічна ферментна ізоформа, як розкрито далі. Зазначені дослідження продемонстрували роль шляхів передачі сигналів, контрольованих РІЗК ферментами в запаленнях. Було виявлено, що РІЗК б селективний інгібітор ІС-87114 інгібує гіперзбудливість дихальних шляхів, виділення ІДЕ, експресію прозапальних цитокінів, нагромадження запалених клітин у легенях і судинну проникність в овальбумін-сприйнятливих, овальбумін-заражених мишей (ее, К. 5. еї аї., 9.

АПегоду Сіїп. Іттипої!., 2006, 118:403-409 і І ее, К. 5. еї аІ., РАЗЕВ .)., 2006, 20:455-65.|. Крім того,

Іб-87114 знижує нагромадження нейтрофілів у легких мишей і функції нейтрофілів, стимульовані ТМЕа ІЗадпи, С. еї аІ., Віоспет. Віорпуз5. Ке5. Соттип., 2003, 308:764-9).

Зо РІЗК 5 ізоформа активується інсуліном і іншими факторами росту, також як зв'язаними з О- білок-зв'язаними шляхами передачі сигналів білками і запальними цитокінами. Більше того: дослідження з використанням нокаутних мишей виявили той факт, що активація РІЗК гамма (РІЗК у) може бути важливою в патогенезі астми. Наприклад, реакції мишиних тучних клітин підсилюються іп міо і іп мімо за рахунок аутокринних сигналів, що вимагає функціональних сигналів РІЗК у. У мишей, у яких відсутні РІЗК у, не утворюються пухлини при заражені пасивною системною анафілаксією (М/утапп М.Р. еї а!., Віоспет. бос. Тгтапв., 2003, 31:275-80.|.

Так РІЗК у передають запальні сигнали через різні зв'язані з С-білюом рецептори (ОРСЕ5), особливо шляхом контролювання функцій тучних клітин. Також повідомляється, що нагромадження еозинофілів в овальбуміні сенсибілізованих і заражених мишей інгібується в таких РІЗК у-дефіцитних мишей, порівняно з мишами дикого типу (іт О.Н.еїа!., Ат. .). Рнувіо). пуд СеїЇ. Мої. РнНнузіо!.,2009,296(2)1210-1219|. | нарешті, лікування РІЗК у інгібіторами послаблює ІІЇ-13-посилену повітряну скорочувальну здатність зрізів легень (іапа Н.езаї., 4).

Рпаптасої. Ехр. ТНег.,2012,342(2):305-111.

Нещодавно з'явилося повідомлення, що РІЗК подвійний б/у інгібітор Т100-115 інгібує легеневу еозинофілію і знижує рівні інтерлейкіну-13, нагромадження слизу (Фі гіперсприйнятливість дихальних шляхів у моделі на мишах, при введенні за допомогою аерозолей. Ті ж автори також повідомляють, що зазначена сполука здатна інгібувати легеневу нейтрофілію, викликану або ГР5, або сигаретним димом |ОоикКав, 5. еї аї., У Рпапгтасої. Ехр.

ТНег., 2009, 328:758-765.|. Повідомляється, що інші дрібні молекули інгібіторів РІЗК 5 і у роблять чудову інгібуючу дію на викликане І РЗ5 продукування ТМРЕа і Т-клітинну активацію при порівнянні з РІЗК б селективними інгібіторами (М/Піатв О.еїаІ.,Спетвіо!., 2010,17(2):123-34.|.

Тому що це також активується оксидативним стресом, РІЗК б ізоформа, очевидно, може використовуватися, відповідно, як мішень для терапевтичного втручання при таких захворюваннях, що супроводжуються високим рівнем оксидативного стресу. Медіатори, які регулюють наступні ланки сигнальних каскадів РіІЗК, включають АК (серин/греонін протеїнкіназу) і мішень ссавців для рапамуцину, ферменту ттТоОК. У нещодавніх роботах було висловлене припущення, що активація РІЗК б, що приводить до фосфорилування АКІ, здатна викликати стан несприйнятливості до кортикостероїдів в інших кортикостероїд-сприйнятливих клітинах |То, У. еї аІ., Ат. У. Кезріг. Ст. Саге Меа., 2010, 182:897-904.|. Такі спостереження 60 привели до гіпотези, що зазначений сигнальний каскад може бути одним механізмом,

відповідальним за несприйнятливість до кортикостероїдів запалень, що спостерігаються в легенях пацієнтів, які страждають на ХоОЗл, також як у тих астматиків, які палять, тим самим піддаючи свої легені підвищеному оксидативному стресу. Дійсно, було висловлене припущення, що теофілін, сполука, яку використовують при лікуванні як ХОЗЛ, так і астми, повністю змінює на зворотне несприйнятливість до стероїдів за рахунок механізмів, які включають взаємодію із сигнальними шляхами, контрольованими РІЗ кіназою б |То, У. єї аіІ., Ат. ). Везріг. Стії. Саге

Меа., 2010, 182:897-904.|.

В даний час основними способами лікування як астми, так і ХОЗЛ, є інгаляційна терапія, у якій використовують комбінації кортикостероїдів, мускаринових антагоністів і г2-агоністів, як вважають, клінічно відповідної. Один шлях, адресований до незадоволених потреб медицини для лікування ХОЗЛ і астми, є ідентифікація нових лікарських засобів для інгаляцій, що були б достатньо ефективними для забезпечення значної переваги при використанні або у вигляді монотерапії, або в комбінації з одним або більше з лікарських засобів із зазначених трьох фармакологічних класів. Тому залишається необхідність в ідентифікації і розробці ізоформ селективних РІЗК інгібіторів, що мали б потенціал для забезпечення підвищеної терапевтичної ефективності відносно астми, ХОЗЛ і інших запальних захворювань.

МО 2012/052753 розкриває: 6-(2-((4-аміно-3-(З-гідроксифеніл)-1 Н-піразолоїЇ3,4-4|піримідин-1- ілуметил)-3-(2-хлорбензил)-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-5-іл)-М,М-біс(2-метоксіетил)гекс-5-інамід, названий в описі як відома раніше Сполука А.

УМО 2011/048111 розкриває деякі З-бензил-5-алкініл-хіназолін-4(ЗН)-они.

Сполука прикладу, розкритого в описі, є 2-((4-аміно-3-(З-гідроксифеніл)-1Н-піразолої3,4- д9Іпіримідин-1-іл)уметил)-3-(2-фторбензил)-5-(3-(2-(2-метоксіетоксі)зетокси)проп-1-іїніл)хіназолін- 4(ЗН)-оном, названим в описі як сполука Прикладу 50.

Жодна з відомих раніше сполук не має такий же вигідний профіль, як профіль розкритої в описі сполуки формули (1).

Суть винаходу

Відповідно до даного винаходу, запропонована сполука формули (1): о. ит оМе (в) СЕз - ак

Мт 1 / З -М но Мн»

Е або її фармацевтично прийнятна сіль, включаючи всі її стереоізомери, таутомери й ізотопні похідні.

В іншому аспекті даного винаходу запропонована сполука формули (І) у твердій кристалічній формі.

У наступному аспекті даного винаходу запропонована сполука формули (І) у вигляді форми 2 її кристалічного поліморфу (іноді названого в описі як "форма 2 кристалічного поліморфу").

У наступному аспекті даного винаходу запропонована сполука формули (І) у вигляді її форми З кристалічного поліморфу (іноді названого в описі як "форма З кристалічного поліморфу!").

Порівняння іп міго профілів відомих раніше сполук, Сполуки А і сполуки прикладу 50, зі сполукою за даним винаходом представлене нижче (див. таблицю 5 в експериментальному розділі). Сполука за даним винаходом являє собою дуже ефективний подвійний інгібітор ізоформи РІЗК б/у, фармакологічні характеристики якого надають йому чіткий і вигідний терапевтичний профіль порівняно з розкритими раніше сполуками. Такий аспект даного винаходу явно випливає з іп мімо профілю сполук формули (І) у моделях на тваринах, що є предикторами терапевтичної ефективності і клінічної користі при запаленнях легень (див. таблиці 8-12 в експериментальному розділі).

В одному варіанті зазначена сполука за даним винаходом має підвищену інгібуючу активність порівняно з відомими раніше сполуками при порівнянні в аналізі іп мімо, у якому вимірюють здатність тестованої речовини інгібувати роїу-ІС-індукований приплив нейтрофілів у легенях мишей. Таке підвищення може бути 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10 кратним (або більше) порівняно з відомими раніше в даній галузі сполуками.

Вважають, що активність у роїу-ІС аналізі іп мімо є показником ефективності сполуки даного винаходу відносно інгібування вірус-індукованого загострення в пацієнтів, що страждають на астму або ХОЗЛ. Вважають, що вірусні інфекції викликають загострення захворювань у результаті посилення запалення в легенях пацієнтів і за рахунок вироблення стійкого до стероїдів фенотипу. Роїу-ІСЄ стимулюють один із механізмів, за рахунок яких віруси стають прозапальними.

Подібні до лікарських засобів властивості розкритої в описі сполуки, включаючи властиві їй фізичну і хімічну стабільність, профіль розчинності, і особливо її чітку біологічну активність, роблять зазначену сполуку особлива придатною для використання як фармакологічного агента і, зокрема, для лікування опосередкованих запаленнями захворювань.

Короткий опис креслень

ФІГ. та: являє собою стовпчасту діаграму, що зображує ефекти лікування сполукою (І) або сполукою А відносно роїу-І:С-індукованого нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах мишей.

ФІГ. 15: демонструє порівняння інгібуючої ефективності сполуки (І) відносно сполуки А відносно роїу-І:С-індукованого нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах мишей.

ФІГ. 2а: являє собою стовпчасту діаграму, що зображує ефекти лікування сполукою (І) або сполукою А відносно індукованого сигаретним димом нагромадження макрофагів у мишиних

ВАЇ Р.

ФІГ. 2р: являє собою стовпчасту діаграму, що демонструє ефект лікування сполукою (І) або сполукою А відносно індукованого сигаретним димом нагромадження нейтрофілів у мишиних

ВАЇ Р.

ФІГ. 3: являє собою порошкову дифракційну картину рентгенівських променів (ХАЕРО), отриману для зразка форми 1 кристалічного поліморфу (див. приклад 2).

Зо ФІГ. 4: демонструє результати термогравіметричного аналізу (ТГА) (верхня крива) і диференційного скануючого калориметричного аналізу (ДСК) (нижня крива) зразка форми 1 кристалічного поліморфу (див. приклад 2)

ФІГ. 5: являє собою картину ХКРО, отриману для зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4).

ФІГ. 6: демонструє результати ТГА аналізу зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4).

ФІГ. 7 демонструє результати ДСК аналізу зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4).

ФІГ. 8: являє собою ДСП ізотермічний графік для зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4).

ФІГ. 9: являє собою ДСП графік зміни маси для зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4).

ФІГ. 10: являє собою картини ХЕРО, отримані до (верхня крива) і після (нижня крива) ДСП аналізу зразка форми 2 кристалічного поліморфу (див. приклад 4)

ФІГ. 11: являє собою картини ХКРО зразка форми 2 кристалічного поліморфу, отримані до (нижня крива) і після 1 тижня зберігання при 257С/96 95 КН (середня крива) і 40"С/75 55 ВН (верхня крива) (див. приклад 4).

ФІГ. 12: являє собою картину ХЕРО, отриману для зразка форми З кристалічного поліморфу (див. приклад 8).

ФІГ. 13: демонструє результати ТГА (верхня крива) і ДСК (нижня крива) аналізів зразка форми З кристалічного поліморфу (див. приклад 8).

ФІГ. 14: являє собою результати ГОСП аналізу зразка форми З кристалічного поліморфу (див. приклад 8).

ФІГ. 15: являє собою картину ХЕРО, отриману до (нижня крива) і після (верхня крива) ГСП аналізу зразка форми З кристалічного поліморфу (див. приклад 8).

ФІГ. 16: являє собою картини ХКРО зразка форми З кристалічного поліморфу, отримані до (нижня крива) і після 1 тижня зберігання при 25"С/ 96 95 КН (середня крива) і 40"С/75 95 ВН (верхня крива) (див. приклад 8).

ФІГ. 17: являє собою накладення картин ХКРО, отриманих від зразків форми 7 (верхня крива), форми 6, форми 5, форми 4, форми 3, форми 2 і форми 1 (нижня крива) (див. приклади 9-12).

Докладний опис переважного варіанта втілення даного винаходу

Термін інгібітор у тому змісті, як використаний в описі, стосується сполуки, що зменшує (наприклад, щонайменше на 10 95, 20 9», ЗО ЗУ, 40 У, 50 95 або більше) або виключає біологічну активність мішеневого білка, наприклад, РІЗК б ізозиму, у ферментному аналізі іп міго.

Термін дельта/гамма (б/у) інгібітор у тому змісті, як використаний в описі, стосується того факту, що зазначена сполука інгібує, до деякого ступеня, інгібуючу активність обох ферментних ізоформ, хоча необов'язково в однаковому ступені.

Зазначена сполука за даним винаходом є активною у клітинних скринуючих системах, і, тим самим, демонструє той факт, що вона має придатні властивості для проникнення в клітини, і здатна викликати внутрішньоклітинні фармакологічні ефекти (див. таблицю 6 і таблицю 7 в експериментальному розділі).

Зазначена сполука за даним винаходом має терапевтично релевантні і необхідні фармацевтичні характеристики для лікарських засобів, наприклад, фізико-хімічними характеристики, включаючи адекватну хімічну і фотостабільністьї придатний профіль розчинності і потенційну активність.

В одному варіанті запропонована фармацевтично прийнятна сіль зазначеної сполуки даного винаходу.

В одному варіанті запропонована фармацевтично прийнятна сіль приєднання кислоти зазначеної сполуки за даним винаходом.

Мається на увазі, що зазначені в описі фармацевтично прийнятні солі приєднання кислот включають терапевтично активні, нетоксичні, солі приєднання кислот, що здатні утворювати сполуки формули (І). Такі фармацевтично прийнятні солі приєднання кислот звичайно одержують, обробляючи форму вільної основи сполуки формули (І), наприклад, придатними кислотами. Приклади придатних кислот включають, наприклад, неорганічні кислоти, такі як хлористоводнева кислота, бромистоводнева кислота, і сірчана і фосфорна кислоти і т. п.; або органічні кислоти, такі як, наприклад, оцтова, пропанова, гідроксіоцтова, молочна, малонова,

Зо сукцинова, малеїнова, фумарова, яблучна, винна, лимонна, метансульфонова, пара- толуолсульфонова, цикламова, саліцилова, пара-аміносаліцилова, памоєва кислота і т. п.

Іншим прикладом придатної кислоти є бензолсульфонова кислота.

Приклади солей сполуки формули (І) включають усі фармацевтично прийнятні солі, такі як, без обмежень, солі приєднання мінеральних кислот, таких як солі НСІ і НВ"Гг, ії солі приєднання органічних кислот, такі як сіль метансульфонової кислоти. Подальші приклади включають солі сірчаної кислоти і солі фосфорної кислоти.

В іншому варіанті запропонована фармацевтично прийнятна сіль сполуки за даним винаходом, отримана у результаті здійснення взаємодії зазначеної сполуки формули (1) із придатною основою. Приклади придатних основ включають, наприклад, гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид магнію, гідроксид кальцію, І -аргінін, холін і І -лізин.

В одному варіанті запропонований 2-((4-аміно-3-(3-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразолої3,4- д9|піримідин-1-ілуметил)-5-(3-(2-(2-метоксіетоксі)етокси)проп-1-ін-1-іл)-3-(2- (трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-он як вільна основа.

Даний винахід також поширюється на сольвати розкритих в описі сполук. Приклади сольватів включають гідрати.

Сполуки за даним винаходом включають такі, у яких зазначений атом є природним або є неприродним ізотопом. В одному варіанті ізотоп є стабільним ізотопом. Так, сполуки за даним винаходом включають, наприклад, такі, які містять один або більше з атомів дейтерію замість атомів водню і т. п.

Відкриття також поширюється на всі поліморфні форми розкритих в описі сполук.

Сполуки формули (І) можна зручно одержувати способом, що включає здійснення взаємодії сполуки формули (ІІ):

ІГ.6б, о СЕз

М

Се о (в

М

М

М М

З

-М

Е або її захищеного похідного, де Її являє собою відхідну групу, таку як галоген, зокрема бром, зі сполукою формули (ПП): о ок! ! Италии

ЇЇ (ІЙ) у присутності придатного каталізатора й органічної основи й у полярному апротонному розчиннику в інертній атмосфері. Придатні каталізатори включають паладієві каталізатори, такі як дихлорид біс(трифенілфосфін)паладію(І), у присутності йодиду міді. Придатним полярним апротонним розчинником для такого перетворення є ДМФ, і придатною інертною атмосферою є азот.

Для способу синтезу, у якому зазначена сполука формули (ІЇ) є захищеним похідним, зазначену сполуку формули (І) піддають відповідній стадії видалення захисних груп, як добре відомо фахівцям у даній галузі. Наприклад, якщо фенол, що є присутнім у сполуці формули (1), захищений силільною групою, наприклад, трет-бутилдиметилсилільною групою, видалення захисних груп можна здійснити, обробляючи таким реагентом, як тетрабутиламонійфторид, у присутності полярного апротонного розчинника, такого як ДМФ. Реакцію можна проводити при зниженій температурі, такій як 0"С.

Сполуки формули (ІЇ) можна одержати, здійснюючи взаємодію сполуки формули (ІМ):

Гб; о СЕз

М

СОГО з --

М

І 6, або її захищеного похідного, де Її являє собою відхідну групу, як визначено в описі для сполуки формули (І), і Ї б2 також являє собою відхідну групу, таку як галоген, наприклад атом галогену, і особливо хлор, зі сполукою формули (М):

Н

М л з

Му

М (М) мно но

Е або її захищеним похідним, у присутності основи й у полярному апротонном розчиннику.

Придатні основи для такого перетворення включають карбонат калію, і придатним полярним апротонним розчинником є ДМФ.

Способи синтезу включають такі для яких вигідно захистити фенольний гідроксил зазначеної сполуки формули (Мі) під час стадії сполучення, і придатні захищені похідні включають трет-бутилдиметилсилільний ефір і трет-бутиловий ефір.

Альтернативно сполуки формули (Ії) можна одержати, здійснюючи взаємодії сполуки формули (МІ): біо СЕз в

А. (МІ)

М

М

М

«о

М

НМ або її захищеного похідного, де І С, має ті ж значення, що зазначено для сполуки формули (І), і Її Сз являє собою відхідну групу, таку як галогенід, зокрема йод, зі сполукою формули (МІ): в(онН). (МІЇ) або її захищеним похідним, у присутності придатного каталізатора благородного металу, неорганічної основи й у полярному протонному розчиннику, в інертній атмосфері; з наступним, у випадку потреби, видаленням захисних груп.

Придатним каталізатором є тетракис(трифенілфосфін)паладій(О).

Придатною неорганічною основою є карбонат натрію і придатним полярним протонним розчинником є етанол.

Зазначену реакцію можна проводити при підвищеній температурі, наприклад, при 8570 протягом тривалого проміжку часу, такого як, наприклад, протягом З днів до охолодження до кімнатної температури.

Захисні групи можуть вдало маскувати хімічно сприйнятливі групи під час однієї або більше з послідовних реакцій, як розкрито вище, для забезпечення ефективності одного або більше зі способів. Так, якщо бажано або необхідно, проміжні сполуки можна захистити, використовуючи звичайні захисні групи. Захисні групи і засоби для їхнього введення розкриті в "Ргоїесіїме сгоиреь іп Огдапіс Зупіпевів", Тпеодога МУ. Сгеепе апа Реїег б.М. М/цї5, опубліковане допп Уміеу 5 5оп5

Іпс; 47 Вем Еа., 2006, ІБВМ-10: 0471697540.

Нові проміжні сполуки заявлені у вигляді аспекту даного винаходу.

Бажано, щоб сполука (І) даного винаходу не виявляла атропізомеризму.

Сполуку (І), отриману за способом, розкритим у прикладі 2 розглянутого опису, одержують як форму 1 кристалічного поліморфу. Форма 1 кристалічного поліморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 3.

Зо Було виявлено, що термічна поведінка зразка форми 1 кристалічного поліморфу є складною. Як обговорюється в прикладі 2 і проілюстровано в результатах ДСК аналізу, представлених на ФІГ. 4 (нижня крива), зразок форми 1 кристалічного поліморфу піддається ряду змін при нагріванні, і в кінцевому рахунку перетворюється в кристалічний поліморф, що відрізняється, -- названий в описі як форма 2 кристалічного поліморфу.

Було виявлено, що форма 2 кристалічного поліморфу є безводною і плавиться з розкладанням при температурі близько 1907С (максимум піка). Експерименти по суспендуванню, здійснені для форми 1 кристалічного поліморфу, привели до утворення форми 2 кристалічного поліморфу в більшості розчинників, хоча безводний кристалічний поліморф -- названий в описі як форма З кристалічного поліморфу, -- був отриманий при суспендуванні форми 1 кристалічного поліморфу в дихлорметані. Було виявлено, що форма З кристалічного поліморфу є безводною і плавиться з розкладанням при температурі близько 186"С (максимум піка; див. приклад 8). Ряд псевдополіморфів сполуки (І) (форми 4, 5, 6 і 7 псевдополіморфів) також були отримані в результаті суспендування форми 1 кристалічного поліморфу або сполуки () в аморфній формі з ТГФ, 1,4-діоксаном, сумішшю 1095 вода/ацетонітрил або 1095 вода/ацетон (див. приклади 9-12).

З семи різних поліморфних і псевдополіморфних форм сполуки (І) форма 2 і форма З кристалічних поліморфів мають найбільш обіцяючі характеристики стану твердої речовини, причому форма 2 кристалічного поліморфу найбільш виграшна, тому що має найвищу температуру плавлення.

Конкуруючі експерименти із суспензіями здійснюють, використовуючи суміш 50/50 форми 2 і форми З кристалічних поліморфів у різних розчинниках при різних температурах (див. приклад 13). Всі експерименти виділили форму 2 кристалічного поліморфу, підтверджуючи той факт, що вона є найбільш термодинамічно стабільною формою. Зважаючи, що бажано мінімізувати ризик взаємоперетворення поліморфної форми під час зберігання зазначеної сполуки і виготовлення фармацевтичних продуктів, що містять зазначену сполуку, або під час тривалого зберігання таких продуктів після виготовлення, форма 2 кристалічного поліморфу має переваги порівняно з формою З кристалічного поліморфу й іншими поліморфними формами сполуки (1).

Бажано одержувати форму 2 кристалічного поліморфу в результаті кристалізації сполуки (І) з розчину в 1-пропанолі. Приклади способів з використанням 1-пропанолу розкриті в прикладі 3, із застосуванням затравки і без неї.

Форму 2 кристалічного поліморфу можна також одержати, суспендуючи форму 1 кристалічного поліморфу в метанолі, етанолі, 2-пропанолі, 1-пропанолі, ацетоні, етилацетаті, ацетонітрилі, толуолі, ізопропілацетаті, ТВМЕ, 2-бутаноні, ДМСО, діетиловому ефірі, МІВК, гептані, нітрометані, суміші 10 95 вода/етанол, суміші 10 95 вода/ацетонітрил або суміші 10 95 вода/2-пропанол.

Альтернативно, форму 2 кристалічного поліморфу можна одержати, суспендуючи сполуку (1) в аморфній формі в метанолі, етанолі, 2-пропанолі, 1-пропанолі, ацетоні, етилацетаті, ацетонітрилі, толуолі, ізопропілацетаті, ТВМЕ, 2-бутаноні, ДМСО, діетиловому ефірі, МІВК, нітрометані, суміші 10 95 вода/етанол або суміші 10 95 вода/2-пропанол.

Експерименти авторів показали, що суспендування сполуки (І) в аморфній формі в

Зо дихлорметані приводить до утворення форми З кристалічного поліморфу. Тому використання дихлорметану в умовах кристалізації для одержання форми 2 кристалічного поліморфу варто уникати.

Експерименти авторів показали, що суспендування сполуки (І) в аморфній формі або у формі 1 кристалічного поліморфу в ТГФ приводить до утворення форми 4 псевдополіморфу.

Тому використання ТГФ в умовах кристалізації для одержання форми 2 кристалічного поліморфу варто уникати.

Експерименти авторів показали, що суспендування сполуки (І) в аморфній формі або у формі 1 кристалічного поліморфу в 1,4-діоксані, приводить до утворення форми 5 псевдополіморфу. Тому використання 1,4-діоксану в умовах кристалізації для одержання форми 2 кристалічного поліморфу зі сполуки (І) варто уникати.

Експерименти авторів показали, що суспендування сполуки (І) в аморфній формі в суміші 10 95 вода/ацетонітрил приводить до одержання форми 6 псевдополіморфу. Тому використання суміші 10 95 вода/ацетонітрил в умовах кристалізації для одержання форми 2 кристалічного поліморфу зі сполуки (І) в аморфній формі варто уникати.

Експерименти авторів показали, що суспендування сполуки (І) в аморфній формі в суміші 10 95 вода/ацетонітрил приводить до одержання форми 7 псевдополіморфу. Тому використання суміші 10 95 вода/ацетонітрил в умовах кристалізації для одержання форми 2 кристалічного поліморфу зі сполуки (І) в аморфній формі варто уникати.

Форма 2 кристалічного поліморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 5. Основні піки на цій картині знаходяться в положеннях 8,2, 9,0, 92, 9,7, 12,2, 14,1, 14,3, 15,0, 16,4, 18,0, 18,5, 19,0, 19,6, 21,8, 22,3, 22,5, 24,3, 24,5, 24,8, 25,1 і 25,8 (30,2 градуси, значення 2-тета). Звичайно щонайменше три (наприклад три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять або всі двадцять один) з них спостерігаються в отриманій картині ХКРО. Піки на 9,7, 12,2, 14,1 і 14,3 особливо характеристичні для форми 2 кристалічного поліморфу і тому звичайно щонайменше один (наприклад один, два, три або всі чотири) із зазначених піків спостерігаються в картині ХКРО.

Форма З кристалічного поліморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 12.

Форма 4 псевдополіморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 17.

Форма 5 псевдополіморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 17.

Форма 6 псевдополіморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 17.

Форма 7 псевдополіморфу характеризується картиною ХКРО практично відповідно до картини, представленої на ФІГ. 17.

В одному аспекті зазначену сполуку можна використовувати для лікування, наприклад,

ХОЗЛ і/або астми.

РІЗК сполуки, розроблені до даного часу, звичайно призначені для перорального введення.

Звичайно така стратегія включає оптимізацію сполук фармакокінетичного профілю для досягнення адекватної тривалості дії. У такий спосіб встановлюють досить високі концентрації лікарських засобів і вони знаходяться в інтервалі доз, забезпечення безперервної клінічної вигоди. Неминучі і часто небажані наслідки такого підходу зводяться до того, що тканини організму, які не є мішенями, особливо печінка і кишечник, очевидно, піддаються фармакологічно активним концентраціям лікарських засобів.

Альтернативна стратегія полягає в створенні таких режимів лікування, при яких лікарський засіб потрапляє безпосередньо в запалений орган (наприклад, при місцевій терапії). Хоча такий підхід не придатний для лікування всіх хронічних запальних станів, він інтенсивно використовувався при лікуванні легеневих захворювань (астми, ХОЗЛ, кістозного фіброзу), шкірних уражень (атопічного дерматиту і псоріазу), назальних захворювань (алергійного риніту), очних хвороб (алергійного кон'юнктивіту) і шлунково-кишкових порушень (виразкового коліту).

При місцевій терапії бажаної ефективності можна іноді досягти, забезпечуючи тривалу дію лікарських засобів і збереження їх у переважно мішеневому органі, тим самим мінімізуючи ризики системної токсичності. Альтернативно можна використовувати композиції, які сСТВОрюють "резервуар" активного лікарського засобу, що потім стає доступним для створення уповільнених необхідних ефектів. Прикладом першого підходу служить використання антихолінергічного лікарського засобу тіотропійброміду (Орігіма НапаїНа|егкт), який вводять місцево в легені, як

Зо лікування при ХОЗЛ. Зазначена сполука має винятково високу спорідненість до її мішеневих рецепторів, що приводить до дуже малої швидкості виведення (швидкості дисоціації) і, отже, до уповільненої тривалої дії.

Запропоновано відповідно до одного аспекту даного винаходу використання зазначеної сполуки формули (І) або фармацевтичної композиції, що містить її, як інгібітора РІЗ кінази, наприклад, при місцевому введенні в легені.

Так, в одному варіанті зазначена сполука за даним винаходом передбачається для використання шляхом місцевого введення в легені для досягнення максимальної терапевтичної вигоди для пацієнтів при мінімізації потенціалу небажаних системних ефектів. Тому вигідно, щоб зазначена сполука формули (І) швидко метаболізувалася після потрапляння в кровоносну систему, і щоб продукт (продукти) перетворення був (були) менш активний (активні), ніж вихідні молекули.

Очевидно, основним продуктом пресистемного метаболізму сполуки формули (І) є відповідний спирт, сполука (Іа), що утворюється в результаті О-деметилування, метаболічного процесу, що є загальною рисою для структур подібного хемотипу. Такий можливий метаболічний продукт значно менш активний, ніж зазначена сполука формули (І) у вигляді інгібітору РІЗК по обох а і ВД субтипах (див. таблицю 6 в експериментальному розділі).

о. ит он о СЕ» ї- так м М і / У -М но МН»

Е

Так, в одному аспекті запропонована сполука формули (Іа) або її фармацевтично прийнятна сіль, включаючи всі її стереоізомери, таутомери й ізотопні похідні.

В одному аспекті даного винаходу зазначена сполука за даним винаходом особливо підходить для місцевої доставки, такої як місцева доставка в легені, зокрема, для лікування

ХОЗЛ.

Так в одному аспекті запропоноване використання сполуки за даним винаходом для лікування ХОЗЛ і/або астми, зокрема ХОЗЛ або важкої астми, за допомогою інгаляцій, тобто шляхом місцевого введення в легені. Вигідно, що введення в легені забезпечує сприятливі ефекти зазначеної сполуки, що реалізуються при мінімізації побічних ефектів для пацієнтів.

В одному варіанті зазначені сполуки придатні для сенсибілізованих пацієнтів до лікування кортикостероїдами.

Крім того, у даному винаході запропонована фармацевтична композиція, що включає сполуку відповідно до даного винаходу, необов'язково в комбінації з одним або більше з фармацевтично прийнятних розріджувачів або носіїв.

Розріджувачі і носії можуть включати такі, які придатні для парентерального, перорального, місцевого, мукозального і ректального способів введення, і можуть бути різними залежно від способу введення.

В одному варіанті композиції можна одержати, наприклад, для парентерального, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, інтраартикулярного або періартикулярного введення, зокрема, у формі рідких розчинів або суспензій; для перорального введення, зокрема, у формі таблеток або капсул; для місцевого, наприклад, легеневого або інтраназального введення, зокрема, у формі порошків, крапель для носа або аерозолей і трандермального введення; для мукозального введення, наприклад, для букального, сублінгвального або вагінального слизу, і для ректального введення, наприклад, у формі супозиторіїв. В іншому варіанті композиції можна одержати для перорального введення у формі рідких розчинів або суспензій; для місцевого введення у формі рідких розчинів, рідких суспензій, крапель для носа, що включають розчини або суспензії, або аерозолів у контейнерах або у контейнерах під тиском.

Зо Композиції зручно вводити в одиничній дозованій формі, і їх можна одержати будь-яким зі способів добре відомих фахівцям в галузі фармацевтики, наприклад, як розкрито в Кептіпдіоп'є

Рпаптасешіса! Зсіепсе5, 171п ейа., Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавіоп, РА., (1985). Композиції також зручно вводити в множинній одиничній дозованій формі.

Композиції для парентерального введення можуть містити як ексципієнти стерильну воду або сольовий розчин, алкіленгліколі, такі як пропіленгліколь, поліалкіленгліколі, такі як поліетиленгліколь, олії рослинного походження, гідровані нафталіни і т. п.

Композиції для назального введення можуть бути твердими речовинами і можуть містити ексципієнти, наприклад, лактозу або декстран, або можуть бути водними або масляними розчинами для використання у формі крапель для носа або мірних спреїв. Композиції для назального введення можуть також бути у формі водних суспензій. Для букального введення типові ексципієнти включають цукри, стеарат кальцію, стеарат магнію, прежелатинізований крохмаль і т. п.

Композиції, що підходять для перорального введення, можуть включати один або більше з фізіологічно сумісних носіїв і/або ексципієнтів, і можуть бути у формі твердої речовини або у формі рідини. Таблетки і капсули можна одержати зі зв'язувальними агентами, наприклад, сиропом, смолою акації, желатином, сорбітом, трагакантом або полівінілпіролідоном; з наповнювачами, такими як лактоза, сахароза, кукурудзяний крохмаль, фосфат кальцію сорбіт або гліцин; зі змащувальними агентами, такими як стеарат магнію, тальк, поліетиленгліколь або двоокис кремнію; і з поверхнево-активними речовинами, такими як натрійлаурилсульфат. Рідкі композиції можуть містити звичайні добавки, такі як суспендуючі агенти, наприклад сироп сорбіту, метилцелюлоза, цукровий сироп, желатин, карбоксиметилцелюлоза або харчові жири; емульгуючі агенти, такі як лецитин або смола акації; рослинні олії, такі як мигдальна олія, кокосова олія, риб'ячий жир або арахісова олія; консерванти, такі як бутильований гідроксіанізол (ВНА) і бутильований гідрокситолуол (ВНТ). Рідкі композиції можуть бути інкапсульовані, наприклад, у желатині, для створення одиничної дозованої форми.

Дозовані форми твердої речовини для перорального введення включають таблетки, складені з двох частин капсули у твердій оболонці і м'які еластичні желатинові (ЗЕС) капсули.

Такі тверді, що складаються з двох частин капсули можуть бути приготовлені, наприклад, з желатину або гідроксипропілметилцелюлози (НРМО).

Сухі капсули у твердій оболонці звичайно включають близько 40 95-60 95 концентрації желатину, близько 20 95-30 95 концентрації пластифікатора (такого як гліцерин, сорбіт або пропіленгліколь) і близько 30 95-40 95 концентрації води. Можуть також бути присутніми інші матеріали, такі як консерванти, барвники, замутняючі агенти і смакові добавки. Рідкі матеріали наповнювачів включають тверду речовину лікарського засобу, що розчинена, солюбілізована або диспергована (із суспендуючими агентами, такими як бджолиний віск, гідрована касторова олія або поліеєтиленгліколь 4000), або рідкий лікарський засіб у носіях, або в комбінації носіїв, таких як мінеральне масло, рослинні олії, тригліцериди, гліколі, поліоли і поверхнево-активні агенти.

Звичайно зазначену сполуку формули (І) вводять місцево в легені. Отже, в одному варіанті запропонована фармацевтична композиція, що включає сполуку за даним винаходом необов'язково в комбінації з одним або більше з розріджувачів або носіїв, прийнятних для місцевого застосування.

Місцеве введення в легені можна здійснити, використовуючи аерозольні композиції.

Зо Аерозольні композиції звичайно включають активний інгредієнт, суспендований або розчинений у придатному аерозольному пропеланті, такому як хлорфторвуглець (СЕС) або гідрофторвуглець (НЕС). Придатні СЕС опропеланти включають трихлормонофторметан (пропелант 11), дихлортетрафторметан (пропелант 114), і дихлордифторметан (пропелант 12).

Придатні НЕС пропеланти включають тетрафторетан (НЕС-134а) і гептафторпропан (НЕС-227).

Пропелант звичайно складає 40 95-99,5 95, наприклад, 40 95-90 95 за масою від всієї інгаляційної композиції. Композиції можуть включати ексципієнти, включаючи співрозчинники (наприклад, етанол) і поверхнево-активні речовини (наприклад, лецитин, сорбітантриолеат і т. п). Інші можливі ексципієнти включають поліетиленгліколь, полівінілпіролідон, гліцерин і т. п.

Аерозольні композиції упаковують у каністри, і придатні дози відмірюють за допомогою мірних клапанів (наприклад, таких, як постачають ВезракК, Маїіої5 або ЗМ або, альтернативно, Аріаг,

Созіег або Магі).

Місцеве введення в легені можна також здійснити, використовуючи композиції, які не знаходяться під тиском, такі як водні розчини або суспензії. Їх можна вводити, використовуючи небулайзер, наприклад, ручний і портативний, або для домашнього або госпітального використання (тобто непортативний). Композиції можуть включати ексципієнти, такі як вода, буфери, речовини, що регулюють тонічність, регулятори рН, поверхнево-активні речовини і співрозчинники. Рідкі суспензійні й аерозольні композиції (незалежно від того, знаходяться вони під тиском чи ні) звичайно містять сполуку за даним винаходом в тонкоздрібненій формі, наприклад з Охо 0,5-10 мкм, наприклад, близько 1-5 мкм. Розподіл частинок по розмірах можна представити, використовуючи значення О:о, ЮОво і Ого. Середнє значення Озо розподілу частинок по розмірах визначають як розмір частинок у мікронах, який ділить розподіл навпіл. Результати вимірювань за допомогою лазерної дифракції більш точно визначають об'ємний розподіл, і відповідно, значення ЮОво отримане з використанням такої процедури є більш значним і представляється у вигляді значення Юу5зо (середнє для розподілу по об'ємах). У тому змісті, як використано в описі, значення Юм стосуються розподілів частинок по розмірах, вимірювані за допомогою лазерної дифракції. Аналогічно, значення Ото і Юосо, використовувані в контексті лазерної дифракції, означають значення Юм'о і ЮОмео і стосуються розміру частинок, коли 10 95 розподілу розташовано нижче значень О':о, і 90 956 розподілу розташовано нижче значення ОЮбо, відповідно.

Місцеве введення в легені можна також здійснити, використовуючи сухі порошкові композиції. Сухий порошок містить сполуку за даним винаходом в тонкоздрібненій формі, звичайно з масовим середнім діаметром (ММАБ) 1-10 мкм або О5о 0,5-10 мкм, наприклад, близько 1-5 мкм. Порошки сполуки за даним винаходом в тонкоздрібненій формі можна одержати, використовуючи процес мікронізації або аналогічні процеси зменшення розмірів частинок. Мікронізацію можна здійснити, використовуючи струминні млини, такі як ті, що робить

НозоКаула Аїріпе. Досягнутий розподіл частинок по розмірах можна визначити, використовуючи лазерну дифракцію (наприклад, за допомогою приладу МаїЇмегп Мабхіегвігег 20005). Композиції звичайно містять розріджувач, прийнятний для місцевого введення, такий як лактоза, глюкоза або маніт (переважно лактозу), звичайно з відносно кружним розміром частинок, наприклад, з масовим середнім діаметром (ММАБ) 50 мкм або більше, наприклад, 100 мкм або більше, або з

ЮОво 40-150 мкм. У тому змісті, як використаний в описі, термін "лактоза" стосується утримуючого лактозу компоненту, включаючи моногідрат с-лактози, моногідрат ДВ-лактози, безводну а- лактозу, безводну В-лактозу й аморфну лактозу. Компонент лактози можна обробити шляхом мікронізації, просівання, розмелювання, компресії, агломерації або сушіння розпиленням.

Комерційно доступні форми лактози в різних формах також включені, наприклад, І асіопаєе? (лактоза інгаляційного ступеня чистоти; ОРЕ РІагта), Іппаі асе70 (просіяна лактоза для сухих порошкових інгаляторів; Меддіеє), Рпаппайозе? (ОРЕ РІагта) і Кезрйозе? (просіяна лактоза інгаляційного ступеня чистоти; ОРЕ РІагта). В одному варіанті, компонент лактози вибирають із групи, що складається з моногідрату а-лактози, безводної с-лактози й аморфної лактози.

Переважно, щоб лактозою був моногідрат а-лактози.

Сухі порошкові композиції можуть також містити інші ексципієнти, такі як стеарат натрію, стеарат кальцію або стеарат магнію.

Сухі порошкові композиції звичайно вводять, використовуючи сухі порошкові інгалятори (ОРІ). Приклади систем доставки сухих порошків включають 5РІМНАГЕКФ, ОІЗКНАГЕКФ,

ТОКВОНАГЕКФ, 0БІЗКОБОЯ, 5КУЕНАГЕКФ, АССОНАГЕКФ Її СГІСКНАГЕКФ. Інші приклади систем доставки сухих порошків включають ЕСІІРБЕ, МЕХТ, КОТАНАГЕК, НАМОІНАГЕК,

АЕВОПГІЗЕВ, СУСІ ОНАГЕВ, ВАЕЕ2НАГ ЕВ/МЕОНАГ ЕВ, МОМОБО5Е, ПН ОМ/САРБ5, ТУМІМСАРБ,

Х-САРБ5, ТОВВОБРІМ, ЕГРЕМНАГЕВН, МІАТНАГЕВН, ТУ/ЛІЗТНАГЕВН, МОМОЇІЛЕВ, РЕЕЗБЗАЇВ,

Зо ЕССІРТА, ОКІБЇ сухий порошковий інгалятор, МІСКОСОБЕ, РИЇМІМАЇ, ЕАБУНАГ ЕК,

ОСТКАНАГЕК, ТАІРОМ, РОСМОЕТ, ОММІНАГЕК, СУКОНАГЕК, ТАРЕК, СОМІХ, ХСЕГОМАЇК і

РАОНАГЕВ.

В одному варіанті сполука за даним винаходом представлена у вигляді мікронізованої порошкової композиції, наприклад, такої що включає лактозу придатного ступеня чистоти, поміщену в пристрій, такий як РІЗКО. Зручно, щоб такі пристрої були багатодозовими пристроями, наприклад, композицію поміщають у блістери для використання в багатодозовому пристрої, такому як СІЗКИЗ.

В одному варіанті сполука за даним винаходом представлена у вигляді мікронізованої порошкової композиції, наприклад, такої, що включає лактозу придатного ступеня чистоти і стеарат магнію, поміщені в блістери для використання в багатодозовому пристрої, такому як різкивб. Зручно, щоб такий пристрій було багатодозовим пристроєм.

В іншому варіанті сполука за даним винаходом представлена у вигляді мікронізованої порошкової композиції, поміщеної в капсули з твердою оболонкою для використання в однодозовому пристрої, такому як АЕКОЇ ІЗЕК.

В іншому варіанті сполука за даним винаходом представлена у вигляді мікронізованої порошкової композиції, наприклад, такої, що включає лактозу придатного ступеня чистоти і стеарат магнію, поміщені в капсули з твердою оболонкою для використання в однодозовому пристрої, такому як АЕКОЇ ІЗЕК.

Приклади композицій сполуки (І), що придатні для використання в сухих порошкових інгаляторах, перераховані в прикладі 15.

Сполуки відповідно до даного винаходу повинні мати терапевтичну активність. У наступному аспекті в даному винаході запропонована сполука за даним винаходом для використання як лікарський засіб.

Сполуки відповідно до даного винаходу також можуть бути корисні при лікуванні респіраторних порушень, включаючи ХОЗЛ (включаючи хронічний бронхіт і емфізему), астму, педіатричну астму, фіброзний кістоз, саркоїдоз, ідіопатичний легеневий фіброз, алергійний риніт, риніт, синусит і викликані вірусами загострення будь-якого одного з перерахованих вище, респіраторні вірусні інфекції, особливо астму, хронічний бронхіт і ХОЗЛ.

Респіраторні віруси включають вірус грипу, респіраторний синцитіальний вірус, людський вірус парагрипу, БАК5 коронавірус і аденовіруси. Іншим прикладом респіраторного вірусу є риновірус.

Сполука за даним винаходом може також повторно сенсибілізувати стан пацієнтів до лікування кортикостероїдами, якщо попередній стан пацієнтів став до них нечутливим.

В одному варіанті даного винаходу використовують дозу сполуки за даним винаходом, що дорівнює дозі, що підходить для використання у вигляді монотерапії, але яку вводять у комбінації з кортикостероїдом.

В одному варіанті використовують дозу зазначеної сполуки формули (І), що була б субтерапевтичною при використанні як одного агента, у комбінації з кортикостероїдом, тим самим зберігаючи сприйнятливість пацієнта до останнього, у тих випадках, коли пацієнт раніше був до кортикостероїду несприйнятливий.

В одному варіанті дозу сполуки формули (І) використовують у комбінації з дозою кортикостероїду, що була б субтерапевтичною, якби її вводили у відсутності сполуки формули (ЇЇ, тим самим зберігаючи сприйнятливість пацієнта відносно кортикостероїду, у тих випадках, коли пацієнт раніше ставав до кортикостероїду несприйнятливим.

Крім того, сполука за даним винаходом може виявляти противірусну активність і, наприклад, як доведено, її можна використовувати при лікуванні вірусних загострень запальних станів, таких, як астма і/або ХОЗЛ.

Зазначена сполука за даним винаходом може також виявитися корисною для профілактики, лікування або ослаблення захворювання або ускладнень після захворювань, пов'язаних з вірусом грипу, риновірусом і/або респіраторним синцитіальним вірусом.

В одному варіанті запропонована сполука формули (І) для використання при лікуванні або для профілактики вірусної інфекції або запальних ускладнень, викликаних вірусною інфекцією.

Очікується також, що зазначена сполука формули (І), відповідно до даного винаходу може бути корисна при лікуванні деяких станів, які можна лікувати, використовуючи місцеву або локальну терапію, включаючи алергійний кон'юнктивіт, кон'юнктивіт, алергійний дерматит, контактний дерматит, псоріаз, виразковий коліт, запалення суглобів, вторинні відносно ревматоїдого артриту або остеоартриту.

Зо В одному варіанті зазначену сполуку формули (І) вважають корисною при лікуванні гепатиту

С і/або ВІЛ, при введенні відповідним способом. Придатні способи введення можуть включати пероральний, внутрішньовенні ін'єкції або вливання.

В одному варіанті зазначену сполуку формули (І) для лікування гепатиту С вводять у кров до її надходження в печінку.

Очікують також, що сполука за даним винаходом може бути корисною при лікуванні деяких інших станів, включаючи ревматоїдний артрит, панкреатит, кахексію, інгібування росту і метастазування пухлин, включаючи дрібноклітинну карциному легень, карциному грудей, карциному шлунка, колоректальну карциному і злоякісну меланому.

В одному варіанті сполуку за даним винаходом й фармацевтичні композиції, які містять Її, можна використовувати при лікуванні або для профілактики раку, зокрема раку легень, особливо шляхом місцевого введення в легені.

Так, у наступному аспекті в даному винаході запропонована сполука, як розкрито в описі, для використання при лікуванні одного або більше з вищевказаних станів.

У наступному аспекті в даному винаході запропоноване використання зазначеної сполуки, як розкрито в описі, для виготовлення лікарського засобу для лікування одного або більше з вищевказаних станів.

У наступному аспекті, у даному винаході запропонований спосіб лікування вищевказаних станів, що включає введення суб'єкту ефективної кількості сполуки за даним винаходом або її фармацевтичної композиції.

Розкриту в описі сполуку можна також використовувати при виготовленні лікарських засобів для лікування одного або більше з перерахованих вище захворювань.

Передбачається, що термін "лікування" включає як профілактику, так і терапевтичне лікування.

Сполуки за даним винаходом можна також вводити в комбінації з одним або більше з інших активних інгредієнтів, наприклад, активних інгредієнтів, що придатні для лікування вищезгаданих станів. Наприклад, можливі комбінації для лікування респіраторних порушень включають комбінації з кортикостероїдами (наприклад, будезонідом, дипропіонатом беклометазону, пропіонатом флутиказону, фуроатом мометазону, фуроатом флутиказону), бета-агоністами (наприклад, тербуталіном, салбутамолом, салметеролом, формотеролом, бо індакатеролом), ксантинами (наприклад, теофіліном), мускариновими антагоністами

(наприклад, іпратропієм) і/або інгібітором р38 МАР кінази. Іншими прикладами придатних кортикостероїдів є циклезоніл або флунізолід. Придатним бета-агоністом є бетаг2-агоніст.

Іншими прикладами бетаг2-агоністів є репротерол, вілантерол, олодатерол, репротерол і фенотерол. Подальші приклади мускаринових антагоністів включають тіотропій, умеклідиній, глікопіроній, аклідиній і даратропій, причому будь-які з них, наприклад, у вигляді бромідних солей. Іншими можливими комбінаціями для лікування респіраторних порушень є сполука за даним винаходом й інгібітор фосфодіестерази.

В одному варіанті сполуку за даним винаходом вводять у комбінації з противірусним агентом, наприклад, ацикловіром, озелтамівіром, занамавіром (Кеїеп7аг) або інтерфероном.

В одному варіанті комбінацію активних інгредієнтів комбінують спільно.

В одному варіанті сполуку за даним винаходом спільно комбінують з кортикостероїдом у вигляді лікарського засобу для інгаляції, наприклад, для використання при підтримуючій терапії

ХОЗЛ або раку легень, включаючи профілактику останнього.

В одному варіанті комбінацію активних інгредієнтів просто вводять спільно.

В одному варіанті запропонований комбінований продукт, що містить: (А) сполуку за даним винаходом; і (В) інший активний інгредієнт, наприклад, вибраний з кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів, інгібіторів фосфодіестерази й інгібіторів р38 МАР кінази (наприклад, вибраних із кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів і інгібіторів р38 МАР кінази), де кожний з компонентів (А) і (В) готують у суміші з фармацевтично прийнятним розріджувачем або носієм. Такі комбінації можуть необов'язково включати відповідні додаткові ексципієнти. Переважно, щоб бета-агоністом був бета?2-агоніст.

В одному варіанті запропонована сполука формули (І) за п. 1 для застосування у вигляді лікарського засобу, призначеного для введення в комбінації з одним або більше з інших активних інгредієнтів, наприклад, вибраних з кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів і інгібіторів р3З38 МАР кінази. Переважно, щоб бета-агоністом був бета2-агоніст.

В одному варіанті зазначену сполуку за даним винаходом вводять за допомогою інгаляцій, і

Зо кортикостероїд вводять перорально або за допомогою інгаляцій, або в комбінації або окремо.

В одному варіанті зазначену сполуку за даним винаходом вводять за допомогою інгаляцій і бета2-агоніст вводять перорально або за допомогою інгаляцій, або в комбінації або окремо.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ РОЗДІЛ

Використані в описі скорочення представлені нижче (Таблиця 1). Будь-які скорочення, що не зазначені в таблиці, мають свої звичайно використовувані значення.

Таблиця 1

Скорочення

Аа водний

Ас ацетил

АСО кислий цитрат декстрози

АТР аденозин-5'-трифосфат

ВАГ Е Рідина бронхоальвеолярного лаважа ій уширений

ВЗА альбумін бичачої сироватки

ХОЗЛ хронічне обструктивне захворювання легень

СХ СХС фрагмент хемокінінового ліганду 1

СХСІ8 СХС фрагмент хемокінінового ліганду 8 а дублет ром дихлорметан

ОМА диметилацетамід

ОМАР 4-диметиламінопіридин рМ5о (ДМСО) диметилсульфоксид

ЕЮС.НСЇ гідрохлорид 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодіїміду

ЕИПЗА Ферментний імуносорбентний аналіз (ЕБУ) іонізація електророзпиленням, в режимі позитивних іонів

КЕ етил

ЕОАс етилацетат

ЕЮН етанол

ЕАС5 активований флуоресценцією клітинний сортинг

ЕС5 фетальна теляча сироватка то флуоресцинізотіоціанат

ЕР флутиказонпропіонат

НАГО-мМ5 високоефективна рідинна хроматографія-мас-спектрометрія

НГ год.(години)

НАР пероксидаза хрону

ІЕМу гамма-інтерферон і-п інтраназально і-ї інтратрахеально

І -4 інтерлейкін 4

І. -5 інтерлейкін 5

І/-13 інтерлейкін 13

І/-17 інтерлейкін 1 7

ІР5 (ЛПС) ліпополісахарид

ІРА ізопропанол (пропан-2-ол

М молярний (МАН); протонований молекулярний іон

МОР-1 моноцитарний хемоатрактантний білок

МОА малондіальдегід

Ме метил меон метанол

МНІ (МГц) МегаГерц тіп хвилина (хвилини)

МІВК метилізобутилкетон

МОМА-2 анти-моноцитарне і макрофагове антитіло

МІ 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолійбромід т/: відношення маси до заряду

МНаОАс ацетат амонію пт нанометр

ММ М-метилпіролідон

ЯМР ядерний магнітний резонанс (спектроскопія)

ОМА овальбумін

РВвВМО мононуклеарна клітина (клітини) периферичної крові

РВ5 буферований фосфатом сольовий розчин

Рахава)з тріс(дибензиліденацетон)дипаладій(0)

Расіг(РРАз)» дихлорид біс(трифенілфосфін)паладіюці!)

РП феніл

РІР2 фосфатидилінозитол 4,5-біфосфат

РІРЗ фосфатидилінозитол 3,4,5-трифосфат

РМА форболміристатацетат ро пероральне введення

РРИз трифенілфосфін а квартет дип квінтет в час утримування вн відносна вологість

ВТ (КТ) кімнатна температура

ВР-НРІС Високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою синглет зО5 натрійдодецилсульфат

ЗЕМ (СПС) стандартна помилка середнього значення ! триплет

ТВМЕ метил трет-бутиловий ефір тгФ тетрагідрофуран

ТМв 3,37,5,5 -тетраметилбензидин

ТМЕа альфа-фактор некрозу пухлини

ТА-ЕВЕТ Резонансне перенесення енергії флуоресценції з розрізненням за часом

Загальні процедури

Усі вихідні матеріали і розчинники одержували або з комерційних джерел, або одержували відповідно до цитованих літературних джерел. Якщо не зазначене інше, усі реакційні розчини 5 перемішували. Органічні розчини рутинно сушили над безводним сульфатом магнію.

Колонкову хроматографію здійснювали, використовуючи попередньо набиті силікагелем (230-400 мешей, 40-63 мкм) картриджі, використовуючи зазначені кількості.

Аналітичні способи

Аналітична РХМС

Аналітичну РХМС здійснювали, використовуючи колонку Умаїег5 ХвеЇесі С5Н Сів 3,5 мкм (4,6х50 мм) зі швидкістю потоку 2,5-4,5 мл хв", здійснюючи градієнтне елюювання НгОо-месм, що містить 0,1 95 об./06. мурашиної кислоти протягом 4 хвилин. Інформація про градієнт: 0-3,00 хв, зменшення з 95 95 НгО-5595 МесмМ до 5 95 НгО-95 95 МесмМ; 3,00-3,01 хв, витримували при 5 96 НгО-95 95 МесмМм, швидкість потоку збільшували 4,5 мл хв"; 3,01 3,50 хв, витримували при 595 Н20О-9595 Месм; 3,50-3,60 хв, повертали до 9595 Нг2О-5595 Месм, швидкість потоку зменшували до 3,50 мл хв"; 3,60-3,90 хв, витримували при 95 95 НгО-5 95 МесмМм; 3,90-4,00 хв, витримували при 95 95 НгО-5 95 Месм, швидкість потоку зменшували до 2,5 мл хв". Фракції, що містять зразок, детектували по поглинанню УФ на 254 нм. Мас-спектри елюйованих піків вимірювали, використовуючи квадрупольний мас-спектрометр Адіепі 6120, що працює в змішаних позитивних і негативних режимах розпилення іонів.

ІН ЯМР Спектроскопія

ІН ЯМР спектри одержували на спектрометрі ВгиКег Амапсе ПП з частотою 400 МГЦ, використовуючи залишковий недейтерований розчинник як стандарт, і якщо не зазначено інше, сполуки розчиняли в ДМСО-в.

Порошкова дифракція рентгенівських променів - спосіб 1 (використовуючи дифрактометр

ВгписКег АХ5О Сб2 САБОБ)

Дифракційні картини одержували, використовуючи Си Ка випромінювання (40 кВ, 40 мА), автоматичну ХХУ2 підставку, лазерний відеомікроскоп для автопозиціонування зразка і Нієїаг двовимірний детектор площ. Рентгенівська оптика складалася з одиночного багатошарового дзеркала Собе!, з'єднаного з точковим коліматором 0,3 мм. Розбіжність пучка, тобто ефективний розмір рентгенівського пучка на зразок, складала приблизно 4 мм.

Використовували безперервний режим сканування 9-О з відстанню зразок-детектор 20 см, що забезпечувало ефективний 2 О інтервал 3,27-29,77. Звичайно зразок опромінювали пучком рентгенівських променів протягом 120 секунд. Для збору результатів використовували програмне забезпечення САБО для ХР/2004 4.1.43 і результати аналізували і представляли, використовуючи програми Обійтас Рін5 ЕМА м13.0.0.2 або м15.0.0.0. Зразки, що зберігаються при кімнатній температурі, підготовляли як плоскі зразкові пластини, використовуючи порошок, отриманий без здрібнювання. Приблизно 1-2 мг зразка злегка пресували на скляному слайді, щоб одержати плоску поверхню. Зразки, випробовувані не при умовах навколишнього середовища, встановлювали на силіконову пластину з теплопровідною сполукою. Потім зразок нагрівали до відповідної температури зі швидкістю 20"С/хв і потім витримували ізотермально протягом 1 хвилини перед початком збору даних.

Порошкова дифракція рентгенівських променів - спосіб 2 (використовуючи удосконалений дифрактометр ВгисКег АХЗ 08)

Дифракційні картини одержували, використовуючи Си Ка випромінювання (40 кВ, 40 мА), 9- 2О гоніометр, і розбіжність М4 і приймальні щілини, бе монохроматор і І упхеуеє детектор.

Програмне забезпечення для збору даних являло собою Оійтас Ріо ХКО Соттапаег м2.6.1 і результати аналізували і представляли, використовуючи програми Ойтас Ріи5 ЕМА м13.0.0.2 або м15.0.0.0. Зразки вимірювали в умовах навколишнього середовища як плоскі пластини зразків, використовуючи порошки, як вони отримані. Зразок обережно поміщали в порожнину, вирізану в полірованій, з нульовим фоном (510) силіконовій пластині. Під час аналізу зразок обертали в його власній площині. Подробиці одержання результатів: кутовий інтервал: від 2 до 427 209; розмір кроку: 0,057 20; час нагромадження: 05 сек/крок.

Порошкова дифракція рентгенівських променів - спосіб З (використовуючи дифрактометр

РАМаїуїса! (Рпйїр5) Х'РептРКО МРО)

Прилад оснащували рентгенівською трубкою Си ГЕРБ. Сполуку розподіляли на тримачеві зразків з нульовим фоном. Використані параметри приладу були наступні: генератор напруги: 45 кВ; генератор струму: 40 мА; геометрія: Вгадд-Вгепіапо; підставка: обертова підставка.

Вимірювання проводили в такий спосіб: режим сканування: безперервний; інтервал сканування: від З до 507 29; розмір кроку: 0,02г/крок; час збору: 30 сек/крок; час обертання спінера: 1 сек; тип випромінювання: Си Ка. Параметри падаючого пучка: програм. розбіжність щілини: 15 мм; щілина Солера: 0,04 рад; маска пучка: 15 мм; протирозсіювальна щілина: 12: ніж пучка: ж.

Зо Параметри дифрагмованого пучка наступні: довгий протирозсіювальний екран: ж; щілина

Солера: 0,04 рад; Мі фільтр: ж; детектор: Х'Сеїегаїог.

Диференційна скануюча калориметрія - спосіб 1 (використовуючи прилад МешШег О5С 823е)

Менше О5С 823Е оснащений 34-позиційним автоматичним пробовідбірником. Прилад калібрували по енергії і температурі, використовуючи сертифікований індій. Звичайно 0,5-3 мг кожного зразка, в алюмінієвому контейнері з голчастими отворами, нагрівали зі швидкістю 10"С/хв із 25"С до 300"С. Над зразком підтримували потік азоту зі швидкістю 50 мл/хв.

Програмне забезпечення для контролю приладу й аналізу даних було ЗТАКе м9.20.

Диференційна скануюча калориметрія - спосіб 2 (використовуючи прилад ТА 201000 МТДСК, оснащений охолоджувальним вузлом КС5)

Контейнер зразка в ТА інструменті закривали придатною кришкою, і криву О5С реєстрували на приладі ТА-Іпбзігитепіз 01000 МТОБУУМС, оснащеному КС5 охолоджувальним вузлом.

Використовували наступні параметри: початкова температура: 25"С; швидкість нагрівання: 10"С/хв; кінцева температура: 25076.

Термогравіметричний аналіз - спосіб 1 (використовуючи прилад МенйіегТсА/50ТА 851еє)

Результати ТГА одержували на приладі Мейег ТОА/5ОТА 851е, оснащеному 34-позиційним автоматичним пробовідбірником. Температуру приладу калібрували, використовуючи сертифікований індій. Звичайно 5-30 мг кожного зразка поміщали на попередньо зважений алюмінієвий тигель і нагрівали зі швидкістю 10"С/хв із кімнатної температури до 35070. Над зразком підтримували потік азоту зі швидкістю 50 мл/хв. Програмне забезпечення контролю приладу й аналізу даних було ЗТАКЕе м9.20.

Термогравіметричний аналіз (ТГА) - спосіб 2 (використовуючи термогравіметр ТА-

Іпвігтитепів 0500 ТОаА)

Результати ТГА одержували на термогравіметрі ТА-Іпзігитепіє 0500 ТОА. Сполуку переносили в алюмінієвий тигель для зразка перед тим, як аналізували, використовуючи наступні параметри: початкова температура: кімнатна температура; швидкість нагрівання: 20"С/хв; коефіцієнт розрізнення: 4; кінцеві умови: 3507С або «80 (мас/мас) обі.

Гравіметрична сорбція парів (ГСП)

Ізотерми сорбції одержували, використовуючи 5М5 БУ аналізатор істинної сорбції вологи, під контролем програмного забезпечення ЮМ5 Іпігіпвіс Сопіго!Ї зопймаге м1.0.1.2 (або м 1.0.1.3). бо Температуру зразка підтримували при 25"С, використовуючи інструментальний контроль.

Вологість контролювали, змішуючи потоки сухого і вологого азоту, з повною швидкістю потоку 200 мл/хв. Відносну вологість вимірювали, використовуючи калібрований зонд Коїгопіс (динамічний інтервал 1,0-100 95КН), розташований поблизу зразка. Зміни маси (релаксація маси) зразка у вигляді функції 9оКН постійно контролювали, використовуючи мікроваги (точність 0,005 мг). Звичайно 5-20 мг зразка поміщали в тарований кошик з нержавіючої сталі в умовах навколишнього середовища. Зразок завантажували і витягали при 40 95КН і 25"С (звичайно кімнатне оточення). Ізотерму сорбції вологи одержували, як зображено нижче (4 скани, що дають 2 повні цикли). Стандартну ізотерму одержували при 25"7С при 10 95КН з інтервалами 0- 90 90КН. Результати аналізу обробляли в Місгозоїй Ехсеї, використовуючи ЮМ5 Апаїузіз З!ийе м6.2 (або 6.1, або 6.0).

Таблиця 2

Параметри способу для 5М5 МУЗ експериментів

Адсорбція - скани 1 і З 40-90

Десорбція/Адсорбція - Скани 2 і 4 90-0, 0-40

Інтервали (268Н

Швидкість потоку (мл/хв

Температура СС)

Стабільність (С/хв

Час сорбції (години б 11111111

Зразок витягали після завершення одержання ізотерми і знову аналізували, використовуючи

ХАРО.

Динамічна сорбція парів (М)

Близько 20 мг сполуки переносили в динамічну сорбцію парів 5М5, і реєстрували зміни маси при відносній вологості атмосфери при 25"7С, використовуючи наступні параметри: сушіння: 60 хв у сухому азоті; рівновага: 60 хв; КН (95) точки вимірювання: цикл 1:5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5; цикл: 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20,10, 5,0.

Приклад 1 - Одержання сполуки (І) і сполуки (Іа)

Проміжна сполука А: 2-((4-аміно-3-йодо-1Н-піразоло|3,4-д|піримідин-1-іл)метил)-5-бром-3-(2- (трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-он. н ог о СЕЗ св й о : их ЕЙ Ме: ій ви ово Се о А Си о Мах ша І! МН» М Й - ю «А Я ' '|(ійі ЮК | і і і р - 4 Я Яя :- -ж т к Н Н С гі - и

Мн Різ, гам, виш -- КИ У о, толувлп С І с сі Нам проміжна А

До суміші, що перемішується, 2-бром-6-(2-хлорацетамідо)бензойної кислоти |(Кіпд-

Опаєпмоой еї аїІ., МО2011/0481111, (50,0 г, 171 ммоль), (2-(трифторметил)феніл)метанаміну (29,4 мл, 205 ммоль) і триетиламіну (34 мл, 430 ммоль) у толуолі (1,2 л) при -1"С по краплях додавали розчин трихлориду фосфору (37 мл, 430 ммоль) у толуолі (100 мл) протягом 1 години, причому протягом цього часу внутрішню температуру підтримували нижче 5"С. Реакційну суміш

Зо нагрівали при кипінні зі зворотним холодильником протягом 2,5 години, і потім отриману суспензію фільтрували, поки вона ще гаряча. Фільтрат зберігали, і зібрані тверді речовини суспендували у свіжому толуолі (100 мл), і нагрівали до 90"7С при інтенсивному перемішуванні.

Тверді речовини видаляли фільтруванням, і органічні екстракти, що містять сирий продукт, поєднували.

Другу партію зазначеного матеріалу обробляли, повторюючи реакцію в ідентичних умовах у тому ж масштабі. Об'єднані фільтрати з обох реакцій випарювали у вакуумі, і отриманий залишок ретельно розтирали з ІРА (2х400 мл). Отриманий в такий спосіб сирий матеріал сушили у вакуумі, одержуючи 5-бром-2-(хлорметил)-3-(2-(трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)- он у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (100 г, 90 95 ступінь чистоти за даними

ВЕРХ, 61 95); В! 2,70 хв; т/2 431/433 (МН): (ЕБУ).

До розчину хіназолінону, отриманого як розкрито вище (100 г, 90 до ступінь чистоти, 210 ммоль), і З-йодо-1Н-піразоло|3,4-4|піримідин-4-аміну (50,4 г, 193 ммоль) у ДМФ (600 мл) при КТ додавали карбонат калію (80,0 г, 580 ммоль), і після 18 годин реакційну суміш виливали у воду (1,2 л). Осад, що утворився, збирали фільтруванням, і промивали послідовно водою (500 мл),

ЕЮАс (600 мл) і нарешті Е2гО (400 мл). Отриманий фільтрувальну пігулку сушили у вакуумі, одержуючи зазначену в заголовку сполуку, проміжну сполуку А, у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (115 г, 89 95); В 2,28 хв, т/72 656/658 (МАН): (Е5-).

Проміжна сполука В: 2-((4-аміно-3-(3З-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразолої|3,4-4|піримідин-1- ілуметил)-5-бром-3-(2-(трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-он.

Вб о СЕЗ

КарОцРР зі Рада); Со о проміжна А -- ло Я ун проміжна В (ОН), у. м

С до. і в ял да у

Е н но у р тих

Е

Розчин проміжної сполуки А (54,4 г, 83,0 ммоль), (3-фтор-5-гідроксифеніл)боронової кислоти (15,5 г, 99,0 ммоль) і КзРОх (19,1 г, 83,0 ммоль) у 1-бутанолі (900 мл) барботували азотом при

КТ протягом 20 хв. Отриману суміш обробляли РР: (3,26 г, 12,4 ммоль) і Раз(абва)з (1,90 г, 2,07 ммоль) і барботували азотом протягом додаткових 10 хв, і потім нагрівали до 907 у потоці азоту. Після 40 годин отриману суміш охолоджували до 70"С і по краплях додавали воду (250 мл). Отриману суміш охолоджували до 50"С протягом З годин, і потім до КТ протягом 3 днів, причому протягом цього часу утворювався осад бежевого кольору. Тверду речовину збирали фільтруванням, промивали 1-бутанолом (2х100 мл) і водою (2х100 мл) і потім сушили у вакуумі при 40"С, одержуючи зазначену в заголовку сполуку, проміжну сполуку В, у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (35,2 г, 65 9); В'2,25 хв, т/: 640/642 (МН) (Е5").

Сполука (1): 2-((4-аміно-3-(3-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразоло!|3,4-4| піримідин-1-ілуметил)- 5-(3-(2-(2-метоксієетоксі)зетокси)проп-1-ін-1-іл)-3-(2-(трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-он. титул Ме / | о СЕЗ и на - щи проміжна В - ( Ж « ж ж ж (4 (4 (3 ( ( - --- ро Сполука (1 денний ре се ЕСМН/ РаСі(вРАзЬ М о

М

І ни М

УЛ: а ноу Доном

Гі

Суспензію проміжної сполуки В (35,2 г, 55,0 ммоль), 3-(2-(2-метоксіетоксі)етокси)проп-1-іну

ЇКіпд-Опаегмоос еї аї., ММО2011/0481111, (17,4 г, 110 ммоль), РасіІзх(РРНз)» (3,86 г, 5,50 ммоль) і

Зо йодиду міді(І) (1,05 г, 5,50 ммоль) у суміші Е2МН і ДМФ (4:11 об./о6., 820 мл) барботували азотом при КТ протягом 10 хв. Отриману суміш нагрівали до 65"С протягом 1,5 години, і потім охолоджували до КТ. Леткі випарювали у вакуумі, і отриманий залишок розділяли між ЕЮАсС (600 мл) і насиченим водним розчином МНаСАс (650 мл). Водний шар виділяли й екстрагували

ЕАс (300 мл), і об'єднані органічні шари випарювали у вакуумі, одержуючи в'язке масло темно-коричневого кольору. Додавали метанол (200 мл), і отриману суміш перемішували при

КТ протягом 16 годин. Осад жовтого кольору, що утворюється, збирали фільтруванням і промивали Меон (100 мл). Отриману тверду речовину очищували, використовуючи колонкову флеш-хроматографію в два окремі завантаження (5102, 330 г, МеОоН у ОСМ, 0-6 95, градієнтне елюювання). Очищені матеріали з'єднували разом у суміші ЮСМ/Меон (10:1 об./об.), одержуючи гомогенний розчин, що потім випарювали і сушили у вакуумі, одержуючи зазначену в заголовку сполуку, сполуку (І), у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (20,1 г, 51 96); В'2,15 хв, т/: 718 (МН) (Е5");

ІН ЯМР б: 3.19 (ЗН, 5), 3,35-3,38 (2Н, омепарріпд т), 3,44-3,49 (4Н, омепарріпд т), 3,60-3,63 (2Н, омепарріпа т), 4,37 (2Н, 5), 5,49 (2Н, 5), 5,76 (2Н, 5), 6,42 (ІН, а), 6,65 (ІН, т), 6,73 (1Н, т), 6,79 (1Н, т), 7,15(1Н, У), 7,28 (ІН, У, 7,52 (1Н, а), 7,65-7,69 (2Н, омепарріпд т), 7,82 (1Н, т), 8,12 (ІН, 5),10,15 1Н, 5)

Сполука (Іа): 2-((4-аміно-3-(З-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразоло!|3,4-4|піримідин-1-ілуметил)- 5-(3-(2-(2-гідроксіетоксі)етокси)проп-1-ін-1-іл)-3-(2-(трифторметил)бензил)хіназолін-4(ЗН)-он. о СЕЗ пуття ох ; то

І ; Сполука (Ів) проміжна В -Щ88ШЩФФЩй З « « 'лєЙИ- р М

СЯ ЕЬМН РСР з) Кк У

М но МН»

Е

Суспензію проміжної сполуки В (190 мг, 0,297 ммоль), 2-(2-(проп-2-ін-1-ілоксі)етоксі)етанолу

ЇКіпду-Опаегуоой еї аї., УМО2011/048111) (257 мг, 0,890 ммоль), Расіх(РРНз)2 (208 мг, 0,297 ммоль) і йодиду міді(І) (57 мг, 0,30 ммоль) у суміші ЕЄМН і ДМФ (4:1 об./о6., 7,5 мл) дегазували, використовуючи Ме, і потім нагрівали до 60"С протягом 16 годин. Отриману реакційну суміш охолоджували до КТ і випарювали у вакуумі на силікагелі, і очищували, використовуючи колонкову флеш-хроматографію (5102, 12 г, МеоН у ОСМ, 0-5 95, градієнтне елюювання), одержуючи зазначену в заголовку сполуку, сполуку (Іа), у вигляді твердої речовини блідого жовто-коричневого кольору (30 мг, 14 95); В! 1,88 хв, т/2 704 (МН): (Е5").

ІН ЯМР б: 3,36-3,50 (6Н, омепарріпд т), 3,61-3,63 (2Н, омепарріпд т), 4,37 (2Н, 5), 4,58 (1Н, т), 5,48 (2Н, 5), 5,76 (2Н, 5), 6,41 (1Н, 49), 6,64 (1Н, т), 6,72 (1Н, а), 6,78 (1Н, 5), 7,14 (ІН, У, 7,27 (ІН, У, 7,52 (1Н, а), 7,65-7,71 (2Н, омепарріпод т), 7,82 (1Н, У, 8,13 (1Н, 5), 10,19 (1Н, Бі 5).

На основі аналізів структурно схожих сполук (див. ММО2011/048111) був зроблений висновок, що малоймовірно, що зазначена сполука (І) буде демонструвати атропізомеризм. Додаткові складнощі і наслідки для створення лікарських засобів, що виникають через атропізомеризм, аналогічні тим, що виникають з інших джерел ізомеризму молекул, таких як наявність стереогенних центрів. Зазначена властивість стосується таких молекул, як хіральні, так і, і якщо

Зо вони не розділені, рацемічних сумішей; причому компоненти яких можуть відрізнятися різними фармакологічними і токсилогічними профілями. Зазначена особливість, очевидно, значно знижує вартість створення таких молекул, і тому відсутність атропізомеризму в сполуки (І) є дуже бажаною і вигідною властивістю.

Приклад 2 - Одержання сполуки (І) у формі 1 кристалічного поліморфу

Сполуку (І) у формі 1 кристалічного поліморфу одержували, виходячи з проміжної сполуки В, яку можна одержати, як представлено на наступній схемі:

НО. д/ОН

ВІРІ; уві шо "Вц, ТНЕ . рай

Ве пу Е З о Ви

Масиви пентентитні ж Ме М Н

ОМА б. Ме Ме ме ие

Е Е Е о Ви ; і

Ме х в Ме во і і проміжна

В-я, б. и | роміжна

М То о Ме В | | А

Ме Ме Н І

С. ща Маюо, рРОСІжарой ГО ВРАЗ, кос, ОМ5О г Ви р ВОоНнНню , рі о се доз М і, к проміжна а

В Є У

Х і

М

Ом фуви !

Одержання проміжної сполуки представлено нижче. 1-бром-3-(трет-бутокси)-5-фторбензол

Вг Вг дї мое - сх - 666 -ї- -»»

Е Е Е О!Ви

До охолодженого льодом ОМА (2,0 л) додавали трет-бутоксид натрію (284 г, 3,89 моль) порціями, потім по краплях додавали 1-бром-3,5-дифторбензол (298 мл, 2,59 моль). Після завершення додавання отриману суміш нагрівали до КТ і перемішували протягом 72 годин.

Додавали воду (200 мл) і відфільтровували смолистий осад, що утворився. Надосадову рідину концентрували у вакуумі, і отриманий залишок очищували, використовуючи вакуумну перегонку.

Отримане масло розчиняли в дієтиловому ефірі (1,0 л), промивали водою (6х250 мл), сушили (М9505) і концентрували у вакуумі, одержуючи зазначену в заголовку сполуку у вигляді безбарвного масла (220 г, 881 ммоль, 34,0 95): Т.пл. 84-862С (8 мбар)

І"Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») 6: 1,35 (ОН, 5), 6,64 (1Н, аю, 6,92-6,96 (2Н, омепарріпд т). (3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)боронова кислота; 2

НО Дон

Вг в' ув В(О!РГ)з ув - 88:88: - -ю

Е ОЇВи "ВШ, ТНЕ Е ОВи 2

До розчину 1-бром-3-(трет-бутокси)-5-фторбензолу (75,0 г, 304 ммоль) у ТГФф (1,0 л) додають н-бутиллітій (2,5 М у гексанах, 150 мл, 337 ммоль) по краплях при -78"С. Отриману суміш перемішували при зазначеній температурі протягом 45 хв і потім по краплях додавали триіїзопропілборат (105 мл, 455 ммоль). Отриману суміш перемішували при зазначеній температурі протягом 1,5 години, і потім нагрівали до -57С протягом 1,5 години. Отриману суміш розбавляли діетиловим ефіром (1,0 л) і 1 М водним розчином НС (450 мл), і шари розділялися.

Водний шар потім екстрагували діетиловим ефіром (2х250 мл). Об'єднані органічні екстракти сушили (Ма5О54), фільтрували і потім випарювали у вакуумі, одержуючи масло блідо-жовтого кольору. Отримане масло знову розчиняли в ізогексанах (300 мл) і концентрували знову, одержуючи липку тверду речовину не зовсім білого кольору. Тверду речовину ретельна розтирали з ізогексанами (150 мл) і фільтрували, одержуючи порошок білого кольору.

Отриманий матеріал розділяли між 2 М Маон (600 мл) і діеетиловим ефіром (600 мл). Водний шар збирали, і органіку екстрагували додатковою кількістю Маон (2х200 мл). Значна кількість матеріалу виявилася нерозчинною, і його відфільтровували, промиваючи діетиловим ефіром (чистота продукту підтверджена даними РХМС). Лужний водний шар охолоджували на бані з льодом, і підкисляли до рН 1 концентрованої НСІ (4130 мл). Водний шар екстрагували ОСМ (3х300 мл) і об'єднану органіку сушили (Маг5О»4), фільтрували і концентрували у вакуумі, одержуючи порошок бежевого кольору. Його ретельно розтирали з ізогексанами (100 мл), одержуючи ще чистий продукт. Обидві порції поєднували, одержуючи зазначену в заголовку сполуку 2 у вигляді порошку не зовсім білого кольору (17,2 г, 73,0 ммоль, 24,1 Ов): В" 1,87 хв. 2-(3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан; З

Ме Ме

Ме Ме Ме Ме о; (о; ) !

Ве «т д-в те ов е о о е

Ме Ме ув расіхаррі) дх

Е ОВи КОдс, ОМ5О Е о Ви

Суміш паладій(ІІ)дихлорид-1,1-бісідифенілфосфіно)фероцену (6,81 г, 9,31 ммоль), ацетату калію (54,8 г, 558 ммоль) і 4,4,4,4,5,5,5,5'-октаметил-2,2/-6і(1,3,2-діоксаборолану) (52,0 г, 205 ммоль) продували азотом і до суміші додавали розчин 1-бром-3-(трет-бутокси)-5-фторбензолу (46,0 г, 186 ммоль) у ДМСО (528 мл). Отриману суміш обробляли ультразвуком протягом З хвилин, дегазували протягом 5 хвилин і нагрівали при 80"С протягом 23 годин. Отриману реакційну суміш розділяли між діетиловим ефіром (500 мл) і водою (500 мл). Водний шар екстрагували додатковою кількістю діетилового ефіру (3х400 мл). Об'єднані органічні екстракти промивали сольовим розчином (300 мл), сушили (Ма5О»), фільтрували і випарювали у вакуумі, одержуючи залишок темно-коричневого кольору. Залишок розчиняли в суміші ізогексани/ЕТОАс, фільтрували через коротку пробку силікагелю і випарювали у вакуумі, одержуючи тверду речовину ясно-коричневого кольору. Залишок твердої речовини попередньо абсорбували на силікагелі й очищували, використовуючи колонкову хроматографію (5102, здійснювали

Зо градієнтне елюювання 0-4 95 ЕОАс у ізогексанах), одержуючи зазначену в заголовку сполуку З у вигляді твердої речовини білого кольору. (27,0 г, 87,0 ммоль, 46,8 95):

ІН ЯМР (400 МГц, СОС») 6: 1,31 (12Н, 5), 1,34 (9Н, 5), 6,78 (1Н, т), 7,17-7,20 (2Н, омепарріпа т). 2-(4-аміно-3-(3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)-1 Н-піразоло|3,4-д|Іпіримідин-1-іл)уметил)-5- бром-3-(2-(трифторметил)бензил)хіназолін-4(ЗН)-он; 1 (з боронової кислоти, 3)

Е ОН)

Фф Вг 0) Ез

Вб о СЕ ех та шщ ОВи З ! їх /

Фі М | В: и М с т і і і ший кт іх

М | Ам » МагсОз, РИ) М -

М" сте М ЕЮНІіНО щк і

К у; й

НОМ

, ОВи проміжна '

А

Суміш проміжної сполуки А (2х10,0 г, 14,9 ммоль), (3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)боронової кислоти З (2х3,17 г, 14,9 ммоль), декагідрату карбонату натрію (2х6,75 г, 23,6 ммоль) і тетракистрифенілфосфінпаладію (2х0,52 г, 0,45 ммоль) у суміші ЕЮН/вода (9:11, 2х500 мл) дегазували азотом, обробляли ультразвуком протягом 10 хв і потім перемішували при 65"С в атмосфері азоту протягом 18 годин. Реакційні суміші поєднували і розчинники видаляли у вакуумі, отриманий залишок розчиняли в 10 95 розчині МеоОН у ОСМ (500 мл) і промивали насиченим водним розчином ацетату амонію (400 мл). Водний шар екстрагували додатковою кількістю розчину 10 95 МеонН у ОСМ (2х400 мл). Об'єднані органічні екстракти випарювали у вакуумі й отриманий залишок попередньо адсорбували на силікагелі й очищували, використовуючи колонкову флеш-хроматографію (здійснюючи градієнтне елюювання 0-40 95

ЕЮАс в ОСМ), одержуючи зазначену в заголовку сполуку 1 у вигляді твердої речовини блідо- жовтого кольору (8,4 г, 9,89 ммоль, 32,4 9): В: 2,70 хв

І"Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав) 5: 1,37 (ОН, 5), 5,50 (2Н, 5), 5,78 (2Н, 5), 6,49 (ІН, 9), 6,91 (1Н, У, 6,95 (1Н, а, 7,04 (ІН, т), 7,15(1Н, У), 7,28 (1Н, У, 7,54 (1Н, а), 7,68-7,72 (2Н, омепарріпд т), 7,83 (ІН, аа), 8.15 (1Н, 5).

Ступінь чистоти отриманого матеріалу складав приблизно 80 95. 2-(4-аміно-3-(3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)-1 Н-піразоло|3,4-д|Іпіримідин-1-іл)уметил)-5- бром-3-(2-(трифторметил)бензил)хіназолін-4(ЗН)-он; 1 (з боронового ефіру, 2)

М Ме о Ме

ІЙ Ге, Ез

Б о Ез | 2 М

Ви р ч нок - 6 6 6 6(--20503-3З2З23286 ак м

Маг2СОз КР Р зн, М пе м -к, ЕЮНІНоО Х щ / ) і

І іх Е (і ном

Не оті» ОВи проміжна.

А 1

Й

Суміш проміжної сполуки А (10,0 г, 14,9 ммоль; отриманої за способом прикладу 1), 2-(3- (трет-бутокси)-5-фторфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолану 2 (6,59 г, 22,40 ммоль) (3,17 г, 14,9 ммоль), декагідрату карбонату натрію (26,75 г, 23, ммоль) і тетракистрифенілфосфінпаладію (0,52 г, 0,45 ммоль) у суміші ЕЮН/вода (9:11, 500 мл) дегазували азотом, обробляли ультразвуком протягом 10 хв і потім перемішували при 65"С в атмосфері азоту протягом 40 годин. Розчинники видаляли у вакуумі, отриманий залишок розчиняли в 10 956 розчині МеОН у ОСМ (250 мл) і промивали насиченим водним розчином ацетату амонію (200 мл). Водний шар екстрагували додатковою кількістю 10 96 розчину МеОнН у

ОСМ (2х200 мл). Об'єднані органічні екстракти випарювали у вакуумі, і отриманий залишок попередньо адсорбували на силікагелі й очищували, використовуючи колонкову флеш- хроматографію (здійснюючи градієнтне елюювання 0-40 95 ЕТОАс у ОСМ), одержуючи зазначену в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини блідо-жовтого кольору (4,5 г, 6,14 ммоль, 41,1 96): Не2,70 хв. 2-(4-аміно-3-(3-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразолої|3,4-4д|піримідин-1-іл)уметил)-5-бром-3-(2- (трифторметил)бензил)хіназолін-4(ЗН)-он

В о СЕЗ Вш о СЕ де ! - !

З є к сиеМ пінеток м се М х у; ТЕА, ОСМ хи 7 хх к хх 0 ня 0 не ї 1 '

ОВи он проміжна В

До о орозчину /2-(4-аміно-3-(3-(трет-бутокси)-5-фторфеніл)-1 Н-піразоло!|3,4-4|піримідин- 1- ілуметил)-5-бром-3-(2-(трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-ону 1 (13,0 г, 18,6 ммоль) у ОСМ (150 мл) додавали трифтороцтову кислоту (21,6 мл, 280 ммоль), і отриманий розчин перемішували протягом 2 годин. Розчинник видаляли у вакуумі. Отриманий залишок поміщали в ОСМ (200 мл) і насичений розчин МансСоОз (200 мл). Водний шар екстрагували додатковою кількістю 10 96 МеоН у ОСМ (2х100 мл), і об'єднані органічні екстракти випарювали у вакуумі.

Отриманий залишок попередньо адсорбували на силікагелі й очищували, використовуючи колонкову флеш-хроматографію, елююючи 0-39 МеоОН у ОСМ, одержуючи зазначену в заголовку сполуку 15 у вигляді твердої речовини білого кольору (7,60 г, 11,8 ммоль, 63,0 9Ув): т/72 640 (МАН): (Е5У).

І"Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав) 0: 5,47 (2Н, 5), 5,78 (2Н, 5), 6,43 (1Н, а), 6,65 (1Н,аю, 6,75 (1Н, т), 6,79 (1Н, У, 7,14 (ІН, У, 7,28 (ІН, У, 7,53 (1Н, а), 7,69-7,73 (2Н, омепарріпа т), 7,85 (1Н, т), 8,13 (1Н, 5), 10,18 (1Н, а).

Сполука (): 2-((4-аміно-3-(З-фтор-5-гідроксифеніл)-1 Н-піразолої|3,4-4|піримідин-1-ілуметил)- 5-(3-(2-(2-метоксіетоксі)зетокси)проп-1-ін-1-іл)-3-(2-(трифторметил)бензил)ухіназолін-4(ЗН)-он у формі 1 кристалічного поліморфу о. - «ОМе а ОМе 5-7

Її Її СЕЗ | | ; ї СЕ 2 п си, РаСІХеРПЗ», уче ак ЕБМІН ле -Е

М се ЇМ "М М до ун;

М 5 м

Е- рана «й Нам й ХМ ИН он ОН проміжна В Сполука(ї)

Суміш 3-(2-(2-метоксієетоксі)етокси)проп-1-іну (4,69 г, 29,7 ммоль), йодиду міді(І) (226 мг, 1,19 ммоль), проміжної сполуки В (7,6 г, 11,9 ммоль) і дихлориду біс(трифенілфосфін)паладіюкії) (833 мг, 1,19 ммоль) у дієтиламіні (330 мл) ретельно дегазували азотом і перемішували при 60"С протягом З годин. Додавали ще 3-(2-(2-метоксіетоксі)етокси)проп-1-ін (400 мг), дихлорид біс(трифенілфосфін)паладію(і!) (167 мг, 0,24 ммоль) і йодид міді(І) (0,45 г, 0,24 ммоль) у дієтиламіні (30,0 мл) і перемішували при 60"С протягом З годин. Додавали додаткову аліквоту 3-(2-(2-метоксіетоксі)етокси)проп-1-іну 7 (400 мг), дихлориду біс(трифенілфосфін)паладіюці!) (167 мг, 0,24 ммоль) і йодиду міді(!) (0,45 г, 0,24 ммоль), і отриману реакційну суміш перемішували при 60"С протягом ще 7 годин. Розчинник видаляли у вакуумі, отриманий залишок розчиняли в 1095 розчині МеОН у ОСМ (200 мл), і промивали водним розчином ацетату амонію (10 масою, 300 мл). Водний шар ще екстрагували 10 95 розчином МеОоН у ОСМ (2х200 мл). Об'єднані органічні шари випарювали у вакуумі. Отриманий залишок суспендували в Меон (30,0 мл) протягом ночі і фільтрували. Залишок твердої речовини попередньо адсорбували на силікагелі й оочищували, використовуючи флеш-хроматографію (51О», здійснюючи градієнтне елюювання 0-5 96 МеоН у ОСМ,) одержуючи сполуку (І) у вигляді твердої речовини жовто-коричневого кольору у формі форми 1 кристалічного поліморфу (4,73 г, 6,52 ммоль, 55,0 У): т/2 718 (МАН) (Е5"). "Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав) 6: 3,20 (ЗН, 5), 3,35-3,39 (2Н, омепарріпа т), 3,43-3,50 (АН, омепарріпд т), 3,60-3,64 (2Н, омепарріпу т), 4,38 (2Н, 5), 5,49 (2Н, 5), 5,77 (2Н, 5), 6,42 (1Н, 9), 6,65 (1Н,аю, 6,74 (1Н, аа), 6,79 (ІН, У, 7,15 (ІН, 9, 7,28 (ІН, 9, 7,52 (1Н, а), 7,65-7,72 (2Н, омепарріпд т), 7,83 (1Н, т), 8,13 (1Н, 5), 10,19 (1Н, 5).

Аналіз ХАРО зразка отриманого матеріалу здійснювали, використовуючи ХЕРО спосіб 2 у розділі загальні процедури. Матеріал виявився кристалічним, про що свідчать дані отриманої картини ХКРО (ФІГ. 3), але також містив деяку кількість аморфного матеріалу.

Аналіз ДСК (за способом ДСК 1, розкритим в розділі загальні процедури) зразка форми 1 кристалічного поліморфу, що представлений на ФІГ. 4 (нижня крива), де можна бачити, що зразок був підданий ряду змін при нагріванні. Після широкої ендотерми з максимумом піка при 1027"С слідувала екзотерма з максимумом піка при 1417"С, за якою слідувала більш вузька ендотерма з максимумом піка при 174"С. Спостерігалося, що в процесі нагрівання утворювався

Зо новий кристалічний поліморф - пізніше було виявлено, що це форма 2 кристалічного поліморфу. ТГА (термічний гравіметричний аналіз) (використовуючи спосіб 1 ТГА в розділі загальні процедури) зразка форми 1 кристалічного поліморфу (ФІГ. 4; верхня крива) демонстрував втрату маси в 0,34 95 від навколишньої температури до 75"С, що ймовірно пов'язано з випаровуванням вільного розчинника і/або гігроскопічної води.

Приклад З - Одержання сполуки (І) у вигляді форми 2 кристалічного поліморфу

Спосіб 1

Форму 2 кристалічного поліморфу можна одержати в результаті кристалізації з розчину в 1- пропанолі у такий спосіб. У 100 мл реактор завантажували 1,98 г сполуки (І) і 49,5 мл 1- пропанолу (25 л/кг). Отриману суміш перемішували і нагрівали до 957С (розчин спостерігався при 92"С). Отриманий розчин витримували при 957"С протягом 30 хвилин, охолоджували до 23"С протягом 10 годин, спонтанна кристалізація відбувалася при 72"С. Отриману гетерогенну суміш перемішували протягом 4 годин, потім осад відфільтровували і промивали 1-пропанолом (2 мл). Отриманий продукт сушили при 45"С у вакуумі протягом 18 годин, одержуючи 1,71 г форми 2 кристалічного поліморфу з виходом 86,4 95.

Спосіб 2

Кристалізацію форми 2 кристалічного поліморфу з розчину в 1-пропанолі можна також полегшити, вводячи кристали або кристалічні форми 2 кристалічного поліморфу, у такий спосіб. 1-пропанол (25,00 л/кг, 275,0 мл) додавали до сполуки (І) (11,00 г). Отриману суміш перемішували при 350 об/хв при 25"С. Потім гетерогенну суміш нагрівали до 97"С протягом 40 хвилин (температура кипіння), витримували 5 хвилин при 97"С, потім охолоджували до 967 протягом 5 хвилин, потім витримували протягом 1 години при 96"С. Гомогенний, злегка жовтогарячий розчин охолоджували до 85"С протягом 15 хвилин. Потім швидкість перемішування знижували до 250 об/хв, і в розчин вводили затравку - форму 2 кристалічного поліморфу (0,01 кг затравкових кристалів/кг вихідного матеріалу сполуки (І), 0,11 г). Отриману суміш перемішували протягом 10 хвилин при 85"С, потім охолоджували до 22"С протягом 8 годин, використовуючи кубічне охолодження з нелінійним коефіцієнтом 2,3. Гетерогенну суміш перемішували протягом 10 годин при 22"С перед тим, як відфільтровували осад. Отриманий продукт промивали 1-пропанолом (1,00 л/кг, 8,84 г, 11,00 мл) потім сушили при 45"7С (вихідні; 72 години), одержуючи кристалічний поліморф форми 2 (9,5 г, 86,4 95). (510) Спосіб З

Форму 2 кристалічного поліморфу можна одержати, суспендуючи форму 1 кристалічного поліморфу в метанолі, етанолі, 2-пропанолі, 1-пропанолі, ацетоні, етилацетаті, ацетонітрилі, толуолі, ізопропілацетаті, ТВМЕ, 2-бутаноні ДМСО, діетиловому ефірі, МІВК, гептані, нітрометані, у суміші 10 95 вода/етанол, у суміші 10 95 вода/ацетонітрил або в суміші 10 95 вода/2-пропанол.

Спосіб 4

Форму 2 кристалічного поліморфу можна одержати, суспендуючи сполуку (І) в аморфній формі в метанолі, етанолі, 2-пропанолі, 1-пропанолі, ацетоні, етилацетаті, ацетонітрилі, толуолі, ізопропілацетаті, ТВМЕ, 2-бутаноні, ДМСО, діетиловому ефірі, МІВК, нітрометані, у суміші 10 95 вода/етанол або в суміші 10 95 вода/2-пропанол.

Спосіб 5

Одержання форми 2 кристалічного поліморфу в більшому масштабі здійснюють у такий спосіб: 200 мг форми 1 кристалічного поліморфу відмірювали в 20 мл сцинтиляційну ампулу.

Додавали 50 об'ємів метанолу, і зразок суспендували протягом 24 годин при температурі між 2070 ії 5072 (4 години при кожній температурі) при постійному перемішуванні при швидкості 500 об/хв. Отриманий матеріал відфільтровували у вакуумі і сушили у вакуумному термостаті протягом ночі при 407С.

Приклад 4 - Характеризація сполуки (І) як форми 2 кристалічного поліморфу

Аналіз ХКРО зразка форми 2 кристалічного поліморфу починали, використовуючи спосіб З

ХЕРОІ у розділі загальні процедури. Отримана картина ХКРО представлена на ФІГ. 5.

Аналіз ТГА зразка форми 2 кристалічного поліморфу здійснювали, використовуючи спосіб 2

ТГА в розділі загальні процедури. Отримані результати представлені на ФІГ. 6, з яких видно, що форма 2 кристалічного поліморфу демонструвала втрату маси в 20,5 90 від 1557С аж до 20076.

Аналіз ДСК (диференційна скануюча калориметрія) зразка форми 2 кристалічного поліморфу здійснювали, використовуючи спосіб 2 ДСК у розділі загальні процедури. Отримані результати представлені на ФІГ. 7, з яких видно, що форма 2 кристалічного поліморфу плавиться з розкладанням при 190,17С (максимум піка).

Графік ізотерми ДСП (динамічна сорбція парів) зразка форми 2 кристалічного поліморфу представлений на ФІГ. 8 і зміна ДСП на масовому графіку представлена на ФІГ. 9.

Зо Спостерігалося, що форма 2 кристалічного поліморфу поступово абсорбувала воду 50,4 95 від

О 95 ЕН аж до 95 95 ЕН, і таке захоплення води було оборотним, указуючи на те, що форма 2 не є гігроскопічною.

Статистичні дослідження стабільності зразка форми 2 кристалічного поліморфу демонстрували той факт, що зразок був стабільний відносно вологи порівняно з формою твердої речовини, тому що не виявлено ніяких змін за даними ХКРО (використовуючи спосіб З

ХЕРОІ у розділі загальні процедури) після аналізу ДСП (див. ФІГ. 10) і після 1 тижня зберігання при 25"С/96 95 КН і 40"С/75 95 КН (див. ФІГ. 11, використовуючи спосіб 1 ХКРО у розділі загальні процедури).

Приклад 5 - Стабільність мікроздрібненої сполуки (І), як форми 2 кристалічного поліморфу

Мікронізовану форму 2 кристалічного поліморфу одержували, використовуючи 5 ми мікронізуючий пристрій Уейтіїї, одержуючи наступний розподіл частинок по розмірах: О:о-1,14 мкм; О5о-1,94 мкм ії Юєго-3,39 мкм (розподіл частинок по розмірах визначали, використовуючи лазерну дифракцію (прилад Маїмегп Махіегві7ег іпзігитепо).

Мікроздрібнений матеріал аналізували, використовуючи ТГА, ХКРО, і ДСК у момент часу нуль і після різних умов зберігання. Зразки зберігали в наступних умовах: (ї) 7 тижнів при

КТ/«5 96 КН; (ії) 7 тижнів при КТ/56 95 КН; (іїї) 7 тижнів при КТ/75 95 КН; (ім) 7 тижнів при 50"С; і (м) 7 тижнів при 40"С/75 Фо ВН.

Результати, представлені в таблиці З, свідчать про те, що зразок виявився кристалографічно і термодинамічно стабільним, тому що в різних умовах не спостерігалося значних змін.

Таблиця З

Результати дослідження стабільності для форми 2 кристалічного поліморфу (мікроздрібненого)

Се гою реф вигляд 7 о ре рвесі 00017711 Мах масо . 115,3 с. тити вве тив 71 о

БОгсх 0,3 -Веє | «Вей | 187,8 119,8 білий

З 9/9 х протягом 7 тижнів; ВЕР - кристалічний еталон; «Неї - ідентично еталону

Приклад 6 - Одержання сполуки (І) в аморфній формі

Сполуку (І) в аморфній формі одержували, нагріваючи форму 1 кристалічного поліморфу (отриманого за способом прикладу 2) до 1207С.

Приклад 7 - Одержання сполуки (І) як форми З кристалічного поліморфу

Спосіб 1

Форму З кристалічного поліморфу можна одержати, суспендуючи сполуку (І) в аморфній формі в дихлорметані.

Спосіб 2

Форму З кристалічного поліморфу в більш великому масштабі одержують у такий спосіб: 200 мг форми 1 кристалічного поліморфу поміщали в 4 мл ампулу, що містить 5 об'ємів дихлорметану. Зразок перемішували на вортексі протягом 30 секунд. Потім додавали ще 5 об'ємів ОСМ, ї зразок перемішували на вортексі ще протягом 30 секунд. Зразок фільтрували у вакуумі і сушили у вакуумному термостаті протягом вихідних при 25"7С.

Приклад 8 - Характеризація сполуки (І) як форми З кристалічного поліморфу

Аналіз ХКРО зразка форми З кристалічного поліморфу здійснювали, використовуючи спосіб 2 ХЕРО у розділі загальні процедури. Картина ХКРО представлена на ФІГ. 12.

Дані ТГА і ДСК (використовуючи спосіб 1 ТГА і спосіб 1 ДСК у розділі загальні процедури), отримані для зразка форми З кристалічного поліморфу, представлені на ФІГ. 13. Форма З кристалічного поліморфу плавиться з розкладанням при температурі близько 186"7С (максимум піка; ДСК - нижня крива).

Ізотерма ГОСП, отримана для зразка форми З кристалічного поліморфу, представлена на

ФІГ. 14, де спостерігалася зміна маси 0,99 95 при 0-90 95 ВН.

Дослідження статистичної стабільності зразка форми 3 кристалічного поліморфу демонстрували той факт, що зразок був стабільний відносно вологи, порівняно з формою твердої речовини, так не відзначено ніяких змін за даними ХКРО (використовуючи спосіб 2

ХЕРОІ у розділі загальні процедури) після аналізу ГСП (див. ФІГ. 15) і після 1 тижня зберігання при 25"С/96 95 КН і 40"С/75 95 КН (див. ФІГ. 16; використовуючи спосіб 1 ХКРО у розділі

Зо загальні процедури).

Приклад 9 - Одержання сполуки (І) як форми 4 псевдополіморфу

Сполуку (Ї) у формі форми 1 кристалічного поліморфу (20 мг) або сполуку (І) в аморфній формі (20 мг) відмірювали в ампулу ВЕРХ. Потім додавали ТГФ порціями при кімнатній температурі при струшуванні протягом 1 хвилини. Потім зразок струшували (500 об/хв) при 507С протягом 15 хвилин перед наступним додаванням ТГФ. Зазначений процес продовжували доти, поки не додали 80 об'ємів ТГФ до одержання розчину. Отриманий розчин охолоджували з 507 до 5"С зі швидкістю 0,1"С/хв і зберігали при 5"С протягом ночі. Потім розчин залишали випаровуватися до одержання твердої речовини. Тверду речовину фільтрували у вакуумі, сушили повітрям (у вакуумі) протягом 2 годин, перед тим, як аналізували за допомогою ХКРО,

використовуючи спосіб 1 ХКРО у розділі загальні процедури. Картина ХКРО зразка твердої речовини, отриманої з використанням сполуки (І) в аморфній формі як вихідний матеріал, представлена на ФІГ. 17 і відповідає формі 4 псевдополіморфу.

Зразок твердої речовини, отриманий з використанням форми 1 кристалічного поліморфу як вихідний матеріал, сушили у вакуумному термостаті при 257С протягом 248 годин, перед тим, як знову аналізували за допомогою ХКРО. Виявилося, що після такого тривалого процесу сушіння форма 4 кристалічного поліморфу перетворилася в аморфну форму сполуки (І). Як така, форма 4 псевдополіморфу являє собою метастабільний сольват.

Приклад 10 - Одержання сполуки (І) як форми 5 псевдополіморфу

Сполуку (І) у формі форми 1 кристалічного поліморфу (20 мг) або сполуки (І) в аморфній формі (20 мг) відмірювали в ампулу ВЕРХ. Потім порціями додавали 1,4-діоксан при кімнатній температурі при струшуванні протягом 1 хвилини. Потім зразок струшували (500 об/хв) при 50"7С протягом 15 хвилин, перед наступним додаванням 1,4-діоксану. Зазначений процес продовжували доти, поки не додали 80 об'ємів 1,4-діоксану до одержання розчину. Отриманий розчин охолоджували з 50"С до 5 С зі швидкістю 0,1"С/хв, і витримували при 5"7С протягом ночі.

Потім розчин залишали випаровуватися для одержання твердої речовини. Тверду речовину фільтрували у вакуумі, сушили повітрям (у вакуумі) протягом 2 годин, перед тим, як аналізували за допомогою ХКРО, використовуючи спосіб 1 ХКРО у розділі загальні процедури. Картина

ХЕРО зразка твердої речовини, отриманої з використанням сполуки (І) в аморфній формі як вихідного матеріалу, представлена на ФІГ. 17 і відповідає формі 5 псевдополіморфу. Зразок твердої речовини, отриманої з використанням форми 1 кристалічного поліморфу як вихідного матеріалу, сушили у вакуумному термостаті при 257"С протягом 248 годин, перед тим, як аналізували знову за допомогою ХКРО. Після настільки тривалого періоду сушіння форма 5 псевдополіморфу не змінила форму. Подальшу характеризацію здійснювали, використовуючи результати "Н ЯМР, ТГА і ДСК (не представлені), що свідчили про те, що форма 5 псевдополіморфу знову перетворилася в аморфну форму сполуки(І) після втрати розчинника при зниженому тиску. Як така, форма 5 псевдополіморфу являє собою метастабільний сольват.

Приклад 11 - Одержання сполуки (І) як форми 6 псевдополіморфу

Сполука (І) в аморфній формі (20 мг) відмірювали в ампулу ВЕРХ. Порціями додавали суміш

Зо 10 95 вода/ацетонітрил при кімнатній температурі при струшуванні протягом 1 хвилини. Потім зразок струшували (500 об/хв) при 507"С протягом 15 хвилин перед наступним додаванням суміші 10 95 вода/ацетонітрил. Зазначений процес продовжували доти, поки не додали 50 об'ємів суміші 10 95 вода/ацетонітрил. Отриману суспензію залишали для дозрівання при температурі між 257С їі 507С (4 години при кожній температурі) при струшуванні зі швидкістю 500 об/хв протягом 2 днів. Тверду речовину відфільтровували у вакуумі, сушили повітрям протягом 2 годин і аналізували за допомогою ХКРО, використовуючи спосіб 1 ХКРО у розділі загальні процедури. Картина ХКРО зразка цього матеріалу представлена на ФІГ. 17 і відповідає формі 6 псевдополіморфу. Після аналізу ХКРО аналізу матеріал сушили у вакуумному термостаті при 40"С протягом ночі. Після настільки тривалого періоду сушіння знайшли, що форма 6 псевдополіморфу втратила розчинник і перетворилася у форму 2 кристалічного поліморфу. Як така, форма 6 псевдополіморфу являє собою метастабільний сольват.

Приклад 12 - Одержання сполуки (І) у вигляді форми 7 псевдополіморфу

Сполуку (І) в аморфній формі (20 мг) відмірювали в ампулу ВЕРХ. Потім порціями додавали суміш 10 95 вода/ацетон при кімнатній температурі при струшуванні протягом 1 хвилини. Потім зразок струшували (500 об/хв) при 50"С протягом 15 хвилин перед наступним додаванням суміші 10 95 вода/ацетон. Зазначений процес продовжували доти, поки не додали 80 об'ємів суміші 10 95 вода/ацетон. Отриману суспензію залишали визрівати при температурі між 25" і 50"С (4 години при кожній температурі) при струшуванні зі швидкістю 500 об/хв протягом 2 днів.

Потім тверду речовину відфільтровували у вакуумі, сушили повітрям протягом 2 годин, і аналізували за допомогою ХКРО, використовуючи ХКРО спосіб 1 у розділі загальні процедури.

Картина ХКЕРО зразка зазначеного матеріалу представлена на ФІГ. 17 і вона відповідає формі 7 псевдополіморфу. Після аналізу ХКРО матеріал сушили у вакуумному термостаті при 40"С протягом ночі. Після такого тривалого періоду сушіння виявилося, що форма 7 псевдополіморфу втратила розчинник і перетворилася у форму 2 кристалічного поліморфу. Як така, форма 7 псевдополіморфу являє собою метастабільний сольват.

Приклад 13 - Термодинамічна стабільність форми 2 і форми З кристалічних поліморфів і їхнє взаємоперетворення

Порівняльні експерименти для суспензій здійснювали на сумішах 50:50 форми 2 і форми З кристалічних поліморфів. Додавали 50 об'ємів розчинника, і зразки перемішували (300 об/хв)

при встановленій температурі протягом З днів. Потім усі зразки фільтрували у вакуумі і сушили повітрям протягом 30 хвилин до аналізу ХКРО.

Результати експериментів із суспензіями підсумовані далі в таблиці 4:

Таблиця 4

Співставні результати для суспензій

Усі порівняльні експерименти із суспензіями приводили до форми 2, указуючи на те, що вона є термодинамічно більш стабільною формою.

Приклад 14 - Методологія іп міїго і іп мімо скринування і результати іп міго скринування

Експериментальні способи біологічного тестування

Аналіз інгібування ферментів

РІЗК ферменти каталізують фосфорилування фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату (РІР2) до фосфатидилінозитол 3,4,5-трифосфату (РІРЗ) у присутності АТР і іонів Мд". Продукт РІРЗ можна визначити за зсувом біотин-РІРЗ з енергетичного перенесення комплексів, що складаються з мічених европієм анти-с5ї моноклональних антитіл, зЗ5Т-міченого плекстрин гомологічного (РН) домену, біотинільованого РІРЗ і стрептавідин-алофікоціаніну (АРС) за допомогою розрізненого за часом резонансного перенесення енергії флуоресценції (ТК-ЕНЕТ) (НТКЕФРІЗК ферментний аналіз, Мійіроге). Збудження европію в комплексі при 330 нм приводить до перенесення енергії на АРС ії до емісії флуоресценції на 665 нм, хоча емісія самого европію спостерігається на його характеристичній довжині хвилі 620 нм. РІРЗ продукт, утворений за рахунок активності РІЗК, заміщає біотин-РІРЗ з комплексу і приводить до втрати енергії перенесення (зменшення інтенсивності сигналу).

Додавали сполуку, що підлягає тестуванню, в необхідних кінцевих концентраціях до суміші

РІР2 субстрату і рекомбінантного РІЗК ферменту (або а, ВД або б ізоформи, від Мійїроге, або у ізоформи Ір!тОужр101 конструкція), від Опіей е(агез ВіоіодісаІ, Зулатр5сой, МА) і отриману суміш інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після зазначеного періоду інкубування додавали АТР (10 мкМ) до суміші фермент/сполука/РІР2 субстрат, і отриману суміш інкубували ще 30 хвилин при КТ. Зупиняючий розчин, що містить біотинільований РІРЗ і детектуючу суміш, що містить З5Т-мічений ЗКРІ плекстрин гомологічного (РН) домену, і флуорофори потім додавали, й отриману суміш інкубували при КТ протягом 15-18 годин, до

Зо детектування у флуоресцентному мікропланшетному зчитувальному пристрої (Зупегду 4,

ВіоТек ОК, Весгогавніге, ОК).

Отримані результати розраховували відповідно до формули: АРС сигнал (емісія на 665 нм)/сигнал европію (емісія на 620 нм)х107. Відсоток інгібування кожної реакції розраховували відносно контролю, обробленого ДМСО, і 50 95 інгібуючу концентрацію (величина ІСво) розраховували потім, використовуючи криву концентрація-реакція.

Клітинний аналіз РІЗКб

Для способу оцінки активації РізЗКб у відповідь на стимули, визначали статус фосфорилування білка, АКІ, передачу сигналів по ходу транскрипції продукту РІЗКб. 0937 клітини, отримані від людини, лейкемічної, моноцитарної лімфомної клітинної лінії, диференціювали до клітин типу макрофагів шляхом інкубування з РМА (100 нг/мл) протягом 48- 72 годин. Потім клітини попередньо інкубували або з тестованою сполукою, або з носієм протягом 2 годин, і потім їх коротко стимулювали впливом Н2гОг (10 мМ, 5-7 хв) і реакцію зупиняли, заміняючи середовище 4595 розчином формальдегіду. Активність ендогенного пероксиду і формальдегіду інактивували шляхом інкубування з гасильним буфером (0,1 95 азид натрію, 1 95 Н2О» у РВЗ з 0,1 95 Топ Х-100) протягом 20 хв. Клітини промивали буфером (РВ5, що містить 0,1 96 Тип Х-100) і інкубували з блокуючим розчином (1 95 ВЗА у РВ5) протягом 1 години, і потім знову промивали буфером і інкубували протягом ночі або з анти-рАКІ антитілом, або з анти-пан-АКІі антитілом (обидва від СеїЇ бБідпаїййпуд ТесппоЇоду). Після промивання буфером (РВЗ, що містить 0,195 Тійоп Х-100), клітини інкубували з НЕР-кон'югованим вторинним антитілом (Бакосо) і отриманий сигнал визначали колориметрично (00: 450 нм із порівняльною довжиною хвилі 655 нм), використовуючи субстрат ТМВ (пакет субстратного реагенту, що постачаться КО Зуєгептв, Іпо.).

Зазначену реакцію зупиняли, додаючи розчин Нг5О.4 (100 мкл). Потім клітини промивали буфером (РВ5, що містить 0,1 95 Топ Х-100) і на 30 хвилин наносили 5 95 розчин кристалічного фіолетового (100 мкл). Після промивання буфером (РВ5, що містить 0,1 95 ТиИйоп Х-100), 1 95

ЗОЗ (100 мкл) додавали в кожну ямку, і планшети злегка струшували протягом 1 години, до того, як вимірювали поглинання при 595 нм (МагпозКапФ Ріазп, Тпепгто-Рівпег 5сієпійіс).

Вимірювані значення ОЮО»450-655 коректували на число клітин, розділивши ОЮа450-655 на значення

ОЮО5о5. Відношення сигналу рАКЇ до повного сигналу АК використовували для кількісного визначення ступеня активації РІЗК б. Відсоток інгібування для кожної ямки розраховували відносно 10 мкг/мл стандартного контролю (І294002), прийнявши за 100 95 інгібування відносно тільки контролів Н2гОг як 095 інгібування. Значення Со розраховували, використовуючи криві концентрація-реакція, отримані із серіальних розведень тестованих сполук.

Клітинний аналіз РІЗКУ

Зо Як засоби оцінки активації РІЗКу у відповідь на стимули, статус фосфорилування білка, АК, передачу сигналів по ходу транскрипції продукту РІЗК у, визначали, використовуючи стимуляцію за допомогою МОР-1. 0937 клітини диференціювали до клітин типу макрофагів шляхом інкубування з РМА (100 нг/мл) протягом 48-72 годин. Потім клітини попередньо інкубували або з тестованою сполукою, або з носієм протягом 2 годин, і потім їх коротко стимулювали за допомогою МСОР-1 (10 мМ, 5-7 хв) і реакцію зупиняли, заміняючи середовище 495 розчином формальдегіду. Активність ендогенного пероксиду і формальдегіду інактивували, шляхом інкубування з гасильним буфером (0,1 95 азид натрію, 195 Н2Ог2 у РВЗ з 0,195 Тийоп Х-100) протягом 20 хв. Клітини промивали буфером (РВ5, що містить 0,1 95 ТИйоп Х-100) і інкубували з блокуючим розчином (195 ВЗА у РВ5) протягом 1 години, і потім знову промивали буфером і інкубували протягом ночі або з анти-рАКІЇ антитілом, або з анти-пан-АКі антитілом (обидва від СеїЇ Зідпаїййпа

Тесппоїоду). Після промивання буфером (РВ5, що містить 0,195 Топ Х-100), клітини інкубували з НКР-кон'югованим вторинним антитілом (Юако), і отриманий сигнал визначали колориметрично (00: 450 нм із порівняльною довжиною хвилі 655 нм), використовуючи ТМВ субстрат (упаковка субстратного реагенту, що постачається КУО Зузіетв, Іпос.).

Реакцію зупиняли, додаючи 1 н розчин Н250О»5 (100 мкл). Потім клітини промивали буфером (РВ5, що містить 0,1 95 Тийоп Х-100) ії 5 956 розчин кристалічного фіолетового (100 мкл) наносили на 30 хвилин. Після промивання буфером (РВ5, що містить 0,1 95 ТИйоп Х-100), 1 956 505 (100 мкл) додавали в кожну ямку, і планшети злегка струшували протягом 1 години до вимірювання поглинання при 595 нм (МагіозКапФ РіІазп, Тпепто-Різпег Зсіепіййс). У вимірювані значення

ОО а5о-єо5 вносили виправлення шляхом ділення ОЮг450-655 на значення ОЮОзхе5. Відношення сигналу рАКІ до повного сигналу АКІ використовували для кількісної оцінки ступеня активації РІЗК у.

Відсоток інгібування для кожної ямки розраховували відносно 10 мг/мл стандартного контролю (294002), прийнятого за 100 95 інгібування проти тільки контролів МСР-1 як 0 95 інгібування.

Значення ІСво розраховували, використовуючи криві концентрація-реакція, отримані в результаті серіальних розведень тестованих сполук, використовуючи програмне забезпечення

ХІ-Е (ід, СзиПагтога, ОК).

Аналіз утворення супероксидних аніонів

Для оцінки функцій РІЗК5-залежних клітин оцінювали продукування супероксидних аніонів у бо ІЕМм-примованих 0937 клітинах, використовуючи хемілюмінісцентний аналіз. 0937 клітини

(закуплені в АТСС, Мапаззав, МА) зберігали в КРМІ1640 (Іпмігодеп Ча., РаїхІєу, ОК), доповненій 1095 РС5 при 372С. Клітини суспендували при густині 107 клітин/мл у 40 мл 1095 ЕС5

ЕРМІ1640, і обробляли 20 мкл 100 мкг/мл ІРМу розчину (кінцева концентрація: 50 нг/мл), і інкубували при 37"С, 5 95 СО» протягом 4 днів.

ІЕМу-примовані 0937 клітини висівали в кількості 0,2х105 клітин/ямку в 96-ямкові планшети, і попередньо інкубували з тестованими сполуками протягом 2 годин у нестачі середовища (0,5 95

ЕС5 КРМІ 1640, що не містить фенолу червоного). Зимозан А (10 мг) з Засспаготузев5 сегемізіае (від Зідта-АїаІістп) знову суспендували в 1 мл 150 мМ Масі ії кип'ятили при 100"С протягом 15 хв. Після кип'ятіння частинки зимозану двічі промивали 1 мл РВЕ, і інкубували з 0,5 мл ВіоРагіїсіе5"М опсонізованими реагентами (Ге їесппоїодіеє) протягом 60 хв при 37"С.

Клітини обробляли сумішшю розчину частинок зимозану (10 мкл), аналітичним буфером (85 мкл), люмінолом (2,5 мкл) і розчином енхансера (2,5 мкл), причому усі вони представлені (крім зимозану) у наборі для аналізу супероксидних аніонів (Ме 51000, Зідта-Аїагісн Це, Роо!іє, ОК).

Хемілюмінісценцію, що свідчить про виділення супероксидного аніона, вимірювали кожні 15 хвилин аж до 60 хвилин, здійснюючи люмінометричні вимірювання (МагіозхКапФ Ріазп, Тпепто-

Еівпег Зсієпійіс).

Результати, отримані через 60 хвилин після інкубування, використовували для аналізу.

Відсоток інгібування для кожної ямки розраховували відносно 10 мкг/мл ІС87114, стандартного

РІЗКО інгібітору, приймаючи його за 100 95 інгібування, проти контролю, що приймали за 0 95 інгібування. Відносні ЕСзо значення розраховували, використовуючи криві концентрація-реакція, отримані в результаті серіальних розведень тестованих сполук, використовуючи програмне забезпечення ХІ--Р Її (ідьЬ5, Сага, ОК).

Індуковане цитостимом продукування цитокінів у РВМСОС5

Для оцінки РІЗК5-залежних клітинних функцій, оцінювали цитостимом-індуковане ІІ--4, ІІ -5,

І--13 ії ІТЕМу продукування в РВМС, використовуючи люмінесцентний мультиплексний аналіз. Усі здорові волонтери були завербовані ОпціпіШеб5 Іітйей (Гопдоп, ОК), і зразки крові були доставлені в дослідницьку компанію Кебзрімегі (14. Зазначені дослідження проводилися з дозволу місцевого комітету з етики, і всі суб'єкти дали свою письмову згоду.

Суспензії РВМОС (200 мкл; 2х105 клітин/мл) додавали в 9б-ямковий планшет. Клітини

Зо обробляли або тестованими сполуками в чистому ДМСО, або ДМСО як носієм (2 мкл), і інкубували при КТ протягом 1 години. Цитостим (Мінкепіу! Віотес, З,йггеу, ОК) вводили відносно 1:50, і клітини інкубували протягом 20 годин (37"С; 5 95 С0О2). Планшети обертали зі швидкістю 500 х д протягом 5 хвилин, і надосадову рідину збирали. Набір високочутливих цитокінових магнітних кульок (ЖНЗСУТМАС-60О5К, МіПроге, УХанога, ОК) використовували для вимірювання чотирьох аналітів (1-4, 11/-5, 11-13 ї ІЄМм), використовуючи І штіпех у такий спосіб: Магнітні кульки антитіл мультиплексували і інкубували в 9б-ямковому планшеті зі стандартом, тільки середовищем або зразком (50 мкл) протягом ночі зі струшуванням при 4"С. Після промивання двічі промивним буфером Мійїроге, представленим у наборі, використовуючи промивний пристрій для магнітних планшетів, кульки інкубували протягом 1 години з детекторним антитілом (50 мкл) при струшуванні при КТ. Розчин стрептавідин-фікоеритрину, представлений у наборі, додавали протягом 30 хвилин при струшуванні при КТ. Після промивання, кульки знову суспендували в проточній рідині (150 мкл) і відразу аналізували. Систему Гитіпех налаштовували для підрахунку 50 кульок, і кількість кожного з аналітів у надосадовій рідині розраховували, використовуючи стандартну криву. ІСво значення визначали з кривих концентрація-інгібування, використовуючи програмне забезпечення ХІ -Рй 1085, сзийатога, ОК)

Хемотаксис відносно МСР1

Для оцінки залежних від РІЗК у клітинних функцій, оцінювали хемотаксис клітин ТНРІ1 відносно МСР-1, використовуючи 48-ямкову хемотаксисну камеру. ТНРІ клітини людської клітинної лінії лейкемічної моноцитарної лімфоми (закуплені в АТСС Мапазвзав5, МА) підтримували в КРМІ 1640 (Іпмігодеп Ц., Раїзієу, ОК) з 10 96 ЕС5 при 3720. Клітини повторно суспендували в 0,5 95 ВБА/ВРМІ 1640 (2х105 клітин/мл) і інкубували протягом 10 хвилин при 37"С, 5 95 СО». Аліквоти клітинної суспензії (500 мкл) потім обробляли або сполуками в чистому

ДМСО, або з ДМСО як носієм (2,5 мкл) протягом 1 години (37"С, 5 95 СбОг).

МСРІ1 (50 нМ) готували в 0,5 95 ВБА/КРМІ 1640. У кожну ямку додавали розчин МСРІ1 (50 мкл) у нижній планшет 48-ямкової хемотаксисної камери (АР48, МешигоРгобе Іпс., Сайпетериго,

МО). Встановлювали полікарбонатну мембрану (8 мкм) на дно камери, і потім верхній планшет встановлювали на нижню камеру і мембранний фільтр. Аліквоти клітинної суспензії (50 мкл) обробляли сполуками або носієм перед тим, як обережно додавали у верхню камеру, ії 0,5 95

ВЗА ЕРМІ 1640 (50 мкл) наносили зверху. Потім камеру залишали на 2 години (37"С, 5 95 СбОг).

Зо

Потім мембрану обережно видаляли, і зразок (25 мкл) з нижньої камери переносили в новий 96- ямковий планшет.

Розчин МТТ (50 мкл) у 10 95 ЕС5 КРМІ 1640, що не містить фенолу червоного, додавали в кожну ямку, і планшет інкубували протягом 2 годин (37"С, 595 СбОг2). У кожну ямку додавали чистий ДМСО (100 мкл), щоб екстрагувати формазан, що утворився з МТТ, і планшети злегка струшували протягом 1 години до того, як вимірювали поглинання при 595 нм (МагіозКапФф Ріазп,

ТНнепто-Різпег 5сіепійіс). Значення порівнювали з інгібуванням за рахунок А5б604850 (10 мг/мл), селективного інгібітору РІЗКУ, щоб розрахувати відносний відсоток інгібування. Відносні значення ЕСво визначали за допомогою кривих концентрація-інгібування, використовуючи програмне забезпечення ХІ -Р Її (ідр5, Схийатога, ОК).

Виділення СХСІ 8 з нейтрофілів, отриманих від пацієнтів з ХОЗЛ

Ефекти обробки СХСІ8, виділених з нейтрофілів, отриманих від пацієнтів з ХОЗЛ, оцінювали, використовуючи аналіз ЕГІБА. Усі пацієнти були завербовані Опціпійе5 І ітйеа (Гопдоп, ОК), і зразки крові були доставлені в компанію Кезрімегі Ца. Зазначені дослідження були дозволені місцевим комітетом з етики, і всі суб'єкти дали підписку про інформованість і про згоду. Усю кров (30 мл) обережно змішували з АСО (5 мл; що включає: 7,36 г лимонної кислоти, 14,71 г цитрату натрію, 9,91 г декстрози в 250 мл стерильної, двічі дистильованої води) і 6 95 декстраном (15 мл; розведеним у 0,995 МасСі) для видалення червоних кров'яних клітин (еритроцитів). Ампули інкубували при КТ протягом 45 хв, і потім збирали надосадову рідину (фракції з великим вмістом білих клітин (лейкоцитів)), залишаючи еритроцити.

Зазначену фракцію центрифугували (10 хв зі швидкістю 1200 об/хв, 4"С) з невеликим гальмуванням. Надосадову рідину відсмоктували, і осад знову суспендували в охолодженій льодом, двічі дистильованій НО (10 мл), і через 30 секунд додавали 0,6 М КСІ (4 мл). Клітинну суспензію розбавляли стерильним РВ5 (до кінцевого об'єму 50 мл), і потім центрифугували зі швидкістю 1500 об/хв протягом 5 хв. Надосадову рідину відсмоктували, і осад знову суспендували в РВЗ5 (2,5 мл), і дві ампули від того самого донора зливали в одну.

Отриману клітинну суспензію обережно поміщали поверх 5 мл середовища РісоїІ-радиетм ргетішт (СЕ НеайПсаге Віо Зсіепсе АВ, Оррзаїа, Змедеп), використовуючи пастерівську піпетку, і потім центрифугували (30 хв зі швидкістю 1500 об/хв із невеликим гальмуванням). Виділені

Зо нейтрофіли з донної частини ампул знову суспендували в КРМІ-1640 середовища (бірсо,

РаїзіІєу, ОК), що містить 5 95 ЕС5, і висівали з густиною 4х105 клітин/ямку в 96-ямковий планшет.

Клітини інкубували протягом 30 хв (37"С; 5 95 СбО2г) перед початком обробки.

Нейтрофіли попередньо інкубували з тестованими сполуками або з ДМСО носієм протягом 1 години і потім стимулювали з використанням ТМЕса (10 нг/мл). Надосадову рідину, що не містить клітин, збирали через З години після стимуляції за допомогою ТМРЕа, і СХСІ 8 визначали за допомогою ЕГІЗА, використовуючи комплект ЮиобБеї ЕГІБА (КО зу«іетв5, Абіпддоп, ШК).

Наведені ІСво значення визначали з кривих концентрація-інгібування, використовуючи програмне забезпечення ХІ -РйЙ (1085, С1ийатога, ОК).

МТ аналіз

РМА-диференційовані (РМА-форболміристатацетат) 0937 клітини попередньо інкубували з тестованими сполуками (10 мг/мл) або з носієм протягом 4 годин у 595 ЕС5 або 1095 ЕСб5 протягом 24 годин. Надосадову рідину замінювали новим середовищем (200 мкл) і вихідний розчин МТТ (10 мкл, 5 мг/мл) додавали в кожну ямку. Після інкубування протягом 1 години середовище видаляли, у кожну ямку додавали 200 мкл ДМСО, і планшети злегка струшували протягом 1 години перед тим, як вимірювали поглинання при довжині хвилі 550 нм. Відсоток втрати клітинної життєздатності розраховували для кожної ямки відносно обробки носія (0,5 905

ДМСО).

Іп Мімо скринування: Фармакодинаміка і протизапальна активність

Індуковане ліпополісахаридами (Р5) нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах мишей

Неголодуючим мишам ВАЇВ/с (у віці 6-8 тижнів) вводили носій або тестовані сполуки, використовуючи інтратрахеальний спосіб введення (об'єм дози 20 мкл) у моменти часу Т :- -2 години, -8 годин або -12 годин відносно початку ГРо-обробки. І Р5 одержували в розчині 0,5 мг/мл і у вигляді аерозолей, використовуючи ультразвуковий небулайзер (Ое Мібіїє5 ийгазопіс пебиїїзег 2000) (7 мл протягом 30 хвилинного впливу). Через вісім годин після обробки І Р5 у трахею вводили канюлю й екстрагували бронхоальвеолярну промивну рідину (ВАГ Е), вливаючи і потім витягаючи РВ5 (1 мл) у легені через трахеальний катетер. Цю процедуру повторювали, одержуючи на виході приблизно 2 мл промивної рідини. Загальні кількості клітин у ВАГ Е зразках вимірювали, використовуючи гемоцитометр. Цитоспинові клітинні мазки ВАГ Е зразків готували бо шляхом центрифугування зі швидкістю 1200 об/хв протягом 2 хв при КТ і забарвлювали,

використовуючи систему забарвлювання ЮШОціК (Оаде Вепйгіпу) для диференційної кількості клітин. Клітини підраховували, використовуючи масляну імерсійну мікроскопію. Результати виражають як кількість нейтрофілів у клітині на мл ВАГЕ (середнє 55.Е.М). (5.Е.М.- стандартна помилка середнього - С.О.С.)

Індуковане ГР5 нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах щурів

Неголодуючим щурам вводили носій або тестовані сполуки, використовуючи інтратрахеальний спосіб введення (об'єм дози 100 мкл) у моменти часу Т - -2 години, -8 годин або -12 годин відносно початку ГРО обробки. І РЗ розчин (0,3 мг/мл) вводили у вигляді аерозолей, використовуючи ультразвуковий небулайзер (Оеє Мібії55 ийгазопіс периїїбзег 2000) (7 мл протягом 30 хвилинного впливу). Через вісім година після обробки І РЗ у трахею вводили канюлю й екстрагували бронхоальвеолярну промивну рідину (ВАГ Е), вводячи і потім витягаючи

РВЗ (1 мл) у легені через трахеальний катетер. Цю процедуру повторювали, одержуючи на виході приблизно 2 мл промивної рідини.

Загальну кількість клітин у ВАГЕ зразках вимірювали, використовуючи автоматичний лічильник клітин Соипіез5 (Іпмігодеп). Цитоспинові клітинні мазки ВАГ зразків готували шляхом центрифугування зі швидкістю 1200 об/хв протягом 2 хв при КТ і забарвлювали, використовуючи систему забарвлювання ЮШОціК (Оаде Вепйгіпу) для диференційної кількості клітин. Клітини підраховували, використовуючи масляну імерсійну мікроскопію. Результати виражають як кількість нейтрофілів у клітині на мл ВАГ Е (середнє ж С.О.С.).

Індуковане овальбуміном нагромадження еозинофілів і нейтрофілів у дихальних шляхах мишей

Мишей ВАЇВ/с (у віці 6-8 тижнів) імунізували, використовуючи ОМА (10 мкг/миша внутрішньочеревинно) у дні 0 ії 7. Для того, щоб викликати локальну запальну реакцію, мишей повторно заражали між днями 13-15 розпилювальним розчином овальбуміну (10 мг/мл, 30 хвилин впливу, ЮОе Мміїїріз5 Ойгапеб 2000). На 17 день кожній тварині інтратрахеально вводили або носій, або тестовану сполуку за дві години до остаточного зараження ОМА. Тварин анестезували через 8 годин перед проведенням трахеотомії. ВАЇ одержували в результаті введення РВЗ (1 мл) у легені, що потім витягали. Цю процедуру повторювали, одержуючи на виході приблизно 2 мл промивної рідини. Загальну кількість клітин у ВАГ Е зразках вимірювали,

Зо використовуючи гемоцитометр. Цитоспинові клітинні мазки ВАГЕ зразків готували шляхом центрифугування зі швидкістю 31200 об/хв протягом 5 хв при КТ і забарвлювали, використовуючи систему забарвлювання ЮШОціК (Оаде Вепйгіпу) для диференційної кількості клітин. Клітини підраховували, використовуючи масляну імерсійну мікроскопію. Результати виражають як диференційну кількість клітин на мл назальної промивної рідини (середнє ж

С.0.С.).

Індуковане Роїу-І:С нагромадження клітин у мишах

Специфічним мишам, які не містять патогенів А/У (самці у віці 5 тижнів), вводили полі (1І:С)-

МУ (1 мг/мл, 40 мкл) (ІпмімоСеп, зап Оіедо, СА, ОА) інтраназально двічі в день протягом З днів під анестезією (З 95 ізофлуран). Тестовані речовини вводили інтраназально (50 мкл у 10 95

ДМСО)/ізотонічний сольовий розчин) за 2 години до кожного введення роїу-І:С. Через 24 години після останнього зараженя роїу-ІС тварин анестезували, у трахею вводили канюлю, і одержували бронхіально-альвеолярну промивну рідину (ВАГ), вводячи і потім видаляючи з легень ізотонічний сольовий розчин (100 мл/кг). Загальну кількість клітин у ВАГЕ зразках вимірювали, використовуючи гемоцитометр із фазово-контрастним мікроскопом.

Кількість альвеолярних макрофагів і нейтрофілів визначали за допомогою аналізу ЕАС5, використовуючи анти-мишиний МОМА2-РІТС (макрофаг) або анти-мишиний 7/4-РІТС (нейтрофіл). Клітини суспендували в РВ5З і інкубували з анти-МОМА2-РІТС (2 мг/мл, Мо за каталогом 5МО65БЕ, Асгі5 Апііродіеєх етрн, Негпога, сСегптапу) або анти-7/4-РІЇТС (2 мг/мл, Мо за каталогом СІГО5ОЕ, Асгіз Апіїродіез СтрнН, Непога, (зептапу) протягом 30 хвилин при ЗО"С, і потім дозабарвлювали, використовуючи пропідіумйодид (2 мг/мл), щоб виключити некротичні клітини. Клітини промивали РВ5, і переносили в ЕАС5 ампули. Зразки поміщали в проточний цитометр (АЇ ТКА ІІ; Весктап Сошег дарап, ТоКуо, дарап), і будували однопараметричну РІ2

ІРМТ2І (РІТС) гістограму з Ід х-осями для ілюстрації відносної інтенсивності ІТС. Файли з результатами зберігали для наступного аналізу, використовуючи аналітичне програмне забезпечення Каїшилга (версія 1.2) для розрахунку кількості кожного типу клітин.

Модель сигаретного диму

Мишей А/) (самці у віці 5 тижнів) піддавали впливу сигаретного диму (4 95 сигаретний дим, розведений стисненим повітрям) протягом 30 хвилин/у день протягом 11 днів, використовуючи експериментальну систему тютюнового диму для дрібних тварин (Моаеї 515-605; 5іраїа Зсієпійіс 60 Тесппоіоду, ТоКуо, ЧУЧарап). Тестовані речовини вводили раз у день протягом З днів після останнього піддавання впливу тютюнового диму (інтраназальна доза, що містить 35 мкл розчину в суміші 50 96 ДМСО/зотонічний сольовий розчин).

Через 12 годин після введення останньої дози тварин анестезували, у трахею вводили канюлю, і бронхіальноальвеолярну промивну рідину (ВАЇ) одержували, вводячи і потім видаляючи з легень РВ5 (100 мл/кг). Загальну кількість клітин у ВАГЕ зразках вимірювали, використовуючи гемоцитометр із фазово-контрастним мікроскопом. Кількість альвеолярних макрофагів і нейтрофілів визначали за допомогою аналізу ЕАС5, використовуючи анти-мишині

МОМА2-РІТС (макрофаги) або анти-мишині 7/4 (нейтрофіли).

Клітини суспендували в РВЗ і інкубували з анти-МОМА2-РІТС (2 мг/мл, Мо за каталогом

ЗМОб65БЕ, Асгіз Апіїродіе5 СтрьнН, Непгога, Септапу) або анти-7/4-РІТС (2 мг/мл, Мо за каталогом

СОБОР, Асгі5 Апібодіеє тн, Негога, Сеппапу) протягом 30 хвилин при З0"С, і також дозабарвлювали, використовуючи пропідіумйодид (2 мг/мл), щоб виключити некротичні клітини.

Клітини промивали РВ5, і переносили в РЕАС5 ампули. Зразки встановлювали в проточний цитометр (АЇ ТКА ІІ; ВесКктап Сошег дарап, ТоКуо, Щдарап), і будували однопараметричну РІ 2

ІРМТ2І (РІТС) гістограму з Іод х-осями для ілюстрації відносної інтенсивності РІТС.

Файли з результатами зберігали для наступного аналізу, використовуючи аналітичне програмне забезпечення Каїшила (версія 1.2) для розрахунку кількості кожного типу клітин. Рівні вмісту СХСІ1(КС), МСРІ, ТМЕа, 1-17 або остеопонтину в ВАЇ Є визначали, використовуючи

Оцепіїкіпе? тоизе КС, МСРІ, ТМЕа, 1-17 або остеопін-набір ЕГІБА (К8У0О системи, Іпс.,

Міппеароїїз, ММ, О5А). Присутність малондіальдегіду вимірювали, використовуючи аналітичний набір Охізеіескю ТВАК5З Авзау Кії (МОА Оцапійайоп; Сеї! Віоїабз Іпс, Зап Оіедо, СА, ОА).

Підсумкові результати іп Міїго і іп Мімо скринування

Іп мійго профіль сполуки формули (І), як визначено з використанням розкритих вище способів, представлений далі (Таблиці 5, б і 7). Сполука за даним винаходом демонструє ефективне інгібування обох РІЗК б і у ізоформ, і не виявляє інгібуючої активності проти РІЗК а, і лише низьку інгібуючу активність проти РІЗК ВД у ферментних аналізах (Таблиця 5).

Зазначені ефекти втілюються в ефективному інгібованим фосфорилування АКІЇ, що викликається стимуляцією клітин або перекисом водню, або МСР-1, не виявлено впливу на клітинну життєздатність у результаті інкубування із зазначеною сполукою формули (І) (Таблиця

Зо 6). Більше того: було виявлено, що обробка клітин розкритою в описі сполукою формули (1) інгібує продукування КО5 з Ш937 клітин і цитокінів з цитостим-заражених РВМСз (Таблиця 7).

Потрібно зазначити, що, очевидно, метаболічний продукт зазначеної сполуки формули (1), а саме - сполука (Іа), що відповідає спирту, - є значно менш активним інгібітором обох РІЗК б і у ізоформ, ніж зазначена сполука формули (І) (Таблиця 6). Відповідно сполука формули (Іа) є значно менш активним інгібітором продукування КОЗ5 з 0937 клітин і цитокінів з цитостим- заражених РВМСз (Таблиця 7), ніж зазначена сполука формули (1).

Таблиця 5

Порівняння інгібуючих активностей РІЗК ізоформ відомих раніше сполук зі сполукою (І) о й . оМе о. ; ОоМе уд п зи

Й ве ! о сі о Е

М ше а щ. М одну ям

М,

Мотя Ми "З у З тн де М де М ту дн но на

Сполука А Приклад 50

Значення ІСзхо для інгібування РІЗК при виміряній кількості

Тестовані сполуки ізозиму (НМ)

РІЗКа РІЗК В РІЗК 6 РІЗКУ 1) Відома раніше сполука, розкрита в МО 2012/052753; 2) Відома раніше сполука, розкрита в МО 2011/048111; МТ: не тестували

Таблиця 6

Інгібуюча активність сполук (І) і (Іа) відносно ізоформ РІЗК ферменту; інгібування індукованого фосфорилування АКІ у клітинах і відносно клітинної життєздатності.

Інгібування РІЗ Клітинна Клітинна кінази активність життєздатність

Тест споп Величина ІСвхо при Величиниг ВЕСзо в 4-0937 МТТ Аналіз? "| встановленій кількості ізозиму (НМ) клітинах (НМ) в а-0937 клітинах віти (0 | 25 | 28 | 13900 | 4890

Ма) | 17 | 577 | 14200 | 514200 а) для інгібування, викликаного фосфорилуванням АК Б) -хє вказує на значення «30 95 інгібування при 10 мг/мл; МО: не проводили.

Таблиця 7

Вплив сполук формули (І) і (Іа) відносно продукування НОЗ5 з клітин 0937 і виділення цитокінів із

РВМСО5

Кпітинна система Значення ВЕсСбво! або ІСво- (НМ)

Сполука (І) Сполука (Іа)

Індуковане зимозаном НОБе продукування в 11 8 143

ІРМмУ-примованих 0937 клітинах! '

Індуковане цитостимом ІІ--4 в РВМСв?

Індуковане цитостимом 1-5 в РВМСв8?

Індуковане цитостимом 1-13 в РВМС8?

Індуковане цитостимом ІРМУ в РВМС8?

ТНРІ клітинний хемотаксис відносно МОР! »14200

Індуковані ТМЕс СХСІ 8 в нейтрофілах від 22 Мо

ХОЗЛ пацієнтів! "

Ефекти обробки сполукою (І) відносно ІРб-індукованої нейтрофілії дихальних шляхів у мишей і щурів представлені в таблицях 8 і 9, відповідно. Було виявлено, що обробка викликає дозо-залежне інгібування І РоЗ-індукованої нейтрофілії в обох видів. Більше того: було виявлено, що інгібуючі ефекти обробки відносно нагромадження клітин демонструють тривалу дію.

Таблиця 8

Ефекти обробки сполукою (І) відносно І Ре-індукованої нейтрофілії в дихальних шляхах мишей

Кількість нейтрофілів у ВАГ Е (х105/мл, середнє х СПС) у вказаний до

Сполука (І) (мг/мл) дозування час (95 інгібування) 17,152,5 нннжіИИВНШИШЕННИ 13,8:2,5 (19 нини 8,0-31,4 (53 9,4-2,0 (45 13,12,5 (23 5,520,9 (68 инші

М - 8 тварин в групі

Таблиця 9

Ефекти обробки сполукою (І) відносно І Р5о-індукованої нейтрофілії в дихальних шляхах щурів

Кількість нейтрофілів у ВАГ Е (х105/мл, середнє ж СПС) у вказаний до

Сполука (І) (мг/мл) дозування час (95 інгібування) 15,122,6 ниинишиншЕншш 13,222,3 (9 нини шЕншш 6,3:-1,6 (58 10,121,8 (33 13,6:22,7 (10 4,150,7 (73 нин шншншш

М - 8 тварин в групі

Ефекти обробки сполукою (І) відносно індукованої алергізацією еозинофілії і нейтрофілії в дихальних шляхах мишей наведені в таблиці 10. Було виявлено, що обробка мишей розкритою в описі сполукою викликає дозо-залежне інгібування нагромадження як еозинофілів, так і нейтрофілів у бронхіально-альвеолярному лаважі після зараженя алергеном.

Таблиця 10

Ефекти обробки сполукою (І) відносно овальбумін-індукованої еозинофілії і нейтрофілії в дихальних шляхах овальбумін-сенсибілізованих мишей

Кількість клітин у ВАГ Е (х105/мл, середнє х СПО) і 95 інгібування

Сполука О (мемп) газ 9,820,6 19,753,2 (20) 8,020,4 (18) 3,8:50,9 (85) 2,920,5 (70) 2,150,4 (91) 2,020,3 (80)

М - 8 тварин в групі

Ефект обробки сполукою (І) або сполукою А відносно нагромадження макрофагів і нейтрофілів у ВАГ Е після піддавання мишей роїу-І:С також досліджували. При безпосередньому порівнянні обробки або сполукою (І) або сполукою А, було виявлено, що відбувається дозо- залежне інгібування роїу-І:С-індукованого нагромадження макрофагів і нейтрофілів у ВАГ Е (Таблиця 11). Примітно, що сполука (І) демонструє значно більш високий потенціал, ніж сполука

А, і отримані результати представлені графічно для нейтрофілів (ФІГ. Таї 15)

Таблиця 11

Ефекти обробки сполукою (І) або сполукою А відносно роїу-І:С-індукованого нагромадження клітин в дихальних шляхах мишей

Обробка і доза Кількість клітин у ВАГ Ра (х 107/мл) і (95 інгібування) сполуки (І) або сполуки А (мг/мл) 3,6х0,2 1,40

Носій --Роїу ІС 19,020,5 11,6:20,2

Сполука (І) (0,002)--Роїу І:С 11,5:20,2 (49) 7,35-0,3 (43)

Сполука (І) (0,02)--Роїу ІС 8,35-0,3 (69) 5,0--0,2 (65)

Сполука (І) (0,2)-Роїу І:С 6,8:0,3 (79) 3,8:-0,2 (77)

Сполука А (0,02)--Роїу ІС 14,3-20,3 (31) 8,9-0,2 (26)

Сполука А (0,2)-Роїу І:С 11,020,4 (52) 7,35-0,3 (42)

Сполука А (2)1Роїу І:С 7,8:-0,2 (73) 4,8:-0,2 (67) а) Результати для кількості клітин представлені як середнє СПС; М - 5 тварин в групі.

Зб

Таблиця 12

Ефект обробки сполукою (І) 5 пропіонат флутиказону відносно індукованого сигаретним димом (С5) нагромадження клітин у мишиних ВАЇ Е

Обробка і доза Кількість клітин у ВАГ? (х107/мл) і (95 інгібування) сполуки (І) (мг/мл)

Макрофаги

СвжСполука (І) (2)

СвжСполука (І) (ужЕрРа

М - 5 тварин в групі; а) ЕР « пропіонат флутиказону в дозі 50 мкг/мл; Юр) Результати для кількості клітин представлені як середнє х СПО.

Визначають ефекти обробки сполукою (І) відносно нагромадження макрофагів і нейтрофілів у ВАЇЕ після піддавання впливу сигаретного диму (Таблиця 12). Повідомляється, що використовуваний у даній моделі дослідження сигаретний дим являє собою кортикостероїдну рефракторну систему |То, У. еї аІ., Ат. У. Везріг. Стії. Саге Мед., 2010, 182:897-904; Медіснепа,

З. еї а, у. РНаптасої. Ехр. Тег. 2008, 324:921-9| ії отримані результати виявили, що дексаметазон (0,3-10 мг/кг, перорально) виявився, як припускали, неактивним. Ефекти обробки сполукою (І) відносно кількості ВАГЕ нейтрофілів і активованих альвеолярних макрофагів демонструють, що обробка має протизапальну активність при введенні у вигляді монотерапії.

Більше того: якщо сполуку (І) вводять разом із пропіонатом флутиказону, у дозі, що не робить ніякого помітного ефекту на монотерапію, виявляється помітне посилення протизапальної активності. В одночасних дослідженнях оцінювали ефекти обробки сполукою А мишей, підданих сигаретному диму. Порівняння отриманих результатів з результатами, представленими вище для сполуки (І), свідчить про те, що сполука (І) є більш ефективним інгібітором викликаного сигаретним димом нагромадження клітин у мишиних ВА ЛЕ, ніж є сполука А (ФІГ. 2а і 25).

Піддавання впливу тютюнового диму також підвищує концентрації запальних біомаркерів

СХСІ1, МСРІ, ТМЕа, 1-17, остеопонтину і малондіальдегіду в бронхоальвеолярної промивній рідині. Обробка сполукою (І) знижує концентрації кожного з біомаркерів дозо-залежним чином.

Більше того: обробка сполукою (І) і пропіонатом флутиказону в комбінації демонструє більш значне зниження концентрацій біомаркерів, ніж досягається при обробці тільки сполукою (1) (Таблиця 13).

Таблиця 13

Ефект обробки сполукою (І) х пропіонат флутиказону відносно біомаркерів у мишиних ВАГ Е

ЇЇ Концентрація біомаркера в Інгібування (95)

ВАТ залежно й обробки Сполука (І) (мг/мл) Сполука (І)(мг/мл)-- ЕР- 11111111 Повітря | Тютюн. | 002 |02| 2 | 0002 сх 8, АжО и 18:0,3

МОР-ї 2,350,2 720 1,5ж0,04 360,1 -17 РН 21501 | 27 | 41 |60| 26 | 51 | 67 1150,3 23504 0,320,023 1.6ж0,043

М - 5 тварин в групі; 1) Процент інгібування відносно тютюну, 2): пропіонат флутиказону (0,5 мг/мл); 3) Представленні результати є значеннями мкМ; контроль ефектів для тютюнового диму після вирахування контрольних значень для повітря.

У підсумку зазначена сполука за даним винаходом є ефективним інгібітором як РІЗК б, такі м ізоформ. Іп мійго профіль переводиться в широкий протизапальний фенотип іп мімо. У проведених експериментах інгібуючі ефекти розкритої в описі сполуки відносно Роїу І:С- індукованого нагромадження клітин у дихальних шляхах є значними. Особливо дивним є також той факт, що, на відміну від селективних інгібіторів РІЗК б, обробка тільки розкритою в описі сполукою (І) приводить до помітного інгібування викликаного сигаретним димом запалення дихальних шляхів, і що зазначені ефекти спостерігаються при більш низьких дозах, якщо сполуки вводять разом із кортикостероїдом, пропіонатом флутиказону, у таких умовах, коли обробка тільки кортикостероїдом не робить дії.

Приклад 15 - Фармацевтичні композиції, які включають сполуку (І)

Композицію сполуки (І) можна приготувати для використання в сухих порошкових інгаляторах у такий спосіб:

Сполуку (І) тонко подрібнюють придатним способом, наприклад, використовуючи повітроструминний млин, одержуючи частинки зі значення Ю5о приблизно в 2 мкм, і потім готуючи суміш зі стеаратом магнію або без нього. Отриманою сумішшю заповнюють дозові контейнери (наприклад, капсули, блістери) для інгаляції з використанням сухого повітряного інгалятора. Наведено приклади композицій, що містять від 0 до 1 95 стеарату магнію, якими заповнюють, наприклад, контейнери з дозами 25 мг/дозу, і в кількості від 1 до 1000 мікрограмів (мкг) на дозу. Можна також використовувати суміші різної сили, з різними кількостями стеарату магнію і з різною масою в дозі.

Таблиця 14

Композиції, що містять 0 95 стеарату магнію до мас/мас

Матеріал/продукт, ефективність мкг/дозу ! 9 25 100 250 1000

Сполука формули (І) 0,004 99,996 99,98 | 999 | 996 | 990 | 96,0

Таблиця 15

Композиції, що містять 0,5 95 стеарату магнію до мас/мас

Матеріал/ продукт, ефективність 1 5 25 100 250 1000 мкг/доз 0,004 99,496 99,48

Таблиця 16

Композиції, що містять 1 95 стеарату магнію до мас/мас

Матеріал/продукт,

Сполука формули (І) 0,004 98,996 98,98

Протягом всього опису й у формулі винаходу, яка слідує далі, якщо в контексті не зазначене інше, слово "включають і такі варіанти як "включає і що включає, варто розглядати як включення зазначеного цілого, стадії, групи цілих або групи стадій, але не як виключення будь- якого іншого цілого, стадії, групи цілих або групи стадій.

Усі зазначені в описі патенти і патентні заявки включені за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Claims (15)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сполука формули (І) (в) ОМе -илтаття в) СЕ, М - М ж М У -М но МН, Й ,() або її фармацевтично прийнятна сіль, включаючи всі її таутомери.

2. Сполука формули (І) за п. 1, рентгенограма ХАРО якої містить характерні піки 9,7, 12,2, 141 ї 14,3 (140,2 градуса, значення 2-тета).

З. Сполука формули (І) за п. 2, у вигляді її форми 2 кристалічного поліморфу, рентгенограма ХАРО якої містить характерні піки 8,2, 9,0, 9,2, 9,7, 12,2, 14,1, 14,3, 15,0, 16,4, 18,0, 18,5, 190, 19,6, 21,8, 22,3, 22,5, 24,3, 24,5, 24,8, 25,1 і 25,8 (740,2 градуса, значення 2-тета).

4. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за будь-яким одним із пп. 1-3, у комбінації з одним або більше фармацевтично прийнятним розріджувачем або носієм.

5. Фармацевтична композиція за п. 4, яка містить додатково другий або додатковий активний інгредієнт, наприклад, вибраний із кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів і інгібіторів р38 МАР кінази.

6. Комбінований продукт, який містить: (А) сполуку формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3; і (В) додатковий активний інгредієнт, наприклад, вибраний із кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів, інгібіторів фосфодіестерази й інгібіторів р38 МАР кінази, де кожний з компонентів (А) і (В) знаходиться в складі суміші з фФармацевтично прийнятним розріджувачем або носієм.

7. Застосування сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3 як лікарського засобу.

8. Застосування сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3 як лікарського засобу, що підлягає введенню, у комбінації з одним або більше додатковим активним інгредієнтом, наприклад, вибраним із кортикостероїдів, бета-агоністів, ксантинів, мускаринових антагоністів і інгібіторів р38 МАР кінази.

9. Застосування сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3 або фармацевтичної композиції за п. 4 або за п. 5, або комбінованого продукту за п. 6 у лікуванні або профілактиці стану, вибраного із: ХОЗЛ (включаючи хронічний бронхіт і емфізему), астми, педіатричної астми, кістозного фіброзу, саркоїдозу, ідіопатичного легеневого фіброзу, алергійного риніту, риніту, синуситу, і викликаного вірусом загострення будь-якого одного з них, респіраторних вірусних інфекцій (включаючи викликані ними ускладнення), алергійного кон'юнктивіту, кон'юнктивіту, алергійного дерматиту, контактного дерматиту, псоріазу, виразкового коліту, запалення суглобів, вторинного відносно ревматоїдного артриту або остеоартриту, ревматоїдного артриту, панкреатиту, кахексії, інгібування росту і метастазування пухлин, включаючи дрібноклітинну карциному легень, Зо карциному грудей, карциному шлунка, колоректальну карциному і злоякісну меланому.

10. Застосування сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3 або фармацевтичної композиції за будь-яким одним із пп. 4 або 5, або комбінованого продукту за п. б для виготовлення лікарського засобу для лікування або профілактики стану, вибраного із: ХОЗЛ (включаючи хронічний бронхіт і емфізему), астми, педіатричної астми, кістозного фіброзу, саркоїдозу, ідіопатичного легеневого фіброзу, алергійного риніту, риніту, синуситу, і викликаного вірусом загострення будь-якого одного з них, респіраторних вірусних інфекцій (включаючи викликані ними ускладнення), алергійного кон'юнктивіту, кон'юнктивіту, алергійного дерматиту, контактного дерматиту, псоріазу, виразкового коліту, запалення суглобів, вторинного відносно ревматоїдного артриту або остеоартриту, ревматоїдного артриту, панкреатиту, кахексії, інгібування росту і метастазування пухлин, включаючи дрібноклітинну карциному легень, карциному грудей, карциному шлунка, колоректальну карциному і злоякісну меланому.

11. Спосіб лікування стану, вибраного із: ХОЗЛ (включаючи хронічний бронхіт і емфізему), астми, педіатричної астми, кістозного фіброзу, саркоїдозу, ідіопатичного легеневого фіброзу, алергійного риніту, риніту, синуситу, і викликаного вірусом загострення будь-якого одного з них, респіраторних вірусних інфекцій (включаючи викликані ними ускладнення), алергійного кон'юнктивіту, кон'юнктивіту, алергійного дерматиту, контактного дерматиту, псоріазу, виразкового коліту, запалення суглобів, вторинного відносно ревматоїдного артриту або остеоартриту, ревматоїдного артриту, панкреатиту, кахексії, інгібування росту і метастазування пухлин, включаючи дрібноклітинну карциному легень, карциному грудей, карциному шлунка, колоректальну карциному і злоякісну меланому, що включає введення суб'єкту ефективної кількості сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3, фармацевтичної композиції за будь- яким одним із пп. 4 або 5, або комбінованого продукту за п. 6.

12. Проміжна сполука формули (ІІ):

І6б, 0 СЕ, М р М М М М З -кМк но МН, й (1) де І Сх являє собою відхідну групу або її захищене похідне.

13. Спосіб одержання сполуки формули (І) за будь-яким одним із пп. 1-3, який включає здійснення взаємодії сполуки формули (ІІ) ів, о Се, М -- М М М М 5 -Ш-Мк но МН, й (1) або її захищеного похідного, де І Сі являє собою відхідну групу, із фрагментом: (в) ОМе в умовах, що підходять для одержання сполуки формули (Її) або її захищеного похідного, і, за необхідності, видалення захисної групи в захищеної сполуки з одержанням сполуки формули (1).

14. Сполука формули (Іа)

(в) он иа о СЕ, М - М 7 М У - но МН, й , (в) або її фармацевтично прийнятна сіль, включаючи всі її таутомери.

15. Сполука формули (1): (в) ОМе иа о СЕ, М - М о М З -к но МН, й ,() у вигляді її кристалічного поліморфу Форми 2, рентгенограма ХАРО якої практично відповідає рентгенограмі, представленій на ФІГ. 5.

Ефекти обробки сполукою (1) або-сполукою А відносно роїу-:С- індукованого нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах мишей що 5 В Кос щі Ф ! «10 Ж Се Ж 4 0002009 0.3 002 02 З очвле т Спзлука о фро Сполука А Мт | воцС МІ: без обробки, Гплінтраназально

ФІГ. Іа Порівняння потенціалів інгібування сполуки (І) зісполукою А відносно роїу-І:С-індукованого нагромадження нейтрофілів у дихальних шляхах мишей доз З Сполука (й) зи Сполука А. во щ ВЗА їх Бо Во р Ксей ЖЕ в Кк ях я 40 рей в ши ме во З 1 ФО о ЕЗЛК ці юю моїми. ня

Фіг. ІВ фект обробки сполукою 4) або сполукою А. відносно зндухованого Ефект обробки сполукою () ай у А НО ЗНУ сигаретним димом нагромадження макрофагів у мишиних ВАГ - (А) Макрофаги я ви Г ово я 15 У ; ою ІХ як Кк | й й ря хй МИШІ 12 в я ВДВ 0 20050000 бжяжлин) -- Сполука у з Сполука й - Повітря Тютюв Повітря ЗЧкпюв. пох

ФІГ. 2а

Ефект обробки сполукою або снолукою А відносно індукованого сигаретним димом нагромадження макрофагія у мишиних ВАТ (8) Нейтрофіли о я - ї-и ї ек В АЙ І 7 ДА - для - В і. й А й і і - х - оз и х «000 й (можлокні т, Сполука (8 Сполукай, . Повітря "Тютюв Новітря Тютюн Фіг: 25 ге, ІВ Н г

Ва. т щоеві оооюа в 773. еоозяю ек джу не ЗЖк о як Н я щі 23 т | у / І у ! М, : 3 Км А У ни но шия що КА им дня ду ей м Що По ддуаа тілі іні ів він ніде 4 х - тити тт я х й г 1. дк п г 2:Теата:нкала «Фіг. З талія 34072 95 Стадія -5У ЗБ -

і . щк | - Канн повна пишна: пав нак ання кави ЖІйнн ново зони линии зи зи тить син ЗІ вин пи запо Іст кино лан вадах лов лава мово: заввах лоно ЗІ ЛИ: ПІ «0 5 50 но 1205 тк 5о іно 2 22 2 255 285 з 3 Ус виогІ1 ДОК а жали док ай; з вам Нормапізований 270,53 МДЖ вх інтеграй, 17:22 Джі: Нормалізований 33,20) МДЖ й пк Іо інтеграл, -27,п9 Дж/е Ви : настанню 1413570 й пікте7,34 о Шок : ; настання 17599 Норкиалізозаний -27,53 МДж з ; й й інтеграл, ау дж ткВвя о і : настання 102,0 ; Да и сн поглевові радіні завоих пиши вик зима миши понос жав; звйнть живи: зи ший Зрао ишов, оиини зИВО пи пох и: а: зи пою вових лових зевава вовах лах лолоих дод них, ЗВО ка во во ме о їйк о з40 збо що вб220Мбо 2600 280 30бо 325 зо

Фіг. 4 Я г І-І е 8 дн т. і | ; Я чо Ю і ; Е Й і 11 Е В : і ї ! | і | | . І НЕ НІ | ці; .

зоб. - ці | ! ! | ЩІ ! Й ОД МА кий ДА ММ М Її Ду мі / (5 4 А с : Й . КЛ МАЛИМ що й ; а т Ї тереторії Е т 15 20 95 за ЗВ 45 2тета 1

Фіг. 5 фета античні ОВ, ! вало аа : др яю ти федштютьттєттття НЯ я х | г ї моде у батввх й ' ж Те їх | -о3 су гі і І кі в гово» Бий З феоге Кк о й ов: ї х /4 се в 4 І | іч х х ся й ні / | / х вах В - х ! а р ши ше ге пт Х - і рр и ОВ я онов " вд Х або» слина нн о п і Кеде 20 чо Б во Зо. о 149 тв 180 рн йо ій Температура ЄС) Фіг, 6 жна ан а а ан а а а а а . ва твк ос - і ! М пу БЕ в 1 Ки есте пінки ЗВ Ж ду. І д-о Н х | і

Б. МІ В й я | | ! І і Е ! мк и : ї- Н і з. І ! 43 Ї і і і15аще і ша а я 2 40. во Во о їй 16 300 їв 0020 25 зай : Температура Со ! Фіг. 7

БУВ ззотерма са Цевкліз с Цика З ла Цакл 2- же Цикл 2. сорбція десопонція соронія десороція па вах: я еВ , в -к Й М: ш ї Нохоси о озві 5 пуб ре. в ; «ші т- і оо» ки 02: ние Й се Ка ! с щи в 015 : вл ЕР сих одв і вия рий і 2 10 за зо 40 ко Кс те зо во 400 За відносної вологості

Фіг. й ПМ зміна маси порівн.) яр С Пічьсяа Я а: ї таб ! І; у : дих й -й г во а БЖ 1 1 Н и : ри « Я ї. си і - і і 4 1. ш- п Їй Вова: і ї : ! ; св В г ко і -ї Н Е Н щ е і и - не ня те в - : і Н : : і Ге) се вав і у | я де В На ст Ба -- Кб ос Ечіе ї ; Я : : ; оо : ! ів 8 їх іа ше -- М г І 5) а е : Я Е | Н щ що ї Й Щк Й іа

Шов. : ! ке Е і - пь т ст і за як ши й я тк п Аж їх ! 20 Ї В ! ; і ов - Ах --у І 70 о іш! -ка Геї В Кози я ання фр вх Коти баню тро єю оди у хуя .ооктомитн нумо яння Ж СЛУ в о 240 чні 720 во 4200 1340 лаво тва азї85 24095 Час/кв Фіг, 9

ЗІНОд рт З чо. 7 Е | | | ШИ. «СНИ он ки й ВИ А» Шу ДМ ці ї; її Щ. ща ! ! й Й м | Тк ЗАЛА, дл диня пи нн чаю нн о и но и и 2Тетай не Фіг. 10 І ! ї і І Ї ї І ТЯ МИ МД й / / А А, АП ММА ТИ УМ - ж ее ме в пн ен и ПДМ ОД і; якетнея 7 89 10 11 12 3 М 15 16 17 15 19 20 31 23 23 54 25 код др» -Тета() шкала

Фіг.

у ! ! ! | і й й і у | ! ! НИ, | МІХ т ; ня ш АЛ і / МА А І ДДА Ай, слі еавиядечнит іпоолослова новою мова вв наве сова кине нини пи пило и нин НИХ зІНпа ст в пропо опо: пово каавс това пові тав загс ловила КІВ иа айв ве зва и пи ПИВ ЗИ Но 20 за 385 ЯТежз ту шкала

Фіг. 12 ГА ке зав ЗхОг ТКА ЕБбЕ-ЗОБ-33 0, Зп в НЕ тттфетвя й - Єтадія фа 00000000 й «з Бавааоя мг Ше : т я й я ва ва Поої о 455 0Мо 0000 0х2е о 0250280 зоб змо ДСК ше: О9й 330 ДСК ког-зовб-я32, ТКО кі ен - о а щі шаштя в Нормапізований 07,25 МДЖ й інтеграл, 81 08 Джуг піки настання вві ру - траур 40 ва та 109. 390 зяб 386 звої спа ж? я яБо 985 Зо 00Змро зас

Фіг. 13

-Циклі сорбція -- Циклої песорбція я Цикл а сорбція 15 -к-Мика б сорбійія Цикл 2 десорбнія ! 14 Ще в нн

Я. ов. к-т 1 к-т 5 08. 5

З о.

в 0.4 г: т ог ні жк 3) ско нниваенннх пон нснввнно зи я По ос нн Опов повннвлововввв мопоме вана ло и а пани т

(В. ЩО 20 30 40 5О Бо то о 90 то -02 Міхшенева КН(Ов) ! Фіг. 14 сн, Х. 7 шо 7 й І І. КА у Лат ДАК ду дини тім ие же Ку інн сне нини поссе зоовв тини песо нав она п пн ння пн нки пн ков вввсвленни ВИНИ а и Пса ви ЗИ пив пово пив повалив мовити п Той по рі ов ВИНИК Юю 20 Зо 40 2Тета ()- шкала

Фіг. 15